TWI673062B - 粒狀疫苗調配物 - Google Patents

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Abstract

本發明提供包含至少一種肽抗原組裝體及至少一種佐劑之疫苗調配物。本發明亦提供使用該等疫苗調配物在哺乳動物中誘導免疫反應之方法及使用該等疫苗調配物治療哺乳動物之疾病之方法。

Description

粒狀疫苗調配物
本申請案根據35 USC § 119(e)主張2011年9月12日提出申請之美國臨時申請案第61/533,512號之權利，該申請案之全部揭示內容以引用方式併入本文中。
研發安全且有效的供人類使用之免疫療法及治療性疫苗對於全世界患者而言仍然係重要的醫學需要。通常，疫苗調配物包括抗原以刺激目標免疫反應。然而，一些研發的疫苗係無效的，此乃因其在廣泛哺乳動物群體中係免疫反應之弱刺激物。例如，疫苗調配物中之抗原可在哺乳動物中具有較差免疫原性。另外，一些疫苗可不能將抗原有效地遞送至哺乳動物免疫系統之抗原呈現細胞(「APC」)。
此外，已知，疫苗調配物中之一些抗原在哺乳動物中係免疫反應之弱刺激物。其他抗原可需要由哺乳動物免疫系統對特定抗原表位進行處理以為有效的。因此，需要遞送較大量之該等抗原。然而，使用奈米顆粒遞送系統不能有效且安全地達成該等較大量之遞送。投與存於水溶液中之蛋白質及肽抗原亦可為不利的，此乃因該等抗原通常具有弱免疫原性且APC對其之吸收較差。儘管將抗原研發成病毒樣顆粒(VLP)已取得成功，但VLP之製造不期望地昂貴且需要使用大的重組蛋白質(通常需要融合蛋白)及複雜的特定組裝技術。此外，VLP排除使用肽抗原。
疫苗通常亦包括佐劑以試圖增強疫苗調配物中之抗原的 功效。例如，通常使用諸如油包水乳液、明礬(例如，鋁鹽)及其他化學品等佐劑來增強哺乳動物中之抗原反應。除傳統佐劑以外，亦可使用具有內在免疫效應之其他佐劑(例如，流感病毒體及Chiron之MF59)。然而，該等佐劑亦為不期望的，此乃因來自動物模型之證據(根據關於HSV及流感疫苗之臨床試驗報告)表明，其僅增強動物中之中和抗體之產生而不增強T細胞反應。
因此，需要有效地遞送抗原或促進抗原呈現細胞對抗原之吸收以在哺乳動物中刺激免疫反應之新穎疫苗調配物。此外，亦非常期望在哺乳動物中刺激細胞介導之免疫反應的新穎且有效方法，該方法可能藉由在疫苗調配物中納入安全且有效之免疫修飾劑(「免疫調節劑(immunomodulator)」)。因此，本發明提供疫苗調配物及使用該等調配物之方法，該等調配物展現期望特性且提供改良簡單性、抗原吸收及哺乳動物中免疫反應之誘導之相關優點。
本發明提供包含至少一種肽抗原組裝體及至少一種佐劑之疫苗調配物。本發明亦提供使用該等疫苗調配物在哺乳動物中誘導免疫反應之方法及使用該等疫苗調配物治療哺乳動物疾病之方法。
本發明之疫苗調配物及方法與業內之其他調配物及方法相比提供數個優點。第一，該等疫苗調配物包括為免疫調節劑之佐劑，以增強、引導或促進哺乳動物中之合適免疫反應。若將免疫調節劑納入疫苗調配物中，則其具有有效 地加強哺乳動物對抗原之免疫反應的潛力。例如，免疫調節劑可有利地達成以下各項中之一或多項：(1)改良APC中之抗原遞送及/或處理，(2)誘導產生有利於發生對抗原之免疫反應之免疫調節性細胞因子，由此促進細胞介導之免疫性，包括細胞毒性T-淋巴球(「CTL」)，(3)降低免疫次數或有效疫苗所需要之抗原的量，(4)延長疫苗抗原之生物學或免疫學半衰期，及(5)藉由抑制免疫阻抑因子來克服對抗原之免疫耐受性。在一些實施例中，基於陽離子脂質之佐劑可用作強效免疫修飾佐劑，且可在疫苗調配物中引發優異的T細胞及抗體免疫反應。
第二，疫苗調配物(例如粒狀疫苗調配物)包括天然形成或自形成之抗原組裝體，例如微胞結構或雙層結構，其有效地促進與傳統疫苗調配物相比較大量之抗原為APC所吸收。該抗原組裝體容許抗原之調配物以適宜形式由哺乳動物中之APC吸收及處理，從而達成更強效之抗原特異性免疫反應。此外，蛋白質或肽抗原在水性介質中自發形成諸如微胞或雙層結構等簡單而有組織之粒狀結構使得結構可有效地由APC吸收及處理。因此，可以與佐劑之混合物或與佐劑之組合投與強效的疫苗調配物。
第三，抗原組裝體中所用之肽或蛋白質可經修飾，以使親水性基團對親脂性基團之比率能夠實現雙層或微胞結構之形成。對蛋白質或肽抗原之修飾可藉由多種方式來達成，例如藉由將親脂性基團(例如，烴鏈或疏水性胺基酸序列)附接至親水性肽，且對於疏水性蛋白質或肽，則反 之。所附接基團之大小亦可基於肽的大小及所期望之疏水性或親水性程度加以修飾。
最後，如本發明中所展示，與經由傳統的脂質體或微胞囊封之疫苗調配物投與相同量之抗原及佐劑相比，該等疫苗調配物使得疫苗之免疫原性顯著改良。
本發明涵蓋以下編號實施例，且該等實施例不具有限制性：
1.一種疫苗調配物，其包含佐劑及抗原組裝體。
2.如第1項之疫苗調配物，其中該調配物係粒狀疫苗調配物。
3.如第1或2項之疫苗調配物，其中該佐劑與該抗原組裝體係混合物。
4.如第1至3項中任一項之疫苗調配物，其中該佐劑係免疫調節劑。
5.如第1至4項中任一項之疫苗調配物，其中該佐劑係奈米顆粒。
6.如第1至5項中任一項之疫苗調配物，其中該佐劑係陽離子脂質。
7.如第6項之疫苗調配物，其中該陽離子脂質係經過純化。
8.如第6或7項之疫苗調配物，其中該陽離子脂質係選自由下列組成之群：DOTAP、DOTMA、DOEPC及其組合。
9.如第6至8項中任一項之疫苗調配物，其中該陽離子 脂質係DOTAP。
10.如第6至8項中任一項之疫苗調配物，其中該陽離子脂質係DOTMA。
11.如第6至8項中任一項之疫苗調配物，其中該陽離子脂質係DOEPC。
12.如第1至5項中任一項之疫苗調配物，其中該佐劑係陽離子脂質之對映異構體。
13.如第12項之疫苗調配物，其中該對映異構體係經過純化。
14.如第12或13項之疫苗調配物，其中該對映異構體係R-DOTAP或S-DOTAP。
15.如第12至14項中任一項之疫苗調配物，其中該對映異構體係R-DOTAP。
16.如第12至14項中任一項之疫苗調配物，其中該對映異構體係S-DOTAP。
17.如第1至16項中任一項之疫苗調配物，其中該抗原組裝體係自行組裝結構。
18.如第1至17項中任一項之疫苗調配物，其中該抗原組裝體係微胞結構。
19.如第1至17項中任一項之疫苗調配物，其中該抗原組裝體係脂質雙層結構。
20.如第1至19項中任一項之疫苗調配物，其中該抗原組裝體係管狀結構。
21.如第1至19項中任一項之疫苗調配物，其中該抗原組 裝體係球形結構。
22.如第1至21項中任一項之疫苗調配物，其中該抗原組裝體包含一或多種抗原。
23.如第1至22項中任一項之疫苗調配物，其中一或多種抗原係基於蛋白質之抗原。
24.如第1至23項中任一項之疫苗調配物，其中一或多種抗原係基於肽之抗原。
25.如第1至24項中任一項之疫苗調配物，其中一或多種抗原係選自由下列組成之群：癌抗原、病毒抗原、細菌抗原及病原性抗原。
26.如第1至25項中任一項之疫苗調配物，其中一或多種抗原係病毒抗原。
27.如第1至26項中任一項之疫苗調配物，其中一或多種抗原係細菌抗原。
28.如第1至27項中任一項之疫苗調配物，其中一或多種抗原係病原性抗原。
29.如第28項之疫苗調配物，其中該病原性抗原係合成或重組抗原。
30.如第1至29項中任一項之疫苗調配物，其中至少一種抗原係HPV蛋白質或肽。
31.如第1至30項中任一項之疫苗調配物，其中至少一種抗原係黑色素瘤抗原。
32.如第31項之疫苗調配物，其中該黑色素瘤抗原係選自包含以下之群：gp100(KVPRNQDWL[SEQ.ID.No.8])、 TRP2(SYVDFFVWL[SEQ.ID.No.9])及p53(KYICNSSCM[SEQ.ID.No.10])，及其組合。
33.如第1至32項中任一項之疫苗調配物，其中至少一種抗原係選自由下列組成之群：脂蛋白、脂肽及經具有增加的疏水性或降低的疏水性之胺基酸序列修飾之蛋白質或肽。
