JPH0634727B2 - ベクタ−および形質転換体 - Google Patents
ベクタ−および形質転換体Info
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- JPH0634727B2 JPH0634727B2 JP59170351A JP17035184A JPH0634727B2 JP H0634727 B2 JPH0634727 B2 JP H0634727B2 JP 59170351 A JP59170351 A JP 59170351A JP 17035184 A JP17035184 A JP 17035184A JP H0634727 B2 JPH0634727 B2 JP H0634727B2
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- gene
- vector
- cells
- bpv
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は動物細胞遺伝子操作系における外来遺伝子の発
現物を分泌するベクターおよび形質転換細胞に関する。
更に詳しくは本発明は動物細胞中でも微生物細胞中でも
同様に増殖し得るいわゆるシャトルベクターに関するも
のである。
現物を分泌するベクターおよび形質転換細胞に関する。
更に詳しくは本発明は動物細胞中でも微生物細胞中でも
同様に増殖し得るいわゆるシャトルベクターに関するも
のである。
近年に到り牛パピローマウイルス・タイプＩ（以下，Ｂ
ＰＶ−Ｉと略す）の遺伝子を含むＤＮＡベクターを動物
細胞系に導入する試みが広く検討されている。（例えば
Eukaryotic Viral Vectors,79〜98頁，1982年 Y.Gluzm
an編，Cold Spring Harbor Laboratory;M.Low,N.Sarve
r,P.Howly,ウシパピローマウイルス，医学研究における
組換えＤＮＡ実験II，69〜88頁，1983年医学研究振興財
団編）。ＢＰＶ−１の特徴は動物細胞に感染した場合核
内染色体には組込まれずに染色体外プラスミドとして存
在し，コピー数も10〜200コピー／細胞と多数存在する
こと，又7944塩基対からなるＢＰＶの31％を削除した，
いわゆるＢＰＶ69（Bam HIとHind IIIで消化して31％
を除去した）の短かいベクターがけつ歯類由来のＢＰＶ
感受性細胞に感染してこれを癌化せしめ得ることが報告
されている。外来遺伝子発現用ベクターとしては複製，
維持に必要な最低限の機能を持つできるだけ小さいベク
ターを使用することが一般的であるから，ＢＰＶ系ベク
ターではＢＰＶ69が外来遺伝子発現の際に使用されてい
る。又ＢＰＶが感染した結果癌化した細胞は細胞分裂速
度が早まり，かつそれを継代培養する際に高価な血清の
要求度が減少するなどの有利な性質を獲得することが報
告されている。又生産されるタンパク質の多くは細胞外
に分泌される。
ＰＶ−Ｉと略す）の遺伝子を含むＤＮＡベクターを動物
細胞系に導入する試みが広く検討されている。（例えば
Eukaryotic Viral Vectors,79〜98頁，1982年 Y.Gluzm
an編，Cold Spring Harbor Laboratory;M.Low,N.Sarve
r,P.Howly,ウシパピローマウイルス，医学研究における
組換えＤＮＡ実験II，69〜88頁，1983年医学研究振興財
団編）。ＢＰＶ−１の特徴は動物細胞に感染した場合核
内染色体には組込まれずに染色体外プラスミドとして存
在し，コピー数も10〜200コピー／細胞と多数存在する
こと，又7944塩基対からなるＢＰＶの31％を削除した，
いわゆるＢＰＶ69（Bam HIとHind IIIで消化して31％
を除去した）の短かいベクターがけつ歯類由来のＢＰＶ
感受性細胞に感染してこれを癌化せしめ得ることが報告
されている。外来遺伝子発現用ベクターとしては複製，
維持に必要な最低限の機能を持つできるだけ小さいベク
ターを使用することが一般的であるから，ＢＰＶ系ベク
ターではＢＰＶ69が外来遺伝子発現の際に使用されてい
る。又ＢＰＶが感染した結果癌化した細胞は細胞分裂速
度が早まり，かつそれを継代培養する際に高価な血清の
要求度が減少するなどの有利な性質を獲得することが報
告されている。又生産されるタンパク質の多くは細胞外
に分泌される。
以上にのべた諸性質からＢＰＶ感染動物細胞を宿主とし
ＢＰＶをベクターとする遺伝子工学的物質生産系は種々
の有利性を持つものと期待されている。特に動物細胞を
宿主とする遺伝子操作系は糖タンパク質などの生産系と
しての利用が重要であると考えられる。糖タンパク質な
どの複合タンパク質が生合成される場合はＤＮＡ→ｍＲ
ＮＡ→タンパク質→糖，リピドなどの付加→細胞外分泌
の順序を経るが，例えば大腸菌，枯草菌などの原核生物
の場合にはタンパク質に糖やリピドを付加する活性を欠
いている。従ってこれらの微生物を宿主として糖タンパ
ク質の遺伝子を発現させてもそれのタンパク質部分しか
合成されず従って得られる目的物は天然品とはその化学
構造が違った物となる大きな欠点を持っている。又大腸
菌を宿主とした場合には目的物は分泌されずに菌体内に
蓄積するため菌体中での一部分解は避けられず，又培養
後菌体からの抽出を行なう必要がありその結果抽出収率
の低下，および目的物の純度低下などの好ましくない欠
点を持っている。
ＢＰＶをベクターとする遺伝子工学的物質生産系は種々
の有利性を持つものと期待されている。特に動物細胞を
宿主とする遺伝子操作系は糖タンパク質などの生産系と
しての利用が重要であると考えられる。糖タンパク質な
どの複合タンパク質が生合成される場合はＤＮＡ→ｍＲ
ＮＡ→タンパク質→糖，リピドなどの付加→細胞外分泌
の順序を経るが，例えば大腸菌，枯草菌などの原核生物
の場合にはタンパク質に糖やリピドを付加する活性を欠
いている。従ってこれらの微生物を宿主として糖タンパ
ク質の遺伝子を発現させてもそれのタンパク質部分しか
合成されず従って得られる目的物は天然品とはその化学
構造が違った物となる大きな欠点を持っている。又大腸
菌を宿主とした場合には目的物は分泌されずに菌体内に
蓄積するため菌体中での一部分解は避けられず，又培養
後菌体からの抽出を行なう必要がありその結果抽出収率
の低下，および目的物の純度低下などの好ましくない欠
点を持っている。
本来，動物細胞で生産されている物質の生産の目的のた
めには動物細胞を宿主とする遺伝子操作技術の方がより
好ましい系であり，従って動物細胞生産系の生産効率の
上昇が強く要望されているゆえんである。
めには動物細胞を宿主とする遺伝子操作技術の方がより
好ましい系であり，従って動物細胞生産系の生産効率の
上昇が強く要望されているゆえんである。
ＢＰＶ−１遺伝子をベクターとする動物細胞発現系は最
近活発に検討され，これを使用して高等動物由来の外来
遺伝子を発現させた例がいくつか報告されている。Mani
atisはヒトＨＬＡ遺伝子の発現を報告し(Mol.Gel.Biol.
