CN1875029A - 蛋白酶抑制剂及其变异体在丝状真菌中的表达 - Google Patents

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Abstract

本文描述了蛋白酶抑制剂、其变异体以及它们的生产方法。

Description

蛋白酶抑制剂及其变异体在丝状真菌中的表达
发明领域
[01]本发明涉及蛋白酶抑制剂及其变异体在丝状真菌中表达的方法。本发明公开了融合核酸、载体、融合多肽以及用于获得蛋白酶抑制剂的方法。
发明背景
[02]蛋白酶参与很多生物过程。蛋白酶与蛋白酶抑制剂之间的平衡失调经常与病理组织破坏有关。
[03]许多研究集中在蛋白酶在组织损伤中的作用，并且据认为，蛋白酶与蛋白酶抑制剂之间的平衡对保持组织完整性是主要的决定因素。来自包括嗜中性白细胞的炎性细胞的丝氨酸蛋白酶参与多种炎症疾病，例如肺气肿、关节炎、过敏性湿疹和银屑病。
[04]蛋白酶似乎也对一些癌的扩散起作用。正常细胞与被称作胞外基质(ECM)的复杂蛋白质网络接触而存在。ECM是细胞运动的屏障，为了转移，癌细胞必须设计出打破它们的粘附，使之降解的途径，并移动通过ECM。蛋白酶是降解其它蛋白质的酶，并且长久以来被认为是通过消化ECM帮助肿瘤细胞从其原始位置释放出来。最近的研究已经表明，通过激活被称作蛋白酶-激活受体-2(PAR2)的肿瘤细胞膜中的蛋白质，它们可以促进细胞形状改变以及运动。这导致激活细胞的运动器(motility apparatus)的胞内级联反应。因此，假设在肿瘤转移中的第一步骤之一是细胞形状的再组织，以使其在面向移动的方向的一边上形成不同的突出。然后，细胞迁移通过血管壁，并移动到远侧位置，最终重新粘附并形成转移肿瘤(metastasis tumor)。例如，人前列腺上皮细胞组成性地分泌前列腺-特异性抗原(PSA)，一种激肽释放酶-样丝氨酸蛋白酶(kallikrein-like serine protease)，其为精液血浆的正常组分。蛋白酶的作用是降解胞外基质并促进癌细胞的侵入。
[05]合成的和天然的蛋白酶抑制剂已经显示出在体内和体外抑制肿瘤诱发。在前的研究调查表明，已知属于结构-相关蛋白质家族的被分类为丝氨酸蛋白酶抑制剂或SERPINS的一些蛋白酶抑制剂，抑制数种蛋白酶，包括胰蛋白酶、组织蛋白酶G、凝血酶、组织激肽释放酶以及嗜中性白细胞弹性蛋白酶。SERPINS对体外预防/抑制致癌剂-诱导的转化和动物模型系统中的癌的发生非常有效。全身性给予纯化蛋白酶抑制剂减少了关节炎症以及软骨和骨破坏。
[06]发现局部施用蛋白酶抑制剂在如过敏性湿疹这样的状况中有用途，过敏性湿疹是皮肤炎症的一种常见形式，其可以定位于少量的部分，或涉及身体的大部分。蛋白酶抑制剂的褪色活性以及其可以预防紫外-诱导色素形成的能力已经在体外和体内都得以证实。Paine等，Journal of Investigative Dermatology 116，587-595(2001)。此外，已经发现蛋白酶抑制剂有助于创伤愈合(http：//www.sciencedaily.com/releases/2000/10/001002071718.htm)。已经证实，分泌性白细胞蛋白酶抑制剂在被局部给予时，可逆转组织破坏并加速创伤愈合过程。另外，丝氨酸蛋白酶抑制剂也可以帮助减轻红斑狼疮患者的疼痛(参见美国专利号6537968)。
[07]如上所述，蛋白酶抑制剂干扰蛋白酶的作用。天然存在的蛋白酶抑制剂可以在很多食品中找到，例如谷类(燕麦、大麦和玉米)、芽甘蓝(Brussels sprouts)、洋葱、甜菜根、小麦、龙爪稷(finger millet)和花生。一种感兴趣的来源是大豆。在大豆中的Kunitz和Bowman-Birk的平均含量分别是大约1.4％和0.6％，Kuniz和Bowman-Birk是两种最重要的蛋白酶抑制剂。这些低含量使得分离用于临床应用的天然蛋白酶抑制剂是不现实的。
[08]因此，需要可生产大量蛋白酶抑制剂及其变异体的方法，这种方法也可以减少或消除在哺乳动物组织培养细胞中产生这些物质中的，与血液-携带的传染剂(blood-borne infectious agent)有关的风险。在此所提供的本发明的生产方法允许大量的蛋白质治疗剂的生产。
发明概述
[09]在此所提供的是核酸、细胞以及用于生产蛋白酶抑制剂及其变异体的方法。
[10]在第一个实施方案中，提供了编码功能性蛋白酶抑制剂的核酸。在一个方面，提供了包含与第一个、第二个、第三个和第四个核酸序列可操作连接的调节序列的核酸。提供了在第四个核酸序列之后的终止序列。
[11]在第二个方面，所述第一个核酸序列编码在第一丝状真菌中功能为分泌性序列的信号多肽，第二个核酸编码正常分泌自所述第一丝状真菌或第二丝状真菌的分泌多肽或其功能部分，第三个核酸编码可切割连接子，以及第四个核酸编码蛋白酶抑制剂或其片段。
[12]在第三个方面，提供了包含编码蛋白酶抑制剂的核酸序列的表达盒。
[13]在第四个方面，本发明涉及编码蛋白酶抑制剂变异体的多核苷酸。所述多核苷酸可以编码Bowman-Birk抑制剂变异体，其中至少一个环已被改变。所述多核苷酸可以编码大豆胰蛋白酶抑制剂变异体，其中至少一个环已被改变。
[14]在第二个实施方案中，提供了表达功能性蛋白酶抑制剂或其变异体的方法。在一个方面，(i)宿主细胞用包含编码蛋白酶抑制剂或其变异体的核酸序列的表达盒转化，和(ii)在合适的条件下被培养，以表达蛋白酶抑制剂或其变异体。任选地，所述方法进一步包括回收蛋白酶抑制剂或其变异体。
[15]在第二个方面，(i)宿主细胞用包含编码蛋白酶抑制剂或其变异体的核酸序列的第一个表达盒转化，(ii)用包含编码侣伴蛋白的核酸序列的第二个表达盒转化，和(iii)在合适的条件下被培养，以表达蛋白酶抑制剂或其变异体。任选地，可以回收蛋白酶抑制剂或其变异体。在一个方面，蛋白酶抑制剂或其变异体作为融合蛋白被表达。任选地，所述方法进一步包括回收蛋白酶抑制剂或其变异体。
[16]在第三个实施方案中，提供了可以表达蛋白酶抑制剂或其变异体的细胞。宿主细胞用编码蛋白酶抑制剂或其变异体的表达盒转化。宿主细胞可以选自曲霉属(Aspergillus)或木霉属(Trichoderma)。
[17]在第四个实施方案中，提供了功能性蛋白酶抑制剂或其变异体。在一个方面，所述功能性蛋白酶抑制剂或其变异体作为融合蛋白表达，所述融合蛋白由葡糖淀粉酶信号序列、前序列、催化结构域和连接区域，其可达成熟葡糖淀粉酶的氨基酸数目502，随后的氨基酸NVISKP，以及然后的成熟蛋白酶抑制剂或其变异体组成。
[18]在第二个方面，用蛋白酶处理表达的蛋白质，以便从融合蛋白中释放蛋白酶抑制剂或其变异体。
[19]在第三个方面，本发明提供具有蛋白酶抑制活性的多肽，选自：
a)Bowman-Birk抑制剂变异体；
b)大豆胰蛋白酶抑制剂变异体；
c)Bowman-Birk抑制剂；
d)大豆胰蛋白酶抑制剂；和
e)包含至少一个变异体序列的骨架。
[20]根据下面详细的描述，本发明的其它目的、特征和优势将是显而易见的。然而，应当理解，虽然指明是本发明的优选实施方案，所述详细的描述和具体实施例仅通过举例说明被提供，因为根据该详细描述，在本发明的范围和精神之内的各种改变和修改对本领域普通技术人员将是显而易见的。
附图简述
[21]图1是大豆Bowman-Birk型蛋白酶抑制剂的密码子优化的核苷酸序列(BBI)(SEQ ID NO：1)。该序列包括编码NVISKR的核苷酸(点下划线)、融合蛋白的切割位点以及克隆到表达质粒中的三个限制性酶位点。在5’端的Nhel位点和在3’端的Xhol位点被加以下划线并进行标记。在3’端的BstEII位点用#符号标出。终止密码子用星号标明。没有起始密码子，因为其作为融合蛋白被表达。编码成熟BBI的序列由双下划线标注(SEQ ID NO：2)。在图2中所示，使用编码三个甘氨酸残基的序列，可以将编码三个甘氨酸(图1B)残基的核苷酸添加到编码成熟BBI的序列之前(SEQ ID NO：5)。图1C示出了编码BBI的核苷酸序列、三个限制性位点、kex2位点、在N-端的三个甘氨酸残基和在C-端的六个组氨酸残基(SEQ ID NO：54)。
[22]图2是大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)，Kunitz型蛋白酶抑制剂的密码子优化的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)。该序列包括编码NVISKR的核苷酸(点下划线)(SEQ ID NO：4)、融合蛋白的切割位点以及在C-端的六个组氨酸残基(用点表示)。也包括用于克隆到表达质粒中的三个限制酶位点(在5′端的NheI和在3′端的XhoI和BstEII，如图1所述进行标记)。用黑体表示在kex2位点(NVISKR)之后的三个甘氨酸残基。编码成熟STI的核苷酸序列由虚下划线标出(SEQ IN NO：6)。
[23]图3A是BBI的成熟氨基酸序列(SEQ ID NO：7)。图3B是在N-端具有三个甘氨酸残基的BBI(SEQ ID NO：8)。图3C是在N-端具有三个甘氨酸残基和在C-端具有六个组氨酸残基的BBI(SEQ IDNO：9)。在图3A-C中，环1由下划线标出的氨基酸残基表示，环II氨基酸残基由黑体字表示。
[24]图4A是在N-端具有三个甘氨酸残基和在C-端具有六个组氨酸残基的成熟STI(SEQ ID NO：10)。图4B是在N-端具有三个甘氨酸残基的STI(SEQ ID NO：11)。图4C是STI的成熟氨基酸序列(SEQ IDNO：12)。环1由下划线的氨基酸残基表示(SEQ ID NO：13)。环II氨基酸残基由黑体字表示(SEQ ID NO：14)。
[25]图5是表达质粒pSLGAMpR2-BBI的图。该表达质粒基于pSLGAMpR2，其是通过插入黑曲霉(A.niger)葡糖淀粉酶启动子、催化核心和终止子、标记基因(黑曲霉pyrG)和牛凝乳酶原基因，由pSL1180衍生而来。pSL1180质粒供应自Amersham Biosciences(Piscataway，NJ)。pSLGAMpR2质粒具有上面所列出的插入在与如pSLGAMpR2-BBI所示的相同的相对位置的元件，除牛凝乳酶原基因位于BBI基因处之外。因此，在pSLGAMpR2中BBI基因置换凝乳酶原基因，以产生pSLGAMpR2-BBI。
[26]图6是野生型BBI(SEQ ID NO：7)和BBI的选择的变异体(SEQID NOs：15 thru 29)的氨基酸序列。野生型BBI具有下划线的环。变异体与野生型的差别被显示为或者粗体/下划线(环I)或者粗体(环II)。在一些变异体中，例如C2、C3、C4、C5和B因子，在位置13的丙氨酸(在两个半光氨酸之间)也被变为或者“丝氨酸”、“甘氨酸”或者“谷氨酰胺”。并且，compstatin肽具有9个氨基酸而不是7个。也显示了变异体序列(SEQ ID NOs：30 thru 40)。
