JPH0912479A

JPH0912479A - 腫瘍細胞の免疫原性を高めるための組成物及び方法

Info

Publication number: JPH0912479A
Application number: JP8105982A
Authority: JP
Inventors: Lieping Chen; チェンリーピン; Karl Erik Hellstroem; エリックヘルストロームカール
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1995-03-23
Filing date: 1996-03-25
Publication date: 1997-01-14
Also published as: MX9601071A; EP0733373A2; EP0733373A3; CA2172436A1

Abstract

(57)【要約】【課題】腫瘍細胞の免疫原性を強化するための組成物
及び方法に関する。【解決手段】Ｂ７をコードする遺伝子及びＣＤ２リガ
ンドをコードする遺伝子によりトランスフェクトされた
腫瘍細胞の表面上に前記Ｂ７及びＣＤ２リガンドを発現
せしめる組成物及びその組成物による腫瘍細胞の免疫原
性を高めるための方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の背景】癌研究の長く続いている目標は、腫瘍の
免疫学的拒絶を刺激することである。この目標は、腫瘍
が免疫システムのための標的として潜在的に作用できる
外来性抗原を発現するという仮説に基づかれている（Hi
mmelweit, 1957, The Collected Papers of Paul Ehrli
ch, Pergamon Press, Oxford, England)。自発的な腫瘍
が従来の免疫化及びチャレンジ実験において免疫システ
ムにより外来物として認識され得る抗原をどの程度発現
するかについては、議論する余地が残っている（Hewitt
et al., 1976, Br.J.Cancer 33, 241-259) が、多くの
実験的腫瘍がそのような実験において腫瘍拒絶を仲介で
きる抗原を発現することが十分に記載されている (Hell
strom and Hellstrom, 1991, "Principles of Tumor Im
munity： Tumor Antigens," The Biologic Therapy of
Cancer； DeVita, Jr. et al., Eds., J.B.Lippincott
Co., Philadelphia, 35-52ページ；Boon, 1992, Adv.Ca
ncerRes. 58：177-211)。

【０００２】腫瘍免疫性は主として細胞仲介性であり、
そして循環する抗体は重要でない役割を演じる傾向があ
る(Hellstrom, K.E. and Hellstrom, I., 1969, Adv.Ca
ncerRes. 12：167-223)。ある場合、エフェクター細胞
はＣＤ８⁺細胞毒性リンパ球（ＣＴＬ）であり；そして
他の場合、ＣＤ４⁺ヘルパーＴ（Ｔ_H）細胞は主要なエ
フェクターであり、そしてＣＴＬ応答を増幅し、そして
マクロファージ及び他の細胞と調和して作用することに
よって作動する (Melief, 1992, Adv.Cancer Res. 58：
143-175 ：Greenberg, 1991, Adv.Immunol. 49：281-35
5)。ＣＴＬにより認識されるべき腫瘍抗原に関しては、
それは小さなペプチドに細胞内プロセシングされ、そし
て細胞表面で、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラス
Ｉ分子を通して提供されなければならない。

【０００３】ＣＤ４⁺Ｔ細胞により認識されるために
は、抗原は腫瘍細胞から放され（少ない腫瘍がＭＨＣク
ラスII分子を有するので）、摂取され、そして抗原提示
細胞（ＡＰＣ）によりペプチドにプロセシングされ、次
にＭＨＣクラスII分子上に示されるべきである。正常な
細胞タンパク質から生成されるペプチドは、“自己”と
して耐えられるが、しかしウィルスタンパク質又は変異
された細胞性タンパク質から生成されるペプチドは外来
物として認識され、そしてそれ故に、Ｔ−細胞応答のき
っかけを作る (Yewdell and Bennick, 1992, Adv.Immun
ol. 52：1-123)。

【０００４】腫瘍免疫学は１９８０年代はほとんど無視
されていた。なぜならば、ほとんどの自然に生じる動物
新生物は、免疫化及びチャレンジの従来のアプローチに
より試験される場合、いかなる拒絶抗原をも発現しなか
ったためである。しかしながら、この分野は今日、より
注目を引いている。その再現を一部担当する最近の発見
は、（１）ほとんどの癌が変異された腫瘍遺伝子及び／
又は変異されたサプレッサー遺伝子を発現し(Bishop, 1
991, Cell 64：235-248 ：Levine et al., 1991, Natur
e 351, 453-456) ；（２）いくつかのウィルス、たとえ
ばヒト乳頭腫ウィルス（ＨＰＶ）タイプ１６及び１８が
ある一定のヒト腫瘍の病因において役割を演じ(Zur Hau
sen, 1991, Science 254：1167-1173)、そして腫瘍特異
的拒絶抗原をコードすることができ（Chen et al., 199
1, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：110-114)；（３）ＭＨ
ＣクラスＩ分子はペプチドとして細胞内タンパク質を提
示することができ (Yewdell and Bennick, 1992, Adv.I
mmunol. 52：1-123)、これは変異された細胞性腫瘍遺伝
子、サプレッサー遺伝子及び／又はウィルス遺伝子によ
りコードされるタンパク質が“非自己”として免疫シス
テムにより検出できることを包含しており；そして
（４）一定の細胞内タンパク質をコードする遺伝子はほ
とんどの正常な細胞においては“休止(silent)”状態で
あるが、しかし癌細胞の生成物がＭＨＣクラスＩ分子に
より提示されそして非自己として認識され得る癌細胞に
おいては活性化され得る(Van der Bruggen et al., 199
1, Science254：1643-1647)ことを包含する。

【０００５】それらの発見が示唆するところによれば、
ほとんどの自然腫瘍は非免疫原性であるように思え、そ
してそれ故に、腫瘍破壊のために標的として作用できる
分子の固有の欠乏よりもむしろ腫瘍に対していかに免疫
化するかについての知識の欠乏を反映している。多くの
因子が免疫学的制御からの腫瘍の逃げに寄与している(H
ellstrom, K.E. and Hellstrom I., 1992, The Biologi
c Therapy of Cancer,DiVita et al, eds., 35-52ペー
ジ、J.B.Lippincott Co.) 。それらは、腫瘍細胞による
抗原提示のために必要とされるＭＨＣ及びトランスポー
ター分子の損失；種々の免疫抑制分子、たとえば形質転
換成長因子β（ＴＧＦ−β）の腫瘍細胞による生成；及
び抗−腫瘍免疫性をたぶん、サプレッサー細胞を活性化
することによってダウンレギュレートする腫瘍抗原の可
能性ある放出を包含する。

