ES2345885T3 - Metodos para prevenir y tratar metastasis de cancer y perdida de hueso asociada con la metastasis de cancer. - Google Patents
Metodos para prevenir y tratar metastasis de cancer y perdida de hueso asociada con la metastasis de cancer. Download PDFInfo
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Abstract
Un anticuerpo antagonista no murina que enlaza a M-CSF, para uso en prevención o tratamiento de metástasis ósea en un sujeto afligido con cáncer metastático.
Description
Métodos para prevenir y tratar metástasis de
cáncer y pérdida de hueso asociada con la metástasis de cáncer.
Está invención se relaciona con métodos para
prevenir y tratar metástasis de cáncer y pérdida de hueso asociada
con la metástasis de cáncer administrando una antagonista de
M-CSF a un sujeto.
La metástasis de cáncer es la causa primaria de
la recurrencia post-operatoria y
post-terapéutica en pacientes de cáncer. A pesar de
los intensos esfuerzos para desarrollar tratamientos, la
metástasis del cáncer sigue siendo sustancialmente refractaria a la
terapia. El hueso es uno de los sitios más comunes de metástasis
de varios tipos de cánceres humanos (por ejemplo de seno, pulmones,
próstata y tiroides). La presencia de metástasis ósea osteolítica
produce seria morbilidad debido al dolor intratable, a alta
susceptibilidad a la fractura, compresión de nervios e
hipercalcemia. A pesar de la importancia de estos problemas
críticos, hay pocos tratamientos disponibles para la pérdida de
hueso asociada con metástasis de cáncer.
Los osteoclastos median la readsorción ósea. Los
osteoclastos son células multinucleadas diferenciadas de las
células hemopoyéticas. Se acepta en general que los osteoclastos se
forman mediante la fusión de precursores mononucleares derivados de
células madre hemopoyéticas en la médula ósea, en vez de por
divisiones celulares incompletas (Chambers, Bone and Mineral
Research, 6: 1-25, 1989; Göthling et al.,
Clin Orthop Relat R. 120: 201-228, 1976; Kahn et
al., Nature 258: 325-327, 1975, Suda et
al., Endocr Rev 13: 66-80, 1992; Walker, Science
180: 875. 1973; Walker, Science 190: 785-787, 1975;
Walker, Science 190: 784-785, 1975). Comparten una
célula madre común con una línea celular
monocito-macrófago (Ash et al., Nature 283:
669-670, 1980, Kerby et al., J. Bone Miner
Res 7: 353-62, 1992). La diferenciación de los
precursores de osteoclastos en osteoclastos multinucleados maduros
requiere diferentes factores que incluyen estímulos hormonales y
locales (Athanasou et al., Bone Miner 3:
317-333, 1988; Feldman et al., Endocrinology
107: 1137-1143, 1980; Walker, Science 190:
784-785, 1975; Zheng et al., Histochem J 23:
180-188, 1991) y se ha demostrado que los huesos
vivos y las células jugar un papel crítico en el desarrollo de los
osteoclastos (Hagenaars et al., Bone Miner 6:
179-189, 1989). Las células osteoblásticas o
estromales de la médula ósea también son requeridas para la
diferenciación de los osteoclastos. Uno de los factores producidos
por estas células que soporta la formación de osteoclastos es un
factor estimulador de la colonia de macrófagos,
M-CSF (Wiktor-Jedrzejczak et
al., Proc Natl Acad Sci USA 87: 4828-4832,
1990; Yoshida et al., Nature 345: 442-444,
1990). El activador del receptor para el ligando
NF-\kappaB (RANKL, también conocida como TRANCE,
ODF y OPGL) es otra señal (Suda et al., Endocr Rev 13:
66-80, 1992) a través de la cual las células
osteoblásticas/estromales estimulan la formación de osteoclastos y
la resorción a través de un receptor, RANK (TRANCER), localizado
sobre los osteoclastos y precursores de los osteoclastos (Lacey
et al., Cell 93: 165-176, 1998; Tsuda et
al., Biochem Biophys Res Co 234: 137-142, 1997;
Wong et al., J Exp Med 186: 2075-2080, 1997;
Wong et al., J Biol. Chem 272: 25190-25194,
1997; Yasuda et al., Endocrinology 139:
1329-1337, 1998; Yasuda et al., Proc Natl
Acad Sci US 95: 3597-3602, 1998). Los osteoblastos
también secretan una proteína que inhibe fuertemente la formación de
osteoclastos llamada osteoprotegerina (OPG, también conocida como
OCIF), la cual actúa como un receptor de descodificación para el
RANKL midiendo así la señal positiva entre los osteoclastos y los
osteoblastos a través de RANK y RANKL.
Shioi A. et al., (Calcified Tissue
International, 1994, 55: 387-394) describe un método
mediante el cual los osteoclastos de murina generados en cultivo,
pueden ser enriquecidos de manera efectiva a la vez que mantienen
su viabilidad, y explora los mecanismos mediante los cuales las
células estromales promueven la generación de osteoclastos de
murina y su supervivencia.
Neales S D et al., (Journal of
Orthopaedic Research, the Journal of Bone and Joint Surgery, Inc.,
US, 1999, 17: 686-694) describe un estudio que
identifica que un anticuerpo
anti-M-CSF inhibe la formación de
osteoclastos y la resorción de hueso in vitro.
Los osteoclastos son responsables por la
disolución tanto de la matriz mineral como orgánica del hueso (Blair
et al., J Cell Biol 102: 1164-1172, 1986).
Los osteoclastos representan células diferenciadas de forma terminal
que expresan una morfología polarizada única con áreas de membrana
especializadas y varios marcadores de membrana y citoplásmicos,
tales como fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP) (Anderson
et al., 1979), anhidrasa carbónica II (Väänänen et
al., Histochemistry 78: 481-485, 1983), receptor
de calcitonina (Warshafsky et al., Bone 6:
179-185, 1985) y receptor de vitronictina (Davies
et al., J Cell Biol 109: 1817-1826, 1989).
Los osteoclastos multinucleados contienen usualmente menos de 10
núcleos, pero pueden contener hasta 100 núcleos de entre 10 y 100
\mum de diámetro (Göthling et al., Clin Orthop Relat R 120:
201-228, 1976). Esto los hace relativamente fáciles
de identificar por microscopia de luz. Están altamente vacuolados
cuando están en estado activo, y también contienen muchas
mitocondrias, indicativas de una alta rata metabólica (Mundy, in
Primer on the metabolic bone diseases and disorders of mineral
metabolism, paginas 18-22, 1990). Puesto que los
osteoclastos juegan un papel principal en la metástasis osteolítica
de los huesos, hay necesidad en la técnica para
\hbox{nuevos
agentes y métodos para prevenir la estimulación de los
osteoclastos.}
Así, se mantiene una necesidad en la técnica
para identificar nuevos agentes y métodos para prevenir o tratar la
metástasis de cáncer, incluyendo la metástasis ósea osteolítica.
Las composiciones y métodos de la presente
invención satisfacen las necesidades antes mencionadas y otras
necesidades relacionadas en la técnica. En una realización de la
invención se provee un anticuerpo antagonista no murinico que se
enlaza al M-CSF, para su uso en la prevención o
tratamiento de metástasis de hueso en un sujeto afligido con cáncer
metastático.
En otra realización de la invención se
proporciona el uso de un anticuerpo antagonista no murinico que se
enlaza al M-CSF y un segundo agente terapéutico en
la manufactura de un medicamento para prevenir o tratar la
metástasis de hueso en un sujeto afligido con un cáncer
metastático.
En otra realización de la invención se
proporciona el uso de un anticuerpo antagonista no murinico que se
enlaza al M-CSF en la preparación de un medicamento
para prevenir o tratar metástasis en un sujeto afligido con un
cáncer metastático, donde el medicamento se administra de forma
simultánea, separada o secuencial con un agente terapéutico para el
cáncer.
Se describe un método para prevenir la
metástasis ósea que comprende administrara a un sujeto afligido con
cáncer metastático una cantidad terapéuticamente efectiva del
antagonista de M-CSF, previniendo con ello la
pérdida de hueso asociada con el cáncer metastático. Se describe un
método para tratar un sujeto afligido con un cáncer metastático al
hueso, comprendiendo la administración a dicho sujeto de una
cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista
M-CSF, reduciendo mediante ello la severidad de la
pérdida ósea asociada con el cáncer metastático. Los métodos antes
mencionados se describen cuando el sujeto es un mamífero o cuando el
mamífero es un
humano.
humano.
Se contempla que los métodos alcanzan su
potencial terapéutico inhibiendo la interacción entre el
M-CSF y su receptor (M-CSFR). Se
contempla adicionalmente que la inhibición de la interacción
M-CSF/M-CSFR inhibe la
proliferación de osteoclastos y/o la diferenciación inducida por las
células tumorales. El antagonista M-CSF de los
métodos antes mencionados puede seleccionarse del grupo consistente
de: un polipéptido que comprende un anticuerpo
anti-M-CSF, un polipéptido que
contiene un anticuerpo anti-M-CSFR
del mismo; un polipéptido soluble que comprende una muteina de
M-CSF o un derivado de la misma; o un polipéptido
soluble que comprende una muteina de M-CSFR o un
derivado de la misma.
El método antes mencionado se provee cuando el
antagonista de M-CSF puede ser un anticuerpo
anti-M-CSF. El antagonista
M-CSF puede ser un polipéptido que comprende un
anticuerpo anti-M-CSFR.
El antagonista de M-CSF puede
ser un polipéptido que comprende una muteina de
M-CSF o un derivado de la misma. El antagonista de
M-CSF puede ser un polipéptido soluble que comprende
una muteina de M-CSFR o un derivado de la
misma.
El antagonista de M-CSF puede
ser un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de: un
anticuerpo policlonal; un anticuerpo monoclonal; un anticuerpo
humanizado; un anticuerpo humano; un anticuerpo quimérico; Fab,
F(ab')2 o Fv como fragmento de anticuerpos; y una muteina de
cualquiera de los anticuerpo antes mencionados. El anticuerpo puede
enlazarse al mismo epítope como anticuerpo monoclonal 5H4 (ATCC
Accession No. HB 10027).
Un cierto número de canceres metastaticos se
contemplan como abordables por los métodos aquí descritos. En una
realización, el cáncer metastático es de seno, pulmón, renal,
mieloma múltiple, tiroides, próstata, adenocarcinoma, cáncer
maligno de células sanguíneas, incluyendo leucemia y linfoma,
cánceres de cabeza y cuello, cánceres gastrointestinales,
incluyendo cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer colon rectal,
cáncer pancreático, cáncer de hígado; enfermedades malignas del
tracto genital femenino, incluyendo carcinoma ovárico, cánceres
endometriales uterinos y cáncer cervical; cáncer de la vesícula;
cáncer cerebral, incluyendo neuroblastomas; sarcoma, osteosarcoma;
y cáncer de la piel, incluyendo melanoma maligno o cáncer de células
escamosas.
La administración de una dosis efectiva
terapéuticamente de un antagonista de M-CSF también
se contempla mediante la invención presente. En una realización, el
antagonista M-CSF es un anticuerpo administrado a
una dosis entre aproximadamente 0.01 mg/kg y aproximadamente 100
mg/kg.
En otra realización de la invención, se
proporciona un anticuerpo no murinico que se enlaza al
M-CSF para tratar un sujeto afligido con un cáncer
metastático, donde dicho anticuerpo efectivamente reduce la
severidad de la pérdida ósea asociada con el cáncer
metastático.
Como se describe aquí, los anticuerpos pueden
inhibir la osteólisis. En una realización de la invención, se
proporciona un anticuerpo monoclonal no murinico que específicamente
se enlaza al mismo epítope del M-CSF como 5H4. En
otra realización, se provee un anticuerpo monoclonal no murinico que
compite con 5H4 para enlazarse a M-CSF.
Preferiblemente, el anticuerpo monoclonal no murinico compite con
5H4 para enlazarse a M-CSF por más de 10%, más
preferiblemente más de 25%, aún más preferiblemente más de 50%, aún
más preferiblemente más de 75% y lo más preferiblemente más de
90%.
\newpage
Se contempla que cualquiera de los anticuerpos
antes mencionados puede utilizarse para ser administrado a un
sujeto que requiere del mismo. De acuerdo con lo anterior, se
describe una composición farmacéutica que comprende uno cualquiera
de los anticuerpos antes mencionados y un vehículo, excipiente o
diluyente farmacéuticamente aceptable.
Un anticuerpo no murinico para tratar un sujeto
afligido con un cáncer metastático se provee en una realización de
la invención, donde el anticuerpo reduce efectivamente la severidad
de la pérdida ósea asociada con el cáncer metastático. En una
realización relacionada, el anticuerpo antes mencionado se
selecciona del grupo consistente de: un anticuerpo policlonal; un
anticuerpo monoclonal; un anticuerpo humanizado; un anticuerpo
humano; un anticuerpo quimérico; Fab, F(ab')2 o Fv como
fragmento de anticuerpos; y una muteina de uno cualquiera de los
anticuerpos antes mencionados. En otra realización, el anticuerpo es
específico para el M-CSF. En aún otra realización
de la invención, el anticuerpo es específico para
M-CSFR. En otras realizaciones, el anticuerpo es un
anticuerpo completamente humano o un anticuerpo humanizado. En aún
otra realización de la invención se proporciona un hibridoma que
secreta un anticuerpo antes mencionado.
Se contemplan como abordables un buen número de
cánceres metastaticos frente a los anticuerpos aquí descritos. En
una realización, el cáncer metastático es de seno, pulmón, renal,
mieloma múltiple, tiroides, próstata, adenocarcinoma, enfermedad
maligna de las células sanguíneas, incluyendo leucemia y linfoma;
cánceres de cabeza y cuello; cánceres gastrointestinales,
incluyendo cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer colon rectal,
cáncer pancreático, cáncer de hígado; enfermedades malignas del
tracto genital femenino, incluyendo carcinoma ovárico, cánceres
endometriales uterino y cáncer cervical; cáncer de vesícula; cáncer
de cerebro, incluyendo neuroblastoma; sarcoma, osteosarcoma; y
cáncer de piel, incluyendo melanoma maligno o cáncer de células
escamosas. En una realización relacionada, se provee una
composición farmacéutica que comprende un anticuerpo antes
mencionado y un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente
adecuado.
Los antagonistas de M-CSF
potencialmente útiles en la prevención o tratamiento de la pérdida
de hueso asociada con la metástasis de cáncer pueden ser
seleccionados utilizando diversos ensayos.
Se describe un método para seleccionar un
antagonista de M-CSF que comprende las etapas de
poner en contacto un medio de células tumorales metastáticas,
osteoclastos y un antagonista candidato; detectar la formación,
proliferación y/o diferenciación de osteoclastos; e identificar
dicho antagonista candidato como un antagonista de
M-CSF si se detecta una disminución en la formación,
proliferación y/o de osteoclastos. Se describe un método de
selección donde el medio de células de tumor metastático incluye
células tumorales.
Se describe un método donde la etapa de contacto
ocurre in vivo, la etapa de detección comprende detectar el
tamaño y/o número de metástasis óseas y el antagonista candidato es
identificado como un antagonista M-CSF si se
detecta un descenso en el tamaño y/o número de las metástasis óseas.
El método puede comprender adicionalmente la etapa de determinar si
dicho antagonista candidato se enlaza al M-CSF. El
método puede comprender adicionalmente la etapa de determinar si
dicho candidato antagonista inhibe la interacción entre
M-CSF y su receptor
M-CSFR.
M-CSFR.
Se contempla que un cierto número de diferentes
antagonistas pueden ser identificados utilizando los métodos de
selección descritos aquí. Se describe un método donde el antagonista
candidato es seleccionado del grupo que consiste de: un polipéptido
que comprende un anticuerpo
anti-M-CSF; un polipéptido que
comprende un anticuerpo anti-M-CSFR
del mismo; un polipéptido soluble que comprende una muteina de
M-CSF o un derivado de la misma; un polipéptido
soluble que comprende una muteina M-CSFR o un
derivado de la misma; un péptido; o una molécula pequeña. Se
describe un método donde dicho candidato antagonista es una muteina
M-CSF. Se describe un método donde dicho candidato
antagonista es un anticuerpo de
anti-M-CSF. El candidato antagonista
puede ser una muteina M-CSF. El candidato
antagonista puede ser un anticuerpo
anti-M-CSF. El candidato antagonista
puede ser un anticuerpo
anti-M-CSFR.
Un método para identificar un antagonista de
M-CSF que puede prevenir o tratar el cáncer
metastático en el hueso, que comprende las etapas de: detectar el
enlazamiento de un candidato antagonista al M-CSF; y
ensayar la capacidad de dicho candidato antagonista para prevenir o
tratar el cáncer metastático en el hueso in vitro o in
vivo se describe aquí. Se describe también un método para
identificar un antagonista de M-CSF que puede
prevenir o tratar el cáncer metastático al hueso, que comprende las
etapas de: detectar el enlazamiento de un candidato antagonista al
M-CSFR; y probar la capacidad de dicho candidato
antagonista para prevenir o tratar el cáncer metastático al hueso
in vitro o in vivo. Se describe también un método para
identificar un antagonista de M-CSF que pueda
prevenir o tratar el cáncer metastático al hueso, que comprende las
etapas de: identificar un candidato antagonista que inhiba la
interacción entre el M-CSF y M-CSFR;
y probar la capacidad de dicho candidato antagonista para prevenir
o tratar el cáncer metastático al hueso in vitro o in
vivo.
Puede ser adicionalmente ventajoso mezclar dos o
más antagonistas M-CSF juntos para proveer una
eficacia mejorada contra la metástasis del cáncer y/o pérdida de
hueso asociada con metástasis de cáncer. De acuerdo con lo
anterior, se describe un método para prevenir la metástasis ósea y
el crecimiento de tumores que comprende administrar a un sujeto
afligido con un cáncer metastático cantidades terapéuticamente
efectivas de un antagonista M-CSF y un agente
terapéutico, previniendo por lo tanto la pérdida de hueso asociada
con el cáncer metastático y previniendo el crecimiento tumoral. De
la misma forma, se describe un método para tratar un sujeto afligido
con un cáncer metastático que comprende administrar al sujeto
cantidades terapéuticamente efectivas de antagonista
M-CSF y un agente terapéutico, reduciendo con ello
la severidad de la pérdida ósea asociada con el cáncer metastático
e inhibiendo el crecimiento de tumores. El sujeto del método antes
mencionado puede ser un mamífero. El sujeto puede ser un
humano.
Se describen los métodos antes mencionados donde
el antagonista inhibe la interacción entre el M-CSF
y su receptor M-CSFR. El antagonista puede inhibir
la proliferación de osteoclastos y/o la diferenciación inducida por
células tumorales. El antagonista de M-CSF puede ser
seleccionado del grupo que consiste de un polipéptido que comprende
un anticuerpo M-CSF; un polipéptido que comprende
un anticuerpo anti-M-CSFR del mismo;
un polipéptido soluble que comprende una muteina de
M-CSF o un derivado de la misma; y un polipéptido
soluble que comprende una muteina de M-CSFR o un
derivado de la misma.
Se contempla un cierto número de anticuerpos
antagonistas de M-CSF. En los métodos antes
mencionados dicho anticuerpo puede ser seleccionado del grupo que
consiste de un anticuerpo policlonal; un anticuerpo monoclonal; un
anticuerpo humanizado; un anticuerpo humano; un anticuerpo
quimérico; fragmento de anticuerpos Fab, F(ab')2 o FV; y una
muteina de uno cualquiera de los anticuerpos antes mencionados.
Se describen los métodos antes mencionados donde
el agente terapéutico es un bisfosfonato. El bisfosfonato puede ser
zeledronato, pamidronato, clodranato, etidronato, tilundronato,
alendronato, o ibandronato. Se describen los métodos antes
mencionados donde el agente terapéutico puede ser un agente
quimioterapéutico. Se contempla que algunos sujetos pueden ser
restringidos en cuanto a recibir el tratamiento con bisfosfonato. A
manera de ejemplo, puede evitarse que un sujeto reciba el
tratamiento de bisfosfonato si el sujeto no responde adecuadamente
al bisfosfonato, si el sujeto no tolera el tratamiento con
bisfosfonato o si el bisfosfonato está contraindicado para los
síntomas particulares del sujeto (por ejemplo fallo renal). Los
agentes quimioterapéuticos incluyen, sin limitación, agentes
alquilantes tales como carboplatin o cisplatin; agentes alquilantes
de mostaza nitrógeno; agentes alquilantes de nitrosourea, tales
como carmustina (BCNU); antimetabolitos, tales como metotrexato;
antimetabolitos análogos a la purina, mercaptopurina;
antimetabolitos análogos a la pirimidina, tales como fluorouracil
(5-FU) y gemcitabina; antineoplásticos hormonales,
tales como goserelina, leuprolide, y tamoxifen; antineoplásticos
naturales, tales como aldesleuquina,
interleuquina-2, docetaxel, etoposide
(VP-16), interferón alfa, paclitaxel, y tetrinoina
(ATRA); antineoplásticos antibióticos naturales, tales como
bleomicina, dactinomicina, daunorobicina, doxorubicina, y
mitomicina; y antineoplásticos naturales alcaloides vinca, tales
como vinblastina, vincristina, vindesina; hidroxiurea; aceglatona,
adriamicina, ifosfamida, enocitabina, epitiostanol, aclarubicina,
ancitabina, nimustina, procarbazina hidroclorida, carbocuona,
carboplatina, carmofur, cromomicina A3, polisacáridos anitumorales,
factores de plaqueta antitumorales, ciclofosfamida, Squizofilan,
citarabina, dacarbazina, tionosina, tiotepa, tegafur,
neocarcinostatina, OK-432, bleomicina, furfulon,
broxuridina, busulfan, honvan, peplomicina, Bestatina (ubenimex),
interferón-\beta, mepitiostano, mitobronitol,
marfalan, péptidos de laminina, lentinan, extracto de Coriolus
versicolor, tegafur/uracilo, estramustina
(estrógeno/mecloretamina).
Además, agentes adicionales utilizados como
terapia adyuvante para pacientes de cáncer incluyen EPO,
G-CSF, ganciclovir; antibióticos, leuprolida;
meperidina; zidovudina (AZT); interleuquinas 1 a 18, incluyendo
mutantes y análogos; interferones o citoquinas tales como
interferones \alpha, \beta y \gamma; hormonas, tales como la
hormona liberadora de la hormona luteinizante (LHRH) y análogos y
hormona liberadora de gonadotropina (GnRH); factores de
crecimiento, tales como factor de crecimiento transformante \beta
(TGF-\beta), factor de crecimiento de
fibroblastos (FGF), factor de crecimiento de nervios (NGF), factor
liberador de hormona de crecimiento (GHRF), factor de crecimiento
epidérmico (EGF), factor homólogo al factor de crecimiento de
fibroblastos (FGFHF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), y
factor de crecimiento de insulina (IGF); factor necrosis tumoral
\alpha & \beta (TNF - \alpha & \beta); factor de
inhibición de la invasión 2 (IIF-2); proteínas
morfogenéticas de hueso 1-7 (BMP
1-7); somatostatina;
timosina-\alpha-1;
\gamma-globulina; superóxido dismutasa (SOD);
factores complementarios; factores antiangiogénesis; materiales
antigénicos; profármacos; inhibidores de quinasa del receptor de
factor de
\hbox{crecimiento; anticuerpo
anti-Her2; y anticuerpo neutralizante de
VEGF.}
El antagonista de M-CSF puede
ser efectivo para reducir la dosificación de agente terapéutico
requerido para alcanzar un efecto terapéutico. Así, un antagonista
M-CSF puede mejorar la eficacia del segundo agente
terapéutico, o reducir los efectos colaterales asociados con la
administración del segundo agente terapéutico, o mejorar la
seguridad del segundo agente terapéutico. Un antagonista
M-CSF puede mejorar la eficacia, reducir los efectos
colaterales o mejorar la seguridad de una segunda modalidad
terapéutica tal como una cirugía o una terapia de radiación. Los
métodos antes mencionados pueden comprender adicionalmente la etapa
de administrar un factor estimulante de colonia no
M-CSF, por ejemplo G-CSF. Se
describe una composición farmacéutica que comprende un antagonista
de M-CSF y un agente terapéutico para el cáncer.
Se describe un paquete, vial o contenedor que
comprende un medicamento que comprende un antagonista
M-CSF e instrucciones de que el medicamento debería
ser usado en combinación con cirugía o terapia de radiación. Se
describe un método para prevenir o tratar el cáncer metastático, que
comprende las etapas de administrar un antagonista
M-CSF a un sujeto y tratar dicho sujeto con cirugía
o terapia de radiación.
Se contempla que los antagonistas
M-CSF pueden ser útiles como agentes
inmunoterapéuticos. De acuerdo con lo anterior se describe un
método de apuntar a una célula tumoral que exprese el enlace a
membrana de M-CSF sobre su superficie que comprende
la etapa de administrar un anticuerpo que específicamente se enlace
a la porción extracelular del M-CSF enlazado a la
membrana [SEQ ID NO: 2] descrito. El anticuerpo puede ser conjugado
a un radionúclido u otra toxina. El anticuerpo puede ser
seleccionado del grupo consistente de: un anticuerpo policlonal; un
anticuerpo monoclonal; un anticuerpo humanizado; un anticuerpo
humano; un anticuerpo quimérico; un fragmento de anticuerpo Fab,
F(ab')2 o FV; y una muteina de uno cualquiera de los
anticuerpos antes mencionados.
Los métodos basados en inmunoterapia para tratar
el cáncer utilizando anticuerpos
anti-M-CSF para apuntar a células
tumorales que expresan enlace a la membrana de M-CSF
sobre su superficie se describen aquí. Los ejemplos aquí mostrados
de que una variedad de células cancerosas expresa la forma de
enlazamiento a membrana de M-CSF, incluyen pero no
se limitan a cáncer de seno, cáncer de colon, cáncer de riñón,
cáncer de hígado, cáncer pulmonar, linfoma, melanoma, cáncer
ovárico, cáncer pancreático, cáncer de próstata, osteosarcoma y
cáncer de tiroides. Así, la invención contempla métodos para matar o
inhibir el crecimiento de células tumorales que expresan el enlace
a membrana de M-CSF que comprende la etapa de
administrar una cantidad efectiva de un anticuerpo que se enlace a
M-CSF, solo o conjugado con una unidad estructural
citotóxica. A la vez que los anticuerpos específicos para el enlace
a membrana de M-CSF son los preferidos, un
anticuerpo que se enlace a la porción extracelular del enlace de
membrana de M-CSF es útil de acuerdo con estos
métodos.
Cualquiera de los antagonistas
M-CSF descritos puede ser utilizado para tratar
cáncer, incluyendo cáncer no metastático. Se describe el uso de uno
cualquiera de los antagonistas de la invención para el tratamiento
de hipercalcemia, enfermedad de Paget u osteoporosis.
En una realización de la invención, se provee un
método para tratar un sujeto que sufre de un cáncer, donde las
células que comprenden dicho cáncer no secretan
M-CSF, que comprende la etapa de administrar un
antagonista de M-CSF. En una realización
relacionadas se provee un método para prevenir la metástasis ósea
que comprende administrar a un sujeto afligido con un cáncer
metastático una cantidad de antagonista de M-CSF
efectiva para neutralizar el M-CSF producido por
las células del sujeto, siendo la cantidad mayor que la cantidad
efectiva para neutralizar el M-CSF producido por
las células cancerosas. En aún otra realización, se provee un método
para tratar un sujeto afligido con un cáncer metastático en el
hueso, que comprende administrar al sujeto una cantidad de
antagonista de M-CSF efectiva para neutralizar el
M-CSF producido por las células del sujeto, siendo
la cantidad mayor que la cantidad efectiva para neutralizar el
M-CSF producido por las células cancerosas.
Se describen numerosos usos. A manera de
ejemplo, cualquiera de los anticuerpos antes mencionados está
descrito para su uso en medicina. De la misma forma, se describe un
uso de un antagonista de M-CSF en la manufactura de
un medicamento para prevenir la metástasis en hueso en un sujeto
afligido con un cáncer metastático. Se describe un uso de un
antagonista M-CSF en la manufactura de un
medicamento para prevenir, en un sujeto afligido con un cáncer
metastático, la pérdida de hueso asociada con el cáncer. Se describe
un uso de un antagonista de M-CSF en la manufactura
de un medicamento para tratar un sujeto afligido con un cáncer
metastático en el hueso. Se describe un uso de un antagonista de
M-CSF en la manufactura de un medicamento para
reducir, en un sujeto afligido con un cáncer metastático al hueso,
la severidad de la pérdida ósea asociada con el cáncer.
Se contempla que numerosos objetos pueden
beneficiarse de los métodos y usos de los antagonistas de
M-CSF descritos aquí. El sujeto puede ser un
mamífero. El mamífero puede ser humano.
Los usos antes mencionados son descritos cuando
el antagonista inhibe la interacción entre M-CSF y
su receptor (M-CSFR). El antagonista puede inhibir
la proliferación de osteoclastos y/o la diferenciación de los mismos
inducida por células tumorales. El antagonista de
M-CSF puede ser seleccionado del grupo que consiste
de un polipéptido que comprende un anticuerpo
anti-M-CSF; un polipéptido que
comprende un anticuerpo anti-M-CSFR
del mismo; un polipéptido soluble que comprende una muteína de
M-CSF o un derivado de la misma. O un polipéptido
soluble que comprende una muteína de M-CSFR o un
derivado de la misma. El anticuerpo puede ser seleccionado del
grupo que consiste de un anticuerpo policlonal; un anticuerpo
monoclonal; un anticuerpo humanizado; un anticuerpo humano; un
anticuerpo quimérico; un fragmento de anticuerpo Fab, F(ab')2
o Fv; y una muteína de uno cualquiera de los anticuerpos o
fragmentos antes mencionados.
Se describen los usos mencionados cuando el
anticuerpo es específico para M-CSF. El anticuerpo
puede ser el anticuerpo 5H4. El anticuerpo puede ser específico al
M-CSFR.
Se contemplan numerosos cánceres metastáticos
como objetivo en conexión con los usos antes mencionados de la
presente invención. En una realización, el cáncer metastático es
cáncer de seno, pulmón, renal, mieloma múltiple, tiroides,
próstata, adenocarcinoma, enfermedades malignas de los glóbulos
rojos, de las células sanguíneas, incluyendo leucemia y linfoma,
cánceres de cabeza y cuello; cánceres gastrointestinales, incluyendo
cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer
pancreático, cáncer de hígado; enfermedades malignas del tracto
genital femenino, incluyendo carcinoma ovárico, cánceres
endometriales uterinos y cáncer cervical; cáncer de vesícula;
cáncer de cerebro, incluyendo neuroblastoma; sarcoma, osteosarcoma;
y cáncer de piel incluyendo melanoma maligno o cáncer de células
escamosas. En otra realización, el antagonista de
M-CSF de los usos antes mencionados es un anticuerpo
administrado a una dosis entre aproximadamente 0.01 mg/kg y
aproximadamente 100 mg/kg.
Se contemplan numerosos medicamentos en la
invención presente. A manera de ejemplo, los usos antes mencionados
están provistos en la manufactura de un medicamento para tratar un
sujeto afligido con cáncer metastático. El uso del anticuerpo en la
manufactura de un medicamento para reducir, en un sujeto afligido
con un cáncer metastático, la severidad de la pérdida ósea asociada
con el cáncer se describe aquí. Se describe un uso para un
antagonista M-CSF y un agente terapéutico en la
manufactura de un medicamento para prevenir, en un sujeto afligido
con cáncer metastático, la metástasis ósea y el crecimiento
tumoral.
\newpage
Se describe un uso de un antagonista de
M-CSF y un agente terapéutico en la manufactura de
un medicamento para prevenir, en un sujeto afligido con cáncer
metastático, la pérdida ósea asociada con el cáncer.
Se describe un uso de un antagonista de
M-CSF y un agente terapéutico en la manufactura de
un medicamento para tratar un cáncer metastático. Se describe un
uso de un antagonista de M-CSF y un agente
terapéutico en la manufactura de un medicamento para reducir la
severidad de la pérdida ósea asociada con el cáncer e inhibir el
crecimiento tumoral en un sujeto afligido con el cáncer metastático.
Se describe un producto que comprende un antagonista de
M-CSF y un agente terapéutico combinados en
preparación para uso
\hbox{simultáneo, separado o secuencial
en el tratamiento del cáncer.}
Se describe un uso de un antagonista de
M-CSF en la preparación de un medicamento para
prevenir o tratar cáncer metastático en el hueso, donde el
medicamento se administra de forma simultánea, separada o secuencial
con un agente terapéutico para el cáncer. Se describe un uso de un
agente terapéutico para el cáncer en preparación de un medicamento
para prevenir o tratar cáncer metastático en el hueso, donde el
medicamento se administra simultánea, separada o secuencialmente
con un antagonista de M-CFS. Se describe un paquete,
vial o contenedor que comprende un medicamento que comprende un
antagonista de M-CSF e instrucciones que el
medicamento debería ser usado en combinación con cirugía o terapia
de radiación.
