JPH11510046A - アデノ関連ウイルスリポソーム及び樹状細胞をトランスフェクトして特異性免疫を刺激することにおけるそれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 細胞の遺伝子操作用組成物は脂質物質、及びアデノ関連ウイルス(AAV) 物質を含むリポソームを含む。典型的には、AAV 物質はプラスミドであり、AAV ゲノムの一つ以上の末端反復塩基を含む。AAV/リポソーム複合体を使用してＤＮＡを細胞に導入する方法が開示される。ＤＮＡが幹細胞、Ｔ細胞、原発性腫瘍細胞、腫瘍細胞系及び樹状細胞又はその他の抗原提示細胞に導入され、発現される。このようなトランスフェクトされた細胞は癌又は微生物感染症を有する被験者を治療する治療方法に使用される。腫瘍抗原又はウイルス抗原をコードするＤＮＡを有する樹状細胞はin vivo 投与により、又は抗原特異性リンパ球のex vivo の活性化、続いて被験者へのこれらのリンパ球の投与により腫瘍又はウイルス感染症を有する被験者を治療するのに使用される。

Description

【発明の詳細な説明】 アデノ関連ウイルスリポソーム及び樹状細胞をトランスフェクトして特異性免疫 を刺激することにおけるそれらの使用 関連出願の相互参照 本件出願は1995年７月21日に出願された仮出願60/001,312号、及び1995年11月 １日に出願された仮出願60/007,184号からの優先権を主張し、1995年12月１日に 出願された出願08/566,286号の一部継続出願であり、これは前記仮出願の主題を 含み、又その優先権を主張し、又この出願は1994年９月12日に出願された米国特 許出願第08/305,221号の一部継続出願であり、これは1993年９月13日に出願され た米国特許出願第08/120，605 号の一部継続出願（1995年６月６日に出願された ファイル・ラッパー継続米国特許出願第08/482,323号に有利となるように放棄さ れた）である。 発明の背景 発明の分野 分子生物学及び医療の分野の本発明はアデノ関連ウイルス(AAV) プラスミドに よるトランスフェクションを促進するための陽イオン性リポソームの使用により 細胞、特に樹状細胞及びその他の抗原提示細胞をトランスフェクトするための改 良された方法及び組成物に関する。関係する遺伝子、例えば、腫瘍関連遺伝子ま たはウイルス抗原の遺伝子を発現するトランスフェクトされた細胞が免疫化及び 治療に使用される。背景技術の説明 真核細胞のトランスフェクションは遺伝子治療の研究及び開発に関して次第に 重要な技術になってきている。遺伝子治療の進歩はＤＮＡを標的細胞に有効に導 入することができる送出系の開発に大部分依存している。幾つかの方法が培養さ れた細胞型中の異種遺伝子の安定または一時的な発現のために開発されていた。 これらはキャリヤー分子またはウイルスを使用する形質導入技術を含む。 殆どの遺伝子治療戦略はレトロウイルスまたはＤＮＡウイルスベクターへのト ランスジーン挿入による形質導入に頼っていた。しかしながら、アデノウイルス ベクター及びその他のＤＮＡウイルスベクターは感染性後遺症を生じることがあ り、反復投与後に免疫原性であることがあり、又制限された量のインサートＤＮ Ａのみをパッケージし得る。 ウイルスベクター系の中で、組換えアデノ関連ウイルス(AAV) 形質導入系が種 々の哺乳類細胞型に安定かつ有効に遺伝子を搬入するのに最も有効なベクター系 の一種であることがわかった(Lebkowski，J.S.ら，Mol.Cell.Biol.（1988）8:39 88-3996)。AAV DNA はウイルスＤＮＡの逆方向末端反復塩基(ITRs)により細胞Ｄ ＮＡに結合された一種〜数種のタンデムコピーとして細胞ＤＮＡに組込むこと、 及び組込まれたAAV ゲノムの物理構造はウイルス挿入がAAV 末端反復塩基を介し てタンデム頭尾配向で多重コピーとして通常現れることを示唆することが良く実 証されていた(Kotin，R.M.ら，Proc.Natl.Acad.Sci．USA (1990)87:2211-2215) 。こうして、AAV 末端反復塩基(ITRs)はAAV 形質導入系の必須部分である。 組換えアデノ関連ウイルス(AAV) ベクターはアデノウイルスベクターとは異な るが、トランスジーンＤＮＡサイズ制限及びパッケージング特性はその他のＤＮ Ａウイルスベクターと同じである。 AAV は直線状一本鎖ＤＮＡパルボウイルスであり、増殖性感染を達成するため に第二の無関係ウイルスによる同時感染を必要とする。AAV は二組の機能性遺伝 子：rep 遺伝子（これらはウイルス複製に必要である）、及び構造キャプシドタ ンパク質遺伝子を保有する (Hermonat，P.L.ら，J.Viol．(1984) 51:329-339)。 AAV のrep 遺伝子及びキャプシド遺伝子は所望のＤＮＡフラグメントにより置換 されてAAV プラスミドＤＮＡを生成し得る。rep 遺伝子及びキャプシド遺伝子の トランスコンプリメンテーション(transcomplementation)が組換えウイルス株を 生じるのに必要とされる。このようなウイルス株を使用する形質導入後に、一つ の組換えウイルスが核中で脱外被し、その分子末端により宿主ゲノムに組込む。 広範囲の進展がなされていたが、形質導入技術は可変の効率、内在性ウイルス による可能な組換えに関する重大な関心、細胞毒性及び宿主免疫反応を問題とし ている。こうして、非ウイルスＤＮＡトランスフェクション操作に対する要望が ある。 リポソームが核酸及びウイルス粒子を含む種々の物質を封入し、細胞に送出す るのに使用されていた(Faller，D.V．ら，J.Virol.（1984）49:269-272)。 合成陽イオン性脂質を含む予備生成されたリポソームがポリ陰イオン性ＤＮＡ と安定な複合体を生成することが示されていた(Felgner，P.L.ら，Proc.Natl.Ac ad.Sci．USA（1987）84:7413-7417)。膜融合促進脂質ジオクタデシルジメチル- アンモニウム−ブロミド(DDAB)を含む或る種の陽イオン性脂質を含むリポソーム である陽イオン性リポソームは異種遺伝子を真核細胞に有効に移入した(Rose,J. K.ら，Biotechniques（1991）10:520-525)。陽イオン性リポソームはトランスジ ーン、又はｍＲＮＡを種々の培養された細胞系に送出することによりそれらの高 レベルの細胞発現を媒介することができる(Malone，R．ら，Proc.Natl.Acad.Sci .USA（1989）86:6077-6081)。 環境栄養性及び両栄養性のパッケージされたレトロウイルスベクターはリポフ ェクチンの如き陽イオン性リポソームの存在下で(BRL，Gaithersburg，MD) 、又 特定のレセプターの不在下で(Innes，C.L.ら，J.Virol.（1990）64:957-961) 培 養細胞を感染することが示されていた。 たとえ、非ウイルス技術がウイルス系の問題の幾つかを解決していたとしても 、非ウイルス系における改良されたトランスフェクション効率、トランスフェク ト可能である細胞型の増大された範囲、トランスフェクトされた細胞中の発現の 増大された期間、及びトランスフェクション後の発現の増大されたレベルに関す る要望が依然として存する。或る種の改良された効率がプラスミドＤＮＡ構築物 中のプロモーターエンハンサー要素の使用により得られる(Philip，R．ら，J.Bi ol.Chem.（1993）268:16087-16090) 。 腫瘍細胞の免疫破壊 インターロイキン-2（IL-2）は、ヒトの癌の免疫介在性破壊の一つのアプロー チとして、転移性腎臓細胞癌腫の如き腫瘍を治療するのに使用されていた。永続 性の完全緩解が得られたが、総合の応答速度は低かった。 癌患者に対する組換えIL-2 (rIL-2)の試験（Chiron Corp.，Emeryville，CA） はIL-2投与の経路及びスケジュールに依存性である投与量制限毒性を明らかにし ていた。高投与量の巨丸剤IL-2投与はほぼあらゆる臓器系に関与する重大な毒性 と関連していた。更に、ECOG 0能力状態の患者における４％の死亡率が高投与量 IL-2で見られた。ECOG能力状態の大要について、例えば、Oken，Am.J.Clin.Onc- ol.（CCT）5:649-655 (1982)、654 頁の表２を参照のこと。 巨丸剤投与とは区別されるように、IL-2の低投与量(1-7 x 10⁶セタス(Cetus) 単位/M²/日) の連続静脈内注入の使用は臨床効力及び低下された毒性を示し、進 行癌の養子免疫治療における改良された安全性プロフィールを示唆した(West,W. H.ら，(1987) N.Engl.J.Med．316:898)。 IL-2と合わされた時に腫瘍の免疫破壊を潜在的に媒介又は促進する細胞集団は リンホカイン活性化キラー(LAK) 細胞及び細胞毒性Ｔリンパ球(CTL) 、特に腫瘍 浸潤リンパ球(TIL) を含む。TIL は主として単離でき、増加でき、in vitroで活 性化し得る腫瘍塊に並列して見られるＴリンパ球である。TIL はそれらのアフィ ニティー及びおそらく腫瘍細胞に対するそれらの特異性並びにそれらの細胞毒性 作用のために腫瘍の治療に重要である。TILsは外在性IL-2とともに患者に再度注 入され（例えば、米国特許第5,126,132 号、Rosenberg 、1992年６月30日）、こ れらは或る場合に進行悪性腫瘍の永続性の完全緩解をもたらした。 樹状細胞 望ましくない細胞、組織又は微生物、特に、腫瘍又はオンコジーンウイルス、 例えば、エプスタイン−バールウイルス(EBV) の破壊及び除去をもたらす多くの 試みが被験者中で免疫応答を誘発するためになされていた。一つの難点は腫瘍関 連抗原を免疫系に適切に提示して細胞免疫応答を誘発することにある。樹状細胞 （“DC”;複数が“DCs”である）は高度に強力な抗原提示細胞（“APC; 複数が (APCs”である）であることが知られている。DCs 及び免疫原性におけるそれら の役割の概説について、Steinman，R.，Annu.Rev.Immunol．9:271-296 (1991)を 参照のこと。その文献が参考としてそのまま含まれる。本発明は腫瘍抗原を提示 して特定の免疫応答をin vitro又はin vivo で誘発する手段としてこのような細 胞を使用する。 抗原特異性CTL は癌又はウイルス感染症の治療におけるそれらの潜在的な免疫 治療実用性に関する活発な研究の主題であった。癌腫を含む、腫瘍の幾つかの異 なる型で同定された腫瘍関連抗原(TAA) が腫瘍の細胞に対する溶解活性を有する CTL のin vitro生成に使用し得る。CEA （癌胎児性抗原）は結腸直腸癌、胃癌、 膵臓癌、非小細胞肺、及び乳癌の大部分で発現される公知のTAA である。MART-1 はメラノーマと関連する抗原の例である。本発明はCEA 及びメラノーマ抗原並び にその他の腫瘍関連抗原を標的とする。 発明の要約 陽イオン性リポソームが原発性細胞型及び培養細胞型のアデノ関連ウイルス(A AV) プラスミドトランスフェクションを促進するのに使用される。リポソームと 複合体形成されたAAV プラスミドＤＮＡは、通常のプラスミドを使用する複合体 よりも数倍高いレベルのＤＮＡの発現をもたらす。加えて、発現は選択しないで 30日の期間にわたって持続する。AAV プラスミド：リポソーム複合体は組換えAA V 形質導入により得られたものに匹敵するレベルのトランスジーン発現を誘発し た。高レベルの遺伝子発現が正常なヒト末梢血から新たに単離されたCD4⁺及びCD 8⁺Ｔ細胞、TILs及びCD34⁺幹細胞中で観察された。 原発性の乳、卵巣及び肺の腫瘍細胞が、AAV プラスミドＤＮＡ：リポソーム複 合体を使用してトランスフェクトされた。又、トランスフェクトされた腫瘍細胞 は致死照射後にトランスジーン産物を発現した。トランスフェクション効率はJ- ガラクトシダーゼ(J-gal) 遺伝子発現により評価して10〜50％の範囲であった。 原発性腫瘍細胞中でトランスジーンを発現する能力が利用されて腫瘍ワクチンを 生産し、又、癌及びエイズ、並びに遺伝子治療における細胞免疫応答の高度に特 異な変調を可能にするリンパ系細胞を生じる。 脂質物質及びAAV 物質を含むリポソームを含む宿主細胞の遺伝子操作用組成物 が本明細書に開示される。AAV 物質はpMP6-IL2又はpACMV-IL2 の如きプラスミド であることが好ましい。AAV 物質は逆方向末端反復塩基(ITR) 、又は２種以上の ITRsを含むことができる。２種のITRsがAAV 物質中に存在する場合、関係するＤ ＮＡ配列（又は“遺伝子物質”）が２種のITRsの間に組込み得る。更に、プロ モーターが２種のITRsの間に組込み得る。プロモーターは真核細胞、好ましくは 哺乳類細胞、更に好ましくはヒト細胞中で活性である幾つかのプロモーター、例 えば、CMV 即時−早期プロモーター、CMV 即時−後期プロモーター、CMV 早期プ ロモーター、ADA プロモーター、又はTKプロモーターのいずれかであってもよい 。組成物は関係するＤＮＡ配列、例えば、IL-2遺伝子又はJ-gal 遺伝子を含むこ とが好ましい。脂質物質は陽イオン性脂質を含むことができる。又、抗原提示細 胞、更に好ましくは樹状細胞を含む、組成物によりトランスフェクトされた細胞 が提供される。 関係する遺伝子配列を宿主細胞に導入する方法が本明細書に開示される。その 方法はリポソームAAV 物質及び関係する遺伝子配列を含む組成物を用意する工程 及びその組成物を宿主細胞（これは遺伝子物質を含む）と接触させ、それにより 関係する配列を宿主細胞に導入する工程を含む。宿主細胞はCD34⁺幹細胞、Ｔ細 胞、例えば、CD3⁺細胞、CD4⁺細胞、又はCD8⁺細胞、腫瘍細胞系の細胞、例えば、 膀胱癌、前立腺癌もしくはＢリンパ腫細胞、又は胚腎臓細胞系であってもよい。 又、腫瘍細胞は原発性腫瘍細胞であってもよい。組成物を用意する工程は陽イオ ン性脂質を含むリポソームを用意することを含み得る。又、プラスミド、例えば 、pMP6-IL2又はpACMV-IL2 を含むAAV 物質の組成物を用意することが含まれる。 関係する遺伝子配列を細胞に導入する方法は関係する配列を宿主細胞の遺伝子物 質に組込む工程を更に含み得る。 被験者、好ましくはヒトの治療方法が開示される。その治療方法は(a) 治療を 要する症状を有する被験者を用意し、(b) リポソームAAV 物質及び関係する遺伝 子配列を含む組成物を用意することを含む。その方法は組成物を宿主細胞と接触 させる工程を更に含み、それにより関係する遺伝子配列を宿主細胞に導入する。 接触工程はin vivo であってもよく、この場合、宿主細胞は被験者の細胞である 。又、その接触はex vivo であってもよく、この場合、その方法は関係する遺伝 子配列でトランスフェクトされた宿主細胞を被験者に送出する工程を更に含む。 本方法の被験者は腫瘍（悪性腫瘍を含む）、HIV 感染症を含む感染症、自己免疫 症状又は遺伝子異常、例えば、欠失遺伝子又は欠損遺伝子を有する被験者である ことが好ましい。 関係する遺伝子配列はペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又はＲＮ Ａをコードしてもよい。用意されるのに好ましいプラスミドとして、pMP6-IL2又 はpACMV-IL2 が挙げられる。関係する遺伝子配列はIL-2を含むサイトカイン（そ してIL-2ゲノムＤＮＡを含んでいてもよい）、同時刺激因子、MHC クラス１分子 、腫瘍特異性抗原もしくは腫瘍関連抗原又はMDR I 遺伝子をコードしてもよい。 その方法が本発明の組成物を宿主細胞と接触することを伴う場合、宿主細胞は腫 瘍細胞（原発性腫瘍細胞又は腫瘍細胞系の細胞）、骨髄造血細胞、末梢血細胞又 はTIL であってもよい。 その他の好ましいプラスミドは、pMP6-IL2プラスミドのIL-2遺伝子に代えて挿 入された関係するあらゆるその他の遺伝子を有する、本明細書に記載されたpMP6 主鎖を有する。 好ましい発現ベクターは図３（配列番号１）に実質的に示された遺伝子配列を 含む。又、実質的に配列番号１の遺伝子配列を含む発現ベクターが好ましい。別 の実施態様において、発現ベクターは配列番号１である遺伝子配列を含む。好ま しい実施態様において、発現ベクターは実質的にプラスミドpMP6の遺伝子配列、 又は実質的にプラスミドpMP6の遺伝子配列もしくはプラスミドpMP6の遺伝子配列 の遺伝子配列を含む。実質的にプラスミドpMP6の遺伝子配列の遺伝子配列を含む 発現ベクターは更にトランスフェクトされる細胞、例えば、腫瘍細胞又はDCに導 入すべき関係するＤＮＡ配列を含むことが好ましい。 又、実質的に配列番号１の遺伝子配列を含む発現ベクター又は先にリストされ た発現ベクターで遺伝的に修飾される細胞が提供される。遺伝的に修飾された細 胞は上記カテゴリーのいずれかの細胞であってもよい。 本発明はリポソーム、AAV 物質及び関係する遺伝子配列を含む組成物を用意す る工程を含むタンパク質の生産方法を提供する。上記組成物は遺伝子物質を含む 宿主細胞と接触され、それにより関係する遺伝子配列が宿主細胞に導入される。 タンパク質生産方法は関係する遺伝子配列によりコードされたタンパク質を発現 する工程を更に含む。宿主細胞はCD34⁺幹細胞、Ｔ細胞、腫瘍細胞系の細胞もし くは原発性腫瘍細胞、TIL、又はCD3⁺細胞、CD4⁺細胞、もしくはCD8⁺細胞であっ てもよい。細胞が細胞系、好ましくは腫瘍細胞系からのものである場合、 それは膀胱癌細胞、前立腺癌細胞、Ｂリンパ腫、又は胚腎臓細胞系の細胞であっ てもよい。 上記のタンパク質生産方法に用意された組成物は陽イオン性脂質及びAAV 物質 を含んでもよい。AAV 物質はプラスミド、例えば、pMP6-IL2又はpACMV-IL2 を含 むことが好ましい。 上記のタンパク質の生産方法は関係する遺伝子物質を宿主細胞の遺伝子物質に 組込む更に別の工程を含むことができる。タンパク質を発現する工程はリンホカ イン、例えば、IL-2、リンホカイン類似体、MDR-I 遺伝子の産物又はマーカーも しくはリポーター産物、例えば、J-gal もしくはクロラムフェニコール−アセチ ル−トランスフェラーゼ(CAT) を発現することを含むことができる。 本発明の別の目的は養子免疫治療に使用するための腫瘍抗原特異性CTL の生成 方法を提供することである。本発明者らによりとられたアプローチは、抗原によ るDCの直接負荷(loading) 又は抗原の発現をもたらす遺伝子構築物によるDCのト ランスフェクションにより所望の腫瘍抗原を発現し、提示するためのDCの使用を 伴った。このようなトランスフェクションは、本明細書に記載された方法及び組 成物、即ち、陽イオン性リポソームと複合体形成されたAAV プラスミドＤＮＡ（ これはTAA をコードするＤＮＡを含む）を使用して行われることが好ましい。又 、AAV プラスミド／陽イオン性リポソーム方法及び組成物はDCに関してその他の 抗原、例えば、ウイルス抗原、好ましくは有効な抗ウイルスＴ細胞又は抗体応答 の標的として利用できるHIV 抗原を発現するのに使用される。 本発明は、一局面において、DCの表面における非内在性ペプチド又はタンパク 質、特にTAA 又はウイルス抗原の発現に関する。更に、本発明は抗原を有する腫 瘍細胞又はウイルス感染細胞を死滅することができるCTL を生成するためのAPCs としてのDCの使用に関する。抗原は細胞を所望のペプチドでパルス化することに より、又は細胞を所望の抗原を発現することができるベクターでトランスフェク トすることによりDCに与えられ、それによりDCがペプチドをその表面に適当に提 示することができる。 CTL へのDC細胞による抗原提示がCTL により非常に有効な応答を誘発するとい う本件出願人の発見が与えられたとすると、所定のタンパク質又はペプチド抗原 をDC細胞に与える種々のその他の方法が抗原を有している腫瘍細胞又はウイルス 感染細胞を死滅することができるCTL を生成するのに使用し得るものと考えられ る。DCは培養中の強力な反応性リンパ球集団、好ましくはCTL を刺激するのに使 用されることが好ましく、次いでこのようなリンパ球が被験者に投与されて腫瘍 又はウイルス感染症の如き症状の治療を行う。別途、又は付加的に、免疫治療の 直接形態として、免疫原形態で所望の抗原を発現するDCが被験者に投与され、in vivo でCTL 応答又はその他の保護免疫応答を誘発するのに使用される。 本発明はDCに天然ではないＤＮＡ配列を含むベクターによりトランスフェクト された非不死化DCを提供する。又、リポソーム（これは脂質物質を含む）及びAA V 物質を含む組成物によりトランスフェクトされたDC又はその他のAPC が提供さ れる。