【０００６】しかしながら、なぜ高い抗原性の腫瘍が免
疫応答性の同系宿主において増殖でき、そして免疫応答
によりすぐに排除されないかについて、追加の説明が必
要とされる。最近、Ｔ細胞応答の刺激が、Ｔ細胞抗原レ
セプターを通して提供される抗原特異的シグナルの他
に、抗原提示細胞上に発現されるリガンドによる作用に
続いて、アクセサリーレセプターにより提供される第２
抗原非特異的且つ共同刺激性シグナルを必要とすること
が見出された。そのようなシグナルの存在下で、抗原−
ＭＨＣ複合体の相互作用が、Ｔ細胞クローンのアネルギ
ー (anergy) 又は欠如を導びくかもしれない(Mueller e
t al., 1989, Annu.Rev.Immunol. 7：455-480)。共同刺
激機能を提供できるいくつかの分子は、細胞内付着分子
（ＩＣＡＭ）、リンパ球機能関連抗原（ＬＦＡ）−３、
血管細胞付着分子（ＶＣＡＭ）−１及び頭部−安定性抗
原（ＨＳＡ）(Liu and Linsley, 1993, Curr.Opin.Immu
nol.4：265-270)を包含する。

【０００７】Ｔ細胞免疫性の生成のためのキーシグナル
を提供するためにＴ細胞上でのそのレセプターＣＤ２８
及びＣＴＬＡ４と相互反応するＢ７分子が、造血細胞上
に主として発現され (Freeman et al., 1989, J.Immuno
l. 143：2714) 、そしてそれは多くの培養されたヒト腫
瘍細胞系上にひじょうに低いレベルで存在する。それら
の発見が示唆するところによれば、免疫原性腫瘍がしば
しばＴ細胞破壊を逃れ得る理由の１つは、それらが適切
な同時刺激性分子を欠いていることである。この仮説か
らの予測は、腫瘍拒絶抗原を有する腫瘍中への共同刺激
性分子の導入が免疫応答宿主において腫瘍の根絶を導び
く特定の抗腫瘍免疫性を誘発するそれらの能力を増強す
るということである。

【０００８】共同刺激性分子Ｂ７が腫瘍細胞をトランス
フェクトするために使用されて来た（１９９２年１０月
２日に出願された一部継続出願第０７／９５６，１２３
号である、１９９３年１月１５日に出願された０８／０
０６，１０２のファイルラッパー継続出願である、１９
９３年１２月１日に出願された０８／１６１，１８３の
ファイルラッパー継続出願である、１９９５年３月１０
日に出願された、まだ番号が割り当てられていない同時
継続アメリカ特許出願が引用により全体として組込まれ
ており；Chen et al., 1992, Cell 71：1093-1102 ；To
wnsend and Allison, 1993, Science 259, 368-370； B
askar et al., 1993, Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 90：56
87-5690)。ウィルス拒絶抗原（ＨＰＶ１６Ｅ７）を発
現する、Ｂ７トランスフェクトされたネズミ腫瘍細胞
は、免疫応答同系宿主中に注入される場合、高められた
免疫原性を有することが示された。

【０００９】驚くべきことには、Ｂ７⁺Ｅ７⁺トランス
フェクトされた腫瘍細胞による免疫化に続いて、Ｂ７^-
Ｅ７⁺腫瘍細胞もまた拒絶された。Ｂ７によりトランス
フェクトされた、弱い免疫原性の腫瘍細胞は、親の腫瘍
細胞に見られる免疫原性よりも高められた免疫原性を有
することが示された。Ｂ７トランスフェクトされた腫瘍
による免疫化に続いて、非トランスフェクトされた腫瘍
細胞の拒絶もまた、それらのタイプの腫瘍細胞に関して
見られた。Ｂ７とＣＤ２８との相互反応はまた、抗−Ｃ
Ｄ２又は抗−ＣＤ３モノクローナル抗体のいづれかによ
り開始されたＴ細胞の細胞仲介細胞毒性及び増殖を共同
刺激することが見出された (Azuma et al., 1992, J.Ex
p.Med. 175：353-360)。

【００１０】ＣＤ２はＴ細胞付着及び活性化の両者に関
与するコレセプターである(Moingeon et al., 1989, Im
munol.Rev. 111：111 及び Bierer and Burakoff, 198
9, Immunol.Rev. 111：267)。マウスにおいては、ＣＤ
２のための天然リガンドが、ＣＤ４８と称する４５KDa
の糖タンパク質として定義されている(Kato et al., 19
92, J.Exp.Med. 176：1241-1249)。ネズミＣＤ２とその
リガンドＣＤ４８との間の相互作用は、ネズミにおいて
ＣＤ２−依存性付着及びさらに、Ｔ細胞活性化を担当す
ると思われる。ヒトの系においては、３種のＣＤリガン
ド、すなわちＣＤ５８（ＬＦＡ−３），ＣＤ５９及びＣ
Ｄ４８が同定されている (Hahn et al., 1993, Lymphoc
yte Adhesion Molecules, Shimizu ed., 105-134ペー
ジ、R.G.Landes Co.) 。ネズミの系におけるように、ヒ
トＣＤ２とそのリガンドとの相互作用は、抗原特異的Ｔ
細胞応答を調節し、そして増幅することにおいて重要な
役割を演じる。

【００１１】いくつかのタイプの腫瘍細胞は、標準の免
疫学的アッセイにより非免疫原性であると思われる。Ｂ
７のみによるそれらの腫瘍のトランスフェクションは、
それらの腫瘍細胞の免疫原性を高めるようには見えな
い。免疫原性の欠如の他に、それらの細胞は、その同系
宿主において腫瘍特異的ＣＤ８⁺ＣＴＬを効果的に誘発
できない。当業界において必要とされるものは、腫瘍細
胞、特に弱い免疫原性又は非免疫原性の腫瘍細胞の免疫
原性、及び特定の細胞毒性Ｔリンパ球を誘発するそれら
の能力を高めるための組成物及び方法である。本発明は
そのような組成物及び方法を提供する。

【００１２】

【発明の要約】本発明は腫瘍細胞の免疫原性を高めるた
めの組成物及び方法を含んで成る。特に、弱いか又は非
免疫原性腫瘍であると思われるものに対する免疫応答が
本発明の組成物及び方法を用いて高められ得る。本発明
の組成物は、トランスフェクトされた腫瘍細胞の表面上
にＢ７及びリガンドＣＤ２を発現するために、Ｂ７をコ
ードする遺伝子及びＣＤ２リガンドをコードする遺伝子
によりトランスフェクトされた腫瘍細胞を含んで成る。
それらの組成物をインビトロ及びインビボで用いて、ト
ランスフェクトされた腫瘍細胞及び非トランスフェクト
された腫瘍細胞の両者に対する免疫応答が高められる。
そのトランスフェクションのために使用される腫瘍細胞
は、腫瘍を担持する患者から単離され得る。

【００１３】腫瘍細胞の免疫応答又は免疫原性を高める
のに使用するための医薬組成物は、トランスフェクトさ
れたＢ７⁺ＣＤ２リガンド⁺腫瘍細胞及び生理学的に許
容できるキャリヤを含むことができる。トランスフェク
トされた腫瘍細胞は生存でき、又は弱毒化された形で供
給され得る。弱毒化とは、細胞が弱毒化されていない細
胞よりもより一層遅く生長し、そして増殖するように弱
められているか又はそれらは死亡していることを意味す
る。組成物はまた、トランスフェクトされたＢ７⁺ＣＤ
２リガンド⁺腫瘍細胞から単離された膜及び生理学的に
許容できるキャリヤを含んで成る。