34.如第1至33項中任一項之疫苗調配物，其中一或多種抗原係脂質化抗原或經修飾以增加抗原之疏水性的抗原。
35.如第1至34項中任一項之疫苗調配物，其中至少一種抗原係經修飾之蛋白質或肽。
36.如第35項之疫苗調配物，其中該經修飾之蛋白質或肽鍵結至疏水性基團。
37.如第35或36項之疫苗調配物，其中鍵結至疏水性基團之該經修飾之蛋白質或肽進一步包含介於該抗原與該疏水性基團之間之連接體序列。
38.如第37項之疫苗調配物，其中該疏水性基團係棕櫚醯基。
39.如第1至38項中任一項之疫苗調配物，其中至少一種抗原係未經修飾之蛋白質或肽。
40.如第1至39項中任一項之疫苗調配物，其中至少一種抗原係選自由下列組成之群：RAHYNIVTF(SEQ.ID.NO：1)、GQAEPDRAHYNIVTF(SEQ.ID.NO：2)、KSSGQAEPDRAHYNIVTF(SEQ.ID.NO：3)、YMLDLQPETT(SEQ.ID.NO：4)、KSSYMLDLQPETT(SEQ.ID.NO：5)、KSSMHGDTPTLHEYMLDLQPETT(SEQ.ID.NO：6)、 KSSLLMGTLGIVCPICSQKP(SEQ.ID.NO：7)、KVPRNQDWL(SEQ.ID.NO：8)、SYVDFFVWL(SEQ.ID.NO：9)、KYICNSSCM(SEQ.ID.NO：10)及KSSKVPRNQDWL(SEQ.ID.NO：11)。
41.如第1至40項中任一項之疫苗調配物，其中至少一種抗原係RAHYNIVTF(SEQ.ID.NO：1)。
42.如第1至41項中任一項之疫苗調配物，其中至少一種抗原係GQAEPDRAHYNIVTF(SEQ.ID.NO：2)。
43.如第1至42項中任一項之疫苗調配物，其中至少一種抗原係KSSGQAEPDRAHYNIVTF(SEQ.ID.NO：3)。
44.如第43項之疫苗調配物，其中KSSGQAEPDRAHYNIVTF(SEQ.ID.NO：3)經修飾以進一步包含疏水性基團。
45.如第44項之疫苗調配物，其中該疏水性基團係棕櫚醯基。
46.如第1至45項中任一項之疫苗調配物，其中至少一種抗原係YMLDLQPETT(SEQ.ID.NO：4)。
47.如第1至46項中任一項之疫苗調配物，其中至少一種抗原係KSSYMLDLQPETT(SEQ.ID.NO：5)。
48.如第47項之疫苗調配物，其中KSSYMLDLQPETT(SEQ.ID.NO：5)經修飾以進一步包含疏水性基團。
49.如第48項之疫苗調配物，其中該疏水性基團係棕櫚醯基。
50.如第1至49項中任一項之疫苗調配物，其中至少一種抗原係KSSMHGDTPTLHEYMLDLQPETT(SEQ.ID.NO：6)。
51.如第50項之疫苗調配物，其中 KSSMHGDTPTLHEYMLDLQPETT(SEQ.ID.NO：6)經修飾以進一步包含疏水性基團。
52.如第51項之疫苗調配物，其中該疏水性基團係棕櫚醯基。
53.如第1至52項中任一項之疫苗調配物，其中至少一種抗原係KSSLLMGTLGIVCPICSQKP(SEQ.ID.NO：7)。
54.如第53項之疫苗調配物，其中KSSLLMGTLGIVCPICSQKP(SEQ.ID.NO：7)經修飾以進一步包含疏水性基團。
55.如第54項之疫苗調配物，其中該疏水性基團係棕櫚醯基。
56.如第1至55項中任一項之疫苗調配物，其中至少一種抗原係KVPRNQDWL(SEQ.ID.NO：8)。
57.如第1至56項中任一項之疫苗調配物，其中至少一種抗原係SYVDFFVWL(SEQ.ID.NO：9)。
58.如第1至57項中任一項之疫苗調配物，其中至少一種抗原係KYICNSSCM(SEQ.ID.NO：10)。
59.如第1至58項中任一項之疫苗調配物，其中至少一種抗原係KSSKVPRNQDWL(SEQ.ID.NO：11)。
60.如第59項之疫苗調配物，其中KSSKVPRNQDWL(SEQ.ID.NO：11)經修飾以進一步包含疏水性基團。
61.如第60項之疫苗調配物，其中該疏水性基團係棕櫚醯基。
62.如第1至61項中任一項之疫苗調配物，其中該調配物 藉由激活有絲分裂誘致劑激活性蛋白(MAP)激酶信號傳導路徑在哺乳動物中誘導免疫反應。
63.如第62項之疫苗調配物，其中該MAP激酶信號傳導路徑係藉由刺激細胞外信號調控激酶(「ERK」)-1、ERK-2及p38中之至少一者來激活。
64.如第1至63項中任一項之疫苗調配物，其中該調配物增強哺乳動物中之功能性抗原特異性CD8+ T淋巴球反應。
65.如第62至64項中任一項之疫苗調配物，其中該哺乳動物係人類。
66.一種在哺乳動物中誘導免疫反應之方法，該方法包含向該哺乳動物投與有效量之疫苗調配物的步驟，其中該疫苗調配物包含佐劑及抗原組裝體。
67.如第66項之方法，其中該免疫反應係經由該哺乳動物之免疫系統之細胞中之MAP激酶信號傳導路徑來激活。
68.如第67項之方法，其中該MAP激酶信號傳導路徑係藉由刺激ERK-1、ERK-2及p38中之至少一者來激活。
69.如第66至68項中任一項之方法，其中該免疫反應激活該哺乳動物中之細胞毒性T淋巴球。
70.如第69項之方法，其中該等細胞毒性T淋巴球係CD8+ T細胞。
71.如第66至70項中任一項之方法，其中該投與增強該哺乳動物中之功能性抗原特異性CD8+ T淋巴球反應。
72.如第66至71項中任一項之方法，其中該免疫反應激活該哺乳動物中之抗體反應。
73.如第66至72項中任一項之方法，其中該免疫反應激活該哺乳動物中之干擾素-γ(IFN-γ)。
74.如第66至73項中任一項之方法，其中該調配物係粒狀疫苗調配物。
75.如第66至74項中任一項之方法，其中該佐劑與該抗原組裝體係混合物。
76.如第66至75項中任一項之方法，其中該佐劑係免疫調節劑。
77.如第66至76項中任一項之方法，其中該佐劑係奈米顆粒。
78.如第66至77項中任一項之方法，其中該佐劑係陽離子脂質。
79.如第78項之方法，其中該陽離子脂質係經過純化。
80.如第78或79項之方法，其中該陽離子脂質係選自由下列組成之群：DOTAP、DOTMA、DOEPC及其組合。
81.如第78至80項中任一項之方法，其中該陽離子脂質係DOTAP。
82.如第78至80項中任一項之方法，其中該陽離子脂質係DOTMA。
83.如第78至80項中任一項之方法，其中該陽離子脂質係DOEPC。
84.如第66至78項中任一項之方法，其中該佐劑係陽離子脂質之對映異構體。
85.如第84項之方法，其中該對映異構體係經過純化。
86.如第84或85項之方法，其中該對映異構體係R-DOTAP或S-DOTAP。
87.如第84至86項中任一項之方法，其中該對映異構體係R-DOTAP。
88.如第84至86項中任一項之方法，其中該對映異構體係S-DOTAP。
89.如第66至88項中任一項之方法，其中該抗原組裝體係自行組裝結構。
90.如第66至89項中任一項之方法，其中該抗原組裝體係微胞結構。
91.如第66至89項中任一項之方法，其中該抗原組裝體係脂質雙層結構。
92.如第66至91項中任一項之方法，其中該抗原組裝體係管狀結構。
93.如第66至91項中任一項之方法，其中該抗原組裝體係球形結構。
94.如第66至93項中任一項之方法，其中該抗原組裝體包含一或多種抗原。
95.如第94項之方法，其中一或多種抗原係基於蛋白質之抗原。
96.如第94項之方法，其中一或多種抗原係基於肽之抗原。
97.如第94至96項中任一項之方法，其中一或多種抗原係選自由下列組成之群：癌抗原、病毒抗原、細菌抗原及 病原性抗原。
98.如第94至97項中任一項之方法，其中一或多種抗原係病毒抗原。
99.如第94至97項中任一項之方法，其中一或多種抗原係細菌抗原。
100.如第94至97項中任一項之方法，其中一或多種抗原係病原性抗原。
101.如第100項之方法，其中該病原性抗原係合成或重組抗原。
102.如第94至101項中任一項之方法，其中至少一種抗原係HPV蛋白質或肽。
103.如第94至102項中任一項之方法，其中至少一種抗原係黑色素瘤抗原。
