PT1572106E - Métodos para prevenção e tratamento de metástase de cancro e perda óssea associada a metástase de cancro - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "MÉTODOS PARA PREVENÇÃO E TRATAMENTO DE METÁSTASE DE CANCRO E PERDA ÓSSEA ASSOCIADA A METÁSTASE DE CANCRO"

CAMPO TÉCNICO

Este invento refere-se a métodos para prevenção e tratamento de metástase de cancro e perda óssea associada a metástase de cancro através da administração de um antagonista de M-CSF a um sujeito.

ANTECEDENTES DO INVENTO

As metástases de cancro são a principal causa de recorrência pós-operatória ou pós-terapia em pacientes de cancro. Apesar de esforços intensos para desenvolver tratamentos, a metástase de cancro permanece substancialmente refractária à terapia. 0 osso é um dos locais mais comuns de metástase de vários tipos de cancros humanos (e.g., cancros da mama, do pulmão, da próstata e da tiróide). A ocorrência de metástases ósseas osteoliticas causa morbidez grave devido a dor intratável, elevada susceptibilidade a fractura, compressão de nervos e hipercalcemia. Apesar da importância destes problemas clinicos, existem poucos tratamentos disponíveis para a perda óssea associada a metástase de cancro. 2 ΡΕ1572106

Os osteoclastos medeiam a reabsorção óssea. Os osteoclastos são células multinucleadas que se diferenciam a partir de células hematopoéticas. É geralmente aceite que os osteoclastos são formados através da fusão de precursores mononucleares derivados de células estaminais hematopoéticas na medula óssea, em vez de divisões celulares incompletas (Chambers, Bone and Mineral Research 6: 1-25, 1989; Gothling et al., Clin. Orthop. Relat. R. 120: 201-228, 1976; Kahn et al., Nature 258: 325-327, 1975, Suda et al., Endocr. Rev. 13: 66-80, 1992; Walker, Science 180: 875, 1973; Walker, Science 190: 785-787, 1975; Walker, Science 190: 784-785, 1975). Eles partilham uma célula estaminal comum com células da linhagem monócitos-macrófagos (Ash et al., Nature 283: 669-670, 1980, Kerby et al., J. Bone Miner. Res. 7: 353-62, 1992). A diferenciação dos precursores de osteoclastos em osteoclastos maduros requer diferentes factores incluindo estímulos hormonais e locais (Athanasou et al., Bone Miner 3: 317-333, 1988; Feldman et al., Endocrinology 107: 1137-1143, 1980; Walker, Science 190: 784-785, 1975; Zheng et al., Histochem. J. 23: 180-188, 1991) e mostrou-se que o osso vivo e as células ósseas têm um papel crítico no desenvolvimento dos osteoclastos (Hagenaars et al., Bone Miner. 6: 179-189, 1989). Células osteoblásticas ou do estroma da medula óssea são também necessárias para a diferenciação dos osteoclastos. Um dos factores produzidos por estas células que suporta a formação de osteoclastos é o factor estimulador de colónias de macrófagos, M-CSF (Wiktor- 3 ΡΕ1572106

Jedrzejczak et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 4828-4832, 1990; Yoshida et al., Nature 345: 442-444, 1990) . 0 activador do receptor para o ligando NF-k B (RANKL, também conhecido como TRANCE, ODF e OPGL) é outro sinal (Suda et al., Endocr. Rev. 13: 66-80, 1992) através do qual as células osteoblásticas/do estroma estimulam a formação de osteoclastos e a reabsorção através de um receptor, RANK (TRANCER) , situado nos osteoclastos e precursores de osteoclastos (Lacey et al., Cell 93: 165-176, 1998; Tsuda et al., Biochem. Biophys. Res. Co. 234: 137-142, 1997; Wong et al., J. Exp. Med. 186: 2075-2080, 1997; Wong et al., J. Biol. Chem. 272: 25190-25194, 1997; Yasuda et al.,

Endocrinology 139: 1329-1337, 1998; Yasuda et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95: 3597-3602, 1998). Os osteoblastos segregam também uma proteina que inibe fortemente a formação de osteoclastos chamada osteoprotegerina (OPG, também conhecida como OCIF), que actua como um receptor isco para RANKL inibindo assim o sinal positivo entre os osteoclastos e os osteoblastos através de RANK e RANKL.

Shioi et al. (Calcified Tissue International 55: 387-394, 1994) descrevem um método através do qual osteoclastos de murideo gerados em cultura podem ser eficazmente enriquecidos ao mesmo tempo que mantêm a viabilidade e exploram os mecanismos através dos quais as células do estroma promovem a geração e sobrevivência de osteoclastos de murideo.

Neales, S.D. et al. (Journal of Orthopaedic 4 ΡΕ1572106

Research, the Journal of Bone and Joint Surgery, INC., US, 17: 686-694, 1999) descrevem um estudo identificando que um anticorpo anti-M-CSF inibe a formação de osteoclastos e a reabsorção óssea in vitro.

Os osteoclastos são responsáveis pela dissolução da matriz óssea tanto mineral como orgânica (Blair et al., J. Cell. Biol. 102: 1164-1172, 1986). Os osteoclastos representam células terminalmente diferenciadas expressando uma morfologia polarizada única com áreas membranares especializadas e vários marcadores membranares e citoplas-máticos, tais como fosfatase ácida resistente a tartrato (TRAP) (Anderson et al., 1979), anidrase carbónica II (Váànánen et al., Histochemistry 78: 481-485, 1983), receptor de calcitonina (Warshafsky et al., Bone 6: 179- 185, 1985) e receptor de vitronectina (Davies et al., J.

Cell. Biol. 109: 1817-1826, 1989). Os osteoclastos multinucleados contêm habitualmente menos de 10 núcleos, mas podem conter até 100 núcleos tendo entre 10 e 100 ym de diâmetro (Gõthling et ai., Clin. Orthop. Relat. R. 120: 201-228, 1976). Isto torna-os relativamente fáceis de identificar através de microscopia óptica. São altamente vacuolados quando no estado activo e contêm também muitas mitocôndrias, indicativo de uma elevada taxa metabólica (Mundy, em "Primer on the metabolic bone diseases and disorders of mineral metabolism", páginas 18-22, 1990). Uma vez que os osteoclastos têm um papel principal em metástases ósseas osteoliticas, existe a necessidade na técnica de novos agentes e métodos para prevenção da estimulação de osteoclastos. 5 ΡΕ1572106

Assim, permanece a necessidade na técnica de identificar novos agentes e métodos para prevenção ou tratamento de metástase de cancro, incluindo metástases ósseas osteoliticas.

SUMÁRIO DO INVENTO

As composições e métodos do presente invento preenchem as necessidades na técnica acima mencionadas e outras relacionadas. Numa concretização do invento, é proporcionado um anticorpo antagonista não de murideo que se liga a M-CSF, para utilizar na prevenção ou no tratamento de metástases ósseas num sujeito afligido com cancro metastático.

Noutra concretização do invento é proporcionada a utilização de um anticorpo antagonista não de murideo que se liga a M-CSF e um segundo agente terapêutico no fabrico de um medicamento para prevenção ou tratamento de metástases ósseas num sujeito afligido com um cancro metastático.

Noutra concretização do invento é proporcionada a utilização de um anticorpo antagonista não de murideo que se liga a M-CSF na preparação de um medicamento para prevenção ou tratamento de metástases ósseas num sujeito afligido com um cancro metastático, em que o medicamento é simultaneamente, separadamente ou sequencialmente administrado com um agente terapêutico de cancro. 6 ΡΕ1572106 É descrito um método para prevenção de metástases ósseas compreendendo a administração a um sujeito afligido com cancro metastático de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de M-CSF, prevenindo deste modo a perda óssea associada ao cancro metastático. É descrito um método de tratamento de um sujeito afligido com um cancro metastático para o osso, compreendendo a administração ao referido sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz de antagonista de M-CSF, reduzindo deste modo a gravidade da perda óssea associada ao cancro metastático. São descritos os métodos acima mencionados em que o sujeito é um mamífero ou em que o mamífero é um humano.

Está contemplado que os métodos alcançam o seu potencial terapêutico através da inibição da interacção entre M-CSF e o seu receptor (M-CSFR) . Está ainda contemplado que a inibição da interacção M-CSF/M-CSFR inibe a proliferação de osteoclastos e/ou a diferenciação induzida por células tumorais. 0 antagonista de M-CSF dos métodos acima mencionados pode ser seleccionado a partir do grupo que consiste em: um polipéptido compreendendo um anticorpo anti-M-CSF; um polipéptido compreendendo um anticorpo anti-M-CSFR deste; um polipéptido solúvel compreendendo uma muteína de M-CSF ou derivado desta; ou um polipéptido solúvel compreendendo uma muteína de M-CSFR ou derivado desta. É proporcionado o método acima mencionado em que 7 ΡΕ1572106 o antagonista de M-CSF pode ser um anticorpo anti-M-CSF. 0 antagonista de M-CSF pode ser um polipéptido compreendendo um anticorpo anti-M-CSFR. 0 antagonista de M-CSF pode ser uma polipéptido solúvel compreendendo uma muteina de M-CSF ou derivado desta. 0 antagonista de M-CSF pode ser um polipéptido solúvel compreendendo uma muteina de M-CSFR ou derivado desta. 0 antagonista de M-CSF pode ser um anticorpo seleccionado a partir do grupo que consiste em: um anticorpo policlonal; um anticorpo monoclonal; um anticorpo humanizado; um anticorpo humano; um anticorpo quimérico; fragmento de anticorpo Fab, F(ab')2 ou Fv; e uma muteina de qualquer um dos anticorpos acima mencionados. 0 anticorpo pode ligar-se ao mesmo epitopo que o anticorpo monoclonal 5H4 (N°. de Entrada ATCC HB 10027). Vários cancros metastáticos estão contemplados como sendo susceptíveis aos métodos aqui divulgados. Numa concretização, o cancro metastático é cancro da mama, do pulmão, renal, mieloma múltiplo, da tiróide, da próstata, adenocarcinoma, malignidades de células sanguíneas, incluindo leucemia e linfoma; cancros da cabeça e do pescoço; cancros gastrointestinais, incluindo cancro do estômago, cancro do cólon, cancro colorrectal, cancro pancreático, cancro do figado; malignidades do tracto genital feminino, incluindo carcinoma do ovário, cancros uterinos do endométrio e cancro cervical; cancro da bexiga; cancro cerebral, incluindo neuroblastoma; sarcoma, ΡΕ1572106 osteossarcoma; e cancro de pele, incluindo melanoma maligno ou cancro de células escamosas. A administração de uma dose terapeuticamente eficaz de um antagonista de M-CSF é também contemplada pelo presente invento. Numa concretização, o antagonista de M-CSF é um anticorpo administrado a uma dose entre cerca de 0,01 mg/kg e cerca de 100 mg/kg.

Noutra concretização do invento, é proporcionado um anticorpo não de murídeo que se liga a M-CSF para tratamento de um sujeito afligido com um cancro metastático, em que o referido anticorpo reduz eficazmente a gravidade da perda óssea associada ao cancro metastático.

Tal como aqui descrito, anticorpos podem inibir a osteólise. Numa concretização do invento, é proporcionado um anticorpo monoclonal não de murideo que se liga especificamente ao mesmo epitopo de M-CSF que 5H4. Noutra concretização, é proporcionado um anticorpo monoclonal não de murideo que compete com 5H4 pela ligação a M-CSF. De preferência, o anticorpo monoclonal não de murideo compete com 5H4 pela ligação a M-CSF em mais de 10%, de maior preferência em mais de 25%, ainda de preferência em mais de 50%, ainda de maior preferência em mais de 75% e de maior preferência mais de 90%.

Está contemplado que qualquer um dos anticorpos acima mencionados pode ser utilizado para administrar a um 9 ΡΕ1572106 sujeito a necessitar deste. Concordantemente, é descrita uma composição farmacêutica compreendendo qualquer um dos anticorpos acima mencionados e um transportador, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável.

Um anticorpo não de murideo para tratar um sujeito afligido com um cancro metastático é proporcionado numa concretização do invento, em que o anticorpo reduz eficazmente a gravidade da perda óssea associada ao cancro metastático. Numa concretização relacionada, o anticorpo acima mencionado é seleccionado a partir do grupo que consiste num anticorpo policlonal; um anticorpo monoclonal; um anticorpo humanizado; um anticorpo humano; um anticorpo quimérico; fragmento de anticorpo Fab, F(ab')2 ou Fv; e uma muteina de qualquer um dos anticorpos acima mencionados. Noutra concretização, o anticorpo é especifico para M-CSF. Ainda noutra concretização do invento, o anticorpo é especifico para M-CSFR. Noutras concretizações, o anticorpo é um anticorpo inteiramente humano ou um anticorpo humanizado. Ainda noutra concretização do invento é proporcionado um hibridoma que segrega um anticorpo acima mencionado. Vários cancros metastáticos estão contemplados como sendo susceptíveis aos anticorpos aqui divulgados. Numa concretização, o cancro metastático é cancro da mama, do pulmão, renal, mieloma múltiplo, da tiróide, da próstata, adenocarcinoma, malignidades de células sanguíneas, incluindo leucemia e linfoma; cancros da cabeça 10 ΡΕ1572106 e do pescoço; cancros gastrointestinais, incluindo cancro do estômago, cancro do cólon, cancro colorrectal, cancro pancreático, cancro do fígado; malignidades do tracto genital feminino, incluindo carcinoma do ovário, cancro uterinos do endométrio e cancro cervical; cancro da bexiga; cancro cerebral, incluindo neuroblastoma; sarcoma, osteossarcoma; e cancro de pele, incluindo melanoma maligno ou cancro de células escamosas. Numa concretização relacionada, é proporcionada uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo acima mencionado e um transportador, excipiente ou diluente farmaceuticamente adequado.

Antagonistas de M-CSF potencialmente úteis em prevenção ou tratamento de perda óssea associada a metástase de cancro podem ser pesquisados utilizando vários ensaios. É descrito um método de pesquisa para um antagonista de M-CSF compreendendo os passos de pôr em contacto meio de células do tumor metastático, osteoclastos e um antagonista candidato; detecção da formação, proliferação e/ou diferenciação de osteoclastos; e identificação do referido antagonista candidato como um antagonista de M-CSF se for detectada uma diminuição na formação, proliferação e/ou diferenciação de osteoclastos. É descrito um método de pesquisa em que o meio das células do tumor metastático inclui células tumorais. É descrito um método em que o passo de contacto ocorre in vivo, o passo de detecção compreende detecção do 11 ΡΕ1572106 tamanho e/ou número de metástases ósseas e o antagonista candidato é identificado como um antagonista de M-CSF se for detectada uma diminuição no tamanho e/ou número de metástases ósseas. 0 método pode ainda compreender o passo de determinação de se o referido antagonista candidato se liga a M-CSF. 0 método pode ainda compreender o passo de determinação de se o referido antagonista candidato inibe a interacção entre M-CSF e o seu receptor M-CSFR.

Está contemplado que vários dos diferentes antagonistas podem ser identificados utilizando os métodos de pesquisa aqui descritos. É descrito um método em que o antagonista candidato é seleccionado a partir do grupo que consiste em: um polipéptido compreendendo um anticorpo anti-M-CSF; um polipéptido compreendendo um anticorpo anti-M-CSFR deste; um polipéptido solúvel compreendendo uma muteina de M-CSF ou derivado desta; um polipéptido solúvel compreendendo uma muteina de M-CSFR ou derivado desta; um péptido; ou uma molécula pequena. É descrito um método em que o referido antagonista candidato é uma muteina de M-CSF. É descrito um método em que o referido antagonista candidato é um anticorpo anti-M-CSF. 0 antagonista candidato pode ser uma muteina de M-CSF. 0 antagonista candidato pode ser um anticorpo anti-M-CSF. 0 antagonista candidato pode ser um anticorpo anti-M-CSFR. É descrito um método de identificação de um antagonista de M-CSF que pode prevenir ou tratar cancro metastático para o osso, compreendendo os passos de: 12 ΡΕ1572106 detecção da ligação de um antagonista candidato a M-CSF; e ensaio da capacidade do referido antagonista candidato para prevenir ou tratar cancro metastático para o osso in vitro ou in vivo. É também descrito um método de identificação de um antagonista de M-CSF que pode prevenir ou tratar cancro metastático para o osso, compreendendo os passos de: detecção da ligação de um antagonista candidato a M-CSFR; e ensaio da capacidade do referido antagonista candidato para prevenir ou tratar cancro metastático para o osso in vitro ou in vivo. É também descrito um método de identificação de um antagonista de M-CSF que pode prevenir ou tratar cancro metastático para o osso, compreendendo os passos de: identificação de um antagonista candidato que inibe a interacção entre M-CSF e M-CSFR; e ensaio da capacidade do referido antagonista candidato para prevenir ou tratar cancro metastático para o osso in vitro ou in vivo.

Pode ser mais vantajoso misturar dois ou mais antagonistas de M-CSF uns com os outros para proporcionar melhor eficácia contra metástases de cancro e/ou perda óssea associada a metástase de cancro. Concordantemente, é descrito um método de prevenção de metástases ósseas e crescimento tumoral compreendendo a administração a um sujeito afligido com cancro metastático de quantidades terapeuticamente eficazes de antagonista de M-CSF e um agente terapêutico, prevenindo deste modo a perda óssea associada ao cancro metastático e prevenindo o crescimento tumoral. Semelhantemente, é descrito um método de tratamento de um sujeito afligido com um cancro metastático 13 ΡΕ1572106 compreendendo a administração ao sujeito de quantidades terapeuticamente eficazes de antagonista de M-CSF e um agente terapêutico, reduzindo deste modo a gravidade da perda óssea associada ao cancro metastático e inibindo o crescimento tumoral. 0 sujeito do método acima mencionado pode ser um mamífero. 0 sujeito pode ser um humano. São descritos os métodos acima mencionados em que o antagonista inibe a interacção entre M-CSF e o seu receptor M-CSFR. 0 antagonista pode inibir a proliferação e/ou diferenciação de osteoclastos induzida por células tumorais. 0 antagonista de M-CSF pode ser seleccionado a partir do grupo que consiste em: um polipéptido compreendendo um anticorpo anti-M-CSF; um polipéptido compreendendo um anticorpo anti-M-CSFR deste; um polipéptido solúvel compreendendo uma muteína de M-CSF ou derivado desta; e um polipéptido solúvel compreendendo uma muteína de M-CSFR ou derivado desta. Vários anticorpos antagonistas de M-CSF estão contemplados. Nos métodos acima mencionados o referido anticorpo pode ser seleccionado a partir do grupo que consiste em: um anticorpo policlonal; um anticorpo monoclonal; um anticorpo humanizado; um anticorpo humano; um anticorpo quimérico; fragmento de anticorpo Fab, F(ab')2 ou Fv; e uma muteína de qualquer um dos anticorpos acima mencionados. São descritos os métodos acima mencionados em que 14 ΡΕ1572106 ancitabina, o agente terapêutico é um bisfosfonato. 0 bisfosfonato pode ser zeledronato, pamidronato, clodronato, etidronato, tilundronato, alendronato ou ibandronato. São descritos os métodos acima mencionados em que o agente terapêutico pode ser um agente quimioterapêutico. Está contemplado que alguns sujeitos possam estar impossibilitados de receber tratamento com bisfosfonato. Como exemplo, um sujeito pode estar impossibilitado de receber tratamento com bisfosfonato se o sujeito não responder adequadamente ao bisfosfonato, se o sujeito não tolerar tratamento com bisfosfonato ou se o bisfosfonato estiver contra-indicado para os sintomas particulares do sujeito (e.g., insuficiência renal). Agentes quimioterapêuticos incluem, sem limitação, agentes alquilantes, tais como carboplatina e cisplatina; agentes alquilantes de mostarda de azoto; agentes alquilantes de nitrosoureia, tais como carmustina (BCNU); antimetabolitos, tais como metotrexato; antimetabo-litos análogos de purina, mercaptopurina; antimetabolitos análogos de pirimidina, tais como fluorouracilo (5-FU) e gemcitabina; antineoplásicos hormonais, tais como gose-relina, leuprolide e tamoxifeno; antineoplásicos naturais, tais como aldesleucina, interleucina-2, docetaxel, etopó-sido (VP-16), interferão alfa, paclitaxel e tretinoina (ATRA); antineoplásicos naturais antibióticos, tais como bleomicina, dactinomicina, daunorubicina, doxorubicina e mitomicina; e antineoplásicos naturais alcaloides vinca, tais como vinblastina, vincristina, vindesina; hidroxi-ureia; aceglatona, adriamicina, ifosfamida, enocitabina, epitiostanol, aclarubicina, ancitabina, nimustina, clori- 15 ΡΕ1572106 drato de procarbazina, carboquona, carboplatina, carmofur, cromomicina A3, polissacáridos anti-tumorais, factores de plaquetas anti-tumorais, ciclofosfamida, Esquizofilano, citarabina, dacarbazina, tioinosina, tiotepa, tegafur, neocarzinostatina, OK-432, bleomicina, furtulon, broxuri-dina, bussulfano, honvan, peplomicina, Bestatina (ubeni-mex) , interferão-β, mepitiostano, mitobronitol, merfalano, péptidos de laminina, lentinano, extracto de Coriolus versicolor, tegafur/uracilo, estramustina (estrogénio/me-cloretamina).

Mais, agentes adicionais utilizados como terapia secundária para pacientes de cancro incluem EPO, G-CSF, ganciclovir; antibióticos, leuprolide; meperidina; zidovu-dina (AZT); interleucinas 1 a 18, incluindo mutantes e análogos; interferões ou citocinas, tais como os interfe-rões α, β e γ; hormonas, tais como hormona libertadora da hormona luteinizante (LHRH) e análogos, e hormona libertadora da gonadotrofina (GnRH); factores de crescimento, tais como o factor de crescimento transformante-β (TGF-β), factor de crescimento de fibroblastos (FGF) , factor de crescimento dos nervos (NGF), factor libertador da hormona de crescimento (GHRF), factor de crescimento epidérmico (EGF), factor homólogo do factor de crescimento de fibroblastos (FGFHF), factor de crescimento de hepatócitos (HGF) e factor de crescimento de insulina (IGF); factor de necrose tumoral-α e β (TNF-a e β) ; factor de inibição de invasão-2 (IIF-2); proteínas morfogenéticas do osso 1-7 (BMP 1-7); somatostatina; timosina-a-1; γ-globulina; superóxido-dismutase (SOD); factores do complemento; facto- 16 ΡΕ1572106 res anti-angiogénese; materiais antigénicos; pró-fármacos; inibidores de receptores-cinase de factores de crescimento; anticorpo anti-Her2; e anticorpo neutralizante de VEGF. 0 antagonista de M-CSF pode ser eficaz para reduzir a dosagem de agente terapêutico necessária para alcançar um efeito terapêutico. Assim, um antagonista de M-CSF pode melhorar a eficácia do segundo agente terapêutico, ou reduzir os efeitos secundários associados à administração do segundo agente terapêutico, ou melhorar a segurança do segundo agente terapêutico. Um antagonista de M-CSF pode também melhorar a eficácia, reduzir os efeitos secundários, ou melhorar a segurança de uma segunda modalidade terapêutica tal como cirurgia ou terapia de radiação. Os métodos acima mencionados podem ainda compreender o passo de administração de um factor estimulador de colónias não M-CSF, por exemplo G-CSF. É descrita uma composição farmacêutica compreendendo um antagonista de M-CSF e um agente terapêutico de cancro. É descrita uma embalagem, um frasco ou recipiente compreendendo um medicamento compreendendo um antagonista de M-CSF e instruções de que o medicamento deve ser utilizado em combinação com cirurgia ou terapia de radiação. É descrito um método de prevenção ou tratamento de cancro metastático para o osso, compreendendo os passos de administração de um antagonista de M-CSF a um sujeito e tratamento do referido sujeito com cirurgia ou terapia de radiação. 17 ΡΕ1572106

Está contemplado que os antagonistas de M-CSF podem ser úteis como agentes imunoterapêuticos. Concordantemente, é descrito um método de alvejamento de uma célula tumoral expressando M-CSF ligado à membrana na sua superficie compreendendo o passo de administração de um anticorpo que se liga especificamente à porção extracelular do M-CSF ligado à membrana [SEQ ID N0:2]. 0 anticorpo pode ser conjugado com um radionuclideo ou outra toxina. 0 anticorpo pode ser seleccionado a partir do grupo que consiste em: um anticorpo policlonal; um anticorpo monoclonal; um anticorpo humanizado; um anticorpo humano; um anticorpo quimérico; fragmento de anticorpo Fab, F(ab')2 ou Fv; e uma muteina de qualquer um dos anticorpos acima mencionados. São descritos métodos baseados em imunoterapia de tratamento de cancro através da utilização de anticorpos anti-M-CSF para atingir células tumorais expressando M-CSF ligado à membrana na sua superficie. Os exemplos aqui mostram que uma variedade de células de cancro expressam a forma ligada à membrana de M-CSF, incluindo mas não se limitando a cancro da mama, cancro do cólon, cancro do rim, cancro do figado, cancro do pulmão, linfoma, melanoma, cancro do ovário, cancro pancreático, cancro da próstata, osteossarcoma e cancro da tiróide. Assim, o invento contempla métodos de morte ou inibição do crescimento de células tumorais expressando M-CSF ligado à membrana compreendendo o passo de administração de uma quantidade eficaz de um anticorpo que se liga a M-CSF, sozinho ou 18 ΡΕ1572106 conjugado com uma porção citotóxica. Embora sejam preferidos anticorpos específicos para M-CSF ligado à membrana, qualquer anticorpo que se ligue à porção extracelular de M-CSF ligado à membrana é útil de acordo com estes métodos.

Qualquer um dos antagonistas de M-CSF descritos pode ser útil para tratamento de cancro, incluindo cancro não metastático. É descrita a utilização de qualquer um dos antagonistas do invento para o tratamento de hipercalcemia, doença de Paget ou osteoporose.

Numa concretização do invento, é proporcionado um método de tratamento de um sujeito sofrendo de um cancro, em que as células compreendendo o referido cancro não segregam M-CSF, compreendendo o passo de administração de um antagonista de M-CSF. Numa concretização relacionada, é proporcionado um método para prevenção de metástases ósseas compreendendo a administração a um sujeito afligido com cancro metastático de uma quantidade de antagonista de M-CSF eficaz a neutralizar o M-CSF produzido pelas células do sujeito, sendo a quantidade maior que a quantidade eficaz para neutralizar o M-CSF produzido pelas células de cancro. Ainda noutra concretização, é proporcionado um método de tratamento de um sujeito afligido com um cancro metastático para o osso, compreendendo a administração ao sujeito de uma quantidade de antagonista de M-CSF eficaz a neutralizar o M-CSF produzido pelas células do sujeito, sendo a quantidade maior que a quantidade eficaz a neutralizar o M-CSF produzido pelas células de cancro. 19 ΡΕ1572106 São descritas numerosas utilizações. Como exemplo, qualquer um dos anticorpos acima mencionados é descrito para utilizar em medicina. Semelhantemente, é descrita uma utilização de um antagonista de M-CSF no fabrico de um medicamento para prevenção de metástases ósseas num sujeito afligido com cancro metastático. É descrita uma utilização de um antagonista de M-CSF no fabrico de um medicamento para prevenção, num sujeito afligido com cancro metastático, de perda óssea associada ao cancro. É descrita uma utilização de um antagonista de M-CSF no fabrico de um medicamento para tratamento de um sujeito afligido com um cancro metastático para o osso. É descrita uma utilização de um antagonista de M-CSF no fabrico de um medicamento para redução, num sujeito afligido com um cancro metastático para o osso, da gravidade da perda óssea associada ao cancro.

Está contemplado que vários sujeitos beneficiem dos métodos e utilizações dos antagonistas de M-CSF aqui descritos. 0 sujeito pode ser um mamífero. 0 mamífero pode ser um humano. São descritas as utilizações acima mencionadas em que o antagonista inibe a interacção entre M-CSF e o seu receptor (M-CSFR). 0 antagonista pode inibir a proliferação e/ou diferenciação de osteoclastos induzida por células tumorais. 0 antagonista de M-CSF pode ser seleccionado a partir do grupo que consiste em: um polipéptido compre- 20 ΡΕ1572106 endendo um anticorpo anti-M-CSF; um polipéptido compreendendo um anticorpo anti-M-CSFR deste; um polipéptido solúvel compreendendo uma muteina de M-CSF ou derivado desta; ou um polipéptido solúvel compreendendo uma muteina de M-CSFR ou derivado desta. O anticorpo pode ser selec-cionado a partir do grupo que consiste em: um anticorpo policlonal; um anticorpo monoclonal; um anticorpo humanizado; um anticorpo humano; um anticorpo quimérico; fragmento de anticorpo Fab, F(ab')2 ou Fv; e uma muteina de qualquer um dos anticorpos ou fragmentos acima mencionados. São descritas as utilizações acima mencionadas em que o anticorpo é especifico para M-CSF. O anticorpo pode ser o anticorpo 5H4. O anticorpo pode ser especifico para M-CSFR. osteossarcoma;

Estão contemplados numerosos cancros metastáticos como alvos em conjunto com as utilizações acima mencionadas do presente invento. Numa concretização, o cancro metastático é cancro da mama, do pulmão, renal, mieloma múltiplo, da tiróide, da próstata, adenocarcinoma, malignidades de células sanguíneas, incluindo leucemia e linfoma; cancros da cabeça e do pescoço; cancros gastrointestinais, incluindo cancro do estômago, cancro do cólon, cancro colorrectal, cancro pancreático, cancro do figado; malignidades do tracto genital feminino, incluindo carcinoma do ovário, cancros uterinos do endométrio e cancro cervical; cancro da bexiga; cancro cerebral, incluindo neuroblastoma; sarcoma, osteossarcoma; e cancro da pele, incluindo 21 ΡΕ1572106 melanoma maligno ou cancro de células escamosas. Noutra concretização, o antagonista de M-CSF das utilizações acima mencionadas é um anticorpo administrado a uma dose entre cerca de 0,01 mg/kg e cerca de 100 mg/kg.

Numerosos medicamentos são contemplados pelo presente invento. Como exemplo, as utilizações acima mencionadas são proporcionadas no fabrico de um medicamento para tratamento de um sujeito afligido com cancro metastático. É descrita a utilização do anticorpo no fabrico de um medicamento para redução, num sujeito afligido com um cancro metastático, da gravidade da perda óssea associada ao cancro. É descrita uma utilização de um antagonista de M-CSF e um agente terapêutico no fabrico de um medicamento para prevenção, num sujeito afligido com cancro metastático, de metástases ósseas e crescimento tumoral. É descrita uma utilização de um antagonista de M-CSF e um agente terapêutico no fabrico de um medicamento para prevenção, num sujeito afligido com cancro metastático, de perda óssea associada ao cancro. É descrita a utilização de um antagonista de M-CSF e um agente terapêutico no fabrico de um medicamento para tratamento de um cancro metastático. É descrita a utilização de um antagonista de M-CSF e um agente terapêutico no fabrico de um medicamento para redução da gravidade da perda óssea associada ao cancro e inibição de crescimento tumoral num sujeito afligido com cancro metastático. É descrito um produto compreendendo um 22 ΡΕ1572106 antagonista de M-CSF e um agente terapêutico como uma preparação combinada para utilização simultânea, separada ou sequencial em tratamento de cancro. É descrita uma utilização de um antagonista de M-CSF na preparação de um medicamento para prevenção ou tratamento de cancro metastático para o osso, em que o medicamento é administrado simultaneamente, separadamente ou sequencialmente com um agente terapêutico de cancro. É descrita uma utilização de um agente terapêutico de cancro na preparação de um medicamento para prevenção ou tratamento de cancro metastático para o osso, em que o medicamento é administrado simultaneamente, separadamente ou sequencialmente com um antagonista de M-CSF. É descrita uma embalagem, um frasco ou recipiente compreendendo um medicamento compreendendo um antagonista de M-CSF e instruções de que o medicamento deve ser utilizado em combinação com cirurgia ou terapia de radiação. Mais, são descritas as utilizações acima mencionadas em que o sujeito é um mamifero. Mais ainda, são descritas as utilizações acima mencionadas em que o mamifero é um humano. 0 antagonista das utilizações acima mencionadas pode inibir a interacção entre M-CSF e o seu receptor M-CSFR. 0 antagonista pode inibir a proliferação e/ou diferenciação de osteoclastos induzida por células tumorais. São descritas as utilizações acima mencionadas em que o referido antagonista de M-CSF é seleccionado a partir do grupo que consiste em: um polipéptido compreendendo um 23 ΡΕ1572106 anticorpo anti-M-CSF; um polipéptido compreendendo um anticorpo anti-M-CSFR deste; um polipéptido solúvel compreendendo uma muteina de M-CSF ou derivado desta; ou um polipéptido solúvel compreendendo uma muteina de M-CSFR ou derivado desta. Mais, o anticorpo pode ser seleccionado a partir do grupo que consiste em: um anticorpo policlonal; um anticorpo monoclonal; um anticorpo humanizado; um anticorpo humano; um anticorpo quimérico; fragmento de anticorpo Fab, F(ab')2 ou Fv; e uma muteina de qualquer um dos anticorpos acima mencionados.

Numerosos agentes terapêuticos são contemplados pelo presente invento. Numa concretização, são proporcionadas as utilizações acima mencionadas em que o agente terapêutico é um bisfosfonato. Mais, noutra concretização o bisfosfonato é zeledronato, pamidronato, clodronato, etidronato, tilundronato, alendronato ou ibandronato. Noutra concretização, o agente terapêutico é um agente quimioterapêutico. Numa concretização relacionada, o sujeito está impossibilitado de receber tratamento com bisfosfonato. É descrita uma utilização de um antagonista de M-CSF no fabrico de um medicamento para redução da dose de um agente terapêutico administrada a um sujeito para tratar ou prevenir metástases ósseas e crescimento tumoral. É descrita uma utilização de um antagonista de M-CSF, um agente terapêutico, e um factor de estimulação de colónias não M-CSF no fabrico de um medicamento para prevenção, num 24 ΡΕ1572106 sujeito afligido com cancro metastático, de metástases ósseas e crescimento tumoral. É descrita uma utilização de um antagonista de M-CSF, um agente terapêutico, e um factor estimulador de colónias não M-CSF no fabrico de um medicamento para prevenção, num sujeito afligido com cancro metastático, de perda óssea associada ao cancro. É descrita uma utilização de um antagonista de M-CSF, um agente terapêutico, e um factor estimulador de colónias não M-CSF no fabrico de um medicamento para tratamento de um cancro metastático. É descrita uma utilização de um antagonista de M-CSF, um agente terapêutico, e um factor estimulador de colónias não M-CSF no fabrico de um medicamento para redução da gravidade da perda óssea associada ao cancro e inibição de crescimento tumoral num sujeito afligido com cancro metastático. São descritas as utilizações acima mencionadas em que o factor estimulador de colónias não M-CSF é G-CSF. É descrita uma utilização de um anticorpo que se liga especificamente à porção extracelular do M-CSF ligado à membrana no fabrico de um medicamento para atingir uma célula tumoral que expresse M-CSF ligado à membrana na sua superfície. É descrita uma utilização de um anticorpo que (a) se liga especificamente à porção extracelular de M-CSF ligado à membrana, e (b) é conjugado com um radionuclídeo ou outra toxina no fabrico de um medicamento para tratamento de cancro. É descrita a utilização acima mencionada em que o referido anticorpo é seleccionado a 25 ΡΕ1572106 partir do grupo que consiste em: um anticorpo policlonal; um anticorpo monoclonal; um anticorpo humanizado; um anticorpo humano; um anticorpo quimérico; fragmento de anticorpo Fab, F(ab')2 ou Fv; e uma muteina de qualquer um dos anticorpos acima mencionados. É descrita uma utilização de um anticorpo anti-M-CSF não de murideo no fabrico de um medicamento para tratamento de cancro. As células constituindo o cancro podem não segregar M-CSF. É descrita uma utilização de um antagonista de M-CSF, numa quantidade que é maior que a quantidade eficaz para neutralizar o M-CSF produzido pelas células de cancro, no fabrico de um medicamento para prevenção de metástases ósseas. É descrita uma utilização de um antagonista de M-CSF, numa quantidade que é maior que a quantidade eficaz para neutralizar o M-CSF produzido pelas células de cancro, no fabrico de um medicamento para neutralização do M-CSF produzido pelas células de um sujeito. É descrita uma utilização de um antagonista de M-CSF, numa quantidade maior que a quantidade eficaz a neutralizar o M-CSF produzido pelas células de cancro, no fabrico de um medicamento para tratar um sujeito afligido com um cancro metastático para o osso. É descrita uma utilização de um antagonista de M-CSF, numa quantidade que é maior que a quantidade eficaz a neutralizar o M-CSF produzido pelas células de cancro, no fabrico de um medicamento para tratamento de cancro. São também descritos estojos. Um estojo tipico 26 ΡΕ1572106 pode compreender uma embalagem, um recipiente ou frasco compreendendo um antagonista de M-CSF e instruções, tais como um folheto ou etiqueta, orientando o utilizador para utilizar a formulação farmacêutica de acordo com qualquer um dos métodos aqui descritos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 é um diagrama de topologia mostrando as ligações dissulfureto num M-CSF dimérico truncado. A Figura 2 é um estereodiagrama da estrutura C-alfa com cada décimo residuo marcado e com o eixo de simetria não cristalográfico indicado por uma linha tracej ada. A Figura 3 é uma comparação da actividade de indução de osteoclastos entre M-CSF purificado e meio condicionado (MC) de células MDA 231 e células MCF7. A Figura 4 é uma comparação da actividade neutralizante de um anticorpo monoclonal 5H4 contra M-CSF purificado relativamente a MC de células MDA231. A Figura 5 mostra actividade neutralizante de 5H4 e outros anticorpos contra M-CSF humano. A Figura 6 mostra que o número de animais com um registo médio de osteólise >2,5 era mais baixo no grupo que recebeu a combinação de anticorpos 5A1 + 5H4. 27 ΡΕ1572106 A Figura 7 mostra que o número de animais com um registo médio de osteólise >2,5 era mais baixo no grupo que recebeu a combinação de anticorpos 5A1 + 5H4. A Figura 8 mostra que um anticorpo especifico de M-CSF se ligou à linha celular de cancro da mama MDA231 ou à linha celular de cancro mieloma múltiplo ARH77. A Figura 9 mostra que M-CSF é prevalente em várias superficies de células de cancro.

DESCRIÇÃO DETALHADA A capacidade para metastizar é uma caracteristica definidora de um cancro. A metástase refere-se à disseminação de células de cancro a outras partes do corpo ou à condição produzida por esta disseminação. A metástase é um processo complexo de múltiplos passos que inclui alterações no material genético de uma célula, proliferação descontrolada da célula alterada para formar um tumor primário, desenvolvimento de um novo fornecimento sanguíneo para o tumor primário, invasão do sistema circulatório pelas células do tumor primário, dispersão de pequenos grupos de células do tumor primário para outras partes do corpo e o crescimento de tumores secundários nestes locais. 0 osso é um dos locais mais vulgares de metástase nos cancros humanos da mama, do pulmão, da próstata e da 28 ΡΕ1572106 tiróide, bem como outros cancros, e em autópsias verifica-se que tantos como 60% dos pacientes de cancro têm metástases ósseas. A metástase óssea osteolitica mostra um passo único de reabsorção óssea osteoclástica que não é observado em metástase para outros órqãos. A perda óssea associada a metástase de cancro é mediada por osteoclastos (células gigantes multinucleadas com a capacidade para reabsorver tecidos mineralizados), que parecem ser activados através de produtos tumorais.

