ES2213149T3

ES2213149T3 - Liposomas asociados a adenovirus y metodos relacionados.

Info

Publication number: ES2213149T3
Application number: ES94927972T
Authority: ES
Inventors: Ramila Philip; Jane Lebkowski
Original assignee: Gencell SAS
Current assignee: Gencell SAS
Priority date: 1993-09-13
Filing date: 1994-09-13
Publication date: 2004-08-16
Anticipated expiration: 2014-09-13
Also published as: SG48099A1; DE69433462T2; DE69433462D1; DK0719343T3; WO1995007995A2; US5861171A; CA2171318A1; KR100421753B1; US5834441A; AU692470B2; KR960705055A; AU7717594A; JPH09505982A; ATE257177T1; FI961146A0; US5861314A; WO1995007995A3; EP0719343B1; NO961010D0; NO961010L

Abstract

SE PRESENTA UNA COMPOSICION PARA LA MANIPULACION GENETICA QUE COMPRENDE UN LIPOSOMA QUE COMPRENDE UN MATERIAL LIPIDO, Y UN MATERIAL VIRAL ADENOASOCIADO (AAV). TIPICAMENTE, EL MATERIAL AAV ES UN PLASMIDO Y COMPRENDE UNA REPETICION DEL TERMINAL DEL GENOMA AAV. SE PRESENTAN METODOS PARA INTRODUCIR EL MATERIAL GENETICO EN EL INTERIOR DE CELULAS MEDIANTE EL USO DE LIPOSOMAS AAV. DE ESTA FORMA, EL MATERIAL GENETICO SE INTRODUJO Y SE INTEGRO EN LAS CELULAS DEL TALLO, LAS CELULAS T, LAS CELULAS TUMORALES PRIMARIAS O LAS LINEAS CELULARES TUMORALES.

Description

Liposomas asociados a adenovirus y métodos relacionados.

Campo técnico Modificación génica

El presente invento implica la manipulación celular, más particularmente se refiere al uso de liposomas catiónicos para facilitar la transfección mediante plásmidos virales asociados a adenovirus (VAA).

Técnica antecedente

La transfección de células eucarióticas se ha vuelto una técnica cada vez más importante para el estudio y desarrollo de la terapia génica. Los avances en la terapia génica dependen en gran parte del desarrollo de sistemas de liberación capaces de introducir eficazmente ADN en una célula diana. Un número de métodos han sido desarrollados para la expresión estable o transitoria de genes heterólogos en tipos celulares en cultivo. Estos incluyen técnicas de transducción que usan una molécula vehículo o un virus.

La mayoría de las estrategias de terapias génicas se han basado en transducción mediante inserción transgénica en vectores retrovirales o de virus ADN. Sin embargo, los adenovirus y otros vectores virales de ADN pueden producir secuelas infecciosas, pueden ser inmunogénicos después de administraciones repetidas, y sólo pueden empaquetar una cantidad limitada de inserto de ADN.

De los sistemas de vectores virales, el sistema de transducción viral asociado a adenovirus (VAA) recombinante ha demostrado ser uno de los sistemas vectores más eficaces para llevar genes de modo estable y eficaz a una variedad de tipos celulares de mamíferos (Lebkowski, J.S., y otros, "Adeno-associated virus: A vector system for efficient introduction and integration of DNA into a variety of mammalian cell types," Mol. Cell. Biol. (1988) 8: 3988-3996). Ha sido bien documentado que el ADN de VAA se integra en el ADN celular como una a siete copias en tandem unidas a ADN celular a través de repeticiones terminales invertidas (ITR) del ADN viral, y que la estructura física de los genomas de VAA integrados sugieren que las inserciones virales aparecen normalmente como múltiples copias con una repetición en tandem con orientación cabeza a cola vía las repeticiones terminales de VAA (Kotin, R.M. y otros, "Site-specific integration of adeno-associated virus", Proc. Natl. Acad. Sci. (1990) 87: 2211-2215). Así, las repeticiones terminales (ITR) de VAA son una parte esencial del sistema de transducción de VAA.

Aunque los vectores virales asociados a adenovirus (VAA) recombinantes se diferencian de los vectores adenovirales, la limitación del tamaño del ADN del transgen y las propiedades empaquetadores son las mismas que con cualquier otro vector de virus ADN.

El VAA es un parvovirus ADN de cadena única lineal, y requiere coinfección mediante un segundo virus no relacionado para lograr una infección productiva. El VAA lleva dos juegos de genes funcionales: genes rep, que son necesarios para la replicación viral, y genes de proteínas de la cápside estructural (Hermonat, P.L., y otros, "Genetics of adeno-associated virus; Isolation and preliminary characterization of adeno-associated type 2 mutant", J.Virol.(1984) 51:329-339). Los genes rep y cápside del VAA pueden ser remplazados por una fragmento de ADN deseado para generar el ADN plasmídico de VAA. La transcomplementación de los genes rep y cápside se requiere para crear un patrón viral recombinante. Después de la transducción usando tal patrón viral, el virus recombinante se libera de la cubierta dentro del núcleo y se integra en el genoma hospedante mediante sus extremos
moleculares.

Aunque se ha hecho un progreso importante, las técnicas de transducción tienen una eficacia variable, aún una preocupación significativa acerca de la posible recombinación con el virus endógeno, toxicidad celular y reacciones de respuesta inmunológica del hospedante. Así, hay una necesidad para procedimientos de transfección de ADN no viral.

Los liposomas han sido usados para encapsular y liberar una variedad de materiales a las células, incluyendo ácidos nucleicos y partículas virales (Faller, D.V. y D, Baltimore, "Liposome encapsulation of retrovirus allows efficient superinfection of resistant cell lines, " J. Virol. (1984) 49 :269-272).

Se ha demostrado que los liposomas preformados que contienen lípidos catiónicos sintéticos forman complejos estables con ADN poli aniónico (Felgner, P.L., y otros, "A highly efficient, lipid- mediated DNA transfection procedure", Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987), 84: 7413-7417). Los liposomas catiónicos, liposomas que comprendían algún lípido catiónico, que contenían un lípido bromuro de dioctadecildimetilamónico (DDAB) promotor de fusión a membrana han trasferido eficazmente genes heterólogos en células eucariotas (Rose, J.K., y otros, "A new cationic liposome reagent mediating nearly quantitative transfection of animal cells, "Biotechniques (1991) 10: 520-525). Los liposomas catiónicos pueden mediar altos niveles de expresión celular de transgenes, o ARNm, liberándolos en una variedad de líneas celulares en cultivo (Malone, R., y otros, "Cationic liposome mediated RNA tranfection" Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86: 6077-6081).

Los vectores retrovirales de empaquetamiento ecotrópico y anfotrópico se ha demostrado que infectan células en cultivo en presencia de liposomas catiónicos, tal como Lipofectina (BRL, Galthersburg, MD), y en ausencia de receptores específicos (Innes, C.L., y otros, "Cationic liposomes (Lipofectin) mediate retroviral infection in the absence of specific receptors," J. Virol. (1990) 64: 957-961).

Aún cuando las técnicas no virales han superado algunos de los problemas de los sistemas virales, permanece la necesidad de una eficacia de transfección mejorada en sistemas no virales, una necesidad de aumentar el intervalo de tipos celulares que son transfectables, una necesidad de aumentar la duración de la expresión en células transfectadas, y una necesidad para aumentar los niveles de expresión después de la transfección. En cierta medida, se alcanza una eficacia mejorada usando elementos potenciadores del promotor en las construcciones de ADN plasmídico (Philip, R., y otros, "In vivo gene delivery: Efficient transfection of T lymphocytes in adult mice," J. Biol. Chem. (1993)268: 16087-16090).

Destrucción inmunológica de células tumorales

El uso de interleuquina-2 (IL-2) en el tratamiento de células neoplásicas, tales como carcinoma de células renales metastático (CCR), es una manera de llevar a cabo una destrucción mediada por el sistema inmune de neoplasmas humanos. Aunque se han alcanzado remisiones completas duraderas, la tasa de respuesta total ha sido baja.

Durante el ensayo de rIL-2 (Chiron Corp., Emeryville, CA) en pacientes con cáncer, la toxicidad que limita la dosis ha sido dependiente de la ruta y horario de administración. La administración de altas dosis de bolos de IL-2 se asoció con una toxicidad significativa, una toxicidad que implicaba a casi cada sistema orgánico. Por otro lado, se ha encontrado una tasa de mortalidad del 4% en pacientes en estado de rendimiento ECOG 0 con administración de altas dosis de IL-2. Para una perspectiva general del estado de rendimiento de ECOG, véase, por ejemplo, Oken, Am. J. Clin. Oncol. (CTT) 5: 649-655 (1982) "Toxicity and Response criteria of the Eastern Cooperative Oncology Group" Tabla 2, en la p. 654.

Como se distingue de la administración de bolos, el uso de dosis inferiores (1-7 x 10^{6} unidades Cetus/M^{2}/d) en infusión intravenosa continua (CIV) de IL-2 ha producido informes de eficacia clínica y toxicidad disminuida, y ha sugerido un perfil de seguridad mejorado en inmunoterapia adoptiva de cáncer avanzado (West, S.H., y otros, "Constant infusion of Recombinant interleukin-2 in Adoptive immunotherapy of Advanced Cancer," (1987) N. Engl. J. Med. 316: 898).

Los elementos celulares que mejoran potencialmente la destrucción inmunológica de tumores cuando se combinan con IL-2 incluyen células asesinas activadas por linfoquinas y células linfocíticas T citotóxicas (CTL) tales como células linfocíticas citotóxicas infiltrantes en tumores (TIL).

Los linfocitos infiltrantes en tumores (TIL) son principalmente linfocitos T que se encuentran normalmente en próxima aposición con una masa tumoral, y que pueden ser aislados, expandidos, y activados in vitro. Las células TIL son de interés en el estudio del tratamiento de la neoplasia debido a que estas células tienen afinidad por células tumorales. Consecuentemente, las TIL citotóxicas son de particular interés puesto que estas células tienen afinidad por tumores y también poseen cualidades citotóxicas.

Como una metodología de tratamiento, las TIL han sido reinfundidas en un hospedante junto con IL-2 exógena. (véase, por ejemplo, el documento de patente norteamericana Nº 5.126.132 de Rosenberg, número del 30 de junio de 1992). El tratamiento con IL-2 en combinación con TIL ha resultado, en algunos casos, en remisiones completas duraderas en el tratamiento de tumores malignos avanzados.

Descripción del invento

Los liposomas catiónicos fueron usados para facilitar las transfecciones de plásmidos virales asociados a adenovirus (VAA) de tipos celulares primarios y cultivados. El ADN plasmídico de VAA, acomplejado con liposomas mostró niveles de expresión varias veces más elevados que los complejos con plásmidos estándar. Además, la expresión duró durante un período de 30 días sin ninguna selección. Los complejos plásmido VAA: liposoma inducen niveles de expresión del transgen que fueron comparables con los obtenidos mediante transducción por VAA recombinante. Se observaron altos niveles de expresión génica en células T CD4+ y CD8+recién aislados, en linfocitos infiltrantes en tumores, y en células progenitoras CD34+ de sangre periférica humana normal.

Las células primarias de tumores de mama, ovario y pulmón fueron transfectadas usando los complejos ADN plasmídico de VAA: liposoma. Las células tumorales transfectadas fueron capaces de expresar el producto transgénico después de irradiación letal. La eficacia de transfección osciló desde 10-50% como se evaluó mediante expresión del gen de \beta-galactosidasa. La capacidad de expresar transgenes en células tumorales primarias se utiliza para producir vacunas tumorales y para producir células linfoides que permiten modulaciones altamente específicas de la respuesta inmune celular en cáncer y SIDA, y en terapias génicas.

Aquí descrita está una composición para manipulación genética. La composición comprende un liposoma que comprende el material lipídico y el ADN viral asociado a adenovirus, el ADN viral asociado a adenovirus puede ser un plásmido, y el plásmido puede ser pMP6-IL2 como se muestra en la figura 3, o pACMV-IL2 como se muestra en la figura 1. El ADN viral asociado a adenovirus puede comprender una repetición terminal invertida, o dos o más repeticiones terminales invertidas. Donde dos repeticiones terminales invertidas están presentes en el ADN viral asociado a adenovirus, un material genético de interés puede ser integrado entre dos repeticiones terminales invertidas; por otro lado, un promotor puede ser integrado entre dos repeticiones terminales invertidas, el promotor puede ser un promotor CMV inmediato temprano, un promotor CMV inmediato tardío, un promotor CMV temprano, un promotor ADA, o un promotor TK. La composición puede comprender una secuencia genética de interés, tal como una secuencia genética de un gen de IL-2 o de un gen de \beta-gal. El material lipídico puede comprender un lípido catiónico. Están descritas células transfectadas mediante la composición.

Aquí descrito está un método para introducir una secuencia genética de interés en una célula hospedante. El método comprende etapas de proporcionar una composición que comprende liposoma de ADN viral asociado a adenovirus y una secuencia genética de interés y poner en contacto la composición con una célula hospedante que comprende material genético mediante el cual la secuencia genética de interés se introduce en la célula hospedante. La célula hospedante puede ser una célula progenitora CD34+; una célula T, tal como una célula CD3+, CD4+ o CD8+; una célula de una línea celular tumoral tal como una línea celular de vejiga, próstata, linfoma B, o una línea celular de riñón embriónico; o una célula tumoral primaria. La etapa de proporcionar una composición puede comprender proporcionar un liposoma que en sí mismo comprende lípidos catiónicos.

La etapa de proporcionar una composición puede proporcionar ADN viral asociado a adenovirus que comprende un plásmido, y el plásmido puede ser pMP6-IL2 como se muestra en la Figura 3, o pACMV-IL2 como se muestra en la Figura 1. El método para introducir la secuencia genética de interés en una célula puede comprender además una etapa de integración del material genético de interés en el material genético de la célula hospedante.

