JPH09505982A

JPH09505982A - アデノ関連ウイルス（ａａｖ）リポソームおよびそれに関連する方法

Info

Publication number: JPH09505982A
Application number: JP7509211A
Authority: JP
Inventors: フィリップ，ラミラ; レブコウスキ，ジェーン
Original assignee: アプライドイミューンサイエンシーズ，インコーポレイテッド
Priority date: 1993-09-13
Filing date: 1994-09-13
Publication date: 1997-06-17
Also published as: KR100421753B1; FI961146A0; PT719343E; CA2171318A1; KR960705055A; AU692470B2; SG48099A1; WO1995007995A3; US5861314A; US5861171A; EP0719343B1; FI961146A; DK0719343T3; WO1995007995A2; NO961010L; DE69433462T2; DE69433462D1; AU7717594A; NO961010D0; ATE257177T1

Abstract

(57)【要約】脂質物質を含むリポソーム、およびアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）物質を含む遺伝子操作用の組成物。典型的には、このＡＡＶ物質はプラスミドであり、ＡＡＶゲノムの末端反復配列を含む。ＡＡＶリポソームの使用によって細胞に遺伝子物質を導入する方法を開示する。従って、遺伝子物質を、幹細胞、Ｔ細胞、原発性腫瘍細胞、または腫瘍細胞系に導入し、組み込んだ。

Description

【発明の詳細な説明】アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）リポソームおよびそれに関連する方法技術分野遺伝子修飾本発明は細胞操作を含み、さらに詳しくは、本発明はカチオン性リポソームを用いてアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）プラスミドによるトランスフェクションを容易にすることに関する。背景技術真核細胞のトランスフェクションは、遺伝子治療の研究および開発にとって益々重要となった。遺伝子治療の進歩は、その大部分は、効率的にＤＮＡを標的細胞に導入し得る送達系の開発に依存する。多数の方法が、培養細胞のタイプにおいて異種遺伝子の安定なまたは一過性の発現をするために開発されてきた。これらは、キャリアー分子またはウイルスを使用する形質導入技術を含む。ほとんどの遺伝子治療戦略は、レトロウイルスまたはＤＮＡウイルスベクターへのトランスジーン挿入による形質導入に頼ってきた。しかしながら、アデノウイルスおよび他のＤＮＡウイルスベクターは感染による後遺症を生じる可能性があり、投与を繰り返すと免疫原性となり得、また、限られた大きさの挿入ＤＮＡのみをパッケージし得る。ウイルスベクター系のうち、組換えアデノウイルス関連ウイルス（ＡＡＶ）形質導入系は、種々の哺乳動物細胞タイプに遺伝子を安定かつ効率的に有させる最も有効なベクター系のうちの１つであることが示されている（Lebkowski，J.S. ら「アデノ関連ウイルス：種々の哺乳動物細胞タイプへのＤＮＡの効率的な導入および組込みのためのベクター系(Adeno-associated virus: A vector system f or efficient introduction and integration of DNA into a variety of mamma lian cell types)」、Mol．Cell．Biol．（１９８８）８：３９８８−３９９６）。ＡＡＶＤＮＡがウイルスＤＮＡの逆方向反復配列（ＩＴＲ）を介して、１ないし数個のタンデムコピーとして細胞ＤＮＡに連結され細胞ＤＮＡに組み込まれること、および組み込まれたＡＡＶゲノムの物理的構造は、ウイルスの挿入によって、通常、マルチコピーとして出現するがこれはＡＡＶ末端反復配列を介してタンデムのヘッドからテイル方向であることを示唆することが文献に記載されている（Kotin，R.M.ら「アデノ関連ウイルスの部位特異的組込み(Site-speci fic integration of adeno-associated virus)」、Proc．Natl．Acad．Sci．（１９９０）８７：２２１１−２２１５）。このようにして、ＡＡＶ末端反復配列（ＩＴＲ）はＡＡＶの形質導入系の必須の部分である。組換えアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターはアデノウイルスベクターとは異なるにも拘わらず、トランスジーンＤＮＡサイズの限定およびパッケージング特性はどの他のＤＮＡウイルスベクターとも同一である。ＡＡＶは直鎖状の一本鎖ＤＮＡパルボウイルスであり、増殖的感染を行うためには第２の無関係なウイルスによるコインフェクションを必要とする。ＡＡＶは２セットの機能的遺伝子：ウイルスの複製に必要なｒｅｐ遺伝子、および構造キャプシド蛋白質遺伝子を有する（Hermonat，P．L.ら「アデノ関連ウイルスの遺伝学：アデノ関連２型突然変異体の単離および予備的特徴付け（Genetics od ad eno-associated virus: Isolation and preliminary characterization of aden o-associated type 2 mutants）、J．Virol．（１９８４）５１：３２９−３３９）。ＡＡＶのrｅｐおよびキャプシド遺伝子は、所望のＤＮＡ断片によって置換されＡＡＶプラスミドＤＮＡを生じる。ｒｅｐおよびキャプシド遺伝子のトランス相補性は組換えウイルス株を創製するのに必要である。このようなウイルス株を用いる形質導入に際し、組換えウイルスは核内で脱外被し、その分子端部によって宿主ゲノムに組み込まれる。かなりの進歩したにも拘わらず、形質導入技術には、効率が変動すること、内因性ウイルスによる組換えの可能性、細胞障害性および免疫学的宿主応答反応という重要な問題がある。従って、非ウイルス性ＤＮＡトランスフェクション手法に対する要求がある。リポソームは核酸およびウイルス粒子を含む種々の物質をカプセル化し、細胞に送達するのに使用されてきた（Faller,D.V.およびD．Baltimore，「レトロウイルスのリポソームによるカプセル化は耐性細胞系の効率的な重複感染を可能とする(Liposome encapsulation of retrovirus allows efficient superinfection of resistant cell lines)」、J．Virol.（１９８４）４９：２６９−２７２）。合成カチオン性脂質を含有する予め形成されたリポソームはポリアニオン性ＤＮＡと安定な複合体を形成することが示されている（Felgner，P．L.ら「高度に効率的な脂質-媒介ＤＮＡトランスフェクション方法(A highly efficient，lipi d-mediated DNA transfection procedure)」、Proc．Natl．Acad．Sci．USA（１９８７）８４：７４１３−７４１７）。カチオン性リポソーム、ある種のカチオン性の脂質を含むリポソームは、膜融合促進性脂質ジオクタデシルジメチル−アンモニウム−ブロマイド（ＤＤＡＢ）を含有しており真核細胞に異種遺伝子を効率的に移入している（Rose，J.K.ら「動物細胞の新しいカチオン性リポソーム試薬が媒介するほとんど定量的なトランスフェクション(A new cationic liposome reagent mediating nearly quantitative transfection of animal cells)」、Biotechniques （１９９１）１０：５２０−５２５）。カチオン性リポソームは、種々の培養細胞系にトランスジーンまたはｍＲＮＡを送達することによって、それらの高レベルの細胞発現を媒介し得る（Malone，R.ら「カチオン性リポソーム媒介ＲＮＡトランスフェクション（Cationic liposome mediated RNA transfe ction）、Proc．Natl．Acad．Sci．USA（１９８９）８６：６０７７−６０８１）。エコトロピック（ecotropic）および両種性（amphotropic）のパッケージされたレトロウイルスベクターは、Lipofectin(ＢＲＬ、Gaithersburg，MD)のようなカチオン性リポソームの存在下で、かつ特異的レセプターの非存在下で培養細胞に感染することが示されている（Innes，C.L.ら「カチオン性リポソーム(Lipofe ction)は特異的レセプターの非存在下でレトロウイルス感染を媒介する（Cation ic liposomes（Lipofectin）mediate retroviral infection in the absence of specific receptors）」、J．Virol．（１９９０）６４：９５７−９６１）。非ウイルス技術がウイルス系の問題のいくつかを克服したにも拘わらず、非ウイルス系におけるトランスフェクション効率の改良に対する要求、トランスフェクト可能な細胞タイプの幅を広げる要求、トランスフェクトされた細胞における発現の持続を増大させる要求、およびトランスフェクションに続く発現のレベルを増大させる要求が依然存在する。プラスミドＤＮＡ築物におけるプロモーターエンハンサーエレメントの使用によって、ある程度は、効率の改良が達成されている（Philip，R.ら「インビボにおける遺伝子送達：成体マウスにおけるＴリンパ球の効率的トランスフェクション(In vivo gene delivery：Efficient transf ection of T lymphocytes in adult mice)」、J．Biol．Chem．（１９９３）２６８：１６０８７−１６０９０）。腫瘍細胞の免疫破壊インターロンキン−２（ＩＬ−２）を用いて、転移性腎臓細胞癌（ＲＣＣ）のような新生物細胞を治療することはヒト新生物を免疫を媒介して破壊する１つの方法である。持続性の完全な緩解が達成されたにも拘わらず、全体としての応答速度は低い。癌患者に対するｒＩＬ−２(Chiron Corp.，Emeryville，CA)のテストにおいて、用量限定による毒性は投与の経路および方法に依存する。高用量のＩＬ−２ボーラス投与は重大な毒性（ほとんど全ての器官系に関係する毒性）に関連していた。さらに、ＥＣＯＧＯ効率状態の患者における４％の死亡率が、高用量のＩＬ−２投与で見い出されている（例えば、Oken，Am．J．Clin．Oncol．(CCT)５：６４９−６５５（１９８２）、「東部共同癌学グループの毒性および応答基準 (Toxicity and Response Criteria of the Eastern Cooperative Oncology Grou p)」、表２、第６５４頁参照）。ボーラス投与と区別できるように、低用量（１〜７×１０⁶Cetus単位／Ｍ²／ｄ）のＩＬ−２を連続的に静脈内注入（ＣＩＶ）することにより臨床的効率および毒性低下を報告し、進行性癌の養子免疫療法において改良された安全性プロフィールを示唆している（West，W．H．ら「進行した癌の養子免疫療法における組換えインターロンキン−２の一定注入(Constant Infusion of Recombinant Inte rleukin-2 in Adoptive Immunotherapy of Advanced Cancer)」、（１９８７）N ．Engl．J．Med．３１６：８９８）。ＩＬ−２と組み合わせた場合に腫瘍の免疫破壊を潜在的に改良する細胞エレメントには、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞および細胞障害性腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）細胞のような細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が含まれる。腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）は、一次Ｔリンパ球であって、腫瘍塊に密接に関係することが通常見い出され、かつインビトロ(in vitro)で単離、増殖、次いで活性化できるＴリンパ球である。ＴＩＬ細胞は、腫瘍細胞に対して親和性を有するので、新形成治療の研究で興味深い。従って、細胞障害性ＴＩＬは特に興味深い。というのは、これらの細胞は腫瘍に対して親和性を有し、また、細胞障害性の特質を有するからである。治療方法として、ＴＩＬは外因性ＩＬ−２と共に宿主に再注入されている（例えば、１９９２年６月３０日にRosenbergに発行された米国特許第５,１２６,１３２号参照）。ＴＩＬと組み合わせたＩＬ−２での治療は、ある場合には、進行した悪性疾患の治療において持続性のある完全な緩解をもたらした。発明の開示カチオン性リポソームを用いて初代のおよび培養した細胞タイプのアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）プラスミドトランスフェクションが容易となった。リポソームと複合体化したＡＡＶプラスミドＤＮＡは、標準的なプラスミドとの複合体よりも数倍高レベルの発現を示した。さらに、発現は、何の選択もすることなく３０日間の期間継続した。ＡＡＶプラスミド：リポソーム複合体は、組換えＡＡＶ形質導入によって得られたものに匹敵するトランスジーン発現のレベルを誘導した。高レベルの遺伝子発現が、正常ヒト末梢血液からの新たに単離したＣＤ４⁺ およびＣＤ８⁺Ｔ細胞、腫瘍浸潤性リンパ球、およびＣＤ３４⁺幹細胞（stem cel l）で観察された。ＡＡＶプラスミドＤＮＡ：リポソーム複合体を用いて、原発性乳腫瘍、卵巣腫瘍および肺腫瘍細胞をトランスフェクトした。トランスフェクトした腫瘍細胞は致死的放射線照射の後にトランスジーンを発現できた。トランスフェクション効率は、β−ガラクトシダーゼ遺伝子発現によって評価して、１０〜５０％の範囲であった。原発性腫瘍細胞におけるトランスジーンの発現能力を利用して腫瘍ワクチンを生産し、癌およびエイズにおける、および遺伝子治療における細胞性免疫応答を高度に特異的に調節し得るリンパ様細胞を生産する。本明細書で開示するのは遺伝子操作のための組成物である。この組成物は、脂質物質およびアデノ関連ウイルス物質を有するリポソームを含有する。アデノ関連ウイルス物質はプラスミドであり得、このプラスミドはｐＭＰ６−ＩＬ２またはｐＡＣＭＶ−ＩＬ２であり得る。アデノ関連ウイルス物質は逆方向末端反復配列または２またはそれ以上の逆方向末端反復配列を含み得る。２つの逆方向末端反復配列がアデノ関連ウイルス物質に存在する場合、目的の遺伝物質は２つの逆方向末端反復配列の間に組み込むことができ；さらに、プロモーターを２つの逆方向末端反復配列の間に組み込むことができ、このプロモーターはＣＭＶ即時性 −初期プロモーター、ＣＭＶ即時性−後期プロモーター、ＣＭＶ初期プロモーター、ＡＤＡプロモーター、またはＴＫプロモーターであり得る。この組成物は、ＩＬ−２遺伝子またはβ−ｇａｌ遺伝子の遺伝子配列のような目的の遺伝子配列を含む。この脂質物質はカチオン性脂質であり得る。この組成物によってトランスフェクトされた細胞を開示する。