FR2822846A1 - Procede de preparation et de selection d'anticorps - Google Patents
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Abstract
La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'anticorps comprenant les étapes suivantes : a) la transfection d'une lignée cellulaire par une construction d'acide nucléique comprenant une séquence nucléique d'intérêt codant pour un polypeptide d'intérêt à exprimer à la surface des cellules de ladite lignée, b) la préparation d'anticorps dirigés contre le polypeptide d'intérêt avec les cellules préparées à l'étape (a).
Description
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PROCÉDÉ DE PRÉPARATION ET DE SÉLECTION D'ANTICORPS.
La présente invention concerne une méthode de présentation d'antigène pour la préparation et avantageusement la sélection d'anticorps notamment d'anticorps monoclonaux.
Les anticorps monoclonaux produits par des hybridomes présentent des intérêts multiples qui ont été décrits de manière exhaustive dans plusieurs ouvrages (Bazin,"Rat hybridomas and rat monoclonal antibodies", CRC Press, 1990,515 pages ; Goding, "Monoclonal antibodies : principles and practise", 3ème édition, Academic Press, 1996,492 pages ; Shepherd et Dean, "Monoclonal antibodies", Oxford university press, 2000, 479 pages). Ces anticorps sont utiles à des emplois aussi bien de diagnostic que de thérapeutiques préventives et/ou curatives. La présente invention s'intéresse plus largement à l'immunisation tant in vivo que in vitro.
Les réponses immunes sont toujours dirigées contre un matériel, qui peut être soit une molécule naturelle ou artificielle avec un ou plusieurs épitopes soit un ou plusieurs haptènes couplés à au moins une molécule porteuse. Un adjuvant peut être ajouté à la préparation antigénique. Cette préparation antigénique aussi désignée ci-après"antigène"correspond à la définition classique des manuels d'immunologie. Les réponses immunes considérées dans le cadre de la présente invention concernent celles conduisant à la synthèse
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d'anticorps telles que décrites dans les manuels d'immunologie.
Les anticorps monoclonaux dirigés contre un déterminant antigénique sont produits par un grand nombre de laboratoires depuis l'introduction de la technique de fusion cellulaire entre une cellule myélomateuse et une cellule lymphoïde d'un animal immunisé. Le premier modèle d'hybridomes sécrétant des anticorps monoclonaux développé par Köhler et Milstein (1975, Nature, vol. 256, page 495) fut un modèle murin. Ce modèle a été étendu à l'espèce rat (Galfré et al., 1979,277, 131) et est maintenant largement utilisé.
Toutefois, outre la technique de fusion, l'obtention d'un anticorps monoclonal dépend surtout de la méthode d'immunisation utilisée et du criblage correct des clones hybrides intéressants. On peut distinguer 2 grands types d'immunisation d'organismes animaux soit in vivo soit in vitro, en sélectionnant certaines de leurs cellules et en les cultivant avec un antigène.
On distingue encore trois techniques d'immunisation i) l'immunisation avec l'antigène d'intérêt purifié, ii) l'immunisation avec une cellule présentant l'antigène d'intérêt, iii) l'immunisation ADN consistant à administrer une séquence d'ADN (plasmide) exprimant le gène codant pour l'antigène d'intérêt. Dans les trois cas, on admet que la réaction immune conduisant à la production d'anticorps dirigés contre l'antigène requiert l'activation simultanée des lymphocytes B reconnaissant spécifiquement l'antigène natif et, le plus souvent, des lymphocytes T reconnaissant spécifiquement l'antigène dégradé et présenté
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sous forme de peptide par les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité de cellules dites présentatrices de l'antigène.
L'immunisation conventionnelle dans ses différentes modalités a été décrite depuis un siècle environ, alors que les immunisations in vitro sont plus récentes, on peut citer par exemple les techniques décrites par Mishell et Dutton chez la souris ou celle de plusieurs groupes chez l'homme.
L'immunisation par une protéine requiert une purification préalable de l'antigène ou sa production, sous une forme recombinante qui ne présente pas toujours les caractéristiques conformationnelles et posttranscriptionnelles de la protéine native.
