CN102805868A - 用配体-免疫原缀合物治疗的方法 - Google Patents

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Abstract

提供了用于增强宿主动物体内内源免疫应答介导的消除致病细胞群体的方法和药用组合物，其中所述致病细胞优先表达、独特表达或过量表达特定配体的结合部位。本发明包括将与免疫原缀合的所述配体给予带有所述致病细胞群体的宿主动物。所述宿主动物体内的现有抗体或者给予所述宿主动物以建立针对所述免疫原的被动免疫的抗体，与所述配体-免疫原缀合物结合，导致通过所述宿主的免疫应答消除所述致病细胞。给予至少一种选自以下的另外的治疗因子：细胞杀伤剂、肿瘤渗透增强剂、化疗药、抗微生物药、细胞毒性免疫细胞和能够刺激内源免疫应答的化合物，其中所述化合物不与所述配体-免疫原缀合物结合。

Description

用配体-免疫原缀合物治疗的方法
本申请是2001年3月30日提交的题为“用配体-免疫原缀合物治疗的方法”的国家申请号为01810185.2(PCT/US01/10254)的发明专利申请的分案申请。
发明领域
本发明涉及用于治疗特征为存在致病细胞群体的疾病的方法和药用组合物。更具体地讲，将细胞靶向配体-免疫原复合物给予患病宿主、最好与免疫系统刺激物或其它治疗因子联合给予，以增强和/或再指导宿主对所述致病细胞的免疫应答。
背景技术
哺乳动物免疫系统提供了识别和消除肿瘤细胞、其它致病细胞和侵入的外源病原体的工具。虽然免疫系统正常提供一道强防线，但仍有许多情况下癌细胞、其它致病细胞或病原体避过宿主的免疫应答，并且增殖或持续存在并伴随宿主发病。已经开发了化疗药和放射疗法来消除复制中的肿瘤。然而，目前可利用的化疗药和放射治疗方案中的大多数(即使不是全部)都有毒副作用，因为它们发挥作用不仅破坏癌细胞，而且也影响正常宿主细胞，例如造血系统的细胞。此外，化疗药在宿主产生抗药性时功效有限。
外源病原体也可以通过避过有效的免疫应答或在由于药疗或其它健康问题宿主免疫系统无应答的情况下在宿主中增殖。虽然已经研制了许多治疗化合物，但许多病原体抗这类治疗剂，或已经变为抗这类治疗剂。癌细胞和感染性生物对治疗药产生抗性的能力、以及目前可利用的抗癌药的毒副作用使得非常需要开发对致病细胞群体具特异性并且宿主毒性降低的新疗法。
研究人员已经开发了通过将细胞毒性化合物特异性靶向这类细胞破坏癌细胞的治疗方案。这些方案利用与同癌细胞特有的或过量表达的受体结合的配体缀合的毒素，以尝试最大限度地减少所述毒素传递至正常细胞。采用这种方法，已经研制了一些由针对致病细胞上特定受体、与毒素(例如蓖麻毒蛋白、假单胞菌外毒素、白喉毒素和肿瘤坏死因子)联合的抗体组成的免疫毒素。这些免疫毒素靶向带有所述抗体所识别的特定受体的肿瘤细胞(Olsnes，S.，Immunol.Today，10，第291-295页，1989；Melby，E.L.，Cancer Res.，53(8)，第1755-1760页，1993；Better，M.D.，1991年5月30日公开的PCT公开说明书WO 91/07418)。
选择性靶向宿主中癌细胞群体或外源病原体的另一种方法是增强宿主针对所述致病细胞的免疫应答，从而无需给予也可能表现出独立的宿主毒性的化合物。一种已报道的免疫疗法的策略是使抗体例如遗传工程多聚抗体结合于肿瘤细胞表面，以在所述细胞表面展示所述抗体的恒定区，从而通过各种免疫系统介导的过程诱导肿瘤细胞杀伤(De Vita，V.T.，Biologic Therapy of Cancer，第2版，Philadelphia，Lippincott，1995；Soulillou，J.P.，美国专利5,672,486)。然而，这种方法由于难以确定肿瘤特异性抗原而复杂化。依赖于宿主免疫活性的另一种方法是将抗T细胞受体抗体或抗Fc受体抗体靶向肿瘤细胞表面，以促进免疫细胞与肿瘤的直接结合(Kranz，D.M.，美国专利5,547,668)。也介绍了一种基于疫苗的方法，该方法依赖于包含与细胞因子融合的抗原的疫苗，所述细胞因子修饰所述疫苗抗原的免疫原性，从而刺激针对所述病原体的免疫应答(Pillai，S.，1991年2月7日公开的PCT公开说明书WO 91/11146)。该方法依赖于所报道的免疫应答的间接调节。另一种用于杀伤不想要的细胞群体的方法利用与抗原联合的IL-2或抗胸腺细胞球蛋白的Fab片段，以消除不想要的T细胞；然而，根据所报道的实验数据，该方法看来仅消除了50％的靶细胞群体，并且在体内导致非特异性细胞杀伤(即50％的不是T细胞的外周血淋巴细胞也被杀伤(Pouletty，P.，1997年10月16日公开的PCT公开说明书WO97/37690))。因此，仍非常需要针对治疗特征为受影响宿主中存在致病细胞群体的疾病状态的疗法。
本发明涉及一种通过增强宿主免疫系统识别致病细胞群体并对其应答而消除宿主中这类细胞群体的方法。有效地增强所述细胞病原体的抗原性，以增强内源免疫应答介导的致病细胞群体的消除。该方法避免或减少了对细胞毒性或抗微生物治疗药的应用。该方法包括给予配体-免疫原缀合物，其中所述配体能够在体内特异性结合独特表达、优先表达或过量表达配体结合部分的致病细胞群体，而所述配体缀合的免疫原能够激发抗体产生，或更优选能够被宿主动物体内内源抗体或共同给予的外源抗体所识别。通过所述免疫原缀合的配体与所述致病细胞独特表达、过量表达或优先表达的受体、转运蛋白或其它表面呈递蛋白结合，指导免疫系统介导的致病细胞的消除。所述致病细胞独特表达、过量表达或优先表达的表面呈递蛋白是在非致病细胞上不存在的或以较低量存在的受体，提供了一种选择性消除所述致病细胞的方法。可以将至少一种另外的治疗因子例如免疫系统刺激物、细胞杀伤剂、肿瘤渗透增强剂、化疗药、细胞毒性免疫细胞或抗微生物药共同给予宿主动物，以增强治疗功效。
在一个实施方案中，本发明方法包括下述步骤：给予能够在体内高亲和性特异性地结合所述靶致病细胞群体上独特表达、优先表达或过量表达的细胞表面蛋白的配体，所述配体与所述宿主动物中已经存在的或可以被激发的先天性免疫或获得性免疫所针对的免疫原缀合，任选地共同给予至少一种作为内源免疫应答激活剂或细胞毒性化合物的治疗因子。在一个优选实施方案中，所述方法包括给予宿主动物一种配体-免疫原缀合物组合物，其中所述配体是叶酸或另一种叶酸受体结合配体。所述配体通过例如共价结合与能够在宿主动物体内激发抗体应答的免疫原缀合，或者更优选与结合于宿主动物体内现有内源抗体(因先天性免疫或获得性免疫而产生的)或共同给予的抗体(即通过被动免疫)的免疫原缀合。可以与所述配体-免疫原缀合物的给予结合，将至少一种另外的不能与所述配体-免疫原复合物特异性结合、但能够刺激或增强内源免疫应答的治疗因子、细胞杀伤剂、肿瘤渗透增强剂(例如炎性因子或促炎因子)、化疗药、细胞毒性免疫细胞或抗微生物药给予宿主动物。