[27]图7是蛋白质SDS凝胶的照片。泳道1含有分子量标记。泳道2是未转化的亲代菌株。泳道3是用编码BBI的DNA转化的亲代菌株。泳道4是用编码BBI的载体和编码侣伴蛋白(pdiA)的载体共转化的亲代菌株。泳道15是用编码BBI的载体和编码侣伴蛋白(prpA)的载体共转化的亲代菌株。在侣伴蛋白存在时，期望蛋白质例如BBI的表达得以增强。
[28]图8是质粒pTrex4的图。
[29]图9A-D是pTrex2的核酸序列(SEQ ID NO：41)。
发明详述
[30]现在使用下面的定义和实施例，仅以参考的方式，本发明被予以详细的描述。在此所参考的所有专利和出版物，包括公开在此类专利和出版物中的所有序列，被清楚地引入作为参考。
[31]除非在本文中另外被定义，此处所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域中的普通技术人员一般所理解的同样的含义。Singleton等，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULARBIOLOGY，2D ED.，John Wiley and Sons，New York(1994)和Hale &Marham，THE HARPER COLINS DICTIONARY OF BIOLOGY，HarperPerennial，NY(1991)为普通技术人员提供了关于本发明中所使用的很多术语的综合词典。尽管在本发明的实践或试验中可以使用与那些在此所述的相似或等同的任何方法或材料，优选的方法和材料被予以描述。数字范围包括定义范围的数字。除非另外指示，分别地，核酸以5′到3′的方向，从左到右书写；氨基酸以氨基到羧基的方向，从左到右书写。至于本领域的定义和术语，技术人员特别要参考Sambrook等，1989和Ausubel FM等，1993。应当理解，本发明并不限于所述的具体方法、方案和试剂，因为这些可以改变。
[32]此处所提供的标题并非限制本发明的各个方面或实施方案，其通过参考说明书作为一个整体而被拥有。因此，通过参考作为整体的说明书，下面随即所定义的术语被更加充分地定义。
定义
[33]“表达盒(expression cassette)”或“表达载体(expression vector)”是重组产生或合成产生的核酸构建物(nucleic acid construct)，该核酸构建物具有允许特定核酸在靶细胞中转录的一系列具体的核酸元件。重组表达盒可以被整合到质粒、染色体、线粒体DNA、质粒DNA、病毒或核酸片段中。一般地，除其它序列之外，表达载体的重组表达盒部分包括待转录的核酸序列和启动子。表达盒可以与DNA构建物及其语法等同物交替使用。
[34]如此处所用，术语“载体(vector)”指的是被设计为将核酸序列转移到细胞中的核酸构建物。“表达载体(expression vector)”指的是有能力将异源DNA片段整合到外源细胞中，并在外源细胞中表达的载体。许多原核和真核表达载体是商业可得的。合适的表达载体的选择在具有本领域技术的普通技术人员的知识范围内。
[35]如此处所用，术语“质粒(plasmid)”指的是被用作克隆载体的环状双链(ds)DNA构建物，并且其在一些真核细胞中形成染色体外自我复制的遗传元素，或者整合到宿主染色体内。
[36]术语“核酸分子(nucleic acid molecule)”或“核酸序列(nucleicacid sequence)”包括RNA、DNA和cDNA分子。应当理解，作为遗传密码简并性的结果，可以产生众多编码特定蛋白质的核苷酸序列。
[37]如此处所用，“融合DNA序列(fusion DNA sequence)”从5′到3′，包含第一个、第二个、第三个和第四个DNA序列。
[38]如此处所用，“第一个核酸序列(first nucleic acid sequence)”或“第一个DNA序列(first DNA sequence)”编码在丝状真菌中功能为分泌性序列的信号肽。这样的信号序列包括来自葡糖淀粉酶、α-淀粉酶和天冬氨酰蛋白酶的那些信号序列，所述葡糖淀粉酶、α-淀粉酶和天冬氨酰蛋白酶来自黑曲霉泡盛变种(Aspergillus niger var.awamori)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)；来自木霉属(Trichoderma)的纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、内切葡聚糖酶I、内切葡聚糖酶III的信号序列；来自葡糖淀粉酶的信号序列，所述葡糖淀粉酶来自链孢霉属(Neurospora)和腐质霉属(Humicola)；以及真核细胞的信号序列，包括来自牛凝乳酶、人组织纤溶酶原激活子、人干扰素的信号序列，以及例如由Gwynne等(1987)Bio/Technoloqy 5，713-719所述的合成的共有真核信号序列(consensuseukaryotic signal sequence)。特别优选的信号序列是那些由表达宿主所分泌的多肽衍生而来的信号序列，所述表达宿主被用于表达和分泌融合多肽。例如，当表达和分泌来自黑曲霉(Aspergillus niqer)的融合多肽时，则优选来自黑曲霉的葡糖淀粉酶的信号序列。如此处所用，第一个氨基酸序列对应于在丝状真菌内起作用的分泌性序列。这样的氨基酸序列由所定义的第一个DNA序列编码。
[39]如此处所用，“第二个DNA序列(second DNA sequences)”编码从丝状真菌中正常表达的“分泌多肽(secreted polypeptides)”。这样的分泌多肽包括来自黑曲霉泡盛变种、黑曲霉和米曲霉的葡糖淀粉酶、α-淀粉酶和天冬氨酰蛋白酶；来自木霉属的纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、内切葡聚糖酶I和内切葡聚糖酶III；以及来自链孢霉属的种和腐质霉的种的葡糖淀粉酶。如同第一个DNA序列，优选的分泌多肽是那些由丝状真菌表达宿主天然分泌的多肽。因此，例如当使用黑曲霉时，优选的分泌多肽是来自黑曲霉的葡糖淀粉酶和α-淀粉酶，最优选葡糖淀粉酶。在一个方面，该葡糖淀粉酶与曲霉属的葡糖淀粉酶的同源性大于95％、96％、97％、98％或99％。
[40]当曲霉属葡糖淀粉酶是由第二个DNA序列编码的分泌多肽时，可以使用全蛋白质或其部分，任选包括前序列。因此，在从位置468-509的任何氨基酸残基上，可以将可切割连接多肽(linker polypeptide)融合到葡糖淀粉酶中。其它氨基酸残基也可以成为融合位点，但是利用上述残基是特别有优势的。
[41]“分泌多肽的功能部分(functional portion of a secretedpolypeptide)”或语法等同物指截断的分泌多肽，虽然被截短，其保留可折叠成正常构型的能力。例如，在通过黑曲霉泡盛变种生产牛凝乳酶的情况下，已经显示，与前凝乳酶原(preprochymosin)的生产相比，在成熟葡糖淀粉酶的第11个氨基酸之后的凝乳酶原的融合没有提供益处(美国专利5,364,770)。在USSN 08/318,494中显示，在高达成熟葡糖淀粉酶的第297个氨基酸处，将凝乳酶原融合到前葡糖淀粉酶(preproglucoamylase)的C-端，加上成熟葡糖淀粉酶的氨基酸1-11的重复，没有在黑曲泡盛变种中产生分泌型凝乳酶。在后面的情况中，存在于融合蛋白中的葡糖淀粉酶催化结构域的部分(大约63％)能够正确地折叠是不可能的，因此可能已经产生了异常的、错误折叠的和/或不稳定的融合蛋白，其不能被细胞分泌。部分催化结构域不能正确地折叠可能已经干扰了所连接的凝乳酶的折叠。因此，必须存在天然分泌多肽的结构域的足够残基，以允许它以其正常构型折叠，独立于它所连接的期望多肽，这是有可能的。
[42]在大多数情况下，分泌多肽的部分不但会正确折叠，并且与其不存在时相比可导致分泌增加。
[43]类似地，在大多数情况下，分泌多肽的截断意味着功能部分(functional portion)保留了生物功能。在优选的实施方案中，使用了分泌多肽的催化结构域(catalytic domain)，尽管可以使用其它功能域，例如底物结合结构域(substrate binding domains)。在黑曲霉和黑曲霉泡盛变种葡糖淀粉酶的情况下，优选的功能部分保留了酶的催化结构域，并且包括氨基酸1-471。另外优选的实施方案使用催化结构域和所有或部分连接区。可选择地，可以使用葡糖淀粉酶的淀粉结合结构域，其包含黑曲霉和黑曲霉泡盛变种葡糖淀粉酶的氨基酸509-616。
[44]如此处所用，“第三个DNA序列(third DNA sequences)”包含编码可切割连接多肽的DNA序列。这样的序列包括那些编码葡糖淀粉酶的前序列、牛凝乳酶的前序列、枯草蛋白酶的前序列、包括人免疫缺陷病毒蛋白酶的逆转录蛋白酶的前序列的序列，以及编码被胰蛋白酶、因子Xa胶原酶、梭菌蛋白酶、枯草蛋白酶、凝乳酶、酵母KEX2蛋白酶、曲霉属KEXB及类似物识别并切割的氨基酸序列的DNA序列。参见例如Marston，F.A.O.(1986)Biol.Chem J.240，1-12。这样的第三个DNA序列也可以编码可以被溴化氰选择性切割的氨基酸甲硫氨酸。应当理解，第三个DNA序列仅需要编码被特定的酶或化学试剂识别所必需的氨基酸序列，以进行融合多肽的切割。因此，不必使用例如葡糖淀粉酶、凝乳酶或枯草蛋白酶的完整前序列。相反，仅对被合适的酶识别和切割是必需的那部分前序列是不可缺少的。
[45]应当理解，第三个核酸仅需要编码被特定的酶或化学试剂识别所必需的氨基酸序列，以引起融合多肽的切割。
[46]特别优选的可切割连接子是KEX2蛋白酶识别位点(Lys-Arg)——其可以被天然曲霉属KEX2-样(KEX2-like)(KEXB)蛋白酶切割、胰蛋白酶识别位点Lys和Arg，以及内切蛋白酶的切割识别位点-Lys-C。
[47]如此处所用，“第四个DNA序列(fourth DNA sequence)”编码“期望多肽(desired polypeptides)”。这样的期望多肽包括蛋白酶抑制剂及其变异体。
[48]上面所定义的编码相应的四种氨基酸序列的DNA序列结合形成“融合DNA序列(fusion DNA sequence)”。这样的融合DNA序列从5′端到3′端按第一、第二、第三和第四DNA序列的顺序被装配在合适的阅读框中。当这样装配时，DNA序列将编码“融合多肽(fusionpolypeptide)”或“融合蛋白(fusion protein)”或“融合类似物(fusionanalog)，从其氨基端起，编码在丝状真菌中功能为分泌性序列的信号肽、正常分泌自丝状真菌的分泌多肽或其部分、可切割连接多肽以及期望多肽。