L'immunisation avec une cellule présente comme principal inconvénient la grande diversité des anticorps générés qui reconnaissent, non seulement la protéine d'intérêt, mais aussi la multitude des autres antigènes présentés par les cellules, ce qui rend difficile la caractérisation des anticorps monoclonaux obtenus.
Enfin, l'immunisation par des méthodes dites d'ADN nu a déjà été employée avec succès (Costaglioga et al., Journal of Immunology 1998,160, 1458-1465) mais reste limitée au niveau de l'ampleur des réponses immunologiques obtenues. En effet, ces méthodes nécessitent que le gène codant pour la protéine antigénique s'exprime dans les cellules hôtes du sujet immunisé et que cette protéine soit ensuite présentée à la surface desdites cellules hôtes ou sécrétées par celles-ci. En outre, ces méthodes ne permettent pas le criblage des clones obtenus.
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Ces données sont applicables aussi bien pour une immunisation classique d'un animal comme le rat, la souris ou toute autre espèce capable de donner des réponses immunes humorales, normales ou modifiées par des artifices de transgénies. Elles sont valables pour une immunisation in vivo et même in vitro.
La présente invention a pour but d'offrir une nouvelle méthode d'immunisation qui permet d'avoir aisément des réponses immunologiques très spécifiques et de cribler facilement les anticorps formés. Ce but est atteint grâce à un procédé de préparation d'anticorps comprenant les étapes suivantes : a) la transfection d'une lignée cellulaire par une construction d'acide nucléique comprenant une séquence nucléique d'intérêt codant pour un polypeptide d'intérêt à exprimer à la surface des cellules de ladite lignée, b) la préparation d'anticorps dirigés contre le polypeptide d'intérêt avec les cellules préparées à l'étape (a).
Les anticorps peuvent être préparés puis sélectionnés à l'étape (b) par toute méthode d'immunisation ou de biologie moléculaire connue de l'homme du métier.
Avantageusement, l'étape (b) est réalisée : (i) par immunisation d'un animal avec des cellules transfectées exprimant à leur surface le polypeptide d'intérêt préparé à l'étape (a), (ii) par mise en contact des cellules transfectées exprimant à leur surface le polypeptide
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d'intérêt préparé à l'étape (a) avec des populations cellulaires comprenant des cellules produisant des anticorps.
L'invention concerne tout particulièrement un procédé de préparation d'anticorps dans lequel la lignée cellulaire transfectée à l'étape (a) est histocompatible avec l'animal immunisé en (i) ou les cellules mises en oeuvre en (ii).
Le procédé de l'invention peut être mis en oeuvre avec des cellules de tout animal capable de produire des anticorps comme bien entendu les mammifères. La lignée cellulaire transfectée peut être toute lignée animale y compris de mammifère et plus particulièrement humaine. A titre d'exemple particulier, on peut citer une lignée myélomateuse de rongeur, de préférence une lignée myélomateuse de rat et tout préférentiellement une lignée myélomateuse de rat de souche LOU, comme la lignée myélomateuse de rat LOU IR 983 FI TEC déposée à la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes à l'Institut Pasteur (Paris) sous le No. 1-2584, le 29 novembre 2000.
Selon une première forme de mise en oeuvre de l'invention, la transfection d'une lignée cellulaire de l'étape (a) est effectuée avec une construction d'acide nucléique comprenant une séquence nucléique d'intérêt codant pour un polypeptide d'intérêt membranaire. Bien entendu, la séquence nucléique d'intérêt est placée sous le contrôle de séquences de régulation qui permettent
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l'expression élevée du polypeptide d'intérêt et son exportation vers la surface des cellules transfectées.
