KR19980703045A - 신규 유전자 재조합체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 시토톡신을 암호화하는 DNA 서열을 함유한 재조합 인간 면역결핍 바이러스 벡터에 관한 것이다.

Description

신규 유전자 재조합체

[기술분야]

본 발명은 재조합 인간 면역결핍 바이러스 벡터 및 그것의 제조 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로는, CD4-양성 세포들에 의해 야기되는 질병의 유전자 요법에 유용한 새로운 재조합 인간 면역결핍 바이러스 벡터와 그것의 제조 방법에 관한 것이다.

[배경기술]

후천성 면역결핍 증후군(AIDS)은 인간 면역결핍 바이러스(HIV)에 의한 감염에 의해 야기되는 질병으로서, 세포성 면역이 상당히 손상되어 있으며 따라서 각종의 기회 감염, 림프종, 신경성 질환 등이 유발된다. 현단계에서 사용되는 HIV 치료약은 아지도티미딘(AZT), 디다노신(ddI), 잘시타빈(ddC) 등으로 예시되는 누클레오티드 역전사효소 억제제들이라 불리우는 약물들로서, 이들은 단독으로 혹은 배합하여 사용되고 있다. 그러나, 이들 약물들은 이미 감염된 세포들을 제거시킬 수가 없다. 게다가, 강력한 골수 억제, 소화 장애와 같은 심한 부작용, 약물-내성 바이러스의 출현 등의 심각한 문제들이 발생한다. 그러므로, 부작용이 거의 없거나 그에 대하여 내성을 지닌, 약효가 향상된 새로운 타입의 약물의 개발이 시급히 요청되어 왔다.

유전자 치료법이란 용어는 몸 속으로 도입되었던 그리고 약물로서 작용할 수가 있는 외래 유전자의 발현을 통한 완전히 새로운 질병 치료법을 가리킨다. 유전자 치료법은 유전자의 비정상성에 의해 초래된 모든 선천성 및 후천성 질병들에 대하여 효력이 있을 것으로 예상되고 있다. 특히, 유전자 치료법은 불치의 병으로서 지금까지 어떠한 치료법도 정립되지 못한 암 및 AIDS의 치료에 아주 유용할 것으로 예상되고 있다. 미국에서는, 유전 질병 [아데노신 데아미네이즈(ADA) 결핍증, 저밀도 지방단백질(LDL) 수용체 결핍증, cystic lung fibrosis 등]과 암(뇌종양, 악성 멜라노마 등)의 치료에 유전자 치료법을 적용하려는 시도가 이미 시작되었다. 근래, AIDS로 대표되는 바이러스성 감염 질환의 유전자 치료법에 대한 기초 연구가 여럿 이루어지고 있다.

약물 유전자의 사용에 의한 AIDS의 유전자 치료법 중 전망이 있는 것으로는 표면상 HIV의 복제를 촉진하는 Tat 또는 Rev를 TAR 디코이 또는 RRE 디코이 등의 RNA 디코이를 사용하여 억제시키는 방법 [설렌저(Sullenger, B.A.)등, 셀(Cell), 제 63권, 제 601 페이지(1990년)] ; HIV의 mRNA 또는 DNA를 안티센스 올리고누클레오티드와 혼성체화시키는 방법 [채터지(Chatterjee S.) 등, 사이언스, 제 258권, 제 1485페이지 (1992년)] ; HIV의 RNA를 리보자임으로써 쪼개어 주는 방법 [스티블로(Stevelo, K.M.) 등, 바이롤로지(Virology), 제 190권, 제 176페이지 (1992년)]; 그리고 HIV의 복제에 필수적으로 요구되는 단백질의 기능을 우성형질절환(transdominant) 돌연변이체로 억제시켜 주는 방법 [호프(Hope, T.J.) 등, J. Virol., 제 66권, 제 1849페이지 (1992년)] 등이 있다. 이들 치료 방식에서는 HIV의 복제 메카니즘이 교묘하게 이용되고 있으나, 거기에는 약물 유전자의 발현에 의해 HIV의 복제가능성을 억제시키는 것이 요구된다. 따라서, 더욱 효율적인 유전자 발현에 목표를 둔 프로모터들의 개발을 위한 연구가 더 요구되는 것으로 보인다.