[49]如此处所用，术语“期望蛋白质(desired protein)”或“期望多肽(desired polypeptide)”指的是处于其成熟形式的多肽或蛋白质，其没有被融合到分泌增强构建物(secretion enhancing construct)中。因此，“期望蛋白质(desired protein)”或“期望多肽(desired polypeptide)”指的是以非融合形式被宿主细胞表达和分泌的蛋白质。
[50]如此处所用，“融合多肽(fusion polypeptide)”或“融合蛋白(fusion protein)”或“融合类似物(fusion analog)”从其氨基端起，编码在宿主细胞中作为分泌性序列的信号肽、正常分泌自宿主细胞的分泌多肽或其部分、可切割连接多肽以及期望的多肽。可以通过宿主细胞酶例如蛋白酶加工融合蛋白，以便产生与融合蛋白中的其它蛋白质序列分离的期望蛋白质。如此处所用，术语“融合类似物(fusion analog)”或“融合多肽(fusion polypeptide)”或“融合蛋白(fusion protein)”可以被交替使用。
[51]如此处所用，“启动子序列(promoter sequence)”是被具体丝状真菌识别用于表达目的的DNA序列。它被可操作性地连接到编码上面所定义的融合多肽的DNA序列上。这样的连接包括与编码融合DNA序列的DNA序列的翻译起始密码子有关的启动子的定位。启动子序列含有介导融合DNA序列表达的转录和翻译控制序列。例子包括来自黑曲霉泡盛变种或黑曲霉葡糖淀粉酶基因的启动子(Nunberg，J.H.等(1984)Mol.Cell.Biol.4，2306-2315；Boel，E.等(1984)EMBO J.3，1581-1585)；米曲霉、黑曲霉泡盛变种或黑曲霉α-淀粉酶基因，米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)羧基蛋白酶基因，里氏木霉纤维二糖水解酶I基因的启动子(Shoemaker，S.P.等(1984)欧洲专利申请号EPO0137280A1)；构巢曲霉菌(A.nidulans)trpC基因的启动子(Yelton，M.等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81，1470-1474；Mullaney，E.J.等(1985)Mol.Gen.Genet.199，37-45)；构巢曲霉菌alcA基因的启动子(Lockington，R.A.等(1986)Gene 33137-149)；构巢曲霉菌amdS基因的启动子(McKnight，G.L.等(1986)Cell 46，143-147)；构巢曲霉菌amdS基因的启动子(Hynes，M.J.等(1983)Mol.Cell Biol.3，1430-1439)，以及较高等的真核细胞启动子，例如SV40早期启动子(Barclay，S.L.和E.Meller(1983)Molecular and Cellular Bioloay 3，2117-2130)。
[52]同样，“终止序列(terminator sequence)”是被表达宿主识别以终止转录的DNA序列。它被可操作性地连接到编码待被表达的融合多肽的融合DNA的3′端。例子包括来自构巢曲霉菌trpC基因(Yelton，M.等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81，1470-1474；Mullaney，E.J.等(1985)Mol.Gen.Genet.199，37-45)、黑曲霉泡盛变种或黑曲霉葡糖淀粉酶基因(Nunberg，J.H.等(1984)Mol.Cell.Biol.4，2306-253；Boel，E.等(1984)EMBO J.3，1581-1585)、米曲霉、黑曲霉泡盛变种或黑曲霉α-淀粉酶基因以及米黑根毛霉羧基蛋白酶基因(EPO公开号0215594)的终止子，尽管在本发明中任何真菌终止子都有可能是起作用的。
[53]“聚腺苷酸化序列(polyadenylation sequence)”是当转录时被表达宿主识别以将多腺苷酸残基(polyadenosine residue)加入到转录的mRNA的DNA序列。它被可操作地连接到编码待表达的融合多肽的融合DNA的3′端。例子包括来自上述的构巢曲霉菌trpC基因(Yelton，M.等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81，1470-1474；Mullaney，E.J.等(1985)Mol.Gen.Genet.199，37-45)、黑曲霉泡盛变种或黑曲霉葡糖淀粉酶基因(Nunberg，J.H.等(1984)Mol.Cell.Biol.4，2306-2315)(Boel，E.等(1984)EMBO J.3，1581-1585)、米曲霉、黑曲霉泡盛变种或黑曲霉α-淀粉酶基因以及米黑根毛霉羧基蛋白酶基因的聚腺苷酸化序列。然而，任何真菌聚腺苷酸化序列在本发明中有可能是起作用的。
[54]如此处所用，术语“编码选择标记的核苷酸序列(selectablemarker-encoding nucleotide sequence)”指的是能够在真菌细胞中表达的核苷酸序列，并且其中选择标记的表达赋予含有表达的基因的细胞可在相应的选择性条件存在下生长的能力。
[55]当一个核酸被放置到与另一个核酸序列的功能关系中的时候，该核酸是“可操作连接的(operably linked)”。例如编码分泌前导序列(secretory leader)的DNA被表达为参与多肽的分泌的前蛋白质的话，则所述DNA与多肽的DNA是可操作连接的；如果启动子或增强子影响序列的转录，则所述启动子或增强子与所述编码序列是可操作连接的；或者如果核糖体结合位点被置于促进翻译的位置，则其与编码序列是可操作连接的。一般而言，“可操作连接的(operably linked)”意味着被连接的DNA序列是邻接的，而且在分泌性前导序列的情况下，是邻接并处于阅读相(reading phase)中。然而，增强子不必是邻接的。连接通过在方便的限制位点的连接得以实现。如果这样的部位不存在，根据常规实践，使用合成的寡核苷酸接头(adaptor)或连接子。
[56]如此处所用，“重组体(recombinant)”包括涉及细胞或载体，其已经被异源核酸序列的引入而修饰，或者细胞衍生自如此进行修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达了在天然(非重组)形式的细胞内没有以同样的形式被发现的基因，或者作为有目的的人为干预的结果，表达了在其他情况下异常表达的、低量表达或者根本不被表达的天然基因。
[57]如此处所用，术语“表达(expression)”指的是过程，通过该过程，基于基因的核酸序列而产生多肽。此过程包括转录和翻译。接下来，术语“蛋白酶抑制剂表达(protease inhibitor expression)”指的是待表达的特定蛋白酶抑制剂及其变异体基因的转录和翻译，其产物包括前体RNA、mRNA、多肽、翻译后加工的多肽及其衍生物。类似地，“蛋白酶抑制剂表达(protease inhibitor expression)”指的是蛋白酶抑制剂及其变异体转录、翻译及装配成为由图6所示范的形式。通过例子，蛋白酶抑制剂表达的测定包括对暴露于合适条件时的真菌菌落的检查，蛋白酶抑制剂蛋白质的蛋白质印迹，以及蛋白酶抑制剂mRNA的Northen印迹分析和逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)测定。
[58]如此处所用，术语“糖基化的(glycosylated)”意指已经被加入到蛋白质上的具体氨基酸残基中的寡糖分子。“去糖基化的(de-glycosylated)”蛋白质是已经进行处理以将寡糖分子部分和完全从蛋白质去除的蛋白质。“无糖基化的(aglycosylated)”蛋白质指的是没有将寡糖分子添加到蛋白质中的蛋白质。这可能是由于在蛋白质中的突变，该突变阻止了寡糖的添加。
[59]“非糖基化的(non-glycosylated)”蛋白质是没有附着于蛋白质的寡糖的蛋白质。这可能是由于多种原因，包括但不限于缺乏负责将寡糖加入到蛋白质中的酶。术语“非糖基化的”蛋白质包括没有将寡糖加入到蛋白质中的蛋白质，以及那些其中寡糖已经被加入但随后被去除的蛋白质。“无糖基化的”蛋白质可以是“非糖基化的”蛋白质。“非糖基化的”蛋白质可以或者是“无糖基化的”蛋白质或者是“去糖基化的”蛋白质。
[60]如此处所用的术语“分离的(isolated)”或“纯化的(purified)”指的是从与其天然有联系的至少一种组分中被移去的核酸或多肽。
[61]术语“基本上没有(substantially free)”包括具有小于大约20％(按干重计算)的其它蛋白质(即污染蛋白质(contaminating protein))、小于大约10％的其它蛋白质、小于大约5％的其它蛋白质或小于大约1％的其它蛋白质的期望多肽制剂。
[62]词语“基本上纯的(substantially pure)”，当应用于本发明的蛋白质或其片段时，意指蛋白质基本没有其它物质，对于它们的目的用途而言，达到实践及合适的程度。具体而言，所述蛋白质足够纯，并且充分地无宿主细胞的其它生物组分，以便用于例如蛋白质测序或生产药物制剂。
[63]如此处所用的“靶蛋白(target protein)”指的是蛋白质，例如酶、激素或类似物，它们的作用将通过本文所提供的不同的抑制剂的结合而阻断。
[64]术语“变异体序列(variant sequence)”或“许多变异体序列(variantsequences)”指的是置换野生型蛋白酶抑制剂或其它支架的结合环(binding loop)的短多肽序列(许多短多肽序列)。变异体序列不必与其在支架中所置换的结合环序列具有相同的长度。
[65]术语“支架(scaffold)”指的是变异体序列可以被引入其中的野生型蛋白质序列。在一个实施方案中，支架具有可以被置换的部分，例如环。例如，此处所用的STI和BBI序列将是变异体序列的支架。
蛋白酶抑制剂
[66]两种蛋白酶抑制剂已经从大豆中分离出：Kunitz-型胰蛋白酶抑制剂(大豆胰蛋白酶抑制剂，STI)和Bowman-Birk蛋白酶抑制剂(BBI)。参见例如Birk，Int.J.Pept.Protein Res.25：113-131(1985)和Kennedy，Am.J.Clin.Neutr.68：1406S-1412S(1998)。这些抑制剂作为变异体序列的支架。
