BRPI0506726B1 - Anticorpo monoclonal específico para m-csf e usos deste - Google Patents

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BRPI0506726B1
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Cheng Liu
Deborah Lee Zimmerman
Gregory Martin Harrowe
William Michael Kavanaugh
Kirston Koths
Li Long
Arnold H. Horwitz
Maria Calderon-Cacia
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Xoma Technology Ltd.
Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc
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Abstract

anticorpo monoclonal específico para m-csf e usos deste são fornecidos anticorpos específicos para m-csf baseados ou derivados de rx1, juntamente com composições farmacêuticas contendo tal anticorpo, kits contendo uma composição farmacêutica, e métodos de prevenção e tratamento de perda óssea em um indivíduo que sofre de uma doença osteolítica.

Description

Este pedido reivindica prioridade do Pedido Provisório U.S. N°. 60/535,181, depositado em 7 de janeiro de 2004, e Pedido Provisório U.S. N°. 60/576.417 depositado em 2 de junho de 2004, cada um desses aqui incorporado em sua totalidade por referência.
Campo técnico
Esta invenção relaciona-se a métodos para prevenção e tratamento de osteólise, metástase de câncer e perda óssea associadas a metástase de câncer por administração de um anticorpo específico a M-CSF a um indivíduo.
Fundamento da invenção
Metástase de câncer é a causa primária de recorrência pós-operatória ou pós-terapia em pacientes com câncer. A despeito de esforços intensivos para o desenvolvimento de tratamentos, a metástase de câncer permanece substancialmente refratária à terapia. O osso é um dos locais mais comuns de metástases de vários tipos de câncer humano (por exemplo, cânceres de mama, pulmão, próstata e tireoide). A ocorrência de metástases ósseas osteolíticas causa séria morbidez devido a dor intratável, alta suscetibilidade a fraturas, compressão nervosa e hipercalcemia. A despeito da importância desses problemas clínicos, há poucos tratamentos disponíveis para perda óssea associada a metástase cancerosa.
Osteoclastos medeiam a reabsorção óssea. Osteoclastos são células multinucleadas que se diferenciam de células hematopoiéticas. É aceito de forma geral que os osteoclastos são formados pela fusão de precursores mononucleares derivados de células-tronco hematopoiéticas na medula óssea, ao invés de divisão celular incompleta (Chambers, Bone and Mineral Research, 6: 125, 1989;Giithling e cols., Clin Orthop Relat R. 120: 201-228, 1976; Kahn e cols., Nature 258: 325-327, 1975, Suda e cols., Endocr Rev 13: 66-80, 1992; Walker, Science 180: 875, 1973; Walker, Science 190: 785-787, 1975; Walker, Science 190:784-785, 1975). Eles partilham uma célula-tronco comum com células de linhagem de monócito-macrófago (Ash e cols., Nature 283: 669-670, 1980, Kerby e cols., J, Bone Miner Res 10 7: 353-62, 1992) . A diferenciação de precursores deosteoclasto em osteoclastos maduros multinucleados requer diferentes fatores que incluem estímulo hormonal e local (Athanasou e cols., Bone Miner 3: 317-333, 1988; Feldman e cols., Endocrinology 107: 1137-1143, 1980; Walker, Science 15 190: 784-785, 1975; Zheng e cols., Histochem J 23: 180-188,1991) e células ósseas e osso vivo mostraram ter um papel crítico no desenvolvimento de osteoclasto (Hagenaars e cols., Bone Miner 6: 179-189, 1989). Células estromais osteoblásticas ou da medula óssea também são necessárias 20 para diferenciação de osteoclasto.
Um dos fatores produzidos por essas células que sustentam a formação de osteoclasto é o fator estimulante de colônia de macrófagos, M-CSF (Wiktor-Jedrzejczak e cols., Proc Natl Acad Sei USA 87: 4828-4832, 1990; Yoshida 25 e cols., Nature 345: 442-444, 1990). Ativador de receptor para ligante NF-x B (RANKL, também conhecido como TRANCE, ODF e OPGL) é um outro sinal (Suda e cols., Endocr Rev 13: 66-80, 1992) através do qual células osteoblásticas/estromais estimulam a formação de 30 osteoclastos e reabsorção via um receptor, RANK (TRANCER), Biochem Biophys Res Co 234: 137-142, 1997; Wong e cols., J Exp Med 186: 2075-2080, 1997; Wong e cols., J Biol. Chem 272: 25190-25194, 1997; Yasuda e cols., Endocrinology 139: 1329-1337, 1998; Yasuda e cols., Proc Natl Acad Sci US 95: 3597-3602, 1998). Osteoblastos também secretam uma proteína que inibe firmemente a formação de osteoclasto chamada osteoprotegerina (OPG, também conhecida como OCIF), que age como um receptor isca para RANKL assim inibindo o sinal positivo entre osteoclastos e osteoblastos via RANK e RANKL.
Osteoclastos são responsáveis pela dissolução de matriz óssea mineral e orgânica (Blair e cols., J Cell Biol 102: 1164-1172, 1986). Osteoclastos representam células de diferenciação terminal que expressam uma morfologia polarizada única com áreas de membrana especializada e vários marcadores de membrana e citoplasmáticos, como fosfatase ácida resistente a tartrato (TRAP) (Anderson e cols. 1979), anidrase carbônica II (Vãanãnen e cols., Histochemistry 78: 481-485, 1983), receptor de calcitonina (Warshafsky e cols., Bone 6: 179-185, 1985) e receptor de vitronectina (Davies e cols., J Cell Biol 109: 1817-1826, 1989) . Osteoclastos multinucleados contêm comumente menos de 10 núcleos, mas eles podem conter até 100 núcleos tendo entre 10 e 100 μm de diâmetro (Gõthling e cols., Clin Orthop Relat R 120: 201-228, 1976). Isso os torna relativamente fáceis de serem identificados por microscopia ótica. Eles são altamente vacuolados quando no estado ativo, e também contêm várias mitocôndrias, indicativo de uma alta taxa metabólica (Mundy, in Primer on the metabolic bone diseases and disorders of mineral metabolism, páginas 18-22, 1990) . Uma vez que os osteoclastos têm um papel principal nas metástases ósseas osteolíticas, há uma 5 necessidade na técnica por novos agentes e métodos para a prevenção do estímulo e função de osteoclasto.
Portanto, permanece uma necessidade na técnica de identificar novos agentes e métodos para prevenir ou tratar osteólise ou metástase cancerosa, incluindo metástases 10 ósseas osteolíticas.
Sumário da invenção
Os materiais e métodos da presente invenção preenchem as necessidades anteriormente mencionadas e outras relacionadas na técnica. Em uma modalidade da invenção, é 15 fornecido um anticorpo monoclonal não murídeo, incluindo fragmento funcional, que se liga especificamente ao mesmo epitopo de M-CSF como qualquer um dos anticorpos monoclonais de murídeo RX1, MCI, ou MC3 tendo as seqüências de aminoácidos apresentadas nas Figuras 4, 14 e 15, respectivamente. Em uma modalidade relacionada, é fornecido um anticorpo previamente mencionado no qual o anticorpo é selecionado do grupo que consiste em um anticorpo policlonal; um anticorpo monoclonal incluindo um anticorpo Human Engineered™; um anticorpo humanizado; um anticorpo humano; um anticorpo quimérico; fragmento de anticorpo Fab, F(ab')2; Fv; Sc Fv ou SCA; um diacorpo; anticorpo linear; ou uma muteína de qualquer um desses anticorpos, que retém preferivelmente afinidade de ligação de pelo menos 10’7, 10' 8 ou 10'9 ou maior. Um anticorpo monoclonal não murídeo, 30 incluindo fragmento funcional, que compete com anticorpo monoclonal RX1, MCI, e/ou MC3 tendo a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 4 para ligação a M-CSF em mais de 75%, também é contemplada.
Em uma outra modalidade, é fornecido um anticorpo 5 monoclonal não murídeo, incluindo fragmento funcional, onde o referido anticorpo monoclonal não murídeo ou fragmento funcional deste liga um epitopo de M-CSF que inclui pelo menos 4, 5, 6, 7 ou 8 resíduos contíguos de aminoácidos 98105 da Figura 12.
Em uma outra modalidade, a invenção fornece um anticorpo monoclonal não murídeo, que inclui fragmento funcional, onde o referido anticorpo monoclonal não murídeo ou fragmento funcional deste liga um epitopo de M-CSF que inclui pelo menos 4, 5, 6, 7 ou 8 resíduos contíguos de aminoácidos 65-73 ou 138-144 da Figura 12 (que correspondem a Epitopos de M-CSF reconhecidos por 5H4 ou MC3).
Ainda em uma outra modalidade, é fornecido o anticorpo ou fragmento anteriormente mencionado que liga um epitopo de M-CSF que inclui aminoácidos 98-105 da Figura 12. Em uma 20 modalidade relacionada, é fornecido o anticorpo anteriormente mencionado que compreende CDR3 da Figura 4A. Em uma outra modalidade, é fornecido o anticorpo que compreende pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 CDRs de anticorpo RX1 de murídeo apresentado na Figura 4A. Tal anticorpo que 2 5 compreende pelo menos 1, 2, 3, 4, ou 5 CDRs de anticorpo RX1 de murídeo também pode compreender pelo menos 1, 2, 3, 4, ou 5 CDRs de qualquer um dos 6 CDRs do anticorpo 5H4 apresentado na Figura 16A-B. Alternativamente, o anticorpo que compreende pelo menos 1, 2, 3, 4, ou 5 CDRs do anticorpo RX1 de murídeo também pode compreender pelo menos - 1, 2, 3, 4, ou 5 CDRs de qualquer uma das 6 CDRs de anticorpo MCI apresentadas na Figura 16A-B. Ainda em uma outra alternativa, o anticorpo anteriormente mencionado também pode compreender pelo menos 1, 2, 3, 4, ou 5 CDRs de qualquer uma das 6 CDRs de anticorpo MC3 apresentadas na Figura 16A-B. Em uma modalidade relacionada, é fornecido o anticorpo que compreende pelo menos 1, 2, 3, 4, ou 5 CDRs de anticorpo RX1 de murídeo e pode compreender pelo menos 1, 2, 3, 4 ou 5 CDRs das CDRs de consenso apresentadas na Figura 16A-B. Ainda em uma outra modalidade relacionada, no anticorpo anteriormente mencionado, um ou mais resíduos da CDR(s) de consenso é substituído pelo resíduo correspondente de qualquer uma das CDRs de anticorpo de murídeo RX1, 5H4, MCI ou MC3. A afinidade de ligação desejada pode ser retida embora um ou mais dos aminoácidos no anticorpo tenham sido mutados, por exemplo, por substituições conservadoras nas CDRs, e/ou mudanças conservadoras ou não conservadoras nos resíduos de risco baixo ou moderado.
Em uma outra modalidade da invenção, variantes do anticorpo anteriormente mencionado são fornecidas, compreendendo uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada variável que é pelo menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99% homóloga à sequência de aminoácidos apresentada nas Figuras 4A, 13, 14, ou 15. Em uma modalidade relacionada, o anticorpo compreende uma seqüência de aminoácidos de cadeia leve variável que é pelo menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99% homóloga à seqüência de aminoácidos apresentada nas Figuras 4A, 13, 14, ou 15.
Ainda em uma outra modalidade, o anticorpo compreende uma região constante e uma ou mais regiões de estrutura variável de cadeia pesada e leve de uma seqüência de anticorpo humano. Em uma modalidade relacionada, o 5 anticorpo compreende uma região constante modificada ou não modificada de uma IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana. Em uma modalidade preferida, a região constante é IgGl ou IgG4 humana, que pode ser opcionalmente modificada para melhorar ou diminuir certas propriedades. No caso de IgGl, 10 modificações à região constante, particularmente a articulação ou região de CH2, podem aumentar ou diminuir a função efetora, incluindo atividade de ADCC e/ou CDC. Em outras modalidades, uma região constante de IgG2 émodificada para diminuir a formação de agregado antígeno- 15 anticorpo. No caso da IgG4, modificações à região constante, particularmente a região de articulação, podem reduzir a formação de meio-anticorpos.
Ainda em uma outra modalidade da invenção, o anticorpo anteriormente mencionado ê derivado de, baseado em, ou 20 contém parte de uma seqüência de consenso humana, seqüência de linha germinativa humana, seqüência de linha germinativa de consenso humana, ou qualquer uma das sequências de anticorpo humano em Kabat, NCBI Ig Blast, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/ showGermline.cgi, Kabat Database http://www.bioinf.org.uk/ abs/segtest.html, FTP site for Kabat Release 5.0 (1992) ftp://ftp.ncbi.nih.gov/repository/kabat/Rel5.0/, ImMunoGeneTics database (Montpellier France) http://imgt.cnusc.fr:8104/, V-Base http://www.mrc- cpe.cam.ac.uk/LIST.php?menu=901, Zurich University http://ww.unizh.ch/--anticorpo/Sequences/index.html, The Therapeutic Antibody Human Homology Project (TAHHP) http://www.path.cam.ac.uk/-mrc7/humanisation/TAHHP.html, protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Domains 5 http://how.to/AnalyseAnticorpos/, Humanization by designhttp://people.cryst.bbk.ac.uk/-ubcg07s/, Antibody Resources http://www.anticorporesource.com/educational.html, Anticorpo Engineering (by TT Wu), Humana Press.
Em um aspecto preferido da invenção, o anticorpo anteriormente mencionado é um anticorpo Human EngineeredTM.
Por exemplo, a sequência de anticorpo Human EngineeredTM é qualquer uma das sequências apresentadas nas Figuras 23-24. Outros anticorpos Human EngineeredTM ou variantes destes são contemplados.
Por exemplo, em uma modalidade, o anticorpo baseado em RX1 anteriormente mencionado é fornecido, no qual a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos XÍVX2LX3EX4GX5X6X7X8X9XÍQXHXÍ2XÍ3LX14LXÍ5CXÍ6VXÍ7DYSITSDYAWNWIXÍB QXÍ9X20X2ÍX22X23LX24WMGYISYSGSTSX25NX26X27LX28X29X30IX3ÍIX32RX33 X34X35X36X37X33FX39LX4OLX41X42VX43X44X45DX46AX47YYCASFDYAHAMDYWGX48GT X4 9VX5oVXsiX52 (Id. de Seq. N° : 124), onde X é qualquer aminoácido. Em uma modalidade relacionada, é fornecido o anticorpo no qual a região variável de cadeia pesada 25 compreende a seqüência de aminoácidos DVX1LX2EXJGPX4XsVX6PX7XgX9LX1()LX|1CXI2VTDYSITSDYAWNWIRQXl3PXI4X15K LEWMGYISYSGSTSYNPSLKX16RIX17lXlsRX19TX20X21NX22FX23LX24LX2iX26VX27X2SX 29DX30ATYYCASFDYAH AMDYWGXj 1 GTX32VX33VX34X3 3 (Id. de Seq. N°: 125), onde X é qualquer aminoácido.
Ainda em uma outra modalidade da invenção, o anticorpo * anteriormente mencionado é fornecido, no qual a região variável de cadeia pesada compreende a seqüência de aminoácidos X1VQLQESGPGLVKPSQX2LSLTCTVX3DYSITSDYAWNWIRQFPGX4X5LEWMGYISY 5 SGSTS YNPSLKSRIX&IX7RDTSKNQFX8LQLNSVTX9XIODTAXI , YYCASFDYAHAMDY WGQGTX12VTVSS (Id. de Seq. N°: 126), onde X é qualquer aminoácido. Em uma modalidade relacionada, o anticorpo é fornecido, onde a região variável de cadeia pesada compreende a seqüência de 10 aminoácidos DVQLQESGPGLVKPSQX1LSLTCTVTDYSITSDYAWNWIRQFPGX2KLEWMGYISYSG STSYNPSLKSRIXjLXiRDTSKNQFXjLQLNSVTX^DTATYYCASFDYAHAMDYWGQ GTXsVTVSS (Id. de Seq. N°: 127), onde X é qualquer aminoácido. Ainda 15 em uma outra modalidade, o anticorpo é fornecido onde a região variável de cadeia pesada compreende a seqüência de aminoácidos DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVTDYSITSDYAWNWIRQFPGKKLEWMGYISYSGS TSYNPSLKSRITISRDTSKNQFSLQLNSVTAADTATYYCASFDYAHAMDYWGQGTTV TVSS (Id. de Seq. N° : 41). Era uma outra modalidade, o anticorpo é fornecido onde a região variável de cadeia pesada compreende a seqüência de aminoácidos QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSDYSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWMGYISYSGS TSYNPSLKSRITISRDTS KNQF S LQLNSVTAADTAVYYCAS FD YAHAMD YWGQGTT VTVSS (Id. de Seq. N°: 43).
Em uma outra modalidade da invenção, o anticorpo anteriormente mencionado é fornecido onde a região variável de cadeia leve compreende a seqüência de aminoácidos X|IX2LX3QX4X5X6X7X8Xí)VXJOX11XI2Xt3X14VX15FX16CXnAXIJ|QSIGTSIHWYX19QX20X □ n 2|X22X23X24PX25LLIKYASEX2δX27X2gX29lX3θX3iX32FX33GX34GX35GX36Xj7FX38LX39IX4θ X41VX42X43X44DX45ADYYCQQINS WPTTFGX4ÕGTX47LX48X49X50X51 xi2 (Id. de Seq. N°: 128), onde X é qualquer aminoácido. Em uma modalidade relacionada, o anticorpo é fornecido onde a região variável de cadeia leve compreende a seqüência de aminoácidos X) lX2LX3QX4PX5X6LX7VX8PX9X10Xi j VX12FXi3CX14ASQ$IGTSIHWYQQX15TXI6Xl7SP RLLIKYASEXI8ISX19IPX2ORFX21GX22GX23GX24X25FX26LX27IX2SX29VX3OX31X32DXJ3AD YYCQQINSWPTTFGX34GTX35LX36X37X3gX39X4a (Id. de Seq. N°: 129), onde X é qualquer aminoácido. Ainda em uma outra modalidade, o anticorpo é fornecido onde a região variável de cadeia leve compreende a seqüência de aminoácidos XJXzLTQSPXsXXSVSPGERVXjFSCRASQSIGTSIHWYQQXéTX^XsPRLLIKYASEX ^XuXuGIPXuRFSGSGSGTDFTLXMlXuXiôVESEDXnADYYCQQINSWPTTFGXiíGT KLEIKRX19(Id. de Seq. N°: 130), onde X é qualquer aminoácido.
Em uma outra modalidade da invenção, o anticorpo anteriormente mencionado é fornecido onde a região variável de cadeia leve compreende a seqüência de aminoácidos XiIX2LTQSPX3X4LSVSPGERVX5FSCRASQSIGTSIHWYQQX6TX7X8SPRJLLIKYASEX9I SGIPXIORFSGSGSGTDFTLXHIXIÍXUVESEDXKADYYCQQINSWPTTFGX^GTKLEIKRX16 (Id. de Seq. N°: 131), onde X é qualquer aminoácido. Em uma modalidade relacionada, o anticorpo é fornecido onde a 25 região variável de cadeia leve compreende a seqüência de aminoácidos Xi^LTQSPXjXaLSVSPGERVXsFSCRASQSIGTSIHWYQQXúTX-jXsXíPRLLIKYASESI SGTPX|0RFSGSGSGTDFTLXiiIX|2Xi3VESEDX|4ADYYCQQINSWPTTFGXlsGTKLEIKRXIÚ (Id. de Seq. N°: 132), onde X é qualquer aminoácido. Ainda - em uma outra modalidade, o anticorpo é fornecido onde a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos EIVLTQS PGTLSVSPGERVTFSCRASQSIGTSIHWYQQKTGQAPRLLIKYASESISGIP 5 DRFSGSGSGTDFTLTISRVESEDFADYYCQQINSWPTTFGQGTKLEIKRT (Id. de Seq. N°: 45).
Em uma outra modalidade da invenção, o anticorpo anteriormente mencionado é fornecido onde a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos 10 EIVLTQSPGTLSVSPGERVTFSCRASQSIGTSIHWYQQKTGQAPRLLIKYASERATGIP DRFSGSGSGTDFTLTISRVESEDFADYYCQQINSWPTTFGQGTKLEIKRT (Id. de Seq. N° : 47) . Em uma outra modalidade, o anticorpo é fornecido, onde a região variável de cadeia leve compreende a seqüência de aminoácidos EIVLTQSPGTLSVSPGERVTFSCRASQSIGTSIHWYQQKTGQSPRLLIKYASERISGIP D RFSGSGSGTDFTLTISRVESEDFADYYCQQINSWPTTFGQGTKLEIKRT (Id. de Seq. N°: 48).
Em uma outra modalidade da invenção, é fornecido o anticorpo anteriormente mencionado onde pelo menos um X é 20 um aminoácido correspondente na seqüência de aminoácidos apresentada na Figura 4A. Em uma modalidade relacionada, o anticorpo é fornecido onde pelo menos um X é uma substituição conservadora (de acordo com a tabela 1) de um aminoácido correspondente na seqüência de aminoácidos 25 apresentada na Figura 4A. Ainda em uma outra modalidade relacionada, o anticorpo é fornecido onde pelo menos um X é uma substituição não-conservadora (de acordo com a Tabela 1) de um aminoácido correspondente na seqüência de aminoácidos apresentada na Figura 4A. Ainda em uma outra 30 modalidade da invenção, o anticorpo é fornecido onde pelo menos um X é um aminoácido correspondente em uma seqüência de anticorpo humano.
O anticorpo Human Engineered anteriormente mencionado é derivado de, baseado em, ou contém parte da seqüência de 5 consenso de anticorpo humano, seqüência de linhagerminativa humana, seqüência de linha germinativa de consenso humana, ou qualquer uma das seqüências de anticorpo humano em Kabat, NCBI Ig Blast, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/showGermline.cgi, Kabat 10 Database http://www.bioinf.org.uk/abs/segtest.html, FTP site for Kabat Release 5.0 (1992) ftp://ftp.ncbi.nih.gov/repository/kabat/Re15.0/, ImMunoGeneTics database (Montpellier France) http://imgt.cnusc.fr:8104/, V-Base http://www.mrc-5 cpe.cam.ac.uk/LIST.php?menu=9 01, Zurich University http://www.unizh.ch/-anticorpo/Sequences/index.html, The Therapeutic Antibody Human Homology Project (TAHHP) http://www.path.cam.ac.uk/-mrc7/humanisation/TAHHP.html, Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Domains http://how.to/AnalyseAnticorpos/, Humanization by design http://people.crvst.bbk.ac.uk/-ubcg07s/, Antibody Resources http://www.anticorporesource.com/educational.html, Antibody Engineering (by TT Wu), Human Press.
Em uma outra modalidade da invenção, é fornecido o 25 anticorpo anteriormente mencionado no qual a seqüência de anticorpo Human EngineeredTM é uma das seqüências apresentadas nas Figuras 23-24 ou 29-30. Em uma outra modalidade, o anticorpo compreende uma seqüência de aminoácidos de cadeia pesada variável que é pelo menos 60, 30 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99% idêntica a uma das sequências de aminoácidos de cadeia pesada apresentadas na Figura 19B. Ainda modalidade, o anticorpo compreende uma seqüencia de aminoácidos de cadeia leve variável que é pelo menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99% idêntica a uma das sequências de aminoácidos de cadeia leve apresentadas em qualquer uma das Figuras 20B-22B.
Ainda em uma outra modalidade, o anticorpo anteriormente mencionado como anticorpo 5H4, MC 1 ou MC3 com as sequências apresentadas em uma das Figuras 24C-24E é Human EngineeredTM de acordo com os métodos apresentados em Studnicka e cols., Patente U.S. N°: 5.766.886 e Exemplo 4A aqui, usando a numeração de Kabat apresentada nas Figuras 24C-24E para identificar resíduos de baixo, moderado e alto risco. Em uma modalidade relacionada, o anticorpo anteriormente mencionado é fornecido onde todos os resíduos de baixo risco da cadeia pesada ou leve ou ambas são modificados, quando necessário, para serem os mesmos resíduos que uma seqüência de imunoglobulina humana de referência. De forma similar, uma outra modalidade da invenção fornece o anticorpo anteriormente mencionado onde todos os resíduos de baixo e moderado risco da cadeia pesada ou leve ou ambas são modificados, quando necessário, para serem os mesmos resíduos que uma seqüência de imunoglobulina humana de referência. Uma cadeia pesada onde todos os resíduos de risco baixo foram modificados pode ser combinada com uma cadeia leve onde todos os resíduos de risco baixo e moderado foram modificados e vice-versa. De modo similar, uma cadeia leve ou pesada de Human EngineeredTM pode ser combinada com uma cadeia leve ou pesada de um anticorpo humanizado ou quimérico.
Em uma outra modalidade, o anticorpo compreende uma seqüência de aminoácidos de cadeia pesada variável que é pelo menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 5 96, 97, 98, ou 99% idêntica a uma das seqüências de aminoácidos de cadeia pesada descritas imediatamente acima Human EngineeredTM de acordo com o método de Studnicka. Ainda em uma outra modalidade, o anticorpo compreende uma seqüência de aminoácidos de cadeia leve variável que é pelo 10 menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99% idêntica a uma das seqüências de aminoácidos de cadeia leve descritas imediatamente acima de Human EngineeredTM de acordo com o método de Studnicka.
Ainda em uma outra modalidade, é fornecido um 15 anticorpo que compreende uma cadeia pesada como acima apresentado e uma cadeia leve como acima apresentado.
Ainda em uma outra modalidade da invenção, o anticorpo anteriormente mencionado tem uma afinidade Kd de pelo menos 10[-7] . Em uma modalidade relacionada, o anticorpo tem uma 20 afinidade Kd de pelo menos 10[-9].
Em uma outra modalidade da invenção, é fornecido o anticorpo anteriormente mencionado que é um anticorpo policlonal; um anticorpo monoclonal que inclui um anticorpo Human Engineered™; um anticorpo humanizado; um anticorpo 25 humano; um anticorpo quimérico; fragmento de anticorpo Fab, F(ab')2, Fv, ScFv ou SCA; um diacorpo; um anticorpo linear; ou uma muteína de qualquer um desses anticorpos. Em uma modalidade relacionada, o anticorpo monoclonal é um anticorpo isolado.
Ainda em uma outra modalidade da invenção, é fornecido um ácido nucleico isolado que compreende uma seqüência de ácidos nucleicos que codifica uma cadeia leve do anticorpo anteriormente mencionado. Em uma modalidade relacionada, o ácido nucleico isolado compreende uma seqüência de ácidos 5 nucleicos de cadeia pesada que é pelo menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99% idêntica à seqüência de nucleotídeos de cadeia pesada apresentada nas Figuras 4A, 13, 14, ou 15. Ainda em uma outra modalidade relacionada, o ácido nucleico isolado compreende 10 uma seqüência de ácidos nucleicos de cadeia leve que é pelo menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99% idêntica à seqüência de nucleotídeos de cadeia leve apresentada nas Figuras 4A, 13, 14, ou 15.
Em uma outra modalidade, é fornecido um vetor que 15 compreende o ácido nucleico isolado anteriormente mencionado. Em uma modalidade relacionada, é fornecido o vetor anteriormente mencionado no qual o ácido nucleico isolado é operacionalmente ligado a uma seqüência de controle reguladora. Ainda em uma outra modalidade, é 20 fornecida uma célula hospedeira que compreende o vetor anteriormente mencionado.
Numerosos métodos são contemplados na presente invenção. Por exemplo, é fornecido um método de produção do anticorpo anteriormente mencionado que compreende a cultura 25 da célula hospedeira anteriormente mencionada de forma que o ácido nucleico isolado é expresso para produzir o anticorpo. Em uma modalidade relacionada, o método também compreende a etapa de recuperação do anticorpo da cultura de célula hospedeira. Em uma modalidade relacionada, é 30 fornecido um anticorpo isolado produzido pelo método anteriormente mencionado.
Um hibridoma que secreta um anticorpo anteriormente mencionado também é fornecido pela presente invenção. Adicionalmente, é fornecido um anticorpo anteriormente mencionado que é conjugado a uma toxina.
Em uma outra modalidade da invenção, é fornecida uma composição farmacêutica que compreende qualquer um dos anticorpos anteriormente mencionados e um transportador, excipiente ou diluente, farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade relacionada, a composição farmacêutica também compreende um segundo agente terapêutico. Ainda em uma outra modalidade relacionada, é fornecida a composição farmacêutica na qual o segundo agente terapêutico é um agente quimioterápico de câncer. Em uma outra modalidade relacionada, é fornecida a composição farmacêutica na qual o segundo agente terapêutico é um bisfosfonato. Em uma outra modalidade, o segundo agente terapêutico é um outro anticorpo.
Anticorpos da presente invenção são contemplados por terem numerosas características desejadas para o tratamento de doenças e distúrbios. Em uma modalidade da invenção, é fornecido qualquer um dos anticorpos anteriormente mencionados que se ligam a um M-CSF para prevenir um indivíduo que tem a doença que causa ou contribui para osteólise, na qual o anticorpo reduz, de forma eficaz, a severidade da perda óssea associada à doença. De modo similar, é fornecido qualquer um dos anticorpos anteriormente mencionados que se ligam a M-CSF para o tratamento de um indivíduo que tem a doença que causa ou contribui para osteólise, onde o referido anticorpo reduz, de forma eficaz, a severidade da perda óssea associada à doença.
Numerosas doenças e distúrbios são contemplados como sendo tratáveis pelo tratamento baseado em anticorpo na presente invenção. Em uma modalidade da invenção, o anticorpo anteriormente mencionado é fornecido onde a referida doença é selecionada do grupo que consiste em doenças ósseas metabólicas associadas a atividade de osteoclasto relativamente aumentada, incluindo endocrinopatias (hipercortisolismo, hipogonadismo, hiperparatireoidismo primário ou secundário, hipertireoidismo), hipercalcemia, estados de deficiência (raquitismo/osteomalácia, escorbuto, desnutrição), doenças crônicas (síndromes desabsortivas, insuficiência renal crônica (osteodistrofia renal), doença hepática crônica (osteodistrofia hepática)), medicamentos (glicocorticóides (osteoporose induzida por glicocorticóide), heparina, álcool), e doenças hereditárias (osteogenesis imperfecta, homocistinúria), câncer, osteoporose, osteopetrose, inflamação óssea associada a artrite e artrite reumatóide, doença periodontal , displasia fibrosa, e/ou doença de Paget.
Em uma modalidade relacionada, o anticorpo anteriormente mencionado que se liga a M-CSF é fornecido para prevenção ou tratamento de câncer metastático ao osso, onde o câncer metastático é câncer de mama, pulmonar, renal, mieloma múltiplo, tireóide, próstata, adenocarcinoma, malignidades de células sanguíneas, incluindo leucemia e linfoma; cânceres da cabeça e pescoço; cânceres gastrointestinais, incluindo câncer esofagiano, gástrico, câncer de cólon, câncer intestinal, câncer colo- retal, câncer retal, câncer pancreático, câncer hepático, câncer do duto ou da vesícula biliar; malignidades do trato genital feminino, incluindo carcinoma ovariano, cânceres endometriais uterinos, câncer vaginal e câncer cervical; câncer da bexiga; câncer cerebral incluindo neuroblastoma; sarcoma, osteossarcoma; e câncer epitelial, incluindo melanoma ou câncer de célula escamosa.
Em uma outra modalidade da invenção, é fornecido um método de rastreamento de um anticorpo específico para M- CSF que compreende as etapas de contato do meio de células tumorais metastáticas, osteoclastos e um anticorpo candidato; detecção da formação de osteoclasto, proliferação e/ou diferenciação; e identificação do referido anticorpo candidato como um anticorpo específico para M-CSF se uma diminuição na formação, proliferação e/ou diferenciação de osteoclastos for detectada. De modo similar, é fornecido o método anteriormente mencionado onde o referido meio de células tumorais metastáticas inclui células tumorais.
Em uma outra modalidade, o método acima mencionado é fornecido onde a etapa de contato (a) ocorre in vivo, a referida etapa de detecção (b) compreende a detecção do tamanho e/ou números de metástases ósseas, e o anticorpo candidato é identificado como um anticorpo específico para M-CSF se uma diminuição no tamanho e/ou número de metástases ósseas for detectada. Em uma modalidade relacionada, o método anteriormente mencionado é fornecido também compreendendo a etapa de determinar se o anticorpo candidato se liga a M-CSF. De modo similar, uma outra modalidade da invenção fornece o método anteriormente mencionado que também compreende a etapa de determinar se o referido anticorpo candidato inibe a interação entre M-CSF e seu receptor M-CSFR.
Em uma outra modalidade da invenção, é fornecido um método de identificação de um anticorpo específico para M- CSF que pode evitar ou tratar câncer metastático ao osso, que compreende as etapas de: (a) detecção da ligação de um anticorpo candidato a um epitopo de M-CSF que inclui pelo menos 4 resíduos contíguos de aminoácidos 98-105 da Figura 12; e (b) análise da capacidade do referido anticorpo candidato para prevenir ou tratar câncer metastático ao osso in vitro ou in vivo.
Em uma outra modalidade da invenção, é fornecido um método de identificação de um anticorpo específico para M- CSF que pode evitar ou tratar câncer metastático ao osso, que compreende as etapas de: (a) detecção da ligação de um anticorpo candidato a um epitopo de M-CSF que inclui pelo menos 4 resíduos contíguos de aminoácidos 65-73 ou 138-144 da Figura 12 (que correspondem a Epitopos de M-CSF reconhecidos por 5H4 ou MC3); e (b) análise da capacidade do referido anticorpo candidato para prevenir ou tratar câncer metastático ao osso in vitro ou in vivo.
Ainda em uma outra modalidade da invenção, é fornecido um método de alteração de um CDR de um anticorpo que liga um epitopo de M-CSF que inclui aminoácidos 98-105 da Figura 12 que compreende a alteração de um aminoácido em um CDR da seqüência de aminoácidos apresentada na Figura 4A e seleção por um anticorpo que se ligue a M-CSF com uma afinidade Ka de pelo menos 10 [-7] . Em uma outra modalidade, é fornecido um método de alteração sistemática de até 60% da seqüência de aminoácidos de cadeia pesada apresentada na Figura 4A que compreende a alteração de qualquer um de X1-X52 na seqüência de aminoácidos X|VX2LX3EX4GXsX(IX7X8X9Xl0XuX12X13LX]4LX15CXi6VXi7DYSITSDYAWNWIXl8QX 19X20X21X22X23LX24WMGYIS YSGSTSXIJNX^XJTLX^XJSXJOIXS I JX32RX33X3<IX35X36X37X 38FX39LX4iLX4iX42VX43X44X4jDX46AX47YYCASFDYAHAMDYWGX4βGTX4<)VXJoVXJ| X52 (Id. de Seq. N°: 133), e teste de um anticorpo que compreende a seqüência de aminoácidos alterada para ligação a um epitopo de M-CSF que inclui aminoácidos 98-105 da Figura 12.
Em uma modalidade relacionada, é fornecido um método de alteração sistemática de até 60% da seqüência de aminoácidos de cadeia leve apresentada na Figura 4A que compreende a alteração de qualquer um de X1-X52 na seqüência de aminoácidos X1IX2LX3QX4X5X6X7XSX9 VXI OX ], X12X1 íX, 4 VX, 5FX! óCX 17 AX1eQSIGTSIHWYXj 9QX20X 21X22X23X24PX25LLIKYASEX26X27X2gX2yIX3oXj1X32FX33GX34GX35GX3íXj7FX38LXJ9IX4O X4|VX42X43X44DX45ADYYCQQINSWPTTFGX46GTX47LX48X49X5OXS|X52 (Id. de Seq. N° : 134), e teste de um anticorpo que compreende a seqüência de aminoácidos alterada para ligação a um epitopo de M-CSF que inclui aminoácidos 98-105 da Figura 12.
Ainda em uma outra modalidade da invenção, é fornecido um método de alteração de um CDR de um anticorpo que liga um epitopo de M-CSF que inclui aminoácidos 65-73 ou 138-144 da Figura 12 (que correspondem a Epitopos de M-CSF reconhecidos por 5H4 ou MC3) que compreende a alteração de um aminoácido em uma CDR da seqüência de aminoácidos apresentada em uma das Figuras 13, 14 e 15 e seleção para um anticorpo que se liga a M-CSF com uma afinidade Ka de pelo menos 10[-7] . Em uma outra modalidade, é fornecido um método de alteração sistemática de até 60% da seqüência de aminoácidos de cadeia pesada apresentada em uma das Figuras 5 13, 14 e 15, que compreende a alteração das sequências acima mencionadas de acordo com os métodos apresentados em Studnicka e cols., Patente U.S. N°: 5.766.886 e Exemplo 4A nessa, e de acordo com a numeração de Kabat apresentada nas Figuras 24C-24E, e teste de um anticorpo que compreende a 10 seqüência de aminoácidos alterada para ligação a um epitopo de M-CSF que inclui aminoácidos 65-73 ou 138-144 da Figura 12 (que correspondem a Epitopos de M-CSF reconhecidos por 5H4 ou MC3) . Em uma modalidade relacionada, todos os resíduos de risco baixo são modificados. De modo similar, 15 em uma outra modalidade da invenção, todos os resíduos de risco baixo e moderado são modificados. Ainda em uma outra modalidade, todos os resíduos de risco baixo e moderado que excluem prolinas são modificados.
Em uma outra modalidade da invenção, é fornecido um 2 0 método de expressar um anticorpo que tem CDRs projetadas pelo processo acima mencionado. Em uma outra modalidade, é provida uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo que se liga a MCSF na qual o referido anticorpo é feito usando o método anteriormente mencionado.
Ainda em uma outra modalidade da invenção, é provido um método de prevenção ou redução da perda óssea que compreende a administração a um indivíduo com a doença que causa ou contribui para osteólise, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer um dos anticorpos 30 anteriormente mencionados, através disso fazendo a prevenção ou redução da perda óssea associada à doença. Em uma modalidade relacionada, é fornecido um método de tratamento de um indivíduo com a doença que causa ou contribui para osteólise que compreende a administração ao referido indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo de qualquer um dos anticorpos anteriormente mencionados, dessa forma reduzindo a severidade da perda óssea associadas à doença.
Em uma modalidade relacionada, é fornecido o método anteriormente mencionado no qual a referida doença é selecionada do grupo que consiste em doenças ósseas metabólicas associadas a atividade de osteoclasto relativamente aumentada, incluindo endocrinopatias (hipercortisolismo, hipogonadismo, hiperparatireoidismo primário ou secundário, hipertireoidismo), hipercalcemia, estados de deficiência (raquitismo/osteomalácia, escorbuto, desnutrição), doenças crônicas (síndromes desabsortivas, insuficiência renal crônica (osteodistrofia renal), doença hepática crônica (osteodistrofia hepática) ) , medicamentos (glicocorticóides (osteoporose induzida por glicocorticóide), heparina, álcool) , e doenças hereditárias {osteogenesis imperfecta, homocistinúria), câncer, osteoporose, osteopetrose, inflamação óssea associada a artrite e artrite reumatóide, doença periodontal , displasia fibrosa, e/ou doença de Paget.
Ainda em uma outra modalidade, é fornecido um método de prevenção ou tratamento de câncer metastático ao osso que compreende a administração a um indivíduo com câncer metastático de uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer um dos anticorpos anteriormente mencionados. Em *" uma modalidade relacionada, o método é fornecido onde o câncer metastático é câncer de mama, pulmonar, renal, mieloma múltiplo, tireoide, próstata, adenocarcinoma, malignidades de células sanguíneas, incluindo leucemia e linfoma; cânceres da cabeça e pescoço; cancers gastrointestinais, incluindo câncer esofagiano, gástrico, câncer de cólon, câncer intestinal, câncer colo-retal, câncer retal, câncer pancreático, câncer hepático, câncer do duto ou da vesícula biliar; malignidades do trato genital feminino, incluindo carcinoma ovariano, cânceres endometriais uterinos, câncer vaginal e câncer cervical; câncer da bexiga; câncer cerebral incluindo neuroblastoma; sarcoma, osteossarcoma; e câncer epitelial, incluindo melanoma ou câncer de célula escamosa.
Ainda em uma outra modalidade da invenção, é fornecido um método de prevenção da perda óssea e crescimento tumoral que compreende a administração em um indivíduo em necessidade desse de quantidades terapeuticamente eficazes de qualquer um dos anticorpos anteriormente mencionados. Em uma modalidade relacionada, o método também compreende a administração de um segundo agente terapêutico. Ainda em uma outra modalidade relacionada, é fornecido o método no qual o segundo agente terapêutico é um agente quimioterápico de câncer ou um bisfosfonato. Ainda em uma outra modalidade relacionada, é fornecido o método no qual o bisfonato é zeledronato, pamidronato, clodronato, etidronato, tilundronato, alendronato ou ibandronato. Ainda em uma outra modalidade relacionada, são fornecidos os métodos acima mencionados nos quais o agente terapêutico é um agente quimioterápico citotóxico. Em uma outra modalidade, é fornecido o método anteriormente mencionado no qual o indivíduo é impedido de receber tratamento com bisfosfonato.
Ainda em uma outra modalidade relacionada, o método anteriormente mencionado é fornecido no qual o anticorpo é eficaz para reduzir a dosagem do segundo agente terapêutico necessária para atingir um efeito terapêutico. Em uma outra modalidade, o segundo agente terapêutico é um fator estimulante de colônia não M-CSF, por exemplo, G-CSF, ou anticorpo anti-RANKL, ou receptor solúvel de RANKL.
Em uma outra modalidade da invenção, os métodos anteriormente mencionados são fornecidos nos quais o indivíduo é um mamífero. Em uma modalidade relacionada, o mamífero é humano.
Em uma outra modalidade, os métodos anteriormente mencionados são fornecidos nos quais o anticorpo inibe a interação entre M-CSF e seu receptor (M-CSFR). Em uma outra modalidade relacionada, o anticorpo inibe a proliferação e/ou diferenciação de osteoclasto induzida por células tumorais. Ainda em uma outra modalidade, os métodos anteriormente mencionados são fornecidos nos quais o anticorpo é administrado em uma dose entre cerca de 2 μg/kg a 30 mg/kg, 0,1 mg/kg a 30 mg/kg ou 0,1 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal.
Em uma outra modalidade da invenção, o uso de um anticorpo da invenção é contemplado na manufatura de um medicamento para prevenção ou redução da perda óssea em um paciente que exibe sintomas de osteólise e na manufatura de um medicamento para o tratamento de um paciente com a doença que causa ou contribui para osteólise. O uso anteriormente mencionado também é contemplado no qual a doença é selecionada do grupo que consiste em doenças ósseas metabólicas associadas a atividade de osteoclasto relativamente aumentada, incluindo endocrinopatias (incluindo hipercortisolismo, hipogonadismo, hiperparatireoidismo primário ou secundário, hipertireoidismo), hipercalcemia, estados de deficiência (incluindo raquitismo/osteomalácia, escorbuto, desnutrição), doenças crônicas (incluindo síndromes desabsortivas, insuficiência renal crônica (incluindo osteodistrofia renal), doença hepática crônica (incluindo osteodistrofia hepática)), medicamentos (incluindo glicocorticóides (osteoporose induzida por glicocorticóide), heparina, álcool), e doenças hereditárias (incluindo osteogenesis imperfecta, homocistinúria), câncer, osteoporose,, osteopetrose, inflamação óssea associada a artrite e artrite reumatóide, doença periodontal , displasia fibrosa, e/ou doença de Paget.
Em uma outra modalidade, é contemplado o uso de um anticorpo da invenção na manufatura de um medicamento para a prevenção ou tratamento de câncer metastático ao osso em um paciente que sofre de câncer metastático. Em uma modalidade relacionada, o câncer metastático é câncer de mama, pulmonar, renal, mieloma múltiplo, tireóide, próstata, adenocarcinoma, malignidades de células sanguíneas, incluindo leucemia ou linfoma; cânceres da cabeça e pescoço; cânceres gastrointestinais, incluindo câncer esofagiano, gástrico, câncer de cólon, câncer intestinal, câncer colo-retal, câncer retal, câncer pancreático, câncer hepático, câncer do duto ou da vesícula biliar; malignidades do trato genital feminino, incluindo carcinoma ovariano, cânceres uterinos endometriais, câncer vaginal, ou câncer cervical; câncer da bexiga; câncer cerebral, incluindo neuroblastoma; sarcoma, osteossarcoma; ou câncer epitelial, incluindo melanoma maligno ou carcinoma de célula escamosa.