Adicionalmente, se describen los usos antes
mencionados donde el sujeto es un mamífero. Aún adicionalmente, se
describen los usos antes mencionados donde el mamífero es humano. El
antagonista de los usos antes mencionados puede inhibir la
interacción entre M-CSF y su receptor
M-CSFR. El antagonista puede inhibir la
proliferación y/o diferenciación de osteoclastos inducidas por las
células tumorales.
Se describen los usos antes mencionados donde
dicho antagonista de M-CSF es seleccionado del grupo
consistente de un polipéptido que comprende un anticuerpo
anti-M-CSF; un polipéptido que
comprende un anticuerpo anti-M-CSFR
del mismo; un polipéptido soluble que comprende una muteína de
M-CSF o un derivado de la misma; o un polipéptido
soluble que comprende una muteína de M-SCFR o un
derivado de la misma. Adicionalmente, el anticuerpo puede ser
seleccionado del grupo consistente de un anticuerpo policlonal; un
anticuerpo monoclonal; un anticuerpo humanizado; un anticuerpo
humano; un anticuerpo quimérico; un fragmento de anticuerpo Fab,
F(ab')2 o Fv; y una muteína de uno cualquiera de los
anticuerpos antes mencionados.
Numerosos agentes terapéuticos son contemplados
por la presente invención. En una realización, se proveen los usos
antes mencionados cuando el agente terapéutico es un bisfosfonato.
Adicionalmente, en otra realización el bisfosfonato es celedronato,
pamidronato, clodronato, etidronato, tilundronato, alendronato o
ivandronato. En otra realización, el agente terapéutico es un
agente quimioterapéutico. En una realización relacionada, se impide
que el sujeto reciba tratamiento con bisfosfonato. Se describe un
uso de un antagonista M-CSF en la manufactura de un
medicamento para reducir la dosis de un agente terapéutico
administrado a un sujeto para tratar o prevenir la metástasis ósea
y el crecimiento tumoral. Se describe un uso de un antagonista
M-CSF, un agente terapéutico y un factor
estimulante de colonias no-M-CSF en
la manufactura de un medicamento para prevenir, en un sujeto
afligido con cáncer metastático, la metástasis ósea y el crecimiento
tumoral. Se describe un uso de un antagonista de
M-CSF, un agente terapéutico y un factor estimulante
de colonia no-M-CSF en la
manufactura de un medicamento para prevenir, en un sujeto afligido
con un cáncer metastático la pérdida ósea asociada con el
cáncer.
Se describe un uso de un antagonista
M-CSF, un agente terapéutico y un factor estimulante
de colonia no-M-CSF en la
manufactura de un medicamento para tratar un cáncer metastático. Se
describe un uso de un antagonista M-CSF, un agente
terapéutico y un factor estimulador de colonia
no-M-CSF en la manufactura de un
medicamento para reducir la severidad de la pérdida ósea asociada
con el cáncer e inhibir el crecimiento tumoral en un sujeto
afligido con cáncer metastático. Se describen los usos antes
mencionados cuando el factor estimulante de colonia no
M-CSF es G-CSF.
Se describe un uso de un anticuerpo que
específicamente se enlaza con una porción extracelular de un enlace
de membrana M-CSF en la manufactura de un
medicamento para apuntar a una célula tumoral que expresa enlace de
membrana M-CSF sobre su superficie. Se describe un
uso de un anticuerpo que (a) se enlaza específicamente a la porción
extracelular de un enlace de membrana M-CSF, y (b)
se conjuga con un radionúclido u otra toxina en la manufactura de
un medicamento para tratar cáncer. Se describe el uso antes
mencionado cuando dicho anticuerpo es seleccionado del grupo
consistente de: un anticuerpo policlonal; un anticuerpo monoclonal;
un anticuerpo humanizado; un anticuerpo humano; un anticuerpo
quimérico; un fragmento de anticuerpo Fab, F(ab')2 o Fv; y
una muteína o uno cualquiera de los anticuerpos antes
mencionados.
Se describe un uso de un anticuerpo no murínico
anti-M-CSF en la manufactura de un
medicamento para tratar cáncer. Las células que comprenden el
cáncer pueden no secretar M-CSF. Se describe un uso
de un antagonista de M-CSF, en una cantidad que es
mayor que la cantidad efectiva para neutralizar el
M-CSF producido por las células de cáncer, en la
manufactura de un medicamento para prevenir la metástasis ósea. Se
describe un uso de un antagonista de M-CSF, en una
cantidad que es mayor a la cantidad efectiva para neutralizar el
M-CSF producido por células cancerígenas, en la
manufactura de un medicamento para neutralizar el
M-CSF producido por las células de un sujeto. Se
describe un uso de un antagonista de M-CSF, en una
cantidad que es superior a la cantidad efectiva para neutralizar el
M-CSF producido por células cancerígenas, en la
manufactura de un medicamento para tratar un sujeto afligido con un
cáncer metastático en el hueso. Se describe un uso de un
antagonista de M-CSF, en una cantidad que es
superior a la cantidad efectiva para neutralizar el
M-CSF producido por células cancerígenas, en la
manufactura de un medicamento para tratar cáncer.
También se describen Kits. Un kit típico puede
comprender un paquete, contenedor o vial que comprende un
antagonista M-CSF e instrucciones, tales como un
inserto o etiqueta de producto que indica al usuario como utilizar
la formulación farmacéutica de acuerdo con cualquiera de los
métodos aquí descritos.
La Figura 1 es un diagrama de topología que
muestra los enlaces disulfuro en un M-CSF
dimérico.
La Figura 2 es un estereodiagrama del esqueleto
C-alfa que muestra cada décimo residuo marcado y con
un eje de simetría no cristalográfico indicado por una línea
punteada.
La Figura 3 es una comparación de los
osteoplastos que inducen la actividad entre el M-CSF
purificado y un medio acondicionado (CM) a partir de células MDA
231 y células MCF7.
La Figura 4 es una comparación de la actividad
de neutralización de un anticuerpo monoclonal 5H4 contra
M-CSF con respecto a CM de células MDA 231.
La Figura 5 muestra la actividad de
neutralización de 5H4 y otros anticuerpos contra el
M-CSF humano.
La Figura 6 muestra que el número de animales
con un marcador de osteólisis medio de \geq 2.5 fue el más bajo
en el grupo que recibió la combinación de los anticuerpos 5A1 +
5H4.
La Figura 7 muestra que el número de animales
con un marcador de osteólisis media de \geq 2.5 fue el más bajo
en el grupo que recibió la combinación de anticuerpos 5A1 + 5H4.
La Figura 8 muestra que el anticuerpo específico
de M-CSF se enlazó a la línea celular MDA 231 de
cáncer de seno o a la línea celular ARH77 de mieloma múltiple.
La Figura 9 muestra que el M-CSF
es prevalente sobre un cierto número de superficies celulares
cancerígenas.
La habilidad para hacer metástasis es una
característica definidora de un cáncer. La metástasis se refiere a
que las células de cáncer se esparcen a otras partes del cuerpo o a
la condición producida por esta dispersión. La metástasis es un
proceso de etapas múltiples complejo que incluye cambios en el
material genético de una célula, proliferación no controlada de la
célula alterada para formar un tumor primario, desarrollo de un
nuevo suministro de sangre para el tumor primario, invasión del
sistema circulatorio por las células a partir del tumor primario,
dispersión de pequeños grumos de células tumorales primarias a otras
partes del cuerpo, y el crecimiento de tumores secundarios en esos
sitios.
El hueso es uno de los sitios más comunes de
metástasis en los cánceres humanos de seno, pulmón, próstata y
tiroides, así como de otros cánceres, en autopsias se encuentra que
tanto como el 60% de los pacientes de cáncer tiene metástasis ósea.
La metástasis ósea osteolítica muestra una única etapa de resorción
ósea osteoclástica que no es vista en la metástasis en otros
órganos. La pérdida de hueso asociada con la metástasis de cáncer
es mediada por los osteoclastos (células gigantes multinucleadas con
la capacidad de reabsorber tejidos mineralizados), que parecen ser
activadas por los productos tumorales. El factor de estimulación de
colonias (CSF 1), también conocido como factor estimulante de
colonias macrófagas (M-SCF), ha sido encontrado como
crucial en la formación de osteoclastos. Además, se ha demostrado
que el M-CSF modula las funciones osteoclásticas de
los osteoclastos maduros, su migración y su supervivencia en
comparación con otros factores solubles e interacciones célula a
célula provistas por los osteoblastos y fibroblastos ((Fixe and
Praloran, Cytokine 10: 3-7, 1998; Martin et
al., Critical Rev. in Eukaryotic Gene Expression 8:
107-23 (1998)).
El ARNm de M-CSF humano de
longitud total codifica una proteína precursora de 554 aminoácidos
(SEQ ID NO:4). A través de una división alternativa de ARNm y un
procesamiento proteolítico post traslacional diferencial, el
M-CSF puede bien ser secretado en la circulación en
forma de una glicoproteína o sulfato de condroitina que contiene
proteoglícano o puede ser expresado como una glicoproteína de
membrana giratorios sobre la superficie de las células que producen
M-CSF. La estructura tridimensional de los 150
aminoácidos aminoterminales expresados varía bacterianamente de un
M-CSF humano, la secuencia mínima requerida para una
actividad biológica completa in vitro, indica que esta
proteína es un dímero enlazado por disulfuro consistiendo cada
monómero de 4 haces en hélice alfa y una lámina beta antiparalela
(Pandit et al., Science 258: 1358-62 (1992)).
Se producen tres especies distintas de M-CSF a
través de la división alternativa del ARNm. Los tres precursores
polipeptídicos son M-CSF\alpha de 256 aminoácidos
(secuencia de ADN y aminoácidos definidas en SEQ ID NOS:1 y 2),
M-CSF\beta de 554 aminoácidos (secuencias de ADN
y aminoácidos definidas en SEQ ID NOS: 3 y 4), y
M-CSF\gamma de 438 aminoácidos (secuencias de ADN
y aminoácidos definidas en SEQ ID NOS: 5 y 6). El
M-CSF\beta es una proteína secretada que no se
presenta en la forma de enlace de membrana. EL
M-CSF\alpha se expresa como una proteína integral
de membrana que se libera lentamente mediante ruptura proteolítica.
El M-CSF\alpha es escindido en los aminoácidos
191-197 de SEQ ID NO: 2. La forma de enlazamiento
membrana del M-CSF puede interactuar con los
receptores en las células cercanas y por lo tanto puede mediar
contactos específicos célula a célula.
Diversas formas de M-CSF
funcionan por enlazamiento a su receptor M-CSFR
sobre células objetivo. El M-CSFR (secuencias de
ADN y aminoácidos definidas en SEQ ID NOS: 7 y 8) es una molécula de
distribución sobre membrana con cinco dominios similares a
inmunoglobulinas extracelulares, un dominio tras membrana y un
dominio de tirocina quinasa relacionada con Src interrumpida
intracelularmente. El M-CSFR es codificado por el
C-FMS proto-oncógeno. El
enlazamiento de M-CSF al dominio extracelular del
M-CSFR lleva la dimerización del receptor, lo cual
activa el dominio de la quinasa citoplasmática, llevando a la
autofosforilación y fosforilación de otras proteínas celulares
(Hamilton J. A., J Leukoc Biol.,62(2):145-55
(1997); Hamilton J, A., Immuno Today., 18(7):
313-7 (1997).
Las proteínas celulares fosforiladas inducen una
cascada de eventos bioquímicos que llevan a respuestas celulares:
mitosis, secreción de citoquinas, distorsión de membranas y
regulación de la transcripción de su propio receptor (Fixe and
Praloran, Cytokine 10: 32-37 (1998)).
El M-CSF se expresa en células
estromales, osteoblastos, y otras células. También se expresa en
células tumorales de seno, uterinas y ováricas. El grado de
expresión de estos tumores se correlaciona con un alto grado y pobre
prognosis (Kacinski Ann. Med. 27: 79-85 (1995);
Smith et al., Clin. Cancer Res 1: 313-25
(1995)). En carcinomas de seno, la expresión de
M-CSF es prevalente en células tumorales invasivas
en oposición al cáncer intraductal (pre-invasivo)
(Scholl et al., J. Nati. Cancer Inst. 86:
120-6 (1994). Además, se muestra que el
M-CSF promueve la progresión de tumores mamarios
hasta estados malignos (Lin et al., J. Exp. Med. 93:
727-39 (2001)). Para cáncer de seno y ovárico, la
producción de M-CSF parece ser responsable del
reclutamiento de macrófagos al tumor.
Existe un reporte de la utilización de
antagonista de M-CSF en la prevención o tratamiento
de metástasis de cáncer o perdida ósea asociada con metástasis de
cáncer. Se ha descubierto, como parte de la presente invención, que
los antagonistas de M-CSF neutralizan la inducción
de los osteoclastos por células de cáncer metastáticas. Así, la
presente invención proporciona composiciones y métodos para tratar o
prevenir metástasis de cáncer y perdida ósea asociada con la
metástasis de cáncer.
"Tumor", tal como se usa aquí, se refiere a
todo crecimiento y proliferación celular neoplásticos, bien sea
maligno o benigno, y todas las células y tejidos precancerosos y
cancerosos.
Los términos "Cáncer" y "Cancerosos"
de refieren o describen la condición fisiológica en mamíferos que es
típicamente caracterizada por el crecimiento celular sobreregulado.
Ejemplos de cáncer incluyen pero no se limitan a, carcinoma;
linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Ejemplos más particulares de
tales cánceres incluyen cáncer de seno, cáncer de próstata, cáncer
de colón, cáncer de células escamosas, cáncer de células pulmonares
pequeñas, cáncer de células pulmonares no pequeñas, cáncer
gastrointestinal, cáncer pancreático, glioglastoma, cáncer
cervical, cáncer ovárico, cáncer de hígado, cáncer de vesícula,
hematoma, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial, carcinoma de
las glándulas salivales, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer
de la vulva, cáncer de la tiroides, carcinoma hepático y diversos
tipos de cáncer de cabeza y cuello.
"Tratamientos" es una intervención llevada
a cabo con la intensión de prevenir el desarrollo o alterar la
patología de un desorden. De acuerdo con lo anterior,
"Tratamiento" se refiere tanto a tratamiento terapéutico como
a medidas profilácticas o preventivas. Los que requieren de un
tratamiento incluyen los que ya tienen el desorden así como
aquellos en los cuales el desorden debe ser evitado. En tratamiento
de tumores (por ejemplo cáncer), un agente terapéutico puede hacer
disminuir directamente la patología de las células tumorales, o
hacer las células tumorales más susceptibles a tratamiento por otros
agentes terapéuticos, por ejemplo, radiación y/o quimioterapia. La
"Patología" del cáncer incluye todos los fenómenos que
comprometen el bienestar del paciente. Esto incluye, sin
limitación, crecimiento celular anormal o incontrolable, metástasis,
interferencia con el funcionamiento normal de células vecinas,
liberación de citoquinas u otros productos secretorios en niveles
anormales, supresión o agravamiento de respuestas inflamatorias o
inmunológicas, etc.
Tal como se usa aquí, la frase "Cáncer
metastático" se define como los cánceres que tienen el potencial
de esparcirse a otras áreas del cuerpo, particularmente a los
huesos. Una amplia variedad de cánceres pueden hacer metástasis al
hueso, pero los cánceres más comunes que hacen metástasis son
cánceres de seno, pulmón, renal, mieloma múltiple, tiroides y
próstata. A manera de ejemplo, otros cánceres que pueden tener el
potencial de hacer metástasis al hueso incluyen pero no se limitan
a adenocarcinoma, enfermedades malignas de las células sanguíneas,
incluyendo leucemia y linfoma; cánceres de cabeza y cuello; cánceres
gastrointestinales, incluyendo cáncer de estomago, cáncer de colón,
cáncer colorrectal, cáncer pancreático, cáncer de hígado,
enfermedades malignas del tracto genital femenino, incluyendo
carcinoma ovárico, cánceres endometriales uterinos y cáncer
cervical; cáncer de vesícula; cáncer de cerebro, incluyendo
neuroblastoma; sarcoma, osteosarcoma, y cáncer de piel, incluyendo
melanoma maligno y cáncer de células escamosas. La presente
invención contempla especialmente la prevención y tratamiento de
lecciones osteolíticas inducidas por tumores en el hueso.
Tal como se usa aquí, el término
"antagonista" se refiere en general a la propiedad de una
molécula, compuesto u otro agente para, por ejemplo, interferir con
el enlazamiento de una molécula con otra molécula o la estimulación
de una célula con otra célula bien a través de impedimento estérico,
alteraciones conformacionales u otros mecanismos bioquímicos. En un
aspecto, el término antagonista se relaciona con la propiedad de un
agente para prevenir el enlazamiento de un receptor a su ligando,
esto es, el enlazamiento de M-CSF con
M-CSFR, mediante el cual se inhibe el camino de
transducción de señales disparado por el M-CSF. El
término antagonista no se limita por ningún mecanismo de acción
específica, pero, al contrario, se refiere en general a la propiedad
funcional definida aquí. Los antagonistas de la presente invención
incluyen, pero no se limitan a: anticuerpos de
M-CSF y fragmentos y muteínas y modificaciones de
los mismos, M-CSF soluble y fragmentos y muteínas y
modificaciones de los mismos, anticuerpos de M-CSFR
y fragmentos y muteínas y modificaciones de los mismos,
M-CSFR soluble y fragmentos y muteínas y
modificaciones de los mismos, y péptidos así como otros compuestos
químicos y moléculas que se enlazan a M-CSF o
M-CSFR y compuestos antisentido que inhiben la
expresión de M-CSF y M-CSFR. Los
antagonistas de la presente invención excluyen opcionalmente
moléculas antisentido que apunten al M-CSF.
Cualquiera de los antagonistas de la presente invención puede ser
administrado de cualquier manera conocida en la técnica. Por
ejemplo, las muteínas de M-CSF, muteínas de
M-CSFR o fragmentos de anticuerpos que se enlazan al
M-CSF o M-CSFR pueden ser
administrados a través de terapia genética.
Los antagonista M-CSF de la
presente invención incluyen, cuando es aplicable, equivalentes
funcionales. Por ejemplo, las moléculas pueden diferir en longitud,
estructura, componentes etc, pero aún pueden retener una o más de
las funciones definidas. Más particularmente, los equivalentes
funcionales de los anticuerpos, fragmentos de anticuerpos o
péptidos de la presente invención pueden incluir compuestos
miméticos, esto es construcciones diseñadas para imitar las
configuraciones y/o orientaciones propias para el enlazamiento
antigénico.
Los antagonistas de M-CSF
preferidos pueden ser modificados opcionalmente mediante la adición
de grupos laterales, etc, por ejemplo, por acilación de la terminal
amino, amidación del terminal carboxi o acoplamiento de grupos
adicionales a las cadenas laterales de aminoácidos. Los antagonistas
pueden también comprender una o más sustituciones de aminoácidos
capaces de efectuar conservación. Por "sustituciones de
aminoácidos capaces de conservación" se entienden aquellos
cambios en la secuencia de aminoácidos que preservan la carga
general, la hidrofobicidad/hidrofilicidad y/o volumen estérico del
aminoácido sustituido. Por ejemplo, la sustituciones entre los
siguientes grupos se consideran conservadoras: Gly/Ala,
Val/lle/Leu, Asp/Glu, Lys/Arg, Asn/Gln, Ser/Cys/Thr, y Phe/Trp/Tyr.
Tales modificaciones no disminuirán sustancialmente la eficacia de
los antagonistas de M-CSF y pueden impartir tales
propiedades deseadas, por ejemplo, incrementar in vivo la
vida media o disminuir la toxicidad.
La invención también está dirigida para incluir
polipéptidos que llevan modificaciones diferentes a la inserción,
eliminación o sustitución de residuos de aminoácidos. A manera de
ejemplo, las modificaciones pueden ser covalentes en su naturaleza,
e incluir por ejemplo, enlazamiento químico con polímeros, lípidos,
otras unidades estructurales orgánicas e inorgánicas. Tales
derivados pueden ser preparados para incrementar la vida media en
circulación de un polipéptido, o pueden ser diseñados para mejorar
la capacidad de acierto del polipéptido en las células, tejidos u
órganos deseados. De la misma forma, la invención abarca
adicionalmente polipéptidos de M-CSF o
M-CSFR que han sido modificados de forma covalente
para incluir uno o más anexos poliméricos solubles en agua tales
como polietilenglicol, polioxietilenglicol o polipropilenglicol.
Tal como se usa aquí, la frase "cantidad
terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad de
antagonista de M-CSF terapéutico o profiláctico que
sería apropiado para una realización de la presente invención, que
elicitaría el efecto terapéutico o profiláctico deseado por la
respuesta cuando se administra de acuerdo con el régimen de
tratamiento deseado.
El "M-CSF" humano tal como
se usa aquí se refiere a un polipéptido humano que tiene
sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que los
polipéptidos M-CSF\alpha,
M-CSF\beta o M-CSF\gamma humanos
maduros descritos en Kawasaki et al., Science 230: 291
(1985), Cerretti et al., Molecular Immunology, 25:
761(1988), or Ladner et al., ENBO Journal 6: 2693
(1987). Tal terminología refleja el entendimiento de que los tres
M-CSF maduros tienen diferentes secuencias de
aminoácidos, tal como se describió más arriba, y que la forma activa
de M-CSF es un dímero enlazado a través de
disulfuro; así, cuando el término "M-CSF" se
refiere a la forma biológicamente activa, se entiende la forma
dimérica. "dímero de M-CSF" se refiere a dos
monómeros del polipéptido de M-CSF que se han
dimerizado e incluyen tanto homodímeros (que consiste de dos del
mismo tipo de monómero de M-CSF) y heteridímeros
(que consiste de dos monómeros diferentes). Los monómeros de
M-CSF pueden ser convertidos en dímeros de
M-CSF in Vitro tal como se describe en la
Patente de los Estados Unidos 4,929,700 la cual se incorpora aquí
como referencia.
El término "anticuerpo" se usa en el
sentido más amplio y cubre anticuerpos completamente ensamblados,
fragmentos de anticuerpos que puedan enlazarse a antígenos (por
ejemplo Fab', F'(ab)2, Fv, anticuerpos de cadena sencilla,
dianticuerpos) y péptidos recombinantes que comprenden los
anteriores.
El término "anticuerpo monoclonal" tal como
se usa aquí se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una
población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, esto es, los
anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos
excepto; por mutaciones de presencia posiblemente natural que pueden
estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales
son altamente específicos, dirigidos contra un sitio antihigiénico
individual. Adicionalmente, en contraste con las preparaciones de
anticuerpos convencionales (policlonales) que típicamente incluyen
diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes
(epítopes), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un
determinante individual del antígeno. Además de su especificidad,
los anticuerpos monoclonales son ventajosos puesto que pueden ser
sintetizados mediante un cultivo homogéneo, no contaminado por
otras inmunoglobulinas con diferentes especificidades y
características.
El modificador "monoclonal" indica el
carácter del anticuerpo tal como es obtenido a partir de una
población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se
construye como la producción requerida del anticuerpo por cualquier
método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se
usa de acuerdo con la presente invención pueden hacerse por el
método del hibridoma descrito inicialmente por Kohler et al.,
Nature, 256: 495 [19751 o pueden hacerse por métodos de ADN
recombinante (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos
No 4,816, 567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden
aislarse a partir de bibliotecas de anticuerpos fagos utilizando
las técnicas descritas en Clackson et al., Nature, 352:
624628 [1991] end Marks et al., J. Mol. Biol., 222:
581-597 (1991), por ejemplo.
"Los fragmentos de anticuerpos" comprenden
una porción de un anticuerpo intacto, preferiblemente el antígeno
que se enlaza o la región variable de anticuerpo intacto. Ejemplos
de fragmentos de anticuerpos incluyen Fab, Fab', F(ab')2 y
Fv; diacuerpos; diacuerpos lineales (Zapata et al., Protein
Eng., (10): 1057-1062 (1995)); moléculas anticuerpo
de cadena sencilla; y anticuerpos multiespecíficos formados por
fragmentos de anticuerpos. La digestión con papaína de anticuerpos
produce dos fragmentos idénticos que se enlazan al antígeno,
llamados fragmentos "Fab", cada uno de ellos con un sitio de
enlazamiento de antígenos, y un fragmento residual "Fc" cuyo
nombre refleja su capacidad para cristalizar rápidamente. El
tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que
tiene dos "cadenas sencilla Fv" o fragmentos "sFv" de
anticuerpos que comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo,
donde estos dominios están presentes en una cadena polipeptídica
sencilla. Preferiblemente, el polipéptido Fv comprende un enlazante
polipeptídico entre los dominios VH y VL que permite que el Fv forme
la estructura deseada para el enlazamiento de antígenos. Para una
revisión de los sFv véase Pluckthun en Pharmacology of Monoclonal
Antibodies, vol. 1 13, Rosenburg and Moore eds.,
Springer-Verlag, New York, pp.
269-315 (1994).
El término "diacuerpos" se refiere a
pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de enlazamiento de
antígenos, fragmentos que comprenden un dominio variable de cadena
pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL)
en la misma cadena polipeptídica (VH VL), utilizando un enlazante
que sea demasiando corto para permitir el apareamiento entre dos
dominios sobre la misma cadena, los dominios son forzados a
aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y crear
dos sitios de enlazamiento de antígeno. Los diacuerpo son descritos
más completamente, por ejemplo, en EP 404,097; WO 93/11161; y 30
Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
90:6444-6448 (1993).
Un anticuerpo "aislado" es uno que ha sido
identificado y separado y recuperado a partir de un componente de
su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente
natural son materiales que interferirían con los usos diagnósticos
o terapéuticos del anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y
otros solutos proteináceos o no proteináceos. En realizaciones
preferidas, el anticuerpo será purificado (1) a más del 95% en peso
de anticuerpos según se determina por el método de Lowry, y más
preferiblemente a más del 99% en peso, (2) hasta un grado
suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia de
aminoácidos con terminal N o internas mediante el uso de un
secuenciador de giro, o (3) hasta la homogeneidad mediante
SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no
reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción
con plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in
situ con células recopilantes puesto que al menos un componente
del ambiente natural del anticuerpo no estará presente. De forma
ordinaria, sin embargo, el anticuerpo aislado será preparado por al
menos una etapa de purificación.
"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo
que contiene un sitio de reconocimiento y enlazamiento completo del
antígeno. Esta región consiste de un dímero de un dominio variable
de cadena pesada o cadena ligera en asociación estrecha no
covalente. Es en esta configuración que los tres CDR de cada uno de
los dominios variables interactúan para definir un sitio de
enlazamiento del antígeno sobre la superficie del dímero VH VI.
Colectivamente, los seis CDR confieren especificidad al
enlazamiento del antígeno al anticuerpo. Sin embargo, aun cuando un
dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solamente tres
CDR específicos para un antígeno) tiene la habilidad de reconocer y
enlazarse al antígeno, aunque con una afinidad inferior que la del
sitio de enlazamiento completo.
El fragmento Fab contiene el dominio constante
de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la
cadena pesada. Los fragmento Fab difieren de los fragmentos Fab'
mediante la adición de unos pocos residuos en el término carboxi de
la cadena pesada CH1 como dominio incluyendo una o más cisteínas de
la región de pliegue del anticuerpo. Fab'-SH es una
designación aquí para el Fab' en el cual el residuo cisteína o
residuos cisteína de los dominios constantes portan un grupo tiol
libre. Los fragmentos de anticuerpos F(ab')2 originalmente
fueron producidos como parejas de fragmentos Fab' que tienen
cisteínas plegadas entre ellos.
Por "anticuerpo neutralizador" se entiende
cualquier molécula de anticuerpo que sea capaz de eliminar o reducir
significativamente una función de efecto de un antígeno objetivo al
cual se enlaza. De acuerdo con lo anterior, un anticuerpo
antiobjetivo "neutralizante" es capaz de eliminar o reducir
significativamente una función de efecto, tal como una actividad de
enzima, enlazamiento de ligandos o señalización intracelular.
Tal como se provee aquí, las composiciones y los
métodos para tratamiento de la metástasis de cáncer y/o pérdida
ósea asociada con la metástasis de cáncer pueden utilizar uno o más
anticuerpos utilizados de forma singular en combinación con otros
agentes terapéuticos para alcanzar los efectos deseados. Los
anticuerpos de acuerdo con la presente invención pueden ser
aislados a partir de un animal que produzca el anticuerpo como
resultado bien de contacto directo con un antígeno del ambiente o
por inmunización con el antígeno. Alternativamente, los anticuerpos
pueden ser producidos por la metodología de ADN recombinante
utilizando uno de los sistemas de expresión de anticuerpos bien
conocidos en la técnica (véase por ejemplo, Harlow and Lane,
Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory
(1988)). Tales anticuerpos pueden incluir proteínas de fusión
quimérica recombinantes IgGs que tienen secuencias de
inmunoglobulinas derivadas o anticuerpos "humanizados" que
pueden ser utilizados para el tratamiento de metástasis de cáncer
y/o pérdida ósea asociada con la metástasis de cáncer de acuerdo
con la presente invención. Además de las moléculas intactas de
longitud larga, el término "anticuerpo" también se refiere a
fragmentos de las mismas (tales como, por ejemplo, fragmentos scFv,
Fv, Fd, Fab, Fab' y F(ab)'2) o multímeros o agregados de
moléculas intactas y/o fragmentos que se enlazan a
M-CSF (o M-CSFR). Estos fragmentos
de anticuerpos enlazan antígenos y pueden ser derivados para exhibir
características estructurales que faciliten la limpieza y consumo,
por ejemplo, mediante la incorporación de residuos de galactosa.
En una realización de la presente invención, los
antagonistas de M-CSF son anticuerpos monoclonales
preparados esencialmente como se describe en Halenbeck et
al. U.S. Pat. No. 5, 491,065 (1997). Antagonistas
M-CSF a manera de ejemplo incluyen anticuerpos
monoclonales que se enlazan a un epítope conformacional aparente con
M-CSF recombinante o dimérico nativo con
neutralización concomitante de su actividad biológica. Estos
anticuerpos son sustancialmente no reactivos con formas
bilógicamente inactivas del M-CSF que incluyen
M-CSF monoméricos y diméricos derivados
químicamente.
En otras realizaciones de la presente invención,
los anticuerpos monoclonales
anti-M-CSF humanizados son provistos
aquí. La frase "anticuerpo humanizado" se refiere a un
anticuerpo derivado de un anticuerpo no humano, típicamente un
anticuerpo monoclonal de ratón. Alternativamente, un anticuerpo
humanizado puede ser derivado a partir de un anticuerpo quimérico
que retenga o retenga sustancialmente las propiedades de
enlazamiento al antígeno del anticuerpo no humano de origen pero
que exhiba una inmunogenicidad disminuida, en comparación con el
anticuerpo de origen cuando se administra a los humanos. La frase
"anticuerpo quimérico" tal como se usa aquí, se refiere a un
anticuerpo que contiene una secuencia derivada de dos anticuerpos
diferentes (véase, por ejemplo la Patente de los Estados Unidos No.
4, 816,567) el cual se origina típicamente a partir de especies
diferentes. De forma más típica, los anticuerpos quiméricos
comprenden fragmentos de anticuerpos humanos y murinicos,
generalmente regiones constantes humanas y variables de ratón.
La frase "región determinante
complementaria" se refiere a secuencia de aminoácidos que definen
juntas la afinidad de enlazamiento y la especificidad de la región
natural Fv de un sitio de enlazamiento nativo de inmunoglobulina
(véase por ejemplo, Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:
901-917 (1987); Kabat et al., U.S. Dept. of
Health and Human Services NIH Publication No. 91 3242 (1991). La
frase "región constante" se refiere a la porción de la
molécula de anticuerpo que confiere las funciones de efecto. En la
presente invención, las regiones de efecto en ratón están
sustituidas preferiblemente por regiones constantes humanas. Las
regiones constantes de los anticuerpos humanizados sujetos son
derivadas de inmunoglobulinas humanas. La región constante de
cadena pesada puede ser seleccionada a partir de cualquiera de los
cinco isotipos: alfa, delta, épsilon, gamma o mu.
Los anticuerpos de la presente invención son
considerados inmunoespecíficos o que se enlazan específicamente si
se enlazan al antígeno con un Ka mayor o igual a aproximadamente
104M-1, preferiblemente de más o igual a
aproximadamente 105M-1, más preferiblemente de más
de o igual a 106M-1, y aún más preferiblemente de
más de o igual a 107M-1, y lo más preferiblemente
de más de o igual a aproximadamente 108M-1,
109M-1, o 1010M-1. Por ejemplo, los
anticuerpos específicos de
anti-M-CSF/M-CSFR
adecuados se enlazan a su antígeno con una afinidad de al menos
104M-1, preferiblemente más de o igual a
aproximadamente 105M-1, más preferiblemente más de o
igual a aproximadamente 106M-1, y aún más
preferiblemente de más de o igual a aproximadamente
107M-1, y lo más preferiblemente de más de o igual
a aproximadamente 108M-1, 109M-1, o
1010M-1. Los anticuerpos
anti-MCSF/M-CSFR se enlazan a
diferentes formas de ocurrencia natural de
M-CSF/M-CSFR como incluyendo las
expresadas por los tejidos de huésped/sujeto así como las
expresadas por el tumor. Los anticuerpos monoclonales aquí
divulgados tienen afinidad por M-CSF y
M-CSFR y se caracterizan por una constante de
equilibrio de disociación (Kd) de al menos 10-4M,
preferiblemente al menos 10-7M a aproximadamente
10-8M, más preferiblemente al menos
10-8M hasta aproximadamente 10-12M.
