CZ304942B6 - Léčivo pro zvyšování specifické eliminace populace tumorových buněk a farmaceutický prostředek obsahující konjugát fosfát-FITC nebo fosfát-dinitrofenyl - Google Patents

Abstract

Je popsáno použití konjugátu folát-flouresceinisothiokyanátu (neboli –FITC) nebo folát-dinitrofenylu, a sloučeniny schopné stimulace endogenní imunitní odpovědi pro výrobu léčiva používaného pro zvyšování specifické eliminace populace tumorových buněk zprostředkované endogenní imunitní odpovědí u hostitelského živočicha s touto populací, jakož i farmaceutického prostředku, který obsahuje terapeuticky účinná množství uvedeného konjugátu schopného specifické vazby na populaci tumorových buněk v hostitelském živočichovi, pro specifickou eliminaci těchto buněk prostřednictvím imunitní odpovědi.

Description

Tento vynález se týká použití konjugátu folát-fluoresceinisothiokyanátu (neboli -FITC) nebo folát-dinitrofenylu, a sloučeniny schopné stimulace endogenní imunitní odpovědí pro výrobu léčiva používaného pro zvyšování specifické eliminace populace tumorových buněk zprostředkované endogenní imunitní odpovědí u hostitelského živočicha s touto populací, spočívající v kroku podávání tohoto konjugátu folát-FITC nebo folát-dinitrofenylu a této sloučeniny uvedenému hostiteli, přičemž uvedený FITC nebo uvedený dinitrofenyl je rozpoznáván endogenní nebo exogenní protilátkou v hostitelském živočichovi neboje rozpoznáván přímo imunitní buňkou v hostiteli. Tento vynález se také týká farmaceutického prostředku, který obsahuje terapeuticky účinná množství konjugátu folát-FITC nebo folát-dinitrofenylu schopného specifické vazby na populaci tumorových buněk v hostitelském živočichovi pro specifickou eliminaci těchto buněk prostřednictvím získané nebo vrozené imunitní odpovědi, současně podávané protilátky nebo přímo prostřednictvím imunitních buněk hostitele.

Dosavadní stav techniky

Savčí imunitní systém představuje prostředky pro rozpoznávání a eliminaci nádorových buněk, jiných patogenních buněk a invazivních cizích patogenů. Zatímco normálně imunitní systém poskytuje silnou obrannou linii, existuje mnoho případů, při kterých nádorové buňky, jiné patogenní buňky nebo infekční agens obejdou imunitní odpověď a proliferují či přetrvávají za současného patogenního působení na hostitele. Existují chemoterapeutické prostředky a způsoby radiační terapie pro eliminaci replikace novotvarů. Avšak většina, ne-li všechny ze současně dostupných chemoterapeutických prostředků a způsobů radiační terapie, vykazují nepříznivé vedlejší účinky, neboť nejen ničí rakovinové buňky, avšak též ovlivňují normální buňky pacienta, jako jsou buňky krvetvorného systému. Navíc mají chemoterapeutické prostředky omezenou účinnost v případech, ve kterých se u pacienta vyvine rezistence na léky.

Cizí patogeny mohou u pacienta rovněž proliferovat tím, že se vyhnou kompetentní imunitní odpovědi nebo v případech, kdy byl imunitní systém pacienta ohrožen lékovou terapií nebo jinými zdravotními problémy. I když existuje řada terapeutických sloučenin, jsou mnohé patogeny rezistentní nebo se stávají rezistentními nebo tyto terapeutické prostředky. Schopnost rakovinových buněk a infekčních organismů vyvinout rezistenci na terapeutické prostředky a nepříznivé vedlejší účinky současně dostupných protinádorových léků zdůrazňují potřebu vývoje nových terapeutických způsobů specifických pro populace patogenních buněk se sníženou toxicitou vůči příjemci.

Výzkumní pracovníci vyvíjejí terapeutické způsoby pro ničení nádorových buněk na základě cílení cytotoxických sloučenin specificky na tyto buňky. Tyto způsoby užívají toxiny konjugované s ligandy, které se vážou na receptory jedinečné pro nádorové buňky nebo nadměrně exprimované nádorovými buňkami ve snaze minimalizovat dodávku toxinu k normálním buňkám. S použitím tohoto přístupu byly vyvinuty některé imunotoxiny zahrnující protilátky směrované na specifické receptory patogenních buněk a tyto protilátky jsou připojené na toxiny, jako je ricin, exotoxin Pseudomonas, toxin Diptherie a faktor nekrózy tumoru. Tyto imunotoxiny se zaměřují na nádorové buňky nesoucí specifické receptory rozpoznávané protilátkou [S. Olsnes, lmmunol. Today, 10, 291-295 (1989), E. L. Melby, Cancer Res., 53 (8), 1755-1760 (1993), M. D. Better, publikace PCT WO 91/07 418, 30. května, 1991].

Další přístup k selektivnímu cílení na populaci nádorových buněk nebo cizích patogenů u pacienta je zvýšení jeho imunitní odpovědi vůči patogenním buňkám, čímž se předchází potřebě podá- 1 CZ 304942 B6 vání sloučenin, které mohou též vykazovat toxicitu pro příjemce. Jedna z popisovaných strategií imunoterapie je vázat protilátky, například multimerní protilátky vyvinuté genetickým inženýrstvím, na povrch nádorové buňky pro vystavení konstantní oblasti protilátek na buněčném povrchu a tím pro indukci usmrcování buněk různými způsoby zprostředkovanými imunitním systémem (V. T. De Vita, Biologie Therapy of Cancer, 2. vydání, Philadelphia, Lippincott, 1995, J.P. Soulillou, patent US 5 672 486). Tento přístup se však komplikuje obtížemi při definici antigenů specifických pro tumor. Další přístup spoléhání na imunokompetenci pacienta je cílení protilátky proti T buněčným receptorům nebo protilátky proti Fc receptorům na povrchy buněk tumoru pro podporu přímé vazby imunitních buněk k tumorům (D.M. Kranz, patent US 5 547 668). Popisuje se též přístup založený na očkovací látce, který spočívá na očkovací látce obsahující antigeny připojené k cytokinům, s cytokinem modifikujícím imunogenicitu antigenu očkovací látky a tím stimulujícím imunitní odpověď na patogenní agens (S. Pillai, publikace PCT WO 91/11 146, 7. února 1991). Tento způsob spočívá na nepřímém pozměnění popisované imunitní odpovědi. Další přístup k usmrcení nežádoucích populací buněk používá fragmenty IL-2 nebo Fab antithymocytového globulinu připojené na antigeny pro eliminaci nežádoucích T buněk, avšak na základě popisovaných experimentálních údajů se zjišťuje, že tento způsob eliminuje pouze 50 % cílové buněčné populace a vede k nespecifickému usmrcování buněk in vivo [to jest usmrcuje se též 50 % lymfocytů periferní krve, které nejsou T buňkami (P. Pouletty, publikace PCT WO 97/37 690, 16. října 1997)]. Proto zůstává značná potřeba způsobů léčení zaměřených na léčení chorobných stavů charakterizovaných přítomností populací patogenních buněk u postiženého pacienta.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je použití konjugátu folát-flouresceinisothiokyanátu (neboli -FITC) nebo folát-dinitrofenylu, a sloučeniny schopné stimulace endogenní imunitní odpovědi, přičemž tato sloučenina je vybrána ze souboru sestávajícího z IL-2, IFN-alfa a GM-CSF a kde sloučenina není vázána na konjugát folát-FTC nebo folát-dinitrofenyl, pro výrobu léčiva používaného pro způsob zvyšování specifické eliminace populace tumorových buněk zprostředkované endogenní imunitní odpovědí u hostitelského živočicha s touto populací, spočívající v kroku podávání tohoto konjugátu folát-FITC nebo folát-dinitrofenylu a této sloučeniny uvedenému hostiteli, kde členové uvedené buněčné populace mají přístupové vazebné místo pro folát, přičemž uvedení FITC nebo uvedený dinitrofenyl je rozpoznáván endogenní nebo exogenní protilátkou v hostitelském živočichovi neboje rozpoznáván přímo imunitní buňkou v hostiteli.

Výhodné provedení tohoto vynálezu spočívá v použití, kde folát je schopen specifické vazby na receptor buněčné membrány.

Jiné výhodné provedení tohoto vynálezu spočívá v použití, kde folát má glutamylový zbytek kovalentně připojený k FITC nebo k dinitrofenylu pouze prostřednictvím gamma-karboxylové skupiny.

Ještě jiné výhodné provedení tohoto vynálezu spočívá v použití, kde folát má glutamylový zbytek kovalentně připojený k FITC nebo k dinitrofenylu pouze prostřednictvím alfa-karboxylové skupiny. Obzvláště výhodné je použití, kde kovalentní spojení mezi FITC nebo dinitrofenylem a folátem je kovalentní vazbou prostřednictvím bivalentního spojovacího článku.

-2CZ 304942 B6

Ještě jiné výhodné provedení tohoto vynálezu spočívá v použití, kde populace tumorových buněk na svém povrchu preferenčně exprimuje, jedinečně exprimuje nebo nadměrně exprimuje receptor schopné vázat folát.

Ještě jiné výhodné provedení tohoto vynálezu spočívá v použití, kde protilátka je exogenní pro uvedeného hostitele aje podávána spolu s konjugátovým prostředkem.

Ještě jiné výhodné provedení tohoto vynálezu spočívá v použití, kde prostředek konjugátu folátFITC nebo folát-dinitrofenylu se podává ve více injekcích.

Ještě jiné výhodné provedení tohoto vynálezu spočívá v použití, kde hostitelský živočich byl předem vystaven přirozeně FITC nebo dinitrofenylu, takže tento hostitelský živočich má předem přítomnou imunitu k podepisovanému FITC nebo popisovanému dinitrofenylu ověřenou přítomností endogenních protilátek proti FITC nebo dinitrofenylu.

Ještě další výhodné provedení tohoto vynálezu spočívá v použití, kde hostitelský živočich byl předem vystaven FITC nebo dinitrofenylu nepřirozeným způsobem, s následnou imunitní odpovědí hostitelského živočicha na tento FITC nebo tento dinitrofenyl. Obzvláště výhodné je použití, kde nepřirozeným způsobem majícím za výsledek imunitní odpověď hostitelskému živočichovi je očkování. Jiné obzvláště výhodné je použití, kde nepřirozeným způsobem majícím za výsledek imunitní odpověď je aktivní imunizace.

Ještě jiné výhodné provedení tohoto vynálezu spočívá v použití, kde endogenní imunitní odpověď zahrnuje humorální imunitní odpověď. Obzvláště výhodné je použití, kde humorální odpovědí je získaná imunitní odpověď nebo použití, kde humorální odpovědí je vrozená imunitní odpověď, popřípadě použití, kde získaná imunitní odpověď je vyvolána podáváním očkovacího prostředku hostitelskému živočichovi.

