PL211872B1 - Kompozycja farmaceutyczna - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Dziedzina wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej stosowanej w leczeniu stanów chorobowych cechujących się obecnością populacji komórek patogennych. Dotkniętemu chorobą gospodarzowi podaje się ukierunkowaną na komórki kompozycję, korzystnie w połączeniu z czynnikiem stymulującym układ immunologiczny lub innym czynnikiem leczniczym, aby wzmocnić i/lub przekierować odpowiedź immunologiczną gospodarza na patogenne komórki.

Tło i streszczenie wynalazku

Układ immunologiczny ssaków dostarcza środków do rozpoznawania i usuwania komórek nowotworu, innych komórek patogennych oraz patogenów wnikających z zewnątrz. Podczas gdy zwykle układ immunologiczny stanowi silną linię obrony, w wielu przypadkach komórki nowotworowe, inne komórki patogenne lub czynnik zakaźny unikają odpowiedzi immunologicznej i proliferują lub trwają z towarzysząc ą im patogennością wobec gospodarza. Aby usuwać proliferujące nowotwory opracowano czynniki chemioterapeutyczne i radioterapię. Jednakże większość, jeśli nie wszystkie, z dostępnych aktualnie trybów leczenia środkami chemoterapeutycznymi i radioterapią, powodują niekorzystne skutki uboczne, ponieważ działają nie tylko niszcząc komórki nowotworowe, ale również atakują prawidłowe komórki gospodarza, jak komórki układu krwiotwórczego. Co więcej, czynniki chemioterapeutyczne mają ograniczoną skuteczność w przypadkach, gdy u gospodarza rozwinie się oporność na leki.

Obce patogeny mogą się również namnażać w gospodarzu unikając skutecznej odpowiedzi immunologicznej lub gdy układ immunologiczny gospodarza został upośledzony terapią lekową lub innymi zaburzeniami zdrowotnymi. Choć opracowano wiele związków leczniczych, liczne patogeny są lub stały się oporne na takie leki. Zdolność komórek nowotworowych i organizmów zakaźnych do rozwijania oporności na czynniki lecznicze oraz niekorzystne skutki uboczne aktualnie dostępnych leków przeciwnowotworowych podkreślają potrzebę rozwijania nowych sposobów leczenia, specyficznych wobec populacji komórek patogennych i o zmniejszonej toksyczności dla gospodarza.

Badacze opracowali protokoły terapeutyczne do niszczenia komórek nowotworowych przez kierowanie związków cytotoksycznych specyficznie do takich komórek. Takie protokoły stosują toksyny skoniugowane z ligandami wiążącymi się do receptorów wyrażanych jedynie lub wyrażanych nadmiernie przez komórki nowotworowe, próbując zminimalizować dostarczanie toksyn do komórek prawidłowych. W tym podejściu opracowano pewne immunotoksyny, składające się z przeciwciał skierowanych przeciw specyficznym receptorom na komórkach patogennych, które to przeciwciała są połączone z toksynami takimi jak rycyna, egzotoksyna Pseudomonas, toksyna krztuśca i czynnik martwicy nowotworów. Takie immunotoksyny kierują się przeciw komórkom nowotworu noszącym specyficzne receptory rozpoznawane przez przeciwciało (Olsnes, S., Immunol. Today, 10, str. 291-295, 1989; Melby, E. L., Cancer Res., 53 (8), str. 1755-1760, 1993; Better, M. D., numer publikacji PCT WO91/07418, opublikowano 30 maja 1991).

Innym podejściem w wybiórczym ukierunkowywaniu na populacje komórek nowotworowych lub zewnętrznych patogenów w gospodarzu jest wzmocnienie odpowiedzi immunologicznej gospodarza przeciw komórkom patogennym, pozwalające uniknąć potrzeby podania związków, które mogą również wykazywać niezależną toksyczność dla gospodarza. Jedną z opisywanych strategii immunoterapii jest związanie przeciwciał, na przykład zmienionych technikami inżynierii genetycznej przeciwciał multimerycznych z powierzchnią komórek guza tak, że prezentują stały region przeciwciał na powierzchni komórki i w ten sposób wywołują zabijanie komórek nowotworu w różnych procesach w których pośredniczy układ immunologiczny.(De Vita, V. T., Biologie Therapy of Cancer, wyd. 2 Philadelphia, Lippincott, 1995; Soulillou, J. P., patent USA 5672486). To podejście jednak komplikują trudności w określeniu specyficznych dla guza antygenów. Innym podejściem opierającym się na zdolności gospodarza do odpowiedzi immunologicznej jest nakierowanie przeciwciał przeciw receptorom limfocytów T lub przeciwciał przeciw receptorom Fc na powierzchnię komórek nowotworu, aby rozwinąć bezpośrednie wiązanie komórek układu immunologicznego do nowotworu (Kranz, D. M., patent USA 5547668). Opisywano również podejście w oparciu o szczepionkę, polegające na szczepionce zawierającej antygeny połączone z cytokinami, które zmieniają immunogenność antygenu szczepionki w ten sposób stymulując odpowiedź immunologiczną na czynnik patogenny (Pillai S., numer publikacji PCT WO 91/11146, opublikowano 7 lutego 1991). Ten sposób opiera się na opisywanej pośredniej modulacji odpowiedzi immunologicznej. W innym podejściu do zabijania niepożądaPL 211 872 B1 nych populacji komórek stosuje się IL-2 lub fragmenty globuliny Fab przeciw tymocytom, połączone z antygenem aby usunąć niepożądane limfocyty T; jednakż e, wedł ug oryginalnych danych do ś wiadczalnych, tym sposobem usuwa się jedynie 50% docelowej populacji komórek i powoduje on niespecyficzne zabijanie komórek in vivo (np. zabijane jest również 50% limfocytów krwi obwodowej, które nie są limfocytami T (Pouletty, P., numer publikacji PCT WO 97/37690, opublikowano 16 października 1997)). Zatem jest duże zapotrzebowanie na terapie do leczenia stanów chorobowych cechujących się istnieniem populacji komórek patogennych w dotkniętych nimi gospodarzu.

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna charakteryzująca się tym, że zawiera związek o wzorze:

i farmaceutycznie akceptowalny noś nik.

Kompozycja według wynalazku pozwala na usuwanie populacji komórek patogennych w gospodarzu przez polepszenie rozpoznawania i zwiększenie odpowiedzi układu immunologicznego gospodarza na takie populacje komórek. Skutecznie zwiększa się antygenowość patogenów komórkowych, aby wzmóc endogenne usuwanie populacji komórek patogennych, w którym pośredniczy odpowiedź immunologiczna. Metoda usuwania populacji komórek patogennych opisana w wynalazku pozwala na uniknięcie lub zminimalizowanie użycia leczniczych środków cytotoksycznych lub antybakteryjnych. Metoda ta obejmuje podanie koniugatu ligand-immunogen, który to ligand jest zdolny specyficznie wiązać się z populacją komórek patogennych in vivo, która jako jedyna wyraża, wyraża głównie lub wyraża nadmiernie cząstkę wiążącą ligand, a skoniugowany z ligandem immunogen jest zdolny spowodować wytwarzanie przeciwciał lub, korzystniej, może być rozpoznawany przez endogenne lub podane łącznie z nim egzogenne przeciwciała w organizmie gospodarza zwierzęcego. Usuwanie populacji komórek patogennych, w którym pośredniczy odpowiedź immunologiczna, polega na wiązaniu ligandu skoniugowanego z immunogenem do receptora, transportera lub innego białka prezentowanego na powierzchni komórek wyrażanego jedynie, wyrażanego głównie, wyrażanego nadmiernie lub wyrażanego preferencyjnie przez komórkę patogenną. Białko prezentowane na powierzchni komórek wyrażane jedynie, wyrażane głównie, wyrażane nadmiernie lub wyrażane preferencyjnie przez komórkę patogenną jest receptorem nieobecnym lub obecnym w mniejszych ilościach na komórkach niepatogennych, co dostarcza metody wybiórczego usuwania komórek patogennych. Aby wzmóc skuteczność leczniczą można podać jednocześnie czynnik leczniczy, na przykład czynnik pobudzający układ immunologiczny, czynnik zabijający komórki, wzmacniacz penetracji guza, czynnik chemoterapeutyczny, cytotoksyczna komórka układu immunologicznego albo czynnik antybakteryjny.

W wynalazku opisuje się takż e etap podawania ligandów zdolnych do specyficznego wią zania się z wysokim powinowactwem in vivo z białkami powierzchniowymi komórki wyrażanymi jedynie, wyrażanymi preferencyjnie lub wyrażanymi nadmiernie na docelowej populacji komórek patogennych, przy czym te ligandy są skoniugowane z immunogenami, przeciw którym już istnieje uprzednio lub może zostać wzbudzona wrodzona lub nabyta odporność oraz ewentualnego jednoczesnego podania przynajmniej jednego czynnika leczniczego aktywującego endogenną odpowiedź immunologiczną lub związku cytotoksycznego. W niektórych przypadkach sposób wymaga podania zwierzęcemu gospodarzowi kompozycji koniugatu ligand-immunogen, w której ligand jest kwasem foliowym lub innym ligandem wiążącym się z receptorem folianu. Ligand jest skoniugowany na przykład przez wiązanie kowalencyjnie z immunogenem zdolnym wywołać odpowiedź przeciwciał w zwierzęcym gospodarzu lub, korzystniej, immunogenem zdolnym do wiązania istniejących wcześniej (wskutek wrodzonej lub

PL 211 872 B1 nabytej odporności) endogennych przeciwciał lub podanych jednocześnie przeciwciał (np. przez bierną immunizację) w gospodarzu zwierzęcym. W połączeniu z podaniem koniugatów ligand-immunogen można podać przynajmniej jeden dodatkowy czynnik leczniczy, niezdolny do specyficznego wiązania z kompleksem ligand-immunogen, ale zdolny do pobudzenia lub wzmożenia endogennej odpowiedzi imunologicznej, czynnik zabijający komórki, wzmacniacz penetracji nowotworu, jak czynnik zapalny lub prozapalny, czynnik chemoterapeutyczny, cytotoksyczna komórka układu immunologicznego lub czynnik antybakteryjny.