Verificou-se que o factor estimulador de colónias (CSF 1), também conhecido como factor estimulador de colónias de macrófagos (M-CSF), é crucial para a formação de osteoclastos. Adicionalmente, foi mostrado que o M-CSF modula as funções osteoclásticas dos osteoclastos maduros, a sua migração e a sua sobrevivência em cooperação com outros factores solúveis e interacções célula a célula proporcionadas por osteoblastos e fibroblastos (Fixe e Praloran, Cytokine 10: 3-7, 1998; Martin et al., Criticai Rev. in Eukaryotic Gene Expression 8: 107-23, 1998). O ARNm inteiro do M-CSF humano codifica uma proteína precursora de 554 aminoácidos (SEQ ID NO:4). Através de processamento alternativo do ARNm e processamento proteolítico diferencial pós-tradução, M-CSF pode ser segregado para a circulação como uma glicoproteína ou proteoglicano contendo sulfato de condroitina ou ser expresso como uma glicoproteína abrangendo a membrana na superfície de células produtoras de M-CSF. A estrutura 29 ΡΕ1572106 tridimensional dos 150 aminoácidos amino-terminais expressos em bactérias do M-CSF humano, a sequência minima necessária para uma completa actividade biológica in vitro, indica que esta proteína é um dímero ligado por dissulfureto com cada monómero consistindo em feixes de quatro hélices alfa e uma folha beta anti-paralela (Pandit et al.r Science 258: 1358-62, 1992). Três espécies distintas de M-CSF são produzidas através de processamento alternativo do ARNm. Os três precursores polipeptídicos são M-CFSa de 256 aminoácidos (sequências de ADN e de aminoácidos expostas em SEQ ID NOS: 1 e 2), Μ-ΟΞΡβ de 554 aminoácidos (sequências de ADN e de aminoácidos expostas em SEQ ID NOS:3 e 4), e M-CSFy de 438 aminoácidos (sequências de ADN e de aminoácidos expostas em SEQ ID NOS: 5 e 6). M-CSFp é uma proteína segregada que não ocorre numa forma ligada à membrana. O M-CSFa é expresso como uma proteína membranar integral que é lentamente libertada através de clivagem proteolítica. O M-CSFa é clivado nos aminoácidos 191-197 de SEQ ID NO:2. A forma ligada à membrana de M-CSF pode interagir com receptores em células vizinhas e por essa razão mediar contactos específicos célula-a-célula. Várias formas de M-CSF funcionam através de ligação ao seu receptor M-CSFR em células alvo. M-CSFR (sequências de ADN e de aminoácidos expostas em SEQ ID NOS:7 e 8) é uma molécula que abrange a membrana com cinco domínios extracelulares semelhantes a imunoglobulina, um domínio transmembranar e um domínio tirosina-cinase intracelular interrompido relacionado com Src. O M-CSFR é 30 ΡΕ1572106 codificado pelo proto-oncogene c-fms. A ligação de M-CSF ao domínio extracelular de M-CSFR leva à dimerização do receptor, que activa o domínio cinase citoplasmático, levando a autofosforilação e fosforilação de outras proteínas celulares (Hamilton J.A., J. Leukoc. Biol. 62(2): 145-55, 1997; Hamilton J.A., Immune Today. 18(7): 313-7, 1997).

Proteínas celulares fosforiladas induzem uma cascata de eventos bioquímicos conduzindo a respostas celulares: mitose, secreção de citocinas, enrugamento da membrana, e regulação da transcrição do seu próprio receptor (Fixe e Praloran, Cytokine 10: 32-37, 1998). M-CSF é expresso em células do estroma, osteoblastos e outras células. É também expresso em células tumorais da mama, uterinas e do ovário. A extensão da expressão nestes tumores correlaciona-se com grau elevado e fraco prognóstico (Kacinski, Ann. Med. 27: 79-85, 1995; Smith et al.r Clin. Câncer Res. 1: 313-25, 1995). Em carcinomas da mama, a expressão de M-CSF é prevalente em células tumorais invasivas em oposição ao cancro intraductal (pré-invasivo) (Scholl et al., J. Natl. Câncer Inst. 86: 120-6, 1994). Adicionalmente, mostra-se que M-CSF promove a progressão de tumores mamários em malignidade (Lin et al., J. Exp. Med. 93: 727-39, 2001). Para cancro da mama e do ovário, a produção de M-CSF parece ser responsável pelo recrutamento de macrófagos para o tumor. 31 ΡΕ1572106 Não existe relato de utilização de um antagonista de M-CSF em prevenção ou tratamento de metástase de cancro ou perda óssea associada a metástase de cancro. Foi descoberto, como parte do presente invento, que os antagonistas de M-CSF neutralizam a indução de osteoclastos através de células de cancro metastático. Assim, o presente invento proporciona composições e métodos para tratamento ou prevenção de metástase de cancro e perda óssea associada a metástase de cancro. "Tumor", tal como aqui se utiliza, refere-se a todo o crescimento e proliferação de células neoplásicas, seja maligno ou benigno, e todas as células e tecidos pré-cancerosos e cancerosos.

Os termos "cancro" e "canceroso" referem-se ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada por crescimento celular desregulado. Exemplos de cancro incluem mas não se limitam a carcinoma; linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia. Exemplos mais particulares de tais cancros incluem cancro da mama, cancro da próstata, cancro do cólon, cancro de células escamosas, cancro do pulmão de células pequenas, cancro do pulmão de células não pequenas, cancro gastrointestinal, cancro pancreático, glioblastoma, cancro cervical, cancro do ovário, cancro do fígado, cancro da bexiga, hepatoma, cancro colorrectal, carcinoma do endomé-trio, carcinoma da glândula salivar, cancro do rim, cancro do fígado, cancro da vulva, cancro da tiróide, carcinoma hepático e vários tipos de cancro da cabeça e do pescoço. 32 ΡΕ1572106 "Tratamento" é uma intervenção efectuada com a intenção de prevenir o desenvolvimento ou alterar a patologia de um distúrbio. Concordantemente, "tratamento" refere-se tanto a tratamento terapêutico como a medidas profilácticas ou preventivas. Aqueles a necessitar de tratamento incluem aqueles já com o distúrbio bem como aqueles em que será para prevenir o distúrbio. Em tratamento de tumores (e.g., cancro), um agente terapêutico pode diminuir directamente a patologia das células tumorais, ou tornar as células tumorais mais susceptiveis a tratamento através de outros agentes terapêuticos, e.g., radiação e/ou quimioterapia. A "patologia" do cancro inclui todos os fenómenos que comprometem o bem-estar do paciente. Isto inclui, sem limitação, crescimento celular anormal ou incontrolável, metástase, interferência com o funcionamento normal de células vizinhas, libertação de citocinas ou outros produtos de secreção a niveis anormais, supressão ou agravamento da resposta inflamatória ou imunológica, etc.

Tal como aqui se utiliza, a frase "cancro metastático" é definida como cancros que têm potencial para se disseminarem para outras áreas do corpo, particularmente para o osso. Uma variedade de cancros pode metastizar para o osso, mas os cancros que metastizam mais vulgares são da mama, do pulmão, renal, mieloma múltiplo, da tiróide e da próstata. Como exemplo, outros cancros que têm o potencial para metastizar para o osso incluem mas não se limitam a adenocarcinoma, malignidades de células sanguíneas, 33 ΡΕ1572106 incluindo leucemia e linfoma; cancros da cabeça e do pescoço; cancros gastrointestinais, incluindo cancro do estômago, cancro do cólon, cancro colorrectal, cancro pancreático, cancro do fígado; malignidades do tracto genital feminino, incluindo carcinoma do ovário, cancros uterinos do endométrio e cancro cervical; cancro da bexiga; cancro do cérebro, incluindo neuroblastoma; sarcoma, osteossarcoma; e cancro da pele, incluindo melanoma maligno e cancro de células escamosas. 0 presente invento contempla especialmente a prevenção e o tratamento de lesões osteolíticas induzidas por tumores no osso. I. Antagonistas

Tal como aqui se utiliza, o termo "antagonista" refere-se geralmente à propriedade de uma molécula, um composto ou outro agente para, por exemplo, interferir com a ligação de uma molécula a outra molécula ou a estimulação de uma célula por outra célula através de impedimento espacial, alterações conformacionais ou outros mecanismos bioquímicos. Num aspecto, o termo antagonista refere-se à propriedade de um agente para prevenir a ligação de um receptor ao seu ligando, e.g., a ligação de M-CSF com M-CSFR, inibindo deste modo a via de transdução de sinal desencadeada por M-CSF. 0 termo antagonista não é limitado por qualquer mecanismo de acção específico, mas, em vez disso, refere-se geralmente à propriedade funcional presentemente definida. Antagonistas do presente invento incluem, mas não se limitam a: anticorpos de M-CSF e 34 ΡΕ1572106 fragmentos e muteínas e modificações destes, M-CSF solúvel e fragmentos e muteinas e modificações destes, anticorpos de M-CSFR e fragmentos e muteinas e modificações destes, M-CSFR solúvel e fragmentos e muteinas e modificações destes, e péptidos bem como outros compostos químicos e moléculas que se ligam a M-CSF ou M-CSFR, e compostos anti-sentido que inibem a expressão de M-CSF e M-CSFR. Os antagonistas do presente invento excluem opcionalmente moléculas anti-sentido que se direccionam a M-CSF. Qualquer um dos antagonistas do presente invento pode ser administrado de qualquer modo conhecido na técnica. Por exemplo, muteínas de M-CSF, muteínas de M-CSFR ou fragmentos de anticorpo que se ligam a M-CSF ou M-CSFR podem ser administrados através de terapia génica.

Antagonistas de M-CSF do presente invento incluem, quando aplicável, equivalentes funcionais. Por exemplo, as moléculas podem diferir no comprimento, estrutura, componentes, etc., mas mantêm ainda uma ou mais das funções definidas. Mais particularmente, os equivalentes funcionais dos anticorpos, fragmentos de anticorpo ou péptidos do presente invento podem incluir compostos mi-méticos, i.e., construções desenhadas para imitar a configuração e/ou orientação correcta para ligação ao antigénio.

Os antagonistas de M-CSF preferidos podem ser opcionalmente modificados através da adição de grupos laterais, etc., e.g., através de acilação amino-terminal, amidação carboxi-terminal ou através de ligação de grupos 35 ΡΕ1572106 adicionais a cadeias laterais dos aminoácidos. Os antagonistas podem também compreender uma ou mais substituições conservativas. Por "substituições de aminoácidos conservativas" entenda-se as alterações na sequência de aminoácidos que conservam a carga geral, a hidrofobi-cidade/hidrofilicidade e/ou o volume espacial do aminoácido substituído. Por exemplo, substituições entre os seguintes grupos são conservativas: Gly/Ala, Val/Ile/Leu, Asp/Glu, Lys/Arg, Asn/Gln, Ser/Cys/Thr, e Phe/Trp/Tyr. Tais modificações não diminuirão substancialmente a eficácia dos antagonistas de M-CSF e podem conferir propriedades desejadas tais como, por exemplo, maior semi-vida in vivo ou menor toxicidade.

Pretende-se também que o invento inclua polipé-ptidos possuindo modificações para além da inserção, deleção ou substituição de resíduos de aminoácidos. Como exemplo, as modificações podem ser de natureza covalente, e incluir por exemplo, ligação química com polímeros, lípidos, outras porções orgânicas e inorgânicas. Tais derivados podem ser preparados para aumentar a semi-vida em circulação de um polipéptido, ou podem ser desenhados para melhorar a capacidade direccionadora do polipéptido para as células, tecidos ou órgãos desejados. Semelhantemente, o invento engloba ainda polipéptidos M-CSF ou M-CSFR que tenham sido covalentemente modificados para incluir uma ou mais uniões de polímeros solúveis em água tais como poli-etilenoglicol, polioxietilenoglicol ou polipropilenoglicol. 36 ΡΕ1572106

Tal como aqui se utiliza, a frase "quantidade terapeuticamente eficaz" pretende referir-se a uma quantidade de antagonista de M-CSF terapêutico ou profilático que seria apropriada para uma concretização do presente invento, que desencadeará o efeito ou resposta terapêutica ou profilática desejada quando administrado de acordo com o regimen de tratamento desejado. "M-CSF" humano tal como aqui se utiliza refere-se a um polipéptido humano possuindo substancialmente a mesma sequência de aminoácidos que os polipéptidos M-CSFa, Μ-03Εβ ou M-CSFy humanos maduros descritos em Kawasaki et al., Science 230: 291, 1985, Cerretti et al., Molecular Immunology 25: 761, 1988 ou Ladner et al., EMBO Journal 6: 2693, 1987. Tal terminologia reflecte a compreensão que os três M-CSFs maduros têm sequências de aminoácidos diferentes, tal como descrito acima, e que a forma activa de M-CSF é um dimero ligado com dissulfureto; assim, quando o termo "M-CSF" se refere à forma biologicamente activa, entenda-se a forma dimérica. "Dimero de M-CSF" refere-se a dois monómeros do polipéptido M-CSF que foram dimerizados e inclui tanto homodimeros (consistindo em dois monómeros M-CSF do mesmo tipo) e heterodimeros (consistindo em dois monómeros diferentes) . Os monómeros de M-CSF podem ser convertidos em dimeros de M-CSF in vitro tal como descrito na Patente U.S. N°. 4929700, que é aqui incorporada por referência. ΡΕ1572106 37

Anticorpos de M-CSF 0 termo "anticorpo" é utilizado no sentido mais amplo e cobre anticorpos completamente montados, fragmentos de anticorpo que se podem ligar ao antigénio (e.g., Fab', F'(ab)2, Fv, anticorpos de cadeia simples, diacorpos), e péptidos recombinantes compreendendo os antecedentes. 0 termo "anticorpo monoclonal" tal como aqui se utiliza refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogénea, i.e., os anticorpos individuais constituindo a população são idênticos excepto quanto a possiveis mutações de ocorrência natural que possam estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único local antigénico. Para além disso, em contraste com as preparações de anticorpos convencionais (policlonais) que incluem tipicamente diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante no antigénio. Para além da sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos por serem sintetizados pela cultura homogénea, não contaminada por outras imunoglobulinas com especificidades e caracteristicas diferentes. 0 adjectivo "monoclonal" indica o carácter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogénea de anticorpos, e não deve ser 38 ΡΕ1572106 entendido como requerendo a produção do anticorpo através de qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a utilizar de acordo com o presente invento podem ser produzidos através do método de hibridoma descrito pela primeira vez por Kohler et al., Nature, 256: 495, 1975, ou podem ser produzidos através de métodos de ADN recombinante (ver, e.g., Patente U.S. N°. 4816567). Os "anticorpos monoclonais" podem também ser isolados a partir de bibliotecas fágicas de anticorpos utilizando as técnicas descritas em Glackson et al., Nature 352: 624628, 1991 e Marks et al. , J. Mol. Biol. 222: 581-597, 1991, por exemplo.

Os "fragmentos de anticorpo" compreendem uma porção de um anticorpo intacto, de preferência a região de ligação ao antigénio ou variável do anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, e Fv; diacorpos; anticorpos lineares (Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062, 1995); moléculas de anticorpo de cadeia simples; e anticorpos multiespecificos formados a partir de fragmentos de anticorpo. A digestão com papaina de anticorpos produz dois fragmentos de ligação ao antigénio idênticos, chamados fragmentos "Fab", cada um com um único local de ligação ao antigénio, e um fragmento "Fc" residual, cujo nome reflecte a sua capacidade para cristalizar facilmente. O tratamento com pepsina produz um fragmento F(ab')2 que tem dois fragmentos de anticorpo "Fv de cadeia simples" ou "sFv" compreendendo os domínios VH e VL do anticorpo, em que estes domínios estão presentes numa 39 ΡΕ1572106 única cadeia polipeptídica simples. De preferência, o polipéptido Fv compreende ainda um ligador polipeptídico entre os dominios VH e VL que permite que Fv forme a estrutura desejada para ligação ao antigénio. Para uma revisão de sFv ver Pluckthun em "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies", vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, págs. 269-315, 1994. 0 termo "diacorpos" refere-se a pequenos fragmentos de anticorpo com dois locais de ligação ao antigénio, fragmentos esses que compreendem um domínio variável da cadeia pesada (VH) ligado a um domínio variável da cadeia leve (VL) na mesma cadeia polipeptídica (VH VL) . Ao utilizar um ligador que é demasiado curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínio são forçados a emparelhar com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois locais de ligação ao antigénio. Os diacorpos são descritos mais completamente em, por exemplo, EP 404097; WO 93/11161; e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90: 6444-6448, 1993.

Um anticorpo "isolado" é um que foi identificado e separado e recuperado a partir de um componente do seu ambiente natural. Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que interfeririam com utilizações de diagnóstico ou terapêuticas do anticorpo, e podem incluir enzimas, hormonas e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em concretizações preferidas, o anticorpo será purificado (1) até mais de 95% 40 ΡΕ1572106 do peso do anticorpo conforme determinado através do método de Lowry e de preferência mais de 99% do peso, (2) até um grau suficiente para se obter pelo menos 15 residuos da sequência de aminoácidos N-terminal ou interna através da utilização de um sequenciador de copo giratório, ou (3) até à homogeneidade através de SDS-PAGE sob condições redutoras ou não redutoras utilizando azul de Coomassie ou, de preferência, coloração de prata. O anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ dentro de células recombinantes uma vez que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente. Vulgarmente, no entanto, o anticorpo isolado será preparado através de pelo menos um passo de purificação. "Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um local de reconhecimento e ligação ao antigénio completo. Esta região consiste num dímero de um domínio variável da cadeia pesada e um da cadeia leve em íntima associação não covalente. É nesta configuração que as três CDRs de cada domínio variável interagem para definir um local de ligação ao antigénio à superfície do dímero VH VL. Colectivamente, as seis CDRs conferem especificidade de ligação ao antigénio ao anticorpo. No entanto, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv compreendendo apenas três CDRs específicas para um antigénio) tem a capacidade de reconhecer e se ligar ao antigénio, embora a uma menor afinidade que o local de ligação inteiro. O fragmento Fab contém também o domínio constante 41 ΡΕ1572106 da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CHI) da cadeia pesada. Os fragmentos Fab diferem dos fragmentos Fab' pela adição de alguns resíduos no terminal carboxilo do domínio CHI da cadeia pesada incluindo uma ou mais cisteínas da região charneira do anticorpo. Fab'-SH é a designação aqui para Fab' no qual o resíduo ou resíduos de cisterna dos domínios constantes possuem um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpo F(ab')2 foram originalmente produzidos como pares de fragmentos Fab' que têm cisteínas charneira entre eles.

Por "anticorpo neutralizante" entenda-se uma molécula de anticorpo que é capaz de eliminar ou reduzir significativamente uma função efectora de um antigénio alvo ao qual se liga. Concordantemente, um anticorpo "neutralizante" anti-alvo é capaz de eliminar ou reduzir significativamente uma função efectora, tal como uma actividade enzimática, ligação ao ligando ou sinalização intracelular.

Tal como aqui proporcionado, as composições e métodos de tratamento de metástase de cancro e/ou perda óssea associada a metástase de cancro podem utilizar um ou mais anticorpos utilizados singularmente ou em combinação com outros produtos terapêuticos para alcançar os efeitos desejados. Anticorpos de acordo com o presente invento podem ser isolados a partir de um animal produtor do anticorpo em resultado do contacto directo com um antigénio ambiental ou imunização com o antigénio. Alternativamente, 42 ΡΕ1572106 os anticorpos podem ser produzidos através de metodologia de ADN recombinante utilizando um dos sistemas de expressão de anticorpos bem conhecidos na técnica (ver, e.g., Harlow e Lane, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory (1988)). Tais anticorpos podem incluir IgGs recombinantes, proteínas de fusão quiméricas possuindo sequências derivadas de imunoglobulina ou anticorpos "humanizados" que podem ser todos utilizados para o tratamento de metástases de cancro e/ou perda óssea associada a metástase de cancro de acordo com o presente invento. Para além de moléculas inteiras, intactas, o termo "anticorpo" refere-se também a fragmentos destas (tais como, e.g., fragmentos scFv, Fv, Fd, Fab, Fab' e F(ab) '2) ou multimeros ou agregados de moléculas intactas e/ou fragmentos que se liguem a M-CSF (ou M-CSFR). Estes fragmentos de anticorpo ligam-se ao antigénio e podem ser derivados para exibir caracteristicas estruturais que facilitem a eliminação e a tomada, e.g., através de incorporação de residuos de galactose.

Numa concretização do presente invento, os antagonistas de M-CSF são anticorpos monoclonais preparados essencialmente tal como descrito em Halenbeck et al. Patente U.S. N°. 5491065 (1997). Antagonistas de M-CSF exemplares incluem anticorpos monoclonais que se ligam a um epitopo conformacional aparente associado a M-CSF dimérico recombinante ou nativo com concomitante neutralização da actividade biológica. Estes anticorpos são substancialmente não reactivos com formas biologicamente inactivas de M-CSF 43 ΡΕ1572106 incluindo M-CSF monomérico e dimérico derivado quimicamente .

Noutras concretizações do presente invento, são proporcionados anticorpos monoclonais anti-M-CSF humanizados. A frase "anticorpo humanizado" refere-se a um anticorpo derivado de um anticorpo não humano, tipicamente um anticorpo monoclonal de ratinho. Alternativamente, um anticorpo humanizado pode ser derivado de um anticorpo quimérico que mantenha ou substancialmente mantenha as propriedades de ligação ao antigénio do anticorpo parental, não humano, mas que exiba uma imunogenicidade diminuída em comparação com o anticorpo parental quando administrado a humanos. A frase "anticorpo quimérico", tal como aqui se utiliza, refere-se a um anticorpo contendo uma sequência derivada de dois anticorpos diferentes (ver, e.g., Patente U.S. N°. 4816567) que tipicamente têm origem em espécies diferentes. Mais tipicamente, os anticorpos quiméricos compreendem fragmentos de anticorpos humanos e de murideo, geralmente regiões constantes humanas e variáveis de ratinho. A frase "região determinante de complementaridade" refere-se a sequências de aminoácidos que juntas definem a afinidade e especificidade de ligação da região Fv natural de um local de ligação da imunoglobulina nativa (ver, e.g., Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917, 1987; Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services NIH Publicação N°. 913242 (1991)). A frase "região 44 ΡΕ1572106 constante" refere-se à porção da molécula de anticorpo que confere funções efectoras. No presente invento, as regiões constantes de ratinho são de preferência substituídas por regiões constantes humanas. As regiões constantes dos anticorpos humanizados sujeitos são derivadas de imunoglobulinas humanas. A região constante da cadeia pesada pode ser seleccionada a partir de qualquer um dos cinco isotipos: alfa, delta, épsilon, gama ou miu.

Os anticorpos do presente invento são referidos como sendo imunoespecificos ou ligando-se especificamente se se ligarem ao antigénio com uma Ka maior ou igual a cerca de 104 M-1, de preferência maior ou igual a cerca de 105 M”1, de maior preferência maior ou igual a cerca de 106 M”1 e ainda de preferência maior ou igual a cerca de 107 M“ 1, e ainda de maior preferência maior ou igual a cerca de ΙΟ8 Μ-1, 109 M_1, ou IO10 M_1. Por exemplo, anticorpos específicos anti-M-CSF/M-CSFR adequados ligam-se ao seu antigénio com uma afinidade de pelo menos 104 M”1, de preferência maior ou igual a cerca de 105 M"1, de maior preferência maior ou igual a cerca de 106 M"1 e ainda de preferência maior ou igual a cerca de 107 M"1, e ainda de maior preferência maior ou igual a cerca de ΙΟ8 Μ-1, 109 M"1 ou IO10 M_1. Os anticorpos anti-M-CSF/M-CSFR ligam-se a diferentes formas de ocorrência natural de M-CSF/M-CSFR, incluindo as expressas pelos tecidos do hospedeiro/sujeito bem como as expressas pelo tumor. Os anticorpos monoclonais aqui divulgados têm afinidade para M-CSF e M-CSFR e são caracterizados por uma constante de dissociação em 45 ΡΕ1572106 equilíbrio (Kd) de pelo menos 10“4 M, de preferência pelo menos cerca de 10'7 M a cerca de IO'8 M, de maior preferência pelo menos cerca de 10'8 M a cerca de 10'12 M. Os anticorpos monoclonais e fragmentos de ligação ao antigénio destes que são adequados para utilizar nos métodos do invento são capazes de se ligar especificamente a M-CSF/M-CSFR. Tais afinidades podem ser facilmente determinadas utilizando técnicas convencionais, tais como através de diálise em equilíbrio; através da utilização do instrumento BIAcore 2000, utilizando procedimentos gerais delineados pelo fabricante; através de radioimunoensaio utilizando M-CSF marcado com 125I; ou através de outro método conhecido dos peritos na técnica. Os dados de afinidade podem ser analisados, por exemplo, através do método de Scatchard et al., Ann N. Y. Acad. Sei. 51: 660, 1949. Assim, será aparente que os antagonistas preferidos de M-CSF exibirão um elevado grau de especificidade para M-CSF e ligar-se-ão com uma afinidade substancialmente inferior a outras moléculas. O antigénio a utilizar para produção de anticorpos pode ser, e.g., M-CSF intacto ou um fragmento de M-CSF que mantenha o epitopo desejado, opcionalmente fundido com outro polipéptido que permita que o epitopo seja apresentado na sua conformação nativa.

Anticorpos Policlonais

Os anticorpos policlonais são de preferência 46 ΡΕ1572106 criados em animais através de múltiplas injecções subcutâneas (sc) ou intraperitoneais (ip) do antigénio relevante e um adjuvante. Uma resposta de anticorpos melhorada pode ser obtida através da conjugação do antigénio relevante com uma proteina que seja imunogénica na espécie a imunizar, e.g., hemocianina da lapa, albumina do soro, tiroglobulina bovina ou inibidor da tripsina de soja utilizando um agente bifuncional ou de derivação, por exemplo, éster de maleimidobenzoil-sulfosuccinimida (conjugação através de residuos de cisterna), N-hidroxisuccinimida (através de residuos de lisina), glutaraldeido, anidrido succinico ou outros agentes conhecidos na técnica.

Os animais são imunizados contra o antigénio, conjugados imunogénicos ou derivados através de combinação, e.g., 100 yg ou 5 yg da proteina ou conjugado (para coelhos ou ratinhos, respectivamente) com 3 volumes de adjuvante completo de Freund e injectando a solução intradermicamente em múltiplos locais. Um mês depois, os animais são reforçados com 1/5 a 1/10 da quantidade original de péptido ou conjugado em adjuvante completo de Freund através de injecção subcutânea em múltiplos locais. Aos 7-14 dias após a injecção de reforço, os animais são sangrados e o soro é ensaiado quanto ao titulo de anticorpo. Os animais são reforçados até o titulo alcançar um patamar. De preferência, o animal é reforçado com o conjugado do mesmo antigénio, mas conjugado com uma proteina diferente e/ou através de um reagente de ligação cruzada diferente. Os conjugados podem também ser produzidos em cultura de 47 ΡΕ1572106 células recombinantes como proteínas de fusão. Também, agentes de agregação tais como alúmen são adequadamente utilizados para aumentar a resposta imunitária.

Anticorpos Monoclonais

Os anticorpos monoclonais podem ser produzidos utilizando o método de hibridoma descrito pela primeira vez por Kohler et al., Nature, 256: 495, 1975, ou podem ser produzidos através de métodos de ADN recombinante.

No método de hibridoma, um ratinho ou outro animal hospedeiro apropriado, tal como um hamster ou macaco, é imunizado tal como aqui descrito para desencadear linfócitos que produzam ou sejam capazes de produzir anticorpos que se ligarão especificamente à proteína utilizada para imunização. Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. Os linfócitos são então fundidos com células de mieloma utilizando um agente de fusão adequado, tal como polietilenoglicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, "Monoclonal Antibodies: Principies and Practice", págs. 59-103 (Academic Press, 1986)).

As células de hibridoma assim preparadas são semeadas e criadas num meio de cultura adequado que contém de preferência uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevivência das células de mieloma parentais não fundidas. Por exemplo, se as células de 48 ΡΕ1572106 mieloma parentais não possuírem a enzima hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas incluirá tipicamente hipoxan-tina, aminopterina e timidina (meio HAT), substâncias estas que impedem o crescimento de células deficientes em HGPRT. Células de mieloma preferidas são as que se fundem eficientemente, suportam uma produção estável de elevado nível de anticorpo pelas células produtoras de anticorpo seleccionadas e são sensíveis a um meio. Foram também descritas linhas celulares de mieloma humano e de heteromieloma ratinho-humano para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Brodeur et ai., "Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications", págs. 51-63 (Mareei Dekker, Inc., New York, 1987)). 0 meio de cultura no qual as células de hibridoma estão a crescer é ensaiado quanto à produção de anticorpos monoclonais dirigidos contra o antigénio. De preferência, a especificidade de ligação dos anticorpos monoclonais produzidos pelas células de hibridoma é determinada através de imunoprecipitação ou através de um ensaio de ligação in vitro, tal como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunos-sorvente enzimático (ELISA). A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode, por exemplo, ser determinada através de análise Scatchard (Munson et al., Anal. Biochem., 107: 220, 1980).

Após serem identificadas as células de hibridoma 49 ΡΕ1572106 que produzem anticorpos com a especificidade, afinidade e/ou actividade desejadas, os clones podem ser subclonados através de procedimentos de diluição limitante e criados através de métodos padrão (Goding, "Monoclonal Antibodies: Principies and Practice", págs. 59-103 (Academic Press, 1986)). Meios de cultura adequados para este fim incluem, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI-1640. Adicionalmente, as células de hibridoma podem ser criadas in vivo como tumores de ascites num animal. Os anticorpos monoclonais segregados pelos subclones são adequadamente separados do meio de cultura, do fluido de ascites ou do soro através de procedimentos convencionais de purificação de imunoglo-bulinas tais como, por exemplo, proteina A-Sepharose, cromatografia de hidroxilapatite, electroforese em gel, diálise ou cromatografia de afinidade. O ADN codificando os anticorpos monoclonais pode ser isolado e sequenciado a partir das células de hibridoma utilizando procedimentos convencionais (e.g., através da utilização de sondas oligonucleotidicas que sejam capazes de se ligar especificamente a genes codificando as cadeias pesadas e leves dos anticorpos monoclonais). Uma vez isolado, o ADN pode ser colocado em cassetes de expressão, que são então transfectadas para células hospedeiras tais como células de E. coli, células COS de símio, células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células de mieloma que de outro modo não produzem proteina imunoglobulina, para obter a sintese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. A produção recombinante de anticorpos é bem conhecida na técnica. 50 ΡΕ1572106

Variantes da sequência de aminoácidos do anticorpo desejado podem ser preparadas através da introdução de alterações nucleotidicas apropriadas no ADN codificador ou através de síntese peptídica. Tais variantes incluem, por exemplo, deleções de e/ou inserções em e/ou substituições de resíduos dentro das sequências de aminoácidos dos anticorpos. É feita qualquer combinação de deleção, inserção e substituição para se chegar à construção final, desde que a construção final possua as características desejadas. As alterações de aminoácidos podem também alterar os processos pós-tradução do anticorpo humanizado ou variante, tal como a alteração do número ou da posição de locais de glicosilação.

As moléculas de ácido nucleico codificando variantes da sequência de aminoácidos do anticorpo são preparadas através de uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Estes métodos incluem, mas não se limitam a, isolamento a partir de uma fonte natural (no caso de variantes da sequência de aminoácidos de ocorrência natural) ou preparação através de mutagénese mediada por oligonucleótidos (ou dirigida ao local), mutagénese por PCR, e mutagénese de cassete de uma variante preparada anteriormente ou uma versão não variante do anticorpo.

Como os anticorpos guiméricos ou humanizados são menos imunogénicos em humanos que os anticorpos monoclonais parentais de ratinho, podem ser utilizados para o 51 ΡΕ1572106 tratamento de humanos com muito menos risco de anafilaxia. Assim, estes anticorpos podem ser preferidos em aplicações terapêuticas que envolvam administração in vivo a um humano.

Anticorpos monoclonais quiméricos, nos quais os dominios Ig variáveis de um anticorpo monoclonal de ratinho são fundidos com dominios Ig constantes humanos, podem ser gerados utilizando procedimentos padrão conhecidos na técnica (ver Morrison, S.L., et al. (1984) "Chimeric Human Antibody Molecules; Mouse Antigen Binding Domains with Human Constant Region Domains", Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 6841-6855; e, Boulianne, G.L., et al. Nature 312: 643-646, 1984). Embora se tenha provado que alguns anticorpos monoclonais quiméricos eram menos imunogénicos em humanos, os dominios Ig variáveis de ratinho podem ainda conduzir a uma resposta humana anti-ratinho significativa.

Os anticorpos humanizados podem ser alcançados através de uma variedade de métodos incluindo, por exemplo: (1) enxerto das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) não humanas numa estrutura e região constante humana (um processo referido na técnica como humanização através de "enxerto de CDRs"), ou, alternativamente, (2) transplante dos dominios variáveis não humanos inteiros, mas "disfarçando-os" com uma superfície semelhante à humana através de substituição de resíduos superficiais (um processo referido na técnica como "folheamento"). No presente invento, os anticorpos humanizados incluirão tanto 52 ΡΕ1572106 anticorpos "humanizados" como "folheados". Estes métodos são divulgados, e.g., em Jones et al., Nature 321: 522 525, 1986; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 6851 6855, 1984; Morrison e Oi, Adv. Immunol. 44: 65-92, 1988; Verhoeyer et al., Science 239: 1534-1536, 1988; Padlan, Molec. Immun. 28: 489-498, 1991; Padlan, Molec. Immunol. 31(3): 169-217, 1994; e Kettleborough, C.A. et al., Protein Eng. 4(7): 773-83, 1991). 0 enxerto de CDRs envolve a introdução de uma ou mais das seis CDRs dos domínios Ig variáveis das cadeias pesadas e leves nas quatro regiões estruturais apropriadas dos domínios Ig variáveis humanos. Esta técnica (Riechmann, L., et al., Nature 332: 323, 1988), utiliza as regiões estruturais conservadas (FR1-FR4) como uma estrutura para suportar as voltas das CDRs que são os contactos primários com o antigénio. No entanto, uma desvantagem do enxerto de CDRs é que pode resultar num anticorpo humanizado que tenha uma actividade de ligação substancialmente inferior à do anticorpo de ratinho original, porque os aminoácidos das regiões estruturais podem contribuir para a ligação ao antigénio, e porque os aminoácidos das voltas das CDRs podem influenciar a associação dos dois domínios Ig variáveis. Para manter a afinidade do anticorpo monoclonal humanizado, a técnica de enxerto de CDRs pode ser melhorada através da escolha de regiões estruturais humanas que mais intimamente se assemelhem a regiões estruturais do anticorpo de ratinho original e através de mutagénese dirigida ao local de aminoácidos únicos dentro da estrutura 53 ΡΕ1572106 ou das CDRs auxiliada por modelação computacional do local de ligação ao antigénio (e.g., Co, M.S., et al. (1994), J. Immunol. 152: 2968-2976).

Um método de humanização de anticorpos compreende o alinhamento das sequências das cadeias pesadas e leves não humanas com sequências de cadeias pesadas e leves humanas, selecção e substituição da estrutura não humana por uma estrutura humana baseada em tal alinhamento, modelação molecular para prever a conformação da sequência humanizada e comparação com a conformação do anticorpo parental. Este processo é seguido de retro-mutação repetida de residuos na região CDR que perturbe a estrutura das CDRs até que a conformação prevista do modelo da sequência humanizada se aproxime intimamente da conformação das CDRs não humanas do anticorpo não humano parental. Tais anticorpos humanizados podem ainda ser derivados para facilitar a tomada e eliminação, e.g., através de receptores Ashwell (ver, e.g., Patentes U.S. Nos. 5530101 e 5585089) .

Foram relatadas várias humanizações de anticorpos monoclonais de ratinho através de desenho racional (ver, por exemplo, 20020091240 publicada a 11 de Julho de 2002, WO 92/11018 e Patente U.S. N°. 5693762, Patente U.S. N°. 5776886) .

Um método útil para identificação de certos residuos ou regiões do anticorpo que são localizações 54 ΡΕ1572106 preferidas para mutagénese é designado "mutagénese de varrimento de alanina", tal como descrito por Cunningham e Wells, Science 244: 1081-1085, 1989. Aqui, um resíduo ou grupo de resíduos alvo é identificado (e.g., resíduos carregados tais como arg, asp, his, lys, e glu) e substituído por um aminoácido neutro ou carregado negativamente (de preferência alanina ou polialanina) para afectar a interacção dos aminoácidos com o antigénio. As localizações de aminoácidos que demonstrem sensibilidade funcional às substituições são então refinadas através da introdução de mais ou de outras variantes em, ou para, os locais de substituição. Assim, embora o local para introdução de uma variação na sequência de aminoácidos seja predeterminado, a natureza da mutação per se não necessita de ser predeterminada. Por exemplo, para analisar o desempenho de uma mutação num dado local, é conduzida mutagénese por varrimento de ala ou aleatória no codão ou região alvo e as variantes do anticorpo expressas são pesquisadas quanto à actividade desejada.

As inserções na sequência de aminoácidos incluem fusões amino-terminais e/ou carboxi-terminais variando no comprimento de um resíduo a polipéptidos contendo cem ou mais resíduos, bem como inserções intra-sequência de um ou múltiplos resíduos de aminoácidos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo metionil N-terminal ou o anticorpo fundido com uma etiqueta epitopo. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo incluem a fusão com um polipéptido que aumente a semi-vida sérica do anticorpo. 55 ΡΕ1572106

Outro tipo de variante é uma variante de substituição de aminoácidos. Estas variantes têm pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula de anticorpo removido e um resíduo diferente inserido no seu lugar. Está contemplada mutagénese de substituição dentro de qualquer uma das regiões hipervariáveis ou CDRs ou regiões estruturais. As substituições conservativas são mostradas na Tabela 1 sob o título de "substituições preferidas". Se tais substituições resultarem numa alteração na actividade biológica, então mais alterações substanciais, denominadas "substituições exemplares" na Tabela 1, ou como melhor descrito abaixo em relação às classes de aminoácidos, podem ser introduzidas e os produtos pesquisados. TABELA 1

Substituições de Residuos Originais Exemplares Preferidas

Ala (A) vai; leu; ile vai Arg (R) lys; gin; asn lys Asn (N) gin; his; asp, lys; gin arg Asp (D) glu; asn glu Cys (C) ser; ala ser Gin (Q) asn; glu asn Glu (E) asp; gin asp Gly (G) ala His (H) asn; gin; lys; arg Ile (1) leu; vai; met; ala; leu phe; norleucina Leu (L) norleucina; ile; vai; ile met; ala; phe Lys (K) arg; gin; asn arg Met (M) leu; phe; ile leu Phe (F) leu; vai; ile; ala; tyr Pro (P) ala Ser (S) thru Thr (T) ser ser Trp (W) tyr; phe tyr Tyr (Y) trp; phe; thr; ser phe Vai (V) ile; leu; met; phe; leu ala; norleucina 56 ΡΕ1572106

Modificações substanciais nas propriedades biológicas do anticorpo são alcançadas através de selecção de substituições que difiram significativamente no seu efeito na manutenção (a) da estrutura do esqueleto polipeptidico na área da substituição, por exemplo, como uma conformação em folha ou helicoidal, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no local alvo, ou (c) o volume da cadeia lateral. Os residuos de ocorrência natural são divididos em grupos com base nas propriedades comuns da cadeia lateral: 1) hidrófobos: norleucina, met, ala, vai, leu, ile; 2) hidrófilos neutros: cys, ser, thr; 3) ácidos: asp, glu; 4) básicos: asn, gin, his, lys, arg; cadeia 5) residuos que influenciam a orientação da gly, pro; e 6) aromáticos: trp, tyr, phe.