Los anticuerpos monoclonales y los fragmentos de enlazamiento de
antígeno de los mismos que son adecuados para su uso en los métodos
de la invención son capaces de enlazarse específicamente a
M-CSF/M-CSFR. Tales afinidades
pueden ser determinadas fácilmente utilizando técnicas
convencionales, tales como diálisis de equilibrio; utilizando un
instrumento BIAcore 2000, utilizando procedimientos generales
delineados por el fabricante; por radioinmunoensayo utilizando
M-CSF marcado con 12SI; u otro método conocido por
el experto en la técnica. Los datos de afinidad pueden ser
analizados, por ejemplo, mediante el método de Scatchard et
al., Ann N.Y. Acad. Sci., 51: 660 (1949). Así, será evidente que
los antagonistas de M-CSF preferidos exhibirán un
alto grado de especificidad por el M-CSF y se
enlazaran con afinidad sustancialmente inferior a otras
moléculas.
El antígeno que se utilizará para la producción
de anticuerpos puede ser, por ejemplo, M-CSF intacto
o un fragmento de M-CSF que retenga el epítope
deseado, opcionalmente fusionado con otro polipéptido que permita
que el epítope sea desplegado en su conformación nativa.
Los anticuerpos policlonales son elevados
preferiblemente en animales mediante inyecciones subcutáneas
múltiples (sc) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y un
adyuvante. Una respuesta a anticuerpo mejorado puede ser obtenida
conjugando el antígeno relevante con una proteína que sea
inmunogénica en la especie que va a ser inmunizada, por ejemplo,
hemocianina clave limpet, albumina de suero, tiroglobulina bovina, o
inhibidor de tripsina de soja utilizando un agente bifuncional o de
formación de derivados, por ejemplo, maleimidobenzoil
sulfosuccinimida éster (conjugación a través de residuos de
cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de
residuos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico u otros
agentes conocidos en la técnica.
Los animales son inmunizados contra el antígeno,
conjugados inmunogénicos o derivados conjugando por ejemplo, 100
\mug o 5 \mug de la proteína o conjugado (para conejos o
ratones, respectivamente) con 3 volúmenes del adyuvante completo de
Freund inyectando la solución de forma intradérmica en sitios
múltiples. Un mes más adelante, los animales son potenciados con
1/5 {hasta (1/10 fracción)} de la cantidad original de péptido o
conjugado en el adyuvante completo de Freund mediante inyección
subcutánea en sitios múltiples. A los 7 - 14 días después de la
inyección de potenciación, los animales son sangrados y el suero es
ensayado en cuanto a su título de anticuerpos. Los animales son
potenciados hasta un título constante. Preferiblemente, los animales
son potenciados con el conjugado del mismo antígeno, pero
conjugados con una proteína diferente y/o a través de un diferente
reactivo de entrecruzamiento. Los conjugados también pueden hacerse
en cultivos de células recombinantes como fusiones proteínicas.
También, los agentes de agregación tales como alum son utilizados
de forma adecuada para potenciar la respuesta inmune.
Los anticuerpos monoclonales pueden ser hechos
utilizando el método del hibridoma descrito primero por Kohler
et al., Nature, 256: 495 (1975), o pueden hacerse mediante
métodos de ADN recombinante.
En el método del hibridoma, un ratón u otro
animal huésped apropiado, tal como un hámster o un mono macaco, se
inmuniza como se describe aquí para elicitar los linfocitos que
producen o son capaces de producir anticuerpos que se enlazaran
específicamente a la proteína utilizada para la inmunización.
Alternativamente, los linfocitos pueden ser inmunizados in
vitro. Los linfocitos son entonces fusionados con células de
mieloma utilizando un agente de fusión adecuado, tal como
polietilen glicol, para formar una célula de hibridoma (Goding,
Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.
59-103 (Academic Press, 1986)).
Las células de hibridoma así preparadas son
sembradas y cultivadas en un medio de cultivo adecuado que
preferiblemente contiene una o más sustancias que inhiban el
crecimiento o supervivencias de las células de mieloma originales
no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma original
carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa
(HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluirá
típicamente hipoxantina, aminopterina, y timidina (medio HAT),
sustancias que previenen el crecimiento de células deficientes en
HGPRT.
Células de mieloma preferidas son las que se
fusionan eficientemente, soportan una producción a alto nivel
estable de anticuerpos mediante las células seleccionadas
productoras de anticuerpos, y son sensibles a un medio. Las líneas
celulares de mieloma humano y heteromieloma
ratón-humano también han sido descritas para la
producción de anticuerpos monoclonales humanos (Brodeur et
al., Monoclonal Antibody Production Techniques and
Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New
York, 1987)).
El medio de cultivo en el cual se cultivan las
células de hibridoma se prueban en cuanto a la producción de
anticuerpos monoclonales dirigido contra el antígeno.
Preferiblemente, la especificidad de enlazamiento de los
anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma es
determinada por la inmunoprecipitación o por una prueba de
enlazamiento in vitro, tal como la prueba de
radioinmunoensayo (RIA) o de ensayo de inmunoabsorción unida por
enzima (ELISA). La afinidad de enlazamiento del anticuerpo
monoclonal, por ejemplo, puede determinarse mediante el análisis de
Scatchard (Munson et al., Anal. Biochem., 107:220
(1980)).
Después de que las células de hibridoma son
identificadas en cuanto a su producción de anticuerpos de la
especificidad deseada, afinidad y/o actividad, los clones pueden
ser subclonados por procedimientos de dilución limitante y
crecimiento por métodos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies:
Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic
Press, 1986)). Medios de cultivo apropiados para este propósito
incluyen, por ejemplo, D-MEM o
RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden
ser cultivadas in vivo en tumores ascitis en un animal. Los
anticuerpos monoclonales secretados por los subclones son separados
de forma adecuada del medio de cultivo, del fluido de ascitis., o
del suero por procedimientos de purificación convencionales de
inmunoglobulina tales como, por ejemplo,
A-Sepharose de proteína, cromatografía sobre
hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis, o cromatografía
de
afinidad.
afinidad.
El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales
puede ser aislado y secuenciado a partir de las células de
hibridoma utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo,
utilizando sondas de oligonucleótidos que sean capaces de enlazarse
específicamente con genes que codifican las cadenas pesada y liviana
de los anticuerpos monoclonales). Una vez aislado, el ADN puede ser
colocado en vectores de expresión, los cuales son transferidos
entonces en células huésped tales como células de E. coli,
células COS de simios, células de ovario de hámster chino (CHO), o
células de mieloma que no producen de otra forma proteínas
inmunoglobulina, para obtener la síntesis de los anticuerpos
monoclonales en las células huésped recombinantes. La producción
recombinante de anticuerpos es bien conocida en la técnica.
Las variantes de secuencia de aminoácidos del
anticuerpo deseado pueden ser preparadas introduciendo cambios en
nucleótidos apropiados en el ADN codificante, o por síntesis de
péptidos. Tales variantes incluyen, por ejemplo, eliminaciones de,
y/o inserciones en y/o sustituciones de, residuos dentro de las
secuencias de aminoácidos de los anticuerpos. Cualquier combinación
de eliminación, inserción y sustitución se hace con el fin de llegar
a la construcción final, siempre y cuando la construcción final
posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos
también pueden alterar los procesos
post-translacionales del anticuerpo humanizado o
variante, tal como el cambio de número o posición de los sitios de
glicosilación.
Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican
las variantes de secuencias de aminoácidos del anticuerpo se
preparan mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica.
Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, aislamiento a partir
de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencias de
aminoácidos de presencia natural) o preparación por mutagénesis
mediada por oligonucleótidos (o dirigida a los sitios), mutagénesis
por PCR, y mutagénesis de casette de una variante preparada
anteriormente o de una versión no variante del anticuerpo.
Puesto que los anticuerpos quiméricos o
humanizados son menos inmunogénicos en humanos que los anticuerpos
monoclonales originales de ratón, pueden ser utilizados para el
tratamiento de humanos con bastante menos riesgo de anafilaxis.
Así, estos anticuerpos pueden ser preferidos en las aplicaciones
terapéuticas que involucran la administración in vivo a un
humano.
Los anticuerpos monoclonales quiméricos, en los
cuales los dominios Ig variables de un anticuerpo monoclonal de
ratón son fusionados con dominios Ig constantes humanos, pueden ser
generados utilizando procedimientos estándar conocidos en la
técnica (vea Morrison, S.L., et al, (1984) Chimeric Human
Antibody Molecules; Mouse Antigen Binding Domains with Human
Constant Region Domains, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81,
6841-6855; and, Boulianne, G.L., et al,
Nature. 312, 643-646. (1984)). Aunque algunos
anticuerpos monoclonales quiméricos han demostrado ser menos
inmunogénicos en humanos, los dominios Ig variables de ratón aún
pueden llevar a una respuesta humana antiratón significativa.
Los anticuerpos humanizados pueden ser logrados
mediante una variedad de métodos que incluyen, por ejemplo; (1)
injertar las regiones determinantes complementarias no humanas (CDR)
sobre un marco humano y una región constante (un proceso denominado
en la técnica como humanización a través de "injerto de CDR"),
o, alternativamente, (2) trasplantar los dominios variables no
humanos completos, pero "cubrir" con una superficie similar a
la humana por reemplazo de los residuos de superficie (un proceso
denominado en la técnica como " chapado"). En la presente
invención, los anticuerpos humanizados incluirán tanto anticuerpos
"humanizados" como "chapado". Estos métodos son descritos
en, por ejemplo, Jones et al., Nature 321:
522-525 (1986); Morrison et al., Proc. Natl.
Acad. Sci., U.S.A., 81: 6851-6855 (1984); Morrison
and Oi, Adv. Inmunol., 44: 65-92 (1988); Verhoeyer
et al., Science 239: 1534-1536 (1988);
Padlan, Molec. Immun. 28: 489-498 (1991); Padlan,
Molec. Immunol. 31(3): 169-217 (1994); and
Kettleborough, C.A. et al., Protein Eng. 4(7):
773-83 (1991).
El injerto de CDR involucra la introducción de
uno o más de los seis CDR de los dominios de Ig variables de cadena
pesada y ligera de ratón en las cuatro regiones marco apropiadas de
los dominios Ig variables humanos que también se conoce como
injerto CDR. Esta técnica (Riechmann, L., et al., Nature 332,
323 (1988)), utiliza las regiones de marco conservadas
(FR1-FR4), como un andamio para soportar los bucles
CDR que son los contactos primarios con el antígeno. Una desventaja
del injerto de CDR, sin embargo, es que puede resultar en un
anticuerpo humanizado que tenga una afinidad de enlazamiento
sustancialmente más baja que el anticuerpo de ratón original,
porque los aminoácidos de las regiones marco pueden contribuir al
enlazamiento del antígeno, y porque los aminoácidos de los bucles
CDR pueden influir en la asociación de los dos dominios Ig
variables. Para mantener la afinidad del anticuerpo monoclonal
humanizado, la técnica de injerto CDR puede ser mejorada escogiendo
regiones de marco humanas que recuerden de manera lo más
cercanamente posibles las regiones marco del anticuerpo de ratón
original, y por mutagénesis dirigida al sitio de aminoácidos
individuales dentro del marco o por CDR ayudado por modelación
computacional del sitio de enlazamiento del antígeno (por ejemplo,
Co, M.S., et al., (1994), J. Immunol. 152,
2968-2976).
Un método de humanización de anticuerpos
comprende alinear las secuencias de cadena pesadas y ligeras humanas
con secuencias de cadenas humanas pesadas y ligeras, seleccionando
y reemplazando el marco no humano con un marco humano basado en tal
alineamiento, modelación molecular para predecir la conformación de
la secuencia humanizada y comparación de la conformación del
anticuerpo original. Este proceso es seguido mediante una
retromutación repetida de los residuos en la región CDR que perturba
la estructura de los CDR hasta que la conformación predicha del
modelo de secuencia humanizada se aproxima de forma cercana a la
conformación del CDR no humano del anticuerpo no humano original.
Tales anticuerpos humanizados pueden ser derivados adicionalmente
para facilitar el consumo y tránsito, por ejemplo a través de
receptores Ashwell (véase, por ejemplo, las Patentes de los Estados
Unidos Nos. 5, 530,101 y 5, 585,089).
Se ha informado acerca de un cierto número de
humanizaciones de anticuerpos monoclonales de ratón mediante diseño
racional (véase por ejemplo, 20020091240 publicado el 11 de Julio de
2002, WO 92/11018 y la Patente de los Estados Unidos No. 5,
693,762, Patente de los Estados Unidos No. 5, 776,886).
Un método útil para la identificación de ciertos
residuos o regiones del anticuerpo que son localizaciones
preferidas para la mutagénesis se denomina "mutagénesis de barrido
por alanina", tal como lo describen Cunningham y Wells Science,
244: 1081-1085 (1989). Aquí, se identifica un
residuo o grupo de residuos objetivo (por ejemplo, residuos
cargados tales como, arg, asp, his, lys, y glu) y se reemplazan por
un aminoácido neutro o cargado negativamente (más preferiblemente
alanina o polialanina) para afectar la interacción de los
aminoácidos con el antígeno. Estas localizaciones de aminoácidos
que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones son
refinadas entonces introduciendo variantes adicionales o diferentes
en, o para, los sitios de sustitución. Así, mientras que el sitio
para introducir una variación en secuencia de aminoácidos está
predeterminado, la naturaleza de la mutación por sí misma no
necesita ser predeterminada. Por ejemplo, para analizar el
rendimiento de una mutación en un sitio dado, la mutagénesis por
barrido de alanina o aleatorios se lleva a cabo en el codón
objetivo o región objetivo y las variantes de anticuerpos expresada
son seleccionadas para la actividad deseada.
Las inserciones de secuencias de aminoácidos
incluyen fusiones en los terminales amino y/o carboxi que varían en
longitud de un residuo hasta polipéptidos que contienen cien o más
residuos, así como inserciones intrasecuencia de residuos de
aminoácidos individuales o múltiples. Ejemplos de inserciones
terminales incluyen un anticuerpo con un residuo metionilo
N-terminal o el anticuerpo fusionado con una
etiqueta epítope. Una variante de inserción de la molécula de
anticuerpo incluye la fusión a un polipéptido que incrementa la vida
media en suero del anticuerpo.
Otro tipo de variante es una variante de
sustitución de aminoácidos. Estas variantes tienen al menos un
residuo de aminoácido en la molécula de anticuerpo que es eliminada
insertándose un residuo diferente en su lugar. La mutagénesis
sustitucional dentro de cualquiera de las regiones hipervariables o
CDR o regiones de marco se contempla en la presente invención. Se
muestran sustituciones conservadoras en la Tabla 1 bajo el
encabezamiento de "sustituciones preferidas". Si tales
sustituciones se traducen en un cambio en la actividad biológica,
entonces pueden introducirse más cambios sustanciales, denominados
"sustituciones de ejemplo" en la Tabla 1, o como se describe
más abajo con referencia a las clases de aminoácidos, y los
productos seleccionados.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA
1
Sustituciones de Residuos
Preferidas de Ejemplo
Originales
Ala (A) val; leu; ile val Arg (R) lys; gln; asn
lys Asn (N) gln; his; asp, lys; gln arg Asp (D) glu; asn glu Cys
(C) ser; ala ser Gln (Q) asn; glu asn Glu (E) asp; gln asp Gly (G)
ala His (H) asn; gln; lys; arg Ile (I) leu; val; met; ala; leu phe;
norleucine Leu (L) norleucine; ile; val; ile met; ala; phe Lys (K)
arg; gln; asn arg Met (M) leu; phe; ile leu Phe (F) leu; val; ile;
ala; tyr Pro (P) ala Ser (S) thru Thr (T) ser ser Trp (W) tyr; phe
tyr Tyr (Y) trp; phe; thr; ser phe Val (V) ile; leu; met; phe; leu
ala; norleucine
\vskip1.000000\baselineskip
Las modificaciones sustanciales en las
propiedades biológicas del anticuerpo se alcanzan seleccionando las
sustituciones que difieran significativamente en su efecto en
mantener (a) la estructura del esqueleto polipéptido en el área de
sustitución, por ejemplo, como una conformación en lámina o
helicoidal, (b) la carga o la hidrofobicidad de la molécula en el
sitio objetivo, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos
de presencia natural se dividen en grupos con base en propiedades
comunes de las cadenas laterales:
- (1)
- hidrófobos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;
- (2)
- hidrófilicos neutrales: cys, ser, thr;
- (3)
- ácido: asp, glu;
- (4)
- básico: asn, gln, his, lys, arg;
- (5)
- residuos que influyen la orientación de la cadena: gly, pro; y
- (6)
- aromáticos: trp, tyr, phe.
Las sustituciones no conservadoras involucran
reemplazar un miembro de una de estas clases como un miembro de
otra clase.
Cualquier residuo cisteína no involucrado en el
mantenimiento de la conformación apropiada del anticuerpo humano
humanizado o variante también puede ser sustituido, en general con
serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y
evitar entrecruzamiento aberrante. Por el contrario, los enlaces de
cisteína pueden ser añadidos al anticuerpo para mejorar su
estabilidad (en particular cuando el anticuerpo es un fragmento de
anticuerpo tal como un fragmento Fv).
La maduración por afinidad involucra la
preparación y selección de variantes de anticuerpos que tengan
sustituciones dentro de los CDR de un anticuerpo original y
seleccionar variantes que tengan propiedades biológicas mejoradas
tales como una afinidad de enlazamiento con respecto al anticuerpo
original. Una forma convincente para generar tales variantes de
sustitución es la maduración por afinidad utilizando la presentación
de fagos. En resumen, varios sitios de regiones hipervariables (por
ejemplo, sitios 6 - 7) se mutan para generar todas las posibles
sustituciones de aminoácidos en cada sitio. Las variantes de
anticuerpo así generadas son presentadas de una forma monovalente a
partir de partículas de fago filamentosas como fusiones al producto
gen III de M13 empacado dentro de cada partícula. Las variantes
presentadas en fago son entonces seleccionadas en cuanto a su
actividad biológica (por ejemplo afinidad de enlazamiento).
La mutagénesis por barrido de alanina puede ser
llevada a cabo para identificar residuos en regiones hipervariables
que contribuyen significativamente al enlazamiento de antígenos.
Alternativamente, o adicionalmente, puede ser benéfico analizar una
estructura cristalina del complejo
antígeno-anticuerpo para identificar puntos de
contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Tales residuos de
contacto y sus residuos vecinos son candidatos para sustitución de
acuerdo con las técnicas elaboradas aquí. Una vez que se generan
tales variantes, el panel de variantes es sometido a selección tal
como se describe aquí y los anticuerpos con propiedades superiores
en uno o más ensayos relevantes serán seleccionados para un
desarrollo posterior.
Los anticuerpos pueden también ser producidos de
manera que tengan un patrón de glicosilación modificado con
respecto al anticuerpo original, por ejemplo, eliminando una o más
unidades estructurales carbohidrato encontradas en el anticuerpo,
y/o añadiendo uno o más sitios de glicosilación que no están
presentes en el anticuerpo.
La glicosilación de los anticuerpos se hace
típicamente bien enlazada al N o al O. Enlazada a N se refiere a la
unión de la unidad estructural carbohidrato a la cadena lateral de
un residuo asparagina. La secuencias tripéptidicas
asparagina-X-serina y
asparagina-X-treonina, donde X es
cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de
reconocimiento del enlace enzimático de la unidad estructural
carbohidrato a la cadena lateral asparagina. La presencia de
cualquiera de estas secuencias tripéptidicas en un polipéptido crea
un sitio potencial de glicosilación. Así, los sitios de
glicosilación unidos a N pueden ser añadidos a un anticuerpo
alterando la secuencia de aminoácidos de tal manera que contenga una
o más de estas secuencias tripéptidicas. La glicosilación con
enlazamiento a O se refiere a la unión de los azúcares
N-acetilgalactosamina, galactosa, o xilosa a un
hidroxiaminoácido, principalmente de forma común serina o treonina,
aunque también pueden usarse 5-hidroxiprolina o
5-hidroxilisina. Los sitios de glicosilación con
unión a O pueden ser añadidos a un anticuerpo insertando o
sustituyendo uno o más residuos de serina o treonina en la secuencia
del anticuerpo original.
Los anticuerpos humanizados o humanos del
M-CSF también pueden ser producidos utilizando
animales transgénicos que no tengan producción endógena de
inmunoglobulina y son manipulados genéticamente para que contengan
loci de inmunoglobulina humana. Por ejemplo WO 98/24893 divulga
animales transgénicos que tienen un locus Ig humano donde los
animales no producen inmunoglobulinas endógenas funcionales debido a
la inactivación de los loci de cadena delgada y pesada endógenos.
La WO 91/741 también divulga huéspedes mamíferos no primates
transgénicos capaces de montar una respuesta inmune a un
inmunógeno, donde los anticuerpos tienen regiones de primate
constantes y/o variables, y donde los loci que codifican
inmunoglobulina endógena son sustituidos o inactivados. La WO
96/30498 divulga el uso del sistema Cer/lox para modificar el locus
de inmunoglobulina en un mamífero, de tal forma que se remplace
toda o una porción de la región constante o variable para formar una
molécula de anticuerpo modificada. La WO 94/02602 divulga huéspedes
mamíferos no humanos que tienen loci de IG endógena inactivados y
loci de Ig humana funcional. La patente de los Estados Unidos No
5,939,598 divulga métodos para hacer ratones transgénicos en los
cuales los ratones carecen de loci de Ig humana funcionales, y
expresan un locus de inmunoglobulina exógena que comprende una o
más regiones xenogénicas constantes.
Al utilizar un animal transgénico descrito más
arriba, puede producirse una respuesta inmune a una molécula
antigénica seleccionada, y pueden eliminarse células productoras de
anticuerpos del animal y utilizadas para producir ibridomas que
secretan anticuerpos monoclonales humanos. Los protocolos de
inmunización adyuvantes y similares son conocidos en la técnica, y
se utilizan en la inmunización de, por ejemplo, un ratón transgénico
como se describe en WO 96/33735. Esta divulgación divulga
anticuerpos monoclonales contra una variedad de moléculas
antigénicas incluyendo IL 6, IL 8, TNFa, CD4 humano, selección L,
gp39 y toxina del tétano. Los anticuerpos monoclonales pueden ser
probados en cuanto se capacidad para inhibir o neutralizar la
actividad biológica o el efecto fisiológico de la proteína
correspondiente. La W0 96/33735 divulga los anticuerpos monoclonales
contra IL-8, derivados de células inmunes de
ratones transgénicos inmunizados con IL-8, funciones
bloqueadas inducidas por IL-8 de neutrófilos. Los
anticuerpos monoclonales humanos con especificidad para el antígeno,
usados para inmunizar animales transgénicos también se divulgan en
WO 96/34096 y la solicitud de Patente de los Estados Unidos No.
20030194404; y la solicitud de Patente de los Estados Unidos No.
20030031667).
Véase también Jakobovits et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al.,
Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et
al., Year in Immuno., 7:33 (1993); and U.S. Pat. No. 5,591,669,
U.S. Patent No. 5,589,369, U.S. Patent No. 5,545,807; y la
solicitud de Patente de los Estados Unidos no. 20020199213. La
solicitud de Patente de los Estados Unidos no. 20030092125 describe
métodos para hacer bioensayos de la respuesta inmune de un animal
al epítope deseado. Los anticuerpos humanos también pueden ser
generados por células B activadas in vitro (véase Patentes
de los Estados Unidos no. 5,567,610 y 5,229,275).
El desarrollo de tecnologías para hacer
repertorios de genes de anticuerpos humanos recombinantes, y la
presentación de los segundos fragmentos de anticuerpos codificados
y sobre la superficie de bacteriófagos filamentosos, ha
proporcionado un medio para hacer directamente anticuerpos humanos.
Los anticuerpos producidos por la tecnología de fagos son
producidos como fragmentos de enlazamiento al antígeno- usualmente
fragmentos Fv o Fab - en bacterias y así carecen de funciones de
efecto. Las funciones de efecto pueden ser introducidas por una de
dos estrategias: Los filamentos pueden ser manipulados
genéticamente bien para ser convertidos en anticuerpos completos
para la expresión en células de mamíferos, o en fragmentos de
anticuerpos bioespecíficos con un segundo sitio de enlazamiento
capaz de disparar una función de efecto.
\newpage
Típicamente el fragmento Fv
(VH-CH1) y la cadena ligera (VL-CL)
de los anticuerpos son clonadas separadamente por PCR y
recombinadas de forma aleatoria en librerías de presentación de
fagos combinacionales, las cuales pueden ser entonces seleccionadas
para enlazarse a un antígeno en particular. Los fragmentos Fab se
expresan en la superficie del fago, esto es, se enlazan físicamente
a los genes que los codifican. Así, la selección del Fab por el
enlazamiento al antígeno coselecciona las secuencias codificantes
del Fab, las cuales pueden ser amplificadas posteriormente. Al
hacer diversas rondas de enlazamiento al antígeno y reamplificación,
un procedimiento denominado panning, los Fab específicos para el
antígeno son enriquecidos y finalmente aislados. En 1994, se
describió un intento para realizar la humanización de anticuerpos,
denominado "selección guiada". La selección guiada utiliza la
potencia de la técnica de presentación de fagos para la humanización
de anticuerpos monoclonales de ratón (Véase Jespers, L. S., et
al., Bio/Technology 12, 899-903 (1994)). Para
esto, el fragmento Fd del anticuerpo monoclonal de ratón puede ser
presentado en combinación con una biblioteca de cadena ligera
humana, y la biblioteca Fab híbrida resultante puede ser entonces
seleccionada con el antígeno. El fragmento de Fd de ratón
proporciona por lo tanto un molde para guiar la selección.
Subsecuentemente, las cadenas ligeras humanas seleccionadas son
combinadas con una biblioteca de fragmentos Fd humanos. La selección
de la biblioteca resultante produce Fab completamente humano.
Se ha descrito una variedad de procedimientos
para derivar anticuerpos humanos a partir de bibliotecas de
despliegue de fagos (Véase, por ejemplo, Hoogenboom et al.,
J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol,
222:581-597 (1991); U.S. Pat. Nos. 5,565,332 y
5,573,905; Clackson, T., y Wells, J. A., TIBTECH 12,
173-184 (1994)). En particular, la selección y
evolución in vitro de los anticuerpos derivados de las
bibliotecas de despliegue de fagos se ha convertido en una
herramienta poderosa (Véase Burton, D. R., y Barbas III, C. F.,
Adv. Immunol. 57, 191-280 (1994); y, Winter, G.,
et al.., Annu. Rev. Immunol. 12, 433-455
(1994); solicitud de Patente de los Estados Unidos no. 20020004215
y WO92/01047; solicitud de Patente de los Estados Unidos no.
20030190317 publicada el 9 de octubre de 2003 y Patente de los
Estados Unidos No. 6,054,287; Patente de los Estados Unidos No.
5,877,293.
Watkins, "Screening of
Phage-Expressed Antibody Libraries by Capture
Lift," Methods in Molecular Biology, Antibody Phage Display:
Methods and Protocols 178:187-193, y la solicitud de
Patente de los Estados Unidos no. 200120030044772 publicada el 6 de
marzo de 2003 describe métodos para seleccionar bibliotecas de
anticuerpos expresadas en fagos u otras moléculas de enlazamiento
por captura por elevación, un método que involucra la
inmovilización de las moléculas enlazantes candidato sobre un
soporte sólido.
Los productos de anticuerpo pueden ser
seleccionados en cuanto su actividad como antagonistas de MCSF y en
cuanto a su conveniencia en los métodos de tratamiento de la
invención utilizando pruebas tales como las que se describen en la
sección titulada "métodos de selección" aquí utilizando
cualquier prueba adecuada conocida en la técnica.
"Fragmento" como se utiliza aquí significa
una porción de la molécula nativa intacta; por ejemplo, un fragmento
de polipéptido es un fragmento de polipéptido nativo en el cual uno
o más aminoácidos bien del terminal N o del terminal C han sido
eliminados.
"Muteina" tal como se usa aquí con respecto
a los polipéptidos significa una variante de la molécula nativa
intacta o una variante de un fragmento de la molécula nativa, en el
cual uno o más aminoácidos han sido sustituidos, insertados o
eliminados. Tales sustituciones, inserciones o eliminaciones pueden
ser en el terminal N, terminal C o internos en la molécula. Así, el
termino "muteína" incluye dentro de su alcance fragmentos de la
molécula nativa. Las moléculas insercionales incluyen funciones en
los terminales N o C, por ejemplo, fusión a la porción Fc de una
inmunoglobulina para incrementar su vida media.
Las muteínas preferidas exhiben al menos 65%,
70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o más identidades secuencia
(homología) con el polipéptido nativo, según se determina mediante
el algoritmo de búsqueda de homología
Smith-Waterman (Meth. Mol. Biol.
70:173-187 (1997)), como se implementa en el
programa MSPRCH (Oxford Molecular) utilizando una búsqueda de
afinación de espacio con los siguientes parámetros de búsqueda:
penalidad de espacio abierto de 12, penalidad de extensión de
espacio de 1. Otros programas de algoritmo de barrido de
homología/identidad bien conocidos y utilizados rutinariamente
incluyen Pearson y Lipman, PNAS USA, 85:2444-2448
(1988); Lipman y Pearson, Science, 222:1435 (1985); Devereaux et
al., Nuc. Acids Res., 12:387-395 (1984); o los
algoritmos BLASTP, BLASTN o BLASTX de Altschul, et al., Mol.
Biol., 215:403-410 (1990). Los programas
computarizados que utilizan estos algoritmos también están
disponibles e incluyen, pero no se limitan a GAP, BESTFIT, BLAST,
FASTA y TFASTA, los cuales están comercialmente disponibles a partir
del paquete Genetics Computing Group (GCG), Version 8, Madison
Wis., Estados Unidos; y CLUSTAL en el programa PC/Gene de
Intellegenetics, Mountain View Calif. Preferiblemente, el
porcentaje de identidad de secuencia se determina utilizando los
parámetros de fondo determinados por el programa.
"Modificación", tal como se usa aquí,
significa cualquier modificación del polipéptido nativo, fragmento o
muteína, tal como glicosilación, fosforilación, conjugación de
polímeros (tales como con polietileno glicol), u otra adición de
unidades estructurales extrañas, en cuanto la actividad deseada
(agonista o antagonista se retenga.
La Patente de los Estados Unidos No. 6,025,146 y
Koths, Mol. Reprod. Dev. 1997
Jan;46(1):31-38, describen la cristalización
de M-CSF sola y M-CSF en complejo
con MCSF-R, y caracteriza la estructura
tridimensional del M-CSF así como los residuos
involucrados en enlazamiento de receptores. La Patente de los
Estados Unidos No. 6,025,146 también describe métodos para
seleccionar sustituciones de aminoácidos candidatos en
M-CSF, con base en la información estructural. La
Figura 1 es un diagrama de topología que muestra los puentes de
sulfuro en M-CSF dimérico truncado, la Figura 2 es
un estereodiagrama del esqueleto C-alfa con cada
diez residuos marcados y con el eje de simetría no cristalográfico
indicado por una línea punteada. La topología general de esta forma
M-CSF como se muestra en la Figura 1 es la de un haz
de cuatro hélices alfa antiparalelo, en el cual las hélices van de
arriba hacia abajo, a diferencia de la conectividad hacia arriba y
hacia abajo observada mas comúnmente de la mayoría de los haces de
cuatro hélices. Una conexión transversal larga une la hélice A con
la hélice B y una conexión similar se encuentra entre las hélices C
y D. En la forma dimérica de puente de disulfuro, los haces están
enlazados de extremo a extremo, formando una estructura
extremadamente plana, alargada (aproximadamente de dimensiones de
85 x 35 x 25). Hay tres puentes disulfuro intramoleculares en cada
monómero (Cys7-Cys90, Cys48-Cys139,
Cys102-Cys146) todos los cuales están en el extremo
distal de la molécula. Un puente de disulfuro intercadenas
(Cys31--Cys31) está localizado en la interfaz con el eje de
simetría doble no cristalográfico que pasa a través del mismo como
se muestra en la Figura 2. Los experimentos de mutación indican que
todos los residuos de cisteína en esta forma de
M-CSF pueden ser necesarios para la actividad
biológica. La estructura descrita aquí sugiere que su papel es
primariamente estructural en vez de estar relacionado con el
conocimiento del receptor. La Patente de los Estados Unidos No.