Selon une seconde forme de mise en oeuvre de l'invention, la transfection d'une lignée cellulaire à l'étape (a) est effectuée avec une construction d'acide nucléique comprenant dans un même cadre de lecture une séquence nucléique codant pour une protéine membranaire et une séquence nucléique d'intérêt codant pour un polypeptide d'intérêt. Bien entendu, la séquence nucléique codant pour une protéine membranaire et la séquence nucléique d'intérêt sont placées ensemble sous le contrôle de séquences de régulation qui permettent l'expression élevée du polypeptide d'intérêt et son exportation vers la surface des cellules transfectées. La séquence nucléique d'intérêt peut être placée avant, après ou dans la séquence nucléique codant pour une protéine membranaire. Dans cette forme de mise en oeuvre, la séquence nucléique codant pour une protéine membranaire et la séquence nucléique codant pour un polypeptide d'intérêt peuvent être reliées directement l'une à l'autre ou être reliées par une ou plusieurs séquences nucléiques de liaison identiques ou différentes. Il peut s'agir des séquences de liaison codant pour un peptide ou polypeptide relativement inertes dont le but est seulement d'éviter des interactions entre la protéine membranaire et le polypeptide d'intérêt. La séquence nucléique de liaison peut aussi coder pour un polypeptide participant à la réponse immune. A titre d'exemple d'une telle séquence de liaison, on peut citer la séquence suivante : GGGGSGGGGSGGGGS.
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La construction d'acide nucléique mise en oeuvre pour transfecter la lignée cellulaire de l'étape (a) du procédé de l'invention comprend avantageusement un gène de sélection par exemple un gène de résistance à un antibiotique comme la néomycine.
La construction d'acide nucléique mise en oeuvre pour transfecter la lignée cellulaire de l'étape (a) est de préférence un vecteur nucléique adapté aux cellules de la lignée transfectée à l'étape (a).
Un exemple tout particulier de vecteur selon l'invention comprend de 5'vers 3' : - un promoteur, comme le promoteur Sera, - une séquence leader comme celle du CD80 de souris, - un polysite de clonage dans lequel est inséré le gène du polypeptide d'intérêt, - une séquence nucléotidique de liaison, la séquence nucléique codant pour un polypeptide membranaire comme le CD80 de souris, éventuellement précédée d'une séquence leader comme la séquence leader du CD80 de souris.
Selon une forme toute préférée du procédé selon l'invention, la lignée cellulaire transfectée à l'étape (a) est autologue, isologue ou homologue avec les cellules mises en oeuvre en (i) ou (ii) pour la préparation des anticorps.
Avantageusement, après transfection de la lignée cellulaire à l'étape (a), les transfectants sont
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analysés pour l'expression de la protéine de membrane ou du polypeptide d'intérêt, avant l'étape (b).
Ainsi, après transfection de la lignée cellulaire avec le vecteur et sélection dans un milieu correspondant au gène de résistance, les transfectants sont analysés par cytométrie de flux pour l'expression de la protéine membranaire ou du polypeptide d'intérêt par exemple à l'aide d'un anticorps monoclonal dirigé contre l'un de ces polypeptides. Les clones sélectionnés présentent à leur surface le polypeptide d'intérêt.
Les anticorps préparés par le procédé de l'invention peuvent être polyclonaux ou monoclonaux selon la technique mise en oeuvre à l'étape (b) du procédé selon l'invention.
Ainsi, une première forme de mise en oeuvre de l'étape (b) du procédé de l'invention consiste à préparer des anticorps monoclonaux dirigés contre le polypeptide d'intérêt. Ce mode de réalisation comprend une technique de fusion cellulaire à partir de cellules d'un animal ayant reçu des cellules transfectées exprimant à leur surface le polypeptide d'intérêt préparées à l'étape (a). Ces cellules sont avantageusement administrées en un ou plusieurs fois à l'animal sous la forme d'une composition comprenant outre lesdites cellules un adjuvant du type couramment utilisé pour ce type d'immunisation. Il peut être utile d'irradier lesdites cellules avant l'immunisation pour diminuer ou bloquer leur mécanisme de division. Après immunisation et fusion des cellules lymphoïdes par les techniques précédemment décrites bien connues de l'homme du métier,
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les clones produisant des anticorps monoclonaux dirigés contre le polypeptide d'intérêt peuvent être détectés par exemple par cytométrie de flux en comparant leurs fixations sur des cellules exprimant la protéine de surface mais transfectées par le vecteur ne comprenant pas le polypeptide d'intérêt (vecteur"vide") et des cellules exprimant la protéine de surface transfectées par le vecteur comprenant aussi le polypeptide d'intérêt.