[67]另外，对于包含变异体序列的支架中的改变，此处所用的其它期望蛋白质包括在N-端加入三个甘氨酸残基，和/或在C-端加入六个组氨酸残基。参见图3和4。
大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)
[68]通过形成稳定的化学计量复合物(stoichiometric complex)，STI抑制胰蛋白酶的蛋白酶解活性。参见例如Liu，K.，Chemistry andNutritional value of soybean components，在Soybeans，chemistry，technology and utilization.pp.32-35(Aspen publishers，Inc.，Gaithersburg，Md.，1999)中。STI由具有两个二硫键的181个氨基酸残基组成，并且是近似球形的。参见例如Song等，J.Mol.Biol.275：347-63(1998)。所述两个二硫键形成两个结合环，其类似于下面为BBI描述的那些结合环。
[69]Kunitz-型大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)在蛋白酶的早期研究中起了关键的作用，已经被用作生化和动力学工作中的主要底物，其导致了对蛋白酶抑制剂作用的标准机理的定义。
Bowman-Birk抑制剂(BBI)
[70]BBI蛋白质是在动力学和结构上被充分表征的小蛋白质(60-90个残基)家族，其从豆科种子中分离得到。它们具有两个三环结构域(tricyclic domain)的对称结构，每个三环结构域含有独立的结合环。环I一般抑制胰蛋白酶，而环II抑制胰凝乳蛋白酶(Chen等，J.Biol.Chem.(1992)267：1990-1994；Werner & Wemmer，1992；Lin等，Eur.J.Biochem.(1993)212：549-555；Voss等，Eur.J.Biochem.(1996)242：122-131)。这些结合结构域各自含有“正则环(canonical loop)”结构，其为被发现存在于很多丝氨酸蛋白酶抑制剂中的基序(Bode & Huber，Eur.J.Biochem.(1992)204：433-451)。
[71]BBI是在不同的反应位点抑制蛋白酶胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的8k-Da蛋白质。参见例如Billings等，Pro-Natl.Acad.Sci.89：3120-3124(1992)。STI和BBI仅在大豆种子中被发现，而在该植物的任何其它部分都没有发现。参见例如Birk，Int.J.Pept.Protein Res.25：113-131(1985)。
[72]尽管BBI的很多同种型已经被表征，SEQ ID NO：7(图3)显示了此处所用的包含大约71个氨基酸残基的BBI主架的氨基酸序列。另外，BBI可以被截断，从N-端或C-端去除多达10个氨基酸残基。例如，在种子干燥之后，可将BBI去除C-端的9个或10个氨基酸残基。因此，在起始二硫键之前和末端二硫键之后，蛋白水解是高度耐受的，其结果对于结合靶蛋白通常是无害的。然而，应当理解，可以使用同种型或截短形式中的任何一种。
蛋白酶抑制剂变异体
[73]如上所述，STI和BBI蛋白酶抑制剂具有抑制蛋白酶的结合环。此处所提供的本发明的蛋白酶抑制剂变异体在环I、环II或两个环中都有变化。在一个实施方案中，用与靶蛋白相互作用的序列置换环。
[74]可以用衍生自VEGF结合蛋白，其为补体途径(complementpathway)的抑制剂，例如C2、C3、C4或C5抑制剂；棉花结合蛋白；Compstatin及类似物的序列来置换环。可选择地，可以通过在本领域中已知的多种方法选择变异体序列，例如，噬菌体文库或其它筛选方法。例如，将随机肽基因文库与噬菌体PIII基因融合，这样肽文库将被展示在噬菌体的表面上。随后，将噬菌体展示文库暴露于靶蛋白，并用缓冲液洗，以去除非特异结合(该过程有时被称作淘选)。最后，分离结合噬菌体并PCR扩增编码肽的DNA序列。
[75]一般地，环将被变异体序列即肽置换，其长度为3至14个氨基酸，5至10个氨基酸是优选的。可以使用更长的序列，只要它们提供所需的结合和/或抑制。另外，适合用作置换结合环的肽当被包含在约束环(constrained loop)内时应当采用功能性构象(functionalconformation)，约束环即为通过在两个半胱氨酸残基之间存在二硫键而形成的环。在具体实施方案中，肽的长度在7个到9个氨基酸之间。这些置换序列也提供了对靶蛋白的蛋白酶抑制作用或与靶蛋白的结合。
[76]在一些情况下，改变单个氨基酸是有利的。具体而言，在野生型STI或BBI的残基-13的丙氨酸可以被变为丝氨酸、甘氨酸或谷氨酰胺。
融合蛋白
[77]每个蛋白酶抑制剂及其变异体将被宿主真菌细胞作为融合蛋白表达。尽管切割融合多肽以释放期望蛋白质经常是有用的，然而这不是必需的。作为融合蛋白被表达并被分泌的蛋白酶抑制剂及其变体令人惊奇地保留了它们的功能。
[78]上面所定义的编码相应的四个氨基酸序列的DNA序列结合形成“融合DNA序列”。这样的融合DNA序列从5′端到3′端按第一个、第二个、第三个和第四个DNA序列的顺序被装配在合适的阅读框中。当这样装配时，DNA序列将编码“融合多肽(fusion polypeptide)”，其从它的氨基端起，编码在丝状真菌中功能为分泌性序列的信号肽、正常分泌自丝状真菌的分泌多肽或其部分、可切割连接肽以及期望多肽，例如蛋白酶抑制剂及其变异体。
[79]通过使用在例如美国专利5,411,873、5,429,950和5,679,543中所公开的方法，可以实现融合蛋白的生产。其它方法在本领域中是熟知的。
重组蛋白酶抑制剂的表达
[80]就本发明取决于融合蛋白的生产这一范畴来说，它依靠重组遗传学领域中的常规技术。公开用在本发明中的一般方法的基础教材包括Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(2nd ed.1989)；Kriegler，Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual(1990)和Ausubel等，eds.，Current Protocols in Molecular Biology(1994)。
[81]本发明提供了已经用包含编码蛋白酶抑制剂的核酸序列的表达载体转导、转化或转染的丝状真菌宿主细胞。培养条件例如温度、pH及类似条件，是先前在转导、转化或转染之前用于亲代宿主细胞的那些条件，而且对本领域普通技术人员将是显而易见的。
[82]基本上，编码融合蛋白的核酸序列被可操作性地连接到在宿主细胞中起作用的启动子序列。然后，在转化到宿主细胞中进行复制和/或表达之前，一般将该启动子-基因单元克隆到中间载体中。这些中间载体一般为原核载体如质粒或穿梭载体。
[83]在一个方法中，用表达载体转染丝状真菌细胞系，所述表达载体具有启动子，或生物活性启动子片段，或一个或多个(例如一系列)在宿主细胞系中发挥作用的增强子，它们可操作连接到编码蛋白酶抑制剂的核酸序列上，因此，蛋白酶在细胞系中被表达。在一个优选的实施方案中，DNA序列编码蛋白酶抑制剂或其变异体。在另一个优选地实施方案中，启动子是可调节的启动子。
A.密码子优化
[84]用那些表达不好的基因来优化表达良好的基因中的密码子选择在本领域中是已知的。参见Barnett等，GB2200118和Bergquist等，Extremophiles(2002)6：177-184。如此处所用，密码子优化基于比较在曲霉属中表达良好的异源蛋白质及天然分泌蛋白与表达不好的异源蛋白质。参见表1。
表1：
  表达良好的蛋白质   表达不好的蛋白质
  葡糖淀粉酶α-淀粉酶葡萄穗霉属漆酶A(stachybotryslaccase A)葡萄穗霉属漆酶B人胰蛋白酶SCCE牛凝乳酶原Her2抗体轻链   人DPPIVNEP
[85]在表达的蛋白质中不被使用或不被经常使用的选择的密码子将被变为经常被使用的密码子。因此，我们仅改变密码子的亚型(subset)。
B.核酸构建物/表达载体
[86]编码蛋白酶抑制剂的天然或合成多核苷酸片段(“编码PI的核酸序列(PI-encoding nucleic acid sequences)”)可以被整合到异源核酸构建物或载体中，所述异源核酸构建物或载体能够引入到丝状真菌细胞中，并且在丝状真菌细胞中复制。此处所公开的载体和方法适合用在用于蛋白酶抑制剂及其变异体的表达的宿主细胞中。可以使用任何载体，只要所述载体在其被引入的细胞中是可复制以及能生存的。很多合适的载体和启动子对本领域的普通技术人员而言是已知的，并且是商业可得的。用在丝状真菌细胞中的合适的克隆和表达载体也在Sambrook等，1989和Ausubel FM等，1989中得以描述，在此将这些文献清楚地引入作为参考。通过很多方法，可以将合适的DNA序列插入到质粒或载体中(在此全部被称作“载体(vectors)”)。一般而言，通过标准方法将DNA序列插入到合适的限制酶位点。这样的方法以及相关的亚克隆方法(sub-cloning procedures)被认为是在本领域普通技术人员的知识范围内。
[87]合适的载体一般被装备有编码选择性标记的核酸序列、插入位点和合适的控制元件例如终止序列。载体可以包含调节序列，包括例如非编码序列，如内含子和控制元件，即启动子和终止子元件或5′和/或3′非翻译区，其对编码序列在宿主细胞(和/或在载体中，或宿主细胞环境中，其中编码修饰的可溶性蛋白质的序列未被正常表达)中的表达是有效的，所述调节序列被可操作性地连接到编码序列上。很多合适的载体和启动子是本领域普通技术人员已知的，其中许多是商业可得的，和/或在Sambrook等(如前述)中得以描述。
[88]示例性启动子包括组成型启动子和诱导型启动子，其例子包括CMV启动子、SV40早期启动子、RSV启动子、EF-1α启动子、在如(ClonTech和BASF)所述的tet-on或tet-off系统中含有tet效应元件(tet responsive element)(TRE)的启动子、β-肌动蛋白启动子以及通过一些金属盐的加入可以被上调(upregulated)的金属硫蛋白启动子。在本发明的一个实施方案中，使用了glaA启动子。在麦芽糖存在下，该启动子被诱导。这样的启动子是本领域普通技术人员所熟知的。
[89]本领域普通技术人员知道，在不改变其功能的情况下，通过一个或多个核苷酸的置换、取代、添加或删除，可以修饰天然启动子。本发明的实践包含对启动子的此类改变，并且不限于对启动子的此类改变。