6,025,146 proporciona la estructura tridimensional del dímero
M-CSF \alpha recombinante truncado tal como se
identifica por las posiciones de carbono alfa de los residuos de
aminoácido en la secuencia.
Los residuos específicos en las hélices A, C y D
parecen estar involucrados en la especificidad de la interacción
receptor-enlace. Puesto que el
M-CSF\beta tiene puentes disulfuro dentro de la
cadena que involucran cisteínas 157 y/o 159, la región terminal C
del M-CSF probablemente se extiende desde la
"parte posterior" de la estructura, proporcionando un
"tether" de longitud variable para las formas de enlace a
membrana de M-CSF. Así, el "frente" o región
receptor-enlace del M-CSF está sobre
el lado opuesto de las moléculas, consistiendo de residuos
accesibles por solvente en o cerca de las hélices A, C y D,
incluyendo residuos de aproximadamente 6 a 26, 71 a 90 y 110 a 130,
respectivamente, de M-CSF nativo. Al alterar los
residuos accesibles por solvente en estas regiones por la
mutagénesis dirigida al sitio para incrementar o disminuir las
interacciones lado-cadena con el receptor puede
generar agonistas o antagonistas de M-CSF. Los
residuos que tienen un área de superficie accesible por solvente de
más de aproximadamente 0.25 y preferiblemente superior a
aproximadamente 0.4 son preferidas con base en la normalización del
área superficial del aminoácido accesible cuando en el tripéptido
gly-x-gly (Kabsch, W. et
al., Biopolymers 22:2577 (1983)). Preferiblemente los residuos
se escogen de manera que no interactúen con otras partes de la
proteína tales como la interfaz del dímero con el fin de mantener la
orientación relativa de los monómeros y evitar la perturbación del
proceso de plegado de la proteína. Una consideración opcional
adicional es seleccionar residuos no conservados entre
M-CSF humano y de ratón, el cual no reconoce el
receptor humano M-CSF. Los aminoácidos candidatos
son preferiblemente seleccionados para sustitución con aminoácidos
no conservantes, de manera que se perturbe los enlaces de hidrógeno
y/o las interacciones hidrófobas con los residuos de
MCSF-R. Por ejemplo, al cambiar una o más histidinas
a aminoácidos no donadores de hidrógeno de tamaño similar puede
crearse un M-CSF con capacidad de enlazamiento al
receptor alterada. Los aminoácidos preferidos para la sustitución
incluyen pero no se limitan a: H15; Q79; R86; E115; E41; K93; D99;
L55; S18; Q20; I75; V78; L85; D69; N70; H9; N63; y T34. Los
residuos de M-CSF importantes en la señalización del
receptor se cree que están compuestos de regiones discontinuas de
M-CSF. Para minimizar la probabilidad de formación
de anticuerpos a fármacos proteinaceos basados en
M-CSF administrados potencialmente, es deseable
retener los residuos de M-CSF de origen accesible
por solvente (para recordar la molécula nativa) cuando sea
posible.
La mutagénesis de los aminoácidos H15 y H19 en
la región N-terminal/hélice A se traduce en muteínas
con actividad biológica significativamente más baja y capacidad de
enlazamiento AMCS-R significativamente más baja.
Estos resultados indican que la actividad biológica reducida se
debía a una afinidad de enlazamiento al receptor disminuida; así,
estos aminoácidos histidina representan contactos que son
importantes para la afinidad de enlazamiento al receptor de
M-CSF y deberían mantenerse sin cambio si se desea
una capacidad de enlazamiento a receptor completa. Residuos
cercanos accesibles por solvente tales como Y6 y S13 son otros que
también pueden representar residuos de contacto con receptor de
M-CSF. Un mutante doble de M-CSF
(Q20A, V78K) fue construido para probar la importancia de los
residuos accesibles por solvente en la porción central de las
hélices A y C. Esta doble muteína tiene actividad biológica
ligeramente más baja (8-10 veces) y
correspondientemente una actividad de enlazamiento al receptor más
baja. La mutagénesis de los residuos Q17, R21, E115 y E119 cambiaron
las propiedades de cadena lateral de los aminoácidos accesibles por
solvente en las áreas de interés pero no afectaron la actividad
específica biológica, sugiriendo que estos residuos no necesitan ser
alterados en muteínas diseñadas para tener actividad
antagonista.
Las muteínas de M-CSF en las
cuales los residuos de las hélices A y/o C y/o D involucradas en el
enlazamiento al receptor (por ejemplo, aminoácidos 6 a 26, 71 a 90
y/o 110 a 130), han sido mutadas de forma no conservadora tal como
se describió. Tales muteínas preferiblemente retienen al menos 65%,
70%, 75%, 80%, 85% o 90% de similaridad (esto es aminoácidos que
son idénticos o tienen propiedades idénticas) a la secuencia nativa
con las hélices A, C o D, pero tienen más alta similaridad con la
secuencia nativa en el resto del polipéptido, esto es al menos 95%,
98% o 99% de similaridad. Además, los residuos que soportan la
conformación tridimensional del sitio de enlazamiento al receptor
pueden ser mutadas de manera no conservadora.
La muteína de M-CSF puede ser
una forma monomérica del M-CSF. La forma dimérica
del M-CSF es la forma biológicamente activa, y las
formas monoméricas de M-CSF generalmente no son
activas. El puente de disulfuro de los monómeros parece presentarse
a través de la unión intercadenas CyS31-CyS31. Así,
se contempla que las formas monoméricas de M-CSF
pueden ser adecuadas para su uso como antagonistas. Tales formas
incluyen muteínas que comprenden eliminaciones de cisteína y/o
reemplazos de cisteína (por ejemplo, sustituciones de cisteína por
alanina) de Cys31 y/o otras cisteínas, o muteínas en las cuales las
cisteínas, particularmente Cys31, han sido modificadas químicamente
de manera que no están disponibles para formar puentes
disulfuro.
La muteína de M-CSF comprende
una o más hélices A, C o D, o porciones de las mismas involucradas
en el enlace de receptor, sola o fusionadas con otros polipéptidos
que permiten el despliegue de los fragmentos en una conformación
tridimensional apropiada.
Las muteínas que contienen cualquier muteína
deseada conservadora y/o no conservadora se preparan fácilmente
utilizando técnicas bien conocidas en el arte, incluyendo producción
recombinante o síntesis química.
Las sustituciones conservadoras, particularmente
las sustituciones por fuera de regiones involucradas directamente
en enlazamiento ligando-receptor, no se espera que
cambien de manera significativa las propiedades de enlazamiento de
las muteínas M-CSF (o muteínas
M-CSFR). Los aminoácidos pueden ser clasificados de
acuerdo con las propiedades físicas y su contribución a la
estructura secundaria y terciaria de la proteína. Una sustitución
conservadora se reconoce en la técnica como una sustitución de un
aminoácido por otro aminoácido que tiene propiedades similares.
Sustituciones conservadoras a manera de ejemplo se presentan en la
Tabla 2 (de la WO 97/09433, pagina 10, publicada el 13 de marzo de
1997 (PCT/GB96/02197, presentada en 9/6/96), inmediatamente a
continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Alternativamente, los aminoácidos conservadores
pueden agruparse como se describe en Lehninger, (Biochemistry,
Second Edition; Worth Publishers, Inc. NY:NY (1975), pp.
71-77) como se muestra en la Tabla 3, inmediatamente
más abajo.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Como aún otra alternativa, las sustituciones
conservadoras de ejemplo se presentan en la Tabla 4, inmediatamente
a continuación.
La disponibilidad de secuencias de ADN que
codifique M-CSF permite el uso de diversos sistemas
de expresión para producir los polipéptidos deseados. La
construcción de los vectores de expresión y la producción
recombinante a partir de las secuencias apropiadas de ADN son
llevadas a cabo por métodos bien conocidos en la técnica. Estas
técnicas y diversas otras técnicas se llevan a cabo generalmente de
acuerdo con Sambrook et al., Molecular Cloning--A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.
(1989), and Kriegler, M., Gene Transfer and Expression, A
Laboratory Manual, Stockton Press, New York (1990).
Ciertas modificaciones a la secuencia primaria
de M-CSF pueden hacerse por eliminación, adición o
alteración de los aminoácidos codificados por la secuencia de ADN
sin destruir la estructura deseada (por ejemplo la capacidad de
enlazar al receptor del M-CSF) de acuerdo con
técnicas de ADN recombinante bien conocidas. Adicionalmente, un
técnico experimentado notará que los aminoácidos individuales pueden
ser sustituidos o modificados por oxidación, reducción u otra
modificación, y el polipéptido puede ser escindido para obtener
fragmentos que retienen el sitio de enlace activo y la información
estructural. Tales sustituciones y alteraciones tienen como
resultado polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que
cae dentro de la definición de polipéptido "que tiene
sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que el
M-CSF\alpha maduro (SEQ ID NO:2),
M-CSF\beta (SEQ ID NO:4), y
M-CSF\gamma (SEQ ID NO:6) como
polipéptidos".
Los polipéptidos pueden ser sintetizados
utilizando técnicas de síntesis de péptidos en fase sólida o en fase
en solución estándar conocidas en la técnica. En la síntesis en
fases en solución, puede utilizarse una amplia variedad de métodos
de acoplamiento y grupos de protección (véase Gross and Meienhofer,
eds., "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology," Vol.
1-4 (Academic Press, 1979); Bodansky and Bodansky,
"The Practice of Peptide Synthesis," 2d ed. (Springer Verlag,
1994)). Además, la purificación intermedia y el escalamiento lineal
son posibles. Las personas de experiencia normal en la técnica
apreciaran que la síntesis en solución requiera la consideración de
grupos protectores de la cadena principal y cadena lateral y el
método de activación así como la selección de segmentos para
minimizar la racemización.
La síntesis de péptidos en fase sólida puede
llevarse a cabo en general de acuerdo con el método de Merrifield
et al,. J. Am. Chem. Soc. 85:2149, 1963, el cual involucra el
ensamblaje de una cadena de péptidos lineal sobre un soporte de
resina utilizando aminoácidos protegidos. La síntesis en fase sólida
utiliza típicamente bien sea la estrategia Boc o Fmoc. La
estrategia Boc utiliza una resina de poliestireno entrecruzada al
1%. El grupo protector estándar para las funciones
\alpha-amino es el
ter-butiloxicarbonilo (Boc). Este grupo puede ser
eliminado con soluciones diluidas de ácidos fuertes tales como ácido
trifluoroacético al 25% (TFA). El siguiente aminoácido Boc es
típicamente acoplado a la resina aminoacilo utilizando
diciclohexilcarbodiimida (DCC). Después de terminar el ensamblaje
la resina p de péptido es tratada con HF anhidro para escindir la
unión esterbencílico y liberar el péptido libre. Los grupos
funcionales de cadena lateral se bloquean usualmente durante la
síntesis mediante grupos bloqueantes derivados del bencilo, los
cuales también son escindidos por HF. El péptido libre es extraído
entonces de la resina con un solvente adecuado, purificado y
caracterizado. Pueden purificarse los péptidos recién sintetizados,
por ejemplo, mediante filtración por gel, HPLC, cromatografía de
partición y/o cromatografía de intercambio iónico, y pueden ser
caracterizados mediante por ejemplo, espectrometría de masas o
análisis de secuencia de aminoácidos. En la estrategia Boc, los
péptidos amidados de ese terminal pueden obtenerse utilizando
resinas de bencilhidramina o metilbencilhidramina, las cuales
producen amidas peptídicas directamente por escisión con HF. Un
método alternativo que utiliza
9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) utiliza
diferentes reactivos que permiten que los grupos protectores de la
cadena lateral y la resina peptídica se enlacen para ser
completamente estables a las aminas secundarias utilizadas para
escindir el grupo N-\alpha-Fmoc.
La protección de la cadena lateral y la unión de la resina peptídica
se escinde mediante acidólisis suave. El contacto repetido con la
base hace que la resina de Merrifield sea inadecuada para la
química Fmoc, y se utilizan en general ésteres
p-alcoxibencílicos enlazados a la resina. La
desprotección y escisión se llevan a cabo generalmente utilizando
TFA. La acetilación del N terminal puede lograrse haciendo
reaccionar el péptido final con anhídrido acético antes de la
escisión de la resina. La C-amidación se logra
utilizando una resina apropiada tal como resina de
metilbenchidrilamina utilizando la tecnología Boc.
En general, las modificaciones de los genes que
codifican el polipéptido de M-CSF se logran
fácilmente mediante una variedad de técnicas bien conocidas, tales
como la mutagénesis dirigida al sitio (véase Gillman and Smith,
Gene 8:81-97 (1979) y Roberts, S. et al.,
Nature 328:731-734 (1987) y U.S. Pat. No.
5,032,676,). La mayoría de las modificaciones se evalúan
seleccionando en una prueba adecuada la característica deseada. Por
ejemplo, un cambio en el carácter de enlace receptor de
M-CSF del polipéptido puede detectarse mediante
pruebas competitivas con polipéptidos de referencia apropiados
mediante los bioensayos descritos en la patente de los Estados
Unidos
No 4,847,201.
No 4,847,201.
Las variantes insercionales de la presente
invención son aquellas en las cuales uno o más residuos de
aminoácidos son introducidos en un sitio predeterminado en el
M-CSF. Por ejemplo, las variantes insercionales
pueden ser fusiones de proteínas o polipéptidos heterólogos al
terminal amino o carboxilo de las subunidades. Las variantes
sustitucionales son aquellas en las cuales al menos un residuo ha
sido eliminado y se inserta un residuo diferente en su lugar. Los
aminoácidos no naturales (esto es aminoácidos que no se encuentran
normalmente en las proteínas nativas), así como análogos
isostéricos (aminoácidos u otros) son también adecuados para su uso
en esta invención. Ejemplos de sustituciones adecuadas son bien
conocidos en la técnica, tales como Glu->Asp, Ser->Cys, y
Cys->Ser, His->alanina por ejemplo. Otra clase de variantes
son variantes eliminatorias, las cuales se caracterizan por la
eliminación de uno o más residuos de aminoácidos del
M-CSF.
Otras variantes de la presente invención pueden
ser producidas mediante la modificación química de aminoácidos de
la proteína nativa (por ejemplo tratamiento con dietilpirocarbonato
el cual modifica los residuos de histidina). Se prefieren
modificaciones químicas que son específicas para ciertas cadenas
laterales de aminoácidos. La especificidad también puede ser
alcanzada bloqueando otras cadenas laterales con anticuerpos
dirigidos a las cadenas laterales que van a ser protegidas. La
modificación química incluye reacciones tales como oxidación,
reducción, amidación, desamidación, o sustitución de grupos
voluminosos tales como polisacáridos o polietilenglicol (véase por
ejemplo, patente de los Estados Unidos No 4,179,337 y WO
91/21029).
Modificaciones de ejemplo incluyen la
modificación de residuos terminales lisinilo y amino o reacción con
anhídrido succínico u otros anhídridos de ácidos carboxílicos. La
modificación de estos agentes tiene el efecto de invertir la carga
de los residuos lisinilo. Otros reactivos adecuados para modificar
los residuos que contienen amino incluyen iminoésteres tales como
picolinimidato de metilo, fosfato de piridoxal, cloroborohidruro de
piridoxal; ácido trinitrobencenosulfónico;
O-metilisourea, 2,4-pentanodiona; y
reacción catalizada por transaminasa con glioxilato, y ésteres de
N-hídroxisuccinimida del polietilenglicol u otras
sustituciones voluminosas. Los residuos de arginilo pueden ser
modificados por reacción con un cierto número de reactivos,
incluyendo fenilgliosal, 2,3-butanodiona,
1,2-ciclohexanodiona, y ninhidrina. La modificación
de los residuos de arginina requiere que la reacción se lleve a
cabo en condiciones alcalinas debido al alto pKa del grupo funcional
guanidina. Además, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos
de la lisina así como con el grupo arginina
Epsilon-amina.
Los residuos de tirosilo también pueden ser
modificados con interés particular en la introducción de etiquetas
espectrales en residuos de tirosilo por reacción con compuestos de
diazonio aromáticos o tetranitrometano tal como se usan para formar
especies de O-acetil tirosilo y derivados de
3-nitro, respectivamente. Los residuos de tirosilo
también pueden ser yodados utilizando 125I o 131I para preparar
proteínas marcadas para uso en radioinmuno-
ensayos.
ensayos.
Los grupos laterales carboxilo (aspartilo o
glutamilo) pueden ser modificados selectivamente por reacción con
carbodiimidas (R--N.dbd.C.dbd. N-R.sup.1), donde R y
R1 son grupos alquilo diferentes, tales como
1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etil)
carbodiimida o
1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)
carbodiimida. Además, los residuos aspartilo y glutamilo son
convertidos a residuos asparaginilo y glutaminilo por reacción con
iones amonio.
Por el contrario, los residuos glutaminilo y
asparaginilo pueden ser desamidados hasta los correspondientes
residuos glutamilo y aspartilo, respectivamente, bajo condiciones
suavemente ácidas. Cualquier forma de estos residuos cae dentro del
alcance de esta invención.
Otras modificaciones incluyen hidroxilación de
prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos
serilo o treonilo, metilación de grupos
\alpha-amino de cadenas laterales de lisina,
arginina e histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and
Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp.
79-86 (1983)), acetilación de amina
N-terminal y amidación de cualquier grupo carboxilo
C-terminal.
Puede utilizarse un cierto número de métodos
para determinar la similaridad de las muteinas de
M-CSF con la proteína original
M-CSF. Por ejemplo, se calcula el porcentaje de
homología como porcentaje de residuos de aminoácidos en la más
pequeña de las dos secuencias que se alinean con idénticos residuos
de aminoácidos en la secuencia que está siendo comparada, cuando
pueden introducirse cuatro espacios en una longitud de 100
aminoácidos para maximizar el alineamiento (Dayhoff, in Atlas of
Protein Sequence and Structure, Vol.5, p. 124, National Biochemical
Research Foundation, Washington, D.C. (1972)). La alineación
secuencial de los polipéptidos para propósitos de comparación de
frecuencias también puede hacerse utilizando una variedad de
múltiples servidores de alineamiento, la mayoría de los cuales
están actualmente disponibles en internet, por ejemplo, Clustal W,
MAP, PIMA, Block Maker, MSA, MEME, and Match-Box.
Preferiblemente Clustal W (Higgins et al., Gene (1988) 73:
237-244; Higgins et al., Meth. Enzymol.
(1996) 266: 383-402) emplea para alineamiento
secuencial de polipéptidos (también de polinucleótidos). De la
misma forma, el programa BLASTP compara una secuencia de inquisición
de aminoácidos contra una base de datos de proteínas, y TBLASTN
compara una secuencia de inquisición de proteína contra una base de
secuencias de nucleótidos dinámicamente traducida en todos los seis
marcos de lectura (ambas hebras), y puede ser empleada en la
invención. Las determinaciones de si dos secuencias de aminoácidos
son sustancialmente homólogas (esto es, similares o idénticas)
también puede basarse en las búsquedas FASTA de acuerdo con Pearson
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:
2444-2448 (1988).
En particular, los métodos preferidos para
determinar la identidad y/o la similaridad están diseñados para dar
la máxima coincidencia entre las secuencias probadas. Los métodos
para determinar la identidad y similaridad son codificados en
programas de ordenador públicamente disponibles (por ejemplo, tales
como los que se describieron previamente). Los métodos de programas
de ordenador preferidos para determinar la identidad y similaridad
entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan, al programa GCG,
incluyendo GAP (Devereux et al., Nucleic Acids Research
(1984) 12 (1): 387; Genetics Computer Group, University of
Wisconsin, Madison, WI), BLASTP, BLASTN, y FASTA (Altschul et
al., J. Molec. Biol. (1990) 215: 403-410). El
programa BLAST X está públicamente disponible en el National Center
for Biotechnology Information (NCBI), y otras fuentes (Altschul
et al., BLAST Manual, NCB NLM NIH Bethesda, MD 20894;
Altschul et al., J. Mol. Biol. (1990) 215:
403-410). El bien conocido algoritmo de Smith
Waterman también puede ser utilizado para determinar la identidad.
Al comparar las secuencias de nucleótidos utilizando el programa
GAP, se prefieren los siguientes parámetros de fondo: matriz de
comparación: identidad=+10, no identidad=0, con una franquicia de
espacio de 50 y una franquicia de longitud de espacio de 3
(Needleman et al., J. Mol Biol. (1970) 48:
443-453).
La relatividad de las proteínas también puede
ser caracterizada a través de la relatividad de sus ácidos nucleicos
codificantes. Los métodos para determinar la identidad y/o
similaridad de las secuencias de polinucleótidos se describen más
arriba. Además, los métodos para determinar la similaridad de las
secuencias de polinucleótidos a través de la prueba de su capacidad
para hibridizar bajo condiciones moderada o altamente restrictivas
puede determinarse como sigue. Condiciones de hibridización
moderadamente restrictivas a manera de ejemplo son como siguen: la
hibridización a 42ºC en una solución de hibridización que comprende
50% de formamida, 1% de SDS, NaCl 1 M, 10% de sulfato de dextrano,
y lavado dos veces durante 30 minutos a 60ºC en una solución de
lavado que comprende 0.1 x SSC y 1% de SDS. Condiciones altamente
restrictivas incluyen lavados a 68ºC en una solución de lavado que
comprende 0.1 x SSC y 1% de SDS. Se entiende en la técnica que las
condiciones de restricción equivalentes pueden alcanzarse a través
de la variación de la temperatura y el regulador, o de la
concentración de sal como se describe en la técnica (Ausubel, et
al., (Eds.), Protocols in Molecular Biology, John Wiley &
Sons (1994), pp. 6.0.3 a 6.4.10). Las modificaciones en las
condiciones de hibridización pueden ser determinadas empíricamente
o calcularse de manera precisa con base en la longitud y porcentaje
del apareamiento de las bases guanosina/citosina (GC) de la sonda.
Las condiciones de hibridización pueden ser calculadas como se
describen en Sambrook et al., (Eds.), Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring
Harbor, New York (1989), pp. 9.47 a
9.51.
9.51.
Fragmentos de M-CSFR de ejemplo
de acuerdo con la invención pueden comprender uno o más, o dos o
más, de los dominios involucrados en el enlazamiento del
M-CSF/receptor (se cree que son los dominios 1, 2 y
3). Fragmentos de M-CSFR preferidos comprenden
todos los tres dominios 1, 2 y 3 de M-CSFR. Las
mutaciones y/o modificaciones adicionales de tales fragmentos o el
dominio extracelular completo de M-CSFR se
contemplan y pueden producirse como se describió más arriba en la
sección sobre las muteinas M-CSF.
La invención también proporciona anticuerpos al
M-CSFR que pueden ser utilizados como antagonistas
de M-CSF de acuerdo con los métodos de la
invención.
La M-CSFR (SEQ ID NO:8) es una
molécula de barrido de membrana con cinco dominios extracelulares
similares a la inmunoglobulina (de los cuales los dominios
1-3 se cree que están involucrados en el
enlazamiento ligando-receptor), un dominio de
transmembrana y un dominio intracelular interrumpido Src relacionado
con tirosina quinasa. Con referencia a SEQ ID NO: 8, los dominios
antes mencionados están localizados como siguen: Ig dominio 1:
aminoácidos 27-102; Ig dominio 2: aminoácidos
112-196; Ig dominio 3: aminoácido
215-285; Ig dominio 4: aminoácidos
308-399; Ig dominio 5: aminoácidos
410-492; dominio de transmembrana: aminoácidos
515-537; y dominio de quinasa: aminoácidos
582-910. Un dominio similar a inmunoglobulina
"típico" contiene una estructura de bucle usualmente anclada
por un puente disulfuro con dos cisteínas en la extremidad de cada
bucle. En la M-CSF-R, estas
cisteínas que forman los bucles similares a Ig están en las
siguientes posiciones de aminoácidos: dominio 1: 42, 84; dominio 2:
127, 177; dominio 3: 224, 278; dominio 4: no hay cisteínas
involucradas; dominio 5: 419-485.
La porción extracelular intacta de
M-CSFR o cualquier fragmento de la misma que retiene
la antigenicidad, por ejemplo, uno o más de los bucles similares a
Ig, puede ser utilizada para generar anticuerpos que se enlazarían
al receptor nativo. Anticuerpos policlonales, monoclonales,
quiméricos, injertados de CDR, humanizados, completamente humanos
y fragmentos de enlazamiento de antígeno de los mismos pueden
prepararse como se describió más arriba para los anticuerpos al
M-CSF. Los productos de anticuerpos pueden ser
seleccionados en cuanto a su actividad como antagonistas de MCSF y
en cuanto a su conveniencia en métodos de tratamiento de la
invención utilizando pruebas como las descritas en la sección
titulada "métodos de selección" aquí o utilizando cualquier
prueba adecuada conocida en la técnica.
La función biológica de M-CSF
in vivo toma lugar a través de enlazamiento y activación del
receptor M-CSF, también denominado como el producto
gen c-fms. El receptor de M-CSF
soluble humano recombinante (rhsM-CSFR) que
representa los aminoácidos 20 a 511 de SEQ ID NO: 8 (Coussens, L
et al., Nature, 320-277 (1986) se utilizó
como un reactivo de prueba in vitro para probar la capacidad
de enlazamiento a receptor de las proteínas M-CSF.
Para generar una forma soluble de un receptor de transmembrana,
solamente el dominio extracelular del receptor humano
M-CSF fue expresado en un sistema de expresión
celular recombinante baculovirus/insecto. Con el fin de purificar
el receptor soluble sin afectar adversamente la estructura terciaria
o cuaternaria, se escogieron métodos cromatográficos no
desnaturalizantes, como se describe más abajo. Existen otras
posibilidades para la purificación del receptor recombinante. La
cromatografía de afinidad puede ser empleada cuando un anticuerpo
adecuado o un ligando del receptor están disponibles.
Alternativamente, pueden añadirse "etiquetas" al terminal C
del receptor recombinante, esto es, secuencia de reconocimiento del
anticuerpo KT3, y purificarse mediante un anticuerpo antietiqueta,
esto es, con un KT3 columna, para uso en cromatografía de afinidad.
En sistemas de expresión en los cuales el rhsM-CSFR
esta glicosilado, puede utilizarse la cromatografía de lectina para
enriquecer las glicoproteínas específicas.
Uno o más de los bucles similares a Ig antes
mencionados dentro del dominio extracelular del receptor puede ser
suficiente para inhibir la reacción entre M-CSF y
M-CSFR. Así fragmentos del dominio extracelular de
M-CSFR y muteinas de los mismos puede preparase
fácilmente utilizando medios sintéticos recombinantes o químicos
bien conocidos en la técnica. Los productos pueden ser seleccionados
en cuanto a su actividad como antagonistas de M-CSF
y en cuanto a su uso adecuado en métodos de tratamiento de la
invención utilizando pruebas como las descritas en la sección
titulada "métodos de selección" aquí o utilizando cualquier
ensayo adecuado conocido en la técnica.
La administración de una proteína terapéutica a
una célula apropiada puede efectuarse a través de una terapia
genética ex vivo, in situ, o in vivo mediante
el uso de una metodología adecuada conocida en la técnica,
incluyendo el uso de métodos de transferencia física de ADN (por
ejemplo, liposomas o tratamientos químicos) o mediante el uso de
vectores virales (por ejemplo, adenovirus, virus adenoasociados, o
un retrovirus). Por ejemplo, para una terapia en vivo, puede
inyectarse un ácido nucleico que codifique la proteína deseada, bien
sea sola o en unión con un vector, liposoma o precipitado
directamente en el sujeto, y en algunas realizaciones, puede
inyectarse en el sitio donde la expresión del compuesto proteínico
es deseada. Para tratamiento ex vivo, las células del sujeto
son retiradas, se introduce ácido nucleico en esas células, y las
células modificadas son regresadas al sujeto bien de forma directa
o, por ejemplo, encapsuladas con membranas porosas que se implantan
en el paciente. Véase, por ejemplo, las patentes de los Estados
Unidos Nos. 4, 892,538 y 5, 283,187. Hay una variedad de técnicas
disponibles para introducir ácidos nucleicos en células viables. Las
técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico es transferido
en células cultivadas in vitro, o in vivo en las
células del huésped buscado. Las técnicas adecuadas para la
transferencia de ácido nucleico en células de mamíferos in
vitro incluyen el uso de liposomas, electroporación,
microinyección, fusión celular, DEAE dextrano, y precipitación con
fosfato de calcio. Un vector comúnmente usado para la administración
ex vivo de un ácido nucleico es un retrovirus.
Otras técnicas de transferencia de ácidos
nucleicos in vivo incluyen transfección con vectores virales
(tales como adenovirus, o virus de Herpes simplex I, o virus
adenoasociados), y sistemas basados en lípidos. El ácido nucleico y
el agente de transfección están asociados opcionalmente con una
macropartícula. Agentes de transfección de ejemplo incluyen
coprecipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio,
tranfección mediada por DEAE-dextrano, DOTMA
((dioleoiloxipropil) trimetil amonio bromuro amonio cuaternario,
comercializado como Lipofectina por GIBCO-BRL))
(Felgner et al, (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84,
7413-7417; Malone et al. (1989) Proc. Natl
Acad. Sci. USA 86: 6077-6081); diésteres de
glutamato lipofilicos con cabezas pendientes de trimetilamonio (Ito
et al. (1990) Biochem. Biophys. Acta 1023,
124-132); los lípidos originales metabolizables
tales como el lípido catiónico dioctadecilamido glicilespermina
(DOGS, Transfectam, Promega) y
dipalmitoilfosfatidiletanolamilespermina (DPPES) (J.P. Behr (1986)
Tetrahedron Lett. 27, 5861-5864; J.P. Behr et
al. (1989) Proc Natl. Acad. Sci. USA 86,
6982-6986); sales de amonio cuaternario
metabolizables (DOTB, N-(1-[2,3-dioleoiloxi]
propil)-N.N.N-trimetil amonio
metilsulfato (DOTAP) (Boehringer Mannheim), polietilenimina (PEI),
ésteres de dioleoilo, Cho TB, ChoSC, DOSC) (Leventis et al.
(1990) Biochim. Inter. 22, 235-241);
3beta[N-(N',N'-dimetilaminoetano)-carbamoil]
colesterol (DC-Chol), dioeloilfosfatidil
etalonamida
(DOPE)/3beta[N-(N',N'-dimetilaminoetano)-carbamoil]colesterol
DC-ChoI en una de las mezclas (Gao et al.,
(1991) Biochim, Biophys. Acta 1065, 8-14) espermina,
espermidina, lipopoliaminas (Behr et al., Bioconjugate Chem,
1994, 5: 382-389), polilisinas lipofilicas (LPLL)
(Zhou et al., (1991) Biochim, Biophys. Acta 939,
8-18),
[[(1,1,3,3-tetrametilbutil)cre-soxi]etoxi]etil]dimetilbencylamonio
hidróxido (hidróxido de DEBDA) con exceso de
fosfatidilcolina/colesterol (Ballas et al., (1988) Biochim.
Biophys. Acta 939, 8-18), mezclas de bromuro de
cetiltrimetilamonio (CTAB)/DOPE (Pinnaduwage et al, (1989)
Biochim. Biophys. Acta 985, 33-37), diéster
lipofilico de ácido glutámico (TMAG) con DOPE, CTAB, DEBDA, bromuro
de didodecilamonio (DDAB), y estearil amina en mezcla con
fosfatidil etanolamina (Rose et al., (1991) Biotechnique 10,
520-525), DDAB/DOPE (TransfectACE, GIBCO BRL), y
lípidos que portan oligogalactosa. Agentes potenciadores de la
transfección a título de ejemplo que incrementan la eficiencia de
la transferencia incluyen por ejemplo,
DEAE-dextrano, polibreno, péptido disruptivo de
lisosomas (Ohmori N I et al., Biochem Biophys Res Commun Jun.
27, 1997; 235(3): 726-9), proteoglicanos
basados en condroitano, proteoglicanos sulfatados, polietilenimina,
polilisina (Pollard H et al., J Biol Chem, 1998 273 (13):
7507-11), péptidos enlazadores de integrina
CYGGRGDTP, nonasacárido de dextrano lineal, glicerol, grupos
colesterilo suspendidos en el enlace internucleosido
3'-terminal de un oligonucleótido (Letsinger, R.L.
1989 Proc Natl Acad Sci USA 86: (17): 6553-6),
lipofosfatida, lisofosfatidilcolina, lisofosfatidiletanolamina y
1-oleoil lisofosfatidilcolina.