Ještě jiné výhodné provedení tohoto vynálezu spočívá v použití, kde endogenní imunitní odpověď zahrnuje imunitní odpověď zprostředkovanou buňkami.

Ještě další výhodné provedení tohoto vynálezu spočívá v použití, kde endogenní imunitní odpověď zahrnuje humorální odpověď a imunitní odpověď zprostředkovanou buňkami.

Předmětem tohoto vynálezu je rovněž farmaceutický prostředek, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje terapeuticky účinná množství konjugátu folát-FITC nebo folát-dinitrofenylu schopného specifické vazby na populaci tumorových buněk v hostitelském živočichovi pro specifickou eliminaci těchto buněk prostřednictvím získané nebo vrozené imunitní odpovědi, současně podávané protilátky nebo přímo prostřednictvím imunitních buněk hostitele, a sloučeniny schopné stimulace endogenní imunitní odpovědi, přičemž tato sloučenina je vybrána ze souboru sestávajícího z IL-2, IFN-alfa a GM-CSF a naváže se na konjugát folát-FITC nebo folát-dinitrofenyl, a farmaceuticky přijatelný nosič těchto látek.

Výhodné provedení tohoto vynálezu spočívá ve farmaceutickém prostředku, jehož podstata spočívá v tom, že je v parenterální formě s prodlouženým uvolňováním dávky.

Předmětem tohoto vynálezu je také farmaceutický prostředek, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje konjugát ligand-imunogen v množství, kteréje účinné ke značení populace tumorových buněk v organismu živočišného hostitele pro specifickou eliminaci endogenní imunitní odpovědi nebo současně podávanými protilátkami,

-3 CZ 304942 B6 přičemž konjugát ligand-imunogen představuje fluoresceinisothiokyanát konjugovaný s folátem přes ethylendiaminový můstek navázaný na gamma-karboxylovou skupinu folátu nebo dinitrofenyl konjugovaný s folátem, a farmaceuticky přijatelný nosič těchto látek.

Předmětem tohoto vynálezu je též použití folát-FITC pro výrobu léčiva pro značení populace tumorových buněk v hostitelském živočichovi pro specifickou eliminaci endogenní imunitní odpovědi nebo současně podávanými protilátkami.

Předmětem tohoto vynálezu je taktéž farmaceutický prostředek, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje fluoresceinisothiokyanát (F1TC) konjugovaný s folátem přes ethylendiaminový můstek navázaný na gamma-karboxylovou skupinu folátu a farmaceuticky přijatelný nosič.

Výhodné provedení tohoto vynálezu spočívá ve farmaceutickém prostředku, jehož podstata spočívá v tom, že je v parenterální dávkové formě. Obzvláště výhodný je farmaceutický prostředek, jehož podstata spoěívá v tom, že uvedený farmaceuticky přijatelný nosič je vybrán z isotonického fyziologického roztoku, 5% glukózy, kapalných alkoholů, kapalných glykolů, kapalných esterů a kapalných amidů.

Dále jsou uvedeny podrobnější údaje vztahující se k předmětnému vynálezu a jeho vysvětlení, stejně jako údaje o nalezeném vynálezu jako celku a různých možnostech aplikace vynálezu.

Nalezené řešení se zaměřuje na způsob eliminace populace patogenních buněk pacienta zvyšováním rozpoznávání imunitního systému a odpovědi na tyto buněčné populace. Antigenní působení buněčných patogenů se účinně zvyšuje pro posílení endogenní eliminace populace patogenních buněk zprostředkované imunitní odpovědí. Tento způsob se vyhýbá použití nebo minimalizuje použití cytotoxických nebo antimikrobiálních terapeutických prostředků. Tento způsob zahrnuje podávání konjugátu ligand-imunogen, při kterém je tento ligand schopný specifické vazby s populací patogenních buněk in vivo, která jedinečně exprimuje, preferenčně exprimuje nebo nadměrně exprimuje vazebný zbytek ligandu, a imunogen konjugovaný s ligandem je schopen vyvolat tvorbu protilátky nebo je přednostně schopen rozpoznání endogenními či současně podávanými exogenními protilátkami u hostitelského živočicha. Eliminace patogenních buněk zprostředkovaná imunitním systémem se zaměřuje vazbou ligandu konjugovaného s imunogenem k receptoru, transportéru nebo jinému jedinečně exprimovanému proteinu prezentovanému na povrchu, nadměrně exprimovanému nebo preferenčně exprimovanému patogenní buňkou. Protein na povrchu, který je jedinečně exprimovaný, nadměrně exprimovaný nebo preferenčně exprimovaný patogenní buňkou, je receptor nepřítomný nebo přítomný v nižším množství nepatogenních buněk, což poskytuje prostředek pro selektivní eliminaci patogenních buněk. Hostitelskému živočichovi lze pro zvýšení terapeutické účinnosti podávat alespoň jeden další terapeutický faktor, například stimulátor imunitního systému, prostředek usmrcující buňky, prostředek zvyšující pronikání do tumoru, chemoterapeutický prostředek, cytotoxické imunitní buňky nebo antimikrobiální prostředek.

V jednom svém ztělesnění zahrnuje tento způsob kroky podávání ligandů schopných vysokoafinitní specifické vazby in vivo s proteiny buněčného povrchu jedinečně exprimovanými, preferenčně exprimovanými nebo nadměrně exprimovanými na populaci cílových patogenních buněk, kde se tyto ligandy konjugují s imunogeny, proti kterým již existuje vrozená či získaná imunita, nebo které lze u hostitelského živočicha rozpoznat, a případné současné podávání alespoň jednoho terapeutického faktoru, který je endogenním aktivátorem imunitní odpovědi nebo cytotoxickou sloučeninou. V jednom preferovaném ztělesnění tento způsob zahrnuje podávání prostředku konjugátu ligand-imunogen hostitelskému živočichu, kde tímto ligandem je kyselina listová nebo jiný vazebný ligand folátového receptoru. Tento ligand je konjugovaný, například kovalentní vazbou, s imunogenem schopným vyvolat protilátkovou odpověď hostitelského živočicha nebo

-4CZ 304942 B6 přednostněji s ímunogenem schopným vazby s předem existujícími endogenními protilátkami (následkem vrozené či získané imunity) nebo se současně podávanými protilátkami (to jest pasivní imunizací) hostitelskému živočichu. Hostitelskému živočichu lze ve spojení s podáváním konjugátů ligand-imunogen podávat alespoň jeden další terapeutický faktor, který není schopen specifické vazby na komplex ligand-imunogen, avšak je schopen stimulovat nebo zvyšovat endogenní imunitní odpověď, prostředek usmrcující buňky, prostředek pro zvýšení průniku do tumoru, jako je zánětlivý, či prozánětlivý prostředek, chemoterapeutický prostředek, cytotoxické imunitní buňky nebo antimikrobiální prostředek.

V souladu s dalším ztělesněním tohoto vynálezu se poskytuje způsob zvyšování specifické eliminace populace patogenních buněk zprostředkované endogenní imunitní odpovědí u hostitelského živočicha s touto populací, kde členové této buněčné populace mají přístupné vazebné místo pro ligand. Tento způsob zahrnuje krok podávání tomuto hostitelskému živočichovi přípravku konjugátu ligand-imunogen zahrnujícího komplex ligandu a imunogenu, kde je známo, že se tento imunogen rozpoznává endogenní či exogenní protilátkou u hostitele nebo se rozpoznává přímo imunitní buňkou hostitele, a alespoň jednoho dalšího přípravku zahrnujícího terapeutický faktor, který se volí z případů prostředku usmrcujícího buňky, prostředky zvyšujícího pronikání do tumoru, chemoterapeutického prostředku, antimikrobiálního prostředku, cytotoxické imunitní buňky a sloučeniny schopné stimulace endogenní imunitní odpovědi, při které se tato sloučenina neváže s konjugátem ligand-imunogen.

Podle alternativního ztělesnění tohoto vynálezu se poskytuje způsob zvyšování specifické eliminace populace patogenních buněk u hostitelského živočicha zprostředkované endogenní imunitní odpovědí, při kterém tato populace exprimuje vazebné místo pro ligand. Tento způsob zahrnuje kroky podávání hostitelskému živočichu přípravku obsahujícího komplex tohoto ligandu a imunogenu, podávání protilátek cílených proti imunogenu a podávání alespoň jednoho dalšího terapeutického faktoru, který se volí z případů prostředku usmrcuj ícího buňky, prostředku zvyšujícího průnik do tumoru, chemoterapeutického prostředku, antimikrobiálního prostředku, cytotoxické imunitní buňky a stimulátoru endogenní imunitní odpovědi, který se neváže na komplex ligand-imunogen.

Vjednom preferovaném ztělesnění tohoto vynálezu se poskytuje způsob zvyšování endogenní eliminace populace patogenních buněk u hostitele zprostředkované imunitní odpovědí, při kterém tato populace preferenčně exprimuje, jedinečně exprimuje nebo nadměrně exprimuje receptor kyseliny listové. Tento způsob zahrnuje krok podávání tomuto hostiteli přípravku obsahujícího kovalentně vázaný konjugát imunogenu, o kterém je známo, že je rozpoznáván endogenní či exogenní protilátkou hostitele nebo je rozpoznáván přímo imunitní buňkou hostitele, a ligandu zahrnujícího kyselinu listovou nebo analog kyseliny listové mající glutamylovou skupinu, kde kovalentní vazba k imunogenu je pouze prostřednictvím gama-karboxylové skupiny glutamylové skupiny. V dalším ztělesnění se podává hostiteli alespoň jeden další přípravek zahrnující terapeutický faktor, který se volí z případů prostředku usmrcuj ícího buňky, prostředku zvyšujícího průnik do nádoru, chemoterapeutického prostředku, antimikrobiálního prostředku, cytotoxické imunitní buňky a sloučeniny schopné stimulace endogenní imunitní odpovědi a tato sloučenina se neváže na konjugát ligand-imunogen.

V dalším ztělesnění tohoto vynálezu se poskytuje způsob zvyšování specifické eliminace populace patogenních buněk hostitele zprostředkované endogenní imunitní dopovědí, při kterém tato populace preferenčně exprimuje, jedinečně exprimuje nebo nadměrně exprimuje receptor kyseliny listové. Tento způsob zahrnuje krok podávání tomuto hostiteli přípravku obsahujícího kovalentně vázaný konjugát imunogenu, který je rozpoznáván endogenní či exogenní protilátkou, hostitele nebo je rozpoznáván přímo imunitní buňkou hostitele, a ligandu obsahujícího kyselinu listovou nebo analog kyseliny listové mající glutamylovou skupinu, kde kovalentní vazba na imunogen je zprostředkovaná pouze α-karboxylovou skupinou glutamylové skupiny. V dalším ztělesnění se podává hostiteli alespoň jeden další přípravek zahrnující terapeutický faktor, který se volí z případů prostředku usmrcuj ícího buňky, prostředku zvyšujícího průnik do tumoru, che-5CZ 304942 B6 moterapeutického prostředku, antimikrobiálního prostředku, cytotoxické imunitní buňky a sloučeniny schopné stimulace endogenní imunitní odpovědi, kde se tato sloučenina neváže na konjugát ligand-imunogen.