Le procédé selon l'invention est particulièrement intéressant en association avec la technique de Köhler et Milstein de préparation des hybridomes synthétisant des anticorps monoclonaux avec ses diverses adaptations à la souris, au rat, ou à toute autre espèce, mais aussi dans toute méthode employant une immunisation in vivo (animal transgénique ou non) ou in vitro. L'emploi de systèmes complètement histocompatibles est hautement préférable, mais il n'exclut pas son usage dans un système non histocompatible où les intérêts : du système d'immunisation seront partiellement conservés en raison de l'identité de la majorité des antigènes entre le système à immuniser et le système immunisant, du criblage aussi sont pratiquement conservés, sauf pour des alloantigènes.
Ainsi, une deuxième forme de mise en oeuvre de l'étape (b) du procédé de l'invention consiste à mettre en contact des cellules transfectées exprimant à leur surface le polypeptide d'intérêt préparées à l'étape (a) avec des cellules produisant des anticorps. Il est donc possible
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d'immortaliser un ou des lymphocytes B provenant de cette réponse immune et d'obtenir un criblage rapide et aisé des clones provenant de diverses techniques employées, à l'aide de fusion cellulaire classique à la Köhler et Milstein, mais aussi, à l'aide d'animaux transgéniques synthétisant, par exemple, des anticorps humains, et, en fait, à l'aide de tout système produisant des anticorps spécifiques à partir de lymphocytes B immatures ou mémoires, stimulé à l'aide d'antigène, dans une culture in vivo (par exemple par transfert de cellules humaines dans des animaux immunodéficients) ou in vitro. Dans le cas de lymphocytes B produisant déjà des anticorps spécifiques recherchés (lymphocytes B activés, préplasmocytes, plasmocytes, etc.), la méthode décrite, ci-après, conserve son intérêt au niveau du criblage des anticorps venant des cellules immortalisées.
Une troisième forme de mise en oeuvre de l'étape (b) du procédé de l'invention comprend : l'isolement, à partir de cellules B produisant des anticorps contre le polypeptide d'intérêt, des séquences d'acide nucléique codant pour chacune des chaînes desdits anticorps, - l'expression dans un hôte desdites séquences d'acide nucléique.
Le procédé de l'invention peut comprendre après l'étape (b), le test de la capacité des anticorps obtenus à reconnaître le polypeptide d'intérêt en mettant en contact lesdits anticorps avec :
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les cellules de la lignée transfectées à l'étape (a), et/ou - les cellules de la lignée transfectées avec une construction d'acide nucléique identique à celle utilisée à l'étape (a) mais sans la séquence nucléique d'intérêt.
Le procédé selon l'invention est remarquable en ce qu'il permet d'immortaliser de (s) cellule (s) d'un même organisme, par exemple, un même individu de l'espèce humaine qui pourrait avoir certains de ses lymphocytes B immortalisés par la technique très classique du virus d'Epstein-Barr et d'autres cellules récoltées dans une même prise de sang (et conservées par congélation) ou quelque temps après. En sélectionnant la lignée cellulaire et le système d'expression adapté, le procédé de l'invention permet de faire exprimer l'antigène dans des cellules ayant non seulement une histocompatibilité de classe I avec les cellules à immuniser mais, de plus, de choisir des cellules exprimant des molécules d'histocompatibilité de classe II.
Dans ce dernier cas, les cellules transfectées pourront présenter des épitopes T de l'antigène, s'il en possède, aux lymphocytes T CD4 du système d'immunisation.