依照本发明的另一实施方案，提供一种增强内源免疫应答介导的特异性消除带有致病细胞群体的宿主动物体内的所述细胞群体的方法，其中所述细胞群体的成员具有配体可及的结合部位。所述方法包括下述步骤：给予所述宿主一种配体-免疫原缀合物组合物和至少一种另外的组合物，所述组合物包含所述配体和一种免疫原的复合物，其中已知所述免疫原为所述宿主体内的内源或外源抗体所识别，或者已知所述免疫原被所述宿主的免疫细胞直接识别，所述至少一种另外的组合物包含一种治疗因子，所述因子选自细胞杀伤剂、肿瘤渗透增强剂、化疗药、抗微生物药、细胞毒性免疫细胞和能够刺激内源免疫应答的化合物，其中所述化合物不结合所述配体-免疫原缀合物。
依照本发明的一个替代实施方案，提供一种在带有致病细胞群体的宿主动物体内增强所述细胞群体的内源免疫应答介导的特异性消除的方法，其中所述群体表达配体的结合部位。所述方法包括下述步骤：给予所述宿主一种组合物，所述组合物包含所述配体和一种免疫原的复合物；给予所述宿主针对所述免疫原的抗体；以及给予所述宿主至少一种另外的治疗因子，所述因子选自细胞杀伤剂、肿瘤渗透增强剂、化疗药、抗微生物药、细胞毒性免疫细胞和不结合所述配体-免疫原复合物的内源免疫应答刺激物。
在本发明的一个优选实施方案中，提供一种在带有致病细胞群体的宿主动物体内增强所述细胞群体的内源免疫应答介导的特异性消除的方法，其中所述群体优先表达、独特表达或过量表达叶酸受体。所述方法包括下述步骤：给予所述宿主一种组合物，所述组合物包含免疫原的共价连接缀合物和一种配体，其中已知所述免疫原为所述宿主体内的内源或外源抗体所识别，或者已知所述免疫原被所述宿主的免疫细胞直接识别，而所述配体包含具有谷氨酰基团的叶酸或叶酸类似物，其中与所述免疫原的共价连接仅通过所述谷氨酰基团的γ-羧基。在另一实施方案中，将至少一种另外的包含一种治疗因子的组合物给予所述宿主，所述因子选自细胞杀伤剂、肿瘤渗透增强剂、化疗药、抗微生物药、细胞毒性免疫细胞和能够刺激内源免疫应答的化合物，其中所述化合物不结合所述配体-免疫原缀合物。
在本发明的再一实施方案中，提供一种在带有致病细胞群体的宿主动物体内增强所述细胞群体的内源免疫应答介导的特异性消除的方法，其中所述群体优先表达、独特表达或过量表达叶酸受体。所述方法包括下述步骤：给予所述宿主一种组合物，所述组合物包含免疫原的共价连接缀合物和一种配体，其中已知所述免疫原为所述宿主体内的内源或外源抗体所识别，或者已知所述免疫原被所述宿主的免疫细胞直接识别，而所述配体包含具有谷氨酰基团的叶酸或叶酸类似物，其中与所述免疫原的共价连接仅通过所述谷氨酰基团的α-羧基。在另一实施方案中，将至少一种另外的包含一种治疗因子的组合物给予所述宿主，所述因子选自细胞杀伤剂、肿瘤渗透增强剂、化疗药、抗微生物药、细胞毒性免疫细胞和能够刺激内源免疫应答的化合物，其中所述化合物不结合所述配体-免疫原缀合物。
在本发明的再一实施方案中，所述靶致病细胞群体是癌细胞群体。在另一实施方案中，所述靶细胞群体是病毒感染的内源细胞。在另一实施方案中，所述靶细胞群体是外源生物群体，例如细菌、支原体、酵母或真菌。所述配体-免疫原缀合物结合于肿瘤细胞或致病生物表面，并且用所述免疫原“标记”所述靶细胞群体的细胞膜，从而触发免疫介导的针对所述被标记的细胞群体的应答。以被动免疫给予所述宿主的抗体或所述宿主系统中由于现有的先天性免疫或者获得性免疫而存在的抗体，与所述免疫原结合并触发内源免疫应答。抗体与所述细胞结合的配体-免疫原缀合物结合，引起补体介导的细胞毒性、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性、抗体调理作用和吞噬作用、抗体诱导的发送细胞死亡或静息信号的受体聚集、或者由于抗体与细胞结合的配体-免疫原缀合物结合刺激的任何其它体液或细胞免疫应答。在免疫细胞可以直接识别抗原而无需预先抗体调理的情况下，可以发生直接的致病细胞杀伤。
外源病原体或者受感染的内源细胞或肿瘤内源细胞的消除可以通过给予能够刺激内源免疫应答的治疗因子、细胞杀伤剂、肿瘤渗透增强剂、化疗药、细胞毒性免疫细胞或抗微生物药来进一步增强。在一个实施方案中，所述细胞毒性免疫细胞是一种经分离、离体扩充、然后注射到宿主动物中的细胞毒性免疫细胞群体。在本发明的另一实施方案中，使用免疫刺激物，所述免疫刺激物是白介素例如IL-2、IL-12或IL-15或者IFN例如IFN-α、IFN-β或IFN-γ或者GM-CSF。在另一实施方案中，所述免疫刺激物可以是一种细胞因子组合物，所述组合物包含细胞因子的组合，例如IL-2、IL-12或IL-15与IFN-α、IFN-β或IFN-γ、或者GM-CSF联合、或者其任何有效的组合、或者细胞因子的任何其它有效组合。
在本发明的再一实施方案中，提供一种药用组合物，所述药用组合物包含治疗有效量的配体-免疫原缀合物、一种治疗因子及其药学上可接受的载体的组合物，所述配体-免疫原缀合物能够与宿主动物体内的致病细胞群体特异性地结合，促进通过获得性或先天性免疫应答、共同给予的抗体、或通过所速宿主体内的免疫细胞直接地特异性地消除所述细胞，所述治疗因子选自细胞杀伤剂、肿瘤渗透增强剂、化疗药、抗微生物药、细胞毒性免疫细胞和能够刺激内源免疫应答的化合物，其中所述化合物不与所述配体-免疫原缀合物结合。在一个实施方案中，所述药用组合物为胃肠外缓释剂型。在另一实施方案中，所述治疗因子是一种免疫刺激物，包括选自以下的一种化合物：白介素例如IL-2、IL-12、IL-15、IFN例如IFN-α、IFN-β或IFN-γ和GM-CSF或其组合。
发明详述
提供治疗性治疗患有癌症的宿主或感染致病生物的宿主的方法。所述方法通过赋予/标记所述致病细胞抗原性、导致所述细胞被宿主免疫系统识别并消除，导致增强所述致病细胞群体的免疫应答介导的消除。所述方法利用能够高亲和性结合癌细胞或其它病原体的配体-免疫原缀合物。所述高亲和性结合可以是所述配体固有的，所述高亲和性结合可以利用化学修饰的配体或者由于所述缀合物中存在的所述配体和所述免疫原之间的特定化学键合而得到改进(增强)。所述方法也可以利用联合疗法，采用所述配体-免疫原缀合物和能够刺激内源免疫应答的另外的治疗因子、细胞杀伤剂、化疗药、肿瘤渗透增强剂、细胞毒性免疫细胞或抗微生物药，以增强所述致病细胞群体的免疫应答介导的消除。
本发明的方法可用来在带有致病细胞群体的宿主动物中增强所述致病细胞群体的内源免疫应答介导的消除。本发明适用于引起各种各样病状例如癌症和传染病的致病细胞群体。因此，致病细胞群体可以是致肿瘤的癌细胞群体，包括良性肿瘤和恶性肿瘤，或者它可以是非致肿瘤的。所述癌细胞群体可以自发产生，获得通过诸如宿主动物的生殖系中存在的突变或体细胞突变而产生，或者它可以被化学、病毒或放射诱导。本发明可以用来治疗诸如癌症、肉瘤、淋巴瘤、霍奇金病、黑素瘤、间皮瘤、伯基特淋巴瘤、鼻烟癌、白血病和骨髓瘤。所述癌细胞群体可以包括但不限于口腔癌、甲状腺癌、内分泌癌、皮肤癌、胃癌、食道癌、喉癌、胰腺癌、结肠癌、膀胱癌、骨癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫癌、乳癌、睾丸癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、肝癌和肺癌。