4(2)340(1984))ヒトＩＦＮβ（Howleyら，Mol.Cel.Bio
l.3,233(1983))ＨＢｓ抗原(Hofschneldeら，Mol.Cel.Bi
ol.3,1032(1983)などの発現が知られている。
近活発に検討され，これを使用して高等動物由来の外来
遺伝子を発現させた例がいくつか報告されている。Mani
atisはヒトＨＬＡ遺伝子の発現を報告し(Mol.Gel.Biol.
4(2)340(1984))ヒトＩＦＮβ（Howleyら，Mol.Cel.Bio
l.3,233(1983))ＨＢｓ抗原(Hofschneldeら，Mol.Cel.Bi
ol.3,1032(1983)などの発現が知られている。
上述の例ではＢＰＶ69を使用しこれのBam ＨＩあるいは
Hind III切断点を利用して，その場所に外来遺伝子を
結合して発現ベクターの製造が実施されている。しかし
ながら上記ベクターでは目的とするタンパク質が十分満
足のいく効率で生産されないのが現状である。
Hind III切断点を利用して，その場所に外来遺伝子を
結合して発現ベクターの製造が実施されている。しかし
ながら上記ベクターでは目的とするタンパク質が十分満
足のいく効率で生産されないのが現状である。
本発明はＢＰＶ−１ベクターを使用することにより外来
遺伝子の発現効率が高い新規ベクターを提供することを
目的とする。
遺伝子の発現効率が高い新規ベクターを提供することを
目的とする。
本発明は、牛パピローマウイルス・タイプＩの遺伝子を
含むＤＮＡベクターを制限酵素ＰｖｕIIで切断して得ら
れる該牛パピローマウイルス・タイプＩ遺伝子の９７％
を含むＤＮＡフラグメントと、外来蛋白構造遺伝子およ
び該構造遺伝子の発現制御領域を含有するＤＮＡフラグ
メントとを結合、閉環してなる発現効率が高い新規ベク
ター、および該ベクターにより形質転換して得られる形
質転換体を提供するものである。
含むＤＮＡベクターを制限酵素ＰｖｕIIで切断して得ら
れる該牛パピローマウイルス・タイプＩ遺伝子の９７％
を含むＤＮＡフラグメントと、外来蛋白構造遺伝子およ
び該構造遺伝子の発現制御領域を含有するＤＮＡフラグ
メントとを結合、閉環してなる発現効率が高い新規ベク
ター、および該ベクターにより形質転換して得られる形
質転換体を提供するものである。
ＢＰＶ−１ＤＮＡを制限酵素BamＨＩで消化した線状Ｄ
ＮＡ（ＢＰＶ−１の100％を含む）および制限酵素BamＨ
ＩとHind IIIで消化して得られる大きい断片（ＢＰＶ
−１の69％を含む）と大腸菌ベクターｐＢＲ322の断片
（大腸菌中での複製の開始点およびアンピシリン耐性遺
伝子を含む）とを結合して動物細胞中でも大腸菌細胞中
でも維持増殖できるいわゆる“シャトルベクター”pdＢ
ＰＶ−１およびｐＢＰＶ69TなどがHowley博士より構築
され(Proc.Natl.Acad.Sci.,79,7147(1982))，本発明に
おいて使用したベクターもHowley博士より供与を受けた
上記２種のベクターである。
ＮＡ（ＢＰＶ−１の100％を含む）および制限酵素BamＨ
ＩとHind IIIで消化して得られる大きい断片（ＢＰＶ
−１の69％を含む）と大腸菌ベクターｐＢＲ322の断片
（大腸菌中での複製の開始点およびアンピシリン耐性遺
伝子を含む）とを結合して動物細胞中でも大腸菌細胞中
でも維持増殖できるいわゆる“シャトルベクター”pdＢ
ＰＶ−１およびｐＢＰＶ69TなどがHowley博士より構築
され(Proc.Natl.Acad.Sci.,79,7147(1982))，本発明に
おいて使用したベクターもHowley博士より供与を受けた
上記２種のベクターである。
上記ベクターに外来遺伝子を結合して動物細胞を宿主と
して発現させるためには，外来遺伝子をｍＲＮＡに転写
するプロモーターの下流に結合しなければならない。プ
ロモーターは動物ウイルス遺伝子のプロモーターもしく
は動物細胞遺伝子のプロモーターなどが好ましい。一例
としてＳＶ40初期プロモーター，ＳＶ40後期プロモータ
ー，アデノウイルス遺伝子のプロモーター，ＨＢウイル
ス遺伝子のプロモーター，レトロウイルス遺伝子のプロ
モーター等が動物ウイルス遺伝子のプロモーターとして
あげられる。また，チミジンキナーゼ遺伝子のプロモー
ター，メタロチオネイン遺伝子のプロモーター，インタ
ーフェロン遺伝子のプロモーター等が動物細胞遺伝子の
プロモーターとしてあげられる。本発明の実施例におい
てはＳＶ40初期プロモーターを使用した例について述べ
るが，これに限定されるものではない。
して発現させるためには，外来遺伝子をｍＲＮＡに転写
するプロモーターの下流に結合しなければならない。プ
ロモーターは動物ウイルス遺伝子のプロモーターもしく
は動物細胞遺伝子のプロモーターなどが好ましい。一例
としてＳＶ40初期プロモーター，ＳＶ40後期プロモータ
ー，アデノウイルス遺伝子のプロモーター，ＨＢウイル