Ainda em uma outra modalidade, é contemplado o uso de um anticorpo da invenção na manufatura de um medicamento para o tratamento de um paciente que tem câncer.
Em qualquer um dos usos anteriormente mencionados, o medicamento é coordenado com tratamento que usa um segundo agente terapêutico. Em uma modalidade relacionada, o segundo agente terapêutico é um agente quimioterápico de câncer. Em modalidades relacionadas, o segundo agente terapêutico é um fator estimulante de colônia não M-CSF, ou anticorpo anti-RANKL, ou receptor solúvel de RANKL, ou um bisfosfonato. Em uma modalidade relacionada, o bisfonato é zeledronato, pamidronato, clodronato, etidronato, tilundronato, alendronato, ou ibandronato.
Ainda em uma outra modalidade da invenção, qualquer um dos usos anteriormente mencionados é contemplado no qual o paciente é impedido de receber tratamento com bisfosfonato, e/ou no qual o paciente foi pré-tratado com o segundo agente terapêutico. Em uma modalidade relacionada, o segundo agente terapêutico é um agente quimioterápico de câncer, um fator estimulante de colônia não M-CSF, ou anticorpo anti-RANKL, ou receptor solúvel de RANKL, ou um bisfosfonato. Ainda em uma outra modalidade relacionada, o bisfonato é zeledronato, pamidronato, clodronato, etidronato, tilundronato, alendronato, ou ibandronato.
Ainda em uma outra modalidade relacionada, o paciente é impedido de receber tratamento com bisfosfonato.
Em uma outra modalidade da invenção, é contemplado o uso de uma combinação sinérgica de um anticorpo da invenção para a preparação de um medicamento para o tratamento de um paciente que exibe sintomas de osteólise no qual o medicamento é coordenado com tratamento que usa um segundo agente terapêutico. Em uma modalidade relacionada, o segundo agente terapêutico é um agente quimioterápico de câncer, um fator estimulante de colônia não M-CSF, ou anticorpo anti-RANKL, ou receptor solúvel de RANKL, ou um bisfosfonato. Em uma modalidade relacionada, o bisfonato é zeledronato, pamidronato, clodronato, etidronato, tilundronato, alendronato, ou ibandronato. Ainda em uma outra modalidade, o paciente é impedido de receber tratamento com bisfosfonato.
Modalidades de qualquer um dos usos anteriormente mencionados são contempladas onde a quantidade de anticorpo no medicamento está em uma dose eficaz para reduzir a dosagem do segundo agente terapêutico necessária para atingir um efeito terapêutico. Em qualquer uma das modalidades anteriormente mencionadas em relação à perda óssea associada ao câncer, a quantidade de anticorpo no medicamento é preferivelmente eficaz para inibir proliferação e/ou diferenciação de osteoclasto induzida por células tumorais.
A quantidade de anticorpo em qualquer um dos medicamentos anteriormente mencionados pode ser uma dose entre cerca de 2 μg/kg a 30 mg/kg de peso corporal. Em uma modalidade relacionada, a quantidade de anticorpo no medicamento está em uma dose entre cerca de 0,1 mg/kg a 30 mg/kg de peso corporal. Ainda em uma outra modalidade, a quantidade de anticorpo no medicamento está em uma dose entre cerca de 0,1 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal.
Kits também são contemplados pela presente invenção. Em uma modalidade, um kit que compreende a quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo da invenção, embalada em um recipiente, como um frasco ou vidro, e que também compreende um rótulo anexado ou embalado com o recipiente, o rótulo descrevendo os conteúdos do recipiente e fornecendo indicações e/ou instruções em relação ao uso dos conteúdos do recipiente para prevenir ou reduzir perda óssea é fornecido.
Em uma outra modalidade, um kit que compreende a quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo da invenção, embalada em um recipiente, como um frasco ou vidro, e que também compreende um rótulo anexado ou embalado com o recipiente, o rótulo descrevendo os conteúdos do recipiente e fornecendo indicações e/ou instruções em relação ao uso dos conteúdos do recipiente a um paciente com a doença que causa ou contribui para osteólise é fornecido.
Em uma modalidade relacionada, o kit é fornecido no qual a referida doença é selecionada do grupo que consiste em doenças ósseas metabólicas associadas a atividade de osteoclasto relativamente aumentada, incluindo endocrinopatias (incluindo hipercortisolismo, hipogonadismo, hiperparatireoidismo primário ou secundário, hipertireoidismo), hipercalcemia, estados de deficiência (incluindo raquitismo/osteomalácia, escorbuto, desnutrição), doenças crônicas (incluindo slndromes desabsortivas, insuficiência renal crônica (incluindo osteodistrofia renal), doença hepática crônica (incluindo osteodistrofia hepática)), medicamentos (incluindo 5 glicocorticóides (osteoporose induzida por glicocorticóide), heparina, álcool), e doenças hereditárias (incluindo osteogenesis imperfecta, homocistinúria), câncer, osteoporose, osteopetrose, inflamação óssea associada a artrite e artrite reumatóide, doença 10 periodontal , displasia fibrosa, e/ou doença de Paget.
Em uma outra modalidade, é fornecido um kit que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo da invenção, embalada em um recipiente, como um frasco ou vidro, e que também compreende um rótulo anexado 15 ou embalado com o recipiente, o rótulo descrevendo os conteúdos do recipiente e fornecendo indicações e/ou instruções em relação ao uso dos conteúdos do recipiente para prevenir ou tratar câncer metastático ao osso. Em uma modalidade relacionada, o câncer metastático é câncer de 20 mama, pulmonar, renal, mieloma múltiplo, tireóide, próstata, adenocarcinoma, malignidades de células sanguíneas, incluindo leucemia ou linfoma; cânceres da cabeça e pescoço; cânceres gastrointestinais, incluindo câncer esofagiano, gástrico, câncer de cólon, câncer 25 intestinal, câncer colo-retal, câncer retal, câncer pancreático, câncer hepático, câncer do duto ou da vesícula biliar; malignidades do trato genital feminino, incluindo carcinoma ovariano, cânceres uterinos endometriais, câncer vaginal, ou câncer cervical; câncer da bexiga; câncer 30 cerebral, incluindo neuroblastoma; sarcoma, osteossarcoma; ou câncer epitelial, incluindo melanoma ou câncer de célula escamosa.
Ainda em uma outra modalidade, é fornecido um kit que compreende a quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo da invenção, embalada em um recipiente, como um frasco ou vidro, e que também compreende um rótulo anexado ou embalado com o recipiente, o rótulo descrevendo os conteúdos do recipiente e fornecendo indicações e/ou instruções em relação ao uso dos conteúdos do recipiente para tratar câncer.
Em uma outra modalidade, o kit também compreende um segundo agente terapêutico. Em uma modalidade relacionada, o segundo agente terapêutico é um agente quimioterápico de câncer, um fator estimulante de colônia não M-CSF, ou anticorpo anti-RANKL, ou receptor solúvel de RANKL, ou um bisfosfonato. Em uma modalidade relacionada, o bisfonato é zeledronato, pamidronato, clodronato, etidronato, tilundronato, alendronato, ou ibandronato. Ainda em uma outra modalidade, o kit inclui instruções para tratar um paciente que não recebe tratamento com bisfosfonato.
Em uma outra modalidade, é fornecido o kit anteriormente mencionado que compreende uma dose de anticorpo eficaz para reduzir a dosagem do segundo agente terapêutico necessária para atingir um efeito terapêutico. Em uma outra modalidade, o kit compreende uma dose sinérgica de anticorpo. Ainda em uma outra modalidade, o kit compreende uma dose de anticorpo eficaz para inibir proliferação e/ou diferenciação de osteoclasto induzida por células tumorais.
Ainda em uma outra modalidade da invenção, o kit anteriormente mencionado compreende uma dose de anticorpo entre cerca de 2 μg/kg a 30 mg/kg de peso corporal. Em uma outra modalidade, o kit compreende uma dose de anticorpo entre cerca de 0,1 mg/kg a 30 mg/kg de peso corporal. Ainda em uma outra modalidade, o kit compreende uma dose de anticorpo entre cerca de 0,1 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal.
Em uma outra modalidade da invenção, é fornecida uma embalagem, frasco ou recipiente que compreende um medicamento com um ou mais dos anticorpos anteriormente mencionados e instruções de que o medicamento deve ser usado em combinação com cirurgia ou terapia de radiação. Em uma outra modalidade, é fornecido um método de prevenção ou tratamento de câncer metastático ao osso que compreende as etapas de administração de qualquer um dos anticorpos anteriormente mencionados a um indivíduo e tratamento do indivíduo com cirurgia ou terapia de radiação. Em uma outra modalidade, é fornecido um método de visar uma célula tumoral que expressa M-CSF ligado a membrana em sua superfície que compreende a etapa de administração de qualquer um dos anticorpos anteriormente mencionados, no qual o anticorpo é conjugado a um radionuclídeo ou outra toxina. Ainda em uma outra modalidade, é fornecido um método de tratamento de um indivíduo que sofre de um câncer que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer um dos anticorpos anteriormente mencionados.
Ainda em uma outra modalidade da invenção, é fornecido um método de prevenção da perda óssea que compreende a administração a um indivíduo com uma doença que causa ou contribui para osteólise de uma quantidade de qualquer um dos anticorpos anteriormente mencionados em uma quantidade eficaz para neutralizar M-CSF produzido pelas células do indivíduo, a quantidade sendo maior que a quantidade eficaz para neutralizar M-CSF produzido pelas células cancerosas. Em uma modalidade relacionada, é apresentado um método de tratamento de um indivíduo com a doença que causa ou contribui para osteólise que compreende a administração ao referido indivíduo de uma quantidade de qualquer um dos anticorpos anteriormente mencionados em uma quantidade eficaz para neutralizar M-CSF produzido pelas células do indivíduo, a quantidade sendo maior que a quantidade eficaz para neutralizar M-CSF produzido pelas células cancerosas.
Em uma modalidade da invenção, é fornecida uma composição farmacêutica que compreende anticorpo RX1, 5H4, MCI e/ou MC3, ou um anticorpo derivado de RX1, 5H4, MCI e/ou MC3 não murídeo ou um anticorpo de competição RX1, 5H4, MCI e/ou MC3 e um agente terapêutico para câncer. Em uma outra modalidade da invenção, é fornecida uma embalagem, frasco ou recipiente que compreende um medicamento com anticorpo RX1, 5H4, MCI e/ou MC3, ou um anticorpo derivado de RX1, 5H4, MCI e/ou MC3 não murídeo ou um anticorpo de competição RX1, 5H4, MCI e/ou MC3, e instruções que o medicamento deve ser usado em combinação com cirurgia ou terapia de radiação.
Em uma outra modalidade da invenção, é apresentado um método de tratamento de um indivíduo que sofre de um câncer, no qual as células que compreendem o câncer não secretam M-CSF, que compreende a etapa de administração de qualquer um dos anticorpos anteriormente mencionados.
Breve descrição dos desenhos
Figura 1 é um diagrama de tipologia que mostra as ligações de dissulfeto em M-CSF truncado dimérico.
Figura 2 é um estereodiagrama da estrutura C-alfa de M-CSF com cada décimo resíduo rotulado e com o eixo de simetria não cristalográfico indicado por uma linha pontilhada.
Figura 3 é uma comparação de atividade de indução de osteoclasto entre M-CSF purificado e meio condicionado (CM) de células MDA 231 e células MCF7.
Figura 4A mostra a seqüência de aminoácidos do anticorpo específico para M-CSF RX1 de murídeo (Id. de Seq. N° : 2 e 4) (codificada pela inserção de cDNA do plasmídeo depositado com a "American Type Cultura Collection", Manassas, VA, USA, sob o número de depósito ATCC PTA- 6113) e uma seqüência de ácidos nucleicos correspondente (Id. de Seq. N° : 1 e 3) . As regiões de CDR são numeradas e mostradas em negrito.
Figuras 4B e 4C mostram as seqüências de aminoácidos da cadeia leve (Id. de Seq. N° : 5) e cadeia pesada (Id. de Seq. N° : 6) de anticorpo específico para M-CSF RX1 de murídeo, respectivamente, com resíduos de alto risco(negrito), risco moderado(sublinhado), e risco baixo identificados de acordo com Studnicka e cols., W093/11794.
Figura 5A mostra que os anticorpos RX1 e 5A1 de M-CSF são específicos para espécie. Figura 5B mostra a atividade de neutralização de M-CSF de anticorpos MCI e MC3.
Figura 6 mostra que anticorpo RX1 inibe de forma eficaz a osteólise em um modelo de xenoenxerto humano em uma concentração de 5mg/kg.
Figura 7 mostra que o número de metastases é reduzido quando o anticorpo RX1 é administrado a MDA-MB-231 de câncer de mama humano em uma concentração de 5 mg/kg.
Figura 8A e 8B mostra que um anticorpo específico para M-CSF ligado a linha de células de câncer de mama MDA-MB- 231 ou a linha de células de câncer de mieloma múltiplo ARH77.
Figura 9 mostra que M-CSF é prevalente em inúmeras superfícies de células cancerosas.
Figura 10 é a seqüência de aminoácidos de M-CSFa (Id. de Seq. N°: 7) .
Figura 11 é a seqüência de aminoácidos de M-CSFβ (Id. de Seq. Nα: 8) .
Figura 12 é a seqüência de aminoácidos de M-CSFy (Id. de Seq. N° : 9) . Um número de polimorfismos na seqüência de DNA pode resultar em diferenças de aminoácido. Por exemplo, um polimorfismo comum fornece uma Ala ao invés de Pro na posição 104.
Figuras 13, 14, e 15 mostram as seqüências de aminoácidos de anticorpos 5H4 de murídeo específicos para MCSF (Id. de Seq. N°: 10 e 11), MCI (Id. de Seq. N°: 12 e 13) (produzido pelo hibridoma depositado sob o número de depósito ATCC PTA-6263) e MC3 (Id. de Seq. N° : 14 e 15) (produzido pelo hibridoma depositado sob o número de depósito ATCC PTA- 6264), respectivamente.
Figuras 16A e B são um alinhamento de regiões CDR das seqüências de aminoácidos de cadeia pesada e leve de anticorpos RX1 5H4; MCI; e MC3 (Id. de Seq. N° : 16-38) de murídeo específicos para M-CSF humano;.
Figura 17 mostra as atividades de neutralização de fragmentos intactos versus Fab para RX1 versus 5H4.
Figura 18 mostra a estrutura de M-CSF com epitopos de RX1, 5H4, e MC3 destacados (Id. de Seq. N°: 120, 122, e 123) .
Figura 19A mostra (a) a linha de risco para a cadeia pesada RX1 de murídeo (H=alto risco, M= risco moderado, L=risco baixo), (b) a seqüência de aminoácidos de cadeia pesada de RX1 (Id. de Seq. N° : 6), (c) a seqüência de aminoácidos da seqüência de consenso humana mais próxima, Kabat Vh2 de consenso, alinhada para RX1 (Id. de Seq. N° : 39) e (d) mudanças que foram feitas para produzir duas seqüências de Human Engineered™ de exemplo (Id. de Seq. N° : 41 e 43) . Figura 19B mostra as seqüências de aminoácidos das duas de Human Engineered™ de cadeia pesada de exemplo (Id. de Seq. N°: 41 e 43), designadas "de risco baixo" e "risco baixo e moderado" assim como seqüências de ácidos nucleicos correspondentes (Id. de Seq. N° : 40 e 42).
Figura 2 0A mostra (a) a linha de risco para a cadeia leve de RX1 de murídeo (H= alto risco, M- risco moderado, L= risco baixo), (b) a seqüência de aminoácidos de cadeia leve de RX1 (Id. de Seq. N°: 5), (c) a seqüência de aminoácidos da seqüência de consenso humana mais próxima, Kabat Vk3 consenso, alinhada para RX1 (Id. de Seq. N° : 49) e (d) mudanças que foram feitas para produzir duas seqüências de Human Engineered™ de exemplo (Id. de Seq. N° : 45 e 47) . Figura 20B mostra as seqüências de aminoácidos da duas seqüências de Human Engineered™ de cadeia leve de exemplo (Id. de Seq. N°: 45 e 47), designadas "risco baixo" e "risco baixo e moderado" assim como seqüências de ácidos nucleicos correspondentes (Id. de Seq. N°: 44 e 46).
Figura 21A mostra (a) a linha de risco para a cadeia leve de RX1 de murídeo (H=alto risco, M=risco moderado, L=risco baixo), (b) a seqüência de aminoácidos de cadeia leve de RX1 (Id. de Seq. N° : 5) , (c) a seqüência de aminoácidos da seqüência de consenso humana mais próxima, Kabat Vk3 consenso, alinhada para RX1 (Id. de Seq. N° : 49) e (d) uma seqüência de aminoácidos alternativa de exemplo na qual as posições 54-56 não foram modificadas (ou seja, permaneceram a seqüência de murídeo) (Id. de Seq. N° : 48) .
Figura 21B mostra as seqüências de aminoácidos de duas seqüências de Human EngineeredTM de cadeia leve alternativas de exemplo (Id. de Seq. N° : 48, 136) , assim como seqüências de ácidos nucleicos correspondentes (Id. de Seq. N°: 137 e 135) .
Figura 22A mostra (a) a linha de risco para a cadeia leve de RX1 de murídeo (H=alto risco, M=risco moderado, L=risco baixo), (b) a seqüência de aminoácidos de cadeia leve de RX1 (Id. de Seq. N° : 5) , (c) a seqüência de aminoácidos da seqüência de linha germinativa de consenso humana mais próxima, subgrupo Vk6 2-1-(1) A14, alinhada para RX1 (Id. de Seq. N° : 50) e (d) mudanças que foram feitas para produzir duas seqüências de Human Engineered™ de exemplo (Id. de Seq. N°: 51 e 53) . Figura 22B mostra as seqüências de aminoácidos das duas seqüências de Human Engineered™ de cadeia leve de exemplo (Id. de Seq. N° : 51 e 53), designadas de "risco baixo" e "risco baixo e moderado" assim como a seqüência de ácidos nucleicos correspondente (Id. de Seq. N°: 52).
Figuras 23A e 23B mostram o alinhamento de seqüência de aminoácidos de cadeia leve de RX1 de murídeo (Id. de Seq. N°: 54) com várias seqüências humanas de consenso e seqüências de linha germinativa de consenso humanas que usam o sistema de numeração de Kabat (numeração de aminoácidos indicada na linha designada "POS") (Id. de Seq. N° : 55-82) .
Figuras 24A e 24B mostram o alinhamento de seqüência de aminoácidos de cadeia pesada de RX1 de murídeo (Id. de Seq. N°: 83) com várias seqüências humanas de consenso e seqüências de linha germinativa de consenso humanas que usam o sistema de numeração de Kabat numeração de aminoácidos indicada na linha designada "POS" (Id. de Seq. N° : 84-112). Figuras 24C-24E mostram como os resíduos de aminoácidos de anticorpos 5H4, MCI e MC3 correspondem ao sistema de numeração de Kabat (Id. de Seq. N°: 10 e 11; Id. de Seq. N° : 12 e 13; Id. de Seq. N°: 14 e 15, respectivamente).
Figura 25 mostra a neutralização comparativa de MCSF humano recombinante por anticorpo RX1 recombinante de murídeo, rotulado como rmRXl, e três versões de anticorpo RX1-1 de Human Engineered™ (na qual todas as modificações de risco baixo foram feitas) o qual tem, cada um, uma região constante diferente (IgGl, IgG2 ou IgG4), rotulada como heRXl-l.Gl, heRXl-l.G2, eheRXl-l.G4.
Figura 26 mostra a neutralização comparativa de soro humano por anticorpo RX1 recombinante de murídeo, rotulado como rmRXl e várias versões diferentes de heRXl-1 (na qual todas as modificações de risco baixo foram feitas) o qual tem, cada um, uma região constante diferente (IgGl, IgG2 ou IgG4) , rotulada como RX2, RXl-l-IgG2, RXl-l-IgGl, RX1-1- IgGl, RXl-l-IgG4, RXl-a-IgG4.
Figura 27 mostra a neutralização comparativa de meio MDA231 (linha de células de câncer de mama) por anticorpo RX1 recombinante de murídeo, rrnRXl, e várias versões diferentes de heRXl-1 (nas quais todas as modificações de risco baixo foram feitas) o qual tem, cada um, uma região constante diferente (IgGl, IgG2 ou IgG4), rotulada como RX2, RXl-l-IgG2, RXl-l-IgGl, RXl-l-IgGl, RXl-l-IgG4, RXl-a- IgG4 .
Figura 28 mostra o efeito sobre osteoclastogênese (como medido pela atividade de TRAP) de anticorpo RX1 recombinante de murídeo, rrnRXl, e duas versões diferentes de heRXl-1 que têm, cada uma, uma região constante diferente (IgGl ou IgG2), heRXl-1.IgGl e heRXll.IgG2 rotulados.
Figura 29A mostra a seqüência de aminoácidos (Id. de Seq. N° : 114) e de nucleotídeos (Id. de Seq. N° : 113) para heRXl-1.IgGl com mudanças de aminoácido de baixo risco. Figura 29B mostra a seqüência de aminoácido (Id. de Seq. N°: 116) e de nucleotídeos (Id. de Seq. N° : 115) para heRXl-1.IgGl com mudanças de aminoácido de baixo e moderado risco.
Figura 30 mostra a seqüência de aminoácidos (Id. de Seq. N°: 119) e de nucleotídeos (cDNA (Id. de Seq. N°: 118) e DNA genômico (Id. de Seq. N°: 117)) para heRXl-1.IgG4 com mudanças de aminoácido de baixo risco.
Descrição detalhada
A capacidade de metastatizar é um característica de definição de um câncer. Metástase se refere à disseminação de células cancerosas para outras partes do corpo ou à condição produzida por essa disseminação. Metástase é um processo complexo de múltiplas etapas que inclui modificações no material genético de uma célula, proliferação não controlada da célula alterada para formar um tumor primário, desenvolvimento de um novo suprimento sanguíneo para o tumor primário, invasão do sistema circulatório por células do tumor primário, dispersão de pequenos aglomerados de células tumorais primárias para outras partes do corpo e o crescimento de tumores secundários nesses locais.
O osso é um dos locais mais comuns de metástase em cânceres humanos de mama, pulmão, próstata e tireoide, assim como outros cânceres e em autópsias, descobriu-se que 60% dos pacientes com câncer têm metástases ósseas. Metástase óssea osteolítica mostra uma etapa única de reabsorção óssea osteoclástica que não é observada em metástase para outros órgãos. A perda óssea associada a metástase de câncer é mediada por osteoclastos (células gigantes multinucleadas com a capacidade de reabsorver tecidos mineralizados) , que parecem ser ativados por produtos tumorais.
Fator estimulante de colônia (CSF-1), também conhecido como fator estimulante de colônia de macrófagos (M-CSF), tem sido crucial para a formação de osteoclastos. Além disso, MCSF mostrou modular as funções osteoclásticas de osteoclastos maduros, sua migração e sua sobrevivência em cooperação com outros fatores solúveis e interações célula a célula fornecidos por osteoblastos e fibroblastos (Fixe e Praloran, Cytokine 10: 3-7, 1998; Martin e cols., Criticai Rev. in Eukaryotic Gene Expression 8: 107-23 (1998)) .
O mRNA de M-CSF humano de comprimento total codifica uma proteína precursora de 554 aminoácidos. Através de junção de mRNA alternativo e processamento proteolítico diferencial pós-tradução, M-CSF pode ser secretado na circulação como uma glicoproteína ou sulfato de condroitina que contém proteoglicano ou pode ser expresso como uma glicoproteína que atravessa a membrana na superfície de células produtoras de M-CSF. A estrutura tridimensional dos 150 aminoácidos de terminal amino expressos bacterialmente de M-CSF humano, a seqüência mínima necessária para atividade biológica total in vitro, indica que essa proteína é um dímero ligado a dissulfeto com cada monômero consistindo em quatro feizes alfa helicoidais e uma folha beta anti-paralela (Pandit e cols., Science 258: 1358-62 (1992)). Três espécies distintas de M-CSF são produzidas através de junção de mRNA alternativo. Os três precursores de polipeptídeo são M-CFSa de 256 aminoácidos, M-CSFβ de 554 aminoácidos, e M-CSFy de 438 aminoácidos. M-CSFβ é uma proteína secretada que não ocorre em uma forma ligada a membrana. M-CSFa é expresso como uma proteína integral da membrana que é liberada lentamente por divagem proteolítica. M-CSFa é clivada nos aminoácidos 191-197 da seqüência apresentada na Figura 10. A forma ligada à membrana de M-CSF pode interagir com receptores em células próximas e portanto medeiam contatos específicos célula a célula. O termo "M-CSF" também pode incluir aminoácidos 36-438 da Figura 12.
Várias formas de M-CSF funcionam por ligação a seu receptor M-CSFR em células alvo. M-CSFR é uma molécula que atravessa membrana com cinco domínios extracelulares semelhantes a imunoglobulina, um domínio de transmembrana e um domínio de tirosina quinase relacionado a Src interrompido intracelular. M-CSFR é codificado por protooncogene c-fms. A ligação de M-CSF ao domínio extracelular de M-CSFR leva à dimerização do receptor, que ativa o domínio citoplasmático de quinase, levando a autofosforilação e fosforilação de outras proteínas celulares (Hamilton J. A., J Leukoc Biol.,62(2):145-55 (1997); Hamilton J, A., Immuno Today., 18(7): 313-7(1997).proteínas celulares fosforiladas induzem uma cascata de eventos bioquímicos que levam a respostas celulares: mitose, secreção de citocinas, ondulação de membrana e regulação de transcrição de seu próprio receptor (Fixe e Praloran, Cytokine 10: 32-37 (1998)).
M-CSF é expresso em células estromais, osteoblastos e outras células. Ele também é expresso em células tumorais de mama, uterinas e ovarianas. A extensão da expressão nesses tumores tem relação com alto grau e prognóstico pobre (Kacinski Ann. Med. 27: 79-85 (1995); Smith e cols., Clin. Cancer Res. 1: 313-25 (1995)). Em carcinomas de mama, a expressão de M-CSF é prevalente em células tumorais invasivas em oposição ao câncer intraductal (pré-invasivo) (Scholl et al., J. Natl. Cancer Inst. 86: 120-6 (1994)). Além disso, M-CSF promove a progressão de tumores mamários para malignidade (Lin e cols., J. Exp. Med. 93: 727-39 (2001)) . Para câncer de mama e ovariano, a produção de M- CSF parece ser responsável pelo recrutamento de macrófagos para o tumor.
Como aqui mostrado, um anticorpo específico para M-CSF como anticorpo RX1, 5H4, MCI ou MC3, neutraliza indução de osteoclasto por células de câncer metastático e/ou reduz as metástases para o osso em modelos animais de câncer. Portanto, a presente invenção fornece composições e métodos para o tratamento ou prevenção de câncer, metástase de câncer e perda óssea associadas a metástase cancerosa.
Um anticorpo anti-M-CSF preferido RX1 de murídeo foi modificado para ser menos imunogênico em humanos baseado no método Human Engineering™ de Studnicka e cols. Em uma modalidade preferida, 8 a 12 resíduos de aminoácidos expostos de superfície da região variável de cadeia pesada e 16 a 19 resíduos expostos de superfície na região de cadeia leve foram modificados para resíduos humanos nas posições determinadas para improvavelmente afetar de forma adversa a ligação de antígeno ou dobra de proteína, enquanto reduz sua imunogenicidade com relação a um ambiente humano. Genes sintéticos que contêm regiões variáveis de cadeia pesada e/ou leve modificadas foram construídos e ligados a regiões constantes de cadeia pesada y e/ou cadeia leve kapa. Quaisquer regiões constantes de cadeia pesada e cadeia leve humana podem ser usadas em combinação com as regiões variáveis de anticorpo Human Engineered™. Os genes de cadeia pesada e leve humanas foram introduzidos em células de mamíferos e os produtos de imunoglobulina recombinante resultante foram obtidos e caracterizados. Outros anticorpos anti-M-CSF de exemplo como 5H4, MCI, ou MC3 são de modo similar Human Engineered™.
O termo "Anticorpo derivado de RX 1" inclui qualquer um dos seguintes: 1) uma variante de aminoácido de anticorpo RX1 de murídeo que tem a seqüência de aminoácidos apresentada na Figura 4, incluindo variantes que compreendem uma seqüência de aminoácidos de cadeia pesada variável que é pelo menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99% homóloga à seqüência de aminoácidos como apresentadas na Figura 4, e/ou que compreendem uma seqüência de aminoácidos de cadeia leve variável que é pelo menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99% homóloga à seqüência de aminoácidos como apresentadas na Figura 4, levando em consideração aminoácidos similares para a determinação de homologia; 2) polipeptídeos de ligação a M-CSF (excluindo anticorpo RX-1 de murídeo) que compreendem um ou mais regiões de determinação complementar (CDRs) de anticorpo RX-1 de murídeo que tem a seqüência de aminoácidos apresentada na Figura 4, preferivelmente que compreendem que compreendem pelo menos CDR3 da cadeia pesada de RX 1, e preferivelmente que compreendem duas ou mais, ou três ou mais, ou quatro ou mais, ou cinco ou mais, ou todas seis CDRs ; 3) Anticorpos Human Engineered™ que têm seqüências de aminoácidos de cadeia pesada e leve apresentadas nas Figuras 19B até 22B ou variantes dessas que compreendem uma cadeia pesada ou leve que tem pelo menos 60% de identidade de seqüência de aminoácidos com a cadeia pesada ou leve original de Human Engineered™ das Figuras 19B até 22B, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, e ainda mais preferivelmente pelo menos 95%, incluindo, por exemplo, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% e 100% idênticas; 4) polipeptídeos de ligação a M-CSF (excluindo anticorpo RX-1 de murídeo) que compreendem os resíduos de alto risco de uma ou mais CDRs dos anticorpos Human Engineered™ das Figuras 19B até 22B, e preferivelmente que compreendem resíduos de alto risco de duas ou mais, ou três ou mais, ou quatro ou mais, ou cinco ou mais, ou todas seis CDRs ; 5) Anticorpos Human EngineeredTM ou variantes que retêm os os resíduos de aminoácidos de alto risco apresentados na Figura 4B, e que compreendem uma ou mais modificações nos resíduos de risco baixo ou moderado apresentados na Figura 4B;por exemplo, que compreendem uma ou mais modificações em uma resíduo de risco baixo e substituições conservadoras em um resíduo de risco moderado apresentado ma Figura 4B, ou por exemplo, retenção dos resíduos de aminoácidos de risco moderado e alto apresentados na Figura 4B e que compreendem uma ou mais modificações em um resíduo de risco baixo,onde modificações incluem inserções, deleções ou substituições e podem ser substituições conservadoras ou podem fazer o anticorpo construído ficar mais próximo em seqüência a uma seqüência de cadeia leve ou cadeia pesada humana, uma seqüência de cadeia leve ou cadeia pesada de linha germinativa humana , uma seqüência de cadeia leve ou cadeia pesada humana de consenso, ou uma seqüência de cadeia leve ou cadeia pesada humana de linha germinativa de consenso;que retém a capacidade de se ligar a M-CSF. Tais anticorpos preferivelmente se ligam a M-CSF com uma afinidade of pelo menos 10 , 10 ou 10' ou maior e preferivelmente neutralizam a atividade de indução de osteoclastogênese de M-CSF.
De modo similar, o termo "anticorpo derivado de MC3" inclui qualquer um dos seguintes: 1) uma variante de aminoácido de anticorpo MC3 de murídeo que tem a seqüência de aminoácidos apresentada na Figura 15, incluindo variantes que compreendem uma seqüência de aminoácidos de cadeia pesada variável que é pelo menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99% homóloga à seqüência de aminoácidos como apresentada na Figura 15, e/ou que compreende uma seqüência de aminoácidos de cadeia leve variável que é pelo menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99% homóloga à seqüência de aminoácidos como apresentada na Figura 15, levando em consideração aminoácidos similares para a determinação de homologia; 2) polipeptídeos de ligação a M-CSF (opcionalmente incluindo ou excluindo anticorpo MC3 de murídeo) que compreendem uma ou mais regiões de determinação complementar (CDRs) de anticorpo MC3 de murídeo que tem a seqüência de aminoácidos apresentada na Figura 15, preferivelmente que compreendem pelo menos CDR3 da cadeia pesada de MC3, e preferivelmente que compreendem duas ou mais, ou três ou mais, ou quatro ou mais, ou cinco ou mais, ou todas seis CDRs; 3) Anticorpos Human Engineered™ gerado por alteração da seqüência de murídeo de acordo com os métodos apresentados em Studnicka e cols., Patente U.S. N°; 5.766.886 e Exemplo 4A nessa, usando a numeração de Kabat apresentada nas Figuras 24C-24E para identificar resíduos de baixo, moderado e alto risco; tais anticorpos que compreendem pelo menos uma das seguintes cadeias pesadas e pelo menos uma das cadeias leves a seguir: (a) uma cadeia pesada na qual todos os resíduos de risco baixo foram modificados, se necessário, para serem os mesmos resíduos que uma seqüência de imunoglobulina humana de referência ou (b) uma cadeia pesada na qual todos os resíduos de risco baixo e moderado foram modificados, se necessário, para serem os mesmos resíduos que uma seqüência de imunoglobulina humana de referência, (c) uma cadeia leve na qual todos os resíduos de risco baixo foram modificados, se necessário, para serem os mesmos resíduos que uma seqüência de imunoglobulina humana de referência ou (b) uma cadeia leve na qual todos os resíduos de risco baixo e moderado foram modificados, se necessário, para serem os mesmos resíduos que uma seqüência de imunoglobulina humana de referência 4) variantes dos anticorpos mencionados no parágrafo anterior (3) que compreendem uma cadeia pesada ou leve que tem pelo menos 60% de identidade de seqüência de aminoácidos com a cadeia pesada ou leve original de Human Engineered™, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, e ainda mais preferivelmente pelo menos 95%, incluindo por exemplo, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, e 100% idênticas; 5) polipeptídeos de ligação a M-CSF (opcionalmente incluindo ou excluindo anticorpo MC3 de murídeo) que compreendem os resíduos de alto risco de uma ou mais CDRs 5 do anticorpo MC3 de murídeo da Figura 15, e preferivelmente que compreendem resíduos de alto risco de duas ou mais, ou três ou mais, ou quatro ou mais, ou cinco ou mais, ou todas seis CDRs; 6) Anticorpos Human Engineered™ ou variantes que 10 retêm os resíduos de alto risco de aminoácidos de anticorpo MC3 de murídeo, e que compreendem uma ou mais modificações nos resíduos de risco baixo ou moderado;por exemplo, que compreendem uma ou mais modificações em um resíduo de risco baixo e substituições conservadoras 15 em um resíduo de risco moderado, ou, por exemplo, que retêm os resíduos de aminoácidos de risco moderado e alto e que compreendem uma ou mais modificações em um resíduo de risco baixo,onde modificações incluem inserções, deleções ou 20 substituições e podem ser substituições conservadoras ou ou podem fazer o anticorpo construído ficar mais próximo em seqüência a uma seqüência de cadeia leve ou cadeia pesada humana, uma seqüência de cadeia leve ou cadeia pesada de linha germinativa humana , uma seqüência de cadeia leve ou 25 cadeia pesada humana de consenso, ou uma seqüência de cadeia leve ou cadeia pesada humana de linha germinativa de consenso; que retem a capacidade de se ligar a M-CSF. Tais anticorpos preferivelmente se ligam a M-CSF com uma 30 afinidade of pelo menos 10‘7, 10'a ou 10‘9 ou maior e preferivelmente neutralizam a atividade de indução de osteoclastogênese de M-CSF
O termo "anticorpo derivado de 5H4" ou "anticorpo derivado de MCI" é de modo similar definido de acordo com a descrição acima.
Como aqui descrito em detalhes, anticorpos derivados de RX1, 5H4, MCI ou MC3, incluindo anticorpos Human Engineered™ ou variantes, podem ser de diferentes isotipos, como IgG, IgA, IgM ou IgE. Anticorpos da classe IgG podem incluir uma região constante diferente, por exemplo, um anticorpo IgG2 pode ser modificado para apresentar uma região constante de IgGl ou IgG4. Em. modalidades preferidas, a invenção fornece anticorpos Human Engineered™ ou variantes que compreendem uma região constante de IgGl ou IgG4 modificada ou não modificada. No caso de IgGl, modificações à região constante, particularmente a região de dobradiça ou CH2, podem aumentar ou diminuir a função efetora, incluindo atividade de ADCC e/ou CDC. Em outras modalidades, uma região constante de IgG2 é modificada para diminuir a formação de agregados anticorpo-antígeno. No caso de IgG4, modificações à região constante, particularmente a região de dobradiça, podem reduzir a formação de meio-anticorpos. Em modalidades específicas de exemplo, a mutação da seqüência de dobradiça de IgG4 Cys-Pro-Ser-Cys para a seqüência de dobradiça de IgGl Cys-Pro-Pro-Cys é fornecida.
Anticorpos Human Engineered™ que contêm regiões constantes de IgGl ou IgG4 têm propriedades melhoradas em relação a anticorpos Human Engineered™ que contêm regiões constantes de IgG2. A escolha da afinidade de ligação melhorada da região Fc de IgGl ou IgG4, atividade de neutralização de MCSF e atividade anti-osteoclasto. Em adição, a escolha da região de Fc de IgGl ou IgG4 forneceu complexos antígeno-anticorpo que lembram mais muito aqueles formados pelo anticorpo parente de murídeo.
A mobilidade na região de dobradiça parece afetar, portanto, a ligação do anticorpo ao antígeno dimérico MCSF assim como a atividade de neutralização do anticorpo. A invenção contempla de forma geral que a preparação de anticorpos que contêm a cadeia pesada que compreende uma região constante modificada ou não modificada de IgGl ou IgG4, particularmente os domínios de dobradiça e CH2, ou preferivelmente pelo menos os domínios de dobradiça, melhora a afinidade de ligação e/ou retarda a dissociação de anticorpo de antígenos diméricos.
O termo "anticorpo de competição RX1" inclui: 1) um anticorpo monoclonal não murídeo ou não roedor que se liga ao mesmo epitopo de M-CSF que RX1 de murídeo tendo as seqüências completas de cadeia leve e pesada apresentadas na Figura 4; 2) um anticorpo monoclonal não murídeo ou não roedor que se liga a pelo menos 4 aminoácidos contíguos de aminoácidos 98-105 de M-CSF da Figura 12; e 3) um anticorpo monoclonal não murídeo ou não roedor que compete com anticorpo RX1 de murídeo que tem a seqüência completa apresentada na Figura 4 para ligação a MCSF, em mais de 75%, mais de 80%, ou mais de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% ou 95%. Tais anticorpos preferivelmente se ligam a MCSF com uma afinidade de pelo menos 10'7, 10'8 ou 10'9 ou maior e preferivelmente neutralizam a atividade indutora de osteoclastogênese de M-CSF.
O termo "anticorpo de competição MCI" ou "anticorpo de competição MC3" ou "anticorpo de competição 5H4" é de modo similar definido com referência aos anticorpos de murídeo 5H4, MCI ou MC3 tendo as seqüências completas de cadeia leve e pesada apresentada na Figura 13, 14 ou 15, respectivamente, e com referência ao epitopo de M-CSF ligado pelo anticorpo, por exemplo, aminoácidos 65-73 ou 138-144 da Figura 12 (que correspondem a Epitopos de M-CSF reconhecidos por 5H4 ou MC3).
Opcionalmente, qualqeur anticorpo de M-CSF quimérico, humano ou humanizado publicamente revelado antes da data de depósito desta, ou revelado em um pedido depositado antes da data de depósito desta, é excluído do escopo da invenção.
Anticorpo monoclonal "não roedor" é qualquer anticorpo, como amplamente definido nessa, que não é um anticorpo monoclonal de roedor intacto completo gerado por um hibridoma e roedor. Portanto, anticorpos não roedores incluem especificamente, sem limitações, variantes de anticorpos de roedores, fragmentos de anticorpos de roedores, anticorpos lineares, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, Anticorpos Human Engineered e anticorpos humanos, incluindo anticorpos humanos produzidos a partir de animais transgênicos ou por meio de tecnologia de apresentação de fago. De modo similar, anticorpos não murídeos incluem, sem limitação, variantes de anticorpos de murídeo, fragmentos de anticorpos de murídeo, anticorpos lineares, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados,
Anticorpos Human Engineered e anticorpos humanos.
"Tumor", como aqui usado, se refere a todo crescimento e proliferação de célula neoplásica, maligno ou benigno, e todas células e tecidos pré-cancerosos e cancerosos.
Os termos "câncer" e "canceroso" se referem ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada por crescimento celular não regulado. Exemplos de câncer incluem, sem limitação, carcinoma,; linfoma, blastoma, sarcoma, e leucemia. Mais particular exemplos de tais cânceres incluem câncer de mama, câncer de próstata, câncer de cólon, câncer de célula escamosa, câncer pulmonar de célula pequena, câncer pulmonar de célula não pequena, câncer gastrointestinal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer ovariano, câncer hepático, câncer da bexiga, hepatoma, câncer colo-retal, carcinoma endometrial, carcinoma da glândula salivar, câncer renal, câncer hepático, câncer da vulva, câncer da tireoide, carcinoma hepático e vários tipos de câncer da cabeça e pescoço.
"Tratamento" é uma intervenção realizada com a intenção de prevenir o desenvolvimento ou alterar a patologia de um distúrbio. Consequentemente, "tratamento" se refere ao tratamento terapêutico e profilático ou medidas preventivas. Aqueles em necessidade de tratamento incluem aqueles já com o distúrbio assim como aqueles nos quais o distúrbio pode ser prevenido. Em tratamento de tumor (por exemplo, câncer), um agente terapêutico pode diminuir diretamente a patologia das células tumorais, ou tornar as células tumorais mais suscetíveis ao tratamento por outros agentes terapêuticos, por exemplo, radiação e/ou quimioterapia. Tratamento de pacientes que sofrem de sintomas clínicos, bioquímicos, radiológicos ou subjetivos de uma doença, como osteólise, may inclui o alívio de alguns ouo de todos os sintomas ou redução da predisposição à doença. A "patologia" de câncer inclui todos fenômenos que comprometem o bem estar do paciente. Isso inclui, sem limitação, crescimento celular anormal ou incontrolado, metástase, interferência com o funcionamento normal de células vizinhas, liberação de citocinas ou outros produtos secretores em níveis anormais, supressão ou agravamento de resposta inflamatória ou imunológica etc. Portanto, a melhora após o tratamento pode ser manifestada como diminuição no tamanho do tumor, declínio na taxa de crescimento do tumor, destruição de células tumorais existentes ou células metastáticas e/ou uma redução no tamanho ou número de metastases.
"Mamífero" para objetivos de tratamento se refere a qualquer animal classificado como um mamífero, incluindo humanos, animais domésticos e de fazenda, e zoológico, esportes, ou animais de estimação, como cães, cavalos, gatos, vacas etc. Preferivelmente, o mamífero é humano.
Como aqui usado, a frase "câncer metastático" é definida como cânceres que têm potencial para se disseminar para outras áreas do corpo, particularmente osso. Uma variedade de cânceres pode metastatizar para o osso, mas os cânceres metastatizantes mais comuns são mama, pulmonar, renal, mieloma míltiplo, tireóide e próstata. Por via de exemplo, outros cânceres que têm potencial para metastatizar para o osso incluem, sem limitação, adenocarcinoma, malignidades de células sanguíneas,incluindo leucemia e linfoma; cânceres da cabeça e pescoço; cânceres gastrointestinais, incluindo câncer esofagiano, gástrico, câncer de cólon, câncer intestinal, câncer colo- retal, câncer retal, câncer pancreático, câncer hepático, câncer do duto ou da vesícula biliar; malignidades do trato genital feminino, incluindo carcinoma ovariano, cânceres endometriais uterinos, câncer vaginal e câncer cervical; câncer da bexiga; câncer cerebral incluindo neuroblastoma; sarcoma, osteossarcoma; e câncer epitelial, incluindo melanoma e câncer de célula escamosa. A presente invenção contempla especialmente a prevenção e tratamento de lesões osteolíticas induzidas por tumor no osso.