[90]对用在遗传构建物中的启动子的选择在本领域普通技术人员的知识范围内。
[91]对合适的选择标记的选择将取决于宿主细胞，并且不同的宿主的适宜标记在本领域中是熟知的。一般的选择标记基因编码蛋白质，所述蛋白质(a)赋予对抗生素或其它毒素的抗性，例如氨苄青霉素、甲氨蝶呤、四环素、新霉素(Southern and Berg，J.，982)，酶酚酸(Mulligan和Berg，1980)、嘌呤霉素、zeomycin或潮霉素(Sugden等，1985)，或(b)补充宿主菌株中的营养缺陷型突变或天然存在的营养缺陷。在优选的实施方案中，使用真菌pyrG基因作为选择标记(Ballance，D.J.等，1983，Biochem.Biophys.Res.Commun.112：284-289)。在另一个优选的实施方案中，使用真菌amdS基因作为选择标记(Tilburn，J.等，1983，Gene 26：205-221)。
[92]根据熟知的重组技术，编码选择性的PI的序列可以被插入到合适的载体中，并被用于转化能够进行PI表达的细胞系。由于遗传密码具有固有的简并性，可以使用编码基本相同或功能等同的氨基酸序列的其它核酸序列来克隆和表达特异蛋白酶抑制剂，如上进一步祥述。因此，应当理解，在编码区中的这样的取代在由本发明所覆盖的序列变异体的范围内。可以按与此处为编码亲代PI的核酸序列所述的相同的方法，使用任何或所有这些序列变异体。本领域普通技术人员将会认识到，不同的PI将由不同的核酸序列编码。
[93]一旦获得期望形式的蛋白酶抑制剂核酸序列、同源物、变异体或其片段，它可以用很多方式进行修饰。在序列包括非编码侧翼区处，侧翼区可以进行切除、诱变等。因此，在天然存在的序列上可以进行转换、颠换、剔除和插入。
[94]异源核酸构建物可以包括蛋白酶抑制剂或其变异体、片段或剪接变体的编码序列：(i)分离的；(ii)与额外的编码序列结合；例如编码融合蛋白或信号肽的序列，其中编码PI的序列是显性编码序列(dominant coding sequence)；(iii)与非编码序列结合，例如内含子和控制元件，例如启动子和终止子元件或5′和/或3′非翻译区，其对编码序列在合适的宿主中的表达是有效的；和/或(iv)在载体或宿主环境中，其中编码PI的序列是异源基因。
[95]如上所述，含有适当的核酸编码序列的异源核酸，连同适当的启动子和控制序列可以被用于转化丝状真菌细胞，以便允许细胞表达蛋白酶抑制剂或其变异体。
[96]在本发明的一个方面，使用异源核酸构建物，在体外将编码PI的核酸序列转移到细胞中，优选确定的细胞株。优选地，被用作生产宿主(production host)的细胞系具有被稳定整合的本发明的核酸序列。应当理解，对产生稳定的转化体有效的任何方法都可以被用在实践本发明中。
[97]在本发明的一个方面，第一个和第二个表达盒可以存在于单个载体上或不同的载体上。
[98]除非另外表明，本发明的实践将使用分子生物学、微生物学和重组DNA的常规技术，这些技术都在本领域的技术范围内。此类技术在文献中得到充分解释。参见例如“Molecular Cloning：A LaboratoryManual”，Second Edition(Sambrook，Fritsch & Maniatis，1989)，“AnimalCell Culture”(R.I.Freshney，ed.，1987)；和“Current Protocols in MolecularBiology”(F.M.Ausubel等，eds.，1987)。在本文中所提及的所有上述和下述专利、专利申请、文章以及出版物通过参考清楚地并入本文。
[99]除启动子序列之外，表达盒也应当含有结构基因下游的转录终止区，以便提供有效的终止。终止区可以从与启动子序列相同的基因中获得，或者可以从不同的基因中获得，这也在本领域普通技术人员的知识范围内。
[100]用于将遗传信息转运到细胞中的特定表达载体不是特别关键的。可以使用在真核或原核细胞中用于表达的任何一种常规载体。标准细菌表达载体包括噬菌体λ和M13，以及质粒，例如基于pBR322的质粒、pSKF、pET23D，和融合表达系统，例如MBP、GST和LacZ。也可以将附加表位例如c-myc加入重组蛋白质中，以便提供方便的分离方法。
[101]一般包括在表达载体中的元件也包括复制子，编码抗生素抗性的基因以允许选择容纳重组质粒的细菌，以及在质粒的非必需区中的独特的限制性位点，以便允许异源序列的插入。所选择的具体抗生素抗性基因不是关键的，在本领域中已知的许多抗性基因的任何一种部是合适的。
C.宿主细胞和培养条件
[102]本发明提供了细胞系，所述细胞系包含以有效的方式被修饰、选择和培养，从而表达蛋白酶抑制剂及其变异体的细胞。
[103]可以被处理和/或修饰用于PI表达的亲代细胞系的例子包括但不限于丝状真菌细胞。用于实施本发明的适当的初级细胞类型的例子包括但不限于曲霉属和木霉菌属。
[104]在一般被用于培养亲代细胞系的条件下，培养蛋白酶抑制剂表达细胞。一般地，细胞被培养在标准培养基中，该标准培养基含有生理盐水和营养物，例如标准RPMI、MEM、IMEM或DMEM，一般补充以5-10％的血清，例如胎牛血清。培养条件也是标准的，例如，在37℃，在静置培养或转管培养中温育培养物，直到达到蛋白酶抑制剂的期望水平。
[105]给定细胞系的优选的培养条件可以在科学文献和/或细胞系的来源例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC；“http：//www.atcc.org/”)中找到。一般而言，在细胞生长已经被建立之后，将细胞暴露于可有效引起或抑制蛋白酶抑制剂及其变异体表达的条件。
[106]在优选的实施方案中，在编码PI的序列在诱导型启动子的控制之下时，将诱导剂例如碳水化合物、金属盐或抗生素以可有效诱导蛋白酶抑制剂表达的浓度加入到培养基中。
D.将编码蛋白酶抑制剂的核酸序列引入到宿主细胞中
[107]所使用的转化方法可以导致所有或部分转化载体稳定整合入丝状真菌的基因组中。然而，导致自我复制的染色体外转化载体的维持的转化也被考虑在内。
[108]本发明进一步提供了细胞和细胞组合物，所述细胞和细胞组合物已经被遗传修饰，以包含外源提供的编码PI的核酸序列。亲代细胞或细胞系可以用克隆载体或表达载体进行遗传修饰(即转导、转化或转染)。载体可以是例如质粒、病毒颗粒、噬菌体等的形式，进一步如上所述。在优选的实施方案中，质粒被用于转染丝状真菌细胞。转化可以是顺序的或者通过共转化进行。
[109]各种方法可以被用于体外将表达载体传输到细胞中。将核酸引入到细胞中用于表达异源核酸序列的方法也是本领域普通技术人员已知的，包括但不限于电穿孔；核显微注射或直接显微注射入单细胞中；与完整细胞的原生质融合；使用聚阳离子，例如聚凝胺(polybrene)或聚鸟氨酸；或用脂质体、脂转染胺或脂转染介导的转染进行的PEG膜融合；利用DNA包被的微粒的高速轰击；用磷酸钙-DNA沉淀温育；二乙胺乙基葡聚糖介导的转染；用修饰的病毒核酸进行的感染；农杆菌属介导的DNA的转移；以及类似方法。另外，可以体外转录包含编码PI的核酸序列的异源核酸构建物，并且所形成的RNA通过熟知的方法例如注射可以被引入宿主细胞中。
[110]在引入包含蛋白酶抑制剂的编码序列的异源核酸构建物之后，遗传修饰的细胞可以培养在常规营养培养基中，该常规营养培养基被修饰以适合于激活启动子，选择转化体，或者扩增编码PI的核酸序列的表达。培养条件例如温度、pH及类似条件是前面被选择用于表达的宿主细胞所用的那些条件，并且这些条件对本领域普通技术人员将是显而易见的。
[111]此类异源核酸构建物所引入其中的细胞的子代一般被认为包含编码PI的核酸序列，该核酸序列被发现存在于异源核酸构建物中。
E.真菌表达
[112]适当的宿主细胞包括丝状真菌细胞。本发明的“丝状真菌(filamentous fungi)”，作为表达宿主和第一及第二核酸的来源，是真核微生物，并且包括亚门真菌亚门(Eumycotina)的所有丝状形式，Alexopoulos，C.J.(1962)，Introductory Mycology，New York：Wiley。这些真菌的特征是营养菌丝，其具有由几丁质、葡聚糖和其它复杂多糖组成的细胞壁。本发明的丝状真菌在形态上、生理上以及遗传上是不同于酵母的。丝状真菌的营养生长是通过菌丝延伸进行的。相反，酵母例如酿酒酵母(S.cerevisiae)的营养生长是通过单细胞菌体的芽殖来进行的。酿酒酵母和丝状真菌之间的差异的例子包括酿酒酵母不能处理曲霉属和木霉菌属内含子，以及酿酒酵母不能识别丝状真菌的许多转录调节物(Innis，M.A.等，(1985)Science，228，21-26)。
[113]多种丝状真菌可以被用作表达宿主，包括下列属：曲霉属、木霉菌属、链孢霉属、青霉属、头孢霉属(Cephalosporium)、绵霉属(Achlya)、白腐菌属(Phanerochaete)、柄孢壳菌属(Podospora)、栗疫壳菌属(Endothia)、毛霉属(Mucor)、镰孢菌属、腐质霉属和Chrysosporium。具体的表达宿主包括构巢曲霉(Yelton，M.等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，1470-1474；Mullaney，E.J.等(1985)Mol.Gen.Genet.199，37-45；John，M.A.和J.F.Peberdy(1984)Enzyme Microb.Technol.6，386-389；Tilburn等(1982)Gene 26，205-221；Ballance，D.J.等(1983)Biochem.Biophys.Res.Comm.112，284-289；Johnson，I.L.等(1985)EMBO J.4，1307-1311)、黑曲霉(Kelly，J.M.和M.Hynes(1985)EMBO 4，475-479)、黑曲霉泡盛变种例如NRRL 3112、ATCC 22342、ATCC 44733、ATCC 14331和菌株UVK 143f、米曲霉例如ATCC 11490、粗糙脉孢菌(N.crassa)(Case，M.E.等(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76，5259-5263；Lambowitz的美国专利号4,486,553；Kinsey，J.A.和J.A.Rambosek(1984)Molecular and Cellular Biology 4，117-122；Bull，J.H.和J.C.Wooton(1984)Nature 310，701-704)、里氏木霉例如NRRL15709、ATCC 13631、56764、56765、56466、56767，以及绿色木霉(Trichoderma viride)例如ATCC 32098和32086。优选的表达宿主是黑曲霉泡盛变种，其中编码主要的分泌型天冬氨酰蛋白酶的基因已经被去除。在于1988年7月1日提交的美国专利申请序列号214,237中描述了此种优选的表达载体的产生，在此清楚地引入该文献作为参考。