ス遺伝子のプロモーター，レトロウイルス遺伝子のプロ
モーター等が動物ウイルス遺伝子のプロモーターとして
あげられる。また，チミジンキナーゼ遺伝子のプロモー
ター，メタロチオネイン遺伝子のプロモーター，インタ
ーフェロン遺伝子のプロモーター等が動物細胞遺伝子の
プロモーターとしてあげられる。本発明の実施例におい
てはＳＶ40初期プロモーターを使用した例について述べ
るが，これに限定されるものではない。
本発明で使用される外来遺伝子がコードするタンパク質
もしくはペプチドが本発明のベクターを使用することに
よって動物細胞で産生される。このタンパク質もしくは
ペプチドは特に限定されず通常有用な生理活性たんぱく
質，酵素，ペプチド等を示す。本発明ではインターフェ
ロンγの例を示すが，もちろん本発明はこれによって限
定されるものではない。
もしくはペプチドが本発明のベクターを使用することに
よって動物細胞で産生される。このタンパク質もしくは
ペプチドは特に限定されず通常有用な生理活性たんぱく
質，酵素，ペプチド等を示す。本発明ではインターフェ
ロンγの例を示すが，もちろん本発明はこれによって限
定されるものではない。
ＢＰＶ−１ベクターに，発現機能を持つ外来遺伝子を連
結し挿入する方法は多数存在する。ＢＰＶ−１をBam H
IとHind IIIで消化して31％のＤＮＡ断片を除去した残
りの69％断片は細胞中で維持増殖するというベクターの
基本的性質を保持するから，しばしばこの断片に外来遺
伝子が挿入されて発現が行なわれた。発現用ベクターと
しては，複製・維持に必要な最低限の機能をもつできる
だけ小さいベクターを用いることが，使いやすいという
利点もあり一般的である。従って外来遺伝子を挿入した
後でも，元のベクターと同じ位の長さにするという方法
が通常の方法である。ところが本発明では，P.M.Howley
から分与されたpdＢＰＶ−１ベクターを使用してＢＰＶ
由来のＤＮＡの中間に外来遺伝子を導入し，かつＢＰＶ
遺伝子を可能な限り，そのままの形で残すベクターの作
製方法について検討を加えたところ，従来のベクターよ
り発現効率の非常に高いベクターが得られることが発見
されたのである。
結し挿入する方法は多数存在する。ＢＰＶ−１をBam H
IとHind IIIで消化して31％のＤＮＡ断片を除去した残
りの69％断片は細胞中で維持増殖するというベクターの
基本的性質を保持するから，しばしばこの断片に外来遺
伝子が挿入されて発現が行なわれた。発現用ベクターと
しては，複製・維持に必要な最低限の機能をもつできる
だけ小さいベクターを用いることが，使いやすいという
利点もあり一般的である。従って外来遺伝子を挿入した
後でも，元のベクターと同じ位の長さにするという方法
が通常の方法である。ところが本発明では，P.M.Howley
から分与されたpdＢＰＶ−１ベクターを使用してＢＰＶ
由来のＤＮＡの中間に外来遺伝子を導入し，かつＢＰＶ
遺伝子を可能な限り，そのままの形で残すベクターの作
製方法について検討を加えたところ，従来のベクターよ
り発現効率の非常に高いベクターが得られることが発見
されたのである。
外来遺伝子を挿入する位置としては除去してもベクター
の機能を失なわないBamＨＩとHind III切断部位の中間
が望ましい。ＢＰＶ−１のBamＨＩ近傍には制限酵素Ｐv
u II切断部位が近接して２ケ所存在している（第１
図）。
の機能を失なわないBamＨＩとHind III切断部位の中間
が望ましい。ＢＰＶ−１のBamＨＩ近傍には制限酵素Ｐv
u II切断部位が近接して２ケ所存在している（第１
図）。
pdＢＰＶ−１には，これ以外にはＰvu II切断部位は存
在しないから，Ｐvu II消化により直線状のＤＮＡが得
られ，これはＢＰＶ−１遺伝子の97％を含む好ましいベ
クター断片（10.3kbの断片）であった。第１図から理解
されるように，この断片はＢＰＶ−１由来のＤＮＡの末
梢付近のみが削除（92-95％）された物で修飾の程度の
低いＤＮＡ断片である。
在しないから，Ｐvu II消化により直線状のＤＮＡが得
られ，これはＢＰＶ−１遺伝子の97％を含む好ましいベ
クター断片（10.3kbの断片）であった。第１図から理解
されるように，この断片はＢＰＶ−１由来のＤＮＡの末
梢付近のみが削除（92-95％）された物で修飾の程度の
低いＤＮＡ断片である。
ここに得られたＤＮＡ断片に，先にのべたプロモータと
結合した外来遺伝子を結合することにより，本発明にも
とずくＢＰＶベクターによる高発現ベクターの作製が完
成する。使用するプロモーターと目的タンパク質との結
合方法および上記断片への挿入方法はプロモーター，目
的遺伝子，塩基配列，制限酵素地図，必要とあれば合成
ヌクレオチドなどを利用すれば一般の遺伝子操作技術に
習熟した者に取って容易に設計し，実施できる物であ
る。以下にＳＶ40初期プロモータにＩＦＮγ遺伝子を結
合した例について説明するが，もちろん本発明はこれに