致病细胞群体也可以是外源病原体或带有外源病原体例如病毒的细胞群体。本发明适用于诸如细菌、真菌、病毒、支原体和寄生虫的外源病原体。可以用本发明治疗的病原体可以是任何本领域熟知的在动物体内致病的感染性生物，包括诸如以下的生物：革兰氏阴性或革兰氏阳性球菌或杆菌的细菌、DNA病毒和RNA病毒，包括但不限于诸如乳头瘤病毒、细小病毒、腺病毒、疱疹病毒和痘苗病毒的DNA病毒、以及诸如沙粒病毒、冠形病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、细小核糖核酸病毒、副粘病毒、呼肠孤病毒、逆转录病毒和弹状病毒的RNA病毒。特别感兴趣的是抗生素抗性细菌，例如抗生素抗性链球菌(Streptococcus species)和葡萄球菌(Staphlococcus species)，或者是对抗生素敏感但引起用抗生素治疗的复发性感染、以致最终产生抗性生物的细菌。这类生物可以用本发明的配体-免疫原缀合物与低于正常给予患者的剂量的抗生素联合治疗，以避免产生这些抗生素抗性细菌菌株。本发明也适用于任何真菌、支原体种、寄生虫或在动物中致病的其它感染性生物。可以用本发明方法治疗的真菌的实例包括生长为霉或酵母样的真菌，包括例如引起诸如以下疾病的真菌：癣、组织胞浆菌病、芽生菌病、曲霉病、隐球菌病、孢子丝菌病、球孢子菌病、类球孢子菌病和念珠菌病。本发明可以用来治疗寄生虫感染，包括但不限于由以下寄生虫引起的感染：体绦虫、血吸虫、组织蛔虫、变形虫和疟原虫属(Plasmodium)、锥虫属(Trypanosoma)、利什曼原虫属(Leishmania)和弓形体属(Toxoplasma)种。特别感兴趣的寄生虫是表达叶酸受体并结合叶酸的寄生虫；然而，在文献中关于对感染性生物表现出高亲和性的配体有大量的参考文献。例如，已知其抗生素活性并且与细菌细胞壁前体特异性结合的青霉素和头孢菌素同样可以用作制备按照本发明使用的配体-免疫原缀合物的配体。本发明的配体-免疫原缀合物也可以针对带有内源病原体的细胞群体，其中所述病原体特异性抗原优先在带有所述病原体的细胞表面表达，并且用作与所述抗原特异性结合的配体的受体。
本发明的方法可以用于人类临床医学和兽医学应用。因此，带有致病生物群体并且用配体-免疫原缀合物治疗的宿主动物可以是人类，或者在兽医学应用的情况下，可以是实验室动物、农用动物、驯养动物或野生动物。本发明可以适用于包括但不限于以下的宿主动物：人类；实验室动物，诸如啮齿动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠等)、兔、猴、黑猩猩；驯养动物，例如狗、猫和兔；农用动物，例如牛、马、猪、绵羊、山羊；和关养的野生动物，例如熊、熊猫、狮、虎、豹、大象、斑马、长颈鹿、大猩猩、海豚和鲸。
所述配体-免疫原缀合物最好胃肠外给予宿主动物，例如皮内、皮下、肌内、腹膜内或静脉给予。或者，所述缀合物可以通过其它药物有用的方法给予宿主动物，可以使用任何有效的剂量和合适的治疗剂型，包括缓释剂型。本发明的方法可以与肿瘤的手术去除、放射疗法、化学疗法或生物疗法例如包括但不限于以下的其它免疫疗法联合应用：单克隆抗体疗法、用免疫调节药治疗、免疫效应细胞的继承性转移、用造血生长因子、细胞因子和疫苗接种治疗。
按照本发明，所述配体-免疫原缀合物可以选自各种各样的配体和免疫原。所述配体必须因为所述致病细胞上优先表达所述配体结合可及的所述配体的受体，而能够特异性地消除宿主动物体内的致病细胞群体。可接受的配体包括叶酸、叶酸类似物和其它叶酸受体结合分子、其它维生素、通过文库筛选鉴定的肽配体、肿瘤特异性肽、肿瘤特异性适体(aptamer)、肿瘤特异性糖类、肿瘤特异性单克隆抗体或多克隆抗体、抗体的Fab或scFv(即单链可变区)片段例如针对EphA2或转移性癌细胞上特异性表达或特有可及的其它蛋白的抗体的Fab片段、得自组合文库的小有机分子、生长因子例如EGF、FGF、胰岛素和胰岛素样生长因子和同源多肽、促生长素抑制素及其类似物、运铁蛋白、脂蛋白复合物、胆盐、选择蛋白、类固醇激素、含Arg-Gly-Asp肽、类视黄醇、各种半乳凝素(Galectin)、δ-阿片样物质受体配体、缩胆囊素A受体配体、血管紧张肽AT1或AT2受体特异性配体、过氧化物酶体增殖活化受体γ配体、β-内酰胺抗生素、小有机分子包括抗微生物药、和与优先在肿瘤细胞或感染性生物表面表达的受体特异性结合的其它分子、或任何这些分子的片段。在与感染性生物结合的配体的情况下，感兴趣的是本领域已知优先与所述微生物结合的任何分子，例如抗生素或其它药物。本发明也适用于作为根据特定受体的晶体结构设计以适合所述受体的结合口袋的分子的配体(例如抗微生物药)、或其它细胞表面蛋白，并且其中所述受体在肿瘤、细菌、病毒、支原体、真菌、寄生虫或其它病原体表面上优先表达。在本发明的一个优选实施方案中，也考虑了可以利用配体与任何肿瘤抗原或在肿瘤细胞表面优先表达的其它分子的结合。
所述配体的结合部位可以包括能够与受体特异性结合的任何分子的受体，其中所述受体或其它蛋白在致病细胞群体上优先表达，包括例如生长因子、维生素、肽(包括阿片样肽)、激素、抗体、糖类和小有机分子的受体。所述结合部位也可以是任何分子例如抗生素或其它药物的结合部位，其中本领域已知所述部位优先存在于微生物上。例如，所述结合部位可以是细菌细胞壁中β-内酰胺抗生素(例如青霉素)的结合部位，或者是病毒表面特有存在的抗病毒药的结合部位。本发明也适用于根据所述受体的晶体结构设计以适合于所述受体结合部位的配体(例如抗微生物药)的结合部位，并且其中所述受体优先在所述致病细胞或生物表面表达。也设想了肿瘤特异性抗原可以用作本发明方法中配体的结合部位。可以用作配体-免疫原缀合物的结合部位的肿瘤特异性抗原的一个实例是Ephrin蛋白家族成员(例如EphA2)的胞外表位。EphA2表达限于正常细胞的细胞间连接，但在转移性肿瘤细胞中EphA2分布在整个细胞表面上。因此，转移细胞上EphA2对于与例如免疫原缀合的抗体Fab片段的结合而言是可及的，而所述蛋白对于正常细胞上Fab片段的结合将是不可及的，产生转移性癌细胞特异性的配体-免疫原缀合物。本发明还设想了联合应用配体-免疫原缀合物，以将所述致病细胞的靶向最大化，以供获得性或先天性免疫应答或通过共同给予的抗体进行消除。
用于本发明的可接受的免疫原是能够在宿主动物体内诱发抗体产生、或者先前已经在宿主动物体内诱发了抗体产生、引起现有免疫或者作为先天性免疫系统组成部分的免疫原。或者，可以将针对所述免疫原的抗体给予所述宿主动物，以建立被动免疫。用于本发明的合适免疫原包括已经通过正常的计划接种或先前天然接触诸如脊髓灰质炎病毒、破伤风、斑疹伤寒、风疹、麻疹、流行性腮腺炎、百日咳、结核病的因子和流感抗原的因子和α-半乳糖基已经产生的现有免疫所针对的抗原或抗原肽。在这种情况下，所述配体-免疫原缀合物将用来将先前获得的体液免疫或细胞免疫再导向宿主动物体内的致病细胞群体，以消除所述外源细胞或致病生物。其它合适的免疫原包括所述宿主动物已经通过抗非天然抗原或半抗原(例如异硫氰酸荧光素或二硝基苯基)的免疫产生的新免疫所针对的抗原或抗原肽、以及存在的先天性免疫所针对的抗原(例如超抗原和胞壁酰二肽)。