目的の遺伝子配列を宿主細胞に導入する方法を開示する。この方法は、リポソームアデノ関連ウイルス物質および目的の遺伝子配列を含む組成物を提供する工程、およびこの組成物を遺伝子物質を含む宿主細胞と接触させ、それにより、目的の遺伝子配列を宿主細胞に導入する工程を含む。この宿主細胞は、ＣＤ３４⁺ 幹細胞：ＣＤ３⁺、ＣＤ４⁺またはＣＤ８⁺細胞のようなＴ−細胞；膀胱、前立腺、Ｂリンパ腫、または胚性腎臓細胞系のような腫瘍細胞系の細胞；または原発性腫瘍細胞であり得る。組成物を提供するこの工程は、それ自体カチオン性脂質を含むリポソームを提供する工程を含み得る。組成物を提供する工程はプラスミドを含むアデノ関連ウイルス物質を提供し得、このプラスミドはｐＭＰ６−ＩＬ２またはｐＡＣＭＶ−ＩＬ２であり得る。目的の遺伝子配列を細胞に導入する工程は、さらに、目的の遺伝子配列を宿主細胞の遺伝物質に導入する工程を含み得る。脂質物質、アデノ関連ウイルス物質、目的の遺伝子配列を含むリポソームを含む組成物を使用する方法を開示する。この方法は、疾患を持つ患者を提供し；リポソームアデノ関連ウイルス物質および目的の遺伝子配列を含む組成物を提供することを含む。この方法は、さらに、この組成物を宿主細胞と接触させ、それにより、目的のこの遺伝子配列を宿主細胞に導入することを含む。この接触工程はインビボであり得、宿主細胞は患者の細胞である。別法として、この接触工程はエクスビボであり得、この接触がエクスビボであれば、この方法は、さらに、導入された目的の遺伝子配列を含む宿主細胞を患者に送達することを含む。患者を提供するこの工程は、新生物のような疾患；ＨＩＶ感染のような感染；自己免疫疾患；または欠失または欠陥遺伝子のような遺伝子異常を持つ患者を提供し得る。組成物を提供するこの工程は、ペプチドをコードする目的の遺伝子配列、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはＲＮＡを提供し得る。組成物を提供するこの工程は、ｐＭＰ６−ＩＬ２またはｐＡＣＭＶ−ＩＬ２のようなプラスミドを提供し得る。組成物を提供するこの工程は、サイトカイン、共刺激性因子（costim ulatory factor）、ＭＨＣクラスＩ分子、腫瘍−特異的抗原、または腫瘍関連抗原をコードする遺伝子配列を含む目的の遺伝子配列を提供し得る。患者を提供するこの工程は、悪性新生物疾患、またはＨＩＶ感染患者を提供し得；組成物を提供するこの工程はＩＬ−２ゲノム物質を含む目的の遺伝子配列をかかる患者に提供し得る。患者を提供するこの工程は悪性新生物疾患患者を提供し得；組成物を提供するこの工程はかかる患者のためにＭＤＲＩ遺伝子を含む遺伝子配列を提供し得る。この組成物を宿主細胞と接触させるこの工程は、新生物細胞である宿主細胞、骨髄造血細胞または末梢血液細胞である宿主細胞と接触させることを含み得；この接触工程は腫瘍浸潤性リンパ球、腫瘍細胞系の細胞、または原発性腫瘍細胞である宿主細胞と接触させることを含む。本質的に図３に示す遺伝子配列を含む発現ベクターを開示する；実質的に図３の遺伝子配列である遺伝子配列を含む発現ベクターを開示する；図３の遺伝子配列である遺伝子配列を含む発現ベクターを開示する。実質的に図３の遺伝子配列である遺伝子配列を含む発現ベクターで修飾した遺伝子を含む細胞を開示する；この細胞は末梢血液細胞、骨髄細胞、腫瘍浸潤性リンパ球、腫瘍細胞系、または原発性腫瘍細胞であり得る。本質的にプラスミドｐＭＰ６の遺伝子配列である遺伝子配列を含む発現ベクターを開示する；発現ベクターは実質的にプラスミドｐＭＰ６遺伝子配列を含み；発現ベクターはプラスミドｐＭＰ６の遺伝子配列である遺伝子配列を有する。本質的にプラスミドｐＭＰ６の遺伝子配列である遺伝子配列を含む発現ベクターは、さらに、目的の遺伝子配列を含み；細胞はかかる発現ベクターで修飾した遺伝子であり得、この細胞は末梢血液細胞、骨髄細胞、腫瘍浸潤性リンパ球、腫瘍細胞系細胞、または原発性腫瘍細胞であり得る。蛋白質を産生する方法を開示する。この蛋白質産生方法は、リポソーム、アデノ関連ウイルス物質および目的の遺伝子配列を含む組成物を提供する工程を含む。この組成物を、遺伝物質を含む宿主細胞と接触させ、それにより、目的の遺伝子配列を宿主細胞に導入する。この産生方法は、さらに、目的の遺伝子配列によってコードされる蛋白質を発現させる工程を含む。宿主細胞はＣＤ３４⁺幹細胞、Ｔ−細胞、腫瘍細胞系の細胞、または原発性腫瘍細胞であり得；この宿主細胞は腫瘍浸潤性リンパ球、ＣＤ３⁺、ＣＤ４⁺、またはＣＤ８⁺細胞であり得る。この宿主細胞は、膀胱、前立腺、Ｂリンパ球、または胚性腎臓細胞系由来であり得る。リポソームを含む組成物を提供する工程は、カチオン性脂質を含む組成物を提供することを含み得る。組成物を提供する工程は、ｐＭＰ６−ＩＬ２またはｐＡＣＭＶ−ＩＬ２のようなプラスミドを含むアデノ関連ウイルス物質を提供し得る。蛋白質を提供する方法は、さらに、目的の遺伝物質を宿主細胞の遺伝物質に組み込む工程を含む。蛋白質を発現する工程は、リンホカインアナログを発現することを含み得る。蛋白質を発現する工程は、ＩＬ−２、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコール−アセチル−トランスフェラーゼ、またはＭＤＲＩを発現し得る。新生物を有する患者を治療するための治療用細胞組成物を調製する方法を開示する。この方法は、エフェクターＴ−リンパ球細胞を含む細胞組成物を得；この細胞組成物を特異的結合蛋白質と接触させ、ここで、この特異的結合蛋白質は表面に共有結合されており、それにより、特異的結合蛋白質によって特異的に結合されたエフェクターＴ−リンパ球細胞は表面に特異的に結合するようになり、そして、表面に結合した特異的結合エフェクターＴ−リンパ球細胞を残したまま未結合細胞を除去する工程を含む。治療用細胞組成物を調製する方法は、さらに、エフェクターＴ−リンパ球細胞を増殖させ、それにより、実質的に同種表現型集団が提供される工程を含み；この増殖工程は、さらに、エフェクターＴ−リンパ球を腫瘍細胞と共に培養することを含み；この腫瘍細胞は放射線照射され得；この腫瘍細胞はインターロイキン−２の発現カセットを含むベクターで遺伝子修飾され得る。治療用細胞組成物を調製する方法において、この取得工程は、腫瘍浸潤性リンパ球であるエフェクターＴ−リンパ球細胞を得る工程を含み、この腫瘍浸潤性リンパ球はオートローガスのまたは同種異系の新形成組織由来であり得る。この接触工程は、細胞組成物を、ＣＤ４、ＣＤ８、またはＣＤ４およびＣＤ８に特異的な特異的結合性蛋白質の混合物に対し特異的に結合する蛋白質と接触させることを含み得る。治療用細胞組成物を調製する方法は、さらに、特異的に結合した細胞を放出する工程を含み、それにより、この細胞の放出の結果、特異的結合性蛋白質が実質的になくなる。この特異的結合性蛋白質はモノクローナル抗体を含み得る。この方法は、さらに、ＩＬ−２ゲノム物質を含むプラスミドでトランスフェクトするような、特異的に結合した細胞を遺伝子修飾する工程を含み得、それにより、インターロイキン−２を全身投与することがなくても治療効果を有する治療用細胞組成物が得られる。この方法よって調製した細胞の実質的に均質な集団を開示する。この方法によって調製した細胞集団の、腎臓細胞癌、浸潤性延性癌、黒色腫、卵巣癌、肺癌または鱗状細胞癌のような新生物を有する患者を処置するための使用を開示する。ＣＤ８⁺ＴＩＬ細胞の実質的に均質な集団を開示する。この集団の細胞は外部表面を含み、ここで、この細胞のこの外部表面は実質的に抗体がなく；この集団の細胞はＣＤ８について少なくとも８０％均質であり得る。新形成細胞を取得し；脂質物質およびアデノ関連ウイルス物質およびさらに目的の遺伝子配列（リンホカインをコードする配列のような）を含むリポソームを含む組成物でこの細胞を遺伝子修飾することを含む、新生物を有する患者を治療するための治療用細胞組成物を開示する；本方法に従って調製した組成物の使用も開示する。図面の簡単な説明図１。本実験で用いる３種のプラスミドのプラスミド地図。プラスミドｐＡＣＭＶ−ＩＬ２は、ＣＭＶプロモーター、ＩＬ−２ｃＤＮＡおよびラットプレプロインスリンおよびｐＢＣ１２／ＣＭＶ−ＩＬ２プラスミドと同一のＳＶ４０ポリアデニル化配列を含有し、さらに、ｐＡＣＭＶ−ＩＬ２は両末端にＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）も有していた。プラスミドｐＡ１ＣＭＶＩＸ−ＣＡＴはＣＭＶプロモーターならびに２つのＡＡＶＩＴＲの間に挿入されたＣＡＴ遺伝子で構築された。図２。この図はＩＬ−２の実施態様であるｐＭＰ６プラスミド（ｐＭＰ６−ＩＬ２）の詳細な制限地図を提供する。図３ａ〜ｅ。この図はｐＭＰ６−ＩＬ２プラスミドのＤＮＡ配列を示す。この図において、パネルａ〜ｅは配列の連続的部分を示す。公知のＤＮＡ配列に対応するｐＭＰ６−ＩＬ２配列の部分を示し；この対応する配列情報はｐＭＰ６−ＩＬ２プラスミドについての配列情報の直接直ぐ下にリストする。印を付さない配列はリンカーからのものである。図４ａ〜ｂ。図４ａは、プラスミドＤＮＡ：リポソーム複合体によって誘導された遺伝子発現のレベルを示す。種々のＩＬ−２プラスミド構築物をリポソームで複合体として、ラット膀胱およびラット前立腺細胞系で遺伝子発現を誘導する能力についてテストした。両細胞系において、ＡＡＶプラスミド構築物は、高レベルの発現を示した。このレベルをピコグラム／ｍｌ／１０⁶細胞として表す。図４ｂは、ＡＡＶプラスミド：リポソーム複合体によって誘導された遺伝子発現の経時変化を示す。トランスジーン発現の持続性を比較するために、前立腺細胞系を、リポソームで複合体とした、ＡＡＶプラスミド（ｐＡＣＭＶ−ＩＬ２）および対応する対照プラスミド（ｐＢＣ１２／ＣＭＶ−ＩＬ２）でトランスフェクトした。上清を種々の時点で集め、ＥＬＩＳＡ法を用いてＩＬ−２のレベルについてアッセイした。ＩＬ−２のレベルは、培養２４時間内におけるピコグラム／ｍｌ／１０⁶細胞として表される。図５ａ〜ｂ。ＡＡＶプラスミド：リポソーム複合体媒介トランスフェクションと組換えＡＡＶ形質導入との比較。ＡＡＶプラスミド：リポソーム複合体によって誘導された遺伝子発現のレベルがｒＡＡＶ形質導入と同等であるか否かを決定するために、前立腺細胞系（図５ａ）および膀胱系（図５ｂ）を用いてＩＬ−２遺伝子のトランスフェクションおよび形質導入を比較した。ＩＬ−２レベルはＥＬＩＳＡ法を用いて評価した。このレベルは培養２４時間内におけるピコグラム／ｍｌ／１０⁶細胞として表される。図６。種々の原発性腫瘍細胞のＡＡＶプラスミド：リポソーム複合体でのリポフェクションによるＩＬ−２遺伝子の発現。１つの肺、１つの卵巣、および２つの乳房腫瘍サンプルを新鮮な腫瘍バイオプシーから単離した。ＩＬ−２レベルはＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。このレベルは培養２４時間内におけるピコグラム／ｍｌ／１０⁶細胞として表される。図７ａ〜ｂ。本発明に従ってトランスフェクトし、次いで致死的放射線照射に付した細胞によるＩＬ−２の発現。遺伝子発現に対する放射線照射の効果を測定するために、前立腺細胞系（図７ａ）および原発性乳細胞（図７ｂ）をトランスフェクトし、本明細書に記載のように、致死的放射線照射後に遺伝子発現について評価した。上清を照射後２４、４８、７２および９６時間に集め、ＩＬ−２レベルについてテストした。ＩＬ−２レベルは２４時間培養におけるｐｇ／ｍｌ／１０⁶細胞として表される。図８。β−ｇａｌ遺伝子発現によって測定したＡＡＶ：リポソームトランスフェクションの効率。β−ｇａｌレポーター遺伝子を用いて細胞ベース当たりのトランスフェクション効率を評価した。本明細書に記載のように、前立腺細胞系をトランスフェクションに用いた。データは、蛍光陽性細胞のパーセントとして表す。図９ａ〜ｄ。トランスフェクトされたＴリンパ球を示す薄層クロマトグラフィー実験。供血者から得た血液をＡまたはＢとする。供血者ＡまたはＢの末梢血液を用いてＴ細胞を単離し、トランスフェクションした。供血者の末梢血液から新たに単離した一次（Primary）Ｔ細胞の、ＡＡＶプラスミドＤＮＡ：リポソーム複合体を用いるトランスジーン発現についてテストした。ＡＩＳ MicroCELLect orデバイスを用い、Ｔリンパ球をＣＤ３⁺（図９ａ）、またはＣＤ５／８⁺（図９ｂ）、またはＣＤ４⁺（図９ｃ）またはＣＤ８⁺（図９ｄ）集団として分画した。関連細胞を捕獲し、本明細書に記載のように培養した。その後、５〜１０×１０⁶ 細胞を培養し、ＡＡＶプラスミドＤＮＡの５０マイクログラムおよびリポソームの５０または１００ｎｍｏｌｅでトランスフェクトして、１：１または１：２のＤＮＡ：リポソーム比を達成した。この細胞をトランスフェクションの３日後に集めた。クロマトグラフィーアッセイ法を用いて抽出物からの正規化した蛋白質含有量をＣＡＴ活性で測定した。図１０。ＡＡＶプラスミド：リポソームでトランスフェクトされた末梢血液ＣＤ３４⁺幹細胞の薄層クロマトグラフィー。トランスフェクションの３日および７日後に細胞を集めた。クロマトグラフィーアッセイ法を用いて抽出物からの正規化した蛋白質含有量を、ＣＡＴ活性で測定した。図１１ａ〜ｂ。ＡＡＶプラスミドＤＮＡ：リポソーム複合体でトランスフェクトされたクローンからのゲノムＤＮＡの増強された化学ルミネッセンス（ＥＣＬ）サザーン分析。図１１ａにおいて、サンプルをＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＩＬ−２でプローブした。図１１ｂにおけるデータでは、サンプルをＢａｍＨＩで消化し、ＩＬ−２でプローブした。０.６８５ｋｂのバンドによって示されるように、分析したすベてのクローンはＩＬ−２遺伝子の存在を示した。図１１ａ〜ｂにつき：レーン１：１ｋｂ目盛レーン２：ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ（９ａ）およびＢａｍＨＩ／ｐｖｕＩＩ（９ｂ）で切断したプラスミドレーン３：トランスフェクトしていないＲ３３レーン４〜１１：クローン図１２ａ〜ｂ。クローン１Ａ１１および１Ｂ１１のサザーン分析（³²Ｐ）。サザーンブロッティングの後、図１２ａに示すフィルターをｐＡＣＭＶ−ＩＬ−２の０.６８ｋｂのＩＬ−２のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片でプローブした。図１２ａにつき、レーン１：ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断したクローン１Ａ１１レーン２：ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断したクローン１Ｂ１１レーン３：ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断したクローンＲ３３レーン４：ＢａｍＨＩで切断したクローン１Ａ１１レーン５：ＢａｍＨＩで切断したクローン１Ｂ１１レーン６：ＢａｍＨＩで切断したクローンＲ３３レーン７：ＨｉｎｄＩＩＩで切断したクローン１Ａ１１レーン８：ＨｉｎｄＩＩＩで切断したクローン１Ｂ１１レーン９：ＨｉｎｄＩＩＩで切断したクローンＲ３３レーン１０：ブランクレーン１１：ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＡＣＭＶ−ＩＬ２プラスミドレーン１２：ＨｉｎｄＩＩＩ／ｐｖｕＩＩで切断したｐＡＣＭＶ−ＩＬ２プラスミドレーン１３：ＢａｍＨＩ／ｐｖｕＩＩで切断したｐＡＣＭＶ−ＩＬ２プラスミド図１２ｂで示したデータは、フィルターを、プラスミドｐＡＣＭＶ−ＩＬ２の０.８５ｋｂのｐｖｕＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ（ＡＡＶＩＴＲ／ＣＭＶ）断片でプローブしたものである。レーン１：ｓｍａＩで切断したクローン１Ａ１１レーン２：ｓｍａＩで切断したクローン１Ｂ１１レーン３：ｓｍａＩで切断したクローンＲ３３レーン４：ｐｖｕＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断したクローン１Ａ１１レーン５：ｐｖｕＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断したクローン１Ｂ１１レーン６：ｐｖｕＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断したクローンＲ３３レーン７：ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＡＣＭＶ−ＩＬ２レーン８：ＨｉｎｄＩＩＩ／ｐｖｕＩＩで切断したｐＡＣＭＶ−ＩＬ２レーン９：ｓｍａＩで切断したｐＡＣＭＶ−ＩＬ２レーン１０：１ｋｂの目盛図１３。この図は、オートローガス（autologous）腫瘍とともに、ＩＬ−２形質導入した腫瘍とともに、およびＩＬ−２単独とともに増殖させた乳癌ＴＩＬのＲＮＡａｓｅ保護によるＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）レパートリー分析を示す。図中の軸については、Ｖ_βはＴＣＲのβ鎖の可変セグメントであり；Ｃ_βはＴＣＲのβ鎖の定常セグメントであり；水平軸上の、Ａ、ＢおよびＣは異なる患者を表す。図１４。本図は、乳癌腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）の増殖を示し；データはＩＬ−２遺伝子トランスフェクションの５日後に得た。図１５。本図は、ＩＬ−２についての遺伝子の代わりにネオマイシン耐性遺伝子およびＴｈｙ１.２遺伝子（ｐＭＰ６／ｎｅｏ／Ｔｈｙ１.２）を含有するｐＭＰ６プラスミドでトランスフェクトした乳癌ＴＩＬにおける遺伝子発現の効率を示す。ｐＭＰ６／ｎｅｏ／Ｔｈｙ１.２プラスミドはＤＤＡＢ：ＤＯＰＥリポソームで複合体とした。リポソーム組成は図１４に対応するデータのものと同一組成であった。図１６。本図は、種々のプラスミド構築物でトランスフェクションした後のトランスジーン発現のレベルおよび持続性を比較する。前立腺腫瘍細胞系Ｒ３３２７を標準的なプラスミド（ｐＢＣ１２／ＣＭＶ−ＩＬ２）またはプラスミド（ｐＡＣＭＶ−ＩＬ２）とＤＤＡＢ：ＤＯＰＥリポソームとを複合体としてトランスフェクトした。種々の時点で上清を集め、ＩＬ−２レベルをＥＬＩＳＡ法によってアッセイした。ＩＬ−２レベルは培養２４時間におけるｐｇ／ｍｌ／１０⁶細胞として表される。図１７。本図は、ＡＡＶプラスミド（ｐＡＣＭＶ−ＩＬ２）または標準的なプラスミド（ｐＢＣ１２／ＣＭＶ−ＩＬ２）のいずれかでトランスフェクトしたＲ３３２７細胞からの染色体ＤＮＡのサザーンブロット分析を示す。ブロットを、ＩＬ−２遺伝子の０.６８５ｋｂＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片でプローブした。Ｃはトランスフェクトしていない細胞からのＤＮＡである。ＩＬ−２インサートを最後のレーンで示す。図１８。この図は、前立腺細胞系Ｒ３３２７におけるＩＬ−２遺伝子のトランスフェクション効率についての細胞内アッセイの結果を示す。ＤＤＡＢ：ＤＯＰＥリポソーム（１：１または１：２組成）で複合体としたＡＡＶＩＬ−２プラスミドで細胞をトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞の細胞内ＩＬ−２蛋白質レベルを種々の時点で染色した。データはＩＬ−２蛋白質を発現するパーセント陽性細胞として表される。トランスフェクトされていない細胞を陰性対照として用い、対照の値をトランスフェクトした群の値から差し引いた。図１９ａ〜ｂ。本図は、放射線照射した腫瘍細胞系細胞（図１９ａ）による、および放射線照射した原発性乳腫瘍（図１９ｂ）によるＩＬ−２の発現を示す。原発性乳細胞および前立腺細胞系細胞をトランスフェクトし、致死的照射後の遺伝子発現についてアッセイした。照射２４、４８、７２および９６時間後に上清を集め、ＩＬ−２レベルをテストした。ＩＬ−２レベルは２４時間培養におけるｐｇ／ｍｌ／１０⁶細胞として表される。発明を実施するための態様本明細書で初めて、ウイルス形質導入を含まない系によってＡＡＶプラスミドＤＮＡの細胞への輸送を開示する。また、本開示による方法によって、ＡＡＶ物質を含むリポソームを使用することによって、いくつかの哺乳動物細胞タイプを効率的にトランスフェクトした。本開示はトランスフェクションに関するものであり、ＡＡＶプラスミド構築物をうまく形質導入すると共にリポフェクションのエレガントなキャリアー系を用いる。有利には、ｒｅｐおよびキャプシドトランス相補性、組換えウイルスまたは野生タイプＡＡＶの非存在下においてＡＡＶプラスミドＤＮＡを細胞に導入するのを容易とする手段としてカチオン性リポソームを用いる。本発明におけるリポフェクション方法は、遺伝子発現の効率を評価するために用いられた。本データによって、未修飾幹細胞、Ｔ細胞のような未修飾一次リンパ系細胞、種々の新たに単離した腫瘍細胞、および培養した哺乳動物細胞タイプを、ＤＮＡの一過性および持続性発現の双方が高効率に維持されてトランスフェクトする能力が確立された。腫瘍浸潤性リンパ球のような未修飾Ｔ細胞；未修飾幹細胞；腫瘍細胞系細胞；および原発性腫瘍細胞を効率的にトランスフェクトする能力は当該分野では最初に開示されるものである。Ｉ．原料および使用した方法Ａ．細胞系ラット前立腺細胞系（Ｒ３３２７）およびラット膀胱細胞系（ＭＢＴ−２）はＤｕｋｅ大学のEli Gilboa博士から入手した。両細胞系を、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地て維持した。細胞系２９３は、アデノウイルス５タイプによって形質転換されており、ＡＴＣＣから入手したヒト胚性腎臓細胞系である（Graham，F.L.ら「ヒト・アデノウイルス５タイプからのＤＮＡによって形質転換されたヒト細胞系の特徴（Characteristic s of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5）」、J．Gen．Virol．（１９７７）３６：５９〜７２）。細胞系２９３は、１０％ＦＢＳを補充したダルベッコの修飾イーグル培地で増殖させた。Ｂ．原発性腫瘍細胞の細胞調製原発性の肺、卵巣および３種の乳腫瘍細胞は患者の固形腫瘍から得た。腫瘍サンプルを細片に切り刻み、４５０ｕ／ｍｌコラゲナーゼＩＶ(Sigma)、１０.８Ｋ単位／ｍｌＤＮａｓｅＩ(Sigma)、および２０００ｕ／ｍｌヒアルロニダーゼＶ(Sigma)を補充した２００ｍｌのＡＩＭＶ培地(Gibco)中で消化した（Topolian，S.L.ら「免疫療法試行で用いるためのヒト腫瘍浸潤性リンパ球の増殖(Expansion of human tomor infiltrating lymphoc ytes for use in immunotherapy trials)」、J．Immunol．Methods（１９８７）１０２：１２７−１４１）。消化の１〜２時間後、細胞をガラス製ホモジナイザー(Bellco)でホモジナイズした。細胞を３回、ＤＰＢＳ−ＣＭＦ（Whittaker）で洗浄した。リンパ球を、ＡＩＳ MicroCELLector-CD5/8デバイス(ＡＩＳ，San ta Clara，CA)で捕獲し非リンパ系細胞から分離した。非吸着細胞（主として腫瘍細胞）を取り出し、２ｍＭＬグルタミン、１００ｕ／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシン、および１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０中で培養した。腫瘍細胞を２〜４週間培養しトランスフェクションした。Ｃ．末梢血液単核細胞の調製健康な対照患者からの末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Lymphoprep(Nycomed，ノルウェー)を用い、バフィコート(Stanford University Blood Bank，Stanford，CA)を用いて単離した。ＡＩＳ MicroCELLector(Applied Immune Sciences，Santa Clara，CA)（それに共有結合した（モノクローナル抗体のような）特異的蛋白質を有する表面を有するデバイス）を用い、Ｔ細胞、Ｔ細胞サブセット、またはＣＤ３４⁺細胞をさらに単離した。簡単にいうと、ＰＢＭＣを０.５％Gamimmune(Miles，Inc.，Elkh art，IN)中に１ｍｌ当たり１５×１０⁶細胞で再懸濁し、洗浄したＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ５／８、又はＣＤ３４ＡＩＳ MicroCELLectorにロードした。１時間後、吸着しなかった細胞をＡＩＳ MicroCELLectorsから取り除いた。完全培地、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭＬ−グルタミンおよび１００ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０(Whittaker)をＡＩＳ MicroCELLector中の吸着細胞に添加した。５％ＣＯ₂、３７℃湿潤環境下で２〜３日培養後、吸着細胞を取り出し、トランスフェクション用に調製した。Ｄ．プラスミドの調製本実験で用いた最初のプラスミドは（ｐＡＣＭＶ− ＩＬ２）であり；このプラスミドは、ＩＬ−２ｃＤＮＡとしてヒト・インターロイキン−２遺伝子（ＩＬ−２）、およびヒト・サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の即時性−初期プロモーター−エンハンサーエレメント、ならびにラットプレプロインスリンおよびＳＶ４０ポリアデニル化配列を含有し、両末端におけるアデノ関連ウイルス逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）によって挟まれている。（このプラスミドはJ．Rosenblatt博士(UCLA，CA)から入手可能；当該プラスミドについてのRosenblatt博士の命名はｐＳＳＶ９／ＣＭＶ−ＩＬ２である）。ｐＡＣＭＶ−ＩＬ２と同一であるが、ＡＡＶ末端反復配列を欠くプラスミドｐＢＣ１２／ＣＭＶ−ＩＬ２も対応する対照プラスミドとして使用した（図１）。第２の実験用プラスミドｐＡ１ＣＭＶＩＸ−ＣＡＴは、ＣＭＶ即時性−初期プロモーターエンハンサー配列、およびｐＯＧ４４(Stratagene)に由来するイントロン；細菌ＣＡＴ遺伝子；ＡＡＶ末端配列によって挟まれたＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナルをｐＢＲ３２２骨格中に含有していた（図１）。プラスミドｐＡＴＫ−βｇａｌおよびｐＡＡＤＡ−βｇａｌは、ＡＡＶプラスミド骨格中、各々ＴＫまたはＡＤＡプロモーターいずれかに連結したβｇａｌ遺伝子を含有していた（βｇａｌプラスミドはEli Gilboa博士(Duke Univ.)によって提供された）。本実験で用いたもう１つのプラスミドはｐＭＰ６であった。図２に示すごとく、ＩＬ−２ＤＮＡを含有するプラスミド（ｐＭＰ６−ＩＬ２）は二本鎖環状プラスミドである。このｐＭＰ６−ＩＬ２プラスミドは、ＣＭＶプロモーターの制御下にあるヒト・インターロイキン−２遺伝子およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを有する。このプロモーターとＩＬ−２のコード配列の間には、このプラスミドに挿入されたＩＬ−２またはいずれかの他の外因性遺伝子の発現を増強すると考えられるイントロン（ｐＯＧ４４(Stratagene)由来）がある。全発現カセットがアデノ関連ウイルスの左および右末端配列の間にある。また、このｐＭＰ６−ＩＬ２プラスミドはまたBluescript骨格を有し；この骨格はＣｏｌ−Ｅ１細菌の複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子を有し、イー・コリ(E．coli)におけるこのプラスミドの増殖を容易とする。図３ａ〜ｅは、ｐＭＰ６−ＩＬ２プラスミドのＤＮＡ配列を示し；パネルａないしｅは、配列の連続した部分を示す。図において、公知のＤＮＡ配列に対応するｐＭＰ６−ＩＬ２配列の部分が示されている；対応する配列情報はｐＭＰ６− ＩＬ２プラスミドについての配列情報の直接下にリストされている。印を付さない配列はリンカーからのものである。ＩＬ−２遺伝子を含有するが、ＡＡＶ成分を含有しない標準的プラスミド構築物も使用された。この標準的プラスミド構築物は、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）または即時性−後期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターと共にＩＬ−２遺伝子を有していた（ＡＴＣＣから得られた標準的プラスミド）。選択されたプラスミドについてのデータは表１に示す。全てのプラスミドは、アルカリ溶解および酢酸アンモニウム沈澱、続いてＤＮａｓｅを含まないＲＮａｓｅでの処理、フェノール／クロロホルム／イソアミル抽出および酢酸アンモニウム沈澱によって単離した（Ausubel，F.M.ら（分子生物学における現在のプロトコル）(Current Protocols in Molecular Biology)(J ohn Wiley.and Sons，Inc．１９９３)。Ｅ．リポソーム調製中性脂質ジオレイル−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＯＰＥ）(Avanti Polar Lipids)とカチオン性脂質ジオクタデシル−ジメチル−アンモニウム−ブロマイド（ＤＤＡＢ）(Sigma)とを組み合わせて小さな単層リポソームを調製した。脂質をクロロホルムに溶解した。丸底フラスコ中、ＤＤＡＢとＤＯＰＥとを１：１または１：２のモル比で混合し、脂質混合物をロータリーエバポレーターで乾燥した。滅菌二回蒸留水を添加して１ｍＭＤＤＡＢの終濃度として、脂質フィルムを再水和させた。この溶液を超音波処理浴(L aboratory Supplies，Hicksville，NY)中で清澄となるまで超音波処理した。リポソームをアルゴン下で４℃で保存した。静脈内投与によるリポソームのインビボ使用のために、１：４ないし１：５のＤＤＡＢ：ＤＯＰＥ比を用い；腹腔内投与には１：１ないし１：２の比を用いた。Ｆ．ウイルス感染を用いる形質導入のための組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）の調製組換えＡＡＶ株の調製のために、細胞系２９３の細胞を分け、ほぼ３０〜５０％密集まで増殖させた。その際、１ないし５の多重感染度で細胞をアデノウイルス５タイプで感染させ、３７℃でインキュベートた。２ないし４時間後、感染した細胞（０.