104.如第103項之方法，其中該黑色素瘤抗原選自包含以下之群：gp100(KVPRNQDWL[SEQ.ID.No.8])、TRP2(SYVDFFVWL[SEQ.ID.No.9])及p53(KYICNSSCM[SEQ.ID.No.10])，及其組合。
105.如第94至104項中任一項之方法，其中至少一種抗原係選自由下列組成之群：脂蛋白、脂肽及經具有增加的疏水性或降低的疏水性之胺基酸序列修飾之蛋白質或肽。
106.如第94至105項中任一項之方法，其中一或多種抗原係脂質化抗原或經修飾以增加抗原之疏水性的抗原。
107.如第94至106項中任一項之方法，其中至少一種抗原係經修飾之蛋白質或肽。
108.如第107項之方法，其中該經修飾之蛋白質或肽鍵結至疏水性基團。
109.如第107或108項之方法，其中鍵結至疏水性基團之該經修飾之蛋白質或肽進一步包含介於該抗原與該疏水性基團之間之連接體序列。
110.如第109項之方法，其中該疏水性基團係棕櫚醯基。
111.如第94至110項中任一項之方法，其中至少一種抗原係未經修飾之蛋白質或肽。
112.如第94至111項中任一項之方法，其中至少一種抗原係選自由下列組成之群：RAHYNIVTF(SEQ.ID.NO：1)、GQAEPDRAHYNIVTF(SEQ.ID.NO：2)、KSSGQAEPDRAHYNIVTF(SEQ.ID.NO：3)、YMLDLQPETT(SEQ.ID.NO：4)、KSSYMLDLQPETT(SEQ.ID.NO：5)、KSSMHGDTPTLHEYMLDLQPETT(SEQ.ID.NO：6)、KSSLLMGTLGIVCPICSQKP(SEQ.ID.NO：7)、KVPRNQDWL(SEQ.ID.NO：8)、SYVDFFVWL(SEQ.ID.NO：9)、KYICNSSCM(SEQ.ID.NO：10)及KSSKVPRNQDWL(SEQ.ID.NO：11)。
113.如第94至112項中任一項之方法，其中至少一種抗原係RAHYNIVTF(SEQ.ID.NO：1)。
114.如第94至113項中任一項之方法，其中至少一種抗原係GQAEPDRAHYNIVTF(SEQ.ID.NO：2)。
115.如第94至114項中任一項之方法，其中至少一種抗原係KSSGQAEPDRAHYNIVTF(SEQ.ID.NO：3)。
116.如第115項之方法，其中KSSGQAEPDRAHYNIVTF (SEQ.ID.NO：3)經修飾以進一步包含疏水性基團。
117.如第116項之方法，其中該疏水性基團係棕櫚醯基。
118.如第94至117項中任一項之方法，其中至少一種抗原係YMLDLQPETT(SEQ.ID.NO：4)。
119.如第94至118項中任一項之方法，其中至少一種抗原係KSSYMLDLQPETT(SEQ.ID.NO：5)。
120.如第119項之方法，其中KSSYMLDLQPETT(SEQ.ID.NO：5)經修飾以進一步包含疏水性基團。
121.如第120項之方法，其中該疏水性基團係棕櫚醯基。
122.如第94至121項中任一項之方法，其中至少一種抗原係KSSMHGDTPTLHEYMLDLQPETT(SEQ.ID.NO：6)。
123.如第122項之方法，其中KSSMHGDTPTLHEYMLDLQPETT(SEQ.ID.NO：6)經修飾以進一步包含疏水性基團。
124.如第123項之方法，其中該疏水性基團係棕櫚醯基。
125.如第94至124項中任一項之方法，其中至少一種抗原係KSSLLMGTLGIVCPICSQKP(SEQ.ID.NO：7)。
126.如第125項之方法，其中KSSLLMGTLGIVCPICSQKP(SEQ.ID.NO：7)經修飾以進一步包含疏水性基團。
127.如第126項之方法，其中該疏水性基團係棕櫚醯基。
128.如第94至127項中任一項之方法，其中至少一種抗 原係KVPRNQDWL(SEQ.ID.NO：8)。
129.如第94至128項中任一項之方法，其中至少一種抗原係SYVDFFVWL(SEQ.ID.NO：9)。
130.如第94至129項中任一項之方法，其中至少一種抗原係KYICNSSCM(SEQ.ID.NO：10)。
131.如第94至130項中任一項之方法，其中至少一種抗原係KSSKVPRNQDWL(SEQ.ID.NO：11)。
132.如第131項之方法，其中KSSKVPRNQDWL(SEQ.ID.NO：11)經修飾以進一步包含疏水性基團。
133.如第132項之方法，其中該疏水性基團係棕櫚醯基。
134.如第66至133項中任一項之方法，其中該哺乳動物係人類。
135.一種治療哺乳動物疾病之方法，該方法包含向該哺乳動物投與有效量之疫苗調配物的步驟，其中該疫苗調配物包含佐劑及抗原組裝體。
136.如第135項之方法，其中該方法係預防性治療。
137.如第135項之方法，其中該疾病係癌症。
138.如第135至137項中任一項之方法，其中該投與經由該哺乳動物之免疫系統之細胞中之MAP激酶信號傳導路徑來激活免疫反應。
139.如第138項之方法，其中該MAP激酶信號傳導路徑係藉由刺激ERK-1、ERK-2及p38中之至少一者來激活。
140.如第135至139項中任一項之方法，其中該免疫反應 激活該哺乳動物中之細胞毒性T淋巴球。
141.如第140項之方法，其中該等細胞毒性T淋巴球係CD8+ T細胞。
142.如第135至141項中任一項之方法，其中該免疫反應激活該哺乳動物中之抗體反應。
143.如第135至142項中任一項之方法，其中該免疫反應激活該哺乳動物中之干擾素-γ(IFN-γ)。
144.如第135至143項中任一項之方法，其中該投與增強功能性抗原特異性CD8+ T淋巴球反應。
145.如第135至144項中任一項之方法，其中該調配物係粒狀疫苗調配物。
146.如第135至145項中任一項之方法，其中該佐劑與該抗原組裝體係混合物。
147.如第135至146項中任一項之方法，其中該佐劑係免疫調節劑。
148.如第135至147項中任一項之方法，其中該佐劑係奈米顆粒。
149.如第135至148項中任一項之方法，其中該佐劑係陽離子脂質。
150.如第149項之方法，其中該陽離子脂質係經過純化
151.如第149或150項之方法，其中該陽離子脂質係選自由下列組成之群：DOTAP、DOTMA、DOEPC及其組合。
152.如第149至151項中任一項之方法，其中該陽離子脂質係DOTAP。
153.如第149至151項中任一項之方法，其中該陽離子脂質係DOTMA。
154.如第149至151項中任一項之方法，其中該陽離子脂質係DOEPC。
155.如第135至148項中任一項之方法，其中該佐劑係陽離子脂質之對映異構體。
156.如第155項之方法，其中該對映異構體係經過純化
157.如第155或156項之方法，其中該對映異構體係R-DOTAP或S-DOTAP。
158.如第155至157項中任一項之方法，其中該對映異構體係R-DOTAP。
159.如第155至157項中任一項之方法，其中該對映異構體係S-DOTAP。
160.如第135至159項中任一項之方法，其中該抗原組裝體係自行組裝結構。
161.如第135至160項中任一項之方法，其中該抗原組裝體係微胞結構。
162.如第135至160項中任一項之方法，其中該抗原組裝體係脂質雙層結構。
163.如第135至162項中任一項之方法，其中該抗原組裝體係管狀結構。
164.如第135至162項中任一項之方法，其中該抗原組裝體係球形結構。
165.如第135至164項中任一項之方法，其中該抗原組裝 體包含一或多種抗原。
166.如第165項之方法，其中一或多種抗原係基於蛋白質之抗原。
167.如第165或166項之方法，其中一或多種抗原係基於肽之抗原。
168.如第165至167項中任一項之方法，其中一或多種抗原係選自由下列組成之群：癌抗原、病毒抗原、細菌抗原及病原性抗原。
169.如第165至168項中任一項之方法，其中一或多種抗原係病毒抗原。
170.如第165至168項中任一項之方法，其中一或多種抗原係細菌抗原。