【００１４】腫瘍細胞に対する免疫応答又は免疫原性を
高めるための方法もまた、本発明に包含され得る。その
ような方法においては、腫瘍細胞、特に非免疫原性又は
弱い免疫原性の腫瘍細胞は、Ｂ７及びＣＤ２リガンドが
トランスフェクトされた腫瘍細胞の表面上に発現される
ようにＢ７をコードする遺伝子及びＣＤ２リガンドをコ
ードする遺伝子によりトランスフェクトされる。トラン
スフェクトされたＢ７⁺ＣＤ２リガンド⁺は、免疫原的
に有効な量での腫瘍を担持する患者への投与の前、増殖
され、そして集められる。その腫瘍細胞は特に非免疫原
性又は弱い免疫原性であり、そしてさらにより特定に
は、腫瘍を担持する患者から単離される。本発明の方法
はまた、弱毒化された、トランスフェクトされたＢ７⁺
ＣＤ２リガンド⁺腫瘍細胞又はトランスフェクトされた
腫瘍細胞から単離された膜を投与することも含んで成
る。

【００１５】さらに、本発明は、腫瘍反応性細胞毒性Ｔ
リンパ球応答を刺激するための方法も包含する。それら
の方法においては、腫瘍細胞、特に弱い免疫原性の又は
非免疫原性の腫瘍細胞が、Ｂ７及びＣＤ２リガンドがト
ランスフェクトされた腫瘍細胞の表面上に発現されるよ
うに、Ｂ７をコードする遺伝子及びＣＤ２リガンドをコ
ードする遺伝子によりトランスフェクトされる。弱毒化
された形で生存するか又は細胞膜としてのそれらのトラ
ンスフェクトされた細胞は、免疫学的に有効な量で腫瘍
を担持する患者に投与される。腫瘍細胞に対する免疫応
答が検出された後すぐに、リンパ球が腫瘍を担持する患
者から単離され得る。

【００１６】単離されたリンパ球は、腫瘍反応性細胞毒
性Ｔリンパ球応答を高めるために、腫瘍細胞、すなわち
Ｂ７⁺ＣＤ２リガンド⁺又は親腫瘍細胞のいづれか及び
インターロイキン２の存在下でインビトロで増殖され
る。十分なＣＴＬが得られた後、ＣＴＬは生理学的に許
容できるキャリヤと共に配合され、そして腫瘍を担持す
る患者に再び投与される。種々のサイトキニン及びイン
ターロイキンが、細胞毒性応答をさらに強めるためにＣ
ＴＬと共に組合され得る。

【００１７】図１は、Ａｇ１０４トランスフェクタント
上でのＣＤ４８及びＢ７−１分子の発現を示す。細胞
は、ＦＩＴＣ−接合抗−ＣＤ４８ｍＡｂ、抗−Ｂ７−１
ｍＡｂ又は対照のｍＡｂにより染色され、そしてＦＡＣ
Ｓ分析にかけられた。合計５，０００個の細胞が個々の
サンプルのために分析された。

【００１８】図２は、同系マウスにおいてＣＤ４８⁺Ａ
ｇ１０４により誘発された腫瘍の増殖を示す。マウス
は、示される細胞を１×１０⁶個の細胞／マウスで皮下
注射された。腫瘍の大きさが、カリパスにより直角に直
径を測定することによって毎週評価された。腫瘍が直径
２０〜３０mmに達し、重度の潰瘍及び出血が進行し、又
はマウスが死亡した場合、実験は停止された。その結果
は、それぞれ５匹のマウスから成るグループからの腫瘍
の平均直径（mm）として表わされた。誤差バーは、平均
の標準偏差を示す。類似する結果が個々の細胞系による
少なくとも２回の実験において得られた。

【００１９】図３（Ａ）及び（Ｂ）は、ＣＤ４８⁺又は
ＣＤ４８⁺Ｂ７⁺Ａｇ１０４細胞のいづれかにより免疫
化されたマウスから生成されるＣＴＬ活性及びそれらの
特異性の比較を示す。５匹のマウスから成るグループ
に、ＣＤ４８⁺Ａｇ１０４細胞（Ｂ）又はＣＤ４８⁺Ｂ
７⁺Ａｇ１０４細胞（Ａ）のいづれかを１×１０⁶個の
細胞／マウスで皮下注射した。脾臓細胞を、注射から１
４日後に調製し、そしてγ−照射された野生型Ａｇ１０
４細胞と共に５日間、同時培養した。⁵¹Ｃｒ−ラベルさ
れた標的細胞に対するＣＴＬ活性を測定した。

【００２０】図４は、細胞毒性Ｔ細胞クローンＣＴＬの
養子移入による野生型Ａｇ１０４細胞の３日間の肺微小
転移巣の治療を示す。１０匹から成るグループのマウス
に、野生型Ａｇ１０４細胞を１×１０⁶個の細胞／マウ
スで静脈内に注射した。３日後、マウスに、５×１０⁶
個の細胞を細胞毒性Ｔ細胞系Ａ１ＣＴＬを、静脈内注射
により及び次の日、１０⁴Ｕの組換えヒトＩＬ−２を腹
腔内注射により３日間、１日１度処理した。対照グルー
プは、塩溶液のみ、ＩＬ−２のみ又はＨ−２ｄ抗原に対
して特異的なＣ３Ｈ−由来のＣＴＬ系及びＩＬ−２の組
合せのいづれかを注射されたマウスを包含した。マウス
は、生存する間、毎日モニターされた。

【００２１】

【好ましい態様の記載】本発明は、腫瘍細胞の免疫原性
を高めるための組成物及び方法に向けられる。特に、本
発明の組成物及び方法は、腫瘍を担持する患者が腫瘍に
対して高められた免疫応答を有するように弱い免疫原性
又は非免疫原性の腫瘍細胞の免疫原性を高めるために使
用される。本発明の組成物は、Ｂ７及びＣＤ２リガンド
がトランスフェクトされた腫瘍細胞の表面上に発現され
るように、Ｂ７をコードする遺伝子、共同刺激分子ＣＤ
２８及びＣＴＬＡ４のためのリガンド並びにＣＤ２のた
めのリガンドをコードする遺伝子によりトランスフェク
トされた腫瘍細胞を含んで成る。腫瘍を担持する患者へ
のトランスフェクトされた（Ｂ７⁺ＣＤ２リガンド ⁺）
腫瘍細胞の投与は、トランスフェクトされた及び最とも
重要なことには、非トランスフェクトされた腫瘍細胞の
両者に対する応答を高めるように免疫システムを刺激す
る腫瘍細胞の免疫原性を高める。

