ES2213149T3 - Liposomas asociados a adenovirus y metodos relacionados. - Google Patents
Liposomas asociados a adenovirus y metodos relacionados.Info
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Abstract
SE PRESENTA UNA COMPOSICION PARA LA MANIPULACION GENETICA QUE COMPRENDE UN LIPOSOMA QUE COMPRENDE UN MATERIAL LIPIDO, Y UN MATERIAL VIRAL ADENOASOCIADO (AAV). TIPICAMENTE, EL MATERIAL AAV ES UN PLASMIDO Y COMPRENDE UNA REPETICION DEL TERMINAL DEL GENOMA AAV. SE PRESENTAN METODOS PARA INTRODUCIR EL MATERIAL GENETICO EN EL INTERIOR DE CELULAS MEDIANTE EL USO DE LIPOSOMAS AAV. DE ESTA FORMA, EL MATERIAL GENETICO SE INTRODUJO Y SE INTEGRO EN LAS CELULAS DEL TALLO, LAS CELULAS T, LAS CELULAS TUMORALES PRIMARIAS O LAS LINEAS CELULARES TUMORALES.
Description
Liposomas asociados a adenovirus y métodos
relacionados.
El presente invento implica la manipulación
celular, más particularmente se refiere al uso de liposomas
catiónicos para facilitar la transfección mediante plásmidos virales
asociados a adenovirus (VAA).
La transfección de células eucarióticas se ha
vuelto una técnica cada vez más importante para el estudio y
desarrollo de la terapia génica. Los avances en la terapia génica
dependen en gran parte del desarrollo de sistemas de liberación
capaces de introducir eficazmente ADN en una célula diana. Un número
de métodos han sido desarrollados para la expresión estable o
transitoria de genes heterólogos en tipos celulares en cultivo.
Estos incluyen técnicas de transducción que usan una molécula
vehículo o un virus.
La mayoría de las estrategias de terapias génicas
se han basado en transducción mediante inserción transgénica en
vectores retrovirales o de virus ADN. Sin embargo, los adenovirus y
otros vectores virales de ADN pueden producir secuelas infecciosas,
pueden ser inmunogénicos después de administraciones repetidas, y
sólo pueden empaquetar una cantidad limitada de inserto de ADN.
De los sistemas de vectores virales, el sistema
de transducción viral asociado a adenovirus (VAA) recombinante ha
demostrado ser uno de los sistemas vectores más eficaces para llevar
genes de modo estable y eficaz a una variedad de tipos celulares de
mamíferos (Lebkowski, J.S., y otros,
"Adeno-associated virus: A vector system for
efficient introduction and integration of DNA into a variety of
mammalian cell types," Mol. Cell. Biol. (1988) 8:
3988-3996). Ha sido bien documentado que el ADN de
VAA se integra en el ADN celular como una a siete copias en tandem
unidas a ADN celular a través de repeticiones terminales invertidas
(ITR) del ADN viral, y que la estructura física de los genomas de
VAA integrados sugieren que las inserciones virales aparecen
normalmente como múltiples copias con una repetición en tandem con
orientación cabeza a cola vía las repeticiones terminales de VAA
(Kotin, R.M. y otros, "Site-specific integration
of adeno-associated virus", Proc. Natl. Acad.
Sci. (1990) 87: 2211-2215). Así, las
repeticiones terminales (ITR) de VAA son una parte esencial del
sistema de transducción de VAA.
Aunque los vectores virales asociados a
adenovirus (VAA) recombinantes se diferencian de los vectores
adenovirales, la limitación del tamaño del ADN del transgen y las
propiedades empaquetadores son las mismas que con cualquier otro
vector de virus ADN.
El VAA es un parvovirus ADN de cadena única
lineal, y requiere coinfección mediante un segundo virus no
relacionado para lograr una infección productiva. El VAA lleva dos
juegos de genes funcionales: genes rep, que son necesarios para la
replicación viral, y genes de proteínas de la cápside estructural
(Hermonat, P.L., y otros, "Genetics of
adeno-associated virus; Isolation and preliminary
characterization of adeno-associated type 2
mutant", J.Virol.(1984)
51:329-339). Los genes rep y cápside del VAA
pueden ser remplazados por una fragmento de ADN deseado para generar
el ADN plasmídico de VAA. La transcomplementación de los genes rep y
cápside se requiere para crear un patrón viral recombinante. Después
de la transducción usando tal patrón viral, el virus recombinante se
libera de la cubierta dentro del núcleo y se integra en el genoma
hospedante mediante sus extremos
moleculares.
moleculares.
Aunque se ha hecho un progreso importante, las
técnicas de transducción tienen una eficacia variable, aún una
preocupación significativa acerca de la posible recombinación con el
virus endógeno, toxicidad celular y reacciones de respuesta
inmunológica del hospedante. Así, hay una necesidad para
procedimientos de transfección de ADN no viral.
Los liposomas han sido usados para encapsular y
liberar una variedad de materiales a las células, incluyendo ácidos
nucleicos y partículas virales (Faller, D.V. y D, Baltimore,
"Liposome encapsulation of retrovirus allows efficient
superinfection of resistant cell lines, " J. Virol. (1984)
49 :269-272).
Se ha demostrado que los liposomas preformados
que contienen lípidos catiónicos sintéticos forman complejos
estables con ADN poli aniónico (Felgner, P.L., y otros, "A highly
efficient, lipid- mediated DNA transfection procedure", Proc.
Natl. Acad. Sci. USA (1987), 84:
7413-7417). Los liposomas catiónicos, liposomas que
comprendían algún lípido catiónico, que contenían un lípido bromuro
de dioctadecildimetilamónico (DDAB) promotor de fusión a membrana
han trasferido eficazmente genes heterólogos en células eucariotas
(Rose, J.K., y otros, "A new cationic liposome reagent mediating
nearly quantitative transfection of animal cells,
"Biotechniques (1991) 10: 520-525).
Los liposomas catiónicos pueden mediar altos niveles de expresión
celular de transgenes, o ARNm, liberándolos en una variedad de
líneas celulares en cultivo (Malone, R., y otros, "Cationic
liposome mediated RNA tranfection" Proc. Natl. Acad. Sci.
USA (1989) 86: 6077-6081).
Los vectores retrovirales de empaquetamiento
ecotrópico y anfotrópico se ha demostrado que infectan células en
cultivo en presencia de liposomas catiónicos, tal como Lipofectina
(BRL, Galthersburg, MD), y en ausencia de receptores específicos
(Innes, C.L., y otros, "Cationic liposomes (Lipofectin) mediate
retroviral infection in the absence of specific receptors," J.
Virol. (1990) 64: 957-961).
Aún cuando las técnicas no virales han superado
algunos de los problemas de los sistemas virales, permanece la
necesidad de una eficacia de transfección mejorada en sistemas no
virales, una necesidad de aumentar el intervalo de tipos celulares
que son transfectables, una necesidad de aumentar la duración de la
expresión en células transfectadas, y una necesidad para aumentar
los niveles de expresión después de la transfección. En cierta
medida, se alcanza una eficacia mejorada usando elementos
potenciadores del promotor en las construcciones de ADN plasmídico
(Philip, R., y otros, "In vivo gene delivery: Efficient
transfection of T lymphocytes in adult mice," J. Biol.
Chem. (1993)268: 16087-16090).
El uso de interleuquina-2
(IL-2) en el tratamiento de células neoplásicas,
tales como carcinoma de células renales metastático (CCR), es una
manera de llevar a cabo una destrucción mediada por el sistema
inmune de neoplasmas humanos. Aunque se han alcanzado remisiones
completas duraderas, la tasa de respuesta total ha sido baja.
Durante el ensayo de rIL-2
(Chiron Corp., Emeryville, CA) en pacientes con cáncer, la toxicidad
que limita la dosis ha sido dependiente de la ruta y horario de
administración. La administración de altas dosis de bolos de
IL-2 se asoció con una toxicidad significativa, una
toxicidad que implicaba a casi cada sistema orgánico. Por otro lado,
se ha encontrado una tasa de mortalidad del 4% en pacientes en
estado de rendimiento ECOG 0 con administración de altas dosis de
IL-2. Para una perspectiva general del estado de
rendimiento de ECOG, véase, por ejemplo, Oken, Am. J. Clin.
Oncol. (CTT) 5: 649-655 (1982) "Toxicity and
Response criteria of the Eastern Cooperative Oncology Group"
Tabla 2, en la p. 654.
Como se distingue de la administración de bolos,
el uso de dosis inferiores (1-7 x 10^{6} unidades
Cetus/M^{2}/d) en infusión intravenosa continua (CIV) de
IL-2 ha producido informes de eficacia clínica y
toxicidad disminuida, y ha sugerido un perfil de seguridad mejorado
en inmunoterapia adoptiva de cáncer avanzado (West, S.H., y otros,
"Constant infusion of Recombinant interleukin-2 in
Adoptive immunotherapy of Advanced Cancer," (1987) N. Engl. J.
Med. 316: 898).
Los elementos celulares que mejoran
potencialmente la destrucción inmunológica de tumores cuando se
combinan con IL-2 incluyen células asesinas
activadas por linfoquinas y células linfocíticas T citotóxicas (CTL)
tales como células linfocíticas citotóxicas infiltrantes en tumores
(TIL).
Los linfocitos infiltrantes en tumores (TIL) son
principalmente linfocitos T que se encuentran normalmente en próxima
aposición con una masa tumoral, y que pueden ser aislados,
expandidos, y activados in vitro. Las células TIL son de
interés en el estudio del tratamiento de la neoplasia debido a que
estas células tienen afinidad por células tumorales.
Consecuentemente, las TIL citotóxicas son de particular interés
puesto que estas células tienen afinidad por tumores y también
poseen cualidades citotóxicas.
Como una metodología de tratamiento, las TIL han
sido reinfundidas en un hospedante junto con IL-2
exógena. (véase, por ejemplo, el documento de patente norteamericana
Nº 5.126.132 de Rosenberg, número del 30 de junio de 1992). El
tratamiento con IL-2 en combinación con TIL ha
resultado, en algunos casos, en remisiones completas duraderas en el
tratamiento de tumores malignos avanzados.
Los liposomas catiónicos fueron usados para
facilitar las transfecciones de plásmidos virales asociados a
adenovirus (VAA) de tipos celulares primarios y cultivados. El ADN
plasmídico de VAA, acomplejado con liposomas mostró niveles de
expresión varias veces más elevados que los complejos con plásmidos
estándar. Además, la expresión duró durante un período de 30 días
sin ninguna selección. Los complejos plásmido VAA: liposoma inducen
niveles de expresión del transgen que fueron comparables con los
obtenidos mediante transducción por VAA recombinante. Se observaron
altos niveles de expresión génica en células T CD4+ y CD8+recién
aislados, en linfocitos infiltrantes en tumores, y en células
progenitoras CD34+ de sangre periférica humana normal.
Las células primarias de tumores de mama, ovario
y pulmón fueron transfectadas usando los complejos ADN plasmídico de
VAA: liposoma. Las células tumorales transfectadas fueron capaces de
expresar el producto transgénico después de irradiación letal. La
eficacia de transfección osciló desde 10-50% como se
evaluó mediante expresión del gen de
\beta-galactosidasa. La capacidad de expresar
transgenes en células tumorales primarias se utiliza para producir
vacunas tumorales y para producir células linfoides que permiten
modulaciones altamente específicas de la respuesta inmune celular en
cáncer y SIDA, y en terapias génicas.
Aquí descrita está una composición para
manipulación genética. La composición comprende un liposoma que
comprende el material lipídico y el ADN viral asociado a adenovirus,
el ADN viral asociado a adenovirus puede ser un plásmido, y el
plásmido puede ser pMP6-IL2 como se muestra en la
figura 3, o pACMV-IL2 como se muestra en la figura
1. El ADN viral asociado a adenovirus puede comprender una
repetición terminal invertida, o dos o más repeticiones terminales
invertidas. Donde dos repeticiones terminales invertidas están
presentes en el ADN viral asociado a adenovirus, un material
genético de interés puede ser integrado entre dos repeticiones
terminales invertidas; por otro lado, un promotor puede ser
integrado entre dos repeticiones terminales invertidas, el promotor
puede ser un promotor CMV inmediato temprano, un promotor CMV
inmediato tardío, un promotor CMV temprano, un promotor ADA, o un
promotor TK. La composición puede comprender una secuencia genética
de interés, tal como una secuencia genética de un gen de
IL-2 o de un gen de \beta-gal. El
material lipídico puede comprender un lípido catiónico. Están
descritas células transfectadas mediante la composición.
Aquí descrito está un método para introducir una
secuencia genética de interés en una célula hospedante. El método
comprende etapas de proporcionar una composición que comprende
liposoma de ADN viral asociado a adenovirus y una secuencia genética
de interés y poner en contacto la composición con una célula
hospedante que comprende material genético mediante el cual la
secuencia genética de interés se introduce en la célula hospedante.
La célula hospedante puede ser una célula progenitora CD34+; una
célula T, tal como una célula CD3+, CD4+ o CD8+; una célula de una
línea celular tumoral tal como una línea celular de vejiga,
próstata, linfoma B, o una línea celular de riñón embriónico; o una
célula tumoral primaria. La etapa de proporcionar una composición
puede comprender proporcionar un liposoma que en sí mismo comprende
lípidos catiónicos.
La etapa de proporcionar una composición puede
proporcionar ADN viral asociado a adenovirus que comprende un
plásmido, y el plásmido puede ser pMP6-IL2 como se
muestra en la Figura 3, o pACMV-IL2 como se muestra
en la Figura 1. El método para introducir la secuencia genética de
interés en una célula puede comprender además una etapa de
integración del material genético de interés en el material genético
de la célula hospedante.
Se describe un método para usar una composición
que comprende un liposoma que comprende material lípido, ADN viral
asociado a adenovirus, una secuencia genética de interés. El método
comprende proporcionar a un paciente con un estado; y proporcionar
una composición que comprende liposoma de ADN viral asociado a
adenovirus y una secuencia genética de interés. El método comprende
además una etapa para contactar la composición con una célula
hospedante, mediante el cual la secuencia genética de interés se
introduce en la célula hospedante. La etapa de contacto puede ser
in vivo y la célula hospedante es una célula del paciente.