As substituições não conservativas envolvem a substituição de um membro de uma destas classes por um membro de outra classe. 57 ΡΕ1572106

Qualquer resíduo de cisterna não envolvido na manutenção da conformação correcta do anticorpo humanizado ou variante pode também ser substituído, geralmente por serina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula e prevenir ligação cruzada aberrante. Inversamente, pode ser adicionada uma ou mais ligações de cisteina ao anticorpo para melhorar a sua estabilidade (particularmente quando o anticorpo é um fragmento de anticorpo tal como um fragmento Fv). A maturação da afinidade envolve preparação e pesquisa de variantes de anticorpo que tenham substituições dentro das CDRs de um anticorpo parental e selecção de variantes que tenham propriedades biológicas melhoradas tais como afinidade de ligação relativamente ao anticorpo parental. Um modo conveniente de gerar tais variantes de substituição é a maturação da afinidade utilizando apresentação fágica. Resumidamente, são mutados vários locais de regiões hipervariáveis (e.g., 6-7 locais) para gerar todas as possíveis substituições de aminoácidos em cada local. As variantes de anticorpo assim geradas são apresentadas de um modo monovalente a partir de partículas fágicas filamentosas como fusões com o produto do gene III de M13 empacotadas dentro de cada partícula. As variantes de apresentação fágica são então pesquisadas quanto à sua actividade biológica (e.g., afinidade de ligação). A mutagénese por varrimento de alanina pode ser efectuada para identificar resíduos da região hipervariável 58 ΡΕ1572106 que contribuam significativamente para a ligação ao antigénio. Alternativamente, ou adicionalmente, pode ser benéfico analisar uma estrutura cristalina do complexo antigénio-anticorpo para identificar pontos de contacto entre o anticorpo e o antigénio. Tais resíduos de contacto e resíduos vizinhos são candidatos para substituição de acordo com as técnicas aqui elaboradas. Uma vez geradas tais variantes, o painel de variantes é sujeito a pesquisa tal como aqui descrito e os anticorpos com propriedades superiores num ou mais ensaios relevantes podem ser seleccionados para mais desenvolvimento.

Podem também ser produzidas variantes de anticorpos que tenham um padrão de glicosilação modificado relativamente ao anticorpo parental, por exemplo, suprimindo uma ou mais porções hidrato de carbono verificadas no anticorpo e/ou adicionando um ou mais locais de glicosilação que não estejam presentes no anticorpo.

A glicosilação de anticorpos é tipicamente ligada a N ou ligada a 0. Ligada a N refere-se à união da porção hidrato de carbono à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências tripeptídicas asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido excepto prolina, são as sequências de reconhecimento para a união enzimática da porção hidrato de carbono à cadeia lateral da asparagina. A presença de uma destas sequências tripeptídicas num polipéptido cria um potencial local de glicosilação. Assim, locais de glicosilação ligada em N 59 ΡΕ1572106 podem ser adicionados a um anticorpo através da alteração da sequência de aminoácidos de modo a que contenha uma ou mais destas sequências tripeptidicas. A glicosilação ligada em 0 refere-se à união de um dos açúcares N-acetil-galactosamina, galactose, ou xilose a um hidroxiaminoácido, mais vulgarmente serina ou treonina, embora possam também ser utilizados 5-hidroxiprolina ou 5- hidroxilisina. Os locais de glicosilação ligada em 0 podem ser adicionados a um anticorpo através de inserção ou substituição de um ou mais residuos de serina ou treonina à sequência do anticorpo original.

Anticorpos humanizados ou humanos para M-CSF podem também ser produzidos utilizando animais transgénicos que não tenham produção de imunoglobulina endógena e sejam modificados para conter loci de imunoglobulinas humanas. Por exemplo, WO 98/24893 divulga animais transgénicos possuindo um locus de Ig humana em que os animais não produzem imunoglobulinas endógenas funcionais devido à inactivação dos loci das cadeias pesadas e leves endógenas. WO 91/741 divulga também hospedeiros mamíferos não primatas transgénicos capazes de montar uma resposta imunitária a um imunogénio, em que os anticorpos têm regiões constantes e/ou variáveis de primata e em que os loci codificando a imunoglobulina endógena são substituídos ou inactivados. WO 96/30498 divulga a utilização do sistema Cre/Lox para modificar o locus da imunoglobulina num mamífero, de forma a substituir toda ou uma porção da região constante ou variável para formar uma molécula de anticorpo modificada. 60 ΡΕ1572106 WO 94/02602 divulga hospedeiros mamíferos não humanos possuindo loci da Ig endógena inactivados e loci da Ig humana funcionais. A Patente U.S. N°. 5939598 divulga métodos de produção de ratinhos transgénicos em que os ratinhos não têm cadeias pesadas endógenas, e expressam um locus de imunoglobulina exógena compreendendo uma ou mais regiões constantes xenogeneicas.

Utilizando um animal transgénico descrito acima, pode ser produzida uma resposta imunitária para uma molécula antigénica seleccionada e as células produtoras de anticorpos podem ser removidas do animal e utilizadas para produzir hibridomas que segreguem anticorpos monoclonais humanos. Os protocolos de imunização, adjuvantes e semelhantes são conhecidos na técnica e são utilizados em imunização, por exemplo, de um ratinho transgénico tal como descrito em WO 96/33735. Esta publicação divulga anticorpos monoclonais contra uma variedade de moléculas antigénicas incluindo IL-6, IL-8, TNF-α, CD4 humana, selectina L, gp39 e toxina do tétano. Os anticorpos monoclonais podem ser testados quanto à capacidade para inibirem ou neutralizarem a actividade biológica ou o efeito fisiológico da proteína correspondente. WO 96/33735 divulga que anticorpos monoclonais contra IL-8, derivados de células imunitárias de ratinhos transgénicos imunizados com IL-8, bloquearam funções induzidas por IL-8 de neutrófilos. Anticorpos monoclonais humanos com especificidade para o antigénio utilizado para imunizar animais transgénicos são também 61 ΡΕ1572106 divulgados em WO 96/34096 e no pedido de patente U.S. N°. 20030194404; e pedido de patente U.S. N°. 20030031667).

Ver também Jakobovits et al., Proc. Na ti. Acad. Sei. USA 90 : 2551, 1993; Jakobovits et al., Nature 362 : 255-258, 1993; Bruggermann et al., Year in Immuno. 7 : 33, 1993; e Pat. U. S . N° . 5591669, Patente U.S. N°. 5589369, Patente U.S. N° . 5545807; e pedido de patente U.S. N°. 20020199213. 0 pedido de patente U.S. N°. 20030092125 descreve métodos para inclinar a resposta imunitária de um animal para o epitopo desejado. Anticorpos humanos podem também ser gerados através de células B activadas in vitro (ver Pat. U.S. Nos. 5567610 e 5229275). O desenvolvimento de tecnologias para produção de repertórios de genes de anticorpos humanos recombinantes e a apresentação dos fragmentos de anticorpo codificados à superfície de bacteriófagos filamentosos, proporcionou um meio para a produção de anticorpos humanos directamente. Os anticorpos produzidos através de tecnologia de fagos são produzidos como fragmentos de ligação ao antigénio habitualmente fragmentos Fv ou Fab - em bactérias e assim sem funções efectoras. As funções efectoras podem ser introduzidas através de uma de duas estratégias: Os fragmentos podem ser concebidos em anticorpos completos para expressão em células de mamífero ou em fragmentos de anticorpo biespecíficos com um segundo local de ligação capaz de desencadear uma função efectora. 62 ΡΕ1572106

Tipicamente, o fragmento Fd (VH-CH1) e a cadeia leve (VL-CL) dos anticorpos são clonados separadamente por PCR e recombinados aleatoriamente em bibliotecas de apresentação fágica combinatórias, que podem então ser seleccionadas pela ligação a um determinado antigénio. Os fragmentos Fab são expressos à superfície dos fagos, i.e., ligados fisicamente aos genes que os codificam. Assim, a selecção de Fab através da ligação ao antigénio co-selecciona as sequências codificando o Fab, que podem ser subsequentemente amplificadas. Através de vários ciclos de ligação ao antigénio e re-amplificação, um procedimento designado peneira, Fab específicos para o antigénio são enriquecidos e finalmente isolados.

Em 1994, foi descrita uma abordagem para a humanização de anticorpos, designada "selecção orientada". A selecção orientada utiliza o poder da técnica de apresentação fágica para a humanização de anticorpo monoclonal de ratinho (ver Jespers, L.S., et al., Bio/Technology 12: 899-903, 1994). Para isto, o fragmento Fd do anticorpo monoclonal de ratinho pode ser apresentado em combinação com uma biblioteca de cadeias leves humanas e a biblioteca de Fab híbrida resultante pode então ser seleccionada com antigénio. 0 fragmento Fd de ratinho proporciona deste modo um molde para orientar a selecção. Subsequentemente, as cadeias leves humanas seleccionadas são combinadas com uma biblioteca de fragmentos Fb humanos. A selecção da biblioteca resultante produz Fab totalmente humano. 63 ΡΕ1572106

Foi descrita uma variedade de procedimentos para derivar anticorpos humanos a partir de bibliotecas de apresentação fágica (ver, por exemplo, Hoogenboom et ai., J. Mol. Biol. 227: 381, 1991; Marks et ai., J. Mol. Biol. 222: 581-597, 1991; Pat. U.S. Nos. 5565332 e 5573905;

Clackson, T. e Wells, J.A., TIBTECH 12: 173-184, 1994). Em particular, a selecção e evolução in vitro de anticorpos derivados de bibliotecas de apresentação fágica tornou-se uma ferramenta poderosa (ver Burton, D.R. e Barbas III, C.F., Adv. Immunol. 57: 191-280, 1994; e, Winter, G., et ai., Annu. Rev. Immunol. 12: 433-455, 1994; pedido de patente U.S. N°. 20020004215 e W0 92/01047; pedido de patente U.S. N°. 20030190317 publicado a 9 de Outubro de 2003 e Patente U.S. N°. 6054287; Patente U.S. N°. 5877293.

Watkins, "Screening of Phage-Expressed Antibody Libraries by Capture Lift," Methods in Molecular Biology, Antibody Phage Display: Methods and Protocols 178: 187-193, e pedido de patente U.S. N°. 200120030044772 publicado a 6 de Março de 2003 descreve métodos para pesquisa de bibliotecas de anticorpos expressas em fagos ou outras moléculas de ligação através de levantamento por captura, um método envolvendo a imobilização das moléculas de ligação candidatas num suporte sólido.

Os produtos de anticorpo podem ser pesquisados quanto à actividade como antagonista de M-CSF e quanto à adequação nos métodos de tratamento do invento utilizando 64 ΡΕ1572106 ensaios tal como descrito na secção intitulada "Métodos de Pesquisa" aqui ou utilizando quaisquer ensaios adequados conhecidos na técnica.

Muteínas de M-CSF "Fragmento" tal como aqui se utiliza significa uma porção da molécula nativa intacta, por exemplo, um fragmento polipeptídico é um fragmento do polipéptido nativo em que um ou mais aminoácidos do terminal N ou do terminal C foram suprimidos. "Muteina" tal como aqui se utiliza em relação a polipéptidos significa uma variante da molécula nativa intacta ou uma variante de um fragmento da molécula nativa, em que um ou mais aminoácidos foram substituídos, inseridos ou suprimidos. Tais substituições, inserções ou deleções podem ser no terminal N, terminal C ou internas à molécula. Assim o termo "muteínas" inclui dentro do seu âmbito fragmentos da molécula nativa. As muteínas de inserção incluem fusões no terminal N ou C, e.g., fusão com a porção Fc de uma imunoglobulina para aumentar a semi-vida.

As muteínas preferidas exibem pelo menos cerca de 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou mais identidade de sequência (homologia) com o polipéptido nativo, conforme determinado através do algoritmo de pesquisa de homologia de Smith-Waterman (Meth. Mol. Biol. 70: 173-187, 1997) tal como implementado no programa MSPRCH (Oxford Molecular) 65 ΡΕ1572106 utilizando uma pesquisa de intervalos afins com os seguintes parâmetros de pesquisa: penalidade de intervalo aberto de 12 e penalidade de prolongamento de intervalo de 1. Outros programas de algoritmo de varrimento de homologia/identidade bem conhecidos e rotineiramente utilizados incluem Pearson e Lipman, PNAS USA 85: 2444-2448, 1988; Lipman e Pearson, Science 222: 1435, 1985; Devereaux et al., Nuc. Acids Res. 12: 387-395, 1984; ou os algoritmos BLASTP, BLASTN ou BLASTX de Altschul, et al., Mol. Biol. 215: 403-410, 1990. Programas computorizados utilizando estes algoritmos estão também disponíveis e incluem, mas não se limitam a: GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA e TFASTA, que estão comercialmente disponíveis no pacote Genetics Computing Group (GCG), Versão 8, Madison Wis., USA; e CLUSTAL no programa PC/Gene de Intellegenetics, Mountain View Calif. De preferência, a percentagem de identidade de sequência é determinada através da utilização dos parâmetros por defeito determinados pelo programa. "Modificação" tal como aqui se utiliza significa qualquer modificação do polipéptido nativo, fragmento ou muteína, tal como glicosilação, fosforilação, conjugação com polímero (tal como com polietilenoglicol) ou outra adição de porções estranhas, desde que a actividade desejada (agonista ou antagonista) seja mantida. A Patente U.S. N°. 6025146, e Koths, Mol. Reprod. Dev. 46(1): 31-38, Jan. 1997, descrevem a cristalização de M-CSF sozinho e de M-CSF complexado com MCSF-R, e 66 ΡΕ1572106 caracterizam a estrutura tridimensional de M-CSF bem como dos residuos envolvidos na ligação ao receptor. A Patente U.S. N°. 6025146 descreve também métodos para selecção de substituições de aminoácidos candidatos em M-CSF, com base na informação estrutural. A FIG. 1 é um diagrama de topologia mostrando as ligações dissulfureto em M-CSF dimérico truncado; a FIG. 2 é um estereodiagrama do esqueleto C-alfa com cada décimo resíduo marcado e com o eixo de simetria não cristalográfico indicado por uma linha tracejada. A topologia global desta forma de M-CSF tal como mostrada na FIG. 1 é a de um feixe de quatro hélices alfa anti-paralelas, em que as hélices correm para cima-cima-baixo-baixo, ao contrário da conectividade mais vulgarmente observada de cima-baixo-cima-baixo da maioria dos feixes de quatro hélices. Uma ligação longa cruzada une a hélice A à hélice B e uma ligação semelhante é verificada entre as hélices C e D. Na forma dimérica ligada com dissulfureto, os feixes são ligados extremidade-a-extremidade, formando uma estrutura alongada extremamente plana (dimensões apropriadas 85x35x25). Existem três ligações dissulfureto intramoleculares em cada monómero (Cys7-Cys90, Cys48-Cysl39, Cysl02-Cysl46), todas as quais estão na extremidade distai da molécula. Uma ligação dissulfureto intercadeias (Cys31--Cys31) está localizada na interface do dímero com o eixo de simetria não cristalográfico de duas vezes a passar através dela tal como mostrado na FIG. 2. Experiências de mutação indicam que todos os resíduos de cisteína nesta forma de M-CSF podem ser necessários para uma actividade biológica completa. A estrutura aqui descrita sugere que o 67 ΡΕ1572106 seu papel é principalmente estrutural em vez de estar relacionado com o reconhecimento do receptor. A Patente U.S. N°. 6025146 proporciona a estrutura tridimensional do dimero a de M-CSF recombinante truncado tal como identificado através das posições dos carbonos alfa dos resíduos de aminoácidos na sequência.

Resíduos específicos das hélices A, C e D parecem estar envolvidos na especificidade da interacção de ligação ao receptor. Uma vez que M-CSFB tem ligações dissulfureto intracadeias envolvendo as cisternas 157 e/ou 159, a região C-terminal de M-CSF provavelmente prolonga-se da "parte de trás" da estrutura, proporcionando uma "amarra" de comprimento variável para as formas ligadas à membrana de M-CSF. Assim, a "parte da frente" da região de ligação ao receptor de M-CSF está no lado oposto das moléculas, consistindo em resíduos acessíveis ao solvente nas hélices A, C e D ou próximo destas, incluindo os resíduos de cerca de 6 a 26, 71 a 90, e 110 a 130, respectivamente, do M-CSF nativo. A alteração dos resíduos acessíveis ao solvente nestas regiões através de mutagénese dirigida ao local para aumentar ou diminuir as interacções das cadeias laterais com o receptor pode gerar agonistas ou antagonistas de M-CSF. Resíduos possuindo uma área de superfície acessível ao solvente de mais de cerca de 0,25 e de preferência mais de cerca de 0,4 são preferidos com base na normalização da área superficial do aminoácido acessível quando no tripéptido gly-x-gly (Kabsch, W. et ai., Biopolymers 22: 2577, 1983). De preferência, são escolhidos resíduos que 68 ΡΕ1572106 não interajam com outras partes da proteína tais como a interface do dímero para manter a orientação relativa dos monómeros e para evitar perturbar o processo de dobragem da proteína. Uma consideração opcional adicional é a selecção de resíduos não conservados entre o M-CSF humano e de ratinho, que não reconheçam o receptor de M-CSF humano. Os aminoácidos candidatos são de preferência seleccionados para substituição com aminoácidos não conservativos, para destruir pontes de hidrogénio e/ou interacções hidrófobas com resíduos de MCSF-R. Por exemplo, a mudança de uma ou mais histidinas para aminoácidos não dadores de hidrogénio de tamanho semelhante pode criar um M-CSF com capacidade de ligação ao receptor alterada. Aminoácidos preferidos para

substituição incluem mas não se limitam a: H15; Q7 9; R8 6; E115; E41; K93; D99; L55; S18; Q20; 175; V7 8; L85 ; D69; N70; H9; N63; e T34. Crê-se que os resíduos de M-CSF importantes na sinalização do receptor sejam compostos por regiões descontínuas de M-CSF. Para minimizar a probabilidade de formação de anticorpos para fármacos proteináceos baseados em M-CSF potencialmente administrados, é desejável manter os resíduos do M-CSF parental acessíveis ao solvente (para se assemelharem à molécula nativa) sempre que possível. A mutagénese dos aminoácidos H15 e H9 na região N-terminal/hélice A resultou em muteínas com actividade biológica significativamente mais baixa e actividade de ligação a MCSF-R significativamente mais baixa. Estes resultados indicaram que a actividade biológica reduzida 69 ΡΕ1572106 era devida a menor afinidade de ligação ao receptor; assim, estes aminoácidos histidina representam contactos que são importantes para a afinidade de ligação ao receptor de M-CSF e devem ser deixados inalterados se for desejada uma capacidade de ligação ao receptor completa. Residuos próximos acessiveis ao solvente tais como Y6 e S13 e outros podem também representar residuos de contacto com o receptor de M-CSF. Foi construido um duplo mutante de M-CSF (Q20A, V78K) para testar a importância dos residuos acessiveis ao solvente na porção central das hélices A e C. Esta dupla muteina tinha uma actividade biológica ligeiramente mais baixa (8-10 vezes) e correspondentemente uma actividade de ligação ao receptor mais baixa. Muta-génese dos residuos Q17, R21, E115 e E119 mudou as propriedades da cadeia lateral de aminoácidos acessiveis ao solvente nas áreas de interesse mas não afectou a actividade biológica especifica, sugerindo que estes residuos não necessitam ser alterados em muteinas desenhadas para terem actividade antagonista. São descritas muteinas de M-CSF nas quais residuos das hélices A e/ou C e/ou D envolvidos na ligação ao receptor (por exemplo, aminoácidos 6 a 26, 71 a 90 e/ou 110 a 130) foram mutados de forma não conservativa. Tais muteinas mantêm de preferência pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85% ou 90% de semelhança (i.e., aminoácidos que são idênticos ou têm propriedades semelhantes) com a sequência nativa dentro das hélices A, C ou D, mas têm uma semelhança 70 ΡΕ1572106 mais elevada com a sequência nativa no restante do poli-péptido, e.g.f pelo menos 95%, 98% ou 99% de semelhança. Adicionalmente, resíduos que suportem a configuração tridimensional do local de ligação ao receptor podem ser mutados de forma não conservativa. A muteína de M-CSF pode ser uma forma monomérica de M-CSF. A forma dimérica de M-CSF é a forma biologicamente activa, e as formas monoméricas de M-CSF são geralmente não activas. As ligações dissulfureto dos monómeros parecem ocorrer através da ligação intercadeias Cys31-Cys31. Assim, está contemplado que as formas monoméricas de M-CSF possam ser adequadas para utilizar como antagonistas. Tais formas incluem muteínas compreendendo deleções de cisterna e/ou substituições de cisterna (e.g., substituições de cisterna para alanina) de Cys31 e/ou outras cisternas, ou muteínas nas quais a cisterna ou cisternas, particularmente Cys31, foram quimicamente modificadas para que não estejam disponíveis para ligações dissulfureto. A muteína de M-CSF compreende uma ou mais hélices A, C ou D, ou porções destas envolvidas em ligação ao receptor, sozinhas ou fundidas com outros polipéptidos que permitam a apresentação dos fragmentos na conformação tridimensional correcta.

Muteínas, contendo quaisquer muteínas conserva- 71 ΡΕ1572106 tivas e/ou não conservativas desejadas são facilmente preparadas utilizando técnicas bem conhecidas na técnica, incluindo produção recombinante ou sintese quimica. Não se espera que substituições conservativas, particularmente substituições fora das regiões directamente envolvidas na ligação ligando-receptor, alterem significativamente as propriedades de ligação das muteinas de M-CSF (ou muteinas de M-CSFR). Os aminoácidos podem ser classificados de acordo com propriedades físicas e a contribuição para a estrutura secundária e terciária da proteína. Uma substituição conservativa é reconhecida na técnica como uma substituição de um aminoácido por outro aminoácido que tenha propriedades semelhantes. Substituições conservativas exemplares são expostas na Tabela 2 (de WO 97/09433, página 10, publicado a 13 de Março de 1997; PCT/GB96/02197, apresentado a 9/6/96), imediatamente abaixo.

Tabela 2

Substituições Conservativas I CARACTERÍSTICA DA CADEIA LATERAL AMINOÁCIDO Alifática

G A P I L V C S T Μ N Q D E K R H F W Y Não polar Polar sem carga Polar com carga

Aromática

Outra

N Q D E 72 ΡΕ1572106

Alternativamente, os aminoácidos conservativos podem ser agrupados tal como descrito em Lehninger, (Biochemistry, Segunda Edição; Worth Publishers, Inc. NY: NY (1975), págs. 71-77) tal como exposto na Tabela 3, imediatamente abaixo.

Tabela 3

Substituições Conservativas II CARACTERÍSTICA DA CADEIA LATERAL AMINOÁCIDO Não polar (hidrófoba)

A. Alifática A L I V B. Aromática FW C. Contendo enxofre M D. Limiar G Polar sem carga A. Hidroxilo S T Y B. Amidas N Q C. Sulfodrilo C D. Limiar G Com Carga Positiva (Básica) K R H Com Carga Negativa (Ácida) D E

Ainda como outra alternativa, substituições conservativas exemplares são expostas na Tabela 4, imediatamente abaixo. ΡΕ1572106 73

Tabela 4

Substituições Conservativas III

Residuo Original Substituição Exemplar Ala (A) Vai, Leu, Ile Arg (R) Lys, Gin, Asn Asn (N) Gin, His, Lys, Arg Asp (D) Glu Cys (C) Ser Gin (Q) Asn Glu (E) Asp His (H) Asn, Gin, Lys, Arg Ile (D Leu, Vai, Met, Ala, Phe Leu (L) Ile, Vai, Met, Ala, Phe Lys (K) Arg, Gin, Asn Met (M) Leu, Phe, Ile Phe (F) Leu, Vai, Ile, Ala Pro (P) Gly Ser (S) Thr Thr (T) Ser Trp (W) Tyr Tyr (Y) Trp, Phe, Thr, Ser Vai (V) Ile, Leu, Met, Phe, Ala A disponibilidade : de uma sequência de ADN codificando M -CSF permite a utilização de vários sistemas de expressão para produzir os polipéptidos desejados. A construção de vectores de expressão e a produção recombinante a partir das sequências de ADN apropriadas são 74 ΡΕ1572106 efectuadas através de métodos bem conhecidos na técnica. Estas técnicas e várias outras técnicas são geralmente efectuadas de acordo com Sambrook et al., "Molecular Cloning-A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), e Kriegler, M., "Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual", Stockton Press, New York (1990).

Certas modificações à sequência primária de M-CSF podem ser feitas através de deleção, adição ou alteração dos aminoácidos codificados pela sequência de ADN sem destruição da estrutura desejada (e.g., a capacidade de ligação ao receptor de M-CSF) de acordo com técnicas de ADN recombinante bem conhecidas. Mais, um perito na técnica apreciará que aminoácidos individuais podem ser substituídos ou modificados através de oxidação, redução ou outra modificação e o polipéptido pode ser clivado para obter fragmentos que mantenham o local de ligação activo e a informação estrutural. Tais substituições e alterações resultam em polipéptidos possuindo uma sequência de aminoácidos que cai dentro da definição de polipéptido "possuindo substancialmente a mesma sequência de aminoácidos que os polipéptidos M-CSFa (SEQ ID N0:2), M-CSFB (SEQ ID N0:4) e M-CSFy (SEQ ID N0:6) maduros".

Os polipéptidos podem ser sintetizados utilizando técnicas de sintese peptidica em fase de solução ou fase sólida conhecidas na técnica. Na sintese em fase de solução, pode ser utilizada uma ampla variedade de métodos 75 ΡΕ1572106 de ligação e grupos protectores (ver Gross e Meienhofer, eds., "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology" Vol. 1-4 (Academic Press, 1979); Bodansky e Bodansky, "The Practice of Peptide Synthesis" 2a ed. (Springer Verlag, 1994)). Adicionalmente, purificação intermédia e aumento linear da escala são possíveis. Os peritos na técnica apreciarão que a síntese em solução requer a consideração dos grupos protectores da cadeia principal e da cadeia lateral e do método de activação bem como a selecção de segmentos para minimizar a racemização. A síntese peptídica de fase sólida pode ser geralmente efectuada de acordo com o método de Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc. 85: 2149, 1963, que envolve a montagem de uma cadeia peptídica linear num suporte de resina utilizando aminoácidos protegidos. A síntese peptídica em fase sólida utiliza tipicamente a estratégia Boc ou Fmoc. A estratégia Boc utiliza uma resina de poliestireno reticulada a 1%. 0 grupo protector padrão para as funções α-amino é o grupo terc-butiloxicarbonilo (Boc). Este grupo pode ser removido com soluções diluídas de ácidos fortes tais como ácido trifluoroacético (TFA) a 25%. 0 Boc-aminoácido seguinte é tipicamente ligado à aminoacil-resina utilizando diciclo-hexilcarbodiimida (DCC). Após terminar a montagem, a péptido-resina é tratada com HF anidrido para clivar a ligação éster benzílico e libertar o péptido livre. Os grupos funcionais da cadeia lateral são habitualmente bloqueados durante a síntese através de grupos de bloqueio derivados de benzilo, que são também 76 ΡΕ1572106 clivados por HF. 0 péptido livre é então extraído da resina com um solvente adequado, purificado e caracterizado. Os péptidos recentemente sintetizados podem ser purificados, por exemplo, através de filtração em gel, HPLC, cromato-grafia de partição e/ou cromatografia de permuta iónica, e podem ser caracterizados através, por exemplo, de espectro-metria de massa ou análise da sequência de aminoácidos. Na estratégia Boc, péptidos com o terminal C amidado podem ser obtidos utilizando resinas de benzidrilamina ou metilbenzi-drilamina, que produzem amidas peptídicas directamente após clivagem com HF. Uma abordagem alternativa utilizando 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) utiliza diferentes reagentes que permitem que os grupos protectores da cadeia lateral e a ligação péptido-resina sejam completamente estáveis às aminas secundárias utilizadas para clivar o grupo Ν-α-Fmoc. A protecção da cadeia lateral e a ligação péptido-resina são clivadas através de acidólise suave. 0 contacto repetido com uma base torna a resina de Merrifield inadequada para química Fmoc, e são geralmente utilizados ésteres p-alcoxibenzílicos ligados à resina. A desprotecção e clivagem são geralmente alcançadas utilizando TFA. A acetilação do terminal N pode ser alcançada fazendo reagir o péptido final com anidrido acético antes da clivagem da resina. A amidação de C é alcançada utilizando uma resina apropriada tal como resina de metilbenzidrilamina utilizando a tecnologia Boc.

Em geral, modificações dos genes codificando o polipéptido M-CSF são facilmente alcançadas através de uma 77 ΡΕ1572106 variedade de técnicas bem conhecidas, tais como mutagénese dirigida ao local (ver, Gillman e Smith, Gene 8: 81-97, 1979 e Roberts, S. et al., Nature 328: 731-734, 1987 e Pat. U.S. N°. 5032676). A maioria das modificações é avaliada através de pesquisa num ensaio adequado para a caracterís-tica desejada. Por exemplo, uma alteração no carácter de ligação ao receptor de M-CSF do polipéptido pode ser detectada através de ensaios competitivos com polipéptidos de referência apropriados ou através de bioensaios descritos em Pat. U.S. N°. 4847201.

As variantes de inserção do presente invento são aquelas nas quais um ou mais resíduos de aminoácidos são introduzidos num local predeterminado no M-CSF. Por exemplo, variantes de inserção podem ser fusões de proteínas ou polipéptidos heterólogos com o terminal amino ou carboxilo das subunidades. As variantes de substituição são aquelas em que pelo menos um resíduo foi removido e um resíduo diferente inserido no seu lugar. Aminoácidos não naturais (i.e., aminoácidos normalmente não verificados em proteínas nativas), bem como análogos isostéricos (aminoácidos ou outros) são também adequados para utilizar neste invento. Exemplos de substituições adequadas são bem conhecidos na técnica, tais como, por exemplo, Glu->Asp, Ser->Cys e Cys->Ser, His->alanina. Outra classe de variantes é a das variantes de deleção, que são caracte-rizadas pela remoção de um ou mais resíduos de aminoácidos do M-CSF. 78 ΡΕ1572106

Outras variantes do presente invento podem ser produzidas através da modificação quimica dos aminoácidos da proteína nativa (e.g., tratamento com dietilpirocarbona-to que modifica resíduos de histidina). Preferidas são modificações químicas que sejam específicas para certas cadeias laterais de aminoácidos. A especificidade pode também ser alcançada através do bloqueio de outras cadeias laterais com anticorpos dirigidos às cadeias laterais a proteger. A modificação química inclui reacções tais como oxidação, redução, amidação, desamidação ou substituição de grupos volumosos tais como polissacáridos ou polietileno-glicol (ver e.g., Pat. U.S. N°. 4179337 e WO 91/21029).

Modificações exemplares incluem a modificação de resíduos lisinil e amino-terminais através de reacção com ácido succínico ou outros anidridos de ácido carboxílico. A modificação com estes agentes tem o efeito de reverter a carga dos resíduos lisinil. Outros reagentes adequados para modificação de resíduos contendo amino incluem imidoésteres tais como metilpicolinimidato; fosfato de piridoxal; cloroboroidrato de piridoxal; ácido trinitrobenzenos-sulfónico; O-metilisoureia, 2,4-pentanodiona; e reacção catalisada com transaminase com glioxilato, e ésteres N-hidroxisuccinamida de polietilenoglicol ou outras substituições volumosas.

Os resíduos arginil podem ser modificados através de reacção com vários reagentes, incluindo fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclo-hexanodiona e ninidrina. A 79 ΡΕ1572106 modificação de resíduos de arginina requer que a reacção seja efectuada em condições alcalinas devido ao elevado pKa do grupo funcional guanidina. Para além disso, estes reagentes podem reagir com os grupos de lisina bem como o grupo épsilon-amino da arginina.

Os resíduos tirosil podem também ser modificados com particular interesse na introdução de marcadores espectrais em resíduos tirosil através de reacção com compostos diazónio aromáticos ou é utilizado tetranitro-metano para formar espécies O-acetiltirosil e derivados 3-nitro, respectivamente. Os resíduos tirosil podem também ser iodados utilizando 125I ou 131I para preparar proteínas marcadas para utilização em radioimunoensaio.

Os grupos carboxilo laterais (aspartilo ou glutamilo) podem ser selectivamente modificados através de reacção com carbodiimidas (R-N=C=N-Ri) , onde R e Ri são grupos alquilo diferentes, tais como l-ciclo-hexil-3-(2-morfolinil-4-etil)carbodiimida ou l-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)carbodiimida. Para além disso, os resíduos aspartil e glutamil são convertidos em resíduos asparaginil e glutaminil através de reacção com iões amónio.

Inversamente, os resíduos glutaminil e asparaginil podem ser desamidados nos resíduos glutamil e aspartil correspondentes, respectivamente, sob condições suavemente ácidas. Qualquer forma destes resíduos cai dentro do âmbito deste invento. 80 ΡΕ1572106

Outras modificações incluem hidroxilação de prolina e lisina, fosforilação dos grupos hidroxilo de residuos seril ou treonil, metilação dos grupos α-amino das cadeias laterais de lisina, arginina e histidina (T.E. Creighton, "Proteins: Structure and Molecular Properties", W.H. Freeman & Co., San Francisco, págs. 79-86 (1983)), acetilação da amina N-terminal e amidação do grupo carboxilo C-terminal. Vários métodos podem ser utilizados para determinar a semelhança das muteinas de M-CSF com a proteina M-CSF nativa. Por exemplo, a percentagem de homologia é calculada como a percentagem de residuos de aminoácidos na menor das duas sequências que alinham com um resíduo de aminoácido idêntico na sequência a comparar, quando podem ser introduzidos quatro intervalos numa extensão de 100 aminoácidos para maximizar o alinhamento (Dayhoff, em "Atlas of Protein Sequence and Structure", Vol. 5, pág. 124, National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C. (1972)). O alinhamento das sequências de polipéptidos para fins de comparação de sequências pode também ser feito utilizando uma variedade de servidores de alinhamento múltiplo, a maioria dos quais está actualmente disponível na Internet, e.g., Clustal W, MAP, ΡΙΜΑ, Block Maker, MSA, MEME e Match-Box. De preferência é empregue Clustal W (Higgins et al., Gene 73: 237- 244, 1988; Higgins et al., Meth. Enzymol. 266: 383-402, 1996) para alinhamento de sequências de polipéptidos (e também polinucleótidos). 81 ΡΕ1572106

Semelhantemente, o programa BLASTP compara uma sequência de aminoácidos de consulta contra uma base de dados de proteínas, e TBLASTN compara uma sequência proteica de consulta contra uma base de dados de sequências nucleo-tídicas dinamicamente traduzidas em todos os seis enquadramentos de leitura (ambas as cadeias), e podem ser empregues no invento. As determinações de se duas sequências de aminoácidos são substancialmente homólogas (i.e., semelhantes ou idênticas) podem também ser baseadas em pesquisas FASTA de acordo com Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 2444-2448, 1988.

Em particular, os métodos preferidos para determinar a identidade e/ou semelhança são desenhados para dar a maior coincidência entre as sequências testadas. Os métodos para determinar a identidade e semelhança são codificados em programas de computador publicamente disponíveis (e.g., tais como os anteriormente descritos). Métodos de programas de computador preferidos para determinar a identidade e semelhança entre duas sequências incluem, mas não se limitam ao pacote de programas GCG, incluindo GAP (Devereux et al., Nucleic Acids Research 12(1): 387, 1984; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI), BLASTP, BLASTN, e FASTA (Altschul et al., J. Molec. Biol. 215: 403-410, 1990). O programa BLAST X está publicamente disponível em National Center for Biotechnology Information (NCBI) e outras fontes (Altschul et al., BLAST Manual, NCB NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990). O 82 ΡΕ1572106 algoritmo bem conhecido de Smith Waterman pode também ser utilizado para determinar identidade. Na comparação de sequências polinucleotídicas utilizando o programa GAP, são preferidos os seguintes parâmetros por defeito: matriz de comparação: coincidência = +10, não coincidência = 0, com uma penalidade de intervalo de 50 e uma penalidade de comprimento do intervalo de 3 (Needleman et al., J. Mol Biol. 48: 443-453, 1970). O parentesco das proteínas pode também ser caracterizado através do parentesco dos seus ácidos nucleicos codificadores. Os métodos para determinar a identidade e/ou semelhança de sequências polinucleotídicas são descritos acima. Adicionalmente, os métodos para determinar a semelhança de sequências polinucleotídicas através do teste da sua capacidade para hibridarem sob condições moderadamente ou altamente rigorosas podem ser determinados como se segue. Condições de hibridação moderadamente rigorosas exemplares são como se seguem: hibridação a 42°C numa solução de hibridação compreendendo formamida a 50%, SDS a 1%, NaCl 1 M, sulfato de Dextrano a 10% e lavagem duas vezes durante 30 minutos a 60°C numa solução de lavagem compreendendo SSC 0,1χ e SDS a 1%. Condições altamente rigorosas incluem lavagens a 68°C numa solução de lavagem compreendendo SSC 0,1* e SDS a 1%. É entendido na técnica que condições de rigor equivalente podem ser alcançadas através de variação da temperatura e do tampão ou da concentração salina tal como descrito na técnica (Ausubel, et al., (Eds.), "Protocols in Molecular 83 ΡΕ1572106

Biology", John Wiley & Sons (1994), págs. 6.0.3 a 6.4.10). As modificações nas condições de hibridação podem ser determinadas empiricamente ou calculadas com precisão com base no comprimento e na percentagem de emparelhamentos de bases guanosina/citosina (GC) da sonda. As condições de hibridação podem ser calculadas tal como descrito em Sambrook et al., (Eds.), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York (1989) págs. 9.47 a 9. 51.

Fragmentos exemplares de M-CSFR de acordo com o invento podem compreender um ou mais, ou dois ou mais, dos dominios envolvidos na ligação M-CSF/receptor (que se crê serem os dominios 1, 2 e 3). Os fragmentos preferidos de M-CSFR compreendem todos os três dominios 1, 2 e 3 de M-CSFR. Mutações e/ou modificações adicionais a tais fragmentos ou no domínio extracelular inteiro de M-CSFR estão contempladas e podem ser produzidas tal como descrito acima na secção muteínas de M-CSF.