５〜１×１０⁷細胞）を、１００ｍｍ組織培養ディシュ当たり、目的の遺伝子を含有するプラスミド１０μｇとｒｅｐキャプシド相補性プラスミドｐ ΔＢａｌ１０μｇでコトランスフェクトした。トランスフェクションにリン酸カルシウム共沈澱法を用いた（Hermonat，P．L.およびMuzyczka，N.，「哺乳動物ＤＮＡクローニングベクターとしてのアデノ関連ウイルスの使用。哺乳動物組織培養細胞へのネオマイシン耐性の形質導入(Use of adeno-associated virus a s a mammalian DNA cloning vector．Transduction of neomycin resistance in to mammalian tissue culture cells)」、Proc．Natl．Acad．Sci．USA（１９８４）８１：６４６６−６４７０）。トランスフェクションから１２ないし１８時間後、細胞から培地を除き１０％ＦＢＳを含む５ｍｌのＤＭＥＭ培地で置換した。トランスフェクション後４８から７２時間後、以下の手法に従ってＡＡＶを回収した：細胞および培地を一緒に回収し、３回凍結解凍して細胞を溶解した。次いで、細胞および培地の懸濁液を遠心分離して細胞残渣を除去し、上清を５６℃ で１時間インキュベートしてアデノウイルスを不活化した（Hermonat，P．L.およびN．Muzyczka，「哺乳動物ＤＮＡクローニングベクターとしてのアデノ関連ウイルスの使用。哺乳動物組織培養細胞へのネオマイシン耐性の形質導入(Use o f adeno-associated virus as a mammalian DNA cloning vector．Transduction of neomycin resistance into mammalian tissue culture cells)」、Proc．Na tl.Acad.Sci.USA （１９８４）８１：６４６６−６４７０；Tratschin，J.D.ら「哺乳動物細胞における遺伝子の高頻度組込、発現およびレスキューのためのアデノ関連ウイルスベクター（Adeno-associated virus vector for high frequency integration，expression，and rescue of genes in mammalian cells)、Mol.C ell．Biol．（１９８５）５：３２５１−３２６０）。熱不活化の後、ウイルス上清を酢酸セルロースフィルター（１.２μｍ）を通して濾過した。次いで、ウイルス株を−２０℃で貯蔵した。１ミリリットルのＡＡＶ上清を用いて１×１０⁶ 細胞を形質導入した。Ｇ．細胞トランスフェクション「リポフェクション」原発性腫瘍細胞およびラット腫瘍細胞系（Ｒ３３２７およびＭＢＴ−２）については、６ウェルディシュのウェル当たり２ｍｌの無血清培地中、１×１０⁶細胞を培養した。その後、５μｇのＡＡＶプラスミドＤＮＡと、各々、１：２のモル比のＤＤＡＢとＤＯＰＥとからなるリポソームとしての５ｎｍｏｌｅのＤＤＡＢとを混合した。無血清培地（０.５ｍｌ）をＡＡＶ：リポソーム複合体に添加し、次いで、これを細胞に導入した。リポフェクションを行うために、細胞を室温で５分間インキュベートし、次いで、ウシ胎児血清を細胞に補充して、５％ウシ胎児血清の終濃度とした。Ｔ細胞は、５〜１０×１０⁶細胞を、６ウェルディシュのウェル当たり１ｍｌの無血清培地中で培養した。５０μｇのプラスミドＤＮＡと、１：１のモル比のＤＤＡＢとＤＯＰＥとからなるリポソームとしての５０ｎｍｏｌｅのＤＤＡＢと混合した。次いで、トランスフェクション「リポフェクション」を腫瘍細胞と同様に行った。幹細胞は、１〜２×１０⁶細胞を、１０マイクログラムのプラスミドＤＮＡおよび１０ｎｍｏｌｅのリポソームを含む複合体でトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、幹細胞成長因子ＩＬ−３およびＩＬ−１を含有する培地で培養した。３および７日目に、細胞を回収し、抽出を行った。Ｈ．ＩＬ−２アッセイ細胞を計数し、１×１０⁶細胞を、２４ウェルプレートのウェル当たり１ｍｌ中で培養した。翌日、上清を集め、Quantikine IL-2 ELISAキット(R & D System s，Minneapolis，MN)を用いて評価した。ＩＬ−２レベルはピコグラム／ｍｌ上清と定義した。Ｉ．β−ガラクトシダーゼアッセイ Molecular Probes(Eugene，OR)から購入したFluoReporter ｌａｃＺ遺伝子融合検出キットを用いて、酵素加水分解生成物フルオレセインの蛍光を測定して、単一細胞におけるｌａｃＺ β−Ｄ−ガラクトシダーゼを定量した。ＡＡＶ／β −ｇａｌプラスミド（ｐＡＴＫ−βｇａｌおよびｐＡＡＤＡ−βｇａｌ）をこのキットに用いた。マーカー遺伝子ｂ−Ｄ−ガラクトシダーゼを発現する細胞中では、フルオレセインジ−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＦＤＧ）の酵素的切断によってフルオレセインが生成される。次いで、フローサイトメトリー(FACScan，Becton Dicki nson，San Jose，CA)を用いて細胞を分析した。ＩＩ．実験結果Ａ．ＡＡＶプラスミド：カチオン性リポソーム複合体を用いるＩＬ−２遺伝子発現のレベルＡＡＶプラスミドの遺伝子導入効率を評価するために、ＡＡＶプラスミドのＩＬ−２遺伝子導入効率を標準的プラスミド構築物の効率と比較した。この標準的プラスミドは、ＩＬ−２遺伝子の他にアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）プロモーター（ｐＡＤＡ−ＩＬ２）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター（ｐＴＫＩＬ−２）、または即時性−後期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（ｐＣＭＶ−ＩＬ２）を有していた。ＡＡＶＩＬ−２実験用プラスミド（ｐＡＣＭＶ−ＩＬ２）はＣＭＶプロモーター（即時性初期）を含有し、当該プロモーターの下流に位置するＩＬ−２遺伝子を有していた（図１）。図１に示すように、対応する対照プラスミドのｐＢＣ１２／ＣＭＶ−ＩＬ２構築物はｐＡＣＭＶ− ＩＬ２と同一であったが、ＡＡＶ末端反復配列（ＩＴＲ）を欠くものであった。比較のために、ＩＬ−２遺伝子を有する５つのプラスミド（ｐＡＣＭＶ−ＩＬ２、ｐＢＣ１２／ＣＭＶ−ＩＬ２、ｐＡＤＡ−ＩＬ２、ｐＴＫ−ＩＬ２、ｐＣＭＶ−ＩＬ２）をリポソームで複合体とし、２種の培養した腫瘍細胞系：ラット膀胱（ＭＢＴ−２）およびラット前立腺（Ｒ３３２７）細胞系に対するトランスフェクション効率をテストした。細胞系を、１×１０⁶細胞当たり、１０ｎｍｏｌｅのリポソームで複合体とした１０マイクログラムのプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。上清を３日目に集め、ＩＬ−２ＥＬＩＳＡキットを用いてＩＬ−２のレベルをテストした。ＡＡＶプラスミド（ｐＡＣＭＶ−ＩＬ２）は両細胞系において高レベルの発現を誘導した（図４ａ）。ＡＤＡプロモーターを持つＩＬ−２遺伝子（ｐＡＤＡ− ＩＬ２）は両細胞系において最小量の発現を誘導した。図４ａに示すように、ＴＫおよびＣＭＶ（即時性−後期プロモーター）ＩＬ−２構築物はともに、両細胞系において匹敵するレベルのＩＬ−２発現を誘導した。しかしながら、ＣＭＶ即時型−初期プロモーターを有するｐＢＣ１２／ＣＭＶ−ＩＬ２プラスミドは、膀胱細胞系と比較した場合、前立腺細胞系において高レベルの遺伝子発現を示した。テストしたプラスミドのうち、ＡＡＶＩＬ−２実験用プラスミドは両細胞系で最高レベルの発現を誘導し、前立腺細胞系では有意レベルの増加が観察された。前立腺細胞系Ｒ３３２７において対応する対照プラスミド（ｐＢＣ１２／ＣＭＶ−ＩＬ２）およびＡＡＶＩＬ−２実験用プラスミド（ｐＡＣＭＶ−ＩＬ２）によって誘導された発現の持続性を実験した（図４ｂ）。何の選択もすることなくこれらの培養物の発現を３０日まで評価した。細胞を１×１０⁶／ｍｌで植え、２４時間毎に分析用に上清を集めた。細胞は培養中、４８時間毎に倍加した。図４ｂにおけるデータは、発現の増強されたレベルに加え、発現の持続がＡＡＶプラスミド（ｐＡＣＭＶ−ＩＬ２）でトランスフェクションした後３０日間継続したことを示す。注目すベきは、有意な発現が、評価期間の全期間を通じて継続したことである。図４ｂに示すように、両プラスミドは、２日目および７日目の間に最大レベルの発現を誘導し、１５日目までには、ＩＬ−２レベルは低下し、次いで、ＡＡＶプラスミドでトランスフェクトした群ではほんの１００ｐｇ／ｍｌに維持されたに過ぎなかった。同様に、ＡＡＶプラスミド：リポソーム複合体をトランスフェクションで用いた場合、持続されたレベルの発現が、膀胱細胞系、ならびに原発性の肺、乳房および卵巣腫瘍からの細胞で観察された（図４ｂにデータを示さず）。Ｂ．ＡＡＶプラスミド：リポソームトランスフェクション「リポフェクション」および組換えＡＡＶ形質導入の比較前立腺および膀胱細胞系をトランスフェクトし、形質導入して、最適なＡＡＶ：リポソームトランスフェクションが最適な組換えＡＡＶ形質導入に匹敵するか否かを決定した。最適なトランスフェクションは、２ｍｌの最終容量中１×１０⁶ 細胞当たり１０マイクログラムのＡＡＶプラスミドＤＮＡを、１０ｎｍｏｌｅのリポソームで複合体としたものであった。最大ｒＡＡＶ形質導入のために、２ｍｌのウイルス上清を、完全培地１ｍｌ中の１×１０⁶細胞に添加した。２４時間後、細胞を洗浄し、新鮮な完全培地に再懸濁した。トランスフェクションおよび形質導入の後の種々の時点で上清を集めた。前立腺系においては（図５ａ）、トランスフェクションは、テスト条件下で（１×１０⁶細胞に対する２ｍｌのウイルス上清、対１０μｇＤＮＡ：１０ｎｍｏｌｅのリポソーム）、ＡＡＶ形質導入よりも高レベルの発現を誘導した。３日目ないし５日目についての結果はトランスフェクションしたＩＬ−２は約１０倍高いレベルを示したが、２０日目までには、トランスフェクトしたおよび形質導入した群双方で同等のレベルが観察された。組換えＡＡＶを用いる形質導入は、膀胱細胞系においてリポソームを用いるトランスフェクションと比較して、高レベルのＩＬ−２産生をまず誘導した（図５ｂ）。前立腺細胞系と同様に、トランスフェクションしたＩＬ−２レベルはこの期間に増加したにも拘わらず、膀胱細胞系の形質導入は２０日目までにはＩＬ− ２レベルの減少を示した；トランスフェクトしたおよび形質導入した群双方でＩＬ−２の同等のレベルが３３日間を通じて生じた。Ｃ．ＡＡＶプラスミドＤＮＡ：リポソーム複合体を用いる原発性腫瘍細胞のトランスフェクション本明細書に開示したこれまでの実験において、培養した細胞系で有意なトランスジーン発現が示された。カチオン性リポソーム：ＡＡＶプラスミドＤＮＡ複合体も新たに単離した原発性腫瘍細胞において匹敵するトランスジーン発現を介しているか否かを評価するために、４種の異なる原発性腫瘍をリポソームを用いてＡＡＶＩＬ−２実験用プラスミドでトランスフェクトした。腫瘍細胞を、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地で２〜３週間培養し、トランスフェクションした。細胞を１ｍｌ濃度当たり１×１０⁶細胞まで培養し、１０ｎｍｏｌｅのリポソームで複合体とした１０マイクログラムのＤＮＡでトランスフェクトした。上清を２日目および３日目に集めた。図６に示すように、全ての４種の原発性細胞タイプはトランスフェクション後に有意レベルのＩＬ−２を産生した。最高レベルの発現が１０日間の実験期間中、３日目に観察された（肺および１つの乳サンプルを長期間調べた）。培養中、トランスフェクション後２５日間、肺の腫瘍細胞および１つの乳房腫瘍の細胞においてＩＬ−２遺伝子発現を追跡した。１５日目のレベル（１００ｐｇ／ｍｌＩＬ−２）は、両細胞系、および原発性腫瘍に由来する細胞で同等であった（データは示さず）。Ｄ．トランスジーン発現に対する致死的照射の効果遺伝子発現に対する照射の効果を測定するために、前立腺細胞系（図７ａ）および原発性乳腫瘍（図７ｂ）をトランスフェクトし、致死的照射後の遺伝子発現を評価した。最適なＡＡＶプラスミド：リポソーム複合体を用いて両細胞タイプをトランスフェクトした。トランスフェクション後２日目に、各培養のアリコットに対して⁶⁰Ｃｏ照射器を用いて６０００ラドの処理を行い、それにより、細胞分裂を停止させ、次いで、このアリコットを更に培養した。各培養物の１／２を非照射対照として維持した。このアリコットに対して⁶⁰Ｃｏ照射器を用いて６０００ラドの処理を行い、この間、ＩＬ−２の発現レベルはほぼ３００〜４００ｐｇ／ｍｌであった。照射の２４、４８、７２および９６時間後、上清を集め、次いでＩＬ−２レベルをテストした。図７ａ〜ｂに示すように、トランスフェクション後の致死的照射は、トランスジーン発現を阻害しなかった。前立腺細胞系も原発性腫瘍細胞もいずれも照射後にＩＬ−２発現の変化を示さなかった。このように、細胞分裂は停止されたが、ＩＬ−２分泌は照射に対して感受性ではなかった。これは有利である。というのは、多くの遺伝子療法戦略は一次Ｔリンパ球（これは、一般に、活性化しなければ分裂しない）に対する遺伝子送達に関係しているが、しばしば、ウイルス感染を介して形質導入できないからである。Ｅ．ＡＡＶプラスミド：リポソーム複合体の使用によるβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子発現のレベル細胞ベース当たりの発現レベルを示すために、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子をトランスフェクション実験で用いた。２つのＡＡＶ β−ｇａｌプラスミド（ｐＡＴＫ−βｇａｌおよびｐＡＡＤＡ−βｇａｌ）（Duke UniversityのEli G ilboa博士から得たプラスミド）の各々をカチオン性リポソームで複合体とし、前立腺細胞系のトランスフェクションに用いた。１０マイクログラムのｐＡＴＫ −βｇａｌあるいはｐＡＡＤＡ−βｇａｌプラスミドＤＮＡを１０ｎｍｏｌｅのリポソームで複合体とし、次いで、複合体を用いて２ｍｌ容量中、１×１０⁶細胞をトランスフェクトした。種々の時点で、ほぼ５×１０⁵細胞を回収し、蛍光基質ＦＤＧで染色し、フローサイトメトリーを用いて分析した。最大のトランスジーン発現は７日目および１５日目の間で観察された（図８）。有意レベルのβ−ｇａｌ活性が２５日間を通じて観察された。β−ｇａｌ陽性細胞のフローサイトメトリー分析は、両プラスミド構築物で１０ないし５０％のトランスフェクション効率の最大レベルを示した。このレベルは、２５日目までに５〜１０％まで低下した。発現のパターンおよび持続性は前記したＩＬ−２発現のものと同様であった。Ｆ．新たに単離した末梢血液Ｔ細胞亜集団におけるＡＡＶプラスミド：リポソーム複合体によって誘導されたトランスジーン発現新たに単離したヒト末梢血液Ｔ細胞集団をトランスフェクトする場合におけるＡＡＶプラスミド：リポソーム複合体の効果を調ベた。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）酵素の遺伝子を、ｐＡ１ＣＭＶＩＸ−ＣＡＴプラスミド（図１）におけるレポーター遺伝子として用いた。このｐＡ１ＣＭＶＩＸ−ＣＡＴ構築物は、ＡＡＶ骨格（ｐＡ１）とＣＭＶ即時型−初期プロモーターエンハンサー配列およびＣＡＴ遺伝子とを用いて作製した。