Alternativamente, el contacto puede ser ex vivo, si el
contacto es ex vivo el método comprende además una etapa de
distribuir la célula hospedante que comprende la introducción de la
secuencia genética de interés al paciente. La etapa de proporcionar
a un paciente puede proporcionar a un paciente un estado tal como un
neoplasma; una infección, tal como la infección del VIH; un estado
auto-inmune; o una anormalidad genética, tal como un
gen perdido o defectuoso. La etapa de proporcionar una composición
puede proporcionar una secuencia genética de interés que codifica
para un péptido, un oligonucleótido anti sentido, o ARN. La etapa de
proporcionar una composición puede proporcionar un plásmido tal como
pMP6-IL2 como se muestra en la figura 3, o
pACMV-IL2 como se muestra en la figura 1. La etapa
de proporcionar una composición puede proporcionar una secuencia
genética de interés que comprende una secuencia genética que
codifica para una citoquina, un factor coestimulador, una molécula
de MHC de clase I, un antígeno específico de tumor, o un antígeno
asociado a un tumor. La etapa de proporcionar a un paciente puede
proporcionar a un paciente un estado neoplásico maligno, o una
infección de VIH; la etapa de proporcionar una composición puede
proporcionar una secuencia genética de interés que comprende
material genómico de IL-2 a tales pacientes. La
etapa de proporcionar un paciente puede proporcionar a un paciente
un estado neoplásico maligno; la etapa de proporcionar una
composición puede proporcionar una secuencia genética que comprende
el gen MDR I, para tales pacientes. La etapa de poner en contacto la
composición con una célula hospedante puede comprender el contacto
con una célula hospedante que es una célula neoplásica, una célula
hematopoyética de médula espinal o una célula de sangre periférica;
la etapa de poner en contacto puede comprender el contacto con una
célula hospedante que es un linfocito infiltrante en tumores, una
célula de una línea celular tumoral, o una célula tumoral
primaria.
Se describe un vector de expresión que comprende
una secuencia genética que es esencialmente la que está descrita en
la Figura 3; se describe un vector de expresión que comprende una
secuencia genética que es sustancialmente la de las secuencias
genéticas de la Figura 3; y se describe un vector de expresión que
comprende una secuencia genética que es la de la secuencia genética
en la Figura 3. Se describe una célula que está modificada
genéticamente con el vector de expresión que comprende una secuencia
genética que es esencialmente la de la secuencia genética en la
Figura 3; la célula puede ser una célula de sangre periférica, una
célula de médula espinal, un linfocito infiltrante en un tumor, una
célula de una línea celular tumoral, o una célula tumoral
primaria.
Se describe un vector de expresión que comprende
una secuencia genética que es esencialmente la de secuencia genética
del plásmido pMP6; un vector de expresión que comprende una
secuencia genética que es sustancialmente la de la secuencia
genética del plásmido pMP6; un vector de expresión que tiene una
secuencia genética que es la de la secuencia genética del plásmido
pMP6. Un vector de expresión que comprende una secuencia genética
que es esencialmente la de la secuencia genética del plásmido pMP6
puede comprender además una secuencia genética de interés; una
célula puede ser modificada genéticamente con dicho vector de
expresión, la célula puede ser una célula de sangre periférica, una
célula de médula espinal, un linfocito infiltrante en tumores, una
célula de una línea celular tumoral, o una célula tumoral
primaria.
Se describe está un método para producir una
proteína. El método de producción de proteína comprende etapas de
proporcionar una composición que comprende liposoma, ADN viral
asociado a adenovirus y una secuencia genética de interés. La
composición se pone en contacto con una célula hospedante que
comprende material genético, mediante el cual la secuencia genética
de interés se introduce en la célula hospedante. El método de
producción comprende además una etapa de expresar una proteína
codificada por la secuencia genética de interés. La célula
hospedante puede ser una célula progenitora CD34^{+}, una célula
T, una célula de una línea celular tumoral, o una célula tumoral
primaria; la célula hospedante puede ser un linfocito infiltrante en
tumores, una célula CD3^{+}, CD4^{+}, ó CD8^{+}. La célula
hospedante puede ser de una línea celular tumoral que es línea
celular de vejiga, de próstata, de un linfoma B, o una línea celular
de riñón embrionario. La etapa de proporcionar una composición que
comprende liposomas puede comprender el proporcionar una composición
que comprende lípidos catiónicos. La etapa de proporcionar una
composición puede proporcionar ADN viral asociado a adenovirus que
comprende un plásmido, tal como pMP6-IL2 como se
muestra en la figura 3, o pACMV-IL2 como se muestra
en la figura 1. El método para proporcionar una proteína puede
comprender además una etapa para integrar el material genético de
interés en el material genético de la célula hospedante. La etapa de
expresar una proteína puede comprender expresar un análogo de
linfoquina. La etapa de expresar una proteína puede expresar
IL-2, \beta-galactosidasa
cloranfenicol acetiltransferasa, o MDR I.
Se describe un método para preparar una
composición celular terapéutica para tratar a un paciente con un
neoplasma. El método comprende etapas de obtener una composición de
células que comprenden células de linfocitos T efectores; de poner
en contacto la composición de la célula con proteínas de unión
específicas, en las que las proteínas de unión específicas están
unidas covalentemente a una superficie, mediante la cual las células
de linfocitos T efectores unidas específicamente mediante las
proteínas de unión específicas se vuelven específicamente unidas a
la superficie, y, eliminando las células que no están unidas
mientras que se dejan las células de linfocitos T efectores
específicamente unidas a la superficie. El método para preparar una
composición celular terapéutica puede comprender además una etapa de
expansión de células de linfocitos T efectores, mediante la cual se
proporciona una población de fenotipo sustancialmente homogéneo; la
etapa de expansión puede comprender además el cultivo de células de
linfocitos T efectores con células tumorales; las células tumorales
pueden ser irradiadas; las células tumorales pueden ser modificadas
genéticamente con un vector que comprende un casete de expresión
para interleuquina-2. En el método para preparar una
composición celular terapéutica, la etapa de obtención puede
comprender la obtención de células de linfocitos T efectores que son
linfocitos infiltrantes en tumores, los linfocitos infiltrantes en
tumores pueden ser de un tejido neoplástico que es autólogo o
alogénico. La etapa de poner en contacto puede comprender el poner
en contacto la composición celular con proteínas de unión
específicas específicas para CD4, CD8, o una mezcla de proteínas de
unión específicas específicas para CD4 y CD8. El método para
preparar una composición celular terapéutica puede comprender además
una etapa de liberación de células unidas específicamente, mediante
la cual la liberación de las células está sustancialmente libre de
proteínas de unión específicas. Las proteínas de unión específicas
pueden comprender anticuerpos monoclonales. El método puede
comprender además una etapa de modificar genéticamente las células
unidas específicamente, tales como transfectar con un plásmido que
comprende material genómico de IL-2, mediante el
cual resulta una composición celular terapéutica que tiene efecto
terapéutico en ausencia de administración sistémica de
interleuquina-2. Se describe una población
sustancialmente homogénea de células preparadas según el método. Se
describe el uso de una población preparada según el método, para
tratar a un paciente que tiene un neoplasma, tal como un carcinoma
en una célula renal, carcinoma infiltrante dúctil, melanoma,
carcinoma de ovario, carcinoma de pulmón o carcinoma de células
escamosas.
Se describe una población sustancialmente
homogénea de células TIL CD8^{+}, en la que las células de la
población comprenden superficies externas y en la que las
superficies externas de las células están sustancialmente libres de
anticuerpos; las células de la población pueden ser al menos un 80%
homogéneas para CD8.
Se describe el método para preparar una
composición celular terapéutica para tratar a un paciente con un
neoplasma que comprende obtener células neoplásicas; modificando
genéticamente las células con una composición que comprende
liposomas que comprenden material lipídico y ADN viral asociado a
adenovirus y además comprenden una secuencia genética de interés;
tal como una secuencia que codifica para un uso de linfoquina de una
composición preparada según este método también está descrito.
Fig.1. Mapas plasmídicos de tres plásmidos usados
en los presentes estudios. El plásmido pACMV-IL2 que
contiene el promotor CMV, cADN de IL-2 y
preproinsulina de rata y secuencias de poliadenilación de SV40
idénticas al plásmido pBC12/CMV-IL2, adicionalmente
pACMV-IL2 también tenían repeticiones terminales
invertidas de VAA (ITRs) a ambos extremos. El plásmido
pA1CMVIX-CAT fue construido con el promotor CMV y el
gen CAT insertados entre los dos ITRs de VAA.
Fig. 2. Esta figura proporciona un mapa de
restricción detallado de la realización de IL-2 del
plásmido pMP6 (pMP6-IL2).
Fig. 3A-G. Esta figura representa
la secuencia de ADN del plásmido pMP6-IL2. En la
fig, los paneles a-e representan porciones sucesivas
de la secuencia. Se indican porciones de la secuencia
pMP6-IL2 que corresponden a secuencias de ADN
conocidas; la información de la secuencia correspondiente está
listada directamente debajo de la secuencia de información para el
plásmido pMP6-IL2. Las secuencias no marcadas son
los sitios de unión.
Fig. 4a-b. la Fig.4a describen
los niveles de la expresión génica inducida por los complejos ADN
plasmídico: liposoma. Diversas construcciones plasmídicas de
IL-2 fueron ensayadas en lo que se refiere a su
capacidad para inducir expresión génica con una línea celular de
vejiga de rata y una línea celular de próstata de rata, cuando las
construcciones fueron acomplejadas con liposomas. En ambas líneas
celulares, la construcción plasmídica de VAA muestra los niveles de
expresión más altos. Los niveles se expresan como picogramos por ml
por 10^{6} células. La Fig. 4b representa el curso en el tiempo de
la expresión génica inducida por complejos de plásmido de VAA:
liposoma. Para comparar la duración de la expresión del transgen, la
línea celular de próstata fue transfectada con el plásmido VAA
(pACMV-IL2) y el correspondiente plásmido testigo
(pBC12/CMV-IL2) acomplejado con liposomas. Se
recogieron sobrenadantes a diversos puntos de tiempo y se ensayaron
en lo que se refiere a niveles de IL-2 usando un
ELISA. Los niveles de IL-2 se expresan como
picogramos/ml/10^{6} células en 24 h de cultivo.
Fig.6. Expresión del gen de IL-2
por lipofección con complejos de plásmido de VAA: liposoma de
diversas células tumorales primarias. Una muestra de pulmón, una de
ovario, y dos muestras de tumor de mama fueron aisladas de biopsias
recientes de tumores. Los niveles IL-2 fueron
medidos usando un ELISA. Los niveles son indicados como
picogramos/ml/10^{6} células en 24 h de cultivo.
Fig. 7a-b. La expresión de
IL-2 por células transfectadas de acuerdo con el
invento, sometidas después a irradiación letal. Para determinar el
efecto de la irradiación en la expresión génica, la línea celular de
próstata (Fig. 7a) y células de mama primarias (Fig. 7b) fueron
transfectadas y evaluadas en lo que se refiere a la expresión de
genes después de la irradiación letal, como se describe aquí. Los
sobrenadantes fueron recogidos 24, 48, 72 y 96 horas después de la
irradiación y fueron ensayados en lo que se refiere a los niveles de
IL-2. Los niveles de IL-2 fueron
expresados como pg/ml/10^{6} células en 24 horas de cultivo.
Fig. 8. La eficacia de transfección de VAA:
liposoma medida mediante la expresión del gen
\beta-gal. El gen reportero
\beta-gal fue usado para evaluar la eficacia de la
transfección en una base por célula. La línea celular de próstata
fue usada para transfección, como se describe aquí. Los datos están
representados como porcentaje de células positivas para
fluorescencia.
Fig. 9a-d. Los estudios de
cromatografía de capa fina que representan los linfocitos T
transfectados. La sangre fue obtenida de donantes referidos como A o
B. La sangre periférica del donante de A o B fue usada para aislar
células T, y para transfección. Las células primarias T recién
aisladas de la sangre periférica de un donante fueron ensayadas en
lo que se refiere a la expresión del transgen usando complejos ADN
plasmídico de VAA: liposoma. Los linfocitos T fueron fraccionados
como poblaciones CD3^{+} (Fig. 9a), o CD5/8^{+} (Fig. 9b), o
como CD4^{+} (Fig. 9c) o CD8^{+} (Fig. 9d) usando dispositivos
AIS microCELLector. Las células relevantes fueron capturadas y
cultivadas como se describe aquí. Después, 5-10 x
10^{6} células fueron puestas en placas y transfectadas con 50
microgramos de ADN plasmídico de VAA y con 50 ó 100 nmoles de
liposomas para obtener una relación 1:1 ó 1:2 de ADN: liposomas. Las
células fueron recogidas 3 días después de la transfección. Se
ensayó el contenido normalizado para proteína de los extractos en lo
que se refiere a actividad CAT usando un ensayo cromatográfico.
Fig. 10. Cromatografía en capa fina de células
progenitoras de sangre periférica CD34^{+} transfectadas con
plásmido de VAA: liposomas. Las células fueron recogidas a día 3 y
día 7 después de la transfección. Se ensayó el contenido normalizado
para proteína de los extractos en lo que se refiere a la actividad
CAT usando un ensayo cromatográfico.
Fig. 11a-b. Análisis por Southern
de quimioluminiscencia potenciada (ECL) de ADN genómico de clones
transfectados con complejos de ADN plasmídico de VAA: liposomas. En
la Fig. 11a, las muestras fueron digeridas con Bam HI y Hind III e
hibridadas con sondas para IL-2. Para los datos en
la Fig. 11b, las muestras fueron digeridas con Bam HI e hibridadas
con sondas para IL-2. Todos los clones analizados
muestran la presencia del gen de la IL-2, como se
demuestra por las bandas de 0,685 kb.
Para la Fig. 11a-b:
carril 1: escalera de 1 kb
carril 2: plásmido escindido con Bam HI/HindIII
(9a) y BamHI/pvull (9b).
carril 3: R33 sin transfectar
carriles 4-11: clones
Fig. 12a-b. Análisis por Southern
(^{32}P) de los clones 1A11 y 1B11. Después de la transferencia
por Southern, el filtro representado en la Fig. 12a fue hibridado
con el fragmento Bam HI/Hind III de 0,68 kb de IL2 de
pACMV-IL-2.
Para la Fig. 12a:
carril 1: clon 1A11 escindido con Bam HI/Hind
III
carril 2: clón 1B11 escindido con Bam HI/Hind
III
carril 3: clón R33 escindido con Bam HI/Hind
III
carril 4: clón 1A11 escindido con Bam HI
carril 5: clón 1B11 escindido con Bam HI
carril 6: clón R33 escindido con Bam HI
carril 7: clón 1A11 escindido con Hind III
carril 8: clón 1B11 escindido con Hind III
carril 9: clón R33 escindido con Hind III
carril 10: dejado vacío
carril 11: plásmido pACMV-IL2
escindido con Bam HI/Hind III
carril 12: plásmido pACMV-IL2
escindido con Hind III/pvull
carril 13: plásmido pACMV-IL2
escindido con Bam HI/pvull
Para los datos mostrados en la Fig. 12b, el
filtro se hibridó con un fragmento pvull/HindIII de 0,85 kb (VAA
ITR/CMV) del plásmido pACMV-IL2. Para la Fig.