よって限定されるものではない。
結合した外来遺伝子を結合することにより，本発明にも
とずくＢＰＶベクターによる高発現ベクターの作製が完
成する。使用するプロモーターと目的タンパク質との結
合方法および上記断片への挿入方法はプロモーター，目
的遺伝子，塩基配列，制限酵素地図，必要とあれば合成
ヌクレオチドなどを利用すれば一般の遺伝子操作技術に
習熟した者に取って容易に設計し，実施できる物であ
る。以下にＳＶ40初期プロモータにＩＦＮγ遺伝子を結
合した例について説明するが，もちろん本発明はこれに
よって限定されるものではない。
ＩＦＮγのｃＤＮＡがｐＢＲ322中にクローニングされ
たプラスミドｐＩＦＮγ15をBamＨＩで切断して1.6kbの
ＤＮＡ断片を得，これをＤpnＩで消化してＩＦＮγ遺伝
子を含む0.8kbのＤＮＡを得た。ＳＶ−40プロモーター
はMulliganらにより作製されたpSV2 rabbit β globi
nをHind IIIとBgｌIIで消化してＳＶ40プロモーター，
ＳＶ40複製開始点，ｐＢＲ322の複製開始点およびアン
ピシリン耐性遺伝子を含む断片を得た。こうして得られ
た両断片をＴ４のリガーゼにより連結し，得られたプラ
スミドを用いて大腸菌を組みかえ，プラスミドの制限酵
素切断地図を用いてスクリーニングを行ない，目的とす
るプラスミドｐＳＶＩＦＮγ，即ちＳＶ40プロモータの
下流にＩＦＮγを持つ目的プラスミドが得られた。ｐＳ
ＶＩＦＮγをＡｃｃIIで消化すると目的のＳＶ40プロモ
ーターを含むＩＦＮγ遺伝子の断片が得られた。先に得
たＢＰＶ−１の97％を含むＤＮＡ断片とここに得たＳＶ
40プロモーターを含むＩＦＮγ遺伝子の断片とをＴ４リ
ガーゼで結合することにより，本発明にかかわる牛パピ
ローマウイルスタイプＩの遺伝子ＤＮＡのＰvu II切断
部位に外来遺伝子ＩＦＮγ（ＳＶ40のプロモーターを含
む）を挿入・連結したＩＦＮγの発現ベクターｐＳＶＩ
ＦＮγ／ＢＰＶ97の作製に成功した。
たプラスミドｐＩＦＮγ15をBamＨＩで切断して1.6kbの
ＤＮＡ断片を得，これをＤpnＩで消化してＩＦＮγ遺伝
子を含む0.8kbのＤＮＡを得た。ＳＶ−40プロモーター
はMulliganらにより作製されたpSV2 rabbit β globi
nをHind IIIとBgｌIIで消化してＳＶ40プロモーター，
ＳＶ40複製開始点，ｐＢＲ322の複製開始点およびアン
ピシリン耐性遺伝子を含む断片を得た。こうして得られ
た両断片をＴ４のリガーゼにより連結し，得られたプラ
スミドを用いて大腸菌を組みかえ，プラスミドの制限酵
素切断地図を用いてスクリーニングを行ない，目的とす
るプラスミドｐＳＶＩＦＮγ，即ちＳＶ40プロモータの
下流にＩＦＮγを持つ目的プラスミドが得られた。ｐＳ
ＶＩＦＮγをＡｃｃIIで消化すると目的のＳＶ40プロモ
ーターを含むＩＦＮγ遺伝子の断片が得られた。先に得
たＢＰＶ−１の97％を含むＤＮＡ断片とここに得たＳＶ
40プロモーターを含むＩＦＮγ遺伝子の断片とをＴ４リ
ガーゼで結合することにより，本発明にかかわる牛パピ
ローマウイルスタイプＩの遺伝子ＤＮＡのＰvu II切断
部位に外来遺伝子ＩＦＮγ（ＳＶ40のプロモーターを含
む）を挿入・連結したＩＦＮγの発現ベクターｐＳＶＩ
ＦＮγ／ＢＰＶ97の作製に成功した。
ここに得られる発現ベクターは大腸菌の中ではｐＢＲ32
2由来の部分により複製維持され，動物細胞中ではＢＰ
Ｖに由来する部分により複製維持されるいわゆるシャト
ルベクターである。従って本ベクターを大量に得るため
には大腸菌を宿主として培養増殖単離精製するのが好ま
しい。挿入遺伝子のタンパク質への発現はプロモーター
が動物細胞プロモーターを使用するために，大腸菌では
不可能で真核細胞を宿主に使用する必要がある。大腸菌
で大量に得た本ベクターを使用して真核細胞を組み換え
ることにより，目的タンパク質を生産する組換え細胞が
得られる。ＢＰＶ−１ＤＮＡを含むプラスミドが安定に
維持・増殖できる真核細胞としては，マウス由来のＣ−
127細胞，ＮＩＨ３Ｔ３などが知られている。動物細胞
にベクターＤＮＡを導入する手法は一般的な方法で充分
であり，例えば標準的リン酸カルシウム法などが適用で
きる。
2由来の部分により複製維持され，動物細胞中ではＢＰ
Ｖに由来する部分により複製維持されるいわゆるシャト
ルベクターである。従って本ベクターを大量に得るため
には大腸菌を宿主として培養増殖単離精製するのが好ま
しい。挿入遺伝子のタンパク質への発現はプロモーター
が動物細胞プロモーターを使用するために，大腸菌では
不可能で真核細胞を宿主に使用する必要がある。大腸菌
で大量に得た本ベクターを使用して真核細胞を組み換え
ることにより，目的タンパク質を生産する組換え細胞が
得られる。ＢＰＶ−１ＤＮＡを含むプラスミドが安定に
維持・増殖できる真核細胞としては，マウス由来のＣ−
127細胞，ＮＩＨ３Ｔ３などが知られている。動物細胞