V dalším ztělesnění tohoto vynálezu je cílovou populací patogenních buněk populace rakovinných buněk. V dalším ztělesnění představuje cílová populace buněk populaci endogenních buněk infikovaných virem. V dalším ztělesnění je cílová populace buněk populací exogenních organismů, jako jsou bakterie, mykoplazmy, kvasinky nebo plísně. Konjugát ligand-imunogen se váže na povrch buněk tumoru nebo patogenních organismů a označuje buňky cílové populace imunogenem, čímž spouští imunitně zprostředkovanou odpověď zaměřenou na populaci označených buněk. Protilátky podávané hostiteli při pasivní imunizaci nebo protilátky přítomné v systému hostitele na základě předem existující vrozené či získané imunity se vážou na imunogen a spouštějí endogenní imunitní odpovědi. Vazba protilátek na konjugát ligand-imunogen navázaný na buňky vede k cytotoxicitě zprostředkované komplementem, cytotoxicitě zprostředkované buňkami dependentními na protilátce, opsonizaci protilátkou a fagocytose, shlukování receptorů indukované protilátkou, signalizace zániku buněk nebo klidového stavu nebo jakékoliv humorální či buněčné imunitní odpovědi stimulované protilátkou, která se váže na konjugáty ligand-imunogen navázané na buňku. V případech, ve kterých lze antigen přímo rozpoznat imunitními buňkami bez předchozí opsonizace protilátkou, může dojít k přímému usmrcování patogenních buněk.

Eliminace cizích patogenů nebo infikovaných či neoplastických endogenních buněk se může dále zvyšovat podáváním terapeutického faktoru schopného stimulace endogenní imunitní odpovědi, prostředku usmrcujícího buňky, prostředku zvyšujícího prostupnost tumoru, chemoterapeutického prostředku, cytotoxické imunitní buňky nebo antimikrobiálního prostředku. V jednom ztělesnění jsou cytotoxické imunitní buňky populací cytotoxických imunitních buněk, která se izoluje, expanduje ex vivo a poté se podává hostiteli: V dalším ztělesnění tohoto vynálezu se používá imunostimulační prostředek a tím imunostimulačním prostředkem může být interleukin, jako je IL-2, IL-12 nebo IL—15 nebo IFN, jako je IFN-a, IFN-β nebo IFN-gama nebo GM-CSF.

V dalším ztělesnění může být imunostimulačním prostředkem cytokinový prostředek obsahující kombinaci cytokinů, jako je IL-2, IL-12 nebo 1L-15 spolu s IFN-a, IFN-β nebo IFN-gama nebo GTM-CSF nebo jakákoliv účinná kombinace těchto látek nebo jakákoliv další efektivní kombinace cytokinů.

V dalším ztělesnění tohoto vynálezu se poskytuje farmaceutický prostředek obsahující terapeuticky účinná množství konjugátu ligand-imunogen schopného specifické vazby na populaci patogenních buněk hostitele k podpoře specifické eliminace těchto buněk získanou či vrozenou imunitní odpovědí, současným podáváním protilátek nebo přímo imunitní buňkou hostitele, terapeutický faktor zvolený z případů prostředku usmrcujícího buňky, prostředku zvyšujícího průnik do tumoru, chemoterapeutického prostředku, antimikrobiálního prostředku, cytotoxické imunitní buňky a sloučeniny schopné stimulovat endogenní imunitní odpověď, při které se tato sloučenina naváže na konjugát ligand-imunogen, a farmaceuticky přijatelný nosič těchto prostředků. V jednom ztělesnění je farmaceutickým prostředkem parenterální dávková forma s prodlouženým uvolňováním. V dalším ztělesnění je terapeutickým faktorem imunostimulační prostředek obsahující sloučeninu zvolenou ze skupiny interleukinů, jako je IL-2, IL-12, IL—15 a IFN, jako je IFN-a, IFN-β, IFN-gama a GM-CSF, nebo jejich kombinace.

Následuje podrobný popis vynálezu.

Poskytuj se způsoby pro terapeutické léčení hostitele s nádorem nebo hostitele infikovaného patogenními organismy. Tento způsob vede ke zvýšení eliminace populací patogenních buněk zprostředkované imunitní odpovědí tím, že se patogenní buňky stanou antigenními, že se označí, což způsobí jejich rozpoznání a eliminaci imunitním systémem hostitele. Tento model používá konjugát ligand-imunogen schopný vysokoafinitní vazby s nádorovými buňkami nebo jinými patogenními elementy. Vysokoafinitní vazba může být vlastní ligandu a může být modifikovaná

-6CZ 304942 B6 (posílená) použitím chemicky modifikovaného ligandu nebo konkrétní chemickou vazbou mezi ligandem a imunogenem, která se vyskytuje v konjugátu. Tento způsob může též použít kombinovanou terapii užitím konjugátu ligand-imunogen a přídavného terapeutického faktoru schopného stimulovat endogenní imunitní odpověď, prostředku usmrcujícího buňky, chemoterapeutického prostředku, prostředku zvyšujícího průnik do nádoru, cytotoxické imunitní buňky nebo antimikrobiálního prostředku pro zvýšení eliminace patogenních buněk zprostředkované imunitní odpovědí.

Způsob podle tohoto vynálezu se používá pro zvýšení eliminace populace patogenních buněk endogenní imunitní odpovědí u hostitele této populace patogenních buněk. Tento vynález lze provést pro populace patogenních buněk, které způsobují řadu patologických stavů, jako je rakovina a infekční choroba. Proto může populací patogenních buněk být populace rakovinných buněk, která je tumorogenní, včetně benigních tumorů a maligních tumorů nebo může být netumorogenní. Populace rakovinových buněk může vznikat spontánně nebo takovými pochody, jako jsou mutace přítomné v zárodečné linii hostitelského živočicha, nebo somatickými mutacemi nebo může být indukovaná chemicky, viry nebo zářením. Tento vynález lze použít pro léčení typů rakoviny, jako jsou karcinomy, sarkomy, lymfomy, Hodgkinova choroba, melanomy, mesotheliomy, Burkittův lymfom, nasofaryngeální karcinomy, leukémie a myelomy. Populace rakovinových buněk může zahrnovat, avšak bez omezení, ústní, thyroidální, endokrinní, kožní, žaludeční, jícnové, hltanové, pankreatické, střevní, žlučové, kostní, vaječníkové, cervikální, děložní, prsní, testikulámí, prostatické, rektální, ledvinové, jatemí a plicní nádory.

Populace patogenních buněk může být též exogenním patogenem nebo buněčnou populací s exogenním patogenem, například virem. Tento vynález se též může použít pro takové exogenní patogeny, jako jsou baktérie, plísně, viry, mykoplasmy a paraziti. Infekční agens, jejichž působení lze léčit na základě tohoto vynálezu, jsou jakékoliv infekční organismy známé v oboru, které způsobují patogenetické změny u zvířete včetně takových organismů, jako jsou bakterie, které jsou gramnegativní nebo grampozitivní, koky či bacily, viiy DNA a RNA včetně, avšak bez omezení, DNA virů, jako jsou papilomaviry, parvoviry, adenoviry, herpesviry a vakciniaviry, a RNA virů, jako jsou arenoviiy, koronaviiy, thinoviry, respirační syncytiální viry, viry chřipky, pikomaviry, paramyxoviry, reoviry, retroviiy a rhadboviry. Předmětem zvláštního zájmu jsou bakterie, které jsou rezistentní na antibiotika, jako jsou druhy streptokoků a druhy stafylokoků, které jsou rezistentní na antibiotika, nebo bakterie, které jsou citlivé na antibiotika, avšak způsobují rekurentní infekce léčení antibiotiky, takže se případně vyvíjejí rezistentní organismy. Působení těchto organismů lze léčit konjugáty ligand-imunogen podle tohoto vynálezu v kombinaci s nižšími dávkami antibiotik, které by se normálně podávaly pacientovi, aby se předešlo rozvoji těchto bakteriálních kmenů rezistentních na antibiotika. Tento vynález lze též použít v případě jakýchkoliv plísní, druhů mykoplasmy, parazitů a dalších infekčních organismů, které způsobují onemocnění u zvířat. Příklady plísní, které lze léčit způsobem podle tohoto vynálezu, zahrnují plísně, které rostou jako typické plísně, nebojsou typu kvasinek včetně například plísní způsobujících choroby, jako je dermatofýtosa, blastomykosa, aspergilosa, streptokokosa, sporotrichosa, kokcidioidomykosa, parakokcidioidomykosa a kandidasa. Tento vynález lze též použít pro léčení parasitárních infekcí včetně, avšak bez omezení, infekcí způsobených somatickými tasemnicemi, krevními motolicemi, tkáňovými hlísticemi, amebou a druhy Plasmodium, Trypanosoma, Leishmania a Toxoplasma. Zvláště důležití parazité jsou ti, kteří exprimují folátové receptory a vážou folát, avšak v literatuře je řada odkazů na ligandy vykazující vysokou afinitu k infekčním organismům. Například peniciliny a cefalosporiny známé pro své vysoké antibiotické aktivity a specifickou vazbu na prekurzory stěny bakteriální buňky lze podobně použít jako ligandy pro přípravu konjugátů ligand-imunogen pro použití podle tohoto vynálezu. Konjugáty ligand-imunogen podle tohoto vynálezu se mohou též zaměřovat na populaci buněk s endogenními patogeny, kde se na povrchu buněk s patogeny preferenčně exprimují patogen-specifické antigeny a působí jako receptoiy pro ligand se specifickou vazbou ligandu s antigenem.

Způsob podle tohoto vynálezu lze použít v humánní klinické medicíně i ve veterinárních aplikacích. Proto hostitelský živočich nesoucí populaci patogenních organismů a léčený konjugáty

-7 CZ 304942 B6 ligand-imunogen může být člověk nebo v případě veterinárních aplikací to může být laboratorní, hospodářské, domácí ěi divoké zvíře. Tento vynález lze aplikovat na hostitelské živočichy včetně, avšak bez omezení, lidí, laboratorních zvířat, jako jsou hlodavci (například myši, krysy, křečkové, atd.), králíci, opice, šimpanzi, domácí zvířata, jako jsou psi, kočky a králíci, hospodářská zvířata, jako jsou krávy, koně, prasata, ovce, kozy a divoká zvířata v zajetí, jako jsou medvědi, pandy, lvi, tygři, leopardi, sloni, zebry, žirafy, gorily, delfíni a velryby.