12b:
carril 1: clón 1A11 escindido con smal
carril 2: clón 1B11 escindido con smal
carril 3: clón R33 escindido con smal
carril 4: clón 1A11 escindido con pvull/Hind
III
carril 5: clón 1B11 escindido con pvull/Hind
III
carril 6: clón R33, escindido con pvull/Hind
III
carril 7: pACMV-IL2, escindido
con Bam HI/Hind III
carril 8: pACMV-IL2, escindido
con Hind III/pvull
carril 9: pACMV-IL2, escindido
con smal
carril 10: escalera de 1 kb
Fig. 13. Esta figura representa el análisis del
repertorio de Receptor de Célula T (TCR) con protección frente a
ARNasa de TIL de cáncer de mama expandido con tumor autólogo, con
tumor transducido con IL-2, y con
IL-2 sola. Para los ejes en la Fig., V_{\beta} es
una variable de segmento de la cadena \beta del TCR; C_{\beta}
es el segmento constante de la cadena B del TCR; en el eje
horizontal A, B, y C representan diferentes pacientes.
Fig. 14. Esta figura representa la proliferación
de linfocitos infiltrantes en tumores (TIL) de cáncer de mama; los
datos fueron obtenidos 5 días después de la transfección del gen de
la IL-2.
Fig. 15. Esta figura representa la eficacia de la
expresión génica en TIL de cáncer de mama transfectados con el
plásmido pMP6 que contiene los genes de resistencia a neomicina y el
gen Thy 1.2 (pMP6/neo/Thy 1.2) en lugar del gen de la
IL-2. El plásmido pMP6/neo/Thy 1.2 fue acomplejado
con liposomas DDAB: DOPE. Las composiciones de liposomas fueron las
mismas composiciones que las de los datos correspondientes a la Fig.
14.
Fig. 16. Esta figura compara el nivel y duración
de la expresión transgénica después de transfecciones con diversas
construcciones plasmídicas. La línea celular de tumor de próstata
R3327 fue transfectada con plásmido estándar
(pBC12/CMV-IL2) o plásmido
(pACMV-IL2) acomplejado con liposomas DDAB: DOPE.
Los sobrenadantes fueron recogidos a diversos puntos de tiempo y se
ensayaron por ELISA en lo que se refiere a niveles de
IL-2. Los niveles de IL-2 se
expresan como pg/ml/10^{6} células en 24 horas de cultivo.
Fig. 17. Esta figura representa análisis de
transferencia por Southern de ADN cromosómico de células R3327
transfectadas bien con el plásmido de VAA
(pACMV-IL2) o bien el plásmido estándar
(pBC12/CMV-IL2). La transferencia se hibridó con el
fragmento Bam HI/Hind III de 0,685 kb del gen de
IL-2. C = ADN de células sin transfectar. El inserto
de IL-2 se muestra en el último carril.
Fig. 18. La figura representa los resultados de
un ensayo intracelular de la eficacia de transfección del gen de
IL-2 en la línea celular de próstata R3327. Las
células fueron transfectadas con plásmido de IL-2 de
VAA acomplejado con liposomas DDAB: DOPE, composición 1:1 ó 1:2. Las
células transfectadas fueron teñidas en diversos puntos de tiempo
para determinar los niveles de proteína intracelular
IL-2. El dato está representado como porcentaje
positivo de células que expresan la proteína IL-2.
Se usaron células sin transfectar como testigos negativos y los
valores de los testigos fueron restados de los valores de los grupos
transfectados.
Fig. 19a-b. Esta figura
representa la expresión de IL-2 por células de la
línea celular de tumor de próstata irradiadas (Fig. 19a) y por tumor
de mama primario irradiados (Fig. 19b). Las células de mama
primarias y células de la línea celular de próstata fueron
transfectadas y ensayadas para determinar la expresión génica
después de la irradiación letal. Los sobrenadantes fueron recogidos
24, 48, 72 y 96 horas después de la irradiación y fueron ensayados
para determinar los niveles de IL-2. Los niveles de
IL-2 fueron expresados como pg/ml/10^{6} células
en 24 horas de cultivo.
Los estudios, descritos por primera vez aquí,
examinaron el transporte en las células de ADN plasmídico de VAA
mediante un sistema que no implica la transducción viral.
Alternativamente, un método de acuerdo con la presente descripción
transfectó eficazmente varios tipos celulares de mamífero por el uso
de liposomas que comprenden material de VAA. La presente descripción
se refiere a la transfección, y utiliza elegantes sistemas vehículo
de lipofección junto con la capacidad de transducción competente de
la construcción plasmídica de VAA. Ventajosamente, los liposomas
catiónicos fueron usados como un medio para facilitar la entrada de
ADN plasmídico de VAA en células en ausencia de transcomplementación
por rep y capsid, virus recombinantes o VAA de tipo salvaje. Un
método de lipofección de acuerdo con el invento fue evaluado para
calcular la eficacia de la expresión génica. Los presentes datos
establecieron la capacidad para transfectar células progenitoras no
modificadas, células linfoides primarias no modificadas tales como
células T, una variedad de células tumorales recién aisladas, y
tipos celulares de mamífero en cultivo, con una alta eficacia para
una expresión de ADN tanto transitoria como sostenida. La capacidad
para transfectar eficazmente las células T no modificadas, tales
como linfocitos infiltrantes en tumores; células progenitoras no
modificadas; células de líneas celulares tumorales; y, células
tumorales primarias es descrita por primera vez en la técnica.
Una línea celular de próstata de rata (R3327) y
línea celular de vejiga de rata (MBT-2) fueron
obtenidas del Dr. Eli Gilboa, Universidad de Duke. Ambas líneas
celulares fueron mantenidas en medio RPMI-1640
suplementado con suero bovino fetal (FBS) 5%. La línea celular 293
es una línea celular de riñón embrionario humano que se transformó
por adenovirus tipo 5, y se obtuvo de la ATCC (Graham, F.L., y
otros, "Characteristics of a human cell line transformed by
DNA from human adenovirus type 5," J.Gen. Virol. (1977)
36: 59-72). La línea de celular 293 creció en
medio Dulbecco modified eagle suplementado con FBS 10%.
Las células tumorales primarias de pulmón, ovario
y tres tumores de mama fueron obtenidas de tumores sólidos de
pacientes. Las muestras tumorales fueron cortadas en trozos pequeños
y digeridas en 200 ml de medio AIM V (Gibco), suplementado con 450
\mu/ml de colagenasa IV (Sigma) 10,8 K unidades/ml de DNasa I
(Sigma), y 2000 u/ml de hialuronidasa V (Sigma) (Topolian, S.L.,
y otros, "Expansion of human tumor infiltrating lymphocytes
for use in immunotherapy trials," J.Immunol. Methods
(1987) 102: 127-141). Después de
1-2 horas de digestión, las células fueron
homogeneizadas con un homogeneizador de vidrio (Bellco). Las células
fueron lavadas tres veces en DPBS-CMF (Whittaker).
Los linfocitos fueron separados de las células no linfoides por
captura en un dispositivo AIS MicroCELLector-CD5/8
(AIS, Santa Clara, CA). Las células no adherentes (principalmente
células tumorales) fueron retiradas y cultivadas en RPMI 1640
complementado con L glutamina 2 mM,
penicilina-estreptomicina 100 u/ml, y FBS 10%. Las
células tumorales fueron cultivadas durante 2 a 4 semanas
previamente a la transfección.
Las células mononucleadas de sangre periférica
(PBMCs) de pacientes testigo sanos fueron aisladas de la capa beige
(fracción de células blancas) (Banco de sangre de la Universidad de
Stanford, Stanford, CA), usando linfoprep (Nycomed, Noruega).
Las células T, subgrupos de células T, ó células
CD34+ fueron aisladas adicionalmente usando AIS MicroCELLectors
(Applied immune Sciences, Santa Clara, CA), los dispositivos que
comprenden superficies que tienen unidas covalentemente proteínas de
unión específicas (tales como anticuerpos monoclonales) unidas a las
mismas. Brevemente, los PBMCs fueron resuspendidos en 15 x 10^{6}
células por ml en 0,5% de Gamimmune (Miles, Inc., Elkhart, IN) y
cargados en AIS MicroCELLectors CD3, CD4, CD8, CD5/8, ó CD34
lavados. Después de 1 hora, las células no adherentes fueron
retiradas del AIS MicroCELLectors. El medio completo, RPMI 1640
(Whittaker) que contiene suero bovino fetal 10%,
L-glutamina 2 mM, y penicilina/estreptomicina 100
u/ml fue añadido a las células adherentes en el AIS MicroCELLectors.
Después de 2-3 días en medio humidificado a 5% de
CO_{2}, y 37ºC, las células adherentes fueron retiradas y
preparadas para la transfección.
El primer plásmido usado en los presentes
estudios fue (pACMV-IL2): este plásmido contenía el
gen de la interleuquina-2 humana
(IL-2) como cADN de IL-2, y el
elemento potenciador del promotor inmediato temprano del
citomegalovirus humano (CMV), y preproinsulina de rata y secuencias
de poliadenilación de SV40, flanqueadas por repeticiones terminales
invertidas (ITRs) del virus asociados a adenovirus en ambos
extremos. (Este plásmido disponible del Dr. J. Rosenblatt, UCLA, CA;
el nombre del Dr. Rosenblatt para este plásmido es
pSSV9/CMV-IL2). Un plásmido testigo correspondiente
pBC12/CMV-IL2, que era idéntico a
pACMV-IL2 pero que carecía de las repeticiones
terminales de VAA, se usó también (Fig. 1).
Un segundo plásmido de estudio,
pAICMVIX-CAT, contenía las secuencias potenciadoras
del promotor inmediato temprano de CMV, y un intrón derivado de
pOG44 (Stratagene); el gen bacteriano CAT; la señal de
poliadenilación tardía de SV40 flanqueada por repeticiones
terminales de VAA en un esqueleto de pBR322 (Fig.1).
Los plásmidos pATK-\betagal y
pAADA-\betagal contenían el gen \betagal unido
bien al promotor TK o bien al promotor ADA respectivamente, en un
esqueleto de plásmido de VAA. (los plásmidos Bgal proporcionados por
el Dr. Eli Gilboa, Univ de Duke.).
Otro plásmido usado en los presentes estudios fue
el pMP6. Como se muestra en la Fig. 2, el plásmido que contiene ADN
de IL-2 (pMP6-IL2) es un plásmido
circular de doble hebra. El plásmido pMP6-IL2 tiene
el gen de interleuquina-2 humana bajo el control de
un promotor CMV y una señal de poliadenilación SV40. Entre el
promotor y las secuencias codificantes de IL-2, hay
un intrón (derivado de pOG44, Stratagene) que se comprende que
potencia la expresión de IL-2 o cualquier otro gen
exógeno colocado en el plásmido. El casete de expresión completo
está entre las secuencias terminales izquierda y derecha del
adenovirus asociado. El plásmido pMP6-IL2 también
tiene un esqueleto Bluescript; el esqueleto tiene un origen de
replicación bacteriano Col-E1 y un gen de
resistencia a ampicilina que facilita la propagación de este
plásmido en E. coli.
La Figura 3A-G representa la
secuencia de ADN del plásmido pMP6-IL2; los paneles
desde el a hasta el e representan porciones sucesivas de la
secuencia. En la figura, se indican porciones de la secuencia
pMP6-IL2 que corresponden a secuencias de ADN
conocidas; la información de la secuencia correspondiente está
listada directamente debajo de la información de la secuencia para
el plásmido pMP6-IL2. Las secuencias sin marcar son
de los sitios de unión.
Las construcciones plasmídicas estándar que
contienen el gen IL-2, pero que no contienen
componentes de VAA fueron también usadas. Las construcciones
plasmídicas estándar llevaron el gen de IL-2, con un
adenosina desaminasa (ADA), una timidina quinasa (TK) o el promotor
inmediato tardío de citomegalovirus (CMV) (plásmidos estándar
obtenidos de ATCC).
Los datos para los plásmidos seleccionados están
en la Tabla 1:
Todos los plásmidos fueron aislados mediante
lisis alcalina y precipitación por acetato amónico, seguido por un
tratamiento con ARNasa libre de ADNasas, extracciones con
fenol/cloroformo/isoamilo y precipitación con acetato amónico
(Ausubel, F.M., y otros., Current Protocols in
Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc. 1993)).
Los liposomas unilamelares pequeños fueron
preparados a partir del lípido catiónico bromuro de
dioctadecildimetilamonio (DDAB) (Sigma) en combinación con el lípido
neutro dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) (Avanti Polar Lipids).
Los lípidos fueron disueltos en cloroformo. El DDAB fue mezclado con
DOPE bien en una relación molar de 1:1 ó 1:2 en un frasco de fondo
redondo, y la mezcla lipídica fue secada en un evaporador rotatorio.
La película lipídica fue rehidratada añadiendo agua estéril
doblemente destilada para dar una concentración final de DDAB 1 mM.
Esta disolución fue sonicada en un sonicador de baño (Laboratory
Supplies, Hicksville, NY) hasta que quedó clara. Los liposomas
fueron almacenados a 4ºC en atmósfera de argón. Para el uso in
vivo de liposomas vía administración intravenosa se usó una
relación DDAB: DOPE de 1:4 a 1:5; para administración
intraperitoneal se usó una relación DDAB: DOPE de 1:1 a 1:2.
Para la preparación de patrones de VAA
recombinante, las células de la línea celular 293 fueron divididas y
hechas crecer hasta aproximadamente 30-50% de
confluencia. Enseguida, se infectaron las células con adenovirus del
tipo 5 a una multiplicidad de infección de 1 a 5, y se incubaron a
37ºC. Después de 2 a 4 horas, las células infectadas fueron
cotransfectadas con 10 \mug de un plásmido que comprendía un gen
de interés y 10 \mug de plásmido de complementación rep capsid,
p\DeltaBal, por 100 mm de placa de cultivo tisular
(0,5-1 x 10^{7} células). Se usó coprecipitación
por fosfato cálcico para transfección (Hermonat, P.L. y Muzyczka,
N., "Use of adeno-associated virus as a mammalian
DNA cloning vector. Transduction of neomycin resistance into
mammalian tissue culture cells, "Proc. Natl. Acad. Sci.
USA (1984) 81: 6466-6470). Entre 12 y 18
horas después de la transfección, el medio fue retirado de las
células y reemplazado con 5 ml de medio DMEM que contenía FBS
10%.
Entre 48 y 72 horas después de la transfección,
el VAA fue recogido según el siguiente procedimiento: las células y
el medio fueron recogidos juntos, y fueron congeladas descongeladas
tres veces para lisar las células. La suspensión de células y medio
fue después centrifugado para retirar los restos celulares, y los
sobrenadantes fueron incubados a 56ºC durante 1 hora para desactivar
el adenovirus (Hermonat, P.L. y N., Muzyczka, "Use of
adeno-associated virus as a mammalian DNA cloning
vector. Transduction of neomycin resistance into mammalian tissue
culture cells," Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984)
81: 6466-6470); Tratschin, J.D. y otros,
"Adeno-associated virus vector for high frequency
integration, expression, and rescue of genes in mammalian cells,
" Mol. Cell. Biol. (1985) 5
:3251-3260). Después de la desactivación por calor,
el sobrenadante viral se filtró a través de filtros de acetato de
celulosa (1,2 \mum). Los patrones virales se almacenaron entonces
a -20ºC. Se usó un milílitro de sobrenadante de VAA para transducir
1 x 10^{6} células.