171.如第165至168項中任一項之方法，其中一或多種抗原係病原性抗原。
172.如第165至168項中任一項之方法，其中該病原性抗原係合成或重組抗原。
173.如第165至172項中任一項之方法，其中至少一種抗原係HPV蛋白質或肽。
174.如第165至173項中任一項之方法，其中至少一種抗原係黑色素瘤抗原。
175.如第174項之方法，其中該黑色素瘤抗原選自包含以下之群：gp100(KVPRNQDWL[SEQ.ID.No.8])、TRP2(SYVDFFVWL[SEQ.ID.No.9])及p53(KYICNSSCM[SEQ.ID.No.10])，及其組合。
176.如第165至175項中任一項之方法，其中至少一種抗原係選自由下列組成之群：脂蛋白、脂肽及經具有增加的疏水性或降低的疏水性之胺基酸序列修飾之蛋白質或肽。
177.如第165至176項中任一項之方法，其中一或多種抗原係脂質化抗原或經修飾以增加抗原之疏水性的抗原。
178.如第165至177項中任一項之方法，其中至少一種抗原係經修飾之蛋白質或肽。
179.如第178項之方法，其中該經修飾之蛋白質或肽鍵結至疏水性基團。
180.如第178項之方法，其中鍵結至疏水性基團之該經修飾之蛋白質或肽進一步包含介於該抗原與該疏水性基團之間之連接體序列。
181.如第180項之方法，其中該疏水性基團係棕櫚醯基。
182.如第165至181項中任一項之方法，其中至少一種抗原係未經修飾之蛋白質或肽。
183.如第165至182項中任一項之方法，其中至少一種抗原係選自由下列組成之群：RAHYNIVTF(SEQ.ID.NO：1)、GQAEPDRAHYNIVTF(SEQ.ID.NO：2)、KSSGQAEPDRAHYNIVTF(SEQ.ID.NO：3)、YMLDLQPETT(SEQ.ID.NO：4)、KSSYMLDLQPETT(SEQ.ID.NO：5)、KSSMHGDTPTLHEYMLDLQPETT(SEQ.ID.NO：6)、KSSLLMGTLGIVCPICSQKP(SEQ.ID.NO：7)、KVPRNQDWL(SEQ.ID.NO：8)、SYVDFFVWL(SEQ.ID.NO：9)、KYICNSSCM(SEQ.ID.NO：10)及KSSKVPRNQDWL(SEQ.ID.NO：11)。
184.如第165至183項中任一項之方法，其中至少一種抗原係RAHYNIVTF(SEQ.ID.NO：1)。
185.如第165至184項中任一項之方法，其中至少一種抗原係GQAEPDRAHYNIVTF(SEQ.ID.NO：2)。
186.如第165至185項中任一項之方法，其中至少一種抗原係KSSGQAEPDRAHYNIVTF(SEQ.ID.NO：3)。
187.如第186項之方法，其中KSSGQAEPDRAHYNIVTF(SEQ.ID.NO：3)經修飾以進一步包含疏水性基團。
188.如第187項之方法，其中該疏水性基團係棕櫚醯基。
189.如第165至188項中任一項之方法，其中至少一種抗原係YMLDLQPETT(SEQ.ID.NO：4)。
190.如第165至189項中任一項之方法，其中至少一種抗原係KSSYMLDLQPETT(SEQ.ID.NO：5)。
191.如第190項之方法，其中KSSYMLDLQPETT(SEQ.ID.NO：5)經修飾以進一步包含疏水性基團。
192.如第191項之方法，其中該疏水性基團係棕櫚醯基。
193.如第165至192項中任一項之方法，其中至少一種抗原係KSSMHGDTPTLHEYMLDLQPETT(SEQ.ID.NO：6)。
194.如第193項之方法，其中KSSMHGDTPTLHEYMLDLQPETT(SEQ.ID.NO：6)經修飾以進一步包含疏水性基團。
195.如第194項之方法，其中該疏水性基團係棕櫚醯基。
196.如第165至195項中任一項之方法，其中至少一種抗原係KSSLLMGTLGIVCPICSQKP(SEQ.ID.NO：7)。
197.如第196項之方法，其中KSSLLMGTLGIVCPICSQKP(SEQ.ID.NO：7)經修飾以進一步包含疏水性基團。
198.如第197項之方法，其中該疏水性基團係棕櫚醯基。
199.如第165至198項中任一項之方法，其中至少一種抗原係KVPRNQDWL(SEQ.ID.NO：8)。
200.如第165至199項中任一項之方法，其中至少一種抗原係SYVDFFVWL(SEQ.ID.NO：9)。
201.如第165至200項中任一項之方法，其中至少一種抗原係KYICNSSCM(SEQ.ID.NO：10)。
202.如第165至201項中任一項之方法，其中至少一種抗原係KSSKVPRNQDWL(SEQ.ID.NO：11)。
203.如第202項之方法，其中KSSKVPRNQDWL(SEQ.ID.NO：11)經修飾以進一步包含疏水性基團。
204.如第203項之方法，其中該疏水性基團係棕櫚醯基。
205.如第135至204項中任一項之方法，其中該哺乳動物係人類。
本文如下闡述本發明之多個實施例。在本文所述之一個實施例中，提供疫苗調配物。該疫苗調配物包含佐劑及抗原組裝體。
在另一實施例中，提供在哺乳動物中誘導免疫反應之方法。該方法包含向哺乳動物投與有效量之疫苗調配物的步驟，其中該疫苗調配物包含佐劑及抗原組裝體。
在再一實施例中，提供治療哺乳動物疾病之方法。該方法包含向哺乳動物投與有效量之疫苗調配物的步驟，其中該疫苗調配物包含佐劑及抗原組裝體。
在多個實施例中，疫苗調配物包含佐劑及抗原組裝體。本文所用之術語「佐劑」係指增強、增加及/或加強哺乳動物對抗原之免疫反應的物質。本文所用之術語「抗原組裝體」係指含有一或多種抗原之組合物。
在本文所述之一些實施例中，疫苗調配物係粒狀疫苗調配物。在一些實施例中，佐劑與抗原組裝體係混合物。
在本文所述之一些實施例中，佐劑係免疫調節劑。本文所用之術語「免疫調節劑」係指增強、引導及/或促進哺乳動物中之免疫反應的免疫修飾劑。
在本文所述之一些實施例中，佐劑係奈米顆粒。本文所用之術語「奈米顆粒」係指具有經量測為奈米級之大小的顆粒。本文所用之「奈米顆粒」係指具有大小小於約1,000奈米之結構的顆粒。在一些實施例中，奈米顆粒係脂質體。
在本文所述之一些實施例中，佐劑係陽離子脂質。本文所用之術語「陽離子脂質」係指在生理學pH下帶有淨正電荷或具有可質子化基團且在低於pKa之pH下帶正電荷之諸多脂質物質中的任一者。
根據本發明，適宜陽離子脂質包括但不限於：3-β[4N-(1N,8-二胍基精脒)-胺甲醯基]膽固醇(BGSC)；3-β[N,N-二胍基乙基-胺基乙烷)-胺甲醯基]膽固醇(BGTC)；N,N1N2N3四甲基四棕櫚基精胺(cellfectin)；N-第三丁基-N'-十四烷基-3-十四烷基-胺基丙脒(CLONfectin)；二甲基二(十八烷基)溴化銨(DDAB)；1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-二甲基-羥基乙基溴化銨(DMRIE)；2,3-二油醯基氧基-N-[2(精胺羧醯胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙銨三氟乙酸鹽)(DOSPA)；1,3-二油醯基氧基-2-(6-羧基精胺基(spermyl))-丙基醯胺(DOSPER)；4-(2,3-雙-棕櫚醯基氧基-丙基)-1-甲基-1H-咪唑(DPIM)；N,N,N',N'-四甲基-N,N'-雙(2-羥基乙基)-2,3-二油醯基氧基-1,4-丁烷-二碘化銨)(Tfx-50)；N-1-(2,3-二油醯基氧基)丙基-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTMA)或其他N-(N,N-1-二烷氧基)-烷基-N,N,N-三取代銨表面活性劑；1,2二油醯基-3-(4'-三甲基銨基)丁醇-sn-甘油(DOBT)或(4'三甲基銨基)丁酸膽固醇基酯(ChOTB)，其中三甲基銨基經由丁醇間隔臂連接至雙鏈(對於DOTB)或膽固醇基(對於ChOTB)；DORI(DL-1,2-二油醯基-3-二甲基胺基丙基-β-羥基乙基銨)或DORIE(DL-1,2-O-二油醯基-3-二甲基胺基丙基-β-羥基乙基銨)(DORIE)或其揭示於WO 