Konjugát ligand-imunogen se přednostně podává hostitelskému zvířeti parenterálně, to jest intradermálně, subkutánně, intramuskulámě, intraperitoneálně nebo intravenózně. Alternativně lze konjugát podávat hostitelskému živočichu jiným medicínsky použitelným způsobem a lze použít jakoukoliv účinnou dávku a vhodnou terapeutickou dávkovou formu včetně dávkových forem s prodlouženým způsobem uvolňování. Způsob podle tohoto vynálezu lze použít v kombinaci s chirurgickým odstraněním tumoru, radiační terapií, chemoterapií nebo biologickými terapiemi, jako jsou ostatní imunoterapie včetně, však bez omezení, terapie monoklonálními protilátkami, léčení imunomodulačními prostředky, adoptivní transfer imunitních ejektorových buněk, léčení krvetvornými růstovými faktory, cytokiny a očkování.

V souladu s tímto vynálezem lze konjugát ligand-imunogen zvolit ze širokého rozmezí ligandů a imunogenů. Tyto ligandy musí být schopné specifické eliminace populace patogenních buněk z organismu hostitelského zvířete díky preferenční expresi receptoru pro ligand přístupného pro vazbu ligandů na patogenních buňkách. Přijatelné ligandy zahrnují kyselinu listovou, analogy kyseliny listové a další folátové molekuly, které vážou receptory, další vitaminy, peptidové ligandy identifikované skreeningem, tumor-specifické peptidy, tumor-specifické aptamery, tumorspecifické glycidy, tumor-specifické monoklonální nebo polyklonální protilátky, Fab nebo scFv (to jest jednořetězcová variabilní oblast) fragmenty protilátek, jako je například fragment Fab protilátky zaměřené na EphA2 nebo další proteiny specificky exprimované nebo jedinečně přístupné na metastatických nádorových buňkách, malé organické molekuly odvozené od kombinačních knihoven, růstové faktory, jako jsou EGF, FGF, insulin a růstové faktory typu insulinu a homologní polypeptidy, somatostatin ajeho analogy, transferrin, komplexy lipoproteinů, žlučové soli, selektiny, steroidní hormony, peptidy obsahující Arg-Gly-Asp, retinoidy, různé Galektiny, δ-opioidové receptorové ligandy, cholecystokininové A receptorové ligandy, ligandy specifické pro ATI nebo AT2 receptory angiotensinu, peroxisomové proliferačně aktivované receptorové gama ligandy, β-laktamové protilátky, malé organické molekuly včetně antimikrobiálních léků a další molekuly, které se specificky vážou na receptor preferenčně exprimovaný na povrchu tumorových buněk nebo infekčních organismů nebo fragmenty, kterékoliv z těchto molekul. Předmětem zájmu v oblasti ligandů, které se vážou na infekční organismy, jsou kterékoliv molekuly, jako jsou antibiotika nebo jiné léky, u kterých je v oboru známo, že se vážou na mikroorganismy. Tento vynález se též týká ligandů, které jsou molekulami, jako jsou antimikrobiální léky navržené tak, aby se přizpůsobovaly vazebné kapse daného receptoru na základě krystalové struktury tohoto receptoru nebo jinému proteinu buněčného povrchu a tyto receptory se preferenčně exprimují na povrchu tumorů, bakterií, virů, mykoplasmy, plísní, parasitů či dalších patogenů. V preferovaném ztělesnění tohoto vynálezu se též uvažuje, že se mohou využít ligandy, které se vážou na kterékoliv tumorové antigeny či další molekuly preferenčně exprimované na povrchu tumorových buněk.

Vazebné místo pro ligand může zahrnovat receptory kterékoliv molekuly schopné specifické vazby s receptorem, kde tento receptor či jiný protein preferenčně exprimuje na populaci patogenních buněk včetně například receptorů pro růstové faktory, vitaminy, peptidy včetně opioidových peptidů, hormony, protilátky, glycidy a malé organické molekuly. Toto vazebné místo může též být vazebným místem pro kteroukoliv molekulu, jako je antibiotický či jiný lék, kde je známo v oboru, že toto místo preferenčně existuje na mikroorganismech. Například se mohou uvažovat vazebná místa na stěně bakteriální buňky pro β-laktamová antibiotika, jako je penicilín, nebo vazebná místa pro antivirový prostředek jedinečně přítomná na povrchu viru. Tento vynález se též týká vazebných míst pro ligandy, jako jsou antimikrobiální léky navržené tak, aby byly přizpůsobené vazebnému místu receptoru, na základě krystalické struktury receptoru, a pro případy,

-8CZ 304942 B6 kdy receptor se preferenčně exprimuje na povrchu patogenních buněk či organismů. Také se uvažuje, že tumor-specifické antigeny mohou působit jako vazebná místa pro ligandy ve způsobu podle tohoto vynálezu. Příkladem tumor-specifického antigenů, který může působit jako vazebné místo pro konjugáty ligand-imunogen, je extracelulámí epitop členu Ephrinové skupiny proteinů, jako je EphA2. Exprese EphA2 se omezuje na spojení mezi buňkami u normálních buněk, avšak EphA2 se vyskytuje v rámci celého buněčného povrchu v metastatických tumorových buňkách. Proto by ephA2 na metastatických buňkách byl přístupný pro vazbu například fragmentu Fab protilátky konjugované s imunogenem, zatímco by tento protein nebyl přístupný pro vazbu s fragmentem Fab na normálních buňkách, což by mohlo mít za následek tvorbu konjugátu ligand-imunogen specifického pro metastatické nádorové buňky. Tento vynález dále uvažuje použití kombinace konjugátu ligand-imunogen pro dosažení maximálního cílení na patogenní buňky pro jejich eliminaci na základě získané či vrozené imunitní odpovědi nebo s použitím současně podávaných protilátek.

Přijatelnými imunogeny pro použití podle tohoto vynálezu jsou ty imunogeny, které jsou schopné vyvolat tvorbu protilátky u hostitelského živočicha nebo které dříve vyvolaly tvorbu protilátky u hostitelského živočicha s výsledkem předem existující imunity nebo které tvoří část vrozeného imunitního systému. Alternativně lze protilátky zaměřené proti imunogenu podávat hostitelskému živočichu pro vytvoření pasivní imunity. Vhodné imunogeny pro použití v tomto vynálezu zahrnují antigeny či antigenní peptidy, proti kterým se vyvinula předem existující imunita prostřednictvím normálního očkování podle rozpisu nebo předchozí přirozenou expozicí těchto agens, jako jsou antigeny polioviru, mikroorganismy tetanu, tyfu, zarděnek, spalniček, příušnic, černého kašle, tuberkulosy a chřipky a α-galaktosylové skupiny. V těchto případech se použijí konjugáty ligand-imunogen pro opětovné zaměření dříve získané humorální či buněčné imunity k populaci patogenních buněk u hostitelského živočicha pro eliminaci cizích buněk nebo patogenních organismů. Další vhodné imunogeny zahrnují antigeny nebo antigenní peptidy, pro které hostitelský živočich vyvinul novou imunitu imunizací proti nepřirozenému antigenů či haptenu (například fluoresceinisothiokyanátu nebo dinitrofenylu) a antigeny, proti kterým existuje vrozená imunita (například superantigeny a muramyldipeptid).

Ligandy a imunogeny podle tohoto vynálezu lze konjugovat s použitím jakéhokoliv způsobu tvorby komplexu uznávaného v oboru. Tento může zahrnovat kovalentní, iontovou či vodíkovou vazbu ligandu na imunogen, bud’ přímo, či nepřímo prostřednictvím spojovací skupiny, jako je bivalentní spojovací element. Tento konjugát se obvykle tvoří kovalentní vazbou ligandu s imunogenem tvorbou amidu, amidové, esterové nebo iminové vazby mezi skupinami kyseliny, aldehydu, hydroxylovými skupinami, aminoskupinami nebo hydrazoskupinami na příslušných složkách komplexu. V preferovaném ztělesnění tohoto vynálezu je ligandem kyselina listová, analog kyseliny listové nebo jiná molekula, která váže folátový receptor a folátový ligand se konjuguje s imunogenem způsobem, který využívá anhydrid kyseliny trifluoroctové pro přípravu gamaesterů kyseliny listové prostřednictvím pteroylazidového meziproduktu. Tento preferovaný způsob vede k syntéze folátového ligandu konjugovaného s imunogenem pouze prostřednictvím gama-karboxylové skupiny skupin kyseliny glutamové folátu, kde se gama-konjugát váže na folátový receptor s vysokou afinitou a předchází se tvorbě směsí α-konjugátu a gama-konjugátu. Alternativně lze připravit z meziproduktů α-konjugáty, když se gama-karboxylová skupina selektivně blokuje a poté se následně deblokuje s použitím způsobů uznávaných v oboru organické syntézy. Stojí za zmínku, že lze použít další vitaminy jako ligandy pro přípravu konjugátů podle tohoto vynálezu. Například konjugáty ligand-imunogen se mohou tvořit s biotinem a riboflavinem stejně jako s folátem (víz patenty US 5 108 921, US 5 416 016 a US 5 635 382, které se zde zahrnují formou odkazu)

Konjugáty ligand-imunogen podle tohoto vynálezu zvyšují eliminaci populace patogenních buněk endogenní imunitní odpovědí. Tato endogenní imunitní odpověď může zahrnovat humorální odpověď, imunitní odpověď zprostředkovanou buňkami a jakoukoliv jinou imunitní odpověď endogenní pro hostitelského živočicha včetně cytolýzy zprostředkované komplementem, protilátkové dependentní cytotoxicity zprostředkované komponentem (ADCC), opsonizace proti-9CZ 304942 B6 látkou vedoucí k fagocytóze, shlukování receptorů při vazbě protilátky vedoucí k signalizaci apoptózy, antiproliferace nebo diferenciace a přímého rozpoznání dodaného antigenu/haptenu imunitní buňky. Také se uvažuje, že endogenní imunitní odpověď užívá sekreci cytokinů, které regulují tyto procesy, jako je multiplikace a migrace imunitních buněk. Endogenní imunitní odpověď může zahrnovat účast takových buněčných typů, jako jsou B buňky, T buňky včetně helperových a cytotoxických T buněk, makrofágů, buněk přirozených zabíječů, neutrofllů, buněk LAK a podobně.

Humorální odpověď může být odpovědí indukovanou takovými procesy, jako je normální očkování podle rozpisu nebo aktivní imunizací přirozeným antigenem nebo nepřirozeným antigenem či haptenem (například fluoresceinísothiokyanátem) s nepřirozeným antigen indukujícím novou imunitu. Aktivní imunizace zahrnuje několikanásobné injekce nepřirozeného antigenů či haptenu podávaného mimo normální očkovací režim pro vyvolání nové imunity. Humorální odpověď může též vyplývat z vrozené imunity, kde hostitelský živočich má přirozenou předem existující imunitu, jako je imunita vůči α-galaktosylových skupinám. Alternativně se může vytvořit pasivní imunita podáním protilátek hostitelskému živočichu, jako jsou přirozené protilátky obdržené ze séra nebo monoklonální protilátky, které mohou a nemusí být protilátkami vyvinutými způsoby genetického inženýrství, včetně humanizovaných protilátek. Použití konkrétního množství protilátkového prostředku pro rozvoj pasivní imunity a použití konjugátu ligand-imunogen při kterém se pasivně podávané protilátky zaměřují na imunogen, by poskytlo výhodu standardního souboru prostředků použitých v případech, kdy předem existující titr pacientových protilátek proti potenciálním dalším antigenům není terapeuticky použitelný. Pasivně podávané protilátky se mohou podávat současně s konjugátem ligand-imunogen a současné podávání se definuje jako podávání protilátek v čase před podáním v čase podání a v čase po podání konjugátu ligand-imunogen.