Se describe un método para usar una composición que comprende un liposoma que comprende material lípido, ADN viral asociado a adenovirus, una secuencia genética de interés. El método comprende proporcionar a un paciente con un estado; y proporcionar una composición que comprende liposoma de ADN viral asociado a adenovirus y una secuencia genética de interés. El método comprende además una etapa para contactar la composición con una célula hospedante, mediante el cual la secuencia genética de interés se introduce en la célula hospedante. La etapa de contacto puede ser in vivo y la célula hospedante es una célula del paciente. Alternativamente, el contacto puede ser ex vivo, si el contacto es ex vivo el método comprende además una etapa de distribuir la célula hospedante que comprende la introducción de la secuencia genética de interés al paciente. La etapa de proporcionar a un paciente puede proporcionar a un paciente un estado tal como un neoplasma; una infección, tal como la infección del VIH; un estado auto-inmune; o una anormalidad genética, tal como un gen perdido o defectuoso. La etapa de proporcionar una composición puede proporcionar una secuencia genética de interés que codifica para un péptido, un oligonucleótido anti sentido, o ARN. La etapa de proporcionar una composición puede proporcionar un plásmido tal como pMP6-IL2 como se muestra en la figura 3, o pACMV-IL2 como se muestra en la figura 1. La etapa de proporcionar una composición puede proporcionar una secuencia genética de interés que comprende una secuencia genética que codifica para una citoquina, un factor coestimulador, una molécula de MHC de clase I, un antígeno específico de tumor, o un antígeno asociado a un tumor. La etapa de proporcionar a un paciente puede proporcionar a un paciente un estado neoplásico maligno, o una infección de VIH; la etapa de proporcionar una composición puede proporcionar una secuencia genética de interés que comprende material genómico de IL-2 a tales pacientes. La etapa de proporcionar un paciente puede proporcionar a un paciente un estado neoplásico maligno; la etapa de proporcionar una composición puede proporcionar una secuencia genética que comprende el gen MDR I, para tales pacientes. La etapa de poner en contacto la composición con una célula hospedante puede comprender el contacto con una célula hospedante que es una célula neoplásica, una célula hematopoyética de médula espinal o una célula de sangre periférica; la etapa de poner en contacto puede comprender el contacto con una célula hospedante que es un linfocito infiltrante en tumores, una célula de una línea celular tumoral, o una célula tumoral primaria.

Se describe un vector de expresión que comprende una secuencia genética que es esencialmente la que está descrita en la Figura 3; se describe un vector de expresión que comprende una secuencia genética que es sustancialmente la de las secuencias genéticas de la Figura 3; y se describe un vector de expresión que comprende una secuencia genética que es la de la secuencia genética en la Figura 3. Se describe una célula que está modificada genéticamente con el vector de expresión que comprende una secuencia genética que es esencialmente la de la secuencia genética en la Figura 3; la célula puede ser una célula de sangre periférica, una célula de médula espinal, un linfocito infiltrante en un tumor, una célula de una línea celular tumoral, o una célula tumoral primaria.

Se describe un vector de expresión que comprende una secuencia genética que es esencialmente la de secuencia genética del plásmido pMP6; un vector de expresión que comprende una secuencia genética que es sustancialmente la de la secuencia genética del plásmido pMP6; un vector de expresión que tiene una secuencia genética que es la de la secuencia genética del plásmido pMP6. Un vector de expresión que comprende una secuencia genética que es esencialmente la de la secuencia genética del plásmido pMP6 puede comprender además una secuencia genética de interés; una célula puede ser modificada genéticamente con dicho vector de expresión, la célula puede ser una célula de sangre periférica, una célula de médula espinal, un linfocito infiltrante en tumores, una célula de una línea celular tumoral, o una célula tumoral primaria.

Se describe está un método para producir una proteína. El método de producción de proteína comprende etapas de proporcionar una composición que comprende liposoma, ADN viral asociado a adenovirus y una secuencia genética de interés. La composición se pone en contacto con una célula hospedante que comprende material genético, mediante el cual la secuencia genética de interés se introduce en la célula hospedante. El método de producción comprende además una etapa de expresar una proteína codificada por la secuencia genética de interés. La célula hospedante puede ser una célula progenitora CD34^{+}, una célula T, una célula de una línea celular tumoral, o una célula tumoral primaria; la célula hospedante puede ser un linfocito infiltrante en tumores, una célula CD3^{+}, CD4^{+}, ó CD8^{+}. La célula hospedante puede ser de una línea celular tumoral que es línea celular de vejiga, de próstata, de un linfoma B, o una línea celular de riñón embrionario. La etapa de proporcionar una composición que comprende liposomas puede comprender el proporcionar una composición que comprende lípidos catiónicos. La etapa de proporcionar una composición puede proporcionar ADN viral asociado a adenovirus que comprende un plásmido, tal como pMP6-IL2 como se muestra en la figura 3, o pACMV-IL2 como se muestra en la figura 1. El método para proporcionar una proteína puede comprender además una etapa para integrar el material genético de interés en el material genético de la célula hospedante. La etapa de expresar una proteína puede comprender expresar un análogo de linfoquina. La etapa de expresar una proteína puede expresar IL-2, \beta-galactosidasa cloranfenicol acetiltransferasa, o MDR I.

Se describe un método para preparar una composición celular terapéutica para tratar a un paciente con un neoplasma. El método comprende etapas de obtener una composición de células que comprenden células de linfocitos T efectores; de poner en contacto la composición de la célula con proteínas de unión específicas, en las que las proteínas de unión específicas están unidas covalentemente a una superficie, mediante la cual las células de linfocitos T efectores unidas específicamente mediante las proteínas de unión específicas se vuelven específicamente unidas a la superficie, y, eliminando las células que no están unidas mientras que se dejan las células de linfocitos T efectores específicamente unidas a la superficie. El método para preparar una composición celular terapéutica puede comprender además una etapa de expansión de células de linfocitos T efectores, mediante la cual se proporciona una población de fenotipo sustancialmente homogéneo; la etapa de expansión puede comprender además el cultivo de células de linfocitos T efectores con células tumorales; las células tumorales pueden ser irradiadas; las células tumorales pueden ser modificadas genéticamente con un vector que comprende un casete de expresión para interleuquina-2. En el método para preparar una composición celular terapéutica, la etapa de obtención puede comprender la obtención de células de linfocitos T efectores que son linfocitos infiltrantes en tumores, los linfocitos infiltrantes en tumores pueden ser de un tejido neoplástico que es autólogo o alogénico. La etapa de poner en contacto puede comprender el poner en contacto la composición celular con proteínas de unión específicas específicas para CD4, CD8, o una mezcla de proteínas de unión específicas específicas para CD4 y CD8. El método para preparar una composición celular terapéutica puede comprender además una etapa de liberación de células unidas específicamente, mediante la cual la liberación de las células está sustancialmente libre de proteínas de unión específicas. Las proteínas de unión específicas pueden comprender anticuerpos monoclonales. El método puede comprender además una etapa de modificar genéticamente las células unidas específicamente, tales como transfectar con un plásmido que comprende material genómico de IL-2, mediante el cual resulta una composición celular terapéutica que tiene efecto terapéutico en ausencia de administración sistémica de interleuquina-2. Se describe una población sustancialmente homogénea de células preparadas según el método. Se describe el uso de una población preparada según el método, para tratar a un paciente que tiene un neoplasma, tal como un carcinoma en una célula renal, carcinoma infiltrante dúctil, melanoma, carcinoma de ovario, carcinoma de pulmón o carcinoma de células escamosas.

Se describe una población sustancialmente homogénea de células TIL CD8^{+}, en la que las células de la población comprenden superficies externas y en la que las superficies externas de las células están sustancialmente libres de anticuerpos; las células de la población pueden ser al menos un 80% homogéneas para CD8.

Se describe el método para preparar una composición celular terapéutica para tratar a un paciente con un neoplasma que comprende obtener células neoplásicas; modificando genéticamente las células con una composición que comprende liposomas que comprenden material lipídico y ADN viral asociado a adenovirus y además comprenden una secuencia genética de interés; tal como una secuencia que codifica para un uso de linfoquina de una composición preparada según este método también está descrito.

Breve descripción de los dibujos

Fig.1. Mapas plasmídicos de tres plásmidos usados en los presentes estudios. El plásmido pACMV-IL2 que contiene el promotor CMV, cADN de IL-2 y preproinsulina de rata y secuencias de poliadenilación de SV40 idénticas al plásmido pBC12/CMV-IL2, adicionalmente pACMV-IL2 también tenían repeticiones terminales invertidas de VAA (ITRs) a ambos extremos. El plásmido pA1CMVIX-CAT fue construido con el promotor CMV y el gen CAT insertados entre los dos ITRs de VAA.

Fig. 2. Esta figura proporciona un mapa de restricción detallado de la realización de IL-2 del plásmido pMP6 (pMP6-IL2).

Fig. 3A-G. Esta figura representa la secuencia de ADN del plásmido pMP6-IL2. En la fig, los paneles a-e representan porciones sucesivas de la secuencia. Se indican porciones de la secuencia pMP6-IL2 que corresponden a secuencias de ADN conocidas; la información de la secuencia correspondiente está listada directamente debajo de la secuencia de información para el plásmido pMP6-IL2. Las secuencias no marcadas son los sitios de unión.

Fig. 4a-b. la Fig.4a describen los niveles de la expresión génica inducida por los complejos ADN plasmídico: liposoma. Diversas construcciones plasmídicas de IL-2 fueron ensayadas en lo que se refiere a su capacidad para inducir expresión génica con una línea celular de vejiga de rata y una línea celular de próstata de rata, cuando las construcciones fueron acomplejadas con liposomas. En ambas líneas celulares, la construcción plasmídica de VAA muestra los niveles de expresión más altos. Los niveles se expresan como picogramos por ml por 10^{6} células. La Fig. 4b representa el curso en el tiempo de la expresión génica inducida por complejos de plásmido de VAA: liposoma. Para comparar la duración de la expresión del transgen, la línea celular de próstata fue transfectada con el plásmido VAA (pACMV-IL2) y el correspondiente plásmido testigo (pBC12/CMV-IL2) acomplejado con liposomas. Se recogieron sobrenadantes a diversos puntos de tiempo y se ensayaron en lo que se refiere a niveles de IL-2 usando un ELISA. Los niveles de IL-2 se expresan como picogramos/ml/10^{6} células en 24 h de cultivo.

Fig.6. Expresión del gen de IL-2 por lipofección con complejos de plásmido de VAA: liposoma de diversas células tumorales primarias. Una muestra de pulmón, una de ovario, y dos muestras de tumor de mama fueron aisladas de biopsias recientes de tumores. Los niveles IL-2 fueron medidos usando un ELISA. Los niveles son indicados como picogramos/ml/10^{6} células en 24 h de cultivo.

Fig. 7a-b. La expresión de IL-2 por células transfectadas de acuerdo con el invento, sometidas después a irradiación letal. Para determinar el efecto de la irradiación en la expresión génica, la línea celular de próstata (Fig. 7a) y células de mama primarias (Fig. 7b) fueron transfectadas y evaluadas en lo que se refiere a la expresión de genes después de la irradiación letal, como se describe aquí. Los sobrenadantes fueron recogidos 24, 48, 72 y 96 horas después de la irradiación y fueron ensayados en lo que se refiere a los niveles de IL-2. Los niveles de IL-2 fueron expresados como pg/ml/10^{6} células en 24 horas de cultivo.

Fig. 8. La eficacia de transfección de VAA: liposoma medida mediante la expresión del gen \beta-gal. El gen reportero \beta-gal fue usado para evaluar la eficacia de la transfección en una base por célula. La línea celular de próstata fue usada para transfección, como se describe aquí. Los datos están representados como porcentaje de células positivas para fluorescencia.

Fig. 9a-d. Los estudios de cromatografía de capa fina que representan los linfocitos T transfectados. La sangre fue obtenida de donantes referidos como A o B. La sangre periférica del donante de A o B fue usada para aislar células T, y para transfección. Las células primarias T recién aisladas de la sangre periférica de un donante fueron ensayadas en lo que se refiere a la expresión del transgen usando complejos ADN plasmídico de VAA: liposoma. Los linfocitos T fueron fraccionados como poblaciones CD3^{+} (Fig. 9a), o CD5/8^{+} (Fig. 9b), o como CD4^{+} (Fig. 9c) o CD8^{+} (Fig. 9d) usando dispositivos AIS microCELLector. Las células relevantes fueron capturadas y cultivadas como se describe aquí. Después, 5-10 x 10^{6} células fueron puestas en placas y transfectadas con 50 microgramos de ADN plasmídico de VAA y con 50 ó 100 nmoles de liposomas para obtener una relación 1:1 ó 1:2 de ADN: liposomas. Las células fueron recogidas 3 días después de la transfección. Se ensayó el contenido normalizado para proteína de los extractos en lo que se refiere a actividad CAT usando un ensayo cromatográfico.

Fig. 10. Cromatografía en capa fina de células progenitoras de sangre periférica CD34^{+} transfectadas con plásmido de VAA: liposomas. Las células fueron recogidas a día 3 y día 7 después de la transfección. Se ensayó el contenido normalizado para proteína de los extractos en lo que se refiere a la actividad CAT usando un ensayo cromatográfico.

Fig. 11a-b. Análisis por Southern de quimioluminiscencia potenciada (ECL) de ADN genómico de clones transfectados con complejos de ADN plasmídico de VAA: liposomas. En la Fig. 11a, las muestras fueron digeridas con Bam HI y Hind III e hibridadas con sondas para IL-2. Para los datos en la Fig. 11b, las muestras fueron digeridas con Bam HI e hibridadas con sondas para IL-2. Todos los clones analizados muestran la presencia del gen de la IL-2, como se demuestra por las bandas de 0,685 kb.

Para la Fig. 11a-b:

carril 1: escalera de 1 kb

carril 2: plásmido escindido con Bam HI/HindIII (9a) y BamHI/pvull (9b).

carril 3: R33 sin transfectar

carriles 4-11: clones

Fig. 12a-b. Análisis por Southern (^{32}P) de los clones 1A11 y 1B11. Después de la transferencia por Southern, el filtro representado en la Fig. 12a fue hibridado con el fragmento Bam HI/Hind III de 0,68 kb de IL2 de pACMV-IL-2.

Para la Fig. 12a:

carril 1: clon 1A11 escindido con Bam HI/Hind III

carril 2: clón 1B11 escindido con Bam HI/Hind III

carril 3: clón R33 escindido con Bam HI/Hind III

carril 4: clón 1A11 escindido con Bam HI

carril 5: clón 1B11 escindido con Bam HI

carril 6: clón R33 escindido con Bam HI

carril 7: clón 1A11 escindido con Hind III

carril 8: clón 1B11 escindido con Hind III

carril 9: clón R33 escindido con Hind III

carril 10: dejado vacío

carril 11: plásmido pACMV-IL2 escindido con Bam HI/Hind III

carril 12: plásmido pACMV-IL2 escindido con Hind III/pvull

carril 13: plásmido pACMV-IL2 escindido con Bam HI/pvull

Para los datos mostrados en la Fig. 12b, el filtro se hibridó con un fragmento pvull/HindIII de 0,85 kb (VAA ITR/CMV) del plásmido pACMV-IL2. Para la Fig. 12b:

carril 1: clón 1A11 escindido con smal

carril 2: clón 1B11 escindido con smal

carril 3: clón R33 escindido con smal

carril 4: clón 1A11 escindido con pvull/Hind III

carril 5: clón 1B11 escindido con pvull/Hind III

carril 6: clón R33, escindido con pvull/Hind III

carril 7: pACMV-IL2, escindido con Bam HI/Hind III

carril 8: pACMV-IL2, escindido con Hind III/pvull

carril 9: pACMV-IL2, escindido con smal

carril 10: escalera de 1 kb

Fig. 13. Esta figura representa el análisis del repertorio de Receptor de Célula T (TCR) con protección frente a ARNasa de TIL de cáncer de mama expandido con tumor autólogo, con tumor transducido con IL-2, y con IL-2 sola. Para los ejes en la Fig., V_{\beta} es una variable de segmento de la cadena \beta del TCR; C_{\beta} es el segmento constante de la cadena B del TCR; en el eje horizontal A, B, y C representan diferentes pacientes.