93/03709中之類似物；1,2-二油醯基-3-琥珀醯基-sn-甘油膽鹼酯(DOSC)；半琥珀酸膽固醇基酯(ChOSC)；脂多胺，例如二(十八烷基)醯胺基甘胺醯基精胺(DOGS)及二棕櫚醯基磷脂醯基乙醇戊基精胺(DPPES)、膽固醇基-3β-羧基-醯胺基-伸乙基三 甲基碘化銨、1-二甲基胺基-3-三甲基銨基-DL-2-丙基-膽固醇基甲酸酯碘化物、膽固醇基-3-O-羧基醯胺基乙烯胺、膽固醇基-3-β-氧基琥珀醯胺基-伸乙基三甲基碘化銨、1-二甲基胺基-3-三甲基銨基-DL-2-丙基-膽固醇基-3-β-氧基琥珀酸酯碘化物、2-(2-三甲基銨基)-乙基甲基胺基乙基-膽固醇基-3-β-氧基琥珀酸酯碘化物、3-β-N-(N',N'-二甲基胺基乙烷)胺甲醯基膽固醇(DC-chol)及3-β-N-(聚乙烯亞胺)-胺甲醯基膽固醇；天冬胺酸O,O'-二肉豆蔻基-N-離胺醯基酯(DMKE)；麩胺酸O,O'-二肉豆蔻基-N-離胺醯基酯(DMKD)；1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-二甲基-羥基乙基溴化銨(DMRIE)；1,2-二月桂醯基-sn-甘油-3-乙基磷酸膽鹼(DLEPC)；1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-乙基磷酸膽鹼(DMEPC)；1,2-二油醯基-sn-甘油-3-乙基磷酸膽鹼(DOEPC)；1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-乙基磷酸膽鹼(DPEPC)；1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-乙基磷酸膽鹼(DSEPC)；1,2-二油醯基-3-三甲基銨丙烷(DOTAP)；二油醯基二甲基胺基丙烷(DODAP)；1,2-棕櫚醯基-3-三甲基銨丙烷(DPTAP)；1,2-二硬脂醯基-3-三甲基銨丙烷(DSTAP)；1,2-肉豆蔻醯基-3-三甲基銨丙烷(DMTAP)；及十二烷基硫酸鈉(SDS)。此外，本發明亦涵蓋所述陽離子脂質中之任一者之結構變體及衍生物。
在一些實施例中，陽離子脂質係選自由下列組成之群：DOTAP、DOTMA、DOEPC及其組合。在其他實施例中，陽離子脂質係DOTAP。在再一些其他實施例中，陽離子脂 質係DOTMA。在其他實施例中，陽離子脂質係DOEPC。在一些實施例中，陽離子脂質係經過純化。
在一些實施例中，陽離子脂質係陽離子脂質之對映異構體。術語「對映異構體」係指不為其對應立體異構體之可重疊鏡像之陽離子脂質之立體異構體，例如R及S對映異構體。在多個實例中，對映異構體係R-DOTAP或S-DOTAP。在一個實例中，對映異構體係R-DOTAP。在另一實例中，對映異構體係S-DOTAP。在一些實施例中，對映異構體係經過純化。
在本文所述之多個實施例中，抗原組裝體係自行組裝結構。在本文所述之多個實施例中，抗原組裝體係微胞結構。本文所用之術語「微胞」係指分子之集合體，例如在膠質系統中。在其他實施例中，抗原組裝體係脂質雙層結構。在一些實施例中，抗原組裝體係管狀結構。在再一些其他實施例中，抗原組裝體係球形結構。
在本文所述之多個實施例中，抗原組裝體包含一或多種抗原。本文所用之術語「抗原」係指當引入具有免疫系統之哺乳動物中(直接地或在表現後，如在(例如)DNA疫苗中表現)時，可被哺乳動物之免疫系統識別且能夠引發免疫反應之任一製劑(例如，蛋白質、肽、多醣、醣蛋白、醣脂、核酸或其組合)。如本文中所定義，抗原誘導之免疫反應可為體液免疫反應或細胞介導之免疫反應，或二者。當製劑能夠特異性地與免疫系統之抗原識別分子(例如免疫球蛋白(抗體)或T細胞抗原受體(TCR))相互作用 時，將其稱為「抗原性」。
在一些實施例中，一或多種抗原係基於蛋白質之抗原。在其他實施例中，一或多種抗原係基於肽之抗原。在多個實施例中，一或多種抗原係選自由下列組成之群：癌抗原、病毒抗原、細菌抗原及病原性抗原。本文所用之「微生物抗原」係微生物之抗原，且包括(但不限於)傳染性病毒、傳染性細菌、傳染性寄生蟲及傳染性真菌。微生物抗原可為完整的微生物、及其天然分離物、片段或衍生物、與天然存在之微生物抗原相同或類似且較佳誘導對於對應微生物(天然存在之微生物抗原自其得到)具有特異性之免疫反應的合成化合物。在一個實施例中，抗原係病毒抗原。在另一實施例中，抗原係細菌抗原。在多個實施例中，抗原係病原性抗原。在一些實施例中，病原性抗原係合成或重組抗原。
在一些實施例中，抗原係癌抗原。本文所用之「癌抗原」係與腫瘤或癌細胞相關且在MHC分子之上下文中當在抗原呈現細胞之表面上表現時能夠激發免疫反應(體液的及/或細胞的)之分子或化合物(例如，蛋白質、肽、多肽、脂蛋白、脂肽、醣蛋白、醣肽、脂質、醣脂、碳水化合物、RNA及/或DNA)。例如，癌抗原可為腫瘤相關抗原。腫瘤相關抗原包括自體抗原，以及可不與癌症明確相關但雖然如此當投與哺乳動物時仍增強對腫瘤或癌細胞之免疫反應及/或降低腫瘤或癌細胞之生長之其他抗原。在一個實施例中，至少一種抗原係HPV蛋白質或肽。
在一些實施例中，至少一種抗原係黑色素瘤抗原。在一個實施例中，黑色素瘤抗原係選自包含以下之群：gp100(KVPRNQDWL[SEQ.ID.No.8])、TRP2(SYVDFFVWL[SEQ.ID.No.9])及p53(KYICNSSCM[SEQ.ID.No.10])，及其組合。
在多個實施例中，至少一種抗原係選自由下列組成之群：脂蛋白、脂肽及經具有增加的疏水性或降低的疏水性之胺基酸序列修飾之蛋白質或肽。在一些實施例中，一或多種抗原係經修飾以增加抗原之疏水性之抗原。在一個實施例中，至少一種抗原係經修飾之蛋白質或肽。在一些實施例中，經修飾之蛋白質或肽鍵結至疏水性基團。在其他實施例中，鍵結至疏水性基團之經修飾之蛋白質或肽進一步包含介於抗原與疏水性基團之間之連接體序列。在一些實施例中，疏水性基團係棕櫚醯基。在再一些其他實施例中，至少一種抗原係未經修飾之蛋白質或肽。
在本發明之一些實施例中，至少一種抗原係選自由下列組成之群：RAHYNIVTF(SEQ.ID.NO：1)、GQAEPDRAHYNIVTF(SEQ.ID.NO：2)、KSSGQAEPDRAHYNIVTF(SEQ.ID.NO：3)、YMLDLQPETT(SEQ.ID.NO：4)、KSSYMLDLQPETT(SEQ.ID.NO：5)、KSSMHGDTPTLHEYMLDLQPETT(SEQ.ID.NO：6)、KSSLLMGTLGIVCPICSQKP(SEQ.ID.NO：7)、KVPRNQDWL(SEQ.ID.NO：8)、SYVDFFVWL(SEQ.ID.NO：9)、KYICNSSCM(SEQ.ID.NO：10)及KSSKVPRNQDWL(SEQ.ID.NO：11)。在一個實施例中，至少一種抗原係RAHYNIVTF(SEQ.ID.NO：1)。在另一實施 例中，至少一種抗原係GQAEPDRAHYNIVTF(SEQ.ID.NO：2)。在再一實施例中，至少一種抗原係KSSGQAEPDRAHYNIVTF(SEQ.ID.NO：3)。在一些實施例中，KSSGQAEPDRAHYNIVTF(SEQ.ID.NO：3)經修飾以進一步包含疏水性基團。在一個實施例中，疏水性基團係棕櫚醯基。
在其他實施例中，至少一種抗原係YMLDLQPETT(SEQ.ID.NO：4)。在另一實施例中，至少一種抗原係KSSYMLDLQPETT(SEQ.ID.NO：5)。在再一實施例中，KSSYMLDLQPETT(SEQ.ID.NO：5)經修飾以進一步包含疏水性基團。在一個實施例中，疏水性基團係棕櫚醯基。
在其他實施例中，至少一種抗原係KSSMHGDTPTLHEYMLDLQPETT(SEQ.ID.NO：6)。在另一實施例中，KSSMHGDTPTLHEYMLDLQPETT(SEQ.ID.NO：6)經修飾以進一步包含疏水性基團。在一個實施例中，疏水性基團係棕櫚醯基。