【００２２】腫瘍細胞は、黒色腫、癌、たとえば乳癌、
結腸癌、膵臓癌、膀胱癌、卵巣癌、等、又は中でも肉腫
であり得る。腫瘍細胞源は、腫瘍を担持する患者又は腫
瘍細胞バンク、たとえばAmerican Type Culture Collec
tionからであり得る。腫瘍細胞の免疫原性は、当業者に
良く知られている方法により決定され得るが、しかし基
本的には、一定数の腫瘍細胞により宿主を免疫化し、そ
して腫瘍細胞に対する宿主による免疫応答の程度を決定
することを必要とする。そのアッセイは、たとえば標準
的⁵¹Ｃｒ細胞溶解アッセイ(Chen et al., 1992, J.Immu
nol. 148：2617-2621)によることができる。非免疫原性
又は弱い免疫原性の腫瘍は、免疫応答が検出され得ない
か又はひじょうに低い応答が検出されるかいづれかのも
のである。

【００２３】Ｂ７−１（ＣＤ８０）及びＢ７−２（Ｂ７
０，ＣＤ８２）を包含するＢ７は、Ｔ細胞仲介の抗腫瘍
免疫性の誘発において共同刺激物であることが知られて
いる(Chen et al., 1993, Immunol.Today 14：483-486
； G.Yang et al., 1995, J.Immunol. 154：2794-280
0)。Ｂ７をコードするベクターの構成及び腫瘍細胞のト
ランスフェクションへのそれらの使用は記載されてい
る。Ｂ７によりトランスフェクトされた非免疫原性腫瘍
及び弱い免疫原性の腫瘍細胞は、保護免疫性又は高めら
れた腫瘍反応性細胞溶解Ｔ細胞応答のいづれかを誘発す
ることができない。

【００２４】本発明においては、ＣＤ２リガンドの全体
のリーディングフレームをコードするＤＮＡフラグメン
トは、Chen et al., 1991, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8
8：110-114 により記載されているように、逆転写と組
合わせたポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）により増幅され
得る。センス及びアンチセンスプライマーは、種々のＤ
ＮＡフラグメントの操作のために制限部位を含むように
設計される。ヒトの系のモデルとして、ネズミＣＤ２リ
ガンドをコードするＤＮＡフラグメントが使用された。
マウスにおいては、ＣＤ４８はＴ細胞レセプターＣＤ２
に関係していたことが最近わかった(Kato et al., 199
2, J.Exp.Med. 176：1241-1249)。Ｔ細胞レセプターＣ
Ｄ２への抗−ＣＤ２モノクローナル抗体の結合は、Ｔ細
胞を活性化し、そしてそれらの増殖を誘発することが長
く知られている (Bierer and Hahn, 1993, Seminar in
Immunol. 5：249-261)。

【００２５】ヒトの場合、ヒトＣＤ２リガンド、たとえ
ばＬＦＡ−３（ＣＤ５８），ＣＤ５９又はＣＤ４８をコ
ードするＤＮＡ配列が使用されよう。ＣＤ２リガンドを
コードする前記ＤＮＡ配列が増幅された後、そのフラグ
メントは当業界において入手できる多くのベクター、た
とえばｐＲＣ／ＣＭＶ，ｐＬＸＳＨＤ又はＣＤＭ８の１
つに挿入され得る。ベクターはＢ７又はＣＤ２リガンド
のためのコード領域を含み、又は両者をコードすること
ができ、異種ＤＮＡの量に依存して、特定の選択された
ベクターが収容され得る。遺伝子操作のための方法は当
業者に良く知られている(Sambrook et al., 1989, Mole
cular Cloning, A Laboratory Manual,2nd Ed., Cold S
pring Harbor Laboratoriesを参照のこと) 。次に、発
現ベクターは、エレクトロポレーション、ＣａＣｌ₂沈
殿法、注入法又は他の良く知られた技法により腫瘍細胞
中にトランスファーされ得る。

【００２６】Ｂ７及びＣＤ２リガンド構造体はまた、他
の方法、たとえばレトロウィルス (Kuriyama et al., 1
991, Cell Struc.and Func. 16：503-510)又は免疫リポ
ソーム (Martin and Papahadipoules, 1982, J.Biol.C
hem. 257：286-288)をベクターの導入のためのビークル
として用いることによって腫瘍細胞中に導入され得る。
当業者は、多くの他の方法が利用でき、そして本発明は
使用される特定の方法により限定されないことを認識す
るであろう。

【００２７】腫瘍細胞の集団がＢ７及びＣＤ２リガンド
をコードするベクターによりトランスフェクトされた
後、Ｂ７及びＣＤ２リガンドの両者をそれらの表面上に
発現するそれらのトランスフェクトされた腫瘍細胞につ
いてスクリーンする必要がある。トランスフェクトされ
た細胞についてのスクリーニングは、流動細胞計測分析
のような方法により実施され得、ここでＢ７及びＣＤ２
リガンドに対して特異的な抗体が螢光分子によりラベル
され、そしてＢ７及びＣＤ２リガンドの両者に対して陽
性であるそれらの細胞が非トランスフェクトされた及び
個々にトランスフェクトされた腫瘍細胞から分離され
る。都合良く形質転換された細胞はまた、他の良く知ら
れた方法、たとえばトランスフェクトされた細胞のＤＮ
Ａ含有量を分析する方法、ＥＬＩＳＡアッセイ又はいづ
れか他の抗体に基づくアッセイシステムにより同定され
得る。トランスフェクトされた腫瘍細胞の表面上でのＢ
７及びＣＤ２リガンドについて試験できる他のアッセイ
もまた、当業者に知られている。

【００２８】本発明のトランスフェクトされたＢ７⁺及
びＣＤ２リガンド⁺腫瘍細胞は、腫瘍に対する患者の免
疫応答を高めるために腫瘍を担持する患者に再び投与さ
れ得る医薬組成物の調製に直接的に使用され得る。その
ような調製においては、トランスフェクトされた腫瘍細
胞が生理学的に許容できるキャリヤと共に組合され得
る。生理学的に許容できるキャリヤとは、生理学的条件
に近い水溶液を意味する。種々の生理学的に許容できる
キャリヤが当業界において知られており、そしてたとえ
ば水、緩衝水、種々の濃度の塩溶液、グリシン、及び同
様のものが使用され得る。補助物質、たとえばpH調整及
び緩衝剤、毒性調整剤及び同様のもの、たとえば酢酸ナ
トリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシ
ウム、乳酸ナトリウム、等が、生理学的条件に近づくた
めに、必要により添加され得る。

【００２９】トランスフェクトされた腫瘍細胞はまた、
弱毒化された形でも使用され得る。弱毒化とは、トラン
スフェクトされた腫瘍細胞が増殖するそれらの能力を減
じ又は停止するように弱められ又は殺害されていること
を意味する。この弱められた又は殺された状態を達成す
るための方法は当業界において良く知られており、そし
て化学物質、加熱又は放射線によるトランスフェクトさ
れた細胞の処理を包含する。たとえば、トランスフェク
トされた腫瘍細胞のサンプルは、約３，０００〜１５，
０００ラドのγ線により２〜１０分間、γ−照射され得
る。この処理は、トランスフェクトされた腫瘍細胞の表
面上の分子の免疫原性又は抗原性エピトープに損傷を与
えないで又はそれを変えないで細胞を殺害する。