Uvažuje se, že předem přirozené protilátky, indukované protilátky nebo pasivně podávané protilátky budou opět zaměřené na tumorové buňky či infekční organismy preferenční vazbou konjugátů ligand-imunogen k těmto invazním buňkám či organismům a že tyto patogenní buňky budou usmrcovány cytolýzou zprostředkovanou komplementem, ADCC, protilátkové dependentní fagocytózou nebo protilátkovým shlukováním receptorů. Cytotoxický proces může též zahrnovat další typy imunitních odpovědí, jako je imunita zprostředkovaná buňkami, stejně jako je sekundárních odpovědí, které vznikají, jestliže přitahované buňky prezentují antigen fagocytují nežádoucí buňky a přítomné přirozené tumorové antigeny či antigeny cizích patogenů pro imunitní systém pro eliminaci buněk nebo organismů nesoucích antigeny.

Alespoň jeden další přípravek zahrnující jeden terapeutický faktor lze podávat hostiteli v kombinaci s výše popsaným způsobem nebo jako adjuvantní prostředek pro zvýšení eliminace populace patogenních buněk zprostředkované imunitní odpovědí nebo lze podávat více než jeden další faktor. Tento terapeutický faktor lze zvolit ze sloučenin schopných stimulace endogenní imunitní odpovědi, chemoterapeutických prostředků, antimikrobiálních prostředků nebo dalších terapeutických faktorů schopných doplňovat účinnost podávaného komplexu ligand-imunogen. Způsob podle tohoto vynálezu se může provádět podáváním hostiteli navíc k výše popsaným konjugátům sloučenin či přípravků schopným stimulovat endogenní imunitní odpovědi včetně, avšak bez omezení, cytokinů nebo imunitních buňkových růstových faktorů, jako jsou interleukiny 1 až 18, faktor kmenových buněk, základní FGF, EGF, G-CSF, GM-CSF, FLK-2 ligand, H1LDA, MIPla, TGF a, TGF β, M-CSF, IFN a, IFN gama, rozpustný CD23, LIF ajejich kombinace.

Lze též použít terapeuticky účinné kombinace těchto cytokinů. V jednom preferovaném ztělesnění se například používají terapeuticky účinná množství IL-2, například v rozmezí 5000 mezinárodních jednotek/dávka/den až zhruba 500000 mezinárodních jednotek/dávka/den ve vícečetném dávkovém denním režimu a IFN-α, například v množství v rozmezí od zhruba 7500 mezinárodních jednotek/dávka/den do zhruba 150000 mezinárodních jednotek/dávka/den ve vícečetném dávkovém režimu spolu s fluoresceinisothiakynátem vázaným na folát pro eliminaci patogenních buněk z organismu živočicha s těmito patogenními buňkami. V dalším preferovaném ztělesnění

- 10CZ 304942 B6 se používají IL-12 a IFN-α v terapeuticky účinných množstvích a v dalším preferovaném ztělesnění se používají IL-15 a IFN-α v terapeuticky účinných množstvích. V alternativním preferovaném ztělesnění se používají v kombinaci IL-2, IFN-α nebo IFN-gama a GM-CSF. Přednostně se používají terapeutické faktory, jako jsou IL-2, IL-12, IL-15, IFN-α, IFN-gama a GM-CSF včetně jejich kombinací, které aktivují buňky přirozené zabiječe a/nebo T buňky. Alternativně může terapeutický faktor nebo kombinace těchto faktorů včetně interleukinu v kombinaci s interferonem a GM-CSF aktivovat další imunitní efektorové buňky, jako jsou makrofágy, B buňky, neutrofily, buňky LAK nebo podobné. Tento vynález též uvažuje použití jakékoliv jiné efektivní kombinace cytokinů včetně kombinací s ostatními interleukiny a interferony a faktory stimulujícími tvorbu kolonií.

Chemoterapeutické prostředky, které jsou samy o sobě cytotoxické a mohou zvyšovat permeabilitu tumoru, vhodné pro použití ve způsobu tohoto vynálezu zahrnují adrenokortikoidy, alkylační prostředky, antiandrogeny, antiestrogeny, androgeny, estrogeny, antimetabolity, jako je cytosinarabinosid, purinové analogy, pyrimidinové analogy a methotrexát, busulfan, karboplatin, chlorambucil, cisplatin a další platinové sloučeniny, tamoxifen, taxol, cyklofosfamid, rostlinné alkaloidy, prednison, hydroxymočovinu, teniposid, antibiotika, jako je mitomycin C a bleomycin, yperity, nitrosmočoviny, vinkristin, vinblastin, protizánětlivé a protizánětlivé prostředky a jakékoliv další prostředky pro chemoterapii uznávané v oboru. Další terapeutické prostředky lze podávat jako adjuvantní prostředky při podávání konjugátů podle tohoto vynálezu, včetně penicilinu, cefalosporinů, vankomycinu, erytromycinu, klindamycinu, rifampinu, chloramfenikolu, aminoglykosidů, gentamicinu, amfotericinu B, acyklokviru, trifluridinu, gancikloviru, zidovudinu, amantadinu, rebavirinu a jakýchkoliv antimikrobiálních sloučenin uznávaných v oboru.

Eliminace populace patogenních buněk bude zahrnovat redukci či eliminaci masy tumoru nebo patogenních organismů následkem terapeutické odpovědi. V případě tumoru může eliminace být eliminací buněk primárního tumoru nebo eliminací buněk, které metastazovaly nebojsou v procesu disociace z primárního tumoru. Profylaktická léčba pro prevenci návratu tumoru po jeho odstranění jakoukoliv terapeutickou cestou včetně chirurgického odstranění tumoru, radiační terapie, chemoterapie nebo biologické terapie se rovněž uvažuje v rámci tohoto vynálezu. Profylaktické léčení může být počáteční léčení s konjugátem ligand-imunogen, jako je léčení ve vícedávkovém denním režimu a/nebo přídavné léčení či léčebné řady po intervalech dnů či měsíců po počátečním léčení.

Tento vynález se též zaměřuje na farmaceutické přípravky zahrnující množství konjugátu ligandimunogen efektivní pro označení populace patogenních buněk u hostitelského živočicha pro specifickou eliminaci prostřednictvím endogenní imunitní odpovědi nebo současně podávaných protilátek. Tento přípravek dále obsahuje množství přídavného faktoru účinné pro zvýšení eliminace patogenních buněk zvoleného ze skupiny prostředků usmrcujících buňky, prostředků zvyšujících průnik do tumoru, chemoterapeutických prostředků, antimikrobiálních prostředků, cytotoxických imunitních buněk a sloučenin schopných stimulace endogenní imunitní odpovědi, při které se sloučenina neváže na konjugát ligand-imunogen. Farmaceutický prostředek obsahuje terapeuticky účinná množství konjugátu ligand-imunogen a terapeutického faktoru a tento faktor může zahrnovat cytokiny, jako je IL-2, IL-12 nebo IL-15 nebo kombinaci cytokinů včetně IL-2, IL-12 nebo IL-15 a interferony, jako je IFN-α nebo IFN-gama a kombinace interferonů, interleukinů a faktorů stimulujících tvorbu kolonií, jako je GM-CSF.

Jednotková denní dávka konjugátu ligand-imunogen se může značně měnit v závislosti na stavu hostitele, léčené chorobě, nebo molekulární hmotnosti konjugátu, způsobu podání a tkáňové distribuci a na možnosti současného použití dalších terapeutických způsobů léčby, jako je radiační terapie. Účinné množství pro podání pacientovi závisí na povrchu těla, hmotnosti pacienta a fyzikálním posouzení pacientova stavu. Účinná dávka může být v rozmezí od zhruba 1 ng/kg do zhruba 1 mg/kg, přednostněji od zhruba 1 do zhruba 500 pg/kg a nejlépe od zhruba 1 do zhruba 100 pg/kg.

- 11 CZ 304942 B6

Jakýkoliv účinný režim pro podávání konjugátu ligand-imunogen a terapeutického faktoru pro přesměrování předem existujících protilátek na tumorové buňky či infekční organismy nebo pro vyvolání humorální odpovědi na imunogen lze použít. Například lze podávat konjugát ligandimunogen a terapeutický faktor v jednotlivé dávce nebojí lze rozdělit a podávat v režimu několika denních dávek. Dále lze používat střídavý režim, například jeden až tři dny v týdnu jako alternativu k dennímu podávání a pro účely definice tohoto vynálezu lze považovat takový přerušovaný či střídavý denní režim jako ekvivalentní každodennímu podávání a patří do obsahu tohoto vynálezu. V preferovaném ztělesnění tohoto vynálezu na hostitel léčí více injekcemi konjugátu ligand-imunogen a terapeutického faktoru pro eliminaci populace patogenních buněk. V jednom ztělesnění se hostiteli podává injekčně několik (přednostně zhruba 2x až zhruba 50x) konjugát ligand-imunogen, například v intervalech 12 až 72 h nebo 48 až 72 h. Další injekce konjugátu ligand-imunogen lze podávat pacientovi v intervalu dnů či měsíců po počátečních injekcích a další injekce brání novému výskytu choroby. Alternativně mohou bránit novému výskytu choroby počáteční injekce konjugátu ligand-imunogen.

Terapeutický faktor lze podávat hostitelskému živočichu před podáním, v době podání nebo po podání konjugátu ligand-imunogen a terapeutický faktor lze podávat jako část téhož přípravku obsahujícího konjugát nebo jako část jiného přípravku, než je konjugát ligand-imunogen. Jakýkoliv takový terapeutický přípravek obsahuje terapeutický faktor v terapeuticky účinné dávce lze použít v tomto vynálezu. Navíc lze použít více než jeden typ konjugátu ligand-imunogen.

Například lze hostitelského živočicha předem imunizovat fluoresceinisothiokyanátem a dinitrofenylem a následně léčit fluoresceinisothiakyanátem a dinitrofenylem navázanými na stejné nebo jiné ligandy v protokolu současného podávání. V případě chemoterapeutických a antimikrobiálních prostředků lze podávat terapeutický faktor v suboptimální dávce spolu s konjugátem ligandimunogen při kombinované terapii, aby se předešlo vývoji rezistence na chemoterapeutický či antimikrobiální prostředek u hostitelského živočicha.