W wynalazku opisano także sposób wzmocnienia, w gospodarzu zwierzęcym posiadającym populację komórek patogennych, specyficznego usuwania tej populacji za pośrednictwem odpowiedzi immunologicznej, takiego, że członkowie tej populacji komórek mają dostępne miejsce wiązania ligandu. Sposób obejmuje etap podania takiemu gospodarzowi kompozycji koniugatu ligand-immunogen zawierającej kompleks ligandu i immunogen, o którym wiadomo, że jest rozpoznawany przez endogenne lub egzogenne przeciwciało gospodarza lub o którym wiadomo, że jest rozpoznawany bezpośrednio przez komórkę układu immunologicznego gospodarza oraz przynajmniej jednej dodatkowej kompozycji zawierającej czynnik leczniczy, który to czynnik leczniczy jest wybrany z grupy składającej się z czynnika zabijającego komórki, wzmacniacza penetracji guza, czynnika chemioterapeutycznego, czynnika antybakteryjnego, cytotoksycznej komórki układu immunologicznego i związku zdolnego do stymulacji endogennej odpowiedzi immunologicznej, który to związek nie wiąże się do koniugatu ligand-immunogen.

Alternatywnie, dostarcza się także sposobu wzmacniania w gospodarzu zwierzęcym posiadającym populację komórek patogennych, specyficznego usuwania tej populacji za pośrednictwem odpowiedzi immunologicznej, gdy taka populacja wyraża miejsce wiążące ligand. Sposób obejmuje etap podania takiemu gospodarzowi kompozycji koniugatu ligand-immunogen zawierającej kompleks ligandu i immunogen, podanie gospodarzowi przeciwciał przeciw immunogenowi oraz podanie takiemu gospodarzowi przynajmniej jednego dodatkowego czynnika leczniczego, który to czynnik jest wybrany z grupy składającej się z czynnika zabijającego komórki, wzmacniacza penetracji guza, czynnika chemioterapeutycznego, czynnika antybakteryjnego, cytotoksycznej komórki układu immunologicznego i związku zdolnego do stymulacji endogennej odpowiedzi immunologicznej, który to związek nie wiąże się do koniugatu ligand-immunogen.

Wynalazek pozwala także na wzmocnienie, w gospodarzu zwierzęcym posiadającym populację komórek patogennych, specyficznego usuwania tej populacji za pośrednictwem endogennej odpowiedzi immunologicznej, gdy komórki takiej populacji komórek wyrażają, jedynie one wyrażają lub wyrażają nadmiernie receptor kwasu foliowego. Sposób wzmacniania obejmuje etap podania takiemu gospodarzowi kompozycji zawierającej kowalencyjnie połączony koniugat immunogenu, o którym to immunogenie wiadomo, że jest rozpoznawany przez endogenne lub egzogenne przeciwciało gospodarza, lub że jest rozpoznawany bezpośrednio przez komórkę układu immunologicznego gospodarza i ligandu, kiedy to wiązanie kowalencyjne z immunogenem zachodzi tylko przez grupę Υ-karboksylową grupy glutamylowej. W innym wykonaniu wynalazku gospodarzowi podaje się przynajmniej jedną dodatkową kompozycję zawierającą dodatkowy czynnik leczniczy, który to czynnik jest wybrany z grupy składającej się z czynnika zabijającego komórki, wzmacniacza penetracji guza, czynnika chemioterapeutycznego, czynnika antybakteryjnego, cytotoksycznej komórki układu immunologicznego i związku zdolnego do stymulacji endogennej odpowiedzi immunologicznej, który to związek nie wiąże się do koniugatu ligand-immunogen.

Wynalazek pozwala także na zwiększenie w gospodarzu zwierzęcym posiadającym populację komórek patogennych, specyficznego usuwania tej populacji za pośrednictwem endogennej odpowiedzi immunologicznej, gdy komórki takiej populacji komórek wyrażają, jedynie one wyrażają lub wyrażają nadmiernie receptor kwasu foliowego. Sposób obejmuje etap podania takiemu gospodarzowi kompozycji zawierającej kowalencyjnie połączony koniugat immunogenu, o którym to immunogenie wiadomo, że jest rozpoznawany przez endogenne lub egzogenne przeciwciało gospodarza, lub że jest rozpoznawany bezpośrednio przez komórkę układu immunologicznego gospodarza i ligandu, kiedy to wiązanie kowalencyjne z immunogenem zachodzi tylko przez grupę α-karboksylową grupy glutamylowej. W innym wykonaniu wynalazku gospodarzowi podaje się przynajmniej jeden dodatkowy czynnik leczniczy, który to czynnik jest wybrany z grupy składającej się z czynnika zabijającego komórki, wzmacniacza penetracji guza, czynnika chemioterapeutycznego, czynnika antybakteryjnego, cytotoksycznej komórki układu immunologicznego i związku zdolnego do stymulacji endogennej odpowiedzi immunologicznej, który to związek nie wiąże się do koniugatu ligand-immunogen.

PL 211 872 B1

W jeszcze innym wykonaniu wynalazku docelowa populacja komórek patogennych jest populacją komórek nowotworowych. W innym wykonaniu wynalazku docelową populacją komórek patogennych są endogenne komórki zakażone wirusem. W innym wykonaniu wynalazku docelową populacją komórek jest populacja egzogennych organizmów takich jak bakterie, mykoplazmy, drożdże lub grzyby. Koniugat ligand-immunogen wiąże się z powierzchnią komórek nowotworowych lub organizmów patogennych i „wyznakowuje komórki należące do docelowej grupy komórek immunogenem, wyzwalając w ten sposób odpowiedź za pośrednictwem układu immunologicznego, skierowaną przeciw oznakowanej populacji komórek. Przeciwciała, podane gospodarzowi przy biernej immunizacji lub przeciwciała istniejące w organizmie gospodarza na skutek istniejącej wcześniej odporności wrodzonej lub nabytej, wiążą się z immunogenem i wyzwalają endogenną odpowiedź immunologiczną. Wiązanie się przeciwciała z koniugatem ligand-immunogen związanym z komórką powoduje cytotoksyczność za pośrednictwem dopełniacza, cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał, opsonizację i fagocytozę, indukowane przeciwciałami grupowanie się receptorów sygnalizujących śmierć komórkową lub spoczynek lub dowolną inną humoralną albo komórkową odpowiedź immunologiczną pobudzaną wiązaniem przeciwciał do związanych z komórką koniugatów ligand-immunogen. W przypadkach, gdy antygen może być rozpoznany bezpośrednio przez komórki układu immunologicznego bez uprzedniej opsonizacji, może dojść do bezpośredniego zabijania komórek patogennych.

Usuwanie pochodzących z zewnątrz patogenów lub komórek zakażonych albo endogennych komórek nowotworowych można dodatkowo wzmóc podając czynnik pobudzający endogenną odpowiedź immunologiczną, czynnik zabijający komórki, wzmacniacz penetracji guza, czynnik chemoterapeutyczny, cytotoksyczną komórkę układu immunologicznego albo czynnik antybakteryjny. W pewnym wykonaniu wynalazku cytotoksyczna komórka układu immunologicznego jest populacją cytotoksycznych komórek układu immunologicznego, którą się izoluje, namnaża ex vivo i wstrzykuje gospodarzowi zwierzęcemu. W innym wykonaniu wynalazku stosuje się środek pobudzający układ immunologiczny, a środkiem pobudzającym układ immunologiczny może być interleukina taka jak IL-2, IL-12 lub IL-15 albo IFN taki jak IFN -α, IFN-β lub IFN-γ albo GM-CSF. innym wykonaniu wynalazku środkiem pobudzającym układ immunologiczny może być kompozycja cytokinowa zawierająca połączenie cytokin, takich jak IL-2, IL-12 lub IL-15 w połączeniu z IFN-α, IFN-β lub IFN-γ lub GM-CSF, albo z ich dowolnym skutecznym połączeniem lub dowolne inne skuteczne połączenie cytokin.

Kompozycja farmaceutyczna opisana w wynalazku zawiera leczniczo skuteczną ilość koniugatu ligand-immunogen, zdolnego do specyficznego wiązania się z populacją patogennych komórek w gospodarzu zwierzęcym, dla wzmożenia specyficznego usuwania tych komórek przez nabytą lub wrodzoną odpowiedź immunologiczną, przez podane jednocześnie przeciwciała lub bezpośrednio przez komórki immunologiczne w gospodarzu, czynnik leczniczy wybrany z grupy składającej się z czynnika zabijającego komórki, wzmacniacza penetracji guza, czynnika chemoterapeutycznego, czynnika antybakteryjnego, cytotoksycznej komórki układu immunologicznego i związku zdolnego do stymulacji endogennej odpowiedzi immunologicznej, który to związek nie wiąże się do koniugatu ligand-immunogen oraz ich farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

W pewnym wykonaniu kompozycja farmaceutyczna jest w postaci do podawania pozajelitowego o przedłużonym uwalnianiu. W innym wykonaniu wynalazku czynnikiem leczniczym jest środek pobudzający układ immunologiczny zawierający związek wybrany z grupy składającej się z interleukin takich jak IL-2, IL-12, IL15, interferonów, takich jak IFN-α, IFN-β lub IFN-γ oraz GM-CSF lub ich połączeń.

Szczegółowy opis wynalazku

Przy pomocy kompozycji według wynalazku można wdrożyć sposoby leczenia organizmu gospodarza z nowotworem lub organizmu gospodarza zakażonego organizmami patogennymi. Sposoby powodują wzmocnienie, zachodzącego dzięki odpowiedzi immunologicznej, usuwania populacji komórek patogennych przez antygenowe wyznakowywanie komórek patogennych powodujące ich rozpoznawanie i usuwanie przez układ immunologiczny gospodarza. Sposób ten wykorzystuje koniugat ligand-immunogen zdolny do wiązania się, z dużym powinowactwem, do komórek nowotworowych lub innych czynników patogennych. Wiązanie z wysokim powinowactwem może być naturalna właściwością ligandu lub może być zmienione (wzmocnione) przez zastosowanie chemicznie modyfikowanego ligandu lub przez szczególne wiązanie chemiczne między ligandem i immunogenem znajdującym się w koniugacie. Sposób wzmacniania, zachodzącego dzięki odpowiedzi immunologicznej, usuwania populacji komórek patogennych, może również wykorzystywać terapię łączoną przez użycie koniugatu ligand-immunogen i dodatkowego czynnika leczniczego zdolnego do pobudzenia endogennej odpo6

PL 211 872 B1 wiedzi immunologicznej, czynnika zabijającego komórki, czynnika chemoterapeutycznego, wzmacniacza penetracji guza, cytotoksycznej komórki układu immunologicznego, czynnika przeciwbakteryjnego lub przeciwwirusowego.