Fig. 14. Esta figura representa la proliferación de linfocitos infiltrantes en tumores (TIL) de cáncer de mama; los datos fueron obtenidos 5 días después de la transfección del gen de la IL-2.

Fig. 15. Esta figura representa la eficacia de la expresión génica en TIL de cáncer de mama transfectados con el plásmido pMP6 que contiene los genes de resistencia a neomicina y el gen Thy 1.2 (pMP6/neo/Thy 1.2) en lugar del gen de la IL-2. El plásmido pMP6/neo/Thy 1.2 fue acomplejado con liposomas DDAB: DOPE. Las composiciones de liposomas fueron las mismas composiciones que las de los datos correspondientes a la Fig. 14.

Fig. 16. Esta figura compara el nivel y duración de la expresión transgénica después de transfecciones con diversas construcciones plasmídicas. La línea celular de tumor de próstata R3327 fue transfectada con plásmido estándar (pBC12/CMV-IL2) o plásmido (pACMV-IL2) acomplejado con liposomas DDAB: DOPE. Los sobrenadantes fueron recogidos a diversos puntos de tiempo y se ensayaron por ELISA en lo que se refiere a niveles de IL-2. Los niveles de IL-2 se expresan como pg/ml/10^{6} células en 24 horas de cultivo.

Fig. 17. Esta figura representa análisis de transferencia por Southern de ADN cromosómico de células R3327 transfectadas bien con el plásmido de VAA (pACMV-IL2) o bien el plásmido estándar (pBC12/CMV-IL2). La transferencia se hibridó con el fragmento Bam HI/Hind III de 0,685 kb del gen de IL-2. C = ADN de células sin transfectar. El inserto de IL-2 se muestra en el último carril.

Fig. 18. La figura representa los resultados de un ensayo intracelular de la eficacia de transfección del gen de IL-2 en la línea celular de próstata R3327. Las células fueron transfectadas con plásmido de IL-2 de VAA acomplejado con liposomas DDAB: DOPE, composición 1:1 ó 1:2. Las células transfectadas fueron teñidas en diversos puntos de tiempo para determinar los niveles de proteína intracelular IL-2. El dato está representado como porcentaje positivo de células que expresan la proteína IL-2. Se usaron células sin transfectar como testigos negativos y los valores de los testigos fueron restados de los valores de los grupos transfectados.

Fig. 19a-b. Esta figura representa la expresión de IL-2 por células de la línea celular de tumor de próstata irradiadas (Fig. 19a) y por tumor de mama primario irradiados (Fig. 19b). Las células de mama primarias y células de la línea celular de próstata fueron transfectadas y ensayadas para determinar la expresión génica después de la irradiación letal. Los sobrenadantes fueron recogidos 24, 48, 72 y 96 horas después de la irradiación y fueron ensayados para determinar los niveles de IL-2. Los niveles de IL-2 fueron expresados como pg/ml/10^{6} células en 24 horas de cultivo.

Modos para llevar a cabo el invento

Los estudios, descritos por primera vez aquí, examinaron el transporte en las células de ADN plasmídico de VAA mediante un sistema que no implica la transducción viral. Alternativamente, un método de acuerdo con la presente descripción transfectó eficazmente varios tipos celulares de mamífero por el uso de liposomas que comprenden material de VAA. La presente descripción se refiere a la transfección, y utiliza elegantes sistemas vehículo de lipofección junto con la capacidad de transducción competente de la construcción plasmídica de VAA. Ventajosamente, los liposomas catiónicos fueron usados como un medio para facilitar la entrada de ADN plasmídico de VAA en células en ausencia de transcomplementación por rep y capsid, virus recombinantes o VAA de tipo salvaje. Un método de lipofección de acuerdo con el invento fue evaluado para calcular la eficacia de la expresión génica. Los presentes datos establecieron la capacidad para transfectar células progenitoras no modificadas, células linfoides primarias no modificadas tales como células T, una variedad de células tumorales recién aisladas, y tipos celulares de mamífero en cultivo, con una alta eficacia para una expresión de ADN tanto transitoria como sostenida. La capacidad para transfectar eficazmente las células T no modificadas, tales como linfocitos infiltrantes en tumores; células progenitoras no modificadas; células de líneas celulares tumorales; y, células tumorales primarias es descrita por primera vez en la técnica.

I. Materiales fuente y métodos empleados A. Líneas celulares

Una línea celular de próstata de rata (R3327) y línea celular de vejiga de rata (MBT-2) fueron obtenidas del Dr. Eli Gilboa, Universidad de Duke. Ambas líneas celulares fueron mantenidas en medio RPMI-1640 suplementado con suero bovino fetal (FBS) 5%. La línea celular 293 es una línea celular de riñón embrionario humano que se transformó por adenovirus tipo 5, y se obtuvo de la ATCC (Graham, F.L., y otros, "Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5," J.Gen. Virol. (1977) 36: 59-72). La línea de celular 293 creció en medio Dulbecco modified eagle suplementado con FBS 10%.

B. Preparación de células tumorales primarias

Las células tumorales primarias de pulmón, ovario y tres tumores de mama fueron obtenidas de tumores sólidos de pacientes. Las muestras tumorales fueron cortadas en trozos pequeños y digeridas en 200 ml de medio AIM V (Gibco), suplementado con 450 \mu/ml de colagenasa IV (Sigma) 10,8 K unidades/ml de DNasa I (Sigma), y 2000 u/ml de hialuronidasa V (Sigma) (Topolian, S.L., y otros, "Expansion of human tumor infiltrating lymphocytes for use in immunotherapy trials," J.Immunol. Methods (1987) 102: 127-141). Después de 1-2 horas de digestión, las células fueron homogeneizadas con un homogeneizador de vidrio (Bellco). Las células fueron lavadas tres veces en DPBS-CMF (Whittaker). Los linfocitos fueron separados de las células no linfoides por captura en un dispositivo AIS MicroCELLector-CD5/8 (AIS, Santa Clara, CA). Las células no adherentes (principalmente células tumorales) fueron retiradas y cultivadas en RPMI 1640 complementado con L glutamina 2 mM, penicilina-estreptomicina 100 u/ml, y FBS 10%. Las células tumorales fueron cultivadas durante 2 a 4 semanas previamente a la transfección.

C. Preparación de células mononucleadas de sangre periférica

Las células mononucleadas de sangre periférica (PBMCs) de pacientes testigo sanos fueron aisladas de la capa beige (fracción de células blancas) (Banco de sangre de la Universidad de Stanford, Stanford, CA), usando linfoprep (Nycomed, Noruega).

Las células T, subgrupos de células T, ó células CD34+ fueron aisladas adicionalmente usando AIS MicroCELLectors (Applied immune Sciences, Santa Clara, CA), los dispositivos que comprenden superficies que tienen unidas covalentemente proteínas de unión específicas (tales como anticuerpos monoclonales) unidas a las mismas. Brevemente, los PBMCs fueron resuspendidos en 15 x 10^{6} células por ml en 0,5% de Gamimmune (Miles, Inc., Elkhart, IN) y cargados en AIS MicroCELLectors CD3, CD4, CD8, CD5/8, ó CD34 lavados. Después de 1 hora, las células no adherentes fueron retiradas del AIS MicroCELLectors. El medio completo, RPMI 1640 (Whittaker) que contiene suero bovino fetal 10%, L-glutamina 2 mM, y penicilina/estreptomicina 100 u/ml fue añadido a las células adherentes en el AIS MicroCELLectors. Después de 2-3 días en medio humidificado a 5% de CO_{2}, y 37ºC, las células adherentes fueron retiradas y preparadas para la transfección.

D. Preparación de plásmido

El primer plásmido usado en los presentes estudios fue (pACMV-IL2): este plásmido contenía el gen de la interleuquina-2 humana (IL-2) como cADN de IL-2, y el elemento potenciador del promotor inmediato temprano del citomegalovirus humano (CMV), y preproinsulina de rata y secuencias de poliadenilación de SV40, flanqueadas por repeticiones terminales invertidas (ITRs) del virus asociados a adenovirus en ambos extremos. (Este plásmido disponible del Dr. J. Rosenblatt, UCLA, CA; el nombre del Dr. Rosenblatt para este plásmido es pSSV9/CMV-IL2). Un plásmido testigo correspondiente pBC12/CMV-IL2, que era idéntico a pACMV-IL2 pero que carecía de las repeticiones terminales de VAA, se usó también (Fig. 1).

Un segundo plásmido de estudio, pAICMVIX-CAT, contenía las secuencias potenciadoras del promotor inmediato temprano de CMV, y un intrón derivado de pOG44 (Stratagene); el gen bacteriano CAT; la señal de poliadenilación tardía de SV40 flanqueada por repeticiones terminales de VAA en un esqueleto de pBR322 (Fig.1).

Los plásmidos pATK-\betagal y pAADA-\betagal contenían el gen \betagal unido bien al promotor TK o bien al promotor ADA respectivamente, en un esqueleto de plásmido de VAA. (los plásmidos Bgal proporcionados por el Dr. Eli Gilboa, Univ de Duke.).

Otro plásmido usado en los presentes estudios fue el pMP6. Como se muestra en la Fig. 2, el plásmido que contiene ADN de IL-2 (pMP6-IL2) es un plásmido circular de doble hebra. El plásmido pMP6-IL2 tiene el gen de interleuquina-2 humana bajo el control de un promotor CMV y una señal de poliadenilación SV40. Entre el promotor y las secuencias codificantes de IL-2, hay un intrón (derivado de pOG44, Stratagene) que se comprende que potencia la expresión de IL-2 o cualquier otro gen exógeno colocado en el plásmido. El casete de expresión completo está entre las secuencias terminales izquierda y derecha del adenovirus asociado. El plásmido pMP6-IL2 también tiene un esqueleto Bluescript; el esqueleto tiene un origen de replicación bacteriano Col-E1 y un gen de resistencia a ampicilina que facilita la propagación de este plásmido en E. coli.

La Figura 3A-G representa la secuencia de ADN del plásmido pMP6-IL2; los paneles desde el a hasta el e representan porciones sucesivas de la secuencia. En la figura, se indican porciones de la secuencia pMP6-IL2 que corresponden a secuencias de ADN conocidas; la información de la secuencia correspondiente está listada directamente debajo de la información de la secuencia para el plásmido pMP6-IL2. Las secuencias sin marcar son de los sitios de unión.

Las construcciones plasmídicas estándar que contienen el gen IL-2, pero que no contienen componentes de VAA fueron también usadas. Las construcciones plasmídicas estándar llevaron el gen de IL-2, con un adenosina desaminasa (ADA), una timidina quinasa (TK) o el promotor inmediato tardío de citomegalovirus (CMV) (plásmidos estándar obtenidos de ATCC).

Los datos para los plásmidos seleccionados están en la Tabla 1:

TABLA 1

1

Todos los plásmidos fueron aislados mediante lisis alcalina y precipitación por acetato amónico, seguido por un tratamiento con ARNasa libre de ADNasas, extracciones con fenol/cloroformo/isoamilo y precipitación con acetato amónico (Ausubel, F.M., y otros., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc. 1993)).

E. Preparación de liposomas

Los liposomas unilamelares pequeños fueron preparados a partir del lípido catiónico bromuro de dioctadecildimetilamonio (DDAB) (Sigma) en combinación con el lípido neutro dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) (Avanti Polar Lipids). Los lípidos fueron disueltos en cloroformo. El DDAB fue mezclado con DOPE bien en una relación molar de 1:1 ó 1:2 en un frasco de fondo redondo, y la mezcla lipídica fue secada en un evaporador rotatorio. La película lipídica fue rehidratada añadiendo agua estéril doblemente destilada para dar una concentración final de DDAB 1 mM. Esta disolución fue sonicada en un sonicador de baño (Laboratory Supplies, Hicksville, NY) hasta que quedó clara. Los liposomas fueron almacenados a 4ºC en atmósfera de argón. Para el uso in vivo de liposomas vía administración intravenosa se usó una relación DDAB: DOPE de 1:4 a 1:5; para administración intraperitoneal se usó una relación DDAB: DOPE de 1:1 a 1:2.

F. Preparación de VAA recombinante (rVAA) para transducción con infección viral

Para la preparación de patrones de VAA recombinante, las células de la línea celular 293 fueron divididas y hechas crecer hasta aproximadamente 30-50% de confluencia. Enseguida, se infectaron las células con adenovirus del tipo 5 a una multiplicidad de infección de 1 a 5, y se incubaron a 37ºC. Después de 2 a 4 horas, las células infectadas fueron cotransfectadas con 10 \mug de un plásmido que comprendía un gen de interés y 10 \mug de plásmido de complementación rep capsid, p\DeltaBal, por 100 mm de placa de cultivo tisular (0,5-1 x 10^{7} células). Se usó coprecipitación por fosfato cálcico para transfección (Hermonat, P.L. y Muzyczka, N., "Use of adeno-associated virus as a mammalian DNA cloning vector. Transduction of neomycin resistance into mammalian tissue culture cells, "Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81: 6466-6470). Entre 12 y 18 horas después de la transfección, el medio fue retirado de las células y reemplazado con 5 ml de medio DMEM que contenía FBS 10%.

Entre 48 y 72 horas después de la transfección, el VAA fue recogido según el siguiente procedimiento: las células y el medio fueron recogidos juntos, y fueron congeladas descongeladas tres veces para lisar las células. La suspensión de células y medio fue después centrifugado para retirar los restos celulares, y los sobrenadantes fueron incubados a 56ºC durante 1 hora para desactivar el adenovirus (Hermonat, P.L. y N., Muzyczka, "Use of adeno-associated virus as a mammalian DNA cloning vector. Transduction of neomycin resistance into mammalian tissue culture cells," Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81: 6466-6470); Tratschin, J.D. y otros, "Adeno-associated virus vector for high frequency integration, expression, and rescue of genes in mammalian cells, " Mol. Cell. Biol. (1985) 5 :3251-3260). Después de la desactivación por calor, el sobrenadante viral se filtró a través de filtros de acetato de celulosa (1,2 \mum). Los patrones virales se almacenaron entonces a -20ºC. Se usó un milílitro de sobrenadante de VAA para transducir 1 x 10^{6} células.

G. Transfección celular "Lipofección"

Para células tumorales primarias y líneas celulares tumorales de rata (R3327 y MBT-2), 1 x 10^{6} células fueron puestas en placas en 2 ml de medio libre de suero por pocillo en una placa de 6 pocillos. Después, se mezclaron 5 \mug de ADN plasmídico de VAA con 5 nmoles de DDAB como liposomas compuestos de DDAB y DOPE en una relación molar de 1:2, respectivamente. Se añadió medio libre de suero (0,5 ml) al complejo VAA: liposoma, que fueron luego trasferidos a las células. Para efectuar la lipofección, las células fueron incubadas a temperatura ambiente durante 5 minutos, el suero bovino fetal fue añadido a las células para dar una concentración final de suero bovino fetal 5%.