AAV 物質は好ましくは腫瘍特異性抗原、腫瘍関連抗原、微生物抗原、サイ トカイン、細胞レセプター、リポーター分子又は選択可能なマーカーの一種以上 をコードする関係するＤＮＡ配列を含むプラスミドを含むことが好ましい。好ま しいプラスミドは関係するＤＮＡ配列が挿入されるpMP6である。 更に、本発明は (a) リポソーム、好ましくは陽イオン性脂質、AAV 物質、好ましくはプラスミド 、及び関係するＤＮＡ配列を含む組成物を用意する工程、及び (b) 工程(a) の組成物を細胞（その細胞は遺伝子物質を含む）と接触させ、その 結果、関係するＤＮＡ配列が細胞に導入される工程 を含む関係するＤＮＡ配列をDC又はその他のAPC に導入する方法に関する。好ま しいプラスミドは関係するＤＮＡ配列が挿入されるpMP6である。 上記方法において、関係するＤＮＡ配列は腫瘍特異性抗原もしくは腫瘍関連抗 原、微生物抗原、サイトカイン、細胞レセプター、リポーター分子又は選択可能 なマーカーの一種以上をコードすることが好ましい。腫瘍特異性抗原もしくは腫 瘍関連抗原は癌胎児性抗原、乳腫瘍抗原、結腸直腸腫瘍抗原、胃腫瘍抗原、膵臓 腫瘍抗原、肺腫瘍抗原、卵巣腫瘍抗原、膀胱腫瘍抗原、前立腺腫瘍抗原、メラノ ーマ抗原、白血病抗原又はリンパ腫抗原であってもよい。微生物抗原はウイルス 抗原又はバクテリア抗原であってもよい。ウイルス抗原はヒトレトロウイルス抗 原又はヒトＤＮＡウイルス抗原、好ましくはエプスタイン−バールウイルス抗原 又はHIV-1 抗原もしくはHIV-2 抗原であることが好ましい。サイトカインはIL-2 であることが好ましい。レセプターは神経成長因子レセプターであってもよい。 好ましいリポーター分子はバクテリアのクロラムフェニコールアセチルトランス フェラーゼである。 上記方法において、関係するＤＮＡ配列はトランスフェクトされた細胞の遺伝 子物質に組込んでもよく、又は組込まなくてもよい。 本発明は被験者中で選択された抗原に対する免疫応答を刺激することにより治 療し得る疾患又は症状を有する被験者の治療方法を提供し、その方法は (a) 被験者のDCs 又はその他のAPCsをリポソーム、アデノ関連ウイルス物質及び 選択された抗原をコードする関係するＤＮＡ配列を含む組成物とin vivo で接触 させ、その結果、ＤＮＡ配列を細胞に導入する工程、及び (b) ＤＮＡ配列によりコードされた抗原を発現させ、被験者の免疫応答を刺激し 、それにより被験者を治療する工程 を含む。 関係する実施態様において、その方法は (a) 樹状細胞又はその他の抗原提示細胞（これらの細胞は被験者に自己又は同種 である）をリポソーム、アデノ関連ウイルス物質及び選択された抗原をコードす る関係するＤＮＡ配列を含む組成物とex vivo で接触させ、その結果、ＤＮＡ配 列を細胞に導入する工程、 (b) ＤＮＡ配列によりコードされた抗原を細胞中で発現させる工程、及び (c) 抗原を発現する細胞を被験者に送出して免疫応答を刺激し、それにより被験 者を治療する工程 を含む。 更に別の関係する実施態様において、その方法は (a) 樹状細胞又はその他の抗原提示細胞（これらの細胞は被験者に自己又は同種 である）をリポソーム、アデノ関連ウイルス物質及び選択された抗原をコードす る関係するＤＮＡ配列を含む組成物とex vivo で接触させ、その結果、ＤＮＡ配 列を細胞に導入する工程、 (b) ＤＮＡ配列によりコードされた抗原を細胞中で発現させる工程、 (c) リンパ球を抗原を発現する細胞と接触させることによりそれらをex vivo で 活性化させる工程（その結果、リンパ球が抗原を有する宿主細胞に細胞毒性又は 特異的反応性になる）、及び (d) 活性化されたリンパ球を被験者に送出して被験者中の免疫応答を媒介し、そ れにより被験者を治療する工程 を含む。 上記治療方法において、治療すべき症状又は疾患は腫瘍又は感染症であっても よい。これらの方法により治療される腫瘍の例として、乳癌、直腸結腸癌、胃癌 、膵臓癌、肺癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、メラノーマ、白血病及びリンパ腫 が挙げられる。これらの方法により治療し得る感染症として、ヒトレトロウイル ス、好ましくはHIV-1 もしくはHIV-2 、HTLV-1、HTLV-2等、又はヒトＤＮＡウイ ルス、好ましくはエプスタイン−バールウイルスもしくはその他のヘルペスウイ ルスによる感染症が挙げられる。 上記治療方法において、関係するＤＮＡ配列は腫瘍特異性抗原、腫瘍関連抗原 又は微生物抗原の一種以上をコードすることが好ましい。腫瘍関連抗原又は腫瘍 特異性抗原として、癌胎児性抗原、乳腫瘍抗原、結腸直腸腫瘍抗原、胃腫瘍抗原 、膵臓腫瘍抗原、肺腫瘍抗原、卵巣腫瘍抗原、膀胱腫瘍抗原、前立腺腫瘍抗原、 メラノーマ抗原、白血病抗原又はリンパ腫抗原が挙げられる。微生物抗原として 、バクテリア又はウイルスの抗原、好ましくはHIV 抗原、例えば、HIV gag 、po l 、env 又はnef 遺伝子によりコードされたタンパク質のエピトープが挙げられ る。 上記治療方法において、関係するＤＮＡ配列は更にサイトカイン、同時刺激因 子又はMHC クラスＩ分子の抗原をコードしてもよい。 又、本発明は (a) タンパク質をコードするＤＮＡ配列を樹状細胞に導入し、そして (b) ＤＮＡ配列を発現させ、それによりタンパク質を生産することを含む樹状細 胞中のタンパク質の生産方法に関する。その導入は細胞を本明細書に記載された リポソーム、アデノ関連ウイルス物質及びＤＮＡ配列を含む組成物でトランスフ ェクトすることにより行われることが好ましい。 本発明の別の局面は選択された腫瘍関連抗原を有する修飾された樹状細胞を用 意し、細胞溶解性Ｔ細胞を前記腫瘍関連抗原を有する前記樹状細胞と接触させる ことを含む腫瘍関連抗原に対する免疫応答の誘発方法の提供である。接触はin v ivo又はin vitroで起こり得る。“修飾された”という用語は、樹状細胞が治療 すべき患者中の腫瘍の性質に基いて選択された腫瘍関連抗原を有するように変化 された樹状細胞を表す。 図面の簡単な説明 図１は本研究に使用された３種のプラスミドのプラスミドマップを示す。プラ スミドpACMV-IL2 はCMV プロモーター、IL-2ｃＤＮＡ及びラットプレプロインス リン並びにpBC12CMV/IL2プラスミドと同一のSV40ポリアデニル化配列を含んでい た。又、pACMV-IL2 は両末端にAAV 逆方向末端反復塩基(ITRs)を有していた。プ ラスミドpA1CMVIX-CATはCMV プロモーター及び二つのAAV ITRsの間に挿入された CAT 遺伝子で構築された。 図２はpMP6-IL2と称される、pMP6プラスミドのIL-2発現形態の詳細な制限マッ プを示す。 図3a-3e はpMP6-IL2プラスミドのヌクレオチド配列を示す。パネル3a-3e はそ の配列の連続部分を示す。既知ＤＮＡ配列に相当するpMP6-IL2配列の部分が示さ れる。相当する配列情報がpMP6-IL2プラスミドに関する配列情報の直ぐ下にリス トされる。マークされなかった配列はリンカーからのものである。 図4a及び4bはプラスミドＤＮＡ：リポソーム複合体により誘導された遺伝子発 現のレベルを示すグラフである。リポソームと複合体形成された種々のIL-2プラ スミド構築物がラット膀胱細胞系及びラット前立腺細胞系中で遺伝子発現(pg/ml /10⁶細胞として表される）を誘導するそれらの能力について試験された（図4a） 。両方の細胞系中で、AAV プラスミド構築物は最高レベルの発現を示した。図4b はAAV プラスミド：リポソーム複合体により誘導された遺伝子発現の時間進行を 示す。比較のために、前立腺細胞系がAAV プラスミド(pACMV-IL2) 及びリポソー ムと複合体形成された相当する対照プラスミド(pBC12/CMV-IL2) でトランスフェ クトされた。上澄みが種々の時点で回収され、ELISA を使用してIL-2レベルにつ いて評価された。IL-2レベルが培養24時間でpg/ml/10⁶細胞として表された。 図5a-5b はAAV プラスミド：リポソーム複合体媒介トランスフェクションを組 換えAAV 形質導入と比較する。AAV プラスミド：リポソーム複合体により誘導さ れた遺伝子発現のレベルがrAAV形質導入に等しいか否かを測定するために、前立 腺細胞系（図5a）及び膀胱細胞系（図5b）が使用されてIL-2遺伝子のトランスフ ェクション及び形質導入を比較した。培養24時間のpg/ml/ 10⁶細胞として表され たIL-2レベルが、ELISA を使用して評価された。 図６は種々の原発性腫瘍細胞のAAV プラスミド：リポソーム複合体によるリポ フェクション後のIL-2遺伝子の発現を示すグラフである。一つの肺腫瘍サンプル 、一つの卵巣腫瘍サンプル、及び二つの乳腫瘍サンプルが新鮮な腫瘍バイオプシ ーから単離された。IL-2レベル（培養24時間のpg/ml/ 10⁶細胞）が、ELISA を使 用して測定された。 図7a及び7bは致死照射にかけられたトランスフェクトされた細胞によるIL-2の 発現を示すグラフである。遺伝子発現に関する照射の効果を測定するために、前 立腺細胞系（図7a）及び原発性乳腫瘍細胞（図7b）が本明細書に記載されたよう にしてトランスフェクトされ、致死照射後にIL-2遺伝子の発現について評価され た（先の図と同様）。上澄みが照射後24時間、48時間、72時間及び96時間で回収 され、IL-2レベルについて試験された。 図８はJ-gal 遺伝子発現により測定されたAAV:リポソームトランスフェクショ ンの効率（細胞当たりの基準による）を示すグラフである。前立腺腫瘍細胞系が 本明細書に記載されたようにしてトランスフェクトされた。結果が蛍光細胞％（ J-gal について陽性）として表される。 図9a-9d はトランスフェクトされたＴリンパ球からつくられた薄層クロマトグ ラム(TLC) を示す。血液がＡ又はＢと称される二人のドナーから得られ、それか らＴ細胞がトランスフェクションのために単離された。これらのＴ細胞が、AAV プラスミド：リポソーム複合体を使用してトランスフェクトされた。Ｔリンパ球 れた：CD3⁺（図9a）、CD5⁺/8⁺（図9b）、CD4⁺（図9c）又はCD8⁺（図9d）。適当 な細胞が捕獲され、本明細書に記載されたようにして培養された。その後、5-10 x 10⁶細胞が塗布され、1:1 又は1:2 のＤＮＡ：リポソーム比を得るために 50μg のAAV プラスミドＤＮＡ及び50又は100nモルのリポソームでトランスフェ クトされた。細胞がトランスフェクションの３日後に回収された。抽出物からの タンパク質含量の基準化された量が、TLC アッセイを使用してCAT 活性について 評価された。 図10はAAV プラスミド：リポソームでトランスフェクトされた末梢血CD34⁺幹 細胞のTLCsを示す。細胞がトランスフェクション後の３日目及び７日目に回収さ れた。抽出物からのタンパク質の基準化された量が、TLC を使用してCAT 活性に ついて評価された。 図11a-11b はAAV プラスミドＤＮＡ：リポソーム複合体でトランスフェクトさ れたクローンからのゲノムＤＮＡの増進ケミルミネセンス(ECL) サザン分析の結 果を示す。図11a 中、サンプルがBamHI 及びHindIII で消化され、IL-2ＤＮＡで 探査された。図11b について、サンプルがBamHI で消化され、IL-2ＤＮＡで探査 された。分析された全てのクローンが、0.685 kbバンドにより実証されるように IL-2遺伝子の存在を示す。図11a 及び11b 中のレーンは下記のものを表す。レー ン１：１kbラダー；レーン２：BamHI/HindIII(9a) 及びBamHI/PvuII (9b)で切断 されたプラスミド；レーン３：トランスフェクトされなかったR33 ；レーン４− 11：クローン。 図12a-12b はクローン1A11及び1B11のサザン分析(³²P) の結果を示す。サザン ブロッティング後に、図12a に示されたフィルターがpACMV-IL2 の0.68kb IL2 B amHI/Hind IIIフラグメントで探査された。図12a 中、レーン１：BamHI/HindIII で切断されたクローン1A11；レーン２：BamHI/HindIII で切断されたクローン1 B11：レーン３：BamHI/HindIII で切断されたクローンR33 ；レーン４：BamHI で切断されたクローン1A11；レーン５：BamHI で切断されたクローン1B11；レー ン６：BamHI で切断されたクローンR33 ；レーン７：HindIII で切断されたクロ ーン1A11；レーン８：HindIII で切断されたクローン1B11；レーン９：HindIII で切断されたクローンR33 ；レーン10：エンプティー；レーン11：BamHI/HindII I で切断されたpACMV-IL2 プラスミド；レーン12：HindIII/PvuII で切断された pACMV-IL2 プラスミド；レーン13：BamHI/PvuII で切断されたpACMV-IL2 プラス ミド。図12b 中、フィルターがプラスミドpACMV-IL2 の0.85kb pvuII/Hind III (AAV ITR/ CMV)フラグメントで探査された。レーン１：SmaIで切断されたクロー ン1A11；レーン２：SmaIで切断されたクローン1B11；レーン３：SmaIで切断され たクローンR33 ；レーン４：PvuII/HindIII で切断されたクローン1A11；レーン ５：PvuII/HindIII で切断されたクローン1B11；レーン６：PvuII/HindIII で切 断されたクローンR33 ；レーン７：BamHI/HindIII で切断されたpACMV-IL2 ；レ ーン８：HindIII/PvuII で切断されたpACMV-IL2 ；レーン９：SmaIで切断された pACMV-IL2 ；レーン10：１kbラダー。 図13は(a) 自己腫瘍、(b) IL-2形質導入腫瘍、及び(c) IL-2単独で増加された 乳癌TIL のRNAase保護を使用するＴ細胞レセプター(TCR) レパートリー分析の結 果を示す。“VJ”はTCR J 鎖の可変セグメントであり、“CJ”はTCR J 鎖の一定 セグメントである。横軸のＡ、Ｂ、及びＣは３人の異なるヒト被験者を表す。 図14はIL-2遺伝子トランスフェクションの５日後に測定された乳腫瘍を浸潤す るTIL の増殖を示す。 図15は(IL-2遺伝子に代えて) ネオマイシン耐性遺伝子及びThy 1.2 遺伝子を 含むpMP6プラスミド(pMP6/neo/Thy1.2)でトランスフェクトされた乳癌TIL 中の 遺伝子発現の効率を示す。そのpMP6/neo/Thy1.2 プラスミドがDDAB:DOPE リポソ ームに複合体形成された。リポソーム組成物は図14に使用されたのと同じ組成物 であった。 図16は種々のプラスミド構築物によるトランスフェクション後のトランスジー ン発現のレベル及び期間の比較を示す。前立腺腫瘍細胞系R3327 が通常のプラス ミドpBC12/CMV-IL2 又はDDAB:DOPE リポソームに複合体形成されたAAV プラスミ ドpACMV-IL2 でトランスフェクトされた。上澄みが種々の時点で回収され、IL-2 レベル（培養24時間のpg/ml/ 10⁶細胞として表される）についてELISA により評 価された。 図17はAAV プラスミドpACMV-IL2 又は通常のプラスミドpBC12/CMV-IL2 でトラ ンスフェクトされたR3327 細胞からの染色体ＤＮＡのサザンブロット分析を示す 。ブロットがIL-2遺伝子の0.685 kb BamHI/HindIIIフラグメントで探査された。 “C”とマークされたレーンはトランスフェクトされなかった細胞からのＤＮＡ を含んでいた。IL-2インサートが“プラスミド”とマークされた最後のレーンに 示 される。 図18は前立腺腫瘍細胞系R3327 中のIL-2遺伝子のトランスフェクション効率の 細胞内アッセイの結果を示す。細胞がDDAB:DOPE リポソーム(1:1又は1:2 の比) で複合体形成されたAAV IL-2プラスミドでトランスフェクトされた。トランスフ ェクトされた細胞が種々の時点で細胞内IL-2タンパク質について染色された。結 果はIL-2タンパク質を発現する陽性細胞の％を示す。トランスフェクトされなか った細胞が陰性対照として使用され、対照の値がトランスフェクトされたグルー プの値から引かれた。 図19は照射された前立腺腫瘍細胞系細胞（パネルＡ）及び照射された原発性乳 腫瘍（パネルＢ）によるIL-2の発現を示す。腫瘍細胞がトランスフェクトされ、 致死照射後に遺伝子発現について評価された。上澄みが照射後24時間、48時間、 72時間及び96時間で回収され、IL-2レベル（培養24時間のpg/ml/ 10⁶細胞）につ いて試験された。 図20は樹状細胞の単離を記載する略図を示す。 図21はリポソーム及びプラスミドＤＮＡの混合物による樹状細胞のトランスフ ェクションを示す略図である。 図22はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT) リポーター遺 伝子を含むAAV プラスミドでリポフェクトされた樹状細胞の分析の結果を示す。 図23はNGFR遺伝子を含むAAV プラスミドでリポフェクションされた樹状細胞に よる神経成長因子レセプター(NGFR)の発現を示すグラフである。 図24は図23のようにしてリポフェクションされた樹状細胞によるIL-2の産生を 示す。 図25はEBNA 3b 及び3cを含むpMP6Neo ベクターでトランスフェクトされた樹状 細胞によるＴ細胞介在性細胞毒性の刺激を示す。 図26はCEA ペプチドパルス化DCにより刺激された健康なHLA-A2⁺ドナーからのC D8⁺ T 細胞のCEA 特異性細胞毒性活性を示す。エフェクター：標的比は80:1、40 :1、20:1、10:1である。 図27は図26で使用された細胞の表現型を示す。CEA パルス化DC（“CEA”）又 はサイトカイン単独(“サイトカイン”)で刺激された細胞がCD3 、CD4 、CD8 、 及 びCD56の抗体で染色された。 図28はCEA ペプチドパルス化DCにより刺激された膵臓癌患者からのCD8⁺ T 細 胞のCEA 特異性細胞毒性活性を示す。エフェクター：標的比は80:1、40:1、20:1 、10:1である。エンプティーT2細胞に関するバックグラウンド細胞毒性が引かれ た。 図29はCEA ペプチドパルス化DCにより刺激されたHLA-A2⁺乳癌患者からのCD8⁺ T 細胞のCEA 特異性細胞毒性活性を示す。細胞毒性活性が２種の標的細胞につい て試験される。SW403 はHLA-A2⁺ CEA⁺細胞系である。SW1417はHLA-A2^-CEA⁺細胞 系である。エフェクター：標的比：70:1、35:1、18:1、9:1。 図30はDCを含まない10 ng/mlのインターロイキン-7（IL-7）とともに培養され たHLA-A2⁺乳癌患者からのCD8⁺ T 細胞のバックグラウンド細胞毒性活性を示す。 標的細胞及びエフェクター：標的比は図29と同じである。 図31は図29及び11に使用された細胞の表現型を示す。CEA パルス化DC (“CEA ”)又はサイトカイン単独 (“サイトカイン”)で刺激された細胞がCD3 、CD4 、 CD8 、及びCD56の抗体で染色された。 図32は抗CEA 抗体を使用するMCF7細胞にトランスフェクトされたCEA 遺伝子の 発現のフローサイトメトリー分析の結果を示す。左のパネルはトランスフェクト されなかった細胞を示す。中央のパネルはCAT トランスフェクトされた細胞を示 す。右のパネルはCEA トランスフェクトされた細胞を示す。 図33〜35はMART-1ペプチドに対するメラノーマ患者のリンパ球の“二次”応答 を要約する。 図33は60:1、30:1、15:1、又は7.5:1 のエフェクター：標的比でMART-1ペプチ ドでパルス化されたT2標的細胞(T2-MART) 又はエンプティーT2細胞(T2)に関する MART-1特異性細胞毒性を示す。 図34は60、30、15、又は7.5 のE:T 比におけるA2+ MART-1⁺メラノーマ系(624M el)又はA2⁺ MART-1^-メラノーマ系(A375)に関するMART-1特異性細胞毒性を示す。 図35は細胞毒性アッセイの日のMART-1負荷DC (DC-MART)又はIL-7のみで刺激さ れたエフェクター細胞の表現型を特性決定する。細胞がCD3 、CD4 、CD8 、及び CD56の抗体で染色された。エフェクター細胞の90％より多くがCD3⁺CD8⁺である。 図36〜38はMART-1ペプチドに対する健康なドナーからのリンパ球の一次応答を 要約する。 