Ｔ細胞の合計したおよび精製したＣＤ４⁺およびＣＤ８⁺亜集団をトランスフェクションに用いた。合計した（選択したＣＤ３またはＣＤ５／８）および精製した（選択したＣＤ４またはＣＤ８）Ｔ細胞の亜集団双方（図９ａ〜ｄ）、ならびにＣＤ３４⁺幹細胞（図１０、後記するセクションＧに記載）は、有意レベルのＣＡＴ遺伝子発現を示した。末梢血液から新たに単離した一次Ｔ細胞について、ＡＡＶプラスミドＤＮＡ：リポソーム複合体を用いて、トランスジーン発現をテストした。ＣＤ３⁺Ｔ細胞、ＣＤ５／８選択Ｔ細胞（合計Ｔ細胞）、Ｔ細胞のＣＤ４⁺亜集団、およびＴ細胞のＣＤ８⁺亜集団からのＣＡＴ活性についての薄層クロマトグラフィーアッセイの結果を、各々、図９ａ〜ｄに示す。Ｔリンパ球は、ＡＩＳ MicroCELLectorデバイスを用い、ＣＤ３⁺、またはＣＤ５／８⁺またはＣＤ４⁺またはＣＤ８⁺集団として分画した。関連細胞を捕獲し、吸着しなかった細胞を洗浄・除去した。吸着した細胞をＲＰＭＩ−１６４０および１０％ＦＢＳで培養し、２日後にデバイスから取り出した。５ないし１０× １０⁶細胞を培養し、５０マイクログラムのＡＡＶプラスミドＤＮＡおよび１：１または１：２のＤＮＡ：リポソーム比となるように、５０または１００ｎｍｏｌｅのリポソームでトランスフェクトした。細胞をトランスフェクション３日後に集め、細胞抽出物を蛋白質含有量によって正規化し、クロマトグラフィーアッセイを用いてＣＡＴ活性を測定した。ＡまたはＢという供血者から血液を得た。供血者ＡまたはＢの末梢血液を用いてＴ細胞を単離し、トランスフェクションした。図９ａ〜ｄに示すように、ＡＡＶを含むリポソームの脂質組成を、リポソームに対するＤＮＡの比の場合のように変化させた。ＣＤ３⁺Ｔ細胞（図９ａ）の実験において、１人の供血者（供血者Ａ）からの細胞を使用した。後記する、ＣＤ５／８選択T細胞（図９ｂ）、Ｔ細胞のＣＤ４⁺亜集団（図９ｃ）、Ｔ細胞のＣＤ８⁺亜集団（図９ｄ）、およびＣＤ３４⁺幹細胞（図１０）の実験については、２人の患者（供血者Ａおよび供血者Ｂ）に由来する細胞を利用した。図９ａ〜ｄで示した実験では、合計および精製亜集団双方において２日目および３日目に最大レベルの発現が観察された。有意レベルの発現が1４日目まで検出された。トランスフェクション３日後に細胞を集め、各抽出物から蛋白質含有量を正規化してＣＡＴ活性について分析した。同一のリポソーム組成、およびリポソームに対するＤＮＡの比においては、すベての集団で同様のレベルの発現を誘導した。Ｇ．新たに単離したＣＤ３４⁺幹細胞においてＡＡＶプラスミド：リポソーム複合体によって誘導されたトランスジーン発現新たに単離したヒト末梢血液ＣＤ３４⁺幹細胞をトランスフェクトする場合におけるＡＡＶプラスミド：リポソーム複合体の効果を調べた。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）酵素遺伝子を、ｐＡ１ＣＭＶＩＸ− ＣＡＴプラスミドにおけるレポーター遺伝子として用いた（図１）。このｐＡ１ＣＭＶＩＸ−ＣＡＴ構築物は前記のように作製した。ＣＤ３４⁺幹細胞からの薄層クロマトグラフフィーによって測定したＣＡＴ発現のレベルを図１０に示す。新たに単離したＣＤ３４⁺末梢血液幹細胞をＡＡＶＣＡＴプラスミド：リポソーム複合体でトランスフェクトした。ＣＤ５／８ MicroCELLectorデバイスを用いて実質的に全てのＴ細胞を除去した後、ＡＩＳＣＤ３４ MicroCELLector を用いて、ＣＤ３４⁺細胞を末梢血液から精製した。幹細胞をデバイスから取り出し、１０マイクログラムのプラスミドＤＮＡおよび１０ｎｍｏｌｅのリポソームを含む複合体で０.５〜１×１０⁶細胞をトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、幹細胞成長因子、ＩＬ−３およびＩＬ−１を含有する培地で培養した。３日目および７日目に、細胞を集め、抽出を行った。抽出物蛋白質含有量を正規化し、ＣＡＴ活性を分析した。図１０に示すように、ＣＤ３４⁺末梢血液幹細胞において有意レベルのＣＡＴ遺伝子発現があった。Ｈ．組込み実験図１１ａ〜ｂは、本発明に従ってＡＡＶプラスミドＤＮＡ：リポソーム複合体でトランスフェクトした安定なクローン（少なくとも３０日を超えて安定なクローン）からのゲノムＤＮＡの増強された化学ルミネッセンス（ＥＣＬ）サザン分析を示す。ゲノムＤＮＡを単離し、ＥＣＬ直接核酸標識および検出システム(Ame rsham)を用いて分析した。ＩＬ−２プローブはｐＡＣＭＶ−ＩＬ２の０.６８５ｋｂのＩＬ−２遺伝子から調製した。ハイブリダイゼーション後、５５℃１０分間、０.５×ＳＳＣ／０.４％ＳＤＳで２回、および室温５分間、２×ＳＳＣで２回、膜を洗浄した。図１１ａにおいて、サンプルをＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＩＬ−２でプローブした。図１１ａに示すように、全てのクローンはＩＬ−２遺伝子の存在を示したがこれは、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ消化のゲノムＤＮＡにおける０.６８５ｋｂバンドによって示される。図１１ｂ中のデータについては、サンプルをＢａｍＨＩで消化し、ＩＬ−２でプローブした。再度、全てのクローンはＩＬ−２遺伝子の組込みを示した（図１１ｂ）。図１１ｂにおいて、ＩＬ−２の組込みは、高分子量のバンド（１.６および２ｋｂの間）、消化により得られた宿主ゲノム物質の付着と関連した遺伝子の組込みに合致するバンドによって示された。図１１ｂのデータは、１を超える組込み部位があることを示すが、これは、ＢａｍＨＩ消化のゲノムＤＮＡには複数の高分子量バンドがあることによる。さらに、組込み部位は、消化したクローンにおける異なるサイズのバンドによって示されるように、異なるクローンにおいて異なる位置であることが示された（図１１ｂ）。図１２ａ〜ｂは、本実験から得られた２つのクローンの、³²Ｐサザンアッセイを用いる、染色体ＤＮＡ分析を示す。Hirtの分画プロトコルを用いて、核ＤＮＡを２つのＩＬ−２クローン（１Ａ１１および１Ｂ１１）から単離した。陰性対照として、Ｒ３３２７細胞系のトランスフェクトされていない細胞からトータルＤＮＡを単離した。制限酵素消化の後、各サンプルの１０マイクログラムを適当なプラスミドの対照と共に、１％アガロースゲルに負荷し、電気泳動し、変性し、 Hybond＋膜に移した。ランダムプライミングによって、フィルターを³²Ｐで標識したＤＮＡ断片と、６８℃で一晩ハイブリダイズさせた。次いで、６８℃で２× ３０分間、各々２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳおよび０.２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで膜を洗浄した。これらのフィルターのオートラジオグラムをＸ−線フィルムに暴露した。図１２ａにおいて、ＩＬ−２遺伝子を再度プローブとして用いた。そして、サザーンブロッティングの後、図１２ａに示すフィルターをｐＡＣＭＶ−ＩＬ２の０.６８ｋｂのＩＬ２ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片でプローブした。図１２ａに示すデータは、クローンに組み込まれたＩＬ−２遺伝子のコピー数はクローン間で変化することを示し；この知見は、２つのクローンの細胞の（図面の簡単な説明で特定した）消化物の０.６８５ｋｂバンドの種々の濃度によって証明された。さらに、高分子量のバンドも示され、これは、種々の消化プロトコルから得られた宿主ゲノム物質と共に、ＩＬ−２遺伝子の組込みと合致する。図１２ｂに示されたデータについては、フィルターを、プラスミドｐＡＣＭＶ −ＩＬ２の０.８５ｋｂｐｖｕＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ（ＡＡＶＩＴＲ／ＣＭＶ）断片でプローブした。図１２ｂにおけるデータは、右側ＡＡＶＩＴＲの存在を示す。これはｓｍａＩおよびｐｖｕＩＩ消化の染色体ＤＮＡにおける０.８ｋｂバンドによって示される。１つのクローン（クローンＡ）における左側ＡＡＶＩＴＲの存在は、ｓｍａＩおよびｐｖｕＩＩ消化の染色体ＤＮＡにおける２. １ｋｂバンドによって示された。ＩＩＩ．実施例ＡＡＶウイルス物質を含むリポソームを利用する本発明の方法を用いて、サイトカイン、Ｂ７のような共刺激性分子、およびＭＨＣクラスＩ抗原を有する分子の遺伝子を種々の細胞タイプに送達する。例えば、このようなゲノム物質を原発性腫瘍細胞または腫瘍細胞系に送達して腫瘍ワクチンを生産でき；末梢血液または骨髄細胞に送達して血液学的および新形成疾患を治療し得る。ＡＡＶウイルス物質を含有するリポソームを用いることを含む本発明の方法を用いて、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびＲＮＡのような物質の遺伝子を送達する。このようなペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびＲＮＡの発現に際し、被験者の免疫応答が調節され得る。免疫応答の調節は、免疫応答の誘導または免疫応答の阻害の調節のいずれかである。従って、本発明の方法に従って発現されたアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、またはリボザイムを用いることによって、ＨＩＶ感染が治療される。さらに、腫瘍に対する免疫学的応答は、本発明に従って発現されたペプチドまたはＲＮＡを使用することによって調節される。患者の免疫応答は、腫瘍特異的および／または腫瘍− 関連抗原に応答するように調節される。従って、非免疫原性腫瘍を修飾して免疫原性腫瘍とし、これは、インビボおよびインビトロ双方において、細胞溶解性Ｔ細胞応答を誘導する。本発明の方法を用いて、遺伝子を、Ｂ細胞またはＴ細胞のような一次リンパ系細胞に送達する。本発明による別の方法を用いて、遺伝子物質をＣＤ３４⁺幹細胞に送達する。従って、当業者に認識されるように、遺伝子が発現され、それを、目的の遺伝子の発現が望まれる、ＨＩＶ感染のような疾患、遺伝子欠陥の疾患、新形成、および自己免疫疾患の治療に用い得る。例えば、悪性新形成疾患については、ＭＤＲＩ遺伝子は本発明に従って送達され、発現され、治療効果を奏する。さらなる例において、ＣＤ８⁺細胞はＡＩＳ MicroCELLectorで選択される。ＣＤ８⁺細胞用の原料はＨＩＶ患者では末梢血液、新形成を有する患者では腫瘍サンプルである。次いで、Ｔ細胞を、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）などを用いて当該分野で知られている方法に従って活性化する。活性化された細胞を２０日間増殖させる。その後、本発明に従って、ＩＬ−２ゲノム物質を含むＡＡＶ：リポソーム複合体で細胞をトランスフェクトする。トランスフェクトされた細胞を患者に戻す。このようにすると、その細胞障害性Ｔ細胞活性を維持するために患者への引き続くＩＬ−２の投与が減少される。有利なことには、本発明に従って投与されるＩＬ−２遺伝子は、従前患者に全身投与されていたＩＬ−２量を減少し得る。全身投与されるＩＬ−２量の減少は、全身投与されるＩＬ−２が致死的用量関連毒性と関係するので、有利である。Ａ．腫瘍ワクチン接種典型的には、腫瘍ワクチン接種プロトコルは非増殖性新形成細胞を使用する。新形成細胞の増殖は、細胞を照射することによって、あるいは細胞を高圧チャンバーで処理することによって防止される。新形成細胞が体内に存在する場合、最初の腫瘍塊または病巣とは別に、身体は効果的な抗腫瘍反応を起こすことができると信じられている。遺伝子修飾した腫瘍（ＧＭＴ）を用いて腫瘍細胞抗原性を増強するために、黒色腫および腎臓細胞癌を持つ患者に、ある種の腫瘍ワクチン接種試行が行われてきた；これらの試行は、エクスビボ・レトロウイルス遺伝子移入に頼ってきた。エクスビボ・レトロウイルス遺伝子移入は、行うのが非常に複雑な方法であり、送達された遺伝子の組込みおよび発現を達成するためには活性な標的細胞の分裂がなければならないという不利に悩まされている。さらに、十分な量の新形成細胞をエクスビボ培養し、適量の治療用産物を提供するのは非常に困難となる可能性がある。レトロウイルス遺伝子移入とは対照的に、形質導入すベき遺伝子に対して３’ および５’側の位置にアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）の末端反復配列エレメントを有するプラスミド構築物は、非ウイルス・リポソーム媒介移入によって導入された場合に効率的に発現される。例えば、後記にて詳細に検討するように、インターロイキン−２のｃＤＮＡを含むＡＡＶプラスミド（例えば、ｐＭＰ６−ＩＬ２）を原発性ヒト腫瘍細胞（黒色腫細胞）に送達した。次いで、原発性腫瘍細胞はインターロイキン−２を発現した。腫瘍細胞系も効果的にトランスフェクトされた。ＡＡＶ−リポソームトランスフェクションの使用によって得られたＩＬ−２の発現は持続性であって、高レベルであった。ＡＡＶプラスミド−リポソーム組成物によって遺伝子修飾された細胞からのサイトカイン分泌のレベルは、レトロウイルスにより感染された細胞から得られたレベルを越えていた。従って、ＡＡＶプラスミドおよびリポソームを含む組成物の使用によって細胞は遺伝子修飾され；これらの遺伝子修飾細胞は治療用腫瘍ワクチン接種法で利用される。有利なことには、ＡＡＶプラスミドおよびリポソームを含む組成物の使用による遺伝子修飾は、原発性腫瘍細胞が修飾されるのを可能とし、それにより、本開示前には必要であった遺伝子修飾を行うために原発性腫瘍細胞からの腫瘍細胞系を確立する一般的必要性を無くした。また、遺伝子修飾されＩＬ−２を発現する腫瘍細胞は全身系のＩＬ−２と共に投与されるベき必要がないことはさらに有利である；全身系のＩＬ−２は、胎児であっても、極度に重篤な副作用を誘導することが知れられている。Ｂ．治療用投与で用いるトランスジーンＤＮＡでの細胞のリポフェクション全身系のＩＬ−２は、悪性新形成のようなある種の重篤な疾患のための現行の治療法である。加えて、活性化されたＴ細胞は、インビトロおよびインビボ双方での増殖および生存に関して外因性ＩＬ−２に依存するようになる。ＩＬ−２刺激を無くしたら、Ｔ細胞は数日内にアポトーシス（ＤＮＡ断片化）を受ける。しかしながら、全身投与されたＩＬ−２は死亡を含めた重篤な副作用を引き起こすことが知られている。従って、ＩＬ−２の全身投与の必要性を無くするまたは減少させる療法を開発する必要がある。以下のデータよって表される実験は、ウイルス形質導入を含まない系によってＡＡＶプラスミドＤＮＡおよびトランスジーンＤＮＡのＴ細胞への輸送を目指したものであった。より詳しくは、本データはトランスフェクションに関し、リポフェクションのエレガントなキャリアー系およびＡＡＶプラスミド構築物の熟達した形質導入能力を利用した。従って、トランスジーンおよびＡＡＶ末端反復配列を含有するＡＡＶプラスミドをＤＮＡベクターとして使用し、カチオン性リポソームをキャリアー分子として使用した（Ｔリンパ球におけるトランスフェクションおよび発現の一般的議論については、Philip，R．らMol．Cell．Biol．（１９９４）１４（４）：２４１１−２４１８参照）。好ましい実施態様において、トランスジーンはＩＬ−２である。ＡＡＶプラスミド：リポソーム複合体は、組換えＡＡＶ形質導入によって得られたレベルと匹敵するトランスジーン発現のレベルを誘導した。