PT90687B

PT90687B - Baculovirus modificado, processo para a sua preparacao e sua aplicacao como vector de expressao de genes

Info

Publication number: PT90687B
Application number: PT90687A
Authority: PT
Inventors: Gerard Devauchelle; Martine Cerutti; Guy Croizier; Liliane Croizier
Original assignee: Agronomique Inst Nat Rech; Centre Nat Rech Scient
Priority date: 1988-05-31
Filing date: 1989-05-30
Publication date: 1994-10-31
Also published as: DE68927073T2; JP3183877B2; AU3529189A; FR2631974A1; CA1341272C; AU626867B2; DK263689A; US5583023A; EP0345152B1; JPH0235092A; DE68927073D1; EP0345152A1; PT90687A; FR2631974B1; DK263689D0; NZ229369A; NO892172L; NO892172D0; ATE142257T1

Description

INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONQMIQUE - INRA e CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - CNRS ¹¹ BACULOVÍRUS MODIFICADO, PROCESSO PARA A SUA PREPARAÇÃO

E SUA APLICAÇflO COMO VECTOR DE EXPRESSÃO DE GENES,

A presente invenção diz respeito a um baculovírus modificado possuindo um sõ sítio de corte antes do promotor do polipéptido principal da inclusão virai de baculovírus, a poliedrina, e/ou da proteína PIO, a um processo para a obtenção de um tal baculovírus modificado e ã sua aplicação como vector de expressão de genes.

A engenharia genética utiliza sistemas de vectores virais eucariotas para introduzir mediante transdução ADN exógenos nas células animais ou vegetais. Os principais vírus eucariotas susceptíveis de seryir de yectores de transdução de ADN nas cêljj las de mamíferos (SV40 e polioma, por exemplo) e nas células vegetais (yírus do mosaico da couve-f1or, por exemplo) apenas podem receber o ADN exógeno (estranho) cujo comprimento estã limitado, em virtude da morfologia da estrutura do seu nucleocapsj de. Devido ao facto de o tamanho dos genomas estar consideravelmente aumentado pela presença das sequências introduzidas, verificou-se ser absolutamente necessário poder dispor de vectores susceptíveis de alojar mais ADN exógeno, estranho, tanto ι mais que a engenharia genética, ã medida que se desenvolve, tende a procurar inserir em uma célula-hospedeira mais de um gene estranho, com o objectivo, por exemplo, de obter uma expressão

-2coordenada e, se possível, uma actividade coordenada dos compostos dos genes estranhos. 0 vector virai ideal deverá, além disso, permitir a introdução de um longo segmento de ADN estranho nas células, com uma frequência elevada e permitir a conversão da bio-síntese de todas as proteínas celulares na expressão do ou dos gene(s) estranho(s). Dm vírus parecendo possuir todas estas condições é o seguinte baculovírus: vírus da poliedrose nuclear, Autographa californica (AcNPV) que, de acordo com o descrito por Lois K. Miller /Capítulo 14 A vírus vector por genetic engineering in invertebrates do Manual GENETIC ENGINEERING IN PLANT SCIENCES (1981) N.J. PANOPOULOS, ED, PRAEGER PUBL. NEW -YORK, páginas 203-223J, constitui um excelente vector de propagação e expressão de numerosos genes estranhos, em um espaço eucariota. De acordo com este estudo, o AcNPV apresenta duas formas, vírus não incluso, NOV e vírus incluso, OV, que desempenham papeís diferentes no processo de infecção por baculovírus, e os genes que codificam para a poliedrina não são necessários e podem ser eliminados e substituídos pelo ADN estranho introduzido na sequência nucleotídica que codifica para a poliedrina, para procurar um sistema vector capaz de proporcionar uma elevada taxa de expressão dos genes estranhos. Esta igualmente indicado neste estudo que a poliedrina, que é uma proteína cristalina que forma a matriz do corpo de inclusão do AcNPV e cujo peso molecular é de 30 KD, é sintetizada em enormes quantidades pelo OV, sem que se verifique amplificação do gene da poliedrina no processo de replicação, o que leva a pensar que o promotor da sínte se do ARN^ da poliedrina ê excepciona1mente potente e que se poderã utilizar para obter taxas elevadas de expressão de um gene estranho. 0 Autor indica, além disso, que se estabeleceu ante-3riormente que o genoma, ele mesmo identificado, do AcNPV, codif/ ca para o gene da poliedrina. Além disso, observou-se um certo número de variantes genotípicas do AcNPV e cartografaram-se variações dos sítios de endonucleases de restrição para diversas variantes que se formam naturalmente.

Neste estudo, L. MILLER recorda que o genoma (ADN} do AcNPV é infeccioso era culturas celulares e que a aptidão deste genoma para transferir culturas celulares e de modo a permitir ligar o ADN estranho ao ADN virai, inserir o ADN recombínante nas células era cultura mediante um processo de transferência e ) obter ura vírus contendo as sequências de ADN adicionais e que e£ ta aptidão é igualraente de natureza a permitir a manipulação in vitro do ADN do AcNPV ou de um recombínante e a sua reinserção facil em células, o grande tamanho do genoma do AcNPV - que, de acordo cora as estimativas, terã um peso molecular de 82-88 milhões de daltons ou um peso molecular de 92 milhões de daltons - constituem uma vantagem na perspectiva da introdução de grandes segmentos de ADN estranho nas células-hospedeiras. Neste estudo esta indicado que era virtude das grandes quantidades de po-> liedrina produzidas nas células infectadas, é vantajoso substituir o gene da poliedrina pelo ADN estranho, utilizando, para a expressão, o promotor da poliedrina.