En algunas situaciones puede ser deseable
administrar el ácido nucleico con un agente que dirija el vector
que contiene el ácido nucleico a las células objetivo. Tales
moléculas "que buscan objetivos" incluyen anticuerpos
específicos para una proteína de la membrana de la superficie
celular sobre la célula objetivo, o un ligando para un receptor
sobre la célula objetivo. Cuando se emplean liposomas, las proteínas
que se enlazan a la membrana de la superficie celular asociados con
la endocitosis pueden utilizarse para apuntar y/o facilitar el
consumo. Ejemplos de tales proteínas incluyen proteínas de cápsidos
y fragmentos de los mismos trópicos para un tipo celular
particular, anticuerpos para proteínas que sufren internalización en
la ciclización y proteínas que apuntan a la localización
intracelular y potencian la vida media intracelular. En otras
realizaciones, puede utilizarse la endocitosis mediada por
receptor. Tales métodos se describen, por ejemplo en Wu et
al., 1987 o Wagner et al., 1990. Para una revisión de
los protocolos actualmente conocidos de marcación de genes y
terapia de genes, véase Anderson 1992. Véase también WO 93/25673 y
las referencias citadas ahí. Para revisiones adicionales de
tecnología de terapias genética, véase Friedmann, Science, 244:
1275-1281 (1989); Anderson, Nature, supplement to
vol. 392, No 6679, pp. 25-30 (1998); Verma,
Scientific American: 68-84 (1990); and Miller,
Nature, 357: 455-460 (1992).
Los compuestos antisentido y métodos para su uso
también son provistos para la presente invención. El nivel de
actividad de M-CSF o M-CSFR puede
reducirse utilizando métodos bien conocidos antisentido,
"derribo" de genes, ribozima y/o hélice triple para disminuir
la expresión del nivel genético. Las técnicas para producción y uso
de tales moléculas son bien conocidas para los expertos en la
técnica.
Los compuestos antisentido pueden bloquear la
traslación de ARNm hibridizando al ARNm objetivo y previniendo la
traslación de proteínas incluyendo los oligonucleótidos
complementarios al gen objetivo ARNm. El objetivo puede hacerse con
respecto a la región de codificación más preferiblemente a regiones
transcritas, no traducidas. No se requiere una complementaridad
absoluta, solamente la complementaridad suficiente para permitir que
se hibridice con el ARN o ADN endógeno y que se forme un dúplex o
triplex estable. La capacidad para hibridizar depende tanto del
grado de complementaridad como de la longitud del ácido nucleico
antisentido. Los oligonucleótidos complementarios a regiones no
codificantes del gen de interés también pueden utilizarse en un
intento antisentido para inhibir la traslación de ARNm endógeno.
Los ácidos nucleicos antisentido son preferiblemente
oligonucleótidos que varían desde 6 hasta 50 nucleótidos en
longitud. En aspectos específicos, el oligonucleótido es al menos
de 10 nucleótidos, al menos 17 nucleótidos, o al menos 20
nucleótidos.
Los estudios in vitro se llevan a cabo
primero para cuantificar la capacidad del oligonucleótido
antisentido candidato para inhibir la expresión genética objetivo.
Se prefiere que estos estudios utilicen controles que distingan
entre la inhibición de gen antisentido y los efectos biológicos no
específicos de los oligonucleótidos. También se prefiere que estos
estudios comparen niveles del ARN objetivo o de la proteína con la
del ARN o proteína de control interno.
Los oligonucleótidos pueden ser ADN o ARN o
mezclas quiméricas o derivados o versiones modificadas de los
mismos, y pueden ser de cadena sencilla o cadena doble (ARNi). El
oligonucleótido puede ser modificado en la unidad estructural
básica, unidad estructural azúcar, o esqueleto fosfato, por ejemplo,
para mejorar la estabilidad de la molécula o la hibridización.
Véase por ejemplo, WO 03/088921; Dean, Curr Opin Biotechnol.
12(6): 622-5, 2001; Geary et al, Curr
Opin Investig Drugs. 2(4): 562-573, 2001. El
oligonucleótido puede ser conjugado con otras estructuras,
incluyendo péptidos (por ejemplo, células huésped objetivo in
vivo) o agentes que faciliten el transporte a través de la
membrana celular (véase, por ejemplo, Letsinger et al.,
1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6553-6556;
Lemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84:
648-652; la publicación PCT No. WO88/09810,
publicada el 15 de diciembre de 1988) o la barrera
sangre-cerebro (véase, por ejemplo, publicación PCT
No. WO89/10134, publicada el 25 de abril de 1998), agentes de
ruptura disparados por hibridización (véase, por ejemplo, Krol
et al., 1988, BioTechniques 6:958-976), o
agentes de intercalamiento (véase, por ejemplo, Zon, 1988, Pharm.
Res. 5:539-549). El compuesto antisentido puede ser
también un oligonucleótido alfa-anomérico el cual
forma híbridos de doble cadena específicos con ARN complementario
que corren paralelas una a la otra (Gautier et al., 1987,
Nucl. Acids Res. 15: 6625-6641). El oligonucleótido
puede ser un 2'-( )-metilribonucleótido (Inoue,
et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15:
6131-6148), o un análogo ARN-ADN
quimérico (Inoue, et al., 1987. FEBS Lett. 215:
327-330).
Las moléculas antisentido deberían ser
administradas a células que expresen el gen objetivo in vivo.
Se ha desarrollado un cierto número de métodos para administrar ADN
o ARN antisentido a las células; por ejemplo, las moléculas
antisentido pueden ser inyectadas directamente en el sitio del
tejido, o moléculas antisentido modificadas, diseñadas para apuntar
a las células deseadas (por ejemplo, antisentido enlazado con
péptidos o anticuerpos que enlazan específicamente receptores o
antígenos expresados en la superficie celular objetivo) pueden ser
administrados sistémicamente. En una modalidad, las concentraciones
intracelulares del antisentido suficientes para suprimir la
traducción del ARNm endógeno puede ser alcanzado con una
construcción de ADN recombinante en la cual el oligonucleótido
antisentido se coloca bajo el control de un promotor fuerte. El uso
de tal construcción para transfectar células objetivo en el paciente
resultará en la transcripción de cantidades suficientes del ARN de
cadena sencilla que formará los pares de bases complementarias con
los transcritos genéticos objetivos endógenos y por lo tanto
previene en la traducción del gen de ARNm objetivo. Por ejemplo,
puede introducirse un vector, por ejemplo, tal como el que es
consumido por una célula y dirige la transcripción de un ARN
antisentido. Tal vector puede permanecer como episomal o hacerse
integrado cromosómicamente, en tanto pueda ser transcrito para
producir el ARN antisentido deseado.
Las moléculas de ribozima diseñadas para
escindir catalíticamente los transcritos del gen ARNm objetivo
también pueden ser utilizadas para prevenir la traducción del gen
de ARNm objetivo y, por lo tanto, la expresión del producto
genético objetivo (véase, por ejemplo, la publicación internacional
PCT WO90/11364, publicada el 4 de octubre de 1990; Sarver et
al., 1990, Science 247, 1222-1225). Las
ribozimas son moléculas de ARN enzimáticas capaces de catalizar la
ruptura especifica del ARN. (para una revisión, véase Rossi, 1994,
Current Biology 4: 469-471). El mecanismo de la
acción de la ribozima involucra la hibridización específica de la
secuencia de la molécula de ribozima al ARN objetivo
complementario, seguida por un evento de ruptura endonucleolitica.
La composición de las moléculas de ribozima debe incluir una o más
secuencias complementarias al ARNm del gen objetivo,
preferiblemente en un sitio más cercano al extremo 5', y debe
incluir la secuencia catalítica bien conocida responsable de la
ruptura del ARNm. Para esta secuencia, véase, por ejemplo, la
Patente de los Estados Unidos No. 5, 093,246. Las ribozimas de
cabeza de martillo, las cuales rompen el ARNm en localizaciones
dictadas por las regiones flanqueantes específicas que forman los
pares de bases complementarias con el ARNm objetivo también pueden
ser utilizadas. La construcción y producción de las ribozimas de
cabeza de martillo es conocida en la técnica y se describe de forma
más completa en Myers, 1995, Molecular Biology and Biotechnology: A
Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, New York, (véase
especialmente Figura 4, página 833) y en Haseloff and Gerlach,
1988, Nature, 334: 585-591. Las endorribonucleasas
de ARN (también conocidas como "ribozimas tipo Cech"), también
pueden ser utilizadas. Ribozimas tales como la que se presenta de
forma natural en la Tetrahymena thermophila (conocida como
IVS o L-19 IVS ARN) han sido descritas en Zaug,
et al., 1984, Science, 224: 574-578; Zaug
and Cech, 1986, Science, 231: 470-475; Zaug, et
al., 1986, Nature, 324: 429-433; la solicitud
de patente internacional publicada No. WO 88/04300; y Been and Cech,
1986, Cell, 47: 207-216. Las ribozimas tipo Cech
tienen un sitio activo de ocho pares de bases el cual hibridiza a
una secuencia de ARN objetivo. Las ribozimas también pueden ser
compuestas de oligonucleótidos modificados (por ejemplo, para una
estabilidad mejorada, mayor acierto en el objetivo, etc.) y
deberían ser administradas a células que expresan el gen objetivo
in vivo. Puesto que las ribozimas a diferencia de las
moléculas antisentido, son catalíticas, se requiere una
concentración intracelular más baja para alcanzar eficiencia.
La expresión del gen objetivo endógeno también
puede ser reducida por inactivación o "derribamiento" del gen
objetivo o su promotor utilizando recombinación homóloga con
objetivo (por ejemplo, véase Smithies, et al., 1985, Nature
317:230-234; Thomas and Capecchi, 1987, Cell
51:503-512; Thompson, et al., 1989, Cell
5:313-321). Por ejemplo, un gen objetivo mutante no
funcional (o una secuencia de ADN completamente no relacionada)
flanqueada por ADN homólogo al gen objetivo endógeno (bien sea las
regiones codificantes o regiones reguladoras del gen objetivo)
puede utilizarse en este caso, con o sin un marcador seleccionable
y/o un marcador seleccionable negativo, para transfectar células
que expresan el gen objetivo in vivo. La inserción de una
construcción de ADN a través de una recombinación homóloga con
objetivo, trae como resultado la inactivación del gen objetivo.
Alternativamente, la expresión del gen objetivo
endógeno puede reducirse mediante secuencias de
desoxirribonucleótidos con objetivo complementarias a la región
reguladora del gen objetivo (esto es, el promotor y/o potenciadores
del gen objetivo) para formar estructuras helicoidales triples que
previenen la transcripción del gen objetivo en células objetivo en
el cuerpo. (véase en general, Helene, 1991, Anticancer Drug Des.,
6(6):569-584; Helene, et al., 1992,
Ann. N.Y. Acad. Sci., 660:27-36; and Maher, 1992,
Bioassays 14(12):807-815).
Las moléculas de ácido nucleico que se utilizan
en la formación de la hélice triple para la inhibición de la
transcripción deberían ser de cadena sencilla y compuestas de
desoxinucleótidos. La composición base de estos oligonucleótidos
debe estar diseñada para promover la formación de hélice triple a
través de las reglas de apareamiento de bases de Hoogsteen, las
cuales generalmente requieren tensiones dimensionables bien sean de
purinas o pirimidinas presentes en una hebra de un dúplex. Las
secuencias de nucleótidos pueden ser basadas en pirimidinas, las
cuales traerán como resultado tripletes TAT y CGC.+ a través de las
tres hebras asociadas de la hélice triple resultante. Las moléculas
ricas en pirimidina proveen complementareidad de bases a una región
rica en purina de una cadena sencilla de un dúplex en una
orientación paralela de esa cadena. Además. Las moléculas de ácido
nucleico pueden escogerse de forma que sean ricas en purina, por
ejemplo, contener un estiramiento de residuos G. Estas moléculas
formarán una hélice triple con un dúplex de ADN que es rico en
pares GC, en los cuales la mayoría de los residuos de purina están
localizados en una cadena sencilla del dúplex objetivo, resultando
en tripletes GGC a través de las tres cadenas en el triplete.
Alternativamente, las secuencias potenciales que pueden ser
objetivo para la formación de hélices triples pueden ser
incrementadas creando una llamada molécula de ácido nucleico de
"retroceso". Las moléculas de retroceso son sintetizadas en
una forma alternativa 5'-', 3'-5', de manera que
formen parejas de bases con una primera cadena de un dúplex y luego
la otra, eliminando la necesidad de un estiramiento dimensionable
bien para purinas o pirimidinas que estén presentes en una cadena
de un dúplex.
Si es antisentido, la terapia con ribozima o
hélice triple reduce la expresión del gen objetivo a niveles que
son indeseablemente bajos, y pueden administrarse proteínas de
reemplazo. Alternativamente, la terapia de genes para incrementar
la expresión de los genes puede llevarse a cabo utilizando ácidos
nucleicos modificados que no contengan secuencias susceptibles a
tratamientos con antisentido, ribozima o hélices triples que estén
siendo utilizados.
Las moléculas de ARN y ADN antisentido, ribozima
y hélice triple de la invención pueden prepararse por cualquier
método conocido en la técnica de la síntesis de moléculas de ADN y
ARN. Incluyen técnicas para la síntesis química de
oligodesoxirribonucleótido y oligorribonucleótidos bien conocidos en
la técnica tales como por ejemplo síntesis química en fase sólida
con fosforamidita. Alternativamente, las moléculas de ARN pueden ser
generadas en transcripción in vitro e in vivo de
secuencias de ADN que codifican la molécula terapéutica de ARN. Los
métodos químicos sintéticos incluyen el uso de sintetizadores de ADN
automatizados disponibles comercialmente. Los oligonucleótidos de
fosforotioato pueden ser sintetizados por el método de Stein et
al. (1988, Nucl. Acids Res. 16:3209), y los oligonucleótidos de
metilfosfonato pueden ser preparados mediante el uso de soportes
poliméricos con poros de vidrio (Sarin, et al., 1988, Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448-7451).
Tal como se usa aquí, el término "proteína"
incluye proteínas, oligopéptidos, polipétidos, péptidos y similares.
Adicionalmente, el término proteína también puede referirse a
fragmentos, multímeros o agregados de moléculas intactas y/o
fragmentos. Las proteínas pueden tener presencia natural o pueden
ser producidas a través de medios de ADN recombinante o por
síntesis química y/o enzimática. Véase, por ejemplo Sambrook et
al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratories (3rd ed. 2001).
El término "péptidos" se utiliza aquí para
referirse a cadenas relativamente cortas de aminoácidos,
preferiblemente entre 6 y 100 aminoácidos de longitud.
Los péptidos pueden ser seleccionados en cuanto
a su actividad de enlazamiento deseada (por ejemplo, enlazamiento a
M-CSF o M-CSFR) o en cuanto a su
actividad biológica utilizando técnicas de despliegue de fagos
(véase, por ejemplo Scott et al. Science 249: 386 (1990);
Devlin et al., Science 249: 404 (1990); Patente de los
Estados Unidos No. 5,223,409, emitida el 29 de Junio de 1993;
Patente de los Estados Unidos No. 5,733,731, emitida el 31 de Marzo
de 1998; Patente de los Estados Unidos No. 5,498,530, emitida el 12
de Marzo de 1996; Patente de los Estados Unidos No. 5,432,018,
emitida el 11 de Julio 1995; Patente de los Estados Unidos No.
5,338,665, emitida el 16 de Agosto de 1994; Patente de los Estados
Unidos No. 5,922,545, emitida el 13 de Julio de 1999; WO 96/40987,
publicada el 19 de Diciembre de 1996; y WO 98/15833, publicada el 16
de Abril de 1998). En tales bibliotecas, las secuencias de péptidos
son desplegadas por fusión con proteínas red de recubrimiento de un
fago filamentoso. Típicamente, las proteínas desplegadas se eluyen
por afinidad contra un dominio extracelular y movilizado con
anticuerpo de un receptor. Los fagos retenidos pueden ser
enriquecidos mediante rondas sucesivas de purificación por afinidad
y repropagación. Los mejores péptidos enlazantes pueden ser
secuenciados para identificar los residuos clave dentro de una o
más familias de péptidos estructuralmente relacionadas.
Los péptidos también pueden ser seleccionados
utilizando otros métodos, tales como la generación de librerías de
péptidos fusionadas al término carboxilo del represor Iac y
expresadas en E. coli, o desplegando péptidos en la membrana
exterior de E. coli por fusión con una lipoproteína asociada
con peptidoglicano (PAL). En otro método, la traslación del ARN
aleatorio se detiene antes de la liberación del ribosoma, trayendo
como resultado una librería de polipéptidos con su ARN asociado a
un unido. Otros métodos emplean la unión química de péptidos al ARN
(véase, por ejemplo Roberts y Szostak, Proc Natl Acad Sci USA,
94:12297-303 (1997)). Se han desarrollado librerías
de péptidos derivadas químicamente en las cuales los péptidos se
inmovilizan sobre materiales estables no biológicos tales como
barras de polietileno o resinas permeables a solventes. Otras
librerías de péptidos derivadas químicamente utilizan
fotolitografía para barrer péptidos inmovilizados sobre láminas de
vidrio. La selección química de péptidos puede ser ventajosa puesto
que permite el uso de D-aminoácidos y otros análogos
no naturales, así como elementos no peptídicos. Los métodos
biológicos y químicos están revisados en Wells and Lowman, Curr
Opin Biotechnol 3: 355-62 (1992).
Los péptidos pueden ser modificados
adicionalmente por mutagénesis al nivel de ADN. Las librerías de
mutagénesis pueden crearse y seleccionarse para optimizar
adicionalmente la secuencia de los mejores enlazantes (Lowman, Ann
Rev Biophys Biomol Struct 26: 401-24 (1997)). El
análisis estructural de la interacción proteína - proteína también
puede ser utilizado para sugerir péptidos que imitan la actividad
enlazante de ligandos de proteínas grandes. En tal análisis, la
estructura cristalina puede sugerir la identidad y orientación
relativa de residuos críticos del ligando de proteína grande, a
partir del cual puede diseñarse un péptido (véase, por ejemplo,
Takasaki et al., Nature Biotech 15: 1266-70
(1997)).
Péptidos aleatorios o péptidos derivados de CDRs
que enlazan antígeno pueden fusionarse en una forma lineal como
parte de un andamiaje tridimensional, por ejemplo, un anticuerpo o
porción del mismo tal como una región constante, para crear nuevas
macromoléculas que se enlacen al antígeno deseado. Pueden incluirse
copias múltiples del mismo péptido o diferentes péptidos.
Tal como se usa aquí, el término
"peptidomimético" es un compuesto no peptídico que comprende un
ensamblaje de cadenas laterales de aminoácidos, o farmacóforos, o
derivados adecuados de los mismos, que se soportan sobre un
andamiaje tal que la orientación espacial de los farmacóforos imite
sustancialmente la conformación bioactiva de un péptido natural.
Por ejemplo, un peptidomimético puede carecer de aminoácidos o
enlaces peptídicos pero retener la disposición tridimensional
particular de los grupos de las cadenas peptídicas del péptido
original que se requieren para la actividad de enlazamiento. El
andamiaje puede comprender un esqueleto de carbono bicíclico,
tricíclico o policíclico más alto o de heteroátomos, o puede basarse
en una o más estructuras de anillo (por ejemplo, piridina, indazol,
etc) o enlaces amida. Este andamiaje puede estar unido por
espaciadores a un grupo ácido (por ejemplo un grupo funcional ácido
carboxílico) de un extremo y a un grupo básico (por ejemplo una
unidad estructural que contiene N tal como amidina o guanidina) en
el otro extremo del núcleo. Las técnicas a título de ejemplo para
la síntesis de peptidomimético se describen en la solicitud de
patente de los Estados Unidos No. 20030199531 publicada el 23 de
octubre de 2003, la solicitud de patente de los Estados Unidos No.
20030139348 publicada el 24 de julio de 2003.
Además de los anticuerpos y otras proteínas,
esta invención también contempla antagonistas de
M-CSF alternativos que incluyen, pero no se limitan
a, moléculas pequeñas que también son efectivas en el tratamiento de
la metástasis del cáncer y/o la pérdida de hueso asociada con la
metástasis del cáncer. Tales moléculas pequeñas pueden ser
identificadas probando su capacidad para enlazarse a
M-CSF y/o inhibir la interacción entre
M-CSF y M-CSFR.
Los métodos para medir el enlazamiento de
M-CSF con moléculas pequeñas son fácilmente
disponibles en la técnica e incluyen por ejemplo, pruebas de
competición donde la molécula pequeña interfiere con la interacción
entre M-CSF y su receptor (M-CSFR)
o un anticuerpo anti M-CSF. Alternativamente, las
pruebas de enlazamiento directo pueden ser utilizadas para medir la
interacción de una molécula pequeña con M-CSF. A
manera de ejemplo, puede emplearse una prueba de ELISA donde el
M-CSF se adsorbe sobre una matriz insoluble tal como
una placa o perla de cultivo de tejidos. Un anticuerpo marcado
M-CSFR o anti M-CSF es bloqueado en
cuanto al enlazamiento al M-CSF por inclusión de la
molécula pequeña de interés. Alternativamente, el enlazamiento de
una molécula pequeña al M-CSF puede ser determinado
mediante una prueba de búsqueda de células activadas por
fluorescencia (FACS). Por este método, las células que expresan
M-CSF se incuban con un anticuerpo
anti-M-CSF marcado con fluorescencia
o un anticuerpo anti-M-CSF en la
presencia de un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia. El
enlazamiento de una molécula pequeña a M-CSF puede
establecerse mediante una disminución dependiente de una dosis en un
enlace de fluorescencia a las células que expresan
M-CSF. De la misma forma, el enlazamiento directo de
una molécula pequeña puede establecerse mediante marcación, por
ejemplo, radiomarcación o marcación con fluorescencia, de la
molécula pequeña, incubando con células que expresan
M-CSF o M-CSF inmovilizadas y
probando la florescencia de la molécula pequeña enlazada.
La terapia efectiva depende de la identificación
de agentes eficaces carentes de toxicidad significativa. Los
compuestos potencialmente utilizan la prevención del tratamiento de
la pérdida ósea asociada con la metástasis del cáncer pueden
seleccionarse utilizando diversos ensayos. Por ejemplo, un candidato
antagonista puede ser caracterizado primero en un sistema de
células cultivadas para determinar su capacidad para neutralizar
M-CSF en la inducción de osteoclastogénesis. Tal
sistema puede incluir el cocultivo de osteoblastos calvariales de
ratón y células de bazo ((Suda et al., Modulation of
osteoclast differentiation. Endocr. Rev. 13: 66 80, 1992; Martin
and Udagawa, Trends Endocrinol. Metab. 9: 6-12,
1998), el cocultivo de líneas celulares estromales de ratón (por
ejemplo MC3T3-G2/PA6 y ST2) y células de bazo de
ratón ((Udagawa et al., Endocrinology 125: 1805 13, 1989) y
el cocultivo de células ST2 y células de médula ósea, células
mononucleares de sangre periférica o macrófagos alveolares (Udagawa
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 7260 4, 1990; Sasaki
et al., Cancer Res. 58: 462 7, 1998; Mancino et al.,
J. Surg. Res.100: 18-24, 2001). En la ausencia de
cualquier antagonista de M-CSF, las células
multinucleadas formadas en tales cocultivos satisfacen los criterios
principales de los osteoclastos tales como la actividad de la
fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP, una enzima marcadora
de osteoclastos) receptores de calcitonina,
P60C-STC, receptores de vitronectina, y la capacidad
para formar pozos de reabsorción sobre el hueso y sobre láminas de
dentina. La presencia de un antagonista de M-CSF
efectivo inhibe la formación de tales células multinucleadas.
Además de los anteriores sistemas de cocultivo,
la capacidad de un antagonista de M-CSF candidato en
la inhibición de la osteoclastogénesis puede probarse en un sistema
libre de células estromales o libre de osteoblastos. El
M-CSF requerido para la osteclastogénesis puede ser
suministrado mediante células de cáncer metastático cocultivadas
(por ejemplo, MDA 231) o por medios condicionados a partir de estas
células de cáncer (Mancino et al., J. Surg. Res. 0:
18-24, 2001) o mediante la adición de
M-CSF purificado.
La eficacia de un antagonista dado de
M-CSF en la prevención o tratamiento de perdida de
hueso asociada con la metástasis de cáncer también puede probarse
en cualquiera de los sistemas de modelos de metástasis ósea en
animales familiares para los expertos en la técnica. Tales sistemas
modelo incluyen los que involucran una inyección directa de células
tumorales en la cavidad medular de los huesos (Ingall, Proc. Soc.
Exp. Biol. Med., 117: 819-22, 1964; Falasko, Clin.
Orthop. 169: 20 7, 1982), en la aorta abdominal de ratas (Powles
et al., Br. J. Cancer 28: 316 21, 1973), en la vena lateral
de la cola de ratón o en el ventrículo izquierdo del ratón
(Auguello et al., Cancer Res. 48: 6876 81, 1988). En la
ausencia de un antagonista efectivo de M-CSF, la
metástasis osteolítica de hueso formada a partir de células
tumorales inyectadas puede determinarse por radiografías (áreas de
lesiones óseas osteolíticas) o histoquímica (tejidos óseos y
suaves). Sasaki et al., Cancer Res. 55: 3551 7, 1995; Yoneda
et al., J. Clin. Invest. 99: 2509 17, 1997. Clohisy and
Ramnaraine, Orthop Res. 16: 660 6, 1998. Yin et al., J.
Clin. Invest. 103: 197 206, 1999. En la presencia de un antagonista
efectivo de M-CSF, la metástasis ósea osteolítica
puede prevenirse, o inhibirse para dar como resultado una metástasis
más baja y/o más pequeña.
Los antagonistas de M-CSF de la
presente invención también pueden ser útiles en la prevención o
tratamiento de metástasis de cáncer. La efectividad de un
antagonista de M-CSF candidato en la prevención o
tratamiento de la metástasis de cáncer puede seleccionarse
utilizando un modelo de invasión de base de membrana amniónica
humana tal como se describe en Filderman et al., Cancer Res
52: 36616, 1992. Además, cualquiera de los sistemas modelo animales
de metástasis de los diversos tipos de cáncer también pueden ser
utilizados. Tales sistemas modelo incluyen, pero no se limitan, a
los descritos en Wenger et al., Clin. Exp. Metastasis 19: 169
73, 2002; Yi et al., Cancer Res. 62: 917 23, 2002; Tsutsumi
et al., Cancer Lett 169: 77-85,2001;
Tsingotjidou et al., Anticancer Res. 21: 971 8, 2001;
Wakabayashi et al., Oncology 59: 75 80, 2000; Culp and
Kogerman, Front Biosci. 3:D672 83, 1998; Runge et al.,
Invest Radiol. 32: 212 7; Shioda et al., J. Surg. Oncol. 64:
122 6, 1997; Ma et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 37: 2293
301, 1996; Kuruppu et al., J Gastroenterol Hepatol. 11: 26
32, 1996. En la presencia de un antagonista efectivo de
M-CSF, la metástasis de cáncer puede ser prevenida,
o inhibida para dar como resultado metástasis menores y/o más
pequeñas.
La identificación de antagonistas adicionales de
M-CSF puede alcanzarse utilizando cualquiera de un
gran número de métodos conocidos para identificar y obtener
proteínas que interactúen específicamente con otras proteínas o
polipéptidos, por ejemplo, un sistema de selección de dos híbridos
en levadura tal como el descrito en la patente de los Estados
Unidos No 5,283,173 o el equivalente. En una realización de la
presente invención, un ADNc que codifica M-CSF, o
un fragmento del mismo, puede ser clonado en un vector híbrido de
dos cebos y utilizado para seleccionar una librería objetivo
complementaría para una proteína que tiene actividad de
enlazamiento a M-CSF.
La actividad antitumoral de un antagonista
particular de M-CSF, o combinación de antagonistas
de M-CSF, puede evaluarse in vivo utilizando
un modelo animal adecuado. Por ejemplo, los modelos de cáncer del
linfoma xenogénicos donde se introducen células de linfoma humano
en animales con compromiso inmune, tales como ratones desnudos o
SCID. Puede predecirse la eficacia utilizando pruebas que midan la
inhibición de la formación de tumores, la regresión tumoral o la
metástasis, y similares.
La información de secuencia de aminoácidos
provista por la presente invención también hace posible la
identificación de compuestos asociados de enlazamiento con los
cuales interactuarán los polipéptidos o polinucléotidos de
M-CSF o M-CSFR. Los métodos para
identificar los compuestos asociados del enlazamiento incluyen
pruebas en solución, pruebas in vitro donde los polipéptidos
de M-CSF o M-CSFR son inmovilizados,
y pruebas basadas en células. La identificación de compuestos
asociados en el enlazamiento de polipéptidos M-CSF o
M-CSFR proporcionan candidatos para la intervención
terapéutica o profiláctica en patologías asociadas con actividad
biológica normal o aberrante de M-CSF o
M-CSFR.
La invención incluye varios sistemas de prueba
para identificar asociados de enlazamiento para polipéptidos de
M-CSF o M-CSFR. En las pruebas en
solución, los métodos de la invención comprenden las etapas de (a)
poner en contacto los polipéptidos M-CSF o
M-CSFR con uno o más compuestos de asociación de
enlazamiento candidatos y (b) identificar los compuestos que se
enlazan al polipéptido o polipéptidos de M-CSF o
M-CSFR. La identificación de los compuestos que se
enlazan a los polipéptidos de M-CSF o
M-CSFR puede lograrse mediante el aislamiento del
polipéptido M-CSF o M-CSFR/complejo
de asociación de enlazamiento, y separando el polipéptido de
M-CSF o M-CSFR del compuesto de
asociación de enlazamiento. Una etapa adicional para caracterizar
las propiedades físicas, biológicas y/o bioquímicas de los
compuestos de asociación de enlazamiento también está comprendida
en otra realización de la invención. En un aspecto, el complejo
polipéptido de M-CSF o
M-CSFR/asociado de enlazamiento se aísla utilizando
un anticuerpo inmunoespecífico para el polipéptido de
M-CSF o M-CSFR o el compuesto
asociado de enlazamiento candidato.
En aún otras realizaciones, tanto el polipéptido
de M-CSF o M-CSFR o el compuesto
asociado de enlazamiento candidato comprende una marcación o
etiqueta que facilita su aislamiento, y los métodos de la invención
para identificar compuestos asociados de enlazamiento incluyen una
etapa de aislamiento del complejo polipéptido de
M-CSF o M-CSFR/asociado de
enlazamiento a través de la interacción con la marcación o etiqueta.
Una etiqueta de ejemplo de este tipo es una secuencia de
polihistidina, en general alrededor de seis residuos de histidina,
que permite el aislamiento de un compuesto marcado de esa manera
utilizando quelación con níquel. Otros marcadores y etiquetas,
tales como la etiqueta FLAG® (Eastman Kodak, Rochester, NY), bien
conocidos y utilizados de forma rutinaria en la técnica, son
abarcados por la invención.
En una variación de una prueba in vitro,
la invención provee un método que comprende las etapas de (a) poner
en contacto un polipéptido de M-CSF o
M-CSFR inmovilizado con un compuesto asociado de
enlazamiento candidato y (b) detectar el enlazamiento del compuesto
candidato al polipéptido de M-CSF o
M-CSFR. En una realización alternativa, el
compuesto asociado de enlazamiento candidato es inmovilizado y se
detecta el enlazamiento del polipéptido M-CSF o
M-CSFR. La inmovilización se logra utilizando
cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica, e
incluyendo el enlazamiento covalente a un soporte, una perla, o una
resina cromatográfica, así como la interacción de alta afinidad no
covalente de tal forma que el enlazamiento del anticuerpo, o el uso
de enlazamiento estreptavidina/biotina donde el compuesto
inmovilizado incluye una unidad estructural biotina. La detección
del enlazamiento puede lograrse (i) utilizando un marcador
radioactivo sobre el compuesto que no está inmovilizado, (ii)
utilizando un marcador fluorescente sobre el compuesto no
inmovilizado, (iii) utilizando un anticuerpo inmunoespecífico para
el compuesto no inmovilizado, (iv) utilizando un marcador sobre el
compuesto no inmovilizado que excite un soporte fluorescente al cual
se ha unido el compuesto inmovilizado, así como otras técnicas bien
conocidas y practicadas rutinariamente en la técnica.
Los agentes, por ejemplo anticuerpos o
compuestos químicos orgánicos/inorgánicos que modulan (esto es,
incrementan, disminuyen, o bloquean) la actividad o expresión de
los polipéptidos de M-CSF o M-CSFR
pueden identificarse incubando un modulador putativo con una célula
que expresa un polipéptido o polinucleótido de M-CSF
o M-CSFR y determinando el efecto del modulador
putativo sobre la actividad o expresión del polipéptido o
polinúcleotido de M-CSF o M-CSFR.
La selectividad de un compuesto que modula actividad de un
polipéptido o polinúcleotido M-CSF o
M-CSFR puede evaluarse comparando sus efectos sobre
el polipéptido o polinúcleotido de M-CSF o
M-CSFR con su efecto en otros compuestos
relacionados. Los moduladores selectivos pueden incluir, por
ejemplo, anticuerpos y otras proteínas, péptidos, o moléculas
orgánicas que se enlacen específicamente a polipéptidos
M-CSF o M-CSFR o a un ácido
nucleico que codifique un polipéptido M-CSF o
M-CSFR. Los moduladores de la actividad del
polipéptidos de M-CSF o M-CSFR será
terapéuticamente útil en el tratamiento de enfermedades y
condiciones fisiológicas en las cuales está involucrada la
actividad normal o aberrante del polipéptido de
M-CSF o M-CSFR.