図36は60又は30のエフェクター：標的比でMART-1ペプチドでパルス化されたT2 細胞(T2-MART) 又はエンプティーT2細胞(T2)に関するMART-1特異性細胞毒性を示 す。 図37は60又は30のE:T 比におけるA2⁺ MART-1⁺細胞系(624Mel)又はA2⁺ MART-1^- 細胞系(Colo)に関するMART-1特異性細胞毒性を示す。 図38は細胞毒性アッセイの日のMART-1負荷DC (DC-MART)又は対照のパルス化さ れなかったDCで刺激されたエフェクター細胞の表現型を特性決定する。細胞がCD 3 、CD4 、CD8 、及びCD56の抗体で染色された。エフェクター細胞の約70％がCD 3⁺CD8⁺である。 図39はHIV のnef 遺伝子、gag 遺伝子、gp120 遺伝子及びpol 遺伝子を発現す るカナリア痘ベクターvCP300の遺伝子マップの略図である。 図40はHIV のenv 抗原、gag/pol 抗原又はnef 抗原を発現する標的細胞に対す るカナリア痘構築物vCP300で感染された自己DC細胞により一次培養で刺激された エフェクター細胞の細胞毒性活性を示す。培養中のレスポンダー：刺激物質比は 10:1であり、エフェクター：標的比は40:1であった。対照グループはHIV 遺伝子 を欠いているカナリア痘ウイルス構築物(vCPpp) で感染されたDCにより刺激され た細胞又はマイトジェンフィトヘマグルチニン(PHA) により刺激された細胞を含 んでいた。 図41はvCP300ベクターにより培養中に感染された４人の健康なドナーのDCで発 現されたHIV 抗原のフローサイトメトリー分析を要約する。細胞がHIV⁺ドナーか らの血清又はプールされた対照血清で染色された。 図42はCAT、CEA 又はMART-1を含むプラスミドの概略図及びそのプラスミドＤ ＮＡとトランスフェクトされた樹状細胞の逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応分 析において産生されたｍＲＮＡとの関係を示す。 図43はCAT 、CEA 又はMART-1によるトランスフェクション後に樹状細胞中に存 在するｍＲＮＡの分析を示す。 図44a はMART-1遺伝子を発現する樹状細胞へのCTL の暴露後のMART-1ペプチド 負荷標的細胞及びエンプティー標的細胞に対する細胞溶解性Ｔ細胞(CTL) の応答 を示す。図44b はサイトカイン刺激のみの後のMART-1ペプチド負荷標的細胞及び エンプティー標的細胞に対するCTL の応答を示す。 好ましい実施態様の説明 本明細書に最初に開示された研究は、ウイルス形質導入を伴わない系を使用す るAAV プラスミドＤＮＡの細胞への輸送を調べた。又、本開示の方法はAAV 物質 を含むリポソームの使用により数種の哺乳類細胞型を有効にトランスフェクトし た。その成功裏のトランスフェクションはAAV プラスミド構築物のたんのうな形 質導入能力と一緒にリポフェクションの優れたキャリヤー系を利用する。又、陽 イオン性リポソームがrep 及びキャプシドトランスコンプレメンテーション、組 換えウイルス又は野生型AAV の不在下で細胞へのAAV プラスミドＤＮＡの侵入を 促進する手段として使用された。 本発明のリポフェクション方法が遺伝子発現の効率を判断するものと評価され た。本結果は、トランスフェクトされたＤＮＡの一時的発現及び持続された発現 の両方をもたらす高効率で、未修飾幹細胞、未修飾原発性リンパ系細胞、例えば 、Ｔ細胞、種々の新たに単離された腫瘍細胞、及び培養された哺乳類細胞型をト ランスフェクトする能力を実証した。未修飾Ｔ細胞、例えば、腫瘍浸潤リンパ球 、未修飾幹細胞、腫瘍細胞系細胞及び原発性腫瘍細胞を有効にトランスフェクト する能力が当業界で最初に開示される。 癌の細胞及び遺伝子治療は有効なベクター系を利用してエフェクター細胞集団 をex vivo で単離し、操作する能力に主として依存する。本発明者らはアデノ関 連ウイルス(AAV) の逆方向末端反復塩基(ITRs)を含むプラスミドとの陽イオン性 リポソームの組み合わせを使用して単球由来DCを含む種々の原発性細胞型中でト ランスジーンを発現した。このベクター系は通常のプラスミドと比較した時に高 レベルの発現を示したが、等しい量のＤＮＡが細胞に送出された。末梢血単核細 胞(PBMC)集団からのDCが成功裏に使用されてペプチド特異性応答を生じた。加え て、リポーター遺伝子を含むAAV プラスミドＤＮＡ（そのＤＮＡが陽イオン性リ ポソームに複合体形成された）を使用して、本発明者らは約10〜30％の効率でDC 中のトランスジーン発現を達成した。物質源及び方法 A.細胞系 ラット前立腺細胞系(R3327) 及びラット膀胱細胞系(MBT-2) をデューク大学の Eli Gilboa博士から入手した。両方の細胞系を５％ウシ胎児血清(FBS) を補給し たRPMI-1640 培地中で管理した。細胞系293 はアデノウイルス型５により形質転 換されたヒト胚腎臓細胞系であり、ATCC（Graham，F.L.ら，J.Gen.Virol．(1977 )36:59-72）から入手された。293 細胞を10％FBS を補給したダルベッコ改良イ ーグル培地中で増殖させた。 B.原発性腫瘍細胞の細胞調製 原発性の肺腫瘍細胞、卵巣腫瘍細胞及び３種の乳腫瘍細胞を患者の充実性腫瘍 から入手した。腫瘍サンプルを小片に細断し、450 μ/ml のコラゲナーゼIV（シ グマ）、10.8 K単位/ml のDNase I （シグマ）、及び2000μ/ml のヒアルロニダ ーゼＶ（シグマ） (Topolian，S.L.ら，J.Immunol.Methods（1987）102:127-141 )を補給したAIM V 培地（ギブコ）200 ml中で消化した。消化の１〜２時間後に 、細胞をガラスホモジナイザー（ベルコ）で均質にし、DPBS-CMF（ホイットテ プライド・イムン・サイエンシズ、サンタ・クララ、CA）による捕獲により非リ ンパ系細胞から分離した。非付着性細胞（主として腫瘍細胞）を除去し、２mMの グルタミン、100 μ/ml のペニシリン−ストレプトマイシン、及び10％のFBS を 補給したRPMI 1640 培地中で培養した。腫瘍細胞をトランスフェクションの前に ２〜４週間にわたって培養した。 C.末梢血単核細胞の調製 リンフォプレプ（ナイコムド・ノルウェー）を使用して、健康な対照患者から の末梢血単核細胞(PBMCs) をバフィーコート（スタンフォード大学血液バンク、 スタンフォード、CA）から単離した。 付着された特定の結合タンパク質（例えば、モノクローナル抗体）を共有結合 した表面を含むAIS ミクロセレクター装置（アプライド・イムン・サイエンシズ 、サンタ・クララ、CA）を使用して、Ｔ細胞、Ｔ細胞サブセット、又はCD34⁺細 胞を更に単離した。簡単に言えば、PBMCs を0.5 ％のガムイムン（マイルズ社、 エ ルクハート、IN）中で１ml当たり15 x 10⁶細胞で再度懸濁させ、洗浄されたCD3 、 mMのＬ−グルタミン、及び100 μ/ml のペニシリン／ストレプトマイシンを含む 完全培地、RPMI 1640 （ホイットテーカー）をAIS ミクロセレクター中の付着性 細胞に添加した。５％のCO₂ 、37℃の保湿環境中で２〜３日後に、付着性細胞を 除去し、トランスフェクションのために調製した。 D.プラスミド調製 本研究に使用した第一プラスミド、pACMV-IL2 はIL-2ｃＤＮＡとしてのヒトイ ンターロイキン-2遺伝子（IL-2）、並びに両末端でAAV ITRsにより隣接された、 サイトメガロウイルス(CMV) 及びラットプレプロインスリン及びSV40ポリアデニ ル化配列の即時−早期プロモーター−エンハンサー要素を含んでいた。このプラ スミドはJ.Rosenblatt博士(UCLA 、ロサンジェルス、CA) から得られ、又、入手 可能であり、又、pSSV9/CMV-IL2 と称される。又、相当する対照プラスミドpBC1 2/CMV-IL2（これはpACMV-IL2 と同一であるが、AAV 末端反復塩基を欠いていた ）を使用した（図１を参照のこと）。 プラスミドpA1CMVIX-CATはpBR322主鎖中でAAV 末端反復塩基により隣接された CMV 即時−早期プロモーターエンハンサー配列、pOG44(ストラタゲン) に由来す るイントロン、バクテリアCAT 遺伝子、SV40後期ポリアデニル化シグナルを含ん でいた（図１を参照のこと）。 プラスミドpATK-Jgal 及びpAADA-JgalはAAV プラスミド主鎖中で夫々TKプロモ ーター又はADA プロモーターに結合されたJgal遺伝子を含んでいた。これらのプ ラスミドはEli Gilboa博士（デューク大学、ダーハム、NC）により提供された。 本研究に使用した別のプラスミドはpMP6であった。図２に示されるように、IL -2ＤＮＡを含むこのプラスミド（pMP6-IL2と称される）は二本鎖であり、かつ環 状である。pMP6-IL2はCMV プロモーター及びSV40ポリアデニル化シグナルの制御 下にヒトIL-2遺伝子を有する。プロモーターとIL-2のコード配列の間に、IL-2又 はプラスミドに入れられたその他の外在性遺伝子の発現を増進するものと理解さ れるイントロン(pOG44に由来する) がある。全発現カセットはAAV の左右の末 端反復塩基の間にある。又、pMP6-IL2プラスミドはCol-E1バクテリア複製開始点 とE.coli中のこのプラスミドの増殖を促進するアンピシリン耐性遺伝子とを有す るブルースクリプト主鎖を有する。 図3a-3e は配列の連続部分として示されたpMP6-IL2プラスミドのＤＮＡ配列（ 配列番号１）を示す。既知ＤＮＡ配列に相当するpMP6-IL2の部分が示される。相 当する配列情報がpMP6-IL2プラスミドの配列情報の直ぐ下にリストされる。マー クされていない配列はリンカーからのものである。 又、IL-2遺伝子を含むが、AAV 成分を含まない通常のプラスミドを使用した。 通常のプラスミド構築物はアデノシンデアミナーゼ(ADA) 、チミジンキナーゼ(T K)又は即時−後期サイトメガロウイルス(CMV) プロモーターとともにIL-2遺伝子 を有していた(ATCC から得られた通常のプラスミド) 。選択されたプラスミドが 下記の表１に記載される。 全てのプラスミドをアルカリ溶解及び酢酸アンモニウム沈殿、続いてDNase を 含まないRNase による処理、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール 抽出及び酢酸アンモニウム沈殿(Ausubel，F.M.ら，Current Protocols in Mole- cular Biology，John Wiley and Sons，Inc．1993)により単離した。 E.リポソーム調製 小さい単層リポソームを中性脂質ジオレイル−ホスファチジル−エタノールア ミン(DOPE)（アバンチ・ポーラー・リピッズ）と組み合わせて陽イオン性脂質ジ オクタデシル−ジメチルアンモニウム−ブロミド(DDAB)（シグマ）から調製した 。脂質をクロロホルムに溶解した。DDABを丸底フラスコ中で1:1 又は1:2 のモル 比でDOPEと混合し、その脂質混合物をロータリー・エバポレーターで乾燥させた 。無菌２回蒸留水を添加することにより脂質フィルムを再度水和して１mMのDDAB の最終濃度を得た。この溶液を透明になるまでバス・ソニケーター（ラボラトリ ー・サプライズ、ヒックスビル、NY）中で音波処理した。リポソームをアルゴン ガスの下で４℃で貯蔵した。静脈内投与によるリポソームのin vivo 使用のため に、1:4 〜1:5 のDDAB:DOPE 比を使用する。腹腔内投与のために、1:1 〜1:2 の DDAB:DOPE比を使用する。 F.ウイルス感染による形質導入のための組換えAAV (rAAV)の調製 組換えAAV 株の調製のために、293 細胞系の細胞を分割し、約30〜50％の集密 まで増殖させた。その後、細胞を１〜５の感染多重度でアデノウイルス型５で感 染させ、37℃でインキュベートした。２〜４時間後に、感染した細胞を100 mmの 組織培養皿(0.5-1 x 10⁷細胞) 当たり関係する遺伝子を含むプラスミド10μg 及 びrep キャプシド相補プラスミド、ｐΔBal 10μg で同時トランスフェクトした 。リン酸カルシウム共沈をトランスフェクション(Hermonat，P.L．ら，Proc.Nat l.Acad．Sci.USA（1984）81:6466-6470)に使用した。トランスフェクションの12 〜18時間後に、培地を細胞から除去し、10％のFBS を含むDMEM培地５mlと交換し た。 トランスフェクションの48〜72時間後に、AAV を下記の操作に従って回収した 。細胞及び培地を一緒に回収し、３回凍結、解凍して細胞を溶解した。次いで細 胞及び培地の上澄みを遠心分離して細胞デブリを除去し、上澄みを１時間にわた って56℃でインキュベートしてアデノウイルスを失活した(Hermonat，P.L．ら， 上記文献；Tratschin，J.D．ら，Mol.Cell.Biol.（1985）5:3251-3260)。熱不活 化後に、ウイルスを含む上澄みを酢酸セルロースフィルター(1.2 Tm)で濾過した 。次いでウイルス株を-20 ℃で貯蔵した。AAV 上澄み１mlを使用して10⁶細胞を 形質導入した。 G.細胞トランスフェクション（“リポフェクション”） 原発性腫瘍細胞及びラット腫瘍細胞系(R3327及びM3T-2)について、10⁶細胞を ６ウェル皿のウェル当たり２mlの無血清培地に塗布した。その後、AAV プラスミ ドＤＮＡ５μg を夫々1:2 のモル比のDDAB及びDOPEを含むリポソームとしてDDAB ５ｎモルと混合した。無血清培地(0.5ml) をAAV:リポソーム複合体に添加し、次 いでこれを細胞に移した。リポフェクションを行うために、細胞を室温で５分間 インキュベートし、次いでFBS を細胞に添加して５％の最終濃度を得た。 Ｔ細胞について、5-10 x 10⁶細胞を６ウェル皿のウェル当たり１mlの無血清培 地に塗布した。プラスミドＤＮＡ50μg を1:1 のモル比のDDAB及びDOPEを含むリ ポソームとしてDDAB50ｎモルと混合した。次いでトランスフェクション（“リポ フェクション”）を腫瘍細胞について行った。 幹細胞について、1-2 x 10⁶細胞を、プラスミドＤＮＡ10μg 及びリポソーム1 0ｎモルを含む複合体でトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を 幹細胞因子、インターロイキン-３（IL-3）及びインターロイキン-1（IL-1）を 含む培地で培養した。３日目及び７日目に、細胞を回収し、抽出を行った。 H.IL-2 アッセイ 細胞をカウントし、1 x 10⁶細胞を24ウェルプレートのウェル当たり１mlに塗 テムズ、ミネアポリス、MN）を使用して評価した。IL-2レベルをpg/ml 上澄みと 定義した。 I.J- ガラクトシダーゼアッセイ 伝子融合検出キットを使用して酵素加水分解産物、フルオレセインの蛍光の測定 により単一細胞中のlacZ J-D- ガラクトシダーゼを定量した。AAV/J-gal プラス ミド(pATK-Jgal及びpAADA-Jgal) をこのキットとともに使用した。フルオレセイ ンはJ-D-ガラクトシダーゼをコードするマーカー遺伝子lacZを発現する細胞中の フルオレセインジ-J-D- ガラクトピラノシド(FDG) の酵素開裂により生成される 。 CA）により分析した。結果 A.AAV プラスミド：陽イオン性リポソーム複合体の使用によるIL-2遺伝子発現 のレベル AAV プラスミドの遺伝子移入効率を評価するために、AAV プラスミドのIL-2遺 伝子移入効率を通常のプラスミド構築物の効率と比較した。通常のプラスミドは アデノシンデアミナーゼ(ADA) プロモーター(pADA-IL2)、チミジンキナーゼ(TK) プロモーター(pTKIL-2) 、又は即時−後期サイトメガロウイルス(CMV) プロモー ター(pCMV-IL2)とともにIL-2遺伝子を有していた。AAV IL-2研究プラスミド(pAC MV-IL2) はプロモーターの下流に配置されたIL-2遺伝子とともにCMV プロモータ ー（即時早期）を含んでいた（図１）。図１に示されるように、相当する対照プ ラスミド、pBC12/CMV-IL2 はAAV ITRsを欠いていた以外はpACMV-IL2 と同一であ った。 比較のために、IL-2遺伝子を含む５種のプラスミド（pACMV-IL2 、pBC12/CMVI L2 、pADA-IL2、pTK-IL2 、pCMV-IL2）をリポソームと複合体形成し、２種の培 養された腫瘍細胞系：ラット膀胱細胞系(MBT-2) 及びラット前立腺細胞系(R3327 ) に関するトランスフェクション効率について試験した。細胞系を1 x 10⁶細胞 当たり10ｎモルのリポソームに複合体形成されたプラスミドＤＮＡ10μg でトラ ンスフェクトした。上澄みを３日目に回収し、IL-2 ELISAキットを使用してIL-2 のレベルについて試験した。 AAV プラスミド(pACMV-IL2) は両方の細胞系中で最高レベルの発現を誘導した （図4a）。ADA プロモーターを有するIL-2遺伝子(pADA-IL2)は両方の細胞系中で 最小量の発現を誘導した。図4aに示されるように、TK及びCMV（即時−後期プロ モーター）IL-2構築物の両方は両方の細胞系中で匹敵するレベルのIL-2発現を誘 導した。しかしながら、pBC12/CMV-IL2 プラスミド（これはCMV 即時−早期プロ モーターを含んでいた）は膀胱細胞系と比較した時に前立腺細胞系中で高いレベ ルの遺伝子発現を示した。試験したプラスミドの中で、AAV IL-2研究プラスミド が両方の細胞系中で最高レベルの発現を誘導し、かなりのレベルの増加が前立腺 細胞系で観察された。 前立腺細胞系R3327 中の相当する対照プラスミド(pBC12/CMV-IL2) 及びAAV IL -2 研究プラスミド(pACMV-IL2) により誘導された発現の期間が研究された（図4b） 。発現は選択しないこれらの培養物中で30日までと評価された。細胞を10⁶/mlで 接種し、上澄みを24時間毎に分析のために回収した。細胞は培養中48時間毎に二 倍になった。図4b中のデータは、発現の増進されたレベルに加えて、発現の期間 がAAV プラスミド(pACMV-IL2) によるトランスフェクション後30日続いたことを 示す。注目されるように、かなりの発現が評価の期間の全期間にわたって続いた 。図4bに示されるように、両方のプラスミドは２日目と７日目の間で最大レベル の発現を誘導し、15日目までにIL-2レベルが減少し、次いでAAV プラスミドでト ランスフェクトされたグループのみで約100pg/mlで維持された。同様に、AAV プ ラスミド：リポソーム複合体をトランスフェクションに使用した時に、持続した 発現のレベルが膀胱細胞系だけでなく、原発性の肺腫瘍、乳腫瘍及び卵巣腫瘍か らの細胞で観察された。 B.AAV プラスミド：リポソームトランスフェクション“リポフェクション”及 び組換えAAV 形質導入の比較 前立腺細胞系及び膀胱細胞系をトランスフェクトし、形質導入して、最適のAA V:リポソームトランスフェクションが最適の組換えAAV 形質導入に匹敵するか否 かを測定した。最適のトランスフェクションのために、AAV プラスミドＤＮＡ10 μg を２mlの最終容積で10⁶細胞当たり10ｎモルのリポソームに複合体形成した 。最高のrAAV形質導入のために、ウイルス上澄み２mlを完全培地１ml中で10⁶細 胞に添加した。24時間後に、細胞を洗浄し、新鮮な完全培地中で再度懸濁させた 。上澄み液をトランスフェクション及び形質導入後の種々の時点で回収した。 前立腺系（図5a）において、トランスフェクションは試験条件（10⁶細胞につ いてウイルス上澄み２ml、vs10μg ＤＮＡ：10ｎモルのリポソーム）のもとにAA V 形質導入よりも高いレベルの発現を誘導した。３日目〜５日目の結果はトラン スフェクションによるIL-2の約10倍高いレベルを示したが、20日目までに匹敵す るレベルがトランスフェクトされたグループ及び形質導入されたグループの両方 で観察された。 組換えAAV による形質導入は、リポソームを使用するトランスフェクションと 較べて、膀胱細胞系中で高レベルのIL-2産生を最初に誘導した（図5b）。前立腺 細胞系と同様に又、膀胱細胞系の形質導入は20日目までにIL-2レベルの減少を示 したが、トランスフェクションからのIL-2レベルはこの期間中に増加した。匹敵 するレベルのIL-2がトランスフェクトされたグループ及び形質導入されたグルー プの両方で33日目まで観察された。 