Konjugát ligand-imunogen a terapeutický faktor se přednostně injikují parenterálně a tyto injekce mohou být intraperitoneální, subkutánní, intramuskulámí, intravenózní nebo intrathekální. Konjugát ligand-imunogen a terapeutický faktor se mohou též podávat s použitím malého čerpadla. Příklady parenterálních dávkových forem zahrnují vodné roztoky aktivního prostředku v izotonickému roztoku chloridu sodného, 5% glukózy nebo jiných dobře známých farmaceuticky přijatelných kapalných nosičích, jako jsou kapalné alkoholy, glykoly, estery a amidy. Parenterální dávková forma podle tohoto vynálezu může být ve formě rekonstituovatelného lyofilizátu obsahujícího dávku konjugátu ligand-imunogen a terapeutického faktoru. V jednom preferovaném aspektu tohoto ztělesnění lze podávat jakýkoliv počet dávkových forem s prodlouženým uvolňováním známých v oboru, jako jsou například biodegradovatelné glycidové matrice popisované v patentech US 4 713 249, US 5 266 333 a US 5 417 982, jejichž popisy se zde zahrnují formou odkazu.

Příklady uskutečnění vynálezu

Příklad 1

Účinek konjugátů folát-fluoresceinisothiokyanát na přežívání myší s implantovaným tumorem plic

Myší samice Balb/c stáří 6 až 8 týdnů (zhruba 20 až 22 g) se současně imunizují na různých místech bovinním serumalbuminem (BSA) značeným fluoresceinisothiokyanátem (FITC) s pomocí komerčního adjuvantního prostředku (například Freundův adjuvant nebo Titer Max -Gold). Po ověření, že titry proti protilátce FITC jsou vysoké u všech myší (jak ukazují výsledky eseji ELISA vzorků séra myší) se každému zvířeti podá intraperitoneální 5 x 10⁵ buněk Ml09, buněč- 12CZ 304942 B6 né linie syngenního plicního karcinomu, které exprimují vysoké hladiny folátového receptoru. Místa nádorů se ponechají připojit a růst. Po dobu 4 až 7 d po implantaci nádorových buněk se všem zvířatům podává intraperitoneálně buď fyziologický roztok pufrovaný fosfátem, nebo specifické množství FITC konjugovaného na kyselinu listovou prostřednictvím gama karboxylové skupiny připojené ethylendiaminovým můstkem. Podané koncentrace folát-FITC jsou 0 (kontrola PBS), 4,5, 45, 450 a 4500 nmol/kg a 8 myší dostává každou z těchto koncentrací folát-FITC s celkovým množstvím aplikovaných zvířat 40. Řada 5-denních injekcí (dny 8 až 12) 5000 mezinárodních jednotek rekombinantního lidského IL-2 se poté podává všem myším pro stimulaci imunitního systému. Účinnost této imunoterapie se hodnotí monitorováním přežívání jako funkce času myši léčené konjugátem folát-FITC ve srovnání s kontrolami. Jak ukazuje obrázek 1, medián přežívání myši léčené konjugátem folát-FITC závisí na dávce, kontrolní myši vykazují medián přežívání 23 d po implantaci tumoru a myši skupiny folát-FITC přežívají po vzrůstající doby při zvyšování dávky konjugátu. Již 45 nmol/kg folátu-FITC podpořilo dlouhodobé přežívání myší a vyšší dávky byly úměrně účinnější. I když se folát-FITC koncentruje v tumorech, určité množství folátu-FITC je přítomno ve tkáni ledvin (avšak nikoliv ve srovnatelných hladinách v ostatních normálních tkáních). Při pitvě autorizovaným veterinárním patogenem nebyly zjištěny žádné známky toxicity v ledvině ani jiných orgánech.

Příklad 2

Zobrazení normální tkáně oproti tumorové tkáni folátem konjugovaným s fluoresceinisothiokyanátem

Tento způsob je podobný způsobu popsanému v příkladu 1 s tím rozdílem, že zvířata dostávají tumorové buňky 24JK-FBP a myši se utratí brzy po injekci konjugátu folát-FITC a tkáně se rozdělí na tenké řezy a vyšetřují imunofluorescencí FITC s použitím konfokálního fluorescenčního mikroskopu pro lokalizaci konjugátu folát-FITC v jednotlivých tkáních včetně tumoru, ledviny, jater a svalu. Obrázek 2 ukazuje fázově kontrastní mikrofotografie různých tkáňových řezů jako kontrol spolu s fluorescenčními mikrofotografiemi. Zjišťuje se, že se konjugát folát-FITC lokalizuje specificky v tkáni tumoru a v buňkách proximálních tubulů ledvin, kde se jedinečně vyskytují receptory kyseliny listové.

Příklad 3

Zobrazení tkáně tumoru folátem konjugovaným na fluorescein-isothiokyanát nebo kozím protimyším imunoglobulinem značeným fýkoeiytrinem

Postupy jsou podobné způsobům popsaným v příkladu 2 s tím rozdílem, že se používají buňky M109 a tkáně se vyšetřují fluorescencí FITC (zelená zobrazení) a fluorescencí fokoerytrinu (PE) (červená zobrazení). Při fluorescenci PE se fluorescenční značka připojuje na kozí protimyší imunoglobulin jako protilátku pro použití při detekci vazby endogenních myších protilátek proti FITC ke konjugátu folát-FITC, který se akumuluje na buňkách tumoru. Tumorové tkáně zpracované a nezpracované konjugátem folát-FITC se srovnávají a oba typy vzorků se též vyšetřují fázově kontrastní mikroskopií, jak se popisuje v příkladu 2. Fluorescence FITC ukazuje lokalizaci konjugátu folát-FITC v tumorových tkáních (obr. 3). Fluorescence PE prokazuje, že se endogenní myší protilátky proti FITC vázané na konjugát folát-FITC lokalizují v tumorových buňkách. Další studie (neuvádějí se výsledky) prokazují nedostatek takové vazby imunoglobulinu normální tkáně včetně ledvin. Nepřítomnost vazby protilátky na konjugát folát-FITC lokalizovaný v ledvinových tkáních vyplývá ze skutečnosti, že pokud je folátový receptor na apikální membráně buněk proximálních tubulů ledvin, nemají protilátky přístup k této oblasti ledvin. Fázově kontrastní zobrazení (přenesené obrazy) ukazují morfologii ošetřených a neošetřených tumorových tkání s průkazem zániku buněk v ošetřených vzorcích.

- 13 CZ 304942 B6

Příklad 4

Účinek konjugátů folát-fluoresceinisothiokyanát na růst solidních tumorů

Tyto způsoby jsou podobné způsobu popsanému v příkladu 1 s tou výjimkou, že každé zvíře dostává spontánně do oblasti ramena lxlO⁶ buněk Ml09 (den 0) po předchozí imunizaci FITC. Imunizace konjugátem folát-FITC po implantaci tumorových buněk představuje 1500nmol/kg konjugátu folát-FITC podávaných v 6 intraperitoneálních dávkách v intervalech 48 h (dny 7, 9, 11, 13, 15 a 17). Výsledné solidní tumory ramena se měří a stanoví se procentický vzrůst velikosti tumoru. Křivky růstu tumoru znázorněné na obr. 4 ukazují, že se růst tumoru významně inhibuje u zvířat léčených konjugátem folát-FITC v kombinaci s interleukinem IL-2.

Příklad 5

Účinek léčby kombinacemi cytokinů

Tyto způsoby jsou podobné způsobům popsaným v příkladu 1 stím rozdílem, že se zvířata ošetřují 5 dnů injekcemi (dny 8 až 12) 5000 mezinárodních jednotek rekombinantního lidského interleukinu IL-2 spolu s IFN-a (5 denních injekcí 2,5x10⁴ jednotek/den), IL-12 (5 denních injekcí 0,5 gg/den), nebo TNF-a (3 injekce ve dnech 8, 10 a 12, 2 pg/den) po injekci 2 dávek 1500 nmol/kg konjugátu folát-FITC nebo aminofluoresceinu ve dnech 4 a 7 po implantaci tumorových buněk. Dále, ve snaze zkrátit čas požadovaný pro obdržení dat o dlouhodobém přežívání, se tumory implantují intraperitoneálně blízko k jádrům. Tím se přežívají myší s tumorem obecně zkrátí ve srovnání s přežíváním na obr. 1. Výsledky ukázané na obr. 5 ukazují, že IL-2 samotný byl účinnější při podpoře přežívání zvířat než kombinovaná léčba s IL-2 a IFN-α byla účinnější při podpoře dlouhodobého přežívání než IL-2 samotný. Aminofluorescein se podává injekčně spolu s různými kombinacemi cytokinů jako kontrola, neboť tato látka není připojená na folát a nebude znovu cílit antifluoresceinové protilátky k tumorovým buňkám.

Příklad 6

Účinek několika injekcí konjugátů folát-fluorescein isothiokyanát

Tyto způsoby jsou podobné způsobům popsaným v příkladu 1 stím rozdílem, že se zvířatům podává intraperitoneálně v intervalech 48 h 6 denních injekcí (dny 7, 9, 11, 13, 15 a 17 po implantaci tumorových buněk) 1500 nmol/kg konjugátu folát-FITC. Výsledky ukazují (obrázek 6), že několik injekcí konjugátu folát-FITC zlepšuje dlouhodobé přežívání zvířat léčených konjugátem folát-FITC a IL-2 ve srovnání se 2 injekcemi konjugátu folát-FITC podávanými ve dnech 4 a 7 po implantaci tumorových buněk.

Příklad 7

Synergní účinek konjugátu folát-fluoresceinisothiokyanát a IL-2

Tyto způsoby jsou podobné způsobům popsaným v příkladu 1 s tím rozdílem, že se zvířatům podává injekčně 1500 nmol/kg konjugátu folát-FITC a některá zvířata se ošetřují buď konjugátem folát-FITC, nebo samotným IL-2. Dále se tumorové buňky implantují intraperitoneálně, jak se popisuje v příkladu 5. Tento expriment (viz obrázek 7) se provádí pro stanovení toho, zda přispívá konjugát folát-FITC a IL-2 synergicky k podpoře dlouhodobého přežívání myší s nádorem. Mediány dob přežívání pro kontrolní skupinu (n = 8) a skupiny (n = 8) ošetřené IL-2, konjugátem folát-FITC nebo konjugátem folát-FITC + IL—2 jsou 18, 19, 22 respektive 42 d. Výsledky

- 14CZ 304942 B6 ukázané na obrázku 7 dokazují, že schopnost konjugát folát-FITC a IL-2 prodloužit přežívání myší s tumorem je silně synergní při nízké dávce, kde IL-2 má zanedbatelný účinek na dobu přežívání myší za nepřítomnosti konjugátu folát-FITC a folát-FITC má pouze malý účinek.