Um artigo de K.N. POTTER e L. K. MILLER publicado em ANIMAL VIRUS GENETICS, 6, GENETIC MUTATIONS OF A BACULOVIRUS, ACADEMIC PRESS (1980), páginas 71-80, descreve o método do mar ker rescue (recuperação dos marcadores) para o estabelecimento da carta genética de mutantes ts de AcNPV, com base na carta de

-4/ restrição dos sítios de várias endonucleases de restrição, o qual consiste em recombinar i n vivo um genoma de ADN mutante com um fragmento de restrição do ADN do AcNPV selvagem.

Ura certo numero de Publicações fazem aplicação dos dados expostos por L. MILLER no seu estudo. Γ assim que os pedidos de patente de invenção europeia N9 0127 839 em nome de THE TEXAS A&M UNIVERSITY SYSTEM (com MM. G.E: SMITH e D. SUMMERS mencionados como Inventores), N9 0228 036 era nome de MICROGENESYS fcom M.M. COCHRAN mencionado como Inventor) e N? 0260 090 nos nomes de D.H.L. BISHOP e C.Y. KANG, que são depositantes e inventores, tem todos os três por objectivo a produção de um vector de expressão de ura baculovírus recombinante, que se utiliza, em segui_ da, para infectar uma célula de i nsecto-hospedei ro sensível. De acordo com estes processos, isola-se inicialmente de um baculoví rus apropriado, tal como AUTOGRAPHA californica (AcMNPV), um fragmento de ADN que compreende o promotor da poliedrina e as se quências de ADN que codificam para a proteína da poliedrina. De acordo com a primeira destas três publicações, o fragmento isolado insere-se era ura vector de clonagem tal como o plasmídeo pvc 8, para se obter ura vector de transferência constituído por um veículo de clonagem (o plasmídeo) que contem obrigatoriamente o promotor da poliedrina (mas não obrigatoriamente as sequências de ADN que codificam para a poliedrina) e ura sítio disponível p_a ra cionar um gene seleccionado que se encontra sob o controlo transcricional do dito promotor; depois forma-se um vector de trasferência recombinante mediante inserção, no dito sítio de clonagem disponível referido antes, de um gene seleccionado, utj lizando técnicas de ADN recombinante, e, finalmente, a partir

deste vector de transferência recombinante, forma-se um vector de expressão recombinante mediante incorporação, por transferência, no ADN de baculovírus, de um fragmento do vector de transf^ rência recombinante. 0 vector de expressão de baculovírus recombinante formado, e capaz de exprimir o gene seleccionado inserido no vector de transferência recombinante. A segunda destas três Publicações visa a produção de um polipéptido tal como o an_ tigenio de superfície do vírus da hepatite B, em uma cêlula-hospedeira infectada coro ura vírus, mediante isolamento de um bacul£ vírus (vírus capaz de infectar uraa célula-hospedeira de insecto) de um primeiro segmento de ADN incluindo um promotor virai tal como o promotor da poliedrina, depois mediante isolamento de uraa estirpe apropriada, de ura segundo segmento de ADN que contem a sequência que codifica para o polipéptido e mediante combinação destes dois segmentos de ADN para se obter uma cadeia contínua de ura terceiro segmento de ADN que contém o ADN vector no qual o segundo segmento de ADN esta adjacente ao promotor do primeiro segmento de ADN e contêm os sinais do fim da transcrição; forraa-se, em seguida, ura vector recombinante mediante recombinação do terceiro segmento referido com o ADN genómico de baculovírus, após o que se coloca o vector recombinante em contacto com células hospedeiras de insecto em condições que provoquem a incorpora ção do segmento de vector recombinante nas referidas células-hos_ pedeiras, para as infectar; cultivam-se, em seguida, estas ultimas para se isolar das células ou dos sobrenadantes de cultura, o antigénio de superfície do vírus da hepatite Β, A terceira des_ tas Publicações (Pedido de Patente de Invenção europeia 026 0090) tem por objectivo um processo para a produção de um polipéptido que compreende pelo menos uma fracção antigênica da proteína do

-6f antigénio de superfície do vírus da hepatide B (HBsAG) ou da pro teína Pre-S2, para infecção de insectos ou de células de insectos sensíveis, por um vector de expressão constituído por um baculovírus recombinante comportando um segmento de ADN que codifj_ ca para o polipéptido pretendido (HBsAG}, sob o controlo de expressão de um promotor da poliedrina, sendo o próprio baculovírus recombinante obtido mediante contransferencia de culturas de células de insectos por ADN de baculovírus infeccioso e plasmídeos vectores de trasferência de baculovírus contendo genes representando antigénios do vírus da hepatite B, que se colocam no lugar das sequências iniciais 5' que codificam para o gene da p£ liedrina de baculovírus, mas sob o controlo do promotor da ρo 1i£ dri na.

Estas três Publicações têm em comum a necessidade de utilizar para obter o vector de expressão, um vector de transferência que é um veículo que esta carregado com um gene estranho (gene do interferão p no Pedido de Patente de Invenção europeia 01 27 839 ; gene de HBsAG nos dois outros Pedidos de Patente de I_n venção europeia 0228 036 e Q260 090 }, Logo que o vector de trans_ ferência estã carregado, é necessário proceder ã transferência do gene estranho para o vírus, o que se realiza, de acordo com estes Pedidos de Patente de Invenção mediante cotransferência, após o que se procura e se isola os vírus recombi nantes- que cons tituem vectores de expressão, quer estes sejam eficazes ou não. Estas operações de transferência e selecção são longas e delicadas: carrega-se a sequência estranha sobre uma construção inter-? mediaria constituída por um vector plasmídico de trasferência (ou de transcolocação} e e necessário, para obter o vector de ex

/ pressão, passar para a cotransferência e, portanto, pelo método de marker rescue.