C.AAV プラスミドＤＮＡ：リポソーム複合体を使用する原発性腫瘍細胞のトラ ンスフェクション 上記実験において、有意なトランスジーン発現が培養細胞系中で実証された。 陽イオン性リポソーム:AAVプラスミドＤＮＡ複合体が又新たに単離された原発性 腫瘍細胞中で匹敵するトランスジーン発現を媒介するか否かを評価するために、 ４種の異なる原発性腫瘍の細胞を、リポソームを使用してAAV IL-2プラスミドで トランスフェクトした。腫瘍細胞をトランスフェクションの前に２〜３週間にわ たって10％のFBS を補給したRPMI-1640 培地中で培養した。細胞を１ml当たり10⁶ 細胞で塗布し、10ｎモルのリポソームと複合体形成されたＤＮＡ10μg でトラ ンスフェクトした。上澄みを２日目及び３日目に回収した。 図６に示されるように、全ての４種の原発性細胞型がトランスフェクション後 にかなりのレベルのIL-2を産生した。最高レベルの発現が10日の研究期間中で３ 日目に観察された（肺サンプル及び一種の乳サンプルが更に長い期間にわたって 研究された）。IL-2遺伝子発現が培養中のトランスフェクション後の25日程度に 長くにわたって肺腫瘍の細胞及び乳腫瘍の一種の細胞中で追跡された。15日目の レベルは両方の細胞系、及び原発性腫瘍に由来する細胞中で均等(100 pg/mlのIL -2）であった。 D.トランスジーン発現に関する致死照射の効果 遺伝子発現に関する照射の効果を測定するために、前立腺細胞系（図7a）及び 原発性乳腫瘍の細胞（図7b）をトランスフェクトし、致死照射後の遺伝子発現に ついて評価した。最適のAAV プラスミド：リポソーム複合体を使用して、両方の 細胞型をトランスフェクトした。トランスフェクション後の２日目に、⁶⁰Coイラ ジエーターを使用して、夫々の培養物のアリコートを6000 radに暴露し、それに より細胞分裂を無効にし、次いでアリコートを培養して保った。夫々の培養物の 半分を非照射対照として管理した。⁶⁰Coイラジエーターを使用して、アリコート を6000 radに暴露し、その間、IL-2の発現レベルは約300 〜400 pg/ml であった 。上澄みを照射後24時間、48時間、72時間及び96時間で回収し、IL-2レベルにつ いて試験した。 図7a-7b に示されるように、トランスフェクション後の致死照射はトランスジ ーン発現を抑制しなかった。前立腺細胞系又は原発性腫瘍細胞のいずれもが照射 後にIL-2発現の変化を示さなかった。こうして、細胞分裂が無効にされたが、IL -2分泌は照射に感受性ではなかった。これは有利である。何となれば、多くの遺 伝子治療戦略が原発性Ｔリンパ球（これは一般に不在の活性化を分割しない）へ の遺伝子送出を伴い、しばしばウイルス感染により形質導入し得ないからである 。 E.AAV プラスミド：リポソーム複合体の使用によるB-D-ガラクトシダーゼ遺伝 子発現のレベル 細胞当たりの基準で発現レベルを実証するために、J-gal 遺伝子をトランスフ ェクション実験に使用した。２種のAAV J-gal プラスミド(pATK-Jgal及びpAADA- Jgal)の夫々を陽イオン性リポソームと複合体形成し、前立腺細胞系のトランス フェクションに使用した。pATK-Jgal 又はpAADA-JgalプラスミドＤＮＡ10μg を 10ｎモルのリポソームと複合体形成し、複合体を使用して２mlの容積中で10⁶細 胞をトランスフェクトした。種々の時点で、約5 x 10⁵細胞を回収し、蛍光基質F DG で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。 最高のトランスジーン発現が７日目〜15日目の間で観察された（図８）。有意 なレベルのJ-gal 活性が25日目まで観察された。J-gal⁺細胞のフローサイトメト リー分析は両方のプラスミド構築物で10〜50％のトランスフェクション効率の最 高レベルを示した。そのレベルは25日目まで５〜10％に減少した。発現パターン 及び期間は上記のIL-2発現のパターン及び期間と同様であった。 F.新たに単離された末梢血Ｔ細胞亜集団中のAAV プラスミド：リポソーム複合 体により誘導されたトランスジーン発現 新たに単離されたヒト末梢血Ｔ細胞集団をトランスフェクトする際のAAV プラ スミド：リポソーム複合体の効果を調べた。CAT 酵素の遺伝子をpA1CMVIX-CATプ ラスミド中のリポーター遺伝子として使用した（図１）。CMV 即時−早期プロモ ーターエンハンサー配列及びCAT 遺伝子を有するAAV 主鎖(pA1) を使用して、pA 1CMVIX-CAT構築物をつくった。Ｔ細胞の全亜集団並びに精製されたCD4⁺及びCD8⁺ 亜集団をトランスフェクションに使用した。Ｔ細胞の全亜集団(CD3- 又はCD5/8 選択) 及び精製された(CD4- 又はCD8-選択) 亜集団（図9a-d）、並びにCD34⁺幹 細胞（図10; 下記の節G.を参照のこと）の両方が有意なレベルのCAT 遺伝子発現 を示した。 末梢血から新たに単離された原発性Ｔ細胞を、AAV プラスミドＤＮＡ：リポソ ーム複合体を使用してトランスジーン発現について試験した。CD3⁺Ｔ細胞、CD5/ 8 選択Ｔ細胞（全Ｔ細胞）、CD4⁺Ｔ細胞、及びCD8⁺Ｔ細胞からのCAT 活性に関す る薄層クロマトグラフィー(TLC) アッセイの結果が夫々図9a-9d に示される。 8⁺集団、もしくはCD4⁺集団或いはCD8⁺集団として分別した。適当な細胞を捕獲し 、非付着細胞を洗浄により除去した。付着性細胞をRPMI-1640 及び10％のFBS に よる培養中の２日後に装置から除去した。5-10 x 10⁶細胞を塗布し、AAVプラス ミドＤＮＡ50μg 及び50又は100 ｎモルのリポソームでトランスフェクトして1: 1 又は1:2 のＤＮＡ：リポソーム比を得た。細胞をトランスフェクションの３日 後に回収し、細胞抽出物をタンパク質含量により基準化し、TLC アッセイを使用 してCAT 活性を測定した。血液をＡ又はＢと称されるドナーから得た。ドナーＡ 又はＢの末梢血を使用してＴ細胞を単離し、トランスフェクションに使用した。 図9a-9d に示されるように、AAV を含むリポソームの脂質組成は、ＤＮＡ対リ ポソームの比と同様に変化された。CD3⁺Ｔ細胞（図9a）の研究において、ドナー Ａからの細胞を使用した。CD5/8 選択Ｔ細胞（図9b）の研究について、CD4⁺Ｔ細 胞（図9c）、CD8⁺Ｔ細胞（図9d）、及びCD34⁺幹細胞（図10）は２種のドナー（ Ａ及びＢ）に由来した。 図9a-dに示された研究について、最高レベルの発現が全亜集団及び精製された 亜集団の両方で２日目及び３日目に観察された。有意なレベルの発現が14日目ま で検出された。細胞をトランスフェクションの３日後に回収し、夫々の抽出物か らの基準化されたタンパク質含量がCAT 活性について分析された。リポソームの 同じ組成、及びＤＮＡ：リポソーム比が全ての集団中で同様のレベルの発現を誘 導した。 G.新たに単離されたCD34⁺幹細胞中のAAV プラスミド：リポソーム複合体によ り誘導されたトランスジーン発現 新たに単離されたヒト末梢血CD34⁺幹細胞をトランスフェクトする際のAAV プ ラスミド：リポソーム複合体の効果を調べた。CAT 遺伝子をpA1CMVIX-CATプラス ミド中のリポーター遺伝子として使用した（図１）。pA1CMVIXCAT 構築物を上記 のようにして調製した。CD34⁺幹細胞からTLC により測定したCAT 発現のレベル が図10に示される。 新たに単離されたCD34⁺末梢血幹細胞をAAV CAT プラスミドＤＮＡ：リポソー CD34⁺細胞を末梢血から精製した。幹細胞を装置から除去し、0.5-1 x 10⁶細胞を プラスミドＤＮＡ10μg 及び10ｎモルのリポソームを含む複合体でトランスフェ クトした。トランスフェクトされた細胞を幹細胞因子、IL-3及びIL-1を含む培地 で培養した。３日目及び７日目に、細胞を回収し、抽出を行った。抽出物からの 基準化されたタンパク質含量をCAT 活性について評価した。図10に示されるよう に、CD34⁺末梢血幹細胞中で有意なレベルのCAT 遺伝子発現があった。 H.組込み研究 図11a-11b は本発明のAAV プラスミドＤＮＡ：リポソーム複合体でトランスフ ェクトされた安定なクローン（30日目を越えて少なくとも安定なクローン）から のゲノムＤＮＡの増進されたケミルミネセンス(ECL) サザン分析を示す。ゲノム ＤＮＡを単離し、ECL 直接核酸標識及び検出系（アメーシャム）を使用して分析 した。IL-2プローブをpACMV-IL2 からの0.685 kb IL-2 遺伝子から調製した。ハ イブリダイゼーション後に、その膜を10分間にわたって0.5x SSC/0.4％SDS 中で 55℃で２回洗浄し、2x SSC中で室温で５分間にわたって２回洗浄した。 図11a において、サンプルをBamHI 及びHindIII で消化し、IL-2で探査した。 図11a に示されるように、全てのクローンが、BamHI 及びHindIII で消化された ゲノムＤＮＡ中の0.685 kbバンドにより実証されるように、IL-2遺伝子の存在を 示した。 図11b に示された結果について、サンプルをBamHI で消化し、IL-2で探査した 。再度、全てのクローンがIL-2遺伝子組込みを示した。図11b に示されたように 、 IL-2の組込みが高分子量バンド(1.6kbと2kb の間) により実証され、そのバンド は消化により得られた付着された宿主ゲノム物質と一緒のその遺伝子の組込みと 一致する。図11b 中の結果は、一つより多い組込み部位があったことを示す。何 となれば、BamHI で消化されたゲノムＤＮＡ中に多数の高分子量バンドがあった からである。更に、組込み部位は、消化されたクローン中の異なるサイズのバン ドにより実証されるように、異なるクローン中の異なる位置にあることが示され た (図11b)。 図12a-12b は、本研究から得られた２種のクローンの、³²P サザンアッセイを 使用する、染色体ＤＮＡ分析を示す。Hirt分別プロトコルを使用して、核ＤＮＡ を２種のIL-2クローン(1A11 及び1B11) から単離した。陰性対照として、全ＤＮ ＡをR3327 細胞系のトランスフェクトされなかった細胞から単離した。制限酵素 消化後に、適当なプラスミド対照と一緒に、夫々のサンプル10μg を１％のアガ ロースゲルに装填し、電気泳動し、変性し、ハイボンド⁺膜に移した。フィルタ ーをランダムプライミングにより³²P で標識されたＤＮＡフラグメントで68℃で 一夜にわたってハイブリッドを形成した。次いで膜を夫々2x SSC、0.1 ％SDS 及 び0.2x SSC、0.1 ％SDS で30分間にわたって68℃で２回洗浄した。これらのフィ ルターのオートラジオグラムをｘ線フィルムで露出した。 図12a に示された研究において、IL-2遺伝子を再度プローブとして使用した。 サザンブロッティング後に、フィルターをpACMV-IL2 の0.685 kb IL2-BamHI/Hin dIII フラグメントで探査した。これらの結果は、IL-2遺伝子の組込まれたコピ ーの数が、２種のクローンの細胞の消化産物中の0.685 kb バンドの種々の密度 により証明されるように、クローンにより変化したことを示す（上記のこの図面 の記載を参照のこと）。又、高分子量バンドが実証され、種々の消化産物プロト コルから得られた宿主ゲノム物質と一緒にIL-2遺伝子の組込みと一致した。 図12b は、フィルターがプラスミドpACMV-IL2 の0.85 kb PvuII/HindIII（AAV ITR/CMV）フラグメントで探査された研究の結果を示す。SmaI及びPvuII で消化 された染色体ＤＮＡ中の0.8 kbバンドの存在が右AAV ITR の存在を実証する。Sm aI及びPvuII で消化された染色体ＤＮＡ中の2.1 kbバンドの存在がクローンＡ中 の左AAV ITR の存在を示す。 実施例 本発明の方法はサイトカイン、同時刺激分子、例えば、B7、及びMHC クラスＩ 抗原の遺伝子を多種の細胞型に送出するためのAAV ウイルス物質を含むリポソー ムを使用する。例えば、上記タンパク質又はペプチドのいずれかをコードするＤ ＮＡが原発性腫瘍細胞又は腫瘍細胞系に送出され、その結果、この導入されたＤ ＮＡが発現される時に、修飾された腫瘍細胞が腫瘍ワクチンとして利用できる。 更に、上記タンパク質又はペプチドのいずれかをコードするＤＮＡが末梢血細胞 又は骨髄細胞に送出されて血液又は腫瘍の疾患又は症状を治療する。 本発明は、AAV ウイルス物質を含むリポソームが(a) タンパク質又はペプチド をコードする遺伝子、(b) アンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡオリゴヌクレオチド、 又は(c) ＲＮＡを送出し、発現するのに使用される方法を提供する。被験者中の このようなタンパク質／ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はＲＮＡ の発現は被験者の免疫応答を変調する。“変調する”という用語は免疫応答を誘 導し、強化し、抑制し、又は阻止することを含む。 それ故、HIV 感染症が本発明に従って発現されたアンチセンスオリゴヌクレオ チド、ＲＮＡ、又はリボザイムの送出により治療される。 更に、抗腫瘍免疫応答が本発明に従って発現されたペプチド又はＲＮＡを使用 して変調されて、腫瘍特異性抗原及び／又は腫瘍関連抗原に対する反応性を増進 する。非免疫原性腫瘍又は弱い免疫原性腫瘍が本発明のＤＮＡ又はＲＮＡの送出 により免疫原性にされ、その結果、腫瘍がin vivo 及びin vitroで細胞溶解性Ｔ 細胞応答又は抗腫瘍免疫のその他の形態を誘導する。 本発明の方法は、Ｂリンパ球又はＴリンパ球を含む、原発性リンパ系細胞に遺 伝子を送出するのに使用される。別の実施態様において、遺伝子物質がCD34⁺幹 細胞に送出される。リンパ系細胞又は幹細胞に送出され、発現された遺伝子は、 HIV 感染症、遺伝子欠損、腫瘍、及び自己免疫を含む種々の疾患及び症状のいず れかを治療するのに使用される修飾細胞をもたらす。治療すべき症状は、関係す る遺伝子の発現が当業者により認められるように所望される症状である。例えば 、悪性腫瘍症状の治療のために、MDRI遺伝子が本発明に従って腫瘍の細胞に送出 され、発現されて治療効果を生じる。 れらのCD8⁺細胞は、例えば、HIV で感染された被験者の末梢血又は癌患者の腫瘍 組織から得られる。次いでこれらのＴ細胞が当業界で知られている方法に従って 、例えば、IL2 、フィトヘマグルチニン(PHA) 及びコンカナバリンＡ(ConA)を含 むポリクローナルＴ細胞活性化物質の使用により活性化される。活性化されたCD 8⁺Ｔ細胞が約20日にわたって培養して増殖される。その後、細胞が本発明に従っ てIL-2ゲノム物質を含むAAV:リポソーム複合体でトランスフェクトされる。所定 の被験者から最初に得られた細胞が本発明のトランスフェクション後に被験者に 戻される。発現されたIL-2遺伝子の結果として、細胞毒性Ｔ細胞活性を維持する ための患者へのIL-2のその後の投与の必要が減少又は排除され、それにより望ま しくない副作用及びIL-2注入の可能な致死投薬量関連毒性を減少又は排除する。 A.腫瘍予防接種 通常の腫瘍予防接種プロトコルは、増殖が照射への細胞の暴露、化学インヒビ ター又は高圧チャンバーへの暴露により阻止される非増殖性腫瘍細胞を使用する 。生体は生体中に存在する腫瘍細胞（初期の腫瘍塊又は病巣とは別）に対し有効 な抗腫瘍応答を増大することができるものと考えられる。 従来の腫瘍予防接種の試みはメラノーマ及び腎臓細胞癌の患者で腫瘍細胞抗原 性を増進しようと努めて遺伝子修飾腫瘍(GMT) を使用していた。これらの試みは ex vivo レトロウイルス遺伝子移入に頼ったが、これはそれが非常に複雑であり 、かつ送出された遺伝子のとり込み及び発現を得るためにトランスフェクトされ ている細胞の活発な細胞分裂を必要とするという欠点を問題とする。更に、充分 な数の腫瘍細胞をex vivo で培養して適当な量の治療生産物を得ることが非常に 困難であり得る。 レトロウイルス遺伝子移入とは対照的に、形質導入すべき遺伝子に3'及び5'の 部位にAAV の末端反復要素を有するプラスミド構築物は、非ウイルスリポソーム 媒介移入により導入された時に有効に発現された。例えば、以下に詳しく説明さ れるように、リポソームを使用してIL-2をコードするｃＤＮＡを含むpMP6-IL2の 如きAAV プラスミドをメラノーマ細胞の如き原発性ヒト腫瘍細胞に送出した。次 いで原発性腫瘍細胞がIL-2を発現した。又、腫瘍細胞系が有効にトランスフェク トされた。 AAV-リポソームトランスフェクション後のIL-2の発現は永続性であり、高レベ ルであった。AAV プラスミド−リポソーム組成物により遺伝子修飾された細胞か らのサイトカイン分泌のレベルはレトロウイルス感染細胞から得られたレベルを 越えていた。 それ故、AAV プラスミド及びリポソームを含む組成物を使用して、細胞が遺伝 子修飾される。これらの修飾遺伝子が治療腫瘍予防接種レジメで使用される。有 利には、本明細書に開示されたような遺伝子修飾方法が原発性腫瘍細胞を成功裏 に修飾した。これは重要な開発である。何となれば、それが遺伝子修飾（そのプ ロセスが本発明の前に必要とされた）を行うために原発性腫瘍細胞から腫瘍細胞 系を最初に樹立する必要を省くからである。治療レジメで患者に注入された時に 遺伝子修飾されてIL-2を発現する腫瘍細胞が全身性IL-2の同時投与（これは極め て重大な副作用及び可能な死亡を生じることが知られている）を必要としないこ とは高度に有利である。 B.治療投与に使用するためのトランスジーンＤＮＡによる細胞のリポフェクシ ョン 全身性IL-2は癌の如き或る種の重度の症状を治療するのに現在使用されている 。更に、活性化Ｔ細胞はin vitro及びin vivo の両方のそれらの増殖及び生存の ために外在性IL-2に依存するようになる。IL-2刺激が取り去られる時、Ｔ細胞は 二三日以内にアポプトーシス（ＤＮＡ断片化）及び死滅を受ける。しかしながら 、全身投与されたIL-2は死滅を含むひどい副作用を生じることが知られている。 それ故、全身性IL-2投与への依存を排除又は減少する治療を開発する要望がある 。 以下に示される研究は、ウイルス形質導入を伴わない新規な系を使用するAAV プラスミドＤＮＡ及びトランスジーンＤＮＡのＴ細胞への送出に取り組んだ。更 に特別には、本結果はリポフェクションの優れたキャリヤー系及びAAV プラスミ ド構築物の熟練の形質導入能力を利用する成功裏のトランスフェクションを示す 。 トランスジーン及びAAV 末端反復塩基を含むAAV プラスミドをＤＮＡベクター として使用し、陽イオン性リポソームをキャリヤー分子として使用した（トラン スフェクション及びＴリンパ球中の発現の一般的な説明について、Philipら，Mo l.Cell.Biol.（1994）14:2411-2418を参照のこと）。好ましい実施態様において 、トランスジーンはIL-2をコードする。AAV プラスミド：リポソーム複合体は組 換えAAV 形質導入により得られたレベルに匹敵するレベルのトランスジーン発現 を誘導した。有利には、陽イオン性リポソームはrep 及びキャプシドトランスコ ンプレメンテーション、組換えウイルス又は野生型AAV の不在下で細胞へのAAV プラスミドＤＮＡの侵入を促進した。AAV プラスミドＤＮＡ：リポソーム複合体 はTILsを有効にトランスフェクトした。リポソームと複合体形成されたAAV プラ スミドＤＮＡは通常のプラスミドとの複合体よりも数倍高いレベルの発現を与え た。更に、発現は選択なしに30日の期間にわたって持続した。 本明細書に開示されたＴ細胞に関するIL-2遺伝子発現系は、活性化された細胞 が充分な内在性IL-2を産生してin vivo のそれらの維持を支持し、それによりア ポプトーシスを阻止し、全身性IL-2投与に対する必要を省くことを可能にする。 制御された研究において、種々のＴ細胞集団をリポソームに複合体形成された IL-2ｃＤＮＡを有するAAV プラスミドでトランスフェクトした。これらの細胞集 団を、in vitroで外在性IL-2なしに成長及び増殖を維持するそれらの能力につい て試験した。 Ｔ細胞について、アッセイは、IL-2遺伝子でトランスフェクトされた時に、原 発性CD8⁺Ｔ細胞及び活性化されたCD8⁺Ｔ細胞が増殖して無関係の“対照”遺伝子 又はＤＮＡ配列でトランスフェクトされた“対照”よりも多い数の細胞に到達す ることを示した。 IL-2トランスフェクトされたCD8⁺細胞は外在性IL-2を必要としないで培養中に 増殖し、アポプトーシスがかなり減少された。