【００３０】本発明のトランスフェクトされた腫瘍細胞
からの細胞膜はまた、医薬組成物の調製にも使用され得
る。トランスフェクトされた腫瘍細胞は、当業界におい
て知られているいくつかの方法、たとえば音波処理、Fr
onchプレス又は他の機械的手段のいづれか１つにより、
又は酵素又は他の化学物質等を用いることにより破壊さ
れ又は溶解され得る。トランスフェクトされた腫瘍細胞
が破壊された後すぐに、細胞膜は、たとえば傾斜遠心分
離、分画遠心分離又は同様の手段により単離され得る。
次に、集められた膜は、腫瘍を担持する患者に再び投与
される組成物を得るために生理学的に許容できるキャリ
ヤと共に配合され得る。

【００３１】患者を治療する場合、本発明の組成物は、
存在する癌治療、たとえば手術、放射線療法及び化学療
法にアジュバンドとして多分使用されるであろう。腫瘍
負荷の大部分が除去された後、本発明の組成物が、腫瘍
を担持する患者の免疫応答を強めるために免疫学的に有
効な量で投与され得る。この増強された免疫応答は、腫
瘍の再発、初期治療により破壊されなかった腫瘍細胞の
転移性病巣の増殖又は再増殖を遅め、又は停止せしめ
る。本発明のこの提案された使用は二次又は補助治療と
して本発明の組成物の使用を制限するのではないが、し
かし本発明の組成物がいかにして最初に使用されるかに
ついての骨格を提示している。

【００３２】免疫応答を高めるために必要な免疫原的に
有効な量を構成するトランスフェクトされた腫瘍細胞又
はトランスフェクトされた腫瘍細胞膜の正確な量又は数
は、患者の健康状態、トランスフェクトされた腫瘍細胞
の免疫原性及び他の要因に依存するであろう。一回又は
複数回の投与が、処理する医者により選択される投与量
レベル及び投与のパターンを伴って実施され得る。本発
明の組成物に対する患者の免疫応答をいかにモニターす
るかについての方法は当業界において良く知られてお
り、そして投与量レベルをいかに調節するかについての
手段もまた、良く知られている。いづれにせよ、本発明
の医薬組成物は、腫瘍に対する患者の免疫応答を効果的
に増強するのに十分な量のトランスフェクトされたＢ７
⁺及びＣＤ２リガンド⁺腫瘍細胞又は腫瘍細胞膜に供給
すべきである。

【００３３】腫瘍を担持する患者の処理のための好まし
い方法においては、癌のための主要な処理法の一部とし
て腫瘍が患者から除去され得る。次に、その腫瘍が個々
の細胞に分割される。次に、腫瘍細胞の単一の細胞懸濁
液は、Ｂ７及びＣＤ２リガンドがトランスフェクトされ
た腫瘍細胞の表面上に発現されるように、Ｂ７をコード
する遺伝子及びＣＤ２リガンドをコードする遺伝子によ
りトランスフェクトされ得る。

【００３４】それらの表面上でＢ７⁺及びＣＤ２リガン
ド⁺の両者を発現する細胞が選択され、そして腫瘍を担
持する患者に戻す前、生理学的に許容できるキャリヤと
配合される。患者の状態に依存して、治療する医者は、
トランスフェクトされたＢ７⁺及びＣＤ２リガンド⁺腫
瘍細胞の免疫原的に有効な量のために必要とされる用量
を決定する。組成物は医者の判断で一回の投与又は複数
回の投与のいづれかで投与され得る。患者は、得られ
た、腫瘍に対する免疫応答の上昇を決定するために標準
の方法によりモニターされる。

【００３５】本発明のもう１つの治療法は、腫瘍反応性
細胞毒性Ｔリンパ球応答を刺激するための方法である。
その方法は、トランスフェクトされた腫瘍細胞の表面上
にＢ７及びＣＤ２リガンドが発現されるようにＢ７をコ
ードする遺伝子及びＣＤ２リガンドをコードする遺伝子
により、腫瘍を担持する患者から除去された腫瘍細胞を
トランスフェクトすることを含んで成る。その表面上に
Ｂ７及びＣＤ２リガンドを発現するこのトランスフェク
トされた腫瘍細胞は、免疫原的に有効な量で腫瘍を担持
する患者に再び投与される。

【００３６】一定時間の後、患者は腫瘍細胞に対する免
疫応答についてモニターされ、そして十分な応答が検出
された後、リンパ球がその患者から単離される。次に、
単離されたリンパ球は、好ましくは腫瘍反応性細胞毒性
Ｔリンパ球の数を高めるために、好ましくは非トランス
フェクトされた又はトランスフェクトされた腫瘍細胞及
びリンホカイン又はサイトキニン、たとえばインターロ
イキン−２の存在下でインビトロで増殖され得る。活性
化されたリンパ球が集められ、そして生理学的に許容で
きるキャリヤと共に組合される。

【００３７】次に、腫瘍反応性細胞毒性Ｔリンパ球の治
療的有効量が腫瘍を担持する患者に戻される。治療的有
効量とは、インビボでの腫瘍細胞殺害を増強するのに十
分な数の細胞毒性Ｔリンパ球を意味する。上記のような
養子免疫療法は当業界において知られている（たとえ
ば、 Rosenberg et al., 1986, Science 233：1318-132
1 を参照のこと）。従って、上記方法の変更及び修飾は
予期され、そして当業者によって理解されている。

【００３８】

【実施例】次の実験データ及び情報は例示的であって、
本発明の範囲を制限するものではない。例マウス及び細胞系雌の生後４〜６週のＣ３Ｈ／ＨｅＮ（Ｃ３Ｈ）マウス
を、Jackson Laboratory(Bar Harbor, ME) から購入し
た。Ａｇ１０４、すなわちＣ３Ｈ（Ｈ−２^K）起原の自
発的線維肉腫(Ward et al., 1989, J.Exp.Med. 170：21
7-232)が、 University of Chicagoの Dr.Hans Schreib
erにより供給された。ＥＬ４胸腺腫（ＡＴＣＣＴ１Ｂ
４０）は、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２^b）起原のものであ
る。

【００３９】Ｒ１．１．リンパ腫（ＡＴＣＣＴ１Ｂ４
２）は、ＤＢＡ２（Ｈ−２^d）マウス由来のものであ
る。ＹＡＣ−１（ＡＴＣＣＴ１Ｂ１６０）は、ＡＳｎ
（Ｈ−２^a）起原の天然のキラー感受性リンパ腫であ
る。ＡＴＣＣと称する腫瘍系は American Type Culture
Collection, Rockville, Marylandから得られた。得ら
れた後すぐに、すべての腫瘍はインビトロですばやく拡
張され、そして実験の変動を低めるために凍結された。
すべての細胞は、インビボ実験の前、１カ月を越えない
期間、１０％ウシ胎児血清(FCS, HyClone, Logan, Uta
h) を含むＤＭＥＭにおいて３７℃でインビトロで維持
された。