有利なことには、カチオン性リポソームは、ｒｅｐおよびキャプシド・トランス相補性、組換えウイルスまたは野生タイプＡＡＶの非存在下で、ＡＡＶプラスミドＤＮＡの細胞への侵入を容易とした。ＡＡＶプラスミドＤＮＡ：リポソーム複合体はＴＩＬ細胞を効率的にトランスフェクトした。リポソームと複合体化したＡＡＶプラスミドＤＮＡは、標準的なプラスミドでの複合体よりも数倍高いレベルの発現を提供した。さらに、発現はいずれの選択も無くして、３０日間持続した。本明細書で開示するＴ細胞についてのＩＬ−２遺伝子発現系は、活性化された細胞が十分な内因性ＩＬ−２を産生して、インビボでその維持を支持するのを可能とし、それにより、アポトーシスが防止され、ＩＬ−２を全身投与する必要がない。制御された実験において、種々のＴ細胞集団を、リポソームと複合体化したＩＬ−２ｃＤＮＡを有するＡＡＶプラスミドでトランスフェクトした；これらの集団を、インビトロで外因性ＩＬ−２無しで成長および増殖を維持する能力につきテストした。Ｔ細胞については、アッセイの結果は、ＩＬ−２遺伝子でトランスフェクトすると、一次の活性化ＣＤ８⁺Ｔ細胞は、無関係の遺伝子でトランスフェクトした対照のそれよりも高いレベルまで増殖したことを示した。ＩＬ−２でトランスフェクトされたＣＤ８⁺の増殖レベルは外因性ＩＬ−２が無くとも維持され、アポトーシスは有意に減少した。これらのトランスフェクトしたＴ細胞のサザンブロット分析は、２５日目まで、ＩＬ−２プラスミドの存在を示した。本データは、エクスビボで活性化され増殖したＣＤ８⁺細胞へのＩＬ −２遺伝子導入はかかる細胞の増殖を支持し、外因性のＩＬ−２が無くてもアポトーシスを防止した。遺伝子修飾され得る細胞は、原発性肺、卵巣および乳房癌；黒色腫；オートローガス繊維芽細胞；形質転換Ｂ細胞；樹状細胞；および細胞系の細胞を含むが、これらに限定されるものではない。これらのような遺伝子修飾された細胞は、単独で、または腫瘍細胞と組み合わせて使用され、ＴＩＬを刺激し得る。遺伝子修飾された細胞は、培養中に腫瘍関連抗原（例えば、ＨＥＲ２、Ｋ−ｒａｓ、ムチン）を発現しＴＩＬ刺激のため抗原を提示する。さらに、形質転換Ｂ細胞および樹状細胞のような抗原提示細胞は遺伝子修飾され得、ＭＡＧＥ−１およびＭＡＲＴ−１のような腫瘍関連抗原性ペプチドを発現して、培養中にＴＩＬ刺激のために抗原提示を提供し得る。本データは、Ｔ細胞および新形成細胞をトランスフェクトし、ＤＮＡの一過性および持続性の双方の発現を高効率で行う能力を確立する。トランスフェクションは、（アデノウイルス感染細胞におけるｒｅｐおよびキャップキャプシド粒子から産生可能な）いずれの組換えウイルスの非存在下でも起こった。ＡＡＶトランスフェクションによって得られた細胞は患者を治療するのに使用される。かかる細胞で治療した患者は顕著な治療効果を得る。１．反応物の調製および使用したプロトコールａ．プラスミドｉ．プラスミドｐＡＣＭＶ−ＩＬ２プラスミド（ｐＡＣＭＶ−ＩＬ２）は、両端のアデノ関連ウイルス逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）によって挟まれた、ＩＬ−２ｃＤＮＡとしてのヒト・インターロイキン−２遺伝子（ＩＬ−２）、およびヒト・サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の即時性−初期プロモーター−エンハンサーエレメント、ならびにラットプレプロインスリンおよびＳＶ４０ポリアデニル化配列を含有する。対応する対照プラスミドｐＢＣ１２／ＣＭＶ−ＩＬ２は、ＡＡＶ末端反復配列を欠く以外はｐＡＣＭＶ−ＩＬ２と同一であった。図１はｐＡＣＭＶ−ＩＬ２およびｐＢＣ１２／ＣＭＶ−ＩＬ２のプラスミド地図を示す。ｉｉ．プラスミドｐＭＰ６−ＩＬ２図２に示すように、プラスミドｐＭＰ６−ＩＬ２は二本鎖環状プラスミドである。このｐＭＰ６−ＩＬ２プラスミドはＣＭＶプロモーターおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルの制御下にあるインターロイキン−２遺伝子を有する。このプロモーターとＩＬ−２のコード配列との間には、ＩＬ−２の発現を増強するイントロンがある。全体の発現カセットはアデノ関連ウイルスの左側および右側末端配列の間にある。このｐＭＰ６−ＩＬ２プラスミドはBluescript骨格も有し；この骨格はＣｏｌ−Ｅ１細菌複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子を有し、イー・コリ(E．coli)でのこのプラスミドの増殖を容易とする。図３ａ〜ｅは、ｐＭＰ６−ＩＬ２プラスミドのＤＮＡ配列を示し；ａないしｅのパネルは配列の連続的部分を示す。この図において、公知のＤＮＡ配列に対応するｐＭＰ６−ＩＬ２配列の部分が示されており；対応する配列情報はこのｐＭＰ６−ＩＬ２プラスミドについての配列情報の直接下にリストする。印を付さない配列はリンカーからのものである。ｐＭＰ６−ＩＬ２プラスミドはアルカリ溶解および酢酸アンモニウム沈澱によって精製された。核酸の濃度は２６０ｎｍにおけるＵＶ吸収によって測定した。ｉｉｉ．プラスミドｐＡ１ＣＭＶＩＸ−ＣＡＴプラスミドｐＡ１ＣＭＶＩＸ−ＣＡＴは、ｐＢＲ３２２誘導体中で、ＡＡＶ末端反復配列によって挟まれた、ＣＭＶプロモーターエンハンサーエレメント、介在するスプライスアクセプター配列、細菌性クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子およびシミアンウイルス５４０後期ポリアデニル化シグナルを含有する。プラスミドはアルカリ溶解および酢酸アンモニウム沈澱によって精製した。核酸濃度は２６０ｎｍにおけるＵＶ吸収によって測定した。ｂ．リポソーム調製ｉ．ｐＡＣＭＶ−ＩＬ２と共に用いたリポソーム小さな単層リポソームをカチオン性脂質、ジオクタデシル−ジメチル−アンモニウム−ブロマイド（ＤＤＡＢ）(Sigma)と中性脂質、ジオレオイル−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＯＰＥ）(Avanti Polar Lipids)とを組み合わせて調製した。脂質をクロロホルムに溶解した。丸底フラスコ中、ＤＤＡＢを１：１モル比でＤＯＰＥと混合した。脂質混合物をロータリーエバポレーターで乾燥した。滅菌二回蒸留水を添加して最終濃度１ｍＭＤＤＡＢとして脂質フィルムを再水和させた。この溶液を超音波処理浴（Laboratory Supplies，Hicksville ，NY)中、清澄となるまで超音波処理した。リポソームをアルゴン下、４℃で貯蔵した。ｉｉ．ｐＭＰ６−ＩＬ２と共に使用したリポソームリポソームは、１：１のモル比でカチオン性脂質ジオクタデシル−ジメチル− アンモニウム−ブロマイド（ＤＤＡＢ）と中性脂質ジオレオイル−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＯＰＥ）とを混合するか、あるいはＤＤＡＢを１：０ .６のモル比でコレステロールと混合し、ロータリーエバポレーターで脂質を蒸発乾固することによって調製した。脂質を滅菌脱イオン水に再懸濁して濃度１ｍＭＤＤＡＢとし、次いで、超音波処理して超音波浴中で清澄化した。リポソームをアルゴン下、４℃で貯蔵し；少なくとも４カ月安定であった。ｉｉｉ．ＴＩＬ刺激で使用したリポソームリポソームは、カチオン性脂質（ＤＤＡＢ）と中性脂質（ＤＯＰＥ）またはコレステロールとを１：１または１：２のモル比で混合し、ロータリーエバポレーターで脂質を蒸発乾固することによって調製した。脂質を滅菌脱イオン水に再懸濁して濃度を１ｍＭＤＤＡＢとした。次いで、溶液を超音波処理して、超音波浴中で清澄化した。リポソームをアルゴン下、４℃で貯蔵し、少なくとも４カ月安定であった。ｃ．細胞調製ｉ．ＴＩＬ細胞の単離から採取した腫瘍またはリンパ系サンプルであった。次いで、Ｔ細胞を、ＩＬ− ２の使用などによって、当該分野で公知の方法で活性化した。活性化細胞を２０日間増殖させた。ｉｉ．Ｔ細胞および新形成細胞の単離一次Ｔ細胞集団は末梢血液単核細胞から単離し、ＴＩＬおよび腫瘍細胞はデバ標準的な方法に従って細胞を調製しトランスフェクションに用いた。１）固形組織源からの新形成細胞トランスフェクトされる細胞集団を得るために、細胞を固形原発性または転移性病巣から、あるいはリンパ系組織から得た。例えば、乳腫瘍のバイオプシーは、手術前診断にて難治性または再発性乳癌の疑われる手術を受けた患者から得た。また、これらの研究は、卵巣腫瘍の細胞で首尾よく行われた。バイオプシー組織コアを、光学顕微鏡および免疫組織化学的に分析して、一般的病理学的方法で処理した断片にて分割した。新たに切り出した腫瘍を０.５ｃｍ立方に切断した。１０までの腫瘍キューブを、ＡＩＭＶ培地(GIBCO)２５ｍｌを含有する２５ｍｌの回転フラスコに移した。フラスコを５％ＣＯ₂を含有する３７℃のインキュベーターに入れた；フラスコを１００〜１２０ＲＰＭで１２〜１８時間ゆるやかに撹拌した。インキュベーション後、ばらばらにならなかった組織を濾過し、次いで、懸濁液中の細胞をペレット化した。ペレット化した乳癌細胞を、ＡＩＭＶ培地で組織培養フラスコ (Falcon)に入れた。細胞を、５％ＣＯ₂を含有する湿潤空気中、３７℃の温度で維持した。無血清培地で４８時間培養後、非吸着細胞を吸引することによって吸着および非吸着細胞系を得た。非吸着細胞を洗浄し、次いで、新鮮なフラスコ中で再培養した。再培養の間、吸着細胞を密集するまで増殖させ、０.０５％トリプシンおよび０.０２％ＥＤＴＡでトリプシン処理し、高細胞密度で継代して新しいフラスコに入れた。別法として、肺、卵巣および乳房起源の原発性腫瘍細胞を、固形腫瘍サンプルから得、以下のように単離した：この腫瘍を細かく刻み、２時間の酵素消化に付した。次に、組織をモホジナイズしＰＢＳで洗浄した。リンパ球を、ＡＩＳ Mic roCELLector-ＣＤ５／８デバイスへの捕獲によって、非リンパ系細胞から分離した。非吸着集団は腫瘍細胞を含有し、これをＬ−グルタミンおよびｐｅｎ／ｓｔｒｅｐを有するＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ中で培養した。２）体液源からの新形成細胞最後にトランスフェクトされる細胞の別のソースとして、悪性腹水液または腹膜滲出物を用いて、オートローガスな新形成細胞を単離した。悪性腹膜または滲出液を遠心分離し、細胞を含有するペレットをＡＩＭＶ培地に再懸濁した。細胞を計数し、２ステップのフィコールグラジエントを用いて、あるいはＡＩＳＣＥＬＬｅｃｔｏｒ^TMＣＤ５／ＣＤ８デバイスを用いて、リンパ球亜集団を除いた。フィコールグラジエントを用いるかまたはＡＩＳＣＥＬＬｅｃｔｏｒ^TMＣＤ５／ＣＤ８デバイスを用いるかの選択は、当業者に認識されているように、合計細胞数を考慮して行った。体液源からの新形成細胞の単離は、腹膜滲出物に関連することがよく知られている卵巣および肺癌のような悪性疾患に特に関係する。Ｔ細胞除去画分を増強し新形成細胞とした。すベてのオートローガスな新形成細胞を、光学顕微鏡観察、フローサイトメトリーおよび免疫組織化学的染色によって特徴付け、オンコジーンの発現をアッセイし、増殖指標を確立した。例えば、乳癌患者についての実験では、形態学的に乳癌細胞であるか、あるいは乳癌特異的抗体で染色される細胞のみをオートローガス腫瘍細胞であるとみなし、次いで、それ自体利用した。３）細胞系ネズミＢリンパ細胞系３８Ｃ１３の細胞はBernd Gansbacher博士（Sloan Kett ering Memorial Cancer Center)によって提供され；ラット前立腺細胞系Ｒ３３２７細胞はEli Gilboa博士(Duke University)によって提供され；および、ＭＤＡ−２３１乳腫瘍細胞系はＡＴＣＣから入手した。ｄ．細胞トランスフェクション「リポフェクション」ｉ．ＴＩＬ細胞のリポフェクションＴＩＬ細胞のトランスフェクションについては、５〜１０×１０⁶細胞を６− ウェルディシュのウェル当たり１ｍｌの無血清培地中で培養した。ＩＬ−２ゲノム物質を含むプラスミドＤＮＡ（例えば、ｐＭＰ６−ＩＬ２）５０μｇをＤＤＡＢの５０ｎｍｏｌｅ（１：１のモル比のＤＤＡＢおよびＤＯＰＥを含むリポソームとして）と混合した。無血清培地（０.５ｍｌ）をＡＡＶ：リポソーム複合体に添加した。次いでＡＡＶ：リポソーム複合体および無血清培地を細胞と共に入れた。リポフェクションを行うために、細胞を室温にて５分間インキュベートし、次いで、ウシ胎児血清を細胞に補充して５％ウシ胎児血清の最終濃度とした。トランスフェクトされたＴＩＬ細胞は患者に戻す。これらの細胞はＩＬ−２と組み合わせて細胞障害性ＴＩＬ細胞の治療的効果を提供する。有利なことには、細胞障害性Ｔ細胞活性を維持するためにＩＬ−２を患者に全身投与する必要性は減少し、あるいは無くなる。全身投与されるＩＬ−２の量の減少は有利である。というのは、このように投与したＩＬ−２は潜在的致死用量関連毒性に相関することが知られているからである。ｉｉ．新形成細胞のリポフェクション乳癌細胞または卵巣腫瘍細胞の培養のような新形成細胞培養を以下のようにトランスフェクトした：新形成細胞（１×１０⁶細胞）を、合計脂質３０ｎｍｏｌｅと混合したプラスミドＤＮＡ（例えば、ｐＭＰ６−ＩＬ２）５マイクログラムでトランスフェクトした（ここに、この脂質は１：１のモル比のＤＤＡＢおよびＤＯＰＥを含むリポソームを含む）。１ｍｌのＡＩＭＶ培地をリポソーム−ＤＮＡ複合体に添加し、室温で３０分間インキュベートした。次いで、培地およびリポソーム−ＤＮＡ複合体の混合物を細胞に導入した。次いで、この細胞を３７ ℃で２４時荷インキュベートした。２４時間後、細胞を致死的に照射した（１００００ラド）。別法として、ＤＮＡ−リポソーム複合体は以下の方法によって形成した：所望量のＤＮＡを滅菌バイアルに移し、１μｇのＤＮＡ当たり１または２ｎｍｏｌｅのＤＤＡＢを添加した。次いで、１ｍｌの無血清培地をリポソーム−ＤＮＡ複合体に添加した。トランスフェクトすべき全ての細胞を６ウェルプレートで培養した。原発性腫瘍および腫瘍細胞系を、２ｍｌの無血清培地中、ウェル当たり１× １０⁶細胞にて培養した。リポソーム−ＤＮＡ複合体を細胞に添加し、室温で５分間インキュベートした。ＦＢＳを１０％の最終濃度となるよう添加した。ｅ．トランスジーン発現のアッセイｉ．細胞外アッセイトランスジーンの発現は致死的に照射された細胞によるＩＬ−２発現をアッセイすることによって行い；これらのＩＬ−２アッセイは当業者に公知の情報に従ってＥＬＩＳＡアッセイによることができる。無細胞上清を集め、そのＩＬ−２濃度を種々の時点でＥＬＩＳＡ法によって測定した。例えば、ＩＬ−２アッセイは、二サンプルで、７２時間上清で行った。遺伝子修飾された細胞の、＞１００ｐｇ／７２時間／１０⁶細胞のＩＬ−２濃度が得られるものをトランスフェクションがうまくいったものと定義した。ｉｉ．細胞内アッセイ細胞を種々の時点で回収し、ＰＢＳで洗浄し、冷１％パラホルムアルデヒドＰＢＳに再懸濁した。４℃、１０分後、細胞を冷サポニン緩衝液（ＰＢＳ中、０. １％サポニン、１０％ＦＢＳ）で洗浄し、４℃でマウス抗−ヒトＩＬ−２抗体を用いて１５分間染色した。次いで、細胞を冷サポニン緩衝液で洗浄し、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗−マウスＦ（ａｂ’）２抗体を用いて４℃、１５分間染色した。細胞をサポニン、次いで、ＰＢＳで洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。ｆ．ＩＬ−２ＤＮＡのサザンハイブリダイゼーション染色体ＤＮＡをHirt分画によって単離した。