このようなトランスフェクトされ たＴ細胞のサザンブロット分析は25日までにわたってプラスミドをコードするIL -2の存在を示した。これらの結果は、ex vivo で活性化され、増加されたCD8⁺細 胞へのIL-2遺伝子の移入が外在性IL-2を必要としないでこのような細胞の増殖を 促進し、それらのアポプトーシス死滅を阻止することを実証した。 本発明に従って遺伝子修飾し得る細胞として、原発性の肺癌細胞、卵巣癌細胞 及び乳癌細胞、メラノーマ細胞、自己繊維芽細胞、形質転換Ｂ細胞、樹状細胞及 びあらゆる所望の培養細胞系の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。こ のような遺伝子修飾された細胞はTIL を刺激するのに単独で、又は腫瘍細胞（未 修飾又は遺伝子修飾）と一緒に使用し得る。遺伝子修飾された細胞は培養中のTI Ls又はその他のＴリンパ球の刺激抗原として有益なHER2、K-ras 、ムチンを含む 腫瘍関連抗原を発現するようにされた。非MHC 制限Ｔ細胞を含むＴ細胞がムチン のコアタンパク質に存在するヒトムチン１(MUC1)の如きムチン抗原に応答して生 成され、アミノ酸配列PDTRPAPGSTAPPAHGVTSA（配列番号２）を有するタンデム反 復塩基の可変数として現れるそのペプチドエピトープに特異性であり得る。MUC1 は乳、膵臓及び卵巣の腺癌並びに多発性ミエローマ中で発現される。腫瘍細胞の 種々の型に関するこれらの抗原に特異性のCTL は上記癌の患者に見られ、又リン パ節中に見られ、又は血液リンパ球から発生される(Barnd，D.L.ら，Proc.Natl. Acad.Sci．USA 86:7159 (1989)；Jerome，K.R．ら，Canc.Res．51:2908 (1991) ；Ioannides，C.G．ら，J.Immunol．151:3693-3703 (1993)；Finn，O.J.,Biothe rapy 4:239 (1992)；Jerome，K.R．ら，J.Immunol．151:1654-1662 (1993);Taka hashi，T．ら，J.Immunol．153:2102-2109（1994）、これらの文献が参考として 本明細書に含まれる) 。標的細胞はトランスフェクトされてMUC1を発現し得る（ Jeroe らの上記文献，1991，1993）。 更に、APCsの既知の型、例えば、形質転換されたＢ細胞及び樹状細胞が遺伝子 修飾されて培養中のTILsへの提示及び刺激について腫瘍関連抗原ペプチド、例え ば、MAGE-1及びMART-1を発現し得る。本明細書に記載された本発明はＴ細胞又は 腫瘍細胞の有効なトランスフェクションを可能にし、この場合、トランスフェク トされたＤＮＡが一時的及び持続した期間の両方で発現される。本明細書に記載 されるトランスフェクションは組換えウイルス（アデノウイルス感染細胞中でre p 及びキャプシド粒子から生成し得る）の不在下で起こった。本発明のAAV トラ ンスフェクションにより得られた細胞は患者を治療し、顕著な治療上の利益を得 るのに使用される。 1.反応体調製及びプロトコル a.プラスミド i.プラスミドpACMV-IL2 プラスミドpACMV-IL2 は、両端でAAV ITRsにより隣接された、IL-2ｃＤＮＡと してのヒトIL-2遺伝子、及びヒトサイトメガロウイルス(CMV) の即時−早期プロ モーター−エンハンサー要素、並びにラットプレプロインスリン及びSVポリアデ ニル化配列を含む。相当する対照プラスミド、pBC12/CMV-IL2 はAAV 末端反復塩 基を欠いた以外はpACMV-IL2 と同一であった。図１はpACMV-IL2 及びpBC12/CMV- IL2 のプラスミドマップを示す。 ii.プラスミドpMP6-IL2 図２に示されるように、プラスミドpMP6-IL2は二本鎖環状プラスミドであり、 この場合、ヒトIL-2遺伝子がCMV プロモーター及びSV40ポリアデニル化シグナル の制御下にある。プロモーターとIL-2のコード配列の間に、IL-2の発現を増進す るイントロンがある。全発現カセットがAAV の左右の末端配列の間にある。又、 pMP6-IL2プラスミドはブルースクリプト主鎖を有する。その主鎖はCol-E1バクテ リア複製開始点及びE.coli中のこのプラスミドの増殖を促進するアンピシリン耐 性遺伝子を有する。 図3a-3e はpMP6-IL2プラスミドのＤＮＡ配列（連続部分中に示される）を示す 。これらの図中、既知ＤＮＡ配列に相当するpMP6-IL2配列の部分が示される。相 当する配列情報がpMP6-IL2プラスミドの配列情報の下に直接にリストされる。マ ークされていない配列はリンカーからのものである。 pMP6-IL2プラスミドをアルカリ溶解及び酢酸アンモニウム沈殿により精製した 。核酸の濃度を260nm における吸収により測定した。 iii.プラスミドpA1CMVIX-CAT プラスミドpA1CMVIX-CATはpBR322誘導体中のAAV 末端反復塩基により隣接され たCMV プロモーターエンハンサー要素、介在スプライスアクセプター配列、バク テリアCAT 遺伝子及びシミアンウイルス540 後期ポリアデニル化シグナルを含む 。プラスミドをアルカリ溶解及び酢酸アンモニウム沈殿により精製した。核酸の 濃度を260nm における吸収により測定した。 b.リポソーム調製 i.pACMV-IL2 とともに使用したリポソーム 小さい単層リポソームを、中性脂質、ジオレイル−ホスファチジル−エタノー ルアミン(DOPE)（アバンチ・ポーラー・リピッズ）と組み合わせて、陽イオン性 脂質、ジオクタデシル−ジメチル−アンモニウム−ブロミド(DDAB)（シグマ・ケ ミカル社）から調製した。脂質をクロロホルムに溶解した。DDABを丸底フラスコ 中で1:1 のモル比でDOPEと混合した。脂質混合物をロータリー・エバポレーター で乾燥させた。無菌２回蒸留水を添加することにより脂質フィルムを再度水和し て１mMのDDABの最終濃度を得た。この溶液を浴ソニケーター中で透明になるまで 音波処理した。リポソームをアルゴンガスのもとに４℃で貯蔵した。 ii.pMP6-IL2 とともに使用したリポソーム 陽イオン性脂質DDABを1:1 のモル比で中性脂質DOPEと合わせることにより、又 はDDABを1:0.6 のモル比でコレステロールと合わせ、脂質をロータリー・エバポ レーター中で蒸発、乾燥させることにより、リポソームを調製した。脂質を無菌 脱イオン水中で再度懸濁させて１mMのDDABの最終濃度を得、次いで超音波浴中で 透明になるまで音波処理した。リポソームをアルゴンガスのもとに４℃で貯蔵し 、少なくとも４ケ月安定であった。 iii.TIL 刺激に使用したリポソーム 陽イオン性脂質DDABを1:1 又は1:2 のモル比で中性脂質DOPE又はコレステロー ルと合わせ、脂質をロータリー・エバポレーター中で蒸発、乾燥させることによ りリポソームを調製した。脂質を無菌脱イオン水中で再度懸濁させて１mMのDDAB の最終濃度を得た。次いでその溶液を超音波浴中で透明になるまで音波処理した 。リポソームをアルゴンガスのもとに４℃で貯蔵し、少なくとも４ケ月安定であ った。 c.細胞調製 i.TILs の単離 した腫瘍組織サンプル又はリンパ組織サンプルであった。次いでＴ細胞を当業界 で知られている方法、例えば、IL-2による刺激により活性化した。活性化された 細胞を20日間にわたって増殖した。 iiＴ細胞及び腫瘍細胞の単離 原発性Ｔ細胞集団を末梢血単核細胞から単離し、TIL 及び腫瘍細胞をAIS ミク ェクションのために調製した。 1)充実性組織からの腫瘍細胞 トランスフェクションのための細胞集団を得るために、細胞を充実性原発性病 変もしくは転移病変、又はリンパ組織から得た。例えば、乳腫瘍のバイオプシー を疑わしい難治性乳癌又は再発乳癌の手術前の診断により手術を受ける患者から 得た。又、これらの研究を卵巣腫瘍からの細胞で成功裏に行った。バイオプシー 組織コアを断片に分け、これらを光学顕微鏡及び免疫組織化学分析によるルーチ ン病理学のために処理した。 新たに切除された腫瘍を0.5cm の立方体に切断した。10までの腫瘍組織立方体 をAIM V 培地（ギブコ）25mlを含む25mlのスピナーフラスコに移した。フラスコ を５％のCO₂を含む37℃のインキュベーターに入れ、フラスコを12〜18時間にわ たって100 〜120 RPM で軽く攪拌した。インキュベーション後に、離解されなか った組織を濾過し、懸濁液中の細胞を遠心分離によりペレットにした。ペレット にされた乳癌細胞をAIM V 培地中で組織培養フラスコ（ファルコン）に入れ、５ ％のCO₂を含む保湿空気中で37℃の温度に維持した。 無血清培地中の48時間の培養後に、非付着細胞を吸引することにより付着細胞 及び非付着細胞を分離した。非付着細胞を洗浄し、次いで新しいフラスコ中で再 度培養した。再度の培養中に、付着細胞を集密まで増殖させ、0.05％のトリプシ ン及び0.02％のEDTAで除去し、高細胞密度で新しいフラスコに移した。 又、肺腫瘍起源、卵巣腫瘍起源及び乳腫瘍起源の原発性腫瘍細胞を充実性腫瘍 サンプルから得、以下のようにして単離した。腫瘍を細断し、２時間にわたって 酵素消化にかけた。組織を均一にし、PBS で洗浄した。リンパ球をAIS ミクロセ 団は腫瘍細胞を含み、これらをＬ−グルタミン及び抗生物質を含むRPMI 1640 + 10％のFBS 中で培養した。 2)液体からの腫瘍細胞 トランスフェクションのための細胞の別の源として、自己腫瘍細胞を悪性腹水 又は胸膜滲出液から単離した。悪性腹水又は滲出液を遠心分離し、細胞ペレット をAIM V 培地中で再度懸濁させた。細胞をカウントし、２工程フィコール勾配を リンパ球集団を枯渇した。これらの二つの方法の選択は、当業者により認められ るように、全細胞数に基いて行った。液体源からの腫瘍細胞の単離は胸膜滲出液 をもたらすことが知られている悪性腫瘍、例えば、卵巣癌及び肺癌に特に重要で ある。Ｔ細胞枯渇細胞フラクションは腫瘍細胞に富んでいた。 全ての自己腫瘍細胞を光学顕微鏡、フローサイトメトリー及び免疫組織化学染 色により特性決定して、オンコジーン発現を評価し、増殖インデックスを証明し た。例えば、乳癌の研究について、乳癌細胞の形態を有する細胞又は乳癌特異性 抗体で染色された細胞のみが自己腫瘍細胞と考えられ、そのまま使用された。 3)細胞系 マウスＢリンパ腫細胞系38C13 の細胞がBernd Gansbacher博士（メモリアル− スローン・ケタリング癌センター）から提供された。ラット前立腺細胞系R3327 細胞がEli Gilboa博士（デューク大学）から提供され、MDA-231 乳腫瘍細胞系細 胞がATCCから入手された。 d.細胞トランスフェクション（“リポフェクション”） i.TILs のリポフェクション TILsのトランスフェクションのために、5-10 x 10⁶細胞を６ウェル皿のウェル 当たり１mlの無血清培地に塗布した。IL-2遺伝子物質を含むプラスミドＤＮＡ（ 例えば、pMP6-IL2）50μg を50ｎモルのDDAB（1:1 のモル比でDDAB及びDOPEを含 むリポソームとして）と混合した。無血清培地(0.5ml) をAAV:リポソーム複合体 に添加し、次いでこれを細胞に添加した。リポフェクションを行うために、細胞 を５分間にわたって室温でインキュベートし、FBS を５％の最終濃度まで添加し た。 トランスフェクトされたTILsを、それらが由来する患者に戻した。これらの細 胞はIL-2と組み合わせて投与された通常の細胞毒性TILs以上の治療上の利益を与 える。IL-2を全身同時投与して細胞毒性Ｔ細胞活性を維持する必要が軽減又は排 除され、これは不利かつ潜在的致死性の毒性を回避するという利点を患者に与え る。 ii.腫瘍細胞のリポフェクション 乳癌細胞又は卵巣腫瘍細胞の如き腫瘍細胞の培養物を下記の方法でトランスフ ェクトした。10⁶腫瘍細胞を合計30ｎモルの脂質と混合したプラスミドＤＮＡ（ 例えば、pMP6-IL2）５μg でトランスフェクトし、この場合、脂質は1:1 のモル 比でDDAB及びDOPEを含むリポソームを含む。AIM V 培地１mlをリポソーム−ＤＮ Ａ複合体に添加し、その混合物を室温で30分間インキュベートした。次いでこの 混合物を細胞に添加し、37℃で24時間インキュベートし、その後、細胞を10,000 radで致死照射した。 又、ＤＮＡ−リポソーム複合体を下記の方法により生成した。所望の量のＤＮ Ａを無菌バイアルに移し、ＤＮＡ１μg 当たり１または２ｎモルのDDABを混合し ながら添加した。次いで、無血清培地１mlをリポソーム−ＤＮＡ複合体に添加し た。トランスフェクトすべき細胞を６ウェルプレートに塗布した。原発性腫瘍及 び腫瘍細胞系を無血清培地２mlに10⁶細胞／ウェルで塗布した。リポソーム−Ｄ ＮＡ複合体を細胞に添加し、室温で５分間インキュベートした。FBS を10％の最 終濃度まで添加した。 e.トランスジーン発現のアッセイ i.細胞外アッセイ IL-2産生を照射された細胞により評価することにより、トランスジーンの発現 を記録した。当業界で公知の方法を使用して、IL-2をELISA により評価すること ができる。 無細胞上澄みを回収し、IL-2濃度を種々の時点でELISA により測定した。例え ば、IL-2アッセイを２回反復実験で72時間の上澄みについて行った。IL-2トラン スジーンの成功裏のトランスフェクションを>100pg/72 時間/10⁶細胞のIL-2濃度 と定義した。 ii.細胞内アッセイ 細胞を種々の時点で回収し、PBS で洗浄し、PBS 中１％の冷パラホルムアルデ ヒド中で再度懸濁させた。４℃で10分後に、細胞を冷サポニン緩衝液(PBS中0.1 ％のサポニン、10％のFBS)で洗浄し、４℃で15分間にわたってマウス抗ヒトIL-2 抗体で染色した。次いで細胞を冷サポニン緩衝液で洗浄し、４℃で15分間にわた ってFITC接合ヤギ抗マウスF(ab')₂抗体で染色した。細胞をサポニン、次いでPBS で洗浄し、フローサイトメトリーにより分析した。 f.IL-2 ＤＮＡを検出するためのサザンハイブリダイゼーション 染色体ＤＮＡをHirt分別により単離した。制限消化後に、サンプル当たり５μ ラグメントとハイブリッドを形成した。 g.細胞毒性アッセイ 標的細胞を10⁶細胞当たり100 μCiの51Crで標識した。5000の標的細胞を96ウ ェルミクロプレートに３回の反復実験で塗布した。エフェクター細胞を添加して 20:1のエフェクター：標的比を得た。４時間のインキュベーション後に、上澄み 100 μl を夫々のウェルから回収し、放射能をK-カウンターでカウントした。 h.増殖アッセイ I00T1 AIM V 培地中の5 x 10⁴細胞を96ウェルミクロプレートに３回の反復実 験で塗布した。夫々のウェルを１μCiの³H- チミジンでパルス化した。細胞を24 時間後に回収し、放射能をシンチレーションカウンター中で測定した。 i.TCR 分析 TILsを培養中種々の時間後そして刺激後にに凍結した。当業界で知られている 方法を使用して、TCR 用量を逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)により分 析した。 2.結果 a.腫瘍特異性CTL のex vivo 活性化：培養中のTIL 細胞の刺激 TILsを50:1のTILs/ 刺激物質の比で自己照射腫瘍細胞又はIL-2トランスフェク トされた照射自己腫瘍細胞により５〜７日にわたって培養中に刺激した。応答を 600IU/mlのrIL-2 を補給したAIM V 培地中で培養されたTILsの応答と比較した。 刺激されたTILsを表現型、細胞毒性活性、増殖及びTCR レパートリーの変化につ いて分析した。培養中のTILsを刺激するこの簡単かつ迅速な方法がin vitro及び in vivo の遺伝子移入プロトコルの両方に使用される。 培養中のTILsを刺激する別の手段として、腫瘍関連抗原ペプチドがTIL 培養物 に直接添加し得る。 i.トランスフェクトされた腫瘍細胞によるTIL の刺激 腫瘍細胞を、例えば、pMP6-IL2でトランスフェクトしてそれらの抗原性を更に 増大した。トランスフェクトされた細胞を照射し、24時間後に、トランスフェク トされた細胞を洗浄し、トリプシン処理により回収し、遠心分離によりペレット にし、培地中で再度懸濁させた。次いでトランスフェクトされ、照射された腫瘍 細胞をTIL とともに培養した。 腫瘍特異性反応性を培養及び増加中にTIL により保持した。 自己腫瘍細胞又はHLA-適合同種腫瘍細胞を使用して培養物の増加期中に選択さ れたTILsを再度刺激した。これは重要な価値がある。何となれば、それらの標的 に対するＴ細胞の特異性は増加の進行中に減少することが時折知られているから である。TILsの長期培養はポリクローナル増加をもたらし、増加された細胞集団 の腫瘍特異性の減少を伴う。図13に示されるように、自己腫瘍細胞による増加さ れたTIL の刺激はTCR 用量により測定されたように増進された特異性をもたらし た。IL-2トランスフェクトされた腫瘍細胞で刺激されたTILsの特異性は未修飾腫 瘍細胞で刺激されたTIL の特異性より大きかった(TCRレパートリーにより評価さ れた) 。トランスフェクトされた腫瘍細胞により刺激されたTILsの増進された特 異性は30日の培養後に特に顕著であった。 結果は、AAV プラスミドに複合体形成された陽イオン性リポソームが原発性腫 瘍細胞だけでなく、培養された腫瘍細胞系を有効にトランスフェクトすることを 実証した。トランスフェクトされた細胞の50％までが細胞内IL-2レベルとして測 定してIL-2を発現し、発現の期間は30日までであった。トランスフェクション後 の腫瘍細胞の照射はトランスジーン発現を変化しなかった。TCR 分析は、遺伝子 修飾された自己腫瘍細胞の刺激影響下のバルク増加されたTIL からの腫瘍特異性 Ｔ細胞の増加を実証した。 b.IL-2 遺伝子によるトランスフェクション後のTIL の増殖 単離され、600IU/mlのIL-2を含む培地中で３週間にわたって培養された乳TIL の 反応性を示す。同様の実験を卵巣腫瘍からのTILsで行い、一致する結果を得た。 約10⁷ TILsをpMP6-IL2ＤＮＡ：リポソーム複合体を含む種々の組成物でトラン スフェクトした。リポソームの２種の組成物、“RPR DDAB”(ナッターマン・ホ スホリピッドGmBH、コロン、ドイツ) 及び“1100-28”（アプライド・イムン・ サイエンシズ社、サンタクララ、CA）を試験した。RPR DDABリポソームは1:1 の DDAB:DOPE比を有していた。1100-28 リポソームは1:0.6 のDDAB:DOPE 比を有し ていた。次いでTIL 細胞を外在性IL-2なしで培養した。陽性対照を600IU/mlのIL -2の存在下で培養した。 トランスフェクションの５日後に、トランスフェクトされた細胞及びトランス フェクトされなかった対照細胞の増殖を、³H- チミジンとり込みを使用して評価 した。陽性対照細胞からのカウントを100 ％であると定めた。増殖％（対照に対 する）はRPR DDABリポソームでトランスフェクトされたグループについて40〜80 ％の範囲であり、1100-28 リポソームグループについて40〜60％の範囲であった 。図14に示された結果は、乳癌TILsが、IL-2遺伝子でトランスフェクトされた時 、in vitroで増殖を維持するのに外在性IL-2を必要としなかったことを実証する 。 c.TIL 中のThy 1.2 遺伝子発現（図15） 乳癌TILsを、ネオマイシン耐性遺伝子及びマウスThy1.2遺伝子を含むpMP6(pMP 6/neo/Thy1.2) でトランスフェクトした。これはIL-2遺伝子を含むpMP6プラスミ ドの別の実施態様であった。pMP6/neo/Thy1.2 プラスミドを上記の同じDDAB:DOP Eリポソーム（図14中）に複合体形成した。２日目に、トランスフェクトされた 細胞をフィコエリスチン(PE)（ファーミンゲン、サンジエゴ、CA）に接合された 抗Thy1.2抗体で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。図15に示される ように、マウスＴ細胞表面マーカ-Thy1.2がトランスフェクトされたヒトCD8⁺TIL s中で有効に発現された。 d.トランスフェクション後の照射されたヒトメラノーマ細胞中のトランスジ ーン発現 メラノーマ細胞をpMP6-IL2で成功裏にトランスフェクトした。これらのトラン スフェクションについて、DDAB:DOPE に加えて脂質組成物を使用した。これらの 種々の脂質組成物はリポフェクション及びその後のサイトカイン発現を成功裏に 生じた。 当業界で知られている通常の酵素消化方法を使用して、メラノーマ細胞を転移 病巣から単離した。