Sposób ten stosuje się po to, aby wzmóc usuwanie za pośrednictwem endogennej odpowiedzi immunologicznej populacji komórek patogennych w gospodarzu zwierzęcym posiadającym taką populację komórek patogennych. Wynalazek ma zastosowanie wobec populacji komórek patogennych powodujących wiele różnych patologii, takich jak nowotwór i choroby zakaźne. Zatem populacją komórek patogennych może być populacja komórek nowotworowych tworzących nowotwór, włączając nowotwory łagodne i złośliwe, lub mogą one nie tworzyć nowotworu. Populacja komórek nowotworowych może powstać spontanicznie lub przez procesy takie, jak mutacje obecne w linii komórek płciowych gospodarza zwierzęcego lub mutacje somatyczne albo może być zaindukowana chemicznie, wirusowo lub promieniowaniem.

Wynalazek można stosować w leczeniu nowotworów takich jak raki, mięsaki, chłoniaki, ziarnica złośliwa, czerniaki, międzybłoniaki, chłoniaki Burkitta, nowotwory nosogardzieli, białaczki i szpiczaki. Populacja komórek nowotworowych może obejmować nowotwory jamy ustnej, tarczycy, gruczołów dokrewnych, skóry, żołądka, przełyku, krtani, trzustki, okrężnicy, pęcherza moczowego, kości, jajnika, trzonu szyjki macicy, macicy, piersi, jąder, prostaty, odbytu, nerki, wątroby i płuc, nie ograniczając się do nich.

Populacja komórek patogennych może być również egzogennym patogenem lub populacją komórek zawierających egzogenny patogen, np. wirusa. Niniejszy wynalazek ma zastosowanie wobec takich egzogennych patogenów jak bakterie, grzyby, wirusy, mykoplazmy i pasożyty. Czynnikiem zakaźnym, który można leczyć według niniejszego wynalazku jest dowolny znany w dziedzinie organizm zakaźny patogenny dla zwierzęcia, włączając takie organizmy jak: bakterie będące gram-ujemnymi lub gram-dodatnimi ziarniakami lub pałeczkami, wirusy DNA i RNA, włączając wirusy DNA takie jak brodawczaki, parwowirusy, adenowirusy, wirusy opryszczki i wirusy krowianki oraz wirusy RNA, takie jak arenawirusy, koronawirusy, rinowirusy, syncytjalne wirusy okładu oddechowego, wirusy grypy, pikornawirusy, paramiksowirusy, reowirusy, retrowirusy rabdowirusy, ale się do nich nie ograniczając. Szczególnie warte uwagi są bakterie oporne na antybiotyki, jak antybiotykooporne szczepy Streptococcus i szczepy Staphylococcus lub bakterie wrażliwe na antybiotyki, ale powodujące nawracające zakażenia leczone antybiotykami tak, że prowadzi to w końcu do powstania organizmów opornych. Wobec takich organizmów można stosować koniugaty ligand-immunogen według niniejszego wynalazku w połączeniu z mniejszymi dawkami antybiotyków, niż podano by normalnie pacjentowi, aby uniknąć pojawienia się tych antybiotykoopornych szczepów bakterii. Niniejszy wynalazek ma również zastosowanie wobec dowolnych gatunków grzybów, mykoplazm, pasożytów lub innych zakaźnych organizmów mogących wywoływać choroby zwierząt. Przykłady grzybów, wobec których można stosować sposób według niniejszego wynalazku obejmują grzyby rosnące w postaci pleśni lub drożdżopodobne włączając na przykład grzyby powodujące takie choroby jak: grzybica dermatofityczna, histoplazmoza, drożdżyca powodowana przez Blastomyces, grzybica kropidlakowa, drożdżyca europejska, sporotrychoza, kokcydioidiomikoza, parakokcydio-idiomikoza oraz kandydoza. Niniejszy wynalazek można użyć do leczenia zakażeń pasożytami włączając zakażenia spowodowane przez tasiemce, przywry żyjące w naczyniach krwionośnych, obleńce tkankowe, amebę oraz rodzaje Plasmodium, Trypanosoma, Leishmania i Toxoplasma, nie ograniczając się do nich. Szczególnie warte uwagi są pasożyty wyrażające receptor folianu i wiążące folian; jednakże piśmiennictwo jest bogate w odniesienia dotyczące ligandów wykazujących wysokie powinowactwo do organizmów zakaźnych. Przykładowo, penicyliny cefalosporyny, znane ze swojej aktywności antybiotykowej i specyficznego wiązania do prekursorów bakteryjnej ściany komórkowej mogą również być użyte jako ligandy do przygotowania koniugatów ligand-immunogen do zastosowania według niniejszego wynalazku. Koniugaty ligandimmunogen według niniejszego wynalazku mogą być również ukierunkowane na populacje komórek zawierającą endogenne patogeny, gdy specyficzne dla patogenu antygeny są preferencyjnie wyrażane na powierzchni komórek zawierających patogeny i oddziałują z ligandem specyficznie wiążącym się do antygenu jako receptory dla ligandu.

Kompozycję według wynalazku można stosować zarówno w medycynie klinicznej człowieka, jak i w zastosowaniach weterynaryjnych. Zatem, gospodarzem zwierzęcym zawierającym populację patogennych organizmów i leczonym koniugatami ligand-immunogen może być człowiek lub w przypadku zastosowań weterynaryjnych zwierzęta laboratoryjne, hodowlane, domowe lub dzikie. Niniejszy wynalazek można stosować dla gospodarzy zwierzęcych obejmujących ludzi, zwierzęta laboratoryjne takie

PL 211 872 B1 jak gryzonie (np. myszy, szczury, chomiki itp.), króliki, małpy, szympansy, zwierzęta domowe takie jak psy, koty i króliki, zwierzęta hodowlane takie jak krowy, konie, świnie, owce, kozy i dzikie zwierzęta w niewoli takie jak niedźwiedzie, pandy, lwy, tygrysy, lamparty, słonie, zebry, żyrafy, goryle, delfiny oraz wieloryby, ale nie ograniczających się do nich.

Koniugat ligand-immunogen korzystnie podaje się gospodarzowi zwierzęcemu pozajelitowo, np. śródskórnie, podskórnie, domięśniowo, śródotrzewnowo lub dożylnie. Alternatywnie koniugat można podać gospodarzowi zwierzęcemu innymi wykorzystywanymi w medycynie sposobami i można zastosować dowolne skuteczne dawki i postaci odpowiednie do dawkowania leczniczego, włączając postaci do spowolnionego uwalniania. Sposób według niniejszego wynalazku można użyć w połączeniu z usunię ciem chirurgicznym guza, radioterapią , chemoterapią lub terapiami biologicznymi, jak inne immunoterapie obejmujące terapie przeciwciałami monoklonalnymi, leczenie środkami immunomodulującymi, podanie komórek efektorowych układu immunologicznego, leczenie krwiotwórczymi czynnikami wzrostu, cytokinami i szczepienia, ale się do nich nie ograniczające.

Według niniejszego wynalazku koniugaty ligand-immunogen można wybierać spośród szerokiego zakresu ligandów i immunogenów. Ligandy muszą być zdolne do specyficznego usuwania populacji komórek patogennych w gospodarzu zwierzęcym w wyniku preferencyjnego wyrażania receptora dla ligandu, dostępnego dla wiązania ligandu na komórkach patogennych. Dopuszczalne ligandy obejmują kwas foliowy, analogi kwasu foliowego i inne cząsteczki wiążące się z receptorem folianu, inne witaminy, ligandy peptydowe identyfikowane przez przesiewanie bibliotek, specyficzne wobec nowotworu peptydy, specyficzne wobec nowotworu aptamery, specyficzne wobec nowotworu węglowodany, specyficzne wobec nowotworu przeciwciała monoklonalne lub poliklonalne, fragmenty przeciwciał Fab lub scFv (np. jednołańcuchowego regionu zmiennego) takie jak np. fragment Fab przeciwciała skierowanego przeciw EphA2 lub innym białkom specyficznie wyrażanym lub dostępnym jedynie na przerzutowych komórkach nowotworowych, małe cząsteczki organiczne otrzymane z bibliotek kombinatoryjnych, czynniki wzrostu, takie jak EGF, FGF, insulinę i insulinopodobne czynniki wzrostu oraz homologiczne polipeptydy, somatostatynę i jej analogi, transferynę, kompleksy lipoproteinowe, sole żółciowe, selektyny, hormony sterydowe, peptydy zwierające Arg-Gly-Asp, retinoidy, rozmaite Galektyny, ligandy receptora opioidowego, ligandy receptora cholecystokininy A, ligandy specyficzne dla receptorów angiotensyny AT1 lub AT2, ligandy receptora γ peroksysomu aktywowane proliferatorem, antybiotyki β-laktamowe, małe cząsteczki organiczne włączając leki przeciwbakteryjne oraz inne cząsteczki wiążące się specyficznie z receptorem wyrażanym preferencyjnie na powierzchni komórek nowotworowych lub na organizmie zakaźnym lub fragmenty dowolnych z tych cząsteczek. W przypadku ligandów wiążących się do organizmów zakaźnych, interesujące są dowolne cząsteczki, takie jak antybiotyki lub inne leki, które są znane w dziedzinie jako preferencyjnie wiążące się z mikroorganizmem. Wynalazek odnosi się również do ligandów które są cząsteczkami, takimi jak leki przeciwbakteryjne, zaprojektowanymi na podstawie struktury krystalicznej receptora tak, by pasowały do kieszonki wiążącej szczególnego receptora, lub innego białka powierzchni komórki i kiedy takie receptory są preferencyjnie wyrażane na powierzchni nowotworów, bakterii, wirusów, mykoplazm, grzybów, pasożytów lub innych patogenów. W korzystnym wykonaniu wynalazku rozważa się również użycie ligandów wiążących się do dowolnych antygenów powierzchni nowotworu lub innych cząsteczek preferencyjnie wyrażanych na powierzchni komórek nowotworu.