Como aqui usado, a frase "quantidade terapeuticamente eficaz" se refere a uma quantidade de anticorpo de M-CSF terapêutico ou profilático que é adequada para uma modalidade da presente invenção, que irá despertar um efeito ou resposta terapêutica ou profilática desejada quando administrada de acordo com o regime de tratamento desej ado.
"M-CSF" humano como aqui usado se refere a um polipeptídeo humano que tem substancialmente a mesma seqüência de aminoácidos que polipeptídeos humanos maduros M-CSFα, M-CSFβ, ou MCSFy descritos em Kawasaki e cols., Science 230:291 (1985), Cerretti e cols., Molecular Immunology, 25:761 (1988), ou Ladner e cols., EMBO Journal 6:2693 (1987), cada um destes são aqui incorporados por referência. Tal terminologia reflete a compreensão de que os três M-CSFs maduros têm diferentes seqüências de aminoácidos, como acima descrito, e que a forma ativa de M- CSF é um dímero ligado por dissulfeto; assim, quando o termo "M-CSF" se refere à forma biologicamente ativa, entende-se a forma dimérica. "Dímero de M-CSF" se refere a dois monômeros de polipeptídeo de M-CSF que foram dimerizados e incluem ambos os homodímeros (consistindo em dois dos mesmo tipo de monômero de M-CSF) e heterodímeros (consistindo em dois diferentes monômeros). Monômeros de M- CSF podem ser convertidos a dímeros de M-CSF in vitro como descrito na Pat. U.S. No. 4.929.700, que é aqui incorporada por referência.
Anticorpos Anti-MCSF
A presente invenção fornece um anticorpo específico para M-CSF, como RX1, 5H4, MCI, e/ou MC3, formulações farmacêuticas que incluem um anticorpo específico para M- CSF, como RX1, 5H4, MCI, e/ou MC3, métodos de preparação das formulações farmacêuticas e métodos de tratamento de pacientes com as formulações e compostos farmacêuticos. O termo "anticorpo" é usado no sentido mais amplo e inclui anticorpos totalmente configurados, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), fragmentos de anticorpo que podem se ligar ao antígeno (por exemplo, Fab', F'(ab)2, Fv, anticorpos de cadeia única, diacorpos), e peptídeos recombinantes que compreendem os precedentes desde que eles exibam a atividade biológica desejada.
O termo "anticorpo monoclonal" como aqui usado se refere a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos exceto por possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em menores quantidades.
Anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados contra um sítio de antigênico único. Além disso, em contraste a preparações de anticorpo (policlonal) convencionais que incluem tipicamente diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante no antígeno. Em adição a sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos por serem sintetizados pela cultura homogênea, não contaminada por outras imunoglobulinas com diferentes especificidades e características.
O modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogênea, e não deve ser interpretado como necessitando da produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser feitos pelo método de hibridoma primeiramente descrito por Kohler e cols., Nature, 256:495 [19751, ou podem ser feitos por métodos de DNA recombinante (veja, por exemplo, Patente U.S. N°: 4.816.567) . Os "anticorpos monoclonais" também podem ser isolados de bibliotecas de anticorpo de fago que usam as técnicas descritas em Clackson e cols.,Nature,352:624628[1991] end Marks e cols., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), por exemplo.
Dependendo da seqüência de aminoácidos do domínio constante de suas cadeias pesadas, imunoglobulinas podem ser destinadas a diferentes classes. Há cinco classes principais, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias dessas podem ser também divididas em subclasses ou isotipos, por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2 . Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são chamados alfa, delta, epsilon, gama e mu respectivamente. As estruturas de subunidade e configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas. Diferentes isotipos têm diferentes funções efetoras; por exemplo, isotipos IgGl e IgG3 têm atividade de ADCC.
"Fragmentos de anticorpo" compreendem uma porção de um anticorpo de comprimento total intacto, preferivelmente a região de ligação de antígeno ou variável do anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, e Fv; diacorpos; anticorpos lineares (Zapata e cols., Protein Eng.,8(10):1057-1062 (1995)) ; moléculas de anticorpo de cadeia única; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo. A digestão de papaína de anticorpos produz dois fragmentos de ligação de antígeno idênticos, chamados fragmentos "Fab", cada um com um único sítio de ligação de antígeno e um fragmento "Fc", residual cujo nome reflete sua capacidade de cristalizar facilmente. O tratamento com pepsina gera um fragmento F(ab')2 que tem dois fragmentos de anticorpo "Fv de cadeia única" ou "sFv" e compreendem os domínios VH e VL do anticorpo, onde esses domínios estão presentes em uma cadeia de polipeptídeo única. Preferivelmente, o polipeptídeo Fv também compreende um ligante de polipeptídeo entre os domínios VH e VL que permitem que o Fv forme a estrutura desejada para ligação de antígeno. Para uma revisão de sFv veja Pluckthun em "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., SpringerVerlag, New York, pp. 269-315 (1994).
O termo região "hipervariável" se refere aos resíduos de aminoácido de um anticorpo que são responsáveis por ligação de antígeno. A região hipervariável compreende resíduos de aminoácido de uma região de determinação de complementaridade ou CDR [ou seja, resíduos 24-34 (Ll), 5056 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 31-35 (Hl), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável de cadeia pesada como descrito por Kabat e cols., Sequence of proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)] e/ou aqueles de uma alça hipervariável (ou seja, resíduos 26-32 (Ll) , 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26-32 (Hl), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável de cadeia pesada como descrito por [Chothia e cols., J. Mol.Biol. 196: 901-917 (1987)].
"Estrutura" ou resíduos FR são aqueles resíduos de domínio variável outros que não os resíduos de região hipervariável.
O termo "diacorpos" se refere a pequenos fragmentos de anticorpo com dois sítio de ligação de antígeno, cujos fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia de polipeptídeo (VH VL) . Com o uso de um ligante que é muito curto para permitir o pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a parear com os domínios complementares de uma outra cadeia e criam dois sítios de ligação de antígeno. Diacorpos são descritos mais completamente em, por exemplo, EP 404,097; WO 93/11161; e 30 Hollinger e cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).
Em algumas modalidades, pode ser desejável a geração de anticorpo monoclonal multiespecífico (por exemplo biespecífico) incluindo anticorpos monoclonal, humano, humanizado, Human Engineered™ ou variante anti-M-CSF tendo especificidades de ligação por pelo menos dois diferentes epitopos. Anticorpos biespecíficos de exemplo podem se ligar a dois diferentes epitopos de MCSF. Alternativamente, um braço anti-M-CSF pode ser combinado com um braço que se liga a uma molécula desencadeadora em um leucócito como uma molécula receptora de célula T(por exemplo, CD2 ou CD3), ou receptores Fc para IgG (FcyR) , como FcyRI (CD64) , FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD16) de forma a focar mecanismos de defesa celular para a célula que expressa M-CSF. Anticorpos biespecíficos também podem ser usados para localizar agentes citotóxicos para células que expressam M-CSF. Esses anticorpos possuem um braço de ligação de M-CSF e um braço que se liga ao agente citotóxico (por exemplo, saporina, anti-interferon-60, alcalóide da vinca, cadeia de ricina A, metotrexate ou hapteno de isótopo radioativo). Anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos ou fragmentos de anticorpo de comprimento total (por exemplo, anticorpos biespecíficos F(ab').sub.2).
De acordo com uma outra abordagem para fazer anticorpos biespecíficos, a interface entre um par de moléculas de anticorpo pode ser projetada para maximizar a percentagem de heterodímeros que é recuperada de cultura de células recombinantes. A interface preferida compreende pelo menos uma parte do domínio CH3 de um domínio constante de anticorpo. Nesse método, uma ou mais cadeias laterais de aminoácido pequeno da interface da primeira molécula de anticorpo são substituídas por cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano). De forma compensatória "cavidades" de tamanho idêntico ou similar à cadeia lateral grande são criadas na interface da segunda molécula de anticorpo por substituição de cadeias laterais de aminoácido grande com cadeias menores (por exemplo, alanina ou treonina). Isso fornece um mecanismo para aumentar o rendimento do heterodímero sobre outros produtos finais não desejados como homodlmeros. Veja WO96/27011 publicado em 6 de setembro de 1996.
Anticorpos biespecíficos incluem anticorpos entrecruzados ou "heteroconjugados". Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser ligado a avidina, o outro a biotina. Anticorpos heteroconjugados podem ser feitos com o uso de quaisquer métodos convenientes de entrecruzamento. Agentes adequados de entrecruzamento são bem conhecidos na técnica, e são revelados na Pat. U.S. No. 4.676.980, junto com inúmeras técnicas de entrecruzamento.
Técnicas para geração de anticorpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticorpo foram descritas na literatura. Por exemplo, anticorpos biespecíficos podem ser preparados usando ligação química. Brennan e cols., Science 229:81 (1985) descreve um procedimento no qual anticorpos intactos são clivados proteoliticamente para gerar fragmentos F(ab')2. Esses fragmentos são reduzidos na presença do agente de complexação de ditiol arsenito de sódio para estabilizar ditiois vicinais e evitar a formação de dissulfeto intermolecular. Os fragmentos Fab' gerados são então convertidos aos derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados de Fab'-TNB é então reconvertido ao Fab'-tiol por redução com mercaptoetilamina e é misturado com uma quantidade equimolar do outro derivado de Fab'-TNB para formar o anticorpo biespecífico. Os anticorpos biespecíficos produzidos podem ser usados como agentes para a imobilização seletiva de enzimas. Ainda em uma modalidade adicional, fragmentos Fab'-SH recuperados diretamente de E. coli podem ser quimicamente ligados in vitro para formar anticorpos bi-específicos. (Shalaby e cols., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)) .
Shalaby e cols., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992) descreve a produção de uma molécula de anticorpo biespecífico F(ab')2 totalmente humanizado. Cada fragmento Fab' foi separadamente secretado de E.coli e submetido a ligação química direcionada in vitro para formar o anticorpo biespecífico. 0 anticorpo biespecífico assim formado foi capaz de se ligar a células que superexpressam o receptor HER2 e células T humanas normais, assim como despertam a atividade lítica de linfócitos humanos citotóxicos contra alvos de tumor de mama humano.
Várias técnicas para fazer e isolar fragmentos de anticorpo biespecífico diretamente de cultura de células recombinantes foram descritas. Por exemplo, anticorpos biespecíficos foram produzidos usando zippers de leucina. (Kostelny e cols., J. Immunol. 148 (5) :1547-1553 (1992)) . Os peptídeos de zipper de leucina das proteínas Fos e Jun foram ligados às porções Fab' de dois diferentes anticorpos por fusão genética. Os homodímeros de anticorpo foram reduzidos na região de dobradiça para formar monômeros e -* então re-oxidados para formar os heterodímeros de anticorpo. Este método também pode ser utilizado para a 4 produção de homodímeros de anticorpo. A tecnologia de "diacorpo" descrita por Hollinger e cols., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:6444-6448 (1993) forneceu um mecanismo alternativo para fazer fragmentos de anticorpo biespecífico.
Os fragmentos compreendem a região variável de cadeia pesada (VH) conectada a uma região variável de cadeia leve (VL) por um ligante que é muito curto para permitir pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Portanto, os domínios VH e VL de um fragmento são forçados I a parear com os domínios de VL e VH complementares de um outro fragmento, dessa forma formando dois sítios de ligação de antígeno. Uma outra estratégia para fazer fragmentos de anticorpo biespecífico pelo uso de dímeros de Fv (sFv) de cadeia única também foi relatada. Veja, Gruber e cols., J. Immunol. 152: 5368 (1994).
Alternativamente, o anticorpo biespecífico pode ser um "anticorpo linear" produzido como descritos em Zapata e cols. proteína Eng. 8 (10) : 1057-1062 (1995). De forma breve, esses anticorpos compreendem um par de segmentos tandem Fd (VH-CH1-VH-CH1) que formam um par de regiões de ligação de antígeno. Anticorpos lineares podem ser biespecíficos ou monoespecíficos.
Anticorpos com mais de duas valências são também contemplados. Por exemplo, anticorpos triespecíficos podem ser preparados. (Tutt e cols., J. Immunol. 147:60 (1991)).
Em certas modalidades, o anticorpo monoclonal, humano, 30 humanizado, Human Engineered™ ou anti-M-CSF variante é um fragmento de anticorpo, como um fragmento de anticorpo RX1, 5H4, MCI, ou MC3. Várias técnicas foram desenvolvidas para a produção de fragmentos de anticorpo. Tradicionalmente, esses fragmentos foram derivados por meio de digestão 5 proteolítica de anticorpos intactos (veja, por exemplo, Morimoto e cols., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) e Brennan e cols., Science 229:81 (1985)). Entretanto, esses fragmentos podem ser produzidos agora diretamente por células hospedeiras recombinantes. Better e cols., Science 240: 1041-1043 (1988) revela secreção de fragmentos funcionais de anticorpo de bactérias (veja, por exemplo, Better e cols., Skerra e cols. Science 240: 1038-1041 (1988)). Por exemplo, fragmentos Fab'-SH podem ser recuperados diretamente de E. coli e ligados quimicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Carter e cols., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). Em uma outra modalidade, o F(ab')2 é formado usando o zipper de leucina GCN4 para promover a montagem da molécula de F(ab')2. De acordo com uma outra abordagem, fragmentos Fv, Fab ou F(ab')2 podem ser isolados diretamente de cultura de célula hospedeira recombinante. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpo estarão aparentes para o profissional habilitado.
Um anticorpo "isolado" é um que foi identificado e 25 separado e foi recuperado de um componente de seu ambiente natural. Componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais que interferem usos diagnósticos ou terapêuticos para o anticorpo, e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em modalidades preferidas, o anticorpo será purificado (1) em mais de 95% em peso de anticorpo como determinado pelo método de Lowry, e ainda mais preferivelmente mais de 99% em peso, (2) a um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de seqüência 5 de aminoácidos N-terminal ou interna pelo uso de um "spinning cup sequenator", ou (3) para homogeneidade por SDS-PAGE sob condições de redução ou não redução usando azul de Coomassie ou, preferivelmente, corante de prata. Anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ em células 10 recombinantes uma vez que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente. Geralmente, entretanto, anticorpo isolado será preparado 1 por pelo menos uma etapa de purificação.
Para uma descrição detalhada da estrutura e geração de anticorpos, veja Roth, D.B., e Craig, N.L., Cell, 94:411414 (1998), e Patente United States No. 6.255.458, aqui incorporada em sua totalidade por referência. De forma breve, o processo para geração de DNA que codifica os genes de imunoglobulina de cadeia pesada e leve ocorre primariamente em células B em desenvolvimento. Antes do rearranjo e união de vários segmentos de gene de imunoglobulina, os segmentos de gene V, D, J e constante (C) são encontrados geralmente em proximidade em um único cromossomo. Durante a diferenciação de células B, um de cada membro da família adequada de segmentos de gene V, D, J (ou apenas V e J no caso de genes de cadeia leve) são recombinados para formar genes de imunoglobulina pesada e leve funcionalmente rearranjados. Esse processo de rearranjo de segmento de gene parece ser sequencial.
Primeiramente, as ligações de cadeia pesada D-para-J são feitas, seguidas pelas ligações de cadeia pesada V-para-DJ e ligações de cadeia leve V-para-J.
A recombinação de segmentos de gene de região variável para formar regiões variáveis funcionais de cadeia pesada e 5 leve é mediada por seqüências de sinal de recombinação (RSS's) que flanqueiam segmentos V, D e J recombinantemente competentes. RSS's necessárias e suficientes para direcionar recombinação, compreendem um heptâmero de díade simétrico, um nonâmero rico em AT e uma região espaçadora 10 interveniente de 12 ou 23 pares de base. Esses sinais são conservados entre os diferentes lócus e espécies que carregam recombinação D-J (ou V-J) e são funcionalmente intercambiáveis. Veja, Oettinger, e cols. (1990), Science, 248, 1517-1523 e referências aqui citadas. O heptamero compreende a seqüência CACAGTG ou seu análogo seguido por um espaçador de seqüência não conservada e então um nonâmero tendo a seqüência ACAAAAACC ou seu análogo. Essas seqüências são encontradas em J, ou lado abaixo, de cada segmento de gene V e D. Imediatamente antes da linha 20 germinativa segmentos D e J são novamente duas seqüências de sinal de recombinação, primeiro o nonâmero e então o heptâmero novamente separado por uma seqüência não conservada. As seqüências heptaméricas e nonaméricas que seguem um segmento VL, VH ou D são complementares àquelas 25 que precedem os segmentos JL, D ou JH com os quais eles recombinam. Os espaçadores entre as seqüências heptaméricas e nonaméricas são de 12 pares de base de comprimento ou entre 22 e 24 pares de base de comprimento.
Em adição ao rearranjo de segmentos V, D e J, 30 diversidade adicional é gerada no repertório primário de cadeia pesada e cadeia leve de imunoglobulina por meio de recombinação variável nas localizações onde os segmentos V e J na cadeia leve são unidos e onde os segmentos D e J da cadeia pesada são unidos. Tal variação na cadeia leve ocorre tipicamente no último códon do segmento de gene V e o primeiro códon do segmento J. Imprecisão similar na ligação ocorre no cromossomo da cadeia pesada entre os segmentos D e JH e pode se estender por até 10 nucleotídeos. Além disso, vários nucleotídeos podem ser inseridos entre D e JH e entre os segmentos de gene VH e D que não são codificados pelo DNA genômico. A adição desses nucleotídeos é conhecida como diversidade de região N.
O efeito em rede de tal rearranjo nos segmentos de gene da região variável e a recombinação variável que pode 15 ocorrer durante tal ligação é a produção de um repertório de anticorpo primário.
"Fv" é o fragmento mínimo de anticorpo que contém um sítio completo de reconhecimento de antígeno e sítio de ligação. Essa região consiste em um dímero de um domínio 20 variável de cadeia pesada e um de cadeia leve em associação estreita, não covalente. É nessa configuração que as três CDRs de cada domínio variável interagem para definir uma sítio de ligação de antígeno na superfície do dímero VH VI, Coletivamente, as seis CDRs conferem especificidade de ligação de antígeno ao anticorpo. No entanto, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv que compreende apenas três CDRs específicas para um antígeno) tem a capacidade de reconhecer e ligar antígeno, embora em uma menor afinidade que o sítio de ligação inteiro.
O fragmento Fab também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CHI) da cadeia pesada. Fragmentos Fab diferem de fragmentos Fab' pela adição de alguns resíduos no terminal carboxi do domínio de cadeia pesada CHI incluindo uma ou mais cisteínas da região 5 de dobradiça do anticorpo. Fab'-SH ê a designação aqui usada para Fab' no qual o resíduo de cisteína dos domínios constantes sustentam um grupo tiol livre. Fragmentos de anticorpo F(ab')2 originalmente foram produzidos como pares de fragmentos Fab' que têm cisteínas de dobradiça entre eles.
Por "anticorpo neutralizante" entende-se uma molécula de anticorpo que é capaz de eliminar ou reduzir significativamente uma função efetora de um antígeno alvo ao qual se liga. Consequentemente, um anticorpo anti-alvo 15 "neutralizante" é capaz de eliminar ou reduzir significativamente uma função efetora, como atividade de enzima, ligação de ligante ou sinalização intracelular.
Como aqui fornecido, as composições for e métodos de tratamento de metástase de câncer e/ou perda óssea 20 associada a metástase de câncer podem utilizar um ou mais anticorpo usados de forma singular ou em combinação com outros terápicos para atingir os efeitos desejados. Anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser isolados de um animal que produz o anticorpo como um 25 resultado de contato direto com um antígeno ambiental ou imunização com o antígeno. Alternativamente, anticorpos podem ser produzido por metodologia de DNA recombinante usando um dos sistemas de expressão de anticorpo bem conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Harlow e Lane, 30 Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)). Tais anticorpos podem incluir IgGs recombinantes, proteínas de fusão quiméricas tendo seqüências derivadas de imunoglobulina ou anticorpos "Human Engineered™" que podem ser todos usados para o tratamento de metástase de câncer e/ou perda óssea associada a metástase de câncer de acordo com a presente invenção. Em adição às moléculas intactas, de comprimento total, o termo "anticorpo" também se refere a fragmentos dessas (como , por exemplo, fragmentos scFv, Fv, Fd, Fab, Fab' e F(ab)'2) ou multímeros ou agregados de moléculas intactas e/ou fragmentos que se ligam a M-CSF (ou M-CSFR) . Esses fragmentos de anticorpo se ligam ao antígeno e podem ser derivatizados para exibir características estruturais que facilitam o clearance e retenção, por exemplo, por incorporação de resíduos de galactose.
Em uma modalidade da presente invenção, anticorpos monoclonais de M-CSF podem ser preparados essencialmente como descrito em Halenbeck e cols. Pat. U.S. No. 5.491.065 (1997), aqui incorporada por referência. Anticorpos monoclonais de M-CSF de exemplo incluem aqueles que se ligam a um epitopo aparente conformacional associado a M- CSF recombinante ou nativo dimérico com neutralização concomitante da atividade biológica. Esses anticorpos são substancialmente não reativos com formas biologicamente inativas de M-CSF incluindo M-CSF monomérico e dimérico quimicamente derivatizados.
Em outras modalidades da presente invenção, anticorpos monoclonais anti-MCSF Human Engineered™ são fornecidos. A frase "Anticorpo Human Engineered™" se refere a um anticorpo derivado de um anticorpo não humano, tipicamente um anticorpo monoclonal de camundongo. Alternativamente, um anticorpo Human Engineered™ pode ser derivado de um anticorpo quimérico que retém ou retém substancialmente as propriedades de ligação do antígeno do anticorpo parental, 5 não humano, mas que exibe imunogenicidade diminuída quando comparado ao anticorpo parental quando administrado a humanos. A frase "anticorpo quimérico", como aqui usada, se refere a um anticorpo que contém seqüência derivada de dois diferentes anticorpos (veja, por exemplo, Patente U.S. N°: 4.816.567) que se originam tipicamente de diferentes espécies. Mais tipicamente, anticorpos quiméricos compreendem fragmentos de anticorpo humano e de murídeo, geralmente regiões constantes humanas e variáveis de camundongo.
A frase "região de determinação de complementaridade" ou o termo "CDR" se refere a seqüências de aminoácidos que juntas definem a afinidade de ligação e especificidade da região natural Fv de um sítio de ligação de imunoglobulina nativa (veja, por exemplo, Chothia e cols., J. Mol. Biol. 196:901 917 (1987); Kabat e cols., U.S. Dept, of Health and Human Services NIH Publication No. 91 3242 (1991)) . A frase "região constante" se refere à porção da molécula de anticorpo que confere funções efetoras. Na presente invenção, regiões constantes de camundongo são 25 preferivelmente substituídas por região constantes humanas.
As regiões constantes dos anticorpos do indivíduo são derivadas de imunoglobulinas humanas. A região constante de cadeia pesada pode ser selecionada de qualquer um dos cinco isotipos: alfa, delta, epsilon, gama ou mu.
Os anticorpos da presente invenção são ditos como sendo imunoespecíficos ou de ligação específica se eles se ligam ao antígeno com um Ka maior gue ou igual a cerca de 10eM-x preferivelmente maior que ou igual a cerca de lO’M’1, mais preferivelmente maior que ou igual a cerca de 108M-1 e 5 ainda mais preferivelmente maior que ou igual a cerca de 109M-1, 1O1OM-1, lO^M'1 ou ÍO^M'1. Os anticorpos anti-M-CSF podem se ligar a diferentes formas de ocorrência natural de MCSF, incluindo aquelas expressas elos tecidos do hospedeiro/indivíduo assim como aquelas expressas pelo 10 tumor. Os anticorpos monoclonais aqui revelados, como anticorpo RX1, 5H4, MCI, ou MC3, têm afinidade por M-CSF e são caracterizados por uma constante de equilíbrio de dissociação (Kd) de pelo menos 10~4 M, preferivelmente pelo menos cerca de 107M a cerca de 10’8 M, mais preferivelmente pelo menos cerca de 10-8M, 10-10M, 10-I:LM ou 10-12M. Tais afinidades podem ser facilmente determinadas usando técnicas convencionais como por diálise de equilíbrio; pelo uso de instrumento BIAcore 2000, usando procedimentos gerais apontados pelo fabricante; por radioimunoensaio usando M-CSF rotulado com 12SI; ou pro um outro método conhecido pelo profissional habilitado. Os dados de afinidade podem ser analisados, por exemplo, pelo método de Scatchard e cols., Ann N.Y. Acad. Sci. , 51:66 0 (1949). Assim, estará aparente que anticorpos preferidos de M-CSF exibirão um alto grau de especificidade para M-CSF e se ligarão com afinidade substancialmente menor a outras moléculas. Anticorpos preferidos se ligam a M-CSF com uma afinidade similar que RX1 de murídeo da Figura 4 se liga a M-CSF, exibem baixa imunogenicidade e inibem metástase de 30 células cancerosas quando testados em modelos de doença animal metastática. Outros anticorpos de exemplo se ligam a M-CSF com uma afinidade similar que 5H4, MCI ou MC3 de murídeo da Figura 13, 14 ou 15, respectivamente, se ligam a M-CSF.
O antígeno a ser usado para a produção de anticorpos pode ser, por exemplo, M-CSF intacto ou um fragmento de M- CSF que retém o epitopo desejado, opcionalmente fundido a um outro polipeptídeo que permite que o epitopo seja a apresentado em sua conformação nativa. Alternativamente, células que expressam M-CSF em sua superfície celular podem ser usadas para gerar anticorpos. Tais células podem ser transformadas para expressar M-CSF ou podem ser outras células de ocorrência natural que expressam M-CSF. Outras formas de M-CSF úteis para geração de anticorpos serão aparentes para aqueles habilitados na técnica.
Anticorpos policlonais
Anticorpos policlonais são preferivelmente despertados em animais por injeções múltiplas subcutâneas (sc) ou intraperitoniais (ip) do antígeno relevante e um adjuvante. Uma resposta melhorada de anticorpo pode ser obtida por conjugação do antígeno relevante a uma proteína que é imunogênica na espécie a ser imunizada, por exemplo, hemocianina keyhole limpet, albumina sérica, tiroglobulina bovina, ou inibidor de tripsina de soja que usa um agente bifuncional ou de derivatização, por exemplo, maleimidobenzoil sulfosuccinimida éster (conjugação através de resíduos de cisteína), N-hidroxissuccinimida (através de resíduos de lisina), glutaraldeído, anidrido succínico ou outros agente conhecidos ns técnica.
Animais são imunizados contra o antígeno, conjugados imunogênicos, ou derivados por combinação, por exemplo, de 100 μg ou 5 μg da proteína ou conjugado (para coelhos ou camundongos, respectivamente) com 3 volumes de adjuvante completo de Freund e injeção da solução por via 5 intradérmica em múltiplos locais. Um mês depois, os animais recebem dose de reforço com 1/5 da {fração (1/10) ) quantidade original do peptídeo ou conjugado em adjuvante completo de Freund por injeção subcutânea em múltiplos locais. 7-14 dias após a injeção de reforço, os animais são 10 sangrados e o soro é analisado para título de anticorpo. Os animais recebem doses de reforço até o platô de título.
Preferivelmente, o animal recebe reforço com o conjugado do mesmo antígeno, mas conjugado a uma diferente proteína e/ou através de um diferente reagente de entrecruzamento.
Conjugados também podem ser feitos em cultura de células recombinantes como fusões de proteína, além disso, agentes de agregação como alume são adequadamente usados para melhorar a resposta imune.
Anticorpos monoclonais
Anticorpos monoclonais podem ser feitos usado o método de hibridoma primeiramente descrito por Kohler e cols., Nature, 256:495 (1975), ou podem ser feitos por métodos de DNA recombinante.
No método de hibridoma, um camundongo ou outro animal 25 hospedeiro adequado, como um hamster ou macaco, é imunizado como aqui descrito para elicitar linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se ligarão especificamente à proteína usada para imunização. Alternativamente, linfócitos podem ser imunizados in vitro.
Linfócitos são então fundidos com células de mieloma usando um agente de fusão adequado, como polietileno glicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal antibodies: Principles e Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)) .
As células de hibridoma assim preparadas são semeadas e crescem em um meio de cultura adequado qie preferivelmente contém uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou sobrevivência de células de mieloma não fundidas, parentais. Por exemplo, se as células de mieloma parentais são desprovidas da enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas tipicamente irá incluir hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), cujas substâncias evitam o crescimento de células deficientes de HGPRT.
Células de mieloma preferidas são aquelas que se fundem de forma eficaz, sustentam produção de anticorpo de alto nível, estável pelas células produtoras de anticorpo selecionadas e são sensíveis a um meio. Linhas de células de mieloma humano e de heteromieloma de camundongo-humano também foram descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur e cols., Monoclonal Antibodies Production Técnicas and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). Linhas de mieloma de murídeo de exemplo incluem aquelas derivadas de tumores de camundongo MOP-21 e M.C.-ll disponíveis pelo Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. USA, e células SP-2 ou X63-Ag8-653 disponíveis pela American Type Culture Collection,Rockville, Md. USA.
O meio de cultura no qual as células de hibridoma crescem é avaliado para produção de anticorpos monoclonais direcionado contra o antígeno. Preferivelmente, a especificidade de ligação dos anticorpos monoclonais produzidos pelas células de hibridoma é determinada por imunoprecipitação ou por um ensaio de ligação in vitro, como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio de imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA). A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode, por exemplo, ser determinado por análise de Scatchard (Munson e cols., Anal. Biochem., 107:220 (1980)) .
Depois das células de hibridoma que produzem anticorpos da especificidade desejada, afinidade e/ou atividade serem identificadas, os clones podem ser subclonados por procedimentos de diluição limitante e crescem por métodos padrão (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Meios de cultura adequados para este objetivo incluem, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI-1640. Em adição, as células de hibridoma podem crescer in vivo como tumores de ascite em um animal. Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones são adequadamente separados do meio de cultura, fluido de ascite, ou soro por procedimentos convencionais de purificação de imunoglobulina como , por exemplo, proteína A Sepharose, cromatografia de hidroxilapatita, electroforese em gel, diálise ou cromatografia de afinidade.
Produção de Anticorpos Recombinantes
DNA que codifica os anticorpos monoclonais pode ser isolado e seqüenciado a partir das células de hibridoma usando procedimentos convencionais (por exemplo, pelo uso de sondas de oligonucleot ideo que são capazes de ligar especificamente a genes que codificam as cadeias pesadas e leves dos anticorpos monoclonais) . A determinação de seqüência irá requerer a isolação de pelo menos uam porção do gene ou cDNA de interesse. Usualmente isso requer a clonagem do DNA ou, preferivelmente, mRNA (ou seja, cDNA) que codifica os anticorpos monoclonais. A clonagem é realizada com o uso de técnicas padronizadas (veja, por exemplo, Sambrook e cols. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press, que é aqui incorporada por referência). Por exemplo, uma biblioteca de cDNA pode ser construída por transcrição reversa de poliA+ mRNA, preferivelmente mRNA associado a membrana, e a biblioteca rastreada usando sondas específicas para seqüências de gene de polipeptídeo de imunoglobulina humana. Em uma modalidade preferida, no entanto, a reação de cadeia de polimerase (PCR) é usada para amplificar cDNAs (ou porções dos cDNAs de comprimento total) que codificam um segmento de gene de imunoglobulina de interesse (por exemplo, o segmento variável de cadeia leve) . As seqüências amplificadas podem ser facilmente clonadas em qualquer vetor adequado, por exemplo, vetores de expressão, vetores de minigene, ou vetores de apresentação de fago. Deve ser observado que o método particular de clonagem usado não é crítico, desde que seja possível determinar a seqüência de algumas porções do polipeptídeo de imunoglobulina de interesse. Como aqui usado, uma molécula de ácido nucleico "isolado" ou seqüência de ácidos nucleicos "isolada"
ácido nucleico que é (1) identificada e separada de pelo menos uma molécula de ácido nucleico contaminante com a qual ela é comumente associada na fonte natural do ácido nucleico ou (2) clonada, amplificada, rotulada, ou distinta 5 de ácidos nucleicos de base de forma que a seqüência do ácido nucleico de interesse pode ser determinada, é considerada isolada. Uma molécula de ácido nucleico isolado é qualquer uma que não na forma ou ajuste na qual ela é encontrada na natureza. Moléculas de ácido nucleico isolado 10 são, portanto, distinguidas da molécula de ácido nucleico como ela existe em células naturais. Entretanto, uma molécula de ácido nucleico isolado inclui a molécula de ácido nucleico contida em células que expressam comumente o anticorpo onde, por exemplo, a molécula de ácido nucleico 15 está em localização cromossômica diferente daquela das células naturais.
Uma fonte para RNA usado para clonar e seqüenciar é um hibridoma produzido por obtenção de uma célula B do camundongo transgênico e por fusão da célula B a uma célula 20 imortal. Uma vantagem do uso de hibridomas é que eles podem ser facilmente rastreados, e um hibridoma que produz um anticorpo monoclonal humano de interesse é selecionado. Alternativamente, RNA podem ser isolados de células B (ou esplénicas totais) do animal imunizado. Quando fontes 25 outras que não hibridomas são usadas, pode ser desejável rastrear seqüências que codificam imunoglobulinas ou polipeptídeos de imunoglobulina com características de ligação específicas. Um método para tal rastreamento é o uso de use tecnologia de apresentação de fago. Apresentação 30 de fago é escrita, por exemplo, em Dower e cols., WO 91/17271, McCafferty e cols., WO 92/01047, e Caton e Koprowski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6450-6454 (1990), cada um desses aqui incorporado por referência. Em uma modalidade que usa tecnologia de apresentação de fago, cDNA 5 de um camundongo transgênico imunizado (por exemplo, cDNa total de baço) é isolado, a reação de cadeia de polimerase é usada para amplificar seqüências de cDNA que codificam uma porção de um polipeptídeo de imunoglobulina, por exemplo, regiões de CDR, e as seqüências amplificadas são 10 inseridas em um vetor de fago. cDNAs que codificam peptídeos de interesse, por exemplo, peptídeos de região variável com características de ligação desejadas, são identificados por técnicas padrão como panning.
A seqüência do ácido nucleico amplificado ou clonado é 15 então determinada. Tipicamente a seqüência que codifica uma região variável inteira do polipeptídeo de imunoglobulina é determinada, entretanto, it will sometimes by adequate to seqüência only uma porção da região variável, por exemplo, a porção que codifica CDR. Tipicamente a porção seqüenciada 20 terá pelo menos 30 bases de comprimento, mais freqüentemente codificação baseada para pelo menos cerca de um-terço ou pelo menos cerca da metade do comprimento da região variável será seqüenciado.
O seqüenciamento pode ser realizado em clones isolados 2 5 de uma biblioteca de cDNA, ou, quando é usada PCR, depois de subclonagem da seqüência amplificada ou por seqüenciamento direto de PCR do segmento amplificado. O seqüenciamento é realizado usando técnicas padronizadas (veja, por exemplo, Sambrook e cols. (1989) Molecular 30 Cloning: A Laboratory Guide, Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press, e Sanger, F. e cols. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467, que é aqui incorporada por referência). Ao comparar a seqüência do ácido nucleico clonado com seqüências publicadas dos genes de imunoglobulina humana e 5 cDNAs, uma pessoa habilitada será capaz de determinar, dependendo da região seqüenciada, (i) o uso de segmento de linha germinativa do polipeptídeo de imunoglobulina de hibridoma (incluindo o isotipo da cadeia pesada) e (ii) a seqüência das regiões variáveis de cadeia pesada e leve, 10 incluindo seqüências que resultam da adição de região N e o processo de mutação somática. Uma fonte de informação sobre seqüência de gene de imunoglobulina é o "National Center for Biotechnology Information", National Library of Medicine, National Institutes of Health, Bethesda, Md.
Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são então transfectados em células hospedeiras como células de E. coli, células de símio COS, células 293 humanas embriônicas de rim (por exemplo, células 293E), células de ovário de hamster da China (CHO), 20 ou células de mieloma que não produzem proteína de imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. A produção recombinante de anticorpos é bem conhecida na técnica. seqüências de controle de expressão se referem a seqüências de DNA necessárias para a expressão de uma seqüência codificadora operacionalmente ligada em uma organismo hospedeiro particular. As seqüências de controle que são adequadas para procariotas, por exemplo, incluem 30 uma seqüência promotora, opcionalmente uma operadora e um sítio de ligação de ribossomo. Células eucarióticas são conhecidas por utilizarem promotores, sinais de poliadenilação, e intensificadores.
Ácido nucleico é operacionalmente ligado quando ele é colocado em uma relação funcional com uma outra seqüência de ácidos nucleicos. Por exemplo, DNA para uma pré- seqüência ou líder secretora é operacionalmente ligado a DNA para um polipeptídeo se ele é expresso como uma pré- proteína que participa na secreção do polipeptídeo; um promotor ou intensificador é operacionalmente ligado a uma seqüência codificadora se ele afeta a transcrição da seqüência; ou um sítio de ligação de ribossomo é operacionalmente ligado a uma seqüência codificadora se ele é posicionado de forma a facilitar a tradução. Geralmente, operacionalmente ligado significa que as seqüências de DNA sendo ligadas são contíguas, e, no caso de uma líder secretora, contíguas e em fase de leitura. Entretanto, intensificadores não precisam ser contíguos. A ligação é realizada por ligação em sítios de restrição convenientes. Se tais sítios não existirem, os adaptadores de oligonucleotídeo sintético ou ligantes são usados de acordo com prática convencional.
Células, linha de células, e cultura de células são freqüentemente usados de forma intercambiável e todas essas designações incluem prole. Transformantes e células transformadas incluem a célula primária e culturas derivadas dessas sem levar em consideração o número de transferências. Também compreende-se que toda prole pode não ser precisamente idêntica em conteúdo de DNA, devido a mutações deliberadas ou acidentais. Proles mutantes que têm a mesma função ou atividade biológica como rastreado na célula originalmente transformada são incluídas. Onde ser desejar fazer designações distintas, ficará evidente a partir do contexto.
Em uma modalidade alternativa, a seqüência de aminoácidos de uma imunoglobulina de interesse pode ser determinada por seqüenciamento direto de proteína. Seqüências de nucleotídeo codificadoras adequadas podem ser designadas de acordo com uma tabela universal de códon. Variantes de seqüência de aminoácidos do anticorpo desejado podem ser preparadas por introdução de modificações adequadas do nucleotídeo no DNA codificador, ou por síntese de peptídeo. Tais variantes incluem, por exemplo, deleções, e/ou inserções e/ou substituições de resíduos nas seqüências de aminoácidos do anticorpos. Qualquer combinação de deleção, inserção, e substituição é feita para chegar à construção final, desde que a construção final possua as características desejadas. As modificações de aminoácido também podem alterar processos pós-tradução do anticorpo monoclonal, humano, humanizado, Human Engineered™ ou variante, como mudança do número ou posição de sítios de glicosilação.
Moléculas de ácido nucleico que codificam variantes de seqüência de aminoácidos do anticorpo são preparadas por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Esses métodos incluem, mas não se limitam a, isolação a partir de uma fonte natural (no caso de variantes de seqüência de aminoácidos de ocorrência natural) ou preparação por mutagênese mediada por oligonucleotídeo (u direcionada a sítio), PCR, e mutagênese de cassete de uma variante anteriormente preparada ou uma versão não variante do anticorpo.
A invenção também fornece ácido nucleico isolado que codifica anticorpos da invenção, opcionalmente 5 operacionalmente ligado a seqüências de controle reconhecidas por uma célula hospedeira, vetores e células hospedeiras que compreendem os ácidos nucleicos, e técnicas recombinantes para a produção dos anticorpos, que pode compreender cultura da célula hospedeira de forma que o 10 ácido nucleico é expresso e, opcionalmente, recuperação do anticorpo da cultura de célula hospedeira ou meio de cultura.
Para produção de o anticorpo recombinante, o ácido nucleico que o codifica é isolado e inserido em um vetor 15 replicável para posterior clonagem (amplificação do DNA) ou para expressão. DNA que codifica o anticorpo monoclonal é facilmente isolado e seqüenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, pelo uso de sondas de oligonucleotídeo que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeias pesada e leves do anticorpo). Vários vetores são disponíveis. Os componentes do vetor geralmente incluem, sem limitação, um ou mais dos seguintes: uma seqüência sinalizadora, uma origem de replicação, um ou mais genes de marcador 25 seletivo, um elemento intensificador, um promotor e uma seqüência de terminação de transcrição.
(1) Componente de seqüência sinalizadora
O anticorpo desta invenção pode ser produzido recombinantemente não apenas diretamente, mas também como 30 um polipeptídeo de fusão com um polipeptídeo heterólogo, que é preferivelmente uma seqüência sinalizadora ou outro polipeptídeo que tem uma sítio de clivagem específico no terminal N da proteína ou polipeptídeo maduro. A seqüência sinalizadora selecionada preferivelmente é uma que é 5 reconhecida e processada (ou seja, clivada por uma peptidase de sinal) pela célula hospedeira. Se células hospedeiras procarióticas não reconhecem e processam o seqüência sinalizadora de anticorpo nativo, a seqüência sinalizadora pode ser substituída por uma seqüência 10 sinalizadora selecionada, por exemplo, do grupo de pectato liase (por exemplo, pelB) fosfatase alcalina, penicilinase, Ipp, ou líderes de enterotoxina II estável em calor. Para secreção de levedura a seqüência sinalizadora nativa pode ser substituída, por exemplo, por líder de invertase de 15 levedura, um fator líder (que inclui líderes de fator-oc de Saccharomyces e Kluyveromyces) , ou líder de fosfatase ácida, o líder de glicoamilase de C. albicans, ou o sinal descrito em WO90/13646. Em expressão de célula de mamífero, seqüência sinalizadoras de mamífero assim como líderes 20 secretores virais, por exemplo, o sinal de herpes simples gD, são disponíveis.
O DNA para tal região precursora é ligado em estrutura de leitura para DNA que codifica o anticorpo.
(2) Origem de componente de replicação
Tanto vetores de expressão quanto de clonagem contêm uma seqüência de ácidos nucleicos que permite que o vetor replique em uma ou mais células hospedeiras selecionadas. Geralmente, em vetores de clonagem essa seqüência é uma que permite que o vetor replique independentemente do DNA 30 cromossômico hospedeiro, e inclui origens de replicação ou seqüências autonomamente de replicantes. Tais seqüências são bem conhecidas para uma variedade de bactérias, leveduras e vírus. A origem de replicação do plasmídeo pBR322 é adequada para a maioria das bactérias Gram- negativas, a origem do plasmídeo 2 μ é adequada para levedura, e várias origens virais são úteis para vetores de clonagem em células de mamífero. Geralmente, o componente de origem de replicação não é necessário para vetores de expressão de mamífero (a origem SV4 0 pode ser usada tipicamente apenas porque ela contém o promotor precoce).
(3) Componente de marcador seletivo
Vetores de expressão e de clonagem podem conter um gene seletivo, também denominado marcador selecionável. Genes de seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, por exemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, tetraciclina, G418, geneticina, histidinol, ou ácido micofenólico (b) complementam deficiências auxotróficas, ou (c) suprem nutrientes críticos não disponíveis do meio complexo, por exemplo, o gene que codifica D-alanina racemase para Bacilos.
Um exemplo de um esquema de seleção utiliza um medicamento para interromper o crescimento de uma célula hospedeira. Essas células que são transformadas com um gene heterólogo produzem uma proteína que confere resistência a medicamentos e assim sobrevivem ao regime de seleção. Exemplos de tal seleção dominante usam os medicamentos metotrexate, neomicina, histidinol, puromicina, ácido micofenólico e higromicina.