細胞を５〜10％のウシ胎児血清を補給したDMEM中で増殖し、 ５日〜８年にわたって培養して管理した。 リポフェクションのための調製において、腫瘍細胞を5 x 10⁵細胞／皿の密度 で60mmの皿に塗布した。翌日、陽イオン性脂質10〜30ｎモル及びＤＮＡ２〜10μ g を含むリポソームを混合し、無血清培地中で付着単層に移した。１〜５時間の インキュベーション後に、FCS を培地に添加した。 1:1 のモル比のDMRIE:DOPE（バイカル、サンジエゴCA）；3:1 の質量比のDOSP A:DOPE（ギブコ、ガイザースブルグ、MD）及び1:2 のモル比のDDAB:DOPE を含む 種々のリポソーム製剤を成功裏に使用した。 トランスフェクトされた細胞をリポフェクションの24時間後に致死Ｘ線照射(5 000 rads) に暴露した。培養上澄みを72時間で回収し、通常の方法を使用してそ の中のIL-2レベルをELISA により測定した。結果が下記の表５に見られ、これは 夫々のリポソーム製剤で得られたIL-2発現の最高レベルを示す。高レベルの発現 (>5000 pg/ml) が照射後の26日まで非増殖生存細胞中で検出された。 これらの結果はIL-2の有意な産生（致死照射後）をもたらしたプラスミドpMP6 -IL2 の非ウイルスのリポソーム媒介送出によるヒトメラノーマ細胞系の成功裏 の トランスフェクションを実証する。 e.前立腺腫瘍細胞系中のトランスジーン発現の細胞外アッセイ 異なるプラスミド構築物によるトランスフェクション後のトランスジーン発現 のレベル及び期間を比較するために、前立腺腫瘍細胞系、R3327 を通常のプラス ミド(pBC12/ CMV-IL2)10μg 又はDDAB:DOPE 1:2 リポソームとして10ｎモルのDD ABに複合体形成されたAAV プラスミド(pACMV-IL2)10 μg でトランスフェクトし た。 上澄みを種々の時点で回収し、IL-2レベルについてELISA により評価した。図 10は24時間の培養でpg/ml/10⁶細胞として表されたIL-2レベルを示す。AAV プラ スミドによるトランスフェクションは通常のプラスミドよりもかなり高いIL-2レ ベルを生じた。加えて、AAV プラスミドによるトランスフェクションは、通常の IL-2プラスミドではわずかに７日と対照的に、少なくとも30日にわたってIL-2の 産生を生じた。 図17はAAV プラスミド(pACMV-IL2) 又は通常のプラスミド(pBC12/CMV-IL2) で トランスフェクトされたR3327 細胞からの染色体ＤＮＡのサザンブロット分析を 示す。そのブロットをIL-2遺伝子の0.685 kb BamHI/HindIIIフラグメントで探査 した。対照(C) はトランスフェクトされなかった細胞からのＤＮＡを表す。IL-2 インサートが最後のレーンに示される。 f.AAV プラスミドでトランスフェクトされた前立腺細胞系中のトランスジー ン発現の細胞内アッセイ 前立腺細胞系R3327 をDDAB:DOPE リポソーム（1:1 又は1:2 のDDAB:DOPE の組 成比のリポソーム）と複合体形成されたAAV IL-2プラスミド (例えば、pACMV-IL 2)でトランスフェクトした。ＤＮＡ：リポソーム比は両方のグループで10μg の ＤＮＡ：10ｎモルのDDABであった。 トランスフェクトされた細胞を、本明細書に記載された改良フローサイトメト リー操作で免疫染色を使用して種々の時点で細胞内IL-2タンパク質について評価 した。結果が図18に示される（IL-2タンパク質を発現する陽性細胞％として）。 トランスフェクトされなかった細胞を陰性対照として使用し、これらの対照の値 をトランスフェクトされたグループの値から引いた。 g.原発性腫瘍細胞中のトランスジーン発現 AAV プラスミド−リポソーム複合体を使用して種々の原発性腫瘍細胞をトラン スフェクトした。一つの肺腫瘍サンプル、一つの卵巣腫瘍サンプル、及び二つの 乳腫瘍サンプルを新しい腫瘍バイオプシーから単離した。腫瘍細胞をトランスフ ェクションの前に２〜３週間にわたって10％のFBS を補給したRPMI-1640 培地中 で培養した。 原発性腫瘍細胞をDDAB:DOPE 1:1 として10ｎモルのDDABに複合体形成された10 μg のプラスミド (例えば、pACMV-IL2)でトランスフェクトした。上澄みを２日 目及び３日目に回収し、IL-2レベルをELISA により測定した。結果が図６に示さ れる（24時間の培養でpg IL-2/ml/10⁶細胞として表される）。 h.照射された原発性乳腫瘍細胞及び前立腺腫瘍細胞系によるトランスジーン 発現 IL-2遺伝子発現に関する照射の効果を測定するために、原発性乳腫瘍細胞及び 前立腺細胞系の細胞(R3327) を、pACMV-IL2 及びDDAB:DOPE リポソーム複合体を 含む組成物でトランスフェクトし、致死照射後の遺伝子発現について評価した。 腫瘍細胞系に関する結果が図19A に示され、原発性腫瘍細胞に関する結果が図19 B に示される。２日目に、⁶⁰Coイラジエーターを使用して細胞のアリコートを60 00 rads で照射し、次いで培養に戻した。上澄みを照射後24時間、48時間、72時 間及び96時間で回収し、IL-2レベルについて試験した。図19に示されるように、 トランスフェクション後の致死照射は24時間の培養でpg IL-2/ml/10⁶細胞として 測定してトランスジーン発現を抑制しなかった。 IV.検討 本研究において、トランスジーン及びAAV 末端反復塩基を含むAAV プラスミド をＤＮＡベクターとして使用し、陽イオン性リポソームをキャリヤー分子として 使用した。結果は、AAV プラスミドＤＮＡ：リポソーム複合体が原発性腫瘍細胞 、培養された細胞系、原発性リンパ系細胞、及びCD34⁺幹細胞を有効にトランス フェクトすることを実証した。組換えウイルス（アデノウイルス感染細胞中でre p タンパク質及びcap キャプシド粒子から生成し得る）の不在下で、トランスジ ーンの高レベルの組込み及び持続した発現が本発明の優れたトランスフェクショ ン 方法により達成された。 高レベルの発現に加えて、本明細書に開示されたAAV プラスミド：リポソーム の組み合わせは、典型的にはリポソーム媒介トランスフェクションに従う一時的 発現とは対照的に、遺伝子の長期（30日まで）の発現を誘導した (図5a-5b)。注 目することに、持続した発現がAAV プラスミドでリポフェクトされたグループだ けでなく、組換えAAV で形質導入されたグループで実証された（図5a- 5b）。更 に、通常のプラスミドトランスフェクションと較べて、10倍高いレベルの発現が 図4a-4b に示されるようにAAV プラスミドで観察された。 本明細書に開示された試験条件下で、最適のAAV 形質導入及び最高のAAV プラ スミド：リポソームトランスフェクションの間に効率の相違がなかった。発現の 時間経過に関して、陽イオン性リポソームは哺乳類細胞型中で通常のプラスミド ＤＮＡの一時的発現のみを媒介することが既に示されていた(Felgnerらの上記文 献；Roseらの上記文献) 。更に、本明細書に開示された結果と較べて、宿主ゲノ ムへの組込みの極めて低い効率が従来技術のリポソーム媒介トランスフェクショ ンで観察された(Shaefer-Ridder，M．ら，Science（1982）212:166-168) 。本明 細書に示されるように、AAV 末端反復塩基を有するAAV-プラスミドＤＮＡと複合 体形成された陽イオン性リポソームは、AAV ITRaのみを欠いた通常のプラスミド に対しゲノムＤＮＡ組込みを増大した。AAV プラスミド物質を含むリポソームは 特定の細胞表面レセプターの不在下でプラスミドＤＮＡを送出し、遺伝子送出に おけるウイルスの機能を置換した。 以上の開示は、ウイルスベクターがリポソームにより全て置換でき、有効な発 現及び組込みが効率及び組込みの両方の原因のウイルス要素を含む本構築物を使 用することにより得られることを実証する。それ故、感染のためのウイルスの生 産が回避され、実際に危険なウイルス組換えイベントの可能性を排除する。最終 結果がAAV プラスミド及び陽イオン性リポソームを組み合わせる優れたトランス フェクション方法の使用により得られた。 好ましい実施態様において、AAV プラスミド及び陽イオン性リポソームの組み 合わせは培養された細胞系を有効にトランスフェクトしただけでなく、原発性腫 瘍細胞並びにＴ細胞及び幹細胞を含む新しい血液由来細胞をトランスフェクトし た。これらの観察は注目に値する。何となれば、殆どの遺伝子治療戦略が原発性 Ｔリンパ球又は腫瘍細胞への遺伝子送出を伴うからである。現在に至るまで、こ れらの戦略は主としてレトロウイルス又はＤＮＡウイルスベクターへのトランス ジーン挿入に頼っていた。レトロウイルス系の基本的な欠点は非分割原発性細胞 をトランスフェクトすることができないことである。本発明は、AAV 物質を含む 陽イオン性リポソームが分割細胞型及び非分割細胞型のトランスフェクションを 媒介することを示す。それ故、AAV プラスミド：陽イオン性リポソームは持続し た高レベルの遺伝子発現に高度に有効なトランスフェクション系を与える。 有利なことに、プラスミドＤＮＡ：リポソーム複合体は、測定可能な毒性を生 じないで、例えば、静脈内投与、腹腔内投与及びエアゾール投与により、in viv oで送出し得る(Philip，R．ら，1993，上記文献; Stribling，R．ら，Proc.Natl .Acad.Sci．USA（1992）89:11277-11281; Zhu，N.ら，Science（1993）261:209- 211; Stewart，M.J.ら，Human Gene Therapy（1992）3:267-275)。本発明によれ ば、ＤＮＡ濃度は最高の発現を得るように最適化し得る。こうして、AAV 物質を 含むリポソームを使用する遺伝子移入はex vivo で多種の細胞型にAAV 及びトラ ンスジーン物質を成功裏に移入し、同様にin vivo で使用し得る。それ故、本発 明は遺伝子治療プロトコルに多大の利点を与える。 更に、種々の原発性腫瘍細胞型、腫瘍細胞系、及び数種のＴ細胞亜集団が、Ｄ ＮＡ：リポソーム複合体を使用してAAV プラスミドでトランスフェクトされた。 本明細書に示されるように、陽イオン性リポソームは細胞へのAAV プラスミドト ランスフェクションを促進した。原発性腫瘍細胞をトランスフェクトする能力は 大きな重要性を有する。何となれば、このような細胞は一般にトランスフェクト するのに非常に困難であったからである。本発明の方法により行われた高レベル の遺伝子発現に加えて、AAV プラスミド：リポソームの使用はトランスジーンの 長期(>30日) の発現を誘導した。更に、活性化されたＴ細胞及び天然Ｔ細胞がIL -2プラスミドでトランスフェクトされた場合、プラスミドが非選択的条件下でト ランスフェクション後の最低25日で細胞中で検出された。これらの達成は、通常 のプラスミドによる通常のリポソーム媒介トランスフェクションを使用する従来 技術における短期発現から先に進む重要なステップを構成する。 サイトカイントランスジーンでトランスフェクトされたTILsは外在性サイトカ イン又は成長因子を必要としないで増殖することがわかった。この能力は非常に 有利である。何となれば、本発明に従って調製されたTILsはIL-2の同時の全身注 入を必要としないで患者に与えられるからである。 本発明に従って調製されたトランスフェクトされたＴ細胞中のIL-2遺伝子発現 は外在性IL-2に対するＴ細胞の依存性及びIL-2禁断症状の効果を変化させた。注 目することに、IL-2トランスフェクトされたエフェクターＴ細胞はそれらの成長 及び増殖を維持し、かつ外在性IL-2が取り去られる時に通常起こるアポプトーシ スを阻止するのに充分な内在性IL-2を産生した。外在性IL-2に対する依存性が排 除された。 原発性の乳腫瘍細胞、肺腫瘍細胞及び卵巣腫瘍細胞が、本発明のAAV プラスミ ドＤＮＡ：リポソーム複合体を使用してトランスフェクト可能であった。トラン スフェクトされた原発性腫瘍細胞及び培養された腫瘍細胞が、致死照射後でさえ もトランスジーン産物を発現した。 本発明によれば、腫瘍細胞（自己腫瘍細胞及びHLA 適合同種腫瘍細胞の両方） が増加期中に選択されたTILsを再度刺激するのに使用し得る。トランスフェクト された腫瘍細胞が腫瘍予防接種プロトコルで強力な免疫原として使用される。治 療について、トランスフェクトされた腫瘍細胞は、当業界で知られているように 、典型的には医薬賦形剤と一緒に提供される。又、トランスフェクトされた腫瘍 細胞は培養中の相当するTIL 細胞を刺激するのに使用される。細胞表現型、細胞 毒性活性及びTCR 用量の分析は、単離後に腫瘍特異性を初期に示すが、rIL-2 中 で培養された時にこの特異性を一般に失うTILsが、腫瘍細胞、最も好ましくは本 発明に従ってトランスフェクトされた腫瘍細胞の存在下で培養された時にそれら の腫瘍特異性を維持し、増大することを実証した。 抗腫瘍及び抗ウイルス免疫を誘導するためのトランスフェクトされ、又は抗原 負荷された樹状細胞の使用の実施例 本発明の方法及び組成物を使用して、本発明者らはペプチド負荷されたDC又は AAV/リポソームトランスフェクトされたDCを使用して(1) 健康なドナーからのリ ンパ球中で腫瘍抗原及びウイルス抗原に対する一次CTL 応答及び(2) 腫瘍抗原又 はウイルス抗原に対する癌患者又はウイルス感染被験者のリンパ球中の二次応答 を誘導した。これらの知見に基いて、相当する腫瘍又はウイルス感染症を有する 患者における養子免疫療法のための腫瘍抗原特異性CTL 及びウイルス抗原特異性 CTL を生成することが実施可能である。 TAA 特異性CTL 並びにEBV 特異性CTL を、癌患者の末梢血又はEBV⁺正常個体か らのペプチド負荷されたDC又は抗原発現遺伝子修飾DCを使用して生成した。PBMC 由来DCを (a)MART-1(メラノーマ特異性抗原) 、CEA 、又はEBV ペプチド（これらの抗原は HLA-A2主要組織適合性糖タンパク質の状況下で提示される）でパルス化し、又は (b)MART-1 、CEA 、又はEBNA構築物でトランスフェクトしてこれらのタンパク質 を発現した。 DCは同様にその他のTAA 、例えば、MUC1（又はMUCIペプチドPDTRPAPGSTAPPAHG VTSA、配列番号２）、K-ras 、HER2（上記文献）、p53 、Magel 、Mage3 、pg10 0 、チロシナーゼ、Mart1（Melan A）、CEA 、PSA 、PSMA、Rage、Bage及びGage 並びに、例えば、Storkus，W．及びLotze，M., Biologic Therapy of Cancer: P rin-ciples and Practice, 第２編，3.2 節，“Tumor Antigens Recognized by I mmuneCells”，64-77 頁，J.B.Lippincott Co．publishers (1995)に同定された 抗原を含むその他の腫瘍関連抗原のタンパク質又はペプチドエピトープでパルス 化 (“負荷”)又はトランスフェクトし得る。本発明の実施に使用し得る腫瘍関 連抗原のリストが下記の表６に示される。 次いでこのような抗原負荷DC又はトランスフェクトされたDCをin vitroで使用 して以下に記載されるようにCD8⁺細胞を刺激した。これらのDCは原発性腫瘍、再 発腫瘍又は転移を有する被験者をin vivo で治療するのに有益であり、これらの 細胞は直接投与により又はこのようなDCによりex vivo で刺激され、活性化され たＴリンパ球の投与により適当なTAA を発現する。DC の単離及び特性決定 DCの単離が、Romani，N.ら，J.Exp.Med.（1994）180:83-93 により記載された ようにして、若干改良して行われる。末梢血単核細胞(PBMC)をリンホプレプ勾配 分離により健康なドナーバフィーコートから単離した。PBMCをウェル当たり15 x 10⁶細胞で６ウェルプレートに塗布し、37℃で２〜４時間にわたってプラスチッ クに付着させた。非付着細胞を除去し、付着PBMCを顆粒細胞／マクロファージコ ロニー刺激因子(GM-CSF; 800 U/ml)及びインターロイキン-4（IL-4; 500U/ml） とともにRPMI-10 ％FCS 中で５〜７日にわたって培養した。細胞を回収し、AIS に精製した。樹状細胞はフローサイトメトリー分析により測定して60〜90％の純 度であった。 図20に示されるように、DCが60〜90％の純度で単離された。細胞は特徴的なDC マーカーを有し、混合白血球培養物(MLC) 中の応答及び破傷風トキソイドに対す る応答を誘導するのにPBMCよりも強力である（下記の表７に示される）。 又、DCs は、IL-3の任意の存在とともに、GM-CSF及び腫瘍壊死因子-Iの存在下 で末梢血、骨髄又は膿帯血からのヒトCD34⁺先祖又は幹細胞を培養することによ りin vitroで生成される(Caux，C．ら，Nature 360:258-261 (1992); Reid，C.D .ら，J.Immunol．149:2681-2688 (1992); Santiago-Schwarz，F．ら，J.Leuko-c yte Biol．52:274 (1992)、これらの文献が参考としてそのまま含まれる) 。こ のようなin vitroで生成されたDCは天然抗原を捕獲し、処理する能力を有し、天 然Ｔ細胞を感作することができる(Caux，C．ら，J.Imm皿ol．155:5427-5435(199 5)) 。このようにして生成されたDCs は、末梢血からそのまま単離されたDCにつ いて本明細書に記載されたように、腫瘍抗原、ウイルス抗原、等を発現するのに 使用される。DC のトランスフェクション プラスミドをアルカリ溶解及び酢酸アンモニウム沈殿により精製した。核酸濃 度を260nM におけるUV吸収により測定した。 陽イオン性脂質ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド(DDAB)を中性脂 質ジオレイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)単独又は上記の所望のモル 比のDOPE及びコレステロールの両方と合わせることにより、リポソームを調製し た。脂質をロータリー・エバポレーター中で蒸発、乾燥させた後、それらを無菌 脱イオン水中に再度懸濁させて１mMのDDABの濃度を得た。次いでその溶液を超音 波浴中で透明になるまで音波処理した。リポソームをアルゴン雰囲気下で４℃で 貯蔵した。 ＤＮＡ−リポソーム複合体を生成するために、所望の量のＤＮＡを無菌バイア ルに移し、所望の量のDDABを添加し、混合した。無血清培地１mlをリポソーム− ＤＮＡ複合体に添加した。トランスフェクトすべき細胞を100mm の皿中の無血清 培地２mlに塗布した。リポソーム−ＤＮＡ複合体を細胞に添加し、室温で10分間 インキュベートした。血清、IL-4及びGM-CSFを含む培地を添加して所望の最終容 積に達した。 CAT の発現を測定するために、細胞をトランスフェクションの３日後に回収し 、細胞抽出物を調製し、タンパク質含量に従って基準化した。抽出物を200 ｎモ ルのアセチルコエンザイムＡ及び0.3 TCi ¹⁴C-クロラムフェニコールと混合し、 37℃で16時間インキュベートした。アセチル化クロラムフェニコール種及びアセ チル化されなかったクロラムフェニコール種を冷酢酸エチルで抽出し、95:5(vol / vol)のクロロホルム／メタノール溶媒を用いてシリカTLC プレートで分割した。 放射能標識生成物をオートラジオグラフィーにより視覚化した。 細胞内IL-2の測定のために、細胞を免疫染色の18時間前にモネンシンで処理し た。洗浄後、細胞をエタノールで透過性にし、IgG を使用してブロックして非特 異的結合を阻止し、マウス抗ヒトIL-2抗体、続いてFITC接合ヤギ抗マウス抗体で 免疫染色した。次いで細胞をフローサイトメトリーにより分析した。 NGFRの場合、NGFR遺伝子によるトランスフェクションの３日後に、細胞をNGFR に特異性の抗体による染色、続いてフローサイトメトリーによりNGFRの発現につ いて分析した。 抗原提示のための抗原をリポフェクションにより用意することに加えて、抗原 はDCを所望のタンパク質又はペプチドで“パルス化”することにより用意し得る 。例えば、DCはHLA-A2⁺メラノーマ患者の末梢血から単離され、HLA-A2と混在し た内在性ペプチドがストリッピングされ、HLA-A2制限ペプチド、MART-1、メラノ ーマ関連抗原でパルス化されていた（例えば、Restifo，NP ら，Cancer Res (19 95)55:3149-3157）。 