Miejsce wiązania ligandu może obejmować receptory dla dowolnej cząsteczki zdolnej do specyficznego wiązania z receptorem, który to receptor lub inne białko jest preferencyjnie wyrażane w populacji komórek patogennych, włączając, na przykład, receptory dla czynników wzrostu, witaminy, peptydy, w tym peptydy opioidowe, hormony, przeciwciała, węglowodany oraz małe cząsteczki organiczne. Miejsce wiązania może również być miejscem wiązania dowolnej cząsteczki, takiej jak antybiotyk lub inny lek, o ile to miejsce jest znane ze swego preferencyjnego występowania na mikroorganizmach. Na przykład, miejsca wiązania mogą być miejscami wiązania w bakteryjnej ścianie komórkowej dla antybiotyku β-laktamowego, takiego jak penicylina lub miejscami wiązania czynnika antywirusowego występującego jedynie na powierzchni wirusa. Wynalazek znajduje zastosowanie także do miejsc wiązania ligandów takich jak leki antybakteryjne, zaprojektowanych na podstawie struktury krystalicznej tak, aby pasowały do miejsca wiązania receptora, gdy receptor jest preferencyjnie wyrażany na powierzchni patogennych komórek lub organizmów. Uważa się, że specyficzne antygeny nowotworowe mogą działać jako miejsce wiązania ligandów w sposobie według niniejszego wynalazku. Przykładem antygenu specyficznego dla nowotworu, który może działać jako miejsce wiązania koniugatów ligand-immunogen jest zewnątrzkomórkowy epitop przedstawicieli białek z rodziny efryn, takich jak

PL 211 872 B1

EphA2. Ekspresja EphA2 jest ograniczona do połączeń międzykomórkowych w komórkach prawidłowych, ale w komórkach przerzutowych nowotworu EphA2 jest rozmieszczone na całej powierzchni komórek. Dlatego też EphA2 na komórkach przerzutowych może być dostępne do wiązania na przykład dla fragmentu Fab przeciwciała skoniugowanego z immunogenem, podczas gdy białko to nie będzie dostępne dla wiązania fragmentu Fab na komórkach prawidłowych, co powoduje, że w koniugat ligand-immunogen jest specyficzny dla przerzutowych komórek nowotworowych. W zakresie wynalazku rozważa się również użycie kombinacji koniugatów ligand-immunogen w celu maksymalizacji ukierunkowania komórek patogennych do usunięcia drogą nabytej lub wrodzonej odpowiedzi immunologicznej lub przez dostarczone jednocześnie przeciwciała.

Dopuszczalne immunogeny do użycia według niniejszego wynalazku to immunogeny zdolne do wzbudzania wytwarzania przeciwciał w organizmie gospodarza zwierzęcego lub takie, które wcześniej wywołały wytwarzanie przeciwciał w organizmie gospodarza zwierzęcego, co doprowadziło do powstania odporności lub takich, które stanowią część odporności wrodzonej.

Alternatywnie, przeciwciała skierowane przeciwko immunogenowi można podawać gospodarzowi zwierzęcemu w celu wytworzenia odporności biernej. Odpowiednie immunogeny do wykorzystania według niniejszego wynalazku obejmują antygeny lub peptydy antygenowe, przeciwko którym uprzednio istniejąca odporność rozwinęła się drogą prawidłowo przeprowadzanych szczepień lub przez wcześniejszy kontakt z nimi, takimi jak wirus polio, tężec, tyfus, różyczka, odra, świnka, krztusiec, gruźlica oraz antygeny grypy oraz grupy α-galaktozylowe. W takich przypadkach, koniugaty ligand-immunogen używane są do przekierowania uprzednio nabytej odporności komórkowej lub humoralnej na populację komórek patogennych w organizmie gospodarza zwierzęcego w celu wyeliminowania obcych komórek lub organizmów patogennych. Inne odpowiednie immunogeny obejmują antygeny lub peptydy antygenowe, przeciwko którym gospodarz zwierzęcy, przez immunizację przeciwko nienaturalnemu antygenowi lub haptenowi (np. izotiocyjanianowi fluoresceiny lub dinitrofenylowi) wykształcił nową odporność oraz antygeny, przeciwko którym istnieje wrodzona odporność (np. superantygeny i dipeptydowi muramylu).

Ligandy i immunogeny według wynalazku można koniugować przy użyciu dowolnej, znanej w dziedzinie metody tworzenia kompleksów. Obejmują one kowalencyjne, jonowe lub wodorowe wiązanie ligandu do immunogenu, zarówno bezpośrednie, jak i pośrednie przy użyciu grupy łączącej, takiej jak dwuwartościowy łącznik. Koniugat jest zwykle utworzony przez kowalencyjne wiązanie ligandu do immunogenu przez wytworzenie amidu, estru lub wiązania iminowego pomiędzy kwasem a grupami aldehydową, hydroksylową, aminową lub hydrazoniową na odpowiednich składnikach kompleksu. W korzystnym wykonaniu wynalazku ligand jest kwasem foliowym, analogiem kwasu foliowego lub każdą inną cząsteczką wiążącą receptor folianu, a ligand folianu jest skoniugowany z immunogenem przy użyciu metody wykorzystującej bezwodny trifluorooctan do wytworzenia γ-estrów kwasu foliowego przez pośredni związek azydek pteroilu. W wyniku tej korzystnej metody syntetyzowany jest ligand folianu skoniugowany z immunogenem tylko przez grupę γ-karboksylową kwasu glutaminowego folianu, gdzie γ-koniugat wiąże receptor folianu z dużym powinowactwem, unikając tworzenia mieszanin α-koniugatu z γ-koniugatami. Alternatywnie, czyste α-koniugaty można przygotować ze związków pośrednich, gdzie grupa γ -karboksylowa jest selektywnie zablokowana, tworzy się α-koniugat, a grupa γ-karboksylowa jest następnie odblokowywana przy użyciu znanych w dziedzinie syntezy organicznej protokołów i procedur. Zauważa się, że jako ligandów do przygotowania koniugatów według wynalazku można użyć innych witamin. Na przykład, koniugaty ligand-immunogen można utworzyć tak z folianem, jak i z biotyną i ryboflawiną. (Patrz patenty USA Nr 5108921, 5416016 i 5635382, włączone tu jako odniesienia.)

Koniugaty ligand-immunogen według wynalazku wzmagają usuwanie populacji komórek patogennych za pośrednictwem endogennej odpowiedzi immunologicznej. Endogenna odpowiedź immunologiczna obejmuje odpowiedź humoralną, odpowiedź komórkową oraz każdą inną odpowiedź immunologiczną endogenną dla gospodarza zwierzęcego, włączając lizę komórkową za pośrednictwem dopełniacza, cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał (ADCC), opsonizację przeciwciałami prowadzącą do fagocytozy, grupowanie receptorów po związaniu przeciwciała prowadzące do apoptozy, antyproliferację lub różnicowanie oraz bezpośrednie rozpoznanie dostarczonego antygenu/haptenu przez komórki układu odpornościowego.

Uważa się, że endogenna odpowiedź immunologiczna doprowadzi do wydzielania cytokin regulujących takie procesy, jak namnażanie i migracja komórek układu odpornościowego. Endogenna

PL 211 872 B1 odpowiedź immunologiczna może obejmować udział takich typów komórek, jak limfocyty B, limfocyty T, w tym limfocyty T pomocnicze i cytotoksyczne, makrofagi, komórki naturalni zabójcy, neutrofile, komórki LAK i tym podobne.

Odpowiedź humoralna może być odpowiedzią indukowaną takimi procesami, jak prawidłowo przeprowadzane szczepienia lub aktywna immunizacja naturalnym antygenem lub nienaturalnym antygenem albo haptenem (np. izotiocyjanianem fluoresceiny), z nienaturalnym antygenem indukującym nową odporność. Aktywna immunizacja obejmuje wielokrotne iniekcje nienaturalnego antygenu lub haptenu zaplanowane poza normalnym trybem szczepień w celu indukcji nowej odporności. Odpowiedź humoralna może być również wynikiem odporności wrodzonej, gdzie gospodarz zwierzęcy posiada naturalną, istniejącą wcześniej odporność, taką jak odporność na grupy α-galaktozylowe. Alternatywnie, odporność bierną można wytworzyć dostarczając przeciwciał do organizmu gospodarza zwierzęcego, takich jak naturalne przeciwciała wyizolowane z surowicy lub przeciwciała monoklonalne, które mogą lub nie być przeciwciałami modyfikowanymi genetycznie, w tym przeciwciałami humanizowanymi. Użycie szczególnej ilości odczynnika z przeciwciał w celu wytworzenia odporności biernej oraz użycie koniugatu ligand-immunogen, gdzie biernie dostarczone przeciwciała skierowane są przeciwko immunogenowi, zapewniłoby korzyść w stosunku do standardowego zestawu odczynników używanych w przypadkach, w których miano istniejących wcześniej przeciwciał pacjenta przeciwko innym potencjalnym antygenom nie jest terapeutycznie użyteczne. Biernie dostarczone przeciwciała można jednocześnie dostarczać z koniugatem ligand-immunogen, a jednoczesne dostarczanie określane jest jako podawanie przeciwciał w czasie przed, w tym samym czasie lub w czasie po podaniu koniugatu ligand-immunogen.