在其他實施例中，至少一種抗原係KSSLLMGTLGIVCPICSQKP(SEQ.ID.NO：7)。在一些實施例中，KSSLLMGTLGIVCPICSQKP(SEQ.ID.NO：7)經修飾以進一步包含疏水性基團。在一個實施例中，疏水性基團係棕櫚醯基。
在一些實施例中，至少一種抗原係KVPRNQDWL(SEQ.ID.NO：8)。在其他實施例中，至少一種抗原係SYVDFFVWL(SEQ.ID.NO：9)。在再一些其他實施例 中，至少一種抗原係KYICNSSCM(SEQ.ID.NO：10)。在另一實施例中，至少一種抗原係KSSKVPRNQDWL(SEQ.ID.NO：11)。在一些實施例中，KSSKVPRNQDWL(SEQ.ID.NO：11)經修飾以進一步包含疏水性基團。在一個實施例中，疏水性基團係棕櫚醯基。
在本文所述之多個實施例中，疫苗調配物藉由激活有絲分裂誘致劑激活性蛋白(MAP)激酶信號傳導路徑在哺乳動物中誘導免疫反應。藉由佐劑(例如陽離子脂質)誘導免疫反應闡述於(例如)PCT/US2008/057678(WO/2008/116078；「Stimulation of an Immune Response by Cationic Lipids」)及PCT/US2009/040500(WO/2009/129227；「Stimulation of an Immune Response by Enantiomers of Cationic Lipids」)中，兩個案件之全部揭示內容均以引用方式併入本文中。在一些實施例中，MAP激酶信號傳導路徑係藉由刺激細胞外信號調控激酶(「ERK」)-1、ERK-2及p38中之至少一者來激活。在其他實施例中，該調配物增強功能性抗原特異性CD8+ T淋巴球反應。術語「哺乳動物」已為熟習此項技術者所熟知。在一個實施例中，動物係人類。
在本文所述之一個實施例中，提供在哺乳動物中誘導免疫反應之方法。該方法包括向哺乳動物投與有效量之疫苗調配物的步驟，其中該疫苗調配物包含佐劑及抗原組裝體。先前闡述之疫苗調配物的實施例適用於本文所述之在哺乳動物中誘導免疫反應之方法。
在一些實施例中，免疫反應係經由哺乳動物之免疫系統 之細胞中之MAP激酶信號傳導路徑來激活。在多個實施例中，MAP激酶信號傳導路徑係藉由刺激ERK-1、ERK-2及p38中之至少一者來激活。
在其他實施例中，免疫反應激活哺乳動物中之細胞毒性T淋巴球。在一個實施例中，細胞毒性T淋巴球係CD8+ T細胞。在另一實施例中，該投藥法增強功能性抗原特異性CD8+ T淋巴球反應。在再一實施例中，免疫反應激活哺乳動物中之抗體反應。在其他實施例中，免疫反應激活哺乳動物中之干擾素-γ(IFN-γ)。
在本文所述之一個實施例中，提供治療哺乳動物疾病之方法。該方法包括向哺乳動物投與有效量之疫苗調配物的步驟，其中該疫苗調配物包含佐劑及抗原組裝體。先前闡述之疫苗調配物及在哺乳動物中誘導免疫反應之方法的實施例適用於本文所述之治療哺乳動物疾病之方法。
在一些實施例中，對於傳染性病原體，本文所用之「治療(treatment、treat及treating)」係指提高個體對病原體感染之抵抗力或降低個體感染病原體之可能性的預防性治療；及/或在個體受感染後用以對抗感染(例如降低或消除感染或防止其惡化)之治療。在一個實施例中，該方法係預防性治療。
實例1 佐劑及納入抗原之佐劑的製備
佐劑可僅使用陽離子脂質來製備。或者，佐劑可使用陽離子脂質與其他免疫調節劑之混合物來製備。疫苗調配物 可使用納入抗原之基於陽離子脂質之調配物來製備。在本實例中，使用DOTAP作為實例性陽離子脂質且使用HPV蛋白質E7肽抗原作為實例性抗原。
在所有程序中均使用注射用無菌水(WFI)或緩衝液，其中將陽離子脂質製備成脂質體。在此實例中，脂質體係使用脂質膜來製備。用於納入脂質體中之E7抗原係衍生自HPV 16 E7蛋白質之H-2Db限制性CTL表位(胺基酸49至57，RAHYNIVTF[SEQ.ID.NO.1])。脂質膜係在玻璃小瓶中藉由以下來製得：(1)將脂質溶解於有機溶劑(例如氯仿)中，及(2)在乾燥氮氣之穩定流中蒸發氯仿溶液。藉由將膜在真空中保持過夜來除去痕量的有機溶劑。隨後藉由添加所需量的WFI或緩衝液以使最終濃度為4-10 mg/mL使脂質膜水合。隨後將懸浮液擠壓成200 nm之大小並儲存於4℃下。
製備納入抗原之陽離子脂質時，藉由E7肽之水溶液來使DOTAP脂質膜再水合。亦可使用已為熟習此項技術者所熟知之用於一般脂質體製備之其他方法。
實例2 抗原肽粒狀結構之製備
肽序列可作為與本發明一起使用之抗原來製備。在本實例中，使用HPV蛋白質E7肽抗原作為實例性抗原。肽序列可針對適宜親水性來選擇，且可藉由將疏水性分子或序列附接至N末端胺基酸殘基而經修飾。例如，可將疏水性鏈(例如棕櫚酸部分)共價連接至肽之N末端胺基酸殘基。所 得抗原肽粒狀結構可為(例如)微胞或雙層。
在此實例中，選擇肽序列並以介於20 μg/μl至50 μg/μl範圍內之濃度懸浮於適宜溶劑中。基於特定疫苗之期望特徵，其他濃度可為適宜的。
在此實例中，微胞或雙層係藉由將脂質化肽之儲備溶液稀釋於所選水性介質中來製得。該等稀釋液通常含有0.5 mg/ml至2 mg/ml之給定肽，但可端視特定疫苗之期望特徵所需抗原的量而變化。
隨後可將肽粒狀結構與包含陽離子脂質之空脂質體奈米顆粒以1：1(v/v)混合。
實例3 陽離子脂質佐劑與傳統佐劑相比之抗腫瘤功效
可將用作佐劑之陽離子脂質之抗腫瘤功效與已知誘導抗原特異性CTL活性之傳統熟知佐劑進行比較。在此實例中，將各種脂質佐劑與HPV蛋白質E7肽抗原RAHYNIVTF(SEQ.ID.NO：1)(亦稱為「E7」)一起調配成脂質體。各種陽離子脂質包括DOTAP、DOTMA及DOEPC。陰離子脂質包括DOPG。同樣在此實例中，亦將傳統的熟知佐劑CpG及完全弗氏佐劑(complete Freund adjuvant)(「CFA」)與E7一起調配。
為比較陽離子脂質/E7調配物與其他佐劑誘導對腫瘤之免疫反應的功效，在建立腫瘤之後6天，對於每一調配物，用E7肽調配之脂質體治療6至12只具有腫瘤之小鼠。陽離子脂質佐劑調配物以陽離子脂質之100毫微莫耳劑量 組合物包含陽離子脂質(DOTAP、DOEPC及DOTMA)。陰離子脂質佐劑調配物包含DOPG。傳統的熟知佐劑調配物包含已被接受的強佐劑CFA或CpG ODN1826。對照群組不包括治療及僅包括e7抗原(即，無佐劑)。
藉由在第0天將105個TC-1細胞注射至每一小鼠之側腹中在小鼠中建立皮下HPV陽性腫瘤。在第6天，小鼠以0.10 ml注射劑接受調配物之單一皮下注射。
如圖1中所顯示，在第26天，接受CFA或CpG調配物及各種陽離子脂質調配物之小鼠與對照群組相比皆展示腫瘤生長之有效抑制。接受陰離子脂質調配物之小鼠未顯示腫瘤消退。接受基於陽離子脂質之調配物DOTAP/E7、DOTMA/E7及DOEPC/E7調配物之小鼠與接受基於已被接受之佐劑之調配物CpG/E7或CFA/E7之小鼠相比展現較佳之抗癌活性(p<0.01)。
實例4 包含陽離子脂質奈米顆粒及抗原組裝體之疫苗調配物的抗腫瘤功效
疫苗調配物之抗腫瘤功效可藉由評價腫瘤消退進行評價。在此實例中，疫苗調配物包含陽離子脂質奈米顆粒及呈管狀結構的肽抗原組裝體。此外，本實例中之實例性陽離子脂質係R-DOTAP，且實例性抗原組裝體係HPV-16 E7微胞。
在此實例中，將衍生自HPV 16 E7蛋白質之H-2Db限制性CTL表位(胺基酸49-57，RAHYNIVTF[SEQ.ID.NO.1])擴 展至胺基酸43-57，GQAEPDRAHYNIVTF[SEQ.ID.No.2]。SEQ.ID.No.2隨後進一步用胺基酸KSS擴展，且將疏水性棕櫚醯基鏈附接至延長肽。因此，有效地促進微胞或雙層之形成(即，棕櫚醯基-KSSGQAEPDRAHYNIVTF[SEQ.ID.No.3]。當以與SEQ.ID.No.1類似之方式調配及評價時，觀察到SEQ.ID.No.2係弱抗原。