Anticorpos de M-CSFR O invento proporciona também anticorpos de M-CSFR que podem ser utilizados como antagonistas de MCSF de acordo com os métodos do invento. M-CSFR (SEQ ID NO:8) é uma molécula que abrange a membrana com cinco domínios extracelulares semelhantes a imunoglobulina (dos quais se crê que os domínios 1-3 84 ΡΕ1572106 estejam envolvidos na ligação ligando-receptor), um domínio transmembranar e um domínio tirosina-cinase intracelular relacionado com Src interrompido. Com referência a SEQ ID NO:8, os domínios acima mencionados estão localizados como se segue: domínio 1 de Ig: aminoácidos 27-102; domínio 2 de Ig: aminoácidos 112-196; domínio 3 de Ig: aminoácidos 215-285; domínio 4 de Ig: aminoácidos 308-399; domínio 5 de Ig: aminoácidos 410-492; domínio transmembranar: aminoácidos 515-537; e domínio cinase: aminoácidos 582-910. Um domínio semelhante a imunoglobulina "típico" contém uma estrutura de volta habitualmente ancorada por uma ligação dissulfureto entre duas cisteínas na extremidade de cada volta. Em M-CSF-R, estas cisteínas formando as voltas semelhantes a Ig estão nas seguintes posições de aminoácidos: Domínio 1: 42,84; Domínio 2: 127,177; Domínio 3: 224, 278; Domínio 4: sem cisteínas envolvidas; Domínio 5: 419, 485. A porção intracelular intacta de M-CSFR ou qualquer fragmento desta que mantenha a antigenicidade, por exemplo, uma ou mais das voltas semelhantes a Ig, pode ser utilizada para criar anticorpos que se ligariam ao receptor nativo. Podem ser preparados anticorpos policlonais, monoclonais, quiméricos, com CDRs enxertadas, humanizados, completamente humanos e fragmentos de ligação ao antigénio destes tal como descrito acima para anticorpos para M-CSF. Os produtos de anticorpo podem ser pesquisados quanto à actividade como antagonistas de MCSF e quanto à adequação aos métodos de tratamento do invento utilizando ensaios tal 85 ΡΕ1572106 como descritos na secção aqui intitulada "Métodos de Pesquisa" ou utilizando quaisquer ensaios adequados conhecidos na técnica. M-CSFR Solúvel A função biológica de M-CSF in vivo ocorre através da ligação e activação do receptor de M-CSF, também referido como o produto do gene c-fms. 0 receptor de M-CSF solúvel humano recombinante (rhsM-CSFR) , representando os aminoácidos 20 a 511 de SEQ ID NO:8 (Coussens, L. et al., Nature 320: 277, 1986) foi utilizado como reagente de ensaio in vitro para testar a capacidade de ligação ao receptor das proteínas M-CSF. Para gerar uma forma solúvel do receptor transmembranar, apenas o domínio extracelular do receptor de M-CSF humano foi expresso num sistema de expressão recombinante de baculovírus/células de insecto. Para purificar o receptor solúvel sem afectar adversamente a estrutura terciária ou quaternária, foram escolhidos métodos cromatográficos não desnaturantes, tal como descrito abaixo. Existem outras escolhas para a purificação do receptor recombinante. Cromatografia de afinidade pode ser empregue quando está disponível um anticorpo adequado ou um ligando para o receptor. Alternativamente, podem ser adicionadas "etiquetas" ao terminal C do receptor recombinante, i.e., a sequência de reconhecimento do anticorpo KT3, e purificado através de uma coluna de anticorpo anti-etiqueta, i.e., KT3, para utilizar em cromatografia de afinidade. Em sistemas de expressão nos 86 ΡΕ1572106 quais o rhsM-CSFR é glicosilado, pode ser utilizada cromatografia de lectina para enriquecer glicoproteinas especificas.

Uma ou mais das voltas semelhantes a Ig acima mencionadas dentro do dominio extracelular do receptor podem ser suficientes para inibir a interacção entre M-CSF e M-CSFR. Assim, fragmentos do dominio extracelular de M-CSFR e muteinas deste podem ser facilmente preparados utilizando meios sintéticos recombinantes ou quimicos bem conhecidos na técnica. Os produtos podem ser pesquisados quanto à actividade como antagonistas de MCSF e quanto à adequação nos métodos de tratamento do invento utilizando ensaios tais como os aqui descritos na secção intitulada "Métodos de Pesquisa" ou utilizando quaisquer ensaios adequados conhecidos na técnica.

Terapia Génica A distribuição de uma proteína terapêutica a células apropriadas pode ser efectuada através de terapia génica ex vivo, in situ ou in vivo através da utilização de qualquer abordagem adequada conhecida na técnica, incluindo através da utilização de métodos de transferência de ADN (e.g., lipossomas ou tratamentos químicos) ou através da utilização de vectores virais (e.g., adenovírus, vírus adeno-associados ou um retrovírus). Por exemplo, para terapia in vivo, um ácido nucleico codificando a proteína desejada, sozinho ou em conjunto com um vector, lipossoma, 87 ΡΕ1572106 ou precipitado pode ser injectado directamente no sujeito, e, nalgumas concretizações, pode ser injectado no local onde é desejada a expressão do composto proteico. Para tratamento ex vivo, as células do sujeito são removidas, o ácido nucleico é introduzido nessas células e as células modificadas são devolvidas ao sujeito directamente ou, por exemplo, encapsuladas dentro de membranas porosas que são implantadas no paciente. Ver, e.g., Pat. U.S. Nos. 4892538 e 5283187. Existe uma variedade de técnicas disponíveis para introdução de ácidos nucleicos em células viáveis. As técnicas variam dependendo de se o ácido nucleico é transferido para células cultivadas in vitro ou in vivo nas células do hospedeiro pretendido. Técnicas adequadas para a transferência de ácido nucleico para células de mamífero in vitro incluem a utilização de lipossomas, electroporação, microinjecção, fusão celular, DEAE-dextrano, e precipitação com fosfato de cálcio. Um vector vulgarmente utilizado para distribuição ex vivo de um ácido nucleico é um retrovírus.

Outras técnicas de transferência de ácido nucleico in vivo incluem transfecção com vectores virais (tais como adenovírus, vírus Herpes simplex I, ou vírus adeno-associado) e sistemas baseados em lípidos. 0 ácido nucleico e o agente de transfecção são opcionalmente associados a uma micropartícula. Agentes de transfecção exemplares incluem co-precipitação com fosfato de cálcio ou cloreto de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrano, DOTMA anfipático de amónio quaternário (brometo de (dioleoiloxipropil)trimetilamónio, comercializado como 88 ΡΕ1572106

Lipofectin por GIBCO-BRL) (Felgner et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84: 7413-7417, 1987; Malone et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 6077-6081, 1989); diésteres de glutamato lipófilos com cabeças de trimetilamónio pendentes (Ito et al. Biochem. Biophys. Acta 1023: 124-132, 1990); os lípidos parentais metabolizáveis tais como o lípido catiónico dioctadecilamido glicilspermina (DOGS, Transfectam, Prome-ga) e dipalmitoilfosfatidiletanolamilspermina (DPPES) (J.P. Behr, Tetrahedron Lett. 27: 5861-5864, 1986; J.P. Behr et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 6982-6986, 1989); sais de amónio quaternários metabolizáveis (DOTB, N-(1-[2,3-di-oleoiloxi]propil)-N,N,N-trimetilamónio-metilsulfato (DOTAP) (Boehringer Mannheim), polietilenoimina (PEI), ésteres de dioleoilo, ChoTB, ChoSC, DOSC) (Leventis et al. Biochim. Inter. 22: 235-241, 1990); 3β-[N-(N',N'-dimetilaminoetano)-carbamoil]colesterol (DC-Chol), dioleoilfosfatidiletanol-amina (DOPE)/3 β —[N-(Ν',N'-dimetilaminoetano)-carbamoil]colesterol DC-Chol em misturas de um para um (Gao et al., Biochim. Biophis. Acta 1065: 8-14, 1991), espermina, espermidina, lipopoliaminas (Behr et al., Bioconjugate Chem. 5: 382-389, 1994), polilisinas lipófilas (LPLL) (Zhou et al., Biochim. Biophis. Acta 939: 8-18, 1991), hidróxido de [[(1,1,3,3-tetrametilbutil)cre-soxi]etoxi]etil]dimetil-benzilamónio (hidróxido de DEBDA) com excesso de fosfati-dilcolina/colesterol (Bailas et al., Biochim. Biophis. Acta 939: 8-18, 1988), misturas de brometo de cetiltrimetil-amónio (CTAB)/DOPE (Pinnaduwage et al. Biochim. Biophis. Acta 985: 33-37, 1989), diéster lipófilo de ácido glutâmico (TMAG) com DOPE, CTAB, DEBDA, brometo de didodecilamónio 89 ΡΕ1572106 (DDAB), e estearilamina misturada com fosfatidiletanolamina (Rose et al., Biotechnique 10: 520-525, 1991), DDAB/DOPE (TransfectACE, GIBCO BRL), e lípidos possuindo oligogalac-tose. Agentes estimuladores de transfecção exemplares que aumentem a eficiência da transferência incluem, por exemplo, DEAE-dextrano, polibreno, péptido destruidor de lisossomas (Ohmori, N.I. et al., Biochem. Biophis. Res. Commun. 235(3): 726-9, 27 de Jun. 1997), proteoglicanos baseados em condroitano, proteoglicanos sulfatados, poli-etilenimina, polilisina (Pollard, H. et al., J. Blol. Chem. 273(13): 7507-11, 1998), péptido de ligação a integrina CIGGRGDTP, nonassacárido de dextrano linear, glicerol, grupos colesterilo ligados na ligação internucleosidica 3'-terminal de um oligonucleótido (Letsinger, R.L., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86(17): 6553-6, 1989), lisofosfatideo, lisofosfatidileolina, lisofosfatidiletanolamina, e 1-oleoilisofosfatidilcolina.

Nalgumas situações pode ser desejável distribuir o ácido nucleico com um agente que dirija o vector contendo o ácido nucleico para células alvo. Tais moléculas "direccionadoras" incluem anticorpos específicos para uma proteina membranar da superfície celular na célula alvo, ou um ligando para um receptor na célula alvo. Quando são empregues lipossomas, proteínas que se liguem a uma proteina membranar da superfície celular associada a endocitose podem ser utilizadas para direccionamento e/ou para facilitar a tomada. Exemplos de tais proteínas incluem proteínas da cápside e fragmentos destas trópicos para um 90 ΡΕ1572106 determinado tipo celular, anticorpos para proteínas que sofrem internalização em ciclo e proteínas que se dirigem a uma localização intracelular e aumentam a semi-vida intracelular. Noutras concretizações, pode ser utilizada endocitose mediada por receptores. Tais métodos são descritos, por exemplo, em Wu et al., 1987 ou Wagner et al., 1990. Para uma revisão dos protocolos de marcação de genes e terapia génica actualmente conhecidos, ver Anderson 1992. Ver também WO 93/25673 e as referências ai citadas. Para revisões adicionais da tecnologia de terapia génica, ver Friedmann, Science 244: 1275-1281, 1989; Anderson, Nature, suplemento ao vol. 392, N°. 6679, págs. 25-30 (1998); Verma, Scientific American 68-84, 1990; e Miller, Nature 357: 455-460, 1992).

Anti-sentido

Compostos anti-sentido e métodos da sua utilização são também proporcionados pelo presente invento. O nivel de actividade de M-CSF ou M-CSFR pode ser reduzido através da utilização de métodos bem conhecidos anti-sentido, de "knock-out" de genes, ribozimas e/ou hélice tripla para diminuir o nivel de expressão génica. As técnicas para a produção e utilização de tais moléculas são bem conhecidas dos peritos na técnica.

Os compostos anti-sentido podem bloquear a tradução do ARNm através de hibridação com o ARNm alvo e impedindo a tradução da proteína e incluem oligonucleótidos 91 ΡΕ1572106 complementares ao ARNm do gene alvo. 0 direccionamento pode ser para a região de codificação ou de preferência para a região ou regiões transcritas, não traduzidas. Não é necessária complementaridade absoluta, apenas complementaridade suficiente para ser capaz de hibridar com o ARN ou ADN endógeno e formar um duplex ou triplex estável. A capacidade para hibridar depende tanto do grau de complementaridade como do comprimento do ácido nucleico anti-sentido. A complementaridade dos oligonucleótidos com regiões não codificadoras do gene de interesse pode também ser utilizada numa abordagem anti-sentido para inibir a tradução do ARNm endógeno. Os ácidos nucleicos anti-sentido são de preferência oligonucleótidos que variam de 6 a cerca de 50 nucleótidos de comprimento. Em aspectos específicos, o oligonucleótido tem pelo menos 10 nucleótidos, pelo menos 17 nucleótidos ou pelo menos 20 nucleótidos. São primeiro efectuados estudos in vitro para quantificar a capacidade do oligonucleótido anti-sentido candidato para inibir a expressão do gene alvo. É preferido que estes estudos utilizem controlos que distingam entre inibição génica anti-sentido e efeitos biológicos não específicos dos oligonucleótidos. É também preferido que estes estudos comparem níveis do ARN ou da proteína alvo com os de um ARN ou uma proteína de controlo interno.

Os oligonucleótidos podem ser ADN ou ARN ou misturas quiméricas ou derivados ou versões modificadas destes e podem ser de cadeia simples ou de cadeia dupla 92 ΡΕ1572106 (e.g., ARNi). 0 oligonucleótido pode ser modificado na porção base, porção açúcar ou na estrutura de fosfato, por exemplo, para melhorar a estabilidade da molécula ou a hibridação. Ver, por exemplo, WO 03/088921; Dean, Curr. Opin. Biotechnol. 12(6): 622-5, 2001; Geary et ai., Curr.

Opin. Investig. Drugs. 2(4): 562-573, 2001. O oligonucleó tido pode ser conjugado com outras porções, incluindo péptidos (e.g., para alvejar células hospedeiras in vivo), ou agentes que facilitem o transporte através da membrana celular (ver, e.g., Letsinger, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 86: 6553-6556, 1989; Lemaitre, et ai., Proc.

Natl. Acad. Sei. U.S.A. 84: 648-652, 1987; Publicação PCT N°. W088/09810, publicada a 15 de Dez. de 1988) ou a barreira hemato-encefálica (ver, e.g., Publicação PCT N°. W089/10134, publicada a 25 de Abr. de 1988), agentes de clivagem desencadeados por hibridação (ver, e.g., Krol et al., BioTechniques 6: 958-976, 1988) ou agentes intercalantes (ver, e.g., Zon, Pharm. Res. 5: 539-549, 1988). O composto anti-sentido pode também ser um oligonucleótido alfa-anomérico que forme híbridos de cadeia dupla com ARN complementar que correm paralelos uns aos outros (Gautier, et al., Nucl. Acids Res. 15: 6625-6641, 1987). O oligonucleótido pode ser um 2' — () — metilribonucleótido (Inoue, et al., Nucl. Acids Res. 15: 6131-6148, 1987), ou um análogo de ARN-ADN quimérico (Inoue, et al., FEBS Lett. 215: 327-330, 1987).

As moléculas anti-sentido devem ser distribuídas a células que expressem o gene alvo in vivo. Vários métodos 93 ΡΕ1572106 foram desenvolvidos para distribuição de ADN ou ARN anti-sentido a células; e.g., moléculas anti-sentido podem ser injectadas directamente no local do tecido ou moléculas anti-sentido modificadas, desenhadas para alvejar as células desejadas (e.g., anti-sentido ligado a péptidos ou anticorpos que se ligam especificamente a receptores ou antigénios expressos à superfície da célula alvo) podem ser administradas sistemicamente. Numa abordagem, concentrações intracelulares do anti-sentido suficientes para suprimir a tradução de ARNms endógenos podem ser alcançadas com uma construção de ADN recombinante em que o oligonucleótido anti-sentido é colocado sob o controlo de um promotor forte. A utilização de uma tal construção para transfectar células alvo no paciente resultará na transcrição de quantidades suficientes de ARNs de cadeia simples que formarão pares de bases complementares com os transcritos do gene alvo endógeno e impedirão deste modo a tradução do ARNm do gene alvo. Por exemplo, um vector pode ser introduzido e.g., para que seja tomado por uma célula e dirija a transcrição de um ARN anti-sentido. Um tal vector pode permanecer epissómico ou tornar-se cromossomicamente integrado, desde que possa ser transcrito para produzir o ARN anti-sentido desejado.

Moléculas ribozimas desenhadas para clivar cataliticamente transcritos de ARNm do gene alvo podem também ser utilizadas para prevenir a tradução do ARNm do gene alvo e, deste modo, a expressão do produto do gene alvo. (Ver, e.g., Publicação Internacional PCT W090/11364, 94 ΡΕ1572106

publicada a 4 de Out. de 1990; Sarver, et al., Science 247: 1222-1225, 1990). As ribozimas são moléculas de ARN enzimáticas capazes de catalisar a clivagem especifica de ARN. (Para uma revisão, ver Rossi, Current Biology 4: 469-471, 1994). O mecanismo de acção das ribozimas envolve a hibridação especifica da sequência da molécula ribozima com ARN alvo complementar, seguida de um evento de clivagem endonucleolitica. A composição das moléculas ribozimas tem de incluir uma ou mais sequências complementares ao ARNm do gene alvo, de preferência num local próximo da extremidade 5' e tem de incluir a sequência catalitica bem conhecida responsável pela clivagem do ARNm. Para esta sequência, ver, e.g., Pat. U.S. N°. 5093246. Podem também ser utilizadas ribozimas cabeça-de-martelo, que clivam ARNms em localizações ditadas por regiões flanqueadoras especificas que formam pares de bases complementares com o ARNm alvo. A construção e produção de ribozimas cabeça-de-martelo são conhecidas na técnica e estão descritas mais completamente em Myers, 1995, "Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference", VCH Publishers, New York, (ver especialmente a FIG. 4, página 833) e em Haseloff e Gerlach, Nature 334: 585-591, 1988. Podem também ser utilizadas endorribonucleases de ARN (também conhecidas como "ribozimas de tipo Cech"). Tais ribozimas tais como a que ocorre naturalmente em Tetrahymena thermophila (conhecida como IVS, ou ARN de IVS L-19) foram descritas em Zaug, et al., Science 224: 574-578, 1984; Zaug e Cech, Science 231: 470-475, 1986; Zaug, et al., Nature 324: 429-433, 1986; pedido Internacional de patente publicado N°. WO 95 ΡΕ1572106 88/04300; e Been e Cech, Cell 47: 207-216, 1986. As ribozimas de tipo Cech têm um local activo de oito pares de bases que híbrida com uma sequência de ARN alvo. As ribozimas podem também ser compostas por oligonucleótidos modificados (e.g., para melhor estabilidade, direcciona-mento, etc.) e devem ser distribuídas a células que expressem o gene alvo in vivo. Como as ribozimas ao contrário das moléculas anti-sentido, são catalíticas, é necessária uma concentração intracelular mais baixa para serem eficientes. A expressão do gene alvo endógena pode também ser reduzida através de inactivação ou "knocking out” do gene alvo ou do seu promotor utilizando recombinação homóloga direccionada (e.g., ver Smithies, et al., Nature 317: 230-234, 1985; Thomas e Capecchi, Cell 51: 503-512, 1987; Thompson, et al., Cell 5: 313-321, 1989). Por exemplo, pode ser utilizado um gene alvo mutante, não funcional (ou uma sequência de ARN completamente não relacionada) flanqueado por ADN homólogo ao gene alvo endógeno (nas regiões de codificação ou regiões reguladoras do gene alvo), com ou sem um marcador seleccionável e/ou um marcador selec-cionável negativo, para transfectar células que expressem o gene alvo in vivo. A inserção da construção de ADN, através de recombinação homóloga direccionada, resulta em inactivação do gene alvo.

Alternativamente, a expressão do gene alvo endógena pode ser reduzida através de sequências desoxirri- 96 ΡΕ1572106 bonucleotídicas direccionadoras complementares à região reguladora do gene alvo (i.e., o promotor e/ou estimuladores do gene alvo) para formar estruturas de tripla hélice que impedem a transcrição do gene alvo em células alvo no corpo (ver geralmente, Helene, Anticancer Drug Des. 6(6): 569-584, 1991; Helene, et al., Ann. N.Y. Acad. Sei. 660: 27-36, 1992; e Maher, Bioassays 14(12): 807-815, 1992).

As moléculas de ácido nucleico a utilizar na formação de triplas hélices para a inibição da transcrição devem ser de cadeia simples e compostas de desoxinucleó-tidos. A composição de bases destes oligonucleótidos tem de ser desenhada para promover a formação da tripla hélice através das regras de emparelhamento de bases de Hoogsteen, que requerem geralmente que estejam presentes trechos mensuráveis de purinas ou pirimidinas numa cadeia de um duplex. As sequências nucleotídicas podem ser baseadas em pirimidina, o que resultará em tripletos TAT e CGC ao longo das três cadeias associadas da tripla hélice resultante. As moléculas ricas em pirimidina proporcionam complementaridade de bases com uma região rica em purinas de uma cadeia simples do duplex numa orientação paralela a essa cadeia. Adicionalmente, podem ser escolhidas moléculas de ácido nucleico que sejam ricas em purinas, por exemplo, contenham um trecho de residuos G. Essas moléculas formarão uma tripla hélice com um duplex de ADN que seja rico em pares GC, nos quais a maioria dos residuos de purina estejam localizados numa cadeia simples do duplex alvo, resultando em tripletos GGC ao longo das três cadeias do triplex. 97 ΡΕ1572106

Alternativamente, as potenciais sequências que podem ser alvejadas para formação da tripla hélice podem ser aumentadas através da criação de uma designada molécula de ácido nucleico de "comutação". As moléculas de comutação são sintetizadas de um modo alternado 5'-3', 3'-5', de modo a que emparelhem as bases com a primeira cadeia de um duplex e depois com a outra, eliminando a necessidade de estar presente um trecho mensurável de purinas ou pirimidinas numa cadeia de um duplex.

Se a terapia anti-sentido, com ribozimas ou de tripla hélice reduzir a expressão do gene alvo para niveis que sejam indesejavelmente baixos, pode ser administrada proteína de substituição. Alternativamente, para aumentar a expressão do gene pode ser realizada terapia génica utilizando ácidos nucleicos modificados que não contenham sequências susceptiveis a quaisquer tratamentos anti-sentido, com ribozimas ou de tripla hélice utilizados.

As moléculas de ARN e ADN anti-sentido, ribozimas e de tripla hélice do invento podem ser preparadas através de qualquer método conhecido na técnica para a síntese de moléculas de ADN e ARN. Estas incluem técnicas para sintetizar quimicamente oligodesoxirribonucleótidos e oligorribonucleótidos bem conhecidas na técnica tais como por exemplo síntese química de fosforamidite de fase sólida. Alternativamente, moléculas de ARN podem ser geradas através de transcrição in vitro e in vivo de sequências de ADN codificando a molécula de ARN terapêutica. 98 ΡΕ1572106 Métodos de síntese química incluem a utilização de um sintetizador de ADN automático comercialmente disponível; os oligonucleótidos fosforotioato podem ser sintetizados através do método de Stein, et al., Nucl. Acids Res. 16: 3209, 1988, e os oligonucleótidos de metilfosfonato podem ser preparados através da utilização de suportes de polímero de vidro de poro controlado (Sarin, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 85: 7448-7451, 1988). Péptidos e Moléculas Pequenas

Tal como aqui se utiliza, o termo "proteína" inclui proteínas, oligopéptidos, polipéptidos, péptidos e semelhantes. Adicionalmente, o termo proteína pode também referir-se a fragmentos, multímeros ou agregados de moléculas intactas e/ou fragmentos. As proteínas podem ser de ocorrência natural ou podem ser produzidas através de meios de ADN recombinante ou através de síntese química e/ou enzimática. Ver, e.g., Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor

Laboratories (3a ed. 2001) . O termo "péptidos" é utilizado para se referir a cadeias de aminoácidos relativamente curtas, de preferência entre 6 e 100 aminoácidos de comprimento.

Os péptidos podem ser pesquisados quanto à actividade de ligação desejada (e.g., ligação a M-CSF ou M- 99 ΡΕ1572106 CSFR) ou actividade biológica utilizando técnicas de apresentação fágica (ver, por exemplo, Scott et al., Science 249: 386, 1990; Devlin et al., Science 249: 404, 1990; Patente U.S. N°. 5223409, concedida a 29 de Junho de 1993; Patente U.S. N°. 5733731, concedida a 31 de Março de 1998; Patente U.S. N°. 5498530, concedida a 12 de Março de 1996; Patente U.S. N°. 5432018, concedida a 11 de Julho de 1995; Patente U.S. N°. 5338665, concedida a 16 de Agosto de 1994; Patente U.S. N°. 5922545, concedida a 13 de Julho de 1999; WO 96/40987, publicado a 19 de Dezembro de 1996; e WO 98/15833, publicado a 16 de Abril de 1998). Em tais bibliotecas, as sequências peptidicas são apresentadas através de fusão com proteínas de revestimento de fagos filamentosos. Tipicamente, os péptidos apresentados são eluidos por afinidade contra um dominio extracelular de um receptor imobilizado por um anticorpo. Os fagos retidos podem ser enriquecidos através de ciclos sucessivos de purificação por afinidade e re-propagação. Os péptidos que se ligam melhor podem ser sequenciados para identificar residuos chave dentro de uma ou mais familias de péptidos estruturalmente aparentadas.

Os péptidos podem também ser pesquisados utilizando outros métodos, tais como geração de bibliotecas de péptidos fundidos com o terminal carboxilo do repressor lac e expressos em E. coli ou apresentando péptidos na membrana externa de E. coli através de fusão com uma lipoproteina associada a peptidoglicanos (PAL). Noutro método, a tradução de ARN aleatório é parada antes da libertação do 100 ΡΕ1572106 ribossoma, resultando numa biblioteca de polipéptidos com o seu ARN associado ainda ligado. Outros métodos empregam ligação química de péptidos a ARN (ver, por exemplo, Roberts e Szostak, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94: 12297-303, 1997). Foram desenvolvidas bibliotecas de péptidos quimicamente derivadas nas quais os péptidos são imobilizados em materiais não biológicos estáveis, tais como varetas de polietileno ou resinas permeáveis a solventes. Outras bibliotecas peptídicas quimicamente derivadas utilizam fotolitografia para varrer péptidos imobilizados em lâminas de vidro. A pesquisa química de péptidos pode ser vantajosa por permitir a utilização de D-aminoácidos e outros análogos não naturais, bem como elementos não peptídicos. Os métodos biológicos e químicos são revistos em Wells e Lowman, Curr. Opin. Biotechnol. 3: 355-62, 1992.

Os péptidos podem ainda ser modificados através de mutagénese ao nível do ADN. Bibliotecas de mutagénese podem ser criadas e pesquisadas para optimizar mais a sequência dos melhores ligadores (Lowman, Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26: 401-24, 1997). A análise estrutural da interaeção proteína-proteína pode também ser utilizada para sugerir péptidos que imitem a actividade de ligação de grandes ligandos proteicos. Numa tal análise, a estrutura cristalina pode sugerir a identidade e orientação relativa dos resíduos críticos do ligando proteico grande, a partir da qual um péptido pode ser desenhado (ver, e.g., Takasaki et al., Nature Biotech 15: 1266-70, 1997). 101 ΡΕ1572106 Péptidos aleatórios ou péptidos derivados de CDRs de ligação ao antigénio podem ser fundidos de um modo linear ou como parte de uma estrutura tridimensional, e.g., um anticorpo ou porção deste tal como uma região constante, para criar novas macromoléculas que se liguem ao antigénio desejado. Podem ser incluídas múltiplas cópias do mesmo péptido ou de péptidos diferentes.

Tal como aqui se utiliza, o termo "peptidomi-mético" é um composto não peptídico que compreende uma montagem de cadeias laterais de aminoácidos, ou farmaco-fóros, ou derivados adequados destes, que são suportados numa estrutura de modo a que a orientação espacial dos farmacofóros imite substancialmente a conformação bioactiva de um péptido natural. Por exemplo, um peptidomimético pode não ter aminoácidos ou ligações peptídicas mas manter o arranjo tridimensional particular dos grupos da cadeia peptídica do péptido parental que é necessário para a actividade de ligação. A estrutura pode compreender um esqueleto de carbono bicíclico, tricíclico ou policíclico superior ou de heteroátomos ou pode basear-se numa ou mais estruturas em anel (e.g., piridina, indazole, etc.) ou ligações amida. Esta estrutura pode ser ligada por espaçadores a um grupo ácido (e.g., um grupo funcional ácido carboxilico) numa extremidade e um grupo básico (e.g., uma porção contendo N tal como amidina ou guanidina) na outra extremidade do núcleo. Técnicas exemplares para síntese de peptidomiméticos são descritas no pedido de 102 ΡΕ1572106 patente U.S. N°. 20030199531 publicado a 23 de Outubro de 2003, Pedido de Patente U.S. N°. 20030139348 publicado a 24 de Julho de 2003.

Para além de anticorpos e outras proteínas, este invento contempla também antagonistas de M-CSF alternativos incluindo, mas não limitado a, moléculas pequenas que são também eficazes no tratamento de metástase de cancro e/ou perda óssea associada a metástase de cancro. Tais moléculas pequenas podem ser identificadas através da avaliação da sua capacidade para se ligarem a M-CSF e/ou inibirem a interacção entre M-CSF e M-CSFR.

Os métodos para medição da ligação de M-CSF com moléculas pequenas estão prontamente disponíveis na técnica e incluem, por exemplo, ensaios de competição através dos quais a molécula pequena interfere com a interacção entre M-CSF e o seu receptor (M-CSFR) ou um anticorpo anti-M-CSF. Alternativamente, podem ser utilizados ensaios de ligação directa para medir a interacção de uma molécula pequena com M-CSF. Como exemplo, pode ser empregue um ensaio ELISA por meio do qual o M-CSF é adsorvido numa matriz insolúvel tal como uma placa de cultura de tecidos ou conta. Um M-CSFR marcado ou anticorpo anti-M-CSF é bloqueado a partir da ligação a M-CSF através de inclusão da molécula pequena de interesse. Alternativamente, a ligação de uma molécula pequena a M-CSF pode ser determinada através de um ensaio de separação de células activada com fluorescência (FACS). Através deste método, as células expressando M-CSF são 103 ΡΕ1572106

incubadas com um anticorpo anti-M-CSF etiquetado com fluorescência ou um anticorpo anti-M-CSF na presença de um anticorpo secundário etiquetado com fluorescência. A ligação de uma molécula pequena a M-CSF pode ser ensaiada através de uma diminuição dependente da dose na fluorescência ligada às células expressando M-CSF. Semelhantemente, a ligação directa de uma molécula pequena pode ser ensaiada através de marcação, e.g. radiomarcação ou etiquetagem fluorescente, da molécula pequena, incubando com M-CSF imobilizado ou células expressando M-CSF e ensaiando a radioactividade ou fluorescência da molécula pequena ligada. Métodos de Pesquisa

Produtos terapêuticos eficazes dependem da identificação de agentes eficazes desprovidos de toxicidade significativa. Compostos potencialmente úteis em prevenção ou tratamento de perda óssea associada a metástase de cancro podem ser pesquisados utilizando vários ensaios. Por exemplo, um antagonista candidato pode ser primeiro carac-terizado num sistema de células em cultura para determinar a sua capacidade para neutralizar M-CSF na indução de osteoclastogénese. Um tal sistema pode incluir a co-cultura de osteoblastos da abóbada craniana de ratinho e células do baço (Suda et al., "Modulation of osteoclast differen-tiation". Endocr. Rev. 13: 66-80, 1992; Martin e Udagawa, Trends Endocrinol. Metab. 9: 6-12, 1998), a co-cultura de linhas celulares de estroma de ratinho (e.g., MC3T3-G2/PA6 104 ΡΕ1572106 e ST2) e células do baço de ratinho (Udagawa et al., Endocrinology 125: 1805-13, 1989), e a co-cultura de células ST2 e células da medula óssea, células mononucleares do sangue periférico ou macrófagos alveolares (Udagawa et al. , Proc. Natl . Acad. Sei. USA 87: 7260-4, 1990; Sasaki et al., Câncer Res. 58 : 462-7, 1998; Mancino et al., J. Surg. Res. 10 0: 18-24, 2001). Na ausência de qualquer antagonista de M-CSF, as células multinucleadas formadas em tais co-culturas satisfazem os principais critérios dos osteoclastos tais como actividade de fosfatase ácida resistente a tartrato (TRAP, uma enzima marcadora dos osteoclastos), receptores de calcitonina, p60C-STC, receptores de vitronectina e a capacidade para formar cavidades de reabsorção no osso e fatias de dentina. A presença de um antagonista eficaz de M-CSF inibe a formação de tais células multinucleadas.

Para além dos sistemas de co-cultura de cima, a capacidade de um antagonista de M-CSF candidato para inibir a osteoclastogénese pode ser ensaiada num sistema livre de células do estroma ou livre de osteoblastos. O M-CSF necessário para osteoclastogénese pode ser proporcionado através de células de cancro metastáticas co-cultivadas (e.g., MDA 231) ou meio condicionado destas células de cancro (Mancino et al., J. Surg. Res. 0: 18-24, 2001) ou através da adição de M-CSF purificado. A eficácia de um dado antagonista de M-CSF na prevenção ou tratamento de perda óssea associada a 105 ΡΕ1572106 metástase de cancro pode também ser testada em qualquer um dos modelos animais de metástase óssea familiar dos peritos na técnica. Tais sistemas modelo incluem aqueles envolvendo injecção directa de células tumorais na cavidade medular dos ossos (Inqall, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 117: 819-22, 1964; Falasko, Clin. Orthop. 169: 20-7, 1982) na aorta abdominal do rato (Powles et al.r Br. J. Câncer 28: 316-21, 1973) , na veia da cauda lateral de ratinho ou no ventriculo esquerdo de ratinho (Auguello et al., Câncer Res. 48: 6876-81, 1988) . Na ausência de um antaqonista de M-CSF eficaz, as metástases ósseas osteoliticas formadas a partir de células tumorais injectadas podem ser determinadas através de radiografias (áreas de lesões ósseas osteoliticas) ou histoquimica (osso e tecidos moles). Sasaki et al., Câncer Res. 55: 3551-7, 1995; Yoneda et al., J. Clin. Invest. 99: 2509-17, 1997. Clohisy e Ramnaraine, Orthop Res. 16: 660-6, 1998; Yin et al., J. Clin. Invest. 103: 197-206, 1999. Na presença de um antagonista de M-CSF eficaz, as metástases ósseas osteoliticas podem ser prevenidas ou inibidas para resultar em menos e/ou menores metástases.

Os antagonistas de M-CSF do presente invento podem também ser úteis em prevenção ou tratamento de metástase de cancro. A eficácia de um antagonista de M-CSF candidato na prevenção ou no tratamento de metástase de cancro pode ser pesquisada utilizando um modelo de invasão da membrana basal amniónica humana tal como descrito em Filderman et al., Câncer Res. 52: 36616, 1992. Adicionalmente, pode também ser utilizado qualquer um dos 106 ΡΕ1572106 sistemas modelo animais para metástase de vários tipos de cancros. Tais sistemas modelo incluem, mas não se limitam a aos descritos em Wenger et al., Clin. Exp. Metastasis 19: 169-73, 2002; Yi et al., Câncer Res. 62: 917-23, 2002; Tsutsumi et al • r Câncer Lett. 169: 77-85, 2001; Tsingotjidou et al., Anticancer Res. 21: 971-8, 2001;

Wakabayashi et al., Oncology 59: 75-80, 2000; Culp e Kogerman, Front Biosci. 3: D672-83, 1998; Runge et al., Invest. Radiol. 32: 212-7; Shioda et al., J. Surg. Oncol. 64: 122-6, 1997; Ma et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sei. 37: 2293-301, 1996; Kuruppu et al., J. Gastroenterol. Hepatol. 11: 26-32, 1996. na presença de um antagonista de M-CSF eficaz, as metástases de cancro podem ser prevenidas ou inibidas para resultar em menos e/ou menores metástases. A identificação de antagonistas de M-CSF adicionais pode ser alcançada através da utilização de vários métodos conhecidos para identificação e obtenção de proteínas que interagem especificamente com outras proteínas ou polipéptidos, por exemplo, pode ser utilizado um sistema de pesquisa de dois híbridos de levedura tal como o descrito na Patente U.S. N°. 5283173 ou o equivalente. Numa concretização do presente invento, um ADNc codificando M-CSF, ou um fragmento deste, pode ser clonado num vector isco de dois híbridos e utilizado para pesquisar uma biblioteca alvo complementar quanto a uma proteína possuindo actividade de ligação a M-CSF. A actividade anti-tumoral de um determinado 107 ΡΕ1572106 antagonista de M-CSF ou combinação de antagonistas de M-CSF, pode ser avaliada in vivo utilizando um modelo animal adequado. Por exemplo, modelos de cancro de linfoma xeno-génico em que células de linfoma humano são introduzidas em animais imuno-comprometidos, tais como ratinhos nus ou SCID. A eficácia pode ser prevista utilizando ensaios que medem a inibição da formação de tumores, a regressão tumoral ou metástase, e semelhantes. A informação da sequência de aminoácidos proporcionada pelo presente invento torna também possivel a identificação de compostos parceiros de ligação com os quais os polipéptidos ou polinucleótidos de M-CSF ou M-CSFR interagirão. Métodos para identificar compostos parceiros de ligação incluem ensaios em solução, ensaios in vitro em que os polipéptidos M-CSF ou M-CSFR são imobilizados, e ensaios baseados em células. A identificação de compostos parceiros de ligação dos polipéptidos M-CSF ou M-CSFR proporciona candidatos para intervenção terapêutica ou profilática em patologias associadas a actividade biológica normal ou aberrante de M-CSF ou M-CSFR.

O invento inclui vários sistemas de ensaio para identificação de parceiros de ligação para polipéptidos M-CSF ou M-CSFR. Em ensaios em solução, os métodos do invento compreendem os passos de (a) contacto de polipéptidos M-CSF ou M-CSFR com um ou mais compostos parceiros de ligação candidatos e (b) identificação dos compostos que se ligam ao polipéptido ou polipéptidos M-CSF ou M-CSFR. A 108 ΡΕ1572106 identificação dos compostos que se ligam a polipéptidos M-CSF ou M-CSFR pode ser alcançada através de isolamento do complexo polipéptido M-CSF ou M-CSFR/parceiro de ligação, e separação do polipéptido M-CSF ou M-CSFR do composto parceiro de ligação. Está também compreendido noutra concretização do invento um passo adicional de caracterização das propriedades físicas, biológicas e/ou bioquímicas do composto parceiro de ligação. Num aspecto, o complexo polipéptido M-CSF ou M-CSFR/parceiro de ligação é isolado utilizando um anticorpo imunoespecífico para o polipéptido M-CSF ou M-CSFR ou o composto parceiro de ligação candidato.

Ainda noutras concretizações, o polipéptido M-CSF ou M-CSFR ou o composto parceiro de ligação candidato compreende um marcador ou uma etiqueta que facilita o seu isolamento, e métodos do invento para identificar compostos parceiros de ligação incluem um passo de isolamento do complexo polipéptido M-CSF ou M-CSFR/parceiro de ligação através de interacção com o marcador ou etiqueta. Uma etiqueta exemplar deste tipo é uma sequência de poli-histidina, geralmente à volta de seis resíduos de histidina, que permite o isolamento de um composto assim marcado utilizando quelação com níquel. Outros marcadores e etiquetas, tais como a etiqueta FLAG® (Eastman Kodak, Rochester, NY), bem conhecida e rotineiramente utilizada na técnica, estão englobados pelo invento.

Numa variação de um ensaio in vitro, o invento 109 ΡΕ1572106 proporciona um método compreendendo os passos de (a) contacto de um polipéptido M-CSF ou M-CSFR imobilizado com um composto parceiro de ligação candidato e (b) detecção da ligação do composto candidato ao polipéptido M-CSF ou M-CSFR. Numa concretização alternativa, o composto parceiro de ligação candidato é imobilizado e é detectada a ligação do polipéptido M-CSF ou M-CSFR. A imobilização é alcançada utilizando qualquer um dos métodos bem conhecidos na técnica, incluindo ligação covalente a um suporte, uma conta ou uma resina cromatográfica, bem como interacção não covalente, de elevada afinidade tal como uma ligação de anticorpo, ou utilização de ligação estreptavidina/biotina em que o composto imobilizado inclui uma porção biotina. A detecção da ligação pode ser alcançada (i) utilizando um marcador radioactivo no composto que não é imobilizado, (ii) utilizando de um marcador fluorescente no composto não imobilizado, (iii) utilizando um anticorpo imunoespecifico para o composto não imobilizado, (iv) utilizando um marcador no composto não imobilizado que excite um suporte fluorescente ao qual o composto imobilizado está ligado, bem como outras técnicas bem conhecidas e rotineiramente praticadas na técnica.