可以利用任一本领域熟知的形成复合体的方法，将本发明的配体和免疫原缀合。这可以包括将所述配体与所述免疫原或者直接、或者通过一个连接基团(例如二价接头)通过共价键、离子键或氢键结合。所述缀合物通常通过所述配体与所述免疫原通过在所述复合体相应组分上的酸、醛、羟基、氨基或联亚氨基之间形成酰胺键、酯键或亚氨基键(imino bond)共价连接。在本发明的一个优选实施方案中，所述配体是叶酸、叶酸类似物、或任何其它叶酸受体结合分子、以及通过利用三氟乙酸酐通过蝶酰叠氮化物中间体制备叶酸的γ-酯的方法、与所述免疫原缀合的叶酸配体。这种优选方法导致合成仅通过叶酸的谷氨酸基团的γ-羧基与所述免疫原缀合的叶酸配体，其中所述γ-缀合物以高亲和性与所述叶酸受体结合，避免了α-缀合物和γ-缀合物的混合物的形成。或者，可以从中间体制备纯α-缀合物，其中所述γ-羧基被选择性封闭，形成α-缀合物，随后用本领域熟知的有机合成方案和方法将γ-羧基去封闭。特别是，可以用其它的维生素作为可供制备依照本发明的缀合物的配体。例如，可以用生物素和核黄素以及叶酸形成配体-免疫原缀合物(参见美国专利第5,108,921、5,416,016和5,635,382号，所述文献通过引用结合到本文中)。
本发明的配体-免疫原缀合物增强内源免疫应答介导的致病细胞群体的消除。所述内源免疫应答可以包括体液应答、细胞介导的免疫应答、以及宿主动物内源的任何其它免疫应答，包括补体介导的细胞裂解、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、导致吞噬作用的抗体调理作用、抗体结合时产生细胞凋亡信号、抗增殖或分化的受体聚集、以及所传递的抗原/半抗原的直接免疫细胞识别。也设想了所述内源免疫应答将采用细胞因子分泌，所述细胞因子调节诸如免疫细胞增殖和迁移的过程。所述内源免疫应答可以包括诸如B细胞、T细胞(包括辅助T细胞和细胞毒性T细胞)、巨噬细胞、天然杀伤细胞、嗜中性粒细胞、LAK细胞等的免疫细胞类型的参与。
体液应答可以是通过诸如正常计划接种或者用天然抗原或诱导新的免疫的非天然抗原或半抗原(例如异硫氰酸荧光素)主动免疫的过程而诱导的应答。主动免疫包括多次注射正常免疫接种方案计划之外的非天然抗原或半抗原，以诱导新的免疫。体液应答也可以由先天性免疫而产生，其中宿主动物具有天然的现有免疫，例如针对α-半乳糖基的免疫。或者，可以通过将例如从血清收集的天然抗体或可以是或不是遗传工程抗体(包括人源化抗体)的单克隆抗体的抗体给予宿主动物，建立被动免疫。用特定量的抗体试剂产生被动免疫，并且应用其中被动给予的抗体针对所述免疫原的配体-免疫原缀合物，将提供针对其它潜在抗原的患者现有抗体效价并非治疗上有用时使用的一组标准试剂的优势。被动给予的抗体可以与所述配体-免疫原缀合物“共同给予”，共同给予定义为在给予所述配体-免疫原缀合物之前、同时或之后给予抗体。
设想了所述现有的抗体、诱导的抗体、或被动给予的抗体将会通过使所述配体-免疫原缀合物优先结合所述肿瘤细胞或感染性生物而再导向这些侵入性细胞或生物，从而通过补体介导的裂解、ADCC、抗体依赖性吞噬作用或受体的抗体聚集杀伤所述致病细胞。细胞毒性过程也可能涉及其它免疫应答类型例如细胞介导的免疫、以及当被吸引的抗原呈递细胞吞噬所述不想要的细胞时产生的并且将天然肿瘤抗原或外源病原体抗原传递给免疫系统以消除带有所抗原的细胞或生物的再次应答。
可以将包含治疗因子的至少一种另外的组合物联合给予宿主，或者作为以上详述的方法的佐剂给予宿主，以增强致病细胞群体的内源免疫应答介导的消除，或者可以给予不止一种另外的治疗因子。所述治疗因子可以选自能够刺激内源免疫应答的化合物、化疗药、抗微生物药或能够补偿所给予的配体-免疫原复合体的功效的其它治疗因子。本发明的方法可以通过下述方法进行：除给予上述缀合物之外，将能够刺激内源免疫应答的包括但不限于以下的因子的化合物或组合物给予宿主：细胞因子或免疫细胞生长因子，例如白介素1-18、干细胞生长因子、碱性FGF、EGF、G-CSF、GM-CSF、FLK-2配体、HILDA、MIP-1α、TGFα、TGFβ、M-CSF、IFNα、IFNβ、IFNγ、可溶性CD23、LIF和它们的组合。
也可以使用这些细胞因子的治疗有效组合。在一个优选实施方案中，例如将治疗有效量例如约5000IU/剂/天至约500,000IU/剂/天范围的量(以每日多剂量的方案)的IL-2和有效量例如约7500IU/剂/天至约150,000IU/剂/天范围的量(以每日多剂量的方案给予)的IFN-α与叶酸连接的异硫氰酸荧光素一起使用，以消除带有致病细胞群体的宿主动物体内的这类细胞群体。在另一优选实施方案中，使用治疗有效量的IL-12和IFN-α，在再一优选实施方案中，使用治疗有效量的IL-15和IFN-α。在一个替代的优选实施方案中，联合应用IL-2、IFN-α或IFN-γ和GM-CSF。最好是，所用的治疗因子例如IL-2、IL-12、IL-15、IFN-α、IFN-γ和GM-CSF(包括其组合)激活天然杀伤细胞和/或T细胞。或者，所述治疗因子或其组合(包括白介素与干扰素和GM-CSF组合)可以激活其它免疫效应细胞，例如巨噬细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、LAK细胞等。本发明也考虑了应用细胞因子的任何其它有效组合，包括其它白介素和干扰素和集落刺激因子的组合。
本身有细胞毒性并且可以用来增强肿瘤渗透性、适用于本发明方法的化疗药包括肾上腺类皮质激素、烷化剂、抗雄激素、抗雌激素、雄激素、雌激素、抗代谢物例如阿糖胞苷、嘌呤类似物、嘧啶类似物和氨甲蝶呤、白消安、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂和其它铂化合物、他莫昔芬、紫杉醇、环磷酰胺、植物生物碱、泼尼松、羟基脲、替尼泊苷、抗生素例如丝裂霉素C和博来霉素、氮芥、nitrosureas、长春新碱、长春碱、炎性因子和促炎因子、以及本领域熟知的任何其它化疗药。可以作为给予本发明缀合物辅助给予的其它治疗药包括青霉素、头孢菌素、万古霉素、红霉素、克林霉素、利福平、氯霉素、氨基糖苷、庆大霉素、两性霉素B、阿昔洛韦、曲氟尿苷、更昔洛韦、齐多夫定、金刚烷胺、利巴韦林和本领域熟知的任何其它抗微生物化合物。
致病细胞群体的消除将包括肿瘤块或致病生物的减少或消除，产生治疗反应。就肿瘤而言，所述消除可以是消除原发性肿瘤细胞或已经转移或在与原发性肿瘤分离过程中的细胞。按照本发明，也考虑了防止肿瘤在通过任何治疗方法(包括手术除去肿瘤、放射疗法、化学疗法或生物疗法)除去后复发的预防性治疗。所述预防性治疗可以是用所述配体-免疫原缀合物的初次治疗(例如以每日多剂量的方案)和/或可以是另外的治疗或初次治疗后间隔数天或数月后的系列治疗。
本发明也涉及药用组合物，所述药用组合物包含“标记”宿主动物中致病细胞群体有效量的配体-免疫原缀合物，以通过内源免疫应答或通过共同给予的抗体进行特异性消除。所述组合物还包含增强所述致病细胞消除有效量的另外的因子，所述另外的因子选自细胞杀伤剂、肿瘤渗透增强剂、化疗药、抗微生物药、细胞毒性免疫细胞和能够刺激内源免疫应答的化合物，其中所述化合物不与所述配体-免疫原缀合物结合。所述药用组合物含有治疗有效量的所述配体-免疫原缀合物和所述治疗因子，所述因子可以包括细胞因子例如IL-2、IL-12或IL-15或细胞因子包括IL-2、IL-12或IL-15和干扰素例如IFN-α或IFN-γ的组合、以及干扰素、白介素和集落刺激因子例如GM-CSF的组合。