Um outro exemplo de marcadores selecionáveis adequados de mamíferos são aqueles que permitem a identificação de células competentes para absorver o acido nucleico que codifica o anticorpo, como DHFR, timidina quinase, metalotioneína-I e -II, preferivelmente genes de metalotioneína de primata, adenosina desaminase, ornitina descarboxilase, etc.
Por exemplo, células transformadas com o gene de seleção de DHFR são primeiramente identificadas por cultura de todos os trans formant es em um meio de cultura que contém metotrexate (Mtx), um antagonista competitivo de DHFR. Uma célula hospedeira adequada quando DHFR de tipo selvagem é empregado é a linha de célula de ovário de hamster da China (CHO) deficiente de atividade de DHFR.
Alternativamente, células hospedeiras (particularmente hospedeiros de tipo selvagem que contêm DHFR endógeno) transformadas ou co-transformadas com seqüências de DNA que codificam anticorpo da invenção, proteína de DHFR de tipo selvagem, e um outro marcador selecionável como aminoglicosídeo 3'fosfotransferase (APH) podem ser selecionadas por crescimento celular em meio que contém um agente de seleção para o marcador selecionável como um antibiótico aminoglicosídico, por exemplo, kanamicina, neomicina, ou G418. Veja, Patente U.S. N°: 4.965.199.
Um gene de seleção adequado para uso em levedura é o gene trpl presente no plasmídeo de levedura YRp7 (Stinchcomb e cols., Nature, 282: 39 (1979)). 0 gene trpl fornece um marcador de seleção para uma cepa mutante de levedura desprovida da capacidade de crescer em triptofano, por exemplo, ATCC No. 44076 ou PEP4-1. Jones, Genetics, 85: 12 (1977) . A presença da lesão trpl no genoma de célula hospedeira de levedura fornece então um ambiente eficaz para detecção de transformação por crescimento na ausência de triptofano. De modo similar, cepas de levedura deficientes de Leu2 (ATCC 20,522 ou 38,626) são complementadas por plasmídeos conhecidos que sustentam o gene Leu2. Cepas de levedura deficientes de Ura3 são complementadas por plasmídeos que sustentam o gene ura3.
Além disso, vetores derivado do plasmídeo circular de 1,6 μm pKDl podem ser usados para transformação de 10 leveduras Kluyveromyces. Alternativamente, um sistema de expressão para produção em larga escala de quimosina de bezerro recombinante foi relatado para K. lactis. Van den Berg, Bio/Technology, 8: 135 (1990) . Vetores de expressão estáveis de multi-cópias para secreção de albumina sérica 15 humana recombinante madura por cepas industriais de Kluyveromyces também foram revelados. Fleer e cols. , Bio/Technology, 9: 968-975 (1991).
(4) Componente de Promotor
Vetores de expressão e de clonagem comumente contêm um 20 promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e é operacionalmente ligado ao ácido nucleico que codifica o anticorpo. Promotores adequados para uso com hospedeiros procarióticos incluem o promotor de arabinose phoA (por exemplo, araB), sistemas de promotor de β-lactamase e 25 lactose, fosfatase alcalina, sistema de promotor de triptofano (trp), e promotores híbridos como o promotor tac. Entretanto, outros promotores bacterianos conhecidos são adequados. Promotores para uso em sistemas bacterianos também terão uma seqüência de Shine-Dalgarno (S.D.) 30 operacionalmente ligada ao DNA que codifica o anticorpo da invenção.
Seqüências de promotor são conhecidas para eucariotas. Virtualmente todos genes eucarióticos têm uma região rica em AT localizada aproximadamente 25 a 30 bases acima do 5 sítio onde transcrição é iniciada. Uma outra seqüência que encontrou 70 a 80 bases acima do início da transcrição de vários genes é uma região CNCAAT onde N pode ser qualquer nucleotídeo. Na extremidade 3' da maioria dos genes eucarióticos é uma seqüência AATAAA que pode ser o sinal 10 para adição da cauda poli A à extremidade 3' da seqüência codificadora. Todas essas seqüências são adequadamente inseridas em vetores de expressão eucarióticos.
Exemplos de seqüências promotoras adequadas para uso com hospedeiros de levedura incluem os promotores para 315 fosfoglicerato quinase ou outras enzimas glicolíticas, como enolase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase,hexoquinase, piruvato descarboxilase, fosfofrutoquinase, glicose-6-fosfato isomerase, 3-fosfoglicerato mutase, piruvato quinase, triosefosfato isomerase, fosfoglicose 20 isomerase, e glicoquinase.
Outros promotores de levedura, que são promotores indutíveis tendo a vantagem adicional de transcrição controlada por condições de crescimento, são as regiões de promotor para álcool desidrogenase 2, isocitocromo C, 25 fosfatase ácida, enzimas degradativas associadas ao metabolismo do nitrogênio, metalotioneína, gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase e enzimas responsáveis por utilização de maltose e galactose. Vetores adequados e promotores para uso em expressão de levedura são também descritos em EP 30 73.657. Intensificadores de levedura também são usados de forma vantajosa com promotores de levedura.
A transcrição de anticorpo a partir de vetores em células hospedeiras de mamífero é controlada, por exemplo, por promotores obtidos dos genomas de vírus como vírus da 5 leucemia de Abelson, polioma vírus, fowlpox vírus, adenovirus (como Adenovirus 2), vírus de papiloma bovino, vírus do sarcoma das aves, mais preferivelmente citomegalovírus, um retrovirus, vírus da hepatite-B, Vírus Símio 40 (SV40), de promotores heterólogos de mamífero, 10 por exemplo, o promotor de actina ou um promotor de imunoglobulina, de promotores hea.t-shock, desde que tais promotores sejam compatíveis com os sistemas de célula hospedeira.
Os promotores precoce e tardio do vírus SV40 são 15 convenientemente obtidos como um fragmento de restrição de SV40 que também contém a origem de replicação viral de SV40. O promotor precoce imediato do citomegalovírus humano é convenientemente obtido como um fragmento de restrição HindiII E. Um sistema para expressão de DNA em hospedeiros 20 mamíferos que usa o vírus de papiloma bovino como um vetor é revelado na Patente U.S. N° : 4.419.446. A modificação desse sistema é descrita em Patente U.S. N° : 4.601.978. Veja também Reyes e cols., Nature 297: 598-601 (1982) sobre expressão de cDNA de β-interferon humano em células de 25 camundongo sob o controle de um promotor de timidina quinase de vírus herpes simples. Alternativamente, as repetições de terminal longo do vírus de sarcoma de rous podem ser usadas como o promotor.
(5) Componente de elemento intensificador
A transcrição de um DNA que codifica o anticorpo dessa invenção por eucariotas superiores é frequentemente aumentada por inserção de uma seqüência intensificadora em um vetor. Várias seqüências intensificadoras são agora conhecidas de genes de mamífero (globina, elastase, 5 albumina, alfafetoproteína, e insulina). Tipicamente, no entanto, pode-se usar um intensificador de um vírus de célula eucariótica. Exemplos incluem o intensificador SV40 no último lado da origem de replicação (bp 100-270), o intensificador de promotor precoce de citomegalovírus, o 10 intensificador de polioma no último lado da origem de replicação e intensificadores de adenovirus. Veja também, Yaniv, Nature 297: 17-18 (1982) sobre elementos intensificadores para ativação de promotores eucarióticos. 0 intensificador pode ser combinado no vetor na posição 5' 15 ou 3' para a seqüência que codifica o anticorpo, mas é preferivelmente localizado em um sítio 5' do promotor.
(6) Componente de terminação de transcrição
Vetores de expressão usados em células hospedeiras eucarióticas (levedura, fungo, inseto, planta, animal, humana, ou células nucleadas de outros organismos multicelulares) também terão seqüências necessárias para a terminação da transcrição e para estabilização do mRNA. Tais seqüências são comumente disponíveis das regiões não traduzidas 5' e, ocasionalmente 3', de DNAs ou cDNAs 25 eucarióticos ou virais. Essas regiões contêm segmentos de nucleotídeo transcritos como fragmentos poliadenilados na porção não traduzida do anticorpo que codifica mRNA. Um componente de terminação de transcrição útil é a região de poliadenilação de hormônio do crescimento bovino. Veja 30 WO94/11026 e o vetor de expressão revelado nesta. Um outro é o terminador de transcrição de cadeia leve de. imunoglobulina de camundongo.
(7) Seleção e transformação de células hospedeiras
Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão do DNA nos vetores são as células de procariota, levedura, ou eucariota superior acima descritas.
Procariotas adequados para este objetivo incluem eubactérias, como organismos Gram-negativos ou Gram-positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae como Escherichia, por exemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por exemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por exemplo, Serratia marcescans, e , Shigella, assim como Bacilli como B. subtilis e B. licheniformis (por exemplo, B. licheniformis 41 P revelado em DD 266.710 publicado em 12 de abril de 1989), Pseudomonas como P. aeruginosa, e Streptomyces. Um hospedeiro de clonagem preferido de E. coli é E. coli 2 94 (ATCC 31,446), embora outras cepas como E. coli B, E. Coli X1776 (ATCC 31,537), e E. coli W3110 (ATCC 27,325) sejam 20 adequada\s. Estes exemplos são ilustrativos ao contrário de limitantes.
Em adição aos procariontes, micróbios eucarióticos como fungos filamentosos ou levedura são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para vetores que codificam 25 anticorpo. Saccharomyces cerevisiae, ou fermento comum de confeitaria, é o mais comumente usado entre os microorganismos hospedeiros eucariotas inferiores. Entretanto, inúmeros outros gêneros, espécies e cepas são comumente disponíveis e úteis nessa, como 30 Schizosaccharomyces pombe; hospedeiros de Kluyveromyces * como, por exemplo, K. lactis, K fragilis (ATCC 12,424), K. o bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K. thermotolerans, e K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastors (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces como Schwanniomyces occidentalis; e fungos filamentosos como, por exemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, e hospedeiros de Aspergillus como A. nidulans e A. niger.
Células hospedeiras adequadas para a expressão de anticorpo glicosilado são derivadas de organismos muiticelulares. Exemplos de células invertebradas incluem • células de planta e inseto.
Numerosas cepas baculovirais e variantes e células 15 hospedeiras de inseto permissivas correspondentes de hospedeiros como Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca das frutas), e Bombyx mori hforam ■ identificadas. Várias cepas virais para transfecção são publicamente disponíveis, por exemplo, a variante L-l de Autographa californica NPV e a cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, e tais vírus podem ser usados como o vírus nessa de acordo com a presente invenção, particularmente para transfecção de células de Spodoptera frugiperda. culturas de células de plantas de algodão, milho, batata, soja, petúnia, tomate, tabaco, lentícula, e outras células de planta também podem ser usadas como hospedeiros.
No entanto, o interesse tem sido maior em células de vertebrados, e a propagação de células de vertebrados e 30 cultura (cultura de tecido) tem se tornado um procedimento I rotineiro. Exemplos de linhas de células hospedeiras de- mamífero úteis são Células de ovário de hamster da China, incluindo células CHOK1 (ATCC CCL61), DXB-11, DG-44, e células de ovário de hamster da China/-DHFR (CHO, Urlaub e cols., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77: 4216 (1980)); linha CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651) ; linha de rim embriônico humano (293 ou 293 células subclonadas para crescimento em cultura de suspensão, [Graham e cols., J. Gen Virol. 36: 59 (1977)]; células renais de filhote de hamster (BHK, ATCC CCL 10); células de sertoli de camundongo (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243- 251 (1980) ) ; células renais de macaco (CV1 ATCC CCL 70) ;, células renais de macaco African green (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células renais caninas (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75) ; células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51) ; células TRI (Mather e cols., Annals N.Y Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; e uma linha de hepatoma humano (Hep G2).
Células hospedeiras são transformadas ou transfectadas com os vetores de expressão oud e clonagem acima descritos para produção de anticorpo e cultivados em meio nutriente 25 convencional modificado como adequado para indução de promotores, seleção de transformantes, ou amplificação de genes que codificam as seqüências desejadas. Em adição, novos vetores e linhas de células transfectadas com múltiplas unidades de cópia de transcrição separadas por um 30 marcador seletivo são particularmente úteis e preferidos para a expressão de anticorpos que visam M-CSF.
(8) Cultura de células hospedeiras
As células hospedeiras usadas para produzir o anticorpo dessa invenção podem ser cultivadas e uma variedade de meios. Meios comercialmente disponíveis como Ham's FIO (Sigma) , meio essencial mínimo ((MEM) , (Sigma) , RPMI-1640 (Sigma), e meio de Eagle modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma) são adequados para cultura das células hospedeiras. Além disso, qualquer um dos meios descritos em Ham e cols., Meth. Enz. 58: 44 (1979), Barnes e cols., Anal. Biochem. 102: 255 (1980), Patente U.S. Nos. ’ 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; ou 5.122.469; W090103430; WO 87/00195; ou Patente U.S. Re. No. 30.985 podem ser usados como meio de cultura para as células hospedeiras. Qualquer um desses meios pode ser suplementado como necessário com hormônios e/ou outros fatores de crescimento (como insulina, transferrina, ou fator de crescimento epidérmico), sais (como cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (como HEPES), nucleotídeos (como adenosina e timidina), antibióticos (como medicamentos de Gentamicina™) , elementos de traço (definidos como compostos inorgânicos comumente presentes em concentrações finais na escala micromolar) e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Quaisquer outros suplementos necessários também podem ser incluídos em concentrações adequadas que são conhecidas por aqueles habilitados na técnica. As condições de cultura, como temperatura, pH, e outras, são aquelas previamente usadas com a célula hospedeira selecionada para expressão e serão aparentes para o profissional habilitado.
(9) Purificação de anticorpo
Quando do uso de técnicas recombinantes, o anticorpo podem ser produzido intracelularmente, no espaço periplásmico, ou diretamente secretado no meio, incluindo de culturas microbianas. Se o anticorpo é produzido intracelularmente, como uma primeira etapa, os restos particulados, células hospedeiras ou fragmentos Usados, são removidos, por exemplo, por centrifugação ou ultrafiltração. Better e cols. Science 240: 1041-1043 (1988); ICSU Short Reports 10: 105 (1990); e Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 457-461 (1993) descrevem um procedimento para isolar anticorpos que são secretados para o espaço periplásmico de E. coli. (veja também, [Carter e cols., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)].
A composição de anticorpo preparada a partir de células microbianas ou de mamífero pode ser purificada usando, por exemplo, cromatografia de cation de hidroxilapatita ou cromatografia de troca avian e cromatografia de afinidade, com a cromatografia de afinidade sendo a técnica de purificação preferida. A adequação da proteína A com um ligante de afinidade depende da espécie e isotipo de qualquer domínio Fc de imunoglobulina que está presente no anticorpo. Proteína A pode ser usada para purificar anticorpos que são baseados em cadeias pesadas humanas yl, y2, ou y4 (Lindmark e cols., J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). A proteína G é recomendada para todos isotipos de camundongo e para y3 humana (Guss e cols., EMBO J. 5: 15671575 (1986)) . A matriz à qual o ligante de afinidade é ligado é mais frequentemente agarose, mas outras matrizes são disponíveis. Matrizes mecanicamente estáveis como vidros de poro controlado ou poli(estirenodivinil)benzeno permitem taxas de fluxo mais rápidas e tempos de processamento mais curtos que os que podem ser atingidos com agarose. Quando o 5 anticorpo compreende um domínio CH 3, a resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.) é útil para purificação. Outras técnicas para purificação de proteína como fracionamento em uma coluna de troca iônica, precipitação de etanol, HPLC de fase reversa, cromatografia 10 em sílica, cromatografia em heparina SEPHAROSE™ ,cromatografia em uma resina de troca aniônica ou catiônica (como coluna de ácido poliaspártico), cromatofócus, SDS- PAGE, e precipitação de sulfato de amónio também são disponíveis dependendo do anticorpo a ser recuperado.
Anticorpos humanizados e quiméricos
Devido ao fato de anticorpos humanizados ou quiméricos serem menos imunogênicos em humanos que os anticorpos monoclonais parentais de camundongo, eles podem ser usados para o tratamento de humanos com risco muito menor de 20 anafilaxia. Portanto, esses anticorpos podem ser preferidos em aplicações terapêuticas que envolvem administração in vi vo a um humano.
Anticorpos monoclonais quiméricos, nos quais os domínios variáveis Ig de um anticorpo monoclonal de camundongo são 25 fundidos para domínios constantes Ig humanos, podem ser gerados usando procedimentos padrão conhecidos na técnica (veja, Morrison, S. L. , e cols. (1984) Chimeric Human Antibody Molecules; Mouse Antigen Binding Domains with Human Constant Region Domains, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 30 81, 6841-6855; e, Boulianne, G. L. , e cols., Nature 312, 643-646. (1984)). Embora alguns anticorpos monoclonais quiméricos tenham provado ser menos imunogênicos em humanos, os domínios variáveis Ig de camundongo ainda podem levar a uma resposta significativa humana anti-camundongo.
Anticorpos humanizados podem ser atingidos por vários métodos incluindo, por exemplo: (1) enxerto de regiões de determinação de complementaridade não humanas (CDRs) em uma estrutura humana e região constante (um processo referido na técnica como humanização através de "enxerto de CDR"), ou, alternativamente, (2) transplante dos domínios variáveis inteiros não humanos, porém os camuflando com uma superfície semelhante a humana por substituição dos resíduos de superfície (um processo referido na técnica como "embutir"). Na presente invenção, anticorpos humanizados incluirão anticorpos "humanizado" e "embutido". Esses métodos são revelado, por exemplo, em Jones e cols., Nature 321:522 525 (1986); Morrison e cols., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 81:6851 6855 (1984); Morrison e Oi, Adv. Immunol., 44:65 92 (1988); Verhoeyer e cols., Science 239:1534 1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 28:489 498 (1991); Padlan, Molec. Immunol. 31(3):169 217 (1994); e Kettleborough, C.A. e cols., Protein Eng. 4(7):773 83 (1991) cada um desses aqui incorporado por referência.
Em particular, um anticorpo de roedor em administração repetida in vivo em homem isoladamente ou como um conjugado despertará uma resposta imune no recipiente contra o anticorpo de roedor; a resposta chamada KAMA (Anticorpo Humano anti camundongo). A resposta de HAMA pode limitar a eficácia do fármaco se dosagem repetida for necessária. A imunogenicidade do anticorpo pode ser reduzida por modificação química do anticorpo com um polímero hidrofílico como polietileno glicol ou pelo uso dos métodos de engenharia genética para fazer a estrutura de ligação ao anticorpo o mais parecida com humana. Por exemplo, as seqüências de gene para os domínios variáveis do anticorpo de roedor que ligam CEA podem ser substituídas pelos domínios variáveis de uma proteína de mieloma humano, assim produzindo um anticorpo quimérico recombinante. Esses procedimentos são detalhados e, EP 194276, EP 0120694, EP 0125023, EP 0171496, EP 0173494 e WO 86/01533. Alternativamente as seqüências de gene das CDRs do anticorpo de roedor podem ser isolados ou sintetizadas e substituídas pela regiões correspondentes da seqüência de um gene de anticorpo homólogo humano, que produz um anticorpo humano com a especificidade do anticorpo de roedor original. Esses procedimentos são descritos em EP 023940, WO 90/07861 e W091/09967. Alternativamente um grande número dos resíduos de superfície do domínio variável do anticorpo de roedor pode ser modificado para aqueles resíduos normalmente encontrados em um anticorpo homólogo humano, que produz um anticorpo de roedor que tem uma superfície "embutida" de resíduos e que será portanto, reconhecido como próprio pelo corpo humano. Essa abordagem foi demonstrada por Padlan e cols., (1991) Mol. Immunol. 28, 489.
O enxerto de CDR envolve a introdução de uma ou mais das seis CDRs dos domínios variáveis Ig domínios de cadeia pesada e leve de camundongo nas quatro regiões de estrutura adequadas dos domínios variáveis Ig humanos, também chamado enxerto de CDR. Essa técnica (Riechmann, L., e cols., Nature 332, 323 (1988)), utiliza as regiões de estrutura conservada (FR1-FR4) como uma armação para sustentar as alças de CDR que são os contatos primários com antígeno. Uma desvantagem de enxerto de CDR, entretanto, é que ele pode resultar em um anticorpo humanizado que tem uma afinidade de ligação substancialmente menor que a do anticorpo original de camundongo, porque aminoácidos das regiões de estrutura podem contribuir para a ligação de antígeno, e porque os aminoácidos das alças de CDR podem influenciar a associação de dois domínios Ig variáveis. Para manter a afinidade do anticorpo monoclonal humanizado, a técnica de enxerto de CDR pode ser melhorada por escolha de regiões de estrutura humana que lembram mais intimamente as regiões de estrutura do anticorpo original de camundongo, e por mutagênese direcionada a sítio de aminoácidos únicos na estrutura ou CDRs auxiliados por modelagem em computador do sítio de ligação de antígeno (por exemplo, Co, M. S., e cols. (1994), J. Immunol. 152, 2968-2976) .
Um método de humanização de anticorpos compreende alinhamento de seqüências de cadeia pesada e leve não humanas a seqüências de cadeia pesada e leve humanas, seleção e substituição da estrutura não humana com uma estrutura humana baseada em tal alinhamento, modelagem molecular para prever a conformação da seqüência humanizada e comparação à conformação do anticorpo parente. Esse processo é seguido por mutação repetida de resíduos na região de CDR que perturba a estrutura das CDRs até que a conformação prevista do modelo de seqüência humanizada se aproxime da conformação da CDRs não humana do anticorpo parente não humano. Tais anticorpos humanizados podem ser também derivatizados para facilitar retenção e clearance, por exemplo, via receptores de Ashwell (veja, por exemplo, Patente U.S. Nos. 5.530,101 e 5.585.089 cujas patentes são aqui incorporadas por referência).
Inúmeras humanizações de anticorpos monoclonais de camundongo por desenho racional foram relatadas (veja, por exemplo, 20020091240 publicado em 11 de julho de 2002, WO 92/11018 e Patente U.S. N° : 5.693.762, Patente U.S. N° : 5.766.866.
Variantes de seqüência de aminoácidos
Um método útil para identificação de certos resíduos ou regiões do anticorpo que são localizações preferidas para mutagênese é chamado "mutagênese de rastreamento de alanina", como descrito por Cunningham e Wells Science, 244:1081-1085 (1989). Aqui, um resíduo ou grupo resíduos alvo são identificados (por exemplo, resíduos com carga como arg, asp, his, lys, e glu) e substituídos por um aminoácido neutro ou carregado negativamente (mais preferivelmente alanina ou polialanina) para afetar a interação dos aminoácidos com antígeno. Essas localizações de aminoácido que demonstram sensibilidade funcional às substituições são então refinadas por introdução de variantes adicionais ou outras variantes, nos sítios de substituição. Assim, embora o sítio para introdução de uma variação de seqüência de aminoácidos seja predeterminado, a natureza da mutação por si necessária não pode ser predeterminada. Por exemplo, para analisar a performance de uma mutação em um dado sítio, o rastreamento de ala ou mutagênese aleatória é conduzido no códon ou região alvo e as variantes expressas de anticorpo são rastreadas para a atividade desejada.
Inserções de seqüência de aminoácidos incluem fusões de terminal amino e/ou carboxil que variam em comprimento de um resíduo a polipeptídeos que contêm cem ou mais resíduos, assim como inserções intra-seqüência de resíduos aminoácido únicos ou múltiplos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo metionil de terminal N ou o anticorpo (incluindo fragmento de anticorpo) fundido a um rótulo de epitopo ou um epitopo de receptor de salvamento. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo incluem a fusão a um polipeptídeo que aumenta a meia-vida sérica do anticorpo, por exemplo, no terminal N ou terminal C.
O termo "epitopo rotulado" se refere ao anticorpo fundido a um rótulo de epitopo. 0 polipeptídeo de rótulo de epitopo tem resíduos suficientes para fornecer um epitopo contra o qual um anticorpo pode ser feito, curto ainda o suficiente de forma que ele não interfira com a atividade do anticorpo. 0 rótulo de epitopo preferivelmente é suficientemente único de forma que o anticorpo contra ele não reaja de forma substancialmente cruzada com outros epitopos. Polipeptídeos de rótulo adequados geralmente têm pelo menos 6 resíduos de aminoácido e usualmente entre cerca de 8-50 resíduos de aminoácido(preferivelmente entre cerca de 9-30 resíduos). Exemplos incluem o polipeptídeo de rótulo flu HA e seus anticorpo 12CA5 [Field e cols., Mol. Cell. Biol. 8: 2159-2165 (1988)]; o rótulo c-myc e os anticorpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 e 9E10 para esse [Evan e cols., Mol. Cell. Biol. 5(12): 3610-3616 (1985)]; e a glicoproteína D de vírus herpes simples (gD) tag e seu anticorpo [Paborsky e cols., Protein Engineering 3 (6) : 547553 (1990)]. Outros rótulos de exemplo são uma seqüência de poli-histidina, geralmente ao redor de seis resíduos de histidina, que permitem a isolação de um composto assim rotulado usando quelação de níquel. Outros rótulos e marcadores, como o rótulo FLAG® (Eastman Kodak, Rochester, NY), bem conhecidos e usados rotineiramente na técnica, são abrangidos pela invenção.
Como aqui usado, o termo "epitopo de ligação de receptor de salvamento" se refere a um epitopo da região Fc de uma molécula de IgG (por exemplo, IgGi, IgG2, IgG3, ou IgG4) que é responsável por aumento da meia-vida sérica in vivo da molécula de IgG.
Um outro tipo de variante é uma variante de substituição de aminoácido. Essas variantes têm pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula de anticorpo removido e um resíduo diferente inserido em seu ligar. Mutagênese de substituição em qualquer uma das regiões hipervariáveis ou de CDR ou regiões de estrutura é contemplada. Substituições conservadoras são mostradas na Tabela 1. A substituição mais conservadora é encontrada sob o título "substituições preferidas". Se tais substituições resultam em nenhuma mudança na atividade biológica, então mudanças mais substanciais, denominadas "substituições exemplares" na Tabela 1, ou como também descrito a seguir em referência a classes de aminoácidos, podem ser introduzidas e os produtos rastreados. TABELA 1 substituições Preferidas do
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Modificações substanciais nas propriedades biológicas 25 do anticorpo são realizadas por seleção de substituições que diferem significativamente em seu efeito sobre a manutenção (a) da estrutura do esqueleto do polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, como uma folha ou conformação helicoidal, (b) a carga ou hidrofobicidade da 30 molécula no sítio alvo, ou (c) o volume da cadeia lateral.
Resíduos de ocorrência natural são divididos em grupos baseados nas propriedades comuns de cadeia lateral: (1) hidrofóbico: norleucina, met, ala, vai, leu, ile; (2) hidrofílico neutro: cys, ser, thr; (3) ácido: asp, glu; (4) básico: asn, gin, his, lys, arg,- (5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: gly, pro; e (6) aromático: trp, tyr, phe.
Substituições conservadoras envolvem a substituição de um aminoácido com um outro membro de sua classe. Substituições não conservadoras envolvem a substituição de membro de uma dessas classes por um membro de uma outra classe.
Qualquer resíduo de cisteína não envolvido na manutenção da conformação adequada do anticorpo monoclonal, humano, humanizado, Human Engineered™ ou variante também pode ser substituído, geralmente com serina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula e evitar entrecruzamento aberrante. De modo inverso, ligações de cisteína podem ser adicionadas ao anticorpo para melhorar sua estabilidade (particularmente quando o anticorpo é um fragmento de anticorpo como fragmento Fv).
A maturação de afinidade envolve a preparação e rastreamento de variantes de anticorpo que têm substituições nas CDRs de um anticorpo parente e seleção de variantes que têm melhores propriedades biológicas como afinidade de ligação em relação ao anticorpo parente. Uma forma conveniente para geração de tais variantes de substituição é maturação de afinidade que usa apresentação de fago. De forma breve, vários sítios de região hipervariável (por exemplo 6-7 sítios) são mutados para gerar todas substituições de amino possíveis em cada sítio. As variantes de anticorpo assim geradas são apresentadas em uma forma monovalente de partículas de fago filamentoso como fusões ao produto de gene III de M13 embalado em cada partícula. As variantes apresentadas em fago são então rastreadas para sua atividade biológica (por exemplo afinidade de ligação).
Mutagênese de rastreamento de alanina pode ser realizada para identificar resíduos de região hipervariável que contribuem significativamente para ligação do antígeno. Alternativamente, ou em adição, pode ser benéfico analisar uma estrutura de cristal do complexo antígeno-anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e antígeno. Tais resíduos de contato e resíduos vizinhos são candidatos para substituição de acordo com as técnicas aqui elaboradas. Uma vez que tais variantes são geradas, o painel de variantes é submetido a rastreamento como aqui descrito e anticorpos com propriedades superiores em um ou mais ensaios relevantes podem ser selecionados para posterior desenvolvimento.
Podem ser produzidas variantes de anticorpo que têm um padrão de glicosilação modificado em relação ao anticorpo parente, por exemplo, deleção de uma ou mais porções de carboidrato encontradas no anticorpo, e/ou adição de um ou mais sítios de glicosilação que não estão presentes no anticorpo.
A glicosilação de anticorpos é tipicamente ligada a N ou ligada a O. Ligado a N se refere à ligação da porção de carboidrato à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As seqüências de tripeptídeo asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exceto prolina, são as seqüências de reconhecimento para ligação enzimática da porção de carboidrato à cadeia lateral de asparagina. A presença dessas seqüências de tripeptídeo em um polipeptídeo cria um sítio potencial de glicosilação. Portanto, sítios de glicosilação ligados a N podem ser adicionados a um anticorpo por alteração da seqüência de aminoácidos de forma que ela contenha uma ou mais dessas seqüências de tripeptídeo. Glicosilação ligada a O se refere à ligação de um ou mais dos açúcares N- acetilgalactosamina, galactose, ou xilose a um hidroxiaminoácido, mais comumente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina também possam ser usados. Sítios de glicosilação ligados a O podem ser adicionados a um anticorpo por inserção ou substituição de um ou mais resíduos de serina ou treonina à seqüência do anticorpo original. Por via de exemplo, os aminoácidos de RX1 nas posições 41-43 da Figura 4A (NGS) podem ser retidos. Alternativamente, apenas aminoácidos 41 e 42 (NG) podem ser retidos.
Normalmente, variantes da seqüência de aminoácidos do anticorpo Human Engineered™ terão uma seqüência de aminoácidos que tem pelo menos 60% de identidade de seqüência de aminoácidos com as seqüências de aminoácidos originais do Anticorpo Human Engineered™ da cadeia pesada ou leve (por exemplo, como em qualquer das Figuras 19B até 22B) mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, e ainda mais preferivelmente pelo menos 95%, incluindo, por exemplo, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, e 100%. Identidade ou homologia com relação a essa seqüência é aqui definida como a percentagem de resíduos de aminoácido na seqüência candidata que é idêntica aos resíduos de Human Engineered™, depois do alinhamento das seqüências e introdução de gaps, se necessário, para atingir a identidade percentual máxima de seqüência, e não considerando quaisquer substituições conservadoras (como definido na Tabela 1 acima) como parte da identidade de seqüência. Nenhum de terminal N, terminal C, ou extensões internas, deleções, ou inserções na seqüência de anticorpo devem ser interpretadas como afetando a identidade ou homologia da seqüência. Portanto, identidade de seqüência pode ser determinada por métodos padrão que são comumente usados para comparar a similaridade na posição dos aminoácidos de dois polipeptídeos. Usando um programa de computador como BLAST ou FASTA, dois polipeptídeos são alinhados para combinação ótima de seus aminoácidos respectivos (junto ao comprimento total de uma ou ambas seqüências, ou junto a uma porção predeterminada de uma ou ambas seqüências). Os programas fornecem uma penalidade de abertura padrão e uma penalidade de intervalo padrão, e uma matriz de pontuação como PAN 250 [uma matriz de pontuação; veja Dayhoff e cols., in Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp. 3 (1978)] podem ser usadas junto com o programa de computador.
Por exemplo, a identidade percentual pode ser então calculada como o número total de combinações idênticas multiplicado por 100 e então dividido pela soma do comprimento da seqüência mais longa na sobreposição combinada e o número de intervalos introduzidos nas seqüências mais longas para alinhar as duas seqüências.
Outras modificações do anticorpo são contempladas. Por exemplo, pode ser desejável modificar o anticorpo da invenção com relação à função efetora, para melhorar a eficácia do anticorpo no tratamento de câncer, por exemplo. Por exemplo resíduos de cisteína podem ser introduzidos na região Fc, dessa forma permitindo a formação de ponte de dissulfeto intercadeia nessa região. O anticorpo homodimérico assim gerado pode ter capacidade melhorada de internalização e/ou morte celular aumentada mediada por complemento e citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) . Veja, Caron e cols., J. Exp Med. 176: 1191-1195 (1992) e Shopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992). Anticorpos homodiméricos com melhor atividade antitumor também podem ser preparados usando agentes de entrecruzamento heterobifuncionais como descrito em Wolff e cols., Cancer Research 53: 2560-2565 (1993). Alternativamente, pode ser construído um anticorpo que tem regiões Fc duplas e pode assim, ter melhores capacidades de lise de complemento e de ADCC. Veja Stevenson e cols., Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989). Além disso, foi mostrado que seqüências na CDR podem fazer com que um anticorpo se ligue a MHC Classe II e desperte uma resposta indesejada de célula T helper. Uma substituição conservadora pode permitir que o anticorpo retenha a atividade de ligação embora perca sua capacidade de de Steplewski e cols. , Proc Natl Acad. Sci USA. 1988 ; 85 (13) :4852 - 6, aqui incorporado por referência em sua totalidade, que descreve anticorpos quiméricos nos quais uma região variável de murídeo foi ligada com região constantes humanas gama 1, gama 2, gama 3 e gama 4.
Em certas modalidades da invenção, pode ser desejável usar um fragmento de anticorpo, ao invés de um anticorpo intacto, para aumentar a penetração no tumor, por exemplo. Nesse case, pode ser desejável modificar o fragmento de anticorpo para aumentar sua meia vida sérica, por exemplo, adicionando moléculas como PEG ou outros polímeros hidrossolúveis, incluindo polímeros de polissacarídeo a fragmentos de anticorpo para aumentar a meia-vida. Isso também pode ser realizado, por exemplo, por incorporação de um epitopo de ligação de receptor de salvamento no fragmento de anticorpo (por exemplo, por mutação da região adequada no fragmento de anticorpo ou por incorporação do epitopo em um rótulo de peptídeo que é então fundido ao fragmento de anticorpo na extremidade ou no meio, por exemplo, por síntese de DNA ou de peptídeo) (veja, por exemplo, WO96/32478) .
O epitopo de ligação de receptor de salvamento preferivelmente constitui uma região na qual um ou mais resíduos de aminoácido de uma ou duas alças de um domínio Fc são transferidas para uma posição análoga do fragmento de anticorpo. Ainda mais preferivelmente, três ou mais resíduos de uma ou duas alças do domínio Fc são transferidos. Ainda mais preferido, o epitopo é retirado do domínio CH2 da região Fc (por exemplo, de uma IgG) e transferido para a região CHI, CH3, ou VH, ou mais de uma região, do anticorpo. Alternativamente, o epitopo é retirado do domínio CH2 da região Fc e transferido para a região C.sub.L ou região V.sub.L, ou ambas, do fragmento de anticorpo. Veja também Pedidos Internacionais WO 97/34631 e WO 96/32478 que descrevem variantes Fc e sua interação com o receptor de salvamento.
Portanto, anticorpos da invenção podem compreender uma porção Fc humana, uma porção Fc humana de consenso, ou uma variante dessas que retém a capacidade de interagir com o receptor de salvamento Fc, incluindo variantes nas quais cisteínas envolvidas em pontes de dissulfeto são modificadas ou removidas, e/ou nas quais uma met é adicionada no terminal N e/ou um ou mais dos 20 aminoácidos de terminal N são removidos, e/ou regiões que interagem com complemento, côo o sítio de ligação Clq, são removidos, e/ou o sítio ADCC é removido [veja, por exemplo, Molec. Immunol. 29 (5): 633-9 (1992)].
Estudos prévios mapearam o sítio de ligação em IgG humana e de murídeo para FcR primariamente para a região de dobradiça inferior composta de resíduos de IgG 233-239. outros estudos propuseram segmentos adicionais amplos, por exemplo, Gly316-Lys338 para receptor I humano Fc, Lys274- Arg301 e Tyr407-Arg416 para receptor III humano Fc, ou encontrou uns poucos resíduos específicos fora da dobradiça inferior, por exemplo, Asn297 e Glu318 para IgG2b de murídeo que interage com receptor II Fc de murídeo. 0 relatório da estrutura de cristal 3.2-Â do fragmento de IgGl Fc humana com receptor IIIA Fc humano delineou resíduos de IgGl Leu234-Ser239, Asp265-Glu269,Asn297-Thr299, e Ala327-Ile332 com envolvdios na ligação ao receptor IIIA de Fc. Foi sugerido baseado na estrutura de cristal que em adição ao dobradiça inferior (Leu234- Gly237), que resíduos nas alças FG de domínio CH2 de IgG (resíduos 326-330) e BC (resíduos 265-271) devem ter um papel na ligação ao receptor Fc IIA. Veja Shields e cols., J. Biol. Chem., 276 (9) :6591-6604 (2001), aqui incorporado por referência em sua totalidade. A mutação de resíduos nos sítio de ligação de receptor Fc pdoe resultar em função efetora alterada, como atividade alterada de ADCC ou CDC, ou meia-vida alterada. Como acima descrito, mutações potenciais incluem inserção, deleção ou substituição de um ou mais resíduos, incluindo substituição com alanina, uma substituição conservadora, uma substituição não conservadora, ou substituição com um resíduo de aminoácido correspondente na mesma posição de uma subclasse diferente de IgG (por exemplo substituição de um resíduo IgGl com um resíduo correspondente IgG2 na posição).
Shields e cols. relataram que resíduos de IgGl envolvidos na ligação a todos receptores Fc humanos estão localizados no domínio CH2 proximal à dobradiça e estão em duas categorias como se segue: 1) posições que podem interagir diretamente com todo FcR incluem Leu234-Pro238, Ala327, e Pro329 (e possivelmente Asp265); 2) posições que influenciam a natureza de carboidrato ou posição incluem Asp265 e Asn297. Os resíduos de IgGl adicionais que afetaram a ligação de receptor Fc II são como se segue: (efeito maior) Arg255, Thr256, Glu258, Ser267, Asp270, Glu272, Asp280, Arg292, Ser298, e (efeito menor) His268,Asn276, His285, Asn286, Lys290, Gln295, Arg301, Thr307, Leu309, Asn315, Lys322, Lys326, Pro331, Ser337, Ala339, Ala378, e Lys414. A327Q, A327S, P329A, D265A e D270A ligação reduzida. Em adição aos resíduos identificados acima para todo FcR, resíduos adicionais de IgGl que reduzem a ligação ao receptor IIIA Fc em 40% ou mais são como se segue: Ser239, Ser267 (Gly only), His268, Glu293, Gln295, Tyr296, Arg301, Val303, Lys338, e Asp376. Variantes que melhoram a ligação a FcRIIIA incluem T256A, K290A, S298A, E333A, K334A, e A339T. Lys414 mostrou uma redução de 40% na ligação para FcRIIA e FcRIIB, Arg416 uma redução de 10 30% para FcRIIA e FcRIIIA, Gln419 uma redução de 30% paraFcRIIA e uma redução de 40% para FcRIIB, e Lys360 uma melhoria de 23% para FcRIIIA. Veja também Presta e cols., Biochem. Soc. Trans. (2001) 30, 487-490.
Por exemplo, Patente United States No. 6.194.551, aqui 15 incorporada em sua totalidade por referência, descreve variantes com função efetora alterada que contêm mutações na região Fc de IgG humana, na posição de aminoácido 329, 331 ou 322 (usando numeração de Kabat), algumas das quais apresentam ligação de Clq ou atividade de CDC reduzidas.
Como um outro exemplo, Patente United States No. 6.737,056, aqui incorporada em sua totalidade por referência, descreve variantes com ligação de efetor ou de receptor Fc-gama alteradas contendo mutações na região Fc de IgG humana, na posição de aminoácido 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 25 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283,285, 286, 289, 290, 292, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305,307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331,333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388,389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 ou 439 (usando numeração de Kabat), algumas das quais apresentam perfis de ligação de receptor associados a atividade reduzida de ADCC ou CDC. Dessas, uma mutação na posição de aminoácido 238, 265, 269, 270, 327 ou 329 são determinadas para reduzir a ligação a FcRI, uma mutação na posição de aminoácido 238, 265, 269, 270, 292, 294, 295, 298, 303, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 373, 376, 414, 416, 419, 435, 438 ou 439 são determinadas para reduzir a ligação a FcRII, uma mutação na posição de aminoácido 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 293, 294, 295, 296, 301, 303, 322, 327, 329, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 416, 434, 435 ou 437 é determinada para reduzir a ligação a FcRIII.
Patente United States No. 5.624.821, aqui incorporada em sua totalidade por referência, relata que a atividade de ligação de Clq de um anticorpo de murídeo pode ser alterada por mutação de resíduo de aminoácido 318, 320 ou 322 da cadeia pesada e que a substituição de resíduo 2 97 (Asn) resulta na remoção da atividade lítica.
Publicação de Pedido United States No. 20040132101, aqui incorporada em sua totalidade por referência, descreve variantes com mutações nas posições de aminoácido 240, 244, 245, 247, 262, 263, 266, 299, 313, 325, 328, ou 332 (usando numeração de Kabat) ou posições 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 269, 296, 297, 298, 299, 313, 325, 327, 328, 329, 330, ou 332 (usando numeração de Kabat), das quais mutações nas posições 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 269, 296, 297, 298, 299, 313, 325, 327, 328, 329, 330, ou 332 podem reduzir atividade de ADCC ou reduzir aligação a um receptor Fc gama.
Chappel e cols.. Proc Natl Acad Sci USA. 1991;88(20):9036-40, aqui incorporada em sua totalidade por referência, relatam que a atividade citofílica de IgGl é uma propriedade intrínseca de seu domínio de cadeia pesada 5 CH2. Mutações únicas em ponto em qualquer um dos resíduos de aminoácido 234-237 de IgGl diminuíram significativamente ou aboliram sua atividade. Substituição de todos os resíduos de IgGl 234-237 (LLGG) em IgG2 e IgG4 foi necessária para restabelecer a atividade de ligação total. 10 Um anticorpo IgG2 contendo a seqüência inteira ELLGGP (resíduos 233-238) foi observado como sendo mais ativo qie IgGl de tipo selvagem.
Isaacs e cols., J Immunol. 1998;161(8):3862-9, aqui incorporado em sua totalidade por referência, relata que 15 mutações e um motivo crítico para ligação de Fc gamaR (glutamato 233 para prolina, leucina/fenilalanina 234 para valina, e leucina 235 para alanina) evitou completamente o esgotamento de células alvo. A mutação glutamato 318 para alanina elimina a função efetora de IgG2b de camundongo e 20 também reduz a potência de IgG4 humana.
Armour e cols., Mol Immunol. 2003;40 (9) :585 - 93, aqui incorporada em sua totalidade por referência, identificou variantes de IgGl que reagem com o receptor de ativação, Fc gamaRIIa, pelo menos 10 vezes menos eficientemente que IgGl 25 de tipo selvagem mas cuja ligação ao receptor inibidor, FcgamaRIIb, é reduzida em apenas quatro vezes. Mutações foram feitas na região de aminoácidos 233-236 e/ou nas posições de aminoácido 327, 330 e 331. Veja também WO99/58572, aqui incorporado em sua totalidade por 30 referência. Wo Xu e cols., J Biol Chem. 1994;269 (5) :3469-74, aqui incorporado em sua totalidade por referência, relatam que a mutação de IgGl de Pro331 para Ser diminui muito a ligação de Clq e eliminou virtualmente a atividade lítica. Em contraste, a substituição de Pro por Ser331 em IgG4 concedeu atividade lítica parcial (40%) à variante de IgG4 Pro331.