Para las células T, 5-10 x 10^{6} células fueron puestas en placas en 1 ml de medio libre de suero por pocillo de una placa de 6 pocillos. Se mezclaron 50 \mug de ADN plasmídico con 50 nmoles de DDAB como liposomas compuestos de DDAB y DOPE en una relación molar de 1:1. Las transfecciones "lipofecciones" se realizaron luego como para las células tumorales.

Para las células progenitoras, 1-2 x 10^{6} células fueron transfectadas con complejos que comprendían 10 microgramos de ADN plasmídico y 10 nmoles de liposoma. Las células transfectadas fueron cultivadas con medios que contenían factor de células progenitoras, IL-3 e IL-1. En el día 3 y 7, las células fueron recogidas y se hicieron los extractos.

H. Ensayo de IL-2

Se contaron las células, y 1 x 10^{6} células fueron puestas en placas en 1 ml por pocillo de una placa de 24 pocillos. Al día siguiente, se recogieron los sobrenadantes y se valoraron usando un kit de ELISA Quantikine IL-2 (R&D Systems, Minneapolis, MN). Los niveles de IL-2 se definieron como picogramos/ml del sobrenadante.

I. Ensayo de \beta-galactosidasa

El kit de detección del gen de fusión FluoReporter lacZ Molecular Probes (Eugene, OR) fue usado para cuantificar lacZ \beta-D-galactosidasa en células únicas por medición de la fluorescencia del producto de la hidrólisis enzimática, fluoresceína. Los plásmidos VAA/\beta-gal (pATK-\betagal y pAADA-\betagal) fueron usados con este kit. La fluoresceína es producida por escisión enzimática de fluoresceín di-b-D-galactopiranósido (FDG) en células que expresan el gen marcador b-D-galactosidasa. Las células se analizaron después usando citometría de flujo (FACScan, Becton Dickinson, San José,CA).

Resultados del estudio A. Nivel de la expresión del gen de IL-2 mediante el uso del complejo plásmido de VAA: liposoma catiónico

Para evaluar la eficacia de la transferencia génica de los plásmidos de VAA, se compararon las eficacias de transferencia del gen de IL-2 de los plásmidos VAA con las eficacias de las construcciones plasmídicas estándar. Los plásmidos estándar llevaron el gen de IL-2, con un promotor adenosina desaminasa (ADA) (pADA-IL2), un promotor de timidina quinasa (TK) (pTKIL-2), o el promotor inmediato tardío del citomegalovirus (pCMV-IL2) (CMV). Un plásmido de estudio de VAA de IL-2 (pACMV-IL2) contenía el promotor CMV (inmediato temprano), con el gen de IL-2 colocado aguas abajo del promotor (Fig. 1). Como se muestra en la Fig. 1, el plásmido testigo correspondiente, la construcción pBC12/CMV-IL2, era idéntica a pACMV-IL2, pero carecía de las repeticiones terminales (ITRs) de VAA.

Por comparación, cinco plásmidos (pACMV-IL2, pBC12/CMV-IL2, pADA-IL2, pTK-IL2, pCMV-IL2) que contienen el gen de IL-2 fueron acomplejados con liposomas y ensayados para determinar la eficacia de la transfección en las dos líneas celulares tumorales en cultivo: las líneas celulares de vejiga de rata (MBT-2) y de próstata de rata (R3327). Las líneas celulares fueron transfectadas con 10 microgramos de ADN plasmídico acomplejado con 10 nmoles de liposomas por 1 x 10^{6} células. Se recogieron sobrenadantes en el día 3 y se ensayaron para determinar los niveles de IL-2 usando un kit ELISA de IL-2.

El plásmido VAA (pACMV-IL2) indujo los niveles de expresión más altos en ambas líneas celulares (Fig. 4a). El gen de IL-2 con un promotor ADA (pADA-IL2) indujo la mínima cantidad de expresión en ambas líneas celulares. Como se muestra en la Fig. 4a, ambas construcciones de IL-2 de (promotor inmediato tardío) TK y CMV indujeron niveles de expresión de IL-2 comparables en ambas líneas celulares. Sin embargo, el plásmido pBC12/CMV-IL2, que contenía el promotor inmediato temprano de CMV mostró niveles de expresión génica más altos en la línea celular de próstata cuando se comparó con la línea celular de vejiga. Entre los plásmidos ensayados, el plásmido de estudio de IL-2 de VAA indujo los niveles de expresión más altos en ambas líneas celulares, con un nivel significativo de aumento observado en la línea celular de la próstata.

Las duraciones de la expresión inducida por el correspondiente plásmido de testigo (pBC12/CMV-IL2) y el plásmido de estudio de IL-2 de VAA (pACMV-IL2) en la línea celular de próstata R3327 fueron estudiadas (Fig. 4b). La expresión fue evaluada en estos cultivos hasta 30 días sin ninguna selección. Las células fueron sembradas a 1 x 10^{6}/ml y los sobrenadantes fueron recogidos para ser analizados cada 24 horas. Las células se duplicaron cada 48 horas en cultivo. Los datos en la Fig. 4b indican que, además de los niveles de expresión potenciados, la duración de la expresión duró 30 días después de la transfección con plásmido de VAA (pACMV-IL2). Notablemente, la expresión significativa continuó a través de la duración completa del período de tiempo de evaluación. Como se muestra en la Fig. 4b, ambos plásmidos indujeron niveles máximos de expresión entre el día 2 y el día 7, por el día 15 los niveles de IL-2 disminuyeron y después se mantuvieron aproximadamente a 100 pg/ml sólo en el grupo transfectado con plásmidos de VAA. Similarmente, se observaron niveles de expresión sostenidos en la línea celular de vejiga, así como con las células tumorales primarias de pulmón, de mama y de ovario, cuando se usaron para la transfección los complejos de plásmido de VAA: liposoma (datos no ilustrados en la Fig. 4b).

B. Comparación de la transfección por "lipofección" de plásmido de VAA: liposoma y transducción de VAA recombinante

Las líneas celulares de próstata y vejiga fueron transfectadas y transducidas, para determinar si la transfección óptima de VAA: liposoma era comparable a la transducción óptima del recombinante VAA. Para una transfección óptima, 10 microgramos de ADN plasmídico de VAA fueron acomplejados con 10 nmoles de liposomas por 1 x 10^{6} células en 2 ml de volumen final. Para una transducción máxima de rVAA, se añadieron 2 ml del sobrenadante viral a 1x 10^{6} células en 1 ml de medio completo. Después de 24 horas, las células fueron lavadas y se resuspendidas en medio completo recién preparado. Se recogió el sobrenadante en diversos puntos de tiempo después de la transfección y transducción.

En la línea de la próstata (Fig. 5a), la transfección indujo niveles de expresión más altos que la transducción de VAA en condiciones de ensayo (2 ml de sobrenadante viral por 1x 10^{6} células, frente a 10 \mug de ADN: 10 nmoles de liposomas). Aunque los resultados a día 3 hasta día 5 mostraron niveles aproximadamente 10-veces más altos de IL-2 con transfección, a día 20 se observaron niveles comparables en ambos grupos transfectados y transducidos.

La transducción con VAA recombinante indujo inicialmente niveles de producción de IL-2 más altos en la línea celular de vejiga como los comparados para la transfección usando liposomas (Fig. 5b). Similar a la línea celular de próstata, la transducción de la línea celular de la vejiga mostró también una reducción en los niveles de IL-2 a día 20, aunque los niveles de IL-2 a partir de la transfección aumentaron durante este período; niveles comparables de IL-2 se produjeron a partir del día 33 en ambos grupos transfectados y transducidos.

C. Transfección de células tumorales primarias usando un complejo de ADN plasmídico de VAA: liposomas

En los experimentos precedentes descritos aquí, se demostró una expresión transgénica significativa en las líneas celulares en cultivo. Para evaluar si los complejos de liposomas catiónicos: ADN plasmídico de VAA también mediaron expresión transgénica comparable en células tumorales primarias recién aisladas, células de cuatro tumores primarios diferentes fueron transfectadas con plásmido de estudio de IL-2 de VAA usando liposomas. Las células tumorales fueron cultivadas en medio RPMI-1640 suplementado con FBS 10% durante 2-3 semanas previamente a la transfección. Las células fueron puestas en placas a una concentración de 1 x 10^{6} células por ml de y transfectadas con 10 microgramos de ADN acomplejado con 10 nmoles de liposomas. Los sobrenadantes fueron recogidos a día 2 y 3.

Como se muestra en la Fig. 6, los cuatro tipos de células primarias produjeron niveles significativos de IL-2 después de la transfección. El nivel de expresión más alto se observó a día 3 durante el período de estudio de 10 días (se estudiaron muestras de pulmón y una de mama durante un período de tiempo más largo). La expresión del gen de IL-2 fue seguida en células de tumor de pulmón y en células de uno de los tumores de mama durante 25 días después de la transfección en cultivo. Los niveles a día 15 fueron equivalentes (100 pg/ml de IL-2) en ambas líneas celulares, y en las células derivadas de tumores primarios, (datos no mostrados).

D. Efecto de irradiación letal en la expresión transgénica

Para determinar el efecto de la irradiación en la expresión génica, la línea celular de próstata Fig. 7a) y células de un tumor de mama primario (Fig. 7b) fueron transfectadas y evaluadas en lo que se refiere a la expresión génica después de la irradiación letal. Ambos tipos celulares fueron transfectados usando los complejos óptimos de plásmido de VAA: liposomas. El segundo día después de la transfección, un alícuota de cada cultivo fue sometida a 6000 rad usando un irradiador de ^{60}Co, mediante el cual se suprimió la división celular, y las alícuotas fueron mantenidas después en cultivo. Una mitad de cada cultivo fue mantenida como un testigo no irradiado. Las alícuotas fueron sometidas a 6000 rad usando un irradiador ^{60}Co, mientras que el nivel de expresión de IL-2 fue aproximadamente de 300-400 pg/ml. Los sobrenadantes fueron recogidos 24, 48, 72 y 96 horas después de la irradiación, y después fueron ensayados en lo que se refiere a niveles de IL-2.

Como se muestra en la Fig. 7a-b, la irradiación letal posterior a la transfección no inhibió la expresión transgénica. Ni la línea celular de próstata ni las células tumorales primarias mostraron ningún cambio en la expresión de IL-2 después de la irradiación. Así pues, aunque se suprimió la división celular, la secreción de IL-2 no fue sensible a la irradiación. Esto es ventajoso, puesto que muchas estrategias de terapia génicas implican la liberación de genes a los linfocitos T primarios (que generalmente no se dividen en ausencia de activación) y con frecuencia no pueden ser transducidos vía infección viral.

E. Nivel de expresión del gen de \beta-D-galactosidasa mediante el uso de complejos plásmido de VAA: liposoma

Para demostrar los niveles de expresión en base a una célula, se usó el gen de \beta-D-galactosidasa para experimentos de transfección. Cada uno de los dos plásmidos de VAA \beta-gal (pATK-Bgal y pAADA-Bgal) (plásmidos obtenidos del Dr. Eli Gilboa, Universidad de Duke) fueron acomplejados con liposomas catiónicos y usados para transfección de la línea celular de próstata. Diez microgramos de ADN plasmídico de pATK-\betagal o de pAADA-\betagal fueron acomplejados con 10 nmoles de liposomas, los complejos fueron usados después para transfectar 1 x 10^{6} células en un volumen de 2 ml. A diversos puntos de tiempo, aproximadamente 5 x 10^{5} células fueron recogidas y teñidas con el sustrato fluorescente FDG y analizadas usando citometría de flujo.

La expresión transgénica máxima fue observada entre el día 7 y el día 15 (Fig. 8). Los niveles significativos de actividad \beta-gal fueron observados hasta el día 25. El análisis por citometría de flujo de las células \beta-gal positivas mostraron niveles máximos de 10 a 50% de eficacia de transfección con ambas construcciones plasmídicas. Los niveles disminuyeron hasta un 5 a 10% al día 25. El patrón de expresión y duración fue similar al de la expresión de IL-2 expuesta anteriormente.

F. Expresión transgénica inducida por complejos de plásmidos de VAA: liposomas en subpoblaciones de células T recién aisladas de sangre periférica

El efecto de los complejos de plásmido de VAA: liposoma para transfectar poblaciones de células T recién aisladas de sangre periférica humana fue examinado. El gen para la enzima cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) fue usado como el gen reportero en el plásmido pA1CMVIX-CAT (Fig. 1). Las construcciones pA1CMVIX-CAT fueron hechas usando el esqueleto de VAA (pA1) con las secuencias potenciadoras inmediatas tempranas del promotor de CMV y el gen CAT. Las subpoblaciones totales y purificadas de células T CD4^{+} y CD8^{+} fueron usadas para las transfecciones. Ambas subpoblaciones de células T (CD3 o CD5/8 seleccionados) totales y (CD4 ó CD8 seleccionados) purificadas Fig. 9a-d), así como células progenitoras CD34^{+} (Fig. 10, descrita en la Sección G. a continuación), muestran niveles significativos de expresión del gen CAT.

Las células T primarias recién aisladas de sangre periférica fueron ensayadas para determinar su expresión transgénica usando complejos de ADN plasmídico de VAA: liposomas. Los resultados de ensayos de cromatografía en capa fina para la actividad CAT de las células T CD3^{+}, células T seleccionadas por CD5/8 (total de células T), la subpoblación CD4^{+} de células T, y la subpoblación CD8^{+} de células T están representadas en la Fig. 9a-d, respectivamente.

Los linfocitos T fueron fraccionados como poblaciones CD3^{+}, ó CD5/8^{+} ó CD4^{+} ó CD8^{+} usando dispositivos AIS MicroCELLector. Las células relevantes fueron capturadas y las células no adherentes fueron retiradas mediante lavado. Las células adherentes fueron retiradas de los dispositivos después de 2 días en cultivo con RPMI-1640 y FBS10%. De cinco a 10 x 10^{6} células fueron puestas en placas y transfectadas con 50 microgramos de ADN plasmídico de VAA y 50 ó 100 nmoles de liposomas para obtener proporciones 1:1 ó 1:2 de ADN:liposoma. Las células fueron recogidas 3 días después de la transfección y los extractos celulares fueron normalizados por contenido de proteína y se midió la actividad CAT usando un ensayo cromatográfico. La sangre fue obtenida de los donantes a los que se hace referencia como A ó B. Se usó sangre periférica del donante A ó B para aislar células T, y para transfección.