Agentes, e.g., anticorpos ou compostos quimicos orgânicos/inorgânicos que modulem (i.e., aumentem, diminuam ou bloqueiem) a actividade ou expressão de polipéptidos M-CSF ou M-CSFR podem ser identificados através de incubação de um putativo modulador com uma célula expressando um polipéptido ou polinucleótido de M-CSF ou M-CSFR e 110 ΡΕ1572106 determinando o efeito do putativo modulador na actividade ou expressão do polipéptido ou polinucleótido de M-CSF ou M-CSFR. A selectividade de um composto que module a actividade de um polipéptido ou polinucleótido de M-CSF ou M-CSFR pode ser avaliada através da comparação dos seus efeitos no polipéptido ou polinucleótido de M-CSF ou M-CSFR com o seu efeito noutros compostos relacionados. Moduladores selectivos podem incluir, por exemplo, anticorpos e outras proteínas, péptidos ou moléculas orgânicas que se liguem especificamente a polipéptidos M-CSF ou M-CSFR ou a um ácido nucleico codificando um polipéptido M-CSF ou M-CSFR. Moduladores da actividade dos polipéptidos M-CSF ou M-CSFR serão terapeuticamente úteis no tratamento de doenças e condições fisiológicas nas quais está envolvida actividade normal ou aberrante do polipéptido M-CSF ou M-CSFR. Métodos do invento para identificar moduladores incluem variações em qualquer um dos métodos descritos acima para identificar compostos parceiros de ligação, incluindo as variações técnicas em que um composto parceiro de ligação foi identificado e o ensaio de ligação é realizado na presença e ausência de um modulador candidato. É identificado um modulador nos casos onde a ligação entre polipéptidos M-CSF ou M-CSFR e o composto parceiro de ligação muda na presença do modulador candidato em comparação com a ligação na ausência do composto modulador candidato. Um modulador que aumente a ligação entre um polipéptido M-CSF ou M-CSFR e o composto parceiro de 111 ΡΕ1572106 ligação é descrito como um estimulador ou activador, e um modulador que diminua a ligação entre um polipéptido M-CSF ou M-CSFR e o composto parceiro de ligação é descrito como um inibidor. 0 invento compreende também ensaios de pesquisa de elevada tiragem (HTS) para identificar compostos que interajam ou inibam a actividade biológica (i.e., inibam a actividade enzimática, actividade de ligação, etc.) do polipéptido M-CSF ou M-CSFR. Os ensaios HTS permitem a pesquisa de um grande número de compostos de um modo eficiente. Sistemas HTS baseados em células estão contemplados para investigar a interacção entre polipéptidos M-CSF ou M-CSFR e seus parceiros de ligação. Os ensaios HTS são desenhados para identificar "acertos" ou "compostos guia" possuindo a propriedade desejada, a partir dos quais podem ser desenhadas modificações para melhorar a propriedades desejada. A modificação química do "acerto" ou "composto guia" é frequentemente baseada numa relação estrutura/acti-vidade identificável entre o "acerto" e os polipéptidos M-CSF ou M-CSFR.

Outro aspecto do presente invento dirige-se a métodos de identificação de compostos que se ligam ao polipéptido M-CSF ou M-CSFR ou a moléculas de ácido nucleico codificando polipéptidos M-CSF ou M-CSFR, compreendendo o contacto do polipéptido M-CSF ou M-CSFR, ou de uma molécula de ácido nucleico codificando o mesmo, com um composto e determinação de se o composto se liga ao polipé- 112 ΡΕ1572106 ptido M-CSF ou M-CSFR ou a uma molécula de ácido nucleico codificando o mesmo. A ligação pode ser determinada através de ensaios de ligação que são bem conhecidos dos peritos, incluindo, mas não se limitando a ensaios de transição em gel, Western blots, ensaio de competição radiomarcado, clonagem de expressão baseada em fagos, co-fraccionamento por cromatografia, co-precipitação, ligação cruzada, análise de interacção aprisionamento/dois híbridos, análise southwestern, ELISA e semelhantes, que são descritos, e.g., em "Current Protocols in Molecular Biology" (1999) John Wiley & Sons, NY. Os compostos a pesquisar (que podem incluir compostos que são suspeitos de se ligarem a um polipéptido M-CSF ou M-CSFR, ou uma molécula de ácido nucleico codificando o mesmo) incluem, mas não se limitam a, de origem extracelular, intracelular, biológica ou química. Os métodos do invento englobam também ligandos incluindo substratos, moléculas adaptadoras ou receptoras que estejam ligadas a um marcador, tal como um radio-marcador (e.g., 125I, 35S, 32P, 33P, 3H) , um marcador fluorescente, um marcador quimioluminescente, um marcador enzimático ou um marcador imunogénico. Os moduladores que caiem dentro do âmbito do invento incluem, mas não se limitam a, moléculas não peptídicas tais como miméticos não peptídicos, efectores alostéricos não peptídicos e péptidos. 0 polipéptido ou polinucleótido de M-CSF ou M-CSFR empregue num tal teste pode estar livre em solução, ligado a um suporte sólido, preso numa superfície celular ou localizado intracelularmente ou associado a uma porção de uma célula. Um perito na técnica pode, por exemplo, 113 ΡΕ1572106 medir a formação de complexos entre um polipéptido M-CSF ou M-CSFR e o composto a testar. Alternativamente, um perito na técnica pode examinar a diminuição na formação de complexo entre um polipéptido M-CSF ou M-CSFR e o seu substrato causada pelo composto a testar.

Outro aspecto do presente invento dirige-se a métodos de identificação de compostos que modulem (i.e., diminuam) a actividade de um polipéptido M-CSF ou M-CSFR compreendendo o contacto de um polipéptido M-CSF ou M-CSFR com um composto, e a determinação de se o composto modifica a actividade do polipéptido M-CSF ou M-CSFR. A actividade na presença do composto de teste é medida em comparação com a actividade na ausência do composto de teste. Quando a actividade da amostra contendo o composto de teste é superior à actividade na amostra sem o composto de teste, o composto terá uma actividade aumentada. Semelhantemente, quando a actividade da amostra contendo o composto de teste é inferior à actividade na amostra sem o composto de teste, o composto terá actividade inibida. 0 presente invento é particularmente útil para pesquisa de compostos através da utilização dos polipé-ptidos M-CSF ou M-CSFR em qualquer uma de uma variedade de técnicas de pesquisa de fármacos. Compostos a pesquisar (que podem incluir compostos que são suspeitos de se ligarem a um polipéptido M-CSF ou M-CSFR, ou uma molécula de ácido nucleico codificando o mesmo) incluem, mas não se limitam a, de origem extracelular, intracelular, biológica, 114 ΡΕ1572106 ou química. 0 polipéptido ou polinucleótido de M-CSF ou M-CSFR empregue num tal teste pode estar livre em solução, ligado a um suporte sólido, preso numa superfície celular ou localizado intracelularmente ou associado a uma porção de uma célula. Um perito na técnica pode, por exemplo, medir a formação de complexos entre um polipéptido M-CSF ou M-CSFR e o composto a testar. Alternativamente, um perito na técnica pode examinar a diminuição na formação de complexo entre um polipéptido M-CSF ou M-CSFR e o seu substrato causada pelo composto a testar. A actividade dos polipéptidos M-CSF ou M-CSFR do invento pode ser determinada através, por exemplo, de examinação da sua capacidade para se ligarem a ligandos peptídicos quimicamente sintetizados ou de ocorrência natural. Alternativamente, a actividade dos polipéptidos M-CSF ou M-CSFR pode ser ensaiada através de examinação da sua capacidade para se ligarem a moléculas adaptadoras, moléculas receptoras, substratos ou outros ligandos. A actividade dos polipéptidos M-CSF ou M-CSFR pode também ser determinada através de examinação da actividade de moléculas efectoras incluindo, mas não se limitando a outras enzimas a jusante que sejam activadas por M-CSF ou M-CSFR. Assim, moduladores da actividade de polipéptidos M-CSF ou M-CSFR podem alterar uma função de M-CSF ou M-CSFR, tal como uma propriedade de ligação de um polipéptido M-CSF ou M-CSFR. Em várias concretizações do método, o ensaio pode tomar a forma de ensaios de ligação a parceiros de ligação naturais, bem como outros ensaios de ligação ou 115 ΡΕ1572106 baseados na função da actividade de M-CSF ou M-CSFR que são geralmente conhecidos na técnica. As actividades biológicas de M-CSF ou M-CSFR de acordo com o invento incluem, mas não se limitam à ligação de um ligando natural ou não natural bem como qualquer uma das actividades funcionais de M-CSF ou M-CSFR conhecidas na técnica. Exemplos não limitantes de actividades de M-CSF ou M-CSFR incluem proteólise de substratos e ligação a substratos, ligandos, moléculas adaptadoras ou receptoras.

Os moduladores do invento exibem uma variedade de estruturas químicas, que podem ser geralmente agrupadas em miméticos não peptídicos de ligandos naturais de M-CSF ou M-CSFR, efectores alostéricos peptídicos e não peptídicos de M-CSF ou M-CSFR, e péptidos que podem funcionar como activadores ou inibidores (competitivos, sem competição e não competitivos) (e.g., produtos de anticorpos) de M-CSF ou M-CSFR. O invento não restringe as fontes para moduladores adequados, que podem ser obtidos a partir de fontes naturais tais como plantas, animais ou extractos minerais, ou de fontes não naturais tais como bibliotecas de moléculas pequenas, incluindo os produtos de abordagens químicas combinatórias à construção de bibliotecas e biblioteca peptídicas.

Podem ser utilizados outros ensaios para examinar a actividade enzimática, mas não se limitando ao foto-métrico, radiométrico, HPLC, electroquímico e semelhantes, que são descritos, por exemplo, em "Enzyme Assays: A 116 ΡΕ1572106

Practical Approach", eds. R. Eisenthal e M.J. Danson (1992) Oxford University Press. ADNcs codificando polipéptidos M-CSF ou M-CSFR podem ser utilizados em programas de descoberta de fármacos; ensaios capazes de testar milhares de compostos desconhecidos por dia em pesquisas de elevada tiragem (HTSs) estão minuciosamente documentados. A literatura está repleta de exemplos da utilização de ligandos radiomarcados em ensaios de ligação HTS para descoberta de fármacos (ver Williams, Medicinal Research Reviews 11: 147-184, 1991; Sweetnam, et al., J. Natural Products 56: 441-455, 1993 para revisão). M-CSF ou M-CSFR imobilizado são preferidos para o ensaio de ligação HTS porque permitem uma melhor especificidade (pureza relativa mais elevada), proporcionam a capacidade de gerar grandes quantidades de material M-CSF ou M-CSFR, e podem ser utilizados numa ampla variedade de formatos (ver Hodgson, Bio/Technology 10: 973-980, 1992).

Está disponível uma variedade de sistemas hete-rólogos para expressão funcional de polipéptidos recombi-nantes que são bem conhecidos dos peritos na técnica. Tais sistemas incluem bactérias (Strosberg, et al., Trends in Pharmacological Sciences 13: 95-98, 1992), levedura (Pausch, Trends in Biotechnology 15: 487-494, 1997), vários tipos de células de insecto (Vanden Broeck, Int. Rev. Cytology 164: 189-268, 1996), células de anfibio (Jayawickreme et al., Current Opinion in Biotechnology 8: 629-634, 1997) e várias linhas celulares de mamifero (CHO, 117 ΡΕ1572106 ΗΕΚ293, COS, etc; ver Gerhardt, et al., Eur. J. Pharmacology 334: 1-23, 1997). Estes exemplos não excluem a utilização de outros sistemas de expressão celular possíveis, incluindo linhas celulares obtidas de nemátodes (pedido PCT WO 98/37177).

Em concretizações preferidas do invento, os métodos de pesquisa de compostos que modulem a actividade de polipéptidos M-CSF ou M-CSFR compreendem o contacto dos compostos de teste com o polipéptido M-CSF ou M-CSFR e ensaio quanto à presença de um complexo entre o composto e o polipéptido M-CSF ou M-CSFR. Em tais ensaios, o ligando está tipicamente marcado. Após incubação adequada, o ligando livre é separado do presente na forma ligada e a quantidade de marcador livre ou não complexado é uma medida da capacidade do composto particular para se ligar ao polipéptido M-CSF ou M-CSFR.

Noutra concretização do invento, é empregue pesquisa de elevada tiragem de compostos possuindo afinidade de ligação adequada a um polipéptido M-CSF ou M-CSFR. Resumidamente, é sintetizado um grande número de compostos de teste peptídicos pequenos diferentes num substrato sólido. Os compostos de teste peptídicos são postos em contacto com um polipéptido M-CSF ou M-CSFR e lavados. Os polipéptidos M-CSF ou M-CSFR ligados são então detectados através de métodos bem conhecidos na técnica. Os polipéptidos purificados do invento podem também ser revestidos directamente em placas para utilizar nas 118 ΡΕ1572106 técnicas de pesquisa de fármacos acima mencionadas. Adicionalmente, podem ser utilizados anticorpos não neutralizantes para capturar a proteina e imobilizá-la no suporte sólido.

Geralmente, um polipéptido M-CSF ou M-CSFR expresso pode ser utilizado para ensaios de ligação HTS em conjunto com um substrato, ligando, molécula adaptadora ou receptora que esteja marcado com um radioisótopo adequado, incluindo, mas não se limitando a, 125I, 3H, 35S ou 32p, através de métodos que são bem conhecidos dos peritos na técnica. Alternativamente, o substrato, ligando, molécula adaptadora ou receptora pode ser marcado através de métodos bem conhecidos com um derivado fluorescente adequado (Baindur, et ai., Drug Dev. Res. 33: 373-398, 1994; Rogers, Drug Discovery Today 2: 156-160, 1997). O ligando radioactivo especificamente ligado a M-CSF ou M-CSFR imobilizado pode ser detectado em ensaios HTS num de vários modos padrão, incluindo filtração do complexo M-CSF ou M-CSFR-ligando para separar o ligando ligado do ligando não ligado (Williams, Med. Res. Rev. 11: 147-184, 1991; Sweetnam, et al., J. Natural Products 56: 441-455, 1993). Métodos alternativos incluem um ensaio de proximidade de cintilações (SPA) ou um formato FlashPlate no qual tal separação é desnecessária (Nakayama, Cur. Opinion Drug Disc. Dev. 1: 85-91, 1998, Bossé, et al., J. Biomolecular Screening 3: 285-292, 1998). A ligação de ligandos fluorescentes pode ser detectada de vários modos, incluindo transferência de energia de fluorescência (FRET) , análise 119 ΡΕ1572106 espectrofotofluorométrica directa do ligando ligado, ou polarização de fluorescência (Rogers, Drug Discovery Today 2: 156-160, 1997; Hill, Cur. Opinion Drug Disc. Dev. 1: 92-97, 1998). O invento contempla uma multiplicidade de ensaios para pesquisar e identificar inibidores da ligação do substrato, ligando, adaptador ou receptor a M-CSF ou M- CSFR. Num exemplo, M-CSF ou M-CSFR é imobilizado e a interacção com um parceiro de ligação é avaliada na presença e ausência de um modulador candidato tal como um composto inibidor. Noutro exemplo, a interacção entre M-CSF ou M-CSFR e o seu parceiro de ligação é avaliada num ensaio em solução, tanto na presença como na ausência de um composto inibidor candidato. Em qualquer um dos ensaios, um inibidor é identificado como um composto que diminui a ligação entre o M-CSF ou M-CSFR e o seu parceiro de ligação. Outro ensaio contemplado envolve uma variação do ensaio de dois híbridos em que um inibidor de interacções proteina/proteina é identificado através de detecção de um sinal positivo numa célula hospedeira transformada ou transfectada, tal como descrito no número de publicação PCT WO 95/20652, publicada a 3 de Agosto de 1995.

Moduladores candidatos contemplados pelo invento incluem compostos seleccionados a partir de bibliotecas de potenciais activadores ou potenciais inibidores. Existem várias bibliotecas diferentes utilizadas para a identificação de moduladores de molécula pequena, incluindo: 120 ΡΕ1572106 (1) bibliotecas químicas, (2) bibliotecas de produtos naturais, e (3) bibliotecas combinatórias constituídas por péptidos aleatórios, oligonucleótidos ou moléculas orgânicas. As bibliotecas químicas consistem em estruturas químicas aleatórias, algumas das quais são análogos de compostos conhecidos ou análogos de compostos que foram identificados como "acertos" ou "guias" noutras pesquisas de descoberta de fármacos, alguns dos quais são derivados de produtos naturais, e alguns dos quais surgem de química orgânica sintética não dirigida. As bibliotecas de produtos naturais são colecções de microrganismos, animais, plantas ou organismos marinhos que são utilizados para criar misturas para pesquisa através de: (1) fermentação e extracção de caldos de solo, plantas ou microrganismos marinhos ou (2) extracção de plantas ou organismos marinhos. As bibliotecas de produtos naturais incluem policétidos, péptidos não ribossómicos e variantes (de ocorrência não natural) destes. Para uma revisão, ver Science 282: 63-68, 1998. As bibliotecas combinatórias são compostas por um grande número de péptidos, oligonucleótidos ou compostos orgânicos como uma mistura. Estas bibliotecas são relativamente fáceis de preparar através de métodos de síntese automática tradicionais, PCR, clonagem ou métodos sintéticos patenteados. São de particular interesse as bibliotecas combinatórias não peptídicas. Outras bibliotecas ainda de interesse incluem bibliotecas peptídicas, proteicas, de peptidomiméticos, de colecção sintética multiparalela, recombinatórias e polipeptídicas. Para uma revisão da química combinatória e das bibliotecas 121 ΡΕ1572106 criadas a partir desta, ver Myers, Curr. Opin. Biotechnol. 8: 701-707, 1997. A identificação de moduladores através da utilização das várias bibliotecas aqui descritas permite a modificação do "acerto" (ou "guia") candidato para opti-mizar a capacidade do "acerto" para modular a actividade.

Podem ser desenhados ainda outros inibidores candidatos contemplados pelo invento que incluem formas solúveis de parceiros de ligação, bem como tais parceiros de ligação como proteínas quiméricas ou de fusão. Um "parceiro de ligação" tal como aqui se utiliza engloba amplamente moduladores não peptídicos, bem como moduladores peptídicos incluindo anticorpos, fragmentos de anticorpo e compostos modificados compreendendo domínios que são imunoespecíficos para M-CSF ou M-CSFR.

Podem ser utilizados outros ensaios para identificar ligandos específicos de M-CSF ou M-CSFR, incluindo ensaios que identificam ligandos da proteína alvo através de medição directa da ligação dos ligandos de teste à proteína alvo, bem como ensaios que identificam ligandos das proteínas alvo através de ultrafiltração de afinidade com métodos de espectroscopia de massa por vaporização iónica/HPLC ou outros métodos físicos e analíticos. Alternativamente, tais interacções de ligação são avaliadas indirectamente utilizando o sistema de dois híbridos de levedura descrito em Fields et al. , Nature 340: 245-246, 1989, e Fields et ai., Trends in Genetics 10: 286-292, 1994, ambos os quais são aqui incorporados por referência. 122 ΡΕ1572106 0 sistema de dois hibridos é um ensaio genético para detecção de interacções entre duas proteínas ou polipéptidos. Pode ser utilizado para identificar proteínas que se liguem a uma proteína conhecida de interesse ou para delinear domínios ou resíduos críticos para uma interacção. Foram desenvolvidas variações nesta metodologia para clonar genes que codificam proteínas de ligação a ADN, para identificar péptidos que se ligam a uma proteína e para pesquisar fármacos. 0 sistema de dois híbridos explora a capacidade de um par de proteínas que interagem para colocar um domínio de activação da transcrição em íntima proximidade com um domínio de ligação ao ADN que se ligue a uma sequência de activação a montante (UAS) de um gene repórter e é geralmente efectuado em levedura. 0 ensaio requer a construção de dois genes híbridos codificando (1) um domínio de ligação ao ADN que é fundido com uma primeira proteína e (2) um domínio de activação fundido com uma segunda proteína. 0 domínio de ligação ao ADN dirige a primeira proteína híbrida para o UAS do gene repórter; no entanto, como a maioria das proteínas não possui um domínio de activação, esta proteína híbrida de ligação ao ADN não activa a transcrição do gene repórter. A segunda proteína híbrida, que contém o domínio de activação, não pode ela própria activar a expressão do gene repórter porque não se liga ao UAS. No entanto, quando ambas as proteínas híbridas estão presentes, a interacção não covalente da primeira com a segunda proteínas prende o domínio de activação ao UAS, activando a transcrição do gene repórter. Por exemplo, quando a primeira proteína é M-CSF ou M-CSFR, ou uma subunidade ou um fragmento desta, que se sabe interagir com 123 ΡΕ1572106 outra proteína ou ácido nucleico, este ensaio pode ser utilizado para detectar agentes que interfiram com a interacção de ligação. A expressão do gene repórter é monitorizada à medida que diferentes agentes de teste são adicionados ao sistema. A presença de um agente inibidor resulta em falta de um sinal do repórter. 0 ensaio de dois híbridos de levedura pode também ser utilizado para identificar proteínas que se liguem a M-CSF ou M-CSFR. Num ensaio para identificar proteínas que se liguem a M-CSF ou M-CSFR, ou a uma subunidade ou um fragmento destes, pode ser utilizado um polinucleótido de fusão codificando um M-CSF ou um M-CSFR (ou uma subunidade ou um fragmento) e um domínio de ligação a UAS (i.e., uma primeira proteína). Adicionalmente, um grande número de genes híbridos codificando cada um uma segunda proteína diferente fundida com um domínio de activação é produzido e pesquisado no ensaio. Tipicamente, a segunda proteína é codificada por um ou mais membros de uma biblioteca de fusão de ADNc total ou de ADN genómico, sendo cada região de codificação da segunda proteína fundida com o domínio de activação. Este sistema é aplicável a uma ampla variedade de proteínas e nem é necessário conhecer a identidade ou função da segunda proteína de ligação. 0 sistema é altamente sensível e pode detectar interacções não reveladas por outros métodos; até interacções transientes podem desencadear transcrição para produzir um ARNm estável que possa ser repetidamente traduzido para produzir a proteína repórter. 124 ΡΕ1572106

Podem ser utilizados outros ensaios para pesquisar agentes que se liguem à proteina alvo. Um tal método de pesquisa para identificar ligação directa de ligandos de teste a uma proteina alvo está descrito na

Patente U.S. N°. 5585277. Este método baseia-se no principio de que as proteínas existem geralmente como uma mistura dos estados dobrado e não dobrado, e alternam continuamente entre os dois estados. Quando um ligando de teste se liga à forma dobrada de uma proteína alvo (i.e., quando o ligando de teste é um ligando da proteína alvo), a molécula da proteína alvo ligada ao ligando permanece no seu estado dobrado. Assim, a proteína alvo dobrada está presente numa maior extensão na presença de um ligando de teste que se ligue à proteína alvo, que na ausência de um ligando. A ligação do ligando à proteína alvo pode ser determinada através de qualquer método que distinga entre os estados dobrado e não dobrado da proteína alvo. Não é necessário conhecer a função da proteína alvo para que este ensaio seja efectuado. Virtualmente qualquer agente pode ser ensaiado através deste método como ligando de teste, incluindo, mas não se limitando a metais, polipéptidos, proteínas, lípidos, polissacáridos, polinucleótidos e moléculas orgânicas pequenas.

Outro método para identificação de ligandos de uma proteína alvo está descrito em Wieboldt et al., Anal. Chem. 69: 1683-1691, 1997. Esta técnica pesquisa bibliotecas combinatórias de 20-30 agentes de uma vez em fase de solução quanto à ligação à proteína alvo. Os 125 ΡΕ1572106 agentes que se ligam à proteína alvo são separados de outros componentes da biblioteca através de simples lavagem da membrana. As moléculas especificamente seleccionadas que são retidas no filtro são subsequentemente libertadas da proteína alvo e analisadas através de HPLC e espectroscopia de massa de ionização por electrovaporização (aspersão de iões) pneumaticamente assistida. Este procedimento selecciona componentes da biblioteca com a maior afinidade para a proteína alvo e é particularmente útil para bibliotecas de moléculas pequenas.

Outras concretizações do invento compreendem a utilização de ensaios de pesquisa competitivos nos quais anticorpos neutralizantes capazes de se ligar a um polipéptido do invento competem especificamente com um composto de teste pela ligação ao polipéptido. Deste modo, os anticorpos podem ser utilizados para detectar a presença de qualquer péptido que partilhe um ou mais determinantes antigénicos com M-CSF ou M-CSFR. Estudos de ligação competitiva radiomarcada são descritos em A.H. Lin et al. "Antimicrobial Agents and Chemotherapy" (1997) vol. 41, no. 10. págs. 2127-2131.

Noutras concretizações do invento, os polipé-ptidos do invento são empregues como uma ferramenta de investigação para identificação, caracterização e purificação de proteínas reguladoras que interajam. Marcadores apropriados são incorporados nos polipéptidos do invento através de vários métodos conhecidos na técnica e os 126 ΡΕ1572106 polipéptidos são utilizados para capturar moléculas que interagem. Por exemplo, as moléculas são incubadas com os polipéptidos marcados, lavadas para remover os polipéptidos não ligados e o complexo polipeptídico é quantificado. Os dados obtidos utilizando diferentes concentrações de polipéptido são utilizados para calcular valores para o número, a afinidade e associação do polipéptido com o complexo proteico.

Polipéptidos marcados são também úteis como reagentes para a purificação de moléculas com as quais o polipéptido interaja incluindo, mas não se limitando a, inibidores. Numa concretização de purificação por afinidade, um polipéptido é covalentemente ligado a uma coluna de cromatografia. As células e suas membranas são extraídas e vários subcomponentes celulares são passados pela coluna. As moléculas ligam-se à coluna em virtude da sua afinidade com o polipéptido. 0 complexo do polipéptido é recuperado da coluna, dissociado e a molécula recuperada é sujeita a sequenciação proteica. Esta sequência de aminoácidos é então utilizada para identificar a molécula capturada ou para desenhar oligonucleótidos degenerados para clonagem do gene correspondente a partir de uma biblioteca de ADNc apropriada.

Alternativamente, podem ser identificados compostos que exibam propriedades semelhantes às do ligando para M-CSF ou M-CSFR, mas que sejam menores e exibam uma semi-vida mais longa que o ligando endógeno no corpo de um 127 ΡΕ1572106 ser humano ou animal. Quando um composto orgânico é desenhado, uma molécula de acordo com o invento é utilizada como composto "guia". 0 desenho de miméticos para compostos farmaceuticamente activos conhecidos é uma abordagem bem conhecida no desenvolvimento de produtos farmacêuticos baseados em tais compostos "guia". 0 desenho, a sintese e testes de miméticos são geralmente utilizados para evitar a pesquisa aleatória de um grande número de moléculas para uma propriedade alvo. Para além disso, os dados estruturais que derivam da análise das sequências de aminoácidos deduzidas codificadas pelos polinucleótidos do presente invento são úteis para desenhar novos fármacos, mais específicos e portanto com uma potência farmacológica superior.

Modelação por computador pode ser utilizada para desenvolver uma putativa estrutura terciária das proteínas do invento com base na informação disponível sobre M-CSF ou M-CSFR. Assim, podem ser desenhados novos ligandos com base na estrutura prevista de M-CSF ou M-CSFR.

Outro aspecto do presente invento é a utilização das sequências nucleotídicas de M-CSF ou M-CSFR aqui divulgadas para identificação de homólogos noutros animais. Qualquer uma das sequências nucleotídicas aqui divulgadas, ou qualquer porção destas, pode ser utilizada, por exemplo, como sonda para pesquisar bases de dados ou bibliotecas de ácidos nucleicos, tais como, por exemplo, bibliotecas genómicas ou de ADNc, para identificar homólogos, 128 ΡΕ1572106 utilizando procedimentos de pesquisa bem conhecidos dos peritos na técnica. Concordantemente , podem ser identificados homólogos possuindo pelo menos 50%, de preferência pelo menos 60%, de maior preferência pelo menos 70%, ainda de preferência pelo menos 80%, ainda de maior preferência pelo menos 90%, ainda de preferência pelo menos 95% e de maior preferência pelo menos 100% de homologia com as sequências de M-CSF ou M-CSFR.

Terapia de Combinação

Tendo identificado mais de um antagonista de M-CSF que seja eficaz num modelo animal, pode ainda ser vantajoso misturar dois ou mais desses antagonistas de M-CSF para proporcionar uma eficácia ainda melhor contra metástase de cancro e/ou perda óssea associada a metástase de cancro. Composições compreendendo um ou mais antagonistas de M-CSF podem ser administradas a pessoas ou mamíferos sofrendo ou predispostos a sofrer de metástase de cancro e/ou perda óssea associada a metástase de cancro.

Embora a terapia de antagonista de M-CSF possa ser útil para todos os estádios de cancros, a terapia de anticorpos pode ser particularmente apropriada em cancros avançados ou metastáticos. Pode ser preferida a combinação do método de terapia de anticorpos com um regime quimioterapêutico ou de radiação em pacientes que não tenham recebido tratamento quimioterapêutico, enquanto o tratamento com terapia de anticorpos pode ser indicado para 129 ΡΕ1572106 pacientes que tenham recebido uma ou mais quimioterapias. Adicionalmente, a terapia de anticorpos pode também permitir a utilização de dosagens reduzidas de quimioterapia concomitante, particularmente em pacientes que não tolerem muito bem a toxicidade do agente quimioterapêutico. 0 método do invento contempla a administração de anticorpos simples anti-M-CSF e anti-M-CSFR, bem como combinações, ou "misturas", de diferentes anticorpos. Tais misturas de anticorpos podem ter certas vantagens na medida em que contêm anticorpos que exploram diferentes mecanismos efectores ou combinam directamente anticorpos citotóxicos com anticorpos que se baseiam na funcionalidade efectora imunitária. Tais anticorpos em combinação podem exibir efeitos terapêuticos sinergísticos. Adicionalmente, a administração de anticorpos anti-M-CSF e anti-M-CSFR pode ser combinada com outros agentes terapêuticos e/ou procedimentos, incluindo mas não se limitando a vários agentes quimioterapêuticos, bloqueadores de androgénios e modula-dores imunitários (e.g., IL-2, GM-CSF), Bisfosfonato (s) (e.g., Aredia; Zometa; Clodronato), cirurgia, radiação, quimioterapia, terapia hormonal (e.g., Tamoxifeno; terapia anti-Androgénios), terapia de anticorpos (e.g., anticorpos neutralizantes de RANKL/RANK; anticorpo neutralizante de PTHrP, anticorpo anti-Her2, anticorpo neutralizante de VEGF), terapia de proteínas terapêuticas (e.g., receptor RANKL solúvel; inibidores de OPG, e PDGF e MMP), terapia de fármacos de molécula pequena (e.g., inibidor de Src-cinase), inibidores de cinases de receptores de factores de 130 ΡΕ1572106 crescimento; terapia de oligonucleótidos (e.g., Anti-sentido de RANKL ou RANK ou PTHrP), terapia génica (e.g., inibidores de RANKL ou RANK), terapia peptídica (e.g., muteínas de RANKL) bem como proteínas, péptidos, compostos e moléculas pequenas aqui descritas.

Agentes quimioterapêuticos de cancro incluem, sem limitação, agentes alquilantes, tais como carboplatina e cisplatina; agentes alquilantes de mostarda de azoto; agentes alquilantes de nitrosoureia, tais como carmustina (BCNU); antimetabolitos, tais como metotrexato; antimeta-bolitos análogos de purina, mercaptopurina; antimetabolitos análogos de pirimidina, tais como fluorouracilo (5-FU) e gemcitabina; antineoplásicos hormonais, tais como gosere-lina, leuprolide e tamoxifeno; antineoplásicos naturais, tais como aldesleucina, interleucina-2, docetaxel, etopó-sido (VP-16), interferão alfa, paclitaxel e tretinoina (ATRA); antineoplásicos naturais antibióticos, tais como bleomicina, dactinomicina, daunorubicina, doxorubicina e mitomicina; e antineoplásicos alcaloides vinca naturais, tais como vinblastina, vincristina, vindesina; hidroxi-ureia; aceglatona, adriamicina, ifosfamida, enocitabina, epitiostanol, aclarubicina, ancitabina, nimustina, clori-drato de procarbazina, carboquona, carboplatina, carmofur, cromomicina A3, polissacáridos antitumorais, factores de plaquetas antitumorais, ciclofosfamida, Esquizofilano, citarabina, dacarbazina, tioinosina, tiotepa, tegafur,, neocarzinostatina, OK-432, bleomicina, furtulon, broxu-ridina, bussulfano, honvan, peplomicina, Bestatina (ubeni- 131 ΡΕ1572106 mex) , interferão-β, mepitiostano, mitobronitol, merfalano, péptidos laminina, lentinano, extracto de Coriolus versicolor, tegafur/uracilo, estramustina (estrogénio/me-cloretamina).

Mais, agentes adicionais utilizados como terapia para pacientes de cancro incluem EPO, G-CSF, ganciclovir; antibióticos, leuprolide; meperidina; zidovudine (AZT); interleucinas 1 a 18, incluindo mutantes e análogos; interferões ou citocinas, tais como interferões α, β, e γ, hormonas, tais como hormona libertadora da hormona luteinizante (LHRH) e análogos e, hormona libertadora de gonadotrofina (GnRH); factores de crescimento, tais como factor de crescimento transformante (TGF-β), factor de crescimento de fibroblastos (FGF), factor de crescimento dos nervos (NGF), factor de libertação da hormona de crescimento (GHRF), factor de crescimento epidérmico (EGF), factor homólogo do factor de crescimento de fibroblastos (FGFHF), factor de crescimento de hepatócitos (HGF), e factor de crescimento de insulina (IGF); factor de necrose tumoral-cx & β (TNF-cx & β) ; factor de inibição da invasão-2 (IIF-2); proteínas morf ogenéticas do osso 1-7 (BMP 1-7); somatostatina; timosina-a-1; γ-globulina; superóxido-dismutase (SOD); factores do complemento; factores anti-angiogénese; materiais antigénicos; e pró-fármacos.

Administração e preparação 0 presente invento proporciona compostos 132 ΡΕ1572106 formulações farmacêuticas incluindo os compostos, métodos de preparação das formulações farmacêuticas e métodos de tratamento de pacientes com as formulações e compostos farmacêuticos.

Tais composições podem estar na forma, por exemplo, de grânulos, pós, comprimidos, cápsulas, xaropes, supositórios, injecções, emulsões, elixires, suspensões ou soluções. As presentes composições podem ser formuladas para várias vias de administração, por exemplo, através de administração oral, através de administração nasal, através de administração rectal, injecção subcutânea, injecção intravenosa, injecções intramusculares ou injecção intrape-ritoneal. As seguintes formas de dosagem são dadas como exemplo e não devem ser entendidas como limitantes do presente invento.

Para administração oral, bucal e sublingual, os pós, suspensões, grânulos, comprimidos, pílulas, cápsulas, cápsulas de gelatina e cápsulas ("caplet") são aceitáveis como formas de dosagem sólidas. Estas podem ser preparadas, por exemplo, através da mistura de um ou mais compostos do presente invento ou sais farmaceuticamente aceitáveis ou tautómeros destes, com pelo menos um aditivo tal como amido ou outro aditivo. Aditivos adequados são sacarose, lactose, açúcar de celulose, manitol, maltitol, dextrano, amido, agar, alginatos, quitinas, quitosanos, pectinas, goma adragante, goma-arábica, gelatinas, colagénios, caseína, albumina, polímeros sintéticos ou semi-sintéticos ou 133 ΡΕ1572106 glicéridos. Opcionalmente, formas de dosagem orais podem conter outros ingredientes para auxiliar na administração, tal como um diluente inactivo ou lubrificantes tais como estearato de magnésio ou conservantes tais como parabeno ou ácido sórbico, ou anti-oxidantes tais como ácido ascórbico, tocoferol ou cisteina, um agente desintegrante, aglome-rantes, espessantes, tampões, adoçantes, aromatizantes ou agentes perfumantes. Os comprimidos e as pílulas podem ainda ser tratados com materiais de revestimento conhecidos na técnica.

As formas de dosagem líquidas para administração oral podem estar na forma de emulsões farmaceuticamente aceitáveis, xaropes, elixires, suspensões e soluções que podem conter um diluente inactivo, tal como água. As formulações farmacêuticas e medicamentos podem ser preparados como suspensões ou soluções líquidas utilizando um líquido estéril, tal como, mas não se limitando a, um óleo, água, um álcool e combinações destes. Tensioactivos farmaceuticamente adequados, agentes de suspensão e agentes emulsionantes podem ser adicionados para administração oral ou parentérica.

Tal como observado acima, as suspensões podem incluir óleos. Um tal óleo inclui, mas não se limita a, óleo de amendoim, óleo de sésamo, óleo de semente de algodão, óleo de milho e azeite. A preparação da suspensão pode também conter ésteres de ácidos gordos tais como oleato de etilo, isopropilmiristato, glicéridos de ácidos 134 ΡΕ1572106 gordos e glicéridos de ácidos gordos acetilados. As formulações em suspensão podem incluir álcoois, tais como, mas não se limitando a etanol, álcool isopropilico, álcool hexadecílico, glicerol e propilenoglicol. Éteres, tais como mas não se limitando a polietilenoglicol, hidrocarbonetos de petróleo tais como óleo mineral e petrolato; e água podem também ser utilizados em formulações de suspensão.

Para administração nasal, as formulações farmacêuticas e medicamentos podem ser uma aspersão ou aerossol contendo um ou mais solventes apropriados e opcionalmente outros compostos tais como, mas não se limitando a, estabilizantes, agentes antimicrobianos, antioxidantes, modificadores do pH, tensioactivos, modificadores da biodisponibilidade e combinações destes. Um propulsor para uma formulação em aerossol pode incluir ar comprimido, azoto, dióxido de carbono ou um solvente de baixo ponto de ebulição baseado em hidrocarbonetos.

Formas de dosagem injectáveis incluem geralmente suspensões aquosas ou suspensões em óleo que podem ser preparadas utilizando um dispersante ou agente humidifi-cante adequado e um agente de suspensão. As formas injectáveis podem estar em fase de solução ou na forma de uma suspensão, que é preparada com um solvente ou diluente. Solventes ou veículos aceitáveis incluem água esterilizada solução de Ringer ou uma solução salina aquosa isotónica. Alternativamente, podem ser empregues óleos estéreis como solventes ou agentes de suspensão. De preferência, o óleo 135 ΡΕ1572106 ou ácido gordo é não volátil, incluindo óleos naturais ou sintéticos, ácidos gordos, mono, di ou triglicéridos.

Para injecção, a formulação farmacêutica e/ou medicamento pode ser um pó adequado para reconstituição com uma solução apropriada tal como descrito acima. Exemplos destes incluem, mas não se limitam a pós secos por congelação, secos por centrifugação ou secos por vaporização, pós amorfos, grânulos, precipitados ou particulados. Para injecção, as formulações podem opcionalmente conter estabilizantes, modificadores do pH, tensioactivos, modificadores da biodisponibilidade e combinações destes.

Para administração rectal, as formulações farmacêuticas e medicamentos podem estar na forma de um supositório, um unguento, um enema, um comprimido ou um creme para libertação do composto nos intestinos, flexão sigmóide e/ou recto. Os supositórios rectais são preparados através de mistura de um ou mais compostos do presente invento, ou sais farmaceuticamente aceitáveis ou tautómeros do composto, com veiculos aceitáveis, por exemplo, manteiga de cacau ou polietilenoglicol, que está presente numa fase sólida a temperaturas de armazenamento normais, e presente numa fase liquida às temperaturas adequadas para libertar um fármaco dentro do corpo, tal como no recto. Óleos podem também ser empregues na preparação de formulações do tipo gelatina mole e supositórios. Água, solução salina, dextrose aquosa e soluções de açúcar relacionadas e gliceróis podem ser empregues na preparação de formulações 136 ΡΕ1572106 em suspensão que podem também conter agentes de suspensão tais como pectinas, carbómeros, metilcelulose, hidroxi-propilcelulose ou carboximetilcelulose, bem como tampões e conservantes.

Para além das formas de dosagem representativas descritas acima, excipientes e transportadores farmaceuti-camente aceitáveis são geralmente conhecidos dos peritos na técnica e são assim incluídos no presente invento. Tais excipientes e transportadores são descritos, por exemplo, em "Remington's Pharmaceutical Science" Mack Pub. Co., New Jersey (1991) .