將約0.2-0.4 mg/ml(0.1-0.2 mM)之肽抗原囊封至2 mg/ml(2.9 mM)之包含R-DOTAP之脂質體奈米顆粒中，達成弱免疫反應且無有效之腫瘤消退(見圖2)。然而，將肽抗原序列調配成僅包含SEQ.ID.No.3之粒狀結構與經由陽離子脂質佐劑遞送系統遞送相比容許遞送較高劑量之抗原。因此，可獲得克服肽之弱抗原性的有效方式。
為評價此方法，如上文實例3中所述建立HPV陽性腫瘤。在第6天，小鼠(每一群組5只小鼠)接受各種疫苗調配物之單一皮下注射：
- 調配物1(陰性對照)：包含R-DOTAP之空脂質體奈米顆粒。
- 調配物2：2.3 mg/ml R-DOTAP脂質體奈米顆粒與1.1 mg/ml微胞形式之SEQ.ID.No.3肽抗原組裝體的混合物(0.10 ml注射劑)。
- 調配物3：2.3 mg/ml S-DOTAP脂質體奈米顆粒與1.1 mg/ml微胞形式之SEQ.ID.No.3肽抗原組裝體的混合物(0.10 ml注射劑)。
圖3顯示注射調配物2之小鼠中之有效腫瘤消退。陰性染 色掃描電子顯微鏡檢查顯示共存在於調配之疫苗混合物中之呈管狀微胞結構之抗原組裝體及呈球形R-DOTAP脂質體奈米顆粒之佐劑之混合物的存在(圖4)。本實例展示，包含佐劑(例如，R-DOTAP脂質體奈米顆粒)及抗原組裝體(例如，作為微胞顆粒之HPV E7肽抗原)之疫苗調配物可有效地促進動物中之腫瘤消退。
實例5 使用包含陽離子脂質奈米顆粒及含有單一肽抗原之抗原組裝體之疫苗調配物時人類化HLA-A2轉基因小鼠中之免疫反應
已知干擾素-γ(IFN-γ)之誘導係由激活之抗原特異性細胞毒性T-淋巴球(CD8+ T細胞)而產生，且對於動物中有效治療性免疫反應之發生較重要。使用包含陽離子脂質奈米顆粒及抗原組裝體之疫苗調配物時人類化HLA-A2轉基因小鼠中之免疫反應可藉由經由酶聯免疫吸附班點(ELISPOT)分析量測IFN-γ之誘導來評價。在此實例中，疫苗調配物包含陽離子脂質奈米顆粒(例如，R-DOTAP)及各種組成及結構之肽抗原組裝體。
在本實例中對兩種不同之疫苗調配物進行評價。調配物1包含陽離子脂質R-DOTAP佐劑奈米顆粒，且使用已被接受之HPV-16 E7 HLA-A2抗原性人類肽抗原YMLDLQPETT[SEQ.ID.No.4]。藉由附接3個胺基酸及棕櫚酸對SEQ.ID.No.4進行修飾以獲得序列棕櫚醯基-KSSYMLDLQPETT[SEQ.ID.No.5]。根據本文所述方法，自發地形成粒狀肽結構。調 配物1含有約2.8 mg/ml R-DOTAP佐劑奈米顆粒之佐劑及約0.83 mg/ml SEQ.ID.No.5肽之抗原組裝體。
在第0天及第7天，給小鼠注射0.1 ml調配物1。殺死小鼠，並自每一小鼠取脾細胞以在第14天進行評價。自經免疫小鼠收穫脾細胞並接種至96孔板之孔中(每個孔約250,000個脾細胞)。隨後將個別孔暴露於肽抗原YMLDLQPETT[SEQ.ID.No.4]，並分析免疫反應。分析中出現之每一斑點代表單一反應性脾細胞，且分析之讀出提供在孔板上形成之斑點的數目。因此，ELISPOT分析提供定量分析，以有效地測定所產生之對抗原YMLDLQPETT之免疫反應。ELISPOT分析之結果顯示於表1中，其展示調配物1之高功效。
調配物2包含陽離子脂質R-DOTAP佐劑奈米顆粒，且使用自HPV-16 E7蛋白質之N末端選取前20個胺基酸的肽。將此肽修飾成棕櫚醯基-KSSMHGDTPTLHEYMLDLQPETT[SEQ.ID.No.6]。根據本文所述方法，自發地形成粒狀肽結構。調配物2含有約2.8 mg/ml R-DOTAP佐劑奈米顆粒之佐劑及約0.95 mg/ml SEQ.ID.No.6肽之抗原組裝體。
在第0天及第7天，給小鼠注射0.1 ml調配物2。殺死小鼠，並自每一小鼠取脾細胞以在第14天進行評價。再次，如表1中所顯示，展示因應用調配物2免疫之強免疫反應。
陰性染色掃描電子顯微鏡檢查顯示共存在於調配之混合物中之包含棕櫚醯基-KSSYMLDLQPETT且呈球形微胞結構之抗原組裝體及包含球形R-DOTAP脂質體奈米顆粒之佐劑(即，調配物1)之混合物的存在(見圖5)。
圖6顯示共存在於調配之混合物中之包含棕櫚醯基-KSSMHGDTPTLHEYMLDLQPETT且呈管狀微胞結構之抗原組裝體及包含球形R-DOTAP脂質體奈米顆粒之佐劑(即，調配物2)。
實例6 使用包含陽離子脂質奈米顆粒及含有多種肽抗原之抗原組裝體之疫苗調配物時人類化HLA-A2轉基因小鼠中之免疫反應
與實例5類似，可使用ELIPSOT來評價包含陽離子脂質奈米顆粒及抗原組裝體之疫苗調配物的功效。在此實例中，疫苗調配物包含陽離子脂質奈米顆粒(例如，R-DOTAP)及包含三種肽抗原之肽抗原組裝體。
本實例中之調配物包含陽離子脂質R-DOTAP佐劑奈米顆粒及包含三種肽抗原之混合微胞結構之抗原組裝體。評價對肽序列YMLDLQPETT之免疫反應。混合肽顆粒由SEQ.ID.No.5、SEQ.ID.No.6及棕櫚醯基-KSSLLMGTLGIVCPICSQKP[SEQ.ID.No.7]構成。此調配物含有約2.8 mg/ml R-DOTAP 佐劑奈米顆粒之佐劑及約1 mg/mL每種肽之抗原組裝體。
在第0天及第7天，給小鼠注射0.1 ml調配物。殺死小鼠，並自每一小鼠取脾細胞以在第14天進行評價。如表2中所顯示，展示因應用此調配物免疫之強免疫反應。
實例7 使用包含陽離子脂質奈米顆粒及含有微胞黑色素瘤抗原之抗原組裝體之疫苗調配物時的免疫反應
使用包含陽離子脂質奈米顆粒及抗原組裝體之疫苗調配物時C57/BL6小鼠中之免疫反應可藉由ELISPOT進行評價。在此實例中，疫苗調配物包含陽離子脂質奈米顆粒(例如，R-DOTAP)及黑色素瘤抗原之呈微胞結構之肽抗原組裝體。
在此實例中，調配物A包含陽離子脂質R-DOTAP佐劑奈米顆粒及囊封以下三種黑色素瘤抗原之抗原組裝體：gp100(KVPRNQDWL[SEQ.ID.No.8])、TRP2(SYVDFFVWL[SEQ.ID.No.9])及p53(KYICNSSCM[SEQ.ID.No.10])。調配物A含有約4.3 mM R-DOTAP佐劑奈米顆粒之佐劑及約0.25 mM gp100肽。
為遞送更大量之gp100抗原，研發微胞調配物。使用經修飾之抗原棕櫚醯基-KSS KVPRNQDWL[SEQ.ID.No.11]來研發微胞調配物。調配物B包含約4.4 mM脂質體R-DOTAP囊封之TRP2及約0.46 mM gp100之微胞調配物。由經修飾抗原製得之微胞係如實例2中所述來製備。疫苗之效力係在C57/BL6小鼠中如實例5中所述藉由ELISPOT來評價。
圖7顯示與經脂質體囊封之gp100抗原相比，對包含呈微胞調配物之gp100抗原之調配物之免疫反應增加大於20倍。據信，免疫反應增強係由於經由微胞調配物遞送之gp100抗原的量近似加倍。
實例8 在疫苗調配物中使用微胞抗原組裝體及經脂質體囊封之抗原組裝體時免疫反應之比較
使用包含不同陽離子脂質奈米顆粒及不同抗原組裝體之疫苗調配物時的免疫反應可藉由ELISPOT進行評價。在此實例中，疫苗調配物可使用各種陽離子脂質奈米顆粒(例如，DOEPC或DOTMA)或乳液佐劑Montanide來調配。此外，疫苗調配物可使用呈微胞結構或脂質體囊封結構之抗原組裝體來調配。
在本實例中對各種不同疫苗調配物進行評價。在一種調配物中，抗原組裝體包含肽抗原[SEQ.ID.No.2](0.11 mM)及陽離子脂質佐劑DOEPC(1 mM)。在第二種調配物中，抗原組裝體包含用以實現微胞形成之經修飾之肽抗原 [SEQ.ID.No.3](0.11 mM)及陽離子脂質佐劑DOEPC(1 mM)。在第三種調配物中，抗原組裝體包含肽抗原[SEQ.ID.No.2](0.11 mM)及陽離子脂質佐劑DOTMA(1 mM)。在第四種調配物中，抗原組裝體包含經修飾之肽抗原[SEQ.ID.No.3](0.11 mM)及陽離子脂質佐劑DOTMA(1 mM)。在第五種調配物中，抗原組裝體包含肽抗原[SEQ.ID.No.2](0.11 mM)及乳液佐劑Montanide。在第六種調配物中，抗原組裝體包含經修飾之肽抗原[SEQ.ID.No.3](0.11 mM)及乳液佐劑Montanide。