Schuurman e cols., Mol Immunol. 2001;38(1):l-8, aqui incorporado em sua totalidade por referência, relatam que a 10 mutação de uma das cisteínas dobradiça envolvidas na formação de ligação inter-cadeia pesada, Cys226, para serina resultou em uma ligação inter-cadeia pesada mais estável. A mutação na seqüência de dobradiça de IgG4 Cys- Pro-Ser-Cys para a seqüência de dobradiça de IgGl Cys-Pro- Pro-Cys também estabiliza bastante a interação covalente entre as cadeias pesadas.
Angal e cols., Mol Immunol. 1993 ; 30 (1) : 105-8, aqui incorporado em sua totalidade por referência, relatam que a mutação da serina na posição de aminoácido 241 em IgG4 para prolina (encontrada na posição em IgGl e IgG2) levou à produção de um anticorpo homogêneo, assim como extensão da meia-vida sérica e melhor distribuição de tecido comparada à IgG4 original quimérica.
Anticorpos Humanos e Human Engineered™ Human Engineering™
Human Engineering™ de domínios variáveis de anticorpo foi descrito por Studnicka [veja, por exemplo, Studnicka e cols. Patente U.S. N° : 5.766.886; Studnicka e cols.
Protein Engineering 7: 805-814 (1994)] como um método para 30 redução da imunogenicidade enquanto se mantém a atividade de ligação das moléculas de anticorpo. De acordo com o método, cada aminoácido de região variável recebeu um riso de substituição. Substituições de aminoácido são distinguidas por uma de três categorias de risco: (1) modificações de risco baixo são aquelas que têm o maior potencial para redução da imunogenicidade com a menor chance de rompimento da ligação do antígeno; (2) modificações de risco moderado são aquelas que reduzem adicionalmente a imunogenicidade, mas têm uma maior chance de afetar a ligação do antígeno ou dobra de proteína; (3) resíduos de risco alto são aquelas que são importantes para ligação ou para manutenção da estrutura do anticorpo e carregam o maior risco de afetar a ligação de antígeno ou dobra de proteína. devido ao papel da estrutura tridimensional de prolinas, modificações nas prolinas são geralmente consideradas como sendo mudanças pelo menos de risco moderado, mesmo se a posição é tipicamente uma posição de risco baixo.
Regiões variáveis das cadeias leve e pesada de um anticorpo de roedor são Human Engineered™ como se segue a aminoácidos humanos substituídos nas posições determinadas como sendo improváveis de afetar a ligação do antígeno ou dobra da proteína, mas prováveis de reduzir a imunogenicidade em um ambiente humano. Resíduos de aminoácido que são de posições de "risco baixo" e que são candidatos para modificação de acordo com o método são identificados por alinhamento das seqüências de aminoácidos das regiões variáveis de roedor com uma seqüência humana de região variável. Qualquer região variável humana pode ser usada, incluindo uma seqüência individual VH ou VL ou uma seqüência humana de consenso VH ou VL ou uma seqüência de linha germinativa individual ou de consenso humana. Os resíduos de aminoácido em qualquer número das posições de risco baixo, ou em todas as posições de risco baixo, podem ser modificadas. Por exemplo, em cada posição de risco baixo onde os resíduos de aminoácido alinhados de murídeo e humano diferem, uma modificação de aminoácido é introduzidos que substitui o resíduo de roedor por um resíduo humano. Alternativamente, os resíduos de aminoácido em todas as posições de risco baixo e em qualquer número das posições de risco moderado podem ser modificados. Idealmente, para atingir a menor imunogenicidade todas as posições de risco baixo e moderado são trocadas de seqüência de roedor para humana.
Genes sintéticos que contêm regiões variáveis modificadas de cadeia pesada e/ou leve são construídos e ligados a regiões constantes humanas de cadeia pesada y e/ou de cadeia leve kapa. Quaisquer regiões constantes humanas de cadeia pesada e cadeia leve podem ser usadas em combinação com regiões variáveis do anticorpo Human Engineered™, incluindo IgA (de qualquer subclasse, como IgAl ou IgA2) , IgD, IgE, IgG (de qualquer subclasse, como IgGl, IgG2, IgG3, ou IgG4), ou IgM.
Os genes humanos de cadeia pesada e leve são introduzidos em células hospedeiras, como células de mamífero, e os produtos de imunoglobulina recombinantes resultantes são obtidos e caracterizados.
Anticorpos humanos de animais transgênicos
Anticorpos humanos para M-CSF também podem ser produzidos usando animais transgênicos que não têm produção de imunoglobulina endógena e são construídos para conter locus de imunoglobulina humana. Por exemplo, WO 98/24893 revela animais transgênicos que têm um lócus de Ig humana onde os animais não produzem imunoglobulinas endógenas 5 funcionais pela inativação de lócus endógenos de cadeia pesada e leve. WO 91/741 também revela hospedeiros não primatas mamíferos transgênicos capazes de montar uma resposta imune a um imunógeno, onde o anticorpos tem regiões constantes e/ou variáveis de primata, e onde a 10 imunoglobulina endógena que codifica lócus é substituída ou inativada. WO 96/30498 revela o uso de sistema Cre/Lox para modificar o lócus de imunoglobulina em um mamífero, de forma a substituir toda ou uma porção da região constante ou variável para formar uma molécula de anticorpo 15 modificada. WO 94/02602 revela hospedeiros mamíferos não humanos que têm lócus inativados de Ig endógenos e lócus funcionais de Ig humana. Patente U.S. N°: 5.939.598 revela métodos de fazer camundongos transgênicos nos quais os camundongos são desprovidos de cadeias pesadas endógenas, e 20 expressam um lócus de imunoglobulina exógena que compreende uma ou mais regiões constantes xenogênicas.
Usando um animal transgênico acima descrito, uma resposta imune pode ser produzida para uma molécula antigênica selecionada, e células que produzem anticorpos 25 podem ser removidas do animal e usadas para produzir hibridomas que secretam anticorpos monoclonais humanos. Protocolos de imunização, adjuvantes, e outros são conhecidos na técnica, e são usados na imunização de, por exemplo, um camundongo transgênico como descritos em WO 30 96/33735. Essa publicação revela anticorpos monoclonais contra uma variedade de moléculas antigênicas que incluem IL 6, IL 8, TNFa, CD4 humano, L seletina, gp39, e toxina tetânica. Os anticorpos monoclonais podem ser testados para a capacidade para inibir ou neutralizar a atividade biológica ou efeitos fisiológicos da proteína correspondente. WO 96/33735 revela que anticorpos monoclonais contra IL-8, derivados de células imunes de camundongos transgênicos imunizados com IL-8, bloquearam funções induzidas por IL-8 de neutrófilos. Anticorpos monoclonais humanos com especificidade para o antígeno usado para imunizar animais transgênicos são também revelados em WO 96/34096 e Pedido de Patente U.S. no. 20030194404; e Pedido de Patente U.S. no. 20030031667).
Veja também Jakobovits e cols., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits e cols., Nature, 362:255258 (1993); Bruggermann e cols., Year in Immuno., 7:33 (1993); e Pat. U.S. No. 5.591.669, Patente U.S. N°: 5.589.369, Patente U.S. N°: 5.545.807; e Pedido de Patente U.S No. 20020199213. Pedido de Patente U.S. No. e 20030092125 descreve métodos para induzir a resposta imune de urn animal ao epitopo desejado. Anticorpos humanos também podem ser gerados por células B ativadas in vitro (veja Pat. U.S. Nos. 5.567.610 e 5.229.275).
Anticorpos humanos de tecnologia de apresentação de fago
O desenvolvimento de tecnologias para fazer repertórios de genes de anticorpo recombinante humano, e a apresentação dos fragmentos de anticorpo codificados na superfície de bacteriófago filamentoso, forneceu um meio para fazer anticorpos humanos diretamente. Os anticorpos produzidos por tecnologia de fago são produzidos como fragmentos de ligação a antígeno, usualmente fragmentos Fv ou Fab, em bactérias e assim desprovidos de funções efetoras. Funções efetoras podem ser introduzidas por uma de duas estratégias: os fragmentos podem ser construídos em anticorpos completos para expressão em células de mamífero, ou em fragmentos de anticorpo biespecífico com uma segundo sítio de ligação capaz de despertar uma função efetora.
Tipicamente, o fragmento Fd (VH-CH1) e cadeia leve (VL-CL) de anticorpos são clonados separadamente por PCR e recombinados aleatoriamente em bibliotecas de apresentação de fago combinatórias, que podem então ser selecionados para ligação a um antígeno particular. Os fragmentos Fab são expressos na superfície do fago, ou seja, fisicamente ligados aos genes que os codificam. Portanto, a seleção de Fab por ligação de antígeno co-seleciona para as seqüências que codificam Fab, que podem ser amplificadas subsequentemente. Por vários ciclos de ligação a antígeno e re-amplificação, um procedimento denominado panning, Fab específico para o antígeno é enriquecido e finalmente isolado.
Em 1994, uma abordagem para a humanização de anticorpos, chamada "seleção guiada", foi descrita. Seleção guiada utiliza o poder da técnica de apresentação de fago para a humanização de anticorpo monoclonal de camundongo (veja Jespers, L. S., e cols., Bio/ technology 12, 899-903 (1994)). Para isso, o fragmento Fd do anticorpo monoclonal de camundongo pode ser apresentado em combinação com uma biblioteca de cadeia leve humana, e a biblioteca de Fab híbrida resultante pode ser então selecionada com um antígeno. O fragmento Fd de camundongo fornece portanto um modelo para guiar a seleção. Subsequentemente, as cadeias leves humanas selecionadas são combinadas com uma biblioteca de fragmento Fd humano. A seleção da biblioteca resultante redá Fab inteiramente humano.
Uma variedade de procedimentos foi descrita para derivação de anticorpos humanos a partir de bibliotecas de apresentação de fago (veja, por exemplo, Hoogenboom e cols., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks e cols., J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991); Pat . U.S. Nos. 5.565.332 e 5.573.905; Clackson, T. , e Wells, J. A., TIBTECH 12, 173184 (1994)). Em particular, seleção e evolução in vitro de anticorpos derivados de bibliotecas de apresentação de fago se tornou uma ferramenta poderosa (veja Burton, D. R. , e Barbas III, C. F., Adv. Immunol. 57, 191-280 (1994); e, Winter, G., e cols., Annu. Rev. Immunol. 12, 433-455 (1994); Pedido de patente U. S. no. 20020004215 e W092/01047; Pedido de patente U. S. no. 20030190317 publicada em 9 de outubro de 2003 e Patente U.S. N° : 6.054.287; Patente U.S. N°: 5.877.293.
Watkins, "Screening of Phage-Expressed Antibody Libraries by Capture Lift," Methods in Molecular Biology, Antibody Phage Display: Methods and Protocols 178: 187-193, e Pedido de patente U. S. no. 200120030044772 publicado em 6 de março de 2003 descrevem métodos para rastreamento de bibliotecas de anticorpo expresso em fago ou outras moléculas de ligação por capture lift, um método que envolve a imobilização das moléculas de ligação candidatas em um suporte sólido.
Os produtos de anticorpo podem ser rastreados para atividade e para adequação nos métodos de tratamento da invenção usando ensaios como descrito na seção intitulada "Métodos de rastreamento" nessa ou com o uso de quaisquer ensaios adequados conhecidos na técnica.
Outras modificações covalentes
Modificações covalentes do anticorpo também são incluías no escopo dessa invenção. Elas podem ser feitas por síntese química ou por clivagem enzimática ou química do anticorpo, se aplicável. Outros tipos de modificações covalentes do anticorpo são introduzidas na molécula por reação de resíduos de aminoácidos do anticorpo com um agente de derivatização orgânico que é capaz de reagir com cadeias laterais selecionadas ou aos resíduos N- ou C- terminal.
Resíduos de cisteinil reagem mais comumente com <x- haloacetatos (e aminas correspondentes), como ácido cloroacético ou cloroacetamida, para gerar derivados de carboximetil ou carboxiamidometil. Resíduos de cisteinil também são derivatizados por reação com bromotrifluoracetona, ácido .alfa.-bromo-β-(5-imidozoil) propiônico, cloroacetil fosfato, N-alquilmaleimidas, dissulfeto de 3-nitro-2-piridil, dissulfeto de metil 2- piridil, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4- nitrofenol, ou cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3diazol.
Resíduos de histidil são derivatizados por reação com dietilpirocarbonato em pH 5,5-7,0 porque esse agente é relativamente específico para a cadeia lateral de histidil. Brometo de parabromofenacil também é útil; a reação é preferivelmente realizada em 0,1 M cacodilato de sódio em pH 6,0.
Lisinil e resíduos amino-terminais reagem com anidridos de ácido succínico ou outros anidridos de ácido carboxílico. A derivatização com esses agentes te o efeito de reverter a carga dos resíduos de lisinil. Outros reagentes adequados para derivatização de resíduos que contêm .alpha.-amino incluem imidoésteres como metil picolinimidato, piridoxal fosfato, piridoxal, cloroborohidreto, ácido trinitrobenzenossulfônico, O- metilisouréia, 2,4-pentanediona, e reação catalisada por transaminase com glioxilato.
Resíduos de arginil são modificados por reação com um ou vários reagentes convencionais, entre eles fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclohexanodiona, e ninidrina. Derivatização de resíduos de arginina requer que a reação seja realizada em condições alcalinas devido ao alto pKa do grupo funcional de guanidina. Além disso, esses reagentes podem reagir com os grupos de lisina assim como o grupo arginina epsilon-amino.
A modificação específica de resíduos de tirosil podem ser feitas, com interesse particular na introdução de rótulos espectrais nos resíduos de tirosil por reação com compostos aromáticos de diazônio ou tetranitrometano. Mais comumente, N-acetilimidizol e tetranitrometano são usados para formar espécies O-acetil tirosil e derivados de 3- nitro, respectivamente. Resíduos de tirosil são iodinados usando 125I ou 131I para preparar proteínas rotuladas para uso em radioimunoensaio.
Grupos laterais de carboxil (aspartil ou glutamil) são seletivamente modificados por reação com carbodiimidas (R- N.dbd.C.dbd.N-R' ) , onde R e R' são grupos alquil diferentes,comol-ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etil) carbodiimida ou l-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil) carbodiimida. Além disso, resíduos de aspartil e glutamil são convertidos a resíduos de asparaginil e glutaminil por reação com ions de amónio.
Resíduos de glutaminil e asparaginil são frequentemente desamidados aos resíduos correspondentes glutamil e aspartil, respectivamente. Esses resíduos são desamidados sob condições neutras ou básicas. A forma desamidada desses resíduos está dentro do escopo dessa 10 invenção.
Outras modificações incluem hidroxilação de prolina e lisina, fosforilação de grupos hidroxil de resíduos seril ou treonil, metilação de grupos .alfa.-amino de cadeias laterais de lisina, arginina, e histidina (T. E. Creighton, 15 Proteins: Structure e Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), acetilação da amina N-terminal, e amidação de qualquer grupo carboxil C- terminal.
Um outro tipo de modificação grupo envolves ligação 20 química ou enzimática de glicosídeos ao anticorpo. Esses procedimentos são vantajosos por não necessitarem da produção do anticorpo em uma célula hospedeira que tem capacidades de glicosilação para glicosilação ligada a N ou 0. Dependendo do modo de ligação usado, o açúcar) pode ser 25 ligado a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxil livres, (c) grupos sulfidril livres como aqueles de cisteína, (d) grupos hidroxil livres como aqueles de serina, treonina, ou hidroxiprolina, (e) residues aromáticos como aqueles de fenilalanina, tirosina, ou 30 triptofano, ou (f) o grupo amida de glutamina. Esses métodos são descritos em W087/05330 publicado em 11 de setembro de 1987, e em Aplin e Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981) .
A remoção de quaisquer porções de carboidrato presentes no anticorpo pode ser realizada quimicamente ou enzimaticamente. Desglicosilação química requer a exposição do anticorpo ao composto ácido trifluormetanossulfônico ou a um composto equivalente. Esse tratamento resulta na clivagem da maioria ou todos os açúcares exceto o sugar de ligação (N-acetilglicosamina ou N-acetilgalactosamina), enquanto deixa o anticorpo intacto. Desglicosilação química é descrita por Hakimuddin, e cols. Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 (1987) e por Edge e cols. Anal. Biochem., 118: 131 (1981) . A clivagem enzimática de porções de carboidrato em anticorpos podem ser realizada pelo uso de uma variedade de endo- e exo-glicosidases como descrito por Thotakura e cols. Meth. Enzymol. 138: 350 (1987).
Um outro tipo de modificação covalente do anticorpo compreende a ligação do anticorpo a um de uma variedade de polímeros não proteináceos, por exemplo, polietileno glicol, polipropileno glicol, polióis polioxietilados, sorbitol polioxietilado, glicose polioxietilada, glicerol polioxietilados, polioxialquilenos, ou polímeros polissacarídeos como dextrano. Tais métodos são conhecidos na técnica, veja , por exemplo Patentes U.S. Nos. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192, 4.179.337, 4.766.106, 4.179.337, 4.495.285, 4.609.546 ou EP 315 456.
Terapia Genética
A liberação de um anticorpo terapêutico para células adequadas pode ser efetuada via terapia de gene ex vivo, in situ, ou in vivo pelo uso de qualquer uma das abordagens adequadas conhecidas na técnica, incluindo pelo uso de métodos de transferência física de DNA (por exemplo, 5 lipossomos ou tratamentos químicos) ou pelo uso de vetores virais (por exemplo, adenovirus, vírus adeno-associados, ou um retrovirus). Por exemplo, para terapia in vivo, um ácido nucleico que codifica o anticorpo desejado, isoladamente ou junto com um vetor; lipossomo, ou precipitado pode ser 10 injetado diretamente no indivíduo, e em algumas modalidades, pode ser injetado no local onde a expressão do composto de anticorpo é desejada. Para tratamento ex vivo, as células do indivíduo são removidas, o ácido nucleico é introduzidos nessas células, e as células modificadas são 15 devolvidas ao indivíduo diretamente ou, por exemplo, encapsuladas em membranas porosas que são implantadas no paciente. Veja, por exemplo Pat. U.S. Nos. 4.892.538 e 5.283.187. Há uma variedade de técnicas disponíveis para introdução de ácidos nucleicos em células viáveis. As 20 técnicas variam dependendo de se o ácido nucleico é transferidos em células cultivadas in vitro, ou in vivo nas células do hospedeiro desejado. Técnicas adequadas para a transferência de ácido nucleico em células de mamífero in vitro incluem o uso de lipossomos, eletroporação, 25 microinjeção, fusão celular, DEAE-dextrano, e precipitação de fosfato de cálcio. Um vetor comumente usados para liberação ex vivo de um a ácido nucleico é um retrovirus.
Outras técnicas de transferência de ácido nucleico in vivo incluem transfecção com vetores virais (como 30 adenovirus, vírus Herpes simples I, ou vírus adeno- associados) e sistemas baseados em lipídeo. 0 ácido nucleico e agente de transfecção são opcionalmente associadas a uma micropartícula. Agentes de transfecção de exemplo incluem fosfato de cálcio ou co-precipitaçãod e 5 cloreto de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrano, amónio quaternário anfifilo DOTMA ( (dioleoiloxipropil) brometo de trimetilamônio, comercializado como Lipofectina por GIBCO-BRL) ) (Feigner e cols, (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84, 7413-7417; Malone e cols. (1989) Proc. Natl Acad. Sei. USA 86 6077-6081); diésteres lipofílicos de glutamato com cabeças pendentes de trimetilamônio (Ito e cols. (1990) Biochem. Biophys. Acta 1023, 124132) ; os lipídeos metabolizáveis parentes como o lipídeo catiônico dioctadecilamido glicilspermina (DOGS, Transfectam, Promega) e dipalmitoilfosfatidil etanolamilspermina (DPPES)(J. P. Behr (1986) Tetrahedron Lett. 27, 5861-5864;J. P. Behr e cols. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86, 6982-6986) ; sais de amónio quaternário metabolizáveis (DOTB, N- (1-[2,3-dioleoiloxi]propil) -N,N,N- trimetilamônio 20 metilsulfato (DOTAP)(Boehringer Mannheim), polietilenoimina (PEI) , dioleoil ésteres, ChoTB, ChoSC, DOSC) (Leventis e cols. (1990) Biochim. Inter. 22, 235-241); 3beta[N-(N', N'~ dimetilaminoetano)-carbamoil]colesterol (DC-Chol),dioleoilfosfatidil etanolamina (DOPE)/3beta[N-(N',N'- dimetilaminoetano)-carbamoil]colesterolDC-Choi em misturas de um para um (Gao e cols., (1991) Biochim. Biophys. Acta 1065, 8-14), espermina, espermidina, lipopoliaminas (Behr e cols., Bioconjugado Chem, 1994, 5: 382-389), polilisinas lipofílicas (LPLL) (Zhou e cols., (1991) Biochim. Biophys. Acta 939, 8-18), [[(1,1,3,3-tetrametilbutil)cre- soxi] etoxi] etil] dimetilbenzilamônio hidróxido (hidróxido DEBDA) com excesso de fosfatidilcolina/colesterol (Bailas e cols., (1988) Biochim. Biophys. Acta 939, 8-18), brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB)/DOPE misturas (Pinnaduwage et al, (1989) Biochim. Biophys. Acta 985, 33-37), diéster lipofilico de ácido glutâmico (TMAG) with DOPE, CTAB, DEBDA, brometo de didodecilamônio (DDAB), e estearilamina em mistura com fosfatidiletanolamina (Rose e cols., (1991) Biotechniques 10, 520-525), DDAB/DOPE (TransfectACE, GIBCO BRL), e oligogalactose que carregam lipídeos. Agentes intensificadores de transfecção de exemplo que aumentam a eficiência da transferência incluem, por exemplo, DEAE- dextrano, polibreno, peptídeo destruidor de lisossomo (Ohmori N I et al, Biochem Biophys Res Commun Jun. 27, 1997;235(3):726-9), proteoglicanos baseados em condroitano, proteoglicanos sulfatados, polietilenimina, polilisina (Pollard H e cols. J Biol Chem, 1998 273 (13) : 7507-11) , peptídeo de ligação a integrina CYGGRGDTP, nonassacarideo de dextrano linear, glicerol, grupos colesteril presos na ligação internucleosídeo 3'-terminal de um oligonucleotídeo (Letsinger, R. L. 1989 Proc Natl Acad Sei USA 86: (17) : 6553-6) , 1isofosfatideo, lisofosfatidileolina,lisofosfatidiletanolamina, e 1-oleoil lisofosfatidileolina.
Em algumas situações pode ser desejável liberar o ácido nucleico com um agente que direciona o vetor que contém o ácido nucleico para células alvo. Tais moléculas de "alvo" incluem anticorpos específico para uma proteína de membrana de superfície celular na célula alvo, ou um ligante para um receptor na célula alvo. Quando são empregados lipossomos, proteínas que se ligam a uma proteína de membrana de superfície celular associada a endocitose pode ser usada para visar e/ou para facilitar a retenção. Exemplos de tais proteínas incluem proteínas de capsídeo e fragmentos desses trópicos para um tipo particular de célula, anticorpos para proteínas que passam por ciclo de internalização, e proteínas que visam localização intracelular e aumentam a meia-vida intracelular. Em outras modalidades, endocitose mediada por receptor pode ser usada. Tais métodos são descritos, por exemplo, em Wu e cols., 1987 ou Wagner e cols., 1990. Para revisão dos protocolos atualmente conhecidos de marcação de gene e terapia de gene, veja Anderson 1992. Veja também WO 93/25673 e as referências aqui citadas. Para revisões adicionais de tecnologia de terapia de gene, veja Friedmann, Science, 244: 1275-1281 (1989); Anderson, Nature, suplemento ao vol. 392, no 6679, pp. 25-30 (1998); Verma, Scientific American: 68-84 (1990); e Miller, Nature, 357: 455460 (1992) .
Métodos de rastreamento
A terapêutica eficaz depende da identificação de agentes eficazes desprovidos de significativa toxicidade. Anticorpos podem ser rastreados para afinidade de ligação por métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, ensaios de gel-shift, Western blots, ensaio de competição radiomarcado, co-fracionamento por cromatografia, co- precipitação, entrecruzamento, ELISA, e outros podem ser usados, descritos em, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology (1999) John Wiley & Sons, NY, que é aqui incorporado em sua totalidade por referência.
Para rastrear inicialmente anticorpos que se ligam ao epitopo desejado em M-CSF (por exemplo, aqueles que bloqueiam a ligação de RX1, 5114, MCI e/ou MC3 a M-CSF), um ensaio de bloqueio cruzado rotineiro como aquele descrito em Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor 5 Laboratory, Ed Harlow e David Lane (1988), podem ser realizados. Ensaios de ligação competitiva rotineiros também podem ser usados, nos quais o anticorpo desconhecido é caracterizado por sua capacidade para inibir a ligação de M-CSF a um anticorpo específico para M-CSF da invenção. M10 CSF intacto, fragmentos desses, ou epitopos lineares como representados por aminoácidos 98105 de M-CSF da Figura 12, ou aminoácidos 65-73 ou 138-144 da Figura 12 (que correspondem a Epitopos de M-CSF reconhecidos por 5H4 ou f MC3), podem ser usados. Mapeamento de epitopo é descrito em 15 Champe e cols., J. Biol. Chem. 270: 1388-1394 (1995) .
É também contemplado que os anticorpos são testados a seguir para seu efeito sobre a osteoclastogênese, seguida por administração a animais. Compostos potencialmente úteis na prevenção ou tratamento de perda óssea associadas a 20 metástase de câncer podem ser rastreados usando-se vários ensaios. Por exemplo, um antagonista candidato pode ser primeiramente caracterizado em um sistema de célula cultivada para determinar sua capacidade para neutralizar M-CSF na indução de osteoclastogênese. Tal sistema pode 25 incluir a co-cultura de osteoblastos de calvária de camundongo e células esplénicas (Suda e cols., Modulation of osteoclast differentiation. Endocr. Rev. 13: 66 80,1992; Martin e Udagawa, Trends Endocrinol. Metab. 9: 6-12, 1998) , a co-cultura de linhas de células estromais de 3 0 camundongo (por exemplo, MC3T3-G2/PA6 e ST2) e células esplénicas de camundongo (Udagawa e cols., Endocrinology 125: 1805 13, 1989), e a co-cultura de células ST2 e células da medula óssea, células mononucleares de sangue periférico ou macrófagos alveolares (Udagawa e cols., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 7260 4, 1990; Sasaki e cols., Cancer Res. 58: 462 7, 1998; Mancino e cols., J. Surg. Res.lOO: 18-24, 2001). Na ausência de qualquer antagonista de M-CSF, células multinucleadas formadas em tais co- culturas satisfazem os principais critérios de osteoclastos como atividade de fosfatase ácida resistente a tartrato (TRAP, uma enzima marcadora de osteoclastos), receptores de calcitonina, p60C-STC, receptores de vitronectina, e a capacidade para formar buracos de reabsorção no osso e fatias de dentina. A presença de um antagonista eficaz de M-CSF inibe a formação de tais células multinucleadas.
Em adição aos sistemas de co-cultura acima, a capacidade de um anticorpo candidato de M-CSF na inibição de osteoclastogênese pode ser avaliada em um sistema livre de célula estromal ou livre de osteoblasto. O M-CSF necessário para osteoclastogênese pode ser fornecido por células metastáticas de câncer co-cultivadas (por exemplo, MDA 231) ou meio condicionado dessas células de câncer (Mancino e cols., J. Surg. Res. 0: 18-24, 2001) ou por adição de M-CSF purificado.
A eficácia de um dado anticorpo de M-CSF na prevenção ou tratamento de perda óssea associadas a metástase de câncer também pode ser testada em qualquer um dos sistemas de modelo de metástase óssea animal familiares para aqueles habilitados na técnica. Tais sistemas de modelo incluem aqueles que envolvem injeção direta de células tumorais na cavidade medular dos ossos (Ingall, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 117: 819-22, 1964; Falasko, Clin. Orthop. 169: 20 7, 1982) , na aorta abdominal de rato (Powles e cols., Br. J.Câncer 28: 316 21, 1973), na veia lateral da cauda de camundongo OU no ventrículo esquerdo do camundongo (Auguello e cols., Cancer Res . 48 : 6876 81, 1988). Na ausência de um antagonista efetivo de M-CSF, metástases ósseas osteolíticas formadas a partir de células tumorais injetadas podem ser determinadas por radiografias (áreas de 10 lesões ósseas osteolíticas) ou histologia e imunohistoquímica (osso e tecidos moles). Sasaki e cols., Cancer Res. 55: 3551 7, 1995; Yoneda e cols., J. Clin. Invest. 99: 2509 17, 1997. Clohisy e Ramnaraine, Orthop Res. 16: 660 6, 1998. Yin e cols., J. Clin. Invest. 103: 197 206, 1999. Na presença de um anticorpo eficaz de M-CSF,metástases ósseas osteolíticas podem ser evitadas, ou inibidas para resultar em menos e/ou menores metástases.
Os anticorpos M-CSF da presente invenção também podem ser úteis na prevenção ou tratamento de metástase 20 cancerosa. A eficácia de um anticorpo candidato de M-CSF na prevenção ou tratamento de metástase de câncer pode ser rastreada usando um modelo de invasão de membrana basal humana amniônica como descrito em Filderman e cols., Cancer Res 52: 36616, 1992. Em adição, qualquer dum dos sistemas 25 de modelo animal para metástase de vários tipos de cânceres também podem ser usados. Tais sistemas de modelo incluem, mas não se limitam, àqueles descritos em Wenger e cols., Clin. Exp. Metastasis 19: 169 73, 2002; Yi e cols., Cancer Res. 62: 917 23, 2002; Tsutsumi e cols., Cancer Lett 169: 77-85, 2001; Tsingotjidou e cols., Anticancer Res. 21: 971 8, 2001; Wakabayashi e cols., Oncology 59: 75 80, 2000; Culp e Kogerman, Front Biosci. 3:D672 83, 1998; Runge e cols., Invest Radio] . 32: 212 7; Shioda e cols., J. Surg.Oncol. 64: 122 6, 1997; Ma e cols., Invest Ophthalmol Vis Sci. 37: 2293 301, 1996; Kuruppu e cols., J Gastroenterol Hepatol. 11: 26 32, 1996. Na presença de um anticorpo de M- CSF eficaz, as metastases de cancer podem ser evitadas, ou inibidas para resultar em menos e/ou menores metastases.
A atividade anti-tumor de um anticorpo particular de M-CSF, ou combinação de anticorpos de MCSF, pode ser avaliada in vivo usando um modelo animal adequado. Por exemplo, modelos de câncer linfoma xenogênicos nos quais células de linfoma humano são introduzidas em animais imuno-comprometidos, como camundongos desnudos ou SCID. A eficácia pode ser prevista com o uso de ensaios que medem a inibição da formação do tumor, a regressão do tumor ou metástase e outros.
Em uma variação de um ensaio in vitro, a invenção fornece a método que compreendem as etapas de (a) contato de M-CSF imobilizado com um anticorpo candidato e (b) detecção da ligação do anticorpo candidato ao M-CSF. Em uma modalidade alternativa, o anticorpo candidato é imobilizado e a ligação de M-CSF é detectada. A imobilização é realizada com o uso de qualquer um dos métodos bem conhecidos na técnica, incluindo ligação covalente a um suporte, um glóbulo, ou uma resina cromatográfica, assim como uma interação não covalente, de alta afinidade como ligação de anticorpo, ou uso de ligação estreptavidina/biotina na qual o composto imobilizado inclui uma porção de biotina. A detecção de ligação pode ser realizada (i) co o uso de um marcador radioativo no composto que não é imobilizado, (ii) uso de um marcador fluorescente no composto não imobilizado, (iii) uso de um anticorpo immunoespecífico para o composto não imobilizado, (iv) uso de um marcador no composto não imobilizado que excita um suporte fluorescente ao qual o composto imobilizado é ligado, assim como outras técnicas bem conhecidas e rotineiramente praticas na técnica.
Anticorpos que modulam (ou seja, aumentam, diminuem, ou bloqueiam) a atividade ou expressão de M-CSF podem ser identificados por incubação de um modulador suposto com uma expressão celular de um M-CSF e determinação do efeito do modulador suposto sobre a atividade ou expressão do M-CSF. A seletividade de um anticorpo que modula a atividade de um polipeptídeo ou polinucleotídeo de MCSF pode ser avaliada por comparação de seus efeitos sobre o polipeptídeo ou polinucleotídeo de M-CSF a seu efeito sobre outros compostos relacionados. Moduladores seletivos podem incluir, por exemplo, anticorpos e outras proteínas, peptídeos, ou moléculas orgânicas que se ligam especificamente a polipeptídeos de M-CSF ou a um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de M-CSF. Moduladores da atividade de M-CSF serão terapeuticamente úteis no tratamento de doenças e condições fisiológicas nas quais a atividade normal ou aberrante do polipeptídeo de M-CSF é envolvida.
A invenção também compreende ensaios de rastreamento de alto rendimento (HTS) para identificar anticorpos uqe interagem ou inibem a atividade biológica (ou seja, inibem a atividade enzimática, atividade de ligação etc.) de um polipeptídeo de M-CSF. Ensaios de HTS permitem o rastreamento de grandes números de compostos em uma maneira eficiente. Sistemas de HTS baseados em célula são contemplados para investigar a interação entre 5 polipeptídeos de M-CSF e seus parceiros de ligação. Ensaios de HTS são projetados para identificar "acertos" ou "compostos líderes" tendo as propriedade desejadas, das quais modificações podem ser projetadas para melhorar a propriedade desejada. A modificação química do "acerto" ou 10 "composto líder" é frequentemente baseada em uma relação de estrutura/atividade identificável entre o "acerto" e polipeptídeos de M-CSF.
Um outro aspecto da presente invenção é direcionado aos métodos de identificação de anticorpos que modulam (ou 15 seja, diminuem) a atividade de um M-CSF que compreendem o contato de um MCSF com um anticorpo, e determinação de se o anticorpo modifica a atividade do M-CSF. A atividade na presença do anticorpo de teste é comparada à atividade na ausência do anticorpo de teste. Quando a atividade da 20 amostra que contém o anticorpo de teste é menor que a atividade na amostra desprovida do anticorpo de teste, o anticorpo terá atividade inibida.
Uma variedade de sistemas heterólogos é disponível para expressão funcional de polipeptídeos recombinantes que 25 são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Tais sistemas incluem bactérias (Strosberg, e cols., Trends in Pharmacological Sciences (1992) 13:95-98), levedura(Pausch, Trends in Biotechnology (1997) 15:487-494), vários tipos de células de inseto (Vanden Broeck, hit. Rev. Cytology (1996) 164:189-268), células de anfíbios (Jayawickreme e cols., Current Opinion in Biotechnology (1997) 8: 629-634) e várias linhas de células de mamífero (CHO, HEK293, COS, etc.; veja Gerhardt, e cols., Eur. J. Pharmacology (1997) 334:1-23). Esses exemplos não impedem o uso de outros possíveis sistemas de expressão em célula, incluindo linhas de células obtidas de nematódeos (pedido PCT WO 98/37177) .
Em uma modalidade da invenção, métodos de rastreamento por anticorpos que modulam a atividade de M-CSF compreendem o contato de anticorpos de teste com um polipeptídeo de M-CSF e análise para a presença de um complexo entre o anticorpo e o MCSF. Em tais ensaios, o ligante é tipicamente rotulado. Depois de incubação adequada, ligante livre é separado daquele presente em forma ligada, e uma quantidade de rótulo livre ou não complexado é uma medida da capacidade do anticorpo particular de se ligar ao M-CSF ou polipeptídeo de M-CSFR.
Em uma outra modalidade da invenção, rastreamento de alto rendimento por fragmentos de anticorpo ou CDRs tendo afinidade de ligação adequada a um polipeptídeo de M-CSF é empregado. De forma breve, grandes números de diferentes compostos de teste de peptídeos pequenos são sintetizados em um substrato sólido. Os anticorpos de teste de peptídeo fazem contato com um polipeptídeo de M-CSF e são lavados. Polipeptídeos de M-CSF ligados são então detectados por métodos bem conhecidos na técnica. Polipeptídeos purificados da invenção também podem ser cobertos diretamente em placas para uso nas técnicas de rastreamento de medicamento anteriormente mencionadas. Em adição,anticorpos não neutralizantes podem ser usados capturar a proteína e a imobilizar no suporte sólido.
Terapia de Combinação
Tendo identificado mais de um anticorpo de M-CSF que é eficaz em um modelo animal, pode ser também vantajoso misturar dois ou mais de tais anticorpos de M-CSF juntos para fornecer eficácia ainda melhorada contra metástase de câncer e/ou perda óssea associada a metástase cancerosa. Composições que compreendem um ou mais anticorpo de M-CSF podem ser administradas a pessoas ou mamíferos que sofrem, ou são predispostos a sofrer de, metástase cancerosa e/ou perda óssea associada a metástase cancerosa. A administração concomitante de dois agentes terapêuticos não requer que os agentes sejam administrados ao mesmo tempo ou pela mesma via, desde que haja uma sobreposição nos períodos de tempo durante os quais os agentes estão exercendo seu efeito terapêutico. Administração simultânea ou sequencial é contemplada, assim como é a administração em dias ou semanas diferentes.
Embora a terapia de anticorpo de M-CSF possa ser útil para todos os estágios de cânceres, a terapia de anticorpo pode ser particularmente adequada em câncer avançado ou cânceres metastáticos. A combinação do método de terapia de anticorpo com quimioterapia ou regime de radiação podem ser preferida em pacientes que não receberam tratamento quimioterápico, enquanto o tratamento com a terapia de anticorpo pode ser indicado para pacientes que receberam uma ou mais quimioterapias. Adicionalmente, a terapia de anticorpo também pode permitir o uso de dosagens reduzidas de quimioterapia concomitante, particularmente em pacientes que não toleram a toxicidade do agente quimioterápico muito bem.
O método da invenção contempla a administração de anticorpos anti-MCSF únicos, assim como combinações, ou "coquetéis", de diferentes anticorpos. Tais coquetéis de anticorpo podem ter certas vantagens considerando-se que eles contêm anticorpos que se aproveitam de diferentes mecanismos efetores ou combinam diretamente anticorpos citotóxicos com anticorpos que se baseiam em funcionalidade efetora imune. Tais anticorpos em combinação podem exibir efeitos terapêuticos sinérgicos.
A combinação de derivados de RX1 ou Human Engineered™ de anticorpo RX1 com outro terápicos pode ter um efeito sobre um paciente que experimenta doença osteoclastica e/ou crescimento de tumor ou metástase. Por exemplo, uma pessoa pode usar anticorpo RX1 na manufatura de um medicamento para o tratamento de um paciente que tem uma doença osteolítica onde o referido medicamento é coordenado com tratamento que usa an anti-RANKL anticorpo, receptor RANKL solúvel, outros inibidores de RANKL, ou bisfosfonatos (por exemplo, Aredia,- Zometa; Clodronate) . Alternativamente, pode-se usar um anticorpo anti-RANKL ou bisfosfonato na manufatura de um medicamento para o tratamento de a para o tratamento de um paciente having uma doença osteolítica onde o referido medicamento é coordenado com o tratamento que usa anticorpo RX1 ou derivado "human engineered" de anticorpo RX1. A combinação também dever ter um efeito sinérgico em um paciente tratado. O anticorpo RX1 e outros terápicos não precisam ser administrados simultaneamente. RX1 ou a variante de "human engineered" e o outro terápico podem ser administrados em 1 dia, 1 semana, 2 semanas, 4 semanas, 2 meses, 3 meses, 6 meses, 1 ano ou dois anos.
A invenção também contempla o uso de um anticorpo RX1 ou um derivado Human Engineered™ de anticorpo RX1 na manufatura de um medicamento para o tratamento de um paciente que tem uma doença osteolítica onde o referido medicamento é usado em um paciente que foi pré-tratado com um anticorpo anti-RANKL ou bisfosfonatos. "Pré-tratamento" significa que um paciente foi tratado 2 anos, 1 ano, 6 meses, 3 meses 2 meses, 1 mês, 2 semanas, 1 semana, ou pelo menos um dia antes do tratamento com RX1 ou variante Human Engineered™ de RX1.
Anticorpo RX1 ou variantes Human Engineered™ podem ser usados em combinação ci=om outros terápicos de câncer. Por exemplo, uma pessoa pode usar anticorpo RX1 ou variantes de "human engineered" na manufatura de um medicamento para o tratamento de um paciente que tem câncer no qual o referido medicamento é coordenado com tratamento que usa outros agentes terapêuticos e/ou procedimentos, incluindo, sem limitação, vários agentes quimioterápicos, bloqueadores de androgênio, e moduladores imunes (por exemplo, IL-2, GM-CSF, SLC), Bisfosfonato(s) (por exemplo, Aredia; Zometa; Clodronato), cirurgia, radiação, quimioterapia citotóxica, terapia hormonal (por exemplo, Tamoxifen; terapia anti-Androgênio), terapia de anticorpo (por exemplo, anticorpos para neutralização de RANKL/RANK; neutralização de PTHrP, anticorpos anti-Her2, anti-CD20, anti-CD40, CD22, VEGF, IGFR-1, EphA2, HAAH, TMEFF2, CAIX), terapia de proteína terapêutica (por exemplo, receptor solúvel de RANKL; OPG, e PDGF e inibidores de MMP), terapia de medicamento de pequenas molécula (por exemplo, inibidor de Src-quinase), inibidores de quinase de receptores de fator de crescimento, ou inibidor de RANKL, terapia de oligonucleotídeos (por exemplo, RANKL ou RANK ou PTHrP Anti-senso), terapia de gene (por exemplo, inibidores de RANKL ou RANK), terapia de peptídeo (por exemplo muteínas de RANKL) assim como aquelas proteínas, peptídeos, compostos, e moléculas pequenas aqui descritas.RX1 e variantes Human Engineered™ podem ser usados na manufatura de um medicamento para o tratamento de pacientes que foram pré-tratados com os terápicos acima mencionados.
Um agente citotóxico se refere a uma substância que inibe ou evita a função de células e/ou causa a destruição de células. O termo deve incluir isótopos radioativos (por exemplo, I131, I125, Y90 e Re186) , agentes quimioterápicos, e toxinas como toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, de planta ou animal ou toxinas sintéticas, ou fragmentos dessas. Um agente não citotóxico se refere a uma substância que não inibe ou evita a função de células e/ou não causa a destruição de células. Um agente não citotóxico pode incluir um agente que pode ser ativado para ser citotóxico. Um agente não citotóxico pode incluir um glóbulo, lipossomo, matriz ou partícula (veja, por exemplo, Publicações de Patente U.S. 2003/0028071 e 2003/0032995 que são aqui incorporadas por referência). Tais agentes podem ser conjugados, pareados, ligados ou associados a um anticorpo de acordo com a invenção.
Agentes quimioterápicos de câncer incluem, sem limitação, agentes de alquilaçao, como carboplatina e cisplatina; agentes de alquilação de nitrogênio mostarda; agentes de alquilação de nitrosouréia, como carmustina (BCNU); antimetabólitos, como metotrexate; ácido folínico; antimetabólitos de análogo de purina, mercaptopurina; antimetabólitos de análogo de pirimidina, como fluoruracil (5-FU) e gemcitabina (Gemzar®); antineoplásicos hormonais, como goserelina, leuprolide, e tamoxifen; antineoplásicos naturais, como aldesleucina, interleucina-2, docetaxel, etoposide (VP-16), interferon alfa, paclitaxel (Taxol®), e tretinofna (ATRA); antineoplásicos naturais antibióticos, como bleomicina, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, daunomicina e mitomicinas incluindo mitomicina C; e antineoplásicos naturais de alcalóide da vinca, como vinblastina, vincristina, vindesina; hidroxiuréia; aceglatona, adriamicina, ifosfamida, enocitabina, epitiostanol, aclarrubicina, ancitabina, nimustina, cloridrato de procarbazina, carboquona, carboplatina, carmofur, cromomicina A3, polissacarideos antitumor, fatores plaquetários antitumor, ciclofosfamida (Cytoxin®), Schizophyllan, citarabina (citosina arabinoside), dacarbazina, tioinosina, tiotepa, tegafur, dolastatinas, análogos de dolastatina como auristatina, CPT-11 (irinotecan), mitozantrona, vinorelbina, teniposide, aminopterina, carminomicina, esperamicinas (veja, por exemplo, Patente U.S. ND : 4.675.187), neocarzinostatina, OK-432, bleomicina, furtulon, broxuridina, busulfan, honvan, peplomicina, bestatina (Ubenimex®), interferon-β, mepitiostano, mitobronitol, melfalan, peptídeos de laminina, lentinan, extrato de Coriolus versicolor, tegafur/uracil, estramustina (estrogênio/mecloretamina).