Para células tumorales primarias y líneas
celulares tumorales de rata (R3327 y MBT-2), 1 x
10^{6} células fueron puestas en placas en 2 ml de medio libre de
suero por pocillo en una placa de 6 pocillos. Después, se mezclaron
5 \mug de ADN plasmídico de VAA con 5 nmoles de DDAB como
liposomas compuestos de DDAB y DOPE en una relación molar de 1:2,
respectivamente. Se añadió medio libre de suero (0,5 ml) al complejo
VAA: liposoma, que fueron luego trasferidos a las células. Para
efectuar la lipofección, las células fueron incubadas a temperatura
ambiente durante 5 minutos, el suero bovino fetal fue añadido a las
células para dar una concentración final de suero bovino fetal
5%.
Para las células T, 5-10 x
10^{6} células fueron puestas en placas en 1 ml de medio libre de
suero por pocillo de una placa de 6 pocillos. Se mezclaron 50 \mug
de ADN plasmídico con 50 nmoles de DDAB como liposomas compuestos de
DDAB y DOPE en una relación molar de 1:1. Las transfecciones
"lipofecciones" se realizaron luego como para las células
tumorales.
Para las células progenitoras,
1-2 x 10^{6} células fueron transfectadas con
complejos que comprendían 10 microgramos de ADN plasmídico y 10
nmoles de liposoma. Las células transfectadas fueron cultivadas con
medios que contenían factor de células progenitoras,
IL-3 e IL-1. En el día 3 y 7, las
células fueron recogidas y se hicieron los extractos.
Se contaron las células, y 1 x 10^{6} células
fueron puestas en placas en 1 ml por pocillo de una placa de 24
pocillos. Al día siguiente, se recogieron los sobrenadantes y se
valoraron usando un kit de ELISA Quantikine IL-2
(R&D Systems, Minneapolis, MN). Los niveles de
IL-2 se definieron como picogramos/ml del
sobrenadante.
El kit de detección del gen de fusión
FluoReporter lacZ Molecular Probes (Eugene, OR) fue usado para
cuantificar lacZ
\beta-D-galactosidasa en células
únicas por medición de la fluorescencia del producto de la
hidrólisis enzimática, fluoresceína. Los plásmidos
VAA/\beta-gal (pATK-\betagal y
pAADA-\betagal) fueron usados con este kit. La
fluoresceína es producida por escisión enzimática de fluoresceín
di-b-D-galactopiranósido
(FDG) en células que expresan el gen marcador
b-D-galactosidasa. Las células se
analizaron después usando citometría de flujo (FACScan, Becton
Dickinson, San José,CA).
Para evaluar la eficacia de la transferencia
génica de los plásmidos de VAA, se compararon las eficacias de
transferencia del gen de IL-2 de los plásmidos VAA
con las eficacias de las construcciones plasmídicas estándar. Los
plásmidos estándar llevaron el gen de IL-2, con un
promotor adenosina desaminasa (ADA) (pADA-IL2), un
promotor de timidina quinasa (TK) (pTKIL-2), o el
promotor inmediato tardío del citomegalovirus
(pCMV-IL2) (CMV). Un plásmido de estudio de VAA de
IL-2 (pACMV-IL2) contenía el
promotor CMV (inmediato temprano), con el gen de
IL-2 colocado aguas abajo del promotor (Fig. 1).
Como se muestra en la Fig. 1, el plásmido testigo correspondiente,
la construcción pBC12/CMV-IL2, era idéntica a
pACMV-IL2, pero carecía de las repeticiones
terminales (ITRs) de VAA.
Por comparación, cinco plásmidos
(pACMV-IL2, pBC12/CMV-IL2,
pADA-IL2, pTK-IL2,
pCMV-IL2) que contienen el gen de
IL-2 fueron acomplejados con liposomas y ensayados
para determinar la eficacia de la transfección en las dos líneas
celulares tumorales en cultivo: las líneas celulares de vejiga de
rata (MBT-2) y de próstata de rata (R3327). Las
líneas celulares fueron transfectadas con 10 microgramos de ADN
plasmídico acomplejado con 10 nmoles de liposomas por 1 x 10^{6}
células. Se recogieron sobrenadantes en el día 3 y se ensayaron para
determinar los niveles de IL-2 usando un kit ELISA
de IL-2.
El plásmido VAA (pACMV-IL2)
indujo los niveles de expresión más altos en ambas líneas celulares
(Fig. 4a). El gen de IL-2 con un promotor ADA
(pADA-IL2) indujo la mínima cantidad de expresión en
ambas líneas celulares. Como se muestra en la Fig. 4a, ambas
construcciones de IL-2 de (promotor inmediato
tardío) TK y CMV indujeron niveles de expresión de
IL-2 comparables en ambas líneas celulares. Sin
embargo, el plásmido pBC12/CMV-IL2, que contenía el
promotor inmediato temprano de CMV mostró niveles de expresión
génica más altos en la línea celular de próstata cuando se comparó
con la línea celular de vejiga. Entre los plásmidos ensayados, el
plásmido de estudio de IL-2 de VAA indujo los
niveles de expresión más altos en ambas líneas celulares, con un
nivel significativo de aumento observado en la línea celular de la
próstata.
Las duraciones de la expresión inducida por el
correspondiente plásmido de testigo (pBC12/CMV-IL2)
y el plásmido de estudio de IL-2 de VAA
(pACMV-IL2) en la línea celular de próstata R3327
fueron estudiadas (Fig. 4b). La expresión fue evaluada en estos
cultivos hasta 30 días sin ninguna selección. Las células fueron
sembradas a 1 x 10^{6}/ml y los sobrenadantes fueron recogidos
para ser analizados cada 24 horas. Las células se duplicaron cada 48
horas en cultivo. Los datos en la Fig. 4b indican que, además de los
niveles de expresión potenciados, la duración de la expresión duró
30 días después de la transfección con plásmido de VAA
(pACMV-IL2). Notablemente, la expresión
significativa continuó a través de la duración completa del período
de tiempo de evaluación. Como se muestra en la Fig. 4b, ambos
plásmidos indujeron niveles máximos de expresión entre el día 2 y el
día 7, por el día 15 los niveles de IL-2
disminuyeron y después se mantuvieron aproximadamente a 100 pg/ml
sólo en el grupo transfectado con plásmidos de VAA. Similarmente, se
observaron niveles de expresión sostenidos en la línea celular de
vejiga, así como con las células tumorales primarias de pulmón, de
mama y de ovario, cuando se usaron para la transfección los
complejos de plásmido de VAA: liposoma (datos no ilustrados en la
Fig. 4b).
Las líneas celulares de próstata y vejiga fueron
transfectadas y transducidas, para determinar si la transfección
óptima de VAA: liposoma era comparable a la transducción óptima del
recombinante VAA. Para una transfección óptima, 10 microgramos de
ADN plasmídico de VAA fueron acomplejados con 10 nmoles de liposomas
por 1 x 10^{6} células en 2 ml de volumen final. Para una
transducción máxima de rVAA, se añadieron 2 ml del sobrenadante
viral a 1x 10^{6} células en 1 ml de medio completo. Después de 24
horas, las células fueron lavadas y se resuspendidas en medio
completo recién preparado. Se recogió el sobrenadante en diversos
puntos de tiempo después de la transfección y transducción.
En la línea de la próstata (Fig. 5a), la
transfección indujo niveles de expresión más altos que la
transducción de VAA en condiciones de ensayo (2 ml de sobrenadante
viral por 1x 10^{6} células, frente a 10 \mug de ADN: 10 nmoles
de liposomas). Aunque los resultados a día 3 hasta día 5 mostraron
niveles aproximadamente 10-veces más altos de
IL-2 con transfección, a día 20 se observaron
niveles comparables en ambos grupos transfectados y
transducidos.
La transducción con VAA recombinante indujo
inicialmente niveles de producción de IL-2 más altos
en la línea celular de vejiga como los comparados para la
transfección usando liposomas (Fig. 5b). Similar a la línea celular
de próstata, la transducción de la línea celular de la vejiga mostró
también una reducción en los niveles de IL-2 a día
20, aunque los niveles de IL-2 a partir de la
transfección aumentaron durante este período; niveles comparables de
IL-2 se produjeron a partir del día 33 en ambos
grupos transfectados y transducidos.
En los experimentos precedentes descritos aquí,
se demostró una expresión transgénica significativa en las líneas
celulares en cultivo. Para evaluar si los complejos de liposomas
catiónicos: ADN plasmídico de VAA también mediaron expresión
transgénica comparable en células tumorales primarias recién
aisladas, células de cuatro tumores primarios diferentes fueron
transfectadas con plásmido de estudio de IL-2 de VAA
usando liposomas. Las células tumorales fueron cultivadas en medio
RPMI-1640 suplementado con FBS 10% durante
2-3 semanas previamente a la transfección. Las
células fueron puestas en placas a una concentración de 1 x 10^{6}
células por ml de y transfectadas con 10 microgramos de ADN
acomplejado con 10 nmoles de liposomas. Los sobrenadantes fueron
recogidos a día 2 y 3.
Como se muestra en la Fig. 6, los cuatro tipos de
células primarias produjeron niveles significativos de
IL-2 después de la transfección. El nivel de
expresión más alto se observó a día 3 durante el período de estudio
de 10 días (se estudiaron muestras de pulmón y una de mama durante
un período de tiempo más largo). La expresión del gen de
IL-2 fue seguida en células de tumor de pulmón y en
células de uno de los tumores de mama durante 25 días después de la
transfección en cultivo. Los niveles a día 15 fueron equivalentes
(100 pg/ml de IL-2) en ambas líneas celulares, y en
las células derivadas de tumores primarios, (datos no
mostrados).
Para determinar el efecto de la irradiación en la
expresión génica, la línea celular de próstata Fig. 7a) y células de
un tumor de mama primario (Fig. 7b) fueron transfectadas y evaluadas
en lo que se refiere a la expresión génica después de la irradiación
letal. Ambos tipos celulares fueron transfectados usando los
complejos óptimos de plásmido de VAA: liposomas. El segundo día
después de la transfección, un alícuota de cada cultivo fue sometida
a 6000 rad usando un irradiador de ^{60}Co, mediante el cual se
suprimió la división celular, y las alícuotas fueron mantenidas
después en cultivo. Una mitad de cada cultivo fue mantenida como un
testigo no irradiado. Las alícuotas fueron sometidas a 6000 rad
usando un irradiador ^{60}Co, mientras que el nivel de expresión
de IL-2 fue aproximadamente de
300-400 pg/ml. Los sobrenadantes fueron recogidos
24, 48, 72 y 96 horas después de la irradiación, y después fueron
ensayados en lo que se refiere a niveles de
IL-2.
Como se muestra en la Fig. 7a-b,
la irradiación letal posterior a la transfección no inhibió la
expresión transgénica. Ni la línea celular de próstata ni las
células tumorales primarias mostraron ningún cambio en la expresión
de IL-2 después de la irradiación. Así pues, aunque
se suprimió la división celular, la secreción de
IL-2 no fue sensible a la irradiación. Esto es
ventajoso, puesto que muchas estrategias de terapia génicas implican
la liberación de genes a los linfocitos T primarios (que
generalmente no se dividen en ausencia de activación) y con
frecuencia no pueden ser transducidos vía infección viral.
Para demostrar los niveles de expresión en base a
una célula, se usó el gen de
\beta-D-galactosidasa para
experimentos de transfección. Cada uno de los dos plásmidos de VAA
\beta-gal (pATK-Bgal y
pAADA-Bgal) (plásmidos obtenidos del Dr. Eli Gilboa,
Universidad de Duke) fueron acomplejados con liposomas catiónicos y
usados para transfección de la línea celular de próstata. Diez
microgramos de ADN plasmídico de pATK-\betagal o
de pAADA-\betagal fueron acomplejados con 10
nmoles de liposomas, los complejos fueron usados después para
transfectar 1 x 10^{6} células en un volumen de 2 ml. A diversos
puntos de tiempo, aproximadamente 5 x 10^{5} células fueron
recogidas y teñidas con el sustrato fluorescente FDG y analizadas
usando citometría de flujo.
La expresión transgénica máxima fue observada
entre el día 7 y el día 15 (Fig. 8). Los niveles significativos de
actividad \beta-gal fueron observados hasta el día
25. El análisis por citometría de flujo de las células
\beta-gal positivas mostraron niveles máximos de
10 a 50% de eficacia de transfección con ambas construcciones
plasmídicas. Los niveles disminuyeron hasta un 5 a 10% al día 25. El
patrón de expresión y duración fue similar al de la expresión de
IL-2 expuesta anteriormente.
El efecto de los complejos de plásmido de VAA:
liposoma para transfectar poblaciones de células T recién aisladas
de sangre periférica humana fue examinado. El gen para la enzima
cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) fue usado como el gen
reportero en el plásmido pA1CMVIX-CAT (Fig. 1). Las
construcciones pA1CMVIX-CAT fueron hechas usando el
esqueleto de VAA (pA1) con las secuencias potenciadoras inmediatas
tempranas del promotor de CMV y el gen CAT. Las subpoblaciones
totales y purificadas de células T CD4^{+} y CD8^{+} fueron
usadas para las transfecciones. Ambas subpoblaciones de células T
(CD3 o CD5/8 seleccionados) totales y (CD4 ó CD8 seleccionados)
purificadas Fig. 9a-d), así como células
progenitoras CD34^{+} (Fig. 10, descrita en la Sección G. a
continuación), muestran niveles significativos de expresión del
gen CAT.
Las células T primarias recién aisladas de sangre
periférica fueron ensayadas para determinar su expresión transgénica
usando complejos de ADN plasmídico de VAA: liposomas. Los resultados
de ensayos de cromatografía en capa fina para la actividad CAT de
las células T CD3^{+}, células T seleccionadas por CD5/8 (total de
células T), la subpoblación CD4^{+} de células T, y la
subpoblación CD8^{+} de células T están representadas en la Fig.
9a-d, respectivamente.
Los linfocitos T fueron fraccionados como
poblaciones CD3^{+}, ó CD5/8^{+} ó CD4^{+} ó CD8^{+} usando
dispositivos AIS MicroCELLector. Las células relevantes fueron
capturadas y las células no adherentes fueron retiradas mediante
lavado. Las células adherentes fueron retiradas de los dispositivos
después de 2 días en cultivo con RPMI-1640 y FBS10%.
De cinco a 10 x 10^{6} células fueron puestas en placas y
transfectadas con 50 microgramos de ADN plasmídico de VAA y 50 ó 100
nmoles de liposomas para obtener proporciones 1:1 ó 1:2 de
ADN:liposoma. Las células fueron recogidas 3 días después de la
transfección y los extractos celulares fueron normalizados por
contenido de proteína y se midió la actividad CAT usando un ensayo
cromatográfico. La sangre fue obtenida de los donantes a los que se
hace referencia como A ó B. Se usó sangre periférica del donante A ó
B para aislar células T, y para transfección.
Como se representa en la Fig.