Verificou-se, por outro lado, que em um artiqo de SMITH VLACK e SUMMERS intitulado PHYSICAL ANALYSIS OF ADTOGRAPHA CALIFORNICA NUCLEAR POLIHEDROSIS VIRUS TRANSCRIPTS FOR POLYHEDRIN AND 10 000- MOLECULAR-WEIGHT PROTEIN publicado em JOURNAL OF VIROLOGY, Janeiro de 1983, paginas 215-225, estes autores descrevem as dimensões, a direcção de transcrição e a colocação das se quencias de ADN que especificam as extremidades 5' e 3' do ARN_mda poliedrina do AcMNPV (vírus da poliedrose nuclear do Autographa californi ca), que e o polipéptido estrutural principal da inclusão virai trata-se, neste artigo, de uma proteína do AcMNPV de baixo peso molecular em geles SDS-PAGE, da ordem de 10 KDa, que e produzida nas células-hospedeiras infectadas, em quantidades (elevadas) comparáveis ãs da poliedrina. De acordo com este artigo, a proteína P10 e, assim como a poliedrina, um gene do AcMNPV; 24 horas depois da infecção, encontra-se nas células infectadas pelo AcMNPV uma grande quantidade de poli(A)⁺ARN que se hibrida ãs regiões do genoraa em que se encontram localizados os genes da poliedrina e da proteína P10; o ARM^ e as proteínas destes dois genes que se acumulam nas células infectadas permitem compreender o controlo da expressão destes genes nas células de insectos em que se efectuou o estudo utilizands como modelos as sequências de ADN responsáveis pela expressão preferida da poliedrina e da proteína P10 em um estádio tardio da infecção. 0 pe di_ do de Patente de Invençãc europeia NÇ 0 127 839 THE TEXAS A & M UNIVERSITY SYSTEMS referido antes e no qual SMITH & SUMMERS são mencionados como inventores, descreve e reivindica ao pormenor

-8que o gene (ou fragmento de gene) inserido no veículo de clonagem (tal como um plasmídeo), previamente modificado mediante inserção de um fragmento de ADN obtido por clivagem do ADN de bacu lovírus e compreendendo um gene de baculovírus (ou um fragmento de gene), para se obter o vector de baculovírus recombinante de transferência pretendido, e um gene da poliedrina ou uma fracção deste último que inclui o promotor da poliedrina ou é um gene da proteína PIO que inclui o promotor da proteína PIO. As colocacões respectivas do gene da poliedrina e do gene da proteína PIO no genoma do AcMNPV estão indicados neste Pedido de Patente de Invenção. Menciona-se igulraente neste último que, devido ao facto de o genoma do AcMNPV não ter sítios de restrição únicos conhecidos em que se possa efectivamente introduzir genes selecci£ nados, de uma maneira sítio-específico, ê necessário construir vectors plasmídicos quiméricos (ou vectores de transferência) que servem de veículo intermediário para a transferência dos genes .

A presente invenção tem por consequência por objectivo a obtenção de ura vector de expressão que se possa obter sem se passar pelo intermediário de um vector de transferência.

Tem igualraente por objectivo a obtenção de ura vector de expressão não carregado, no qual ê possível introduzir praticamente qualquer sequência. Tem, além disso, por objectivo a obteri ção de um vector de expressão apto a ser carregado coro uma sequência estranha directamente in vitro mediante manipulação ge néti ca .

χ9,

A presente invenção tem por objectivo um processo para a produção de um baculovirus modificado susceptível de ser utiliza_ do como vector de expressão de genes exógenos, caracterizado pelo facto de se inserir directamente, e sera recorrer a ura vector de transferência, no genoma completo ou incompleto de um baculovirus, um sítio de restrição apropriado, a jusante do promotor tardio forte do gene de pelo menos uma das proteínas que constituem formações associadas ao baculovirus - trata-se de inclusões virais de baculovirus, tais como a poliedrina, ou de proteínas a£ sociadas ao baculovirus, alem das inclusões virais, tais como a proteína PIO - para se obter um virus modificado que constitui um vector de expressão não carregado, apto a receber pelo menos uma sequência de pelo menos um gene estranho que se pretende fazer ex p r i m i r,

Entre os genes de tais proteínas, contasse mais particularmente o gene da poliedrina e o gene da proteína PIO,

Segundo ura modo de realização do processo de acordo com a presente invenção, para a construção de um baculovirus modificado que constitui um vector de expressão não carregado pronto a rece-, ber um fragmento de ADN estranho que se pretende fazer exprimir, utiliza-se um baculovirus desprovido de sítio de restrição para pelo menos um dado enzima, sobre o qual se instala pelo menos um sítio de restrição único para pelo menos o enzima considerado,

De acordo com um modo de realização vantajoso do processo para a produção de um baculovirus modificado, segundo a presente invenção, o baculovirus de origem desprovido do sítio de restri-10, f .

ção para um dado enzima, utilizado, e um baculovirus naturalmente desprovido do referido sítio de restrição, tal como, particu. larmente, o baculovirus da poliedrose nuclear de Spodoptera frugi perda ¹¹ (Sf) ,

Segundo ura outro modo de realização vantajoso do processo para a produção de um baculovirus de acordo com a presente invenção, o baculovirus de origem desprovido de sítio de restrição para um dado enzima, utilizado', e um baculovirus em que previamente se suprimiu o ou os sítio(s) de restrição mal colocado(s) sobre o seu genoma.