所述配体-免疫原缀合物的单位日剂量可以根据宿主的身体状况、待治疗的病症、所述缀合物的分子量、其给药途径和组织分布、以及共同使用其它治疗性治疗(例如放射疗法)的可能性而大大改变。给予患者的有效量基于体表面积、患者体重和医师对患者病症的评价。有效量可以在约1ng/kg至约1mg/kg、更优选在约1μg/kg至约500μg/kg、最优选在约1μg/kg至约100μg/kg范围内变动。
给予所述配体-免疫原缀合物和所述治疗因子以将现有抗体重新导向肿瘤细胞或感染性生物或诱导针对所述免疫原的体液应答的任何有效方案都可以使用。例如，可以将所述配体-免疫原缀合物和所述治疗因子作为一剂给予，或者可以将它们分开以每日多剂方案给予。此外，可以使用一种交错的方案例如每周1-3天作为每日治疗的替代方案，为了限定本发明，这类间歇性或交错的每日方案被认为是每日治疗的等同方案，认为在本发明范围内。在本发明的一个优选实施方案中，所述宿主用多次注射所述配体-免疫原缀合物和所述治疗因子来治疗，以消除致病细胞群体。在一个实施方案中，给所述宿主注射多次(最好约2次多至约50次)所述配体-免疫原缀合物，例如以12-72小时间隔或以48-72小时间隔注射。在初次注射后，以数天或数月的间隔给予所述患者额外的所述配体-免疫原缀合物的注射，所述额外注射防止疾病复发。或者，初次注射所述配体-免疫原缀合物可以防止疾病复发。
可以在给予所述配体-免疫原缀合物之前、之后或同时给予所述宿主动物所述治疗因子，所述治疗因子可以作为含有所述缀合物的同一组合物的部分给予，或者作为不同于所述配体-免疫原缀合物的组合物的部分给予。任何这类含有治疗有效量的所述治疗因子的组合物都可以用于本发明。另外，可以使用不止一种类型的配体-免疫原缀合物。例如，宿主动物可以用异硫氰酸荧光素和二硝基苯基预先免疫，随后用与相同或不同配体连接的异硫氰酸荧光素和二硝基苯基用一个共同给药方案中来治疗。就化疗药和抗微生物药而论，所述治疗因子可以以亚适剂量与所述配体-免疫原缀合物在一个联合疗法中一起给予，以避免所述宿主动物产生针对所述化疗药或抗微生物药的抗性。
所述配体-免疫原缀合物和所述治疗因子最好胃肠外注射，这种注射可以是腹膜内注射、皮下注射、肌内注射、静脉注射或鞘内注射。所述配体-免疫原缀合物和所述治疗因子也可以采用慢速泵给予。胃肠外剂型的实例包括所述活性剂在等渗盐水、5％葡萄糖或其它众所周知的药学上可接受的液体载体(例如液体乙醇、二醇、酯和酰胺)中的水溶液。按照本发明的胃肠外剂型可以为可重建冻干制剂的形式，包含所述剂量的配体-免疫原缀合物和治疗因子。在本发明的一个优选方面，可以给予任何数目的本领域已知的缓释剂型，例如美国专利第4,713,249、5,266,333和5,417,982号中描述的生物可降解糖类基质，所述文献的公开内容通过引用结合到本文中。
具体实施方式：
实施例1
叶酸-异硫氰酸荧光素缀合物
对带有肺部肿瘤移植物的小鼠存活的影响
将6-8周龄(～20-22克)雌性Balb/c小鼠用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的牛血清白蛋白(BSA)、利用市售佐剂(例如弗氏佐剂TiterMaxTM-Gold)在多个部位皮下免疫。确定所有小鼠体内抗FITC抗体效价高(通过小鼠血清样品的ELISA测定结果来证明)之后，给每只动物腹膜内注射5×105M109细胞，这是一种表达高水平叶酸受体的同源肺癌细胞系。癌症病灶附着(attach)并生长。移植癌细胞后4天和7天时，给所有动物腹膜内注射或者磷酸缓冲盐溶液(PBS)或者特定量的通过γ羧基连接的乙二胺桥与叶酸缀合的FITC。叶酸-FITC的注射浓度为0(PBS对照)、4.5、45、450和4500nmole/kg，每种叶酸-FITC浓度注射8只小鼠，总共注射40只小鼠。然后给予所有小鼠一系列5个5000IU重组人IL-2的每日注射(第8天至第12天)，以刺激免疫系统。然后，通过监测与对照动物相比叶酸-FITC治疗的小鼠随时间而变的存活率，评估这种免疫疗法的功效。如图1所示，用叶酸-FITC治疗的小鼠的平均存活是剂量依赖性的，而对照小鼠表现出肿瘤移植后平均存活23天，而叶酸-FITC小鼠随所述缀合物剂量的增加存活越来越长。低至45nmole/kg的叶酸-FITC能够促进小鼠的长期存活，而较高剂量成比例地更为有效。虽然发现所述叶酸-FITC在肿瘤中浓缩，但在肾组织中存在一些叶酸-FITC(但与其它正常组织中的水平不相当)。有证书的兽医学病理学家在尸体剖检中没有检测到肾毒性或正常器官的毒性。
实施例2
用与异硫氰酸荧光素缀合的叶酸使正常组织与肿瘤组织成像
所述方法与实施例1中所述方法相似，只是给动物注射24JK-FBP肿瘤细胞，在注射叶酸-FITC后不久处死小鼠，将组织制作薄切片，用聚焦荧光显微镜术通过FITC免疫荧光进行检查，以将叶酸-FITC定位于特定的组织，包括肿瘤、肾、肝和肌肉组织。图2显示了作为对照的各种组织薄切片的相差显微照片以及荧光显微照片。发现叶酸-FITC特异性地定位于肿瘤组织和叶酸受体特别丰富的肾近端小管细胞中。
实施例3
用与异硫氰酸荧光素缀合的叶酸或藻红蛋白标记的
山羊抗小鼠IgG使肿瘤组织成像
所述方法与实施例2中所述方法相似，只是使用M109细胞，通过FITC荧光(绿色图象)和藻红蛋白(PE)荧光(红色图象)检查组织。对于PE荧光，将所述荧光标记与山羊抗小鼠IgG抗体连接，以用于检测内源小鼠抗FITC抗体与叶酸-FITC缀合物的结合，所述缀合物在肿瘤细胞上积累。比较叶酸-FITC治疗的肿瘤组织和未经治疗的肿瘤组织，也通过相差显微镜术，如实施例2中所述，检查两种类型的样品。FITC荧光证明：叶酸定位于肿瘤组织(图3)。PE荧光证明：与叶酸-FITC缀合物结合的内源小鼠抗FITC抗体定位于肿瘤细胞。其它研究(未显示)证明缺乏这类IgG与正常组织包括肾的结合。没有抗体与位于肾组织的叶酸-FITC结合是因为这样一个事实：如果叶酸受体在肾近端小管细胞的顶部膜上，则抗体不能接触肾的该区域。相差图象(透射图象(transmitted image))显示了经治疗和未经治疗的肿瘤组织的形态，显示出经治疗样品中的细胞死亡。
实施例4
叶酸异硫氰酸荧光素缀合物对实体瘤生长的影响
所述方法与实施例1中所述方法相似，只是在用FITC预先免疫后每只动物在肩部皮下注射1×106M109细胞(第0天)。肿瘤细胞移植后用叶酸-FITC的免疫包括1500nmol/kg叶酸-FITC，以48小时间隔以6个腹膜内剂量给予(第7、9、11、13、15和17天)。测量所得的肩部实体瘤，测定肿瘤大小增加的百分率。图4所示的肿瘤生长曲线表明，当动物用叶酸-FITC与IL-2联合治疗时，实体瘤的生长显著受到抑制。
实施例5
细胞因子联合治疗的效应