9a-d, la composición lipídica de los liposomas que
comprenden VAA se varió, como lo fue la relación de ADN a liposoma.
En el estudio de de células T CD3^{+} (Fig. 9a) se emplearon
células de uno de los donantes (donante A). Para los estudios de
células T seleccionadas por CD5/8 (Fig. 9b), la subpoblación de
células T CD4^{+} (Fig. 9c), la subpoblación de células T
CD8^{+} (Fig. 9d), y células progenitoras CD34^{+} (Fig. 10),
descritas a continuación, se usaron células derivadas de dos
pacientes (donante A y donante B).
Para los estudios descritos en la Fig.
9a-d, se observaron niveles de expresión máximos a
días 2 y 3 en ambas subpoblaciones totales y purificadas. Se
detectaron niveles significativos de expresión a partir del día 14.
Las células fueron recogidas 3 días después de la transfección, y se
analizó el contenido de proteína normalizado para cada extracto para
determinar la actividad CAT. La misma composición de liposoma, y la
relación de ADN a liposoma indujo niveles de expresión similares en
todas las poblaciones.
Se examinó el efecto del complejo plásmido de
VAA: liposoma para transfectar células progenitoras CD34^{+}
recién aisladas de sangre periférica humana. Se usó el gen para la
enzima cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) como el gen reportero
en el plásmido pA1CMVIX-CAT (Fig. 1). Las
construcciones pA1CMVIX-CAT fueron hechas, como se
describe anteriormente. El nivel de expresión de CAT como se
determina por cromatografía en capa fina de las células progenitoras
CD34^{+} se expone en la Fig. 10.
Las células progenitoras de sangre periférica
CD34^{+} recién aisladas fueron transfectadas con complejos de ADN
plasmídico de CAT de VAA: liposomas. Las células CD34^{+} fueron
purificadas de sangre periférica usando AIS CD34 MicroCELLector
después de quitar esencialmente todas las células T usando el
dispositivo CD5/8 MicroCELLector. Las células progenitoras fueron
retiradas del dispositivo y 0,5-1 x 10^{6} células
fueron transfectadas con complejos que comprendían 10 microgramos de
ADN plasmídico y 10 nmoles de liposoma. Las células transfectadas
fueron cultivadas con medio que contenía factor de células
progenitoras, IL-3 e IL-1. A día 3
y día 7, las células fueron recogidas y se hicieron los extractos.
El contenido de proteína normalizado del extracto fue ensayado para
determinar la actividad CAT. Como se muestra en la Fig. 10., había
niveles significativos de expresión de gen CAT en las células
progenitoras CD34^{+} de sangre periférica.
La Fig. 11a-b ilustra análisis
por Southern de quimioluminiscencia potenciada (ECL) del ADN
genómico de los clones estables (clones estables al menos hasta
después del día 30) que fueron transfectados con complejos de ADN
plasmídico de VAA: liposoma de acuerdo con el invento. El ADN
genómico fue aislado y analizado usando el sistema de detección y
marcaje de ácidos nucleicos directo ECL (Amersham). La sonda de
IL-2 fue preparada a partir de 0,685 kb del gen de
IL-2 del pACMV-IL2. Después de la
hibridación, se lavó la membrana dos veces en 0,5x SSC/SDS 0,4% a
55ºC durante 10 minutos y dos veces en 2x SSC a temperatura ambiente
durante 5 minutos.
En la Fig. 11a, las muestras fueron digeridas con
Bam HI y Hind III e hibridadas con la sonda de IL-2.
Como se muestra en la Fig. 11a, todos los clones mostraron la
presencia del gen de IL-2, como se demostró por la
banda de 0,685 kb en ADN genómico digerido con Bam HI y Hind
III.
Para los datos en la Fig. 11, las muestras fueron
digeridas con Bam HI e hibridadas con el gen de
IL-2. De nuevo, todos los clones mostraron la
integración del gen de IL-2. (Fig. 11b) En la Fig.
11b, la integración de IL-2 fue demostrada por las
bandas de alto peso molecular (entre 1,6 y 2 kb), bandas que son
consistentes con la integración del gen junto con material genómico
hospedante unido obtenido por la vía de la digestión. Los datos en
la Fig. 11b indican que había más de un sitio de integración, puesto
que había múltiples bandas de alto peso molecular en el ADN genómico
digerido con Bam HI. Además, el sitio de integración se mostró que
estaba en sitios distintos en diferentes clones, como se demostró
por las bandas de distintos tamaños en los clones digeridos (Fig.
11b).
La Fig. 12a-b representa los
análisis de ADN cromosómico, usando un ensayo de Southern de
^{32}P, de los dos clones obtenidos del presente estudio. Se aisló
ADN nuclear de los dos clones de IL-2 (1A11 y 1B11)
usando el protocolo Hirt de fraccionamiento. Como un testigo
negativo, el ADN total fue aislado de células sin transfectar de la
línea celular R3327. Después de la digestión por enzimas de
restricción, 10 microgramos de cada muestra, junto con los plásmidos
testigo apropiados, fueron cargados en un gel de agarosa 1%,
sometidos a electroforesis, desnaturalizados y transferidos a una
membrana Hybond+. Los filtros fueron hibridados durante toda la
noche a 68ºC con fragmentos de ADN marcados con ^{32}P usando
cebadores aleatorios. Las membranas fueron lavadas después a 68ºC
durante 2 x 30 minutos cada una, con 2x SSC, SDS 0,1% y 0,2x SSC,
SDS0 1%. Los autorradiogramas de estos filtros fueron expuestos
sobre película de rayos X.
En la Fig. 12a, el gen IL-2 fue
de nuevo usado como sonda. Así, después de la transferencia por
Southern, el filtro representado en la Fig. 12a fue hibridado con un
fragmento Bam HI/Hind III de 0,68 kb de IL2 de
pACMV-IL2. Los datos en la Fig. 12a indican que el
número de copias del gen de IL-2 que se integró en
un clón, varió de clón a clón; este hallazgo fue demostrado por las
diversas densidades de la banda de 0,685 kb en las digestiones (como
se especificó en la breve descripción de los dibujos) de células de
los dos clones. Por otro lado, se demostraron también otras bandas
de peso molecular más alto, que es consistente con la integración
del gen de IL-2, junto con material genómico
hospedante obtenido de los diversos protocolos de digestión.
Para los datos mostrados en la Fig. 12b, el
filtro fue hibridado con un fragmento pvuII/HindIII de 0,85 kb (VAA
ITR/CMV) del plásmido pACMV-IL2. Los datos en la
Fig. 12b indican la presencia del VAA ITR derecho, como se demuestra
por la banda de 0,8 kb en el ADN cromosomal digerido con smaI y
pvuII. La presencia del ITR de VAA izquierdo en un clón (clón A) fue
demostrado por la banda de 2,1 kb en el ADN cromosomal digerido de
smaI y pvuII.
Un método de acuerdo con el invento, que utiliza
liposomas que comprenden material viral de VAA, es usado para
liberar genes para citoquinas, moléculas coestimuladoras tales como
B7, y moléculas que tienen antígenos MHC de clase I en una amplia
variedad de tipos celulares. Por ejemplo, tal material genómico
puede ser liberado en células tumorales primarias o líneas celulares
tumorales para proporcionar vacunas frente a tumores; en células de
sangre periférica o de médula ósea para tratar estados hematológicos
o neoplásicos.
Un método de acuerdo con el invento, que
comprende el uso de liposomas que contienen material viral de VAA,
es usado para liberar y expresar genes para sustancias tales como
péptidos, oligonucleótidos antisentido, y ARN. Tras la expresión de
tales péptidos, oligonucleótidos antisentido y ARN, la respuesta
inmune de un sujeto se modula. La modulación de la respuesta inmune
es bien la de inducir la respuesta inmune o inhibir la respuesta
inmune. Consecuentemente, la infección por VIH es tratada usando
oligonucleótidos antisentido, ARN o ribozimas que han sido
expresadas mediante un método de acuerdo con el invento.
Adicionalmente, la respuesta inmunológica a un tumor es modulada por
el uso de péptidos o ARN expresados de acuerdo con el invento. La
respuesta inmune de un paciente se modula de modo que responda a
antígenos específicos de tumores y/o asociados a tumores.
Consecuentemente, tumores no inmunogénicos son modificados a tumores
inmunogénicos que inducen una respuesta por células T citolíticas,
tanto in vivo como in vitro.
Un método de acuerdo con el invento es usado para
liberar genes a células linfoides primarias, tales como células B o
células T. Un método alternativo de acuerdo con el invento es usado
para libera material genético a células progenitoras CD34+.
Consecuentemente, los genes son expresados y son usados en terapia
para estados tales como infección por HIV, estados de defecto
genético, neoplasias, y estados autoinmunes, en los que se desea la
expresión de un gen de interés, como es apreciado por un profesional
con experiencia común en la técnica. Por ejemplo, para un estado
neoplásico maligno, el gen MDR I se libera de acuerdo con el
invento, se expresa, y tiene efecto
terapéutico.
terapéutico.
En un ejemplo adicional, las células CD8+ son
seleccionadas con AIS MicroCELLectors. La materia fuente para las
células CD8+ es sangre periférica para pacientes de VIH, y muestras
de tumores de pacientes con neoplasias. Las células T se activan
después según los métodos conocidos en la técnica, tales como
mediante el uso de fitohemaglutinina (PHA). Las células activadas
son hechas crecer durante 20 días. Después, las células son
transfectadas de acuerdo con el invento con complejos VAA: liposomas
que comprenden material genómico de IL-2. Las
células transfectadas son devueltas al paciente. Así, la
administración subsiguiente de IL-2 a un paciente
para mantener su actividad de células T citotóxicas se reduce.
Ventajosamente, el gen de IL-2, administrado de
acuerdo con el invento, permite cantidades reducidas de
IL-2 para ser proporcionadas de modo sistémico a un
paciente. Reduciendo la cantidad de IL-2 que se
administra sistémicamente es ventajoso, puesto que la
IL-2 administrada sistémicamente se asocia con
toxicidad letal relativa a la dosis.
Típicamente, los protocolos de vacunación frente
a tumores emplean células neoplásicas no proliferantes. La
proliferación de células neoplásicas se impide exponiendo las
células a radiación, o sometiendo a las células a cámaras de alta
presión. Se cree que cuando las células neoplásicas están presentes
en el cuerpo, aparte de una concentración tumoral inicial o focos,
el cuerpo es capaz de lanzar una respuesta antitumoral eficaz.
Algunos ensayos de vacunación tumoral han usado
tumores modificados genéticamente (GMT) para pacientes con melanoma
y cáncer de células renales, para potenciar la antigenicidad de las
células tumorales; estos ensayos han dependido de transferencia
génica retroviral ex vivo. La transferencia génica retroviral
ex vivo tiene las desventajas que es un método muy complejo
para realizar, y que debe haber una división de la célula diana
activa para lograr la incorporación y expresión de los genes
liberados. Por otro lado, puede ser muy difícil cultivar ex
vivo suficientes células neoplásicas para proporcionar una
cantidad adecuada de producto terapéutico.
Al contrario que para la transferencia génica
retroviral, las construcciones plasmídicas, que poseen los elementos
de repetición terminal de virus asociados a adenovirus (VAA) en
localizaciones 3' y 5' al gen que ha de ser transducido, fueron
expresadas eficazmente cuando se introdujeron vía transferencia no
viral mediada por liposomas. Por ejemplo, como se trata en mayor
detalle a continuación, los liposomas fueron usados para liberar
plásmido de VAA, tal como pMP6-IL2, que comprende
cADN para la interleuquina-2 en células tumorales
humanas primarias, tales como células de melanoma. Las células
tumorales primaras después expresaron subsiguientemente
interleuquina-2. Las líneas celulares tumorales
fueron también transfectadas de modo eficaz.
La expresión de IL-2 obtenida
mediante el uso de transfección de VAA-liposoma ha
sido duradera, y de niveles altos. Los niveles de secreción de
citoquinas a partir de células modificadas genéticamente mediante
composiciones de plásmido de VAA-liposoma han
excedido los niveles obtenidos a partir de células infectadas de
modo retroviral.
Consiguientemente, las células son modificadas
genéticamente mediante el uso de una composición que comprende
plásmido de VAA y liposomas; estas células modificadas genéticamente
son utilizadas en regímenes de vacunación tumoral terapéuticos.
Ventajosamente, la modificación génica mediante el uso de una
composición que comprende el plásmido de VAA y liposomas permitió
modificar a las células tumorales primarias, obviando de ese modo la
necesidad general de establecer una línea celular tumoral de células
tumorales primarias para afectar la modificación genética como ser
requería previamente a la presente descripción. Es también altamente
ventajoso que las células tumorales que son modificadas
genéticamente y que expresan IL-2 no necesiten ser
administradas junto con IL-2 sistémica: Se conoce
que la IL-2 sistémica induce efectos secundarios
extremadamente graves, incluso fatales.
La IL-2 sistémica es un
tratamiento actual para ciertos estados graves tales como neoplasias
malignas. Adicionalmente, las células T activadas se vuelven
dependientes de IL-2 exógena para el crecimiento y
supervivencia tanto in vitro como in vivo. Cuando se
retira el estímulo de IL-2, las células T sufren
apoptosis (fragmentación del ADN) en unos pocos días. La
IL-2 administrada sistémicamente, sin embargo, se
conoce que causa efectos secundarios graves, incluyendo la muerte.
No hay una necesidad por lo tanto, de desarrollar terapias que
eliminan o disminuyen la necesidad de administración de
IL-2 sistémica.
Los estudios representados por los siguientes
datos abordan el transporte en células T de ADN plasmídico de VAA y
el ADN transgénico mediante un sistema que no implica la
transducción viral. Más particularmente, los presentes datos se
refieren a la transfección, y utilizan el elegante sistema vehículo
de la lipofección y la hábil capacidad de transducción de las
construcciones plasmídicas de VAA.
Consiguientemente, los plásmidos VAA que
contienen el transgen y las repeticiones terminales de VAA fueron
usados como un vector ADN, y los liposomas catiónicos fueron usados
como moléculas vehículo. (Para una discusión general de la
transfección y expresión en linfocitos T, véase, Philip, R. y otros,
Mol. Cell. Biol. (1994) 14 (4): 2411-2418.)
En una realización preferida, el transgen es para
IL-2. Los complejos plásmido de VAA: liposomas
indujeron niveles de expresión del transgen comparables a los
niveles obtenidos mediante transducción de VAA recombinante.
Ventajosamente, los liposomas catiónicos facilitaron la entrada del
ADN plasmídico de VAA en células en ausencia de transcomplementación
por rep y capsid, virus recombinante o VAA silvestre. Los complejos
ADN plasmídico de VAA: liposomas transfectaron eficazmente las
células TIL. El ADN plasmídico de VAA acomplejado con liposomas
proporcionó niveles de expresión varias veces superiores que los
complejos con plásmidos estándar. Por otro lado, la expresión duró
durante un período de 30 días sin ninguna selección.