De acordo com um modo de realização vantajoso do processo para a produção de um baculovirus modificado, no caso em que se pretende suprimir um sítio de restrição mal colocado, esta supres são realizasse mediante cotransferência do ADN do baculovirus de origem considerado, com um plasmídeo em que se clonou o fragmento de ADN que comporta o sítio de restrição que foi cortado por um enzima para se linearizar e ao qual se ligou um ligando (linker) depois do que se transformou, apos ligação, em um plasmídeo desprovido de sítio de restrição suprimido, dando a referida cotran_s ferência lugar a um virus recombinante desprovido deste sítio,

Segundo um outro modo de realização vantajoso do processo para a produção de um baculovirus modificado de acordo com a presente inven_ ção, a introdução de um sítio de restrição para um dado enzima , a jusante do promotor tardio forte do gene de pelo menos uma das proteínas que constituem formações associadas ao baculovirus, e particularmente a jusante do promotor do gene da poliedrina ou/e do polipeptido PIO de baculovirus, realiza-se mediante cotransfe-11rência de uma cultura celular de células permissivas ao baculovírus, com um plasmídeo apropriado no qual se clonou o fragmento que contem o sítio de restrição colocado a jusante do promotor tardio forte, para a formação de vírus recombinado modifica, do, que corresponde ao vector de expressão não carregado de sequência estranha, pronto a receber pelo menos uma sequência estranha com vista ã sua expressão sobre células de insectos,

Segundo um outro modo de realização vantajoso do proces^ so de acordo com a presente invenção, para a construção de um baculovírus modificado que constitui um vector de expressão nao carregado pronto a receber pelo menos dois fragmentos de ADN e£ tranhos que se pretende fazer exprimir, instala-se sobre um baculovírus convenientemente escolhido, pelo menos dois sítios de restrição para pelo menos dois enzimas iguais ou diferentes,

De acordo com uma disposição vantajosa deste modo de realização, no caso em que o baculovirus de origem ê desprovido de dois sítios de restrição para dois enzimas iguais ou diferen. tes, introduzem-se sucessivamente estes dois sítios de restrição mediante cotransferência com um primeiro plasmídeo em que se cio nou o fragmento que contêm o primeiro sítio de restrição que se pretende instalar sobre o baculovírus e depois com um segundo pias, mídeo no qual se clonou o fragmento que contém o segundo sítio de restrição que se pretende instalar sobre o baculovírus,

De acordo com uma outra disposição vantajosa deste modo de realização, no caso em que o baculovírus de origem comporta sítios de restrição mal colocados sobre o seu genoma, estes sí^12.

Ζ tios são sucessivamente suprimidos mediante cotransferência sucessivamente com plasmídeos desprovidos de cada um dos sítios de restrição a suprimir,

De acordo com am modo de realização vantajoso do proces_ so para a produção de um baculovírus modificado constituindo um vector de expressão não carregado, este e caracterizado pelo fa£ to de comportar um sítio de restrição única instalado na proximidade do gene de uma proteína associada ao baculovírus ou instalado na proximidade de um promotor tardio forte deste gene,

De acordo com um outro modo de realização vantajoso do processo para a produção de um baculovírus modificado constituindo um vector de expressão não carregado, este e caracterizado pelo facto de comportar dois sítios iguais on diferentes instalados respectivamente na proximidade do gene de uma proteína a£ sociada ao baculovírus e na proximidade de um promotor tardio forte deste gene,

A presente invenção tem igualmente por objectivo um baculovírus modificado comportando um sítio de restrição único , instalado a jusante do promotor tardio forte apropriado do gene de uma proteína associada ao baculovírus, aDto a constituir um vector de expressão não carregado,

De acordo com um modo de realização vantajoso de um tal baculovírus modificado, susceptível de constituir um vector de expressão não carregado, este e constituído por um baculovírus modificado comportando um sítio de restrição único, instalado

-13na proximidade do codão ATG do gene de pelo menos uma proteína associada ao baculovírus, ou de um promotor tardio forte deste gene.

Segundo um outro modo de realização vantajoso do báculo vírus modificado de acordo com a presente invenção, este compor ta pelo menos dois sítios de restrição insatlados respectivamen. te na proximidade do codão ATG do gene de pelo menos uma proteí na associada ao baculovírus e na proximidade de um outro promotor tardio forte deste vírus,

A presente invenção tem alem disso por objectivo um vector de expressão de genes, não carregado, constituído por um be culovírus modificado tal como definido anteriormente.

A presente inyenção tem, além disso por objectivo um pro cesso para o carregamento de um vector de expressão não carreg£ do, em pelo menos uma sequência estranha, caracterizado pelo fa£ to de se introduzir pelo menos uma sequência estranha directamente in vitro no referido vector de expressão, mdiante manipulação genéti ca,

De acordo com um modo de realização do referido processo de carregamento, introduz-se pelo menos- uma sequência estranha directamente no genoma virai modificado que constitui o ve£ tor de expressão inicialmente não carregado,

De acordo com uma disposição vantajosa deste modo de re£ lização, para a introdução directa de pelo menos uma sequência

-?14'/ estranha, linearizou-se previamente o genoma virai mediante acção de um enzima de restrição,

De acordo com um outro modo de realização vantajoso do referido processo de carregamento, introduz-se um fragmento de ADN estranho directamente em um primeiro sítio de restrição do referido vector de expressão não carregado e depois introduz-se um segundo fragmento de ADN igual ou diferente do primeiro, directamente em um segundo sítio de restrição do referido vector de expressão, sendo os dois sítios de restrição únicos para enzimas diferentes,

De acordo ainda com um outro modo de realização vantaj£ so do referido processo de carregamento, introduzem-se fragmentos de ADN estranhos iguais ou diferentes em sítios de restrição únicos, ou seja definidos como sendo dois sítios de restrição diferentes para um enzima igual, mediante digestão parcial do referido vector de expressão não carregado, para abrir um sí tio, no qual se introduz, então, um primeiro fragmento de ADN , sendo o referido vector submetido a uma segunda digestão parcial para abrir um segundo sítio único igual ao anterior, no qual se introduz um segundo fragmento de ADN,