Le procédé de l'invention est aussi remarquable en ce qu'il n'implique pas de connaître ni de préparer préalablement la séquence polypeptidique ou même la molécule entière sur laquelle les anticorps recherchés doivent pouvoir se lier spécifiquement. En effet, lorsque l'antigène codé par la construction adéquate est présenté au système d'immunisation (animal ou préparation cellulaire
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adéquate), l'antigène seul est considéré comme étranger (le non-soi des manuels classiques d'immunologie) dans le système in vivo ou in vitro, la grande majorité des anticorps seront pratiquement dirigés contre lui. Il existe des théories qui diffèrent sur le point de savoir si tous ou une partie des anticorps formés au cours d'une réponse immune sont dirigés contre l'antigène introduit dans le système. Dans la pratique, une réponse immune est considérée comme spécifique quand la grande majorité des anticorps est dirigée contre l'antigène employé. Dans le cas présent, des anticorps peuvent être dirigés contre des antigènes induits aussi par la construction d'acides nucléiques. Les inconvénients liés à ce problème peuvent être évités par l'obtention de cellules témoins adéquates, par une transfection adéquate, ayant tous les antigènes des cellules tranfectées sauf l'antigène en cours d'étude.
Le procédé selon l'invention est enfin remarquable en ce qu'il permet de simplifier considérablement l'étape du criblage des anticorps intéressants. Il suffit de comparer l'accrochement d'anticorps d'un surnageant de cultures à tester sur les cellules de la lignée cellulaire d'origine ou de la lignée transfectée par la même construction d'acides nucléiques à l'exception de ceux codant pour l'antigène, à celles de la lignée transfectée avec la construction d'acides nucléiques incorporant ceux codant pour l'antigène. Ce type de comparaison peut se faire à l'aide d'un type d'appareil appelé FACS pour"Fluorescent Antibody Cell Sorter".
L'emploi d'un second anticorps marqué à la fluorescéine et choisi de manière adéquate pour pouvoir s'accrocher au
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premier, peut permettre une détection aisée du premier anticorps dont la présence est recherchée. Ce type de technique est d'usage courant dans les laboratoires spécialisés. Toute autre méthode donnant une différence entre les cellules témoins et les cellules transfectées pourrait être employée.
Le procédé selon l'invention trouve des applications dans tous les domaines nécessitant le développement d'anticorps monoclonaux ou même polyclonaux, qui pourraient être employés en recherche, pour le diagnostic ou la thérapeutique. D'un point de vue thérapeutique direct, le procédé de l'invention peut être utilisé pour l'immunisation de patients où le contrôle strict du devenir des cellules transfectées qui seraient inoculées au patient serait assuré.
L'invention concerne aussi une construction d'acide nucléique telle que définie précédemment susceptible d'être mise en oeuvre dans le procédé de l'invention. L'invention concerne encore les cellules obtenues à l'étape (a) du procédé de l'invention et les compositions les contenant, ainsi que les compositions comprenant un anticorps obtenu par le procédé de l'invention. L'invention concerne enfin une méthode de traitement ou de diagnostic appliqué sur un sujet consistant à mettre en oeuvre le procédé de l'invention in vivo avec une séquence polynucléotidique codant une protéine d'intérêt thérapeutique ou diagnostic.
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D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent donnés à titre non limitatif de mise en oeuvre du procédé de l'invention.
EXEMPLE I.
1) Méthode.
La lignée myélomateuse non sécrétante IR983 F, qui est histocompatible avec les rats LOU/C et leurs hybrides de première génération comme les rats LOU/C X OKAMOTO ou LOU/C X PVG/c, a été transfectée par électroporation à l'aide du plasmide pBJ LL177 (Azuma M, Cayabyab M, Buck D Phillips JH and Lanier LL. CD28 interaction with B7 costimulates primary allogenic proliferative responses and cytotoxicity mediated by small, resting T lymphocytes. J. Exp. Med. 175 : 353-360.1992).
Ce plasmide obtenu à l'ATCC (ATCC number 99595) code pour le CD80 humain sous le contrôle du promoteur STRO.
(Takabe Y, Seiki M, Fujisawa JF, Hoy P, Yokota K, Arai KI, Yoshida M and Arai N. Sra promoter : an efficient and versatile mammalian cDNA expression system composed of the simian virus 40 early promoter and the R-U5 segment of human T-cell leukemia virus type 1 long terminal repeat. Mol. Cell. Biol. 8 : 466-472.1988). Ce plasmide présente également un gène de résistance à la néomycine.