Uważa się, że istniejące wcześniej przeciwciała, zaindukowane przeciwciała lub biernie dostarczone przeciwciała będą przekierowane na komórki nowotworowe lub organizmy zakaźne przez preferencyjne wiązanie koniugatów ligand-immunogen do tych komórek lub organizmów oraz, że komórki patogenne zostaną zabite przez lizę za pośrednictwem dopełniacza, ADCC, fagocytozy zależnej od przeciwciał lub grupowania receptorów indukowanego przeciwciałami. Proces cytotoksyczny może również obejmować inne typy odpowiedzi immunologicznej, takie jak odporność komórkową, a także drugorzędne odpowiedzi pojawiające się, gdy przywabione komórki prezentujące antygeny fagocytują niepożądane komórki i prezentują naturalne antygeny nowotworowe lub antygeny obcych patogenów w układzie immunologicznym w celu usunięcia komórek lub organizmów niosących dane antygeny.

W celu wzmożenia eliminacji populacji komórek patogennych, w której pośredniczy endogenna odpowiedź immunologiczna, gospodarzowi można podawać przynajmniej jeden dodatkowy związek obejmujący czynnik terapeutyczny lub więcej niż jeden dodatkowy czynnik terapeutyczny, w połączeniu lub jako adiuwant do wyżej opisanej metodologii. Czynnik terapeutyczny można wybrać spośród związku zdolnego do pobudzenia endogennej odpowiedzi immunologicznej, czynnika chemoterapeutyczny, czynnika antybakteryjny lub innego czynnika zdolnego do uzupełnienia skuteczności podawania kompleksu ligand-immunogen. Sposób według wynalazku można przeprowadzić podając gospodarzowi, dodatkowo do opisanych wyżej koniugatów, związki lub kompozycje zdolne do stymulowania endogennej odpowiedzi immunologicznej, obejmujące cytokiny lub czynniki wzrostu komórek immunologicznych, takich jak interleukiny 1-18, czynniki komórek macierzystych, podstawowy FGF, EGF, G-CSF, GM-CSF, ligand FLK-2, HILDA, ΜΙΡ-1α, TGFa, TGFe, M-CSF, IFNa, IFNp, IFNy, rozpuszczalny CD23, LIF oraz ich połączenia, ale nie ograniczające się do nich.

Można również użyć terapeutycznie skutecznych połączeń tych cytokin. Na przykład, w korzystnym wykonaniu wynalazku, terapeutycznie skuteczne ilości IL-2, na przykład ilości w zakresie od około 5000 IU/dawka/dzień do około 500000 IU/dawka/dzień w trybie podawania wielokrotnych dawek dziennych, oraz IFN-α, na przykład w ilościach w zakresie od około 7500 IU/dawka/dzień do około 150000 IU/dawka/dzień w trybie podawania wielokrotnych dawek dziennych, używa się wraz z folianem połączonym z izotiocyjanianem fluoresceiny w celu eliminacji komórek patogennych w organizmie gospodarza zwierzęcego, w którego organizmie znajdują się takie populacje komórek. W innym korzystnym wykonaniu używa się terapeutycznie skutecznych ilości IL-12 i IFN-α, a w kolejnym korzystnym wykonaniu używa się terapeutycznie skutecznych ilości IL-15 i IFN-α. W innym korzystnym wykonaniu IL-2, IFN-α lub IFN-γ i GM-CSF używa się w połączeniu. Korzystnie, użyty(e) czynnik(i) terapeutyczny(e), takie jak IL-2, IL-12, IL-15, IFN-α, IFN-γ i GM-CSF oraz ich połączenia aktywuje(ą) komórki naturalnych zabójców i/lub limfocyty T. Alternatywnie, czynnik terapeutyczny lub ich kombinacje, włączając interleukinę w kombinacji z interferonem i GM-CSF, mogą aktywować inne komórki efektorowe układu immunologicznego, takie jak makrofagi, limfocyty B, neutrofile, komórki LAK i tym

PL 211 872 B1 podobne. Wynalazek również zawiera użycie każdego innego skutecznego połączenia cytokin, włączając połączenia innych interleukin i interferonów oraz czynników stymulujących wzrost kolonii.

Odpowiednie do użycia czynniki chemoterapeutyczne, które same z siebie są cytotoksyczne i mogą wzmóc przepuszczalność guza, obejmują adrenokortykoidy, czynniki alkilujące, antyadrogeny, antyestrogeny, androgeny, estrogeny, antymetabolity takie, jak arabinozyd cytozyny, analogi puryn, analogi pirymidy, metotreksat, busulfan, karboplatynę, chlorambucyl, cisplatynę i inne związki platyny, tamoksifen, taksol, cyklofosfamid, alkaloidy roślinne, prednizon, hydroksymocznik, tenipozyd, antybiotyki takie, jak mitomycyna C i bleomycyna, iperyt azotowy, nitromoczniki, winkrystynę, winblastynę, czynniki zapalne i prozapalne oraz inne czynniki chemoterapeutyczne znane w dziedzinie. Inne czynniki terapeutyczne, które można podawać jako środki wspomagające do podawania niniejszych koniugatów obejmują penicyliny, cefalosporyny, wankomycynę, erytromycynę, klindamycynę, ryfampinę, chloramfenikol, aminoglikozydy, gentamycynę, amfoterynę B, acyklowir, triflurydynę, gancyklowir, zidowudynę, amantadynę, rybawirynę oraz inne związki przeciw drobnoustrojom znane w dziedzinie.

Eliminacja populacji komórek patogennych obejmuje zmniejszenie bądź eliminację masy guza lub organizmów patogennych w wyniku odpowiedzi terapeutycznej. W przypadku nowotworu, eliminacją może być eliminacja komórek pierwotnego nowotworu lub komórek przerzutowych lub będących w trakcie oddzielania się od nowotworu pierwotnego. Leczenie profilaktyczne zapobiegają ce nawrotowi nowotworu po jego usunięciu dowolnym sposobem terapeutycznym, obejmującym chirurgiczne usunięcie guza, radioterapię, chemoterapię lub leczenie biologiczne uważa się za zgodne z niniejszym wynalazkiem. Leczenie profilaktyczne może być początkowym leczeniem koniugatem ligand-immunogen, takim jak leczenie w trybie wielokrotnych dawek dziennych i/lub może być dodatkowym leczeniem lub serią zabiegów terapeutycznych po okresie dni lub miesięcy przerwy po leczeniu(ach) początkowym(ch).

Wynalazek obejmuje swoim zakresem kompozycje farmaceutyczne zawierające ilość koniugatu ligand-immunogen skuteczną do „wyznakowania populacji komórek patogennych w organizmie zwierzęcego gospodarza w celu ich specyficznej eliminacji przez endogenną odpowiedź immunologiczną lub przez jednoczesne podane przeciwciała. Kompozycja dalej obejmuje ilość dodatkowego czynnika, skutecznego do wzmożenia eliminacji komórek patogennych, wybranego z grupy składającej się z czynnika zabijają cego komórki, wzmacniacza penetracji nowotworu, czynnika chemoterapeutycznego, czynnika antybakteryjnego, cytotoksycznej komórki układu immunologicznego oraz składnika zdolnego do stymulacji endogennej odpowiedzi immunologicznej, ale nie wiążącego się z koniugatem ligand-immunogen. Kompozycja farmaceutyczna zawiera skuteczne terapeutycznie ilości koniugatu ligand-immunogen i czynnika terapeutycznego i czynnik może zawierać cytokinę, taką jak IL-2, IL-12 lub IL-15, lub połączenia cytokin, w tym IL-2, IL-12 lub IL-15 oraz interferony, takie jak IFN-α lub IFN-γ i kombinacje interferonów, interleukin i czynników stymulujących tworzenie kolonii, takich jak GM-CSF.

Dzienne jednostkowe dawkowanie koniugatu ligand-immunogen może różnić się znacząco zależnie od stanu gospodarza, stanu leczonej choroby, masie cząsteczkowej koniugatu, drogi jego podawania i dystrybucji tkankowej oraz możliwości jednoczesnego użycia innych sposobów leczenia, takich jak radioterapia. Skuteczna ilość do podawania pacjentowi opiera się na jego powierzchni ciała, masie oraz badaniu lekarskim stanu pacjenta. Wielkość skutecznej dawki może wahać się w zakresie od około 1 μg/kg do około 1 mg/kg, korzystniej od około 1 μg/kg do około 500 μg/kg, a najbardziej korzystnie od około 1 μg/kg do około 100 μg/kg.

Do przekierowania obecnych wcześniej przeciwciał do komórek nowotworowych lub organizmów infekcyjnych lub w celu indukcji odpowiedzi humoralnej na immunogen można użyć każdego efektywnego trybu podawania koniugatu ligand-immunogen oraz czynnika terapeutycznego. Na przykład, koniugat ligand-immunogen oraz czynnik terapeutyczny można podawać w pojedynczych dawkach, lub można je podzielić i podawać w trybie dziennym wielodawkowym. Dalej, jako alternatywę do leczenia codziennego można zastosować przemienny tryb podawania, na przykład jeden do trzech razy tygodniowo, a do celów określenia niniejszego wynalazku taki przerywany lub przemienny dzienny tryb podawania uważa się za odpowiadający leczeniu codziennemu i pozostaje w zakresie wynalazku. W korzystnym wykonaniu wynalazku gospodarzowi podaje się wielokrotne iniekcje koniugatu ligand-immunogen i czynnika terapeutycznego w celu wyeliminowania populacji komórek patogennych. W pewnym wykonaniu gospodarzowi podaje się wielokrotne iniekcje (korzystnie od 2 do 50 razy) koniugatu ligand-immunogen, na przykład w 12-72 godzinnych odstępach lub w 48-72 godzinnych odstępach. Dodatkowe iniekcje koniugatu ligand-immunogen można podawać pacjentowi

PL 211 872 B1 w odstępach dni lub miesięcy po początkowej(ych) iniekcjach i te dodatkowe iniekcje mogą zapobiec nawrotowi choroby.