Além disso, agentes adicionais usados como terapia para pacientes com câncer incluem EPO, G-CSF, ganciclovir; antibióticos, leuprolide; meperidina; zidovudine (AZT); interleucinas 1 a 18, incluindo mutantes e análogos; interferons ou citocinas, como interferons α, β, e y, 5 hormônios, como hormônio de liberação de hormônio luteinizante (LHRH) e análogos e, hormônio de liberação de gonadotrofina (GnRH); fatores do crescimento como fator-β de crescimento de transformação (TGF-β), fator do crescimento de fibroblasto (FGF), fator do crescimento de 10 nervos (NGF), fator de liberação do hormônio do crescimento (GHRF), fator do crescimento epidérmico (EGF), fator homólogo de fator do crescimento de fibroblasto (FGFHF), fator do crescimento de hepatócito (HGF), e fator do crescimento de insulina (IGF); fator a e β de necrose 15 tumoral (TNF-α e β); fator-2 de inibição de invasão (IIF- 2); proteínas morfogenéticas de osso 1-7 (BMP 1-7); somatostatina; timosina-oc-1; y-globulina; superóxido dismutase (SOD); fatores do complemento; fatores anti- angiogênese; materiais antigênicos; e pró-medicamentos.
Pró-medicamento se refere a uma forma precursora ou derivada de uma substância farmaceuticamente ativa que é menos citotóxica ou não citotóxica a células tumorais comparadas ao medicamento parente e são capazes de serem ativadas enzimaticamente ou convertidas em uma forma ativa 25 ou na forma parente mais ativa, veja, por exemplo, Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) e Stella e cols., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt 30 e cols., (ed.), pp. 247-267, Human Press (1985). Pró- medicamentos incluem, mas não se limitam a, pró- medicamentos que contêm fosfato, pró-medicamentos que contêm tiofosfato, pró-medicamentos que contêm sulfato, pró-medicamentos que contêm peptídeo, pró-medicamentos 5 modificados de D-aminoácido, pró-medicamentos glicosilados, pró-medicamentos que contêm β-lactama, pró-medicamentos que contêm fenoxiacetamida opcionalmente substituídos ou pró- medicamentos que contêm fenilacetamida opcionalmente substituídos, 5-fluorcitosina e outros pró-medicamentos de 10 5-fluoruridina que podem ser convertidos no medicamento livre citotóxico mais ativo. Exemplos de medicamentos citotóxicos que podem ser derivatizados em uma forma de pró-medicamento para uso nesta incluem, mas não se limitam, àqueles agentes quimioterápicos acima descritos.
Administração e preparação
Os anticorpos anti-M-CSF usados na prática de um método da invenção podem ser formulados em composição farmacêuticas que compreendem um transportador adequados para o método de liberação desejado. Transportadores 20 adequados incluem qualquer material que, quando combinado com os anticorpos anti-M-CSF, retêm a função anti-tumor do anticorpo e são não reativos com os sistemas imunes do paciente. Exemplos incluem, mas não se limitam a, qualquer um de inúmeros transportadores farmacêuticos padrão como 25 soluções salinas estéreis tamponadas por fosfato, água bacteriostática e outros. Vários transportadores aquosos podem ser usados, por exemplo, água, água tamponada, solução salina a 0,4%, glicina a 0,3% e outros, e podem incluir outras proteínas para melhor estabilidade, como 30 albumina, lipoproteína, globulina, etc., submetidos a modificações químicas leves ou semelhantes.
Formulações terapêuticas do anticorpo são preparadas para estocagem ou mistura do anticorpo que tem o grau desejado de pureza com transportadores, excipientes ou 5 estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A.Ed. (1980)), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Transportadores, excipientes ou estabilizantes aceitáveis são não tóxicos a receptores nas 10 dosagens e concentrações empregadas, e incluem agentes de tamponamento como fosfato, citrato, acetato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluem ácido ascórbico e metionina; conservantes (como cloreto de octadecildimetilbenzil amónio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio cloreto de, benzetônio; álcool fenólico, butílico ou benzílico; alquil parabens como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3- pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos que cerca de 10 resíduos); proteínas, como albumina sérica, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como polivinilpirrolidona; aminoácidos como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes como EDTA; açúcares como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; countérions formadores de sal como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexos Zn-proteína); e/ou tensoativos não iônicos como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietileno glicol (PEG).
As formulação nessa também podem conter mais de um composto ativo como necessário para a indicação particular sendo tratada, preferivelmente aquelas com atividades complementares que não afetam adversamente uma a outra. Por exemplo, elas podem ser desejáveis para também fornecer um 5 agente imunossupressor. Tais moléculas são adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o objetivo pretendido.
Os ingredientes ativos também podem ser também podem ser aprisionados em microcápsulas preparadas, por exemplo, 10 por técnicas de co-acervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, usando microcápsulas de hidroxi- metilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli(metil-metacrilato), respectivamente, em sistemas de liberação coloidal de medicamento (por exemplo, lipossomos, 15 micro-esferas de albumina, micro-emulsões, nano partículas, e nanocápsulas) ou em macro-emulsões. Tais técnicas são reveladas em Remington's Pharmaceutical Sciences 16a. Ed. , A. Oslo, 1980.
As formulações a serem usadas para administração in 20 vivo devem ser estéreis. Isso é facilmente realizado por filtração através de membranas de filtração estéreis.
O anticorpo é administrada por qualquer via adequada, incluindo parenteral, subcutânea, intraperitoneal, intrapulmonar, e intranasal, e, se desejado, para tratamento local, administração intralesional. Infusões parenterais incluem administração intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intradérmica ou subcutânea. Em adição, o anticorpo é administrado adequadamente por infusão em pulso, particularmente com 30 doses decrescentes do anticorpo. Preferivelmente a dosagem é dada por injeções, mais preferivelmente injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte de se a administração é breve ou crônica. Outros métodos de administração são contemplados, incluindo administração tópica, particularmente transdérmica, transmucosa, retal, oral ou local, por exemplo, através de um cateter colocado no local desejado.
Composições da presente invenção podem estar na forma de, por exemplo, granules, pós, comprimidos, cápsulas, xaropes, supositórios, injeções, emulsões, elixires, suspensões ou soluções. As atuais composições podem ser formuladas para várias vias de administração, por exemplo, por administração oral, por administração nasal, por administração retal, injeção subcutânea, injeção intravenosa, injeção intramuscular, ou injeção intraperitonial. As seguintes formas de dosagem são dadas por via de exemplo e não devem ser interpretadas como limitantes dessa invenção.
Para administração oral, bucal, e sublingual, pós, suspensões, grânulos, comprimidos, pílulas, cápsulas, gelcaps, e drágeas são aceitáveis como formas de dosagem sólidas. Essas podem ser preparadas, por exemplo, por mistura de um ou mais compostos da presente invenção, sais ou tautômeros farmaceuticamente aceitáveis, com pelo menos um aditivo tal como um amido ou outro aditivo. Aditivos adequados são sacarose, lactose, açúcar de celulose, manitol, maltitol, dextrano, amido, agar, alginatos, quitinas, quitosanas, pectinas, goma tragacanto, goma arábica, gelatinas, colágenos, caseína, albumina, polímeros sintéticos ou semi-sintéticos ou glicerídeos.
Opcionalmente, formas de dosagem oral podem conter outros ingredientes para ajudar na administração, tais como um diluente inativo, ou lubrificantes tal como estearato de magnésio, ou conservantes como parabeno ou ácido sórbico, 5 ou anti-oxidantes tais como ácido ascórbico, tocoferol ou cisteína, um agente desintegrante, ligantes, espessantes, agentes de tamponamento, adoçantes, agentes flavorizantes ou agentes de perfume. Comprimidos e pílulas também podem ser tratados com materiais de revestimento adequados 10 conhecidos na técnica..
Formas de dosagem líquidas para administração oral podem estar na forma de emulsões, xaropes, elixires, suspensões e soluções farmaceuticamente aceitáveis, que podem conter um diluente inativo, tal como água.
Formulações farmacêuticas podem ser preparadas como suspensões líquidas ou soluções usando um líquido estéril, tais como, mas não limitados a, um óleo, água, um álcool e combinações desses, Tensoativos farmaceuticamente aceitáveis, agentes de suspensão, agentes emulsificantes, 20 podem ser adicionados para administração oral ou parenteral.
Como acima observado, suspensões podem incluir óleos. Tal óleo inclui, mas não são limitados a, óleo de amendoim, óleo de gergelim, óleo de algodão, óleo de milho e óleo de 25 oliva. Preparação em suspensão também pode conter ésteres de ácidos graxos tais como etil oleato, isopropil miristato, glicerídeos de ácido graxo e glicerídeos de ácido graxo acetilados. Formulações em suspensão podem incluir álcoois, tais como, mas não limitados a, etanol, 30 álcool isopropílico, hexadecil álcool, glicerol e propileno glicol. Éteres, tais como mas não limitados a, poli (etilenoglicol), hidrocarbonetos de petróleo tais como óleo mineral e petrolato (vaselina); e água também podem ser usados nas formulações em suspensão.
Para administração nasal, as formulações farmacêuticas e medicamentos podem ser um spray ou aerossol contendo um solvente adequado e opcionalmente outros compostos tais como, mas não limitados a, estabilizantes, agentes antimicrobianos, antioxidantes, modificadores de pH, 10 tensoativos, modificadores de biodisponibilidade e combinações desses. Um propulsor para uma formulação em aerossol pode incluir ar comprimido, nitrogênio, dióxido de carbono, ou um solvente de baixa ebulição baseado em hidrocarboneto.
Formas de dosagem em injeção geralmente incluem suspensões aquosas ou suspensões oleosas que podem ser preparadas usando um dispersante ou agente umectante e um agente de suspensão adequados. Formas injetáveis podem estar em fase de solução ou na forma de uma suspensão, que 20 é preparada com um solvente ou diluente. Solventes ou veículos adequados incluem água esterilizada, solução de Ringer, ou uma solução salina isotônica aquosa. Como uma alternativa, óleos estéreis podem ser empregados como solventes ou agentes de suspensão. Preferivelmente, o óleo 25 ou ácido graxo é não volátil, incluindo óleos naturais ou sintéticos, ácidos graxos, mono-, di- ou tri-glicerídeos.
Para injeção, a formulação farmacêutica e/ou medicamento pode ser um pó adequado para reconstituição com uma solução adequada como acima descrito. Exemplos desses 3 0 incluem, mas não são limitados a, pós secos por congelamento, secos por rotação ou secos por pulverização, pós amorfos, grânulos, precipitados, ou particulados. Para injeção, as formulações podem conter opcionalmente estabilizantes, modificadores de pH, tensoativos, modificadores de biodisponibilidade e combinações desses.
Para administração retal, as formulações farmacêuticas e medicamentos podem estar na forma de um supositório, uma pomada, um enema, um comprimido ou um creme para liberação do composto nos intestinos, sigmóide e/ou reto. Supositórios retais são preparados por mistura de um ou mais compostos da presente invenção, ou sais farmaceuticamente aceitáveis ou tautômeros do composto, com veículos aceitáveis, por exemplo, manteiga de cacau ou polietileno glicol, que está presente em uma fase sólida em temperaturas normais de estocagem, e presente em uma fase líquida naquelas temperaturas adequadas para liberar um medicamento no interior do corpo, tal como no reto. Também podem ser empregados óleos na preparação de formulações do tipo de gelatina macia e supositórios. Água, solução salina, dextrose aquosa e soluções de açúcar relacionadas, e gliceróis podem ser empregados na preparação de formulações em suspensão que também podem conter agentes de suspensão tais como pectinas, carbômeros, metil celulose, hidroxipropil celulose ou carboximetil celulose, assim como tampões e conservantes.
Preparações de liberação sustentada podem ser preparadas. Exemplos adequados de preparações de liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímero hidrofóbico sólido contendo o anticorpo, cujas matrizes estão na forma de artigos formados, por exemplo, filmes, ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo poli (2- hidroxietil-metacrilato), ou álcool poli(vinílico)) , polilactides (Patente U.S. N° : 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e y-etil-L-glutamato, acetato de etileno- vinil não degradável, copolímeros de ácido glicólico-ácido lático degradáveis como LUPRON DEPOT™ (que são microesferas injetáveis compostas de copolímero ácido glicólico-ácido lático e acetato de leuprolide),e ácido 10 poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Embora polímeros como etilene-vinil acetato e ácido lático-ácido glicólico permitam a liberação de moléculas por mais de 100 dias, certos hidrogéis liberam proteínas por períodos de tempo mais curtos. Quando anticorpos encapsulados permanecem no 15 corpo por um longo tempo, eles podem desnaturar ou se agregar como um resultado de exposição a umidade a 37°C., resultando em uma perda da atividade biológica e possíveis modificações na imunogenicidade. Estratégias racionais podem ser planejadas para estabilização dependendo do 20 mecanismo envolvido. Por exemplo, se o mecanismo de agregação é descoberto como sendo formação de ponte S--S intermolecular através de intercâmbio tio-dissulfeto, a estabilização pode ser atingida por modificação dos resíduos sulfidril, liofilização de soluções ácidas, 25 controle do conteúdo de umidade, uso de aditivos adequados e desenvolvimento de composições de matriz polimérica específicas.
As formulações da invenção podem ser desenhadas para serem de curta ação, de rápida liberação, de longa ação, e 30 de liberação sustentada como aqui descrito. Dessa forma, as formulações farmacêuticas também podem ser formuladas para liberação controlada ou para liberação lenta.
As presentes composições também podem compreender, por exemplo, micelas ou lipossomos, ou alguma outra forma 5 encapsulada, ou podem ser administradas em uma forma de liberação estendida para fornecer uma estocagem e/ou efeito de liberação prolongado. Portanto, as formulações farmacêuticas podem ser compressas em péletes ou cilindros e implantadas por via intramuscular ou subcutânea como 10 injeções de depósito ou como implantes tal como "stents".
Tais implantes podem empregar materiais inertes conhecidos tais como silicones e polímeros biodegradáveis.
Além daquelas formas de dosagem representativas acima descritas, transportadores e excipientes farmaceuticamente 15 aceitáveis são geralmente conhecidos por aqueles habilitados na técnica e são assim incluídos na presente invenção. Tais excipientes e transportadores são descritos, por exemplo, em "Remingtons Pharmaceutical Sciences" Mack Pub. Co., New Jersey (1991), que é aqui incorporado por 20 referência.
Dosagens específicas podem ser ajustadas dependendo das condições da doença, da idade, peso corporal, condições gerais de saúde, sexo, e dieta do indivíduo, intervalos de dose, vias de administração, taxa de excreção, e 25 combinações de medicamentos. Quaisquer uma das formas de dosagem acima contendo quantidades eficazes estão dentro dos limites da experimentação rotineira e portanto, dentro do escopo da presente invenção.
Anticorpos de M-CSF úteis como terápicos para 30 metástase de câncer ou perda óssea associada a metástase de câncer serão frequentemente preparados substancialmente livres de outras imunoglobulinas de ocorrência natural ou outras moléculas biológicas. Anticorpos de M-CSF preferidos exibirão toxicidade mínima quando administrados a um 5 mamífero que tem, ou predisposto a sofrer de, metástase de câncer e/ou perda óssea associada a metástase cancerosa.
As composições da invenção podem ser esterilizadas por técnicas de esterilização convencionais bem conhecidas. As soluções resultantes podem ser acondicionadas para uso ou 10 filtradas sob condições assépticas e liofilizadas, sendo o preparado liofilizado combinado com uma solução estéril antes da administração. As composições podem conter substanciais auxiliares aceitáveis do ponto de vista farmacêutico conforme exigido para se aproximar a condições 15 fisiológicas, tais como agentes de ajuste de pH e de tampão, agentes de ajuste de tonicidade e outros, por exemplo, acetato de sódio, lactato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio e estabilizantes (por exemplo, 1 20% maltose, etc.) .
Os anticorpos de M-CSF da presente invenção também podem ser administrados via lipossomos, que são pequenas vesículas compostas de vários tipos de lipídeos e/ou fosfolipídeos e/ou tensoativos que são úteis para liberação de um medicamento (como os anticorpos aqui revelados e, 25 opcionalmente, um agente quimioterápico). Lipossomos incluem emulsões, espumas, micelas, monocamadas insolúveis, dispersões de fosfolipídeos, camadas lamelares e outros, e podem servir como veículos para direcionar o anticorpos de M-CSF para um tecido particular assim como para aumentar a 30 meia-vida da composição. Uma variedade de métodos são disponíveis para a preparação de lipossomos, como descrito em, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 4.837.028 e 5.019.369, cujas patentes são aqui incorporadas por referência.
Lipossomos contendo o anticorpo são preparado por 5 métodos conhecidos na técnica, como os descritos em Epstein e cols., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 3688 (1985); Hwang e cols., Proc. Natl Acad. Sei. USA 77: 4030 (1980); e Patentes U.S. Nos. 4.485.045 e 4.544.545. Lipossomos com tempos de circulação aumentado são revelados na Patente 10 U.S. N° : 5.013.556. Lipossomos particularmente úteis podem ser gerados pelo método de evaporação de fase reversa com uma composição lipídica que compreende fosfatidileolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivatizada com PEG (PEG-PE). Lipossomos são extrusados através de filtros de 15 tamanho de poro definido para gerar lipossomos com o diâmetro desejado. Fragmentos Fab' do anticorpo da presente invenção podem ser conjugados aos lipossomos como descritos em Martin e cols., J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) via uma reação de intercâmbio de dissulfeto. Um agente 20 quimioterápico (como Doxorrubicina) é opcionalmente contido no lipossomo [veja, por exemplo, Gabizon e cols., J. National Cancer Inst. 81(19) : 1484 (1989)] .
A concentração do anticorpo de M-CSF nessas composições pode variar muito, ou seja, de menos que cerca 25 de 10%, usualmente pelo menos cerca de 25% até 75% ou 90% em peso e serão selecionadas primariamente por volumes fluidos, viscosidades etc., de acordo com o modo particular de administração selecionado. Métodos reais para a preparação de composições administráveis por via oral, 30 tópica e parenteral serão conhecias ou aparentes para aqueles habilitados na técnica e são descritas em detalhe, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Science, 19th ed. , Mack Publishing Co., Easton, PA (1995), que é aqui incorporado por referência.
A determinação de uma quantidade eficaz de uma composição da invenção para tratar metástase de câncer e/ou perda óssea associada a metástase de câncer em um paciente pode ser realizada através de métodos empíricos padronizados que são bem conhecidos na técnica. Por 10 exemplo, a atividade de neutralização in vivo de soro de um indivíduo tratado com uma dosagem dada de anticorpo de M- CSF pode ser avaliada com o uso de um ensaio que determina a capacidade do soro de bloquear a proliferação induzida por M-CSF e sobrevivência de monócitos de murídeo (célula 15 GDI lb+, um subconjunto de células CD11, que expressam altos níveis de receptor para M-CSF) in vitro como descrito em Cenci e cols., J Clin. Invest. 1055: 1279-87, 2000.
Composições da invenção são administrada a um mamífero que já sofre, ou é predisposto a, metástase de câncer e/ou 20 perda óssea associada a metástase de câncer em uma quantidade suficiente para evitar ou pelo menos impedir parcialmente o desenvolvimento de metástase de câncer e/ou perda óssea associada a metástase cancerosa. Uma quantidade adequada para realizar isso é definida como a "dose 25 terapeuticamente eficaz". Quantidades eficazes de um anticorpo de MCSF irão variar e depender da severidade da doença e do peso e estado geral do paciente sendo tratado, mas geralmente podem variar de cerca de 1,0 μg/kg a cerca de 100 mg/kg de peso corporal ou cerca de 10 μg/kg to cerca 30 de 30 mg/kg, com dosagens de cerca de 0.1 mg/kg to cerca de mg/kg ou cerca de 1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg por aplicação sendo mais comumente usada. Por exemplo, cerca de 10 μg/kg a 5 mg/kg ou cerca de 3 0 pg/kg a 1 mg/kg de anticorpo é uma dosagem candidata inicial para 5 administração de ao paciente, se, por exemplo, por uma ou mais administrações separadas, ou por infusão contínua. A administração é diária, em dias alternados, semanal ou menor, frequentemente, como necessário dependendo da resposta ã doença e tolerância do paciente à terapia.
Dosagens de manutenção por um período maior de tempo, como 4, 5, 6, 7, 8, 10 ou 12 semanas ou mais podem ser necessárias até que a supressão desejada dos sintomas da doença ocorra, e as dosagens podem ser ajustadas como necessário. 0 progresso dessa terapia é facilmente 15 monitorado por técnicas e ensaios convencionais.
Administrações únicas ou múltiplas das composições podem ser realizadas com os níveis e padrões de dose sendo selecionados pelo médico que faz o tratamento. Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem adequada de 2 0 anticorpo dependerá do tipo de doença a ser tratada, como acima definido, da severidade e curso da doença, se o anticorpo é administrado para objetivos preventivos ou terapêuticos, terapia prévia, a história clínica do paciente e resposta ao anticorpo e do julgamento do médico. 25 0 anticorpo é adequadamente administrado ao paciente uma vez ou por uma série de tratamentos.
Em qualquer evento, as formulações devem fornecer uma quantidade de anticorpo de M-CSF pelo tempo que é suficiente para prevenir ou minimizar a severidade de 30 metástase de câncer e/ou perda óssea associada a metástase cancerosa. As composições da presente invenção podem ser administradas isoladamente ou como uma terapia adjunta com outros terápicos conhecidos na técnica para o tratamento de metástase de câncer e/ou perda óssea associada a metástase cancerosa.
A composição do anticorpo será formulada, dosada, e administrada em um modo consistente com a boa prática médica. Fatores para consideração nesse contexto incluem o distúrbio particular sendo tratado, o mamífero particular sendo tratado, a condição clínica do paciente individual, a causa do distúrbio, o local de liberação do agente, o método de administração, o esquema de administração, e outros fatores conhecidos por profissionais médicos. A quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo a ser administrada será determinada por tais considerações e é a quantidade mínima necessária para prevenir, melhorar, ou tratar a doença mediada por M-CSF, condição ou distúrbio, particularmente para tratar células cancerosas, e mais particularmente para tratar metástases de célula tumoral. Tal quantidade é preferivelmente abaixo de uma quantidade que é tóxica ao hospedeiro ou torna o hospedeiro significativamente mais suscetível a infecções.
O anticorpo não necessita ser, mas é opcionalmente formulado com um ou mais agentes atualmente usados para prevenir ou tratar o distúrbio em questão. Por exemplo, em câncer, o anticorpo pode ser administrado junto com o agente quimioterápico ou em ADEPT como acima descrito, a quantidade eficaz de tais outros agentes depende da quantidade de anticorpo presente na formulação, do tipo de doença, condição ou distúrbio ou tratamento e de outros fatores acima discutidos. Esses são geralmente usados nas mesmas dosagens e com vias de administração como usados anteriormente ou cerca de 1 a 99% das dosagens até aqui empregadas.
Em uma outra modalidade da invenção, é fornecido um artigo de manufatura que contém materiais úteis para o tratamento das doenças, distúrbios ou condições aqui descritos, que inclui o tratamento de câncer. O artigo de manufatura compreende um recipiente e um rótulo. Recipientes adequados incluem, por exemplo, vidros, frascos, seringas e tubos de teste. Os recipientes podem ser formados de uma variedade de materiais como vidro ou plástico. O recipiente contém a composição que é eficaz para o tratamento da condição e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco que tem uma tampa perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). O agente ativo na composição é o anticorpo da invenção. O rótulo, associado com recipiente indica que a composição é usada para o tratamento da condição de escolha. O artigo de manufatura também pode compreender um segundo recipiente que compreende um tampão farmaceuticamente aceitável, como solução salina tamponada por fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Ele também pode incluir outros materiais desejáveis de um ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e inserções da embalagem com instruções para o uso.
Imunoterapia
Anticorpos anti-M-CSF úteis no tratamento de pacientes que têm cânceres incluem aqueles que são capazes de iniciar uma potente resposta imune contra o tumor e aqueles que são capazes de direcionar citotoxicidade. Com vista a isso, anticorpos anti-M-CSF podem elicitar a lise de célula tumoral por mecanismos de citotoxicidade celular mediada por complemento ou dependente de anticorpo (ADCC), ambos requerem uma porção de Fc intacto da molécula de imunoglobulina para interação com s'tios de receptor Fc de célula efetora ou proteínas complementes. Em adição, anticorpos anti-M-CSF que exercem um efeito biológico direto sobre o crescimento tumoral são úteis na prática da invenção. Mecanismos potenciais pelos quais tais anticorpos diretamente citotóxicos podem agir incluem inibição do crescimento celular, modulação da diferenciação celular, modulação de perfis de fator de angiogênese tumoral e a indução de apoptose. O mecanismo pelo qual um anticorpo anti-M-CSF particular exerce um efeito anti-tumor pode ser avaliado usando qualquer número de ensaios in vitro projetados para determinar ADCC, ADMMC, lise celular mediada por complemento e assim por diante, como é conhecido na técnica.
Em uma modalidade, imunoterapia é realizada com o uso de anticorpos que têm uma maior afinidade pela forma ligada à membrana de M-CSF (M-CSFa) que para as formas secretadas de M-CSF. Por exemplo, podem ser preparados anticorpos que se ligam especificamente ao sítio de clivagem ou ao redor dele de M-CSFa ou à porção de M-CSFa adjacente à membrana. Tais anticorpos também podem inibir de forma benéfica a clivagem e liberação da porção ativa solúvel de M-CSFa.sua forma "desnuda" ou não conjugada, ou podem ter agentes terapêuticos conjugados a eles. Em uma modalidade, anticorpos anti-M-CSF são usados como um radio- sensibilizador. Em tal modalidades, os anticorpos anti-M- CSF são conjugado a um agente radio-sensibilizador. O termo "radio-sensibilizador," como aqui usado, é definido como uma molécula, preferivelmente uma molécula de baixo peso molecular, administrada a animais em quantidades terapeuticamente eficazes para aumentar a sensibilidade das células a serem radio-sensibilizadas para radiação eletromagnética e/ou para promover o tratamento de doenças que são tratáveis com radiação eletromagnética. Doenças que são tratáveis com radiação eletromagnética incluem doenças neoplásicas, tumores benignos e malignos e células cancerosas.
Os termos "radiação eletromagnética" e "radiação" como aqui usado incluem, mas não são limitados a, radiação que tem o comprimento de onda de 10‘20 a 100 metros. Modalidades preferidas da presente invenção empregam a radiação eletromagnética de: radiação gama (10’2° a 10'13 m) , radiação de raio X (10'12 a 10’9 m) , luz ultravioleta (10 nm a 400 nm) , luz visível (400 nm a 700 nm) , radiação infravermelha (700 nm a 1,0 mm) e radiação de microondas (1 mm a 30 cm) .
Radio-sensibilizadores são conhecidos por aumentar a sensibilidade de células cancerosas aos efeitos tóxicos de radiação eletromagnética. Vários protocolos de tratamento de câncer empregam atualmente radio-sensibilizadores ativados pela radiação eletromagnética de raios X. Exemplos de radio-sensibilizadores ativados por raios X incluem, mas não são limitados aos seguintes: metronidazol, misonidazol, desmetilmisonidazol, pimonidazol, etanidazol, nimorazol, mitomicina C, RSU 1069, SR 4233, EO9, RB 6145, nicotinamida, 5-bromodesoxiuridina (BUdR), 5- iododeoxiuridina (lUdR), bromodeoxicitidina, fluordesoxiuridina (FUdR), hidroxiuréia, cisplatina, e análogos terapeuticamente eficazes e derivados dos mesmos.
A terapia fotodinâmica (PDT) de cânceres emprega luz visível como o ativador de radiação do agente sensibilizador. Exemplos de radio-sensibilizadores fotodinâmicos incluem os seguintes, sem limitação: derivados de hematoporfirina, Fotofrin(r), derivados de benzoporfirina, NPe6, etioporfirina de estanho (SnET2), feoborbide-a, bacterioclorofil-a, naftalocianinas, ftalocianinas, ftalocianina de zinco e análogos terapeuticamente eficazes e derivados dos mesmos.
Em uma outra modalidade, o anticorpo pode ser conjugado a um receptor (como estreptavidina) para utilização em pré-direcionamento de tumor onde o conjugado anticorpo-receptor é administrado ao paciente, seguido por remoção de conjugado não ligado da circulação com o uso de um agente de limpeza e então administração de um ligante (por exemplo, avidina) que é conjugado a um agente citotóxico (por exemplo, um radionuclídeo).
A presente invenção também fornece os anticorpos acima descritos em forma detectavelmente marcada. Anticorpos podem ser detectavelmente marcados através do uso de radioisótopos, rótulos de afinidade (como biotina, avidina etc.), rótulos enzimáticos (como peroxidase de raiz forte, fosfatase alcalina etc.) rótulos fluorescentes ou luminescentes ou bioluminescentes (como FITC ou rodamina etc.), átomos paramagnéticos e outros. Procedimentos para realizar tal rotulagem são bem conhecidos na técnica; por exemplo, veja, (Stemberger, L.A. e cols., J. Histochem. Cytochem. 18:315 (1970); Bayer, E.A. e cols., Meth. Enzym. 62:308 (1979); Engval, E. e cols., Immunol. 109:129 (1972); Goding, J.W. J. Immunol. Meth. 13:215 (1976)) .
"Rótulo" se refere a um composto ou composição detectável que é conjugado diretamente ou indiretamente ao anticorpo. O rótulo pode ser detectável por si (por exemplo, rótulos radioisótopos ou rótulos fluorescentes) ou, no caso de um rótulo enzimático, podem catalisar alteração química de um composto ou composição de substrato que é detectável. Alternativamente, o rótulo pode não ser detectável por si mas pode ser um elemento que é ligado por um outro agente que é detectável (por exemplo, um rótulo de epitopo ou um de um par de parceiros de ligação como biotina-avidina etc.). Portanto, o anticorpo pode compreender um rótulo ou marcador que facilita a sua isolação e métodos da invenção para identificar anticorpos incluem uma etapa de isolação do M-CSF/anticorpo através da interação com o rótulo ou marcador.
Imunoconjugados terapêuticos de exemplo compreendem o anticorpo aqui descrito conjugado a um agente citotóxico como um agente quimioterápico, toxina (por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana, fúngica, de planta ou animal, ou fragmentos dessas), ou um isótopo radioativo (ou seja, um radioconjugado). Proteínas de fusão são descritas em maiores detalhes abaixo.
A produção de imunoconjugados é descrita na Patente U.S. N° : 6.306.393. Imunoconjugados podem ser preparados por conjugação indireta de agente terapêutico a um componente de anticorpo. Técnicas gerais são descritas em Shih e cols., Int. J. Cancer 41:832839 (1988); Shih e cols., Int. J. Cancer 46:1101-1106 (1990); e Shih e cols., 5 Pat. U.S. No. 5.057.313. O método geral envolve a reação de um componente de anticorpo que tem uma porção de carboidrato oxididada com um polímero transportador que tem pelo menos uma função de amina livre e que é carregado com vários de medicamento, toxina, quelante, adendos de boro 10 ou outro agente terapêutico. Essa reação resulta em uma ligação de base Schiff inicial (imina), que pode ser estabilizada por redução a uma amina secundária para formar o conjugado final.
O polímero transportador é preferivelmente um 15 aminodextrano ou polipeptídeo de pelo menos 50 resíduos de aminoácido, embora outros polímeros transportadores substancialmente equivalentes também possam ser usados. Preferivelmente, o imunoconjugado final é solúvel em uma solução aquosa, como soro de mamífero, para facilidade de 20 administração e direcionamento eficaz para uso em terapia.
Portanto, funções de solubilização no polímero transportador aumentarão a solubilidade do soro do imunoconjugado final. Em particular, um aminodextrano será preferido.
O processo para a preparação de um imunoconjugado com um transportador de aminodextrano tipicamente inicia com um polímero de dextrano, vantajosamente um dextrano de peso molecular médio de cerca de 10.000-100.000. O dextrano reage com um agente oxidante para afetar uma oxidação 30 controlada de uma porção de seus anéis de carboidrato para gerar grupos aldeído. A oxidação é convenientemente efetuada com reagentes químicos glicolíticos como NaIO4, de acordo com procedimentos convencionais.
O dextrano oxidado reage então com uma poliamina, 5 preferivelmente uma diamina, e mais preferivelmente, uma mono- ou polihidroxi diamina. Aminas adequadas incluem etileno diamina, propileno diamina, ou outros polimetileno diaminas, dietileno triamina ou outras poliaminas, 1,3- diamino-2-hidroxipropano, ou outras diaminas ou poliaminas hidroxiladas e semelhantes. Um excesso da amina em relação aos grupos aldeído do dextrano é usado para assegurar a conversão substancialmente completa das funções de aldeído para grupos de base de Schiff.
A agente de redução, como NaBH4, NaBH3 CN ou outros, é usada para efetuar a estabilização da redução do intermediário de base de Schiff resultante. O aduto resultante pode ser purificado por passagem através de uma coluna convencional de dimensionamento para remover dextranos entrecruzados.
Outros métodos convencionais de derivatização de umdextrano para introdução de funções de amina também podem ser usados, por exemplo, reação com brometo de cianogeno, seguido por reação com uma diamina.
O aminodextrano reage então com um derivado do medicamento, toxina, quelante, imunomodulador, adendo de boro ou outro agente terapêutico particular a ser carregado, em uma forma ativada, preferivelmente, um derivado ativado por carboxil, preparado por meios convencionais, por exemplo, usando diciclohexilcarbodiimida (DCC) ou uam variante hidrossolúvel dessa, para formar um aduto intermediário.
Alternativamente, toxinas de polipeptídeo como proteína antiviral de pokeweed ou cadeia de ricina A, e outros, podem ser ligadas a aminodextrano por condensação 5 de glutaraldeído ou por reação de grupos carboxil ativados na proteína com aminas no aminodextrano.
Quelantes para radiometais ou intensificadores de ressonância magnética são bem conhecidos na técnica, típicos são derivados de ácido etilenodiaminatetraacético 10 (EDTA) e ácido dietilenotriaminapentaacético (DTPA). Esses quelantes tipicamente têm grupos na cadeia lateral pelos quais o quelante pode ser anexado a um transportador. Tais grupos incluem, por exemplo, benzilisotiocianato, pelo qual DTPA ou EDTA pode ser anexado ao grupo amina de um 15 transportador. Alternativamente, grupos carboxil ou grupos amina em um quelante podem ser anexados a um transportador por ativação ou derivatização anterior e então anexação, todos por meios bem conhecidos.
Adendos de boro, como carboranos, podem ser anexados 20 aos componentes do anticorpo por métodos convencionais. Por exemplo, carboranos podem ser preparados com funções de carboxil nas cadeias laterais pendentes, como é bem conhecidos na técnica. A ligação de tais carboranos a um transportador, por exemplo, aminodextrano, pode ser 25 realizada por ativação de grupos carboxil dos carboranos e condensação com aminas no transportador para produzir um conjugado intermediário. Tais conjugados intermediários são então anexados aos componentes do anticorpo para produzir imunoconjugados terapeuticamente úteis, como abaixo 30 descrito.
Um transportador de polipeptídeo pode ser usado ao invés de aminodextrano, mas o transportador de polipeptídeo deve ter pelo menos 50 resíduos de aminoácido na cadeia, preferivelmente 100-5000 resíduos de aminoácido. Pelo menos alguns dos aminoácidos devem ser resíduos de lisina ou glutamato ou resíduos de aspartato. As aminas pendentes dos resíduos de lisina e carboxilatos pendentes da glutamina e aspartato são convenientes para anexação de um medicamento, toxina, imunomodulator, quelante, adendo de boro ou outro agente terapêutico. Exemplos de transportadores de polipeptídeo adequados incluem polilisina, ácido poliglutâmico, ácido poliaspártico, co-polímeros desses e polímeros mistos desses aminoácidos e outros, por exemplo, serinas, para conferir propriedades de solubilidade desejáveis no transportador e imunoconjugado resultantes.
A conjugação do conjugado intermediário com o componente de anticorpo é efetuada por oxidação da porção carboidrato do componente do anticorpo e reação do aldeído resultante (e cetona) carbonis com grupos amina que permanecem no transportador após carga com o medicamento, toxina, imunomodulator, quelante, adendo de boro ou outro agente terapêutico. Alternativamente, um conjugado intermediário podem ser anexado a um componente oxidado do anticorpo via grupos amina que foram introduzidos no conjugado intermediário após carga com o agente terapêutico. A oxidação é convenientemente efetuada quimicamente, por exemplo, com NaI04 ou outro reagente glicolítico, ou enzimaticamente, por exemplo, com neuraminidase e galactose oxidase. No caso de um transportador de aminodextrano, nem todas as aminas do aminodextrano são tipicamente usadas para carregar um agente terapêutico. As aminas remanescentes do aminodextrano se condensam com o componente do anticorpo oxidado para formar adutos de base de Schiff, que são então 5 redutivamente estabilizados, normalmente com um agente de redução de borohidreto.
Procedimentos análogos são usados para produzir outros imunoconjugados de acordo com a invenção. Transportadores de polipeptídeo carregados preferivelmente têm resíduos de 10 lisina livres remanescentes para condensação com a porção de carboidrato oxidado de um componente de anticorpo. Carboxis no transportador de polipeptídeo podem, se necessário, ser convertidos a aminas, por exemplo, por ativação com DCC e reação com um excesso de uma diamina.
O imunoconjugado final é purificado usando técnicas convencionais, como cromatografia de dimensionamento em Sephacryl S-300 ou cromatografia de afinidade usando um ou mais epitopos CD84Hy.
Alternativamente, imunoconjugados podem ser preparados 20 por conjugação direta no componente de anticorpo com um agente terapêutico. O procedimento geral é análogo ao método indireto de conjugação exceto pelo fato de o agente terapêutico ser diretamente anexado a um componente de anticorpo oxidado.
Será avaliado que outros agentes terapêuticos podem ser substituídos pelos quelantes aqui descritos. Aqueles habilitados na técnica serão capazes de planejar esquemas de conjugação sem experimentação indevida.
Como uma ilustração adicional, um agente terapêutico 30 pode ser anexado na região de dobradiça de um componente de anticorpo reduzido via formação de ponte de dissulfeto. Por exemplo, os peptídeos do toxóide tetânico podem ser construídos com um único resíduo de cisteína que é usado para anexar o peptídeo a um componente de anticorpo. Como uma alternativa, tais peptídeos podem ser anexados ao componente de anticorpo usando um agente de entrecruzamento heterobifuncional, como N-succinil 3-(2- piridilditio)proprionato (SPDP). Yu e cols., Int. J. Cancer 56:244 (1994). Técnicas gerais para tal conjugação são bem conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, Wong, Chemistry Of protein Conjugation and Cross-Linking (CRC Press 1991) ; Upeslacis e cols., "Modification of Antibodies by Chemical Methods," in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch e cols, (eds.), pages 187-230 (Wiley- Liss, Inc. 1995); Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Production, Enineering and Clinical Application, Ritter e cols, (eds.), pages 60-84 (Cambridge University Press 1995) .
Conjugados do anticorpo e agente citotóxico são feitos com o uso de uma variedade de agentes de ligação de proteína bifuncional como N-succinimidil-3-(2- piridilditiol) propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (como HCL de dimetil adipimidato), ésteres ativos (como disuccinimidil suberato), aldeídos (como glutaraldeído), compostos bis- azido (como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bisdiazônio (como bis-(p-diazoniobenzoil)- etilenodiamina), diisocianatos (como tolieno 2,6-diisocianato), e compostos de flúor bis-ativos (como 1,5- difluor-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina de ricina pode ser preparada como descrito em Vitetta e cols., Science 238: 1098 (1987). Ácido 1- isotiocianatobenzil-3metildietileno triaminapentaacético (MX-DTPA) marcado com carbono-14 é um agente quelante de exemplo para conjugação de radionuclídeo ao anticorpo (veja, por exemplo, WO94/11026).
Como acima descrito, porções de carboidrato na região Fc de um anticorpo podem ser usadas para conjugar um agente terapêutico. Entretanto, a região Fc pode ser ausente se um fragmento de anticorpo é usado como o componente de anticorpo do imunoconjugado. Todavia, é possível introduzir uma porção de carboidrato em uma região variável de cadeia leve de um anticorpo ou fragmento de anticorpo. Veja, por exemplo, Leung e cols., J. Immunol. 154:5919 (1995); Hansen e cols., Pat. U.S. No. 5.443.953. a porção construída de carboidrato é então usada para anexar um agente terapêutico.
Além disso, aqueles habilitado na técnica reconhecerão numerosas variações possíveis dos métodos de conjugação. Por exemplo, a porção de carboidrato pode ser usada para anexar polietilenoglicol para estender a meia-vida de um anticorpo intacto, ou fragmento de ligação a antígeno desse, no sangue, linfa, ou outros fluidos extracelulares. Ademais, é possível construir um "imunoconjugado divalente" por anexação de agentes terapêuticos a uma porção de carboidrato e a um grupo sulfidril livre. Tal grupo sulfidril livre pode ser localizado na região de dobradiça do componente de anticorpo.Proteínas de fusão de Anticorpo Anti-M-CSF
A presente invenção contempla o uso de proteínas de fusão que compreendem um ou mais porções de anticorpo anti- M-CSF e uma porção de imunomodulador ou toxina. Métodos de fazer proteínas de fusão de anticorpo são bem conhecidos na 5 técnica. Veja, por exemplo, Patente U.S. Nα : 6.306.393.
Proteínas de fusão de anticorpo que compreendem uma porção de interleucina-2 são descrito por Boleti e cols., Ann. Oncol. 6:945 (1995), Nicolet e cols., Cancer Gene Ther.2:161 (1995), Becker e cols., Proc. Nat'l Acad. Sei. USA 10 93:7826 (1996), Hank e cols., Clin. Cancer Res. 2:1951(1996), e Hu e cols., Cancer Res. 56:4998 (1996). Em adição, Yang e cols., Hum. Antibodies Hybridomas 6:129 (1995), descrevem uma proteína de fusão que inclui um fragmento F(ab')2 e uma porção alfa de fator de necrose 15 tumoral.
Métodos de confecção de proteínas de fusão anticorpo- toxina nos quais uma molécula recombinante compreende um ou mais componentes de anticorpos e uma toxina ou agente quimioterápico também são conhecidos por aqueles 20 habilitados na técnica. Por exemplo, proteínas de fusão de exotoxina A de anticorpo-Pseudomonas foram descritas por Chaudhary e cols., Nature 339:394 (1989), Brinkmann e cols., Proc. Nat'l Acad. Sei. USA 88:8616 (1991), Batra e cols., Proc. Nat'l Acad. Sei. USA 89:5867 (1992), Friedman 25 e cols., J. Immunol. 150:3054 (1993), Wels e cols., Int. J.Can. 60:137 (1995), Fominaya e cols., J. Biol. Chem. 271:10560 (1996), Kuan e cols., Biochemistry 35:2872(1996), e Schmidt e cols., Int. J. Can. 65:538 (1996).
Proteínas de fusão de anticorpo-toxina contendo uma porção 30 de toxina diftérica foram descritas por Kreitman e cols., Leukemia 7:553 (1993), Nicholls e cols., J. Biol. Chem. 268:5302 (1993), Thompson e cols., J. Biol. Chem. 270:28037 (1995), e Vallera e cols., Blood 88:2342 (1996). Deonarain e cols., Tumor Targeting 1:177 (1995), descreveram uma proteína de fusão anticorpo-toxina que tem uma porção RNase, enquanto Linardou e cols., Cell Biophys. 24-25:243 (1994), produziu uma proteína de fusão anticorpo-toxina que compreende um componente de DNase I. Gelonina foi usada como a porção de toxina na proteína de fusão anticorpo- toxina de Wang e cols., Abstracts of the 209th ACS National Meeting, Anaheim, Calif., 2-6 de abril de 1995, Parte 1, BIOT005. Como um exemplo adicional, Dohlsten e cols., Proc. Nat'1 Acad. Sci. USA 91:8945 (1994), relataram uma proteína de fusão anticorpo-toxina que compreende enterotoxina-A de Staphylococcus.