최근에는, 독성이 없는 전구약물(prodrug)을 독성이 있는 것으로 전환시킬 수 있는 능력을 가진 효소 유전자의 도입에 관한 연구도 또한 이루어졌다. 세포내에서 인산화에 의해 트리포스페이트로 부분변형되면, 강시클로비르 [즉, 구아노신 유사체 ; 9-(1,3-디히드록시-2-프로폭시메틸) 구아닌, 이하 간단하게 GCV라고 부름] 가 통상의 핵 염기들과 비슷하게 DNA 속으로 결합된다. 그러면 세포 내에서의 그 DNA의 신장이 그후 곧바로 종결되며, 따라서 세포의 죽음을 초래한다. 트리포스페이트를 형성하기 위한 인산화에는 두 가지 종류의 효소들을 필요로 한다. 먼저, 바이러스-감염 세포에서만 배타적으로 관측되는 효소인 바이러스-유래의 티미딘 키네이즈가 GCV의 일인산화에 촉매작용을 한다. 즉, 바이러스에 감염되지 않은 세포에서는 그와 같은 인산화가 결코 일어나지 않는다. 이 GCV 모노포스페이트에, 두 개의 포스페이트기가 세포-유래의 포스포릴레이즈에 의해서 더 추가로 부가되며 따라서 GCV 트리포스페이트가 형성된다. GCV는 이러한 작용 메카니즘들에 의존하는 항바이러스제로서 잘 알려져 있다. 최근에는, 이러한 방식들이 유전자 치료의 분야에 사용되고 있다. 즉, 바이러스-유래의 티미딘 키네이즈를 암호화하는 유전자를 암세포에 도입한 다음, GCV를 사용하여, 즉, 몸으로부터 암세포를 제거하기 위한 수단으로서 GCV를 사용하여 세포의 죽음을 유도함으로써 암을 치료하려는 시도가 있었다 [슈-시아 첸(Shu-Hsia Chen) 등, 미국국립과학원회보(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 제 91권, 제 3054페이지 (1994년)].

또한, 이 치료방식을 AIDS의 유전자 치료에 적용하기 위한 시도가 이루어지고 있다. 벵카테쉬(Venkatesh, L.K.) 등은 티미닌 키네이즈 유전자를 HIV LTR의 아래쪽에 연결시켜서 이들 유전자들을 아데노바이러스의 게놈 구조에 삽입시키는 방법으로 재조합 아데노바이러스 벡터를 만들었다 [벵카테쉬 등, 미국국립과학원회보, 제 87권, 제 8746페이지 (1990년)].

한편, 목표 세포 안으로의 약물 유전자의 이동 효율은, 상기한 바의 약물 유전자의 개발과 마찬가지로, 치료 성적 개선의 중요한 인자가 된다. 높은 효율로 유전자를 이동시키기 위한 여러 가지 시도들이 이루어 졌다. 1980년의 초기에 미세주입(microinjection) 등의 물리적 방법을 사용하려는 시도가 있었으나, 극히 낮은 이동 효율이 얻어질 뿐이었으며 이로 인해 유전자들이 안정된 상태로 이동될 수가 없었다. 게다가, 그 당시에는 대규모 세포 배양의 한정된 기법으로 인해서 그와 같은 시도를 실제적으로 사용하기란 불가능하였다. 그후, 외래 유전자를 목표 세포에 효율적으로 이동시켜 주는 재조합 바이러스들(재조합 벡터들)이 개발되었는데, 이로써 처음으로 임상 목적에 유전자 치료법을 적용하는 것이 가능하게 되었다.