A presente inyenção tem, alem disso, por objectivo um vírus carregado, caracterizado pelo facto de ser formado a partir de um baculovírus modificado constituindo um vector de expressão inicialmente não carregado, no qual se inseriu directamente ¹¹ i n vitro pelo menos uma sequência de ADN estranho que se pretende fazer exprimir, f

-15A presente invenção tem, alem disso, por objectivo um processo para a expressão de genes estranhos, caracteri zado pe_ lo facto de se utilizar um vírus carregado tal como definido an tes .

vector de expressão de acordo com a presente invenção, pode ser carregado, praticamente, com qualquer sequência, enten_ dendo-se que as referidas sequências não devem comportar sítios de restrição particulares,

São deste modo susceptíveis de ser exprimidos pelo vector de expressão de acordo com a presente invenção quaisquer ge_ nes que codificam para proteínas de origem procariota e eucario ta, quaisquer sequências que codificam para genes de bio-síntese, dos antigénios proteínicos virais e, em particular, a título de exemplo não liraitatiyo, os genes das acetilcolimesterases de invertebrados e de vertebrados,

As Publicações citadas anteriormente e especialmente os Pedidos de Patente de Inyenção europeias citados antes, mencionam que o gene do interferão p e expresso muito mais eficazmente se se inserirem alguns nucleótidos a montante do cõdão ATG inicial do géne Pn, quer dizer na proximidade deste codão ATG. Mencionam igual me nte que os plasmídeos vecto res re combi nantes obtidos cori têm a região do promotor da poliedrina, com, por exemplo, um sítio BamHI único a jusante do sítio inicial transcricio na 1, ou seja situado a cerca de 10 nucleótidos a montante do lugar do codão ATG do tipo selvagem, no vector de inserção. Por outras palavras, a técnica anterior propõe a construção de vectores

-16de clonagem que contem sítios de clonagem únicos com uma posição a jusante de um promotor de baculovírus definido, que estão flanqueados por sequências homologas do genoma virai, de modo a dirigir a inserção mediante recombi nação hwõl oga.

Estes conhecimentos são aplicados, de acordo com a presente invenção, ã produção de um vector de expressão não carregado .

A possibilidade que oferece a presente invenção de evitar o recurso a um vector de transferência simplifica consider^ velmente o processo de obtenção de um baculovírus recombinado carregado susceptível de exprimir uma proteína estranha: com efeito, enquanto os processos em que ê obrigatório o recurso a um vector de transferência requerem várias semanas para produzir um baculovírus recombinado carregado, o processo de acordo com a presente invenção permite obter um baculovírus carregado em alguns dias,

Alêm das disposições anterioes, a presente invenção com preende ainda outras disposições, que sobressairão da descrição que se segue.

A presente invenção será melhor compreendida com a ajuda do complemento de descrição que se segue que se refere a exem pios de realização do processo de acordo com a presente invenção, Deve entender-se, no entanto, que estes exemplos e as partes descritivas correspondentes , sao dados a título meramente ilustrativo do objecto da invenção, que nao limitam de modo algum,

EXEMPLO 1:

Supressão do sTtio SmaT do genoma do

SIMNPV,

Para construir o vector de expressão nao carregado, ou seja o baculovTrus modificado pronto a receber uma sequência es_ tranha, seiecciona-se um baculovTrus desprovido de sTtio de re£ trição para um dado enzima e o caso, excepcional, do baculovTrus da polidrose nulcear de Spodoptera frugiperda que não po£ sui sTtio de restrição Smal,

Pode-se igualmente suprimir o ou os sTtiofs) de restrição mal colocadoCs) sobre o genoma de baculovTrus: particularmente suprime-se o sTtio único Cmal localizado no fragmento Pst-I-G do baculovTrus da poliedrose nuclear de 'Spodoptera 1i ttorallis , procedendo como seguej

Corta-se o fragmento Pst-I?G do SIMNPV clonado em um plasmTdeo do tipo pAT153 com Smal , liga-se, depois, um linker ao plasmTdeo linearizado, Cotransfere-se os plasmTdeos obtidos, mediante transformação apos ligação g desprovidos de sTtio Smal , com o SIMNPV de origem para se obter vTrus recombi_ nantes desprovidos de sTtio Smal , Na descendência dos vTrus obtidos apos cotransferência , seiecciona-se os vTrus recombinantes. Estes vTrus terão, em relação ao vTrus de origem, perdido um sTtio Smal , ou seja não terão sTtio Smal e terão pelo contrário adquirido um sTtio Kpnl e possuirão então no total 7+1=8 sTtios Kpnl, Para seleccionar estes vTrus recombi nantes-, procede-se da seguinte maneira: os poliedros recolhidos- apos a morte das lagartas transferidas são a estirpe de ADN que serve para uma

-18nova transferência. Antes desta nova transferência corta-se o ADN com Smal. Este tratamento tem por efeito impedir a multipli cação dos virus de origem visto que o seu genoma estã aberto e permitir apenas a multiplicação dos virus recombi nantes. Vários ciclos de multiplicação dos virus de acordo com este princípio podem ser necessários para eliminar a descendência dos virus de origem que escaparam ao corte por Smal,

Este processo de suspensão de um sítio de restrição Smal mal colocado esta ilustrado na figura 1 anexa.