[114]在真菌中的分泌过程中，分泌性蛋白穿越膜从细胞质进入内质网(ER)的腔，所述真菌是真核细胞。在腔中，蛋白质折叠以及二硫键得以形成。侣伴蛋白质例如BiP，以及蛋白质如蛋白质二硫键异构酶辅助此过程。也是在此阶段，糖链被连接到蛋白质上而产生糖基化的蛋白。糖一般被添加到天冬酰胺残基上作为N-连接糖基化，或者被添加到丝氨酸或苏氨酸残基上作为O-连接糖基化。正确折叠和糖基化的蛋白质从ER传递到高尔基体，在此糖链被修饰，并且酵母和真菌的KEX2或KEXB蛋白酶停留在此处。添加到在真菌中产生的分泌性蛋白中的N-连接糖基化不同于通过哺乳细胞所添加的N-连接糖基化。
[115]由丝状真菌宿主细胞产生的蛋白酶抑制剂及其变异体可以是糖基化的或者非糖基化的(即无糖基化的或者去糖基化的)。因为真菌的糖基化模式不同于由哺乳细胞所产生的糖基化模式，所以可以用酶处理蛋白酶抑制剂，以使蛋白酶抑制剂去糖基化。可用于此类N-连接糖基化的酶是内切糖苷酶H、内切糖苷酶F1、内切糖苷酶F2、内切糖苷酶A、PNGase F、PNGase A以及PNGase At。可用于此类O-连接糖基化的酶是外切糖苷酶，具体地为α-甘露糖苷酶(例如α-甘露糖苷酶(Aspergillus saito，iGKX-5009)、α(1-2，3，6)-甘露糖苷酶(Jack bean，GKX-5010)、α-甘露糖苷酶/MANase Vl(来自Xanthomonas manihoti的重组体，GKX80070)，所有这些酶都来自Glyko (Prozyme)，SanLeandro，California)。
[116]我们惊讶地发现，当融合到天然分泌性蛋白的时候，在真菌中可以制备高水平的蛋白酶抑制剂及其变异体。根据上面所提供的信息，有一点是清楚的，即当葡糖淀粉酶还连接在N端的时候，蛋白酶抑制剂及其变异体将有望在ER中装配。这将产生大于56kD的大蛋白质。当葡糖淀粉酶经过高尔基体时，不期望在没有进一步修饰的情况下而将其从所需蛋白质中切割下来。
[117]使用本发明的方法和宿主细胞，我们已经得到惊人的表达水平。此处所使用的系统已经达到大于0.5g/l蛋白酶抑制剂的分泌和表达水平。
[118]在表达载体被引入到细胞中之后，在有利于编码期望蛋白质的基因的表达的条件下培养转染的细胞。可以培养大批转化的细胞，如上所述。最后，用本领域已知的技术从培养物中回收产品。
侣伴蛋白
[119]如上所述，分泌性蛋白在ER中的折叠和糖基化得到很多被称作侣伴蛋白的ER-驻留蛋白(ER-resident protein)的帮助。通过结合到未折叠状态的暴露的疏水区，并防止不利的相互作用，侣伴蛋白如Bip(GRP78)、GRP94或酵母Lhs1p帮助分泌性蛋白折叠(Blond-Elguindi等，1993，Cell 75：717-728)。侣伴蛋白对于蛋白质转移通过ER膜也是重要的。折叠酶蛋白如蛋白质二硫键异构酶(pdi)及其同系物和脯氨酰-肽基顺-反异构酶分别辅助二硫键的形成，以及邻接脯氨酸残基的肽链的正确构象的形成。
[120]在本发明的一个方面，宿主细胞用编码侣伴蛋白的表达载体转化。侣伴蛋白选自pdiA和prpA。
发酵参数
[121]本发明取决于用于培养真菌的发酵过程。用于生产异源蛋白质的发酵过程其本身在本领域中是已知的。例如，蛋白质可以通过固体培养或浸没培养生产，包括分批、补料分批和连续-流动工艺。
[122]在生长培养基中完成培养，所述生长培养基包括含水无机盐培养基、有机生长因子、碳和能源物质、分子氧，当然还包括一种或多种待用的具体微生物种的起始接种物(starting inoculum)。
[123]除碳和能源、氧、可同化的氮以及微生物的接种物之外，按适当的比例供应适量的矿质营养物是必需的，以保证适宜的微生物生长，并且在微生物转化过程中细胞最大化碳及能源的同化，以及在发酵培养基中用最大的细胞密度得到最大的细胞产量。
[124]含水矿质培养基的组成可以在很宽的范围内变化，这部分取决于所使用的微生物和底物(substrate)，这在本领域是已知的。除氮之外，矿质培养基应当包括适当的、可溶的、可同化的离子或结合形式的适量磷、镁、钙、钾、硫和钠，并且也应该优选存在一些微量元素，例如铜、锰、钼、锌、铁、硼和碘以及其它微量元素，这些微量元素同样是适当的、可溶的、可同化的形式，所有这些都是本领域中已知的。
[125]发酵反应是好氧过程，其中所需分子氧由含分子氧的气体例如空气，富含氧的空气、或者甚至基本纯的分子氧提供，目的是使发酵容器的内含物维持在合适的氧分压下，以有效地帮助微生物菌种茁壮生长。实际上，通过使用氧化的碳氢化合物底物，可减少微生物生长的需氧量。然而，必须供应分子氧用于生长，因为底物的同化和微生物相应的生长部分地是一个氧化过程。
[126]尽管通气速率可以在相当大的范围内变化，通气一般在每分钟每发酵罐中的液体体积大约0.5至10，优选大约0.5至7体积(在所用压力下，25℃)含氧气体的范围内的速率下进行。该量基于供应到反应器中的具有正常氧含量的空气，按照纯氧，各自的范围是每分钟每发酵罐中的液体体积大约0.1至1.7，或优选大约0.1至1.3体积(在所用压力下，25℃)的氧。
[127]微生物转化过程所使用的压力可以在广泛的范围内。压力一般在大约0至50磅/平方英寸(psig)的范围内，目前优选大约0至30磅/平方英寸，更优选至少稍微高于大气压，这样可达到设备与操作费用对氧溶度的平衡。高于大气压是有利的，因为这样的压力的确倾向于增加含水发酵物中的溶解的氧浓度，这反过来可以帮助增加细胞生长速率。同时，通过高的大气压的确增加设备和操作费用这样的事实，这也得以平衡。
[128]发酵温度可以稍微改变，但对于丝状真菌例如黑曲霉泡盛变种而言，温度一般会在大约20℃至40℃的范围内，一般优选在大约28℃至37℃的范围内，这取决于所选择的微生物的菌株。
[129]微生物也需要可同化的氮源。可同化的氮源可以是任何一种含氮化合物或多种含氮化合物，所述化合物能够以适合微生物代谢利用的形式释放氮。虽然可以使用各种有机氮源化合物，例如蛋白水解物，然而通常利用便宜的含氮化合物，例如氨、氢氧化铵、尿素以及各种铵盐例如磷酸铵、硫酸铵、焦磷酸铵、氯化铵或各种其它铵化合物。氨气本身对于大规模操作是方便的，并且可以以合适的量鼓泡通过含水发酵物(发酵培养基)而被利用。同时，此类氨也可被用于帮助控制pH。
[130]含水微生物酵素(发酵混合物)中的pH范围应当在大约2.0至8.0的示例性范围内。对于丝状真菌，pH正常在大约2.5至8.0的范围内；对于黑曲霉泡盛变种，pH正常在大约4.5至5.5的范围内。一些微生物的pH优选范围在某种程度上取决于所使用的培养基，以及具体微生物，因此，随培养基的变化而微微产生的变化可以被本领域普通技术人员容易地确定。
[131]虽然发酵混合物在发酵罐中的平均滞留时间可以相当大地变化，这部分地取决于发酵温度和所用的培养物，一般的，所述滞留时间在大约24至500小时的范围内，目前优选大约24至400个小时。
[132]优选地，发酵以这样的方法进行，即，含碳底物可以被控制作为限制因子，从而可提供含碳底物向细胞的良好的转化，并避免细胞被大量未转化的底物污染。后者对于水溶性底物不是问题，因为任何残余的痕量可被容易地洗去。然而，在非水溶性底物的情况下，这可能是个问题，需要增加的产物处理步骤例如合适的洗涤步骤。
[133]如上所述，达到此种限制底物水平的时间不是关键的，并且可以随具体微生物以及所进行的发酵工艺而改变。然而，如何确定发酵培养基中的碳源浓度以及期望的碳源水平是否已经达到在本领域中是熟知的。
[134]尽管可以按分批或连续的操作进行发酵，由于易于控制、产生统一数量的产品以及所有设备最经济的应用，补料分批操作一般是优选的。
[135]如果需要的话，在将含水矿质培养基送入发酵罐之前，可以将部分或所有碳和能源物质和/或部分可同化的氮源例如氨加入到含水矿质培养基中。
[136]优选在预定的速率下，或者响应于通过监测例如碳和能量底物的浓度、pH、溶解的氧、来自发酵罐的废气中的氧或二氧化碳、通过透光度可测量的细胞密度或类似物而可确定的需要，控制被导入反应器中的每个流。各种材料的加料速度可以被改变，以便得到尽可能快的细胞生长速率，这与碳源和能源的有效利用是一致的，以及获得相对底物进料的尽可能高的微生物细胞产量，而更重要的是每单位体积得到最高的期望蛋白质的生产。
[137]在或者分批，或者优选的补料分批操作中，所有设备、反应器或发酵方法、器皿或容器、管、附属循环(attendant circulating)或冷却装置以及类似物首先都被灭菌，通常通过使用蒸汽灭菌，例如在大约121℃至少大约15分钟。之后，在所有所需的营养物包括氧和含碳底物存在的情况下，将灭菌过的反应器接种选择的微生物的培养物。所用的发酵罐的类型不是关键的，尽管目前优选的是在15L Biolafitte(Saint-Germain-en-Laye，法国)下操作。
蛋白质分离
[138]一旦期望的蛋白质被表达，并且任选地被分泌，对期望蛋白质的回收可能是必需的。本发明提供了从期望蛋白质的融合类似物中分离期望蛋白质的方法。特别考虑的是，在此描述的方法用于从融合类似物中分离蛋白酶抑制剂及其变异体。
[139]通过本身在本领域中已知的方法，也可以从发酵液中进行期望蛋白质的收集和纯化。发酵液一般含有细胞碎片，包括细胞，各种悬浮固体和其它生物质污染物，以及期望的蛋白质产物，优选通过在本领域中已知的方法将它们从发酵液中去除。
[140]用于此类去除的合适的工艺包括常规固-液分离技术，例如离心、过滤、透析、微过滤、旋转真空过滤或其它已知的工艺，以生成无细胞的滤液。在结晶之前，使用例如超滤、蒸发或沉淀的技术，进一步浓缩发酵液或无细胞滤液可以是优选的。
[141]沉淀上清液或滤液中的蛋白质成分可以通过盐例如磷酸铵或者调整pH到2至3得以完成，然后，在80℃加热处理发酵液2小时，之后通过多种层析方法例如离子交换层析、亲和层析或相似的本领域公认的方法进行纯化。
[142]当表达的期望多肽被分泌时，多肽可以从生长培养基纯化。优选地，在多肽纯化之前，将表达宿主细胞从培养基中去除(例如通过离心)。
[143]当表达的重组期望多肽未从宿主细胞分泌时，优选将宿主细胞破碎，而多肽被释放到含水“提取物”中，这是纯化的第一阶段。优选地，在细胞破碎前，从培养基收集表达宿主细胞(例如通过离心)。