所述方法与实施例1中所述方法相似，只是动物通过在肿瘤细胞移植后第4天和第7天注射2剂1500nmol/kg叶酸-FITC或氨基荧光素后，5次每日注射(第8天至第12天)5000IU重组人IL-2与或者IFN-α(5次每日注射2.5×104U/天)、IL-12(5次每日注射0.5μg/天)或TNF-α(于第8、10和12天3次每日注射2μg/天)来治疗。此外，为了减少获得长期存活数据所需的时间，将肿瘤细胞腹膜内移植到肝附近。因此，与实施例1中所示的小鼠相比，有肿瘤小鼠的寿命一般缩短。图5所示的结果证明，单独的IL-2在促进动物长期存活方面比用IL-2和IL-12或用IL-2和TNF-α联合治疗更为有效。相反，用IL-2和IFN-α联合治疗在促进长期存活方面比单独的IL-2更为有效。注射氨基荧光素与各种细胞因子组合作为对照，因为该化合物不与叶酸结合，并且不会使抗荧光素抗体再靶向肿瘤细胞。
实施例6
多次注射叶酸异硫氰酸荧光素缀合物的效应
所述方法与实施例1中所述方法相似，只是以48小时的间隔，给动物腹膜内注射，6次每日注射(肿瘤细胞移植后第7、9、11、13、15和17天)1500nmol/kg叶酸-FITC。结果表明(图6)，与于肿瘤细胞移植后第4天和第7天2次注射叶酸-FITC相比，多次注射叶酸-FITC改进用叶酸-FITC和IL-2治疗的动物的长期存活。
实施例7
叶酸异硫氰酸荧光素缀合物和IL-2的协同效应
所述方法与实施例1中所述方法相似，只是给动物注射1500nmole/kg叶酸-FITC，某些动物或者用单独的叶酸FITC或者单独的IL-2治疗。此外，如实施例5中所述，腹膜内移植所述肿瘤细胞。进行该实验(参见图7)以确定叶酸-FITC和IL-2是否协同起作用，以促进有肿瘤小鼠的长期存活。对照组(n＝8)以及用IL-2、叶酸-FITC或叶酸-FITC+IL-2治疗的组(n＝8)的平均存活时间分别为18天、19天、22天和42天。图7所示结果表明，叶酸-FITC和IL-2促进有肿瘤小鼠的长期存活的能力是强协同的，单独的低剂量的IL-2在缺乏叶酸-FITC时对所述小鼠的存活效应可忽略，叶酸-FITC仅有微小的效应。
实施例8
NK细胞与叶酸异硫氰酸荧光素缀合物和IL-2的协同效应有关
所述方法与实施例7中所述方法相似，只是一组动物用多克隆兔子抗小鼠NK细胞抗体(抗脱唾液酸GM1；Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.，Richmond，Va.)与叶酸-FITC和IL-2联合治疗。每只小鼠于肿瘤移植后第1、4、9和14天注射0.2ml抗体储备液的1∶10稀释液，以达到耗竭NK细胞。对照组和用叶酸-FITC+IL-2或叶酸-FITC+IL-2+α-NK Ab治疗组的平均存活时间分别为18天、42天和18.5天。图8所示的结果表明，NK细胞介导用叶酸-FITC和IL-2联合治疗引起的有肿瘤小鼠长期存活的协同增强。
实施例9
抗M109肿瘤细胞的细胞免疫的产生
所述方法与实施例1中所述方法相似，只是在实施例5中所述的位置腹膜内移植所述肿瘤细胞，并且在肿瘤细胞移植后第7、8、9、11和14天给动物注射PBS(对照)或共同注射叶酸-FITC(1500nmole/kg)、IL-2(250,000IU/剂)和IFN-α(25,000U/剂)。另外，通过在初始肿瘤细胞移植后第62天注射5×105M109细胞，在初始肿瘤细胞移植后第96天注射1.5×106M109细胞，或在初始肿瘤细胞移植后第127天注射2.5×105Line 1细胞(一种Balb/c自发肺癌)，来攻击动物。
如图9所示，注射5×105M109细胞的对照小鼠的平均存活时间为18.5天。注射1.5×106M109细胞的对照小鼠的平均存活时间为18天。注射2.5×105Line 1细胞的对照小鼠的平均存活时间为23.5天。注射5×105M109细胞、用叶酸-FITC与IL-2和IFN-α联合治疗、第62天用5×105M109细胞攻击、第96天用1.5×106M109细胞攻击、以及第127天用2.5×105Line 1细胞攻击的小鼠的平均存活时间超过192天。
图9所示结果表明，在用叶酸-FITC与IL-2和IFN-α联合治疗的动物中产生长期持续的细胞类型特异性细胞免疫。这种长期持续的免疫保护移植有M109细胞并接受叶酸靶向的免疫疗法的动物以免在通过随后注射M109细胞攻击时疾病复发。在最后一次用Line 1细胞攻击后，在这些动物中的存活时间可能是因为在Line 1细胞上存在的叶酸受体水平低于M109细胞上存在的受体，并且因为在M109细胞和Line 1细胞之间存在共享的肿瘤抗原，引起能够与Line 1细胞交叉反应的M109特异性细胞免疫应答。
实施例10
IL-2剂量对用叶酸-异硫氰酸荧光素缀合物治疗小鼠存活的影响
所述方法与实施例1中所述方法相似，只是在实施例5中所述的位置腹膜内移植所述肿瘤细胞，并且动物在肿瘤细胞移植后第7、8、9、11和14天用PBS(对照)治疗，或给动物共同注射叶酸-FITC(1500nmole/kg)和5×103IU(1×)、0.5×105IU(10×)、2.5×105IU(50×)或5×105IU(100×)剂量的IL-2。另外，动物用FITC标记的匙孔
Figure BSA00000748281600211
血蓝蛋白(KLH)免疫，而不是用FITC标记的BSA免疫。如图10所示，移植有M109细胞并用叶酸-FITC治疗的小鼠的平均存活时间当IL-2的剂量增加至高于5×103IU IL-2剂量时增加。相反，在对照小鼠(注射M109细胞并用PBS治疗的小鼠)和仅用IL-2治疗的小鼠的平均存活时间之间没有实质上的差异。
实施例11
IFN-α增强用叶酸-异硫氰酸荧光素缀合物和IL-2治疗小鼠的存活
所述方法与实施例1中所述方法相似，只是在实施例5中所述的位置腹膜内移植所述肿瘤细胞，并且在肿瘤细胞移植后第7、8、9、11和14天动物用PBS(对照)治疗，或给动物共同注射叶酸-FITC(1500nmole/kg)和IL-2(5000IU/剂)或叶酸-FITC(1500nmole/kg)、IL-2(5000IU/剂)和IFN-α(25,000U/剂)。给另外一组小鼠共同注射叶酸-FITC、IL-2和IFN-α，但动物不用BSA-FITC预先免疫。图11显示，用PBS治疗的对照小鼠的平均存活时间为18.5天，共同注射叶酸-FITC和IL-2的小鼠的平均存活时间为20.5天，共同注射叶酸-FITC、IL-2和IFN-α的小鼠的平均存活时间超过60天，而共同注射叶酸-FITC、IL-2和IFN-α、但没有预先免疫的小鼠的平均存活时间为24.3天。注射叶酸-FITC和IL-2的小鼠的平均存活时间与对照小鼠没有实质上的差异，因为给所述小鼠注射5000IU的IL-2，如实施例10中所述，采用第7、8、9、11和14天的方案，增加用叶酸-FITC治疗小鼠的平均存活时间需要高于5000IU的IL-2剂量。图11所示的结果表明，IFN-α进一步增强由于用叶酸-FITC和IL-2治疗移植有肿瘤细胞的小鼠而发生的平均存活时间的增加。
实施例12
CD8+T细胞耗竭对叶酸靶向免疫疗法的影响