El sistema de expresión del gen de la
IL-2 para células T descrito aquí permite a las
células activadas producir suficiente IL-2 endógena
para sostener su mantenimiento in vivo; de esa manera la
apoptosis se evita y no hay necesidad de administrar
IL-2 sistémicamente.
En un estudio controlado, diversas poblaciones de
células T fueron transfectadas con un plásmido de VAA, que lleva el
cADN de IL-2 acomplejado con liposomas; estas
poblaciones fueron ensayadas en lo que refiere a su capacidad para
mantener el crecimiento y proliferación sin IL-2
exógena in vitro.
Para las células T, los ensayos mostraron que
cuando se transfectan con el gen de la IL-2, las
células T CD8+ primarias y activadas proliferan hasta niveles
superiores que el de los testigos transfectados con genes
irrelevantes.
Los niveles de crecimiento de las células CD8+
transfectadas con IL-2 fueron mantenidas sin
IL-2 exógena y la apoptosis fue significativamente
reducida. Los análisis por transferencia Southern sobre estas
células T transfectadas mostraron la presencia del plásmido de
IL-2 hasta 25 días. Los presentes datos demostraron
que la transferencia del gen de la IL-2 en células
CD8+ activadas y expandidas ex vivo sostuvo el crecimiento de
tales células, e impidió la apoptosis sin ninguna
IL-2 exógena.
Las células que pueden ser modificadas
genéticamente incluyen pero no se limitan a: carcinoma primario de
pulmón, ovarios y mama; melanoma; fibroblastos autólogos; células B
transformadas; células dendríticas; y células de líneas celulares.
Las células modificadas genéticamente tales como éstas pueden ser
usadas solas o junto con células tumorales para estimular las TIL.
Se puede hacer que las células modificadas genéticamente expresen
antígenos asociados a tumores (por ejemplo, HER2,
k-ras, mucinas) de uso para proporcionar
presentación antigénica para estimulación de TIL en cultivo. Por
otro lado, las células presentadoras de antígeno, tales como células
B transformadas y células dendríticas, pueden ser modificadas
genéticamente y hacer que expresen péptidos antigénicos asociados a
tumores tales como MAGE-1 y MART-1
para proporcionar presentación antigénica para estimulación de TIL
durante el cultivo. Los presentes datos establecen la capacidad para
transfectar células T y células neoplásicas con alta eficacia para
expresión tanto transiente como sostenida de ADN. La transfección
tuvo lugar en ausencia de ningún virus recombinante (producible a
partir de partículas rep y cap cápside en células infectadas por
adenovirus). Las células obtenidas mediante transfección por VAA son
usadas para tratar pacientes. Los pacientes tratados con tales
células obtienen notable beneficio terapéutico.
El plásmido (pACMV-IL2) contiene
el gen de la interleuquina-2 humana
(IL-2) como cADN de IL-2, y el
elemento potenciador del promotor inmediato temprano del
citomegalovirus humano (CMV), y las secuencias de preproinsulina de
rata y las secuencias de poliadenilación del SV40, flanqueadas por
repeticiones terminales invertidas (ITRs) del virus asociado a
adenovirus a ambos extremos. Un plásmido testigo correspondiente,
pBC12/CMV-IL2, fue idéntico al
pACMV-IL2 pero le faltaban las repeticiones
terminales del VAA, La Fig. 1 representa los mapas plasmídicos de
pACMV-IL2 y pBC12/CMV-IL2.
Como se muestra en la Fig. 2, el plásmido
pMP6-IL2 es un plásmido circular de doble hebra. El
plásmido pMP6-IL2 tiene el gen de la
interleuquina-2 humana bajo el control de un
promotor CMV y una señal de poliadenilación del SV40. Entre el
promotor y las secuencias codificantes de la IL-2
hay un intrón que potencia la expresión de la IL-2.
El casete de expresión completo está entre las secuencias terminales
izquierda y derecha del virus asociado al adenovirus. El plásmido
pMP6-IL2 también tiene el esqueleto Bluescript; el
esqueleto tiene un origen de replicación bacteriano
Col-E1 y un gen de resistencia a ampicilina que
facilita la propagación de este plásmido en E. coli.
Las Figuras 3 a-e representan la
secuencia de ADN del plásmido pMP6-IL2; los paneles
de a hasta e representan porciones sucesivas de la secuencia. En la
figura, las porciones de la secuencia pMP6-IL2 que
corresponden a secuencias conocidas de ADN están indicadas; la
información de secuencias correspondiente esta listada directamente
debajo de la información de la secuencia para el plásmido
pMP6-IL2. Las secuencias no marcadas son de los
sitios de unión.
Los plásmidos pMP6-IL2 fueron
purificados mediante lisis alcalina y precipitación con acetato
amónico. La concentración de ácidos nucleicos fue determinada
mediante absorción por UV a 260 nm.
El plásmido pAICMVIX-CAT contiene
el elemento potenciador del promotor CMV, las secuencias aceptoras
de corte y empalme que intervienen, el gen de la cloranfenicol
acetiltransferasa (CAT) bacteriana y la señal de poliadenilación
tardía del virus 540 de simio flanqueada por las repeticiones
terminales de VAA en un derivado de pBR 322.
Los plásmidos fueron purificados mediante lisis
alcalina y precipitación con acetato amónico. La concentración de
ácidos nucleicos fue medida mediante absorción de UV a 260 nm.
Los liposomas pequeños unilamelares fueron
preparados a partir de lípidos catiónicos, bromuro de
dioctadecil-dimetilamonio (DDAB) (Sigma), en
combinación con el lípido neutro,
dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE) (Avanti Polar
Lipids). Los lípidos fuero disueltos en cloroformo. El DDAB fue
mezclado con DOPE en una relación molar 1:1 en un frasco de fondo
redondo. La mezcla de lípidos fue secada en un evaporador rotatorio.
La película lipídica fue rehidratada añadiendo agua doble destilada
estéril para dar una concentración final de DDAB 1 mM. Esta
disolución fue sonicada en un sonicador de baño (Laboratory
Supplies, Hicksville, NY) hasta que se aclaró. Los liposomas fueron
almacenados a 4ºC en atmósfera de argón.
Los liposomas fueron preparados combinando el
lípido catiónico bromuro de
dioctadecil-dimetilamonio (DDAB) con el lípido
neutro dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE) en una
relación molar 1:1, o combinando DDAB con colesterol en una relación
molar 1:0,6, y evaporando los lípidos hasta secarlos en un
evaporador rotatorio. Los lípidos fueron resuspendidos en agua
desionizada estéril para dar una concentración de DDAB 1 mM y
después sonicados hasta aclarar la disolución en un baño de
ultrasonidos. Los liposomas fueron almacenados en atmósfera de argón
a 4ºC; y, fueron estables durante al menos 4 meses.
Los liposomas fueron preparados combinando los
lípidos catiónicos (DDAB) con bien el lípido neutro (DOPE) o bien
colesterol en una relación molar 1:1 ó 1:2 y evaporando los lípidos
hasta secarlos en un evaporador rotatorio. Los lípidos fueron
resuspendidos en agua desionizada estéril para dar una concentración
de DDAB 1 mM. La disolución fue después sonicada hasta aclarar la
disolución en un baño de ultrasonidos. Los liposomas fueron
almacenados en atmósfera de argón a 4ºC y fueron estables durante al
menos 4 meses.
Las células TIL fueron seleccionadas con AIS
MicroCELLectors®. La materia fuente fueron muestras de tumores o del
sistema linfático tomadas de pacientes con una neoplasia. Las
células T fueron después activadas según los métodos conocidos en la
técnica, tales como usando IL-2. Las células
activadas fueron hechas crecer durante 20 días.
Las poblaciones de células T primarias fueron
aisladas a partir de células mononucleadas de sangre periférica, y
células TIL y células tumorales fueron aisladas mediante el uso de
dispositivos del sujeto (Microcellector®, Applied immune Sciences).
Las células fueron preparadas para transfección según metodologías
estándar.
Para obtener una población celular que será
transfectada, las células fueron obtenidas a partir de lesiones
primarias o metastáticas sólidas, o a partir de tejidos del sistema
linfático. Por ejemplo, las biopsias de tumores de mama fueron
obtenidas de pacientes sometidos a cirugía con un diagnóstico
preoperatorio de sospechas de que no va a responder o cáncer de mama
recurrente. Estos estudios fueron también realizados con éxito con
células de tumores de ovarios. Los núcleos tisulares de la biopsia
fueron divididos con fragmentos procesados para patología de rutina
mediante microscopía óptica y análisis inmunohistoquímicos.
Consecuentemente, los tumores recién escindidos
fueron cortados en cubos de 0,5 cm. Hasta 10 cubos de tumores fueron
transferidos a un frasco rotatorio de 25 ml que contenía 25 ml de
medio AIM V (GIBCO). El frasco fue colocado en un incubador a 37ºC
que contenía CO_{2} 5%; el frasco fue agitado suavemente a 100-
120 RPM durante un período de 12-18 h. Después de la
incubación, cualquier tejido que no estuviera disgregado fue
filtrado, y después las células en suspensión fueron precipitadas.
Las células de cáncer de mama precipitadas fueron colocadas en
frascos de cultivo tisular (Falcon) en medio AIM V. las células
fueron mantenidas en aire humidificado que contenía CO_{2} 5%, a
una temperatura de 37ºC.
Después de 48 horas de cultivo en el medio libre
de suero, las líneas celulares adherentes y no adherentes fueron
generadas aspirando las células no adherentes. Las células no
adherentes fueron lavadas y después vueltas a cultivara en un frasco
nuevo. Durante el recultivo, las células adherentes fueron hechas
crecer hasta confluencia, tripsinizadas con tripsina 0,05% y EDTA
0,02%, y hechas un pase a alta densidad en frascos nuevos.
Alternativamente, las células tumorales primarias
de origen pulmonar, de ovario y mama fueron obtenidas a partir de
muestras tumorales sólidas y aisladas como sigue: el tumor fue
picado y sometido a digestión enzimática durante 2 horas. El tejido
fue después homogeneizado y lavado con PBS. Los linfocitos fueron
separados de células no linfoides mediante captura en dispositivos
AIS MicroCELLector-CD5/8. La población no adherente
que contenía células tumorales que fueron cultivadas en RPMI 1640 +
FBS 10% con L-glutamina y pen/estrept.
Como una fuente alternativa para células que
serán finalmente transfectadas, fluido ascítico maligno o efusiones
pleurales malignas fueron usadas para aislar células neoplásicas
autólogas. Consecuentemente, el líquido ascítico maligno o fluido de
efusión maligno fue centrifugado, y el precipitado que contenía las
células fue resuspendido en medio AIM V. Las células fueron contadas
y la subpoblación linfocitaria fue deplecionada bien usando un
gradiente de Ficoll en 2 etapas o usando dispositivos AIS CELLector
TM CD5/CD8. La elección de usar gradiente de Ficoll o dispositivo
AIS CELLector TM CD5/CD8 fue hecha en vista del número total de
células, como se aprecia por un profesional con experiencia común en
la técnica. El aislamiento de células neoplásicas a partir de una
fuente fluida es particularmente relevante en tumores malignos tales
como cáncer de ovario y de pulmón que se conoce que correlacionan
con efusiones pleurales. La fracción deplecionada de células T fue
potenciada en lo que se refiere a células neoplásicas.
Todas las células neoplásicas autólogas fueron
caracterizadas mediante microscopia óptica, citometría de flujo y
tinciones inmunohistoquímicas para ensayar al expresión de oncogenes
y para establecer un índice de proliferación. Por ejemplo, para
estudios en pacientes con cáncer de mama, sólo células que fueron
morfológicamente células de cáncer de mama o que dieron tinción con
anticuerpos específicos de cáncer de mama fueron consideradas
células tumorales autólogas, y después subsiguientemente utilizadas
como tales.
Las células de la línea celular de linfoma B
murino 38C13 fueron proporcionadas por el Dr. Bernd Gansbacher
(Sloan Kettering Memorial Cancer Center); línea celular de próstata
de rata R3327 fueron proporcionadas por el Dr. Eli Gilboa
(Universidad de Duke); y, las células de la línea celular de tumor
de mama MDA-231 fueron obtenidas de la ATCC.
Para transfección de células TIL,
5-10 x 10^{6} células fueron puestas en placas en
1 ml de medio libre de suero por pocillo de una placa de 6 pocillos.
50 \mug de ADN plasmídico que comprende material genómico de
IL-2 (por ejemplo, pMP6-IL2) fueron
mezclados con 50 nmoles de DDAB (como los liposomas compuestos de
DDAB y DOPE en una relación molar de 1:1). Se añadió medio libre de
suero (0,5 ml) al complejo de VAA: liposomas. El complejo de VAA:
liposomas y el medio libre de suero fueron entonces colocados con
las células. Para efectuar la lipofección, las células fueron
incubadas a temperatura ambiente durante 5 minutos, después se
añadió suero bovino fetal a las células para dar una concentración
final de 5% de suero bovino fetal.
Las células TIL transfectadas son devueltas al
paciente. Estas células proporcionan los beneficios terapéuticos de
células TIL citotóxicas en combinación con IL-2.
Ventajosamente, la necesidad de administrar sistémicamente
IL-2 a un paciente para mantener la actividad de
células T citotóxicas se reduce o elimina. Una reducción en la
cantidad de IL-2 administrada sistémicamente es
ventajosa puesto que la IL-2 administrada de esta
manera se conoce que correlaciona con una toxicidad relativa a la
dosis potencialmente letal.
Un cultivo de células neoplásicas, tal como un
cultivo de células de cáncer de mama o células tumorales de ovario,
fue transfectado de la siguiente manera: las células neoplásicas (1
x 10^{6} células) fueron transfectadas con 5 microgramos de ADN
plasmídico (por ejemplo, pMP6-IL2) mezclado con 30
nmoles de lípido total, en los que el lípido comprende liposomas
compuestos de DDAB y DOPE en una relación molar 1:1. Un ml de medio
AIM V fue añadido al complejo liposoma-ADN, y fue
incubado a temperatura ambiente durante 30 minutos. La combinación
del medio y el complejo liposoma-ADN fue después
transferida a las células. Las células fueron después incubadas a
37ºC durante 24 horas. Después de 24 horas, las células fueron
irradiadas letalmente (10.000 RADS).
Alternativamente, los complejos
ADN-liposoma fueron formados mediante el siguiente
método: la cantidad deseada de ADN fue transferida a un vial estéril
y uno o 2 nmoles de DDAB por \mug de ADN fueron añadidos y
mezclados. Después, 1 ml de medio libre de suero fue añadido al
complejo liposoma-ADN. Todas las células que habían
de ser transfectadas fueron puestas en placas de seis pocillos. Las
células tumorales primarias y líneas celulares de tumores fueron
puestas en placas a 1 x 10^{6} células por pocillo en 2 ml de
medio libre de suero. El complejo liposoma-ADN fue
añadido a las células e incubado durante 5 min a temperatura
ambiente. El FBS fue añadido para llevar la concentración final a
10%.