[144]通过常规技术，例如通过溶菌酶或β-葡聚糖酶消化或通过迫使细胞通过高压，可以进行细胞破碎。关于对此类细胞破碎技术的进一步的描述，参见(Robert K.Scobes，Protein Purification，Second edition，Springer-Verlag)。
[145]将六个组氨酸残基即组氨酸标记(His Tag)添加到C-端也可以帮助期望蛋白质及其融合类似物的纯化。使用His标记作为纯化辅助在本领域中是熟知的。参见，例如Hengen(1995)TIBS 20(7)：285-286。使用固定化金属离子亲和层析(IMAC)可容易地纯化6x组氨酸标记的蛋白质。
[146]特别考虑的是，使用组合的疏水电荷诱导层析(hydrophobiccharge induction chromatography)(HCIC)，可以从含水蛋白质溶液例如全细胞发酵液或澄清液(clarified broth)中纯化蛋白酶抑制剂及其变异体。HCIC提供了从液体培养基以及从期望蛋白质的融合类似物分离期望蛋白质的能力。
效用
[147]对于期望蛋白质的一些应用，蛋白酶抑制剂要非常纯是很重要的，例如具有大于99％的纯度。不论何时当期望蛋白质被用作治疗剂时，这尤为重要，但是对于其它应用也是必需的。在此所述的方法提供了生产基本上纯的期望蛋白质的途径。在此所述的期望蛋白质在医药以及个人护理组合物中是有用的。
[148]在随后的实验公开中，应用下列缩写：eq(当量)；M(摩尔的)；μM(微摩尔的)；N(当量的)；mol(摩尔)；mmol(毫摩尔)；μmol(微摩尔)；nmol(纳摩尔)；g(克)；mg(毫克)；kg(千克)；μg(微克)；L(升)；ml(毫升)；μl(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；μm(微米)；nm(纳米)；℃(摄氏温度)；h(小时)；min(分钟)；sec(秒)；msec(毫秒)；Ci(居里)mCi(毫居里)；μCi(微居里)；TLC(薄层层析)；Ts(甲苯磺酰基)：Bn(苄基)；Ph(苯基)；Ms(甲磺酰基)；Et(乙基)；Me(甲基)；PI(蛋白酶抑制剂)；BBI(Bowman-Birk抑制剂)；STI(大豆胰蛋白酶抑制剂)。
实施例
[149]在下面的实施例中，本发明被进一步详细地描述，这些实施例并非意欲以任何方式限制所要求的本发明的范围。附图被认为是本发明的说明书和描述的完整部分。所引用的所有参考文献在此被明确引入作为对所有本文所述的参考。下面的实施例被提供用于举例说明，而并非限制所要求的发明。
                      实施例1
           编码大豆蛋白酶抑制剂的DNA的克隆
[150]本实施例阐明了STI的表达载体的开发。
[151]一般而言，用工程化的kexB切割位点(NVISKR)，经N-端的Nhel限制酶位点和在C-端的STI终止密码子TAG之后的BstEII限制酶位点，将编码期望蛋白质的基因融合到编码葡糖淀粉酶的连接子区域的DNA上。由MCLAB(South San Francisco，California)体外合成编码大豆STI的基因，其作为DNA片段包含两个限制性位点、kexB切割位点和位于N-端的三个甘氨酸残基以及位于C-端的六个组氨酸残基(SEQ ID NO：3，基因显示在图2中)。此处所用的所有PCR产生的DNA片段最初被克隆到pCRII-TOPO载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。大肠杆菌[One ShotTOP10细胞；来自Invitrogen]被用于常规质粒分离和质粒维持。NheI和BstEII位点被用于从pCRII-TOPO载体切除PCR产物，然后，所生成的DNA片段被连接到表达载体pSL1180-GAMpR-2中(参见图5)。表达载体pSL1180-GAMpR2包含黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、葡糖淀粉酶催化结构域以及终止区。表达质粒也含有黑曲霉pyrG基因作为选择标记。因此对带有表达盒的转化体的检测是通过尿苷-缺乏培养基上的生长而进行的。
[152]通过MCLAB合成编码STI肽的基因(对于氨基酸序列：图4A，SEQ ID NO：10；对于核苷酸序列：图2和SEQ ID NO：6)并克隆到pCRII-TOPO载体(Invitrogen)中。通过限制性消化，从质粒释放出NheI至BstEII之间的片段，从琼脂糖凝胶中提取该DNA片段，并将其克隆到pSLGAMpR2中，以产生表达质粒pSLGAMpR2-SBTI/nonopti(Q110)，pSLGAMpR2是一种葡糖淀粉酶-凝乳酶表达载体，在WO 9831821中被详细描述。
[153]表达质粒被转化到dgr246ΔGAP：pyr2-中。该菌株衍生自菌株dgr246P2，dgr246P2的pepA基因已被剔除，为pyrG负型(pyrG minus)，并且经历了几轮诱变和筛选或选择，以获得异源基因产物改进的生产(Ward，M.等，1993，Appl.Microbiol.Biotech.39：738-743及其参考文献)。为产生菌株dgr246ΔGAP：pyr2-，使用与由Fowler，T等(1990)Curr.Genet.18：537-545所报道的完全相同的缺失质粒(pΔGAM NB-Pyr)和步骤，去除菌株dgr246P2中的glaA(葡糖淀粉酶)基因。简言之，通过用在任一末端具有glaA侧翼序列的线状DNA片段，以及用被构巢曲霉pyrG基因置换作为选择标记的glaA基因的部分启动子和编码区进行转化，实现该缺失。通过DNA印迹分析鉴定到这样的转化体，其中含有glaA侧翼序列的线状片段和pyrG基因已经被整合在染色体的glaA位点。这种变化已经出现在转化的菌株dgr246ΔGAP中。将来自转化体的孢子铺到含有氟乳清酸(fluoroorotic acid)的培养基上，获得自发抗性突变体(spontaneous resistant mutant)，如由van Hartingsveldt，W.等(1987)Mol.Gen.Genet.206：71-75所述。在这些突变体中的一个，dgr246ΔGAP：pyr2-被显示为尿苷营养缺陷型菌株(uridine auxotrophstrain)，其可以通过用含有野生型pyrG基因的质粒转化而被补充。
[154]曲霉属转化方案是CampbeII方法的修改(CampbeII等，(1989).Curr.Genet.16：53-56)。所有溶液和培养基或者被高压灭菌，或通过0.2微米过滤器进行过滤灭菌。从复合培养基琼脂(CMA)板收获黑曲霉泡盛变种的孢子。CMA含有20g/l葡萄糖、20g/l Difco牌麦芽糖提取液、1g/l Bacto胨、20g/l Bacto琼脂、20ml/l的100mg/ml精氨酸以及20ml/l的100mg/ml尿苷。使用大约1.5cm2孢子的琼脂填料(agarplug)来接种100ml的液体CMA(如CMA的配制，只是没有Bacto琼脂)。在37℃，在振荡器上以250-275rpm过夜温育瓶。通过无菌Miracloth(Calbiochem，San Diego，CA，USA)收获菌丝体，并用50ml溶液A(0.8M MgSO4，于10mM磷酸钠中，pH 5.8)洗涤。洗过的菌丝体被放在于20ml溶液A中的300mg的β-D-葡聚糖酶(interspexProducts，San Mateo，CA)无菌溶液中。将其在250ml无菌塑料瓶(Corning Inc，Corning，New York)中，在28℃至30℃，以200rpm温育2小时。温育之后，将此原生质体的溶液通过无菌Miracloth过滤到50ml无菌锥形管(Sarstedt，USA)中。将所形成的含有原生质体的液体均分到两个50ml锥形管中。将40ml溶液B(1.2M山梨醇、50mMCaCl2、10mM Tris，pH 7.5)加入到每个管中，并在台式高速临床离心机(table top clinical centrifuge)中(Damon IEC HN SII离心机)全速离心5分钟。去掉每个管的上清液，并将20ml新鲜溶液B加入到一个管中，混合，然后倒入下一个管中，直到所有沉淀再悬浮。然后将管离心5分钟。去掉上清液，加入20ml新鲜溶液B，将管离心5分钟。在将洗过的原生质体以0.5-1.0×107原生质体/100μl的密度再悬浮在溶液B中之前，最后一次洗涤管。向在15ml无菌锥形管(Sarstedt，USA)中的每个100μl原生质体，加入10μl转化质粒DNA。此时，加入12.5μl溶液C(50％PEG 4000、50mM CaCl2、10mM Tris，pH 7.5)，并将管在冰上放置20分钟。加入1ml溶液C，将管从冰上转移到室温，并轻轻摇动。立刻加入2ml溶液B来稀释溶液C。将转化混合物均等地加入保存在45℃水浴中的3管熔解的MMS覆盖物(melted MMSoverlay)(6g/l NaNO3、0.52g/l KCI、1.52g/l KH2PO4、218.5g/l D-山梨醇、1.0ml/l微量元素-LW、10g/l SeaPlaque琼脂糖(FMC Bioproducts，Rookland，Maine，美国)、20ml/l 50％葡萄糖、2.5ml/l 20％MgSO4.7H2O，用NaOH将pH调整至6.5)中。微量元素-LW由1g/lFeSO4.7H2O、8.8g/l ZnSO4.7H2O、0.4g/l CuSO4.5H2O、0.15g/lMnSO4.4H2O、0.1g Na2B4O7.10H2O、50mg/l(NH4)6Mo7O24.4H2O、250ml H2O、200μl/l浓HCI组成。将携带转化混合物的熔解覆盖物立刻倒在3个MMS板上(与MMS覆盖物配制相同，除采用20g/l Bacto琼脂替代10g/l SeaPlaque琼脂糖外)，此MMS板已经补充以直接加到琼脂板顶部的333μl/板的100mg/ml精氨酸。在琼脂糖凝固之后，在30℃温育培养板，直到转化体生长。
[155]用无菌牙签将孢子形成转化体(sporulating transformant)挑到基本培养基+葡萄糖(MM)的板上。MM由6g/l NaNO3、0.52g/l KCl、1.52g/l KH2PO4、1ml/l微量元素-LW、20g/l Bacto琼脂，用NaOH将pH调整至6.5，25ml/l 40％葡萄糖、2.5ml/l 20％MgSO4.7H2O以及20ml/l的100mg/ml精氨酸组成。一旦转化体在MM上生长，则将它们转移到CMA板上。