Czynnik terapeutyczny można podać gospodarzowi zwierzęcemu przed, po lub jednocześnie z podaniem koniugatu ligand-immunogen, a czynnik terapeutyczny można podać jako część tej samej kompozycji zawierającej koniugat lub jako część odmiennej kompozycji niż koniugat ligandimmunogen. W niniejszym wynalazku można użyć każdej takiej kompozycji terapeutycznej zawierającej czynnik terapeutyczny w dawce skutecznej terapeutycznie. Dodatkowo, można zastosować więcej niż jeden koniugat ligand-immunogen. Na przykład, można preimmunizować gospodarza zwierzęcego zarówno izotiocyjanianem fluoresceiny, jak i dinitrofenolem, a następnie poddać działaniu izotiocyjanianu fluoresceiny i dinitrofenolu przyłączonym do tego samego lub różnych ligandów w protokole wspólnego podawania. W wypadku czynników chemoterapeutycznych i przeciwbakteryjnych i przeciwwirusowych, aby uniknąć rozwoju oporności na czynniki chemoterapeutyczne i przeciwbakteryjne przez gospodarza zwierzęcego, czynnik terapeutyczny można podawać w dawkach suboptymalnych razem z koniugatem ligand-immunogen w terapii kombinacyjnej.

Koniugat ligand-immunogen i czynnik terapeutyczny są korzystnie wstrzykiwane pozajelitowo i takie iniekcje mogą obejmować iniekcje śródotrzewnowe, podskórne, domięśniowe, dożylne lub dooponowe. Koniugat ligand-immunogen i czynnik terapeutyczny można również dostarczać przy użyciu wolnej pompy. Przykłady pozajelitowych form dawkowania obejmują wodne roztwory aktywnego czynnika, w izotonicznej soli fizjologicznej, 5% glukozie lub innych dobrze znanych, farmaceutycznie dopuszczalnych płynnych nośników, takich, jak ciekłe alkohole, glikole, estry i amidy. Dawkowanie pozajelitowe według niniejszego wynalazku może być w formie odtwarzalnego liofilizatu złożonego z koniugatu ligand-immunogen i czynnika terapeutycznego. W pewnym korzystnym aspekcie niniejszego wykonania, można podawać każdą z wielu form o przedłużonym czasie uwalniania, znaną w dziedzinie, taką, jak na przykład biodegradujące węglowodany macierzy, opisane w patentach USA nr: 4713249; 5266333 oraz 5417982, których ujawnienia są tu włączone jako odniesienia.

Przykłady

PRZYKŁAD 1

Wpływ koniugatu folian-izotiocyjanian fluoresceiny na przeżywalność mysz z wszczepieniami nowotworu płuc.

Sześcio- do ośmiotygodniowe (~20-22 gramy) samice myszy Balb/c podskórnie immunizowano w wielu miejscach albuminą surowicy bydlęcej wyznakowaną izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) przy wykorzystaniu dostępnego komercyjnie adiuwantu (np. adiuwantu Freunda lub Titer Max™-Gold). Po upewnieniu się, że miana przeciwciała anty-FITC są wysokie u wszystkich myszy (jak dowiodły wyniki testów ELISA na próbkach surowicy myszy), każdemu zwierzęciu wstrzyknięto dootrzewnowo 5x10⁵ komórek M109, asyngenicznej linii komórkowej nowotworu płuc, wyrażającej wysoki poziom receptora folianu. Ogniskom nowotworu pozwolono na przyczepienie się i wzrost. W 4 i 7 dniu po wszczepieniu nowotworu wszystkim zwierzętom wstrzyknięto dootrzewnowo sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) lub określoną ilość FITC skoniugowanym z kwasem foliowym przez przyłączony do grupy gamma karboksylowej mostek etylodiaminowy. Stężenia wstrzykniętego folianu-FITC wynosiły 0 (kontrola PBS), 4,5, 45, 450 i 4500 nmol/kg, a dla każdego stężenie folianu-FITC przypadało po 8 myszy, co dało w sumie 40 zwierząt. W celu stymulacji układu immunologicznego wszystkim myszom podawano następnie w serii 5 iniekcji raz dziennie (dni 8 do 12) po 5000 IU rekombinowanej ludzkiej IL-2. Skuteczność tej immunoterapii określono, śledząc przeżywalność jako funkcję czasu dla myszy poddanych działaniu folianu-FITC w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi. Jak pokazano na fig. 1, mediana przeżywalności myszy poddanych działaniu folianu-FITC była zależna od dawki, gdy u myszy kontrolnych mediana czasu przeżywalności wynosiła 23 dni, myszy poddane działaniu folianu-FITC przeżywały dłużej w miarę zwiększania dawki koniugatu. Zaledwie 45 nmol/kg folianu-FITC wystarczało do wywołania długoterminowej przeżywalności myszy, a większe dawki były odpowiednio skuteczniejsze. Chociaż folian-FITC koncentrował się w nowotworze, pewna ilość folianu-FITC była obecna w tkance nerki (ale w innych prawidłowych tkankach nie na porównywalnym poziomie). Sekcje przeprowadzone przez dyplomowanego weterynarza patologa nie wykazały toksyczności ani dla nerki, ani dla prawidłowych narządów.

PRZYKŁAD 2

Obrazowanie tkanki prawidłowej i nowotworowej przy użyciu folianu skoniugowanego z izotiocyjanianem fluoresceiny.

PL 211 872 B1

Procedury były podobne do tych opisanych w przykładzie 1, za wyjątkiem wstrzyknięcia zwierzętom komórek nowotworowych 24JK-FBP, i zabicia myszy z wkrótce po wstrzyknięciu folianu-FITC. Tkanki następnie pocięto na skrawki, a lokalizację folianu-FITC w określonych tkankach badano immunofluorescencją FITC przy użyciu konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej w tkance nowotworowej, nerce, wątrobie i tkance mięśniowej. Figura 2 pokazuje mikrografie z kontrastem fazowym różnych skrawków tkanki jako kontroli, wraz z mikrografiami fluorescencji. Folian-FITC lokalizował się specyficznie w tkance nowotworowej oraz w komórkach bliższego kanalika nerkowego, gdzie wyjątkowo receptory dla kwasu foliowego są liczne.

PRZYKŁAD 3

Obrazowanie tkanki nowotworowej przy użyciu folianu skoniugowanego z izotiocyjanianem fluoresceiny lub z kozią anty-mysią IgG wyznakowanym fikoerytryną.

Procedury były podobne do tych opisanych w przykładzie 2, za wyjątkiem tego, że użyto komórki M109, a tkanki badano pod względem fluorescencji FITC (zielone obrazy) (Ang. green images) oraz fluorescencji fikoerytryny (PE) (czerwone obrazy (Ang. red images). W przypadku fluorescencji PE, znacznik fluorescencyjny połączono z kozimi przeciwciałami anty-mysiej IgG w celu wykrycia wiązania endogennych mysich przeciwciał anty-FITC z koniugatem folian-FITC, który kumulował się na komórkach nowotworowych. Porównano tkanki nowotworowe poddane i nie poddane działaniu folianu-FITC i oba typy próbek zbadano mikroskopią z kontrastem fazowym jak opisano w przykładzie 2. Fluorescencja FITC ukazuje lokalizację folianu-FITC w tkankach nowotworowych (fig. 3). Fluorescencja PE pokazuje, że endogenne mysie przeciwciała anty-FITC związane z koniugatami folian-FITC lokalizowały się na komórkach nowotworowych. Inne badania (nie pokazane) wskazują na brak takiego wiązania przez IgG do tkanek prawidłowych, w tym nerki. Brak wiązania przeciwciała do folianuFITC zlokalizowanego w nerkach bierze się z faktu, że jeśli receptor folianu znajduje się na szczytowej błonie komórek bliższego kanalika nerkowego, przeciwciała nie mają dostępu do tego regionu nerki. Obrazy z kontrastem fazowym (obrazy przekazane)(transmitted images) pokazują morfologię tkanek nowotworowych poddanych i nie poddanych opisanej procedurze, ukazując śmierć komórek wśród próbek poddanych działaniu opisanej procedury.

PRZYKŁAD 4

Wpływ koniugatu izotiocyjanianu fluoresceiny na wzrost guzów litych.

Procedury były podobne do tych opisanych w przykładzie 1, za wyjątkiem wstrzyknięcia każdemu zwierzęciu podskórnie w ramię 1x10⁶ komórek M109 (dzień 0) po uprzedniej immunizacji z FITC Immunizacje folianem-FITC po wszczepieniu komórek nowotworowych składały się z 1500 nmol/kg folianu-FITC podanego dootrzewnowo w 6 dawkach w 48-godzinnych odstępach (dni 7,9, 11, 13, 15 i 17). Powstałe guzy lite na ramieniu zmierzono i określono procent wzrostu rozmiarów guza. Krzywe wzrostu nowotworu przedstawione na fig. 4 pokazują, że wzrost guzów litych znacząco zahamowano, kiedy zwierzęta potraktowano folianem-FITC w połączeniu z IL-2.

PRZYKŁAD 5

Wpływ leczenia za pomocą kombinacji cytokin.

Procedury były podobne do tych opisanych w przykładzie 1, za wyjątkiem podania zwierzętom 5 dziennych iniekcji (dni 8 do 12) 5000 IU rekombinowanej ludzkiej IL-2 razem z IFN-α (5 dziennych iniekcji po 2,5x10⁴ U/dzień), IL-12 (5 dziennych iniekcji po 0,5 μg/dzień), lub TNF-α (3 iniekcje w dniach: 8, 10 i 12, po 2 μg/dzień), następujących po iniekcji 2 dawkami 1500 nmol/kg folianu-FITC lub aminofluoresceiny w dniach 4 i 7 po wszczepieniu komórek nowotworu. Co więcej, aby zredukować czas potrzebny do otrzymania długoterminowych danych przeżywalności, komórki nowotworowe wszczepiono dootrzewnowo, w pobliże wątroby. Dlatego też długość życia myszy z nowotworem ogólnie skrócono w porównaniu do pokazanego w przykładzie 1. Wyniki pokazane na fig. 5 ukazują, że sama IL-2 była skuteczniejsza w wywoływaniu długoterminowej przeżywalności zwierząt niż leczenie połączeniem IL-2 i IL-12 lub IL-2 i TNF-α. Przeciwnie natomiast, leczenie kombinacją IL-2 I IFN-α było skuteczniejsze w wywoływaniu długoterminowej przeżywalności niż dla samej IL-2. Aminofluoresceinę wstrzyknięto wraz z różnymi połączeniami cytokin jako kontrolę, ponieważ ten związek nie jest związany z folianem i nie przekierowuje przeciwciał antyfluoresceinowych na komórki nowotworowe.