【００４０】ネズミＣＤ４８のクローニング及びトラン
スフェクションネズミＣＤ４８の完全なリーディングフレームをコード
するＤＮＡフラグメントを、ＥＬ４細胞から調製された
全ＲＮＡから逆転写と組合せたＰＣＲ(Chen etal., 199
1, Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 88：110-114)により増幅
した。センスプライマー（５′−GCTAAAGCTTCTCGAACCGC
CACCATGTGCTTCATAAAACAGGGAT−３′）（配列番号１）
は、ネズミＣＤ４８ｃＤＮＡ(Wong et al., 1990, J.
Exp.Med. 171：2115-2130)の５１−７２ヌクレオチドに
対応するオリゴヌクレオチド及びＨｉｎｄIII 及びＸｈ
ｏＩのための制限部位から成る。

【００４１】アンチセンスプライマー（５′−CGTAAAGC
TTCTCGGAGTCTAGAGTTCCTTGTCAGGTTAACAG −３′）（配列
番号２）は、ネズミＣＤ４８ｃＤＮＡの７６２−７７
３ヌクレオチド及びＨｉｎｄIII ，ＸｈｏＩ及びＸｂａ
Ｉに対応する。ＰＣＲ生成物はベクターｐＲＣ／ＣＭＶ
(Invitrogen, San Diego, CA) 中に直接的にクローン化
された。ネズミＣＤ４８の配列を、ＤＮＡ配列決定分析
により実証した。Ａｇ１０４細胞をエレクトロポレーシ
ョンによりこのベクターによりトランスフェクトし、そ
してそのトランスフェクタントを、１mg／mlのＧ４１８
(Life Technologies, Grand Island, NY) を含む培地に
おいて選択した。Ｂ７⁺Ａｇ１０４細胞をまた、前記ベ
クターによりトランスフェクトし、そして陽性のクロー
ンを記載されるようにしてＦＡＣＳにより分類した(Che
n et al., 1992, Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 88：110-11
4)。

【００４２】抗体精製され、そしてフルオレセインイソシアネート−（Ｆ
ＩＴＣ−）又はＰＥ−接合の（フィコエリテリン−）モ
ノクローナル抗体１Ｇ１０（抗−マウスＢ７−１，Phar
minGen, San Diego, CA)及びＯＸ−７８（抗−マウスＣ
Ｄ４８、ラットＩｇＧ２ａ，BioSource International,
Camarillo, CA) を使用した。ＨＡｂ１０．２（抗−ヒ
トＣＤ５）を対照として用いた。免疫染色及び流動細胞計測分析単一細胞の懸濁液を、ＦＩＴＣ−接合のｍＡｂ及び／又
はＰＥ−接合のｍＡｂと共に１０μｇ／mlで４℃で３０
分間、インキュベートし、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ
により２度洗浄し、そしてCouler Epics CIV細胞計測器
上で分析した。

【００４３】細胞毒性Ｔリンパ球活性の生成及びアッセ
イ腫瘍細胞に対するＣＴＬ応答を誘発し、そしてそれにつ
いてアッセイするための方法は記載されており(Chen et
al., 1992, J.Immunol. 148：2617-2621)、そして少々
の変性を伴って使用した。手短に言及すれば、４グルー
プにおけるＣ３Ｈマウス（ｎ＝５）を、偽りのトランス
フェクトされた、又はＢ７⁺，ＣＤ４８⁺又はＢ７⁺Ｃ
Ｄ４８⁺トランスフェクトされたＡｇ１０４細胞により
１×１０⁶個の細胞／マウスでそれぞれ皮下注射した。
１０日後、増殖する腫瘍節を切除した。７〜２１日後、
個々のグループからのマウスを殺し、そして単一細胞の
懸濁液を脾臓から調製した。

【００４４】次に、脾臓細胞を、２４−ウェルプレート
（Costa, Cambridge, MA) においてγ−照射された野生
型Ａｇ１０４（非トランスフェクトされた）細胞（１
０，０００ラド）と共に５日間、同時培養した。長期間
のＴ細胞系を、上記のようにして(Chen et al., 1992,
J.Immunol. 148：2617-2621)、５Ｕ／mlで、γ−照射さ
れたＢ７⁺ＣＤ４８⁺Ａｇ１０４細胞（１０，０００ラ
ド）及びＣ３Ｈマウスからのγ−照射された脾臓細胞
（３，０００ラド）によりヒト組換えＩＬ−２(Cetus,
CA) の存在下で脾臓細胞培養物を７〜１０日ごとに再刺
激することによって生成した。リンパ球の細胞溶解活性
を、図に示されるように異なったＥ／Ｔ比で標準の４時
間の⁵¹Ｃｒ開放アッセイで試験した。抗体阻止実験にお
いては、ｍＡｂは４時間の培養の間、含まれた。

【００４５】腫瘍形成研究トランスフェクタントの腫瘍形成を、１mlの注射器を用
いて２６−ゲージの針を通して１×１０⁶個の細胞を
０．１mlの体積でマウスの右背部中に注射することによ
ってアッセイした。マウスを４〜８日ごとに腫瘍増殖に
ついて評点を付け、そして腫瘍の大きさを、カリパスを
用いてmm単位で２つの垂直な直径を測定することによっ
て記録を付けた。

【００４６】Ａｇ１０４により誘発された、確立された
微小転移巣の腫瘍特異的細胞毒性Ｔリンパ球の養子免疫
療法これらの実験は、少々の変更を伴って、記載されている
ような方法(Kahn et al., 1991, J.Immunol. 146：235-
341)に従った。手短に言及すれば、１０匹のグループに
おけるＣ３Ｈマウスに、１×１０³個のＡｇ１０４腫瘍
細胞をマウス当たり静脈内投与した。

【００４７】３日後、マウスに５×１０⁶個の細胞の腫
瘍特異的ＣＴＬ系（Ａ１ＣＴＬ）又はＣ３Ｈ由来の抗−
Ｈ−２^dＣＴＬ系（Grabstein, 1980, Selected Method
s inCellular Immunology, Michell et al., eds. 124-
127ページ、W.H.Freeman &Co.)を静脈内注射し、続いて
４日目、１０⁴ＵのｒＩＬ−２(Cetus Corp., Emeryvil
le, CA) を３日間毎日、腹腔内注射した。マウスの他の
グループは同じ用量のｒＩＬ−２のみにより処理される
か、又は未処理のまま放置した。マウスを生存の間、毎
日モニターし、そしてマウスが死亡しつつあるように見
えた場合、そのマウスを殺害し、そして肺を転移の確認
のために切除した。

【００４８】結果及び議論Ａｇ１０４は、成熟したＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスからの自
然に発生した肉腫であり、そして種々の免疫化及びチャ
レンジ方法により保護免疫性を誘発することはできない
(Chen et al., 1994, J.Exp.Med. 179：523-532)。遺伝
子トランスファーによるＢ７−１コスティミュレーター
の発現は、Ａｇ１０４細胞を免疫原性にせず、そしてＢ
７−１を発現するＡｇ１０４細胞による免疫化はＣＴＬ
応答を誘発することができず(Chen et al., 1994, J.Ex
p.Med. 179：523-532)、この肉腫系の不完全な免疫原性
の性質を示す。