にベクターＤＮＡを導入する手法は一般的な方法で充分
であり，例えば標準的リン酸カルシウム法などが適用で
きる。
ＢＰＶ−１ＤＮＡを含むベクターで形質転換された細胞
は癌化し，細胞分裂速度が著名に増加し，その結果，組
換え細胞にみが細胞密度は濃いいわゆるフォーカスを形
成するのでこの性質は組換え細胞ともと通りの宿主細胞
との選別が容易に実施できる有利さを有している。組換
え細胞の選別のためには，薬剤耐性遺伝子を持つベクタ
ーとＢＰＶ−１ＤＮＡを含むベクターとを混合した上で
Co-Transformationし，該薬剤耐性となった組換え細胞
をスクリーニングすれば，その組換え細胞は高頻度にＢ
ＰＶベクターでも形質転換されているという事実を利用
して組換え細胞を選別できる。ＢＰＶ−１ＤＮＡを含む
ベクターで形質転換される細胞としてはマウス由来のＣ
127細胞あるいはＮＩＨ３Ｔ３細胞などＢＰＶ−１を含
むベクターが安定に維持される細胞が好ましく使用され
る。
は癌化し，細胞分裂速度が著名に増加し，その結果，組
換え細胞にみが細胞密度は濃いいわゆるフォーカスを形
成するのでこの性質は組換え細胞ともと通りの宿主細胞
との選別が容易に実施できる有利さを有している。組換
え細胞の選別のためには，薬剤耐性遺伝子を持つベクタ
ーとＢＰＶ−１ＤＮＡを含むベクターとを混合した上で
Co-Transformationし，該薬剤耐性となった組換え細胞
をスクリーニングすれば，その組換え細胞は高頻度にＢ
ＰＶベクターでも形質転換されているという事実を利用
して組換え細胞を選別できる。ＢＰＶ−１ＤＮＡを含む
ベクターで形質転換される細胞としてはマウス由来のＣ
127細胞あるいはＮＩＨ３Ｔ３細胞などＢＰＶ−１を含
むベクターが安定に維持される細胞が好ましく使用され
る。
本発明によるＢＰＶ−１ベクターで形質転換された細胞
は，通常の培地例えばDulbeccoのＭＥＭ培地中で増殖
し，培地中に目的タンパク質例えばＩＦＮγを分泌す
る。組換え細胞は分裂速度が早く，かつ血清要求性が著
減するなどＢＰＶ−１69％ベクターで認められた有利な
性質を保持していた。
は，通常の培地例えばDulbeccoのＭＥＭ培地中で増殖
し，培地中に目的タンパク質例えばＩＦＮγを分泌す
る。組換え細胞は分裂速度が早く，かつ血清要求性が著
減するなどＢＰＶ−１69％ベクターで認められた有利な
性質を保持していた。
本発明のベクターは，発現効率の高いＢＰＶ−１ベクタ
ーである。本実施例に示したヒトインターフェロンγの
発現量は，ヒト扁桃腺由来リンパ球をＴＰＡとＰＨＡ−
Ｍで処理した際に合成される量の約30倍と非常に高い発
現であった。
ーである。本実施例に示したヒトインターフェロンγの
発現量は，ヒト扁桃腺由来リンパ球をＴＰＡとＰＨＡ−
Ｍで処理した際に合成される量の約30倍と非常に高い発
現であった。
以下，実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
実施例１ ＳＶ40プロモータの下流にＩＦＮγ遺伝子を持つプラス
ミドｐＳＶＩＦＮγの作製 ＩＦＮγ遺伝子がｐＢＲ322中にクローニングされたプ
ラスミドｐＩＦＮγ−15（特願昭59-139398号）をBamＨ
Ｉで切断して得られるＩＦＮγ遺伝子を含む1.6KbのＤ
ＮＡ断片をＤpnＩで消化し，アガロースゲル電気泳動を
行なった。0.8kbのＩＦＮγ遺伝子を含むＤＮＡ断片の
バンドを切り出し，電気溶出法によりＤＮＡ断片をゲル
から溶出させ，ミリポアフィルターろ過，フェノール−
クロロホルム処理，エーテル処理によりアガロースを除
きエタノール沈澱により精製した。
ミドｐＳＶＩＦＮγの作製 ＩＦＮγ遺伝子がｐＢＲ322中にクローニングされたプ
ラスミドｐＩＦＮγ−15（特願昭59-139398号）をBamＨ
Ｉで切断して得られるＩＦＮγ遺伝子を含む1.6KbのＤ
ＮＡ断片をＤpnＩで消化し，アガロースゲル電気泳動を
行なった。0.8kbのＩＦＮγ遺伝子を含むＤＮＡ断片の
バンドを切り出し，電気溶出法によりＤＮＡ断片をゲル
から溶出させ，ミリポアフィルターろ過，フェノール−
クロロホルム処理，エーテル処理によりアガロースを除
きエタノール沈澱により精製した。
次にｐＳＶ２ rabbit β globin(R.C.Mulliganet a
l,Science 209,1422(1980))をHind III，BgｌIIで消化
して得られる２つのＤＮＡ断片のうち，長い方のＤＮＡ
断片（ＳＶ40プロモーター，ＳＶ40ori,pBR322 ori,Am
耐性などを含む）を，上述のようにアガロースゲル電気
泳動，電気溶出法により精製した。このＤＮＡ断片を細
菌アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）処理により，脱
リン酸化した後，フェノール−クロロホルム処理により
ＢＡＰを失活させ，エタノール沈澱により精製した。E.