Ilustrativos de toxinas que são adequadamente empregadas ba preparação de tais conjugados são ricina, abrina, ribonuclease, DNase I, enterotoxina-A de Staphylococcus, proteína antiviral de pokeweed, gelonina, toxina diftérica, exotoxina de Pseudomonas e endotoxina de Pseudomonas. Veja, por exemplo, Pastan e cols., Cell 47:641 (1986), e Goldenberg, CA--A Cancer Journal for Clinicians 44:43 (1994). Outras toxinas adequadas são conhecidas 'pr aqueles habilitados na técnica.
Anticorpos da presente invenção também podem ser usados em ADEPT por conjugação do anticorpo a uma enzima de ativação de pró-medicamento que converte um pró-medicamento (por exemplo, um agente quimioterápico de peptidil, veja WO81/01145) a um medicamento ativo anti-câncer. Veja, por exemplo, WO88/07378 e Patente U.S. N° : 4.975.278.
O componente da enzima do imunoconjugado útil para ADEPT inclui qualquer enzima capaz de agir em um pró- medicamento de tal modo a convertê-lo na sua forma mais ativa, citotóxica.
Enzimas que são úteis no método dessa invenção incluem mas não se limitam a fosfatase alcalina útil para converter pró-medicamentos contendo fosfato em medicamentos livres; arilsulfatase útil para converter pró-medicamentos contendo sulfato em medicamentos livres; citosina desaminase útil para converter 5 -fluorcitosina não tóxica no medicamento anti-câncer, 5-fluoruracil; proteases, como protease de serratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidases e catepsinas (como catepsinas B e L) , que são úteis para converter pró-medicamentos contendo peptídeos em medicamentos livres; D-alanilcarboxipeptidases, úteis para converter pró-medicamentos que contêm substituintes de D- aminoácido; enzimas de clivagem de carboidrato como betagalactosidase e neuraminidase úteis para converter pró- medicamentos glicosilados em medicamentos livres; betalactamase úteis para converter medicamentos derivatizados com β-lactamas em medicamentos livres; e penicilina amidases, como penicilina V amidase ou penicilina G amidase, úteis para converter medicamentos derivatizados em seus nitrogénios de amina com grupos fenoxiacetil ou fenilacetil, respectivamente, em medicamentos livres. Alternativamente, anticorpos com atividade enzimática, também conhecidos na técnica como "abzimas", podem ser usados para converter os pró-medicamentos da invenção em medicamentos ativos livres (veja, por exemplo, Massey,1987, Nature 328: 457-458). Conjugados anticorpo-abzima podem ser preparados como aqui descrito para liberação da abzima a uma população de célula tumoral.
As enzimas dessa invenção podem ser ligadas covalentemente aos anticorpos por técnicas bem conhecidas na técnica como o uso dos reagentes de entrecruzamento heterobifunctionais acima discutido. Alternativamente, proteínas de fusão que compreendem pelo menos a região de ligação de antígeno de um anticorpo da invenção ligada a pelo menos uma porção funcionalmente ativa de uma enzima da invenção podem ser construídas usando técnicas de DNA recombinante bem conhecidas na técnica (veja , por exemplo, Neuberger e cols., Nature 312: 604-608 (1984)).
Usos não terapêuticos
Os anticorpos da invenção podem ser usados como agentes de purificação de afinidade para M-CSF ou em ensaios diagnósticos para proteína de M-CSF, por exemplo, detecção de sua expressão em células, tecidos ou soro específicos. Os anticorpos também podem ser usados para ensaios diagnósticos in vivo.
Geralmente, para esses objetivos o anticorpo é rotulado com um radionuclídeo (como 11:LIn, "Tc, 14C, 131I, 12SI, 3H, 32P OU 35S) de forma que o tumor pode ser localizado usando imunocintilografia.
Os anticorpos da presente invenção podem ser empregados em qualquer método de ensaio conhecido, como ensaios de ligação competitiva, ensaios sanduíche diretos e indiretos, como ELISAs e ensaios de imunoprecipitação. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc. 1987). Os anticorpos também podem ser usado para amostras de tumor usando métodos conhecidos na técnica.
Para conveniência, o anticorpo da presente invenção pode ser fornecido em um kit, ou seja, uma combinação embalada de reagentes em quantidades predeterminadas com instruções para realizar o ensaio diagnóstico. Quando o anticorpo é rotulado com uma enzima, o kit incluirá substratos e cofatores necessários pela enzima (por exemplo, um precursor de substrato que fornece o cromóforo ou fluoróforo detectável). Em adição, outros aditivos podem ser incluídos como estabilizantes, tampões (por exemplo, um tampão de bloqueio ou um tampão de lise) e outros. As quantidades relativas dos vários reagentes podem ser amplamente variadas para fornecer concentrações em solução dos reagentes que substancialmente otimizam a sensibilidade do ensaio. Particularmente, os reagentes podem ser fornecidos como pós secos, usualmente liofilizados, incluindo excipientes que em dissolução fornecerão uma solução de reagente que tem a concentração adequada.
A invenção é ilustrada nos exemplos a seguir, que não pretendem de qualquer forma ser limitantes.
EXEMPLOS EXEMPLO 1
Esse exemplo mostra que anticorpos de M-CSF RX1 e 5A1 são específico para espécie e que anticorpos RX1, MCI, e MC3 neutralizam a atividade de M-CSF humano. RX1 é um anticorpo comercialmente vendido que foi disponibilizado mais de um ano antes da data de depósito deste pedido. Fontes comerciais de exemplo incluem, mas não são limitadas a, clones de anticorpo monoclonal anti-M-CSF humano decamundongo 116, 692, e 21 (Anogen) ; clones de anticorpo de M-CSF anti-humano 21113.131, 26730, e 26786 (R & D Systems, Inc.) ; e clone de anticorpo de M-CSF anti-humano M16 (Antigenix America, Inc.).
Para testar a atividade de neutralização de RX1 e 5A1, 5 um ensaio de proliferação de linha de células MNFS-60 foi usado (American Type Culture Collection Accession No. CRL- 183 8, disponível por ATCC in Rockville, MD, USA, derivado de uma leucemia mielógena induzida com o retrovirus ecotrópico de camundongo selvagem Cas-Br-MuLV, responsivas 10 a interleucina 3 e M-CSF e que contêm um c-myb protooncogene truncado causado pela integração de um retrovirus). A proliferação de M-NFS-60 requer M-CSF ativo em um modo dependente de dose. Dessa forma, células M-NFS- 60 foram lavadas e plaqueadas em meio RPMI 1640 com 10% FBS 15 e 3.000 U/ml de M-CSF e 1% Pen/Strep. M-CSF recombinante humano (em concentração final de 10 ng/ml), humano ou murídeo-específico, foi incubado com várias concentrações de anticorpos por 1 hora a 37°C em 5% CO2 em uma incubadora. Após a incubação, a mistura foi adicionada à 20 cultura de M-NFS-60 em placas de microtítulo de 96 cavidades. O volume de ensaio total por cavidade foi de 10 ng/ml, com 10 ng/ml M-CSF, e a concentração de anticorpo indicada na Figura 5. Células foram incubadas a 37°C sob 5% CO2 por 72 horas antes dos números de células serem 25 quantificados por ensaio CellTiter Glo (Promega). Os ensaios anteriormente mencionados foram repetidos para anticorpos MC3 e MCI.
Como mostrado na Figura 5, anticorpos de M-CSF RX1 e 5A1 são específicos para espécie. A proliferação celular é 30 apresentada como a leitura fluorescente do ensaio CellTiter Glo, que é linear com o número de células. A atividade de neutralização específica para espécie de RX1 e 5A1 é mostrada por sua capacidade para inibir M-NFS-60 na presença de M-CSF humano ou de murídeo. Finalmente, como 5 mostrado na Figura 5B, anticorpos MC3 e MCI são também inibidores eficazes da atividade de M-CSF.
EXEMPLO 2
Esse exemplo mostra que anticorpo RX1 inibe eficazmente a osteólise em um modelo de xenoenzerto humano 10 em uma dose de 5mg/kg. Camundongos desnudos fêmeas na idade de 4-7 semanas, com peso médio de ~20g foram usados nesse estudo. Células tumorais (MDA-MB-231, 3xl05) suspensas em 10 μl de solução salina foram injetadas na cavidade da medula óssea da tíbia direita. Radiografias das pernas 15 foram feitas um dia após a inoculação do tumor para se ter uma imagem básica e checagem por fraturas ósseas causadas pela injeção. Os camundongos foram randomizados em grupos de tratamento em 10 camundongos por grupo incluindo PBS e RX1 a 5 mg/kg, injetados por via i.p. uma vez por semana 20 por 6 semanas. Ao final do estudo, radiografias dos membros foram feitas novamente e comparadas contra as de base para dano ósseo. 0 grau de dano ósseo causado pelo tumor foi definido como mostrado na Figura 6. O grupo com tratamento de RX1 a 5 mg/kg mostrou proteção estatisticamente 25 significativa do osso de dano causado pelo tumor.
EXEMPLO 3
Esse exemplo mostra que o número de metástases é reduzido quando anticorpo RX1 é administrado a camundongo desnudo que porta MDA-MB-231 de câncer de mama humano em 30 uma concentração de 5 mg/kg.
Camundongos desnudos femeas na idade de 4-7 semanas, com peso médio de ~20g foram usados nesse estudo. Células tumorais (MDA-MB-231, 3xl05) suspensas em 10 μl de solução salina foram injetadas na cavidade da medula óssea da tíbia direita. Radiografias das pernas foram feitas um dia após a inoculação do tumor para se ter uma imagem básica e checagem por fraturas ósseas causadas pela injeção. Os camundongos foram randomizados em grupos de tratamento incluindo PBS e RX1 a 5 mg/kg, injetados por via i.p. uma vez por semana por 6 semanas. Ao final do estudo, os pulmões de cada grupo de tratamento foram coletados e fixados em solução de Bouin para contagem de nódulos pulmonares metastáticos.
Como mostrado na Figura 7, o número de metástases é reduzido quando o anticorpo RX1 é administrado a camundongo desnudo que porta MDA-MB-231 de câncer de mama humano em uma dose de 5 mg/kg.
EXEMPLO 4
Esse exemplo apresenta um procedimento para humanização do anticorpo RX1. 5H4, MCI e MC3 são humanizados usando procedimentos similares.
Desenho de genes para cadeias leve e pesadas de RX1 humanizado
A seqüência de nucleotídeos e de aminoácidos para RX1 de murídeo são apresentadas na Figura 4B. A seqüência de um anticorpo humano identificado usando o National Biomedical Foundation protein Identification Resource ou banco de dados similar é usada para fornecer a estrutura do anticorpo humanizado. Para selecionar a seqüência da cadeia pesada humanizada, a seqüência de cadeia pesada de RX1 de murídeo é alinhada com a seqüência da cadeia pesada do anticorpo humano. Em cada posição, o aminoácido de anticorpo humano é selecionado para a seqüência humanizada, a menos que essa posição esteja em uma de quatro categorias 5 definidas abaixo, em cujo caso o aminoácido de RX1 de murídeo é selecionado: (1) a posição está em uma região de determinação de complementaridade (CDR), como definido por Kabat, J. Immunol., 125, 961-969 (1980); (2) o aminoácido de anticorpo humano é raro para cadeias pesadas humanas naquela posição, enquanto o aminoácido de RX1 de murídeo é comum para cadeias pesadas humanas naquela posição; (3) a posição é imediatamente adjacente a uma CDR na 15 seqüência de aminoácidos da cadeia pesada de RX1 de murídeo; ou q(4) modelagem tridimensional do anticorpo de RX1 de murídeo sugere que o aminoácido é fisicamente próximo á região de ligação de antígeno.
Para selecionar a seqüência da cadeia leve humanizada, a seqüência de cadeia leve de RX1 de murídeo é alinhada com a seqüência da cadeia leve de anticorpo humano. O aminoácido de anticorpo humano é selecionado em cada posição para a seqüência humanizada, a menos que a posição 25 esteja novamente em uma das quatro categorias acima descritas e repetidas abaixo: (1) CDR's; (2) aminoácido de RX1 de murídeo mais típico que anticorpo humano; (3) Adjacente a CDR's; ou (4) Possível proximidade tridimensional à região de ligação.
A seqüência de nucleotídeos real dos genes de cadeia pesada e leve é selecionada como se segue: (1) as seqüências de nucleotídeos codificam para as seqüências de aminoácidos escolhidas como acima descrito; (2) 5' dessas seqüências codificadoras, as seqüências de nucleotídeos codificam para uma seqüência líder (sinal). Essas seqüências líderes foram escolhidas como típicas de 10 anticorpos; (3) 3' das seqüências codificadoras, as seqüências de nucleotídeos são as seqüências que seguem o segmento J5 de cadeia leve de camundongo e o segmento J2 de cadeia pesada de camundongo, que são parte da seqüência de RX1 de 15 murídeo. Essas seqüências são incluídas porque elas contêm sinais doadores de junção; e (4) em cada extremidade da seqüência está um sítio Xba I para permitir o corte nos sítios Xba I e clonagem no sítio Xba I de um vetor.Construção de genes de cadeia leve e pesada humanizados
Para sintetizar a cadeia pesada, quatro oligonucleotídeos são sintetizados usando um sintetizador de DNA Applied Biosistemas 380B. Dois dos oligonucleotídeos são parte de cada filamento da cadeia pesada, e cada 25 oligonucleotideo sobrepõe o próximo em cerca de 20 nucleotídeos para permitir anelamento. Juntos, os oligonucleotídeos sobre a região variável da cadeia pesada humanizada inteira com uns poucos nucleotídeos extra em cada extremidade para permitir o corte nos sítios Xba I. Os 30 oligonucleotídeos são purificados de géis de poliacrilamida.
Cada oligonucleotídeo é fosforilado usando polinucleotídeo quinase ATP e T4 por procedimentos padrão (Maniatis e cols., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 5 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,N.Y. (1989)). Para anelar os oligonucleotideos fosforilados, eles são suspensos juntos em 40 ul de TA (33 mM Tris acetato, pH 7,9, 66 mM acetato de potássio, 10 mM acetato de magnésio) em uma concentração de cerca de 3,75 uM cada, aquecidos a 95°C por 4 minutos e resfriados lentamente a 4 °C. Para sintetizar o gene completo dos oligonucleotideos por síntese do filamento oposto de cada oligonucleotídeo, os seguintes componentes são adicionados em um volume final de 100 ul: 10 ul oligonucleotideos anelados 0,16 mM cada desoxirribonucleotídeo 0,5 mM ATP 0,5 mM DTT 100 ug/ml BSA 3,5 ug/ml T4 g43 proteína (DNA polimerase) 25 ug/ml T4 g44/62 proteína (proteína acessória de polimerase) 2 5 ug / ml proteína 45 (proteína acessória de polimerase)
A mistura é incubada a 37°C por 30 minutos. Então 10 u de T4 DNA ligase é adicionado e incubação a 3 7°C é renovada por 30 minutos. A polimerase e ligase são inativadas por incubação da reação a 70°C por 15 m. Para digerir o gene com Xba I, 50 ul de 2 X TA contendo BSA a 200 ug/ml e DTT a 1 mM, 43 ul de água, e 50 u de Xba I em 5 ul é adicionado à reação. A reação é incubada por 3 hr a 3 7 °C, e então purificada em um gel. 0 fragmento de Xba I é purificado de um gel e clonado no sítio Xba I do plasmídeo pUC19 por métodos padrão. Plasmídeos são purificados usando técnicas 5 padrão e seqüenciados usando o método didesoxi.
A construção de plasmídeos para expressar cadeias leves e pesadas humanizadas é realizada por isolação da fragmentos de Xba I de cadeia leve e pesada do plasmídeo pUC19 no qual eles foram inseridos e então inserção deles 10 no sítio Xba I de uma vetor de expressão adequado que irá expressar altos níveis de uma cadeia pesada completa quando transfectados em uma célula hospedeira adequada.
Síntese e afinidade de anticorpo humanizado
Os vetores de expressão são transfectados em células 15 Sp2/0 de camundongo, e células que integram os plasmídeos são selecionadas com base no marcador selecionável(s) conferido pelos vetores de expressão por métodos padrão. Para verificar que essas células secretaram anticorpo que se liga a M-CSF, sobrenadante das células são incubados com 20 células que são conhecidas por expressar M-CSF. Depois da lavagem, as células são incubadas com anticorpo anti-humano de cabra conjugado a fluoresceína, lavadas, e analisadas para fluorescência em um citofluorômetro FACSCAN.
Para os próximos experimentos, células que produzem o 25 anticorpo humanizado são injetadas em camundongos, e a ascite resultante é coletada. Anticorpo humanizado é purificado até homogeneidade da ascite por passagem através de uma coluna de afinidade de anticorpo de imunoglobulina anti-humano de cabra, preparado em um suporte Affigel-10 30 (Bio-Rad Laboratories, Inc., Richmond, Calif.) de acordo * com técnicas padrão. Para determinar a afinidade do anticorpo humanizado em relação ao anticorpo original RX1 de murídeo, um experimento de ligação competitiva é « realizado de acordo com técnicas conhecidas na prática.
EXEMPLO 4A
Esse exemplo descreve a clonagem e expressão de anticorpos Human Engineered™ RX1, assim como purificação de tais anticorpos e teste para atividade de ligação. Anticorpos Human Engineered™ 5H4, MCI, e MC3 são 10 preparados usando procedimentos similares.
Desenho de seqüências de Human Engineered™
Human EngineeringTM de domínios variáveis de anticorpo foi descrito por Studnicka [veja, por exemplo, Studnicka e cols. Patente U.S. N° : 5.766.886; Studnicka e cols.
Protein Engineering 7: 805-814 (1994)] como um método para redução da imunogenicidade enquanto é mantida a atividade de ligação das moléculas de anticorpo. De acordo com o método, cada aminoácido de região variável recebeu um risco de substituição. Substituições de aminoácido são 2 0 distinguidas por uma de três categorias de risco: (1) modificações de risco baixo são aquelas que têm o maior potencial para reduzir a imunogenicidade com a menor chance de romper a ligação do antígeno; (2) modificações de risco moderado são aquelas que também reduzem a imunogenicidade, 25 mas têm uma maior chance de afetar a ligação do antígeno ou dobra da proteína; (3) resíduos de alto risco são aqueles que são importantes para ligação ou para manter a estrutura do anticorpo e carregam o maior risco de afetar a ligação do antígeno ou dobra da proteína. Pelo papel estrutural 30 tridimensional de prolinas, modificações nas prolinas são geralmente consideradas como sendo mudanças de riso pelo menos moderado, mesmo se a posição é tipicamente uma posição de risco baixo. Modificações de substituição são preferidas mas inserções e deleções também são possíveis.
Figuras 4B e 4C mostram a determinação de risco para cada resíduo de aminoácido de cadeias leves e pesadas de RX1 de murídeo, respectivamente, categorizadas como mudança de risco alto, moderado ou risco baixo.
Regiões variáveis das cadeias leves e pesadas do 10 anticorpo RX1 de murídeo foram Human Engineered™ usando esse método. Resíduos de aminoácido que são candidatos para modificação de acordo com o método nas posições de risco baixo foram identificados por alinhamento das seqüências de aminoácidos das regiões variáveis de murídeo com uma 15 seqüência de região variável humana. Qualquer região variável humana podem ser usada, incluindo uma seqüência individual VH ou VL ou uma seqüência humana de consenso VH ou VL. Os resíduos de aminoácido em qualquer número de posições de risco baixo, ou em todas as posições de risco 20 baixo, podem ser trocadas. Para a seqüência de cadeia pesada de risco baixo de Human Engineered™ nas Figuras 19A-B, Vh2 humano de consenso (baseado em Kabat) foi usado como o modelo, e para cada posição onde os resíduos de aminoácido de murídeo e humanos diferiram em posições de 25 risco baixo, uma modificação de aminoácido foi introduzida que substituiu o resíduo de murídeo por um resíduo humano. Para a seqüência de cadeia leve de risco baixo de Human Engineered™ nas Figuras 20A-B, kapa 3 humano de consenso (baseado em Kabat) foi usado como o modelo, e para cada 30 posição onde os resíduos de aminoácido de murídeo e humanos diferiram em posições de risco baixo, uma modificação de aminoácido foi introduzida que substituiu o resíduo de murídeo por um resíduo humano. Um total de 16 modificações de aminoácido de risco baixo foram feitas à cadeia leve e 8 5 modificações de risco baixo foram feitas à cadeia pesada.
De modo similar, resíduos de aminoácido que são candidatos para modificação de acordo com o método em todas as posições de risco baixo e moderado foram identificados por alinhamento das seqüências de aminoácidos das regiões 10 variáveis de murídeo com uma seqüência de região variável humana. Os resíduos de aminoácido em qualquer número de posições de risco baixo ou moderado, ou em todas as posições de risco baixo ou moderado, podem ser trocados. Para a seqüência de cadeia pesada de Human Engineered™ nas 15 Figuras 19A-B, Vh2 humano de consenso (baseado em Kabat) foi usado como o modelo, e para cada posição onde os resíduos de aminoácido de murídeo e humanos diferiram em posições de risco baixo ou moderado, uma modificação de aminoácido foi introduzida que substituiu o resíduo de 20 murídeo por um resíduo humano. Para a seqüência de cadeia leve de Human Engineered™ nas Figuras 20A-B, kapa 3 humano de consenso (baseado em Kabat) foi usado como o modelo, e para cada posição onde os resíduos de aminoácido de murídeo e humanos diferiram em posições de risco baixo ou moderado, 25 uma modificação de aminoácido foi introduzida que substituiu o resíduo de murídeo por um resíduo humano. Um total de 19 modificações de aminoácido de risco baixo e moderado foram feitas à cadeia leve e 12 modificações de risco baixo e moderado foram feitas à cadeia pesada.
Uma seqüência de cadeia leve de "risco baixo alternativa" também foi preparada como mostrado nas Figuras 21A-B, nas quais a modificação na posição 54 foi revertida para murídeo. Uma seqüência de cadeia leve de "risco baixo e moderado alternativa" também foi preparada como mostrado 5 nas Figuras 21A-B, nas quais a modificação nas posições 5456 foram revertidas para murídeo.
Finalmente, uma seqüência de região V de cadeia leve de "risco baixo e moderado" de Human Engineered™ Uma seqüência de cadeia leve de "risco baixo e moderado 10 alternativa produzida usando linha germinativa humana VK6 subgrupo 2-1-(1) A14 como o modelo, como mostrado nas Figuras 22A-B.
Também contemplada pela presente invenção é a retenção de aminoácidos 41-43 (NGS) da Figura 4A que representam o 15 sítio de glicosilação. Alternativamente, apenas um ou dois dos aminoácidos 41-43 (por exemplo, NG) podem ser retidos.
Preparação de Vetores de para desenvolvimento de linhas de células permanentes
Fragmentos de DNA que codificam cada um das seqüência de 20 região V de cadeia leve e pesada acima descritas junto com seqüência sinalizadoras derivadas de anticorpo foram construídas usando síntese de nucleotídeo sintético. DNA que codifica cada uma das seqüências de aminoácidos de região V de cadeia leve acima descritas foram inseridas no 25 vetor pMXPlO contendo a região constante de cadeia leve humana Kapa. DNA que codifica cada uma das seqüências de aminoácidos de região V de cadeia pesada acima descritas foram inseridas no vetor pMXP6 contendo a região constante de cadeia pesada humana Gama-2. Vetores adicionais foram 30 construídos contendo as seqüências de aminoácidos de região de cadeia pesada fundidas às regiões constantes humana Gama-1 (cDNA) e Gama-4 (e cDNA genômico) tendo seqüências apresentadas nas Figuras 29A, 29b, e 30. Todos esses vetores contêm um promotor de hCMV e uma região não 5 traduzida 3' de cadeia leve kapa de camundongo assim como genes de marcador selecionável como neo ou his para seleção de transfectantes resistentes a G418 ou histidinol, respectivamente. Os vetores de cadeia leve e pesada são descritos nas Tabelas 2 e 3, respectivamente.
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Vetores que compreendem os genes desejados de cadeia leve e pesada de Human Engineered (Gama-1, Gama-2 e Gama-4) foram então construídos. Esses vetores "2-Gene" contêm genes que codificam cada cadeia de anticorpo, pesada e 5 leve, sob controle do promotor hCMV, doador de junção CMV, receptor de junção SV4 0 16S e o DNA não traduzido 3' de cadeia leve kapa de camundongo incluindo o sítio poliA. Eles também contêm um gene de marcador selecionável como neo ou his e o gene de resistência a ampicilina. Vetores 10 contendo ambos genes de cadeia pesada e leve são descritos na Tabela 4. Vetores que compreendem duas cópias de cada gene de cadeia leve e pesada (quatro vetores de gene) também podem ser construídos.
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Preparação de Vetores de expressão para Expressão Transitória
Vetores contendo ou os genes de cadeia leve ou de cadeia pesada acima descritos também foram construídos para 5 transfecção transitória. Esses vetores são similares àqueles descritos acima para transfecções permanentes exceto pelo fato de em vez dos genes neo ou his, eles conterem oriP de vírus de Epstein-Barr para replicação em células HEK293 que expressam o antígeno nuclear do vírus de 10 Epstein-Barr. Os vetores para transfecção transitória são descritos nas Tabelas 5 e 6.
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Expressão transitória de "Human-Engineered" RX1 em Células HEK293E
Vetores separados cada um contendo oriP do vírus de 5 Epstein-Barr e os genes de cadeia leve ou cadeia pesada acima descritos foram transfectados transitoriamente em células HEK293E. Células transfectadas transitoriamente foram deixadas para incubar por até 10 dias após o que o sobrenadante foi recuperado e o anticorpo purificado usando 10 cromatografia de proteína A. As proteínas produzidas por transfecção transitória de células 293E são descritas na Tabela 7 abaixo.
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Desenvolvimento de células CHO-K1 Permanentemente Transfeetadas
Os vetores acima descritos (Tabela 4) contendo uma cópia de cada um dos genes de cadeia pesada e leve são transfectados em células CHO-K1 adaptadas a Ex-Cell 302. Células CHO-K1 adaptadas a crescimento em suspensão em meio Ex-Cell 302 são tipicamente eletroporadas com 40 ug de vetor linearizado. Alternativamente, DNA linearizado pode ser complexado com polietilenoimina linear (PEI) e usado para transfecção. As células são plaqueadas em placas de 96 cavidades contendo meio Ex-Cell 302 suplementado com 1% FBS e G418. Clones são rastreados em placas de 96 cavidades e -10% dos clones de cada transfecção são transferidos para placas de 24 cavidades contendo meio Ex-Cell 302.
Um teste de produtividade é realizado em placas de 24 cavidades em meio Ex-Cell 302 para culturas que crescem por 7 e 14 dias em cujos tempo os sobrenadantes da cultura são testados para níveis de anticorpo secretado por um ensaio de ELISA de imunoglobulina para IgG.
Os clones superiores são transferidos para frascos de agitação contendo meio Ex-Cell 302. Assim que as células estão adaptadas ao crescimento em suspensão, um teste de frasco de agitação é realizado com esses clones em meio ExCell 302. As células crescem por até 10 dias em frascos de Erlenmeyer de 125 ml contendo 25 ml de meio. Os fracos são abertos pelo menos em dias alternados do período de incubação para permitir troca de gás e os nos níveis de polipeptídeo de imunoglobulina no meio de cultura são determinados por ELISA de IgG ao final do período de incubação. Transfecções seqüenciais múltiplas da mesma linha de células com dois ou três vetores de transcrição de multi-unidade resultam em clones e linhas de células que exibem aumentos nos níveis de produção de imunoglobulina, preferivelmente para 300 μg/ml ou mais.
Purificação
Um processo para a purificação de polipeptídeos de imunoglobulina a partir de vetores e todas as linhas de acordo com a invenção podem ser projetados. De acordo com métodos bem conhecidos na técnica, células são removidas por filtração após terminação. 0 filtrado é colocado em uma coluna de proteína A (em múltiplas passagens, se necessário). A coluna é lavada e então os polipeptídeos de imunoglobulina expressos e secretados são eluídos da coluna. Para preparação de produto de anticorpo, um conjunto de proteína A é mantido em um pH baixo (pH 3 por um mínimo de 30 minutos e um Maximo de uma hora) como uma etapa de inativação virai. Uma etapa de troca catiônica adsortiva é usada a seguir para também purificar o produto. 0 produto de eluição da coluna de separação adsortiva é passado através de um filtro de retenção de vírus para fornecer clearance adicional de partículas virais potenciais. 0 filtrado é também purificado por passagem através de uma coluna de troca aniônica na qual o produto não se liga. Finalmente, o processo de purificação é concluído por transferência do produto para o tampão de formulação através de diafiltração. 0 material retido é ajustado a uma concentração de proteína de pelo menos 1 mg/mL e um estabilizante é adicionado.
Atividade de Ligação
A atividade de ligação MCSF dos Anticorpos recombinantes Human Engineered™ é avaliada. Proteína é purificado de sobrenadantes de cultura do frasco de agitação por passagem por uma proteína uma coluna seguida por determinação de concentração por A280. Ensaios de ligação são realizados como descrito no Exemplo 1 acima ou 12 abaixo. Placas de Immulon II são pré-revestidas com o antígeno sM-CSF pré-diluído em uma solução de revestimento de PBS para imobilizá-la à microplaca. Várias concentrações de teste de M-CSF que variam de 0,25 a 20 ug/ml são adicionadas a 50 ul/cavidade e incubadas a 4°C de um dia para o outro. As placas são então lavadas 3 vezes com PBS- 0,05% Tween. O bloqueio é realizado por adição em PBS-0,05% Tween 1% BSA seguido por uma incubação por 3 0 minutos a 3 7 °C. Diluições de polipeptídeos de imunoglobulina são preparadas em solução PBS-0,05% Tween 1% BSA. Diluições seriadas de 2 ou 3 vezes são preparadas e adicionadas (100 ul/cavidade) em duplicata ou triplicata. Depois de 90 minutos de incubação a 37°C, a microplaca é lavada 3 vezes com PBS-0,05% Tween. Para desenvolvimento de sinal, anticorpo secundário de IgG anti-humana de cabra (gama- ou Fc-específica) conjugado a peroxidase é adicionado a cada cavidade e incubado por 60 minutos a 37 °C seguido pela adição de OPD a 0,4 mg/ml em tampão de citrato mais 0,012% H202. Depois de 5-10 minutos em temperatura ambiente o ensaio é interrompido pela adição de 100 ul 1M H2SO4 e as placas são lidas a 490nm. Ambos anticorpos IgG anti-humana de cabra (gama-específico) e IgG anti-humana de cabra (Fc- específico) foram empregados.
EXEMPLO 5
Os seguintes exemplo apresentam um procedimento para o tratamento de humanos que usa Anticorpo específico para M- CSF, como anticorpo derivado de RX1 ou de competição de RX1, incluindo um Anticorpo Human Engineered™ RX1 com uma região constante de IgGl ou IgG4 modificada ou não modificada. O procedimento também pode ser seguido para um anticorpo derivado de MCI ou MC3 ou de competição de MCI ou MC3. A faixa de dose de eficácia esperada é de 2 ug/kg a 10 mg/kg. Essa estimativa é baseada no seguinte argumento substanciado por dados experimentais:
O nível medido de M-CSF em plasma humano (pacientes saudáveis e com câncer de mama) é de cerca de 1 ng/ml. anticorpo RX1 que neutraliza M-CSF tem uma EC50 medido de 2 ng/ml contra 1 ng/ml de M-CSF humano. Portanto, a concentração eficaz do anticorpo em plasma humano é de 10 a 50.000 vezes sobre sua EC50, ou seja, 20 ng/ml a 100 ug/ml anticorpo em plasma humano. Baseado em estudos de PK, para efetuar essa concentração em pacientes humanos, uma dosagem de 2 μg/kg a 10 mg/kg é necessária para atingir concentração de anticorpo de 20 ng/ml a 100 ug/ml no plasma.
EXEMPLO 6
Esse exemplo apresenta um procedimento para a avaliação da atividade anti-câncer do anticorpo anti-M-CSF monoclonal em um modelo subcutâneo. Exemplo 2 acima mostrou que o tratamento com anticorpo monoclonal anti-M-CSF inibiu significativamente o crescimento tumoral na medula óssea. O objetivo desse estudo é o de avaliar se o anticorpo também pode inibir o crescimento tumoral em tecido mole. Camundongos fêmeas nu/nu com idade de 10 semanas, peso médio de ~20g serão usados para esse estudo. Os camundongos passaram por um período de aclimação de pelo menos 7 dias antes do início do estudo. No dia 0, o flanco direito dos camundongos desnudos será injetado com células SW620 de câncer de cólon humano por via subcutânea em 5xlOε células por camundongo por 100μl. Quando o volume do tumor atinge 100-200 mm3 (usualmente 1 semana depois da inoculação do tumor), os camundongos serão randomizados em 5 grupos com 10 camundongos por grupo como se segue: 1) PBS 2) RX1 3) 5A1 4) isotipo mlgGl+rlgGl controle Ab 5) 5A1+RX1
Os camundongos serão tratados por via intraperitoneal com os anticorpos designados a lOmpk uma vez por semana por 4 semanas. Quando o volume do tumor atingir 2.000 mm3, o estudo será terminado. Alternativamente, os animais serão sacrificados quando qualquer uma das seguintes situações forem encontradas: ulceração da superfície tumoral é maior que 30% da área de superfície total do tumor, significante perda de peso corporal (>20%), desidratação e agonizante. Sangue total será coletado de todos os camundongos e a população de monócitos será analisada como um marcador substituto potencial. O crescimento/tamanho do tumor será medido por análise 2-D. As medições da largura e comprimento do tumor serão usadas para calcular o volume do tumor. Espera-se que o crescimento do tumor em tecido mole seja inibido como um resultado do experimento anterior.
EXEMPLO 7
O exemplo a seguir apresenta um procedimento para a avaliação de terapia de combinação para o tratamento e prevenção de doença osteolítica severa associada a metástase de câncer.
Desenho Experimental. O estudo descrito no Exemplo 5 acima é repetido essencialmente como descrito com as seguintes exceções. Em adição ao anticorpo ou combinação de anticorpo apresentada nos grupos de tratamento abaixo, os animais receberão um dos seguintes tratamentos adicionais: 1. Bisfosfonato (por exemplo, Aredia; Zometa; Clodronato). 2. cirurgia 3. Radiação 4. quimioterapia 5. terapia hormonal (por exemplo, Tamoxifen; terapia anti- Androgênio) 6. terapia com anticorpo (por exemplo, anticorpos neutralizantes RANKL/RANK; anticorpo neutralizante PTHrP) 7. terapia com proteína terapêutica (por exemplo, receptor solúvel RANKL; OPG, e inibidores de PDGF e MMP) 8. terapia de medicamento de molécula pequena (por exemplo, inibidor de Src-quinase) 9. terapia de oligonucleotídeos (por exemplo, RANKL ou RANK ou PTHrP Anti-senso) 10. terapia de gene (por exemplo, inibidores de RANKL ou RANK) 11. terapia de peptídeo (por exemplo muteínas de RANKL)
Os grupos de tratamento são como se segue. Os tratamentos adicionais acima são indicados abaixo como "mais terapia X": 1. PBS apenas 2. tratamento com terapia X apenas 3. isotipo IgGl de rato de controle 4. isotipo IgGl de murídeo de controle 5. RX1 anti-MCSF humano apenas 6. IgGl de rato 5A1 anti-MCSF de camundongo apenas 7. combinação de controle de isotipo IgGl de rato e IgGl de murídeo 8. RX1 uma combinação 5A1 9. controle de isotipo IgGl de rato mais terapia X 10. isotipo IgGl de murídeo de controle mais terapia X 11. RX1 anti-MCSF humano mais terapia X 12. IgGl de rato 5A1 anti-MCSF de camundongo mais terapia X 13 . combinação de controle de isotipo IgGl de rato e IgGl de murídeo mais terapia X 14. combinação RX1 e 5A1 mais terapia X Dosagem: 0,1-30 mg/kg de cada anticorpo é usado para administração a cada animal. A dosagem preferida é 10 mg/kg. A via de administração pode ser IV, IP, SC. A via preferida é IP. Tratamento iniciará no dia após a injeção de células tumorais, como descrito no Exemplo 5, acima. Medições. Para avaliar a severidade de osteólise entre os vários grupos de tratamento, cada camundongo recebe uma imagem de base Faxitron feita no dia após a injeção de células tumorais. A imagem Faxitron também é feita ao final do estudo (8 semanas). O crescimento do tumor é simultaneamente medido usando o sistema Xenogen uma vez que as células tumorais expressam luciferase. Espera-se que a terapia de combinação para o tratamento e prevenção de doença osteolítica severa associada a metástase de câncer será melhorada em relação à terapia de anticorpo isolado.
EXEMPLO 8
O exemplo a seguir fornece um protocolo para avaliação da capacidade de anticorpo M-CSF-especifico de se ligar, por exemplo, a células de câncer de mama (linha de células MDA231) ou células de câncer de mieloma múltiplo (linha de células ARH77) usando um separador de células ativado por fluorescência.
As células foram lavadas duas vezes com PBS (nenhum Ca2+, Mg2+) . Para cada placa de 10 cm, 2 ml de 3 mM EDTA foram adicionados, e as placas foram incubadas a 37°C por 2-3 minutos, até que as células estivessem arredondadas e começassem a se desprender da placa. A seguir, 10 ml de tampão A (PBS + 5% FBS) foram adicionados e misturados. Nesse momento, as células foram peletisadas e ressuspensas a cerca de 5xl06 células/ml em PBS+5% FBS e as células foram colocadas em túbulos a 100 μl/amostra.
Nesse momento, 0,1-10 ug/ml do anticorpo primário (usado na concentração indicada de anticorpo de M-CSF ou anticorpo controle) foi adicionado. Diluição, se necessária, foi feita em 5% FBS/PBS. A mistura foi então incubada por 3 0 minutos a 4°C. Após o período de incubação, as células foram lavadas 3 vezes por centrifugação a 400 g por 5 minutos e as células foram ressuspensas em PBS.
O anticorpo anti-IgG rotulado com FITC ou PE (0,25 ug/amostra) foi diluído em 1% BSA/PBS na diluição ótima, e as células foram ressuspensas nessa solução e incubadas por 30 minutos a 4°C. A seguir, as células foram lavadas 3 vezes como acima descrito. Após as lavagens das células, as células foram ressuspensas com 0,5 ml/amostra PI-PBS (se necessário para distinguir células mortas de vivas). As células também podem ser fixadas para análise posterior (as células podem durar cerca de 3 dias se elas forem fixadas com 0,1% formaldeído) . As células foram analisadas em um FACS ativo por fluorescência usando procedimentos padrão.
Como mostrado na Figura 8A e 8B, um anticorpo RX1 MCSF-específico ligado a linha de células de câncer de mama 5 MDA231 ou a linha de células de câncer de mieloma múltiplo câncer ARH77 em uma variedade de concentrações de anticorpo como indicado.
EXEMPLO 9
O exemplo a seguir mostra que M-CSF é prevalente em 10 inúmeras superfícies celulares de câncer. Coloração imunohistoquímica de M-CSF foi realizada usando um anticorpo RX1 M-CSF-específico como se segue.
No início, lâminas foram aquecidas em um forno a 55- 60QC por 1 hora e deixadas para resfriar por 2-3 minutos. 15 Os parâmetros a seguir de retirada da cera e reidratação foram usados: a. Xileno 3 X 5 minutos b. 100% Reagente i Álcool 2 X 5 minutos c. 95% Reagente Álcool 2 X 4 minutos d. 75% Reagente Álcool 2 X 3 minutos e. 50% Reagente Álcool 1 X 3 minutos 9- dl H2O 2 — 3 enxagúes rápidos
Antes da etapa de bloqueio de peróxido, a recuperação do antígeno foi preparada usando 1 x Biogenex Citra Plus. A 25 solução foi colocada inicialmente em microondas em potência total até ebulição. Uma vez atingida a ebulição da solução, o microondas foi rapidamente ajustado para mais 13 min em nível de potência 2, e deixado para resfriar antes de prosseguir. A etapa de bloqueio de peróxido foi realizada 30 como se segue. As lâminas foram imersas em 3% H2O2 (25 ml 3 0% a 250 ml di H2O) e colocadas em temperatura ambiente por 10 minutos. As lâminas foram enxaguadas a seguir 2x com dl H2O, e lavadas com 1 X PBS 2x2 minutos.
O procedimento de bloqueio de avidina/biotina foi realizado como se segue. As lâminas foram colocadas na horizontal em uma prateleira de metal. Uma caneta Blue PAP foi usada (marcador de lâmina hidrofóbico) ao redor do tecido. A seguir, 2 gotas de Zymed Avidina (Reagente A ) , suficiente para cobri o tecido, foram adicionadas e as lâminas foram incubadas em temperatura ambiente por 10 minutos. Após a incubação, as lâminas foram lavadas como se segue: Lavagens 2x3 minutos em 1 X PBS.2 gotas Zymed Biotina (Reagente B) , temperatura ambiente por 10 min.Lavagens 2x3 minutos em 1 X PBS.
O procedimento de bloqueio da proteína foi realizado como se segue. Primeiro, 10% de soro [em uma concentração final de 2 %] de espécies de anticorpo secundário foi adicionado. 0 BioGenex Power Block foi diluído a seguir a 1 X com dl H20. A prateleira de lâminas foi imersa em Power Block por 8 min em temperatura ambiente e as lâminas foram enxaguadas 2x em IX PBS.
Para a adição do anticorpo primário (RX 1), as lâminas foram colocadas na horizontal em uma prateleira de metal. Anticorpo foi adicionado para cobrir cada seção (~350 μl), e o anticorpo foi espalhado com a ponta da pipeta (se necessário) sem esfregar o tecido. As lâminas foram então incubadas por 1 hora em temperatura ambiente. Após a incubação, as lâminas foram lavadas 3 x com 1 x PBS 3-5 minutos cada vez. Nesse ponto, BioGenex Multi-Link foi aplicado a seções e incubado por 10-11 minutos em temperatura ambiente. As seções foram então lavadas 3 minutos cada vez.
Rotulagem foi realizada por aplicação de rótulo BioGenex HRP a seções, que foram então incubadas em temperatura ambiente por 10-11 min e lavadas com 1 x PBS 3 x 3 minutos. A seguir, BioGenex H2O2 substrato foi adicionado (1 gota AEC para cada 2,5 ml H2O2) às seções e incubado em temperatura ambiente por 10 min. As seções foram então enxaguadas várias vezes com dl H20. A etapa de contra-coloração foi realizada como se segue. As seções foram coradas com hematoxilina por 1 minuto em temperatura ambiente. A seguir, as seções foram enxaguadas com H2O duas vezes, e então incubadas em 1 X PBS por 1 minuto. As seções foram então bem enxaguadas com H2O para remover PBS. As seções foram montadas por aplicação de uma gota de BioGenex Super Mount à seção e então secas ao ar por toda a noite em temperatura ambiente.
Como mostrado na Figura 9, M-CSF é prevalence em inúmeras superfícies celulares de câncer. Seções para os tipos de célula de câncer indicados foram pontuados como se segue: 0 nenhuma coloração 1 coloração foi similar a de base 2 Positiva, mas coloração fraca 3 Positiva e coloração significance 4 Positiva e coloração forte
EXEMPLO 10
O exemplo a seguir mostra o procedimento para produção de anticorpos MCI e MC3 . MCI e MC3 são dois anticorpos monoclonais de murídeo que neutralizam anticorpo de M-CSF humano e se ligam a M-CSF humano. As seqüências de aminoácidos desses anticorpos são mostradas nas Figuras 14 e 15, respectivamente. Eles foram identificados por uma série de etapas incluindo a) imunização de camundongos Balb C com M-CSF recombinante humano; b) rastreamento por clones positivos que produzem anticorpos que se ligam a M- CSF humano em um formato de ELISA; c) subclonagem de clones positivos para gerar clones de hibridoma estáveis; d) aumento das culturas de células para produzir grande quantidade de anticorpos; e) purificação e caracterização de anticorpos em análise de afinidade, ligação de célula e ensaio de atividade de neutralização como descrito em exemplos prévios.