La expresión del transgen fue documentada
ensayando la expresión del IL-2 por células
irradiadas letalmente; estos ensayos de IL-2 pueden
ser mediante ensayo ELISA, de acuerdo con información conocida para
aquellos con experiencia común en la técnica.
Los sobrenadantes libres de células fueron
recogidos y su concentración de IL-2 fue
determinada mediante ELISA a diversos tiempos. Por ejemplo, los
ensayos de IL-2 fueron realizados en sobrenadantes
de 72 horas, en duplicado. Se definió como exitosa una transfección
de células modificadas genéticamente en la que se obtuvieron
concentraciones de IL-2 de 100 pg/72h/10^{6}
células.
Las células fueron recogidas a diversos puntos de
tiempo, lavadas con PBS y resuspendidas en paraformaldehído frío 1%
en PBS. Después de 10 minutos a 4ºC, las células fueron lavadas con
tampón de saponina frío (saponina 0,1%, FBS 10% en PBS) y teñidas
con anticuerpo de ratón anti IL-2 humana durante 15
minutos a 4ºC. Las células fueron después lavadas con tampón de
saponina frío y teñidas con anticuerpo de cabra anti F(ab')2
de ratón conjugado con FITC durante 15 minutos, a 4ºC. Las células
fueron lavadas con saponina, después con PBS y analizadas mediante
citometría de flujo.
El ADN cromosomal fue aislado mediante
fraccionamiento por HIRT. Después de digestiones por restricción, se
sometió a electroforesis a 5 \mug de ADN por muestra, transferidos
a membranas de nilón Hybond N+ e hibridadas con el fragmento de
0,685 kb de IL-2.
Las células diana fueron marcadas con 100 \muCi
de ^{51}Cr por 1 x 10^{6} células. 5000 células diana fueron
puestas en placas en triplicado en placas de 96 pocillos. Las
células efectoras fueron añadidas para dar una relación efector a
diana de 20:1. 100 \mul de sobrenadante de cada pocillo fueron
recogidos después de una incubación de 4 horas, y contadas en un
contador \gamma.
Para ensayar la proliferación, 5 x 10^{4}
células en 100 \mul de medio AIM V fueron puestas en placas en
triplicado en placas de 96 pocillos. A cada pocillo se añadió un
pulso de 1.\muCi de ^{3}H-timidina. Las células
fueron recogidas 24 horas más tarde y contadas con un contador de
centelleo.
Las células TIL fueron congeladas a diversos
puntos de tiempo en cultivo y después de experimentos de
estimulación. La restricción por TCR fue analizada mediante PCR de
transcriptasa inversa de acuerdo con metodologías conocidas en la
técnica.
La estimulación fue llevada a cabo con células
TIL cultivadas en una relación 50:1 con tumor autólogo irradiado; o
con tumor autólogo irradiado transfectado con IL-2.
El período de estimulación fue de 5-7 días. Estas
células fueron comparadas con las células TIL cultivadas en medio
AIM V suplementado con rIL-2 600 UI/ml. Las células
fueron ensayadas después de estimulación para determinar cambios en
fenotipo, actividad citotóxica, proliferación y repertorio de TCR.
Este método simple y rápido de estimular células TIL durante el
cultivo se utiliza para protocolos de transferencia génica tanto
in vitro como in vivo.
Como medios alternativos para estimular células
TIL en cultivo, se pueden añadir péptidos antigénicos asociados a
tumores directamente al cultivo de TIL.
Células para cultivar TIL con células
neoplásicas transfectadas, se transfectaron células neoplásicas, por
ejemplo, con pMP6-IL2, y se irradiaron. Veinticuatro
horas después de la irradiación, las células transfectadas fueron
lavadas, recogidas por tripsinización, precipitadas por
centrifugación, y resuspendidas en medio de cultivo. Las células
neoplásicas transfectadas e irradiadas se cultivaron después con
TIL.
La especificidad del tumor fue conservada por las
TIL durante el cultivo y expansión.
Consiguientemente, las células tumorales (tanto
autólogas como alogénicas unidas al HLA) fueron usadas para
reestimular las TIL seleccionadas durante la fase de expansión. Esto
es de un valor significativo porque se conoce que a veces la
especificidad de las células T por sus dianas disminuye durante el
curso de la expansión.
Así, las propias células tumorales fueron
genéticamente modificadas, por ejemplo con una composición que
comprende liposoma y pMP6-IL2, para incrementar más
su antigenicidad.
El cultivo de larga duración de las TIL induce a
menudo una expansión policlonal, con una disminución de la
especificidad tumoral mediante las células expandidas. Como se
muestra en la Fig. 13, cuando las células TIL expandidas fueron
estimuladas con tumor autólogo, la especificidad fue potenciada. La
especificidad de las TIL estimuladas con tumor transducido con
IL-2 fue mayor que con tumor sin modificar como se
evaluó por los repertorios de TCR. La especificidad potenciada de
las TIL cultivadas/estimuladas con tumor transfectado fue
particularmente notable por los datos obtenidos después de 30 días
de cultivo.
Los datos demostraron que los liposomas
catiónicos acomplejados con un plásmido de VAA eficazmente
transfectado a células tumorales primarias así como a líneas
celulares tumorales cultivadas. Hasta un 50% de las células
transfectadas expresaron IL-2 como se evaluó por los
niveles IL-2 intracelular, y la duración de la
expresión fue hasta 30 días. La irradiación de las células tumorales
después de la transfección no alteró los niveles de expresión
transgénica.
Los análisis de TCR demostraron la expansión de
células T específicas de tumores; estas células T específicas de
tumores que han sido afectadas por el cultivo de las TIL expandidas
en masa con tumor autólogo modificado genéticamente.
Para los datos representados en la Fig. 14,
células TIL de mama fueron aisladas de la efusión pleural con
dispositivos CD8 del sujeto, y cultivadas durante tres semanas en un
medio que contiene IL-2 600 UI/ml. Experimentos
análogos fueron realizados con TIL de tumor de ovario; los
resultados fueron consistentes con los resultados obtenidos con TIL
de tumor de mama.
Aproximadamente 10x10^{6} células TIL fueron
transfectadas con diversas composiciones que comprenden complejos
ADN de pMP6-IL2: liposomas. Dos composiciones de
liposomas, "RPR DDAB" (Nattermann Phospholipid GmBH, Colonia,
Alemania) y "1100-28" (Applied Immune Sciences,
Inc., Santa Clara, CA) fueron ensayadas. Los liposomas RPR DDAB
tenían una relación DDAB: DOPE de 1:1, los liposomas
1100-28 tenían un DDAB: DOPE relación de 1:0,6. Las
células TIL transfectadas fueron cultivadas después sin ninguna IL2
exógena, los testigos positivos fueron cultivados en presencia de
IL-2 600 UI/ml.
Cinco días después de la transfección, los grupos
transfectados y sin transfectar fueron marcados con ^{3}H timidina
y evaluados para determinar la incorporación. Las cuentas de los
testigos positivos fueron establecidas como el 100 por ciento. El
porcentaje de crecimiento osciló entre 40-80% para
los grupos transfectados con liposomas RPR DDAB, y entre
40-60% para el grupo de liposomas
1100-28.
Los datos representados en la Fig. 14 demuestran
que las TIL de cáncer de mama, cuando se transfectaron con el gen de
IL-2, no requirió IL-2 exógena para
mantener la proliferación in vitro.
Para los datos ilustrados en la Fig. 15, las TIL
de cáncer de mama fueron transfectadas con plásmido pMP6 que
contenía el gen de resistencia a neomicina y el gen murino Thy 1.2
(pMP6/neo/Thy1.2), como una realización alternativa del plásmido
pMP6 que contenía el gen de IL-2. El plásmido
pMP6/neo/Thy1.2 se acomplejó a liposomas DDAB: DOPE. Las
composiciones de liposoma fueron las mismas composiciones que las
descritas para los datos representados en la Fig. 14. A día 2, las
células transfectadas fueron teñidas con anticuerpos
anti-Thy1.2 PE (Pharmingen, San Diego, CA) y
analizadas mediante citometría de flujo. Como se representa en la
Fig. 15, el marcador de superficie de células T de ratón Thy1.2 se
expresó eficazmente en TIL CD8^{+} humanos transfectados.
Los siguientes datos fueron obtenidos mediante
transfección de células tumorales con pMP6-IL2.
Estos datos demostraron que las células tumorales fueron modificadas
genéticamente con éxito. Además de DDAB: DOPE, se utilizaron también
otras composiciones lipídicas. Estas composiciones lipídicas
diversas produjeron con éxito lipofección y posteriormente expresión
de citoquinas.
Se aislaron células de melanoma de foci
metastáticos siguiendo las metodologías de digestión enzimática
conocidas por los profesionales con conocimientos comunes de la
técnica. Las células fueron hechas crecer en DMEM suplementado con
suero de ternera fetal 5-10% y mantenidas en cultivo
por un período de entre 5 días a 8 años.
En la preparación para la lipofección, las
células tumorales fueron puestas en placas de 60 mm en un volumen de
5 x 10^{5} células/placa. El día siguiente a la puesta en placas,
los liposomas que comprendían 10-30 nmoles de lípido
catiónico y 2-10 \mug de ADN fueron mezclados y
transferidos en medio libre de suero a las monocapas adherentes. Las
células fueron incubadas durante 1-5 horas y se
añadió FCS al medio.
Diversas preparaciones de liposomas fueron
empleadas con éxito, incluyendo: DMRIE: DOPE en una relación 1:1
molar (Vical, San Diego CA); DOSPA: DOPE, relación de masa 3:1
(Gibco, Gaithersberg, MD) y DDAB: DOPE en una relación de 1:2
molar.
Las células transfectadas fueron expuestas a
niveles letales de irradiación X (5000 rads) 24 horas después de la
lipofección. Los sobrenadantes fueron recogidos a las 72 horas;
después los niveles IL-2 fueron medidos mediante
ELISA de acuerdo con la información conocida por aquellos
profesionales con conocimiento común en la técnica. El nivel de
expresión de IL-2 más alto obtenido con cada
preparación de liposomas está listada en la Tabla 4.
Consiguientemente, altos niveles de expresión
(>5.000 pg/ml) fueron detectados en células viables no
proliferantes hasta 26 días después de la irradiación.
Estos datos demuestran una transfección con éxito
de líneas celulares de melanoma humano vía liberación no viral,
mediada por liposomas del plásmido pMP6-IL2. La
transfección dio como resultado una producción significativa de
IL-2 después de irradiación letal.
Para comparar el nivel y duración de la expresión
del transgen después de transfecciones con diferentes construcciones
plasmídicas, la línea celular tumoral de próstata, R3327, fue
transfectada con 10 \mug de plásmido estándar
(pBC12/CMV-IL2) o 10 \mug de plásmido de VAA (pA
CMV-IL2) acomplejado a 10 nmoles de DDAB como
liposomas DDAB: DOPE 1:2.
Los sobrenadantes fueron recogidos a diversos
puntos de tiempo y ensayados mediante ELISA para determinar los
niveles de IL-2. Para los datos mostrados en la Fig.
10, los niveles de IL-2 fueron expresados como
pg/ml/10^{6} células en 24 horas de cultivo. La transfección con
el plásmido de VAA produjo niveles de IL-2
significativamente más altos que con el plásmido estándar. Además,
la transfección con el plásmido VAA causó la producción de
IL-2 durante al menos 30 días, al contrario que sólo
7 días con el plásmido de IL-2 estándar.
La Fig. 17 representa el análisis por
transferencia Southern de ADN cromosomal de células R3327
transfectadas con un plásmido de VAA (pACMV-IL2) o
el plásmido estándar (pBC12/CMV-IL2). La
transferencia fue hibridada con el fragmento Bam HI/Hind III de
0,685 kb del gen de la IL-2. En la Fig. 17, el
testigo (C) es un ADN de células sin transfectar. El inserto de
IL-2 se muestra en el último carril.
La línea celular de próstata R3327 fue
transfectada con el plásmido de IL-2 de VAA (tal
como pACMV-IL2) acomplejado con liposomas DDAB:
DOPE; los liposomas en una relación de composición DDAB:DOPE 1:1 ó
1:2. La relación ADN: liposoma fue de 10 \mug de ADN: 10 nmoles
DDAB en ambos grupos.
Las células transfectadas fueron teñidas a
diversos puntos de tiempo para determinar lo niveles de proteína
IL-2 usando un procedimiento de citometría de flujo
modificado como se describe aquí; los resultados se muestran en la
Fig. 18. Los datos en la Fig. 18 se representan como porcentaje de
células positivas que expresan la proteína IL-2. Las
células sin transfectar fueron usadas como testigos negativos y los
valores de los testigos fueron restados de los valores de los grupos
transfectados.
Los complejos de plásmido de
VAA-liposoma fueron empleados para transfectar
diversas células tumorales primarias. Una muestra de tumor de
pulmón, una de ovario, y dos de tumores de mama fueron aisladas a
partir de biopsias tumorales recientes. Las células tumorales fueron
cultivadas en medio RPMI-1640 suplementado con FBS
10% durante 2-3 semanas previamente a la
transfección.
Las células tumorales primarias fueron
transfectadas con 10 \mug de plásmido (tal como
pACMV-IL2) acomplejadas con 10 nmoles de DDAB como
DDAB: DOPE 1:1. Los sobrenadantes fueron recogidos a día 2 y 3. Los
niveles de IL-2 fueron medidos mediante ELISA; los
resultados se representan en la Fig. 6 en la que los niveles de
IL-2 se expresan como pg/ml/10^{6} células en 24
horas de cultivo.
Para determinar el efecto de la irradiación en la
expresión génica, las células de tumor primario de mama y células de
una línea celular de próstata (R3327) fueron transfectadas con una
composición que comprende pACMV-IL2 y complejos de
liposomas DDAB: DOPE, y ensayadas para la expresión génica posterior
a irradiación letal. Los datos para la línea celular tumoral se
muestran en la Fig. 19A, y los datos para las células tumorales
primarias están en la Fig. 19B. En estos estudios, el transgen fue
para IL-2. A día 2, una alícuota de las células fue
sometida a 6000r usando un irradiador de ^{60}Co y después
devueltas a cultivo. Los sobrenadantes fueron recogidos a 24, 48, 72
y 96 horas después de la irradiación y ensayadas para determinar los
niveles de IL-2. Como se muestra en la Fig. 19, la
irradiación letal seguida de transfección no inhibe la expresión del
transgen. En la Fig 19, los niveles de IL-2 están
expresados como pg/ml/10^{6} células en cultivos de 24 horas.
En los presentes estudios, el plásmido de VAA que
contiene el transgen y las repeticiones terminales de VAA fue usado
como un vector de ADN, y los liposomas catiónicos fueron usados como
moléculas vehículo. Se demostró que los complejos de ADN plasmídico
de VAA: liposomas transfectaron eficazmente células tumorales
primarias, líneas celulares cultivadas, células linfoides primarias,
y células progenitoras CD34+. También se demostró que, en ausencia
de cualquier virus recombinante (producibles a partir de partículas
rep y cap cápside en células infectadas por adenovirus) la
integración con niveles altos y expresión sostenida de transgen se
logró mediante el proceso de transfección elegante.