Los métodos de la invención para identificar
moduladores incluyen variaciones sobre cualquiera de los métodos
descritos más arriba para identificar los compuestos asociados de
enlazamiento, incluyendo las variaciones técnicas donde un
compuesto asociado de enlazamiento ha sido identificado y la prueba
de enlazamiento se lleva a cabo en la presencia y ausencia de un
modulador candidato. Un modulador se identifica en aquellos casos
en los que el enlazamiento entre los polipéptidos de
M-CSF o M-CSFR y el compuesto
asociado de enlazamiento cambia en la presencia del modulador
candidato en comparación con enlazamiento en la ausencia del
compuesto modulador candidato. Un modulador que incrementa el
enlazamiento entre un polipéptido de M-CSF o
M-CSFR y el compuesto asociado de enlazamiento se
describe como un potenciador o activador, y un modulador que haga
disminuir el enlazamiento entre un polipéptido de
M-CSF o M-CSFR y el compuesto
asociado de enlazamiento se describe como un inhibidor.
La invención también comprende pruebas de
selección de alto rendimiento (HTS) para identificar compuestos que
interactúan con o inhiben la actividad biológica (esto es inhiben la
actividad emzimática, la actividad de enlazamiento, etc.) de un
polipéptido de M-CSF o M-CSFR. Las
pruebas HTS permiten la selección de grandes números de compuestos
de una forma eficiente. Los sistemas HTS basados en células son
contemplados para investigar la interacción entre polipéptidos
M-CSF o M-CSFR y sus asociados de
enlazamiento. Las pruebas de HTS están diseñadas para identificar
"aciertos" o "compuestos candidatos" que tienen la
propiedad deseada, a partir de los cuales pueden diseñarse
modificaciones para mejorar la propiedad deseada. La modificación
química del "acierto" o "compuesto candidato" se basa
frecuentemente en una relación identificable estructura/actividad
entre el "acierto" y los polipéptidos de M-CSF
o M-CSFR.
Otro aspecto de la presente invención está
orientado a métodos para identificar compuestos que se enlazan bien
a un polipéptido de M-CSF o M-CSFR o
moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de
M-CSF o M-CSFR, que comprende
determinar si el compuesto se enlaza al polipéptido de
M-CSF o M-CSFR o a una molécula de
ácido nucleico que codifica el mismo. El enlazamiento puede ser
determinado por pruebas de enlazamiento que son bien conocidas para
el experto en la técnica, que incluyen, pero no se limitan, a
pruebas de separación en gel, Westem blots, pruebas de competición
con radiomarcaje, clonación de expresión basada en fago,
cofraccionamiento por cromatografía, coprecipitación,
entrecruzamiento, análisis de interacción trampa/dos híbridos,
análisis Southwestern, ELISA y similares, que se describen, por
ejemplo, en Current Protocols in Molecular Biology (1999) John
Wiley & Sons, NY. Los compuestos que van hacer seleccionados
(los cuales pueden incluir compuestos de los que se sospecha se
enlazan a un polipéptido de M-CSF o
M-CSFR, o a una molécula de ácido nucleico que
codifica los mismos) incluyen, pero no se limitan a, origen
extracelular, intracelular, biológico o químico. Los métodos de la
invención también abarcan ligandos que incluyen substratos,
moléculas adaptadoras o receptoras, que están marcadas a una
etiqueta tales como radiomarcado (por ejemplo, 125I, 35S, 32P, 33P,
3H), un marcador de fluorescencia, un marcador quimioluminiscente,
un marcador emzimático o un marcador inmunogénico. Los moduladores
que caen dentro del alcance de la invención incluyen, pero no se
limitan a, moléculas no peptídicas tales como simuladores no
peptídicos, actuadores alostéricos no peptídicos, y péptidos. El
polipéptido o polinucleótido de M-CSF o
M-CSFR empleado en tal prueba bien puede estar libre
en solución, enlazado a un soporte sólido, conexión o a una
superficie celular o localizado intracelularmente o asociado con una
porción de una célula. Una persona experimentada en la técnica
puede, por ejemplo, medir la formación de complejos entre un
polipéptido M-CSF o M-CSFR y el
compuesto que está siendo probado. Alternativamente, una persona
experimentada en la técnica puede examinar la disminución en la
formación de complejo entre un polipéptido de M-CSF
o M-CSFR y su sustrato causada por el compuesto que
está siendo
probado.
probado.
Otro aspecto de la presente invención está
dirigido a métodos para identificar compuestos que modulan (esto
es, disminuyen) la actividad de un polipéptido de
M-CSF o M-CSFR que comprende poner
en contacto un polipéptido de M-CSF o
M-CSFR con un compuesto, y determinar si el
compuesto modifica la actividad del polipéptido de
M-CSF o M-CSFR. La actividad en la
presencia de la prueba comparada se mide con la actividad en la
ausencia del compuesto de prueba. Cuando la actividad de la muestra
que contiene el compuesto de prueba es superior a la actividad de
la muestra que carece del compuesto de prueba, el compuesto tendrá
actividad incrementada. De la misma forma, cuando la actividad de
la muestra que contiene el compuesto de prueba es más baja que la
actividad de la muestra que carece del compuesto de prueba, el
compuesto tendrá actividad inhibida.
La presente invención es particularmente útil
para seleccionar compuestos utilizando los polipéptidos de
M-CSF o M-CSFR en cualquiera de una
variedad de técnicas de selección de fármacos. Los compuestos que
van a ser seleccionados (los cuales pueden incluir compuestos que
se sospechan se enlazan con un polipéptido de M-CSF
o M-CSFR, o una molécula de ácido nucleico que
codifica el mismo) incluyen pero no se limitan, a origen
extracelular, intracelular biológico o químico. El polipéptido
M-CSF o M-CSFR o el polinucleótido
empleado en tal prueba pueden bien estar libre en solución,
enlazado a un soporte sólido, tope sobre una superficie celular o
localizado intracelularmente o asociado con una porción de una
célula. Una persona experimentada en la técnica puede, por ejemplo,
medir la formación de complejos entre un polipéptido de
M-CSF o M-CSFR y el compuesto que
está siendo probado. Alternativamente, una persona experimentada
en la técnica puede examinar la disminución en la formación de
complejos entre un polipéptido de M-CSF o
M-CSFR y sus sustrato causada por el compuesto que
está siendo probado.
La actividad de los polipéptidos de
M-CSF o M.CSFR de la invención puede determinarse,
por ejemplo, examinando su capacidad para enlazar ligandos de
péptidos químicamente sintetizados o de ocurrencia natural.
Alternativamente, la actividad de los polipéptidos
M-CSF o M-CSFR puede probarse
examinando su capacidad para enlazarse a moléculas adaptadoras,
moléculas receptoras, sustratos u otros ligandos. La actividad de
los polipéptidos de M-CSF o M-CSFR
también puede determinarse examinando la actividad de las moléculas
efectoras incluyendo, pero no limitándose a otras enzimas corriente
abajo que son activadas por el M-CSF o
M-CSFR. Así, los moduladores de la actividad del
polipéptido M-CSF o M-CSFR puede
alterar una función del M-CSF o
M-CSFR, tal como la propiedad de enlazamiento de un
polipéptido de M-CSF o M-CSFR. En
diversas modalidades del método, la prueba puede tomar la forma de
ensayos de enlazamiento a asociados de enlazamientos naturales así
como otras pruebas de enlazamiento o basadas en la función de la
actividad del M-CSF o M-CSFR que son
conocidas en general en la técnica. Las actividades biológicas del
M-CSF o M-CSFR de acuerdo con la
invención incluyen, pero no se limitan a, el enlazamiento de un
ligando natural o no natural, así como cualquiera de las
actividades funcionales de M-CSF o
M-CSFR conocidas en la técnica. Ejemplos no
limitantes de las actividades de M-CSF o
M-CSFR incluyen la proteólisis de sustratos y el
enlazamiento a sustratos, ligandos, moléculas adaptadoras o
receptoras.
Los moduladores de la invención exhiben una
variedad de estructuras químicas, que pueden agruparse en general
en la imitación no peptídica de ligandos naturales
M-CSF o M-CSFR, efectores
alostéricos peptídicos y no peptídicos de M-CSF o
M-CSFR, y péptidos que pueden funcionar como
activadores o inhibidores (competitivos, incompetitivos y no
competitivos) (por ejemplo, productos anticuerpos) de
M-CSF o M-CSFR. La invención no
restringe las fuentes de moduladores adecuados, los cuales pueden
obtenerse a partir de fuentes naturales tales como extractos
vegetales, animales o minerales, o fuentes no naturales tales como
bibliotecas de moléculas pequeñas, incluyendo los productos de
modalidades químicas combinacionales para la construcción de
bibliotecas, y bibliotecas de péptidos.
Pueden utilizarse otras pruebas para examinar la
actividad enzimática que incluye, pero no se limitan a,
fotométricas, radiométricas, HPLC, electroquímicas, y similares,
las cuales se describen en, por ejemplo, Enzyme Assays: A Practical
Approach, eds.R. Eisenthal and M.J.Danson (1992) Oxford University
Press.
Pueden utilizarse ADNc que codifican
polipéptidos de M-CSF o M-CSFR en
programas de descubrimiento de fármacos; las pruebas capaces de
probar miles de compuestos desconocidos al día en selecciones de
alto rendimiento (HTSs) están documentadas exhaustivamente. La
literatura está repleta con ejemplos del uso de ligandos
radiomarcados en pruebas de enlazamiento de HTS para descubrimiento
de fármacos (véase Williams, Medicinal Research Reviews (1991) 11,
147-184; Sweetnam, et al., J.Natural Products
(1993) 56, 441-455 para revisión). Se prefieren
M-CSF o M-CSFR inmovilizados para
las pruebas de enlazamiento HTS porque permiten una mejor
especificidad (pureza relativa más alta), proporcionan la capacidad
de generar grandes cantidades de material de M-CSF o
M-CSFR, y pueden utilizarse en una amplia variedad
de formatos (véase Hodgson, Bio/Technology (1992) 10:
973-980).
Está disponible una variedad de sistemas
heterólogos para la expresión funcional de polipéptidos
recombinantes que son bien conocidos para los expertos en la
técnica. Tales sistemas incluyen bacterias (Strosberg, et
al., Trends in Pharmacological Sciences (1992) 13:
95-98), levaduras (Pausch, Trends in Biotechnology
(1997) 15: 487-494), diversas clases de células de
insectos (Vanden Broeck, Int. Rev. Cytology (1996) 164:
189-268), células de anfibios (Jayawickreme et
al., Current Opinion in Biotechnology (1997) 8:
629-634) y varias líneas celulares de mamíferos
(CHO, HEK293, COS, etc.; véase Gerhardt, et al., Eur. J.
Pharmacology (1997) 334: 1-23). Estos ejemplos no
inhiben el uso de otros sistemas de expresión celular posibles,
incluyendo líneas celulares obtenidas a partir de nematodos
(solicitud PCT WO 98/37177).
En realizaciones preferidas de la invención,
métodos para seleccionar compuestos que modulan la actividad de
polipéptidos de M-CSF o M-CSFR
comprenden poner en contacto compuestos de prueba con un polipéptido
de M-CSF o M-CSFR y probar la
presencia de un complejo entre el compuesto y el polipéptido de
M-CSF o M-CSFR. Tales pruebas, el
ligando es típicamente está marcado. Después de una incubación
adecuada, el ligando libre es separado del que está presente en la
forma enlazada, y la cantidad de marcado libre o no complejado es
una medida en la capacidad del compuesto particular para enlazarse
al polipéptido de M-CSF o
M-CSFR.
En otra realización de la invención, la
selección de alto rendimiento de compuestos que tienen afinidad de
enlazamiento adecuada a un polipéptido de M-CSF o
M-CSFR es la que se emplea. En resumen, se
sintetizan grandes números de diferentes péptidos pequeños como
compuestos de prueba sobre un sustrato sólido. Los compuestos de
prueba peptídicos se ponen en contacto con un polipéptido de
M-CSF o M-CSFR y se lavan. Los
polipéptidos enlazados a M-CSF o
M-CSFR son detectados entonces por métodos bien
conocidos en la técnica. Los polipéptidos purificados de la
invención también pueden ser puestos como recubrimiento directamente
sobre placas para su uso en las técnicas antes mencionadas de
selección de fármacos. Además, pueden utilizarse anticuerpos no
neutralizantes para capturar la proteína e inmovilizarlas sobre el
soporte sólido.
En general, un polipéptido de
M-CSF o M-CSFR expresado puede
utilizarse para pruebas de enlazamiento de HTS junto con un
sustrato, ligando una molécula adaptora o receptora que está marcada
con un radioisótopo adecuado, incluyendo, pero no limitándose a,
125I, 3H, 35S o 32P, por métodos que son bien conocidos para los
experimentados en la técnica. De forma alternativa, el sustrato,
ligando, molécula adaptora o receptora puede marcarse por métodos
bien conocidos con un derivado fluorescente adecuado (Baindur, et
al., Drug Dev. Res., (1994) 33: 373-398;
Rogers, Drug Discovery Today (1997) 2: 156-160). Un
ligando radioactivo específicamente enlazado a
M-CSF o M-CSFR inmovilizados puede
detectarse en pruebas de HTS mediante una de varias formas estándar,
incluyendo la filtración del complejo M-CSF o
M-CSFR-ligando para separar el
ligando enlazado del ligando no enlazado (Williams, Med.Res.Rev.
(1991) 11: 147-184; Sweetnam, et al.,
J.Natural Products (1993) 56: 441-455). Métodos
alternativos incluyen una prueba de proximidad por centelleo (SPA) o
un formato de FlashPlate en la cual tal separación es innecesaria
(Nakayama, Cur. Opinion Drug Disc. Dev. (1998) 1:
85-91 Bossé, et al., J. Biomolecular
Screening (1998) 3: 285-292). El enlazamiento de
ligandos fluorescentes pueden detectarse de diversas maneras,
incluyendo la transferencia de energía de fluorescencia (FRET),
análisis espectrofluorométrico directo de ligando enlazado, o
polarización de fluorescencia (Rogers, Drugs Discovery Today
\hbox{(1997) 2: 156-160; Hill, Cur. Opinion
Drug Disc. Dev. (1998) 1: 92-97).}
La invención contempla una multitud de pruebas
para seleccionar e identificar inhibidores de sustratos, ligandos,
adaptores o receptores que se enlazan a M-CSF o
M-CSFR. En un ejemplo, el M-CSF o
M-CSFR es inmovilizado y se establece la
interacción con un asociado de enlazamiento en la presencia y
ausencia de un modulador candidato tal como un compuesto inhibidor.
En otro ejemplo, la interacción entre el M-CSF o
M-CSFR y su asociado de enlazamiento se establece
en una prueba en solución, ambos en presencia y ausencia de un
compuesto inhibidor candidato. En cualquiera de los ensayos, un
inhibidor se identifica como un compuesto que hace disminuir el
enlazamiento entre el M-CSF o M-CSFR
y su asociado de enlazamiento. Otra prueba contemplada involucra una
variación de la prueba de dihíbridos donde se identifica un
inhibidor de interacciones proteína/proteína mediante la detección
de una señal positiva en una célula huésped transformada o
transfectada, como se describe en la publicación PCT número WO
95/20652, publicada el 3 de agosto de 1.995.
Los moduladores candidatos contemplados por la
invención incluyen compuestos seleccionados a partir de bibliotecas
bien de activadores potenciales o inhibidores potenciales. Existe un
buen número de diferentes bibliotecas utilizadas para la
identificación de moduladores de moléculas pequeñas que incluyen:
(1) bibliotecas químicas, (2) bibliotecas de productos naturales y
(3) bibliotecas combinacionales conformadas con péptidos,
oligonucleótidos o moléculas orgánicas aleatorios. Las bibliotecas
químicas consisten de estructuras químicas aleatorias, algunas de
las cuales son análogas de compuestos conocidos o análogos de
compuestos que han sido identificados como "aciertos" o
"candidatos" en otras selecciones de descubrimiento de
fármacos, algunos de los cuales son derivados de productos
naturales, y algunos de los cuales surgen de química orgánica
sintética no dirigida. Las bibliotecas de productos naturales son
colecciones de microorganismos, animales, plantas, u organismos
marinos que se utilizan para crear mezclas para selección mediante:
(1) fermentación y extracción de caldos a partir de microorganismos
del suelo, vegetales o marinos o (2) extracción de plantas u
organismos marinos. Las bibliotecas de productos naturales incluyen
policétidos, péptidos no ribosómicos, y variantes (que no ocurren
de forma natural) de los mismos. Para una revisión, véase Science
282: 63-68 (1998). Las bibliotecas combinacionales
están compuestas de grandes números de péptidos, oligonucleótidos o
compuestos orgánicos como una mezcla. Están bibliotecas son
relativamente fáciles de preparar mediante métodos de síntesis
automatizados tradicionales, PCR, clonación o métodos sintéticos
privados. De interés particular son las bibliotecas combinacionales
no peptídicas. Aún otras bibliotecas de interés incluyen bibliotecas
de péptidos, proteínas, peptidomimetícas, de colección sintética
multiparalela, recombinacionales y de polipéptidos. Para una
revisión de la química combinacional y bibliotecas creadas a partir
de la misma, véase Myers, Curr. Opin. Biotechnol. 8:
701-707 (1997). La identificación de moduladores a
través del uso de diversas bibliotecas descrita aquí permiten la
modificación del candidato "acierto" (o "candidato") para
optimizar la capacidad del "acierto" para modular la
actividad.
Aún otros inhibidores candidatos contemplados
por la invención pueden designarse e incluyen formas solubles de
asociados de enlazamiento, así como tales asociados de enlazamiento
tales como proteínas quiméricas o de fusión. Un "asociado de
enlazamiento" tal como se usa aquí abarca ampliamente moduladores
no peptídicos, así como moduladores peptídicos que incluyen
anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, y compuestos modificados
que comprenden dominios de anticuerpos que son inmunoespecíficos
para M-CSF o M-CSFR.
Pueden utilizarse otras pruebas para especificar
ligandos específicos de M-CSF o
M-CSFR, incluyendo ensayos que identifican ligandos
de una proteína objetivo a través de la medición directa del
enlazamiento de ligandos de prueba a la proteína objetivo, así como
pruebas que identifican ligandos de proteínas de prueba a través de
la ultrafiltración por afinidad a través de métodos de
espectroscopía de masas por aspersión de iones/HPLC u otros métodos
físicos y analíticos. Alternativamente, tales interacciones de
enlazamiento se evalúan indirectamente utilizando el sistema
dihíbrido de levaduras descrito en Fields et al., Nature,
340: 245-246 (1989), and Fields et al.,
Trends in Genetics, 10: 286-292 (1994), los cuales
se incorporan aquí como referencia. El sistema dihíbrido es una
prueba genética para detectar interacciones entre dos proteínas o
polipéptidos. Puede utilizarse para identificar proteínas que se
enlazan a una proteína conocida de interés, o para delinear dominios
o residuos críticos para una interacción. Se han desarrollado
variaciones sobre esta metodología para aclarar genes que codifican
genes de enlazamientos de ADN, para identificar péptidos que se
enlazan a una proteína, y para seleccionar fármacos. El sistema
dihíbrido explota la capacidad de un par de proteínas interactuantes
para traer un dominio de activación de transcripción en proximidad
cercana a un dominio de enlazamiento de ADN que se enlaza a una
secuencia de activación corriente arriba (UAS) de un gen informador,
y se lleva a cabo generalmente en una levadura. La prueba requiere
la construcción de dos genes híbridos que codifican (1) un dominio
de enlace de ADN que se fusiona a una primera proteína (2) un
dominio de activación fusionado a una segunda proteína. El dominio
de enlazamiento ADN apunta la primera proteína hibrida hacia el UAS
del gen informador; sin embargo, puesto que la mayoría de las
proteínas carecen de un dominio de activación, está proteína
hibrida de enlazamiento ADN no activa la transcripción del gen
informador. La segunda proteína hibrida, la cual contiene el
dominio de activación, no puede por sí misma activar la expresión
del gen informador porque no se enlaza al UAS. Sin embargo, cuando
ambas proteínas hibridas están presentes, la interacción no
covalente de la primera y segundas proteínas dispara el domino de
activación hacia el UAS, activando la transcripción del gen
informador. Por ejemplo, cuando la primera proteína es
M-CSF o M-CSFR, o una subunidad o
fragmento de los mismos, que se conoce que interactúa con otra
proteína o ácido nucleico, este ensayo puede ser utilizado para
detectar agentes que interfieren con la interacción de enlazamiento.
La expresión del gen informador es monitorizada a medida que
diferentes agentes de prueba son añadidas al sistema. La presencia
de un agente inhibidor trae como resultado la carencia de una señal
informadora.
La prueba dihíbrida en levaduras también puede
ser utilizada para identificar proteínas que se enlazan a
M-CSF o M-CSFR. En una prueba para
identificar proteínas que se enlazan a M-CSF o
M-CSFR, o una subunidad o fragmento de las mismas,
pueden utilizarse un polinucleótido de fusión que codifica tanto un
M-CSF o M-CSFR (o subunidades o
fragmentos) y un dominio de enlazamiento UAS (esto es, una primera
proteína). Además, se producen y seleccionan del ensayo un gran
número de genes híbridos que codifican una segunda proteína
diferente fusionada a un dominio de activación. Típicamente, la
segunda proteína es codificada por uno o más miembros de una
biblioteca de ADNc total o ADN genómico de fusión, estando
fusionada cada segunda región codificadora de proteína al dominio
de activación. Este sistema es aplicable a una amplia variedad de
proteínas, e incluso no es necesario conocer la identidad o función
de la segunda proteína enlazante. El sistema es altamente sensible y
puede detectar interacciones no reveladas por otros métodos;
incluso interacciones transiguientes pueden disparar la
transcripción para producir un ARNn estable que puede ser traducido
repetidamente para producir la proteína informadora.
Pueden utilizarse otras pruebas para buscar
agentes que se enlacen a la proteína objetivo. Un método tal de
selección para identificar el enlazamiento directo de ligandos de
prueba a una proteína objetivo se describen en la Patente de los
Estados Unidos No. 5, 585,277. Este método se basa en el principio
de que las proteínas existen generalmente como una mezcla de
estados plegados y no plegados, y continuamente se alterna entre los
dos estados. Cuando un ligando de prueba se enlaza a la forma
plegada de una proteína objetivo (esto es, cuando el ligando de
prueba es un ligando de la proteína objetivo), la molécula de
proteína objetivo enlazada por el ligando permanece en su estado
plegado. Así, la proteína objetivo plegada está presente en un grado
mayor en la presencia de un ligando de prueba que se enlaza a la
proteína objetivo, que en ausencia de un ligando. El enlazamiento
del ligando a la proteína objetivo puede determinarse por cualquier
método que distinga entre los estados plegado y no plegado de la
proteína objetivo. La función de la proteína objetivo no necesita
ser conocida para que esta prueba pueda ser realizada. Virtualmente
puede establecerse cualquier agente por este método como ligando de
prueba, incluyendo, pero no limitándose a, metales, polipéptidos,
proteínas, lípidos, polisacáridos, polinucleótidos y moléculas
orgánicas pequeñas.
Otro método para identificar ligandos de una
proteína de prueba está descrito en Wieboldt et al., Anal.
Chem., 69: 1683-1691 (1997). Está técnica
selecciona bibliotecas combinacionales de 20-30
agentes a la vez en fase de solución para enlazar con una proteína
objetivo. Los agentes que se enlazan a la proteína objetivo se
separan de otros componentes de la biblioteca por un lavado simple
por membrana. Las moléculas seleccionadas específicamente que se
retienen en el filtro son liberadas subsecuentemente de la proteína
objetivo y analizadas por HPLC y espectroscopia de masas por
ionización asistida por electroaspersión (aspersión de iones). Este
procedimiento selecciona los componentes de la biblioteca con la
mayor afinidad por la proteína objetivo, y es particularmente útil
para bibliotecas de moléculas pequeñas. Otras realizaciones de la
invención comprenden pruebas de selección competitivas en las
cuales los anticuerpos neutralizantes capaces de enlazar un
polipéptido de la invención compiten específicamente con un
compuesto de prueba para enlazar al polipéptido. De esta forma,
pueden utilizarse los anticuerpos para detectar la presencia de
cualquier péptido que comparte uno o más determinantes antigénicos
con M-CSF o M-CSFR. Los estudios de
enlazamiento competitivos con radiomarcación están descritos en A.H.
Lin et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy (1997)
vol. 41, No. 10. pp. 2127-2131.
En otras realizaciones de la invención, los
polipéptidos de la invención, se emplean como una herramienta de
investigación para identificación, caracterización y purificación de
proteínas interactuantes reguladoras. Los marcadores apropiados se
incorporan en los polipéptidos de la invención por métodos diversos
conocidos en la técnica y los polipéptidos se utilizan para
capturar las moléculas interactuantes. Por ejemplo, las moléculas
son incubadas por los polipéptidos de marcación, lavadas para
remover los polipéptidos no enlazados, y el complejo polipeptídico
es cuantificado. Los datos obtenidos utilizando diferentes
concentraciones de polipéptido se utilizan para calcular los
valores de número, afinidad y asociación del polipéptido con el
complejo de proteína.
Los polipéptidos marcados también pueden ser
útiles como reactivos para la purificación de moléculas con las
cuales interactúa el polipéptido incluyendo, pero no limitándose a,
inhibidores. En una realización de purificación por afinidad, un
polipéptido se acopla de forma covalente a una columna de
cromatografía. Las células y sus membranas son extraídas, y los
diversos subcomponentes celulares pasan a través de la columna. Las
moléculas se enlazan a la columna en virtud de su afinidad al
polipéptido. El complejo polipeptídico es recuperado de la columna,
se disocia y la molécula recuperada es sometida a secuenciamiento
de proteínas. Esta secuencia de aminoácidos se utiliza entonces
para identificar la molécula capturada o para diseñar
oligonucleótidos degenerados para la clonación del gen
correspondiente a partir de una biblioteca de ADNc apropiada.
Alternativamente, pueden identificarse
compuestos que exhiben propiedades similares al ligando para
M-CSF o M-CSFR, pero que son más
pequeñas y exhiben un tiempo de vida medio más largo que el ligando
endógeno en un cuerpo humano o animal. Cuando se diseña un
compuesto orgánico, una molécula de acuerdo con la invención es
utilizada como compuesto "candidato". El diseño de imitadores
de compuestos farmacéuticamente activos conocidos es una modalidad
bien conocida en el desarrollo de productos farmacéuticos basados en
tales compuestos "candidatos". El diseño mimético, síntesis y
pruebas se utilizan generalmente para evitar la selección aleatoria
de un gran número de moléculas para una propiedad objetivo. De la
misma forma, los datos estructurales que se derivan del análisis de
la secuencia de aminoácidos deducidas codificadas por los
polinucleótidos de la presente invención son útiles para diseñar
nuevos fármacos, más específicos y por lo tanto con una potencia
farmacológica más alta.
La modelación por ordenador puede ser utilizada
para desarrollar una estructura terciaria putativa de las proteínas
de la invención con base en la información disponible sobre
M-CSR o M-CSFR. Así, pueden
diseñarse ligandos novedoso basados en la estructura predicha de
M-CSF o M-CSFR.
Otro aspecto de la presente invención es el uso
de secuencias de nucleótidos de M-CSF o
M-CSFR descritas aquí para identificar homólogos en
otros animales. Cualquiera de las secuencias de nucleótidos
descritas aquí, o cualquier porción de las mismas, puede
utilizarse, por ejemplo, como sondas para cercenar bases de datos o
bibliotecas de ácidos nucleicos tales como, por ejemplo, bibliotecas
genómicas o de ADNc para identificar homólogos, utilizando
procedimientos de selección bien conocidos para los expertos en la
técnica. De acuerdo con lo anterior, los homólogos que tienen al
menos 50%, más preferiblemente al menos 60%, más preferiblemente al
menos 70%, más preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al
menos 90%, más preferiblemente al menos 95% y lo más preferible al
menos 100% de homología con la secuencias de M-CSF o
M-CSFR pueden ser identificados.
Habiendo identificado más de un antagonista de
M-CSF que es efectivo en un modelo animal, puede ser
ventajoso adicionalmente mezclar dos o más de tales antagonistas de
M-CSF entre sí para proporcionar una eficacia aún
mejorada contra la metástasis de cáncer y/o la pérdida de hueso
asociada con la metástasis de cáncer. Las composiciones que
comprenden uno o más antagonistas de M-CSF pueden
ser administradas a personas o mamíferos que sufren de, o están
predispuestos a sufrir de, metástasis de cáncer y/o perdida de hueso
asociada con la metástasis de cáncer.
Aunque la terapia de antagonistas de
M-CSF puede ser útil para todas las etapas del
cáncer, la terapia con anticuerpos puede ser particularmente
apropiada en cánceres avanzados o metastaticos. Combinando el método
de terapia con anticuerpos con un régimen quimioterapéutico de
radiación puede preferirse en pacientes que no hayan recibido
tratamiento quimioterapéutico, mientras que tratamiento con la
terapia de anticuerpos puede ser indicado para pacientes que hayan
recibido una o más quimioterapias. Adicionalmente, la terapia de
anticuerpos también puede permitir el uso de dosis reducidas de
quimioterapia concomitante, particularmente en pacientes que no
toleran muy bien la toxicidad del agente quimioterapéutico.
El método de la invención contempla la
administración de anticuerpos sencillos
anti-M-CSF y
anti-M-CSFR, así como combinaciones
o "cócteles" de diferentes anticuerpos. Tales cócteles de
anticuerpos pueden tener ciertas ventajas en cuanto que contienen
anticuerpos que explotan diferentes mecanismos efectores o combinan
directamente anticuerpos citotóxicos con anticuerpos que se basan
en la funcionalidad del efector inmune. Tales anticuerpos en
combinación pueden exhibir efectos terapéuticos sinergisticos.
Además, la administración de anticuerpos
anti-M-CSF y
anti-M-CSFR puede combinarse con
otros agentes y/o procedimientos terapéuticos, incluyendo pero no
limitándose a diversos agentes quimioterapéuticos, bloqueadores de
andrógenos, y moduladores inmunes (por ejemplo,
IL-2, GM-CSF), bifosfonatos (por
ejemplo, Aredia; Zometa; Clodronato), cirugía, radiación,
quimioterapia, terapia hormonal (por ejemplo, Tamoxifen; terapia de
anti-andrógenos), terapia de anticuerpos (por
ejemplo, anticuerpos neutralizadores de RANKL/RANK; anticuerpo
neutralizador de PTHrP, anticuerpo anti-Her2,
anticuerpo neutralizador VEGF), terapia de proteínas terapéutica
(por ejemplo, receptor de RANKL soluble; inhibidores de OPG y PDGF
y MMP); terapia de fármacos de moléculas pequeñas (por ejemplo,
inhibidores de Src-quinasa), inhibidores de quinasa
de receptores de factor de crecimiento; terapia de oligonucleótidos
(por ejemplo, antisentido de RANKL o RANK o PTHrP), terapia de
genes (por ejemplo, inhibidores de RANKL o RANK), terapia de
péptidos (por ejemplo, muteinas de RANKL) así como las de
proteínas, péptidos, compuestos y pequeñas moléculas descritos
aquí.
Los agentes quimioterapéuticos para el cáncer
incluyen, sin limitación, agentes alquilantes tales como
carboplatina y cisplatina; agentes alquilantes de nitrógeno
mostaza; agentes alquilantes de nitrosourea, tales como carmustina
(BCNU); antimetabolitos tales como metotrexato; antimetabolitos
análogos a la purina, mercaptopurina,, antimetabolitos análogos a
la pirimidina, tales como fluoruacil (5-FU) y
gencitabina; antineoplásticos hormonales, tales como goserelina,
leuprolide y tamoxifen; antineoplásticos naturales, tales como
aldesleucina, interleucina-2, docetaxel, etoposido
(VP-16), interferón alfa, paclitaxel, y tetrinoina
(ATRA); antineoplásticos antibióticos naturales, tales como
bleomicina, dactinomicina, daonorubicina, doxorubicina y mitomicina;
y antineoplásticos naturales alcaloides de vinca, tales como
vinblastina, vincristina, vindecina; hidroxiurea, aceglatona,
adriamicina, ifosfamida, enocibatina, epitiostanol, aclarubicina,
ancitabina, nimustina, procarbacina clorhidrato, carbocuona,
carboplatina, carmofur, cromomicina A3, polisacáridos antitumorales,
factores de plaquetas antitumorales, ciclofosfamida, esquizofilan,
citabarina, dacarbacina, tioinosina, tiotepa, tegafur,
neocarcinostatin, OK-432, bleomicina, furtulon,
broxuridina, busulfan, honvan, peplomicina, bestatina (ubenimex),
interferón-\beta, mepitiostano, metobronitol,
merfalano, péptidos de laminina, lentitan, extracto de Coriolus
versicolor, tegafur/uracilo, estramustina
(estrógeno/mecloretamina).