Conditions d'électroporation : 5 millions de cellules dans 500 ul de milieu présentant le plasmide à la concentration de 10 ug/ml ont reçu une impulsion de 300 Volts.
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Après sélection dans un milieu contenant de la néomycine (1 mg/ml), les transfectants ont été analysés par cytométrie de flux pour l'expression du CD80 humain à l'aide de l'anticorps monoclonal anti-CD80 BEI (Pharmingen). Le clone exprimant à sa surface le plus de CD80 humain a été développé.
Un rat LOU/C a reçu deux injections intrapéritonéales, espacées de deux mois, d'IR 983F CD80 positives (2 X 107 par injection), irradiées à 2,5 Gy à l'aide d'une source de Césium, émulsionnées dans l'adjuvant de Freund complet pour la première injection et dans l'adjuvant de Freund incomplet pour la seconde. Deux semaines après la seconde immunisation, le sérum de l'animal immunisé présentait des anticorps reconnaissant l'IR983F exprimant le CD80 humain, mais ne reconnaissant pas l'IR983F normale.
Un rat LOU/C a également reçu deux injections intraplantaires, espacées de deux semaines, d'IR 983F CD80 positives (107 cellules par patte), irradiées par rayons du Césium à la dose de 2,5 Gy, émulsionnées dans l'adjuvant de Freund complet pour la première injection et dans l'adjuvant de Freund incomplet pour la seconde. Quatre jours après la seconde immunisation, les ganglions poplités ont été prélevés et les cellules lymphoïdes fusionnées avec l'IR983F.
Dix-sept hybridomes produisant un anticorps monoclonal reconnaissant l'IR983F exprimant le CD80 humain et ne reconnaissant pas l'IR983F non transfectée ont été obtenus. Trois étaient d'isotype IgGl, 9 d'isotype IgG2a, 4 d'isotype IgG2b et un d'isotype IGM.
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Ces anticorps reconnaissent aussi la lignée B humaine DAUDI qui exprime également le CD80.
2) Résultats.
La méthode décrite ci-dessus permet d'obtenir des anticorps dirigés uniquement contre une protéine membranaire. Pour généraliser cette méthode à toute protéine, un vecteur d'expression qui permet d'exprimer un polypeptide à la surface de l'IR 983 F a été préparé. Ce vecteur comprend respectivement de 5'vers 3' : - le promoteur Sra,
- la séquence leader du CD80 de souris, - un site de clonage Sfi I/Not I permettant d'insérer le gène codant pour un polypeptide d'intérêt, - une séquence nucléique codant pour une chaîne polypeptidique"porteuse"ayant pour motif : GGGGSGGGGSGGGGS, et - la partie codante du CD80 de souris, exceptée sa séquence leader. Le vecteur dispose également du gène de résistance à la néomycine.
- la séquence leader du CD80 de souris, - un site de clonage Sfi I/Not I permettant d'insérer le gène codant pour un polypeptide d'intérêt, - une séquence nucléique codant pour une chaîne polypeptidique"porteuse"ayant pour motif : GGGGSGGGGSGGGGS, et - la partie codante du CD80 de souris, exceptée sa séquence leader. Le vecteur dispose également du gène de résistance à la néomycine.
Après transfection d'IR983F avec ce vecteur et sélection dans un milieu contenant de la néomycine, les transfectants sont analysés par cytométrie de flux pour l'expression du CD80 de souris à l'aide d'un anticorps monoclonal anti-CD80 de souris.
Les clones qui expriment le CD80 de souris expriment obligatoirement à leur surface la séquence polypeptidique suivante :
MEMBRANE--CD80souris--GGGSGGGSGGGS--POLYPEPTIDE D'INTERET-NH2.
MEMBRANE--CD80souris--GGGSGGGSGGGS--POLYPEPTIDE D'INTERET-NH2.