PRZYKŁAD 6

Wpływ wielokrotnych iniekcji koniugatów folian-izotiocyjanian fluoresceiny.

Procedury były podobne do tych opisanych w przykładzie przykładzie 1, za wyjątkiem podania zwierzętom 6 iniekcji dootrzewnowych w odstępach 48-godzinnych (dni: 7, 9, 11, 13, 15 i 17 po wszczepieniu komórek nowotworowych) 1500 nmol/kg folianu-FITC. Wyniki pokazują (fig. 6), że wiePL 211 872 B1 lokrotne iniekcje folianu-FITC poprawiły długoterminową przeżywalność zwierząt poddanych działaniu folianu-FITC i IL-2 w porównaniu do 2 iniekcji folianu-FITC podanych w dniach 4 i 7 po wszczepieniu komórek nowotworowych.

PRZYKŁAD 7

Działanie synergistyczne koniugatów folianizotiocyjanian fluoresceiny i IL-2.

Procedury były podobne do tych opisanych w przykładzie 1, za wyjątkiem wstrzyknięcia zwierzętom 1500 nmol/kg folianu-FITC, a niektóre ze zwierząt poddano działaniu folianu-FITC lub samej IL-2. Co więcej, komórki nowotworowe wszczepiono dootrzewnowo jak opisano w przykładzie 5. Eksperyment ten (patrz fig. 7) przeprowadzono w celu określenia czy folian-FITC i IL-2 działają synergistycznie w wywoływaniu długoterminowej przeżywalności myszy z nowotworem. Mediana czasu przeżywalności grupy kontrolnej (n = 8) oraz grup (n = 8) poddanych działaniu IL-2, folianu-FITC lub folianu-FITC +IL-2 wynosiła odpowiednio 18, 19, 22 i 42 dni. Wynik pokazany na fig. 7 ukazuje, że zdolność folianu-FLTC i IL-2 do wywoływania długoterminowej przeżywalności myszy z nowotworem jest silnie synergistyczna, gdy niska dawką samej IL-2 ma zaniedbywalny wpływ na przeżywalność myszy przy braku follianu-FITC i gdy folian-FITC ma mniejszy wpływ.

PRZYKŁAD 8

Udział komórek NK w synergistycznym działaniu koniugatów folian-izotiocyjanian fluoresceiny i IL-2.

Procedury były podobne do tych opisanych w przykładzie 7, za wyjątkiem poddania jednej grupy zwierząt działaniu króliczego poliklonalnego przeciwciała anty-mysie komórki NK (anti-asialo GM1; Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Richmond, Va.) w kombinacji z folianem-FITC i IL-2. W celu wywołania utraty komórek NK, w dniach 1, 4, 9 i 14 po wszczepieniu nowotworu, każdej myszy wstrzyknięto 0,2 ml rozcieńczenia 1:10 stężonego roztworu przeciwciała. Średnie czasy przeżywalności grupy kontrolnej i grup poddanych działaniu folian-FITC + IL-2 lub folian-FITC + IL-2 + α-NK Ab i wynosiły odpowiednio 18, 42, i 18,5 dnia. Wyniki pokazane na fig. 8 ukazują, że komórki NK pośredniczą w synergistycznym wzmożeniu długoterminowej przeżywalności myszy z nowotworem, wywołanym przez leczenie połączeniem folianu-FITC i IL-2.

P R Z Y K Ł A D 9

Rozwój odporności komórkowej przeciwko komórkom nowotworowym M109.

Procedury były podobne do tych opisanych w przykładzie 1, za wyjątkiem wszczepienia komórek nowotworowych dootrzewnowo w miejscu opisanym w przykładzie 5, a zwierzętom wstrzyknięto PBS (kontrola) lub jednocześnie: folian-FITC (1500 nmol/kg), IL-2 (250000 lU/dawka) i IFN-α (25000 U//dawka) w dniach: 7, 8, 9, 11 i 14 po wszczepieniu komórek nowotworu. Dodatkowo, zwierzęta sprowokowano przez iniekcje 5x10⁵ komórek M109 w 62 dniu po początkowym wszczepieniu komórek nowotworu, 1,5x10⁶ komórek M109 w 96 dniu po początkowej wszczepieniu komórek nowotworu lub 2,5x10⁵ komórek linii 1 (spontaniczny rak płuc u myszy Balb/c) w 127 dniu po początkowym wszczepieniu komórek nowotworu. Jak pokazano na fig. 9, mediana czasu przeżywalności myszy kontrolnych, którym wstrzyknięto 5x10⁵ komórek M109 wynosiła 18,5 dnia. Mediana czasu przeżywalności myszy kontrolnych, którym wstrzyknięto 1,5x10⁶ komórek M109 wynosiła 18 dni. Mediana czasu przeżywalności myszy kontrolnych, którym wstrzyknięto 2,5x10⁵ komórek linii 1 wynosiła 23,5 dnia. Średnia czasu przeżywalności myszy kontrolnych, którym wstrzyknięto 5x10⁵ komórek M109 i poddano je działaniu folianu-FITC w kombinacji z IL-2 oraz IFN-α, oraz sprowokowano w 62 dniu 5x10⁵ komórek M109, sprowokowano w 96 dniu 1,5x10⁶ komórek M109 oraz sprowokowano w 127 dniu 2,5x10⁵ komórek linii 1 była większa niż 192 dni. Wyniki pokazane na fig. 9 ukazują rozwój odporności długotrwałej, specyficznej dla odporności komórkowej, u zwierząt poddanych działaniu folianu-FITC w kombinacji z IL-2 i IFN-α. Ta długotrwała odporność chroniła zwierzęta, którym wszczepiono komórki M109 i które otrzymały immunoterapię ukierunkowaną folianem przed nawrotem choroby po kolejnym wstrzyknięciu komórek M109. Czas przeżywalności tych zwierząt po ostatnim sprowokowaniu komórkami linii 1 może wynikać z niższego poziomu receptorów folianu na komórkach linii 1 niż na komórkach M109 oraz z obecności antygenów nowotworowych wspólnych dla komórek M109 oraz komórek linii 1, co prowadziło do komórkowej odpowiedzi immunologicznej specyficznej wobec M109 zdolnej również do krzyżowej odpowiedzi na komórki linii 1.

PRZYKŁAD 10

Wpływ dawki IL-2 na przeżywalność myszy poddanych działaniu koniugatów folian-izotiocyjanian fluoresceiny

PL 211 872 B1

Procedury były podobne do tych opisanych w przykładzie 1, za wyjątkiem wszczepienia komórek nowotworu dootrzewnowo w miejscu opisanym w przykładzie 5, a zwierzętom wstrzyknięto PBS (kontrola) lub jednocześnie: folian-FITC (1500 nmoli/kg) oraz IL-2 w dawkach: 5x10³ IU (1X), 0,5x10⁵ IU (10Χ), 2,5x10⁵ IU (50Χ) lub 5x10⁵ IU (100Χ) w dniach: 7, 8, 9, 11 i 14 po wszczepieniu komórek nowotworu. Dodatkowo, zwierzęta immunizowano hemocyjaniną wyznakowaną FITC (KLH) zamiast BSA wyznakowaną FITC. Jak pokazano na fig. 10, średni czas przeżywalności myszy, którym wszczepiono komórki M109 i poddano działaniu folianu-FITC rosła wraz ze wzrostem dawki IL-2 od dawki IL-2 wynoszącej 5x10³ IU. Natomiast nie zauważono istotnych różnic między średnią czasu przeżywalności myszy kontrolnych (myszy, którym wszczepiono komórki M109 i poddano działaniu PBS) i myszy, które poddano działaniu tylko IL-2.

PRZYKŁAD 11

Wzmaganie przeżywalności myszy poddanych działaniu koniugatów koniugatów folian-izotiocyjanian fluoresceiny i IL-2 przez IFN-α

Procedury były podobne do tych opisanych w przykładzie 1, za wyjątkiem wszczepienia komórek nowotworu dootrzewnowo w miejscu opisanym w przykładzie 5, a zwierzętom wstrzyknięto PBS (kontrola) lub jednocześnie: folian-FITC (1500 nmol/kg) oraz IL-2 (5000 IU/dawka) lub folian-FITC (1500 nmol/kg), IL-2 (5000 IU/dawka) i IFN-α (25000 U/dawka) w dniach 7, 8, 9, 11 i 14 po wszczepieniu komórek nowotworu. Dodatkowej grupie myszy wstrzyknięto również folian-FITC, IL-2 i IFN-α, ale zwierząt tych nie preimmunizowano BSA-FITC. Figura 11 pokazuje, że średni czas przeżywalności myszy kontrolnych poddanych działaniu PBS wynosiła 18,5 dnia, średni czas przeżywalności myszy, którym wstrzyknięto również folian-FITC i IL-2 wynosiła 20,5 dnia, średni czas przeżywalności myszy, którym wstrzyknięto folian-FITC, IL-2 i IFN-α była większa niż 60 dni, a średni czas przeżywalności myszy, którym wstrzyknięto folian-FITC, IL-2 i IFN-α, ale ich nie preimmunizowano, wynosiła 24,3 dnia. Średni czas przeżywalności myszy którym wstrzyknięto folian-FITC i IL-2 nie była znacząco różny niż dla myszy kontrolnych, ponieważ myszom tym wstrzyknięto 5000 IU IL-2, a jak opisano w przykładzie 10, do zwiększenia średniej czasu przeżywalności myszy poddanych działaniu folianu-FITC w trybie dni 7, 8, 9, 11 i 14, potrzebne są dawki IL-2 przekraczające 5000 IU. Wyniki pokazane na fig. 11 ukazują, że IFN-α dalej wzmaga wzrost średniej czasu przeżywalności, w wyniku leczenia myszy z wszczepionym nowotworem folianem-FITC i IL-2.

PRZYKŁAD 12

Wpływ utraty limfocytów T CD8+ na immunoterapię ukierunkowaną folianem.