EXEMPLO 2 : Instalação de um sítio Smal a jusante do pro motor de poliedrina sobre um baculovírus des^ provido de sítio de restrição Smal, sítio unfco, quer se trate de Smal ou de qualquer outro sítio, deve ser colocado na região do ATG que ê o codão inicial do gene de poliedrina (ou da P1Q1, Quando se coloca este sítio antes do ATG, este permite a expressão do gene estranho sob o controlo do seu próprio ATG (a posição do sítio de introdução ê dita a montante do ATG: ou seja do lado 5¹ do ATG). Esta e a situação mais frequentemente pretendida. Quando se coloca o sítio depois do ATG (a jusante do ATG, seja em 3’ em relação a este mesmo ATG) a situ^ ção permite a produção das proteínas ditas fusionadas que, sob o co_n trolo do ATG da poliedrina, comportam na parte N-terminal aminoãcidos correspondendo ã sequência da poliedrina e na parte C-terminal aminoácidos correspondendo a sequência estranha fusionada, A região de instalação do sítio estende-se a título de -10η a +10n .

E conveniente que o A do ATG seja numerado +1, o T+2 e o G+3; as

-19bases que possuam a ATG sco numeradas com o sinal (-), a base que precede A tem o número-l e assim por diante.

A escolha de Smal esta condicionada pela relativa rari_ dade dos sítios Smal nos baculovirus, 0 facto de o ADN virai ser cortado neste sítio de reconhecimento pela endonuclease Smal com a produção de extremidades livres ê na verdade uma vantagem na medida em que as extremidades livres constituem uma entrada universal para sequências estranhas. Esta vantagem não ê deter minante na escolha visto que ê prática corrente tornar livres extremidades que o não são a partida, Qualquer endonuclease de restrição capaz de reconhecer um sítio único de restrição posicionado convenientemente a jusante de um promotor, permite a i_n trodução de sequências estranhas, com vista ã expressão de genes carregados a custa de modificações por vezes menores das extremidades destes.

De acordo com a presente invenção, ê necessário, sobre um vírus desprovido de sítio de restrição por Smal por exemplo, quer NPV de Spodoptera frugiperda'¹, quer NPV de Spodoptera 1 i ttora1 is tratada de acordo com o processo descrito no exemplo 1, instalar um sítio Smal (que se torna um sítio único Dara o gen_o ma virai) a jusante do promotor do gene da poliedrina (ou de qualquer outro promotor tardio forte como o da proteína PIO), A instalação do sítio Smal no melhor local supõe o estabelecimen to prévio da sequência do gene da poliedrina (particularmente na região promotora).

Para instalar o sítio Smal e necessário dispor de um sí

-20( tio de restrição úniço que permita abrir o genoma em uma parte restrita do gene da poliedrina. Os sítios únicos no vírus inteiro são raros. A probabilidade de encontrar um sítio único aumenta quando se reduz o tamanho da sequência.

Esta introdução pode fazer-se por vários métodos, Entre estes, pode-se citar a mutação dirigida com criação de sítio único, seguida da introdução nestes sítios do linker Smai.

Um outro metdodo consiste em proceder a eliminações induzidas pela Bal31 a seguir ao corte da sequência virai ao nível do sítio Saci, Como existe um segundo sítio Saci no poli — linker do plasmídeo, e necessário, antes da digestão pela Bal31 fazer saltar do poli1inker, este sítio Saci, polilinker tem, inicialmente, a seguinte composição: EcoRI; Saci; Kpnl ; Smai : BamHl; Kbal;

Sal 1 ; PstI ; Sphl ; HindIII,

Depois da clonagem do fragmento HindIII no pVC19 , pro. cede-se a uma eliminação dirigida com o sistema ExoIII-Mong bean 0 sítio de bloqueio ê o sítio Pst I contido em 5' do ρo 1i1i nker e o sítio de digestão um sítio Hpal situado entre o polT linker e o sítio Xbal do fragmento HindIII-K, Esta eliminação faz desaparecer um segmento compreendido entre o sítio PstI e o sítio Mpal por um lado e um segmento situado entre este mesmo sítio Hpal e o sítio Xbal virai,

Prepara-se o plasmídeo que sofreu a eliminação para uma

-21sequenciação directa/portanto simplesmente por razões de comodi_ dade) dos plasmídeos que sofreram eliminação ulteriormente em torno do sítio Xbal da sequência virai. Neste estádio o polj_ linker tem a seguinte composição:

Ecori ; Saci ; Kpnl ; Sroal ; BaroHI; Xbal ; SA1I e o primeiro sítio significativo virai em 3' é Xbal,

Elimina-se então o sítio Seal do polilinker mediante uma digestão dupla EcoRI - BamHI que mantêm no poliliinker unicamente os sítios Xbal e Sall, Desta maneira pode-se proceder simultaneamente a uma eliminação em torno do sítio virai Saci e instalar, no lugar desta eliminação, um linker Smal que se ra sítio unico neste plasmídeo, A posição do sítio Smal deve ser de -30 a +10 visto que Xbal estã na posição -40 em relação ao A do ATG.

Os plasmídeos p!3,21XSS são cotransferidos para uma cultura celular de S littoralts e os vírus recombinados que correspondera aos vectores de expressão não carregados de sequên_ cia estranha são reportados pelo fenotipo P menos, Este feno tipo é o dos vírus responsáveis por focos infecciosos pelo méto do das praias (plages) em que os poliedros não podem ser postos em evidência.

Este processo de instalação de um sítio de restrição Smal estã ilustrado na figura 2 anexa.

EXEMPLO 3 ; Introdução da sequência estranha a montante imediato do ATG

Esta etapa da construção do vector de expressão pressupõe a posse do baculovirus modificado de acordo com a presente invenção, ou seja do vírus possuindo um sítio único situado por exemplo -4 (a referência de numeração e sempre +1 para a A do ATG inicial do gene da poliedrina). 0 referido vírus modificado e de facto amputado das bases compreendidas entre -3 e cerca de +280 visto que o sítio Saci a partir do qual Bal31 digere, esta situado a +140. A obtenção do vector supõe a preparação de uraa sequência estranha apta a ser expressa.