이하에 기술하고자 하는 바와 같이 몇 몇 종류의 바이러스 벡터들이 있다. 오늘날 유전자 치료법에 가장 흔히 사용되고 있는 바이러스 벡터는 몰로니 쥐 백혈병 바이러스(MoMLV)-유래의 레트로바이러스 벡터들이다. 즉, 이 바이러스의 증식방식을 이용하여 유전자를 이동시키는 것이다. 레트로바이러스는 호스트 세포 쪽의 수용체에 대하여 자신의 외피 단백질의 결합을 통해서 세포에 침입하는 외피를 갖는 RNA 바이러스다. 침입 후, 단일-가닥 바이러스 RNA는 역전사효소에 의해 이중-가닥 DNA로 전환되며 따라서 안정된 상태로 감염 세포의 게놈 DNA 속으로, 비록 랜덤하지만, 통합된다. 그러나, 세포들이 분열, 증식하고 있지 않는다면 통합이 달성될 수가 없다 [밀러(Miller, D.G.) 등, 분자세포생물학(Molecular and Cellular Biology), 제 10권, 제 8호, 제 4239페이지 (1990년)]. 그리하여 통합된 레트로바이러스 유전자는 프로바이러스라 불리운다. 이 프로바이러스로부터, RNA가 전사되며 따라서 바이러스 단백질들이 합성된다. 그러면 이들 단백질들과 바이러스 RNA로부터 새로운 바이러스 입자들이 형성된다. 레트로바이러스 벡터에 있어서는, 상기한 경우의 레트로바이러스 유전자가 외래 유전자와 재조합한다 [밀러(Miller, A.D.) 등, 미생물학과 면역학에 있어서의 최신지견(Current Topics in Microbiology and Immunology), 제 158권, 제 1 페이지 (1992년)]. 광범위한 호스트에 대하여 수용되고 있으므로, 이 MoMLV 벡터를 쓰면 유전자가 각종 세포들에 이동될 수 있다. 그 안정성에 대하여는, 지금까지 여러 연구가 행해졌으나 현재까지 아무런 심각한 문제점도 발생하지 않고 있다 [케네스(Kenneth, C.) Br. H. Hematol., 제 80권, 제 421페이지 (1992년)].

또한, 아데노바이러스 벡터는 유전자 전달에 사용가능한 또 다른 바이러스 벡터의 예로 언급될 수 있다. 최근에, 아데노바이러스 벡터는, 이들이 분열중이지 않은 세포내로의 유전자 전달을 가능하게 하며 약 10¹⁰수준까지 용이하게 농축될 수 있기 때문에, 가장 주목받고 있다. 최근의 연구는, 아데노바이러스 벡터를 사용함으로써, 높은 비율로 유전자가 에어웨이(airway) 상피세포, 간세포, 근육세포 등으로 체내에서 전달될 수 있음을 나타내고 있다. 반면에, 상기 아데노바이러스 벡터는 필수적으로 외부 유전자가 표적세포의 게놈 DNA 내로 끼어 들어가지 않는다는 특징을 갖고 있다. 그러므로, 표적세포를 상기 벡터로 처리한 후, 유전자 전달의 효과는 단지 수주 또는 길어야 수개월동안만 유지될 수 있다. 따라서, 유전자 전달을 반복할 필요가 있으며, 이는 환자에게 가중된 물리적 및 정신적 부담, 항-아데노바이러스 항체의 출현에 기인한 유전자 전달 효율의 저하와 같은 몇가지 문제를 야기한다.

반면에, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터는 외부 유전자가 표적세포의 게놈 DNA 내로 끼어들어가며 상기 벡터들은 발병성 또는 세포 독성을 갖지 않는다는 것을 특징으로 한다 [Kotin R.M., Hum. Gene Ther., 5, 793-901 (1994) ; Nienhuis A.W. 등, Viruses and Bone Marrow, Dekker Inc., 353-414 (1993)]. 더욱이, 바이러스 입자의 포장 및 게놈 DNA로의 유전자 함입에 필요한 그의 ITR(inverted terminal repeat)이 유전자 발현에 아무런 촉진활성을 갖지 않는다. 따라서, 상기 유전자 발현은 적절한 내부 프로모터를 세팅시킴으로써 임의로 온/오프 시키거나, 또는 조직-특이적 프로모터를 사용할 수 있다. AAV 벡터의 경우, 광범위한 숙주를 사용할 수 있으며, 이는 다양한 표적세포/질병에 상기 벡터를 사용할 수 있게 한다. 이러한 특징들에 기인하여, AAV 벡터는 신규 바이러스 벡터, 즉 MoMLV 벡터의 치환체로 기대되고 있다. 또한, 자연형의 AAV가 19번째 염색체의 일정한 부위에 끼어들어간다는 것이 밝혀졌다 [Samulski R.J. 등, EMBO J., 10, 3941-3980 (1991)]. 따라서, AAV 벡터는 유전자 함입부위를 겨냥할 수 있는 벡터로서 대중의 관심을 불러일으키고 있다.