As Figuras 16A e 16B mostram o alinhamento das CDRs das cadeias pesadas e leves, respectivamente, de anticorpos RX1, 5H4, MCI e MC3.
Versões humanizadas e Human Engineered™ são geradas como descrito nos exemplos acima.
EXEMPLO 11
Esse exemplo mostra que anticorpos de M-CSF RX1 e 5H4, assim como fragmentos Fab desses, têm diferentes atividades de neutralização. O exemplo a seguir também mostra que anticorpos RX1, 5H4, e MC3 têm afinidades variadas por M- CSF. Esse exemplo também demonstra que as afinidades dos anticorpos intactos acima mencionados são maiores em relação a fragmentos Fab dos anticorpos anteriormente mencionados.
As atividades de neutralização do RX1 e 5H4 intacto versus fragmentos Fab de RX1 e 5H4 foram determinadas por medição da proliferação celular dependente de M-CSF na presença de várias concentrações de anticorpo. A proliferação celular foi determinada por corante quimioluminescente. Como mostrado na Figura 17, RX1 intacto tem a maior potência, enquanto o fragmento Fab de RX1 perde sua potência e se comporta como 5H4 e o fragmento Fab de 5H4 .
Propriedades de ligação dos anticorpos anteriormente 10 mencionados foram analisadas usando análise Biacore. Para determinar as afinidades relativas de RX1, 5H4 , e MC3 ao M- CSF, anti-camundongo de coelho Fc foi imobilizado em um chip bio-sensor CM5 via ligação de amina. Os anticorpos anteriormente citados foram então capturados no chip bio- 15 sensor Fc/CM5 ant i-camundongo a 1,5 μg/ml por 3 min a 2 μl/min. MCSF foi fluído sobre a superfície modificada do biosensor em concentrações variáveis (Rmax -15). Anticorpos de teste e antígeno foram diluídos em 0,01 M HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCL, 3 mM EDTA, 0,005% tensoativo P20 (HBS-EP) . 20 Todos os experimentos foram realizados a 25°C. Constantes cinéticas e de afinidade foram determinadas com o uso de programa Biaevaluation (Biacore) com uma interação 1:1 modelo/global fit. Como mostrado abaixo na tabela 8, RX1 se liga a M-CSF com a mais alta afinidade em relação a 5H4 e 25 MC3.
Figure img0011
Para determinar as diferenças relativas es na afinidade de ligação de Mab intacto e fragmentos Fab de RX1, 5H4, e MC3, uma configuração alternativa foi usada na análise Biacore. Especificamente, M-CSF foi imobilizado em 5 um chip de biosensor CM5 via ligação de amina. 0,05/xg/ml M- CSF em lOmM acetato de Na pH 4,0 foi injetado a 1 μl/min por 5 minutos para atingir RL=6-12 RU. Anticorpo de teste (ou fragmento Fab) foram fluídos sobre a superfície modificada do biosensor em concentrações variáveis.
Anticorpos de teste foram diluídos em 0,01 M HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCL, 3 mM EDTA, 0,005% tensoativo P20 (HBS-EP) e todos os experimentos foram realizados a 25°C. Constantes cinéticas e de afinidade foram determinadas com o uso de programa Biaevaluation (Biacore) com uma interação 1:1 modelo/global fit. Como mostrado abaixo na tabela 9, RX1 se liga a M-CSF com a mais alta afinidade em relação aos outros anticorpos testados.
O fragmento Fab de RX1 se liga a M-SCF com uma afinidade significativamente menor em relação a holoproteína de RX1.
Figure img0012
A afinidade de ligação e dados de neutralização indicam que a atividade de neutralização de RX1 é devida primariamente a sua afinidade muito alta por M-CSF e que essa alta afinidade pode ser devida pelo menos em parte à capacidade de ambos braços do anticorpo de se ligar ao dímero de MCSF simultaneamente.
EXEMPLO 12
O exemplo a seguir revela o epitopo linear (ou seja,seqüência de aminoácidos) em M-CSF reconhecido pelo anticorpos RX1, 5H4, e MC3.
Inicialmente, a estratégia de mapeamento de epitopo foi desenhada para determinar se anticorpos RX1, 5H4, e MC3 10 reconheceram epitopos lineares ou epitopos conformacionais em M-CSF. Portanto, os anticorpos anti-M-CSF foram testados contra 0,1 μg M-CSF sob condições de redução como de não redução. Apenas a forma não reduzida de M-CSF foi reconhecida por cada um dos anticorpos, sugerindo que 15 epitopos reconhecidos são descontínuos na natureza.
A seguir, o epitopo linear de M-CSF foi determinado para cada anticorpo. Especificamente, membranas SPOTs (Sigma Genosys) foram preparadas onde as seqüência de fragmento de M-CSF de interesse, sobrepõe o os peptídeos 20 lOmer sintetizados com uma compensação de aminoácido, foram carregados no suporte de membrana de celulose. Essas membranas foram então marcadas com os anticorpos anteriormente citados e SPOTs reativos foram identificados. A seqüência de peptídeos foi então identificada por sua 25 localização correspondente na membrana, e aminoácidos de sobreposição nos peptídeos de reação positivos foram identificados como o epitopo. Como mostrado na Figura 18, RX1 se liga a diferente epitopo linear que 5H4 e MC3, que mapeiam a uma localização diferente em M-CSF. RX1 se liga a 30 um epitopo linear representado por RFRDNTPN (Id. de Seq. N° : 120) ou RFRDNTAN (Id. de Seq. N°: 121), aminoácidos 98105 de M-CSF da Figura 12. 5H4 se liga a epitopo linear representado por ITFEFVDQE (Id. de Seq. N° : 122),aminoácidos 65-73 de M-CSF da Figura 12. MC3 se liga a dois 5 epitopos lineares representados por (1) ITFEFVDQE (Id. de Seq. N°: 122), aminoácidos 65-73 de M-CSF da Figura 12 e (2) FYETPLQ (Id. de Seq. N°: 123), aminoácidos 138-144 de M-CSF da Figura 12.
EXEMPLO 13
A afinidade de ligação das versões Human Engineered™ de anticorpos RX1 preparados como acima descrito no Exemplo 4A foi determinada. Esse exemplo mostra que anticorpos RX1 de Human Engineered™ com diferentes regiões constantes de subclasses de IgG se ligam a M-CSF com diferentes afinidades in vitro. Para determinar as diferenças relativas na afinidade de ligação de anticorpos intactos por análise Biacore, M-CSF foi imobilizado em um chip de biosensor CM5 via ligação de amina. 0,05/zg/ml M-CSF em lOmM acetato de Na pH 4,0 foi injetado a 1 μl/min por 5 minutos para atingir RL=6-12 RU. Anticorpo de teste (ou fragmento Fab) foram fluídos sobre a superfície modificada do biosensor em concentrações que variaram de 100 nM a 1,5 nM em diluições de 2 vezes. Anticorpos de teste foram diluídos em 0,01 M HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCL, 3 mM EDTA, 0,005% tensoativo P20 (HBS-EP) e todos os experimentos foram realizados a 25°C. Cada ponto de concentração e tampões foram feitos em triplicate e os dados foram coletados por 3 minutos de associação e 8 minutos de dissociação. Constantes cinéticas e de afinidade foram determinadas com o uso de programa Biaevaluation (Biacore) com uma interação 1:1 modelo/global fit. Como mostrado abaixo na tabela 10, heRXl-l.Gl e heRXl-l.G4 se ligam a M-CSF com afinidades que lembram a afinidade de ligação de RX1-M-CSF de murídeo.
Figure img0013
Em contraste, como mostrado na Tabela 11 abaixo, embora haja alguma variação na afinidade de ligação, todas as construções de Gmma-2 apresentaram uma diminuição de pelo menos 7 vezes na afinidade de ligação comparada ao anticorpo parente de murídeo.
Figure img0014
Figure img0015
EXEMPLO 14
Esse exemplo mostra que anticorpos Human Engineered RX1 com diferentes regiões constantes de subclasse de IgG possuem diferentes atividades de neutralização in vitro. Para testar a atividade de neutralização de anticorpos de M-CSF, um ensaio de proliferação de linha de células M-NFS- 60 foi usado (American Type Cultura Collection, Acesso No. CRL-1838, disponível por ATCC in Rockville, MD, USA, derivado de uma leucemia mielogênica induzida com Cas- Br.MuLV retrovirus ecotrópico selvagem de camundongo. A linha de células responde a interleucina 3 e M-CSF e contém um proto-oncogene truncado c-myb causado pela integração de um retrovirus). A proliferação de M-NFS-60 requer es M-CSF ativo em um modo dependente de dose-. Nesse ensaio, células M-NFS-60 foram lavadas e plaqueadas em meio RP1M1640 com 10% FBS e 1% Pen/Strep. M-CSF recombinante humano (a 10 ng/ml de concentração final, que é equivalente a 3.000 U/ml de atividade de M-CSF), foi incubado com várias concentrações de anticorpos que variam de 1 ug/ml a 0,5 ng/ml (em diluições seriadas de 2 vezes) por 1 hora a 37°C in 5% C02 em uma incubadora. Após a incubação, a mistura foi adicionada à cultura de M-NFS-60 em placas de microtítulo de 96 cavidades. O volume de ensaio total por cavidade foi de 100 ul, com 10 ng/ml M-CSF e a concentração do anticorpo indicada. Células foram incubadas a 37°C sob 5% C02 por 72 horas antes dos números de células serem quantificados por ensaio CellTiter Glo (Promega). Cada 5 anticorpo foi testado em triplicata, com uma repetição no dia seguinte (por um total de seis ensaios por anticorpo). O IC50 de cada anticorpo foi analisado por curva fit.
O ensaio foi repetido usando MCSF humano em soro, meio condicionado MDA231 (que contém M-CSF), MCSF de macaco 10 cinomolgos em soro e MCSF recombinante de macaco cinomolgos. Os resultados são apresentados nas Figuras 25 (MCSF recombinante) , 26 (MCSF humano em soro) e 27 (meio condicionado MDA231) como a leitura fluorescente de ensaio CellTiter Glo, que é linear com o número de células. A 15 atividade de neutralização dos anticorpos é mostrada como uma inibição da proliferação de células M-NFS-60.
Os resultados mostram que o IC50 de heRXl-1-IgGl e heRXl-l-IgG4 foram cerca quase os mesmos que de anticorpo RX1 recombinante de murídeo parente, enquanto o IC50 de 20 heRXl-l!gG2 foi cerca de 2 a 4 vezes maior.
A TabELA 12 ABAIXO mostra o IC50 relativo (em termos de perda de IC50 em vezes) das várias construções de IgG2 preparadas como acima descrito no Exemplo 4A. Dessas construções, heRXl-l.G2 e heRXl-10.G2 mostraram a menor 25 redução em IC50.
Figure img0016
Figure img0017
EXEMPLO 15
Esse exemplo mostra que anticorpos Human Engineered™ RX1 com diferentes regiões constantes de subclasse de IgG possuem diferentes atividades de TRAP em um ensaio de 5 osteoclastogênese in vitro.
As células CD34 + de medula óssea humana (Biowhittaker catálogo número 2M-101A, 3x 105 células/frasco) foram induzidas para se diferenciarem em osteoclastos sob as condições experimentais descritas nessa. No dia 1, células 10 CD34 + foram descongeladas de um frasco congelado em 10 ml de meio (Alfa MEM com 10% FCS, 1 x Pen Strep e 1 x fungizona). As células foram lavadas uma vez e ressuspensas em 2 ml de meio e colocadas em uma placa de 96 cavidades a 100 ul por cavidade. No dia 2, sem remoção do meio 15 original, 50 ul de 4x CSF-1 em concentração final de 30 ng/ml e 50 ul de 4x RANKL (sRANKL, Chemicon catálogo # GF091, 10 ug/embalagem) a concentração final de 100 ng/ml foi adicionado a cada cavidade. No dia 7, 50 ul de 5x RANKL a concentração final de 100 ng/ml foi adicionado a cada cavidade. No dia 17, as células foram coradas para atividade TRAP (kit de Fosfatase ácida de leucócito para coloração TRAP, Sigma catálogo # 387-A) e examinadas sob o microscópio.
Anticorpos que neutralizam M-CSF são adicionados no dia 2 do ensaio. Os anticorpos inibem a diferenciação de osteoclasto em uma maneira dependente de dose como mostrado na Figure 28. A atividade inibidora dos anticorpos no ensaio de diferenciação de osteoclasto é mostrada como 10 ausência de osteoclastos visíveis no dia 17 do ensaio.
EXEMPLO 16
Os anticorpos Human Engineered™ RX1 com diferentes regiões constantes de subclasse de IgG foram também caracterizados.
Os complexos antígeno-anticorpo que os vários anticorpos Human Engineered™ RX1 formaram com MCSF foram estudados por combinação de M-CSF e anticorpo em tampão em proporções molares iguais, seguido por análise do tamanho do complexo antígeno-anticorpo usando cromatografia de 20 exclusão de tamanho ou dispersão de luz. Os resultados mostraram que o RX1 parente de murídeo parece formar complexos a 1:1 com MCSF de cerca de 200 kDa. Os anticorpos heRXl-9.G2 ou 110.G2 parecem formar complexos a 2:1 ou 2:2 com MCSF de cerca de 400 kDa. 0 heRXl-l.G2 parece formar agregados grandes em treliça com MCSF maiores que 2 x 106 Da. As construções de IgGl e IgG4 formaram pequenos complexos similares àqueles de RX1 parente de murídeo.SDS-PAGE de redução e não redução desnaturante de heRXl-l.G4 mostrou que a versão de IgG4 forma meio- 30 anticorpos, como esperado.
Todas as patentes U.S. acima, publicações de Pedido de * patente U. S., Pedidos de patente U. S., patentes í „ estrangeiras, Pedidos de patente estrangeiras e publicações diferentes de patentes referidas nessa especificação e/ou 5 listadas na folha de dados do pedido, são aqui incorporadas por referência, em sua totalidade.
A partir do antecedente deve-se observar que, embora modalidades específicas da invenção tenham sido descritas para objetivos de ilustração, várias modificações podem ser 10 feitas sem desviar do espírito e escopo da invenção.

Claims (16)

1. Anticorpo humanizado anti-M-CSF caracterizado pelo fato de que: (i) a cadeia pesada compreender a seqüência da região variável de cadeia pesada apresentada no Id. de Seq. N°: 43 e uma região constante de IgG1; e (ii) a cadeia leve compreender a seqüência da região variável de cadeia leve apresentada no Id. de Seq. N°: 53.
2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender a sequência de cadeia pesada apresentada no Id. de Seq. N°: 116.
3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pela cadeia leve compreender uma região constante de kappa humano.
4. Composição farmacêutica, caracterizada por compreender um anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, e um transportador, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável.
5. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por ser para uso em aplicações terapêuticas que envolvem administração in vivo a um humano.
6. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por ser para uso na prevenção ou tratamento de um indivíduo com uma doença que causa ou contribui para osteólise, em que o referido anticorpo reduz eficazmente a severidade da perda óssea associada à doença.
7. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a referida doença é selecionada do grupo que consiste em doenças ósseas metabólicas associadas à atividade osteoclástica relativamente aumentada, incluindo endocrinopatias (incluindo hipercortisolismo, hipogonadismo, hiperparatireoidismo primário ou secundário, hipertireoidismo), hipercalcemia, estados de deficiência (incluindo raquitismo/osteomalácia, escorbuto, desnutrição), doenças crônicas (incluindo síndromes desabsortivas, insuficiência renal crônica (incluindo osteodistrofia renal), doença hepática crônica (incluindo osteodistrofia hepática), medicamentos (incluindo glicocorticóides (osteoporose induzida por glicocorticóide), heparina, álcool) e doenças hereditárias (incluindo osteogenesis imperfecta, homocistinúria), câncer, osteoporose, osteopetrose, inflamação óssea associada a artrite e artrite reumatóide, doença periodontal, displasia fibrosa e/ou doença de Paget.
8. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por ser para uso na prevenção ou tratamento de câncer metastático ao osso, onde o câncer metastático é câncer de mama, pulmonar, renal, mieloma múltiplo, câncer de tireóide, câncer de próstata, adenocarcinoma, malignidades de células sanguíneas, incluindo leucemia ou linfoma; cânceres de cabeça e pescoço; cânceres gastrointestinais, incluindo câncer esofagiano, gástrico, câncer de cólon, câncer intestinal, câncer colo-retal, câncer retal, câncer pancreático, câncer hepático, câncer do duto ou da vesícula biliar; malignidades do trato genital feminino, incluindo carcinoma ovariano, cânceres uterinos endometriais, câncer vaginal, ou câncer cervical; câncer da bexiga; câncer cerebral, incluindo neuroblastoma; sarcoma, osteossarcoma; ou câncer epitelial, incluindo melanoma maligno ou câncer de célula escamosa.
9. Uso do anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 caracterizado por ser utilizado na manufatura de um medicamento para prevenção ou redução da perda óssea em um paciente que exibe osteólise.
10. Uso de anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por ser utilizado na manufatura de um medicamento para o tratamento de um paciente com uma doença que causa ou contribui para osteólise.
11. Uso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a referida doença é selecionada do grupo que consiste em doenças ósseas metabólicas associadas a atividade de osteoclasto relativamente aumentada, incluindo endocrinopatias (incluindo hipercortisolismo, hipogonadismo, hiperparatireoidismo primário ou secundário, hipertireoidismo), hipercalcemia, estados de deficiência (incluindo raquitismo/osteomalácia, escorbuto, desnutrição), doenças crônicas (incluindo síndromes desabsortivas, insuficiência renal crônica (incluindo osteodistrofia renal), doença hepática crônica (incluindo osteodistrofia hepática), medicamentos (incluindo glicocorticóides (osteoporose induzida por glicocorticóide), heparina, álcool), e doenças hereditárias (incluindo osteogenesis imperfecta, homocistinúria),câncer, osteoporose, osteopetrose, inflamação óssea associada a artrite e artrite reumatóide, doença periodontal, displasia fibrosa e/ou doença de Paget.
12. Uso de anticorpo, conforme defindo em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por ser utilizado na manufatura de um medicamento para prevenção ou tratamento de câncer metastático ao osso em um paciente que sofre de câncer metastático.
13. Uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o câncer metastático é câncer de mama, pulmonar, renal, mieloma múltiplo, câncer de tireóide, câncer de próstata, adenocarcinoma, malignidades de células sanguíneas, incluindo leucemia ou linfoma; cânceres de cabeça e pescoço; cânceres gastrointestinais, incluindo câncer esofagiano, gástrico, câncer de cólon, câncer intestinal, câncer colo-retal, câncer retal, câncer pancreático, câncer hepático, câncer do duto ou da vesícula biliar; malignidades do trato genital feminino, incluindo carcinoma ovariano, cânceres uterinos endometriais, câncer vaginal, ou câncer cervical; câncer da bexiga; câncer cerebral, incluindo neuroblastoma; sarcoma, osteossarcoma; ou câncer epitelial, incluindo melanoma maligno ou câncer de célula escamosa.
14. Uso de anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por ser utilizado na manufatura de um medicamento para o tratamento de um paciente com câncer.
15. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 14, caracterizado pelo fato de que a quantidade de anticorpo no medicamento é eficaz para inibir a proliferação e/ou diferenciação de osteoclasto induzida por células tumorais.
16. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 14, caracterizado pelo fato de que a quantidade de anticorpo no medicamento está em uma dose eficaz para reduzir a dosagem do segundo agente terapêutico necessária para atingir um efeito terapêutico.
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Families Citing this family (84)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6913697B2 (en) 2001-02-14 2005-07-05 Science & Technology Corporation @ Unm Nanostructured separation and analysis devices for biological membranes
EP2359689B1 (en) 2002-09-27 2015-08-26 The General Hospital Corporation Microfluidic device for cell separation and use thereof
AR045563A1 (es) 2003-09-10 2005-11-02 Warner Lambert Co Anticuerpos dirigidos a m-csf
EP3476861A1 (en) 2004-01-07 2019-05-01 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. M-csf-specific monoclonal antibody and uses thereof
US20070196820A1 (en) 2005-04-05 2007-08-23 Ravi Kapur Devices and methods for enrichment and alteration of cells and other particles
EP2277916A3 (en) * 2005-07-28 2011-04-27 Novartis AG Use of antibody to M-CSF
WO2007016285A2 (en) * 2005-07-28 2007-02-08 Novartis Ag M-csf specific monoclonal antibody and uses thereof
US8921102B2 (en) 2005-07-29 2014-12-30 Gpb Scientific, Llc Devices and methods for enrichment and alteration of circulating tumor cells and other particles
EP2705854A1 (en) * 2006-01-05 2014-03-12 Novartis AG Methods for preventing and treating cancer metastasis and bone loss associated with cancer metastasis
EP2035549B1 (en) 2006-05-31 2014-07-09 Children's Medical Center Corporation Abcb5 positive mesenchymal stem cells as immunomodulators
US20080050739A1 (en) 2006-06-14 2008-02-28 Roland Stoughton Diagnosis of fetal abnormalities using polymorphisms including short tandem repeats
EP2589668A1 (en) 2006-06-14 2013-05-08 Verinata Health, Inc Rare cell analysis using sample splitting and DNA tags
AR062435A1 (es) * 2006-08-18 2008-11-05 Xoma Technology Ltd Anticuerpo especifico prlr (receptor de prolactina) y sus usos
CN101627055A (zh) 2006-09-05 2010-01-13 梅达雷克斯公司 骨形成蛋白及其受体的抗体以及它们的使用方法
CN101594883B (zh) * 2006-10-12 2018-04-10 中外制药株式会社 使用抗ereg抗体的癌症的诊断和治疗
ES2627923T3 (es) 2007-01-11 2017-08-01 Novo Nordisk A/S Anticuerpos anti-KIR, formulaciones y usos de los mismos
EP2644205B1 (en) 2007-04-12 2018-06-13 The Brigham and Women's Hospital, Inc. Targeting ABCB5 for cancer therapy
US8470977B2 (en) 2008-03-14 2013-06-25 Transgene S.A. Antibody against the CSF-1R
NZ587830A (en) 2008-03-14 2012-08-31 Transgene Sa Antibody against the colony-stimulating factor-1 receptor (CSF-1R)
WO2009136382A2 (en) * 2008-05-09 2009-11-12 Abbott Gmbh & Co. Kg Antibodies to receptor of advanced glycation end products (rage) and uses thereof
WO2010137654A1 (ja) 2009-05-29 2010-12-02 株式会社未来創薬研究所 Egfファミリーリガンドのアンタゴニストを成分とする医薬組成物
SG183356A1 (en) 2010-02-18 2012-09-27 Univ California INTEGRIN aVß8 NEUTRALIZING ANTIBODY
US8962804B2 (en) 2010-10-08 2015-02-24 City Of Hope Meditopes and meditope-binding antibodies and uses thereof
CA2824060C (en) * 2011-01-10 2021-05-11 Novimmune S.A. Anti-tlr4 antibodies and methods of use thereof
CN103547288B (zh) 2011-01-10 2016-03-16 密执安大学评议会 干细胞因子抑制剂
MX336740B (es) * 2011-03-29 2016-01-29 Roche Glycart Ag Variantes de fragmento cristalizable (fc) de los anticuerpos.
CA2841013C (en) * 2011-07-18 2020-04-21 Morphosys Ag Use of c-fms antagonists
JP6093360B2 (ja) 2011-08-17 2017-03-08 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア インテグリンα−ｖβ−８と結合する抗体
CN104039809A (zh) * 2011-10-10 2014-09-10 希望之城公司 中间位和中间位结合抗体及其用途
RU2473367C1 (ru) * 2011-11-22 2013-01-27 Федеральное государственное унитарное предприятие "Научно-производственное объединение "Радиевый институт им. В.Г. Хлопина" Способ изготовления стента для радиационной терапии злокачественных опухолей желчного протока
TWI593705B (zh) 2011-12-28 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Humanized anti-epiregulin antibody and cancer therapeutic agent containing the antibody as an active ingredient
CN104540519B (zh) 2012-05-21 2018-06-01 基因泰克公司 抗Ly6E抗体和免疫缀合物及使用方法
HRP20211641T1 (hr) 2012-07-13 2022-02-04 Roche Glycart Ag Bispecifična protutijela anti-vegf/anti-ang-2 i njihova primjena u liječenju vaskularnih očnih bolesti
US20150239968A1 (en) 2012-09-26 2015-08-27 Julius-Maximilians-Universität Würzburg Monoclonal antibodies to growth and differentiation factor 15 (gdf-15)
CA2906417C (en) 2013-03-14 2022-06-21 Robert Ziemann Hcv core lipid binding domain monoclonal antibodies
BR112015023239A8 (pt) 2013-03-14 2018-04-17 Abbott Lab ensaio de combinação de anticorpo-antígeno de hcv e métodos e composições para uso do mesmo
WO2014143342A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Abbott Laboratories Hcv ns3 recombinant antigens and mutants thereof for improved antibody detection
BR112015025622A2 (pt) 2013-04-12 2017-07-18 Morphosys Ag anticorpo ou fragmento de anticorpo isolado, composição farmacêutica, ácido nucleico, vetor, e célula hospedeira isolada
WO2015006554A1 (en) 2013-07-10 2015-01-15 The Regents Of The University Of Michigan Therapeutic antibodies and uses thereof
MY176026A (en) 2013-09-13 2020-07-22 Genentech Inc Methods and composions comprising purified recombinant polypeptides
JP6546178B2 (ja) 2013-09-13 2019-07-17 ジェネンテック， インコーポレイテッド 細胞株中の宿主細胞タンパク質及び組換えポリペプチド産物を検出及び定量化するための組成物並びに方法
US9290578B2 (en) 2013-10-21 2016-03-22 Genentech, Inc. Anti-Ly6E antibodies and methods of use
EP3083946A4 (en) 2013-12-16 2017-08-16 The University of North Carolina at Chapel Hill Depletion of plasmacytoid dendritic cells
BR122023027559A2 (pt) 2014-03-26 2024-01-30 Julius-Maximilians-Universität Würzburg Anticorpos monoclonais para fator de crescimento e diferenciação 15 (gdf-15), estojo compreendendo os mesmos, vetor de expressão que codifica os mesmos e linhagem de célula capaz de produzir os mesmos
MA41044A (fr) 2014-10-08 2017-08-15 Novartis Ag Compositions et procédés d'utilisation pour une réponse immunitaire accrue et traitement contre le cancer
AU2015333687B2 (en) 2014-10-14 2021-03-18 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Antibody molecules to PD-L1 and uses thereof
WO2016120828A1 (en) 2015-01-30 2016-08-04 Novartis Ag Treatment of breast cancer by m-csf antagonist
WO2016137985A1 (en) 2015-02-26 2016-09-01 Merck Patent Gmbh Pd-1 / pd-l1 inhibitors for the treatment of cancer
KR20170132749A (ko) * 2015-03-31 2017-12-04 브이에이치스퀘어드 리미티드 폴리펩티드
MX2017016324A (es) 2015-06-16 2018-03-02 Merck Patent Gmbh Tratamientos de combinacion de antagonista de ligando 1 de muerte programada (pd-l1).
WO2017019897A1 (en) 2015-07-29 2017-02-02 Novartis Ag Combination therapies comprising antibody molecules to tim-3
WO2017017623A1 (en) * 2015-07-29 2017-02-02 Novartis Ag Combined use of anti pd-1 and anti m-csf antibodies in the treatment of cancer
PT3317301T (pt) 2015-07-29 2021-07-09 Novartis Ag Terapias de associação compreendendo moléculas de anticorpo contra lag-3
WO2017049038A2 (en) 2015-09-16 2017-03-23 Ablexis, Llc Anti-cd115 antibodies
CN108495651A (zh) 2015-12-17 2018-09-04 诺华股份有限公司 抗pd-1的抗体分子及其用途
WO2018022505A1 (en) * 2016-07-29 2018-02-01 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Compositions and methods for reducing adiposity by inhibiting fsh/fshr
BR112019006504A2 (pt) 2016-10-06 2019-06-25 Merck Patent Gmbh regime de dosagem de avelumabe para o tratamento de câncer
WO2018089300A1 (en) * 2016-11-10 2018-05-17 Merck Sharp & Dohme Corp. Ilt3 ligand
MX2019006448A (es) 2016-12-01 2020-02-05 Regeneron Pharma Anticuerpos anti-pd-l1 radiomarcados para imagenes de inmuno-pet.
MA47747A (fr) * 2017-03-09 2020-01-15 Shriners Hospitals Children Tests de mesure du collagène de type x et méthodes d'utilisation de ceux-ci
JOP20190260A1 (ar) 2017-05-02 2019-10-31 Merck Sharp & Dohme صيغ ثابتة لأجسام مضادة لمستقبل الموت المبرمج 1 (pd-1) وطرق استخدامها
SG11201909955XA (en) 2017-05-02 2019-11-28 Merck Sharp & Dohme Formulations of anti-lag3 antibodies and co-formulations of anti-lag3 antibodies and anti-pd-1 antibodies
JP6356317B1 (ja) * 2017-06-05 2018-07-11 国立大学法人北海道大学 多発性骨髄腫患者の医薬への応答性を判定する方法、並びに多発性骨髄腫患者における骨病変の予防及び／又は治療のための医薬
WO2018237157A1 (en) 2017-06-22 2018-12-27 Novartis Ag CD73 BINDING ANTIBODY MOLECULES AND USES THEREOF
EP3642240A1 (en) 2017-06-22 2020-04-29 Novartis AG Antibody molecules to cd73 and uses thereof
WO2019018525A1 (en) * 2017-07-20 2019-01-24 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. CHIMERIC ANTIGENIC RECEPTORS BINDING TO CD123
AU2018368731A1 (en) 2017-11-16 2020-05-14 Novartis Ag Combination therapies
CA3090840A1 (en) * 2018-02-09 2019-08-15 Genmab A/S Pharmaceutical compositions comprising bispecific antibodies directed against cd3 and cd20 and their uses
UY38247A (es) 2018-05-30 2019-12-31 Novartis Ag Anticuerpos frente a entpd2, terapias de combinación y métodos de uso de los anticuerpos y las terapias de combinación
US20210214459A1 (en) 2018-05-31 2021-07-15 Novartis Ag Antibody molecules to cd73 and uses thereof
AR116109A1 (es) 2018-07-10 2021-03-31 Novartis Ag Derivados de 3-(5-amino-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona y usos de los mismos
WO2020044252A1 (en) 2018-08-31 2020-03-05 Novartis Ag Dosage regimes for anti-m-csf antibodies and uses thereof
JP7467438B2 (ja) * 2018-10-18 2024-04-15 メルク・シャープ・アンド・ドーム・エルエルシー 抗ｒｓｖ抗体の製剤及びその使用方法
BR112021011874A2 (pt) 2018-12-20 2021-09-08 Novartis Ag Regime de dosagem e combinação farmacêutica compreendendo derivados de 3-(1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona
MX2021009763A (es) 2019-02-15 2021-09-08 Novartis Ag Derivados de 3-(1-oxo-5-(piperidin-4-il)isoindolin-2-il)piperidina -2,6-diona y usos de los mismos.
KR20210129672A (ko) 2019-02-15 2021-10-28 노파르티스 아게 치환된 3-(1-옥소이소인돌린-2-일)피페리딘-2,6-디온 유도체 및 이의 용도
JP2022548881A (ja) 2019-09-18 2022-11-22 ノバルティス アーゲー Ｅｎｔｐｄ２抗体、組合せ療法並びに抗体及び組合せ療法を使用する方法
CN114929274A (zh) * 2019-10-17 2022-08-19 台湾卫生研究院 琥珀酸作为用于癌症诊断和治疗的生物标记的用途
CA3165399A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Novartis Ag Uses of anti-tgf-beta antibodies and checkpoint inhibitors for the treatment of proliferative diseases
CN111087470B (zh) * 2020-01-19 2022-05-10 中国人民解放军第四军医大学 一种抗人CD47单克隆抗体7G4mAb及其应用
BR112022026202A2 (pt) 2020-06-23 2023-01-17 Novartis Ag Regime de dosagem compreendendo derivados de 3-(1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona
CN116134027A (zh) 2020-08-03 2023-05-16 诺华股份有限公司 杂芳基取代的3-(1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮衍生物及其用途
TW202304979A (zh) 2021-04-07 2023-02-01 瑞士商諾華公司 抗ＴＧＦβ抗體及其他治療劑用於治療增殖性疾病之用途
AR125874A1 (es) 2021-05-18 2023-08-23 Novartis Ag Terapias de combinación

Family Cites Families (126)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US30985A (en) 1860-12-18 Thomas l
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
GB2056642B (en) 1979-08-08 1983-05-11 Dawson Int Radio frequency drying of textile material
WO1981001145A1 (en) 1979-10-18 1981-04-30 Univ Illinois Hydrolytic enzyme-activatible pro-drugs
US4419446A (en) 1980-12-31 1983-12-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
NZ201705A (en) 1981-08-31 1986-03-14 Genentech Inc Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
JPS5896026A (ja) 1981-10-30 1983-06-07 Nippon Chemiphar Co Ltd 新規ウロキナ−ゼ誘導体およびその製造法ならびにそれを含有する血栓溶解剤
EP0098110B1 (en) 1982-06-24 1989-10-18 NIHON CHEMICAL RESEARCH KABUSHIKI KAISHA also known as JAPAN CHEMICAL RESEARCH CO., LTD Long-acting composition
US4601978A (en) 1982-11-24 1986-07-22 The Regents Of The University Of California Mammalian metallothionein promoter system
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4675187A (en) 1983-05-16 1987-06-23 Bristol-Myers Company BBM-1675, a new antibiotic complex
DD266710A3 (de) 1983-06-06 1989-04-12 Ve Forschungszentrum Biotechnologie Verfahren zur biotechnischen Herstellung van alkalischer Phosphatase
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
US4965199A (en) 1984-04-20 1990-10-23 Genentech, Inc. Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection
JPS6147500A (ja) 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
US5019369A (en) 1984-10-22 1991-05-28 Vestar, Inc. Method of targeting tumors in humans
US4879231A (en) 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
DE3675588D1 (de) 1985-06-19 1990-12-20 Ajinomoto Kk Haemoglobin, das an ein poly(alkenylenoxid) gebunden ist.
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
JPS6213552A (ja) 1985-07-12 1987-01-22 Nippon Light Metal Co Ltd 流電陽極用アルミニウム合金
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5057313A (en) 1986-02-25 1991-10-15 The Center For Molecular Medicine And Immunology Diagnostic and therapeutic antibody conjugates
AU597574B2 (en) 1986-03-07 1990-06-07 Massachusetts Institute Of Technology Method for enhancing glycoprotein stability
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
US4837028A (en) * 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
GB8705477D0 (en) 1987-03-09 1987-04-15 Carlton Med Prod Drug delivery systems
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US4929700A (en) 1987-04-16 1990-05-29 Cetus Corporation Production of purified, biologically active, bacterially produced recombinant human CSF-1
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
DE3889853D1 (de) 1987-11-05 1994-07-07 Hybritech Inc Polysaccharidmodifizierte Immunglobuline mit reduziertem immunogenem Potential oder verbesserter Pharmakokinetik.
US4892538A (en) 1987-11-17 1990-01-09 Brown University Research Foundation In vivo delivery of neurotransmitters by implanted, encapsulated cells
US5283187A (en) 1987-11-17 1994-02-01 Brown University Research Foundation Cell culture-containing tubular capsule produced by co-extrusion
EP0435911B1 (en) 1988-09-23 1996-03-13 Cetus Oncology Corporation Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity and product expression
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
DE69028095T2 (de) 1989-02-10 1997-02-06 Cetus Oncology Corp M-csf-monoklonale antikörper, die ein neutralisierendes konformationales epitop erkennen
FR2646437B1 (fr) 1989-04-28 1991-08-30 Transgene Sa Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant
EP0402226A1 (en) 1989-06-06 1990-12-12 Institut National De La Recherche Agronomique Transformation vectors for yeast yarrowia
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
GB8915572D0 (en) 1989-07-07 1989-08-23 Natural Environment Res Use of bluetongue virus proteins as vaccine components
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
JPH05503098A (ja) 1989-12-15 1993-05-27 カイロン　コーポレイション セプシスの処理のためのサイトカイン抗体
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
DE69133566T2 (de) 1990-01-12 2007-12-06 Amgen Fremont Inc. Bildung von xenogenen Antikörpern
US5283173A (en) * 1990-01-24 1994-02-01 The Research Foundation Of State University Of New York System to detect protein-protein interactions
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9014932D0 (en) 1990-07-05 1990-08-22 Celltech Ltd Recombinant dna product and method
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
JPH0517367A (ja) 1991-07-08 1993-01-26 Green Cross Corp:The 骨粗鬆症治療剤
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
JPH0595794A (ja) * 1991-10-04 1993-04-20 Otsuka Pharmaceut Co Ltd ヒトｍ−ｃｓｆ抗体及びヒトｍ−ｃｓｆの測定法
EP0617706B1 (en) 1991-11-25 2001-10-17 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
CA2103887C (en) 1991-12-13 2005-08-30 Gary M. Studnicka Methods and materials for preparation of modified antibody variable domains and therapeutic uses thereof
DE69333082T2 (de) 1992-02-11 2004-05-06 Cell Genesys, Inc., Foster City Erzielen von homozygotem durch zielgerichtete genetische ereignisse
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
EP0646178A1 (en) 1992-06-04 1995-04-05 The Regents Of The University Of California expression cassette with regularoty regions functional in the mammmlian host
ES2301158T3 (es) 1992-07-24 2008-06-16 Amgen Fremont Inc. Produccion de anticuerpos xenogenicos.
PT752248E (pt) 1992-11-13 2001-01-31 Idec Pharma Corp Aplicacao terapeutica de anticorpos quimericos e marcados radioactivamente contra antigenios de diferenciacao restrita de linfocitos b humanos para o tratamento do linfoma de celulas b
JPH06319584A (ja) * 1993-05-07 1994-11-22 Morinaga Milk Ind Co Ltd 抗ｍ−ｃｓｆモノクロ−ナル抗体と、この抗体を産生 するハイブリド−マ
US5807549A (en) 1993-05-21 1998-09-15 Research Corporation Technologies, Inc. Lymphocyte chemoattractant factor and uses thereof
US5443953A (en) 1993-12-08 1995-08-22 Immunomedics, Inc. Preparation and use of immunoconjugates
US6054287A (en) 1994-05-27 2000-04-25 Methodist Hospital Of Indiana, Inc. Cell-type-specific methods and devices for the low temperature preservation of the cells of an animal species
ATE370235T1 (de) * 1994-09-16 2007-09-15 Cancer Res Fund Of Contra Cost Rekombinantpeptide hergeleitet vom mc3 antikörper gegen ba46, verfahren zu deren verwendung und verfahren zur humanisierung von antikörperpeptiden
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6130364A (en) 1995-03-29 2000-10-10 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
EP0822830B1 (en) 1995-04-27 2008-04-02 Amgen Fremont Inc. Human anti-IL-8 antibodies, derived from immunized xenomice
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6025146A (en) * 1995-06-05 2000-02-15 Chiron Corporation Identification of M-CSF agonists and antagonists
CA2249195A1 (en) 1996-03-18 1997-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
GB9712818D0 (en) 1996-07-08 1997-08-20 Cambridge Antibody Tech Labelling and selection of specific binding molecules
CA2722378C (en) 1996-12-03 2015-02-03 Amgen Fremont Inc. Human antibodies that bind tnf.alpha.
US6017757A (en) 1997-02-20 2000-01-25 Mississippi State University Isolated viable nematode intestinal cells
US6306393B1 (en) 1997-03-24 2001-10-23 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
IL123888A0 (en) 1997-04-01 1998-10-30 Sankyo Co Anti-fas antibodies
US20020032315A1 (en) 1997-08-06 2002-03-14 Manuel Baca Anti-vegf antibodies
DE122010000049I1 (de) 1997-04-15 2011-05-05 Daiichi Sankyo Co Ltd Neues protein und verfahren zu dessen herstellung
US20030044772A1 (en) 1997-08-04 2003-03-06 Applied Molecular Evolution [Formerly Ixsys] Methods for identifying ligand specific binding molecules
WO1999029345A1 (en) 1997-12-05 1999-06-17 La Jolla Institute For Experimental Medicine Inhibition of tumor growth by macrophage intervention
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US20020029391A1 (en) 1998-04-15 2002-03-07 Claude Geoffrey Davis Epitope-driven human antibody production and gene expression profiling
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
ES2197885T3 (es) * 1999-10-28 2004-01-16 Hofbauer, Reinhold Uso de inhibidores csf-1.
WO2001034177A2 (en) * 1999-11-08 2001-05-17 The Government Of The United States Of America, A S Represented By The Secretary, Department Of Hea Lth & Human Services, The National Institutes Of Health Method of treating a viral infection using antagonists of macrophage colony stimulating factor
US7108852B2 (en) * 2000-03-20 2006-09-19 Warner-Lambert Company Llc Methods of treating inflammation using antibodies to M-CSF
US7455836B2 (en) * 2000-05-08 2008-11-25 The University Of Melbourne Method of treatment and agents useful for same
US7560534B2 (en) 2000-05-08 2009-07-14 Celldex Research Corporation Molecular conjugates comprising human monoclonal antibodies to dendritic cells
JP4503155B2 (ja) 2000-08-28 2010-07-14 北川工業株式会社 導電スペーサ
GB0028647D0 (en) 2000-11-24 2001-01-10 Nextgen Sciences Ltd Apparatus for chemical assays
ES2295228T3 (es) 2000-11-30 2008-04-16 Medarex, Inc. Roedores transcromosomicos transgenicos para la preparacion de anticuerpos humanos.
US7074175B2 (en) 2001-07-25 2006-07-11 Erik Schroeder Handy Thermotherapy via targeted delivery of nanoscale magnetic particles
US6997863B2 (en) 2001-07-25 2006-02-14 Triton Biosystems, Inc. Thermotherapy via targeted delivery of nanoscale magnetic particles
TW200303759A (en) * 2001-11-27 2003-09-16 Schering Corp Methods for treating cancer
AU2003216778A1 (en) * 2002-01-03 2003-07-30 Institut Curie Antisense compounds directed against human CSF-1
US20030138857A1 (en) 2002-01-15 2003-07-24 Goldschmidt-Clermont Pascal J. Method of inhibiting atherosclerotic plaque destabilization
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
SI1527100T1 (sl) 2002-03-29 2009-12-31 Schering Corp Humana monoklonska protitelesa proti interlevkinu-5 in postopki in sestavki, ki jih obsegajo
US7598258B2 (en) 2002-05-01 2009-10-06 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Quinoline derivatives and quinazoline derivatives inhibiting autophosphorylation of macrophage colony stimulating factor receptor
EP1575499A2 (en) * 2002-06-28 2005-09-21 Centocor, Inc. Mammalian epo mimetic ch1 deleted mimetibodies, compositions, methods and uses
ES2345885T3 (es) * 2002-11-15 2010-10-05 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Metodos para prevenir y tratar metastasis de cancer y perdida de hueso asociada con la metastasis de cancer.
AR045563A1 (es) * 2003-09-10 2005-11-02 Warner Lambert Co Anticuerpos dirigidos a m-csf
EP3476861A1 (en) * 2004-01-07 2019-05-01 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. M-csf-specific monoclonal antibody and uses thereof
WO2007016285A2 (en) * 2005-07-28 2007-02-08 Novartis Ag M-csf specific monoclonal antibody and uses thereof
JP5095794B2 (ja) 2010-10-05 2012-12-12 ヤフー株式会社 レコメンデーション連携装置及びその方法
JP6319584B2 (ja) 2015-02-27 2018-05-09 京セラドキュメントソリューションズ株式会社 画像形成システム

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