在抗原組裝體包含未經修飾之肽抗原[SEQ.ID.No.2]之調配物中，將抗原組裝體調配成脂質體囊封形式。相比之下，在抗原組裝體包含經修飾之肽抗原[SEQ.ID.No.3]之調配物中，將抗原組裝體調配成微胞形式，且與佐劑以1：1之比率混合以保持與對應脂質體調配物相比相同之抗原及佐劑含量。經脂質體囊封之抗原組裝體及微胞抗原組裝體係分別按照實例1及實例1之方案來製得。各種疫苗調配物之效能係藉由經由ELISPOT測定抗原特異性免疫反應進行評價。
圖8顯示本實例之結果。當抗原組裝體係以微胞形式與特定佐劑一起遞送時，相同劑量之抗原及佐劑獲得超級優異之抗原特異性免疫反應。重要的是，當使用以脂質體囊封形式遞送之抗原組裝體時，觀察到非常弱之免疫反應。
所觀察到之免疫反應亦取決於與微胞抗原一起投與之特定佐劑，如用DOTMA、DOEPC及Montanide時所見。 DOTMA調配物展示之免疫反應優於DOEPC調配物，且兩種陽離子脂質調配物均優於乳液佐劑Montanide。
圖1顯示與HPV-16 E7肽抗原聯合之各種陽離子脂質佐劑與以類似方式與E7抗原調配在一起之傳統佐劑相比之抗腫瘤免疫反應。
圖2顯示R-DOTAP/pE743-57複合物之各種脂質體囊封調配物與抗原區中不存在胺基酸43至48之R-DOTAP/pE749-57複合物相比之腫瘤消退功效。
圖3顯示使用經修飾之HVP-16 E743-57微胞與R-DOTAP或S-DOTAP脂質體佐劑奈米顆粒之混合物與空R-DOTAP脂質體奈米顆粒相比的腫瘤消退功效。
圖4顯示含有由棕櫚醯基-KSSGQAEPDRAHYNIVTF[SEQ.ID.No.3]構成之圓柱形pE743-57M微胞及球形陽離子脂質R-DOTAP奈米顆粒之疫苗調配物的陰性染色電子顯微影像。
圖5顯示含有共存在於經調配混合物中之包含棕櫚醯基-KSSYMLDLQPETT[SEQ.ID.NO：5)且呈球形微胞結構之抗原組裝體與包含球形R-DOTAP脂質體奈米顆粒之佐劑之混合物的疫苗調配物之陰性染色電子顯微影像。
圖6顯示含有由pE71-20M或棕櫚醯基-KSSMHGDTPTLHEYMLDLQPETT[SEQ.ID.No.6]構成之圓柱形結構及球形陽離子脂質R-DOTAP奈米顆粒之疫苗調配物的陰性染色電子顯微影像。
圖7顯示ELISPOT研究之結果，其比較對在含有囊封於R-DOTAP佐劑中之各種黑色素瘤抗原之疫苗調配物及與R-DOTAP脂質體佐劑共投與之黑色素瘤肽微胞調配物中之黑色素瘤肽gp100之抗原特異性免疫反應。
圖8顯示ELISPOT研究之結果，其比較對以相同劑量調配成微胞且與各種佐劑共投與之HPV-16肽對囊封於脂質體佐劑中之HPV-16肽之抗原特異性免疫反應。
<110> 美商PDS生技公司
<120> 粒狀疫苗調配物
<130> 50165-222752
<140> 101133392
<141> 2012-09-12
<150> 61/533,512
<151> 2011-09-12
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
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<223> 延長肽
<400> 11

Claims (23)

  1. 一種疫苗調配物，其包含陽離子脂質及粒狀肽抗原組裝體，其中該抗原組裝體係微胞結構，其與該陽離子脂質獨立且分別形成，且該抗原組裝體缺少該陽離子脂質；其中該陽離子脂質係選自由下列組成之群：1,2-二油醯基-3-三甲基銨丙烷(DOTAP)、N-1-(2,3-二油醯基氧基)丙基-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTMA)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-乙基磷酸膽鹼(DOEPC)及其組合。
  2. 如請求項1之疫苗調配物，其中該陽離子脂質係免疫調節劑。
  3. 如請求項1之疫苗調配物，其中該陽離子脂質係1,2-二油醯基-3-三甲基銨丙烷(DOTAP)。
  4. 如請求項2之疫苗調配物，其中該免疫調節劑係陽離子脂質之對映異構體。
  5. 如請求項4之疫苗調配物，其中該對映異構體係(R)-1,2-二油醯基-3-三甲基銨丙烷(R-DOTAP)。
  6. 如請求項1之疫苗調配物，其中該抗原組裝體包含至少一種管狀或球形微胞結構。
  7. 如請求項1之疫苗調配物，其中該抗原組裝體包含一或多種選自由下列組成之群之抗原：癌抗原、病毒抗原、細菌抗原及病原性抗原。
  8. 如請求項7之疫苗調配物，其中至少一種抗原係人類乳突病毒(HPV)蛋白質或肽。
  9. 如請求項7之疫苗調配物，其中至少一種抗原係選自由下列組成之群：RAHYNIVTF(SEQ.ID.NO：1)、GQAEPDRAHYNIVTF(SEQ.ID.NO：2)、KSSGQAEPDRAHYNIVTF(SEQ.ID.NO：3)、YMLDLQPETT(SEQ.ID.NO：4)、KSSYMLDLQPETT(SEQ.ID.NO：5)、KSSMHGDTPTLHEYMLDLQPETT(SEQ.ID.NO：6)、KSSLLMGTLGIVCPICSQKP(SEQ.ID.NO：7)、KVPRNQDWL(SEQ.ID.NO：8)、SYVDFFVWL(SEQ.ID.NO：9)、KYICNSSCM(SEQ.ID.NO：10)及KSSKVPRNQDWL(SEQ.ID.NO：11)。
  10. 如請求項1之疫苗調配物，其中該抗原組裝體包含一或多種經修飾抗原。
  11. 如請求項7之疫苗調配物，其中該抗原組裝體包含肽抗原。
  12. 一種如請求項1至11中任一項之疫苗調配物之用途，其用於製造在哺乳動物中誘導免疫反應之藥劑，其中該疫苗調配物包含陽離子脂質及粒狀肽抗原組裝體，其中該粒狀肽抗原組裝體係微胞結構，其與該陽離子脂質獨立且分別形成，且其中該粒狀肽抗原組裝體缺少該陽離子脂質。
  13. 如請求項12之用途，其中該陽離子脂質係免疫調節劑。
  14. 如請求項12之用途，其中該陽離子脂質係1,2-二油醯基-3-三甲基銨丙烷(DOTAP)。
  15. 如請求項13之用途，其中該免疫調節劑係陽離子脂質之對映異構體。
  16. 如請求項15之用途，其中該對映異構體係(R)-1,2-二油醯基-3-三甲基銨丙烷(R-DOTAP)。
  17. 如請求項12之用途，其中該抗原組裝體包含至少一種管狀或球形微胞結構。
  18. 如請求項12之用途，其中該抗原組裝體包含一或多種選自由下列組成之群之抗原：癌抗原、病毒抗原、細菌抗原及病原性抗原。
  19. 如請求項18之用途，其中至少一種抗原係HPV蛋白質或肽。
  20. 如請求項18之用途，其中至少一種抗原係選自由下列組成之群：RAHYNIVTF(SEQ.ID.NO：1)、GQAEPDRAHYNIVTF(SEQ.ID.NO：2)、KSSGQAEPDRAHYNIVTF(SEQ.ID.NO：3)、YMLDLQPETT(SEQ.ID.NO：4)、KSSYMLDLQPETT(SEQ.ID.NO：5)、KSSMHGDTPTLHEYMLDLQPETT(SEQ.ID.NO：6)、KSSLLMGTLGIVCPICSQKP(SEQ.ID.NO：7)、KVPRNQDWL(SEQ.ID.NO：8)、SYVDFFVWL(SEQ.ID.NO：9)、KYICNSSCM(SEQ.ID.NO：10)及KSSKVPRNQDWL(SEQ.ID.NO：11)。
  21. 如請求項12之用途，其中該抗原組裝體包含一或多種經修飾抗原。
  22. 如請求項12之用途，其中該免疫反應包含細胞毒性(cytotoxic)T細胞反應。
  23. 如請求項12之用途，其中該抗原組裝體包含肽抗原。
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