【００４９】特定のｍＡｂによるＭＨＣ及び共同刺激性
分子の発現のＦＡＣＳ分析は、Ａｇ１０４系がＨ−２Ｋ
^K，Ｄ^K及び血管細胞付着分子１（ＶＣＡＭ−１）の両
者を高レベルで発現するが、しかしそれはＭＨＣクラス
II及びいくつかの可能性ある共同刺激性分子、たとえば
Ｂ７−１，Ｂ７−２，ＣＤ４８、細胞間付着分子１，２
（ＩＣＡＭ−１／II）及び熱安定性抗原（ＨＳＡ）を発
現しない（データは示されていない）ことを示した。

【００５０】ネズミＣＤ４８遺伝子を含む組換えプラス
ミド、ｐＲＣ／ＣＭＶ−ｍＣＤ４８を構成した。このベ
クターはＣＤ４８リーディングクレームの発現を誘導す
るためにＣＭＶプロモーターを用いており、そしてま
た、薬物選択のためのネオマイシン耐性遺伝子も含む。
腫瘍系、たとえば野生型Ａｇ１０４又はＢ７−１⁺Ａｇ
１０４(Chen et al., 1994, J.Exp.Med. 179：523-532)
をこのベクターによりトランスフェクトし、そして個々
のラインから得られたクローンをＣＤ４８の発現のため
にＦＡＣＳによりスクリーンした。それらの表面上にＣ
Ｄ４８及び／又はＢ７−１を安定して発現した個々の腫
瘍系からの３〜５個のクローンを追加の実験のために取
った。インビボ腫瘍形成試験（図２を参照のこと）の
後、個々のラインからの１つのクローンを追加の実験の
ために選択した。いくつかの代表的なクローンにおける
ＣＤ４８及びＢ７−１発現が図１に示されている。

【００５１】図２に示されるように、野生型のＡｇ１０
４腫瘍は接種されたすべてのマウスにおいて漸進的に増
殖した。腫瘍はまた、トランスフェクトされたＣＤ４８
⁺Ａｇ１０４及びＢ７⁺Ａｇ１０４腫瘍細胞により接種
されたマウスにおいても漸進的に増殖した。対照的に、
ＣＤ４８及びＢ７−１の両者、すなわちＢ７⁺ＣＤ４８
⁺Ａｇ１０４を発現するトランスフェクタントは、同系
Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスにおいての一時的な増殖の後、完
全に後退した。それらのデータは、ＣＤ４８とＢ７−１
との間の相乗性が、Ａｇ１０４腫瘍の増殖の阻害のため
の効果的な宿主応答の誘発において必要とされることを
示す。

【００５２】ＣＤ４８⁺Ｂ７⁺Ａｇ１０４腫瘍系の低め
られた腫瘍形成が特定のＣＴＬ応答の誘発に関与してい
ることを示すために、コトランスフェクタントにより免
疫化されたマウスからの脾臓細胞を収穫し、そして照射
された野生型のＡｇ１０４細胞及びＩＬ−２との５日間
の同時培養により、さらにインビトロで刺激した。続い
て、それらを標準の⁵¹Ｃｒ開放アッセイにおいてＣＴＬ
活性について試験した。図３に示されるように、ＣＤ４
８⁺Ｂ７⁺Ａｇ１０４細胞により免疫化されたマウスか
らの多量培養された脾臓細胞は野生型のＡｇ１０４細胞
に対して高レベルのＣＴＬ活性を示した（図３
（Ａ））。対照的に、ＣＤ４８⁺Ａｇ１０４（図３
（Ｂ））又はＢ７⁺Ａｇ１０４（データは示されていな
い）により免疫化されたマウスからの多量培養された脾
臓細胞は、野生型のＡｇ１０４標的に対していづれの有
意なＣＴＬ活性も示さなかった。

【００５３】Ｂ７⁺ＣＤ４８⁺Ａｇ１０４−免疫化マウ
スからの多量培養されたＣＴＬはまた、それらが天然の
キラー細胞感受性ＹＡＣ−１細胞系を中ぐらいのレベル
で溶解したので、天然のキラー細胞様活性を示した。し
かしながら、Ａｇ１０４は天然のキラー細胞仲介の溶解
に対して耐性であり（データは示されていない）、これ
は野生型のＡｇ１０４の溶解が特定の細胞溶解性Ｔ細胞
により仲介されることを示す。この表示は、多量培養さ
れたＣＴＬの溶解に対しての、いくつかの同系及び異系
腫瘍系、たとえばＫ１７３５−Ｍ２黒色腫及びＥＬ４リ
ンパ腫の耐性によりさらに支持される（図３（Ａ））。

【００５４】共トランスフェクトされたＣＤ４８⁺Ｂ７
⁺Ａｇ１０４系により免疫化されたマウスから誘発され
た細胞毒性Ｔリンパ球が有力なＣＴＬ系を誘発するため
にインビトロで増殖され得るかいづれかを決定するため
に、ＣＤ４８⁺Ｂ７⁺Ａｇ１０４系により免疫化された
マウスからの脾臓細胞をくり返して刺激し、そして１０
カ月でＣＴＬ活性を試験した。代表的なＣＴＬ系、すな
わちＡ１ＣＴＬは、Ａｇ１０４細胞に対して高い特異性
を示し、そしていくつかの他の腫瘍系、たとえばＹＡＣ
−１細胞を溶解しなかった。Ａ１ＣＴＬ系のうち、９９
％以上の細胞がＣＤ８⁺であることがまた見出された
（データは示されていない）。それらのデータは、Ａｇ
１０４に対して特異的なＣＴＬ系が長期間インビトロで
増殖され得、そして細胞溶解活性が強められることを示
す。

【００５５】増殖された細胞毒性Ｔリンパ球が確立され
た野生型腫瘍の処理に利用され得るか否かを試験するた
めに、肺微小転移モデルを用いた。図４に示されるよう
に、１×１０⁶個の細胞／マウスでの野生型Ａｇ１０４
細胞によるＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスの静脈内注射は、約５
０日以内ですべてのマウスの死を導びく。しかしなが
ら、Ａ１ＣＴＬ系及びＩＬ−２により処理されたマウス
は６０日以上にわたって生存した。対照的に、ＩＬ−２
又は対照のＣＴＬ系と組合してのＩＬ−２のいづれかに
より処理されたマウスはマウスの生存性を引き延ばさな
かった（図４）。死亡したマウスを、全体的な病理学に
ついて十分に試験し、そして肺における腫瘍増殖が無く
なったことが見出された。