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Après immunisation et fusion des cellules lymphoïdes, les clones produisant des anticorps monoclonaux dirigés contre le polypeptide d'intérêt sont détectés par cytométrie de flux en comparant leurs fixations sur des IR983F exprimant le CD80 mais transfectées par le vecteur ne comprenant pas le polypeptide d'intérêt (vecteur "vide") et des IR exprimant le CD80 et transfectées par le vecteur comprenant le polypeptide d'intérêt.
EXEMPLE II.
La séquence nucléique codant pour les 250 premiers acides aminés de l'antigène protecteur de Bacillus antracis (Séquence and analysis of the DNA encoding protective antigen of Bacillus anthracis. Welkos SL, Lowe JR, Eden-McCutchan F, Vodkin M, Lppla SH, Schmitt JJ. Gene. 69 : 287.1988) a été clonée dans le vecteur d'expression décrit ci-dessus après restriction SfiI/NotI.
Des IR983F ont été transfectées, soit avec le vecteur d'expression"vide", soit avec le vecteur d'expression comprenant le gène de Bacillus anthracis.
Après sélection dans un milieu contenant de la néomycine (1 mg/ml), les transfectants ont été analysés par cytométrie de flux pour l'expression du CD80 de souris à l'aide de l'anticorps monoclonal MCA 1586F (Serotec). Les clones exprimant à sa surface le plus de CD80 de souris ont été développés.
Un rat LOU/C a reçu deux injections intraplantaires, espacées de deux semaines, d'IR 983F CD80 positives transfectées par le vecteur d'expression
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comportant le gène de Bacillus anthracis (107 cellules par patte), émulsionnées dans l'adjuvant de Freund complet pour la première injection et dans l'adjuvant de Freund incomplet pour la seconde. Quatre jours après la seconde immunisation, les ganglions poplités ont été prélevés et les cellules lymphoïdes fusionnées avec l'IR983F.
Des hybridomes produisant un anticorps monoclonal reconnaissant des IR983F CD80 positives transfectées par le vecteur comportant le gène de Bacillus
anthracis, mais ne reconnaissant pas des IR983F CD80 positives uniquement transfectées par le vecteur"vide" ont été obtenus.
anthracis, mais ne reconnaissant pas des IR983F CD80 positives uniquement transfectées par le vecteur"vide" ont été obtenus.
Claims (17)
1) Procédé de préparation d'anticorps comprenant les étapes suivantes : a) la transfection d'une lignée cellulaire par une construction d'acide nucléique comprenant une séquence nucléique d'intérêt codant pour un polypeptide d'intérêt à exprimer à la surface des cellules de ladite lignée, b) la préparation d'anticorps dirigés contre le polypeptide d'intérêt avec les cellules préparées à l'étape (a).
2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la préparation d'anticorps à l'étape (b) est réalisée à partir de cellules B obtenues : (i) par immunisation d'un animal avec des cellules transfectées exprimant à leur surface le polypeptide d'intérêt préparées à l'étape (a), (ii) par mise en contact in vitro des cellules transfectées exprimant à leur surface le polypeptide d'intérêt préparées à l'étape (a) avec des populations cellulaires comprenant des cellules produisant des anticorps.
3) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la lignée cellulaire transfectée à l'étape (a) est histocompatible avec l'animal immunisé en (i) ou les cellules mises en oeuvre en (ii).
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4) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'à l'étape (a), la transfection d'une lignée cellulaire est effectuée avec une construction d'acide nucléique comprenant une séquence nucléique d'intérêt codant pour une protéine d'intérêt membranaire.
5) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la séquence nucléique d'intérêt est placée sous le contrôle de séquences de régulation qui permettent l'expression élevée du polypeptide d'intérêt et son exportation vers la surface des cellules transfectées.
6) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'à l'étape (a), la transfection d'une lignée cellulaire est effectuée avec une construction d'acide nucléique comprenant dans un même cadre de lecture une séquence nucléique codant pour une protéine membranaire et une séquence nucléique d'intérêt codant pour un polypeptide d'intérêt.
7) Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la séquence nucléique codant pour une protéine membranaire et la séquence nucléique d'intérêt sont placées ensemble sous le contrôle de séquences de régulation qui permettent l'expression élevée du polypeptide d'intérêt et son exportation vers la surface des cellules transfectées.
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8) Procédé selon l'une des revendications 6 ou 7, caractérisé en ce que la séquence nucléique d'intérêt est placée avant, après ou dans la séquence nucléique codant pour une protéine membranaire.
9) Procédé selon l'une des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que la séquence nucléique codant pour une protéine membranaire et la séquence nucléique codant pour un polypeptide d'intérêt sont reliées par une ou plusieurs séquences nucléiques de liaison identiques ou différentes.
10) Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'une des séquences nucléiques de liaison code pour un polypeptide participant à la réponse immune.
11) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que la construction d'acide nucléique mise en oeuvre pour transfecter la lignée cellulaire de l'étape (a) comprend un gène de sélection par exemple un gène de résistance à un antibiotique.
12) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la construction d'acide nucléique mise en oeuvre pour transfecter la lignée cellulaire de l'étape (a) est un vecteur nucléique adapté aux cellules de la lignée transfectée à l'étape (a).
<Desc/Clms Page number 22>
13) Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 12, caractérisé en ce que ladite lignée cellulaire transfectée est autologue, isologue ou homologue avec les cellules mises en oeuvre en (i) ou (ii) pour la préparation des anticorps.
14) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'après transfection de la lignée cellulaire, les transfectants sont analysés pour l'expression de la protéine de membrane ou du polypeptide d'intérêt.
15) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'à l'étape (b) on prépare des anticorps monoclonaux par une technique de fusion cellulaire à partir de cellules d'un animal ayant reçu des cellules transfectées exprimant à leur surface le polypeptide d'intérêt préparées à l'étape (a).
16) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que l'étape (b) comprend : l'isolement, à partir de cellules B produisant des anticorps contre le polypeptide d'intérêt, des séquences d'acide nucléique codant pour chacune des chaînes desdits anticorps, - l'expression dans un hôte desdites séquences d'acide nucléique.
<Desc/Clms Page number 23>
17) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'après l'étape (b), on teste la capacité des anticorps obtenus à reconnaître le polypeptide d'intérêt en mettant en contact lesdits anticorps avec : les cellules de la lignée transfectée à l'étape (a), et/ou - les cellules de la lignée transfectée avec une construction d'acide nucléique identique à celle utilisée à l'étape (a) mais sans la séquence nucléique d'intérêt.
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| BORREBAECK C A K ET AL: "Human monoclonal antibodies produced by primary in vitro immunization of peripheral blood lymphocytes", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCE. WASHINGTON, US, vol. 85, no. 11, June 1988 (1988-06-01), pages 3995 - 3999, XP002176306, ISSN: 0027-8424 * |
| FREUND YVONNE R ET AL: "Vaccination with a recombinant vaccinia vaccine containing the B7-1 co-stimulatory molecule causes no significant toxicity and enhances T cell-mediated cytotoxicity.", INTERNATIONAL JOURNAL OF CANCER., vol. 85, no. 4, 15 February 2000 (2000-02-15), pages 508 - 517, XP001042166, ISSN: 0020-7136 * |
| HADDAD DIANA ET AL: "Comparative study of DNA-based immunization vectors: Effect of secretion signals on the antibody responses in mice.", FEMS IMMUNOLOGY AND MEDICAL MICROBIOLOGY, vol. 18, no. 3, 1997, pages 193 - 202, XP001042389, ISSN: 0928-8244 * |
| KASANJI M ET AL: "EXPRESSION AND IMMUNOGENICITY IN RATS OF RECOMBINANT ADENOVIRUS 5 DNA PLASMIDS AND VACCINIA VIRUS CONTAINING THE HTLV-1 ENV GENE", INTERNATIONAL JOURNAL OF CANCER, NEW YORK, NY, US, vol. 71, no. 2, 10 April 1997 (1997-04-10), pages 300 - 307, XP000982098, ISSN: 0020-7136 * |
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