単離された樹状細胞は、本明細書及びPCT 公開WO 95/07995（1995 年３月23日 ）に記載されたAAV プラスミド：リポソーム遺伝子送出系を使用してトランスフ ェクトされていた。図21はこの方法の概説を示す。AAV プラスミドＤＮＡに複合 体形成された陽イオン性リポソームは分割細胞型又は非分割細胞型の成功裏のト ランスフェクションをもたらす。 本明細書に記載されたベクター系を使用して、CAT リポーター遺伝子をコード する遺伝子並びにNGFR及びIL-2をコードする遺伝子を単離された樹状細胞にトラ ンスフェクト又は“リポフェクド”した。トランスフェクトＤＮＡによりコード されたタンパク質の生産が観察された（図22〜24）。 図22を参照して、DCをDDAB:DOPE リポソーム（レーン１、２）又はDDAB:CHOL: DOPEリポソーム（レーン３、４）に複合体形成されたCAT 遺伝子を含むAAV プラ スミドでリポフェクトした。トランスフェクションの３日後に、CAT 発現を記載 されたようにして分析した。全ての３種のドナー（Ａ、Ｂ及びＣ）は未反応クロ ラムフェニコールを示したでけでなく、クロラムフェニコールのモノアセチル化 位置１及びモノアセチル化位置３の形態の両方の発現を示した。mockトランスフ ェクトされたDC（レーン５）は未反応クロラムフェニコールのみを示した。CAT 発現が1 x 10⁶程度に少ない樹状細胞中で検出された。 上記遺伝子に加えて、樹状細胞が腫瘍関連ペプチド、例えば、EBV 関連ペプチ ドをコードする遺伝子でパルス化されることが好ましい。例えば、DC細胞はHLA- A2- 又はHLA-B8- 制限EBV ペプチド又はオンコジーンHER2、癌胎児性抗原(CEA) （以下を参照のこと）、上記MUC1、K-ras 等に由来するペプチドでパルス化され る。又、これらの腫瘍関連ペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡ構築物が本 明細書に記載されたようにしてDCにリポフェクトされる。10〜30％の発現効率が 得られた。 以上の例として、MCF7細胞系をDDAB:DOPE リポソームに複合体形成されたCAT 遺伝子を含むAAV プラスミドでトランスフェクト（“mock”トランスフェクト） し、又はDDAB:DOPE リポソームに複合体形成されたCEA 遺伝子を含むAAV プラス ミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後に、CEA 発現をCE A に特異性の抗体で染色された細胞のフローサイトメトリー分析により分析した 。結果が図32に示される。CEA トランスフェクトされた細胞は、mockトランスフ ェクト細胞と較べて約30％のCEA 発現を示した（42％陽性vs13％陽性）。DC 又はその他の抗原提示細胞によるCTL 活性の刺激 次いで、ペプチドでパルス化することにより、又は適当な遺伝子によるリポフ ェクションにより調製された抗原提示DCが被験者中で免疫応答を誘発するのに使 用される。 一つのアプローチにおいて、例えば、当業界で公知の方法を使用してCD8⁺細胞 を回収することにより、CTL が被験者から単離される。次いでCD8⁺細胞が抗原提 示DCとともに培養される。DCにより刺激された抗原特異性CD8⁺細胞は培養中に増 加されて、被験者に養子免疫反応性を移入することができる数の細胞を得、被験 者に投与される。 別の実施態様において、抗原提示DCが被験者に直接投与され、この場合、それ らが被験者の免疫系を誘導してDCに発現された腫瘍抗原に特異性のCTL を生じる 。 次いでCTL は適当な抗原を有する腫瘍細胞をin vivo で攻撃することができる。 腫瘍細胞それ自体は、本明細書に記載されたAAV をベースとするベクター／リ ポソーム系を使用して同様の方法でAPC として使用される。AAV をベースとする 発現プラスミドは、ウイルスrep 遺伝子及びキャプシド基を異種遺伝子と交換す ることによりAAV から誘導される。これはプロモーター−遺伝子構築物の両側の 二つのウイルスの逆方向末端反復塩基(ITR) の存在により非AAV 発現プラスミド とは異なる。ITRsを欠いている同一プラスミドでトランスフェクトされた細胞と 比較した場合、発現が数倍に上昇される。有効な発現が乳癌、肺メラノーマ及び 卵巣腫瘍から新たに単離された（未培養）腫瘍細胞で観察された。例えば、この ような細胞中のIL-2の発現は35日までにわたって持続した。このようなIL-2発現 細胞が乳癌及び卵巣癌の動物モデルで細胞毒性抗腫瘍応答を刺激するのに使用さ れた。CD8⁺細胞がこの発現系（IL-2結果について）を含むように修飾された場合 、それらはアポプトーシス死滅に対し耐性であった。 形質転換DCは抗原特異性ヒトCTL を生成するのに使用されていた。エプスタイ ンバールウイルスで感染されたヒト被験者からのPBMCをバフィーコート(EBV⁺)細 胞から分離した。この集団中の樹状細胞を、プラスチック付着細胞を回収し、そ れらをGM-CSF及びIL-4中で５日間インキュベートすることにより増殖させた。非 付着PBMCをその後の使用のために凍結した。得られた樹状細胞を回収し、pMP6Ne o に由来する２種のベクター（一方はEBV 誘導核抗原ペプチドEBNA3bを含み、他 方はEBNA3cを含む）でトランスフェクトした。トランスフェクトされたDCをGM-C SF 及びIL-4を含む完全培地(RPMI + 10％FBS)中で３日間インキュベートした。 トランスフェクトされなかったDCを対照として使用した。 細胞毒性活性を誘導するそれらの能力を試験するために、DCを回収し、照射し 、自己非付着PBMC（これはDCを生じるのに必要とされた５日間凍結され、培養直 前に解凍されていた）とともに同時培養した。非付着細胞は細胞毒性エフェクタ ー細胞の源として利用できる。同時培養細胞を試験の前に５日間にわたってIL-7 (10ng/ml) で補給されたAIM V 培地（ギブコ/BRL）中でインキュベートした。 ⁵¹Cr放出アッセイを使用して、CTL 活性を評価した。EBNA 3a 、3b、及び3cを 含むワクシニアウイルスベクター、又は対照ワクシニアベクターで感染された自 己CD4⁺細胞を使用して、アッセイを行った。アッセイは80:1のエフェクター：標 的比を使用した。結果が図25に示される。 pMP6NeoEBNA でトランスフェクトされたDCは特定の細胞毒性エフェクター細胞 を明らかに刺激した。刺激されたエフェクター細胞は約40％の比細胞毒性を示し 、一方、対照エフェクター細胞（これらは対照DC細胞とともに同時培養されてい た）はバックグラウンドレベルの細胞毒性（約25％）を有していた。このような アッセイにおける細胞毒性％は典型的にはエフェクター：標的比を減少するにつ れて減少するが、細胞毒性比、細胞毒性（トランスフェクトされたDCvsトランス フェクトされなかったDCにより刺激された）の本結果のレベルは比較的一定に留 まった。CEA 特異性CTL の生成 二つの戦略がCEA 特異性CTL を生成するのに使用される。 1)DCがクラスI HLA-A2分子の状況下でCTL により認識されるCEA ペプチド(YLSGA NLNL; Tsang，K.Y．ら，J.Natl.Canc.Inst．87:982-989 (1995))でパルス化され る、ペプチドをベースとするアプローチ；及び 2)DCが陽イオン性リポソームに複合体形成されたAAV のITRsを含むCEA をコード するプラスミドでトランスフェクトされる、遺伝子をベースとするアプローチ。 これらの系及びCEA 特異性CTL を生成する際のそれらの実用性が以下に記載され る。 DC 単離 Romaniら（上記文献）の改良を使用して、DCを単離した。簡単に言えば、HLA- A2⁺ドナーからの1.5 x 10⁸ PBMCをRPMI-10 ％FCS 中で37℃で２時間にわたってT 150フラスコに付着させた。インキュベーション後に、非付着細胞を除去し、付 着細胞を800 単位/ml のGM-CSF及び500 単位/ml のIL-4を含むRPMI-10 ％FCS 培 地30ml中で培養した。６〜７日の培養後に、分化したDCを回収し、内在性ペプチ ドをストリッピングし、CEAペプチド(YLSGANLNL) で負荷し、CD8⁺ T 細胞を刺激 するのに使用した。 ペプチドストリッピング及び負荷 ペプチドストリッピングについて、DCを0.9 ％のNaCl、１％のBSA 溶液の冷溶 液中で１回洗浄し、ストリッピング緩衝液（0.13M のＬ−アスコルビン酸、0.06 M の一塩基性リン酸ナトリウム、pH3 、１％のBSA 、3Tg/MLのB2M 、10μg/mlの ペプチド）中で10⁷細胞/ml で再度懸濁させ、氷の上で２分間インキュベートし た。次いで細胞を５倍容の中和緩衝液（0.15M の一塩基性リン酸ナトリウム、pH 7.5 、１％のBSA 、３μg/mlのB2M 、10μg/mlのペプチド）で中和し、1500rpm で５分間回転させた。最後に、細胞をペプチド溶液(PBS-CMF、１％のBSA 、30μ g/mlのDNAase、及び40μg/mlのペプチド) 中で再度懸濁させ、室温で４時間イン キュベートした。細胞を照射(3000 rad)し、刺激に使用する前に洗浄した。 CTL の生成 PBMCをフィコール−ハイペーク密度勾配遠心分離によりHLA-A2⁺患者の末梢血 ロイコホレシス(leukophoresis) 又は健康なドナーからのバフィーコートから分 プチド特異性CTL のレスポンダーリンパ球前駆細胞を調製した。捕獲されたCD8⁺ 細胞を1:3 の刺激物質：レスポンダー(S:R) 比でCEA ペプチドで負荷された照射 DCで刺激した。これらの同時培養細胞を10ng/ml のIL-7を含むRPMI-10 ％FCS 中 でインキュベートした。10〜12日目に、リンパ球をCEA ペプチド(1:5 S:R比) で パルス化されたDCで再度刺激した。レスポンダー細胞を1:5 〜1:15の範囲のS:R 比で合計３〜４回の刺激のために毎週再度刺激した。対照として、CD8⁺捕獲細胞 を(a) 無関係のペプチドでパルス化されたDC、(b) パルス化されなかったDC又は (c) IL-7のみとともに培養した。 細胞毒性の評価 通常の４時間の⁵¹Cr放出細胞毒性アッセイを使用して、上記のようにして生成 されたCTL によるCEA のHLA-A2制限認識を評価した。40μg/mlでペプチドととも に２〜４時間プレインキュベートされたT2細胞（ペプチドの添加により安定化さ れるまで“エンプティー”HLA-A2分子を発現する抗原プロセシングに欠損の細胞 系）を使用して、CTL によるCEA ペプチドの認識を評価した。加えて、CEA 発現 細胞系SW403（HLA-A2⁺）及びSW1417（HLA-A2^-）を標的として使用して、CEA 特 異性細胞毒性を評価した。標的細胞を100 μCiの⁵¹Crで一夜標識し、洗浄し、 Ｕ形底ミクロタイタプレート中で種々のエフェクター：標的(E:T) 比でエフェク ター細胞と混合した。４時間のインキュベーション後に、上澄みを回収し、放出 された⁵¹Crの量をシンチレーションカウンターで測定した。比細胞毒性（％）を 以下のようにして計算した。 結果 CEA ペプチドでパルス化されたT2標的細胞及び“エンプティー”T2 細胞に関 する正常ヒトＴ細胞によるCEA 比細胞毒性が図26に示される。ここで、自己の正 常CD8⁺捕獲レスポンダー細胞はCEA パルス化DCで刺激され、10ng/ml のIL-7中で 培養されていた。細胞毒性をCEA ペプチドパルス化DCによる再度の刺激の３ラウ ンド後に評価した。 CTL アッセイの日の上記エフェクター細胞の表現型が図27に示される。DC-CEA 刺激Ｔ細胞及びサイトカイン刺激Ｔ細胞をCD3 、CD4 、CD8 、及びCD56の抗体で 染色した。このエフェクター細胞集団中の細胞の大部分がCD3⁺８⁺であった。 CEA ペプチドでパルス化されたT2標的細胞に関する膵臓癌患者からのＴ細胞に よるCEA 特異性細胞毒性の発生が図28に示される。自己CD8⁺捕獲レスポンダー細 胞をCEA パルス化DCで刺激し、10ng/ml のIL-7中で培養した。細胞毒性を80:1、 40:1、20:1、10:1のエフェクター：標的比でCEA ペプチドパルス化DCによる再度 の刺激の２又は３ラウンド後に評価した。 HLA-A-2⁺乳癌患者からのＴ細胞をCEA で(10ng/mlのIL-7の存在下で) パルス化 された自己DCによるCEA 特異性CTL の刺激について試験した。生成されたCTL を ２種の異なる標的細胞：HLA-A2⁺CEA⁺細胞系(SW403) 及びHLA-A2^-CEA⁺細胞系(SW1 417)について試験した。結果が図29に示される。CTL 活性はMHC 制限されること が明らかであった。何となれば、HLA-A2^-細胞の死滅がHLA-A2⁺細胞の死滅よりも 著しく低かったからである。更に、CTL の生成は刺激期のCEA パルス化DCの存在 に依存した。何となれば、死滅がサイトカイン単独により刺激されたエフェクタ ー細胞で殆ど観察されなかったからである（図30）。 乳癌患者のエフェクター細胞の表現型(CTLアッセイの日) が図31に示される。 DC-CEA- 刺激Ｔ細胞及びサイトカイン刺激Ｔ細胞をCD3 、CD4 、CD8 、及びCD56 の抗体で染色した。このエフェクター細胞集団中の細胞の大部分がCD3⁺８⁺であ った。 トランスフェクトされた樹状細胞の逆転写酵素(RT)−ポリメラーゼ連鎖反応(P CR) 分析 この実施例は、AAV/リポソームトランスフェクションを使用する樹状細胞への 成功裏の遺伝子移入を示す。下記のデータは、所望の遺伝子が樹状細胞に成功裏 に移入されたことを示す。何となれば、夫々のトランスフェクトされた遺伝子を コードするｍＲＮＡが細胞中に存在したからである。 樹状細胞単離 正常なドナー末梢血からのPBMCs をフィコールで単離した。1.5 ｘ 10⁸PBMCs を37℃で２〜４時間にわたってRPMI-10 ％FCS 中でT150フラスコに付着させた。 インキュベーション後に、非付着細胞を除去し、付着細胞を800 単位/ml のGM-C SF及び500 単位/ml のIL-4を含むRPMI-10 ％FCS 培地30ml中で培養した。７日後 に、分化した樹状細胞を回収し、洗浄し、カウントした。 トランスフェクション 100mm の皿中の無血清RPMI中の3 x 10⁶ 細胞を夫々の条件についてトランスフ ェクトした。30μg/mlのプラスミドpMP6CAT 、pMP6ACEA、又はpMP6AMART1ＤＮＡ をDDAB:DOPE 1:1 リポソームとして合計60ｎモルの脂質に複合体形成した。細胞 を複合体とともにインキュベートした後、ウシ胎児血清、GM-CSF、及びIL-4を含 む追加の培地を添加して最終濃度を10％FCS 、800 単位/ml のGM-CSF、及び500 単位/ml のIL-4にした。細胞をトランスフェクションの１日後、２日後、又は３ 日後に回収した。 樹状細胞に加えて、又、２種の腫瘍細胞系を樹状細胞のトランスフェクション について上記されたプロトコルに従ってトランスフェクトした。腫瘍細胞系はMC F7及びCEM であった。MCF7は乳癌腫瘍細胞系であり、CEM はリンパ芽球様細胞系 である。 ｍＲＮＡ単離 ｍＲＮＡを単離し、DNase で処理して汚染プラスミドＤＮＡを除去した。トラ ンスフェクトされなかった細胞を同様に処理した。ｍＲＮＡの一部を逆転写酵素 を用いないPCR により増幅した。残りのｍＲＮＡを使用してｃＤＮＡを合成し、 次いでこれをPCR により増幅した。対照として、又、プラスミドＤＮＡをPCR に より増幅した。プラスミド構築物のイントロン部分に隣接するプライマーを使用 して、PCR 増幅を行った。ｍＲＮＡがスプライシングされない場合、これらのプ ライマーは完全長産物（プラスミド対照と同じサイズ）を生じるであろうが、イ ントロンがスプライシングで除去された場合には更に小さい産物を生じるであろ う（図42を参照のこと）。PCR 産物をゲル電気泳動により視覚化し、それらのサ イズを測定した。 結果 実験の結果が図43に示される。樹状細胞への成功裏の遺伝子移入をCAT 、CEA 、及びMART-1トランスジーンｍＲＮＡの存在により確認した。全ての場合、完全 長産物（CAT=710 、CEA=774 、MART-1=605）が検出され、樹状細胞からのｍＲＮ Ａがスプライシングされないことを示した。対照的に、同構築物でトランスフェ クトされた腫瘍細胞系(MCF-7、CEM)のｍＲＮＡ分析は小さいスプライシングされ た形態について陽性である。トランスフェクトされなかった細胞及び逆転写酵素 を用いないで増幅されたサンプルはトランスジーンｍＲＮＡについて陰性である 。 トランスフェクトされた樹状細胞中で検出されたｍＲＮＡはスプライシングさ れないが、CAT タンパク質アッセイ及び抗原特異性CTL を生成する能力により実 証されるように、タンパク質発現が依然として起こる。樹状細胞中のスプライシ ングされたｍＲＮＡの量を増加すると、タンパク質発現を増進し得ると考えられ る。メラノーマ抗原特異性CTL の生成 DCがメラノーマ細胞及び正常なメラノサイトで特異的に発現される腫瘍関連抗 原であるMART-1（“Ｔ細胞により認識されたメラノーマ抗原”）でパルス化され る、ペプチドをベースとするアプローチを使用した。免疫優性MART-1ペプチド(A AGIGILTV) はクラスＩ HLA-A2 分子の状況下でCTL により認識され(J.Exp.Med. 180:347 (1994)) 、本研究で使用された。 DC 単離 DCを抗CEA 応答の研究に実質的に上記されたようにして単離した。培養の６〜 ７日後に、分化したDCを回収し、内在性ペプチドをストリッピングし、MART-1ペ プチド(AAGIGILTV; J.Exp.Med．180:347 (1994))で負荷し、CD8⁺ T 細胞を刺激 するのに使用した。 ペプチドストリッピング及び負荷 これを抗CEA 応答の研究に実質的に上記されたようにして行った。 CTL の生成 患者ドナーがHLA-A2⁺メラノーマ患者であった以外は、CTL を抗CEA 応答の研 究に上記されたようにして生成した。ここで、刺激物質DC又はＴ細胞枯渇PBMCを MART-1ペプチド(1:5刺激物質：レスポンダー比) でパルス化し、1.5-2 x 10⁶レ スポンダー細胞／ウェルの密度で24ウェルプレートに塗布した。２日後、20U/ml のIL-2を添加した。レスポンダーを1:5 〜1:15の範囲の刺激物質：レスポンダー 比で刺激の合計３〜４ラウンドについて毎週再度刺激した。ここで又、対照は(a ) 無関係のペプチドでパルス化されたDC、(b) パルス化されなかったDC又は(c) IL-7のみとともに培養されたCD8⁺捕獲細胞を含んでいた。 細胞毒性の評価 上記のようにして生成されたCTL によるMART-1のHLA-A2制限認識を抗CEA 応答 について上記された通常の４時間の⁵¹Cr放出アッセイで評価した。40μg/mlのペ プチドとともに２〜４時間にわたってプレインキュベートされたT2標的細胞を使 用して、CTL によるMART-1ペプチドの認識を評価した。加えて、下記のHLA-A2⁺ 細胞系：624mel（MART-1⁺）、A375（MART-1^-）及び／又はColo205（MART-1^-）を 標的として使用して、MART-1特異性細胞毒性を評価した。標的細胞の標識及びア ッセイそれ自体は抗CEA 応答について記載されている。結果 MARTペプチドでパルス化されたT2標的細胞(T2-MART) 及び“エンプティー”T2 細胞(T2)に関するメラノーマ患者からのＴ細胞によるMART-1特異性細胞毒性が図 33〜35に示される。MART-1ペプチドで負荷され、IL-7とともに培養され、刺激の ３ラウンドにかけられた照射DCで刺激されたCD8 捕獲細胞は、MART-1パルス化標 的の著しく高い死滅として見られる比細胞毒性応答を示した。T2-MART に対する 比細胞毒性（T2に関する活性の引き算後）は夫々60、30、及び15のE:T 比で60％ 、40％、及び15％であった。 細胞毒性応答の特異性がまたMART-1^-標的(A375)と較べてMART-1⁺標的(624mel) の著しく高い死滅により見られた（図34）。624Melに対する比細胞毒性（MART-1^- 標的に関する活性の引き算後）は夫々60、30、及び15のE:T 比で25％、15％、 及び５％であった。 CTL アッセイの日の上記エフェクター細胞の表現型が図35に示される。DC-MAR T刺激患者Ｔ細胞及びIL-7刺激患者Ｔ細胞をCD3 、CD4 、CD8 、及びCD56の抗体 で染色した。