Adicionalmente, otros agentes utilizados en la
terapia de pacientes de cáncer incluyen EPO, G-CSF,
ganciclovir, antibióticos, leuprolida, meperidina, zidovudina
(AZT); interleucinas 1 a 18, incluyendo mutantes y análogos;
interferón o citoquinas, tales como interferones \alpha, \beta y
\gamma, hormonas, tales como la hormona de liberación de la
hormona luteinizante (LHRH) y análogos, y la hormona liberadora de
gonadotropina (GNRH); factores de crecimiento tales como un factor
de crecimiento \beta transformador (TGF-\beta),
factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento
de nervios (NGF), factor de liberación de hormona del crecimiento
(GHRF), factor de crecimiento de epidermis (EGF), el factor homólogo
del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFHF), el factor de
crecimiento de hepatocitos (HGF), y el factor de crecimiento de
insulina (IGF); el factor \alpha y \beta de necrosis tumoral
(TNF-\alpha & \beta); el factor inhibidor de
la invasión 2 (IIF-2); las proteínas morfogenéticas
de hueso 1-7 (BMP 1-7);
somatostatina; timosina-\alpha-1;
\gamma-globulina; superóxido dismutasa (SOD);
factores de complemento; factores de antiangiogénesis; materiales
antigénicos; y prodrogas.
La presente invención provee compuestos,
formulaciones farmacéuticas que incluyen los compuestos, métodos
para preparar las formulaciones farmacéuticas y métodos para tratar
pacientes con las formulaciones y compuestos farmacéuticos.
Tales composiciones pueden ser en la forma de,
por ejemplo, gránulos, polvos, tabletas, cápsulas, jarabes,
supositorios, inyecciones, emulsiones, elixires, suspensiones o
soluciones. Las presentes composiciones pueden formularse por
diversas rutas de administración, por ejemplo, por administración
oral, por administración nasal, por administración rectal,
inyección subcutánea, inyección intravenosa, inyecciones
intramusculares o inyección intraperitoneal. Las siguientes formas
de dosificación son dadas a manera de ejemplo y no deben ser
consideradas como limitantes de la presente invención.
Para administración oral, bucal o sublingual,
son aceptables como formas de dosificación sólidas polvos,
suspensiones, gránulos, tabletas, píldoras, cápsulas, capsulas de
gel y capsuletas. Pueden prepararse, por ejemplo, mezclando uno o
más compuestos de la presente invención, o sales farmacéuticamente
aceptables o automeros de los mismos, con al menos un aditivo tal
como almidón u otro aditivo. Aditivos adecuados son sacarosa,
lactosa, azúcar de celulosa, manitol, maltitol, dextrano, almidón,
agar, alginatos, quitinas, quitosanos, pectinas, goma de
tragacanto, goma arábiga, gelatinas, colágenos, caseína, albumina,
polímeros sintéticos o semisintéticos o glicéridos. Opcionalmente,
las formas de dosificación oral pueden contener otros ingredientes
para ayudar en la administración, tales como diluyentes inactivos o
lubricantes tales como estearato de magnesio, o preservativos tales
como parabeno o ácido sorbico, o antioxidantes tales como ácido
ascórbico, tocoferol o cisteína, un agente de desintegración,
aglomerantes, espesantes, reguladores, endulzantes, agentes
saborizantes o agentes aromatizantes. Las tabletas y píldoras
pueden ser tratadas adicionalmente con materiales de recubrimiento
adecuados conocidos en la técnica.
Las formas de dosificación líquida para
administración oral pueden estar en la forma de emulsiones, jarabes,
elíxires, suspensiones y soluciones farmacéuticamente aceptables,
las cuales pueden contener un diluyente inactivo tal como agua. Las
formulaciones farmacéuticas y los medicamentos pueden ser preparados
como suspensiones o soluciones líquidas utilizando un líquido
estéril, tal como, pero no limitándose a, un aceite, agua, un
alcohol, y combinaciones de estos. Los surfactantes, agentes de
suspensión, agentes emulsificantes, farmacéuticamente aceptables,
pueden ser añadidos para administración oral o parenteral.
Como se anotó mas arriba, las suspensiones
pueden incluir aceites. Tales aceites incluyen, pero no se limitan
a, aceite de cacahuete, aceite de sésamo, aceite de algodón, aceite
de maíz y aceite de oliva. La preparación en suspensión también
puede contener ésteres de ácidos grasos tales como oleato de etilo,
miristato de isopropilo, glicéridos de ácidos grasos y glicéridos
de ácidos grasos acetilados. Las formulaciones en suspensión pueden
incluir alcoholes, tales como, pero no limitándose a, etanol,
alcohol isopropílico, alcohol hexadecílico, glicerol y propilén
glicol. Éteres tales como, pero no limitándose a, poli(etilén
glicol), hidrocarburos del petróleo tales como aceite mineral y
petrolato; y también puede utilizarse agua en formulaciones en
suspensión.
Para administración nasal, las formulaciones
farmacéuticas y medicamentos pueden ser una aspersión o un aerosol
que contiene un solvente o solventes apropiados y opcionalmente
otros compuestos tales como, pero no limitándose a,
estabilizadores, agentes antimicrobianos, antioxidantes,
modificadores del pH, surfactantes, modificadores de la
biodisponibilidad y combinaciones de estos. Un propelente para una
formulación en aerosol puede incluir aire comprimido, nitrógeno,
dióxido de carbono o un solvente de bajo punto de ebullición basado
en hidrocarburos.
Las formas de dosificación inyectables
generalmente incluyen suspensiones acuosas o suspensiones oleosas
que pueden ser preparadas utilizando un dispersante o un agente
humectante adecuado y un agente de suspensión. Las formas
inyectables pueden ser en fase de solución o en la forma de una
suspensión, la cual se prepara con solvente o diluyente. Solventes
o vehículos aceptables incluyen agua esterilizada, solución de
Ringer, o una solución salina acuosa isotónica. Alternativamente,
pueden emplearse aceites estériles como solventes o agentes de
suspensión. Preferiblemente, el aceite o ácido graso es no volátil e
incluye aceites naturales o sintéticos, ácidos grasos, mono, di o
triglicéridos.
Para inyección, la formulación farmacéutica y/o
medicamento puede ser un polvo adecuado para reconstitución con una
solución apropiada como se describe más arriba. Ejemplos de estos
incluyen, pero no se limitan a, polvos liofilizados, secados por
rotación o secados por aspersión, polvos amorfos, gránulos,
precipitados o en forma de partículas. Para inyección, las
formulaciones pueden opcionalmente contener estabilizadores,
modificadores del pH, surfactantes, modificadores de la
biodisponibilidad y combinaciones de estos.
Para administración rectal, las formulaciones
farmacéuticas y medicamentos pueden estar en la forma de un
supositorio, un ungüento, un enema, una tableta o una crema para
liberación del compuesto en los intestinos, flexión sigmoideo y/o
recto. Los supositorios rectales se preparan mezclando uno o más
compuestos de la presente invención, o sales o tautómeros del
compuesto farmacéuticamente aceptables, con vehículos aceptables,
por ejemplo, manteca de cacao o polietilén glicol, el cual está
presente en una fase sólida a temperaturas de almacenamiento
normal, y se presenta en una fase líquida aquellas temperaturas
adecuadas para liberar un fármaco dentro del cuerpo tal como en el
recto. Los aceites también pueden ser empleados en la preparación de
formulaciones del tipo de gelatina suave y supositorios. Pueden
emplearse agua, solución salina, dextrosa acuosa y soluciones de
azúcar relacionadas, y gliceroles, en la preparación de
formulaciones en suspensión que también pueden contener agentes de
suspensión tales como pectinas, carbómeros, metil celulosa,
hidroxipropil celulosa o carboximetil celulosa, así como
reguladores y preservativos.
Además de estas formas de dosificación
representativas descritas más arriba, los excipientes y vehículos
farmacéuticamente aceptables son conocidos en general para los
expertos en la técnica y por lo tanto se incluyen en la presente
invención. Tales excipientes y vehículos se describen, por ejemplo,
en "Remingtons Pharmaceutical Sciences" Mack Pub. Co., New
Jersey (1991).
Las formulaciones de la invención pueden ser
diseñadas para acción a corto plazo, liberación rápida, acción a
largo plazo, y liberación sostenida como se describe más abajo. Así,
las formulaciones farmacéuticas también pueden ser formuladas para
liberación controlada o para liberación lenta.
Las composiciones presentes también pueden
comprender, por ejemplo, micelas o liposomas, o alguna otra forma
encapsulada, o pueden ser administradas en una forma de liberación
extendida para proveer un almacenamiento y/o efecto de
administración prolongados. Por lo tanto, las formulaciones
farmacéuticas y medicamentos pueden ser comprimidos en pellas o
cilindros e implantadas intramuscularmente o subcutáneamente como
inyecciones de depósito o como implantes tales como injertos. Tales
implantes pueden emplear materiales inertes conocidos tales como
siliconas y polímeros biodegradables.
Las dosificaciones específicas pueden ser
ajustadas dependiendo de las condiciones de la enfermedad, edad,
peso corporal, condiciones generales de salud, sexo y dieta del
sujeto, intervalos de dosis, rutas de administración, rata de
excreción y combinaciones de fármacos. Cualquiera de las formas de
dosificación anteriores que contienen cantidades efectivas están
bien dentro de los límites de la experimentación de rutina y por lo
tanto, dentro del alcance de la presente invención.
Mediante los métodos presentes, las
composiciones que comprenden antagonista del M-CSF
pueden ser administradas de forma parenteral, tópicamente,
oralmente o localmente para tratamiento terapéutico.
Preferiblemente, las composiciones se administran oral o
parenteralmente, esto es, de forma intravenosa, intraperitoneal,
intradérmica o intramuscular. Así, esta invención proporciona
métodos que emplean composiciones para administración que
comprenden uno o más antagonistas de M-CSF en un
vehículo farmacéuticamente aceptable, preferiblemente un vehículo
acuoso. Pueden utilizarse una variedad de vehículos acuosos, por
ejemplo, agua, agua regulada, solución salina al 0.4%, glicina al
0.3% y similares, pueden incluirse otras proteínas para estabilidad
mejorada, tales como albúmina, lipoproteínas, globulina, etc.,
sometidas a modificaciones químicas leves o similares.
Los antagonistas de M-CSF útiles
como agentes terapéuticos para la metástasis del cáncer o la pérdida
ósea asociada con la metástasis del cáncer se prepararán
sustancialmente libres de otras inmunoglobulinas de origen natural
u otras moléculas biológicas. Los antagonistas de
M-CSF preferidos también exhibirán una toxicidad
mínima cuando se administran a un mamífero afligido con, o
predispuesto a sufrir de, metástasis de cáncer y/o pérdida de hueso
asociada con la metástasis del cáncer.
Las composiciones de la invención pueden ser
esterilizadas por técnicas convencionales de esterilización bien
conocidas. Las soluciones resultantes pueden ser empacadas para su
uso o filtradas bajo condiciones asépticas y liofilizadas, siendo
combinada la preparación liofilizada con una solución estéril antes
de la administración. Las composiciones pueden contener sustancias
auxiliares farmacéuticamente aceptables que se requieran para
condiciones fisiológicas aproximadas, tales como ajuste del pH y
agentes reguladores, agentes de ajuste de la tonicidad y similares,
por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio,
cloruro de potasio, cloruro de calcio y estabilizantes (por
ejemplo, maltosa al 20%).
Los antagonistas de M-CSF de la
presente invención también pueden administrarse a través de
liposomas. Los liposomas, que incluyen emulsiones, espumas,
micelas, monocapas insolubles, dispersiones de fosfolípidos, capas
lamelares y similares, pueden servir como vehículos para apuntar a
los antagonistas de M-CSF hacia un tejido
particular así como para incrementar la vida media de la
composición. Hay disponible una variedad de métodos para preparar
liposomas, como se describe, por ejemplo en las Patente de los
Estados Unidos Nos. 4,837,028 y
5,019,369.
5,019,369.
La concentración del antagonista de
M-CSF en estas composiciones puede variar
ampliamente, esto es, desde menos de aproximadamente 10%,
usualmente al menos 25% de forma aproximada, hasta tanto como 75% o
90% en peso y seleccionará primariamente en relación con los
volúmenes de fluido, viscosidades, etc., de acuerdo con el modo
particular de administración seleccionado. Los métodos reales para
preparar composiciones administrables oralmente, tópicamente y
parenteralmente serán conocidos o evidentes para los expertos en la
técnica y se describen en detalle en, por ejemplo, Remington's
Pharmaceutical Science, 19th ed., Mack Publishing Co., Easton,
PA
(1995).
(1995).
La determinación de una cantidad efectiva de una
composición de la invención para tratar la metástasis del cáncer
y/o la pérdida ósea asociada con la metástasis del cáncer en un
paciente puede alcanzarse a través de métodos empíricos estándar
que son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la actividad
neutralizadora in vivo de los sueros de un sujeto tratado
con una dosificación dada del antagonista de M-CSF
puede evaluarse utilizando una prueba que determina la capacidad de
los sueros para bloquear la proliferación inducida de
M-CSF y la supervivencia de monocitos de murina
(célula CD11b+, un subconjunto de células CD11, que expresa altos
niveles de receptor al M-CSF) in vitro como
se describe en Cenci et al., J Clin. Invest. 1055:
1279-87, 2000.
Las composiciones de la invención se administran
a un mamífero que ya sufre de, o está predispuesto a, metástasis de
cáncer y/o pérdida ósea asociada con la metástasis del cáncer en una
cantidad suficiente para prevenir o al menos detener parcialmente
el desarrollo de la metástasis del cáncer y/o la pérdida ósea
asociada con la metástasis del cáncer. Una cantidad adecuada para
alcanzar esto se define como una "dosis terapéuticamente
efectiva". Las cantidades efectivas de un antagonista de
M-CSF variarán y dependerán de la severidad de la
enfermedad y del peso y estado general del paciente que está siendo
tratado, pero en general varía desde aproximadamente 1.0 \mug/kg
hasta aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, con dosificaciones
desde aproximadamente 10 \mug/kg hasta aproximadamente 10 mg/kg
por aplicación que está siendo utilizada más comúnmente. La
administración es diaria, semanal o menos frecuente, según sea
necesario dependiendo de la respuesta a la enfermedad y la
tolerancia del paciente a la terapia. Las dosificaciones de
mantenimiento durante un período prolongado de tiempo pueden ser
necesarias, y las dosificaciones pueden ser ajustadas según sea
necesario.
Las administraciones individuales o múltiples de
las composiciones pueden llevarse a cabo con los niveles y patrones
de dosis que son seleccionados por el médico tratante. En cualquier
caso, las formulaciones proveerían una cantidad de antagonista de
M-CSF suficiente para prevenir o minimizar
efectivamente la severidad de la metástasis del cáncer y/o la
pérdida ósea asociada con la metástasis del cáncer. Las
composiciones de la presente invención pueden administrarse solas o
como una terapia adjunta junto con otros procedimientos terapéuticos
conocidos en la técnica para tratamiento de metástasis de cáncer
y/o perdida ósea asociada con la metástasis del cáncer.
Los anticuerpos
anti-M-CSF y
anti-M-CSFR útiles en el tratamiento
de cáncer incluyen los que son capaces de iniciar una respuesta
inmune potente contra el tumor y aquellos que son capaces de dirigir
la citotoxicidad. En este aspecto, los anticuerpos
anti-M-CSF y
anti-CSFR pueden elicitar la lisis de las células
tumorales bien por mecanismos de citotoxicidad mediados por
complemento o citotoxicidad celular dependiente de los anticuerpos
(ADCC), los cuales requieren ambos una porción intacta de Fc de la
molécula de inmunoglobulina para interacción con los sitios de
recepción Fc de la célula efectora o proteínas de complemento.
Además, los anticuerpos anti-M-CSF
y anti-M-CSFR que ejercen un efecto
biológico directo sobre el crecimiento tumoral son útiles en la
práctica de la invención. Los mecanismos potenciales mediante los
cuales tales anticuerpos directamente citotóxicos pueden actuar
incluyen la inhibición del crecimiento celular, modulación de la
diferenciación celular, modulación de los perfiles del factor de
angiogénesis tumoral, y la inducción de apoptosis. El mecanismo
mediante el cual un anticuerpo
anti-M-CSF y
anti-M-CSFR ejerce un efecto
antitumoral puede evaluarse utilizando un cierto número de ensayos
in vitro diseñados para determinar la lisis de las células
ADCC, ADMMC, mediadas por complemento, y así sucesivamente, y es en
general conocido en la técnica.
En una realización, la inmunoterapia se lleva a
cabo utilizando anticuerpos que tienen una afinidad más alta para
la forma de membrana-enlace de M-CSF
(M-CSF\alpha) que para las formas secretadas de
M-CSF. Por ejemplo, puede prepararse anticuerpos
que se enlacen significativamente en o alrededor del sitio de
ruptura del M-CSF\alpha, o la porción del
M-CSF\alpha adyacente a la membrana. Tales
anticuerpos también pueden inhibir de forma benéfica la ruptura y
liberación de la porción soluble activa de
M-CSF\alpha.
\newpage
Los anticuerpos
anti-M-CSF y anti-
M-CSFR pueden administrarse en su forma
"desnuda" o no conjugada, o pueden tener agentes terapéuticos
conjugados a ellos. En una realización, los anticuerpos
anti-M-CSF y
anti-M-CSFR son usados como radios
sensibilizadores. En tales realizaciones, los anticuerpos
anti-M-CSF y
anti-M-CSFR se conjugan a un agente
radiosensibilizante. El término "radiosensibilizador" tal como
se usa aquí se define como una molécula, preferiblemente una
molécula de bajo peso molecular, administrada a animales en
cantidades terapéuticamente efectivas para incrementar la
sensibilidad de las células a ser radiosensibilizadas a la
radiación electromagnética y/o para promover el tratamiento de
enfermedades que son tratables con radiación electromagnética. Las
enfermedades que son tratables con radiación electromagnética
incluyen enfermedades neoplásticas, tumores benignos y malignos, y
células cancerosas.
Los términos "radiación electromagnética" y
"radiación" tal como se usan aquí, incluyen, pero no se limitan
a, radiación que tiene una longitud de onda de
10-20 hasta 100 metros. Realizaciones preferidas de
la presente invención emplean la radiación electromagnética de:
radiación gama (10-20 hasta 10-13
m), radiación de rayos X (10-12 hasta
10-9 m), los ultroavioleta (10 nm a 400 nm), luz
visible (400 nm a 700 nm), radiación infrarroja (700 nm a 1.0 mm),
y radiación de microondas (1 mm a 30 cm).
Los radiosensibilizadores son conocidos por
incrementar la sensibilidad de las células cancerosas a los efectos
tóxicos de la radiación electromagnética. Muchos protocolos para el
tratamiento del cáncer emplean actualmente radiosensibilizadores
activados por la radiación electromagnética de rayos X. Ejemplos de
radiosensibilizadores activados por rayos X incluyen, pero no se
limitan a, lo siguiente: metronidazol, misonidazol,
desmetilmisonidazol, pimonidazol, etanidazol, nimorazol, mitomicina
C, RSU 1069, SR 4233, EO9, RB 6145, nicotinamida,
5-bromodesoxiuridina (BUdR),
5-yododesoxiuridina (IUdR), bromodesoxicitidina,
fluorodesoxiuridina (FUdR), hidroxiurea, cisplatina, y análogos y
derivados terapéuticamente efectivos de los mismos.
La terapia fotodinámica (PDT) de cánceres emplea
luz visible como activador por radiación de los agentes
sensibilizantes. Ejemplos de radiosensibilizantes fotodinámicos
incluyen los siguientes pero no se limitan a: derivados de
hematoporfirina, fotofrina (r), derivados de benzoporfirina, NPe6,
etioporfirina de estaño (SnET2), feoborbide-a,
bacterioclorofil-a, naftalocianinas, ftalocianinas,
ftalocianina de zinc, análogos y derivados terapéuticamente
efectivos de los mismos.
Los anticuerpos
anti-M-CSF y
anti-M-CSFR usados en la práctica de
un método de la invención pueden formularse en composiciones
farmacéuticas que comprenden un vehículo adecuado para el método de
administración deseado. Vehículos adecuados incluyen cualquier
material que, cuando se combina con los anticuerpos
anti-M-CSF y
anti-M-CSFR, retiene la función
antitumoral del anticuerpo y no son reactivos con el sistema inmune
del sujeto. Ejemplos de los mismos incluyen, pero no se limitan a,
cualquiera de un gran número de vehículos farmacéuticos estándar
tales como soluciones salinas reguladas con fosfato estériles, agua
bacteriostática y similares.
La presente invención proporciona adicionalmente
los anticuerpos antes descritos en una forma detectable marcada.
Los anticuerpos pueden ser marcados de forma detectable a través del
uso de radio isótopos, marcadores de afinidad (tales como biotina,
avidina, etc.) marcadores enzimáticos (tales como peroxidasa de
rábano, fosfatasa alcalina, etc.), marcadores fluorescentes (tales
como FITC o rodamina, etc.), átomos paramagnéticos y similares. Los
procedimientos para alcanzar tal etiquetado son bien conocidos en la
técnica; por ejemplo, véase (Sternberger, L.A. et al., J.
Histochem. Cytochem. 18:315 (1970); Bayer, E.A. et al., Meth.
Enzym. 62:308 (1979); Engval, E. et al., Inununol. 109:129
(1972); Goding, J.W. J. Immunol. Meth. 13:215 (1976)).
La presente invención contempla el uso de
anticuerpos anti-MCSF y anti-MCSFR
"desnudos", así como el uso de inmunoconjugados. La producción
de inmunoconjugados se describe en la Patente de los Estados Unidos
No. 6,306,393. Los inmunoconjugados pueden prepararse conjugando
indirectamente un agente terapéutico a un componente anticuerpo.
Las técnicas generales se describen en Shih et al., Int. J.
Cancer 41:832-839 (1988); Shih et al., Int.
J. Cancer 46:1101-1106 (1990); y Shih et al,
Patente de los Estados Unidos No. 5,057,313.
El método general involucra hacer reaccionar un
componente anticuerpo que tiene una porción de carbohidrato oxidada
con un polímero portador que tiene al menos una función amina libre
y que está cargado con una pluralidad de fármaco, toxina, quelante,
adendos de boro, y otros agentes terapéuticos. La reacción da como
resultado un enlace de base de Schiff inicial (imina), el cual
puede ser estabilizado por reducción a una amina secundaria para
formar el conjugado final.
El polímero portador es preferiblemente un
aminodextrano o polipéptido de al menos 50 residuos de aminoácidos,
aunque otros vehículos poliméricos equivalente sustancialmente
también pueden ser utilizados. Preferiblemente, el inmunoconjugado
final es soluble en una solución acuosa, tal como un suero de
mamífero, para facilidad de administración y direccionamiento
efectivo para su uso en terapia. Así, las funciones de
solubilización sobre el polímero portador potenciarán la
solubilidad del suero del inmunoconjugado final. En particular, se
preferirá un aminodextrano. El proceso para prepara un
inmunoconjugado con un vehículo aminodextrano típicamente comienza
con un polímero de dextrano, ventajosamente un dextrano de peso
molecular promedio de aproximadamente
10,000-100,000. El dextrano se hace reaccionar con
un agente oxidante para afectar una oxidación controlada de una
porción de sus anillos carbohidrato para formar grupos aldehído. La
oxidación se efectúa de forma conveniente con reactivos químicos
glicolíticos tales como NalO4, de acuerdo con procedimientos
convencionales.
El dextrano oxidado se hace reaccionar entonces
con una poliamina, preferiblemente una diamina, y más
preferiblemente, un amono o polihidroxi diamina. Aminas adecuadas
incluyen etilén diamina, propilén diamina, u otras polimetilén
diaminas similares, dietilén triamina o poliaminas similares,
1,3-diamino-2-hidroxipropano,
u otras diaminas hidroxiladas similares o poliaminas, y similares.
Se utiliza un exceso de la amina con respecto a los grupos
aldehídos con el fin de asegurar sustancialmente una conversión
completa de las funciones aldehído a los grupos de base de
Schiff.
Se utiliza un agente reductor, tal como NaBH4,
NaBH3 CN o similares, para efectuar la estabilización reductiva del
intermedio de base de Schiff resultante. El aducto resultante puede
ser purificado por paso a través de una columna de selección por
tamaño convencional para eliminar los dextranos entrecruzados.
También pueden utilizarse otros métodos
convencionales para producir un derivado de un dextrano para
introducir funciones amina, por ejemplo, la reacción con bromuro de
cianógeno, seguida por reacción con una diamina.
El aminodextrano se hace reaccionar entonces con
un derivado del fármaco, toxina, quelante, inmunomodulador, adendo
de boro particulares, u otro agente terapéutico que va a ser
cargado, en una forma activada, preferiblemente, un derivado
activado de carboxilo, preparado por medios convencionales, por
ejemplo, utilizando diciclohexilcorbodiimida (DCC) o una variante
soluble en agua del mismo, para formar un aducto intermedio.
Alternativamente, las toxinas de polipéptidos
tales como las proteínas antivirales de fitolaca o una cadena A de
ricino, y similares, pueden acoplarse al aminodextrano por
condensación de glutaraldehído o por reacción de los grupos
carboxilo activados sobre las proteínas con aminas sobre el
aminodextrano.
Los quelantes para radiometales o potenciadores
de la resonancia magnética son bien conocidos en la técnica.
Típicos son los derivados del ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)
y ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA). Estos quelantes
típicamente tienen grupos sobre la cadena lateral mediante los
cuales el quelante puede ser conectado a un vehículo. Tales grupos
incluyen, por ejemplo, bencilisotiocianato, mediante los cuales el
DTPA o el EDTA pueden ser acoplados al grupo amino de un vehículo.
Alternativamente, los grupos carboxilo o grupos amino del quelante
pueden ser acoplados a un vehículo por activación o derivación
previa y luego acoplado, todo por medios bien conocidos.
Los adendos de boro, tales como los carboranos,
pueden ser unidos a componentes de anticuerpos por métodos
convencionales. Por ejemplo, los carboranos pueden prepararse con
fusiones carboxilo sobre cadenas laterales pendientes, como es bien
conocido en la técnica. La unión de tales carboranos a un vehículo,
por ejemplo aminodextrano, puede lograrse mediante la activación de
los grupos carboxilo de los carboranos y condensación con aminas
sobre el vehículo para producir un conjugado intermedio. Tales
conjugados intermedios son unidos entonces a componentes
anticuerpos para producir inmunoconjugados terapéuticamente útiles,
como se describe más abajo.
Un vehículo polipeptídico puede ser utilizado en
vez del aminodextrano, pero el vehículo polipeptídico debería tener
al menos 50 residuos de aminoácidos en la cadena, preferiblemente
100-5000 residuos de aminoácidos. Al menos algunos
de los aminoácidos deberían ser residuos de lisina o glutamato o
residuos de aspartato. Las aminas pendientes de los residuos de
lisina y los carboxilatos pendientes de la glutamina y el aspartato
son convenientes para enlazar un fármaco, toxina, inmunomodulador
quelante, adendo de boro u otros agentes terapéuticos. Ejemplos de
vehículos polipetídicos adecuados incluyen polilisina, ácido
poliglutámico, ácido poliaspártico, copolímeros de los mismos, y
polímeros mixtos de estos aminoácidos y otros, por ejemplo, serinas,
para conferir propiedades de solubilidad deseable al vehículo e
inmunoconjugado cargado resultante.
La conjugación de un conjugado intermedio con el
componente anticuerpo se efectúa oxidando la porción carbohidrato
del componente anticuerpo y para hacer reaccionar los carbonilos del
aldehído resultante (y cetona) con grupos amino que permanecen en
el vehículo después de la carga con un fármaco, toxina, quelante,
inmunomodulador, adendo de boro u otro agente terapéutico.
Alternativamente, puede enlazarse un conjugado intermedio a un
componente anticuerpo oxidado a través de grupos amino que han sido
introducidos en el conjugado intermedio después de cargarlo con el
agente terapéutico. La oxidación se efectúa convenientemente bien
sea de forma química, por ejemplo, con NaIO4 u otro reactivo
glicolítico, o enzimáticamente, por ejemplo con neuraminidasa y
galactosa oxidasa. En el caso de un vehículo aminodextrano, no
todas las aminas del aminodextrano se utilizan típicamente para
cargar un agente terapéutico. Las aminas restantes del aminodextrano
se condensan con el componente anticuerpo oxidado para formar
aductos de base de Schiff, los cuales se estabilizan reductivamente,
normalmente con una gente reductor de borohidruro.
Se utilizan procedimientos análogos para
producir otros inmunoconjugados de acuerdo con la invención. Los
vehículos polipetídicos cargados tienen preferiblemente residuos de
lisina libres que permanecen para la condensación con la porción de
carbohidrato oxidada de un componente anticuerpo. Los carboxilos
sobre el vehículo polipeptídico pueden, si es necesario,
convertirse en aminas mediante, por ejemplo, activación con DCC y
reacción con un exceso de diamina.
El inmunoconjugado final se purifica utilizando
técnicas convencionales, tales como cromatografía de exclusión
sobre Sefacril S-300 o cromatografía de afinidad
utilizando uno o más epítopos CD84Hy.
Alternativamente, los inmunoconjugados pueden
prepararse por conjugación directa de un componente anticuerpo con
una gente terapéutico. El procedimiento general es análogo al método
indirecto de conjugación excepto que un agente terapéutico se
enlaza directamente a un componente anticuerpo oxidado.
Será evidente que otros agentes terapéuticos
pueden ser sustituidos por los quelantes aquí descritos. Las
personas experimentadas en la técnica serán capaces de diseñar
esquemas de conjugación sin una experimentación indebida.
Como una ilustración adicional, un agente
terapéutico puede ser enlazado en la región de flexión de un
componente de anticuerpo reducido a través de formación de puentes
disulfuro. Por ejemplo, los péptidos toxoides del tétano pueden ser
construidos con un residuo de cisteína individual que se utiliza
para enlazar el péptido a un componente anticuerpo. Como
alternativa, tales péptidos pueden ser enlazados al componente
anticuerpo utilizando un agente de entrecruzamiento
heterobifuncional, tal como N-succinil
3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), Yu
et al., Int. J. Cancer 56:244 (1994). Técnicas generales para
tales conjugaciones son bien conocidas en la técnica. Véase, por
ejemplo, Wong, Chemistry Of Protein Conjugation and
Cross-Linking (CRC Press 1991); Upeslacis et
al., "Modification of Antibodies by Chemical Methods," in
Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et
al. (eds.), páginas 187-230
(Wiley-Liss, Inc. 1995); Price, "Production and
Characterization of Synthetic Peptide-Derived
Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Production, Enineering and
Clinical Application, Ritter et al. (eds.), páginas
60-84 (Cambridge University Press 1995).
Como se describe más arriba, las unidades
estructurales carbohidrato en la región Fc de un anticuerpo pueden
utilizarse para conjugar un agente terapéutico. Sin embargo, la
región Fc puede estar ausente si un fragmento de anticuerpos se
utiliza como componente anticuerpo del inmunoconjugado. No obstante,
es posible introducir una unidad estructural carbohidrato en la
región variable de la cadena liviana de un anticuerpo o fragmento
de anticuerpo. Véase, por ejemplo, Leung et al., J. Immunol.
154:5919 (1995); Hansen et al., Patente de los Estados
Unidos No. 5,443,953. La unidad estructural carbohidrato manipulada
por ingeniería genética se utiliza entonces para enlazar un agente
terapéutico.
Además, los experimentados en la técnica
reconocerán numerosas variaciones posibles de los métodos de
conjugación. Por ejemplo, la unidad estructural carbohidrato puede
utilizarse para enlazar polietilén glicol con el fin de extender la
vida media de un anticuerpo intacto, o un fragmento enlazante al
antígeno del mismo, en sangre, linfa, u otros fluidos
extracelulares. Adicionalmente, es posible construir un
"inmunoconjugado divalente" enlazando agentes terapéuticos a
una unidad estructural carbohidrato y a un grupo sulfhidrilo libre.
Tal grupo sulfhidrilo libre puede ser localizado en la región de
flexión del componente anticuerpo.
La presente invención contempla el uso de
proteínas de fusión que comprenden una o más unidades estructurales
de anticuerpo de anti-M-CSF y
anti-M-CSFR y un inmunomodulador o
una unidad estructural de toxina. Los métodos para hacer proteínas
de fusión de anticuerpo son bien conocidos en la técnica. Véase, por
ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 6,306,393. Las
proteínas de fusión de anticuerpos comprenden una unidad estructural
interleucina-2 descritos por Boleti et al.,
Ann. Oncol. 6:945 (1995), Nicolet et al., Cancer Gene Ther.