Como se representa en la Fig. 9a-d, la composición lipídica de los liposomas que comprenden VAA se varió, como lo fue la relación de ADN a liposoma. En el estudio de de células T CD3^{+} (Fig. 9a) se emplearon células de uno de los donantes (donante A). Para los estudios de células T seleccionadas por CD5/8 (Fig. 9b), la subpoblación de células T CD4^{+} (Fig. 9c), la subpoblación de células T CD8^{+} (Fig. 9d), y células progenitoras CD34^{+} (Fig. 10), descritas a continuación, se usaron células derivadas de dos pacientes (donante A y donante B).

TABLA 2

2

TABLA 3

3

Para los estudios descritos en la Fig. 9a-d, se observaron niveles de expresión máximos a días 2 y 3 en ambas subpoblaciones totales y purificadas. Se detectaron niveles significativos de expresión a partir del día 14. Las células fueron recogidas 3 días después de la transfección, y se analizó el contenido de proteína normalizado para cada extracto para determinar la actividad CAT. La misma composición de liposoma, y la relación de ADN a liposoma indujo niveles de expresión similares en todas las poblaciones.

G. Expresión transgénica inducida por el complejo plásmido de VAA: liposoma en células progenitoras CD34^{+} recién aisladas

Se examinó el efecto del complejo plásmido de VAA: liposoma para transfectar células progenitoras CD34^{+} recién aisladas de sangre periférica humana. Se usó el gen para la enzima cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) como el gen reportero en el plásmido pA1CMVIX-CAT (Fig. 1). Las construcciones pA1CMVIX-CAT fueron hechas, como se describe anteriormente. El nivel de expresión de CAT como se determina por cromatografía en capa fina de las células progenitoras CD34^{+} se expone en la Fig. 10.

TABLA 4

4

Las células progenitoras de sangre periférica CD34^{+} recién aisladas fueron transfectadas con complejos de ADN plasmídico de CAT de VAA: liposomas. Las células CD34^{+} fueron purificadas de sangre periférica usando AIS CD34 MicroCELLector después de quitar esencialmente todas las células T usando el dispositivo CD5/8 MicroCELLector. Las células progenitoras fueron retiradas del dispositivo y 0,5-1 x 10^{6} células fueron transfectadas con complejos que comprendían 10 microgramos de ADN plasmídico y 10 nmoles de liposoma. Las células transfectadas fueron cultivadas con medio que contenía factor de células progenitoras, IL-3 e IL-1. A día 3 y día 7, las células fueron recogidas y se hicieron los extractos. El contenido de proteína normalizado del extracto fue ensayado para determinar la actividad CAT. Como se muestra en la Fig. 10., había niveles significativos de expresión de gen CAT en las células progenitoras CD34^{+} de sangre periférica.

H. Estudios de integración

La Fig. 11a-b ilustra análisis por Southern de quimioluminiscencia potenciada (ECL) del ADN genómico de los clones estables (clones estables al menos hasta después del día 30) que fueron transfectados con complejos de ADN plasmídico de VAA: liposoma de acuerdo con el invento. El ADN genómico fue aislado y analizado usando el sistema de detección y marcaje de ácidos nucleicos directo ECL (Amersham). La sonda de IL-2 fue preparada a partir de 0,685 kb del gen de IL-2 del pACMV-IL2. Después de la hibridación, se lavó la membrana dos veces en 0,5x SSC/SDS 0,4% a 55ºC durante 10 minutos y dos veces en 2x SSC a temperatura ambiente durante 5 minutos.

En la Fig. 11a, las muestras fueron digeridas con Bam HI y Hind III e hibridadas con la sonda de IL-2. Como se muestra en la Fig. 11a, todos los clones mostraron la presencia del gen de IL-2, como se demostró por la banda de 0,685 kb en ADN genómico digerido con Bam HI y Hind III.

Para los datos en la Fig. 11, las muestras fueron digeridas con Bam HI e hibridadas con el gen de IL-2. De nuevo, todos los clones mostraron la integración del gen de IL-2. (Fig. 11b) En la Fig. 11b, la integración de IL-2 fue demostrada por las bandas de alto peso molecular (entre 1,6 y 2 kb), bandas que son consistentes con la integración del gen junto con material genómico hospedante unido obtenido por la vía de la digestión. Los datos en la Fig. 11b indican que había más de un sitio de integración, puesto que había múltiples bandas de alto peso molecular en el ADN genómico digerido con Bam HI. Además, el sitio de integración se mostró que estaba en sitios distintos en diferentes clones, como se demostró por las bandas de distintos tamaños en los clones digeridos (Fig. 11b).

La Fig. 12a-b representa los análisis de ADN cromosómico, usando un ensayo de Southern de ^{32}P, de los dos clones obtenidos del presente estudio. Se aisló ADN nuclear de los dos clones de IL-2 (1A11 y 1B11) usando el protocolo Hirt de fraccionamiento. Como un testigo negativo, el ADN total fue aislado de células sin transfectar de la línea celular R3327. Después de la digestión por enzimas de restricción, 10 microgramos de cada muestra, junto con los plásmidos testigo apropiados, fueron cargados en un gel de agarosa 1%, sometidos a electroforesis, desnaturalizados y transferidos a una membrana Hybond+. Los filtros fueron hibridados durante toda la noche a 68ºC con fragmentos de ADN marcados con ^{32}P usando cebadores aleatorios. Las membranas fueron lavadas después a 68ºC durante 2 x 30 minutos cada una, con 2x SSC, SDS 0,1% y 0,2x SSC, SDS0 1%. Los autorradiogramas de estos filtros fueron expuestos sobre película de rayos X.

En la Fig. 12a, el gen IL-2 fue de nuevo usado como sonda. Así, después de la transferencia por Southern, el filtro representado en la Fig. 12a fue hibridado con un fragmento Bam HI/Hind III de 0,68 kb de IL2 de pACMV-IL2. Los datos en la Fig. 12a indican que el número de copias del gen de IL-2 que se integró en un clón, varió de clón a clón; este hallazgo fue demostrado por las diversas densidades de la banda de 0,685 kb en las digestiones (como se especificó en la breve descripción de los dibujos) de células de los dos clones. Por otro lado, se demostraron también otras bandas de peso molecular más alto, que es consistente con la integración del gen de IL-2, junto con material genómico hospedante obtenido de los diversos protocolos de digestión.

Para los datos mostrados en la Fig. 12b, el filtro fue hibridado con un fragmento pvuII/HindIII de 0,85 kb (VAA ITR/CMV) del plásmido pACMV-IL2. Los datos en la Fig. 12b indican la presencia del VAA ITR derecho, como se demuestra por la banda de 0,8 kb en el ADN cromosomal digerido con smaI y pvuII. La presencia del ITR de VAA izquierdo en un clón (clón A) fue demostrado por la banda de 2,1 kb en el ADN cromosomal digerido de smaI y pvuII.

III. Ejemplos

Un método de acuerdo con el invento, que utiliza liposomas que comprenden material viral de VAA, es usado para liberar genes para citoquinas, moléculas coestimuladoras tales como B7, y moléculas que tienen antígenos MHC de clase I en una amplia variedad de tipos celulares. Por ejemplo, tal material genómico puede ser liberado en células tumorales primarias o líneas celulares tumorales para proporcionar vacunas frente a tumores; en células de sangre periférica o de médula ósea para tratar estados hematológicos o neoplásicos.

Un método de acuerdo con el invento, que comprende el uso de liposomas que contienen material viral de VAA, es usado para liberar y expresar genes para sustancias tales como péptidos, oligonucleótidos antisentido, y ARN. Tras la expresión de tales péptidos, oligonucleótidos antisentido y ARN, la respuesta inmune de un sujeto se modula. La modulación de la respuesta inmune es bien la de inducir la respuesta inmune o inhibir la respuesta inmune. Consecuentemente, la infección por VIH es tratada usando oligonucleótidos antisentido, ARN o ribozimas que han sido expresadas mediante un método de acuerdo con el invento. Adicionalmente, la respuesta inmunológica a un tumor es modulada por el uso de péptidos o ARN expresados de acuerdo con el invento. La respuesta inmune de un paciente se modula de modo que responda a antígenos específicos de tumores y/o asociados a tumores. Consecuentemente, tumores no inmunogénicos son modificados a tumores inmunogénicos que inducen una respuesta por células T citolíticas, tanto in vivo como in vitro.

Un método de acuerdo con el invento es usado para liberar genes a células linfoides primarias, tales como células B o células T. Un método alternativo de acuerdo con el invento es usado para libera material genético a células progenitoras CD34+. Consecuentemente, los genes son expresados y son usados en terapia para estados tales como infección por HIV, estados de defecto genético, neoplasias, y estados autoinmunes, en los que se desea la expresión de un gen de interés, como es apreciado por un profesional con experiencia común en la técnica. Por ejemplo, para un estado neoplásico maligno, el gen MDR I se libera de acuerdo con el invento, se expresa, y tiene efecto
terapéutico.

En un ejemplo adicional, las células CD8+ son seleccionadas con AIS MicroCELLectors. La materia fuente para las células CD8+ es sangre periférica para pacientes de VIH, y muestras de tumores de pacientes con neoplasias. Las células T se activan después según los métodos conocidos en la técnica, tales como mediante el uso de fitohemaglutinina (PHA). Las células activadas son hechas crecer durante 20 días. Después, las células son transfectadas de acuerdo con el invento con complejos VAA: liposomas que comprenden material genómico de IL-2. Las células transfectadas son devueltas al paciente. Así, la administración subsiguiente de IL-2 a un paciente para mantener su actividad de células T citotóxicas se reduce. Ventajosamente, el gen de IL-2, administrado de acuerdo con el invento, permite cantidades reducidas de IL-2 para ser proporcionadas de modo sistémico a un paciente. Reduciendo la cantidad de IL-2 que se administra sistémicamente es ventajoso, puesto que la IL-2 administrada sistémicamente se asocia con toxicidad letal relativa a la dosis.

A. Vacunación frente a tumores

Típicamente, los protocolos de vacunación frente a tumores emplean células neoplásicas no proliferantes. La proliferación de células neoplásicas se impide exponiendo las células a radiación, o sometiendo a las células a cámaras de alta presión. Se cree que cuando las células neoplásicas están presentes en el cuerpo, aparte de una concentración tumoral inicial o focos, el cuerpo es capaz de lanzar una respuesta antitumoral eficaz.

Algunos ensayos de vacunación tumoral han usado tumores modificados genéticamente (GMT) para pacientes con melanoma y cáncer de células renales, para potenciar la antigenicidad de las células tumorales; estos ensayos han dependido de transferencia génica retroviral ex vivo. La transferencia génica retroviral ex vivo tiene las desventajas que es un método muy complejo para realizar, y que debe haber una división de la célula diana activa para lograr la incorporación y expresión de los genes liberados. Por otro lado, puede ser muy difícil cultivar ex vivo suficientes células neoplásicas para proporcionar una cantidad adecuada de producto terapéutico.

Al contrario que para la transferencia génica retroviral, las construcciones plasmídicas, que poseen los elementos de repetición terminal de virus asociados a adenovirus (VAA) en localizaciones 3' y 5' al gen que ha de ser transducido, fueron expresadas eficazmente cuando se introdujeron vía transferencia no viral mediada por liposomas. Por ejemplo, como se trata en mayor detalle a continuación, los liposomas fueron usados para liberar plásmido de VAA, tal como pMP6-IL2, que comprende cADN para la interleuquina-2 en células tumorales humanas primarias, tales como células de melanoma. Las células tumorales primaras después expresaron subsiguientemente interleuquina-2. Las líneas celulares tumorales fueron también transfectadas de modo eficaz.

La expresión de IL-2 obtenida mediante el uso de transfección de VAA-liposoma ha sido duradera, y de niveles altos. Los niveles de secreción de citoquinas a partir de células modificadas genéticamente mediante composiciones de plásmido de VAA-liposoma han excedido los niveles obtenidos a partir de células infectadas de modo retroviral.

Consiguientemente, las células son modificadas genéticamente mediante el uso de una composición que comprende plásmido de VAA y liposomas; estas células modificadas genéticamente son utilizadas en regímenes de vacunación tumoral terapéuticos. Ventajosamente, la modificación génica mediante el uso de una composición que comprende el plásmido de VAA y liposomas permitió modificar a las células tumorales primarias, obviando de ese modo la necesidad general de establecer una línea celular tumoral de células tumorales primarias para afectar la modificación genética como ser requería previamente a la presente descripción. Es también altamente ventajoso que las células tumorales que son modificadas genéticamente y que expresan IL-2 no necesiten ser administradas junto con IL-2 sistémica: Se conoce que la IL-2 sistémica induce efectos secundarios extremadamente graves, incluso fatales.

B. Lipofección de células con ADN transgénico para usar en administración terapéutica

La IL-2 sistémica es un tratamiento actual para ciertos estados graves tales como neoplasias malignas. Adicionalmente, las células T activadas se vuelven dependientes de IL-2 exógena para el crecimiento y supervivencia tanto in vitro como in vivo. Cuando se retira el estímulo de IL-2, las células T sufren apoptosis (fragmentación del ADN) en unos pocos días. La IL-2 administrada sistémicamente, sin embargo, se conoce que causa efectos secundarios graves, incluyendo la muerte. No hay una necesidad por lo tanto, de desarrollar terapias que eliminan o disminuyen la necesidad de administración de IL-2 sistémica.

Los estudios representados por los siguientes datos abordan el transporte en células T de ADN plasmídico de VAA y el ADN transgénico mediante un sistema que no implica la transducción viral. Más particularmente, los presentes datos se refieren a la transfección, y utilizan el elegante sistema vehículo de la lipofección y la hábil capacidad de transducción de las construcciones plasmídicas de VAA.

Consiguientemente, los plásmidos VAA que contienen el transgen y las repeticiones terminales de VAA fueron usados como un vector ADN, y los liposomas catiónicos fueron usados como moléculas vehículo. (Para una discusión general de la transfección y expresión en linfocitos T, véase, Philip, R. y otros, Mol. Cell. Biol. (1994) 14 (4): 2411-2418.) En una realización preferida, el transgen es para IL-2. Los complejos plásmido de VAA: liposomas indujeron niveles de expresión del transgen comparables a los niveles obtenidos mediante transducción de VAA recombinante. Ventajosamente, los liposomas catiónicos facilitaron la entrada del ADN plasmídico de VAA en células en ausencia de transcomplementación por rep y capsid, virus recombinante o VAA silvestre. Los complejos ADN plasmídico de VAA: liposomas transfectaron eficazmente las células TIL. El ADN plasmídico de VAA acomplejado con liposomas proporcionó niveles de expresión varias veces superiores que los complejos con plásmidos estándar. Por otro lado, la expresión duró durante un período de 30 días sin ninguna selección.

El sistema de expresión del gen de la IL-2 para células T descrito aquí permite a las células activadas producir suficiente IL-2 endógena para sostener su mantenimiento in vivo; de esa manera la apoptosis se evita y no hay necesidad de administrar IL-2 sistémicamente.