As formulações do invento podem ser desenhadas para ser de acção curta, de libertação rápida, de acção duradoura e de libertação sustida tal como descrito abaixo. Assim, as formulações farmacêuticas podem também ser formuladas para libertação controlada ou para libertação lenta.

As presentes composições podem também compreender, por exemplo, micelas ou lipossomas ou alguma outra forma encapsulada, ou podem ser administradas numa forma de libertação prolongada para proporcionar um armazenamento e/ou efeito de distribuição prolongados. Por essa razão, as formulações farmacêuticas e medicamentos podem ser comprimidos em pastilhas ou cilindros e implantados intramuscularmente ou subcutaneamente como injecções de depósito ou como implantes tais como endopróteses expansíveis 137 ΡΕ1572106 ("stents"). Tais implantes podem empregar materiais inertes conhecidos tais como silicones e polimeros biodegradáveis.

As dosagens especificas podem ser ajustadas dependendo das condições da doença, da idade, do peso corporal, das condições gerais de saúde, do sexo e da dieta do sujeito, dos intervalos de dose, das vias de administração, da taxa de excreção e de combinações de fármacos. Qualquer uma das formas de dosagem de cima contendo quantidades eficazes está bem dentro dos limites da experimentação de rotina e, por essa razão, bem dentro do âmbito do presente invento.

Através dos presentes métodos, composições compreendendo antagonistas de M-CSF podem ser administradas parentericamente, topicamente, oralmente ou localmente para tratamento terapêutico. De preferência, as composições são administradas oralmente ou parentericamente, i.e., intravenosamente, intraperitonealmente, intradermicamente ou intramuscularmente. Assim, este invento proporciona métodos que empregam composições para administração que compreendem um ou mais antagonistas de M-CSF num transportador farmaceuticamente aceitável, de preferência um transportador aquoso. Pode ser utilizada uma variedade de transportadores aquosos, e.g., água, água tamponada, solução salina a 0,4%, glicina a 0,3% e semelhantes que podem incluir outras proteínas para maior estabilidade tais como albumina, lipoproteína, globulina, etc., sujeitas a modificações químicas suaves ou semelhantes. 138 ΡΕ1572106

Antagonistas de M-CSF úteis como terapêuticos para metástase de cancro ou perda óssea associada a metástase de cancro serão frequentemente preparados substancialmente livres de outras imunoglobulinas de ocorrência natural ou outras moléculas biológicas. Os antagonistas de M-CSF preferidos exibirão toxicidade minima quando administrados a um mamífero afligido com, ou predisposto a sofrer de, metástase de cancro e/ou perda óssea associada a metástase de cancro.

As composições do invento podem ser esterilizadas através de técnicas de esterilização convencionais bem conhecidas. As soluções resultantes podem ser embaladas para utilização ou filtradas sob condições assépticas e liofilizadas, sendo a preparação liofilizada combinada com uma solução estéril antes da administração. As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis conforme necessário para se aproximarem das condições fisiológicas, tais como agentes de ajustamento do pH e de tamponamento, agentes de ajustamento da tonicidade e semelhantes, por exemplo, acetato de sódio, lactato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio e estabilizantes (e.g., maltose a 1 20%, etc.).

Os antagonistas de M-CSF do presente invento podem também ser administrados através de lipossomas. Os lipossomas, que incluem emulsões, espumas, micelas, monoca-madas insolúveis, dispersões de fosfolípidos, camadas 139 ΡΕ1572106 lamelares e semelhantes, podem servir como veículos para direccionar os antagonistas de M-CSF para um determinado tecido bem como aumentar a semi-vida da composição. Está disponível uma variedade de métodos para preparação de lipossomas, tal como descrito, e.g., nas Patentes U.S. Nos. 4837028 e 5019369. A concentração do antagonista de M-CSF nestas composições pode variar amplamente, i.e., de menos de cerca de 10%, habitualmente pelo menos cerca de 25% até tanto como 75% ou 90% em peso e será seleccionada principalmente pelos volumes de fluido, viscosidades, etc., de acordo com o modo particular de administração seleccionado. Métodos actuais para preparação de composições administráveis oralmente, topicamente e parentericamente serão conhecidos ou aparentes aos peritos na técnica e estão descritos em detalhe, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Science, 19a ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1995). A determinação de uma quantidade eficaz de uma composição do invento para tratar metástase de cancro e/ou perda óssea associada a metástase de cancro num paciente pode ser alcançada através de métodos empíricos padrão que são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, a actividade neutralizante in vivo de soro de um sujeito tratado com uma dada dosagem de antagonista de M-CSF pode ser avaliada utilizando um ensaio que determina a capacidade do soro para bloquear a proliferação e sobrevivência de monócitos de murídeo induzidas por M-CSF (célula CDllb+, um 140 ΡΕ1572106 subconjunto de células CD11, que expressa elevados níveis do receptor para M-CSF) in vitro tal como descrito em Cenci et ai., J. Clin. Invest. 1055: 1279-87, 2000.

As composições do invento são administradas a um mamífero já a sofrer de, ou predisposto a, metástase de cancro e/ou perda óssea associada a metástase de cancro numa quantidade suficiente para prevenir ou pelo menos parar parcialmente o desenvolvimento de metástase de cancro e/ou perda óssea associada a metástase de cancro. Uma quantidade adequada para alcançar isto é definida como uma "dose terapeuticamente eficaz". As quantidades eficazes de um antagonista de M-CSF variarão e dependerão da gravidade da doença e do peso e estado geral do paciente a tratar, mas variam geralmente de cerca de 1,0 pg/kg a cerca de 100 mg/kg de peso corporal, sendo mais vulgarmente utilizadas dosagens de cerca de 10 pg/kg a cerca de 10 mg/kg por aplicação. A administração é diária, semanal ou menos frequentemente, conforme necessário dependendo da resposta à doença e da tolerância do paciente à terapia. Podem ser necessárias dosagens de manutenção ao longo de um período de tempo prolongado e as dosagens podem ser ajustadas conforme necessário.

Podem ser efectuadas administrações simples ou múltiplas das composições sendo os níveis de dose e padrão seleccionados pelo médico assistente. Num caso, as formulações, as formulações devem proporcionar uma quantidade de antagonista de M-CSF suficiente para prevenir 141 ΡΕ1572106 ou minimizar eficazmente a gravidade da metástase de cancro e/ou perda óssea associada a metástase de cancro. As composições do presente invento podem ser administradas sozinhas ou como uma terapia adjunta em conjunto com outros produtos terapêuticos conhecidos na técnica para o tratamento de metástase de cancro e/ou perda óssea associada a metástase de cancro. II. Imunoterapia

Anticorpos anti-M-CSF e anti-M-CSFR úteis no tratamento de cancros incluem os que são capazes de iniciar uma resposta imunitária potente contra o tumor e os que são capazes de dirigir citotoxicidade. A este respeito, os anticorpos anti-M-CSF e anti-M-CSFR podem desencadear lise de células tumorais através de mecanismos de citotoxicidade celular mediados pelo complemento ou dependente de anticorpos (ADCC), ambos os quais requerem uma porção Fc intacta da molécula de imunoglobulina para interacção com locais dos receptores de Fc da célula efectora ou com proteínas do complemento.

Adicionalmente, anticorpos anti-M-CSF e anti-M-CSFR que exercem um efeito biológico directo no crescimento tumoral são úteis na prática do invento. Potenciais mecanismos através dos quais tais anticorpos citotóxicos podem actuar directamente incluem inibição do crescimento celular, modulação da diferenciação celular, modulação dos perfis de factores de angiogénese tumoral e a indução de 142 ΡΕ1572106 apoptose. 0 mecanismo através do qual um determinado anticorpo anti-M-CSF e anti-M-CSFR exerce um efeito anti-tumoral pode ser avaliado utilizando um qualquer número de ensaios in vitro desenhados para determinar ADCC, ADMMC, lise celular mediada pelo complemento e por ai adiante tal como é geralmente conhecido na técnica.

Numa concretização, a imunoterapia é efectuada utilizando anticorpos que tenham uma afinidade mais elevada para a forma ligada à membrana de M-CSF (M-CSFa) que para as formas segregadas de M-CSF. Por exemplo, podem ser preparados anticorpos que se liguem especificamente no local ou em torno do local de clivagem de M-CSFcí ou à porção de M-CSFa adjacente à membrana. Tais anticorpos podem também inibir beneficamente a clivagem e libertação da porção activa solúvel de M-CSFa.

Os anticorpos anti-M-CSF e anti-M-CSFR podem ser administrados na sua forma "nua" ou não conjugada, ou podem ter agentes terapêuticos conjugados com eles. Numa concretização, os anticorpos anti-M-CSF e anti-M-CSFR são utilizados como um radiossensibilizador. Em tais concretizações, os anticorpos anti-M-CSF e anti-M-CSFR são conjugados com um agente radiosensibilizador. 0 termo "radiosensibilizador", tal como aqui se utiliza, é definido como uma molécula, de preferência uma molécula de baixo peso molecular, administrada a animais em quantidades terapeuticamente eficazes para aumentar a sensibilidade das células para serem radiosensibilizadas a radiação 143 ΡΕ1572106 electromagnética e/ou para promover o tratamento de doenças que sejam tratáveis com radiação electromagnética. As doenças que são tratáveis com radiação electromagnética incluem doenças neoplásicas, tumores benignos e malignos e células cancerosas.

Os termos "radiação electromagnética" e "radiação" tal como aqui se utilizam incluem, mas não se limitam a, radiação possuindo o comprimento de onda de 10“20 a 100 metros. Concretizações preferidas do presente invento empregam a radiação electromagnética de: radiação-gama (10” 20 a 10”13 m) , radiação de raios X (10-12 a 10”9 m) , luz ultravioleta (10 nm a 400 nm) , luz visível (400 nm a 700 mn), radiação infravermelha (700 nm a 1,0 mm) e radiação de microondas (1 mm a 30 cm).

Sabe-se que os radiosensibilizadores aumentam a sensibilidade das células cancerosas aos efeitos tóxicos da radiação electromagnética. Muitos protocolos de tratamento de cancro empregam actualmente radiosensibilizadores activados através da radiação electromagnética de raios X. Exemplos de radiosensibilizadores activados por raios X incluem, mas não se limitam aos seguintes: metronidazole, misonidazole, desmetilmisonidazole, pimonidazole, etanida-zole, nimorazole, mitomicina C, RSU 1069, SR 4233, E09, RB 6145, nicotinamida, 5-bromodesoxiuridina (BUdR), 5-iododesoxiuridina (IUdR), bromodesoxicitidina, fluorodeso-xiuridina (FUdR), hidroxiureia, cisplatina e análogos e derivados dos mesmos terapeuticamente eficazes. 144 ΡΕ1572106 A terapia fotodinâmica (PDT) de cancros emprega luz visível como o activador de radiação do agente sensibilizador. Exemplos de radiosensibilizadores fotodi-nâmicos incluem os seguintes, mas não se limitam a: derivados de hematoporfirina, Photofrin®, derivados de benzoporfirina, NPe6, etioporfirina de estanho (SnET2), feoborbida-α, bacterioclorofila-a, naftalocianinas, ftalo-cianinas, ftalocianina de zinco, e análogos e derivados dos mesmos terapeuticamente eficazes.

Os anticorpos anti-M-CSF e anti-M-CSFR utilizados na prática de um método do invento podem ser formulados em composições farmacêuticas compreendendo um transportador adequado para o método de distribuição desejado. Transportadores adequados incluem qualquer material que, quando combinado com os anticorpos anti-M-CSF e anti-M-CSFR, mantém a função anti-tumoral do anticorpo e é não reactivo com os sistemas imunitários do sujeito. Exemplos incluem, mas não se limitam a, qualquer um de vários transportadores farmacêuticos padrão tais como soluções salinas tamponadas com fosfato estéreis, água bacteriostática e semelhantes. 0 presente invento proporciona ainda os anticorpos acima descritos na forma detectavelmente marcada. Os anticorpos podem ser detectavelmente marcados através da utilização de radioisótopos, marcadores de afinidade (tais como biotina, avidina, etc.), marcadores enzimáticos (tais como peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, etc.), 145 ΡΕ1572106 marcadores fluorescentes (tais como FITC ou rodamina, etc.)/ átomos paramagnéticos e semelhantes. Os procedimentos para alcançar tal marcação são bem conhecidos na técnica; por exemplo, ver (Sternberger, L.A. et al., J. Histochem. Cytochem. 18: 315, 1970; Bayer, E.A. et al.,

Meth. Enzym. 62: 30 8, 1979; Engval, E. et al., Immunol. 109: 129, 1972; Goding, J.W., J. Immunol. Meth. 13: 215, 1976) . O presente invento contempla a utilização de anticorpos "nus" anti-M-CSF e anti-M-CSFR, bem como a utilização de imunoconjugados. A produção de imunoconju-gados é descrita na Patente U.S. N°. 6306393. Os imuno conjugados podem ser preparados conjugando indirectamente um agente terapêutico com um componente anticorpo. Técnicas gerais são descritas em Shih et al., Int. J. Câncer 41: 832-839, 1988; Shih et al., Int. J. Câncer 46: 1101-1106, 1990; e Shih et al. Pat. U.S. N°. 5057313. O método geral envolve a reacção de um componente anticorpo possuindo uma porção hidrato de carbono oxidada com um polímero transportador que tenha pelo menos uma função amina livre e que seja carregado com uma pluralidade de fármacos, toxinas, quelantes, parcelas de boro ou outro agente terapêutico. Esta reacção resulta numa ligação de bases de Schiff (imina) inicial, que pode ser estabilizada através de redução numa amina secundária para formar o conjugado final. O polímero transportador é de preferência um aminodextrano ou polipéptido com pelo menos 50 resíduos de 146 ΡΕ1572106 aminoácidos, embora possam também ser utilizados outros transportadores poliméricos substancialmente equivalentes. De preferência, o imunoconjugado final é solúvel numa solução aquosa, tal como soro de mamifero, para facilidade de administração e direccionamento eficaz para utilização em terapia. Assim, as funções de solubilização no polímero transportador aumentarão a solubilidade sérica do imunoconjugado final. Em particular, será preferido um aminodex-trano. 0 processo para preparação de um imunoconjugado com um transportador de aminodextrano começa tipicamente com um polímero de dextrano, vantajosamente um dextrano de peso molecular médio de cerca de 10000-100000. O dextrano é feito reagir com um agente oxidante para efectuar uma oxidação controlada de uma porção dos seus anéis de hidrato de carbono para gerar grupos aldeído. A oxidação é convenientemente efectuada com reagentes químicos glicolíticos tais como NaI04, de acordo com procedimentos convencionais. 0 dextrano oxidado reage então com uma poliamina, de preferência uma diamina, e de preferência, uma mono- ou poli-hidroxidiamina. Aminas adequadas incluem etilenodi-amina, propilenodiamina ou outras polimetilenodiaminas semelhantes, dietilenotriamina ou poliaminas semelhantes, 1,3-diamino-2-hidroxipropano ou outras diaminas hidroxila-das semelhantes ou poliaminas, e semelhantes. É utilizado um excesso da amina relativamente aos grupos aldeído do dextrano para assegurar uma conversão substancialmente completa das funções aldeído em grupos de bases de Schiff. 147 ΡΕ1572106 É utilizado um agente redutor, tal como NaBH4, NaBH3CN ou semelhante, para efectuar uma estabilização redutora da base de Schiff intermediária resultante. 0 aducto resultante pode ser purificado através de passagem por uma coluna de separação de tamanhos convencional para remover dextranos reticulados.

Podem também ser utilizados outros métodos convencionais de derivação de um dextrano para introduzir funções amina, e.g., reacção com brometo de cianogénio, seguida de reacção com uma diamina. 0 aminodextrano é então feito reagir com um derivado do fármaco particular, toxina, quelante, imunomo-dulador, parcela de boro, ou outro agente terapêutico a carregar, numa forma activada, de preferência, um derivado com carboxilo activado, preparado através de meios convencionais, e.g., utilizando diciclo-hexilcarbodiimida (DCC) ou uma variante deste solúvel em água, para formar um aducto intermédio.

Alternativamente, toxinas polipeptidicas tais como a proteína antiviral de Phytolacca ou a cadeia A do rícino e semelhantes, podem ser ligadas a aminodextrano através de condensação com glutaraldeído ou através de reacção de grupos carboxilo activados na proteína com aminas no aminodextrano. 148 ΡΕ1572106

Os quelantes para radiometais ou estimuladores de ressonância magnética são bem conhecidos na técnica. São típicos os derivados de ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA) e ácido dietilenotriaminapentaacético (DTPA). Estes quelantes possuem tipicamente grupos na cadeia lateral através dos quais o quelante pode ser unido a um transportador. Tais grupos incluem, e.g., benzilisotiocianato, através do qual o DTPA ou EDTA pode ser ligado ao grupo amina de um transportador. Alternativamente, os grupos carboxilo ou amina num quelante podem ser ligados a um transportador através de activação ou derivação prévia e depois ligação, todos através de meios bem conhecidos.

Parcelas de boro, tais como carboranos, podem ser ligadas a componentes anticorpos através de métodos convencionais. Por exemplo, os carboranos podem ser preparados com funções carboxilo em cadeias laterais pendentes, tal como é bem conhecido na técnica. A ligação de tais carboranos a um transportador, e.g., aminodextrano, pode ser alcançada através de activação dos grupos carboxilo dos carboranos e condensação com aminas no transportador para produzir um conjugado intermédio. Tais conjugados são então ligados aos componentes anticorpo para produzir imunoconjugados terapeuticamente úteis, tal como descrito abaixo.

Pode ser utilizado um transportador polipeptídico em vez de aminodextrano, mas o transportador polipeptídico deve ter pelo menos 50 resíduos de aminoácidos na cadeia, 149 ΡΕ1572106 de preferência 100-5000 resíduos de aminoácidos. Pelo menos alguns dos aminoácidos devem ser resíduos de lisina ou resíduos de glutamato ou aspartato. As aminas pendentes dos resíduos de lisina e os carboxilatos pendentes de glutamina e aspartato são convenientes para ligar um fármaco, toxina, imunomodulador, quelante, parcelas de boro ou outro agente terapêutico. Exemplos de transportadores polipeptídicos adequados incluem polilisina, ácido poliglutâmico, ácido poliaspártico, co-polímeros destes e polímeros mistos destes aminoácidos e outros, e.g., serinas, para conferir propriedades de solubilidade desejáveis ao transportador carregado resultante e ao imunoconjugado. A conjugação do conjugado intermédio com o componente anticorpo é realizada através de oxidação da porção hidrato de carbono do componente anticorpo e reacção dos carbonilos do aldeído (e cetona) resultantes com grupos amina que permanecem no transportador após carregamento com um fármaco, toxina, quelante, imunomodulador, parcela de boro ou outro agente terapêutico. Alternativamente, um conjugado intermédio pode ser ligado a um componente anticorpo oxidado através de grupos amina que foram introduzidos no conjugado intermédio após carregamento com o agente terapêutico. A oxidação é convenientemente realizada quimicamente, e.g., com NaI04 ou outro reagente glicolítico, ou enzimaticamente, e.g., com neuraminidase e galactose-oxidase. No caso de um transportador de amino-dextrano, nem todas as aminas do aminodextrano são tipicamente utilizadas para carregamento de um agente 150 ΡΕ1572106 terapêutico. As aminas restantes do aminodextrano condensam com o componente anticorpo oxidado para formar aductos de bases de Schiff, que são então estabilizados com redução, normalmente com um agente redutor de boro-hidreto.

Procedimentos análogos são utilizados para produzir outros imunoconjugados de acordo com o invento. Os transportadores polipeptídicos carregados têm de preferência residuos de lisina livres restantes para condensação com a porção hidrato de carbono oxidada de um componente anticorpo. Os carboxilos no transportador polipeptidico podem, se necessário, ser convertidos em aminas através, e.g., de activação com DCC e reacção com um excesso de uma diamina. O imunoconjugado final é purificado utilizando técnicas convencionais, tais como cromatografia de separação de tamanhos em Sephacryl S-300 ou cromatografia de afinidade utilizando um ou mais epitopos CD84Hy.

Alternativamente, os imunoconjugados podem ser preparados através de conjugação directa de um componente anticorpo com um agente terapêutico. O procedimento geral é análogo ao método indirecto de conjugação excepto que um agente terapêutico é ligado directamente a um componente anticorpo oxidado.

Será apreciado que outros agentes terapêuticos podem substituir os quelantes aqui descritos. Os peritos na 151 ΡΕ1572106 técnica serão capazes de conceber esquemas de conjugação sem demasiada experimentação.

Como outra ilustração, um agente terapêutico pode ser ligado à região charneira de um componente anticorpo reduzido através da formação de uma ligação dissulfureto. Por exemplo, os péptidos toxóides do tétano podem ser construídos com um único resíduo de cisteína que é utilizado para ligar o péptido a um componente anticorpo. Como alternativa, tais péptidos podem ser ligados ao componente anticorpo utilizando um reticulador heterobifuncional, tal como N-succinil-3-(2- piridilditio)proprionato (SPDP). Yu et ai., Int. J. Câncer 56: 244, 1994. Técnicas gerais para tal conjugação são bem conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Wong, "Chemistry Of Protein Conjugation and Cross-Linking" (CRC Press 1991); Upeslacis et al., "Modification of Antibodies by Chemical Methods", em "Monoclonal Antibodies: Principies and Applications", Birch et al. (eds.), páginas 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995); Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies", em "Monoclonal Antibodies: Production, Enineering and Clinicai Application", Ritter et al. (eds.), páginas 60-84 (Cambridge University Press 1995).

Tal como descrito acima, porções hidrato de carbono na região Fc de um anticorpo podem ser utilizadas para conjugar um agente terapêutico. No entanto, a região Fc pode estar ausente se for utilizado um fragmento de anticorpo como componente anticorpo do imunoconjugado. 152 ΡΕ1572106

Contudo, é possível introduzir uma porção hidrato de carbono na região variável da cadeia leve de um anticorpo ou fragmento de anticorpo. Ver, por exemplo, Leung et ai., J. Immunol. 154: 5919, 1995; Hansen et ai., Pat. U.S. N°. 5443953. A porção hidrato de carbono modificada é então utilizada para ligar um agente terapêutico.

Adicionalmente, os peritos na técnica reconhecerão numerosas variações possíveis dos métodos de conjugação. Por exemplo, a porção hidrato de carbono pode ser utilizada para ligar polietilenoglicol para prolongar a semi-vida de um anticorpo intacto, ou fragmento de ligação ao antigénio deste, no sangue, linfa ou outros fluidos extracelulares. Para além disso, é possível construir um "imunoconjugado bivalente" ligando agentes terapêuticos a uma porção hidrato de carbono e a um grupo sulfidrilo livre. Um tal grupo sulfidrilo livre pode estar localizado na região charneira do componente anticorpo.

Proteínas de Fusão de Anticorpo Anti-M-CSF e Anti-M-CSFR 0 presente invento contempla a utilização de proteínas de fusão compreendendo uma ou mais porções anticorpo anti-M-CSF e anti-M-CSFR e uma porção imunomo-dulador ou toxina. Os métodos de produção de proteínas de fusão de anticorpos são bem conhecidos na técnica. Ver, e.g., Patente U.S. N°. 6306393. Proteínas de fusão de anticorpos compreendendo uma porção interleucina-2 são 153 ΡΕ1572106 descritas por Boleti et al., Ann. Oncol. 6: 945, 1995, Nicolet et al., Câncer Gene Ther. 2: 161, 1995, Becker et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 93: 7826, 1996, Hank et al., Clin. Câncer Res. 2: 1951, 1996, e Hu et al., Câncer Res. 56: 4998, 1996. Adicionalmente, Yang et al., Hum. Antibodies Hybridomas 6: 129, 1995, descrevem uma proteína de fusão que inclui um fragmento F(ab')2 e uma porção factor de necrose tumoral alfa.

Os métodos de produção de proteínas de fusão anticorpo-toxina nas quais uma molécula recombinante compreende um ou mais componentes anticorpo e uma toxina ou agente quimioterapêutico são também conhecidos dos peritos na técnica. Por exemplo, proteínas de fusão anticorpo-exotoxina A de Pseudomonas foram descritas por Chaudhary et al., Nature 339: 394, 1989, Brinkmann et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 8616, 1991, Batra et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 5867, 1992, Friedman et al., J. Immunol. 150: 3054, 1993, Wels et al., Int. J. Can . 60: 137, 1995,

Fominaya et al., J. Biol. Chem. 271: 10560, 1996, Kuan et al., Biochemistry 35: 2872, 1996, e Schmidt et al., Int. J. Can. 65: 538, 1996. Proteínas de fusão anticorpo-toxina contendo uma porção toxina da difteria foram descritas por Kreitman et al., Leucemia 7: 553, 1993, Nicholls et al., J. Biol. Chem. 268: 5302, 1993, Thomson et al., J. Biol. Chem. 270: 28037, 1995, e Vallera et al., Blood 88: 2342, 1996. Deonarain et al., Tumor Targeting 1: 177, 1995, descreveram uma proteína de fusão anticorpo-toxina possuindo uma porção ARNase, enquanto Linardou et al., Cell Biophys. 24-25: 243, 154 ΡΕ1572106 1994, produziram uma proteína de fusão anticorpo-toxina compreendendo um componente ADNase I. Foi utilizada gelonina como porção toxina na proteína de fusão anticorpo-toxina de Wang et al., "Abstracts of the 209th ACS National Meeting, Anaheim, Calif.", Abr. 2-6, 1995, Parte 1, BIOT005. Como outro exemplo, Dohlsten et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91: 8945, 1994, relataram uma proteína de fusão anticorpo-toxina compreendendo enterotoxina A de Estafilococos.

Toxinas ilustrativas que são adequadamente empregues na preparação de tais conjugados são rícino, abrina, ribonuclease, ADNase I, enterotoxina A de Estafilococos, proteína antiviral de Phytolacca, gelonina, toxina da difteria, exotoxina de Pseudomonas, e endotoxina de Pseudomonas. Ver, por exemplo, Pastan et al., Cell 47: 641, 1986, e Goldenberg, CA-A Câncer Journal for Clinicians 44: 43, 1994. Outras toxinas adequadas são conhecidas dos peritos na técnica. 0 invento é ilustrado através dos seguintes exemplos, que não se pretende que sejam de modo algum limitantes.

EXEMPLOS EXEMPLO 1

Este exemplo mostra que linhas celulares de 155 ΡΕ1572106 cancro da mama altamente metastáticas expressam elevados níveis de M-CSF. Utilizando microarrays, a expressão génica de M-CSF pela linha celular altamente metastática, MDA 231, foi comparada com a das linhas celulares MCF7 e ZR751. Houve um aumento de 6, 9 vezes quando o nível de expressão de M-CSF em MDA 231 foi comparado com o de MCF7, e um aumento de 5,2 vezes quando o nível de expressão de M-CSF em MDA 231 foi comparado com o de ZR751. EXEMPLO 2

Este exemplo mostra que o M-CSF purificado pode ser substituído por meio condicionado (MC) da linha celular metastática MDA 231 mas não da linha celular MCF7 em ensaios in vitro da formação de osteoclastos (Figura 3). A produção de meio condicionado (MC): células MDA 231 ou MCF7 foram plaqueadas a uma densidade de lxlO6 células/caixa de 10 cm em 8 ml de DMEM a 50%/F12 de HAM a 50% contendo ITS lx, (BD BioSciences, Lexington, Ky) , um suplemento de cultura contendo insulina, transferrina humana e ácido selenioso. Após 48 horas de incubação a 37°C em CO2 a 5%, os meios foram colhidos e centrifugados durante 10 minutos a 1500 RPM para remover quaisquer células suspensas. O sobrenadante foi colhido, filtrado através de um filtro de 0,2 nM e utilizado como MC.

Ensaio de osteoclastos: Células CD34+ da medula óssea foram plaqueadas a uma densidade de 15000 células/96 156 ΡΕ1572106 poços em 100 μΐ de MEM Alfa contendo FCS a 10%, Pen/Estrep 1χ e fungizona lx. No dia seguinte, foram removidos 50 μΐ de meio de cada poço e foram substituídos com 25 μΐ de meio MEM Alfa e 75 μΐ de MC ou DMEM a 50%/F12 de HAM a 50% contendo ITS lx. RANKL foi adicionado a cada poço a uma concentração final de 100 ng/ml e foi adicionado M-CSF a 30 ng/ml aos poços apropriados. As células foram incubadas a 37°C em CO2 a 5% durante 11 dias. Durante esse tempo foi adicionado RANKL fresco novamente após 6 dias. Após 11 dias as células foram fixadas e coradas para fosfatase ácida resistente a tartrato utilizando o estojo de fosfatase ácida de Leucócitos de Sigma.

Resultados: Tal como mostrado na Figura 3, o M-CSF purificado pode ser substituído por meio condicionado (MC) da linha celular metastática MDA 231 mas não da linha celular MCF7 em ensaios in vitro de formação de osteoclastos. EXEMPLO 3

Este exemplo mostra que a indução de osteoclastos por MC de MDA 231 é neutralizada por anticorpos para M-CSF (Figura 4). Células CD34+ da medula óssea foram plaqueadas tal como descrito no Exemplo 2. No dia seguinte foram removidos 50 μΐ de meio de cada poço. Foram adicionados a cada poço 25 μΐ de anticorpo 5H4 6x ou MEM Alfa seguido de 157 ΡΕ1572106 75 μΐ de MC ou DMEM a 50%/F12 de HAM a 50% contendo ITS lx ou meio MEM alfa. Foi adicionado a todos os poços RANKL a

100 ng/ml, e foi adicionado a metade dos poços M-CSF a 30 ng/ml. As células foram incubadas a 37 °C em C02 a 5% durante 11 dias. Durante esse tempo foi adicionado RANKL fresco novamente após 6 dias. Após 11 dias, as células foram fixadas e coradas para fosfatase ácida resistente a tartrato utilizando o estojo de fosfatase ácida de Leucócitos de Sigma.

Tal como mostrado na Figura 4, a indução de osteoclastos por MC de MDA 231 é neutralizada por anticorpos para M-CSF. EXEMPLO 4

Este exemplo mostra actividade neutralizante de um anticorpo monoclonal 5H4 (N°. de Entrada American Type

Culture Collection HB10027) e outros anticorpos contra M-CSF humano (Figura 5) .

Para medir a capacidade neutralizante dos anticorpos contra a actividade do M-CSF humano em células M NFS 60 de murideo (N°. de Entrada American Type Culture Collection CRL-1838, disponível em ATCC em Rockville, MD, USA, derivada de uma leucemia mielogenosa induzida com o retrovirus ecotrópico de ratinho selvagem Cas-Br-MuLV, que responde a interleucina 3 e M-CSF e que contém um proto- 158 ΡΕ1572106 oncogene c-myb truncado devido à integração de um retrovirus), CSF-1 humano recombinante (a uma concentração final de 10 ng/ml) foi incubado com várias concentrações de anticorpos durante 1 hora a 37°C em C02 a 5% numa incubadora. Após a incubação, a mistura foi adicionada à cultura de M NFS 60 em placas de microtitulação de 96 poços. O volume total do ensaio por poço foi de 100 μΐ, com rhM-CSF a 10 ng/ml, a concentração de anticorpo indicada de acordo com a Figura 5, e a densidade celular a 5000 células/poço. Após 72 horas de cultura numa incubadora de C02 a 37°C, a proliferação celular foi ensaiada através do Estojo CellTiter Glo (Promega). Todos os anticorpos foram criados contra M-CSF humano. Anogen refere-se ao produto de Anogen n° de catálogo #MO C40048. Um clone 116; Antigenix refere-se ao clone Ml6 produto de Antigenix America n° de catálogo #MC600520; e R&D refere-se ao produto de R&D Systems n° de catálogo #Mab216.

Tal como mostrado na Figura 5, a proliferação celular foi mais afectada pelo tratamento com o anticorpo 5H4 versus Anogen e Antigenix. EXEMPLO 5

Este exemplo mostra que os anticorpos anti-M-CSF são altamente eficazes na prevenção de doença osteolitica grave associada a metástase de cancro. 159 ΡΕ1572106

Desenho Experimental. Para avaliar a eficácia dos anticorpos de M-CSF como um agente terapêutico para o tratamento de osteólise, a linha celular de cancro da mama humana altamente metastática MDA-231 (3χ105) foi injectada na cavidade de medula óssea da tibia de ratinhos nus fêmea. Os ratinhos tinham uma idade de 4-7 semanas e tinham um peso médio de ~20 g. Os ratinhos foram enviados para identificação e sofreram um periodo de aclimatação de pelo menos 7 dias até ao inicio do estudo de 8 semanas.

Os ratinhos receberam uma dose total de 1,5 mpk (0,03 mg por ratinho) de Buprenorfina subcutaneamente em ambos os flancos 30 minutos antes da injecção intra-tibia. Os ratinhos foram anestesiados através de inalação de isoflurano e a pata posterior direita foi limpa com etanol a 70%. Células tumorais (MDA-MB-231-luc, 3χ105) suspensas em 10 μΐ de solução salina foram injectadas na cavidade de medula óssea da tibia direita utilizando uma micro-seringa de 50 ou 100 μΐ.

Para tratamento de anticorpo, os grupos foram escolhidos como se segue: 1. IgGl de murideo de controlo do isotipo 2. IgGl de murideo anti-MCSF humano 5H4 3. controlo do monoclonal de rato (TBD) 4. IgGl de rato anti-MCSF de ratinho 5A1 5. 5H4 + 5A1 (duplo tratamento) 6. controlos de isotipo de murideo + rato (duplo controlo) (sem grupo de controlo de PBS) 160 ΡΕ1572106

Dosagem. O tratamento com anticorpo começou no dia seguinte à injecção das células tumorais. Para os anticorpos IgGl de murideo de controlo do isotipo, IgGl de murideo anti-MCSF humano 5H4, controlo do monoclonal de rato e IgGl de rato anti-MCSF de ratinho 5A1 (Lokeshwar, B.L., Lin, H.S., J. Immunol. 15: 141(2): 483-8, 1988, 10 mg/kg de anticorpo foram administrados uma vez por semana. Para o grupo de tratamento de combinação (5H4 + 5A1, controlos do isotipo de murideo + rato), foram administrados 10 mg/kg de cada anticorpo (i.e., não misturados) uma vez por semana em injecções separadas de modo a que os ratinhos nestes grupos de tratamento recebessem 2 injecções por semana.

As soluções de dosagem foram proporcionadas a uma concentração pré-diluída (= 2 mg/ml) de modo a que 100 μΐ injectados IP darão uma dose alvo para um ratinho de 20 gramas (= 200 yg) . Para ajustamento do peso, o volume injectado foi aumentado ou diminuído em 5 μΐ por grama de diferença de peso. Por exemplo, um ratinho de 23 gramas recebeu 115 μΐ, enquanto um ratinho de 18 gramas recebeu 90 μΐ.

Medições. Para avaliar a gravidade da osteólise entre os vários grupos de tratamento, cada ratinho recebeu uma imagem Faxitron de limiar tomada no dia a seguir à injecção de células tumorais. Foi tomada uma imagem 161 ΡΕ1572106

Faxitron no final do estudo (8 semanas). 0 crescimento tumoral foi simultaneamente medido utilizando o sistema Xenogen uma vez que as células tumorais expressavam estavelmente luciferase.

Resultados. Tal como mostrado na Figura 6, o número de animais com um registo médio de osteólise >2,5 foi mais baixo no grupo que recebeu a combinação de anticorpos 5A1 + 5H4. Os danos ósseos osteoliticos foram avaliados numa escala de 0-4, com 0 igual a ausência de danos ósseos; 1-2 igual a algum dano ósseo, tal que os registos de 2,25 ou mais eram indicativos de danos ósseos graves. Os dados indicaram que o M-CSF produzido pelo ratinho (i.e., hospedeiro) tinham um maior impacto na osteólise que o M-CSF produzido pelas células tumorais (comparar 5H4 com 5A1 individualmente e em combinação). EXEMPLO 6 O estudo descrito no Exemplo 5 acima foi repetido essencialmente tal como descrito com uma excepção no desenho experimental. Para este estudo, o tratamento de anticorpo não começou senão 2 semanas após a inoculação do tumor. Radiogramas das patas traseiras foram tomados um dia após a inoculação do tumor para obtenção da imagem do limiar e verificação de fractura óssea causada pela injecção. Mais, no dia 14 após inoculação do tumor, os 162 ΡΕ1572106 ratinhos foram visualizados através do sistema Xenogen IVIS para quantificar a emissão de fotões de luz fluorescente pelas células tumorais.

Foram escolhidos sessenta ratinhos com uma quantidade semelhante de sinal de fotões na tibia. Os ratinhos com sinais peitorais (metástases pulmonares artificiais) foram excluidos deste estudo. Os ratinhos seleccionados foram agrupados aleatoriamente nos 6 grupos de tratamento descritos e foram-lhes administrados tratamentos de anticorpo tal como descrito no Exemplo 5. A emissão de fotões foi monitorizada continuamente uma vez por semana ao longo do estudo. Desde a 5a semana após inoculação do tumor, foram também tomados radiogramas uma vez por semana para avaliar o crescimento tumoral no osso.

Tal como mostrado na Figura 7, o número de animais com um registo médio de osteólise h2,5 foi mais baixo no grupo que recebeu a combinação de anticorpos 5A1 + 5H4. 0 dano ósseo osteolitico foi avaliado numa escala de 0-4, com 0 igual a ausência de danos ósseos; 1-2 igual a algum dano ósseo, tal que os registos de 2,25 ou mais eram indicativos de danos ósseos graves. Os dados indicaram que o M-CSF produzido pelo ratinho (i.e., hospedeiro) tinha um maior impacto na osteólise que o M-CSF produzido pelas células tumorais (comparar 5H4 com 5A1 individualmente e em combinação). ΡΕ1572106 163 EXEMPLO 7

Este exemplo expõe um procedimento para a avaliação da actividade anti-cancro do anticorpo monoclonal anti-M-CSF num modelo SW620 subcutâneo. Os Exemplos 5 e 6 acima mostraram que o tratamento de anticorpo monoclonal anti-M-CSF inibiu significativamente o crescimento tumoral na medula óssea. 0 objectivo deste estudo é avaliar se o anticorpo pode também inibir o crescimento tumoral em tecido mole.

Serão utilizados para este estudo ratinhos nu/nu fêmea com 10 semanas de idade, peso médio de 20 g. Os ratinhos sofrerão um período de aclimatação de pelo menos 7 dias antes do início do estudo. No dia 0, o flanco direito dos ratinhos nus será injectado com células de cancro do cólon humano SW620 subcutaneamente a 5><106 células por ratinho por 100 μΐ. Quando o volume tumoral atinge 100-200 mm3 (habitualmente 1 semana após a inoculação do tumor), os ratinhos serão distribuídos aleatoriamente por 5 grupos a 10 ratinhos por grupo como se segue:

1) PBS 2) 5H4 3) 5A1 4) Ac de controlo do isotipo mlgGl+rlgGl 5) 5A1+5H4.

Os ratinhos serão tratados intraperitonealmente com os anticorpos designados a 10 mpk uma vez por semana 164 ΡΕ1572106 durante 4 semanas. Quando o volume tumoral atingir 2000 mm3, o estudo será terminado. Alternativamente, os animais serão também sujeitos a eutanásia quando se verificar qualquer uma das seguintes situações: a ulceração da superfície do tumor ser maior de 30% da área total de superfície do tumor, perda de peso corporal significativa (>20%), desidratação e estado moribundo. O sangue completo será colhido a partir de todos os ratinhos e a população de monócitos será analisada como um potencial marcador substituto. O crescimento/tamanho do tumor será medido através de análise 2D. As medições da largura e comprimento do tumor serão utilizadas para calcular o volume tumoral. Espera-se que o crescimento tumoral em tecido mole seja inibido em resultado da experiência antecedente. EXEMPLO 8 O seguinte exemplo expõe um procedimento para a avaliação da terapia de combinação para o tratamento e prevenção de doença osteolitica grave associada a metástase de cancro.