상기 기재된 MoMLV 벡터, 아데노바이러스 벡터 및 AAV 벡터는 공통의 특징, 즉, 숙주 특이성이 없다는 것을 특징으로 한다. 이러한 특징은 체내에서 다수의 세포가 상기 바이러스 벡터로 처리될 수 있음을 의미한다. 즉, 상기 바이러스 벡터의 사용은 다양한 질병의 치료에 기여할 것이다.

상기 기재된 바와 같이, 이러한 바이러스 벡터들은 숙주 특이성이 없는 특징을 갖지만, 반면에, 이러한 특징이 상기 바이러스가 살아있는 생물체로 투여되는 것을 어렵게 만든다. 실제 치료에 상기 바이러스 벡터를 사용할 때, 그의 투여에는 다양한 방법이 요구된다. 공지된 간세포 처리법은 처리될 세포를 몸으로부터 끄집어 내고, 유전자 전달을 완료한 후, 상기 세포를 다시 몸안으로 되돌리는 것 [엑스 비보(ex vivo) 유전자 전달]으로 구성된다. 기관 또는 조직의 안에 박혀있는 세포의 경우, 처리될 기관 또는 조직내에 바이러스 벡터가 국부적으로 투여된다. 전자의 경우, 특별한 장비가 요구되며, 이는 처리가 수행될 수 있는 시설을 제한하게 된다. 반면에, 후자의 경우는 국부적 투여를 위한 몇몇 경우에 외과적 수술이 수행되어야 한다는 문제를 갖는다. 특히, 세포의 사멸을 야기함으로써 치료되는 질병의 경우, 안정성의 관점에서, 유전자가 표적세포내로 배타적으로 전달되는 것이 필수적으로 요구되어진다. 상기 언급된 벡터들은 이러한 요구사항을 만족시키지 못한다.

AIDS 용 유전자요법에서는, CD4-양성 T 임파구가 표적세포이다. 근년에, AIDS용 유전자요법을 목적으로 하는 다수의 약물 유전자가 개발되었다. 따라서, 상기 특정 유전자가 CD4-양성 T 임파구에 효과적으로 또한 특이적으로 전달될 수 있는 시스템을 개발할 것이 시급히 요구되고 있다. 특히, 세포의 사멸을 야기할 수 있는 유전자의 도입을 통하여 AIDS를 치료하려는 시도에서는, 안정성의 관점에서, 상기 유전자가 CD4-양성 T 임파구에 배타적으로 전달되어야만 한다. 그러나, 이제까지 임상적으로 사용되어왔던 바이러스 벡터들(즉, MoMLV 벡터, 아데노바이러스 벡터, AAV 벡터 등)은 상기 논의된 바와 같이 조직-특이성이 없으며, 따라서 상기 요구조건을 만족시키지 못한다.

도 1 은 재조합 플라스미드 HXTKN의 구조를 보여주는 모형도다.

도 2 는 헬퍼 플라스미드 CGPE (-)의 구조를 보여주는 모형도다.

도 3 은 벡터 플라스미드 HXN의 구조를 보여주는 모형도다.

도 4 는 재조합 바이러스를 사용하여 유전자 이동에 의해 얻어진 G418-내성 콜로니들을 보여주는 도식(생물체의 형태를 보여주는 사진)이다.

도 5 는 게놈 DNA를 Xho I으로 처리하는 소화 후에 실행된 서던 블로팅의 결과를 보여주는 도식(전기영동 패턴)이다.

도 6 은 게놈 DNA를 Sca I으로 처리하는 소화 후에 실행된 서던 블로팅의 결과를 보여주는 도식(전기영동 패턴)이다.

도 7 은 Tat를 암호화하는 플라스미드 BTA/LA의 구조를 보여주는 모형도다.

도 8 은 Tat-의존성 RNA 발현을 나타내는 노던 블로팅의 결과를 보여주는 도식(전기영동 패턴)이다.