coli．ＤＮＡ polymerase Ｉ Large Frag-mentで末
端を平滑末端とした後，これと先に得られたＩＦＮγ遺
伝子を含む0.8kbのＤＮＡ断片とをＴ４リガーゼにより
連結した。大腸菌ＭＣ1061(J.Mol.Biol.138,179(1980))
を形質転換し，５×103コ／ngＤＮＡの頻度で形質転換
体を得た。得られた形質転換体から12コを任意に選び，
アルカリＳＤＳ法でプラスミドＤＮＡを調製し，制限酵
素処理アガロースゲル電気泳動法により，目的のプラス
ミドｐＳＶＩＦＮγ保持株を検索した。その結果，１株
が目的のプラスミドを保持していた。
l,Science 209,1422(1980))をHind III，BgｌIIで消化
して得られる２つのＤＮＡ断片のうち，長い方のＤＮＡ
断片（ＳＶ40プロモーター，ＳＶ40ori,pBR322 ori,Am
耐性などを含む）を，上述のようにアガロースゲル電気
泳動，電気溶出法により精製した。このＤＮＡ断片を細
菌アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）処理により，脱
リン酸化した後，フェノール−クロロホルム処理により
ＢＡＰを失活させ，エタノール沈澱により精製した。E.
coli．ＤＮＡ polymerase Ｉ Large Frag-mentで末
端を平滑末端とした後，これと先に得られたＩＦＮγ遺
伝子を含む0.8kbのＤＮＡ断片とをＴ４リガーゼにより
連結した。大腸菌ＭＣ1061(J.Mol.Biol.138,179(1980))
を形質転換し，５×103コ／ngＤＮＡの頻度で形質転換
体を得た。得られた形質転換体から12コを任意に選び，
アルカリＳＤＳ法でプラスミドＤＮＡを調製し，制限酵
素処理アガロースゲル電気泳動法により，目的のプラス
ミドｐＳＶＩＦＮγ保持株を検索した。その結果，１株
が目的のプラスミドを保持していた。
実施例２ ＢＰＶ−１のＰvu II切断部位にＩＦＮγ遺伝子が連結
されたベクターｐＳＶＩＦＮγ／ＢＰＶ97の作製 ＢＰＶ−１遺伝子を含むベクターとしてpdＢＰＶ−１(1
42-6)を使用した。(P.M.Howley et.al.,Proc.Natl.Aca
d.Sci.,79,7147(1982))。
されたベクターｐＳＶＩＦＮγ／ＢＰＶ97の作製 ＢＰＶ−１遺伝子を含むベクターとしてpdＢＰＶ−１(1
42-6)を使用した。(P.M.Howley et.al.,Proc.Natl.Aca
d.Sci.,79,7147(1982))。
ｐＳＶＩＦＮγ／ＢＰＶ97の作製手順を第１図に示す。
ｉ）pdＢＰＶ−１(142-6)からのＤＮＡの調製： pdＢＰＶ−１(142-6)をＰvu IIで消化した。アガロー
スゲル電気泳動で10.3kbのＤＮＡ断片を含むアガロース
ゲルを切り出した。実施例１と同様に電気溶出法により
ＤＮＡ断片を精製した。得られたＤＮＡ断片をＢＡＰに
より脱リン酸化した。フェノール−クロロホルム処理に
より，ＢＡＰを失活させた後にエーテル処理，エタノー
ル沈澱により精製した。
スゲル電気泳動で10.3kbのＤＮＡ断片を含むアガロース
ゲルを切り出した。実施例１と同様に電気溶出法により
ＤＮＡ断片を精製した。得られたＤＮＡ断片をＢＡＰに
より脱リン酸化した。フェノール−クロロホルム処理に
より，ＢＡＰを失活させた後にエーテル処理，エタノー
ル沈澱により精製した。
ii）ｐＳＶＩＦＮγからのＤＮＡ断片の調製： ｐＳＶＩＦＮγをＡcc IIで消化して，アガロースゲル
電気泳動で，2.9kbのＤＮＡ断片を含むアガロースゲル
を切り出した。実施例１と同様に，電気溶出法によりＤ
ＮＡ断片を精製した。
電気泳動で，2.9kbのＤＮＡ断片を含むアガロースゲル
を切り出した。実施例１と同様に，電気溶出法によりＤ
ＮＡ断片を精製した。
iii）ｐＳＶＩＦＮγ／ＢＰＶ97の構築： ｉ）で調製した10.3kbのＤＮＡ断片0.3μｇとii）で調
製した2.9kbのＤＮＡ断片0.1μｇをＴ４ＤＮＡリガーゼ
６単位を用いて，10℃で一晩反応させた。反応溶液の1/
2量を用いてＭＣ1061コンピテント細胞を常法に従い形
質転換し，1.4×104コ／μｇＤＮＡの頻度で形質転換体
を得た。得られたコロニーから，24個のコロニーを取り
上げ，アルカリＳＤＳ法でプラスミドＤＮＡを調製し，
アガロースゲル電気泳動法により，目的のプラスミドｐ
ＳＶＩＦＮγ／ＢＰＶ97の保持株を検索した。その結果
24株中３株が目的のプラスミドを保持していた。
製した2.9kbのＤＮＡ断片0.1μｇをＴ４ＤＮＡリガーゼ
６単位を用いて，10℃で一晩反応させた。反応溶液の1/
2量を用いてＭＣ1061コンピテント細胞を常法に従い形
質転換し，1.4×104コ／μｇＤＮＡの頻度で形質転換体
を得た。得られたコロニーから，24個のコロニーを取り
上げ，アルカリＳＤＳ法でプラスミドＤＮＡを調製し，
アガロースゲル電気泳動法により，目的のプラスミドｐ
ＳＶＩＦＮγ／ＢＰＶ97の保持株を検索した。その結果
24株中３株が目的のプラスミドを保持していた。
実施例３ ｐＳＶＩＦＮγ／ＢＰＶ97によるマウスＣ127細胞の形
質転換 実施例２で作製したヒトＩＦＮγ発現用ベクターｐＳＶ
ＩＦＮγ／ＢＰＶ970.5pmolと，ネオマイシン耐性遺伝
子を持つベクターｐＳＶ２−neo(D.J.Southern et al,
J.Mol.Appl.Genet.1,327,1982)0.1pmolとをリン酸カル
シウム法(F.L.Graham et al,Virology 54,536,1973)に
より約５×105個のＣ127細胞(D.R.Lowy et al,J.Vi-ro
l.26,191,1978)に導入した。1600μｇ／mlＧ418(GIBCO
社）及び10％牛胎児血清を含むダルベッコＭＥＭ培地
（日水製薬（株））からなる選択培地で17日間培養した
ところ，26個のＧ418耐性となった形質転換体が得られ
た。このうち17個のクローンを96穴マイクロプレート(C
orning社）に分離した。細胞がconfluentになるまで培
養し，２〜４日後の培地中のインターフェロン活性を測
定したところ，最高20300単位／ml以上のヒトインター
フェロンγを産生する組換え細胞株が得られた。結果を
第１表に示す。
質転換 実施例２で作製したヒトＩＦＮγ発現用ベクターｐＳＶ
ＩＦＮγ／ＢＰＶ970.5pmolと，ネオマイシン耐性遺伝
子を持つベクターｐＳＶ２−neo(D.J.Southern et al,
J.Mol.Appl.Genet.1,327,1982)0.1pmolとをリン酸カル