【００５６】不完全な免疫原性肉腫Ａｇ１０４上でのＢ
７−１分子によるＣＤ４８の同時発現は、腫瘍抗原に対
する有力なＣＴＬ応答の誘発を可能にした。従って、不
完全な免疫原性腫瘍細胞でさえ、それらの可能性ある抗
原は効果的なＣＴＬ応答をインビボで誘発しないが、Ｃ
ＴＬのための標的としてインビトロ及びインビボで作用
できる腫瘍特異的抗原を発現する。さらに、得られた細
胞毒性Ｔリンパ球はインビトロで増殖することができ
ず、そしてさらに、初期処理に続いて、腫瘍を潜在的に
治癒し又は腫瘍の後退を防ぐために養子免疫療法のため
に使用され得る。前述の記載及び例は本発明の例示であ
って、限定するものではない。多くの変更及び修飾が本
発明の範囲内で実施できる。

【００５７】

【配列表】

（１）一般的な情報（ｉ）出願者：CHEN LIEPING HELLSTROM, KARL ERIK （ii）発明の名称：腫瘍細胞の免疫原性を高めるための
組成物及び方法 (iii)配列の数：２（２）配列番号１についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：４６個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ（xi）配列：配列番号１： GCTAAAGCTT CTCGAACCGC CACCATGTGC TTCATAAAAC AGGGAT 46

【００５８】（２）配列番号２についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：４３個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ（xi）配列：配列番号２： CGTAAAGCTT CTCGGAGTCT AGAGTTCCTT GTCAGGTTAA CAG 43

【図面の簡単な説明】

【図１】これは、Ａｇ１０４トランスフェクタント上で
のＣＤ４８及びＢ７−１分子の発現を示す。

【図２】これは、同系マウスにおけるＣＤ４８⁺Ａｇ１
０４により誘発された腫瘍の増殖を示す。

【図３】これは、ＣＤ４８⁺Ｂ７⁺Ａｇ１０４細胞
（Ａ）又はＣＤ４８⁺Ａｇ１０４細胞（Ｂ）により免疫
化されたマウスから生成されるＣＴＬ活性及びそれらの
特異性を示す。

【図４】これは、細胞毒性Ｔ細胞クローンＣＴＬの養子
移入による野生型Ａｇ１０４細胞の３日間の肺微小転移
巣の治療を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 15/09 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者カールエリックヘルストロームアメリカ合衆国，ワシントン 98105− 5407，シアトル，ノースイーストサーバードライブ 3925

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】トランスフェクトされた腫瘍細胞の表面
上にＢ７及びＣＤ２リガンドを発現せしめるために、Ｂ
７をコードする遺伝子及びＣＤ２リガンドをコードする
遺伝子によりトランスフェクトされた腫瘍細胞を含んで
成る組成物。
【請求項２】前記ＣＤ２リガンドがヒトＬＦＡ−３，
ＣＤ５８，ＣＤ５９又はＣＤ４８である請求項１記載の
組成物。
【請求項３】前記腫瘍細胞が患者の腫瘍から単離され
たものである請求項１記載の組成物。
【請求項４】前記トランスフェクトされた腫瘍細胞が
弱毒化されている請求項１記載の組成物。
【請求項５】前記腫瘍細胞が非免疫原性又は弱い免疫
原性である請求項１記載の組成物。
【請求項６】トランスフェクトされた腫瘍細胞の表面
上にＢ７及びＣＤ２リガンドを発現せしめるために、Ｂ
７をコードする遺伝子及びＣＤ２リガンドをコードする
遺伝子によりトランスフェクトされた腫瘍細胞及び生理
学的に許容できるキャリヤを含んで成る、腫瘍に対する
免疫原応答の刺激に使用するための医薬組成物。
【請求項７】前記ＣＤ２リガンドがヒトＬＦＡ−３，
ＣＤ５８，ＣＤ５９又はＣＤ４８である請求項６記載の
医薬組成物。
【請求項８】前記腫瘍細胞が患者の腫瘍から単離され
たものである請求項６記載の医薬組成物。
【請求項９】前記トランスフェクトされた腫瘍細胞が
弱毒化されている請求項６記載の医薬組成物。
【請求項１０】前記腫瘍細胞が非免疫原性又は弱い免
疫原性である請求項６記載の医薬組成物。
【請求項１１】トランスフェクトされ腫瘍細胞の表面
上にＢ７及びＣＤ２リガンドを発現せしめるために、Ｂ
７をコードする遺伝子及びＣＤ２リガンドをコードする
遺伝子によりトランスフェクトされた腫瘍細胞から単離
された細胞膜を含んで成る組成物。
【請求項１２】前記ＣＤ２リガンドがヒトＬＦＡ−
３，ＣＤ５８，ＣＤ５９又はＣＤ４８である請求項１１
記載の組成物。
【請求項１３】腫瘍細胞の免疫原性を高めるための方
法であって：（ａ）Ｂ７及びＣＤ２リガンドがトランスフェクトされ
た腫瘍細胞の表面上に発現されるようにＢ７をコードす
る遺伝子及びＣＤ２リガンドをコードする遺伝子により
腫瘍細胞にトランスフェクトし；そして（ｂ）トランスフェクトされたＢ７⁺ＣＤ２リガンド⁺
腫瘍細胞の免疫原的に有効な量を腫瘍を担持する患者に
投与する：ことを含んで成る方法。
【請求項１４】前記ＣＤ２リガンドがヒトＬＦＡ−
３，ＣＤ５８，ＣＤ５９又はＣＤ４８である請求項１３
記載の方法。
【請求項１５】前記腫瘍細胞が前記腫瘍を担持する患
者から単離されたものである請求項１３記載の方法。
【請求項１６】前記トランスフェクトされた腫瘍細胞
が弱毒化されている請求項１３記載の方法。
【請求項１７】前記腫瘍細胞が非免疫原性又は弱い免
疫原性である請求項１３記載の方法。
【請求項１８】腫瘍−反応性細胞毒性Ｔリンパ球応答
を刺激するための方法であって：（ａ）Ｂ７及びＣＤ２リガンドがトランスフェクトされ
た腫瘍細胞の表面上に発現されるようにＢ７をコードす
る遺伝子及びＣＤ２リガンドをコードする遺伝子により
腫瘍細胞をトランスフェクトし；（ｂ）前記トランスフェクトされた腫瘍細胞の免疫原的
に有効な量を、腫瘍を担持する患者に投与し；（ｃ）前記腫瘍細胞に対して免疫原的に効果的な応答を
有する、前記腫瘍を担持する患者からリンパ球を単離
し；（ｄ）腫瘍反応性細胞毒性Ｔリンパ球の数を増すため
に、腫瘍細胞又はトランスフェクトされた細胞及びイン
ターロイキン２の存在下で前記単離されたリンパ球をイ
ンビトロで増殖し；そして（ｅ）前記腫瘍反応性細胞毒性Ｔリンパ球の治療的に有
効な用量を、腫瘍を担持する患者に投与する：ことを含んで成る方法。
【請求項１９】前記ＣＤ２リガンドがヒトＬＦＡ−
３，ＣＤ５８，ＣＤ５９又はＣＤ４８である請求項１８
記載の方法。
【請求項２０】前記トランスフェクトされた腫瘍細胞
が弱毒化されている請求項１８記載の方法。
【請求項２１】前記腫瘍細胞が非免疫原性又は弱い免
疫原性である請求項１８記載の方法。