Příklad 8

Účast NK buněk při synergním účinku konjugátů folát-fluoresceinisothiokyanát a IL-2

Tyto způsoby jsou podobné způsobům popsaným v příkladu 7 s tím rozdílem, že se jedna skupina zvířat ošetřuje polyklonální králičí protilátkou proti myším NK buňkám (anti-asialo GM1, Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Richmond, Va) v kombinaci s konjugátem folát-FITC a IL-2. Každá myš dostává injekčně 0,2 ml zásobního roztoku protilátky ve zředění 1:10 ve dnech 1, 4, 9 a 14 po implantaci tumoru pro dosažení vyčerpání NK buněk. Medián časů přežití pro kontrolní skupinu a skupiny léčené konjugátem folát-FITC + IL-2 nebo folát - FITC + IL-2 + α-NK Ab jsou 18, 42 respektive 18,5 d. Výsledky na obrázku 8 prokazují, že NK buňky zprostředkovávají synergní zvýšení dlouhodobého přežití myší s tumorem dosažené kombinovanou léčbou konjugátem folát-FITC a IL-2.

Příklad 9

Rozvoj buněčné imunity proti tumorovým buňkám Ml09

Tyto způsoby jsou podobné způsobům příkladu 1 s tím rozdílem, že se tumorové buňky implantují intraperitoneálně v poloze popsané v příkladu 5 a zvířatům se podává fyziologický roztok pufrovaný fosfátem (kontrola) nebo konjugát folát-FITC (1500 nmol/kg), IL-2 (250 000 mezinárodních jednotek/dávka) a IFN-a (25 000 mezinárodních jednotek/dávka) ve dnech 7, 8, 9, 11 a 14 po implantaci tumorových buněk. Navíc se zvířata vystaví injekci 5 x 10⁵ buněk Ml 09 v den 62 po počáteční implantaci tumorových buněk, injekci 1,5x10⁶ buněk Ml09 v den 96 po počáteční implantaci tumorových buněk nebo injekci 2,5x10⁵ buněk linie 1 (spontánní lidský karcinom a Balb/c) v den 127 po počáteční implantaci tumorových buněk.

Jak ukazuje obrázek 9, medián času přežívání kontrolních myší injikovaných 5x10⁵ buněk Ml09 je 18,5 d. Medián času přežívání kontrolních myší injikovaných l,5xl0⁶ buněk M109 je 18 d. Medián času přežívání kontrolních myší injikovaných buňkami linie 1, 2,5x10⁵, je 23,5 d. Medián času přežívání myší injikovaných 5xl0⁵ buněk M109 a léčených konjugátem folát-FITC v kombinaci s IL-2 a IFN-a s dalším podáním buněk v den 62, 5xlO⁵ buněk M109, v den 96, l,5xl0⁶ buněk M109 a v den 127, 2,5xl0⁵ buněk linie 1, je delší než 192 d.

Výsledky ukázané na obrázku 9 prokazují rozvoj dlouhodobé buněčné imunity specifické pro typ buněk u zvířat léčených konjugátem folát-FITC v kombinaci s IL-2 a IFN-α. Tato dlouhodobá imunita brání zvířata implantovaná buňkami Ml09 a léčená imunoterapií cílenou na folát proti opětovnému výskytu choroby do další aplikace buněk následnou injekcí buněk Ml09. Často přežívání těchto zvířat po konečné zátěži buňkami linie 1 může být následkem přítomnosti folátových receptorů na buňkách linie 1 při nižších hladinách než na buňkách Ml09 a přítomnosti tumorových antigenů sdílených mezi buňkami Μ109 a buňkami linie 1 vedoucí k imunitní odpovědi specifické pro buňky M109 schopné zkřížené reakce s buňkami linie 1.

- 15CZ 304942 B6

Příklad 10

Účinek dávky IL-2 na přežívání myší léčených konjugáty folát-fluoresceinisothiokyanát

Tyto způsoby jsou podobné způsobům popsaným v příkladu 1 stím rozdílem, že se tumorové buňky implantují intraperitoneálně v poloze popsané v příkladu 5 a zvířata se léčí fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (kontrola) a současně se jim aplikuje infekčně folát-FITC (1500 nmol/kg) a IL-2 v dávkách 5xl0³ mezinárodních jednotek (lx), O,5xlO⁵ mezinárodních jednotek (lOx), 2,5x10⁵ mezinárodních jednotek (50x) nebo 5x10⁵ mezinárodních jednotek (lOOx) ve dnech 7, 8, 9, 11 a 14 po implantaci tumorových buněk. Navíc se zvířata imunizují prostředkem keyhole limpit hemocyanin (KLH) značeným FITC místo bovinním serumalbuminem značeným FITC. Jak ukazuje obrázek 10, medián času přežívání myší s implantovanými buňkami Ml09 léčených konjugátem folát-FITC roste s rostoucí dávkou IL-2 nad hodnotou dávek IL-2 5x10³ mezinárodních jednotek. Oproti tomu se nepozoruje žádný podstatný rozdíl mezi mediány času přežívání kontrolních myší (myši, které obdržely buňky Μ109 a léčení fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem) a myší léčených samotným IL-2.

Příklad 11

Zlepšení přežívání myší léčených konjugáty folát-fluoresceinisothiokyanát a IL-2 prostřednictvím IFN-a

Způsoby jsou podobné způsobům popsaným v příkladu 1 s tím rozdílem, že se tumorové buňky implantují intraperitoneálně v poloze popsané v příkladu 5 a zvířata se léčí fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (kontrola) nebo se současně podává konjugát folát-FITC (1500 nmol/kg) a IL-2 (5000 mezinárodních jednotek/dávka) nebo folát-FITC (1500 nmol/kg), IL-2 (5000 mezinárodních jednotek/dávka) a IFN-a (2500 jednotek/dávka) ve dnech 7, 8, 9, 11 a 14 po implantaci tumorových buněk. Další skupina myší dostává injekčně folát-FITC, IL-2 a IFN-α, avšak zvířata nejsou předem imunizovaná komplexem bovinní serumalbumin-FITC. Obrázek 11 ukazuje, že medián času přežívání pro kontrolní myši léčené fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem je 18,5 d, medián času přežívání pro myši, které současně dostávají injekčně folát FITC a IL-2 je 20,5 g, medián času přežívání pro myši, které dostávají injekčně současně folát-FITC, IL-2 a IFN-α je větší než 60 d a medián času přežívání pro myši, které současně dostávají injekčně folát-FITC, IL-2 a IFN-α, avšak nejsou předem imunizované, je 24,3 d. Medián času přežívání pro myši, které dostávají injekčně folát-FITC a IL-2, se podstatně neliší od mediánu pro kontrolní myši, neboť tyto myši dostávaly injekčně 5000 mezinárodních jednotek IL-2 a jak popisuje příklad 10, jsou nutné dávky IL-2 nad 5000 mezinárodních jednotek pro zvýšení mediánu času přežívání myší léčených konjugátem folát-FITC při režimu dnů 7, 8, 9, 11 a 14. Výsledky ukázané na obrázku 11 prokazují, že IFN-α zvyšuje vzrůst mediánu času přežívání, který nastává jako výsledek léčby myší implantovaných tumorovými buňkami s konjugátem FITC a IL-2.

Příklad 12

Účinek vyčerpání CD8⁺ T buněk na imunoterapii cílenou na folát

Tyto způsoby jsou podobné způsobům popsaným v příkladu 1 stím rozdílem, že se tumorové buňky implantují intraperitoneálně v poloze popsané v příkladu 5 a zvířatům se podává injekčně fyziologický roztok pufrovaný fosfátem (kontroly) nebo se jim současně podává konjugát folátFITC (1500 nmol/kg), IL-2 (5000 mezinárodních jednotek/dávka) a IFN-a (2500 jednotek/dávka) ve dnech 7, 8, 9, 11 a 14 po implantaci tumorových buněk. Dalším skupinám myší se součas-16CZ 304942 B6 ně podává aminofluorescein (1500 nmol/kg), IL-2 a IFN-α nebo folát-FITC, IL-2, IFN-α a protilátka proti buňkám CD8⁺T (ve formě ascitů a tyto myši se aplikují ve dnech 2, 3, 7, 11 a 15). Jak ukazuje obrázek 12, protilátka proti CD8⁺T buňkám inhibuje vzrůst střední doby přežití u myší léčených konjugátem folát-FITC, IL-2 IFN-α, což ukazuje, že CD8⁺T buňky hrají roli při aktivaci buněčné imunitní odpovědi imunoterapií cílenou na folát. Aminofluorescein se podává injekčně spolu s kombinací IL-2, cytokin IFN-α jako kontrola, neboť tato sloučenina není připojená na folát a nebude znovu cílit protifluoresceinové protilátky na tumorové buňky. Obrázek 12 ukazuje, že aminofluorescein spolu s IL-2 a IFN-α je mnohem méně efektivní než folát FITC, IL-2 a IFN-α při zvyšování mediánu přežití myší implantovaných buňkami Ml09.

Příklad 13

Zesilovací účinek GM-CSF na folátovou cílenou imunoterapií s účinkem zvýšeným pomocí IL-2 a IFN-a

Tyto způsoby jsou podobné způsobům popsaným v příkladu 1 s tím rozdílem, že se tumorové buňky implantují intraperitoneálně v poloze popsané v příkladu 5. Navíc, jak ukazuje obrázek 13, se zvířatům podává injekčně více cytokinů včetně IL-2 (5000 mezinárodních jednotek/dávka), IFN-a (25000 jednotek/dávka) a GMCSF (3000 jednotek/dávka). Cytokiny se současně podávají injekčně v sériích 5 denních injekcí ve dnech 8 až 12 po implantaci buněk Ml09, která následuje po injekci dvou dávek 1500 nmol/kg konjugátu folát-FITC ve dnech 4 a 7. Výsledky zobrazené na obrázku 13 ukazují, že medián času přežití pro myši léčené fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem je 19 d, medián času přežití pro myši, kterým se injekčně podává IL-2, IFN-a a GM-CSF bez folát-FITC je 22 d, medián času přežívání pro myši, kterým se injekčně podává folát-FITC, IL-2 a IFN-α, je 38 d a medián času přežívání pro myši, kterým se injekčně podává folát-FITC, IL-2 a IFN-α a GM-CSF je větší než 57,5 d. Tyto výsledky ukazují, že GM-CSF dále zesiluje usmrcování tumorových buněk s cílením na folát u myší, které se též léčí IL-2 a IFN-α. Medián doby přežívání pro myši, kterým se injekčně podává PBS, IL-2, IFN-α a GMCSF není významně rozdílný proti kontrolním myším, což ukazuje na důležitost cílení nádorově specifické imunitní odpovědi při použití konjugátu folát-FITC.