En un estudio controlado, diversas poblaciones de células T fueron transfectadas con un plásmido de VAA, que lleva el cADN de IL-2 acomplejado con liposomas; estas poblaciones fueron ensayadas en lo que refiere a su capacidad para mantener el crecimiento y proliferación sin IL-2 exógena in vitro.

Para las células T, los ensayos mostraron que cuando se transfectan con el gen de la IL-2, las células T CD8+ primarias y activadas proliferan hasta niveles superiores que el de los testigos transfectados con genes irrelevantes.

Los niveles de crecimiento de las células CD8+ transfectadas con IL-2 fueron mantenidas sin IL-2 exógena y la apoptosis fue significativamente reducida. Los análisis por transferencia Southern sobre estas células T transfectadas mostraron la presencia del plásmido de IL-2 hasta 25 días. Los presentes datos demostraron que la transferencia del gen de la IL-2 en células CD8+ activadas y expandidas ex vivo sostuvo el crecimiento de tales células, e impidió la apoptosis sin ninguna IL-2 exógena.

Las células que pueden ser modificadas genéticamente incluyen pero no se limitan a: carcinoma primario de pulmón, ovarios y mama; melanoma; fibroblastos autólogos; células B transformadas; células dendríticas; y células de líneas celulares. Las células modificadas genéticamente tales como éstas pueden ser usadas solas o junto con células tumorales para estimular las TIL. Se puede hacer que las células modificadas genéticamente expresen antígenos asociados a tumores (por ejemplo, HER2, k-ras, mucinas) de uso para proporcionar presentación antigénica para estimulación de TIL en cultivo. Por otro lado, las células presentadoras de antígeno, tales como células B transformadas y células dendríticas, pueden ser modificadas genéticamente y hacer que expresen péptidos antigénicos asociados a tumores tales como MAGE-1 y MART-1 para proporcionar presentación antigénica para estimulación de TIL durante el cultivo. Los presentes datos establecen la capacidad para transfectar células T y células neoplásicas con alta eficacia para expresión tanto transiente como sostenida de ADN. La transfección tuvo lugar en ausencia de ningún virus recombinante (producible a partir de partículas rep y cap cápside en células infectadas por adenovirus). Las células obtenidas mediante transfección por VAA son usadas para tratar pacientes. Los pacientes tratados con tales células obtienen notable beneficio terapéutico.

1. Preparación de reactivos y protocolos empleados a. Plásmidos i. Plásmido pACMV-IL-2

El plásmido (pACMV-IL2) contiene el gen de la interleuquina-2 humana (IL-2) como cADN de IL-2, y el elemento potenciador del promotor inmediato temprano del citomegalovirus humano (CMV), y las secuencias de preproinsulina de rata y las secuencias de poliadenilación del SV40, flanqueadas por repeticiones terminales invertidas (ITRs) del virus asociado a adenovirus a ambos extremos. Un plásmido testigo correspondiente, pBC12/CMV-IL2, fue idéntico al pACMV-IL2 pero le faltaban las repeticiones terminales del VAA, La Fig. 1 representa los mapas plasmídicos de pACMV-IL2 y pBC12/CMV-IL2.

ii. Plásmido pMP6-IL2

Como se muestra en la Fig. 2, el plásmido pMP6-IL2 es un plásmido circular de doble hebra. El plásmido pMP6-IL2 tiene el gen de la interleuquina-2 humana bajo el control de un promotor CMV y una señal de poliadenilación del SV40. Entre el promotor y las secuencias codificantes de la IL-2 hay un intrón que potencia la expresión de la IL-2. El casete de expresión completo está entre las secuencias terminales izquierda y derecha del virus asociado al adenovirus. El plásmido pMP6-IL2 también tiene el esqueleto Bluescript; el esqueleto tiene un origen de replicación bacteriano Col-E1 y un gen de resistencia a ampicilina que facilita la propagación de este plásmido en E. coli.

Las Figuras 3 a-e representan la secuencia de ADN del plásmido pMP6-IL2; los paneles de a hasta e representan porciones sucesivas de la secuencia. En la figura, las porciones de la secuencia pMP6-IL2 que corresponden a secuencias conocidas de ADN están indicadas; la información de secuencias correspondiente esta listada directamente debajo de la información de la secuencia para el plásmido pMP6-IL2. Las secuencias no marcadas son de los sitios de unión.

Los plásmidos pMP6-IL2 fueron purificados mediante lisis alcalina y precipitación con acetato amónico. La concentración de ácidos nucleicos fue determinada mediante absorción por UV a 260 nm.

iii. Plásmido pAICMVIX-CAT

El plásmido pAICMVIX-CAT contiene el elemento potenciador del promotor CMV, las secuencias aceptoras de corte y empalme que intervienen, el gen de la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) bacteriana y la señal de poliadenilación tardía del virus 540 de simio flanqueada por las repeticiones terminales de VAA en un derivado de pBR 322.

Los plásmidos fueron purificados mediante lisis alcalina y precipitación con acetato amónico. La concentración de ácidos nucleicos fue medida mediante absorción de UV a 260 nm.

b. Preparación de liposomas i. Liposomas usados con pACMV-IL-2

Los liposomas pequeños unilamelares fueron preparados a partir de lípidos catiónicos, bromuro de dioctadecil-dimetilamonio (DDAB) (Sigma), en combinación con el lípido neutro, dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE) (Avanti Polar Lipids). Los lípidos fuero disueltos en cloroformo. El DDAB fue mezclado con DOPE en una relación molar 1:1 en un frasco de fondo redondo. La mezcla de lípidos fue secada en un evaporador rotatorio. La película lipídica fue rehidratada añadiendo agua doble destilada estéril para dar una concentración final de DDAB 1 mM. Esta disolución fue sonicada en un sonicador de baño (Laboratory Supplies, Hicksville, NY) hasta que se aclaró. Los liposomas fueron almacenados a 4ºC en atmósfera de argón.

ii. Liposomas usados con pMP6-IL2

Los liposomas fueron preparados combinando el lípido catiónico bromuro de dioctadecil-dimetilamonio (DDAB) con el lípido neutro dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE) en una relación molar 1:1, o combinando DDAB con colesterol en una relación molar 1:0,6, y evaporando los lípidos hasta secarlos en un evaporador rotatorio. Los lípidos fueron resuspendidos en agua desionizada estéril para dar una concentración de DDAB 1 mM y después sonicados hasta aclarar la disolución en un baño de ultrasonidos. Los liposomas fueron almacenados en atmósfera de argón a 4ºC; y, fueron estables durante al menos 4 meses.

iii. Liposomas usados en estimulación de células TIL

Los liposomas fueron preparados combinando los lípidos catiónicos (DDAB) con bien el lípido neutro (DOPE) o bien colesterol en una relación molar 1:1 ó 1:2 y evaporando los lípidos hasta secarlos en un evaporador rotatorio. Los lípidos fueron resuspendidos en agua desionizada estéril para dar una concentración de DDAB 1 mM. La disolución fue después sonicada hasta aclarar la disolución en un baño de ultrasonidos. Los liposomas fueron almacenados en atmósfera de argón a 4ºC y fueron estables durante al menos 4 meses.

c. Preparación celular i. Aislamiento de células TIL

Las células TIL fueron seleccionadas con AIS MicroCELLectors®. La materia fuente fueron muestras de tumores o del sistema linfático tomadas de pacientes con una neoplasia. Las células T fueron después activadas según los métodos conocidos en la técnica, tales como usando IL-2. Las células activadas fueron hechas crecer durante 20 días.

ii. Aislamiento de células T y células neoplásicas

Las poblaciones de células T primarias fueron aisladas a partir de células mononucleadas de sangre periférica, y células TIL y células tumorales fueron aisladas mediante el uso de dispositivos del sujeto (Microcellector®, Applied immune Sciences). Las células fueron preparadas para transfección según metodologías estándar.

1) Células neoplásicas de una fuente de tejido sólido

Para obtener una población celular que será transfectada, las células fueron obtenidas a partir de lesiones primarias o metastáticas sólidas, o a partir de tejidos del sistema linfático. Por ejemplo, las biopsias de tumores de mama fueron obtenidas de pacientes sometidos a cirugía con un diagnóstico preoperatorio de sospechas de que no va a responder o cáncer de mama recurrente. Estos estudios fueron también realizados con éxito con células de tumores de ovarios. Los núcleos tisulares de la biopsia fueron divididos con fragmentos procesados para patología de rutina mediante microscopía óptica y análisis inmunohistoquímicos.

Consecuentemente, los tumores recién escindidos fueron cortados en cubos de 0,5 cm. Hasta 10 cubos de tumores fueron transferidos a un frasco rotatorio de 25 ml que contenía 25 ml de medio AIM V (GIBCO). El frasco fue colocado en un incubador a 37ºC que contenía CO_{2} 5%; el frasco fue agitado suavemente a 100- 120 RPM durante un período de 12-18 h. Después de la incubación, cualquier tejido que no estuviera disgregado fue filtrado, y después las células en suspensión fueron precipitadas. Las células de cáncer de mama precipitadas fueron colocadas en frascos de cultivo tisular (Falcon) en medio AIM V. las células fueron mantenidas en aire humidificado que contenía CO_{2} 5%, a una temperatura de 37ºC.

Después de 48 horas de cultivo en el medio libre de suero, las líneas celulares adherentes y no adherentes fueron generadas aspirando las células no adherentes. Las células no adherentes fueron lavadas y después vueltas a cultivara en un frasco nuevo. Durante el recultivo, las células adherentes fueron hechas crecer hasta confluencia, tripsinizadas con tripsina 0,05% y EDTA 0,02%, y hechas un pase a alta densidad en frascos nuevos.

Alternativamente, las células tumorales primarias de origen pulmonar, de ovario y mama fueron obtenidas a partir de muestras tumorales sólidas y aisladas como sigue: el tumor fue picado y sometido a digestión enzimática durante 2 horas. El tejido fue después homogeneizado y lavado con PBS. Los linfocitos fueron separados de células no linfoides mediante captura en dispositivos AIS MicroCELLector-CD5/8. La población no adherente que contenía células tumorales que fueron cultivadas en RPMI 1640 + FBS 10% con L-glutamina y pen/estrept.

2) Células neoplásicas de una fuente fluida

Como una fuente alternativa para células que serán finalmente transfectadas, fluido ascítico maligno o efusiones pleurales malignas fueron usadas para aislar células neoplásicas autólogas. Consecuentemente, el líquido ascítico maligno o fluido de efusión maligno fue centrifugado, y el precipitado que contenía las células fue resuspendido en medio AIM V. Las células fueron contadas y la subpoblación linfocitaria fue deplecionada bien usando un gradiente de Ficoll en 2 etapas o usando dispositivos AIS CELLector TM CD5/CD8. La elección de usar gradiente de Ficoll o dispositivo AIS CELLector TM CD5/CD8 fue hecha en vista del número total de células, como se aprecia por un profesional con experiencia común en la técnica. El aislamiento de células neoplásicas a partir de una fuente fluida es particularmente relevante en tumores malignos tales como cáncer de ovario y de pulmón que se conoce que correlacionan con efusiones pleurales. La fracción deplecionada de células T fue potenciada en lo que se refiere a células neoplásicas.

Todas las células neoplásicas autólogas fueron caracterizadas mediante microscopia óptica, citometría de flujo y tinciones inmunohistoquímicas para ensayar al expresión de oncogenes y para establecer un índice de proliferación. Por ejemplo, para estudios en pacientes con cáncer de mama, sólo células que fueron morfológicamente células de cáncer de mama o que dieron tinción con anticuerpos específicos de cáncer de mama fueron consideradas células tumorales autólogas, y después subsiguientemente utilizadas como tales.

3) Líneas celulares

Las células de la línea celular de linfoma B murino 38C13 fueron proporcionadas por el Dr. Bernd Gansbacher (Sloan Kettering Memorial Cancer Center); línea celular de próstata de rata R3327 fueron proporcionadas por el Dr. Eli Gilboa (Universidad de Duke); y, las células de la línea celular de tumor de mama MDA-231 fueron obtenidas de la ATCC.

d. Transfección celular "Lipofección" i. Lipofección de células TIL

Para transfección de células TIL, 5-10 x 10^{6} células fueron puestas en placas en 1 ml de medio libre de suero por pocillo de una placa de 6 pocillos. 50 \mug de ADN plasmídico que comprende material genómico de IL-2 (por ejemplo, pMP6-IL2) fueron mezclados con 50 nmoles de DDAB (como los liposomas compuestos de DDAB y DOPE en una relación molar de 1:1). Se añadió medio libre de suero (0,5 ml) al complejo de VAA: liposomas. El complejo de VAA: liposomas y el medio libre de suero fueron entonces colocados con las células. Para efectuar la lipofección, las células fueron incubadas a temperatura ambiente durante 5 minutos, después se añadió suero bovino fetal a las células para dar una concentración final de 5% de suero bovino fetal.

Las células TIL transfectadas son devueltas al paciente. Estas células proporcionan los beneficios terapéuticos de células TIL citotóxicas en combinación con IL-2. Ventajosamente, la necesidad de administrar sistémicamente IL-2 a un paciente para mantener la actividad de células T citotóxicas se reduce o elimina. Una reducción en la cantidad de IL-2 administrada sistémicamente es ventajosa puesto que la IL-2 administrada de esta manera se conoce que correlaciona con una toxicidad relativa a la dosis potencialmente letal.

ii. Lipofección en células neoplásicas

Un cultivo de células neoplásicas, tal como un cultivo de células de cáncer de mama o células tumorales de ovario, fue transfectado de la siguiente manera: las células neoplásicas (1 x 10^{6} células) fueron transfectadas con 5 microgramos de ADN plasmídico (por ejemplo, pMP6-IL2) mezclado con 30 nmoles de lípido total, en los que el lípido comprende liposomas compuestos de DDAB y DOPE en una relación molar 1:1. Un ml de medio AIM V fue añadido al complejo liposoma-ADN, y fue incubado a temperatura ambiente durante 30 minutos. La combinación del medio y el complejo liposoma-ADN fue después transferida a las células. Las células fueron después incubadas a 37ºC durante 24 horas. Después de 24 horas, las células fueron irradiadas letalmente (10.000 RADS).

Alternativamente, los complejos ADN-liposoma fueron formados mediante el siguiente método: la cantidad deseada de ADN fue transferida a un vial estéril y uno o 2 nmoles de DDAB por \mug de ADN fueron añadidos y mezclados. Después, 1 ml de medio libre de suero fue añadido al complejo liposoma-ADN. Todas las células que habían de ser transfectadas fueron puestas en placas de seis pocillos. Las células tumorales primarias y líneas celulares de tumores fueron puestas en placas a 1 x 10^{6} células por pocillo en 2 ml de medio libre de suero. El complejo liposoma-ADN fue añadido a las células e incubado durante 5 min a temperatura ambiente. El FBS fue añadido para llevar la concentración final a 10%.

e. Ensayo de expresión del transgen i. Ensayos extracelulares

La expresión del transgen fue documentada ensayando la expresión del IL-2 por células irradiadas letalmente; estos ensayos de IL-2 pueden ser mediante ensayo ELISA, de acuerdo con información conocida para aquellos con experiencia común en la técnica.