[본 발명을 수행하기 위한 가장 좋은 방식]

본 발명에서 사용되는 바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스 벡터이다. 인간 면역결핍 바이러스(HIV)는 특이적으로 인간 CD4-양성 T 림프구를 감염시키는 것으로 공지되어 있다. 이는 HIV의 엔벨로프 단백질 gp120이 감염시 CD4-양성 T 림프구의 표면에 위치하는 CD4 단백질에 특이적으로 결합하기 때문이다. 이러한 HIV의 특이적 감염 시스템이 본 발명의 바이러스 벡터에 이용된다 [Shimada T., et al., J. Clin. Invest., 88 1043 (1991)].

본 발명의 재조합 인간 면역결핍 바이러스 벡터는 세포독소를 코드하는 DNA 서열을 HIV 벡터에 조립시키므로써 제조된다. 용어 세포독소(cytotoxin)는 세포에 있어서 세포독성 유전자로서 작용하는 물질을 의미한다. 그의 예로는 무독성 약물 전구체를 세포독성을 갖는 물질로 전환시킬 수 있는 효소 유전자(예를 들어, GCV의 단일인산화를 촉매시켜 세포사(細胞死)를 유발하는 티미딘 키나제) 및 직접적으로 세포를 손상시키는 각종 독소의 유전자(예를 들어, 디프테리아 독소, 파상풍 독소, 콜레라 독소)가 포함된다. 세포독소로서 이용되는 효소 유전자로서는, 티미딘 키나제가 바람직하고, 더욱 바람직하게는 인간 단순 포진 바이러스(herpes simplex virus)에서 유래되는 티미딘 키나제이다. 독소로서, 디프테리아 독소를 사용하는 것도 바람직할 수 있다.

본 발명의 세포독소는 분자 생물학 분야에서 널리 공지된 유전자 재조합 기술을 사용하여 HIV 벡터에 조립될 수 있다.

바람직한 구현예에 있어서, 본 발명의 재조합 인간 면역결핍 바이러스 벡터는 세포독소를 코드하는 DNA 서열의 상류에 내부 프로모터가 존재하지 않으므로써 상기 유전자가 HIV LTR에 의해서만 유도되도록 구축될 수 있다. 그러므로, 유전자는 HIV에서 유래된 Tat 단백질의 존재하에서만 발현을 수행한다. 유전자가 HIV가 감염되지 않은 CD4-양성 T 림프구로 전이된다 해도, 결과적으로 유전자가 발현되지 않으므로 세포사는 그에 의해 유도되지 않는다. 상기 구현예에 있어서, HIV-감염 세포는 선택적으로 손상될 수 있으므로, 고특이적 처리가 그에 의해 이루어질 수 있다는 것이 예상될 수 있다.

본 발명에 있어서, 특이적 유전자 전이를 위한 바람직한 바이러스 벡터는, 예를 들어, 하기 방법으로 제조될 수 있다.

본 발명의 바이러스 벡터는 COS 세포를 도 2 에 나타낸 헬퍼 플라스미드(즉, 5'-말단으로부터 3'-말단으로 향하여, 사이토메갈로바이러스 프로모터, HIV의 gag, pol 및 env를 코드하고 임의 포장 시그날이 결여된 유전자, 헤페스 바이러스에서 유래된 티미딘 키나제의 프로모터, 및 네오마이신 내성 유전자를 연속적으로 함유하고, 앰피실린 내성 유전자 및 SV40의 복제 오리진을 함유하는 플라스미드 벡터로 삽입되는 플라스미드), 및 도 1에 나타낸 벡터 플라스미드(즉, 세포를 손상시키기 위한 유전자, 헤페스 바이러스에서 유래된 티미딘 키나제 프로모터 및 네오마이신 내성 유전자가 5'-말단으로부터 3'-말단 방향으로 연속적으로 삽입되는 그 사이에 긴 말단 반복체(LTRs)를 가지며, 앰피실린 내성 유전자 및 SV40의 복제 오리진을 함유하는 플라스미드 벡터로 삽입되는 플라스미드)로 코트랜스펙션시키므로써 수득될 수 있다.