2:161 (1995), Becker et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA
93:7826 (1996), Hank et al., Clin. Cancer Res. 2:1951 (1996),
y Hu et al., Cancer Res. 56:4998 (1996). Además, Yang et
al., Hum. Antibodies Hybridomas 6:129 (1995), describe una
proteína de fusión que incluye un fragmento F(ab')2 y una
unidad estructural alfa de factor de necrosis tumoral.
Métodos para hacer proteínas de fusión
anticuerpo-toxina las cuales una molécula
recombinante comprende uno o más componentes de anticuerpo y una
toxina o un agente quimioterapéutico también son bien conocidas para
los expertos en la técnica. Por ejemplo las proteínas de fusión A
de exotoxinas de anticuerpo-Pseudomonas han sido
descritas por Chaudhary et al., Nature 339:394 (1989),
Brinkmann et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 88:8616 (1991),
Batra et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:5867 (1992),
Friedman et al., J. Immunol. 150:3054 (1993), Wels et
al., Int. J. Can. 60:137 (1995), Fominaya et al., J.
Biol. Chem. 271:10560 (1996), Kuan et. al., Biochemistry
35:2872 (1996), y Schmidt et al., Int. J. Can. 65:538 (1996).
Las proteínas de fusión de anticuerpo-toxina que
contienen una unidad estructural de toxina difteria han sido
descritas por Kreitman et al., Leukemia 7:553 (1993),
Nicholls et al., J. Biol. Chem. 268:5302 (1993), Thompson
et al., J. Biol. Chem. 270:28037 (1995), y Vallera et
al., Blood 88:2342 (1996). Deonarain et al., Tumor
Targeting 1:177 (1995), han descrito una proteína de fusión
anticuerpo-toxina que tiene una unidad estructural
ARNasa, mientras Linardou et al., Cell Biophys.
24-25:243 (1994), produjeron una proteína de fusión
anticuerpo-toxina que comprendía un componente
ADNasa I. La gelonina fue utilizada como la unidad estructural de
toxina en una proteína de fusión anticuerpo-toxina
de Wang et al., Abstracts of the 209th ACS National Meeting,
Anaheim, Calif., Apr. 2-6, 1995, Part 1, BIOT005.
Como ejemplo adicional, Dohlsten et al., Proc. Nat'l Acad.
Sci. USA 91:8945 (1994), reportaron una proteína de fusión
anticuerpo-toxina que comprende
enterotoxina-A de Estafilococo.
Ilustrativas de las toxinas que son empleadas de
forma adecuada en la preparación de tales conjugados son ricina,
abrina, ribonucleasa, ADNasa I, enterotoxina A de Estafilococo,
proteína antiviral de fitolaca, gelonina, toxina de difterina,
exotoxina de Pseudomonas, y endotoxinas de Pseudomonas. Véase, por
ejemplo, Pastan et al., Cell 47: 641 (1986), and Goldenberg,
CA-A Cáncer Journal for Clinicians 44: 43 (1944).
Otras toxinas adecuadas son conocidas para los expertos en la
técnica.
La invención se ilustra mediante los siguientes
ejemplos, los cuales no pretenden ser limitantes de manera
alguna.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Este ejemplo muestra que las líneas celulares de
cáncer de seno altamente metastáticas expresan altos niveles de
M-CSF. Utilizando microdisposiciones, la expresión
genética del M-CSF mediante la línea celular
altamente metastática, MDA 231, se comparó con las líneas celulares
MCF7 y ZR751. Hubo un incremento de 6.9 veces cuando el nivel de
expresión de M-CSF en MDA 231 se comparó con el de
MCF7, y un incremento de 5.2 veces cuando el nivel de expresión de
M-CSF en MDA 231 se comparó con el de ZR751.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Este ejemplo muestra que el
M-CSF purificado puede ser reemplazado por medio
condicionado (CM) de la línea celular metastática MDA 231 pero no
de la línea celular MCF7 en ensayos in vitro de formación de
osteoclastos (Figura 3).
Producción de medios condicionados (CM):
células MDA 231 o MCF7 fueron colocadas en placa a una densidad de
1 x 106 células/10 cm por disco en 8 mls de DMEM al 50%/HAMs 50% F12
que contenía 1 x ITS, (BD Biosciences, Lexington, Ky), un
suplemento de cultivo que contenía insulina, transferrina humana, y
ácido selenoso. Después de 48 horas de incubación a 37ºC en
CO_{2} al 5%, los medios fueron recolectados y centrifugados
durante 10 minutos a 1500 RPM para retirar cualquier célula
suspendida. El sobrenadante fue recolectado, filtrado a través de
un filtro de 0.2 nM y se utilizó como CM.
Ensayo de osteoclastos: células CD34+ de médula
ósea fueron colocadas en placa a una densidad de 15.000 células/96
pozos en 100 \mul de Alfa MEM que contenía 10% de FCS, 1 X
Pen/Strep y 1 x fungizona. Al día siguiente, se retiraron 50 \mul
del medio de cada pozo y se reemplazaron por 25 \mul de medio Alfa
MEM y 75 \mul de CM o DMEM al 50%/HAMs al 50% F12 que contenía 1
x ITS. Se añadió RANKL a cada pozo a una concentración final de 100
ng/ml y se añadieron 30 ng/ml de M-CSF a los pozos
apropiados. Las células fueron incubadas a 37ºC en CO_{2} al 5%
durante 11 días. Durante ese tiempo se añadió RANKL fresco de nuevo
después de 6 días. Después de 11 días las células fueron fijadas y
teñidas para fosfatasa ácida resistente al tartrato utilizando el
kit de fosfatasa ácida de leucocito de Sigma.
Resultados: como se muestra en la Figura 3, el
M-CSF puede ser reemplazado por medio condicionado
(CM) de la línea celular metastática MDA 231 pero no de la línea
celular MCF7 en ensayos in vitro de formación de
osteo-
clastos.
clastos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Este ejemplo muestra que la inducción de
osteoclastos por MDA 231 CM es neutralizada por anticuerpos de
M-CSF (Figura 4).
Las células CD34+ de médula ósea fueron
colocadas en placa como se describió en el ejemplo 2. Al día
siguiente se retiraron 50 \mul de medio de cada pozo. Se
añadieron 25 \mul de 6 x anticuerpo 5H4 o medio Alfa MEM a cada
uno de los pozos seguido por 75 \mul de CM o DMEM al 50%/HAMs al
50% F12 que contenía 1 x ITS o medio alfa MEM. Se añadieron 100
ng/ml de RANKL a todos los pozos, y se añadieron 30 ng/ml de
M-CSF a la mitad de los pozos. Las células fueron
incubadas a 37ºC en CO_{2} al 5% durante 11 días. Durante ese
tiempo se añadió RANKL fresco de nuevo después de 6 días. Después
de 11 días, las células fueron fijada y teñidas para fosfatasa
ácida resistente a tartrato utilizando el kit de fosfatasa ácida de
leucocitos de Sigma.
Como se muestra en la Figura 4, la inducción de
osteoclastos por MDA 231 CM es neutralizada por los anticuerpos
M-CSF.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Este ejemplo muestra la actividad neutralizadora
de un anticuerpo monoclonal 5H4 (American Type Culture Collection
Accession No. HB 10027) y otros anticuerpos contra
M-CSF humano (Figura 5).
Para medir la capacidad de neutralización de los
anticuerpos contra la actividad del M-CSF humano
sobre células de murina M NFS 60 (American Type Culture Collection
Accession No. CRL-1838, disponible de ATCC en
Rockville, MD, USA, derivado de una leucemia mielogenosa inducida
con el retrovirus ecotrópico de ratón silvestre
Cas-Br-MuLV, que tiene respuesta
tanto a la interleucina 3 como al M-CSF y que
contiene un proto oncogen c-myb truncado causado
por la integración de un retrovirus), CSF-1 humano
recombinante (a 10 ng/ml de concentración final) se incubo con
diversas concentraciones de anticuerpos durante 1 hora a 37ºC en
CO_{2} al 5% en una incubadora. Después de la incubación, la
mezcla fue añadida al cultivo de M NFS 60 en placas de
microtitulación de 96 pozos. El volumen de ensayo total por pozo
fue de 100 \mul, con 10 ng/ml de rhM-CSF, la
concentración de anticuerpo indicada de acuerdo con la Figura 5, y
la densidad celular en 5,000 células/pozo. Después de 72 horas de
cultivo en una incubadora de CO_{2} a 37ºC, se probó la
proliferación celular mediante CellTiter Glo Kit (Promega). Todos
los anticuerpos fueron llevados contra el M-CSF
humano. Anogen se refiere al catálogo de productos Anogen # MO
C40048.A clon 116; Antigenix se refiere al catálogo de productos
Antigenix American # MC600520 clon M16; y R&D se refiere al
catálogo de productos R&D Systems # Mab216.
Como se muestra en la Figura 5, la proliferación
celular fue afectada principalmente por el tratamiento con el
anticuerpo 5H4 versus Anogen y Antigenix.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Este ejemplo muestra que los anticuerpos
anti-M-CSF son altamente efectivos
en la prevención de enfermedades osteolíticas severas asociadas con
la metástasis del cáncer.
Diseño experimental: para evaluar la eficacia de
los anticuerpos de M-CSF como agente terapéutico
para el tratamiento de la osteólisis, la línea celular
MDA-231 de cáncer de seno humano altamente
metastatica (3 x 105) fue inyectada en la cavidad de médula ósea
de la tibia de ratones hembra pelados. Los ratones estaban en una
edad de 4 a 7 semanas, y tenían un peso promedio de aproximadamente
20 g. Los ratones recibieron un chip para su identificación y
pasaron un periodo de aclimatación de al menos 7 días antes del
inicio del estudio de 8 semanas.
Los ratones recibieron una dosis total de 1.5
mpk (0.03 mg por ratón) de Buprenorfina subcutáneamente en ambos
flancos durante 30 minutos antes de la inyección intratibia. Los
ratones fueron anestesiados por inhalación de isofluorano y la
pierna derecha fue limpiada con etanol al 70%. Las células tumorales
(MDA-MB-231- luc, 3x105)
suspendidas en 10 \mul de solución salina fueron inyectadas en la
cavidad de médula ósea de la tibia derecha utilizando microjeringas
de 50 o 100 \mul.
Para el tratamiento con anticuerpos, se
escogieron los grupos como sigue:
- 1.
- Control de isotipo de murina IgG1
- 2.
- MCSF antihumano 5H4 murina IgG1
- 3.
- Control monoclonal de rata (TBD)
- 4.
- MCSF antiratón 5A1 de rata IgG1
- 5.
- 5H4 + 5A1 (tratamiento doble)
- 6.
- Murina + controles isotípicos de rata (doble control)
(Sin grupo de control de PBS)
\vskip1.000000\baselineskip
Dosificación. El tratamiento con anticuerpos
comenzó el día después de la inyección de las células tumorales.
Para el control isotipo de murina IgG1, se administraron MCSF
antihumano de 5H4 murina IgG1, control monoclonal de rata, y
anticuerpos MCSF antiratón de 5A1 de rata IgG1 (Lokeshwar, B.L.,
Lin, H.S., J Immunol., 15; 141(2): 483-8
(1988), 10 mg/kg de anticuerpo una vez por semana. Para el grupo de
tratamiento de combinación (5H4 + 5A1, controles de murina +
isotipo de ratas), se administraron 10 mg/kg de cada anticuerpo
individual (esto es sin mezclar) una vez por semana en inyecciones
separadas de tal manera que los ratones en estos grupos de
tratamiento recibieron 2 inyecciones por semana.
Las soluciones de dosificación fueron provistas
en una concentración prediluida (=2 mg/ml) tales que los 100 \mul
inyectados IP suministraran la dosis objetivo para un ratón de 20
gramos (=200 \mug). Para el ajuste del peso, el volumen inyectado
fue incrementado o disminuido por 5 \mul por gramo de diferencia
de peso. Por ejemplo, un ratón de 23 gramos recibió 115 \mul,
mientras que un ratón de 18 gramos recibió 90 \mul.
Mediciones. Para establecer la severidad de la
osteólisis entre los diferentes grupos de tratamiento, cada ratón
recibió una imagen de Faxitron como línea base tomada un día después
de la inyección de las células tumorales. Una imagen Faxitron fue
tomada al final del estudio (8 semanas). El crecimiento del tumor
fue medido simultáneamente utilizando el sistema Xenogen puesto que
las células del tumor expresaron de manera estable la
lucifera-
sa.
sa.
Resultados. Como se muestra en la Figura 6, el
número de animales con un marcador de osteólisis promedio de \geq
a 2.5 fue el más bajo en el grupo que recibió la combinación de
anticuerpos 5A1 + 5H4. El daño óseo osteolítico fue evaluado en una
escala de 0 - 4, siendo 0 igual a ausencia de daño óseo; 1 - 2 igual
a algún daño óseo; de tal forma que los marcadores de 2.25 o
mayores eran indicativos de un severo daño óseo. Los datos
indicaron que el M-CSF producido por el ratón (esto
es, huésped) tiene un impacto mayor sobre la osteólisis que el
M-CSF producido por las células tumorales (compárese
5H4 al 5A1 individualmente, y en combinación).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
El estudio descrito en el ejemplo 5 más arriba
fue repetido esencialmente como se describió con una excepción en
el diseño experimental. Para este estudio, el tratamiento con
anticuerpos no comenzó hasta 2 semanas después de la inoculación.
Los radiogramas de las piernas fueron tomados un día después de la
inoculación del tumor para obtener una imagen de línea base y
revisar la fractura ósea causada por la inyección. Adicionalmente,
en el día 14 después de la inoculación del tumor, los ratones fueron
sometidos a toma de imágenes mediante el sistema Xenogen IVIS para
cuantificar la emisión fotonica de luz fluorescente a partir de las
células tumorales.
Se escogieron 60 ratones con cantidad similar de
señal fotonica tibial. Los ratones con señales en el pecho
(metástasis artificiales de pulmón) fueron excluidos de este
estudio. Los ratones seleccionados fueron agrupados aleatoriamente
en los 6 grupos de tratamiento descritos y se les administraron
tratamientos de anticuerpos como se describió en el ejemplo 5. La
emisión fotonica fue monitorizada continuamente una vez por semana a
lo largo del estudio. A partir de la 5ª.semana después de la
inoculación del tumor, los radiogramas también fueron tomados una
vez por semana para establecer el crecimiento tumoral en el
hueso.
Como se muestra en la Figura 7, el número de
animales con un marcador promedio de osteólisis de \geq a 2.5 fue
el más bajo en el grupo que recibió la combinación de anticuerpos
5A1 + 5H4. El daño óseo osteolítico fue evaluado en una escala de 0
- 4, siendo 0 igual a la ausencia de daño óseo; 1 - 2 igual a algún
daño óseo, de tal manera que los marcadores de 2.25 o mayores eran
indicativos de un daño óseo severo. Los datos indicaron que el
M-CSF producido por los ratones (esto es huésped)
tenía un impacto mayor sobre la osteólisis que el
M-CSF producido por las células tumorales (compárese
5H4 con 5A1 individualmente, y en combinación).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Este ejemplo define un procedimiento para la
evaluación de la actividad anticáncer de un anticuerpo monoclonal
anti-M-CSF en un modelo SW620
subcutáneo. Los ejemplos 5 y 6 más arriba mostraron que un
anticuerpo monoclonal de anti-M-CSF
como tratamiento inhibía significativamente el crecimiento tumoral
en la médula ósea. El propósito de este estudio es evaluar si el
anticuerpo también puede inhibir el crecimiento tumoral en
tejido
blando.
blando.
Ratones hembra nu/nu con una edad de 10 semanas,
peso promedio de aproximadamente 20 g fueron utilizados para este
estudio. Los ratones pasan a través de un período de aclimatación de
al menos 7 días antes que inicie el estudio. En el día 0, el flanco
derecho del ratón pelado será inyectado con células cancerígenas de
colon humano SW620 subcutáneamente a 5x106 células por ratón por
100 \mul. Cuando el volumen del tumor alcanza
100-200 mm^{3} (usualmente 1 semana después de la
inoculación del tumor) los ratones serán distribuidos
aleatoriamente en 5 grupos de 10 ratones por grupo como siguen:
- 1.
- PBS
- 2.
- 5H4
- 3.
- 5A1
- 4.
- Control de isotipo Ab mIgG1 + rIgG1
- 5.
- 5A1 + 5H4.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ratones fueron tratados intraperitonealmente
con los anticuerpos designados a 10 mpk una vez a la semana durante
4 semanas. Cuando el volumen de tumor alcanzo 2.000 mm^{3}, el
estudio se dio por terminado. Alternativamente, los animales fueron
sometidos a eutanasia cuando se dio cualquiera de las siguientes
situaciones: la ulceración de superficie tumoral es superior al 30%
del área total de la superficie del tumor, pérdida significativa de
peso corporal (> de 20%), deshidratación y estado moribundo. Se
recolecto sangre entera de todos los ratones y se analizó la
población de monocitos como un marcador potencial subrogado. El
crecimiento/tamaño del tumor se medirá mediante análisis
2-D. Las mediciones de anchura y longitud del tumor
se utilizarán para calcular el volumen del tumor. Se espera que el
crecimiento del tumor en tejido blando sea inhibido como resultado
del experimento
anterior.
anterior.
\newpage
Ejemplo
8
El ejemplo siguiente define un procedimiento
para la evaluación de la terapia de combinación para el tratamiento
y prevención de enfermedad osteolítica severa asociada con
metástasis de cáncer.
Diseño experimental. El estudio descrito en el
ejemplo 5 más arriba se repite esencialmente como se describió con
las siguientes excepciones. Además del anticuerpo del conjunto de
combinación de anticuerpos establecidos en los grupos de
tratamiento más abajo, los animales recibirán uno de los siguientes
tratamientos adicionales:
- 1.
- Bifosfonato (por ejemplo, Aredia; Zometa; Clodronato).
- 2.
- Cirugía
- 3.
- Radiación
- 4.
- Quimioterapia
- 5.
- Terapia hormonal (por ejemplo, Tamoxifen; terapia anti andrógenos)
- 6.
- Terapia anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos neutralizadores de RANKL/RANK; anticuerpo neutralizador de PTHrP)
- 7.
- Terapia de proteína terapéutica (por ejemplo, receptor de RANKL soluble; OPG e inhibidores PDGF y MMP)
- 8.
- Terapia de fármacos de molécula pequeña (por ejemplo, inhibidor de Src-quinasa)
- 9.
- Terapia de oligonucleótidos (por ejemplo RANKL o RANK o antisentido PTHrP)
- 10.
- Terapia genética (por ejemplo inhibidores de RANKL o RANK)
- 11.
- Terapia de péptidos (por ejemplo, muteinas de RANKL).
\vskip1.000000\baselineskip
Los grupos de tratamientos son como siguen. Los
tratamientos adicionales de más arriba son indicados más abajo como
"más terapia X":
- 1.
- PBS solamente
- 2.
- Tratamiento con terapia X solamente
- 3.
- Control de isotipo de rata IgG1
- 4.
- Control de isotipo de murina IG1
- 5.
- MCSF antihumano 5H4 solamente
- 6.
- MCSF antiratón de 5A1 de rata IgG1 solamente
- 7.
- Combinación de control de isotipo de rata IgG1 y murina IgG1
- 8.
- Combinación de 5H4 y 5A1
- 9.
- Control de isotipo de rata IgG1más terapia X
- 10.
- Control de isotipo de murina IG1 más terapia X
- 11.
- MCSF antihumanos 5H4 más terapia X
- 12.
- MCSF antiratón de 5A1 de rata IgG1 más terapia X
- 13.
- Combinación de control de isotipo de rata IgG1 y murina IgG1 más terapia X
- 14.
- Combinación de 5H4 y 5A1 más terapia X.
\newpage
Dosificación: se utilizan de 0.1 a 30 mg/kg de
cada anticuerpo para administración a cada animal. La dosificación
preferida es 10 mg/kg. La ruta de administración puede ser IV, IP,
SC. La ruta preferida es IP. El tratamiento comenzará el día
después de la inyección de las células tumorales, como se describió
en el ejemplo 5 más arriba.
Mediciones. Para establecer la severidad de la
osteólisis entre los diversos grupos de tratamiento, cada ratón
recibe la toma de una imagen por Faxitron como línea base el día
después de la inyección de las células tumorales. También se toma
una imagen Faxitron al final del estudio (8 semanas). El crecimiento
del tumor se mide simultáneamente utilizando el sistema Xenogen
puesto que las células tumorales expresan de manera estable la
luciferasa. Se espera que la terapia de combinación para el
tratamiento y prevención de enfermedad osteolítica severa asociada
con la metástasis de cáncer se mejorara con respecto a la terapia de
anticuerpos únicamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
9
Los siguientes ejemplos proporcionan un
protocolo para evaluar la capacidad de los anticuerpos específicos
de M-CSF para enlazarse a, por ejemplo, células
cancerosas de seno (línea celular MDA231) o células de cáncer de
mieloma múltiple (línea celular ARH77) utilizando un selector de
células activado por fluorescencia.
Las células fueron lavadas primero dos veces con
PBS (sin Ca2+, Mg2+). Para cada placa de 10 cm, se añadieron 2 ml
de EDTA 3 mM, y las placas fueron incubadas a 37ºC durante
2-3 minutos, hasta que las células se redondearon y
comenzaron a desprenderse de la placa. A continuación, se añadieron
10 ml de regulador A (PBS + FBS al 5%) y se mezclaron. En este
momento, las células fueron peletizadas y resuspendidas
aproximadamente a 5x106 células/ml en PBS + FBS al 5%, y las
células fueron colocadas en túbulos a 100 \mul/muestra.
En este punto, se añadieron 0.1 - 10 ug/ml del
anticuerpo primario (utilizado en la concentración indicada de
anticuerpo M-CSF o anticuerpo de control). La
dilución si es necesario, se hizo en FBS al 5%/PBS. La mezcla fue
incubada entonces durante 30 minutos a 4ºC. Después del período de
incubación, las células fueron lavadas 3 veces por centrifugación a
400 g durante 5 minutos y las células fueron resuspendidas en
PBS.
El FITC o anticuerpo anti-IgG
marcado con PE (0.25 ug/muestra) fue diluido en BSA/PBS al 1% en la
dilución óptima, y las células fueron resuspendidas en esta
solución y se incubaron durante 30 minutos a 4ºC. A continuación
las células fueron lavadas 3 veces como se describió más arriba.
Siguiendo los lavados de las células, las células fueron
resuspendidas con 0.5 ml/muestra de PI-PBS (si es
necesario para distinguir las células muertas de las vivas). Las
células también pueden ser fijadas para un análisis posterior (las
células pueden durar aproximadamente 3 días si son fijadas con
formaldehído al 0.1%). Las células fueron analizadas a continuación
en FACS por fluorescencia activa utilizando procedimientos
estándar.
Como se muestra en las Figuras 8A y 8B, un
anticuerpo específico de M-CSF se enlazo a la línea
celular de cáncer de seno MDA231 o a la línea celular de cáncer de
mieloma múltiple ARH77 en una variedad de concentración de
anticuerpos como se indicó.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
El siguiente ejemplo muestra que el
M-CSF es prevalente sobre un número de superficies
celulares cancerosas. La tinción inmunohistoquímica del
M-CSF fue llevada a cabo utilizando un anticuerpo
específico de M-CSF como sigue.
En el inicio, las placas fueron calentadas en un
horno a 55 - 60ºC durante 1 hora y se dejaron enfriar durante 2 - 3
minutos. Se utilizaron los siguientes parámetros de desencerados y
rehidratación:
- a. Xileno
- 3 x 5 minutos
- b. Alcohol reactivo al 100%
- 2 x 5 minutos
- c. Alcohol reactivo al 95%
- 2 x 4 minutos
- d. Alcohol reactivo al 75%
- 2 x 3 minutos
- e. Alcohol reactivo al 50%
- 1 x 3 minutos
- g. H_{2}O dl
- 2 - 3 enjuagues rápidos.
Antes de la etapa de bloqueo del peróxido, se
preparó la eliminación del antígeno utilizando 1 x Biogenex Citra
Plus. La solución fue sometida a microondas inicialmente a potencia
completa hasta ebullición. Una vez que la solución hirvió, las
microondas fueron puestas en marcha otra vez durante 13 minutos a
nivel de potencia 2 y se dejó enfriar antes del procedimiento. La
etapa de bloqueo de peróxido fue llevada a cabo como sigue. Las
placas fueron sumergidas en H_{2}O_{2} al 3% (25 ml al 30% a 250
ml de H_{2}O dl) y colocadas a temperatura ambiente durante 10
minutos. Las placas fueron lavadas a continuación 2 veces con
H_{2}O dl y lavadas con 1 x PBS 2 x 2 minutos.
El procedimiento de bloqueo de avidina/biotina
fue llevado a cabo como sigue. Las placas fueron colocadas planas
sobre una gradilla metálica. Se utilizó un marcador Blue PAP
(marcador de placa hidrófoba) alrededor del tejido. A continuación,
se añadieron 2 gotas de Zymed Avidin (Reactivo
A)-suficientes para cubrir el tejido y las placas
fueron incubadas a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después
de la incubación, las placas fueron lavadas como sigue:
- 2 x 3 minutos de lavado en 1 x PBS.
- 2 gotas de Zymed Biotina (reactivo B) temperatura ambiente durante 10 minutos.
- 2 x 3 minutos de lavado en 1 x PBS.
El procedimiento de bloqueo de proteínas fue
llevado a cabo como sigue. Primero, se añadió suero al 10% [hasta
2% de concentración final] de la especie de anticuerpos secundario.
Se diluyo a continuación del BioGenex Power Block hasta 1 vez con
H_{2}O dl. La gradilla de placas fue sumergida en el Power Block
durante 8 minutos a temperatura ambiente, y las placas fueron
enjuagadas 2 veces en 1 x PBS.
Para la adición del anticuerpo primario, las
placas fueron colocadas planas sobre una gradilla metálica. Se
añadió un anticuerpo para cubrir cada sección (aproximadamente 350
\mul) y el anticuerpo fue asperjado con la punta de una pipeta
(si es necesario), sin raspar el tejido. Las placas fueron incubadas
entonces durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de la
incubación, las placas fueron lavadas 3 veces con 1 x PBS 3 - 5
minutos cada vez. En este punto, se aplicó Biogenex
Multi-Link a las secciones y se incubo durante 10 -
11 minutos a temperatura ambiente. Las secciones fueron lavadas
entonces 3 minutos cada vez.
La marcación fue llevada a cabo utilizando
BioGenex HRP Label a las secciones, las cuales fueron incubadas
entonces a temperatura ambiente durante 10 - 11 minutos y lavadas
con 1 x PBS 3 x 3 minutos. A continuación se añadió el sustrato
BioGenex H_{2}O_{2} (1 gota de AEC por cada 2.5 ml de
H_{2}O_{2}) a las secciones y se incubaron a temperatura
ambiente durante 10 minutos. Las secciones fueron enjuagadas
entonces varias veces con H_{2}O dl. La etapa de contratinción
fue llevada a cabo como sigue. Las secciones fueron teñidas con
hematoxilina durante 1 minuto a temperatura ambiente. A
continuación, las secciones fueron enjuagadas con agua 2 veces, y
luego incubadas en 1 x PBS durante 1 minuto. Entonces las secciones
fueron bien enjuagadas con H_{2}O para eliminar PBS. Las
secciones fueron montadas aplicando una gota de BioGenex Super Mount
a la sección y luego se secaron al aire durante la noche a
temperatura ambiente.
Como se muestra en la Figura 9, el
M-CSF es prevalente sobre un buen número de
superficies celulares cancerosas. Las secciones para los tipos de
células cancerosas indicadas fueron marcadas como sigue:
- 0
- Sin tinción
- 1
- la tinción fue similar al fondo
- 2
- Positivo, pero tinción débil
- 3
- Positivo y tinción significativa
- 4
- Positivo y tinción fuerte.
<110> Zimmerman, et al.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> MÉTODOS PARA PREVENIR Y TRATAR
METÁSTASIS DE CÁNCER Y PÉRDIDA DE HUESO ASOCIADA CON LA METÁSTASIS
DE CÁNCER
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 27527/39636A
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/426,781
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2002-11-15
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1855
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (190)..(960)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> sig_peptide
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (190)..(285)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_peptide
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (286)..(957)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 256
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2749
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (190)..(1854)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> sig_peptide
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (190)..(285)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_peptide
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (286)..(1851)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 554
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1519
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (190)..(1506)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> sig_peptide
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (190)..(285)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_peptide
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (286)..(1503)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,7cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 438
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3985
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (293)..(3211)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> sig_peptide
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (293)..(349)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_peptide
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (350)..(3208)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (374)..(598)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Immunoglobulin
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (917)..(1177)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Immunoglobulin
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2516)..(3022)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Tyrosine Kinase, Catalytic
Domain
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 972
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
Claims (15)
1. Un anticuerpo antagonista no murina que
enlaza a M-CSF, para uso en prevención o tratamiento
de metástasis ósea en un sujeto afligido con cáncer
metastático.
2. Uso de un anticuerpo antagonista no murinico
que se enlaza a M-CSF y un segundo agente
terapéutico en la manufactura de un medicamento para prevenir y
tratar metástasis ósea en un sujeto afligido con un cáncer
metastatico.
3. Uso de un anticuerpo antagonista no murinico
que se enlaza a M-CSF en la preparación de un
medicamento para prevenir o tratar metástasis de hueso en un sujeto
afligido con un cáncer metastatico, donde el medicamento es
simultánea, separada o secuencialmente administrado con un agente
terapéutico para el cáncer.
4. El uso de acuerdo con la reivindicación 2 o
reivindicación 3, donde el segundo agente terapéutico es un
bifosfonato.
5. El uso de acuerdo con la reivindicación 4
donde el bifosfonato es zeledronato, pamidronato, clodronato,
etidronato, tilundronato, alendronato o ibandronato.
6. El uso de acuerdo con la reivindicación 2 o
la reivindicación 3, donde el segundo agente terapéutico es un
agente quimioterapéutico.
7. El anticuerpo para uso en la prevención o
tratamiento de metástasis ósea de acuerdo con la reivindicación 1,
o el uso de acuerdo con la reivindicación 2 o la reivindicación 3,
donde sujeto es eximido de recibir tratamiento con bifosfonato.
8. El anticuerpo para el uso en la prevención o
tratamiento de metástasis ósea o uso de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, donde dicho anticuerpo no murinico
que se enlaza al M-CSF es seleccionado del grupo
consistente de:
- (a)
- un anticuerpo policlonal;
- (b)
- un anticuerpo monoclonal;
- (c)
- un anticuerpo humanizado;
- (d)
- un anticuerpo humano;
- (e)
- un anticuerpo quimérico; y
- (f)
- un fragmento de anticuerpo Fab, F(ab')2 o Fv.
\vskip1.000000\baselineskip
9. El anticuerpo para uso en la prevención o
tratamiento de metástasis ósea o uso de acuerdo con la
reivindicación 8 donde dicho anticuerpo es un anticuerpo
humano.
10. El anticuerpo para uso en la prevención o
tratamiento de metástasis ósea o uso de acuerdo con la
reivindicación 8 donde dicho anticuerpo es un anticuerpo
humanizado.
11. El anticuerpo para el uso en la prevención o
tratamiento de metástasis ósea o uso de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente, donde el cáncer metastático es de seno,
pulmón, renal, mieloma múltiple, tiroides, próstata, adenocarcinoma
cáncer maligno de las células sanguíneas, incluyendo leucemia y
linfoma; cánceres de cabeza y cuello; cánceres gastrointestinales,
incluyendo cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer colorectal,
cáncer pancreático, cáncer de hígado; enfermedades malignas del
tracto genital femenino, incluyendo carcinoma ovárico, cánceres
endometriales uterinos y cáncer cervical; cáncer de vesícula; cáncer
de cerebro, incluyendo neuroblastoma; sarcoma, osteosarcoma; y
cáncer de piel, incluyendo melanoma maligno o cáncer de células
escamo-
sas.
sas.
12. El anticuerpo para uso en la prevención o
tratamiento de metástasis ósea o uso de acuerdo con la
reivindicación 11, donde el cáncer metastatico es cáncer de
seno.
13. El anticuerpo para uso en la prevención o
tratamiento de metástasis ósea o uso de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente donde dicho sujeto es un humano.
14. El anticuerpo para uso en la prevención o
tratamiento de metástasis ósea o el uso de cualquier reivindicación
precedente, donde el anticuerpo no murinico que se enlaza a
M-CSF debe ser administrado a una dosis entre
aproximadamente de 0.01 mg/kg y aproximadamente 100 mg/kg.
15. El anticuerpo para uso en la prevención o
tratamiento de metástasis ósea o uso de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde el anticuerpo no murinico que
se enlaza a M-CSF compite con el anticuerpo
monoclonal 5H4 obtenible del hibridoma depositado como ATCC
Accession No. HB 10027 para enlazar al M-CSF más
del
75%.
75%.
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