Los sobrenadantes libres de células fueron recogidos y su concentración de IL-2 fue determinada mediante ELISA a diversos tiempos. Por ejemplo, los ensayos de IL-2 fueron realizados en sobrenadantes de 72 horas, en duplicado. Se definió como exitosa una transfección de células modificadas genéticamente en la que se obtuvieron concentraciones de IL-2 de 100 pg/72h/10^{6} células.

ii. Ensayos intracelulares

Las células fueron recogidas a diversos puntos de tiempo, lavadas con PBS y resuspendidas en paraformaldehído frío 1% en PBS. Después de 10 minutos a 4ºC, las células fueron lavadas con tampón de saponina frío (saponina 0,1%, FBS 10% en PBS) y teñidas con anticuerpo de ratón anti IL-2 humana durante 15 minutos a 4ºC. Las células fueron después lavadas con tampón de saponina frío y teñidas con anticuerpo de cabra anti F(ab')2 de ratón conjugado con FITC durante 15 minutos, a 4ºC. Las células fueron lavadas con saponina, después con PBS y analizadas mediante citometría de flujo.

f. Hibridación por Southern para ADN de IL-2

El ADN cromosomal fue aislado mediante fraccionamiento por HIRT. Después de digestiones por restricción, se sometió a electroforesis a 5 \mug de ADN por muestra, transferidos a membranas de nilón Hybond N+ e hibridadas con el fragmento de 0,685 kb de IL-2.

g. Ensayo de citotoxicidad

Las células diana fueron marcadas con 100 \muCi de ^{51}Cr por 1 x 10^{6} células. 5000 células diana fueron puestas en placas en triplicado en placas de 96 pocillos. Las células efectoras fueron añadidas para dar una relación efector a diana de 20:1. 100 \mul de sobrenadante de cada pocillo fueron recogidos después de una incubación de 4 horas, y contadas en un contador \gamma.

h. Ensayo de proliferación

Para ensayar la proliferación, 5 x 10^{4} células en 100 \mul de medio AIM V fueron puestas en placas en triplicado en placas de 96 pocillos. A cada pocillo se añadió un pulso de 1.\muCi de ^{3}H-timidina. Las células fueron recogidas 24 horas más tarde y contadas con un contador de centelleo.

i. Análisis de TCR

Las células TIL fueron congeladas a diversos puntos de tiempo en cultivo y después de experimentos de estimulación. La restricción por TCR fue analizada mediante PCR de transcriptasa inversa de acuerdo con metodologías conocidas en la técnica.

2. Datos y hallazgos resultantes a. Activación ex vivo de CTL específicas de tumores; estimulación de células TIL durante el cultivo

La estimulación fue llevada a cabo con células TIL cultivadas en una relación 50:1 con tumor autólogo irradiado; o con tumor autólogo irradiado transfectado con IL-2. El período de estimulación fue de 5-7 días. Estas células fueron comparadas con las células TIL cultivadas en medio AIM V suplementado con rIL-2 600 UI/ml. Las células fueron ensayadas después de estimulación para determinar cambios en fenotipo, actividad citotóxica, proliferación y repertorio de TCR. Este método simple y rápido de estimular células TIL durante el cultivo se utiliza para protocolos de transferencia génica tanto in vitro como in vivo.

Como medios alternativos para estimular células TIL en cultivo, se pueden añadir péptidos antigénicos asociados a tumores directamente al cultivo de TIL.

i. Estimulación de TIL con células neoplásicas transfectadas

Células para cultivar TIL con células neoplásicas transfectadas, se transfectaron células neoplásicas, por ejemplo, con pMP6-IL2, y se irradiaron. Veinticuatro horas después de la irradiación, las células transfectadas fueron lavadas, recogidas por tripsinización, precipitadas por centrifugación, y resuspendidas en medio de cultivo. Las células neoplásicas transfectadas e irradiadas se cultivaron después con TIL.

La especificidad del tumor fue conservada por las TIL durante el cultivo y expansión.

Consiguientemente, las células tumorales (tanto autólogas como alogénicas unidas al HLA) fueron usadas para reestimular las TIL seleccionadas durante la fase de expansión. Esto es de un valor significativo porque se conoce que a veces la especificidad de las células T por sus dianas disminuye durante el curso de la expansión.

Así, las propias células tumorales fueron genéticamente modificadas, por ejemplo con una composición que comprende liposoma y pMP6-IL2, para incrementar más su antigenicidad.

El cultivo de larga duración de las TIL induce a menudo una expansión policlonal, con una disminución de la especificidad tumoral mediante las células expandidas. Como se muestra en la Fig. 13, cuando las células TIL expandidas fueron estimuladas con tumor autólogo, la especificidad fue potenciada. La especificidad de las TIL estimuladas con tumor transducido con IL-2 fue mayor que con tumor sin modificar como se evaluó por los repertorios de TCR. La especificidad potenciada de las TIL cultivadas/estimuladas con tumor transfectado fue particularmente notable por los datos obtenidos después de 30 días de cultivo.

Los datos demostraron que los liposomas catiónicos acomplejados con un plásmido de VAA eficazmente transfectado a células tumorales primarias así como a líneas celulares tumorales cultivadas. Hasta un 50% de las células transfectadas expresaron IL-2 como se evaluó por los niveles IL-2 intracelular, y la duración de la expresión fue hasta 30 días. La irradiación de las células tumorales después de la transfección no alteró los niveles de expresión transgénica.

Los análisis de TCR demostraron la expansión de células T específicas de tumores; estas células T específicas de tumores que han sido afectadas por el cultivo de las TIL expandidas en masa con tumor autólogo modificado genéticamente.

b. Proliferación de células TIL después de la transfección con el gen de IL2

Para los datos representados en la Fig. 14, células TIL de mama fueron aisladas de la efusión pleural con dispositivos CD8 del sujeto, y cultivadas durante tres semanas en un medio que contiene IL-2 600 UI/ml. Experimentos análogos fueron realizados con TIL de tumor de ovario; los resultados fueron consistentes con los resultados obtenidos con TIL de tumor de mama.

Aproximadamente 10x10^{6} células TIL fueron transfectadas con diversas composiciones que comprenden complejos ADN de pMP6-IL2: liposomas. Dos composiciones de liposomas, "RPR DDAB" (Nattermann Phospholipid GmBH, Colonia, Alemania) y "1100-28" (Applied Immune Sciences, Inc., Santa Clara, CA) fueron ensayadas. Los liposomas RPR DDAB tenían una relación DDAB: DOPE de 1:1, los liposomas 1100-28 tenían un DDAB: DOPE relación de 1:0,6. Las células TIL transfectadas fueron cultivadas después sin ninguna IL2 exógena, los testigos positivos fueron cultivados en presencia de IL-2 600 UI/ml.

Cinco días después de la transfección, los grupos transfectados y sin transfectar fueron marcados con ^{3}H timidina y evaluados para determinar la incorporación. Las cuentas de los testigos positivos fueron establecidas como el 100 por ciento. El porcentaje de crecimiento osciló entre 40-80% para los grupos transfectados con liposomas RPR DDAB, y entre 40-60% para el grupo de liposomas 1100-28.

Los datos representados en la Fig. 14 demuestran que las TIL de cáncer de mama, cuando se transfectaron con el gen de IL-2, no requirió IL-2 exógena para mantener la proliferación in vitro.

c. Expresión del gen Thy 1.2 en TIL

Para los datos ilustrados en la Fig. 15, las TIL de cáncer de mama fueron transfectadas con plásmido pMP6 que contenía el gen de resistencia a neomicina y el gen murino Thy 1.2 (pMP6/neo/Thy1.2), como una realización alternativa del plásmido pMP6 que contenía el gen de IL-2. El plásmido pMP6/neo/Thy1.2 se acomplejó a liposomas DDAB: DOPE. Las composiciones de liposoma fueron las mismas composiciones que las descritas para los datos representados en la Fig. 14. A día 2, las células transfectadas fueron teñidas con anticuerpos anti-Thy1.2 PE (Pharmingen, San Diego, CA) y analizadas mediante citometría de flujo. Como se representa en la Fig. 15, el marcador de superficie de células T de ratón Thy1.2 se expresó eficazmente en TIL CD8^{+} humanos transfectados.

d. Expresión transgénica en células de tumor de melanoma humano irradiado después de la transfección

Los siguientes datos fueron obtenidos mediante transfección de células tumorales con pMP6-IL2. Estos datos demostraron que las células tumorales fueron modificadas genéticamente con éxito. Además de DDAB: DOPE, se utilizaron también otras composiciones lipídicas. Estas composiciones lipídicas diversas produjeron con éxito lipofección y posteriormente expresión de citoquinas.

Se aislaron células de melanoma de foci metastáticos siguiendo las metodologías de digestión enzimática conocidas por los profesionales con conocimientos comunes de la técnica. Las células fueron hechas crecer en DMEM suplementado con suero de ternera fetal 5-10% y mantenidas en cultivo por un período de entre 5 días a 8 años.

En la preparación para la lipofección, las células tumorales fueron puestas en placas de 60 mm en un volumen de 5 x 10^{5} células/placa. El día siguiente a la puesta en placas, los liposomas que comprendían 10-30 nmoles de lípido catiónico y 2-10 \mug de ADN fueron mezclados y transferidos en medio libre de suero a las monocapas adherentes. Las células fueron incubadas durante 1-5 horas y se añadió FCS al medio.

Diversas preparaciones de liposomas fueron empleadas con éxito, incluyendo: DMRIE: DOPE en una relación 1:1 molar (Vical, San Diego CA); DOSPA: DOPE, relación de masa 3:1 (Gibco, Gaithersberg, MD) y DDAB: DOPE en una relación de 1:2 molar.

Las células transfectadas fueron expuestas a niveles letales de irradiación X (5000 rads) 24 horas después de la lipofección. Los sobrenadantes fueron recogidos a las 72 horas; después los niveles IL-2 fueron medidos mediante ELISA de acuerdo con la información conocida por aquellos profesionales con conocimiento común en la técnica. El nivel de expresión de IL-2 más alto obtenido con cada preparación de liposomas está listada en la Tabla 4.

Consiguientemente, altos niveles de expresión (>5.000 pg/ml) fueron detectados en células viables no proliferantes hasta 26 días después de la irradiación.

TABLA 4

5

Estos datos demuestran una transfección con éxito de líneas celulares de melanoma humano vía liberación no viral, mediada por liposomas del plásmido pMP6-IL2. La transfección dio como resultado una producción significativa de IL-2 después de irradiación letal.

e. Ensayos extracelulares de expresión transgénica en una línea celular tumoral de próstata después de transfección con diversas construcciones plasmídicas

Para comparar el nivel y duración de la expresión del transgen después de transfecciones con diferentes construcciones plasmídicas, la línea celular tumoral de próstata, R3327, fue transfectada con 10 \mug de plásmido estándar (pBC12/CMV-IL2) o 10 \mug de plásmido de VAA (pA CMV-IL2) acomplejado a 10 nmoles de DDAB como liposomas DDAB: DOPE 1:2.

Los sobrenadantes fueron recogidos a diversos puntos de tiempo y ensayados mediante ELISA para determinar los niveles de IL-2. Para los datos mostrados en la Fig. 10, los niveles de IL-2 fueron expresados como pg/ml/10^{6} células en 24 horas de cultivo. La transfección con el plásmido de VAA produjo niveles de IL-2 significativamente más altos que con el plásmido estándar. Además, la transfección con el plásmido VAA causó la producción de IL-2 durante al menos 30 días, al contrario que sólo 7 días con el plásmido de IL-2 estándar.

La Fig. 17 representa el análisis por transferencia Southern de ADN cromosomal de células R3327 transfectadas con un plásmido de VAA (pACMV-IL2) o el plásmido estándar (pBC12/CMV-IL2). La transferencia fue hibridada con el fragmento Bam HI/Hind III de 0,685 kb del gen de la IL-2. En la Fig. 17, el testigo (C) es un ADN de células sin transfectar. El inserto de IL-2 se muestra en el último carril.

f. Ensayos intracelulares de la expresión transgénica en una línea celular de tumor de próstata después de la transfección con las construcciones plasmídicas de VAA

La línea celular de próstata R3327 fue transfectada con el plásmido de IL-2 de VAA (tal como pACMV-IL2) acomplejado con liposomas DDAB: DOPE; los liposomas en una relación de composición DDAB:DOPE 1:1 ó 1:2. La relación ADN: liposoma fue de 10 \mug de ADN: 10 nmoles DDAB en ambos grupos.

Las células transfectadas fueron teñidas a diversos puntos de tiempo para determinar lo niveles de proteína IL-2 usando un procedimiento de citometría de flujo modificado como se describe aquí; los resultados se muestran en la Fig. 18. Los datos en la Fig. 18 se representan como porcentaje de células positivas que expresan la proteína IL-2. Las células sin transfectar fueron usadas como testigos negativos y los valores de los testigos fueron restados de los valores de los grupos transfectados.

g. Expresión transgénica en células tumorales primarias

Los complejos de plásmido de VAA-liposoma fueron empleados para transfectar diversas células tumorales primarias. Una muestra de tumor de pulmón, una de ovario, y dos de tumores de mama fueron aisladas a partir de biopsias tumorales recientes. Las células tumorales fueron cultivadas en medio RPMI-1640 suplementado con FBS 10% durante 2-3 semanas previamente a la transfección.

Las células tumorales primarias fueron transfectadas con 10 \mug de plásmido (tal como pACMV-IL2) acomplejadas con 10 nmoles de DDAB como DDAB: DOPE 1:1. Los sobrenadantes fueron recogidos a día 2 y 3. Los niveles de IL-2 fueron medidos mediante ELISA; los resultados se representan en la Fig. 6 en la que los niveles de IL-2 se expresan como pg/ml/10^{6} células en 24 horas de cultivo.

h. La expresión transgénica después de irradiación de células de tumor primario de mama y células de líneas celulares de tumor de próstata

Para determinar el efecto de la irradiación en la expresión génica, las células de tumor primario de mama y células de una línea celular de próstata (R3327) fueron transfectadas con una composición que comprende pACMV-IL2 y complejos de liposomas DDAB: DOPE, y ensayadas para la expresión génica posterior a irradiación letal. Los datos para la línea celular tumoral se muestran en la Fig. 19A, y los datos para las células tumorales primarias están en la Fig. 19B. En estos estudios, el transgen fue para IL-2. A día 2, una alícuota de las células fue sometida a 6000r usando un irradiador de ^{60}Co y después devueltas a cultivo. Los sobrenadantes fueron recogidos a 24, 48, 72 y 96 horas después de la irradiación y ensayadas para determinar los niveles de IL-2. Como se muestra en la Fig. 19, la irradiación letal seguida de transfección no inhibe la expresión del transgen. En la Fig 19, los niveles de IL-2 están expresados como pg/ml/10^{6} células en cultivos de 24 horas.