Sequência introduzida: Sequência da acetilcolinesterase de Drosophila me 1 anogas ter,

A sequência a exprimir resulta da forma replicativa do plasmídeo pEMBL-Ache da aceti1colinesterase de D, me 1onogaster (plasmídeo PE6 obtido por Fournier e colaB. INRA, Anttbes). A sequência original publicada por Hall e Spierer (EMBO, J: ( 1 986), pagina 2952) tem um comprimento de 3481 bases. 0 segmento Nrul-SacI que se estende de +869 a +3181 pode ser utilmente sub-clonado em um pVC19 em Smal-SacI, NruI corta o gene da acetilcolinesterase 127 bases a montante do ATG deste gene. Um sítio único Aatl! a +921 permite a recuperação do fragmento Aat-II-SacI que comporta a totalidade do gene Ache (quer seja uma sequência lider de 72 bases, um ORF de 1947 bases e uma sequência em 3* de 241 bases compreendendo um sinal de poliadenilação a +3050).

23A fim de evitar a presença da sequência que codifica para a cauda de ancoragem efacilitar a purificação da acetilcolinesterase, a utilização do segmento Aatll -Xmnl (+921-+2856) que dã urna proteína truncada de 28 aminoácidos sobre 649 aminoã eidos de drosofila a jusante do gene Ache, e muito favorável.

resultado desta montagem leva a uma proteína fundida em 3‘.A natureza da proteína fundida e função dos resíduos obtidos mediante eliminação induzida por Bal31 . ApÕs a sequência AGTGGG formada no último codão do Ache e do codão GGG que é um meio sí tio Smal contínuo, ou das bases do gene da poliedrina, no bom quadro de leitura no caso em que a proteína fundida comporta cer ca de 120 aminoácidos da poliedrina, ou das bases no mau quadro de leitura, aparecem codões de paragem apos uma trintena de cÕdoes de sentido,

As extremidades do. fragmento de ADN dupla-cadeia a inserir no yírus modificado ao nível do sítio Smal são tornadas liyres se necessário mediante acção do Mung-bean para os sítios Saci e AatII.

Após trans f erên ci a de células de ^Jl-3podoptera littora11 s ¹¹, mede-se a actividade acetil col inesterãsi ca a partir de uma série de sobrenadantes e/ou triturados provenientes de X oé lulas isoladas com 48 horas de põs-infecção e mantém-se 48 horas suplementares para a produção de aceti1colines^ferase. Os lotes associados a uma actividade enzimática elevadadão lugar a uma clonagem mediante diluição limite , Pesquisa-se a presença de clones positivos mediante hibridação com uma sonda pVC-Ache,

-24EXEMPL04 - Introdução a jusante do ATG (caso de proteT nas fundidas).

Expressão do gene da beta-galactosidase

Este exemplo, como o anterior, supoe a existência do baculovírus modificado, Neste caso a eliminação produzida por Bal31 a partir do sítio Sac I respeita o ATG.

fragmento Smal-Sall do plasmídeo pMC1871 de Casadaban (plasmídeo distribuído por Pharmacia) insere-se no sítio Smal do vírus transformado apos modificação da extremidade Sall por Mung-bean.

Esta construção apresenta a estrutura </--- promotor da poliedrina ------ATG TAT --<---GGG

GAT CCC GTC ---- Lac Z ---- AAA TAA TAA TAA CCG GGC AGG GGG

GAT CCG ---extremidade 3' do ORF da poliedrina ---->

Os virus recombinados possuindo esta estrutura são reconhecidos em cultura celular mediante coloração azul com X-gal,

Sobressai assim da descrição anterior, que a presente invenção não se limita de modo nenhum a estas formas de utiliza_ ção, realização e aplicação que acabam de ser descritas de modo mais explícito; pelo contrario ela engloba todas as variantes que possam vir ao espírito do entendido na matéria, sem sair do quadro, nem do alcance da presente invenção.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1.- Processo para a preparação de um baculovírus modificado susceptível de ser utilizado como vector de expressão de genes exógenos, caracterizado pelo facto de se inserir directamente, e sem se recorrer a um vector de transferência, no genoma completo ou incompleto de um baculovírus, um fragmento de restrição apropriado, sob controlo de um promotor tardio forte do gene de pelo menos uma das proteínas que constituem formações associadas ao baculovírus - quer se trate de inclusões virais de baculovírus, tais como a poliedrina, ou de proteínas associadas ao baculovírus, diferentes de inclusões virais, tais como a proteína PIO- para se obter um vírus modificado que constitui um vector de expressão não carregado, pronto a receber pelo menos uma sequência de pelo menos um gene estranho que se pretende fazer exprimir.
2.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de, para a construção de um baculovirus modificado que constitui um vector de expressão não carregado pronto a receber um fragmento de ADN estranho que se pretenda fazer exprimir, se utilizar um baculovirus desprovido de sítio de restrição para pelo menos um dado enzima, sobre o qual se instala pelo menos um sítio de restrição único para pelo menos o enzima considerado.
3. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de o baculovirus de origem desprovido de sítio de restrição para um dado enzima, utilizado, ser um baculovirus naturalmente desprovido do referido sítio de restrição tal como, particularmente, o baculovirus da poliedrose nuclear de