エフェクター細胞の90％より多くがCD3⁺CD8⁺である。 正常の健康なドナー（図36〜38に示される）から得られた末梢血Ｔ細胞を用い て同様の研究を行い、これらはおそらく一次応答を反映する。 CTL 応答の特異性が、パルス化されなかった標的と較べてMART-1パルス化標的 の著しく高い死滅により実証された（図36）。T2-MART に対する比細胞毒性（T2 に関する活性の引き算後）は夫々60及び30のE:T 比で30％及び10％であった。 CTL 応答の特異性に関する更に別の証拠が図37に示され、この場合、MART-1⁺ 標的の死滅がMART-1^-標的の死滅よりも著しく高かった。624Melに対する比細胞 毒性（MART-1 ^-Colo標的に関する活性の引き算後）は60のE:T 比で30％であった 。 CTL アッセイの日の上記エフェクター細胞の表現型が図38に示される。DC-MAR T刺激正常Ｔ刺激及びIL-7刺激正常Ｔ刺激をCD3 、CD4 、CD8 、及びCD56の抗体 で染色した。エフェクター細胞の約70％がCD3⁺CD8⁺であった。 抗原提示細胞(APC) としてのMART-1遺伝子修飾樹状細胞の使用 この実験は、形質転換樹状細胞が腫瘍関連抗原(TAA)MART-1 遺伝子によりコー ドされたペプチド抗原を発現し、提示することができること、及びこれらの樹状 細胞がそれらの表面でMART-1抗原を提示する標的細胞のCD8⁺細胞による死滅をも たらすMART-1に特異性のCD8⁺細胞を刺激することができることを実証した。 樹状細胞単離 Romaniら(J.Exp.Med.，180:83(1994)) の改良を使用して、樹状細胞(DC)を単 離した。簡単に言えば、HLA A2⁺ドナーからの1.5 x 10⁸PBMC をRPMI-10 ％FCS 中で37℃で２〜４時間にわたってT150フラスコに付着させた。インキュベーショ ン後に、非付着細胞を除去し、付着細胞を800 単位/ml のGM-CSF及び500 単位/m lのIL-4を含むRPMI-10 ％FCS 培地30ml中で培養した。細胞を単離の６〜７日後 に回収した。 細胞調製 回収した細胞を無血清RPMI 1640 中で室温で再度懸濁させ、細胞（全ての細胞 型）の合計数を測定した。次いで細胞の容積を調節して1-5 x 10⁶細胞/ml を得 た。 ＤＮＡ：リポソーム複合体の調製 プラスミドpMP6AMART1はpMP6にクローン化されたＴ細胞により認識されたメラ ノーマ抗原である腫瘍関連抗原(TAA) 遺伝子MART-1の遺伝子を含む。MART-1コー ド配列を公表された配列から生成されたプライマーを使用するPCR により生成し た。PCR 産物をNheI及びBamHI で消化し、NheI及びBamHI 消化pMP6にクローン化 し、T4ＤＮＡポリメラーゼ、CIP 及びクレノーでフィルインした(filled in) 。 トランスフェクトすべき夫々1 x 10⁶細胞について、無菌H₂O 中の１mg/ml の濃 度のプラスミドＤＮＡ10μg を無菌の丸底管にアリコートにし、無菌H₂O 中１μ モルDDAB/ml の濃度のDDAB:DOPE 1:1 リポソームとしての10ｎモルのDDABと合わ せた。その溶液を穏やかな渦巻きにより混合し、室温で10〜15分間インキュベー トした。次いで無血清RPMI 1640 をＤＮＡ：リポソーム複合体に添加した。添加 した培地の容積は細胞懸濁液の容積の半分に等しかった。 リポソームトランスフェクション ＤＮＡ：リポソーム複合体を細胞懸濁液に移し、その混合物を室温で15分間イ ンキュベートした。次いで2X樹状細胞培地（RPMI 1640 + 20％FCS + 1600U/mlの GM CSF + 1000U/ml のIL-4）を細胞に添加した。添加した培地の容積は細胞及び 複合体の合計容積に等しかった。次いで細胞懸濁液を適当なサイズの培養容器に 移し、37℃、５％のCO₂のインキュベーターに入れた。 トランスフェクション後のアッセイ トランスフェクションの翌日に、トランスフェクトされた樹状細胞（刺激物質 ） を回収し、カウントし、CD8 ミクロセレクターフラスコで捕獲された正常なHLA- A2⁺ドナーからの自己細胞溶解性Ｔ細胞（レスポンダー）と混合した。刺激物質 を1:3 〜1:10の比でレスポンダー細胞に添加し、10ng/ml のIL7 を培養液に添加 した。刺激の10日後に、別の10ng/ml のIL7 をトランスフェクトされた樹状細胞 とともに培養液に添加した。２回の追加の再刺激を合成４回の刺激について毎週 行った。追加のIL7 を毎週の刺激の間に添加する。 最終の再刺激の５日後に、CTL を回収し、⁵¹Cr放出により適当な標的細胞に対 する比細胞毒性について評価した。 細胞毒性分析 CTL によるHLA-A2制限MART-1認識を通常の４時間の⁵¹Cr放出細胞毒性アッセイ により評価した。MART-1ペプチド(AAGIGILTV) はクラスＩ HLA-A2 分子の状況下 でCTL により認識される(J.Exp.Med.，180:347 (1994))。CTL によるMART-1ペプ チドの認識を、MART-1ペプチドでパルス化されたT2細胞(T2 + MART-1) 及び“エ ンプティー"T2 細胞（エンプティーT2）を使用して評価した。T2細胞はペプチド の添加により安定化されるまでエンプティーA2分子を発現するプロセシング欠損 細胞系である。MART-1でパルス化されたT2細胞を40mg/ml のMART-1ペプチドとと もに２〜４時間にわたってプレインキュベートした。標的細胞を100 mCi⁵¹Cr で 一夜標識した。それらを洗浄し、Ｕ形底ミクロタイタプレート中で種々のエフェ クター：標的(E:T) 比でエフェクター細胞と混合した。４時間のインキュベーシ ョン後に、上澄みを回収し、放出された⁵¹Crの量をβカウンターにより測定した 。比細胞毒性％を以下のようにして計算した。［（試験サンプルのcpm −自然⁵¹ Cr放出のcpm）／（最高⁵¹Cr放出のcpm −自然⁵¹Cr放出のcpm）］x 100 結果 図44a に示された結果は、腫瘍関連抗原遺伝子MART-1を発現する遺伝子修飾樹 状細胞で刺激されたＴ細胞がMART-1ペプチド負荷T2細胞(T2 + MART-1) に対し有 意な細胞毒性応答を示すことを示す。高いエフェクター：標的比でエンプティー T2細胞の或るバックグラウンド死滅があった。サイトカインのみで刺激されたＴ 細胞 (図44b)はエンプティー標的又はペプチド負荷標的に対し細胞毒性ではなか った。観察された応答は抗原特異性であった。このデータは、単一ペプチド応答 が全遺伝子産物を発現する樹状細胞による刺激により生じられることを実証する 。その他のHLA 制限応答が遺伝子修飾樹状細胞を使用して生じられるものと考え られる。HIV 抗原特異性CTL の生成 HIV タンパク質(gag、pol 、gp120 、nef)をコードする遺伝子を含むカナリア 痘ウイルス構築物vCP300（ビロゲネチクス社、トロイ、NY）が図39に図示される 。このベクターを使用してCD8⁺細胞及びCD4⁺細胞の枯渇されたPBMC又はDCを感染 して、これらの細胞がHIV 特異性CTL を刺激することができる免疫原形態でHIV ペプチドを発現するか否かを試験した。vCP300ベクターをポリプロピレン管中で ５又は10の感染多重度でトランスフェクトされる細胞と混合し、１時間にわたっ て37℃で５％のCO₂中でインキュベートした。HIV 遺伝子発現の分析のために、 感染細胞を更に18〜24時間インキュベートした。感染細胞を使用して培養物を直 ちに刺激した。残りの細胞をその後の使用のために凍結した。 HIV⁺ドナーから得られたCD8⁺レスポンダー細胞を100 IU/ml のrIL-2(セタスか ら) を補給したAIM V 培地中で培養した。刺激細胞を10:1のレスポンダー：刺激 物質の比で０日目及び７日目に添加した。 バフィーコートから得られた健康なPBMCを５％のヒトAB血清（アドバンスド・ バイオテクノロジー社、コロンビア、MD）、5.0 ng/ml のrIL-7(ゲンザイム社、 ケンブリッジ、MA) を補給したAIM V 培地中で培養した。加えて、100 IU/ml の rIL-2 を７日目の２回目の刺激の48時間後に添加した。培養物をCD8⁺培養物につ いて上記されたようにして刺激した。 成熟樹状細胞を10％FCS 、800 U/mlのGM-CSF及び500 U/mlのrIL-4(両方とも、 バイオソース・インターナショナル、カマリロ、CAから) を補給したRPMI-1640 培地中で培養した。 細胞毒性の評価 選択されたHIV 抗原を発現する自己CD4⁺細胞を、一般に上記のようにして行わ れた⁵¹Cr放出アッセイで標的細胞として使用した。標的細胞を、HIV の(1)envタ ンパク質、(2)gag/polタンパク質、又は(3)nefタンパク質を含むワクシニアウ イルスベクター（ビロゲネチクス社、トロイ、NY）による感染により調製した。 CD4⁺細胞及びワクシニアウイルスベクター（MOI=10）を37℃で１時間にわたって 同時インキュベートすることにより感染を行った。次いで感染細胞を一夜にわた って37℃で５％のCO₂の雰囲気中で24ウェル組織培養プレートの個々のウェル中 で10⁶細胞当たり100 μCi/ml の濃度の⁵¹Crで標識した。 エフェクター細胞及び標的細胞を96ウェルミクロプレート中で細胞数に応じて ５〜40の範囲のE:T 比で混合し、通常の４時間の細胞毒性アッセイでインキュベ ートした。細胞毒性％を上記のようにして計算した。vCp300 発現の分析 細胞の三つの集団を先に詳述したようにしてカナリア痘構築物vCP300で感染さ せた：(a)PBMC 、(b)CD8を有する細胞及びCD4 を有する細胞の枯渇されたPBMC及 び(c)DC 。これらの細胞を緩衝液(PBS-CMF) 、プールされたヒトAB血清、又はHI V⁺ドナーからプールされた血清（ニューヨーク州健康局、トロイ、NY）とともに インキュベートした。第二工程として、これらの細胞をフルオレセインイソチオ シアネート接合ヤギ抗ヒトIgG(ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ社 、ウェスト・グローブ、PA) ともにインキュベートした。染色された細胞をフロ ーサイトメトリー（ベクトン・ディキンソン・イムノサイトメトリー・システム ズ、サンホセ、CA）により分析した。結果 これらの研究の結果が図40〜41に見られる。カナリア痘構築物vCP300で感染さ れた自己DCで刺激されたPBMCはHIV env 、gag/pol 又はnef を発現する自己標的 細胞に対し細胞毒性活性を有していた（図40）。細胞毒性活性は18％〜30％溶解 の範囲であった。その活性はHIV 遺伝子を欠いている対照カナリア痘構築物(vCP pp) で感染されたDCにより培養中に刺激されたPBMCのバックグラウンド活性より もかなり高かった。同様に、マイトジェンPHA により刺激されたPBMCは溶解活性 を示さなかった。細胞毒性は抗原提示DCを感染するのに使用された構築物中に存 在するHIV タンパク質の全てに対して誘導された。 フローサイトメトリーを使用して４人の健康なドナーから単離され、vCP300で 感染されたDCに関するHIV タンパク質の発現を分析した。図41に示された結果は 、 HIV タンパク質が感染DCへの抗HIV 抗体（HIV⁺ドナーからの血清の形態）の結合 により検出されたことを示す。対照血清は感染DC製剤のいずれとも反応しなかっ た。vCP300ベクターによる感染により獲得されたHIV 抗原を発現する細胞の％は ５％から15％までの範囲であった。 本明細書及び請求の範囲に使用される単数形態“a”、“an”及び“the”は、 文脈が明らかにそうではないことを指示しない限り複数の指示物を含む。こうし て、例えば、“a formulation(配合物)”についての言及は異なる配合物の混合 物を含み、“the method of treatment(治療の方法)”についての言及は当業者 に知られている均等な工程及び方法、等への言及を含む。 特に定義しない限り、本明細書に使用される全ての技術用語及び科学用語は、 本発明が属する分野の当業者により普通に理解されるのと同じ意味を有する。 上記引用文献は、特別に含まれるか否かを問わず、参考として本明細書に全て 含まれる。 今や、本発明を充分に説明したので、本発明が本発明の精神及び範囲から逸脱 しないで、かつ無用の実験をしないで、広範囲の均等なパラメーター、濃度、及 び条件内で実施し得ることが当業者により理解されるであろう。本明細書に使用 される表現又は用語は説明の目的のためであり、限定の目的のためではないこと が理解されるべきである。本明細書に記載された方法及び物質と同様又は均等の あらゆる方法及び物質が本発明の実施又は試験に使用し得るが、好ましい方法及 び物質が記載される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 31/00 ６１７ Ａ６１Ｋ 31/00 ６１７ ６３５ ６３５ ６３５Ａ ６３７ ６３７Ｃ 35/14 35/14 Ｚ 48/00 48/00 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号 ０８／５６６，２８６ (32)優先日 1995年12月１日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，Ｈ Ｕ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 レブコウスキー ジェーン エス アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94028 ポートラ ヴァリー ガバーダ ウェイ 150

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．樹状細胞に天然ではないＤＮＡ配列を含むベクターによりトランスフェクト された非不死化樹状細胞。 ２．脂質物質及びアデノ関連ウイルス物質を含むリポソームを含む組成物により トランスフェクトされた樹状細胞又はその他の抗原提示細胞。 ３．樹状細胞である請求の範囲第２項に記載の細胞。 ４．前記アデノ関連ウイルス物質がプラスミドを含む請求の範囲第２項に記載の 細胞。 ５．前記プラスミドが腫瘍特異性抗原、腫瘍関連抗原、微生物抗原、サイトカイ ン、細胞レセプター、リポーター分子又は選択可能なマーカーの一種以上をコー ドする関係するＤＮＡ配列を含む請求の範囲第４項に記載の細胞。 ６．前記プラスミドは、関係する前記ＤＮＡ配列が挿入されるpMP6である請求の 範囲第５項に記載の細胞。 ７．(a) リポソーム、アデノ関連ウイルス物質及び関係するＤＮＡ配列を含む組 成物を用意する工程、及び (b) 工程(a) の組成物を細胞（その細胞は遺伝子物質を含む）と接触させ、そ の結果、関係するＤＮＡ配列を前記細胞に導入する工程 を含む関係するＤＮＡ配列を樹状細胞又はその他の抗原提示細胞に導入する方法 。 ８．工程(a) のリポソームが陽イオン性脂質を含む請求の範囲第７項に記載の方 法。 ９．アデノ関連ウイルス物質がプラスミドを含む請求の範囲第７項に記載の方法 。 10．プラスミドが関係する前記ＤＮＡ配列を含むpMP6である請求の範囲第９項に 記載の方法。 11．関係するＤＮＡ配列が腫瘍特異性抗原もしくは腫瘍関連抗原、微生物抗原、 サイトカイン、細胞レセプター、リポーター分子又は選択可能なマーカーの一種 以上をコードする請求の範囲第７項に記載の方法。 12．(a) 前記腫瘍特異性抗原もしくは腫瘍関連抗原が癌胎児性抗原、乳腫瘍抗原 、結腸直腸腫瘍抗原、胃腫瘍抗原、膵臓腫瘍抗原、肺腫瘍抗原、卵巣腫瘍抗原、 膀 胱腫瘍抗原、前立腺腫瘍抗原、メラノーマ抗原、白血病抗原又はリンパ腫抗原で あり、又は (b) 前記微生物抗原がエプスタイン−バールウイルス抗原又はHIV 抗原であり 、又は (c) 前記サイトカインがインターロイキン-2であり、又は (d) 前記レセプターが神経成長因子レセプターであり、又は (e) 前記リポーター分子がバクテリアのクロラムフェニコールアセチルトラン スフェラーゼである請求の範囲第11項に記載の方法。 13．関係する前記ＤＮＡ配列が前記細胞の遺伝子物質に組込む請求の範囲第７項 に記載の方法。 14．被験者中で選択された抗原に対する免疫応答を刺激することにより治療し得 る疾患又は症状を有する被験者の治療方法であって、その方法が (a) 前記被験者の樹状細胞又はその他の抗原提示細胞をリポソーム、アデノ関 連ウイルス物質及び前記選択された抗原をコードする関係するＤＮＡ配列を含む 組成物とin vivo で接触させ、その結果、前記ＤＮＡ配列を前記細胞に導入する 工程、及び (b) 前記ＤＮＡ配列によりコードされた抗原を発現させ、前記被験者の前記免 疫応答を刺激し、それにより前記被験者を治療する工程 を含むことを特徴とする治療方法。 15．被験者中で選択された抗原に対する免疫応答を刺激することにより治療し得 る疾患又は症状を有する被験者の治療方法であって、その方法が (a) 樹状細胞又はその他の抗原提示細胞（これらの細胞は前記被験者に自己又 は同種である）をリポソーム、アデノ関連ウイルス物質及び前記選択された抗原 をコードする関係するＤＮＡ配列を含む組成物とex vivo で接触させ、その結果 、前記ＤＮＡ配列を前記細胞に導入する工程、 (b) 前記ＤＮＡ配列によりコードされた抗原を前記細胞中で発現させる工程、 及び (c) 前記抗原を発現する前記細胞を前記被験者に送出して前記免疫応答を刺激 し、それにより前記被験者を治療する工程 を含むことを特徴とする治療方法。 16．被験者中で選択された抗原に対する免疫応答を刺激することにより治療し得 る疾患又は症状を有する被験者の治療方法であって、その方法が (a) 樹状細胞又はその他の抗原提示細胞（これらの細胞は前記被験者に自己又 は同種である）をリポソーム、アデノ関連ウイルス物質及び前記選択された抗原 をコードする関係するＤＮＡ配列を含む組成物とex vivo で接触させ、その結果 、前記ＤＮＡ配列を前記細胞に導入する工程、 (b) 前記ＤＮＡ配列によりコードされた抗原を前記細胞中で発現させる工程、 (c) リンパ球を抗原を発現する前記細胞との接触によりex vivo で活性化させ て、抗原を有する被験者中で細胞に対し細胞毒性又は特異的免疫反応性にする工 程、及び (d) 前記活性化されたリンパ球を前記被験者に送出して前記被験者中の前記免 疫応答を媒介し、それにより前記被験者を治療する工程 を含むことを特徴とする治療方法。 17．前記疾患又は症状が腫瘍形成又は感染症である請求の範囲第14項、第15項又 は第16項に記載の方法。 18．関係する前記ＤＮＡ配列が腫瘍特異性抗原、腫瘍関連抗原又は微生物抗原の 一種以上をコードする請求の範囲第14項、第15項又は第16項に記載の方法。 19．前記微生物抗原がHIV 抗原である請求の範囲第18項に記載の方法。 20．(a) タンパク質をコードするＤＮＡ配列を樹状細胞に導入し、そして (b) 前記ＤＮＡ配列を発現させ、それにより前記タンパク質を生産することを 特徴とする樹状細胞中のタンパク質の生産方法。 21．前記導入が細胞をリポソーム、アデノ関連ウイルス物質及び前記ＤＮＡ配列 を含む組成物でトランスフェクトすることにより行われる請求の範囲第20項に記 載の方法。 22．前記腫瘍関連抗原がMART-1である請求の範囲第５項に記載の細胞。 23．前記腫瘍関連抗原がCEA である請求の範囲第５項に記載の細胞。 24．前記腫瘍関連抗原がMUC-1 である請求の範囲第５項に記載の細胞。 25．前記腫瘍関連抗原がEBNAである請求の範囲第５項に記載の細胞。 26．前記腫瘍関連抗原がMART-1 (Melan A)、CEA 、MUC-1 、p53 、ras 、her 、 Mage1 、Mage3 、pg100 、チロシナーゼ、PSA 、PSMA、Rage、Bage、Gage、E1A 、E6、E7、EBNA2 、EBNA-3A 、EBNA-3C 、EBNA-4、EBNA-6、neu 及びgp100 から なる群から選ばれる請求の範囲第５項に記載の細胞。 27．選択された腫瘍関連抗原を有する修飾樹状細胞を用意し、細胞溶解性Ｔ細胞 を前記腫瘍関連抗原を有する前記樹状細胞と接触させることを含み、前記接触が in vivo 又はin vitroで起こり得ることを特徴とする腫瘍関連抗原に対する免疫 応答の誘発方法。 28．前記接触がin vivo で起こる請求の範囲第27項に記載の方法。 29．前記接触がin vitroで起こる請求の範囲第27項に記載の方法。