所述方法与实施例1中所述方法相似，只是在实施例5中所述的位置腹膜内移植所述肿瘤细胞，并且在肿瘤细胞移植后第7、8、9、11和14天动物用PBS(对照)治疗，或给动物共同注射叶酸-FITC(1500nmole/kg)、IL-2(5000IU/剂)和IFN-α(25,000U/剂)。给另外一组小鼠共同注射氨基荧光素(1500nmole/kg)、IL-2和IFN-α或共同注射叶酸-FITC、IL-2、IFN-α和抗CD8+T细胞抗体(以腹水的形式，并且在第2、3、7、11和15天给予)。如图12所示，抗CD8+T细胞抗体抑制用叶酸-FITC、IL-2和IFN-α治疗小鼠的平均存活时间的增加，表明CD8+T细胞在通过叶酸靶向免疫疗法激活细胞免疫应答中起作用。注射氨基荧光素以及IL-2、IFN-α细胞因子组合作为对照，因为该化合物不与叶酸结合，并且不会将抗荧光素抗体再导向肿瘤细胞。图12显示，氨基荧光素与IL-2和IFN-α一起的效力在增加移植有M109细胞的小鼠平均存活时间方面比叶酸-FITC、IL-2和IFN-α低得多。
实施例13
GM-CSF对IL-2和IFN-α增强的叶酸靶向免疫疗法的增大效应
所述方法与实施例1中所述方法相似，只是在实施例5中所述的位置腹膜内移植所述肿瘤细胞。另外，如图13所示，给动物注射多种细胞因子，包括IL-2(5000IU/剂)、IFN-α(25,000U/剂)和GM-CSF(3000IU/剂)。在移植M109细胞并且随后在第4天和第7天注射2剂1500nmole/kg叶酸-FITC后，于第8天至第12天以一系列5次每日注射共同注射所述细胞因子。图13所示结果表明，用PBS治疗小鼠的平均存活时间为19天，注射IL-2、IFN-α和GM-CSF但无叶酸-FITC的小鼠的平均存活时间为22天，注射叶酸-FITC、IL-2和IFN-α的小鼠的平均存活时间为38天，而注射叶酸-FITC、IL-2、IFN-α和GM-CSF的小鼠的平均存活时间超过57.5天。结果表明，GM-CSF在也用IL-2和IFN-α治疗的小鼠中进一步增进叶酸靶向的肿瘤细胞杀伤。注射PBS、IL-2、IFN-α和GM-CSF的小鼠的平均存活时间与对照小鼠没有显著差异，表明利用叶酸-FITC靶向肿瘤特异性免疫应答的重要性。
实施例14
IFN-α剂量对用叶酸-异硫氰酸荧光素缀合物治疗小鼠存活的影响
所述方法与实施例1中所述方法相似，只是在实施例5中所述的位置腹膜内移植所述肿瘤细胞，并且动物用PBS(对照)治疗，或给动物共同注射叶酸-FITC(1500nmole/kg)和1.5×105IU/剂(6×)、7.5×104IU/剂(3×)、2.5×104IU/剂(1×)或和7.5×103IU(0.3×)剂量的IFN-α。另外，动物用FITC标记的匙孔
Figure BSA00000748281600231
血蓝蛋白(KLH)免疫，而不是用FITC标记的BSA免疫，并且在肿瘤细胞移植后第7、8、9、11和14天给动物注射叶酸-FITC和IFN-α。如图14所示，移植有M109细胞并用叶酸-FITC治疗的小鼠的平均存活时间当IFN-α的剂量增加至高于0.8×104IU/剂的IFN-α剂量时增加。
实施例15
二硝基苯基作为免疫原对叶酸靶向免疫疗法的影响
所述方法与实施例1中所述方法相似，只是在实施例5中所述的位置腹膜内移植所述肿瘤细胞，并且在肿瘤细胞移植后第7、8、9、11和14天动物用PBS(对照)治疗，或给动物共同注射二硝基苯基(DNP)(1500nmole/kg)、IL-2(5000IU/剂/天)和IFN-α(2.5×104单位/天)或共同注射叶酸-二硝基苯基(DNP)(1500nmole/kg)、IL-2(5000IU/剂/天)和IFN-α(2.5×104单位/天)。另外，动物用DNP标记的匙孔血蓝蛋白(KLH)免疫。如图15所示，与对照小鼠(用PBS治疗)或用DNP、IL-2和IFN-α治疗小鼠相比，用叶酸-DNP、IL-2和IFN-α治疗小鼠的平均存活时间增加。因此，DNP也是用于叶酸靶向免疫疗法中的一种有效的免疫原。
实施例16
叶酸异硫氰酸荧光素缀合物和IFN-α的协同效应
所述方法与实施例1中所述方法相似，只是在实施例5中所述的位置腹膜内移植所述肿瘤细胞，并且在肿瘤细胞移植后第7、8、9、11和14天动物用PBS(对照)、单独的IFN-α(7.5×104单位/剂)或单独的叶酸FITC(1500nmole/kg)治疗，或者给动物共同注射叶酸FITC(1500nmole/kg)和IFN-α(7.5×104单位/剂)。另外，动物(每组5只小鼠)用FITC标记的匙孔
Figure BSA00000748281600241
血蓝蛋白(KLH)免疫，而不是用FITC标记的BSA免疫。如图16所示，用PBS(对照)、IFN-α、叶酸-FITC或叶酸-FITC+IFN-α治疗组的平均存活时间分别为17天、17天、23天和33天。这些结果表明，IFN-α同IL-2一样，与叶酸-FITC协同作用，促进有肿瘤小鼠的长期存活。
实施例17
二硝基苯基作为免疫原和高浓度的细胞因子
对小鼠长期存活的影响
所述方法与实施例1中所述方法相似，只是在实施例5中所述的位置腹膜内移植所述肿瘤细胞，并且在肿瘤细胞移植后第7、8、9、11和14天动物用PBS(对照)治疗，或给动物共同注射PBS、IL-2(2.5×105单位/天)和IFN-α(7.5×104单位/天)或共同注射叶酸-二硝基苯基(DNP)(1500nmole/kg)、IL-2(2.5×105单位/天)和IFN-α(7.5×104单位/天)。另外，动物用DNP标记的匙孔
Figure BSA00000748281600242
血蓝蛋白(KLH)免疫。如图17所示，与对照小鼠(用PBS治疗)或用PBS、IL-2和IFN-α治疗小鼠相比，用叶酸-DNP、IL-2和IFN-α治疗小鼠的平均存活时间增加。用叶酸-DNP、IL-2和IFN-α(IL-2和IFN-α的浓度分别为2.5×105单位/天和7.5×104单位/天)治疗的小鼠被完全治愈。

Claims (45)

1.一种在带有致病细胞群体的宿主动物体内增强内源免疫应答介导的特异性消除所述群体的方法，其中所述细胞群体的成员具有配体可及的结合部位，所述方法包括下述步骤：给予所述宿主
一种配体-免疫原缀合物组合物，所述组合物包含所述配体和一种免疫原的复合物，其中已知所述免疫原被所述宿主体内的内源抗体或外源抗体所识别，或者已知所述免疫原直接被所述宿主体内的免疫细胞所识别；和
至少一种另外的组合物，所述组合物包含一种治疗因子，所述治疗因子选自细胞杀伤剂、肿瘤渗透增强剂、化疗药、抗微生物药、细胞毒性免疫细胞和能够刺激内源免疫应答的化合物，其中所述化合物不与所述配体-免疫原缀合物结合。
2.权利要求1的方法，其中所述致病细胞群体是一种癌细胞群体。
3.权利要求2的方法，其中所述癌细胞群体是致瘤性的。
4.权利要求1的方法，其中所述致病细胞群体是一种外源病原体或带有外源病原体的内源细胞群体。
5.权利要求4的方法，其中所述外源病原体选自细菌、真菌、病毒、支原体和寄生虫。
6.权利要求1的方法，其中所述配体是能够与细胞膜受体特异性结合的维生素。
7.权利要求6的方法，其中所述配体选自叶酸和其它叶酸受体结合配体。