Spodoptera frugiperda (SF).
4. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de o baculovirus de origem desprovido de sítio de restrição para um dado enzima, utilizado, ser um baculovirus em que previamente se suprimiu o sítio ou os sítios de restrição mal- colocado (s) sobre o seu genoma.
5. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de, no caso em que se pretenda suprimir um sitio de restrição mal colocado, a supressão se realizar mediante co-27- transferência do ADN do baculovírus de origem considerado, com um plasmídeo em que se clonou o.fragmento de ADN que contém este sítio de restrição, que foi cortado por um enzima para se linearizar e ao qual se ligou um ligando (linker), depois de o transformar, após ligação, em um plasmídeo desprovido de sítio de restrição a suprimir, dando a dita cotransferência lugar a um vírus recombinante desprovido deste sítio.
6. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo facto de a introdução de um sítio de restrição para um dado enzima, a jusante de um promotor tardio forte do gene de pelo menos uma das proteínas que constituem forma ções associadas ao baculovírus e particularmente a jusante do promotor do gene da poliedrina ou do polipeptido PIO de baculovírus, se realizar mediante cotransferência de uma cultura celular de células permissivas ao baculovírus, com um plasmídeo apropriado no qual se clonou o fragmento que contém o sítio de restrição colocado a jusante do promotor tardio forte, a qual leva ã formação do vírus recombinado modificado, que corresponde ao vector de expressão não carregado de sequência estranha, pronta a receber uma sequência estranha com vista ã sua expressão sobre células de insectos.
7. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo facto de, para a construção de

-28/ um baculovírus modificado que constitui um vector de expressão não carregado pronto a receber pelo menos dois fragmentos de ADN estranhos que se pretende fazer exprimir, se instalar sobre um baculovírus convenientemente escolhido, pelo menos dois sítios de restrição para pelo menos dois enzimas iguais ou diferentes.
8. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de, no caso em que o baculovírus de origem ê desprovido de dois sítios de restrição para dois enzimas iguais ou diferentes, se introduzir sucessivamente estes dois sítios mediante cotransferência com um primeiro plasmídeo em que se clonou o fragmento que contém o primeiro sítio de restrição que se pretende instalar sobre o baculovírus e depois com um segundo plasmídeo em que se clonou o fragmento que contém o segundo sítio de restrição que se pretende instalar sobre o baculovírus.
9. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de, no caso em que o baculovírus de origem comporta sítios de restrição mal colocados sobre o seu genoma, se suprimir sucessivamente estes sítios mediante cotransferência, respectivamente com plasmídeos desprovidos de cada um dos sítios de restrição a suprimir.
10.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo facto de comportar um síte de res-29trição único instalado na proximidade do gene de uma proteína associada ao baculovírus, ou instalado na proximidade de um promotor tardio forte deste gene.
11. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo facto de comportar dois sítios iguais ou diferentes instalados respectivamente na proximidade do gene de uma proteína associada ao baculovírus e na proximidade de um promotor tardio forte deste gene.
12. - Baculovírus modificado, caracterizado pelo facto de comportar um sítio de restrição único instalado a jusante de um promotor tardio forte do gene de pelo menos uma das proteínas associadas ao baculovírus, o qual estã apto a constituir um vector de expressão não carregado.
13. - Baculovírus modificado de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo facto de ser constituído por um baculovírus modificado comportando um sítio de restrição instalado na proximidade do cõdão ATG do gene de pelo menos uma proteína associada ao baculovírus ou de um promotor tardio forte deste gene.
14. - Baculovírus modificado, caracterizado pelo facto de comportar pelo menos dois sítios de restrição instalados respectivamente na proximidade do cõdão ATG do gene de pelo menos uma

-30ϊ>

proteína associada ao baculovírus e na proximidade de um promotor tardio forte deste vírus.
15.- Vector de expressão de genes, não carregado, caracterizado pelo facto de ser constituído por um baculovírus modificado de acordo com uma qualquer das reivindicações 12 a 14.
16. - Processo para o carregamento de um vector de expressão não carregado, com pelo menos uma sequência estranha, caracterizado pelo facto de se introduzir pelo menos uma sequência estranha directamente in vitro no referido vector de expressão, mediante manipulação genética.
17. - Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo facto de se introduzir pelo menos uma sequência estranha directamente no genoma virai modificado que constitui o vector de expressão inicialmente não carregado de acordo com a reivindica ção 15.
18.- Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo facto de se introduzir directamente pelo menos uma sequência estranha, sendo o genoma virai previamente linearizado mediante acção de um enzima de restrição.
19.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindi-31- cações 16 a 18, caracterizado pelo facto de se introduzir directamente um fragmento de ADN estranho em um primeiro sítio de restrição do referido vector de expressão não carregado e de se introduzir depois um segundo fragmento de ADN igual ou diferente do primeiro, directamente em um segundo sítio de restrição do referido vector de expressão, sendo os dois sítios de restrição simultaneamente sítios de restrição únicos para enzimas diferentes.

2o.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 16 a 18, caracterizado pelo facto de se carregar fragmentos de ADN estranhos iguais ou diferentes em sítios de restrição únicos, ou seja definidos como sendo dois sítios de restrição diferentes para um enzima idêntico, mediante digestão parcial do referido vector de expressão não carregado, para abrir um sítio, no qual se introduz então um primeiro fragmento de ADN, sendo o referido vector submetido a uma segunda digestão parcial para abrir um segundo sítio único idêntico ao anterior, no qual se introduz um segundo fragmento de ADN.
21.- vírus carregado, caracterizado pelo facto de ser formado por um baculovírus modificado constituindo um vector de expressão inicialmente não carregado, no qual se inseriu directamente, in vitro pelo menos uma sequência de ADN estranha que se pretende fazer exprimir.
22 . -32-

22.- Processo para a expressão de genes estranhos, caracterizado pelo facto de se utilizar um vírus carregado de acordo com a reivindicação 21,