シウム法(F.L.Graham et al,Virology 54,536,1973)に
より約５×105個のＣ127細胞(D.R.Lowy et al,J.Vi-ro
l.26,191,1978)に導入した。1600μｇ／mlＧ418(GIBCO
社）及び10％牛胎児血清を含むダルベッコＭＥＭ培地
（日水製薬（株））からなる選択培地で17日間培養した
ところ，26個のＧ418耐性となった形質転換体が得られ
た。このうち17個のクローンを96穴マイクロプレート(C
orning社）に分離した。細胞がconfluentになるまで培
養し，２〜４日後の培地中のインターフェロン活性を測
定したところ，最高20300単位／ml以上のヒトインター
フェロンγを産生する組換え細胞株が得られた。結果を
第１表に示す。
なお，インターフェロン活性の定量は，S.Ru-binstein
らの方法(J.Virology.37,755,1981)により，ヒトＦＬ細
胞，Sindbis.virusを用いたＣＰＥ50法で行なった。標
準インターフェロンとしては，ＮＩＨ標準ヒトインター
フェロンγとすり合わせを行なった組換え大腸菌由来の
ヒトインターフェロンγ8300単位／mlを用いた。
らの方法(J.Virology.37,755,1981)により，ヒトＦＬ細
胞，Sindbis.virusを用いたＣＰＥ50法で行なった。標
準インターフェロンとしては，ＮＩＨ標準ヒトインター
フェロンγとすり合わせを行なった組換え大腸菌由来の
ヒトインターフェロンγ8300単位／mlを用いた。
実施例４ 形質転換体の有血清培地におけるヒトインターフェロン
γ産生能 実施例３で得られた形質転換体のうち，ヒトインターフ
ェロンγ産性能の高い，クローンについて，２〜４日お
きに培地を交換しながら，42日間に渡り，培地中に分泌
されたインターフェロン活性を測定した。
γ産生能 実施例３で得られた形質転換体のうち，ヒトインターフ
ェロンγ産性能の高い，クローンについて，２〜４日お
きに培地を交換しながら，42日間に渡り，培地中に分泌
されたインターフェロン活性を測定した。
すべてのクローンが培地交換のみで生き続けるととも
に，インターフェロンを産生し続けた。
に，インターフェロンを産生し続けた。
最も活性を高かったクローンNO.64−１は，42日間の合
計で約106細胞当り180万単位のヒトインターフェロンγ
を産生した。結果を第２図に示す。
計で約106細胞当り180万単位のヒトインターフェロンγ
を産生した。結果を第２図に示す。
実施例５ 形質転換体の無血清培地におけるヒトインターフェロン
γ産性能 実施例４で得られたクローンNO.64−１を10％牛胎児血
清を加えたダルベッコＭＥＭ培地及び血清を加えないダ
ルベッコＭＥＭ培地にて９日間培養し，インターフェロ
ン産生量及び到達細胞数を調べた。
γ産性能 実施例４で得られたクローンNO.64−１を10％牛胎児血
清を加えたダルベッコＭＥＭ培地及び血清を加えないダ
ルベッコＭＥＭ培地にて９日間培養し，インターフェロ
ン産生量及び到達細胞数を調べた。
到達細胞数すなわち細胞の増殖速度は，無血清培地にす
ると，有血清培地の場合の80％に減少したが細胞当たり
のインターフェロン産生は変わらなかった。第２表にそ
の結果を示す。
ると，有血清培地の場合の80％に減少したが細胞当たり
のインターフェロン産生は変わらなかった。第２表にそ
の結果を示す。
実施例６ 形質転換体の産生するヒトインターフェロンγの物性 実施例４で得られたクローンNO.64-1の産生したインタ
ーフェロン90単位を抗ヒトインターフェロンγ抗体3nl
(84単位のヒトインターフェロンγを中和する）あるい
は抗ヒトインターフェロンβ抗体12.5nl(560単位のヒト
インターフェロンβを中和する）で37℃30分間処理して
から残存インターフェロン活性を測定したところ抗ヒト
インターフェロンγ抗体で特異的に中和された。
ーフェロン90単位を抗ヒトインターフェロンγ抗体3nl
(84単位のヒトインターフェロンγを中和する）あるい
は抗ヒトインターフェロンβ抗体12.5nl(560単位のヒト
インターフェロンβを中和する）で37℃30分間処理して
から残存インターフェロン活性を測定したところ抗ヒト
インターフェロンγ抗体で特異的に中和された。
また，66単位のインターフェロンをpH２の条件下で４℃
30分間処理してから残存インターフェロン活性を測定し
たところ検出限界以下（18単位＞）であった。
30分間処理してから残存インターフェロン活性を測定し
たところ検出限界以下（18単位＞）であった。
この様に抗体により中和される，酸により失活するとい
う性質は，ヒトインターフェロンγに特異的な性質であ
る，測定結果を第３表に示す。
う性質は，ヒトインターフェロンγに特異的な性質であ
る，測定結果を第３表に示す。
参考例−１ ｐＳＶＩＦＮγ／ＢＰＶ69Tで形質転換したＣ127細胞の
ヒトＩＦＮγ産生能 実施例２で用いたＢＰＶ97の代わりにＢＰＶ69Tを使い
作製したヒトＩＦＮγ発現ベクターｐＳＶＩＦＮγ／Ｂ
ＰＶ69T0.5pmolとｐＳＶ２−neo0.1pmolとをリン酸カル
シウム法により約５×105個のＣ127細胞に導入した。16
00μｇ／mlのＧ418及び10％牛胎児血清を含むダルベッ
コＭＥＭ培地で15日間培養したところ，14個のＧ418耐
性となった形質転換体が得られた。これらを96穴マイク
ロプレートに分離し，細胞がconfluentになるまで４日
間〜７日間培養した。こうして得られた培地中のＩＦＮ
活性を９ケのクローンについて測定したところ2000〜40
00単位／mlであった。これは実施例３で示したクローン
32-1及び64-1のＩＦＮ産生量の1/5以下である。
ヒトＩＦＮγ産生能 実施例２で用いたＢＰＶ97の代わりにＢＰＶ69Tを使い
作製したヒトＩＦＮγ発現ベクターｐＳＶＩＦＮγ／Ｂ
ＰＶ69T0.5pmolとｐＳＶ２−neo0.1pmolとをリン酸カル
シウム法により約５×105個のＣ127細胞に導入した。16
00μｇ／mlのＧ418及び10％牛胎児血清を含むダルベッ
コＭＥＭ培地で15日間培養したところ，14個のＧ418耐
性となった形質転換体が得られた。これらを96穴マイク
ロプレートに分離し，細胞がconfluentになるまで４日
間〜７日間培養した。こうして得られた培地中のＩＦＮ
活性を９ケのクローンについて測定したところ2000〜40
00単位／mlであった。これは実施例３で示したクローン
32-1及び64-1のＩＦＮ産生量の1/5以下である。
測定結果を第４表に示す。