8.权利要求1的方法，其中所述配体通过包括共价键、离子键或氢键的键合与所述免疫原化学上复合(complex)。
9.权利要求8的方法，其中所述配体是具有仅通过所述配体的谷氨酰γ-羧基部分与所述免疫原共价连接的一个谷氨酰部分的叶酸类似物。
10.权利要求8的方法，其中所述配体是具有仅通过所述配体的谷氨酰α-羧基部分与所述免疫原共价连接的一个谷氨酰部分的叶酸类以物。
11.权利要求9或10的方法，其中所述免疫原和所述配体之间的共价连接是与所述免疫原直接共价连接或通过一个二价接头的共价连接。
12.权利要求1的方法，其中所述配体是能够结合受体的小有机分子，并且其中所述受体在所述致病细胞群体表面优先表达、独特表达或过量表达。
13.权利要求12的方法，其中所述小有机分子是一种抗微生物药。
14.权利要求1的方法，其中所述配体是β-内酰胺抗生素。
15.权利要求1的方法，其中所述配体结合部位是一种在转移性癌细胞上优先表达、独特表达或过量表达的抗原。
16.权利要求15的方法，其中所述配体结合部位是EphA2。
17.权利要求1的方法，其中所述免疫原是分子量低于20,000道尔顿的有机分子。
18.权利要求17的方法，其中所述有机分子是荧光素或二硝基苯基。
19.权利要求1的方法，其中所述免疫原是α-半乳糖基。
20.权利要求1的方法，其中所述抗体对于所述宿主而言是外源的，并且将所述抗体与所述缀合物组合物共同给予。
21.权利要求1的方法，其中所述治疗因子包括细胞因子。
22.权利要求21的方法，其中所述治疗因子包括IL-2、IL-12、IL-15或其组合。
23.权利要求21的方法，其中所述治疗因子包括IL-2、IL-12、IL-15或其组合与IFN-α或IFN-γ的联合。
24.权利要求21的方法，其中所述治疗因子包括IL-2、IL-12、IL-15或其组合与IFN-α或IFN-γ或其组合、和GM-CSF的联合。
25.权利要求21的方法，其中所述治疗因子包括至少一种NK细胞或T细胞刺激物。
26.权利要求1的方法，其中所述配体-免疫原缀合物组合物以多次注射给予。
27.权利要求1的方法，其中所述宿主动物已经预先天然接触了所述免疫原，使得所述宿主动物通过存在针对所述免疫原的内源抗体证明、具有针对所述免疫原的现有免疫。
28.权利要求1的方法，其中所述宿主动物已经预先通过非天然过程接触了所述免疫原，导致引发所述宿主动物针对所述免疫原的免疫应答。
29.权利要求28的方法，其中导致引发所述动物免疫应答的所述非天然过程是接种疫苗。
30.权利要求28的方法，其中导致引发所述免疫应答的所述非天然过程是主动免疫。
31.权利要求1的方法，其中所述内源免疫应答包括体液免疫应答。
32.权利要求31的方法，其中所述体液应答是一种获得性免疫应答。
33.权利要求31的方法，其中所述体液应答是一种先天性免疫应答。
34.权利要求32的方法，其中所述获得性应答通过给予所述宿主动物一种疫苗组合物而被诱导。
35.权利要求1的方法，其中所述内源免疫应答包括细胞介导的免疫应答。
36.权利要求1的方法，其中所述内源免疫应答包括体液免疫应答和细胞介导的免疫应答。
37.一种在带有致病细胞群体的宿主动物体内增强内源免疫应答介导的特异性消除所述群体的方法，其中所述群体表达配体的结合部位，所述方法包括下述步骤：
给予所述宿主一种包含所述配体和一种免疫原的复合物的组合物；
给予所述宿主针对所述免疫原的抗体；和
给予所述宿主至少一种另外的治疗因子，所述治疗因子选自细胞杀伤剂、肿瘤渗透增强剂、化疗药、抗微生物药、细胞毒性免疫细胞和不与所述配体-免疫原复合物结合的内源免疫应答的刺激物。
38.一种在带有致病细胞群体的宿主动物体内增强内源免疫应答介导的特异性消除所述群体的方法，其中所述群体优先表达、独特表达或过量表达叶酸受体，所述方法包括下述步骤：给予所述宿主
一种组合物，所述组合物包含免疫原和配体的共价连接缀合物，其中已知所述免疫原被所述宿主体内的内源抗体或外源抗体所识别，或者已知所述免疫原直接被所述宿主体内的免疫细胞所识别；
所述配体包括具有谷氨酰基团的叶酸或叶酸类似物，其中与所述免疫原的共价连接仅通过所述谷氨酰基团的γ-羧基。
39.一种在带有致病细胞群体的宿主动物体内增强内源免疫应答介导的特异性消除所述群体的方法，其中所述群体优先表达、独特表达或过量表达叶酸受体的结合部位，所述方法包括下述步骤：给予所述宿主
一种组合物，所述组合物包含免疫原和配体的共价连接缀合物，其中已知所述免疫原被所述宿主体内的内源抗体或外源抗体所识别，或者已知所述免疫原直接被所述宿主体内的免疫细胞所识别；
所述配体包括具有谷氨酰基团的叶酸或叶酸类似物，其中与所述免疫原的共价连接仅通过所述谷氨酰基团的α-羧基。
40.一种在带有致病细胞群体的宿主动物体内增强内源免疫应答介导的特异性消除所述群体的方法，其中所述群体优先表达、独特表达或过量表达叶酸受体的结合部位，所述方法包括下述步骤：给予所述宿主
一种组合物，所述组合物包含：免疫原的共价连接缀合物，其中已知所述免疫原被所述宿主体内的内源抗体或外源抗体所识别，或者已知所述免疫原直接被所述宿主体内的免疫细胞所识别；
一种配体，所述配体包括具有谷氨酰基团的叶酸或叶酸类似物，其中所述共价连接仅通过所述谷氨酰基团的γ-羧基；和
至少一种另外的包含治疗因子的组合物，所述治疗因子选自细胞杀伤剂、肿瘤渗透增强剂、化疗药、抗微生物药、细胞毒性免疫细胞和能够刺激内源免疫应答的化合物，其中所述化合物不与所述配体-免疫原缀合物结合。
41.一种在带有致病细胞群体的宿主动物体内增强内源免疫应答介导的特异性消除所述群体的方法，其中所述群体优先表达、独特表达或过量表达叶酸受体，所述方法包括下述步骤：给予所述宿主
一种组合物，所述组合物包含：免疫原的共价连接缀合物，其中已知所述免疫原被所述宿主体内的内源抗体或外源抗体所识别，或者已知所述免疫原直接被所述宿主体内的免疫细胞所识别；
一种配体，所述配体包括具有谷氨酰基团的叶酸或叶酸类似物，其中所述共价连接仅通过所述谷氨酰基团的α-羧基；和
至少一种另外的包含治疗因子的组合物，所述治疗因子选自细胞杀伤剂、肿瘤渗透增强剂、化疗药、抗微生物药、细胞毒性免疫细胞和能够刺激内源免疫应答的化合物，其中所述化合物不与所述配体-免疫原缀合物结合。
42.一种药用组合物，所述药用组合物包含：治疗有效量的配体-免疫原缀合物，所述配体-免疫原缀合物能够与宿主动物体内的致病细胞群体特异性地结合，以通过获得性或先天性免疫应答、共同给予的抗体或通过所述宿主体内的免疫细胞直接特异性地消除所述细胞；一种治疗因子，所述治疗因子选自细胞杀伤剂、肿瘤渗透增强剂、化疗药、抗微生物药和能够刺激内源免疫应答的化合物，其中所述化合物不与所述配体-免疫原缀合物结合；和一种其药学上可接受的载体。
43.权利要求42的药用组合物，所述药用组合物为胃肠外缓释剂型。
44.权利要求42的药用组合物，其中所述治疗因子是一种免疫刺激物。
45.权利要求44的药用组合物，其中所述免疫刺激物包含选自以下的化合物或其组合：IL-2、IL-12、IL-15、IFN-α、IFN-γ和GM-CSF。
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