상기 수득된 본 발명의 HIV 벡터는 인간 CD4-양성 T 림프구로 특이적 전이될 수 있을 뿐만 아니라 선택적으로 HIV-감염 세포만을 손상시킬 수 있다. HIV LTR에 의해 유래되기 때문에, 본 발명의 세포독성 유전자는 HIV에서 유래되는 Tat 단백질의 존재하에서만 발현된다. 유전자가 HIV로 감염되지 않은 CD4-양성 T 림프구로 전이된다 해도, 그에 의해 세포사는 유발되지 않는다. 상기 HIV 벡터를 이용하는 유전자 전이 방법을 사용함으로써, 외부 유전자가 안정한 상태의 게놈 DNA로 조립된다. 세포 분열후, 딸 세포는 상기 조립된 유전자를 계승한다. 즉, 상기 방법은 감염의 예방에 있어서 상당히 유용하다. 다시 말하자면, 본 발명의 HIV 벡터는 표면상으로는 통상적인 MoMLV, 아데노바이러스 및 AAV 벡터의 각종 불편함을 해결할 수 있는 매우 넓은 이용 범위를 갖는 유전자 요법을 위한 벡터이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

먼저, 본 발명의 합성 석영 유리분말은 졸-겔법으로 수득되는 것이다. 여기에 석영 유리분말을 사용하면, 성형체를 얻을 수가 있고, 이 혼합물에 멸균 정제수 및 염화칼슘 수용액을 첨가하여 그 총 부피를 0.5ml로 맞추어 주었다. 그 결과로서 얻어지는 혼합액을 0.5ml의 HBSP 완충액에 적하하면서 흔들어 주었고 실온에서 30분간 그대로 두어 플라스미드/인산칼슘 공(共)침전물을 얻었다. 이 공침전물을 융합상태(confluence) 약 70%정도까지 이르도록 배양 접시(9cm)에서 배양시켰던 COS 세포의 배양 배지에 첨가하였다. CO₂배양기에서 4시간의 배양 후, 이 배양 배지를 새로운 것으로 바꾸어 주었으며 2일간 더 계속 배양하여 이렇게 해서 얻어지는 성형체는 용융시에 발포가 적고 고품질이다.

본 발명은, 상기한 상황하에서 이루어졌던 것으로서, 세포에 직접 또는 간접적으로 손상을 가할 수 있는 유전자를 CD4-양성 T 림프구 속으로 효율적이면서도 특이적으로 이동시킬 수 있는 방식을 제공함을 목표로 한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 광범한 연구를 수행하였으며, 그 결과, 인간 면역결핍 바이러스 벡터를 사용하면 세포독성 유전자를 CD4-양성 세포 속으로 효율적이면서도 특이적으로 이동시킬 수 있으며 그리하여 이동된 유전자를 HIV-감염 세포에서 배타적으로 발현시킬 수 있음을 알아 내어, 따라서 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 시토톡신을 암호화하는 DNA 서열을 함유한 재조합 인간 면역결핍 바이러스 벡터를 제공한다.

본 발명을 더욱 상세하게 구체적으로 더 설명하기 위한 목적에서, (한정하기 위한 것은 아님), 다음의 실시예들을 주고자 한다.

실시예 1 : 플라스미드의 구성

모든 플라스미드들은 본 발명분야에서 통상적으로 이용되는 유전자 공학 기법들에 의해서 만들어졌다. 도 1 에 나타낸 바와 같이, 5'-말단으로부터 3'-말단쪽으로, HIV LTR, 인간 허피즈 심플렉스 바이러스 유래의 티미딘 키네이즈 유전자(tk), 인간 허피즈 심플렉스 바이러스 유래의 티미딘 키네이즈 유전자의 프로모터(TK), 네오마이신 내성 유전자(neo) 및 HIV LTR을 연속적으로 가진 플라스미드를 SV40의 복제 원점을 갖고 있는 플라스미드 벡터에 삽입함으로써 재조합 플라스미드 HXTKN이 만들어졌다 [시마다(Shimada T.) 등, J. Clin. Invest., 제 88권, 제 1043 페이지 (1991년)].