Además de los altos niveles de expresión, la
combinación de plásmido de VAA; los liposomas descritos aquí
indujeron una expresión de los genes de larga duración (más de 30
días) (Fig. 5a-b), al contrario que con la expresión
transitoria demostrada por la transfección mediada por liposomas
típica. Notablemente, la expresión sostenida se demostró en el grupo
lipofectado con el plásmido de VAA, así como en el grupo transducido
con VAA recombinante (Figs. 5a-b). Por otro lado, se
observaron niveles de expresión diez veces más altos con plásmido de
VAA comparado con la transfección de plásmido estándar, como se
muestra en la Fig. 4a-b.
En las condiciones de ensayo descritas aquí, no
hubo diferencia en eficacia entre transducción de VAA óptima y
máxima transfección con plásmido de VAA: liposoma. Acerca del
transcurso en el tiempo de la expresión, se había demostrado
previamente que los liposomas catiónicos mediaban sólo la expresión
transitoria de ADN plasmídico estándar en tipos celulares de
mamíferos (Felgner, P.L., y otros, "A highly efficient,
lipid-mediated DNA transfection procedure, "
Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) 84:
7413-7417; Rose, J.K., y otros, "A new
cationic liposome reagent mediating nearly quantitative transfection
of animal cells," Biotechniques (1991) 10:
520-525). Por otro lado, acerca de la eficacia de la
integración, se observó una eficacia de integración en el genoma
hospedante mucho menor en la anterior transfección mediados por
liposomas comparado con los resultados descritos aquí.
(Shaefer-Ridder, M., y otros, "Liposomes as
gene carriers: Efficient transfection of mouse L cells by thymidine
kinase gene," Science (1982) 215:
166-168). Como se muestra aquí, sin embargo, los
liposomas catiónicos acomplejados con ADN plasmídico de VAA que
llevan repeticiones terminales de VAA aumentaron la integración del
ADN genómico, relativo al plásmido estándar que carece sólo de las
repeticiones terminales (ITRs de VAA). Los liposomas que comprenden
el material plasmídico de VAA liberaron el ADN plasmídico en
ausencia de cualquier receptor de superficie específico de célula, y
reemplazaron la función del virus en la liberación génica.
En los presentes estudios, se demostró que los
vectores virales en conjunto pueden ser reemplazados por liposomas,
y se alcanzó una expresión e integración eficaces al utilizar la
construcción, incluyendo los elementos virales responsables de tanto
la eficacia como la integración. De este modo, se evita la
producción de virus para la infección, eliminando así de modo
virtual la posibilidad de un evento recombinante adverso. Los
resultados finales fueron llevados a cabo mediante el uso de un
proceso de transfección elegante que combina el plásmido de VAA y
liposomas catiónicos.
En una realización preferida, la combinación de
plásmido de VAA y liposomas catiónicos no sólo transfectaron
eficazmente las líneas celulares cultivadas, sino que también
transfectaron las células tumorales primarias y células de sangre
periférica tal como células T y células progenitoras. Estos datos
son notables puesto que la mayoría de las estrategias de terapia
génica implican la liberación de genes a linfocitos T primarios o
células tumorales. Previamente, estas estrategias han dependido ante
todo de la inserción transgénica en vectores retrovirales o vectores
de virus ADN. Una desventaja fundamental del sistema retroviral se
comprende que es la incapacidad de transfectar células primarias que
no están dividiendo. Los presentes estudios han mostrado que los
liposomas catiónicos que comprenden material de VAA mediaron la
transfección de ambos tipos celulares en división y no en división.
De acuerdo con el invento, el plásmido de VAA: liposoma catiónico ha
proporcionado un sistema de transfección altamente eficaz que logró
una expresión sostenida, de niveles altos.
Ventajosamente, los complejos de ADN plasmídico:
liposoma pueden ser liberados in vivo (tal como
administración intravenosa, intraperitoneal y aerosol) sin ninguna
toxicidad mensurable (Philip, R., y otros, "In vivo
gene delivery: Efficient transfection of T lymphocytes in adult
mice," J. Biol. Chem. (1993) 268:
16087-16090; Stribling, R., y otros,
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delivery into adult mice," Science (1993) 261:
209-211; Stewart, M.J., y otros, "Gene
transfer in vivo with DNA-liposome complexes:
Safety and acute toxicity in mice," Human Gene Therapy
(1992) 3: 267-275). De acuerdo con el
invento,la concentración de ADN puede ser optimizada para obtener la
máxima expresión. Así, la transferencia génica mediante el uso de
liposomas que contienen material de VAA transfirieron material VAA y
transgénico en una amplia variedad de tipos celulares ex
vivo, y se usa también in vivo. Estos resultados
presentes son de una inmensa ventaja para cualquier protocolo de
terapia génica.
Por otro lado, diversos tipos celulares
neoplásicos primarios, líneas celulares neoplásicas, y varias
subpoblaciones de células T fueron transfectadas con plásmidos de
VAA usando complejos de ADN: liposomas. Como se muestra aquí, los
liposomas catiónicos facilitaron las transfecciones de plásmidos
virales asociados a adenovirus (VAA) en las células. La transfección
de células tumorales primarias fue muy atractiva puesto que tales
células son generalmente muy difíciles de transfectar. Además de los
altos niveles de expresión, el uso de plásmidos de VAA: liposomas
indujo una expresión de transgen de larga duración (>30 días).
Por otro lado, cuando las células T activadas y vírgenes fueron
transfectadas con plásmidos de IL-2, se detectó el
plásmido en las células un mínimo de 25 días después de la
transfección en una condición no seleccionada. Estos descubrimientos
están en contraste con la expresión de corta duración demostrada con
transfección mediada por liposomas típica usando plásmidos
estándares.
Por otro lado, se encontró que las TIL
transfectadas con citoquina transgénica se expandían sin necesidad
de citoquina exógena. Este resultado es muy ventajoso puesto que las
TIL pueden ser proporcionadas a pacientes sin necesidad de tratarlos
con IL-2 sistémica, superando los efectos
secundarios graves del tratamiento de IL-2
sistémica.
La expresión del gen de IL-2 en
las células T transfectadas alteró los efectos de la retirada de
IL-2 exógena. Notablemente, las células T
transfectadas con IL-2 produjeron suficiente
IL-2 endógena para mantener su crecimiento y
proliferación y para evitar apoptosis que tiene lugar normalmente
con la retirada de IL-2 exógena de las células T
efectoras como es conocido en la técnica. La dependencia de
IL-2 exógena se eliminó.
Las células tumorales primarias de mama, de
pulmón y de ovario fueron transfectables usando complejos de ADN
plasmídico de VAA: liposomas. Las células tumorales primarias y en
cultivo transfectadas fueron capaces de expresar el producto
transgénico aún después de irradiación letal.
Las realizaciones de la presente descripción
incluyen esas células tumorales (ambas autólogas y alogénicas unidas
al HLA) pueden ser usadas para reestimular las células TIL
seleccionadas durante la fase de expansión. Las células neoplásicas
transfectadas se usan en protocolos de vacunación tumoral.
Típicamente, las células neoplásicas transfectadas son
proporcionadas juntas con un excipiente farmacéutico, y se conoce en
la técnica. Las células neoplásicas transfectadas son también usadas
para estimular las células TIL correspondientes durante el cultivo.
Los análisis de fenotipo, citotoxicidad y receptor de células T
demostraron que aunque las células TIL inicialmente mostraron
especificidad de células tumorales cuando fueron aisladas de un
tumor, el cultivo prolongado en rIL-2 indujo
frecuentemente expansión policlonal y pérdida de especificidad
tumoral. Mediante el cultivo de células TIL en un medio que
comprende células neoplásicas, y más preferiblemente células
neoplásicas transfectadas, la especificidad tumoral de las células
TIL expandidas fue apreciablemente aumentada.
Como se usa aquí y en las reivindicaciones
anexas, las formas singulares "a", "y", y "el/la"
incluyen referentes plurales a menos que el contexto dicte
claramente de otra manera. Así, por ejemplo, la referencia a "una
formulación" incluye mezclas de diferentes formulaciones y la
referencia a "el método de tratamiento" incluye referencias a
etapas equivalentes y métodos conocidos por aquellos profesionales
expertos en la técnica, y así sucesivamente.
A menos que se defina de otra manera, todos los
términos técnicos y científicos usados aquí tienen el mismo
significado como es comúnmente comprendido por un profesional con
experiencia común en la técnica a la que pertenece este invento.
Aunque cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a
aquellos descritos aquí pueden ser usados en la práctica o ensayo
del invento, los métodos y materiales preferidos son descritos
ahora.
Claims (43)
1. Una composición para manipulación genética que
comprende:
- un liposoma que comprende material lipídico; y
- ADV viral asociado a adenovirus que comprende una o más repeticiones terminales invertidas.
2. Una composición según la reivindicación 1, en
la que el ADN viral asociado a adenovirus está en un plásmido.
3. Una composición según la reivindicación 2, en
la que el plásmido es pMP6-IL2, como se muestra en
la Figura 3, o pACMV-IL2, como se muestra en la
Figura 1.
4. Una composición según cualquier reivindicación
precedente, en la que el ADN viral asociado a adenovirus comprende
dos repeticiones terminales invertidas.
5. Una composición según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, que comprende además una secuencia
genética de interés.
6. Una composición según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en la que una secuencia genética de
interés está integrada entre dos repeticiones terminales
invertidas.
7. Una composición según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en la que un promotor está integrado
entre dos repeticiones terminales invertidas.
8. Una composición según la reivindicación 7, en
la que el promotor es un promotor inmediato temprano de CMV, un
promotor inmediato tardío de CMV, un promotor temprano de CMV, un
promotor ADA o un promotor TK.
9. Una composición según cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 8, en la que la secuencia genética de interés
comprende un gen de IL-2 o un gen
\beta-gal.
10. Una composición según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en la que el material lipídico
comprende un lípido catiónico.
11. Un método para introducir una secuencia
genética de interés en una célula hospedante, método que
comprende:
- proporcionar una composición que comprende un liposoma, un ADN viral asociado a adenovirus que comprende una o más repeticiones terminales invertidas y una secuencia genética de interés; y
- poner en contacto ex vivo la composición con una célula hospedante que comprende material genético, mediante lo cual la secuencia genética de interés se introduce en la célula hospedante.
12. Un método según la reivindicación 11, en el
que la célula hospedante es una célula progenitora CD34+, una célula
T, una célula de una línea celular tumoral, o una célula tumoral
primaria.
13. Un método según la reivindicación 12, en el
que la célula hospedante es un linfocito infiltrante en tumores, una
célula CD3+, CD4+, o CD8+.
14. Un método según la reivindicación 12, en el
que la célula es de una línea celular tumoral, que es una línea
celular de vejiga, de próstata, de linfoma B o de riñón
embrionario.
15. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 14, en el que el liposoma comprende un lípido
catiónico.
16. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 15, en el que la composición es como se define
en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
17. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 16, que comprende además la integración del
material genético de interés en el material genético de la célula
hospedante.
18. Una célula transfectada mediante una
composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o que se
le ha introducido en ella una secuencia genética mediante un método
según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17.
19. El uso de una composición según una cualquier
de las reivindicaciones 1 a 10, o células hospedantes según la
reivindicación 18, para la fabricación de un medicamento para tratar
un estado seleccionado de entre un neoplasma, una infección, un
estado autoinmune, o una anormalidad genética.
20. El uso según la reivindicación 19, de una
composición según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10.
21. El uso según la reivindicación 20, en el que
la anormalidad genética comprende un gen inexistente o
defectuoso.
22. El uso según la reivindicación 20, en el que
el estado es una infección por VIH.
23. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 20 a 22, en el que la secuencia genética de interés
que codifica para un péptido, es un oligonucleótido antisentido o
ARN.
24. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 20 a 23, en el que la composición proporciona un
plásmido.
25. El uso según la reivindicación 24, en el que
el plásmido es pMP6-IL2, como se muestra en la
Figura 3, o pACMV-IL2, como se muestra en la Figura
1.
26. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 20 a 25, en el que la secuencia genética de interés
comprende una secuencia genética que codifica una citoquina, un
factor coestimulador, una molécula de MHC de clase I, un antígeno
específico de tumor o un antígeno asociado a tumores.
27. El uso según la reivindicación 20, en el que
el estado es un estado neoplásico maligno o una infección por VIH y
la secuencia genética comprende el material genómico de
IL-2.
28. El uso según la reivindicación 20, en el que
el estado es un estado neoplásico maligno y la secuencia genética
comprende el gen MDR I.
29. El uso según la reivindicación 20, que
implica poner en contacto la composición con una célula hospedante
ex vivo, mediante el cual la secuencia genética de interés se
introduce en la célula hospedante, y la célula hospedante es
autóloga o alogénica.
30. El uso según la reivindicación 29, en el que
la célula hospedante es una célula neoplásica, una célula
hematopoyética de médula ósea, o una célula de sangre
periférica.
31. El uso según la reivindicación 30, en el que
la célula hospedante es un linfocito infiltrante en tumores, una
célula de una línea celular tumoral o una célula tumoral
primaria.
32. Una composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10 o una célula según la reivindicación 18,
para usar en un método de tratamiento del cuerpo humano.
33. Un método para producir una proteína, método
que comprende:
- proporcionar una composición que comprende liposomas, ADN viral asociado a adenovirus que comprende una o más repeticiones terminales invertidas y una secuencia genética de interés;
- poner en contacto la composición con una célula hospedante, que comprende el material genético mediante el cual la secuencia genética de interés se introduce en la célula hospedante; y
- expresar una proteína codificada por la secuencia genética de interés.
34. Un método según la reivindicación 33, en el
que la célula hospedante es una célula progenitora CD34+, una célula
T, una célula de un línea celular tumoral, o una célula tumoral
primaria.
35. Un método según la reivindicación 34, en el
que la célula hospedante es un linfocito infiltrante en tumores,
célula CD3+, CD4+, o CD8+.
36. Un método según la reivindicación 34, en el
que la célula es de una línea celular tumoral que es una línea
celular de vejiga, de próstata, de linfoma B o de riñón
embrionario.
37. Un método según la reivindicación 33, en el
que la composición comprende un lípido catiónico.
38. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 33 a 37, en el que el ADN viral asociado a
adenovirus comprende un plásmido.
39. Un método de la reivindicación 38, en el que
el plásmido es pMP6-IL2, como se muestra en la
Figura 3, o pACMV-IL3, como se muestra en la Figura
1.
40. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 33 a 39, que comprende además la integración del
material genético de interés en el material genético de la célula
hospedante.
\newpage
41. Un método según cualquiera de las
reclamaciones 33 a 40, en el que la proteína expresada es un análogo
de linfoquinas.
42. Un método según la reivindicación 41, en el
que la proteína es IL-2.
43. Un método según la reivindicación 40, en el
que la proteína es P-galactosidasa, cloranfenicol
acetiltransferasa o MDR 1.
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