Desenho Experimental. O estudo descrito no Exemplo 5 acima é repetido essencialmente tal como descrito com as seguintes excepções. Para além do anticorpo ou combinação de anticorpos expostos nos grupos de tratamento abaixo, os animais receberão um dos seguintes tratamentos adicionais: 165 ΡΕ1572106 1. Bisfosfonato (e.g., Aredia; Zometa; Clodronato). 2. Cirurgia 3. Radiação 4. Quimioterapia 5. Terapia hormonal (e.g., Tamoxifeno; terapia anti-Androgénios) 6. Terapia de anticorpos (e.g., anticorpos neutralizantes de RANKL/RANK; anticorpo neutralizante de PTHrP) 7. Terapia de proteínas terapêuticas (e.g., receptor de RANKL solúvel; OPG, e inibidores de MMP) 8. Terapia de fármacos de molécula pequena (e.g., inibidor de Src-cinase) 9. Terapia de oligonucleótidos (e.g., Anti- sentido de RANKL ou RANK ou PTHrP) 10. Terapia génica (e.g., inibidores de RANKL ou RANK) 11. Terapia de péptidos (e.g., muteinas de RANKL).

Os grupos de tratamento são como se segue. Os tratamentos adicionais acima são indicados abaixo como "mais terapia X":

1. apenas PBS

2. Tratamento apenas com terapia X 3. IgGl de rato de controlo do isotipo ΡΕ1572106 166 4 . 5. 6. 7 . de controlo do 8. 9. terapia X 10 . terapia X 11. 12 . terapia X 13. de controlo do 14 .

IgGl de murídeo de controlo do isotipo apenas anti-MCSF humano 5H4 apenas IgGl de rato anti-MCSF de ratinho 5A1 Combinação de IgGl de rato e IgGl de ratinho isotipo

Combinação de 5H4 e 5A1

IgGl de rato de controlo do isotipo mais

IgGl de murideo de controlo do isotipo mais

anti-MCSF humano 5H4 mais terapia X

IgGl de rato anti-MCSF de ratinho 5A1 mais

Combinação de IgGl de rato e IgGl de murideo isotipo mais terapia X

Combinação de 5H4 e 5A1 mais terapia X.

Dosagem: são utilizados 0,1-30 mg/kg de cada anticorpo para administração a cada animal. A dosagem preferida é de 10 mg/kg. A via de administração pode ser IV, IP, SC. A via preferida é IP. O tratamento começará no dia seguinte à injecção das células tumorais, tal como descrito no Exemplo 5, acima.

Medições. Para avaliar a gravidade da osteólise entre os vários grupos de tratamento, cada ratinho recebe uma imagem Faxitron de limiar tomada no dia seguinte à 167 ΡΕ1572106 injecção de células tumorais. Uma imagem Faxitron é também tomada no final do estudo (8 semanas). 0 crescimento tumoral é simultaneamente medido utilizando o sistema Xenogen uma vez que as células tumorais expressam estavelmente luciferase. Espera-se que a terapia de combinação para o tratamento e prevenção de doença osteolitica grave associada a metástase de cancro seja melhor relativamente à terapia de anticorpos sozinha. EXEMPLO 9 0 seguinte exemplo proporciona um protocolo para avaliação da capacidade de anticorpos específicos de M-CSF para se ligarem, por exemplo, a células de cancro da mama (linha celular MDA231) ou células de cancro mieloma múltiplo (linha celular ARH77) utilizando um separador de células activado com fluorescência.

As células foram primeiro lavadas duas vezes com PBS (sem Ca2+, Mg2+) . Para cada placa de 10 cm, foram adicionados 2 ml de EDTA 3 mM, e as placas foram incubadas a 37°C durante 2-3 minutos, até as células estarem redondas e começarem a desprenderem-se da caixa. Depois, foram adicionados e misturados 10 ml de tampão A (PBS + FBS a 5%). Nesse momento, as células foram sedimentadas e ressuspensas a cerca de 5><106 células/ml em PBS + FBS a 5%, e as células foram colocadas em tubos a 100 μΐ/amostra. 168 ΡΕ1572106

Nesse ponto, foram adicionados 0,1-10 yg/ml do anticorpo primário (utilizado na concentração indicada de anticorpo de M-CSF ou anticorpo de controlo). A diluição, se necessário, era feita em FBS/PBS a 5%. A mistura foi então incubada durante 30 min a 4°C. Após o período de incubação, as células foram lavadas 3 vezes através de centrifugação a 400 g durante 5 min e as células foram ressuspensas em PBS. O anticorpo anti-IgG marcado com FITC ou PE (0,25 yg/amostra) foi diluído em BSA/PBS a 1% na diluição óptima, e as células foram ressuspensas nesta solução e incubadas durante 30 min a 4°C. Depois, as células foram lavadas 3 vezes tal como descrito acima. Após as lavagens celulares, as células foram ressuspensas com PI-PBS a 0,5 ml/amostra (se necessário para distinguir as células mortas das vivas). As células podem também ser fixadas para posterior análise (as células podem durar cerca de 3 dias se foram fixadas com formaldeído a 0,1%). As células foram depois analisadas num FACS activado com fluorescência utilizando procedimentos padrão.

Tal como mostrado na Figura 8A e 8B, um anticorpo específico de MCSF ligou-se à linha celular de cancro da mama MDA231 ou à linha celular de mieloma múltiplo ARH77 a uma variedade de concentrações de anticorpo tal como indicado. 169 ΡΕ1572106 EXEMPLO 10 O seguinte exemplo mostra que M-CSF é prevalente num grande número de superfícies celulares de cancro. Coloração imuno-histoquímica de M-CSF foi realizada utilizando um anticorpo específico de M-CSF como se segue.

Inicialmente as lâminas foram aquecidas num forno a 55-60°C durante 1 hora e deixadas arrefecer durante 2-3 minutos. Foram utilizados os seguintes parâmetros de desparafinagem e re-hidratação: a. Xileno 3x5 minutos b. Álcool Reagente a 100% 2x5 minutos c. Álcool Reagente a 95% 2x4 minutos d. Álcool Reagente a 75% 2x3 minutos e. Álcool Reagente a 50% 1x3 minutos g· dl H20 2-3 enxaguamentos rápidos.

Antes do passo de bloqueio com peróxido, a recuperação do antigénio foi preparada utilizando Biogenex Citra Plus 1*. A solução foi inicialmente sujeita a microondas na potência máxima para ferver. Uma vez fervida a solução o micro-ondas foi rapidamente regulado para mais 13 min no nível 2 de potência e deixou-se arrefecer antes de continuar. 0 passo de bloqueio de peróxido foi efectuado como se segue. As lâminas foram imersas em H2O2 a 3% (25 ml a 30% em 250 ml de dl H20) e colocadas à temperatura ambiente durante 10 minutos. As lâminas foram enxaguadas 2χ com dl H2O, e lavadas com PBS 1* 2x2 minutos. 170 ΡΕ1572106 O procedimento de bloqueio avidina/biotina foi efectuado como se segue. As lâminas foram colocadas deitadas num suporte metálico. Foi utilizada uma caneta Blue PAP (marcador hidrófobo de lâminas) em torno do tecido. Depois, foram adicionadas 2 gotas de Avidina Zymed (Reagente A) - suficientes para cobrir o tecido - e as lâminas foram incubadas à temperatura ambiente durante 10 min. Após a incubação, as lâminas foram lavadas como se segue: lavagens de 2x3 minutos em PBS 1χ; 2 gotas de

Biotina Zymed (Reagente B), temperatura ambiente durante 10 min; lavagens 2x3 minutos em PBS lx. 0 procedimento de bloqueio de proteínas foi efectuado como se segue. Primeiro, foi adicionado soro a 10% (até uma concentração final de 2%) da espécie de anticorpo secundário. O Power Block de BioGenex foi depois diluído até lx com dl H20. O suporte de lâminas foi imerso em Power Block durante 8 min à temperatura ambiente, e as lâminas foram enxaguadas 2χ em PBS lx.

Para a adição de anticorpo secundário, as lâminas foram colocadas deitadas num suporte metálico. O anticorpo foi adicionado para cobrir cada secção ( — 350 μΐ) , e o anticorpo foi espalhado com a ponta de pipeta (se necessário) sem raspar o tecido. As lâminas foram então incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente. Após a incubação, as lâminas foram lavadas 3χ com PBS lx 3-5 minutos de cada vez. Neste ponto, foi aplicado às secções 171 ΡΕ1572106

Multi-Link de BioGenex e incubou-se durante 10-11 minutos à temperatura ambiente. As secções foram então lavadas 3 minutos de cada vez. A marcação foi efectuada através da aplicação de Marcador HRP de BioGenex às secções, que foram então incubadas à temperatura ambiente durante 10-11 min e lavadas com PBS 1χ 3><3 minutos. Depois, foi adicionado às secções substrato de H2O2 de BioGenex (1 gota de AEC para cada 2,5 ml de H202) e incubou-se à temperatura ambiente durante 10 min. As secções foram então enxaguadas várias vezes com dl H20. O passo de contrastação foi efectuado como se segue. As secções foram coradas com hematoxilina durante 1 minuto à temperatura ambiente. Depois, as secções foram enxaguadas com H2O duas vezes, e depois incubou-se em PBS lx durante 1 minuto. As secções foram então enxaguadas bem com H2O para remover o PBS. As secções foram montadas através da aplicação de uma gota de Super Mount de BioGenex na secção e depois secagem ao ar de um dia para o outro à temperatura ambiente.

Tal como mostrado na Figura 9, o M-CSF é prevalente em várias superfícies de células de cancro. As secções para os tipos de células de cancro indicados foram registadas como se segue: 0 Sem coloração; 1 Coloração semelhante ao fundo; 2 Coloração positiva mas fraca; 3 Coloração positiva e significativa; 4 Coloração positiva e forte. 172 ΡΕ1572106 LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS <110> Zimmerman, et al.

<12 0> MÉTODOS PARA PREVENÇÃO E TRATAMENTO DE METÁSTASE DE CANCRO E

PERDA ÓSSEA ASSOCIADA A METÁSTASE DE CANCRO

<130> 27527/39636A <150> US 60/426,781 <151> 2002-11-15 <160> 8 <170> Patentln versão 3.2

<210> 1 <211> 1855 <212> ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (190)..(960) <22 0> <221> sig_peptide <222> (190)..(285) <22 0> <221> mat_peptide <222> (286)..(957) <400> 1 gagggctgge cagtgaggct oggccegggg aaagtgaaâg tfcfcgectggg tcetctcggc 60 gçscagagçcg cfcct.ccgcah cecaggaoag cggfcgcggec ctcggccggg gegeacaefcc 120 cgcagcagcc agcgagcgag cgagcgageg agggcggccg acgcgaccgg ccgggaccca 160 gcfcgcecgfc atg acc gcg ccg ggc gcc gcc ggg cgc fcge coe cce aeg aca 231

Met Thr Ala Pro Gly Ma Ma Qly Arg Cys Pro Pro Thr Thr 15 10 tgg cfcg ggc tco ctg ctg ttg tfcg gtc fcgt ctc ctg age agg agt 279 Trp 15 Leu Gly Ser Leu Leu 20 Leu Leu Vai Cys Leu 2$ Leu Ala Ser Arg ser 30 ato acc gag gag gtg teg gag tac fcgt age cac atg att 933 agt gga 327 lie Thr Glu Glu vai 35 Ser Glu Tyr cys Ser 40 His Met Ile Gly Ser 45 Gly cac otg çag fcet ctg cag C33 ctg atfc gao agt cag atg gag acc teg 37S His Leu Gin Ser 50 Leu Oln Arg Leu Ile 55 Asp Ser Gin Met Glu 60 Thr Ser tgc caa afct aca ttt gag ttt gta gac cag gaa «ag ttg aaa gat cca 423 Cys Qln Ile 65 Tfar Phe Glu Phe Vai ?0 Gin Glu Gin Leu 7S Lys Asp pro gtg tgo tac cfcfc aag aag gca ttt ctc ctg gta caa gac ata atg 3«3 471 Vai Cys 80 Tyr lieu Lys Lys Ala 85 Phe Leu Leu Vai Gin 30 Aap Ile Met Glu 173 ΡΕ1572106 gse acc etg CSC! fctC gat «tftc acc ccc aat gee ate 0CC atfc gtg 519 Âsp fter ss M«fc Arg Rhs Asl-íj 100 Asp Aen The Sro Assa 103 Ala lie Ala lia Vai 110 cag ctg 0¾¾ 9** cfcc tct ttg *99 ctg aag age fcge tte aec aag gat SS7 Gin Leu Gin Glu L®tt xis Ssr It@u Arg Leu Lys 120 Ser cys Rfee T&r Lys 135 RSp isi gsa gâG eat gas aag gcq tgc gtc ega aefc tte tat gag a ca eet. 615 1¾¾1 Glu Gin His 130 &sp Gys Ala Cys Val X3S Arg Tkr PRe lyr GlU 140 Thr Pro etc «ag fefcg ctg 9m áág gtc aag mk gte fcfct aafc g&a aca aag aat 663 tey Gin. Leu 145 Leu ÕXU. Lys Val Lys ten 150 Val Phe Aen Gin 155 Thr Lys Asn etc ctt gac »3 gae tgg aafc atfc tfcc age aag a&c igc aac aae age ?ÍX Leu Leu 160 Asp XsyS ASp Trp As» 165 n«. ms Ser Lys Asn 120 Cys Asn Asn Ser ttfc get gaa (31¾ tgç tce age eaa gge cai g&g *99 c»3 tec 9*9 99* tcc 7SS Phe Ala 175 OyS Sar Ser 180 Gin Gly Ris Gl« Arg 185 Gin ser Glu Gly Ser ISO fccc age ccg esg etc cag gag fcct gfcc fcte cac ctg ctg gfcg çec agi 807 Ser Ser ?ro Gin L&u IS 5 Gin Glu sar val Phe 200 Ris Len Lan Val Pro Ser 205 gte ate efcg gte ttg ctg gee gfce gga 99« cfcc ttg tte tac *99 85 5 vai ii® liSU. Val 210 Leu 4&JL& Val· Gly 215 Gly Leu Le» mm Tyr 220 Arg Tirp age sgg egg age sat eaa S*9 ecfc eag aq.íi 9«g gat tet cee ttg 9*9 S»3 Arg Arg Arg 22.5 Ser· Ria Gin Glu Pro Gin 230 Arg Ala Aap Ser 23S Pro Leu Glu cias eca gag ggc age ccc ctg aefc cag gat gac aga cag Stg gaa ctg 9S1 Gin. pro 240 Giw S&y Ser Pro Lêu .24.S Usaf Gin Asp Aap Arsj -250 Gin Val Glu Leu cca, gtg tag agggasfcfccfc sagctggAGS èscàgascâg tetcteogfcg 1000

Pro Vai ass 99*99*9*«* ttatggggcg t ccaecaíica ecect cectg gccatoafeee tggaatgtgg 3.060 tetgecctcc accagagete ctgcctgcca ggaetggace agageageaa ggctggggec 1130 cctetgtctc aaccsgcaga cccttgacig aaigagagag gç.çagiaggât gctccGcat.g 2180 ctgccaetat itaifcgigag ccctggaggs tcccatgfcgç ttgaggaagg ctggtgagcc 1240 eggeteagga ccetetteec tcaggggctg eacceieçtc tcactccCtt ecatgeegga 1300 aseeaggGca gggasccaee ggcctgtggt t egtgggaaa gcagggtgga cgctgaggag 1360 tgaaagaacc etgcacccag agggeetgcc tggtgecaag gtatccoage ctag&caggc 1430 atggaectgt ctccagagag aggagcctga agfctcgtggg gcgggscagc gteggectga 14 ao tttccpgrtaa. aggtgtgcag cctgagagac. gggaagagga ggeetetgga cctgctggtc 1540 tgcactgaea gectgsaggg tctacaccct cggctcacet aagtgeeefcg tgctggttgc 1600 174 ΡΕ1572106 gccctgcect caggaectge cctctgcecc fccctccttcc cccctcatga aggaagcc&t cecgtccatc catgagccaa cngauctgcc agtgafcgcca agcacctgcc agagcttctc tgcactgtga acacfcgtacc cafcccgtccg tectccactc caggcgcaga ggggaggcca agagggggat caagcacfcgg caggaggcca agcagagget fcgcetgetga aeagcctgec tecagcctcfc cccca

1660 1720 1780 1840 X8SS <210 > 2

<211> 256 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Met Thr Ala Pro Gly Ala Ala Gly Arg Cys Pro Pro Thr Thr Trp Leu 25 10 15

Gly Ser Leu Leu Leu Leu Vai Cys Leu Leu Ala Ser Arg Ser Ile Thr . 20 25 30

Glu Slu Vai Ser <31 u Tyr Cys Ser Eia Met Ile Gly Ser Gly Hís Leu 35 40 45

Gin Ser Leu Gin Arg Leu lie Asp Ser Gin Met Glu Thr Ser Cys Gin 50 55 60

Ile Thr The Glu Phe Vai Asp Gin Glu Gin Leu Lys A»p Pro vai Cys 65 70 75 80

Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu Vai. Gin Asp Ile Met Glu Asp Thr 85 90 95

Met Arg Phe Arg Asp Asn Thr Pro Asn Ala lie Ala lie Vai Gin Leu 100 105 110

Gin Glu Leu Ser Leu Arq Leu Lys ser Cys Phe Thr Lys Asp Tyr Glu 115 220 125

Glu Hís Asp Lys Ala cye vai Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu Gin 230 135 140

Leu Leu Glu Lys Vai Lys Asn Vai Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu Leu 14.S 150 155 ISO

Asp Lys Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe Ala 165 170 175 9 9 175 ΡΕ1572106

Glu Cys Ser Ser Gin Gly His Glu Arg Gin Ser Glu Gly Ser Ser Ser 180 185 ISO

Pro Gin Leu Gin Gin Ser Vai Phe His Leu Leu Vai Pro Ser Vai He 19S 200 205 teu Vai Leu Leu Ala Vai Gly Gly Leu Leu Phe Tyr Ara Trp Arg Arg 210 215 220

Arg Ser His Gin Glu Pro Gin Arg Ala Asp Ser Pro Leu Glu Gin Pro 225 230 235 240

Glu Gly Ser Pro Leu Thr Gin Asp Asp Arg Gin vai Glu Leu Pro Vai

245 250 2SS

<210> 3 <211> 2749 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0>

<221> CDS <222> (190) .. (1854) <22 0> <221> sig_peptide <222> (190)..(285) <220> <221> mat_peptide <222> (286)..(1851) <400> 3 gagggctggc cagtgaggcfc cggccegggg aaagtgaaag tttgccrtggg tcctctcggc 60 gccagagceg ctctengcat cceaggacag eggtgcggcc ctcggccggg gcgcccactc 120 cgcagcagcc agogagcgag cgagcgagcg agggcggccg acgcgcccgg ccgggaccca 180 gctgcccgt atg acc gcg ccg ggc gcc gcc ggg cgc tgc cct ccc aeg aca 231 «et Thr Ala Pro Gly Ala Ala Gly Arg Cys Pro Pro Thr Thr 15 ίο tgg ctg ggc tcc ctg ctg ttg ttg gtc tgfc cfcc ctg 9«S age »99 agt 279 Tm 15’ Leu Gly Ser Leu Leu 20 Leu Leu Vai Cys Leu 25 Leu Ala ser Arg Ser 30 ate acc gag gag gtg teg gag tac tgfc age cac atg att 999 agt «ga 327 Ile Tlir Glu Glu vai 35 Ser Glu Tyr Cys Ser 40 His «et ile Gly ser 45 Gly cac ctg cag fcct ctg cag cgg ctg att gac agt cag atg gag acc teg 375 His Leu Glrt Ser 50 Leu Gin Arg Leu lie 55 Asp Ser Gin Met Glu 60 Thr Ser tgc caa att aca ttt gag ttt gta gac cag gaa caq ttg aaa gat cca 423 Cys Gin Ile S5 Thr Phe Glu Phe Vai 70 Asp Gin Glu Gin Leu 75 Lys Asp Pro 176 ΡΕ1572106 gtg tgc tae efct aag aag gea ttt ctc ctg gta caa gac ata atg gag 471 Vai Cys 80 Tyr Leu Lys Lys Ala 85 Phe Leu Leu Vai Gll! 90 Asp Ile Met Glu gac acc atg ege ttc aga gat aac acc ccc aat gee ate gee att gtg 519 Asp 95 Thr Mefc Arg Phe Arg 100 Asp Aso Thr Pro Asn 105 Ala lie Ala 11« Val no cag etg cag 9»a ctc tet ttg agg ctg aag age tgc ttc acc aag gat 567 Gin Leu Gin Glu Leu 11S Ser Leu Arg Leu Lys 320 Ser Cys phe Thr Lys 125 Asp tat gaa gag cafc gac aag gçc tgc gtc cga a et ttc tat gag aca ccfc §15 Tyr GlU GlU HÍS 130 Asp Lys Ãla Cys vai 13 S Arg Thr Phe Tyr GlU 140 Thr Pro ctc eag Gin ttg efcg gag aag gtc aag aat gtc ttt aat gaa aca aag aat 663 Léu Leu 145 Leu Glu Lys Vai Lys 150 As» Vai Phe Asn Glu. 155 Thr Lys Asn ctc cfcfc gac aag gac aat att ttc age aag aac tgc aac aac age 711 Leu Leu 160 Asp Lys Asp Trp Asn 165 Xle Phe Ser Lys As» 170 cys Aso. Asn Ser tt-t gcfc gaa tge tcc age caa gat gtg gtg acc aag cet gat tgc aac 759 Phe 17S Ma Glu Cya S«r Ser 180 Gin Asp Vai Vai Thr 185 Lys Pro Asp Cys Asn 190 tgc ctc fcac ecc aaa gee ate cet age agt gac ccg gee tet gtc tcc 807 Cya Leu Tyr Pro Lys 195 Ala 11« Pro Ser Ser 200 Asp Pro Ala Ser Val 20S Ser CCt eafc cag ccc ctc gee ccc tcc atg gee ccfc 3tg gct ggc ttg acc 8S5 Pro Hís Gin Pro 210 Leu Ala Pro Ser Met 21S Ala Pro Vai Ala Gly 220 Leu Thr tgg gag gac tet 3ag 33 a acfc gag ggc age tec ctc ttg cet gst gag 903 ΊΧρ Glu ASp 225 ser Glu Gly Thr Glu 230 Gly Ser Ser Leu Leu 235 Pro Gly Glu cag ccc ctg cac aca gtg gat cca ggc agt gee aag cag cgg cca CCC 951 Gin Pro 240 Leu Hís Thr Vai Asp 245 Pro Gly Ser Ala Lys 2S0 Gin Arg Pro Pro ags age acc tgc cag age ttt SaS ceg cca gag acc cca gtt gtc aag 999 Arg 25S Ser Thr Cys Gin Ser 260 Phe Glu Pro Pro Glu 265 Thr Pro Vai vai Lys 270 çjae age «cc ate ggt ggc tea cca cag cet ege ccc tet gtc ggg gee 1047 Asp Ser Thr 11« Gly 275 Gly Ser Pro Gin Pro 280 Arg Pro Ser Val Gly 285 Ala ttc aac ccc ggg atg gag gat att ctfc gac tet gea atg ggc act aat 1095 Phe Asn Pro Gly 290 «et Glu Asp Ile Leu 295 Asp Ser Ala Met Gly 300 Thr Asn tgg gtc CCS. gaa gaa gee fcct c,g& sag gee agt gag att ccc gta ccc 1143 Trp Vai Pro 305 Glu Glu Ala Ser Gly 310 Glu Ala Ser GlU 11« 315 Pro Val Pro caa ggg aça gag ctt tec ccc tcc agg çca 93» ggg ggc age atg cag 1191 Gin Gly 320 Thr Glu Leu Ser Pro 325 Se r Arg Pro Gly Gly 330 Gly Ser Met Gin 177 ΡΕ1572106 aca gag ccc gcc aga ccc age aac ttc etc tca gca tct tct cca ctc 1239 Thr 335 Glu Pro Ala Arg Pro 340 Ser Asn Phe Leu Ssr Ala 345 Ser Ser Pro Leu 350 cct gca tca gca aag ggc caa cag ccg gca gat gta act ggfc aca gcC 1287 Pro Ala Ser Ala Lys Gly 355 Gin Gin Pro Ala 300 Asp Vâl Thr Gly Thr 365 Ara ttg ccc agg gtg gge ccc gtg agg ccc act ggç cag gac tgg aat cac 1335 Leu Pro htg Vai 370 Gly Pro Vai Arg Pro 37S Thr Gly Gin Asp Trp 380 Asrt His acc ccc cag aag aca gac cat cca tct gee ctg ctc aga gac ccc ccg 1383 Thr Pro Gin Lys 385 Thr Asp His Pro 390 Ser Ala Leu Leu Arg Asp 355 Pro Pro gag cca ggc tct ccc agg ate tca tca ctg ege ccc cag ggc ctc age 1431 Glu Pro 400 Gly Ser Pro Arg Ile Ser 405 Ser Leu Arg Pro 410 Gin Gly Leu Ser aac ccc tcc acc ctc tct gct cag cca cag ctt tcc aga age cac tcc 1479 Asn 415 Pro Ser Thr Leu Ser 420 Ala Gin Pro Gin Leu ser 425 Arg Ser His Ser 430 tcg ggc age gtg ctg ccc ct t ggg 9*3 ctg gag ggc *93 *33 age acc 1527 Ser Gly Ser Vai Leu Pro 435 Leu Gly Glu Leu 440 Glu Gly ArgArg Ser 445 Thr agg gat CSS agg age ccc gca gag cca gaa gga gga cca gca agt gaa 1575 Arg Asp Arg Arg 450 Ser Pro Ala Glu Pro 455 Glu Gly Gly Pro Ala 450 Ser Glu ggg gca gee agg ccc ctg ccc cgt ttfc aac tcc gtt cct ttg act gac 1623 Gly Ala Ala Arg 4 £5 Pro Leu Pro Arg 470 Phe Asn Ser Vai Pro Leu 475 Thr Asp aca 39G eat gag agg cag tcc gag gga tcc tcc age ccg cag ctc cag 1671 Thr Gly 480 His Glu Arg Gin Ser Glu 485 Gly Ser Ser Ser 4.90 Pro Gin Leu Gin gag tct gtc fcte cae cfcg ctg gtg ccc agt gtc ate ctg gtc ttg ctg 1719 Glu 495 Ser Vai Phe His Leu 500 Leu Vai Pro Ser vai He 505 Leu Vai Leu Leu 5X0 gcç gtc gga ggc ctc ttg ttç tae agg tgg agg cgg cgg age cat caa 1767 Ala Vai Gly Gly Leu Leu 5X5 Phe Tyr Arg Trp 520 Arg Arg Arg Ser his 525 Gin 3*3 cct cag aga gtg gat tct CCC ttg gag cae cca gag ggc age- ccc 1815 Glu Pro Gin Arg 530 Ala Asp Ser Pro Leu 535 Gru Gin Pro Glu Gly S4Õ Sar Pro ctg Leu act Thr cag gat Gin Asp 545 gac aga Asp Arg cag gtg Gin Vai SSO gaa Glu cfcg Leu cça gtg pro Vai tag agggaat tct 1864 »agcfcggacg cacagaacag fcctcfccegtg ggaggagaca ttatggggcg tccaccacca 1924 ccccfceccfcg gccatcctcc tggaatgtgg tctgccctcc accagagctc ctgcctgcca a984 ggaetggacc agageagcca ggctggggco cctctgtcfcc aacccgcaga occttgactg 2044 aatgagagag gocagaggat gctccecatg ctgccactat ttattgfcgag ccctggsggc 2104 178 ΡΕ1572106 fccccatgfcgc ttgaggaagg ctggfcgagcc cggctcagga ccctcttecc tcaggggctg 2164 caccoucctc tcactccctt ceafcgccgga acccaggcca gggacccace ggcctgfcggt 2224 ttqtgggaaa gcagggtgga cgctgaggag tgaaagaacc ctgcaoccag agggcctgcc 2284 fcggtgccaag gtatcccagc ctggacaggc atggacctgt ctccagagag aggagccfcga 2344 agttcgtggg gcgggacagc gtcggcctga tttcccgfcaa aggfcgtgcag cctgagagac 2404 gggaagagga ggccfcctgga cctgctggtc tgcactgaca gcctgaaggg tctacaccçt 2464 cggctcacct aagtgccctg tgctggttgc caggçgcaga ggggaggcca gcectgccct £524 caggaectgc ctgacctgee agtgafcgcca agagggggat caagcactgg cctctgcccc 2584 tcctccttco agcacctgec agagcttctc caggaggcca agcagaggct ceceteatga 2644 aggaageeat tgcactgtga acaotgtacc tgcctgctga acagcctgcc eeegtccatc 2704 catgagccag eatccgtcog tcctccactc tccagcctct eccca 2740

<210> 4 <211> 554 <212> PRT <213> Homo sapiens <4Ο0> 4

Met Thr Ala Pro Gly Ala Ala Gly Arg Cys Pro Pro Thr Thr Trp Leu 2 5 10 IS

Gly ser Leu Leu l*u Leu Vai Cys Leu Leu Ala Ser Arg Ser Ile Thr 20 25 30

Glu Glu Vai Ser Ql U Tyr Cye Ser His Met Xle Gly Ser Gly His Leu 35 40 45

Gin Ser Leu Gin Arg Leu Ile Asp Ser GXn Met. Glu Thr Ser Cys Gin 50 55 eo

Ile Thr Pfae Glu Phe Vai Asp Gin Glu Gin Leu Lys Asp Pro Vai Cys S5 70 75 80

Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu Vai Gin Asp Xle Met Glu Asp Thr 85 . 50 9S

Kefc Arg S>he Arg Asp hsn Thr Pro Asn Ala Xle Ala Ile Vai Gin Leu 100 105 no <31 n Glu Leu Ser Leu Arg Leu Lys Ser Cys Hhe Thr Lys Asp Tyr Glu 115 120 125 179 ΡΕ1572106

Glu Bis Asp Lys Ala Cys Vai Arg Thr Fhe Tyr Olu Thr Pro Leu Gin 3.30 13 S 140

Leu Leu Glu Lvs Vai Lys Aso vai Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu Leu 145 ISO 1SS 160

Asp Lys Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe Ala 16S 170 175

Glu cys Ser ser Gin Asp Vai Vai Thr Lys vro Aso Cys Asn Cys Leu 180 185 190

Tyr Pro Lys Ala Ile Pro Ser Ser Asp Pro Ala Ser Vai Ser Pro His 195 200 20S

Gin Pro Leu Ala Pro Ser Met Ala Pro Vai Ala Gly Leu Thr Trp Glu 210 215 220

Asp Ser Glu Gly Thr Glu Gly Ser Ser Lsu Leu Pro Gly Glu Gin Pro 225 230 235 240

Leu His Thr Vai Asp Pro Gly Ser Ala Lys Gin Arg Pro Pro Arg Ser 24S 250 255

Thr Cys Gin ser phe Glu Pro Pro Glu Thr Pro Vai Vai Lys Asp Ser 260 ' 265 270

Thr lie Gly Gly Ser Pro Gin Pro Arg Pro Ser Vai Gly Ala Phe Asn 275 280 285

Pro Gly fíei alu Asp Ile Leu Asp Ser Ala Met Gly Thr Asn Trp Vai 290 255 300

Pro Glu Glu Ala Ser Gly Glu Ala Ser Glu lie Pro Vai Pro Gin Gly 305 310 315 320

Thr Glu Leu Ser Pro Ser Arg Pro Gly Gly Gly Ser Met Gin Thr Glu 32S 330 33S

Pro Ala Arg Pro Ser Asn Phe Leu Ser Ala Ser Ser Pro Leu Pro Ala 340 345 350

Ser Ala Lys Gly Gin Gin Pro Ala Asp Vai Thr Gly Thr Ala Leu Pro 355 360 365

Arg Vai Glv Pro Vai Arg Pro Thr Gly Gin Asp Trp Asn Hie Thr Pro 370 375 380 180 ΡΕ1572106

Sl π Lys Thr Asp His Pro Ser Ala Leu Leu Arg Asp Pro Pro Giu pro 38S 390 395 400

Gly Ser Pro Arg lie Ser Ser Leu Arg Pro fíln Gly i.eu Ser Asn Pro 4OS 410 4xs

Ser Thr Leu Ser Ala Gin Pro Gin Leu Ser Arg Ser His Ser Ser Gly 420 425 430

Ser Vai Leu Pro Leu Gly Glu Leu Glu Gly Arg Arg Ser Tlix Arg Asp 435 440 445

Arg Arg Ser Pro Ala Glu Pro Glu Gly gly Pro Ala Ser Glu Gly Ala 450 455 460

Ala Arg Pro Leu Pro Arg Phe Asm Ser Vai Pro Leu Thr Asp Thr Gly 4SS 470 47$ 480

His Giu Arg Gin ser Glu Gly ser ser ser Pro Gin Leu Gin Glu ser 485 490 495

Vai Phe His Leu Leu Vai Pro Ser Vai lie Leu Vai Leu Leu Ala Vai SOO 505 510

Gly Gly Leu Leu Phe Tyr Arg Trp Arg Arg Arg Ser His Gin Glu Pro SIS 520 525

Gin Arg Ala Asp Ser pro Leu Glu Glu Pro Glu Gly Ser Pro Leu Thr 530 535 540

Sln Asp Asp Arg Gin Vai Giu Leu Pro Vai 545 550

<210> 5 <211> 1519 <212> ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (190)..(1506) <220> <221> sig_peptide <222> (190)..(285) <220> <221> mat_peptide <222> (286)..(1503) <400> 5 50 gagggctggc cagtgaggct cggcccgggg aaagtgaaag tttgecfcggg tcctctcggc 181 ΡΕ1572106 gccagagccg ctetccgcat cccaggacag cggtgcggcc ctcgoccggg gegcccactc 120 cgeagcagec agcgagcgag cgagcgagcg agggcggceg aegcgcccgg ecgggaccca 180 gctgcccgt atg acc gcg ccg ggc gcc gcc ggg cgc tgc cct ccc acg aca Met Thr Ala Pro Gly Ma Ala Gly Arg Cys Pro Pro Thr Thr 15 10 tgg ctg ggc toe ctg ctg fctg fcfcg gfcc tgt ctc ctg gcg age agg agt Trp 15 leu Gly Ser leu leu 20 leu leu Vâl Cys leu 25 leu Ala Ser Arg Ser 30 ate acc gag gag gtg teg gag tac tgfc age cac atg atfc ggg agt gga Ile Thr Glu Glu Vai 35 Ser Glu Tyr Cys Ser 40 His Mefc Ile Gly Ser 45 Gly eae efcg cag tet ctg cag cgg ctg afct gac agt cag atg gag acc teg His leu Gin Ser 50 leu Gin Arg leu Ile 55 Asp Ser Gin Met Glu 60 Thr Ser tgc ca a afcfc aca ttt gag ttt Sta gac cag gaa cag fcfcg aaa gat cea Cys Gin Ile SS Thr Phe Glu Phe Val 70 Asp Gin Glu Gin leu 75 lys Asp Pro gfcg tge tac ctt aag aag gea ttt ctc ctg gta caa gac ata atg gag vai Cys 80 Tyr leu lys lys Ala 85 Phe leu leu val Gin 90 Asp Ile Met Glu gac acc atg cgc fcte aga gat aac acc ccc aat gcc afcc gcc att gtg Asp 95 Thr Met Arg Phe Arg 100 Asp Asri Thr Pro As» 105 Ala Ile Ala Ile Val 110 eag ctg cag gaa cfcc tet fcfcg agg ctg aag age tgc ttc acc aag gat Gin leu Gin Glu leu 1X5 Ser Leu Arg leu lys 120 Ser Cys Phe Thr lys 125 Asp tat gaa gag cat gac aag gcc tgc gtc cga act ttc tat gag aca cct Tyr Glu Glu His 130 A3p lys Ala Cys Val 13S Arg Thr Phe Tyr Glu 140 Thr Pro ctc cag fcfcg ctg gag aag gfcc aag aafc gtc ttt aat gaa aca aag aat leu Gin leu 145 leu Glu lys Vai lys ISO Asa Val Phe Asn Glu 155 Thr lys Asn etc ctt gac aag gac tgg aat att ttc age aag aac tgc aac aac age leu .leu 160 Asp lys Asp Trp Aon 16S ile Phe Ser lys Asn 170 Cys Asn Asn Ser fcfcfc gct gaa tgc fccc age caa gat gtg gtg acc aag cct gat tgc aac Phe 17S Ma Glu Cys Ser Ser 180 Mn Asp val Val Thr 185 lys Pro Asp cys Asn ISO fcge cfcg fcae ccc asa gcc ate eefc age agt gac ccg gcc fccfc gfcc tcc Cys leu Tyr Pro Lys 195 Ala Ile Pro Ser Ser 200 k&p Pro Ala Ser Val 205 Ser ccfc eat cag coo etc gcc ccc tcc atg gcc cct 3t.g gct ggo fcfcg acc Pro His Gin Pro 210 leu AXâ Pro Ser Met 2ÍS Ala Pro Val Ala Gly 220 leu Thr tgg gag gac fccfc gag 99¾ açt gag ggc age tcc ctc ttg cct ggfc gag Trp Glu Asp 225 Ser Glu Gly Thr Glu 230 Gly Ser Ser Leu léu 235 pro Gly Glu 231 279 327

37S 423 471 519 567 6X5 663 711 759 007 855 903 182 ΡΕ1572106 cag ccc ctg CSC aca sftg gat cca ggc agt gee aag cag cgg cca ccc 951 Gin Pro Leu His Thr Val Asp Pro Gly Ser Ala Lys Gin Arg Pro Pro 24:0 245 250 *93 age acc tgc cag age fcfct gag ccg cca gag acc cca gfct gtc aag 333 Arg Ser Thr Cys Gin Ser Pfee Glu Prc Pro Glu Thr Pro Val Val Lys 255 260 265 270 gac age acc ate ggt gge tea cca cag ccfc ege ccc tefc gtc ggg gee 1047 Asp Ser Thr 11® Gly Gly Ser Pro Gin Pro Arg Pro Ser Val Gly Ala 275 280 285 ttc aac ccc ggg atg gag gat att ctt gac tet gea atg ggc act aat 1035 Phe Asn Pro Gly mt Glu Asp 11® Leu Asp Ser Ala Wet Gly Thr Asn 290 295 300 tgg gtc cca gaa gaa gsc tet gga gag gee agt gag att CCC gta GCC 3143 Trp vai Pro Glu Glu Ala Ser Gly Glu Ala Ser Glu lie Pro Val Pro 305 310 315 eaa S99 aca gag ctt tea ccc tcc agg cca 93a ggg sse age atg cag 1191 Gin Gly Thr Glu Leu Ser Pro Ser Arg Pro Gly Gly Gly Ser Met Glrs 320 325 330 aca gag ccc gee aga ccc age aac ttc ctc tea gea tet tet cca ctc 1239 ‘Thr Glu Pro Ala Arg Pro Ser Asn Phe Leu Ser Ala Ser Ser Pro Leu 335 340 345 350 ccfc gea tea gea aag ggc caa cag ccg gea gat gta act ggc eat gag 1287 Pro Ala Ser Ala Lys Gly Gin Gin Pro Ala Asp val Tfcr Gly His Glu 3SS 350 355 agg cag tcc gag gga tcc: tcc age ccg cag ctc cag gag tet gtc fcfcc 1335 Arg Gin Ser Glu Gly Ser Ser Ser Pro Gin Leu Gin Glu Ser val Phe 370 375 3ôo cac stg ctg 3*3 ccc agt gtc ate ctg gtc ttg ctg gee gtc gga gge 1383 His Leu Leu val Pro Ser Val lie Leu Val Leu Leu Ala Val Gly Gly 3SS 390 395 çtc ttg ttc tac agg tgg agg tgg tgg age eat caa gag cct cag aga 1431 Leu Leu Phe Tyr Arg Trp Arg Arg Arg Ser His Gin Glu pro Gin Arg 400 405 410 gsg gat tefc ccc ttg gag caa cca gag ggc age ccc ctg act cag gat 1479 Ala Asp Ser Pro Leu Glu Gin Pro Glu Gly Ser Pro Leu Thr Gin Asp 415 420 425 430 gac aga cag s*s gaa ctg cca gtg fcag aSHga&fc*efc aag 1519 Asp Arg Gin vai Glu 435 Léu Pro Val <210> 6 <211> 438 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 6

Met Thr Ma ?ro Gly Ala Ala Gly Arg Cys Pro pro Thr Thr Trp Leu 15 10 15 183 ΡΕ1572106

Gly Ser Leu Leu Leu Leu Vai Cys Leu Leu Ma Ser Arg ser Ile Thr 20 2S 30

Glu Glu Vai Ser Glu Tyr Cys Ser His Met Ile Sly Sér Gly His Leu 35 40 45

Gin Ser Leu Gin Arg Leu Ile Asp Ser Gin Mefc Glu Thr Ser Cys Gin S0 55 60 .