制限消化の後、サンプル当たり５ μｇのＤＮＡを電気泳動し、Hybond Ｎ＋ナイロン膜に移し、０.６８５ｋｂのＩＬ−２断片とハイブリダイズさせた。ｇ．細胞障害性アッセイ標的細胞を１×１０⁶細胞当たり１００μＣｉ⁵¹Ｃｒで標識した。５０００の標的細胞を９６ウェルプレート中、３こずつ培養した。エフェクター細胞を添加して２０：１のエフェクター：標的比とした。各ウェルからの１００μｌの上清を４時間のインキュベーションの後に収集し、ガンマーカウンターで計数した。ｈ．増殖アッセイ増殖をアッセイするために、１００μｌＡＩＭＶ培地中の５×１０⁴細胞を９６ウェルプレート中、３こずつ培養した。各ウェルを１μＣｉ ³Ｈ−チミジンでパルスした。細胞を２４時間後に集め、シンチレーションカウンターで計数した。ｉ．ＴＣＲ分析ＴＩＬ細胞を培養中におよび刺激実験の後に種々の時点で凍結した。ＴＣＲ制限を、当該分野で公知の手法によって逆転写酵素（ＲＴ）により分析した。２．得られたデータおよび知見ａ．腫瘍特異的ＣＴＬのエクスビボ活性化；培養中のＴＩＬ細胞の刺激オートローガスな照射腫瘍と５０：１で培養したＴＩＬを刺激した；あるいはＩＬ−２トランスフェクトし、照射したオートローガス腫瘍と共に５０：１で培養したＴＩＬを刺激した。刺激の期間は５〜７日間であった。これらの細胞と、６００ＩＵ／ｍｌｒＩＬ−２を添加したＡＩＭＶ培地中で培養したＴＩＬとを比較した。表現型、細胞障害活性、増殖およびＴＣＲレパートリーの変化を、細胞を刺激した後にアッセイした。培養中のＴＩＬ細胞の刺激のこの単純で迅速な方法を、インビトロおよびインビボ遺伝子移入プロトコル双方で利用する。培養中にＴＩＬを刺激する別の方法として、腫瘍関連抗原性ペプチドを直接ＴＩＬ培養物に添加することもできる。ｉ．トランスフェクトされた新形成細胞でのＴＩＬの刺激ＴＩＬをトランスフェクトされた新形成細胞と共に培養するために、新形成細胞を、例えば、ｐＭＰ６−ＩＬ２でトランスフェクトし、照射した。照射２４時間後、トランスフェクトされた細胞を洗浄し、トリプシン処理によって集め、遠心によってペレット化し、培地に再懸濁した。トランスフェクトし照射した新形成細胞を、次いで、ＴＩＬと共に培養した。腫瘍特異性は、培養および増殖の間にＴＩＬによって保持された。従って、腫瘍細胞（オートローガスおよびＨＬＡ適合同種異系）を用いて、増殖相の間、選択したＴＩＬを再刺激した。これは非常に価値がある。何故ならば、その標的に対するＴ細胞の特異性は増殖の間に減衰するのがしばしば知られているからである。このように、腫瘍細胞それ自体は、一般的に、例えば、リポソームおよびｐＭＰ６−ＩＬ２を含む組成物で修飾して、さらにその抗原性を増加させた。ＴＩＬの長期培養は、しばしば、ポリクローナル増殖を誘導し、増殖した細胞による腫瘍特異性は減少した。図１３に示すごとく、増殖したＴＩＬをオートローガス腫瘍で刺激され、特異性が増強された。ＩＬ−２形質導入した腫瘍で刺激したＴＩＬの特異性は、ＴＣＲレパートリーによって評価すると、修飾していない腫瘍で刺激したよりも大であった。トランスフェクトした腫瘍と共に培養し／刺激されたＴＩＬの増強された特異性は、培養３０日後で得られたデータで特に顕著であった。データは、ＡＡＶプラスミドと複合したカチオン性リポソームは原発性腫瘍細胞ならびに培養腫瘍細胞系を効果的にトランスフェクトしたことを示した。５０％までのトランスフェクトされた細胞は、細胞内ＩＬ−２レベルによって評価すると、ＩＬ−２を発現し、発現の持続性は３０日までであった。トランスフェクション後の腫瘍細胞の照射は、トランスジーン発現レベルを変化させなかった。ＴＣＲ分析は腫瘍特異性Ｔ細胞の増強を示し；バルクの培養によって影響されたこれらの腫瘍特異性Ｔ細胞は、遺伝子修飾したオートローガス腫瘍を有するＴＩＬを増殖させた。ｂ．ＩＬ２遺伝子でトランスフェクションした後のＴＩＬの増殖図１４に示したデータについては、乳腫瘍ＴＩＬをＣＤ８デバイスを用いて胸膜滲出物から単離し、６００ＩＵ／ｍｌＩＬ−２を含有する培地で３週間培養した。同様の実験を卵巣腫瘍からのＴＩＬで行い；結果は乳房腫瘍ＴＩＬで得られたものと一致した。ほぼ１０×１０⁶ＴＩＬ細胞を、ｐＭＰ６−ＩＬ２ＤＮＡ：リポソーム複合体を含む種々の組成物でトランスフェクトした。リポソームの２つの組成物、「ＲＰＲＤＤＡＢ」（Nattermann Phospholipid ＧｍＢＨ、Cologne，Germany）および「１１００−２８」(Applied Immune Sciences，Inc.，Santa Clara， CA)をテストした。ＲＰＲＤＤＡＢリポソームは１：１のＤＤＡＢ：ＤＯＰＥ比を有し；１１００−２８リポソームは１：０.６のＤＤＡＢ：ＤＯＰＥ比を有していた。次いで、トランスフェクトしたＴＩＬ細胞を、外因性ＩＬ２なしで培養し；陽性対照を６００ＩＵ／ｍｌＩＬ−２の存在下で培養した。トランスフェクションの５日後、トランスフェクトしたおよびトランスフェクトしていない群を³Ｈチミジンで標識し、取り込みを評価した。陽性対照からのカウントを1００パーセントとした。パーセント増殖幅はＲＰＲＤＤＡＢリポソームでトランスフェクトした群では４０〜８０％の範囲、１１００−２８リポソーム群では４０〜６０％の範囲であった。図１４に示すデータは、ＩＬ−２遺伝子でトランスフェクトすると、乳癌ＴＩＬは、インビトロ増殖を維持するのに外因性ＩＬ−２を必要としないことを示す。ｃ．ＴＩＬにおけるＴｈｙ１.２遺伝子発現図１５に示すデータについては、乳癌ＴＩＬを、ＩＬ−２遺伝子を含有するｐＭＰ６プラスミドの別の具体例として、ネオマイシン耐性遺伝子およびネズミＴｈｙ１.２遺伝子を含有するｐＭＰ６プラスミド（ｐＭＰ６／ｎｅｏ／Ｔｈｙ１ .２）でトランスフェクトした。ｐＭＰ６／ｎｅｏ／Ｔｈｙ１.２プラスミドをＤＤＡＢ：ＤＯＰＥリポソームと複合体化した。リポソーム組成は、図１４で示したデータと同一組成であった。２日目に、トランスフェクトされた細胞を抗−Ｔｈｙ１.２ＰＥ抗体(Pharmingen，San Diego，CA)で染色し、フローサイトメトリーで分析した。図１５に示すように、マウスＴ細胞表面マーカーＴｈｙ１.２はトランスフェクトしたヒトＣＤ８⁺ＴＩＬで効率的に発現された。ｄ．トランスフェクション後に照射したヒト黒色腫腫瘍細胞でのトランスジーン発現以下のデータは腫瘍細胞をｐＭＰ６−ＩＬ２でトランスフェクトすることによって得られた。これらのデータは、腫瘍細胞が首尾よく遺伝子修飾されたことを示した。ＤＤＡＢ：ＤＯＰＥ脂質組成物に加えて他の脂質組成物もまた使用され得る。これらの種々の脂質組成物は首尾よくリポフェクションおよび引き続いてのサイトカイン発現を生じた。黒色腫細胞を当該分野で公知の以下の酵素消化によって転移性病巣から、単離した。細胞を、５〜１０％ウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ中で増殖させ、５日および８年の間の期間、培養液中に維持した。リポフェクションのための調製において、腫瘍細胞を５×１０⁵細胞／ディシュの容量にて６０ｍｍのディシュで培養した。次の日、１０〜３０ｎｍｏｌのカチオン性脂質および２〜１０μｇのＤＮＡを含むリポソームを混合し、無血清培地に移して、吸着性単層とした。細胞を１〜５時間インキュベートし、ＦＣＳを培地に補充した。種々のリポソーム調製物が首尾よく使用された。以下を含む；１：１のモル比のＤＭＲＩＥ：ＤＯＰＥ（Vical，San Diego，CA）；ＤＯＳＰＡ：ＤＯＰＥ、３：１質量比(Gibco，Gaithesberg，MD)および１：２のモル比のＤＤＡＢ：ＤＯＰＥ。トランスフェクトされた細胞を、リポフェクションの２４時間後に、致死レベルのＸ線照射（５０００ラド）に暴露した。７２時間目に上清を測定；しかる後、ＩＬ−２レベルを、当業者に公知の情報に従ってＥＬＩＳＡ法によって測定した。各リポソーム調製物で得られた最高レベルのＩＬ−２発現を表４にリストする。従って、高レベルの発現（＞５,０００ｐｇ／ｍｌ）が、照射後２６日までは、非増殖性生存細胞で検出された。これらのデータは、ヒト黒色腫細胞系がうまく、プラスミドｐＭＰ６−ＩＬ２の非ウイルス、リポソーム媒介送達を介してトランスフェクションされたことを示す。トランスフェクションの結果、致死的照射の後にＩＬ−２の有意な生産となった。ｅ．種々のプラスミド構築物を用いるトランスフェクション後の前立腺腫瘍細胞系のトランスジーン発現の細胞外アッセイ異なるプラスミド構築物でのトランスフェクション後のトランスジーン発現のレベルおよび持続性を比較するために、前立腺腫瘍細胞系Ｒ３３２７を、１０μ ｇの標準プラスミド（ｐＢＣ１２／ＣＭＶ−ＩＬ２）または１０μｇのＡＡＶプラスミド（ｐＡＣＭＶ−ＩＬ２）をＤＤＡＢ：ＤＯＰＥ１：２の１０ｎｍｏｌＤＤＡＢリポソームで複合体化してトランスフェクトした。種々の時点で上清を集め、ＩＬ−２レベルをＥＬＩＳＡ法によってアッセイした。図１０に示すデータは、ＩＬ−２レベルを、培養２４時間におけるｐｇ／ｍｌ／１０⁶細胞として表した。ＡＡＶプラスミドでのトランスフェクションにより、標準プラスミドよりも有意に高いＩＬ−２レベルが生じた。加えて、ＡＡＶプラスミドでのトランスフェクションは、少なくとも３０日間のＩＬ−２の生産を引き起こし、標準ＩＬ−２プラスミドでは７日間に過ぎなかったのとは対照的であった。図１７は、ＡＡＶプラスミド（ｐＡＣＭＶ−ＩＬ２）または標準プラスミド（ｐＢＣ１２／ＣＭＶ−ＩＬ２）でトランスフェクトしたＲ３３２７細胞からの染色体ＤＮＡのサザーンブロット分析を示す。ブロットはＩＬ−２遺伝子の０.６８５ｋｂＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片でプローブされた。図１７において、対照（Ｃ）はトランスフェクトされていない細胞からのＤＮＡである。ＩＬ− ２インサートは最後のレーンに示す。ｆ．ＡＡＶプラスミド構築物でのトランスフェクション後における前立腺腫瘍細胞系でのトランスジーン発現の細胞内アッセイ前立腺細胞系Ｒ３３２７を、ＤＤＡＢ；ＤＯＰＥリポソーム（１：１または１：２のＤＤＡＢ：ＤＯＰＥ組成比のリポソーム）で複合体化したＡＡＶＩＬ− ２プラスミド（例えば、ｐＡＣＭＶ−ＩＬ２）でトランスフェクトした。ＤＮＡ：リポソーム比は、両群で、１０μｇＤＮＡ：１０ｎｍｏｌＤＤＡＢであった。トランスフェクトされた細胞を、本明細書に記載した修飾したフローサイトメトリー法を用い、細胞内ＩＬ−２蛋白質レベル測定のため種々の時点で染色した；結果を図１８に示す。図１８におけるデータは、ＩＬ−２蛋白質を発現するパーセント陽性細胞として表される。トランスフェクトしなかった細胞を陰性対照として用い、対照の値をトランスフェクトした群の値から差し引いた。ｇ．原発性腫瘍細胞におけるトランスジーン発現ＡＡＶプラスミド−リポソーム複合体を使用して種々の原発性腫瘍細胞をトランスフェクトした。１つの肺、１つの卵巣、および２つの乳腫瘍サンプルを新鮮な腫瘍バイオプシーから単離した。１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で腫瘍細胞を２〜３週間培養しトランスフェクションした。原発性腫瘍細胞を、ＤＤＡＢ：ＤＯＰＥ１：１としての１０ｎｍｏｌのＤＤＡＢと複合体化した１０μｇのプラスミド（例えば、ｐＡＣＭＶ−ＩＬ２）でトランスフェクトした。上清を２日目および３日目に集めた。ＩＬ−２レベルをＥＬＩＳＡ法によって測定した；結果を図６に示し、ＩＬ−２レベルを培養２４時間においてｐｇ／ｍｌ／１０⁶細胞として表す。ｈ．原発性乳腫瘍細胞および前立腺腫瘍細胞系の照射後のトランスジーン発現遺伝子発現に対する照射の効果を測定するために、原発性乳腫瘍細胞および前立腺細胞系（Ｒ３３２７）の細胞を、ｐＡＣＭＶ−ＩＬ２およびＤＤＡＢ：ＤＯＰＥリポソーム複合体を含む組成物でトランスフェクトし、致死的照射後の遺伝子発現を評価した。腫瘍細胞系についてのデータを図１９Ａに示し、原発性腫瘍細胞についてのデータを図１９Ｂに示す。これらの実験において、トランスジーンはＩＬ−２であった。２日目に、細胞のアリコットを、⁶⁰Ｃｏ照射器を用いて６０００ｒ照射し、次いで、培地に戻した。照射後、上清を２４、４８、７２および９６時間目に集め、ＩＬ−２レベルをテストした。図１９に示すごとく、トランスフェクション後の致死的照射はトランスジーン発現を阻害しなかった。図１９において、ＩＬ−２レベルは２４時間培養におけるｐｇ／ｍｌ／１０⁶細胞として表す。ＩＶ．検討本実験においては、トランスジーンおよびＡＡＶ末端反復配列を含有するＡＡＶプラスミドをＤＮＡベクターとして用い、カチオン性リポソームをキャリアー分子として用いた。ＡＡＶプラスミドＤＮＡ：リポソーム複合体は原発性腫瘍細胞、培養細胞系、一次リンパ系細胞、およびＣＤ３４⁺幹細胞を効果的にトランスフェクトすることが示された。また、（アデノウイルス感染細胞においてｒｅｐおよびキャップキャプシド粒子から産生可能な）組換えウイルスの不存在下で、高レベルの組込みおよびトランスジーンの持続的発現がエレガントなトランスフェクション方法によって達成されることも示された。高レベルの発現に加え、典型的なリポソーム媒介トランスフェクションによって示される一過性発現とは対照的に、本明細書に開示するＡＡＶプラスミド：リポソームは遺伝子の長期間（３０日まで）の発現を誘導した（図５ａ〜ｂ）。注目すべきは、持続された発現が、ＡＡＶプラスミドでリポフェクションした群、ならびに組換えＡＡＶ形質導入群で示された（図５ａ〜ｂ）。さらに、図４ａ〜ｂに示すごとく、標準プラスミドトランスフェクションと比較して１０倍高いレベルの発現が、ＡＡＶプラスミドで観察された。本明細書に開示する実験条件下では、最適ＡＡＶ形質導入と最大ＡＡＶプラスミド：リポソームトランスフェクションの間の効率に差異はなかった。発現の経時変化に関しては、カチオン性リポソームは、哺乳動物細胞タイプで標準プラスミドＤＮＡの一過性発現のみを媒介することがすでに示されている（Felgner，P .L.ら「高度に効果的な脂質媒介ＤＮＡトランスフェクション方法(A highly eff icient，lipid-mediated DNA transfection procedure)」、Proc．Natl．Acad． Sci．USA (１９８７)８４：７４１３−７４１７；Rose，J.K.ら「新しいカチオン性リポソーム試薬が媒介する動物細胞のほぼ定量的なトランスフェクション(A n ew cationic liposome reagent mediating nearly quantitative transfection of animal cells)」、Biotechniques（１９９１）１０：５２０−５２５）。さらに、組込みの効率に関して、本明細書に開示する結果と比較して、前者のリポソーム媒介トランスフェクションにおいて、かなり低い効率の宿主ゲノムへの組込みが観察された（Shaefer-Ridder，M.ら「遺伝子キャリアーとしてのリポソーム：チミジンキナーゼ遺伝子によるマウスＬ細胞の効率的トランスフェクション (Liposomes as gene carrier：Efficient transfection of mouse L cell by th ymidine kinase gene)」、Science（１９８２）２１５：１６６−１６８）。しかしながら、本明細書に示すごとく、ＡＡＶ末端反復配列を有するＡＡＶプラスミドＤＮＡと複合体としたカチオン性リポソームは、ＡＡＶ末端反復配列（ＩＴＲ）のみを欠く標準プラスミドに対して、ゲノムＤＮＡ組込みを増加させた。