실시예 2 : 재조합 바이러스의 제조

상기 실시예 1에서 얻어진 HXTKN 10 ㎍을 헬퍼 플라스미드 CGPE(-) (도 2 에 나타낸 바와 같이, HIV 게놈 서열 중의 gag, pol 및 env 유전자들을 함유하는 유전자군의 위쪽에 사이토메갈로바이러스 프로모터가 있고 패키징 시그널은 없는 유전자 구성이 암피실린 내성 유전자와 SV40의 복제 원점을 함유하고 있는 발현 벡터 속에 삽입된 것임) 10㎍과 혼합하였다. 다음에는, 이 혼합물에 멸균 정제수 및 염화칼슘 수용액을 첨가하여 그 총 부피를 0.5ml로 맞추어 주었다. 그 결과로서 얻어지는 혼합액을 0.5ml의 HBSP 완충액에 적하하면서 흔들어 주었고 실온에서 30분간 그대로 두어 플라스미드/인산칼슘 공(共)침전물을 얻었다. 이 공침전물을 융합상태(confluence) 약 70% 정도까지 이르도록 배양 접시(9cm)에서 배양시켰던 COS 세포의 배양 배지에 첨가하였다. CO₂배양기에서 4시간의 배양 후, 이 배양 배지를 새로운 것으로 바꾸어 주었으며 2일간 더 계속 배양하였다. 그리하여 얻어진 배양 상청액을 바이러스 용액이라 불렀다. 음석 대조표준으로서, 10㎍의 CGPE(-) 만으로 형질감염(transfection)시킨 그룹을 사용하여 바이러스 용액을 준비하였다. 양성 대조표준으로서, 10㎍의 벡터 플라스미드 HXN (도 3) [시마다 등, J. Clin. Invest., 제 88권, 제 1043 페이지 (1991년)]과 10㎍의 CGPE(-)로 공(共)형질감염시킨 그룹을 사용하여 바이러스 용액을 준비하였다.

실시예 3 : 재조합 바이러스에 의한 세포의 형질도입(transduction) 및 약물-내성 균주의 클로닝

CD4-양성 HeLa 세포를 배양 접시 (60mm) 하나당 2 × 10⁵의 밀도로 접종하여 밤새 배양시켰다. 거기에 실시예 2에서 얻어진 각 바이러스 용액 3ml을 폴리브렌 30㎍과 함께 첨가하였다 (형질도입). CO₂배양기에서 2일간 그대로 둔 후, 트립신/EDTA 혼합액을 사용하여 그 접시로부터 세포들을 떼어 내어 다른 하나의 배양 접시 (90mm)에 다시 접종시켰다. CO₂배양기에서 6시간 배양 후, 배양 배지 1ml당 750㎍의 농도가 되도록 G-418을 첨가하였다. 10일 더 배양한 후, 최종 농도가 1ml당 1,000㎍이 되도록 그 배양 배지에 G-418, 즉, 네오마이신의 한 유사체를 첨가하였다. 10일 더 배양한 후, G-418에 대한 내성을 획득한 콜로니들이 얻어졌다. 이들 콜로니들은 크리스탈 바이올렛(Crystal Violet)으로 염색되었다. 도 4 는 이 결과를 보여준다. 음성 대조표준 그룹에서는, 어떠한 재조합 바이러스 벡터도 형성되지 않았으며 따라서 세포들은 모두 절멸(絶滅)되었다. 이와는 대조적이게도, CGPE(-)와 HXN으로 공형질감염시킨 그룹 및 CGPE(-)와 HXTKN으로 공형질감염시킨 그룹에서는, 다수의 약물-내성 콜로니들이 관찰되었다. 이들 두 그룹들은 콜로니들의 갯수에 있어 서로 거의 비슷하였다. 이러한 결과들은 tk 유전자가 재조합 HIV 벡터의 게놈 DNA 속에 삽입된다고 해서 재조합 HIV 벡터의 타이터가 감소되는 것은 아니며 세포 속으로 이동된 tk 유전자는 어떠한 세포독성도 보여주지 아니함을 나타낸다. 트립신-EDTA 혼합액을 사용하여 그 배양 접시로부터 콜로니 몇 개를 떼어내어 각각을 이후의 분석을 위해 다른 배양 접시에 접종시켰다.