第１図は本発明のベクターｐＳＶＩＦＮγ／ＢＰＶ97の
作製方法を示す図であり，第２図は実施例４のクローン
NO.64-1を培地交換のみで維持した際に培地中に分泌さ
れるヒトＩＦＮγ力価の積分値を示すグラフである。
作製方法を示す図であり，第２図は実施例４のクローン
NO.64-1を培地交換のみで維持した際に培地中に分泌さ
れるヒトＩＦＮγ力価の積分値を示すグラフである。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｆ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ. ＵＳＡ，79（1982）Ｐ．7147−7151 Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，４ （２）（1984）Ｐ．340−350 Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３ （２）（1983）Ｐ．233−240 ＥＭＢＯ Ｊ．，２（９）（1983）Ｐ. 1487−1492 Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３ （６）（1983）Ｐ．1032−1039 Ｇｅｎｅ，21（３）（1983）Ｐ．267− 272
Claims (3)
- 【請求項１】牛パピローマウイルス・タイプＩの遺伝子
を含むＤＮＡベクターを制限酵素ＰｖｕIIで切断して得
られる該牛パピローマウイルス・タイプＩ遺伝子の９７
％を含むＤＮＡフラグメントと、外来蛋白構造遺伝子お
よび該構造遺伝子の発現制御領域を含有するＤＮＡフラ
グメントとを結合、閉環してなるベクター。 - 【請求項２】外来蛋白構造遺伝子がヒトインターフェロ
ンγである特許請求の範囲第(1)項記載のベクター。 - 【請求項３】牛パピローマウイルス・タイプＩの遺伝子
を含むＤＮＡベクターを制限酵素ＰｖｕIIで切断して得
られる該牛パピローマウイルス・タイプＩ遺伝子の９７
％を含むＤＮＡフラグメントと、外来蛋白構造遺伝子お
よび該構造遺伝子の発現制御領域を含有するＤＮＡフラ
グメントとを結合、閉環してなるベクターにより動物細
胞を形質転換して得られる形質転換体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59170351A JPH0634727B2 (ja) | 1984-08-17 | 1984-08-17 | ベクタ−および形質転換体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59170351A JPH0634727B2 (ja) | 1984-08-17 | 1984-08-17 | ベクタ−および形質転換体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6152286A JPS6152286A (ja) | 1986-03-14 |
| JPH0634727B2 true JPH0634727B2 (ja) | 1994-05-11 |
Family
ID=15903317
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59170351A Expired - Lifetime JPH0634727B2 (ja) | 1984-08-17 | 1984-08-17 | ベクタ−および形質転換体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0634727B2 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62215391A (ja) * | 1986-03-17 | 1987-09-22 | Ajinomoto Co Inc | 動物細胞の遺伝形質変換方法 |
| JP2536930Y2 (ja) * | 1989-05-23 | 1997-05-28 | 日本ビクター株式会社 | 給紙装置 |
| US6652850B1 (en) | 1993-09-13 | 2003-11-25 | Aventis Pharmaceuticals Inc. | Adeno-associated viral liposomes and their use in transfecting dendritic cells to stimulate specific immunity |
| US5834441A (en) * | 1993-09-13 | 1998-11-10 | Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. | Adeno-associated viral (AAV) liposomes and methods related thereto |
| JPH07163368A (ja) * | 1993-12-15 | 1995-06-27 | Hayashibara Biochem Lab Inc | 組換えｄｎａとその組換えｄｎａを含む形質転換体 |
-
1984
- 1984-08-17 JP JP59170351A patent/JPH0634727B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| ＥＭＢＯＪ．，２（９）（１９８３）Ｐ．１４８７−１４９２ |
| Ｇｅｎｅ，２１（３）（１９８３）Ｐ．２６７−２７２ |
| Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３（２）（１９８３）Ｐ．２３３−２４０ |
| Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３（６）（１９８３）Ｐ．１０３２−１０３９ |
| Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，４（２）（１９８４）Ｐ．３４０−３５０ |
| Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９（１９８２）Ｐ．７１４７−７１５１ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6152286A (ja) | 1986-03-14 |
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