ＡＡＶプラスミド物質を含むリポソームは、いずれの特異的細胞表面レセプターが存在しなくてもプラスミドＤＮＡを送達し、遺伝子送達によってウイルスの機能を置換した。本実験において、ウイルスベクターは、リポソームによって全体的に置換することができ、この効率および組込み双方に関連しているウイルスエレメントを含む構築物を利用することによって効率的な発現および組込みが達成された。このようにして、感染に際してウイルスの生産が回避され、かくして、組換えによる不利益を受ける可能性が実質的に排除される。最終の結果は、ＡＡＶプラスミドおよびカチオン性リポソームを組み合わせるエレガントなトランスフェクション方法の使用によって達成された。好適な態様において、ＡＡＶプラスミドおよびカチオン性リポソームの組合せは、培養細胞系を効果的にトランスフェクトするのみならず、原発性腫瘍細胞ならびにＴ細胞および幹細胞のような末梢血液細胞をトランスフェクトした。これらのデータは価値がある。なぜなら、ほとんどの遺伝子治療戦略は一次Ｔリンパ球または腫瘍細胞への遺伝子送達を含むからである。従前には、これらの戦略は、主には、レトロウイルスまたはＤＮＡウイルスベクターへのトランスジーンの挿入に頼っていた。レトロウイルス系の基本的に不利な点は、非分裂性一次細胞をトランスフェクトできないことにあると考えられる。本研究の結果、ＡＡＶ物質を含むカチオン性リポソームが、分裂性および非分裂性細胞タイプの双方を媒介したことを示した。本発明によると、ＡＡＶプラスミド：カチオン性リポソームにより、持続的で高レベルの発現を達成する高効率トランスフェクション系が提供された。有利には、いずれの毒性も検出されず、プラスミドＤＮＡ：リポソーム複合体をインビボで送達し得る（例えば、静脈内、腹腔内およびエアロゾル投与）（Ph ilip，R.ら「インビボ遺伝子送達：成熟マウスにおけるＴリンパ球の効率的トランスフェクション(In vivo gene delivery: Efficient transfection of T lymp hocytes in adult mice)」、J．Biol．Chem．（１９９３）２６８：１６０８７ −１６０９０ ;Stribling，R.ら「インビトロにおけるエアロゾル遺伝子送達(Ae rosol Gene Delivery in vitro)」、Proc．Natl．Acad．Sci．USA（１９９２）８９：１１２７７−１１２８１；Zhu，N．ら、「成熟マウスへの静脈内ＤＮＡ送達後における全身遺伝子発現（Systemic gene expression after intravenous D NA delivery into adult mice）」、Science（１９９３）２６１：２０９−２１１；Stewart，M.J.ら、「ＤＮＡ−リポソーム複合体でのインビボ遺伝子移入：マウスにおける安全性および急性毒性(Gene transfer in vitro with DNA-lipos ome complexes: Safety and acute toxicity in mice)」、Human Gene Therapy （１９９２）３：２６７−２７５）。本発明によると、ＤＮＡ濃度を最適にして最大発現が得られ得る。このように、ＡＡＶ物質を含むリポソームを用いた遺伝子移入によって、ＡＡＶおよびトランスジーン物質が、エクスビボで種々の細胞タイプへ遺伝子を移入する。同様にインビボでも使用される。これらの本結果は、いずれの遺伝子療法プロトコルに対しても非常に有用である。さらに、種々の原発性新形成細胞タイプ、新形成細胞系、およびいくつかのＴ細胞亜集団を、ＤＮＡ：リポソーム複合体を用いてＡＡＶプラスミドでトランスフェクトした。本明細書に示すごとく、カチオン性リポソームはアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）プラスミドの細胞へのトランスフェクションを容易とした。原発性腫瘍細胞のトランスフェクションは非常にアピールするものであった。なぜなら、このような細胞は一般にトランスフェクトするのが困難だったからである。高レベルの発現に加え、ＡＡＶプラスミド：リポソームの使用はトランスジーンの長期間（＞３０日）発現を誘導した。さらに、活性化されたおよび天然のＴ細胞をＩＬ−２プラスミドでトランスフェクトした場合、このプラスミドは、非選択条件下で、トランスフェクション後の最低２５日間細胞で検出された。これらの知見は、標準プラスミドを用いる典型的なリポソーム媒介トランスフェクションで示されている短期間発現とは対照的である。さらに、サイトカイントランスジーンでトランスフェクトしたＴＩＬは、外因性サイトカインを要求すること無く増殖することが判明した。この結果は非常に有用である。なぜなら、ＴＩＬは全身ＩＬ−２で処置する必要なく患者に提供され得、ＩＬ−２での全身治療の重篤な副作用を克服するからである。トランスフェクトされたＴ細胞におけるＩＬ−２遺伝子の発現は、外因性IＬ −２の効果をなくすように変更した。注目すべきは、ＩＬ−２でトランスフェクトされたＴ細胞は十分な内因性ＩＬ−２を生じて、その成長および増殖を維持し、当該分野で公知の、エフェクターＴ細胞から外因性ＩＬ−２を除くことで通常生じるアポトーシスを防止する。外因性ＩＬ−２への依存は排除された。原発性の乳、肺および卵巣腫瘍細胞は、ＡＡＶプラスミドＤＮＡ：リポソーム複合体を用いてトランスフェクションされ得た。トランスフェクトされた原発性および培養腫瘍細胞は致死的照射の後においてさえトランスジーン産物を発現できた。本明細書開示の具体例は、腫瘍細胞（オートローガスおよびＨＬＡ適合同種異系の双方）を、増殖相において、選択したＴＩＬを再刺激するのに使用し得ることを含む。トランスフェクトされた新形成細胞は腫瘍ワクチン接種プロトコルで使用され得る。典型的には、トランスフェクトされた新形成細胞は、当該分野で公知のような、医薬賦形剤と共に提供される。また、トランスフェクトされた新形成細胞は培養中に対応するＴＩＬ細胞を刺激するのにも使用される。表現型、細胞障害性およびＴ細胞レセプター分析により、ＴＩＬは、それらを腫瘍から単離した場合はまず腫瘍細胞特異性を示したにもかかわらず、ｒＩＬ−２の長期培養はしばしばポリクローナル増殖および腫瘍特異性の喪失を誘導した。新形成細胞、最も好ましくはトランスフェクトされた新形成細胞を含む環境におけるＴＩＬの培養によって、増殖したＴＩＬ細胞の腫瘍特異性は顕著に増加した。本明細書および添付の請求の範囲で使用するごとく、特に断りのない限り、単数形の「１つの」、「および」、「該」は複数の意味を含む。かくして、例えば、「処方」への言及は異なる処方の混合物を含み、「治療方法」は当業者に公知の、同等の工程および方法を含む。特に断りのない限り、本明細書で使用する全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常に理解されるのと同様の意味を有する。本明細書で記載したものと同様または同等のいずれの方法および物質も本発明の実施または研究で使用し得るが、好ましい方法および物質を記載した。本明細書で言及した全ての文献は、文献が引用される特別の情報を記載するために引用し、本明細書に参考として援用される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 38/45 ＡＤＵ 8615−4ＣＣ０７Ｈ 21/04 Ｂ 38/46 ＡＤＹ 9281−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ｂ 48/00 ＡＢＡ 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 ＡＢＤＣ０７Ｈ 21/04 9051−4Ｃ 37/52 ＡＤＵＣ１２Ｎ 5/10 9051−4Ｃ 37/54 ＡＤＹ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者レブコウスキ，ジェーンアメリカ合衆国カリフォルニア 94028, ポートラバリー，ガバルダウェイ 150

Claims

【特許請求の範囲】１．脂質物質を含むリポソーム；および１またはそれ以上の逆方向末端反復配列を含むアデノ関連ウイルスＤＮＡを含む遺伝子操作のための組成物。２．前記アデノ関連ウイルスＤＮＡがプラスミド中に存在する請求項１記載の組成物。３．前記プラスミドがｐＭＰ６−ＩＬ２またはｐＡＣＭＶ−ＩＬ２である請求項２記載の組成物。４．前記アデノ関連ウイルスＤＮＡが２つの逆方向末端反復配列を含む請求項１〜３いずれかの項に記載の組成物。５．さらに、目的の遺伝子配列を含む請求項１〜４いずれかの項に記載の組成物。６．前記目的の遺伝子配列が２つの逆方向末端反復配列の間に組み込まれる請求項１〜５いずれかの項に記載の組成物。７．プロモーターが２つの逆方向末端反復配列の間に組み込まれる請求項１〜６いずれかの項に記載の組成物。８．前記プロモーターがＣＭＶ即時型−初期プロモーター、ＣＭＶ即時型−後期プロモーター、ＣＭＶ初期プロモーター、ＡＤＡプロモーターまたはＴＫプロモーターである請求項７に記載の組成物。９．前記目的の遺伝子配列がＩＬ−２遺伝子またはβ−ｇａｌ遺伝子である請求項５〜８いずれかの項に記載の組成物。１０．前記脂質物質がカチオン性脂質を含む請求項１〜９いずれかの項に記載の組成物。１１．目的の遺伝子配列を宿主細胞に導入する方法であって：リポソーム、１またはそれ以上の逆方向末端反復配列を含むアデノ関連ウイルスＤＮＡおよび目的の遺伝子配列を含む組成物を提供する工程；および、該組成物と遺伝子物質を含む宿主細胞とを接触させ、それにより、該目的の遺伝子配列を宿主細胞に導入する工程；を含む方法。１２．前記宿主細胞がＣＤ３４⁺幹細胞、Ｔ細胞、腫瘍細胞系の細胞、または原発性腫瘍細胞である請求項１１記載の方法。１３．前記宿主細胞が腫瘍浸潤性リンパ球、ＣＤ３⁺、ＣＤ４⁺、またはＣＤ８⁺ 細胞である請求項１２記載の方法。１４．前記細胞が膀胱、前立腺、βリンパ腫または胚性腎臓細胞系である腫瘍細胞由来のものである請求項１２記載の方法。１５．前記リポソームがカチオン性脂質を含む請求項１１〜１４いずれかの項に記載の方法。１６．前記組成物が請求項１〜９いずれかの項に定義されるものである請求項１１〜１５いずれかの項に記載の方法。１７．さらに、目的の遺伝子物質を宿主細胞の遺伝子物質に組み込む工程を含む請求項１１〜１６いずれかの項に記載の方法。１８．請求項１〜１０いずれかの項に記載の組成物または請求項１１〜１７いずれかの項に記載の方法によって導入された遺伝子配列を有する組成物によってトランスフェクトされた細胞。１９．疾患を有するヒト患者を処置する方法であって：請求項５〜１０いずれかの項に記載の組成物と宿主細胞とを接触させる工程を包含し、それにより、目的の遺伝子配列を宿主細胞に導入し、そして該接触工程が、（ａ）インビボにおける接触であって、該宿主細胞が患者の細胞である、工程；または（ｂ）該接触がエクスビボにおける接触であって、該宿主細胞がオートローガスまたは同種異系であり、さらに、（導入された目的の遺伝子配列を含む）該宿主細胞を患者に送達する工程を包含する；疾患を有するヒト患者を処置する方法。２０．前記患者が新生物、感染、自己免疫疾患、または遺伝子異常を有する請求項２１記載の方法。２１．前記遺伝子異常が欠失遺伝子または欠陥遺伝子を含む請求項２０記載の方法。２２．前記患者がＨＩＶ感染している請求項１９または２０記載の方法。２３．ペプチドをコードする目的の遺伝子配列がアンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはＲＮＡである請求項１９〜２２いずれかの項に記載の方法。２４．前記組成物がプラスミドを提供する請求項１９〜２３いずれかの項に記載の方法。２５．前記プラスミドがｐＭＰ６−ＩＬ２またはｐＡＣＭＶ−ＩＬ２である請求項２４記載の方法。２６．前記目的の遺伝子配列がサイトカイン、共刺激因子、ＭＨＣクラスＩ分子、腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原をコードする遺伝子配列を含む請求項１９〜２５いずれかの項に記載の方法。２７．前記患者が悪性新形成疾患またはＨＩＶ感染を有し、前記遺伝子配列がＩＬ−２ゲノム物質を含む請求項１９記載の方法。２８．前記患者が悪性新形成疾患またはＨＩＶ感染を有し、前記遺伝子配列がＭＤＲＩ遺伝子を含む請求項１９記載の方法。２９．前記宿主細胞が新形成細胞、骨髄造血細胞、または末梢血液細胞である請求項１９〜２８いずれかの項に記載の方法。３０．前記宿主細胞が腫瘍浸潤性リンパ球、腫瘍細胞系の細胞、または原発性腫瘍細胞である請求項２９記載の方法。３１．ヒト身体の処置に用いる請求項１〜１０いずれかの項に記載の組成物または請求項１８記載の宿主細胞。３２．ヒト身体を処置する医薬の製造のための、請求項１〜１０いずれかの項に記載の組成物または請求項１８記載の宿主細胞の使用。３３．本質的にプラスミドｐＭＰ６の遺伝子配列である遺伝子配列を含む発現ベクター。３４．実質的にプラスミドｐＭＰ６の遺伝子配列である遺伝子配列を含む請求項３３記載の発現ベクター。３５．プラスミドｐＭＰ６の遺伝子配列の配列である遺伝子配列を含む請求項３４記載の発現ベクター。３６．さらに、目的の遺伝子配列を含む請求項３３記載の発現ベクター。３７．請求項３６記載の発現ベクターで遺伝子修飾された細胞。３８．末梢血液細胞、骨髄細胞、腫瘍浸潤性リンパ球、腫瘍細胞系細胞、または原発性腫瘍細胞である請求項３７記載の細胞。３９．本質的に図３の遺伝子配列の配列である遺伝子配列を含む発現ベクター。４０．実質的に図３の遺伝子配列の配列である遺伝子配列を含む請求項３９記載の発現ベクター。４１．図３の遺伝子配列の配列である遺伝子配列を含む請求項４０記載の発現ベクター。４２．請求項３９記載の発現ベクターで遺伝子修飾された細胞。４３．末梢血液細胞、骨髄細胞、腫瘍浸潤性リンパ球、腫瘍細胞系細胞、または原発性腫瘍細胞である請求項４２記載の細胞。４４．蛋白質の製造方法であって：リポソーム、１またはそれ以上の逆方向末端反復配列を含むアデノ関連ウイルスＤＮＡおよび目的の遺伝子配列を含む組成物を提供する工程；該組成物を遺伝子物質を含む宿主細胞と接触させ、それにより、該目的の遺伝子配列を該宿主細胞に導入する工程；および、該目的の遺伝子配列によってコードされた蛋白質を発現させる工程；を含む蛋白質の生産方法。４５．前記宿主細胞がＣＤ３４⁺幹細胞、Ｔ細胞、腫瘍細胞系の細胞、または原発性腫瘍細胞である請求項４４記載の方法。４６．前記宿主細胞が腫瘍浸潤性リンパ球、ＣＤ３⁺、ＣＤ４⁺、またはＣＤ８⁺ 細胞である請求項４５記載の方法。４７．前記細胞が膀胱、前立腺、Ｂリンパ球または胚性腎臓細胞系である腫瘍細胞系由来である請求項４５記載の方法。４８．前記組成物がカチオン性脂質を含む請求項４４記載の方法。４９．前記アデノ関連ウイルスＤＮＡがプラスミドを含む請求項４４〜４８いずれかの項に記載の方法。５０．前記プラスミドがｐＭＰ６−ＩＬ２またはｐＡＣＭＶ−ＩＬ２である請求項４９記載の方法。５１．さらに、前記目的の遺伝子物質を前記宿主細胞の前記遺伝子物質に導入する工程を含む請求項４４〜５０いずれかの項に記載の方法。５２．発現された蛋白質がリンホカインアナログである請求項４４〜５１いずれかの項に記載の方法。５３．前記蛋白質がＩＬ−２である請求項５２記載の方法。５４．前記蛋白質がβ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコール−アセチル −トランスフェラーゼまたはＭＤＲＩである請求項５１記載の方法。