Příklad 14

Účinek dávky IFN-α na přežívání myší léčených konjugáty folát-fluoresceinisothiokyanát

Tyto způsoby jsou podobné způsobům popsaným v příkladu 1 stím rozdílem, že se tumorové buňky implantují intraperitoneálně v poloze popsané v příkladu 5 a zvířata se léčí fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (kontroly) nebo se jim současně podává injekčně folát FITC (1500 nmol/kg) a IFN-α v dávkách 1,5x10⁵ mezinárodních jednotek/dávka (6x) 7,5x10⁴ mezinárodních jednotek (3x), 2,5x10⁴ mezinárodních jednotek/dávka (lx) a 7,5x10³ mezinárodních jednotek/dávka (0,3x). Navíc se zvířata imunizují keyhole limpit hemocyaninem (KLH) značeným FITC místo bovinního serumalbuminu značeného FITC a zvířatům se podává injekčně folát-FITC a IFN-α ve dnech 7, 8, 9, 11 a 14 po implantaci tumorových buněk. Jak ukazuje obrázek 14, medián doby přežívání myší implantovaných buňkami M109 a léčených konjugátem folát-FITC roste s rostoucí dávkou IFN-α nad hodnotu dávky IFN-a 8x10⁴ mezinárodních jednotek/dávka.

- 17CZ 304942 B6

Příklad 15

Účinek dinitrofenylu jako imunogenu na folátovou cílenou imunoterapii

Tyto způsoby jsou podobné způsobům popsaným v příkladu 1 s tím rozdílem, že se tumorové buňky implantují intraperitoneálně v poloze popsané v příkladu 5 a zvířata se ošetřují fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (kontroly) nebo jim současně podává dinitrofenyl (DNP) (1500 nmol/kg), IL-2 (5000 mezinárodních jednotek/dávka/den) a IFN-a, (2,5x10⁴ jednotek/den) nebo konjugát folát-dinitrofenyl (DNP) (1500 nmol/kg), IL-2 (5000 mezinárodních jednotek/dávka/den) a IFN-α (2,5xl0⁴ jednotek/den) ve dnech 7, 8, 9, 11 a 14 po implantaci tumorových buněk. Navíc se zvířata imunizují keyhole limpit hemocyaninem (KLH) značeným DNP. Jak ukazuje obrázek 15, medián doby přežívání myší léčených konjugátem folát-DNP, IL2 a IFN-α vzrůstá oproti kontrolním myším (léčeným fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem) nebo myším léčeným DNP, IL-2 a IFN-α. DNP je proti též účinným ímunogenem pro použití při folátové cílené imunoterapii.

Příklad 16

Synergní účinek konjugátu folát-fluoresceinisothiokyanát a IFN-a

Tyto způsoby jsou podobné způsobům popsaným v příkladu 1 stím rozdílem, že se tumorové buňky implantují intraperitoneálně v poloze popsané v příkladu 5 a zvířata se léčí fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (kontroly), samotným IFN-a (7,5x10⁴ jednotek/den), samotným konjugátem folát-FITC (1500 nmol/kg) nebo se jim současně podává konjugát folát-FITC (1500 nmol/kg) a IFN-α (7,5xl0⁴ jednotek/d) ve dnech 7, 8, 9, 11 a 14 po implantaci tumorových buněk. Navíc se zvířata (5 myší v každé skupině) imunizují keyhole limpit hemocyaninem (KLH) značeným FITC místo bovinní serumalbuminem značeným FITC. Jak ukazuje obrázek 16, jsou mediány času přežití pro skupiny léčené fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (kontroly), IFN-α, konjugátem folát-FITC nebo konjugátem folát-FITC + IFN-a 17, 17, 23 respektive 33 d. Tyto výsledky ukazují, že IFN-α, podobně jako IL-2, působí synergně s konjugátem folát-FITC při podpoře dlouhodobého přežívání myší s nádorem.

Příklad 17

Účinek dinitrofenylu jako imunogenu a cytokinů při vysokých koncentracích na dlouhodobé přežívání myší

Tyto způsoby jsou podobné způsobům popsaným v příkladu 1 s tím rozdílem, že se tumorové buňky implantují intraperitoneálně v poloze popsané v příkladu 5 a zvířata se léčí fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (kontroly) nebo se současně podává fyziologický roztok pufrovaný fosfátem IL-2 (2,5x10⁵ jednotek/d) a IFN-a (7,5x10⁴ jednotek/d) nebo folát-dinitrofenyl (DNP) (1500 nmol/kg), IL-2 (2,5x10⁵ jednotek/d) a IFN-a (7,5x10⁴ jednotek/d) ve dnech 7, 8, 9, 11 a 14 po implantaci tumorových buněk. Navíc se zvířata imunizují keyhole limpit hemocyaninem (KLH) značeným DNP. Jak ukazuje obrázek 17, medián času přežívání myší léčených konjugátem folát-DNP, IL-2 a IFN-α se zvyšuje proti kontrolním myším (léčeným fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem) nebo myším léčeným fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem, IL-2 a IFN-α. Myši léčené konjugátem folát-DNP, IL-2 a IFN-α (s IL-2 a IFN-a o koncentracích 2,5 xl O⁵ jednotek/d a 7,5x10⁴ jednotek/d) se zcela vyléčily.

Claims (25)

1. Použití konjugátu folát-fluoresceinisothiokyanátu, neboli -FITC, nebo folát-dinitrofenylu, a sloučeniny schopné stimulace endogenní imunitní odpovědi, přičemž tato sloučenina je vybrána ze souboru sestávajícího z IL-2, IFN-alfa a GM-CSF a kde sloučenina není vázána na konjugát folát-FITC nebo folát-dinitrofenyl, pro výrobu léčiva používaného pro způsob zvyšování specifické eliminace populace tumorových buněk zprostředkované endogenní imunitní odpovědí u hostitelského živočicha s touto populací, spočívající v kroku podávání tohoto konjugátu folát-FITC nebo folát-dinitrofenylu a této sloučeniny uvedenému hostiteli, kde členové uvedené buněčné populace mají přístupné vazebné místo pro folát, přičemž uvedený FITC nebo uvedený dinitrofenyl je rozpoznáván endogenní nebo exogenní protilátkou v hostitelském živočichovi neboje rozpoznáván přímo imunitní buňkou v hostiteli.

2. Použití podle nároku 1, kde folát je schopen specifické vazby na receptor buněčné membrány.

3. Použití podle nároku 1, kde folát má glutamylový zbytek kovalentně připojený k FITC nebo k dinitrofenylu pouze prostřednictvím gamma-karboxylové skupiny.

4. Použití podle nároku 1, kde folát má glutamylový zbytek kovalentně připojený k FITC nebo k dinitrofenylu pouze prostřednictvím alfa-karboxylové skupiny.

5. Použití podle nároku 3 nebo 4, kde kovalentní spojení mezi FITC nebo dinitrofenylem a folátem je kovalentní vazbou prostřednictvím bivalentního spojovacího článku.

6. Použití podle nároku 1, kde populace tumorových buněk na svém povrchu preferenčně exprimuje, jedinečně exprimuje nebo nadměrně exprimuje receptor schopný vázat folát.

7. Použití podle nároku 1, kde protilátka je exogenní pro uvedeného hostitele a je podávána spolu s konjugátovým prostředkem.

8. Použití podle nároku 1, kde prostředek konjugátu folát-FITC nebo folát-dinitrofenylu se podává ve více injekcích.

9. Použití podle nároku 1, kde hostitelský živočich byl předem vystaven přirozeně FITC nebo dinitrofenylu, takže tento hostitelský živočich má předem přítomnou imunitu k popisovanému FITC nebo popisovanému dinitrofenylu ověřenou přítomností endogenních protilátek proti FITC nebo dinitrofenylu.

10. Použití podle nároku 1, kde hostitelský živočich byl předem vystaven FITC nebo dinitrofenylu nepřirozeným způsobem, s následnou imunitní odpovědí hostitelského živočicha na tento FITC nebo tento dinitrofenyl.

11. Použití podle nároku 10, kde nepřirozeným způsobem majícím za výsledek imunitní odpověď hostitelského živočicha je očkování.

-19CZ 304942 B6

12. Použití podle nároku 10, kde nepřirozeným způsobem majícím za výsledek imunitní odpověď je aktivní imunizace.

13. Použití podle nároku 1, kde endogenní imunitní odpověď zahrnuje humorální imunitní odpověď.

14. Použití podle nároku 13, kde humorální odpovědí je získaná imunitní odpověď.

15. Použití podle nároku 13, kde humorální odpovědí je vrozená imunitní odpověď.

16. Použití podle nároku 14, kde získaná imunitní odpověď je vyvolána podáváním očkovacího prostředku hostitelskému živočichovi.

17. Použití podle nároku 1, kde endogenní imunitní odpověď zahrnuje imunitní odpověď zprostředkovanou buňkami.

18. Použití podle nároku 1, kde endogenní imunitní odpověď zahrnuje humorální odpověď a imunitní odpověď zprostředkovanou buňkami.

19. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinná množství konjugátu folát-FITC nebo folát-dinitrofenylu schopného specifické vazby na populaci tumorových buněk v hostitelském živočichovi pro specifickou eliminaci těchto buněk prostřednictvím získané nebo vrozené imunitní odpovědi, současně podávané protilátky nebo přímo prostřednictvím imunitních buněk hostitele, a sloučeniny schopné stimulace endogenní imunitní odpovědi, přičemž tato sloučenina je vybrána ze souboru sestávajícího z IL-2, IFN-alfa a GM-CSF a neváže se na konjugát folát-FITC nebo folát-dinitrofenyl, a farmaceuticky přijatelný nosič těchto látek.

20. Farmaceutický prostředek podle nároku 19, vyznačující se tím, že je v parenterální formě s prodlouženým uvolňováním dávky.

21. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje konjugát ligandimunogen v množství, které je účinné ke značení populace tumorových buněk v organismu živočišného hostitele pro specifickou eliminaci endogenní imunitní odpovědí nebo současně podávanými protilátkami, přičemž konjugát ligand-imunogen představuje fluoresceinisothiokyanát konjugovaný s folátem přes ethylendiaminový můstek navázaný na gamma-karboxylovou skupinu folátu nebo dinitrofenyl konjugovaný s folátem, a farmaceuticky přijatelný nosič těchto látek.

22. Použití folát-FITC pro výrobu léčiva pro značení populace tumorových buněk v hostitelském živočichovi pro specifickou eliminaci endogenní imunitní odpovědí nebo současně podávanými protilátkami.

23. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje fluoresceinisothiokyanát (FITC) konjugovaný s folátem přes ethylendiaminový můstek navázaný na gammakarboxylovou skupinu folátu a farmaceuticky přijatelný nosič.

-20CZ 304942 B6

24. Farmaceutický prostředek podle nároku 23, vyznačující se tím, že je v parente rální dávkové formě.

25. Farmaceutický prostředek podle nároku 23 nebo 24, vyznačující se tím, že uve 5 děný farmaceuticky přijatelný nosič je vybrán z isotonického fyziologického roztoku, 5% glukó zy, kapalných alkoholů, kapalných glykolů, kapalných esterů a kapalných amidů.