실시예 4 : 형질도입된 CD4-양성 HeLa 세포의 게놈 DNA의 추출 및 유전자 이동의 서던(Southern) 블로팅에 의한 확인

배양 접시(90mm)에서 융합상태에 도달한 세포들은 트립신-EDTA 혼합액의 처리에 의해 그 접시로부터 세포들을 떼어 내고 거기에 표면활성제를 첨가하여 세포용해시켰다. 프로테이네이즈 K를 첨가하여 최종 농도가 200㎍/ml이 되게한 후, 37℃에서 3시간 배양을 수행하였다. 페놀/클로로포름 추출에 의해 단백질을 제거한 후, 잔류물을 트리스/EDTA 완충액에 대하여 투석시켰다. 다음에는, 염화 소듐(최종 농도 : 0.2M), RNase A(최종 농도 : 100㎍/ml) 및 프로테이네이즈 A(최종 농도 : 100㎍/ml)를 첨가하고 37℃에서 3시간 배양을 수행하였다. 페놀/클로로포름에 의한 추출 후, 그 배양액을 다시 트리스/EDTA 완충액에 대하여 투석시켰다. 2일 후, 투석이 완료되어 게놈 DNA가 얻어졌다.

서던 블로팅은 통상의 방식으로 실행되었다. 게놈 DNA 10㎍을 제한 효소 XhoI 또는 ScaI으로 소화시켰다. 음성 대조표준 그룹으로서, 재조합 바이러스로 처리하지 않은 CD4-양성 HeLa 세포를 동일한 절차를 거치게 하였다. 탐식자로서,³²P로 표지시킨 네오 유전자(600bp)를 사용하였다. 도 5 와 도 6 은 그 결과들을 보여준 것이다. 클론은 G-418에 대한 내성을 획득한 단일 균주를 의미하고, 벌크는 50 클론들의 혼합물을 의미한다. XhoI으로 소화시킨 그룹에서는, 3.6kb에서 방사능이 관찰되었는데, 이는 재조합 유전자가 어떠한 재배열도 일으키는 일 없이 본 발명의 재조합 바이러스 벡터에 의해서 게놈 DNA 속으로 삽입되었다는 것을 증명한다.

실시예 5 : Tat-의존성 RNA 발현의 확인

실시예 3에서 얻어진 세포 균주(클론)를 인산칼슘법에 의해 (도 7에 나타낸) Tat를 암호화하는 플라스미드 BTAT/LH 10㎍으로 형질감염시켰다. 음성 대조표준 그룹으로서, 재조합 바이러스로 처리하지 않은 CD4H 세포들도 또한 똑같은 방식으로 형질감염시켰다. CO₂배양기에서 2일간 그대로 두게 한 후, 배양 접시로부터 세포들을 떼어 내고 구아니딘 이소티오시아네이트를 함유하는 세포 용해용액으로 처리하였다. 그 다음에는 그로부터 염화세슘 기울기 원심분리법에 의해 단백질 및 DNA를 제거시켰으며, 그 결과, RNA만이 분리되었다. 전기영동 후, 노던(Northern) 블로팅을 통상의 방식으로 수행하였다. 탐식자로서,³²P로 표지시킨 tk 유전자(600bp)를 사용하였다. 도 8 이 보여주는 바와 같이, 음성 대조표준 그룹과 BTAT/LH로 형질감염시키지 않은 클론에서는 tk 유전자의 발현이 전혀 관찰되지 않았다. 이와는 대조적이게도, BTAT/LH로 형질감염시킨 클론에서는 Tat 의존성의 RNA가 발현되었다.

Claims (4)

1. 시토톡신을 암호화하는 DNA 서열을 함유한 재조합 인간 면역결핍 바이러스 벡터.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 시토톡신은 티미딘 키네이즈임을 특징으로 하는 재조합 인간 면역결핍 바이러스 벡터.
3. 제 1 항에 있어서, 시토톡신을 암호화하는 DNA 서열의 위쪽에 어떠한 내부 프로모터로 존재하지 않으며 상기 유전자는 HIV LTR에 의해서 배타적으로 조종됨을 특징으로 하는 재조합 인간 면역결핍 바이러스 벡터.
4. 제 1 항에 있어서, 시토톡신을 암호화하는 DNA 서열을 조종하는 내부 프로모터가 소재함을 특징으로 하는 재조합 인간 면역결핍 바이러스 벡터.