IV. Discusión

En los presentes estudios, el plásmido de VAA que contiene el transgen y las repeticiones terminales de VAA fue usado como un vector de ADN, y los liposomas catiónicos fueron usados como moléculas vehículo. Se demostró que los complejos de ADN plasmídico de VAA: liposomas transfectaron eficazmente células tumorales primarias, líneas celulares cultivadas, células linfoides primarias, y células progenitoras CD34+. También se demostró que, en ausencia de cualquier virus recombinante (producibles a partir de partículas rep y cap cápside en células infectadas por adenovirus) la integración con niveles altos y expresión sostenida de transgen se logró mediante el proceso de transfección elegante.

Además de los altos niveles de expresión, la combinación de plásmido de VAA; los liposomas descritos aquí indujeron una expresión de los genes de larga duración (más de 30 días) (Fig. 5a-b), al contrario que con la expresión transitoria demostrada por la transfección mediada por liposomas típica. Notablemente, la expresión sostenida se demostró en el grupo lipofectado con el plásmido de VAA, así como en el grupo transducido con VAA recombinante (Figs. 5a-b). Por otro lado, se observaron niveles de expresión diez veces más altos con plásmido de VAA comparado con la transfección de plásmido estándar, como se muestra en la Fig. 4a-b.

En las condiciones de ensayo descritas aquí, no hubo diferencia en eficacia entre transducción de VAA óptima y máxima transfección con plásmido de VAA: liposoma. Acerca del transcurso en el tiempo de la expresión, se había demostrado previamente que los liposomas catiónicos mediaban sólo la expresión transitoria de ADN plasmídico estándar en tipos celulares de mamíferos (Felgner, P.L., y otros, "A highly efficient, lipid-mediated DNA transfection procedure, " Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) 84: 7413-7417; Rose, J.K., y otros, "A new cationic liposome reagent mediating nearly quantitative transfection of animal cells," Biotechniques (1991) 10: 520-525). Por otro lado, acerca de la eficacia de la integración, se observó una eficacia de integración en el genoma hospedante mucho menor en la anterior transfección mediados por liposomas comparado con los resultados descritos aquí. (Shaefer-Ridder, M., y otros, "Liposomes as gene carriers: Efficient transfection of mouse L cells by thymidine kinase gene," Science (1982) 215: 166-168). Como se muestra aquí, sin embargo, los liposomas catiónicos acomplejados con ADN plasmídico de VAA que llevan repeticiones terminales de VAA aumentaron la integración del ADN genómico, relativo al plásmido estándar que carece sólo de las repeticiones terminales (ITRs de VAA). Los liposomas que comprenden el material plasmídico de VAA liberaron el ADN plasmídico en ausencia de cualquier receptor de superficie específico de célula, y reemplazaron la función del virus en la liberación génica.

En los presentes estudios, se demostró que los vectores virales en conjunto pueden ser reemplazados por liposomas, y se alcanzó una expresión e integración eficaces al utilizar la construcción, incluyendo los elementos virales responsables de tanto la eficacia como la integración. De este modo, se evita la producción de virus para la infección, eliminando así de modo virtual la posibilidad de un evento recombinante adverso. Los resultados finales fueron llevados a cabo mediante el uso de un proceso de transfección elegante que combina el plásmido de VAA y liposomas catiónicos.

En una realización preferida, la combinación de plásmido de VAA y liposomas catiónicos no sólo transfectaron eficazmente las líneas celulares cultivadas, sino que también transfectaron las células tumorales primarias y células de sangre periférica tal como células T y células progenitoras. Estos datos son notables puesto que la mayoría de las estrategias de terapia génica implican la liberación de genes a linfocitos T primarios o células tumorales. Previamente, estas estrategias han dependido ante todo de la inserción transgénica en vectores retrovirales o vectores de virus ADN. Una desventaja fundamental del sistema retroviral se comprende que es la incapacidad de transfectar células primarias que no están dividiendo. Los presentes estudios han mostrado que los liposomas catiónicos que comprenden material de VAA mediaron la transfección de ambos tipos celulares en división y no en división. De acuerdo con el invento, el plásmido de VAA: liposoma catiónico ha proporcionado un sistema de transfección altamente eficaz que logró una expresión sostenida, de niveles altos.

Ventajosamente, los complejos de ADN plasmídico: liposoma pueden ser liberados in vivo (tal como administración intravenosa, intraperitoneal y aerosol) sin ninguna toxicidad mensurable (Philip, R., y otros, "In vivo gene delivery: Efficient transfection of T lymphocytes in adult mice," J. Biol. Chem. (1993) 268: 16087-16090; Stribling, R., y otros, "Aerosol Gene Delivery in vivo, "Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89: 11277-11281; Zhu, N., y otros, "Systemic gene expression after intravenous DNA delivery into adult mice," Science (1993) 261: 209-211; Stewart, M.J., y otros, "Gene transfer in vivo with DNA-liposome complexes: Safety and acute toxicity in mice," Human Gene Therapy (1992) 3: 267-275). De acuerdo con el invento,la concentración de ADN puede ser optimizada para obtener la máxima expresión. Así, la transferencia génica mediante el uso de liposomas que contienen material de VAA transfirieron material VAA y transgénico en una amplia variedad de tipos celulares ex vivo, y se usa también in vivo. Estos resultados presentes son de una inmensa ventaja para cualquier protocolo de terapia génica.

Por otro lado, diversos tipos celulares neoplásicos primarios, líneas celulares neoplásicas, y varias subpoblaciones de células T fueron transfectadas con plásmidos de VAA usando complejos de ADN: liposomas. Como se muestra aquí, los liposomas catiónicos facilitaron las transfecciones de plásmidos virales asociados a adenovirus (VAA) en las células. La transfección de células tumorales primarias fue muy atractiva puesto que tales células son generalmente muy difíciles de transfectar. Además de los altos niveles de expresión, el uso de plásmidos de VAA: liposomas indujo una expresión de transgen de larga duración (>30 días). Por otro lado, cuando las células T activadas y vírgenes fueron transfectadas con plásmidos de IL-2, se detectó el plásmido en las células un mínimo de 25 días después de la transfección en una condición no seleccionada. Estos descubrimientos están en contraste con la expresión de corta duración demostrada con transfección mediada por liposomas típica usando plásmidos estándares.

Por otro lado, se encontró que las TIL transfectadas con citoquina transgénica se expandían sin necesidad de citoquina exógena. Este resultado es muy ventajoso puesto que las TIL pueden ser proporcionadas a pacientes sin necesidad de tratarlos con IL-2 sistémica, superando los efectos secundarios graves del tratamiento de IL-2 sistémica.

La expresión del gen de IL-2 en las células T transfectadas alteró los efectos de la retirada de IL-2 exógena. Notablemente, las células T transfectadas con IL-2 produjeron suficiente IL-2 endógena para mantener su crecimiento y proliferación y para evitar apoptosis que tiene lugar normalmente con la retirada de IL-2 exógena de las células T efectoras como es conocido en la técnica. La dependencia de IL-2 exógena se eliminó.

Las células tumorales primarias de mama, de pulmón y de ovario fueron transfectables usando complejos de ADN plasmídico de VAA: liposomas. Las células tumorales primarias y en cultivo transfectadas fueron capaces de expresar el producto transgénico aún después de irradiación letal.

Las realizaciones de la presente descripción incluyen esas células tumorales (ambas autólogas y alogénicas unidas al HLA) pueden ser usadas para reestimular las células TIL seleccionadas durante la fase de expansión. Las células neoplásicas transfectadas se usan en protocolos de vacunación tumoral. Típicamente, las células neoplásicas transfectadas son proporcionadas juntas con un excipiente farmacéutico, y se conoce en la técnica. Las células neoplásicas transfectadas son también usadas para estimular las células TIL correspondientes durante el cultivo. Los análisis de fenotipo, citotoxicidad y receptor de células T demostraron que aunque las células TIL inicialmente mostraron especificidad de células tumorales cuando fueron aisladas de un tumor, el cultivo prolongado en rIL-2 indujo frecuentemente expansión policlonal y pérdida de especificidad tumoral. Mediante el cultivo de células TIL en un medio que comprende células neoplásicas, y más preferiblemente células neoplásicas transfectadas, la especificidad tumoral de las células TIL expandidas fue apreciablemente aumentada.

Como se usa aquí y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "a", "y", y "el/la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto dicte claramente de otra manera. Así, por ejemplo, la referencia a "una formulación" incluye mezclas de diferentes formulaciones y la referencia a "el método de tratamiento" incluye referencias a etapas equivalentes y métodos conocidos por aquellos profesionales expertos en la técnica, y así sucesivamente.

A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados aquí tienen el mismo significado como es comúnmente comprendido por un profesional con experiencia común en la técnica a la que pertenece este invento. Aunque cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos aquí pueden ser usados en la práctica o ensayo del invento, los métodos y materiales preferidos son descritos ahora.

Claims

1. Una composición para manipulación genética que comprende:

: un liposoma que comprende material lipídico; y

: ADV viral asociado a adenovirus que comprende una o más repeticiones terminales invertidas.

2. Una composición según la reivindicación 1, en la que el ADN viral asociado a adenovirus está en un plásmido.

3. Una composición según la reivindicación 2, en la que el plásmido es pMP6-IL2, como se muestra en la Figura 3, o pACMV-IL2, como se muestra en la Figura 1.

4. Una composición según cualquier reivindicación precedente, en la que el ADN viral asociado a adenovirus comprende dos repeticiones terminales invertidas.

5. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además una secuencia genética de interés.

6. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que una secuencia genética de interés está integrada entre dos repeticiones terminales invertidas.

7. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que un promotor está integrado entre dos repeticiones terminales invertidas.

8. Una composición según la reivindicación 7, en la que el promotor es un promotor inmediato temprano de CMV, un promotor inmediato tardío de CMV, un promotor temprano de CMV, un promotor ADA o un promotor TK.

9. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en la que la secuencia genética de interés comprende un gen de IL-2 o un gen \beta-gal.

10. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el material lipídico comprende un lípido catiónico.

11. Un método para introducir una secuencia genética de interés en una célula hospedante, método que comprende:

: proporcionar una composición que comprende un liposoma, un ADN viral asociado a adenovirus que comprende una o más repeticiones terminales invertidas y una secuencia genética de interés; y

: poner en contacto ex vivo la composición con una célula hospedante que comprende material genético, mediante lo cual la secuencia genética de interés se introduce en la célula hospedante.

12. Un método según la reivindicación 11, en el que la célula hospedante es una célula progenitora CD34+, una célula T, una célula de una línea celular tumoral, o una célula tumoral primaria.

13. Un método según la reivindicación 12, en el que la célula hospedante es un linfocito infiltrante en tumores, una célula CD3+, CD4+, o CD8+.

14. Un método según la reivindicación 12, en el que la célula es de una línea celular tumoral, que es una línea celular de vejiga, de próstata, de linfoma B o de riñón embrionario.

15. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en el que el liposoma comprende un lípido catiónico.

16. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, en el que la composición es como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

17. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, que comprende además la integración del material genético de interés en el material genético de la célula hospedante.

18. Una célula transfectada mediante una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o que se le ha introducido en ella una secuencia genética mediante un método según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17.

19. El uso de una composición según una cualquier de las reivindicaciones 1 a 10, o células hospedantes según la reivindicación 18, para la fabricación de un medicamento para tratar un estado seleccionado de entre un neoplasma, una infección, un estado autoinmune, o una anormalidad genética.

20. El uso según la reivindicación 19, de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10.

21. El uso según la reivindicación 20, en el que la anormalidad genética comprende un gen inexistente o defectuoso.

22. El uso según la reivindicación 20, en el que el estado es una infección por VIH.

23. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, en el que la secuencia genética de interés que codifica para un péptido, es un oligonucleótido antisentido o ARN.

24. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en el que la composición proporciona un plásmido.

25. El uso según la reivindicación 24, en el que el plásmido es pMP6-IL2, como se muestra en la Figura 3, o pACMV-IL2, como se muestra en la Figura 1.

26. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 25, en el que la secuencia genética de interés comprende una secuencia genética que codifica una citoquina, un factor coestimulador, una molécula de MHC de clase I, un antígeno específico de tumor o un antígeno asociado a tumores.

27. El uso según la reivindicación 20, en el que el estado es un estado neoplásico maligno o una infección por VIH y la secuencia genética comprende el material genómico de IL-2.

28. El uso según la reivindicación 20, en el que el estado es un estado neoplásico maligno y la secuencia genética comprende el gen MDR I.

29. El uso según la reivindicación 20, que implica poner en contacto la composición con una célula hospedante ex vivo, mediante el cual la secuencia genética de interés se introduce en la célula hospedante, y la célula hospedante es autóloga o alogénica.

30. El uso según la reivindicación 29, en el que la célula hospedante es una célula neoplásica, una célula hematopoyética de médula ósea, o una célula de sangre periférica.

31. El uso según la reivindicación 30, en el que la célula hospedante es un linfocito infiltrante en tumores, una célula de una línea celular tumoral o una célula tumoral primaria.

32. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o una célula según la reivindicación 18, para usar en un método de tratamiento del cuerpo humano.

33. Un método para producir una proteína, método que comprende:

: proporcionar una composición que comprende liposomas, ADN viral asociado a adenovirus que comprende una o más repeticiones terminales invertidas y una secuencia genética de interés;

: poner en contacto la composición con una célula hospedante, que comprende el material genético mediante el cual la secuencia genética de interés se introduce en la célula hospedante; y

: expresar una proteína codificada por la secuencia genética de interés.

34. Un método según la reivindicación 33, en el que la célula hospedante es una célula progenitora CD34+, una célula T, una célula de un línea celular tumoral, o una célula tumoral primaria.

35. Un método según la reivindicación 34, en el que la célula hospedante es un linfocito infiltrante en tumores, célula CD3+, CD4+, o CD8+.

36. Un método según la reivindicación 34, en el que la célula es de una línea celular tumoral que es una línea celular de vejiga, de próstata, de linfoma B o de riñón embrionario.

37. Un método según la reivindicación 33, en el que la composición comprende un lípido catiónico.

38. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 33 a 37, en el que el ADN viral asociado a adenovirus comprende un plásmido.

39. Un método de la reivindicación 38, en el que el plásmido es pMP6-IL2, como se muestra en la Figura 3, o pACMV-IL3, como se muestra en la Figura 1.

40. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 33 a 39, que comprende además la integración del material genético de interés en el material genético de la célula hospedante.

\newpage

41. Un método según cualquiera de las reclamaciones 33 a 40, en el que la proteína expresada es un análogo de linfoquinas.

42. Un método según la reivindicación 41, en el que la proteína es IL-2.

43. Un método según la reivindicación 40, en el que la proteína es P-galactosidasa, cloranfenicol acetiltransferasa o MDR 1.