Procedury były podobne do tych opisanych w przykładzie 1, za wyjątkiem wszczepienia komórek nowotworu dootrzewnowo w miejscu opisanym w przykładzie 5, a zwierzętom wstrzyknięto PBS (kontrola) lub jednocześnie: folian-FITC (1500 nmoli/kg), IL-2 (5000 IU/dawka) i IFN-α (25000 U/dawka) w dniach: 7, 8, 9, 11 i 14 po wszczepieniu komórek nowotworu. Dodatkowym grupom myszy wstrzyknięto jednocześnie: aminofluoresceinę (1500 nmoli/kg), IL-2 i IFN-α lub folian-FITC, IL-2, IFN-α oraz przeciwciało anty-limfocyty T CD8+ (w postaci i podawano i w dniach 2, 3, 7, 11 i 15) . Jak pokazano na fig. 12, przeciwciało anty-limfocyty T CD8+ hamuje wzrost średniego czasu przeżywalności myszy poddanych działaniu folianu-FITC, IL-2 i I FN-Oi, co wskazuje na udział limfocytów T CD8⁺ w aktywacji komórkowej odpowiedzi immunologicznej przez immunoterapię ukierunkowaną folianem. Jako kontrolę wstrzyknięto aminofluoresceinę razem z kombinacją cytokin IL-2, IFN-α, ponieważ związek ten nie jest związany z folianem i nie przekierowuje przeciwciał anty-fluoresceina na komórki nowotworu. Na fig. 12 pokazano, że aminofluoresceina wraz z IL-2 I IFN-α jest znacznie mniej skuteczna w zwiększaniu średniego czasu przeżywalności myszy z wszczepionymi komórkami M109 niż folian-FITC, IL-2 i IFN-α.

PRZYKŁAD 13

Wzmagający wpływ GM-CSF na immunoterapię ukierunkowaną folianem, wzmożoną przez IL-2 i IFN-α

Procedury były podobne do tych opisanych w przykładzie 1, za wyjątkiem wszczepienia komórek nowotworu dootrzewnowo w miejscu opisanym w przykładzie 5. Dodatkowo, jak pokazano na fig.13, zwierzętom wstrzyknięto cytokiny: IL-2 (5000 Ul/dawka), IFN-α (25000 U/dawka) i GM-CSF (3000 U/dawka). Cytokiny wstrzyknięto jednocześnie w serii 5 iniekcji w dniach od 8 do 12 po wszczepieniu komórek M109, którą przeprowadzono po wstrzyknięciu 2 dawek 1500 nmoli/kg folianu-FITC w dniu 4 i 7. Wyniki pokazane na fig.13 ukazują, że mediana czasu przeżywalności myszy poddanych działaniu PBS wynosiła 19 dni, mediana czasu przeżywalności myszy, którym wstrzyknięto IL-2, IFN-α i GM-CSF bez folianu-FITC wynosiła 22 dni, średnia czasu przeżywalności myszy, którym wstrzyknięPL 211 872 B1 to folian-FITC, IL-2 i IFN -α wynosiła 38 dni, a średnia czasu przeżywalności myszy, którym wstrzyknięto folian-FITC, IL-2, IFN-α i GM-CSF była większa niż 57,5 dnia. Wyniki pokazują, że GM-CSF dalej zwiększa ukierunkowane folianem niszczenie komórek nowotworu u myszy poddanych działaniu IL-2 i IFN -α. Średnia czasu przeżywalności myszy, którym wstrzyknięto PBS, IL-2, IFN-α i GM-CSF nie była znacząco różna niż myszy kontrolnych, wskazując na istotną rolę ukierunkowującą odpowiedź immunologiczną specyficzną dla nowotworu przez użycie folianu-FITC.

PRZYKŁAD 14

Wpływ dawki IFN-α na przeżywalność myszy poddanych działaniu koniugatów folian-izotiocyjanian fluoresceiny.

Procedury były podobne do tych opisanych w przykładzie 1, za wyjątkiem wszczepienia komórek nowotworu dootrzewnowo w miejscu opisanym w przykładzie 5, a zwierzętom wstrzyknięto PBS (kontrola) lub jednocześnie: folian-FITC (1500 nmoli/kg) i IFN-α w dawkach 1,5x10⁵ Ul/dawka (6X), 7.5x10⁴ Ul/dawka (3X), 2,5x10⁴ Ul/dawka (1X) i 7,5x10³ Ul/dawka (0,3Χ). Dodatkowo, zwierzęta immunizowano hemocyjaniną wyznakowaną FITC (KLH) zamiast BSA wyznakowaną FITC, i zwierzętom wstrzyknięto folian-FITC i IFN-α w dniach 7, 8, 9, 11 i 14 po wszczepieniu komórek nowotworu. Jak pokazano na fig. 14, mediana czasu przeżywalności myszy, którym wszczepiono komórki M109 i poddano działaniu folianu-FITC wzrastała w miarę wzrostu dawki IFN-α powyżej dawki IFN-α wynoszącej 0. 8x10⁴ IU/dawka.

PRZYKŁAD 15

Wpływ dinitrofenolu jako immunogenu na immunoterapię ukierunkowaną folianem.

Procedury były podobne do tych opisanych w przykładzie 1, za wyjątkiem wszczepienia komórek nowotworu dootrzewnowo w miejscu opisanym w przykładzie 5, a zwierzętom wstrzyknięto PBS (kontrola) lub jednocześnie: dinitrofenyl (DNP) (1500 nmol/kg), IL-2 (5000 IU/dawka/dzień) i IFN-α (2,5x10⁴ jednostek/dzień) lub folian-dinitrofenyl (DNP) (1500 nmoli/kg), IL-2 (5000 IU/dawka/dzień) i IFN-α (2,5x10⁴ jednostek/dzień) w dniach: 7, 8, 9, 11 i 14 po wszczepieniu komórek nowotworu. Dodatkowo, zwierzęta immunizowano hemocyjaniną wyznakowaną DNP (KLH). Jak pokazano na fig. 15, średnia czasu przeżywalności myszy poddanych działaniu folianu-DNP, IL-2 i IFN-α była większa niż u myszy kontrolnych (poddanych działaniu PBS) lub myszy poddanych działaniu DN P, IL-2 i IFN-α. Zatem DNP jest skutecznym immunogenem również w zastosowaniu w immunoterapii ukierunkowanej folianem.

PRZYKŁAD 16

Synergistyczne działanie koniugatów folian-izotiocyjanian fluoresceiny i IFN-α.

Procedury były podobne do tych opisanych w przykładzie 1, za wyjątkiem wszczepiania komórek nowotworu dootrzewnowo w miejscu opisanym w przykładzie 5, a zwierzętom wstrzyknięto PBS (kontrola), sam IFN-α (7,5x10⁴ jednostek/dzień), sam folian-FITC (1500 nmoli/kg) lub jednocześnie: folian-FITC (1500 nmoli/kg) i IFN -α (7,5x10⁴ jednostek/dzień) w dniach: 7, 8, 9, 11 i 14 po wszczepieniu komórek nowotworu. Dodatkowo, zwierzęta immunizowano (5 myszy na grupę) hemocyjaniną wyznakowaną FITC (KLH) zamiast BSA wyznakowaną FITC. Jako pokazano na fig. 16, średnie czasu przeżywalności grup poddanych działaniu PBS (kontrola), IFN-α, folianu-FITC lub folianu-FITC + IFN-α wynosiły odpowiednio 17, 17, 23 i 33 dni. Te wyniki ukazują, że IFN-α, podobnie jak IL-2, działa synergistycznie z folianem-FITC w wywoływaniu długoterminowej przeżywalności myszy z nowotworem.

PRZYKŁAD 17

Wpływ dinitrofenylu jako immunogenu oraz wysokich stężeń cytokin na długoterminową przeżywalność myszy.

Procedury były podobne do tych opisanych w przykładzie 1, za wyjątkiem wszczepienia komórek nowotworu dootrzewnowo w pozycję opisaną w przykładzie 5, a zwierzętom wstrzyknięto PBS (kontrola) lub jednocześnie: PBS, IL-2 (2,5x10⁵ jednostek/dzień) i IFN-α (7,5x10⁴ jednostek/dzień) lub folian-dinitrofenyl (DNP) (1500 nmol/kg), IL-2 (2,5x10⁵ jednostek/dzień) i IFN-α (7,5x10⁴ jednostek/dzień) w dniach 7, 8, 9, 11 i 14 po wszczepieniu komórek nowotworu. Dodatkowo, zwierzęta immunizowano immunizowano hemocyjaniną wyznakowaną DNP (KLH). Jak pokazano na fig.17, średnia czasu przeżywalności myszy poddanych działaniu folianu-DNP, IL-2 i IFN-α była większa niż u myszy kontrolnych (poddanych działaniu PBS) lub myszy poddanych działaniu PBS, IL-2 i IFN-α. Myszy poddane działaniu folianu-DNP, IL-2, i IFN-α (z IL-2 i IFN-α w stężeniach odpowiednio 2,5x10⁵ jednostek/dzień oraz 7,5x10⁴ jednostek/dzień) całkowicie wyleczono.

Claims (1)

1. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera związek o wzorze

   PL 211 872 B1

   Rysunki

   Dni po wszczepieniu nowotworu

   PL 211 872 B1

   Obrazowanie nowotworu 24JK-FBP ω

   o _ZJ u_

   PL 211 872 B1

   PL 211 872 B1

   Krzywa wzrostu nowotworu ni po pie)

   PL 211 872 B1

   Efekt zastosowania kombinacji cytokin w immunoterapii ukierunkowanej folianem ’Τ

   PL 211 872 B1

   Uaktualnienie immunoterapii >> N CO >» E cc ?=!

   _Ω N O

   PL 211 872 B1

   PL 211 872 B1

   PL 211 872 B1

   Rozwój odporności komórkowej przeciwko rodzicielskim komórkom nowotworowym M109

   Grupy kontrolne PBS w odpowiednich punktach kontrolnych wszczepiania nowotworu

   PL 211 872 B1

   PL 211 872 B1

   PL 211 872 B1

   Wpływ utraty limfocytów T CD8 na immunoterapię ukierunkowaną folianem

   JFIG.ilS

   PL 211 872 B1

   PL 211 872 B1

   Immunoterapia ukierunkowana FEFITC:

   PL 211 872 B1 j/Jj) Dni po wszczepieniu nowotworu