Ile Thr Μια Glu phe vai Asp Gin Glu Gin Leu Lys Asp Pro Vai Cys 65 70 75 80

Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu Vai Gin Asp Ile Met Glu Asp Thr as 90 95 «et Arg Phe Arg Asp Asa Thr Pro As» Ala Ile Ala Ile Vai Gin Leu 100 105 110

Gl» Glu Leu ser Leu Arg Leu Lys Ser Cys Phe Thr Lys Asp Tyr Glu 115 120 125

Glu Mis Asp Lys Ala Cys Vai Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu Gin 130 135 140

Leu Leu Glu Lys Vai Lys Asa Vai Phe Asn Glu Thr Lys Asa Leu Leu 145 150 155 160

Asp Lys Asp Trp Asn Ile Phe ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe Ala 1SS 170 * 175

Glu Cys Ser Ser Gin Asp Vai Vai Thr Lys Pro Asp Cys Asn Cys Leu ISO 18S 190

Tyr Pro Lys Ala Ile Pro Ser Ser Asp Pro Ala Ser Vai Ser Pro His 135 200 205

Gin pro Leu Ala Pro Ser Met Ala Pro vai Ala Gly Leu Thr Trp Glu 210 215 220

Asp Ser Glu Gly Thr Glu Gly Ser Ser Leu Leu Pro Gly Glu Gin. Pro* 225 230 235 340

Leu His Thr Vai Asp Pro Gly Ser Ala Lys Gin Arg Pro Pro Arg Ser 245 250 255

Thr Cys Gin Ser Phe Glu Pro Pm Glu Thr Pro Vai Vai Lys Asp Ser 260 265 270 184 ΡΕ1572106

Thr Tle Gly Gly Ser Pro Gin Pro Arg Pro Ser Vai Gly Ala Phe Asn 275 280 285 pro Gly Met Glu Asp Xle Leu Asp Ser Ala Met. Gly Thr Asn Trp Vai 290 295 300

Pro Glu 01o Ala ser Gly Glu Ala Ser 0lu Ile Pro Vai Pro Gla Gly 305 310 315 320

Thr Gin Leu Ser Pro Ser Arg Pro Gly Gly Gly Ser Met Gin Thr Glu 325 330 335

Pro Alá Arg Pro ser Asn Phe Leu ser Ala ser ser Pro Leu Pro Ala 340 345 350

Ser Ala Lys Gly Gin Gin Pro Ala Asp Vai Thr Gly Hís Glu Arg Gin 355 3S0 365

Ser 01« Gly Ser Ser Ser Pro Gin Leu Gl» Glu Ser Vai Phe Hás Leu 370 37S 380

Leu Vai Pro Ser Vai. ile Leu Vai Leu Leu Ala Vai Gly Gly Leu Leu 38S 390 395 400

Phe Tyr Arg Trp Arg Arg Arg Ser His Gin Glu Pro Gin Arg Ala Asp 4OS 410 415

Ser Pro Leu Glu Gin Pro Glu Gly Ser Pro Leu Thr Gin Asp Asp Arg 420 425 430

Gin Vai Glu Leu Pro Vai 435

<210> 7 <211> 3985 <212> ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (293)..(3211) <220> <221> sig_peptide <222> (293)..(349) <220> <221> mat_peptide <222> (350)..(3208) <220> <221> misc_feature <222> (374)..(598) <223> Imunoglobulina 185 ΡΕ1572106 <220> <221> misc_feature <222> (917) .. (1177) <223> Imunoglobulina <220> <221> misc_feature <222> (2516) .. (3022) <223> Tirosina-cinase, Domínio catalítico <400> 7 gaagggcaga cagagtgtcc aaaagcgtga gagcacgaag tgaggagaag gtggagaaga eo gagaagagga agaggaagag gaagagagga agcggaggga aetgcggcca ggctaaaagg 120 ggaagaagag gatcagccca aggaggagga agaggaaaac aagacaaaea gccagtgcag 180 aggagaggaa cgtgtgtcca gtgfccccgat ccctgcggag ctagtagctg agagetctgt 240 gççctgggea ccttgc&gcc ctgcaectgc ctgccacttc cccsccgagg cc atg ggc 298

Met Gly cca 99* gtt ctg ctg ctc ctg ctg gtg gee aca set tgg cat 1 ggt cag 346 Fro Gly Val 5 Leu Leu Leu Leu Leu 10 Val Alâ Thr Ala Trp IS His Gly Gin gga ate cca gtg ata 9*g çcç agfc gtc cct 3*3 ctg gtc gtg aag cca 394 Gly 11 e 20 Pro vai ile Glu Pro 25 Ser val Pro Glu Leu 30 Val val Lys Pro sara gea acg gtg acc ttg çga tgt gtg ggc 3.S.t* ggc age gtg gaa tgg 442 Gly 35 Ala Thr val Thr Leu 40 Arg Cys Val Gly Asn 45 Gly Ser vai Glu Trp 50 gat 33c ccc cca fcea cct cac tgg et<?c ctg tac tet gst ggc tcc age 430 Asp Gly Pro Pro ser 55 Pro Eia Trp Thr Leu so Tyr Ser Asp Gly Ser 65 Ser age ate ctc age acc aac aac gct acc ttc CH-St aac a cg 939 tafc 538 Ser Ile Leu Ser 70 Thr Asn Ase Ala Thr 75 Phs Gin Aso Thr Gly 80 Thr Tyt ege tgc act 3*3 cct 33a gac ccc ctg 33a ggc age gee gee ate cac 586 Arg Cys Thr 85 G1 u Pro Gly Asp Pro 30 Leu Gly Gly Ser Ala 35 Ala lie His etc tat gtc aaa gac cct gee cgg ççc tgg aac gtg cta gea cag 3*3 S34 Leu Tyt 100 val Lys Asp Pro Ala 105 Arg pro Trp Asn val 110 Leu Ala Gin Glu sfcs gtc gtg tfcc 9*s gac eag gac gea cta ctg ccc tgt ctg ctc aca 682 Vai 115 Vâl Val Fhe GXu Asp 3.20 GXn Asp Ala Leu Leu 125 Pro Cys Leu Leu Thr 130 gac ccg Stg ctg gea ggc gtc fccg ctg gtg cgt gtg cgt 39« egg 730 Asp Pro Val Leu Glu 13 S Ala Gly Val Ser Leu 140 Val Arg Val Arg Gly 145 Arg 186 ΡΕ1572106 ccc etc atg ege CâC acc aac fcac tcc ttc tag ccc tgg cat ggq ttc ??8 Pro LEU Hat Arg 150 HÍS Thr Asn Tyr Ser 155 Phe Ser Pro Trp His 160 Gly Phe ace ate cac agg goe aag ttc att caq age cag gac tat caa tgs agt 826 Thr Ile His 165 Atg Ala Lys Phe Ile Gin 170 Ser Gin Asp Tyr 175 Glu Cys Ser gee etg atg 9St ggc agg aag gtg atg tce ate age ate «93 ctg aaa 874 Ai a Leu 180 Met Gly Gly Arg Lys 185 Val «st Ser Ile Ser 180 Ile Arg Leu Lys qtg eag aaa gtc afcc cca 393 ccc cca gee ttg aca ctg gtg cct gea 322 Vai 135 Gin Lys Val ile Pro 200 Gly Pro Pro Ala Leu 205 Thr Leu Val Pro Ala 3X0 gag ctg gtg cgg att ega ggg gag gct gee eag ato gtg tgc tea gee 370 Glu Leu val Arg lie 215 Arg Gly Glu Ala Ala 22Ú Gin Ile val cys Ser 225 Ala age age gtt gafe gtt aac ttt gat gtc ttc efce caa cac aac aac acc X018 Ser Ser Val Aso 230 Val Aén Phe Asp val 23S Phe Leu Gin His Asn 240 ftsn Thr aag ctc gea ate cct caa caa tet gac ttt cat aat aac cgfc tac caa 1066 Lys Leu Ala 245 Ile Pro Glii Gin Ser Asp 250 Phe His ftsn Asn 255 Arg Tyr Glu aaa gtc ctg acç ctc aac ctc gat caa gta gat ttc caa cat gee ggc 1114 Lys val 260 Xj0U Thr Leu Aon. Leu 265 Asp Gin val Asp Phe 270 Gin HÍS Aia Gly aac tac tge gtg gee age aac gtg cag ggc aag cac tcc acc tcc 1162 Asn 275 i-yr Ser Cys Val Ãla 280 Ser Asn v®l Gin Gly 285 Lys His Ser Thr Ser 230 atg ttc ttc cgg gtg gta gag agt gee tac ttg aac ttg age fcct gag 1210 «et Phe Phe Arg Val 235 Val Glu ser Ala Tyr 300 Leu Asn Leu Ser ser 305 Glu cag aac ctc ate cag gag gtg acc gtg 939 gag ggg ctc aac ctc aaa 1258 Gin Asm Leu Ile 310 Gin Glu Val Thr Vai 3X5 Gly Glu Gly Leu Asn 320 Leu Lys gtc atg gtg gag gw tac cca ggc ctg caa ggt ttt aac tgg aco tac 1306 val «et Vâl 325 Gl.u Ala Tyr Pro Gly Leu 33Ô Gin Gly Phe Asn 335 Trp Thr Tyr ctg gga ccc ttt tefc gac cac cag cct gag CCC aag efefc gct aat gct 1354 It&M, Gly 340 Pro Phe Ser Aso His 34 S Gin Pro Glu Pro Lys 350 Leu Ala Asn Ala acc acc aag gae aca tac agg cac acc ttc acc ctc tet ctg ccc «9« 1402 Thr 555 Thr Lys Asp Thr Tyr 360 Arg His Thr Phe Thr 365 Leu Ser Leu Pro Arg 370 ctg aag ccc tet gag gct ggc ege tac tcc ttc ctg gee aga aac cca 1450 Leu Lys Pro Ser Glu 375 Ala Gly Arg Tyr Ser 380 Phe Leu Alâ Arg Asn 385 Pro gga tgg aga gcfc ctg aco ttt qaq ctc acc ctt cga tac ccc cca 1438 Gly Gly Trp Arq 390 Ala Leu Thr Phe Glu 395 Leu Thr Leu Arg Tyr 400 Pro Pro 187 ΡΕ1572106 gag gta age gtc ata tgg aea ttc are aac ggc tet ggc acc í- ttg 1546 01« Vai Sex 405 Val Ile Trp Ihr Phe ile 410 Asn Gly Ser Gly 415 Thr Leu Leu tgt gst gee tet ggg tac ccc eag ccc aac gtg aca tgg ctg eag tgc 1594 Cys Ala 420 Ala Sai' tíly Tyr Pro 425 Gin Pro Asn Val Thr 430 Trp Leu Glõ Cys agt ggc eac act gat agg tgt gat gag gee CS & gtg cfcg eag gte tgg 1642 Ser 435 siy HiS Thr Asp Arg 440 cys Asp Glu Ala Gin 445 val Léu Gin Val Trp 450 gat gac cca tac cet gag gtc ctg age eag gag ccc ttc cac aag gtg 1690 Ãsp ftsp Pro Tyr Pro 455 Glu val Leu Ser Gin 460 Glu Pro Phe His Lys 465 val acg gtg eag age ctg ctg act gfct gag acc tta gag eac aac caa acc 1738 Thr val Gla Ser Leu 470 Leu Thr val Glu 475 Thr Leu Glu His Asn 400 Gin Thr .tac gag tgc agg gee eac aac age gtg 993 agt ggc tcc tgg gee ttc 1786 Tyr Glu Cys 485 Arg Ala His Asn Ser Val 490 31Y Ser Gly Ser 495 Trp Ala Phe ata ccc ate tet gea gga gee cac acg eafc ccc CCg gat gag ttc ctc 1834 Ue Pro 500 Ile Ser Ala Gly Ala SOS His Thr BÍS Pro Pro 510 Asp Glu Phe Leu ttc aca cca gtg gtg gte gee tgc atg tcc ate atg gee fctg ctg ctg 1882 Phe 515 Thr Pro Val val val 520 Ala Cys Met Ser Ile 525 Met Ala Leu Leu Leu 530 ctg ctg ctc ctg ctg cta ttg tac aag tat aag eag aag ccc aag tac 1930 Leu Leu Leu Leu Leu 535 Leu Leu Tyr Lys Tyr 540 Lys Gin Lys Pro Lys 545 Tyr cag gtc ege tgg aag ate ate gag age tat gag ggc aac agt tat act 1978 Gin Val Arg Xxp Lys SSO Ile Ile Glu Ser 555 Tyr Glu Gly Asn ser 560 Tyr Thr ttc ate gac ccc acg eag ctg cet tac aac gag aag tgg gag ttc ccc 2026 Phe Ile Asp 565 Pro Thr Gin Leu Pro Tyr 570 Asn GlU Lys Trp 575 Glu Phe Pro cgg aac aac ctg eag ttt ggt aag acc etc gga gct gga gee ttt ggg 2074 Arg Asn 580 Asn Leu Gin Phe Gly 585 Lys Thr Leu Gly Ãla 590 Gly Ala Phe Gly aag gtg gtg gag gee acg gee ttt ggt ctg ggc aag gag gat gct gtc 2X22 Lys S95 Val Val Glu Ala Thr soo Ala Phe Gly Leu Gly 605 Lys Glu Asp Ala Val 610 ctg aag gtg gct gtg aag atg ctg aag tcc acg gee cat gct gat gag 2170 Leu Lys Val Ala Val 615 Lys Met Leu Lys Ser 620 Thr Ala His Ala Asp 625 Glu aag gag gee etc atg tec gag ctg aag ate atg age CSC ctg 93« eag 2218 Lys Glu Ala Leu Mefc 630 Ser Glu Leu Lys 635 Ile Met Ser His Leu 640 Gly Gin eac gag aac ate gtc aac ctt ctg gga gee tgt acc cat gga ggc cet 2266 His Glu Asn 645 Xle Val Asn Leu Leu Gly 550 Ala Cys Thr His 655 Gly Gly Pro ΡΕ1572106 188 gt» ctg gtc ate aeg gag tac tgt tgc tat ggc gaç çfcg etc ase ttt Val Leu Vai Ile Thr Glu Tyr Cve Cys 'X'yr Gly Asp Leu Leu Asn phe 660 665 670 ctg cga agg aag gct gag gee atg ctg gga ccc age ctg age çcc ggc Leu Arg Arg Lys Ala Glu Ala Met Leu Gly Pro Ser Leu Ser pxo Gly 675 663 685 €S0 cag gaç ccc gag gga ggc gtc gac tat aag aso ate cac etc- gag aag Gin Asp Pro Glu Gly Gly Val Asp Tyr Lys Asn Ile hís Leu Glu 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Arg Ser Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser Glu Leu Slu Glu Glu Ser 935 940 945

tet agt gag eac ctg acc tgc tgc gag caa ggg gat ate gee cag ece 317S ser Ser Glu His Leu 'l’hr Cys Cys Glu Gin Gly Asp lie Ala Gin Pro 950 955 960 tfcg ctg cag ece aac aae tafc cag ttc fcgc fcga ggagttgacg acagggagta 3231 Leu Leu Sln Pro Asn Asn Tyr Gin Fhe cvs 965 970 ceactctccc cfccctccãaa. cttcaaefcce tceatggatg gggcgacacg gggagaacat 3291 acaaactcfcg cettcggtca tttcacfccaa cagctcggcc cagctctgaa acttgggaag 3351 gfcgagggatt caggggaggt cagaggat.ee cacttectga gcatgggcca tcactgceag 3411 tcaggggctg ggggctgagc cctcaceecc ccctccceta cfcgtfccfccafc ggtgttggcc 3471 tcgtgtfctgc tatgccaact agtagaacct tetttcetaa fcecccttafce tteafcggaaa 3531 tggactgact ttatgcctat gaagtcccca ggagctacac tgafcaetgag aaaaccaggc 3591 tctttgggge tagacagact ggcagagagt gagatctccc tcfcctgagag gageageaga 3651 tgcfccacaga ccacacteag ctcaggcece ttggagcagg atggctcctc taagaatctc 37X1 acaggaccte ttagtctctg ccetatacgc cgecttcact eeacagcctc acecctecea 3771 cceccatact ggtactgctg taatgagcca agtggcagct aaaagttggg ggtgttctgc 3831 ccagtceegt cattefcggge tagaaggcag gggaccttgg cafcgtggctg gecacacçaa 3891 gcaggaagca caaactecce caagctgact catcctaact aacagtcacg ccgtgggatg 3951 tctctgteea cattaaaeta aeageafctaa tgca 3985

<210> 8 <211> 972 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8

Met Gly Pro Gly Vai Leu Leu seu Leu Leu vai Ala Thr Ala Trp His 1 S 10 15

Gly Gin Gly Ue Pro Vai lie Glu Pro Ser Vai Pro Glu Leu Vai Vai 20 25 30

Lys Pro Gly Ala Titr Vai Thr Leu Arg Cys vai Gly Asn Gly Ser Vai 35 40 45 190 ΡΕ1572106

Glu Trp Asp Gly Pro Pro Ser Pro Bis Trp Thr Leu Tyr Ser Asp Gly 50 " 55 60

Ser Ser Ser 11 e Leu Ser Thr Asn Asa Ala Thr Phe Gin Asn Thr Gly 65 70 75 80

Thr Tyr Arg Cys Thr Glu Pro Gly Asp Pro Leu Gly Gly Ser Ala Ala 65 90 95 lie His Leu Tyr Vai Lys Asp Pro Ala Arg Pro Trp Asn Vai Leu Ala 100 105 110

Gin Glu Vai Vai Vai Phe Glu Asp Gin Asp Ala Leu Leu Pro Cys Leu lis 120 125

Leu Thr Asp Pro Vai Leu Glu Ala Gly Vai Ser Leu Vai Arg Vai Arg 130 135 140

Gly Arg pro Leu Met Arg His Thr Asn Tyr Ser Phe Ser Pro Trp His 14S ISO 155 160

Gly Phe Thr Ile His Arg Ala Lys Phe XXe Gin· Ser Gla Asp Tyr Gin 165 170 175

Cys Ser Ala Leu Met Gly Gly Arg Lys Vai Met Ser Xle Ser Ile Arg 180 18S 190

Leu Lys Vai Gin lys Vai Xle Pro Gly Pro Pro Ala Leu Thr Leu Vai 1SS 200 205

Pro Ala Glu Leu Vai Arg Ile Arg Gly Glu Ala Ala Gin lie Vai Cys 210 215 220

Ser Ala Ser ser Vai Asp Vul Asn Phe Asp Vai Phe Leu Gin His Asa 225 230 235 240

Asn Thr Lys Leu Ala Xis Pro Glu Glu Ser Asp Phe His Asn Asn Arg 245 250 255

Tyr Gin Lys Vai Leu Thr Leu Asn Leu Asp Glu Vai Asp Phe Gin His 260 265 270

Ala Gly Asn Tyr Ser Cys Vai Ala Ser Asn Vai Gin Gly Lys His Ser 275 280 285

Thr Ser Met Phe Phe Arg Vai vai Glu Ser Ala Tyr Leu Asn Leu Ser 290 295 300 191 ΡΕ1572106

Ser Glu Gin Asn X>eu Xle Gin Glu Vai Thr Vai Giy Glu 01 y Leu Asn 305 310 315 320 teu tys Vai Met Vai Glu Ala Tyr Pr© Giy Leu Gin Gly Phe Asn Trp 325 330 335

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Asn Ala Thr Thr tys Asp Thr Tyr Arg His Thr Phe Thr teu ser teu 355 360 355

Pro Arg teu tys Pro Ser Glu Ala GXy Arg Tyr- Ser phe teu Ala Arg 370 375 300

Asn Pro Gly Gly Trp Arg Ala teu Thr Phe Glu teu Thr teu Arg Tyr 385 390 395 400

Pro Pro Glu Vai ser Vai He Trp Thr Phe lia Asn Gly Ser Gly Thr 405 410 415

Leu Leu Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Pro Gin Pro Asn Vai Thr Trp teu 420 425 430

Gin, Cys Ser Gly Hís Thr Asp Arg Cys Asp Glu Ala Gin Vai teu Gin 435 440 445

Vai Trp Asp Asp Pro Tyr Pro Glu Vai Leu Ser Gin Glu Pro Phe His 450 455 460 tys Vai Thr Vai Gin Ser teu teu Thr Vai Glu Thr Leu Glu His Asn 465 470 475 480

Gin Thr Tyr Glu Cys Arg Ala His Asn ser Vai Gly ser Gly Ser Trp 43S 490 495

Ala Phe Ile Pro Ile Ser Ala Gly Ala His Thr Hís Pro Pro Asp Glu SOO 505 510

Phe teu Phe Thr pro Vai Vai Vai Ala Cys Met Ser Ile Met Ala teu 515 520 S25 teu Leu teu Leu teu teu Leu Leu Leu Tyr Lys Tyr Lys Gin Lvs Pro 530 535 540

Lys 545

Tyr Gin Vai Arg Trp tys lie lie Glu Ser Tyr Glu Gly Asn Ser 550 555 ' 550 192 ΡΕ1572106

Tyr ihr Phe He Asp Pr© Thr Gin Leu Pro Tyr Asn Glu Lys Trp Glu 56S 57» 575

Pha Pro Arg Asn Asn Leu Gin Phe Gly Lys Thr Leu Gly Ala Gly Ala 580 585 590

Phe Gly Lys vai vai Glu Ala Thr Ala Phe Gly Leu Gly Lys Glu Asp S95 500 SOS

Ala val Leu lys Val Ala vai Lys Hat Leu Lys Ser Thr Ala His Ala 510 615 620

Asp Glu Lys Glu Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Met Ser His Leu 625 630 635 640

Gly Gin His Glu Asn 21 e Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr His Gly 645 650 65S

Gly Pro val Leu Vai Ile Thr Glu Tyr Cys Cys Tyr Gly Asp Leu Leu 6S0 665 670

Asn Pfae Leu Arq Arq Lys Ala Glu Ala Het Leu Gly Pro Ser Leu Ser 675 680 635

Pro Gly Gin Asp Pro Glu Gly Gly Val Asp Tyr Lys Asn ile His Leu 690 695 700

Glu Lys T.,ys Tyr Val Arg Arg Asp Ser Gly Phe Ser Ser Gin Gly Val 705 710 715 720

Asp Thr Tyr Val Glu Met Arg Pro Val Ser Thr Ser ôsr Asn Asp Ser 725 730 735

Phe Ser Glu Gin Asp Leu Asp Lys Glu Asp Gly Arg Pro Leu Glu Leu 740 745 750

Arg Asp Leu Leu His Pha Ser Ser Gin Val Ala Gin Gly Met Ala Phe 755 760 765

Leu Ala Ser Lys Asa Cys Ile His Arg Asp Vai Ala Ala Arg Asn Val 770 775 780

Leu Leu Thr Asn Gly His Val Ala Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala ?85 790 795 SOO

Arg Asp Ile Met Asn Asp Ser Asn Tyr Ile Val Lys Gly Asn Ala Arg 805 810 815 193 ΡΕ1572106

Tyr Thr ?he 2le Asp Pro Thr Gin Leu Pro Tyr Asn Giu hys Trp Glu BêS 570 s?5

Phs Pro Arg Asn Asn Leu Gin Phe Gly Lys Thr Leu «iy Ma Gly Ala 580 585 590

Phe Gly Lys Vai Vai Glu Ala Thr Ala J%s Gly Leu Gly Lys Glu ftsp 39 S 600 . 605

Ala vai Leu Lys Vai Ala vai Lys Met Leu Lys Ser Thr Ala His Ala S1Q SIS 620

Asp Glu Lys Glu Ala Léu Met Ser Glu Leu Lys Ile Met Ser His Leu 62S 630 63S 640

Gly GXtt His Glu Asn Ile Vai Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr His Gly 645 650 6SS

Gly Pro Vai Leu Vai lie Thr Glu Tyr Cys Cys Tyr Gly Asp Leu Leu 660 665 670

Asn Phe Leu Arg Arg Lys Ala Glu Ala Met Leu Gly Pro Ser Leu Ser 675 680 685

Pro Gly Gin Asp Pro Glu Gly Gly Vai Asp Tyr Lys Asn Ile His Leu 690 695 700

Glu Lys Lys Tyr Vai Arg Arg Asp Ser Gly Pha Ser Ser Gin Gly Vai 705 710 715 720

Asp Thr Tyr Vai Giu Met. Arg Pro Vai Ser Thr Ser Ser Asn Asp Ser 725 730 735

Fhe ser Glu Gin Asp Leu Asp Lys Glu Asp Gly Arg Pro Leu Glu Leu 740 745 730

Arg Asp Leu Leu His Phe Ser Ser Gin Vai Ala Gin Gly Met Ala Pha 755 760 765

Leu Ala Ser Lys Asn Cys lie His Arg Asp Vai Ala Ala Arg Asn Vai 770 77S 780 Léu Leu Thr Asn Gly His Vai Ala Lys 11® Gly Asp Pha Gly Lati. Ala 785 790 795 " 800

Arg Asp lie Met Asn Asp Ser Asn Tyr lie Vai Lys Gly Asn Ala Arg 805 810 815 194 ΡΕ1572106

Leu Pro Vai Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Ile Pfaa Asp Cys Vai Tyr 820 825 830

Thr Vai. Gin Ser Asp Vai Trp Ser Tyr Gly Ile Leu Leu Trp Glu Ile 835 840 845

Phe Ser Leu Gly Leu Asn Pro Tyr 850 855

Pro Gly 11« Leu Vai Asn Ser Lys 860

Phe Tyr Lys Leu Vai Lys Asp Gly 865 870

Tyr Gin Het Ala Gin Pro Ala vhe 875 880

Alá Pro Lys Asn Ile Tyr Ser Ile

88S

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Pro Thr His Arg Pro Thr Phe Gin 900

Gin Ile Cys Ser Phe Leu Gin Glu 905 910

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Arg Asp Tyr Thr Asn Leu Pro Ser 925

Ser Ser Arg ser Gly Gly Ser Gly 930 935

Ser Ser âer Ser Glu Leu Glu Glu 940

Glu Ser Ser Ssr Glu His Leu Thr 945 950

Cys Cys Glu Gin Gly Asp Ile Ala 955 960

Gin Pro Leu Leu Gin Pro Asn Asn Tyr Gin Pfae Cys 965 970

Lisboa, 8 de Junho de 2010

Claims (10)

1. ΡΕ1572106 1 REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo antagonista não de murideo que se liga a M-CSF, para utilizar em prevenção ou tratamento de metástases ósseas num sujeito afligido com cancro metastático.
2. 2. Utilização de um anticorpo antagonista não de murideo que se liga a M-CSF e um segundo agente terapêutico no fabrico de um medicamento para prevenção ou tratamento de metástases ósseas num sujeito afligido com um cancro metastático.
3. 3. Utilização de um anticorpo antagonista não de murideo que se liga a M-CSF na preparação de um medicamento para prevenção ou tratamento de metástases ósseas num sujeito afligido com um cancro metastático, em que o medicamento é simultaneamente, separadamente ou sequencialmente administrado com um agente terapêutico de cancro.
4. 4. Utilização de acordo com a reivindicação 2 ou a reivindicação 3, em que o segundo agente terapêutico é um bisfosfonato.
5. 5. Utilização de acordo com a reivindicação 4 em que o bisfosfonato é zeledronato, pamidronato, clodro-nato, etidronato, tilundronato, alendronato ou ibandronato. 2 ΡΕ1572106
6. 6. Utilização de acordo com a reivindicação 2 ou reivindicação 3, em que o segundo agente terapêutico é um agente quimioterapêutico.
7. 7. Anticorpo para utilizar em prevenção ou tratamento de metástases ósseas de acordo com a reivindicação 1 ou a utilização de acordo com a reivindicação 2 ou reivindicação 3, em que o sujeito é excluido de receber tratamento com bisfosfonato.
8. 8. Anticorpo para utilizar em prevenção ou tratamento de metástases ósseas ou utilizar de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que o referido anticorpo não de murideo que se liga a M-CSF é seleccionado a partir do grupo que consiste em: (a) um anticorpo policlonal; (b) um anticorpo monoclonal; (c) um anticorpo humanizado; (d) um anticorpo humano; (e) um anticorpo quimérico; e (f) um fragmento de anticorpo Fab, F(ab')2 ou Fv.

   9. Anticorpo para utilizar em prevenção ou tratamento de metástases ósseas ou utilizar de acordo com a reivindicação 8 em que o referido anticorpo é um anticorpo humano. 10. Anticorpo para utilizar em prevenção ou 3 ΡΕ1572106 tratamento de metástases ósseas ou utilizar de acordo com a reivindicação 8 em que o referido anticorpo é um anticorpo humanizado.

   11. Anticorpo para utilizar em prevenção ou tratamento de metástases ósseas ou utilizar de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que o cancro metastático é cancro da mama, do pulmão, renal, mieloma múltiplo, da tiróide, da próstata, adenocarcinoma, malignidades das células sanguíneas, incluindo leucemia e linfoma; cancros da cabeça e do pescoço; cancros gastrointestinais, incluindo cancro do estômago, cancro do cólon, cancro colorrectal, cancro pancreático, cancro do fígado; malignidades do tracto genital feminino, incluindo carcinoma do ovário, cancros uterinos do endométrio e cancro cervical; cancro da bexiga; cancro cerebral, incluindo neuroblastoma; sarcoma, osteossarcoma; e cancro da pele, incluindo melanoma maligno ou cancro de células escamosas.

   12. Anticorpo para utilizar em prevenção ou tratamento de metástases ósseas ou utilizar de acordo com a reivindicação 11, em que o cancro metastático é cancro da mama.

   13. Anticorpo para utilizar em prevenção ou tratamento de metástases ósseas ou utilizar de acordo com qualquer reivindicação anterior em que o referido sujeito é um humano. 4 ΡΕ1572106

   14. Anticorpo para utilizar em prevenção ou tratamento de metástases ósseas ou utilização de qualquer reivindicação anterior, em que o anticorpo não de murideo que se liga a M-CSF é para administrar a uma dose entre cerca de 0,01 mg/kg e cerca de 100 mg/kg.

   15. Anticorpo para utilizar em prevenção ou tratamento de metástases ósseas ou utilização de qualquer reivindicação anterior, em que o anticorpo não de murideo que se liga a M-CSF compete em mais de 75% com o anticorpo monoclonal 5H4 obtenível a partir do hibridoma depositado como N°. de Entrada ATCC HB 10027 pela ligação a M-CSF. Lisboa, 8 de Junho de 2010 ΡΕ1572106 1/9 FIG. 1

   PE1572106 2/9

   * FÈG. 2 ·*

   ΡΕ1572106 3/9 coΟ ÍL·

   CSF-1 (30ng/ml)* MDA-231 CM + MCF-7CM + RANKL (100 ng/mt) RANKL (100 ng/ml) RANKL (100 ng/ml)

   Número de osteoclastos ΡΕ1572106 4/9

   dWW CZ CM J= O OJ Ó Ê -¾ O I m 3 Cl 0 H 0 M 4* H c **7 tm iL a m. * i ° :Í %S 0 NÉiiiere de osteoelaslos ΡΕ1572106 5/9 SÍ1 C X 40 φ £Ζ 13»:: Ο I < ίΤ Ο * .n

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   ΡΕ1572106 7/9

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   Animais com Osteólise com Registo >2,5 8/9 ΡΕ1572106

   Ligado de anticorpo especifico de &CSF à linha celular ds casier© da tasesa M3A231 VfeEaslbo: controlo sests anticorpo Ereto: anticorpo de M--CSF 1 jag/saL VI rdp ; antrcorpo fie M-CSF 10 íks/ísI. nzii - anticctpo cte M--GSF £0 pg/aiL·

   Mgaçlo cfe anticorpo especifico de M2SF à linha oéXyiar sfe cànoxo <fe ©ielossa miltiplo ARH77 IfeiiEfôliío: tsosÊbrol® sa anticorpo Verde: anticorpo >:fe M-CST S pg/nrL Azul; Ci:,«tr&io cfe igG&a 5 j.sq/jal
9. 9/9 ΡΕ1572106 FIG. 9 Tipo de Cancro Estado do Cancro Registo 0 Registo 1 Registo 2 Registo 3 Registo 4 %com registos 3 ou superior supra-renal normal 10 5 5 0 0 0 células basais cancro 5 0 0 0 0 0 bexiga normal 6 1 2 1 0 10 cérebro normal 17 1 2 0 0 0 mama cancro 6 5 13 62 0 72 mama normal 7 5 7 6 0 24 carcinóides cancro 9 2 2 0 0 0 carcinóides (músculo) cancro 1 0 1 0 0 0 coriocarcinoma cancro 1 0 0 0 0 0 cólon normal 4 0 2 0 0 0 cólon cancro 9 0 1 4 0 27 fibrossarcoma cancro 3 1 0 0 0 0 vesícula biliar normal 2 1 0 1 0 25 célula qerminal cancro 1 0 0 0 0 0 coração normal 7 3 2 4 0 25 rim normal 5 10 1 4 0 20 rim cancro 8 1 0 3 0 25 leiomiossarcoma cancro 5 0 0 0 0 0 fígado normal 11 3 4 1 0 5 fígado cancro 5 3 0 3 0 27 pulmão normal 19 0 1 0 0 0 pulmão cancro 3 1 0 3 0 43 linfóma cancro 13 0 3 2 0 12 melanoma cancro 7 0 2 5 0 36 melanoma (inflamação) cancro 0 0 0 1 0 100 mesotelioma cancro 6 0 0 0 0 0 neuroblastoma cancro 1 0 0 0 0 0 ovário normal 6 0 2 0 0 0 ovário cancro 8 2 0 4 0 29 pâncreas normal 9 2 5 4 0 20 pâncreas cancro 8 1 0 3 0 25 próstata normal 0 3 8 3 0 21 próstata cancro 9 1 1 4 0 27 sarcoma todos cancro 6 0 2 2 0 20 sarcoma cancro 3 0 2 1 0 17 sarcoma (rim) cancro 3 0 2 1 0 17 sarcoma mhf cancro 2 0 0 0 0 0 seminoma cancro 3 0 0 0 0 0 intestino delgado normal 2 1 0 1 0 25 baço normal 14 2 3 0 0 0 células escamosas cancro 3 0 0 0 0 0 estômago normal 3 2 2 1 0 13 estômago cancro 7 1 1 1 0 10 teratoma cancro 1 0 0 0 0 0 testículo normal 5 1 3 3 0 25 tiróide normal 15 0 0 0 0 0 tiróide cancro 6 2 1 2 0 18 indif. todos cancro 6 0 2 1 0 11 indif. cancro 5 0 2 0 0 0 1 ΡΕ1572106 REFERENCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento da patente Europeia. Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e o IEP declina quaisquer responsabilidades a esse respeito. Documentos de patentes citadas na Descrição * US4S2970QA » US 4816587 A * EF 48409? A „ * WO 83111 S I A * USS4S1SS5A * us maem a * US SSSSOSS A * WO 2602088124© A * WO '32 § 101β A * OS A * OS 57758-S6 A » WO 8S2488S A * WO 91741A » WG983S4SS « WO S4G2S02 A US 5S38SS8 A * WO 8633735 A » WO 8634086 A * OS 20030194404 A > mmmmmrA * OS 5581839 À « US 5588388 A * OS 5545637 A * US 20928189213 A - US2SQ3D3S2125A * US 5SS7810  * OS S22S27S A * US 5SB5332 A * OS 5573805 A * US 20828804215 A * WO 8201047 A US2S03S1SS317A * OS8S542S7 US 5577293 A * LSS 200123336*144772 A * US 8025148 A * W0 97S9438 A « GB 9582197 W * «S5Q3267SA * OS 4347201 A . UB 4179337 A « WOS121B2SA * US48S2538A * US 5283187 A * WO §325673 A * WO 83083921A * WO 563SS1G A * WO 3913134 A * WO 9011384 A * US 5033248  * WD 3684388 A * US 5223439 A * LSS 5703731 A * US 5498530 A. * US 5432813 A « US 5338S8S A. * US 5922S45 A « WO :9843937 A * WO S81SSS3 A. * US 20030199521  * US 20030138348 A * US 5233173 A * WO 3637177 A * WO 9S206S2 A * ys 5585277 A * US 4837028 A * US 5018389 A » US 8368393 S * US 50S7313 AtSÍBfa * US 5443353 A, Hansen « US 80428781 B Literatura que não é de patentes citada na Descrição 8. 5-25 > R-% 97e- «*·· 1;% 201-228 :« Kat>«flt sS. 19?S 9s!;2S6: 325-327 * Sudà »t aí. EfxtocrP®/. \ 392, vs. 13. §6-83 > Viam». Sosnce. 1373. voil m S75 '* WaJkaf. SWenc*. 1875. Λ m 7SS.787 > Waifcér. S&snce. 1975. vai Ι&ΤΜ&β Ash et aí. Natufe. 1930, voi. 283,8884570 Kaslsy «-! aí. J. S{x<z?Mier&es. 1992. <o>! 7.553-62 Aí&masmíst ai 1858<: 9Si3,317-333 FsfSÉRSii 8t 'iSi19SC\. voi >07. 1137-1143 assas «* ««»». j. m wfc. tt 2 ΡΕ1572106 * Bspeftsaí-sei ai. Softe Mvjsv; 4989, voí. 6,179-189 * si sl Píoc MstiÂcad Sd USA pa^-voi. 87. «áa^ftâS''; ;» Yesíiltía et st /iates 1S9S, vci. 345, 442-444: * L«Hy «*: aí. CeU -1908, vesí 93.16S-176 * fMKb ®t sí, ssádhem S&jpèys Mas- '£& 'BSfff, 4*í- 234. 127-Í4.2 * :1í®?».víá.'1S8«:áSI®^^0'': * Monç «t aí J S&sí: &stétí. 1997, *sí. 272, 25í?9-2S194 * Yasuda st aí. etdte&HJ&gsç: Í9S8, .SSL· 139, 1329-433? * Ysm&t st si.: Pf$c MaifAíStf Ssá US. 1 396, voj. 95, 3Γ097-3602 * SteíA et «k, t^&$È&T&®iiaMpmátibij$\WBA*.· voí 55, 387-394 * ÍSeatssSBstaí. .íouisstsioif OdhCiDsedicR&sssfd^,. JoxsmioíBorssríí As-sitSiirgsry. ins, 1999. ígí. 17, 688-994 * Síair «t aí. J CèH Bioi, 1966. vol- 102. 118441172 * ¥âãnSnsn <sl;si. 1433. vo! 73, 4®Μ8δ· * WaíshafsiQí ;:^t. al mm,.. 19%;· :pí,: C >79-185 * m mi 196¾ «si.
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