[156]将来自每个转化体的平板培养物的1.5cm2琼脂填料加入到置于250ml摇瓶中的50ml被称作Promosoy special的生产培养基(production medium)中。该培养基含有下述组分：70g/l柠檬酸钠、15g/l(NH4)2SO4、1g/l NaH2PO4.H2O、1g/l MgSO4、1ml Tween 80、用NaOH将pH达到6.2、2ml/l Mazu DF60-P、45g/l Promosoy 100(Central Soya，Fort Wayne，IN)、120g/l麦芽糖。在30℃，以200rpm将生产培养基瓶温育5天，收获上清液样品。在SDS凝胶上测定转化体的蛋白质生产，以基于所产生的蛋白质的量选择转化体。对来自顶部转化体(top transformant)的液体培养基(Broth)，测定胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶抑制活性。
[157]将来自每个转化体的平板培养物的1.5cm2琼脂填料也加入到置于250ml摇瓶中的50ml被称作修饰CSS的生产培养基中。该培养基含有下述组分：50g/l玉米浆固体(Corn Streep Solids)、1g/lNaH2PO4*H2O、0.5g/l MgSO4(无水)、50g/l Staley 7350(55％)和8g/l柠檬酸钠。在30℃，以200rpm将生产培养基瓶温育3天，收获上清液样品，并在SDS凝胶上测定蛋白质生产。对来自顶部转化体的液体培养基，测定胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶抑制活性。
                             实施例2
             编码大豆胰蛋白酶抑制剂的DNA的密码子最优化
[158]下面的实施例详述了编码STI的DNA如何被改变，以实现在丝状真菌中的优化表达。
[159]根据在曲霉属中的被高度表达的蛋白质的密码子选择，将来自合成基因(由MCLAB合成的实施例1中的原材料)的密码子最优化。基本上，将表达良好的蛋白质例如葡糖淀粉酶、α-淀粉酶和凝乳酶原与在曲霉属中表达不好的蛋白质例如人NEP和DPP4比较。参见表1。在曲霉属中两种类型的蛋白质表达的密码子表选择在表II中。
表II
Figure A20048003194200391
密码子AA
  ---   Cys(C)   12   12   12   6   10   5   1   1   8
  caa*   Gln(Q)   14   15   3   1   1   3   2   6   4
  cag   Gln(Q)   17   15   7   24   8   12   14   13   11
--- Gln(Q) 31 30 10 25 9 15 16 19 15
gaa* Glu(E) 36 31 4 2 1 1 2 4 7
  gag   Glu(E)   17   9   2   12   5   8   38   42   11
  ---   Glu(E)   53   40   6   14   6   9   40   46   18
  gga*   Gly(G)   15   20   5   1   1   2   10   10   5
  ggc   Gly(G)   12   7   11   15   14   5   17   20   20
ggg Gly(G) 7 6 1 12 7 0 0 1 4
ggu Gly(G) 7 7 4 3 1 4 17 11 12
  ---   Gly(G)   41   40   21   31   23   11   44   42   41
  cac   His(H)   5   8   5   4   3   2   11   13   4
  cau   His(H)   4   11   2 2   0   1   2   4   0
--- His(H) 9 19 7 6 3 3 13 17 4
  aua   Ile(I)   9   13   1   1   1   0   0   0   0
  auc   Ile(I)   10   12   3   19   9   5   19   16   8
  auu*   Ile(I)   26   22   2   2   2   1   6   12   11
  ---   Ile(I)   45   47   6   22   12   6   25   28   19
  cua*   Leu(L)   5   6   0   0   0   0   0   0   2
  cuc   Leu(L)   7   8   8   5   4   3   13   18   16
  cug   Leu(L)   9   15   10   23   15   10   14   16   15
  cuu   Leu(L)   15   7   0   1   0   0   11   12   3
  uua*   Leu(L)   7   10   1   0   0   0   0   0   0
  uug*   Leu(L)   16   9   1   0   0   1   5   3   6
  ---   Leu(L)   59   55   20   29   19   14   43   49   42
  aaa*   Lys(K)   32   27   3   6   1   5   0   0   0
  aag   Lys(K)   17   10   13   9   14   9   7   19   11
--- Lys(K) 49 37 16 15 15 14 7 19 11
  aug   Met(M)   14   14   6   8   2   1   17   12   3
  ---   Met(M)   14   14   6   8   2   1   17   12   3
  uuc   Phe(F)   12   14   3   13   6   9   24   21   17
  uuu*   Phe(F)   16   17   1   6   1   0   3   6   2
--- Phe(F) 28 31 4 19 7 9 27 27 19
  cca*   Pro(P)   9   14   4   1   0   2   1   6   0
  ccc   Pro(P)   6   2   7   11   8   6   20   17   8
  ccg   Pro(P)   0   1   1   3   0   2   4   2   6
  ccu   Pro(P)   7   10   2   5   2   21   16   3
  ---   Pro(P)   22   27   14   16   13   12   46   41   17
密码子AA
agc Ser(S) 7 12 2 13 6 14 8 7 19
agu* Ser(S) 7 14 2 4 1 1 2 1 10
  uca*   Ser(S)   11   17   3   1   0   0   2   2   2
  ucc   Ser(S)   7   10   9   9   14   11   11   8   16
  ucg   Ser(S)   0   1   1   4   0   2   4   3   11
  ucu   Ser(S)   11   10   1   4   2   5   9   8   15
  ---   Ser(S)   43   64   18   35   23   33   36   29   73
  uaa   Ter(.)   0   0   1   0   0   0   0   1   0
  uag   Ter(.)   0   1   0   0   0   0   0   0   0
  uga   Ter(.)   1   0   0   0   1   1   0   0   0
  ---   Ter(.)   1   1   1   0   1   1   0   1   0
  aca*   Thr(T)   10   21   1   5   4   2   2   1   4
  acc   Thr(T)   9   6   9   13   13   14   12   16   28
  acg   Thr(T)   1   1   3   2   0   2   1   1   8
  acu   Thr(T)   10   17   5   4   0   3   16   12   14
  ---   Thr(T)   30   45   18   24   17   21   31   30   54
  ugg   Trp(W)   14   20   5   4   8   2   11   14   15
  ---   Trp(W)   14   20   5   4   8   2   11   14   15
  uac   Tyr(Y)   11   26   4   17   2   9   21   24   16
  uau*   Tyr(Y)   22   30   0   5   0   2   4   4   6
  ---   Tyr(Y)   33   56   4   22   2   11   25   28   22
gua* Val(V) 5 7 0 2 0 1 0 2 2
guc Val(V) 9 12 6 7 10 10 17 25 13
  gug   Val(V)   13   14   10   14   14   4   8   6   14
  guu   Val(V)   10   11   2   3   0   1   21   12   5
  ---   Val(V)   37   44   18   26   24   16   46   45   34
  nnn   ???(X)   0   0   0   0   0   0   3   0   0
  TOT   AL   701   729   232   365   246   222   583   597   527
[160]显然，在表达良好的基因中，许多密码子未被使用或未被经常使用。这些密码子更为常见地被发现于那些表达不好的基因中(在表II中用星号标出)。在STI基因中，我们鉴定了数种不被其它表达良好的蛋白质使用或不被经常使用的此类密码子，并且这些密码子被变为在表达良好的蛋白质中较常使用的密码子。参见表III和IV。
                             表III
野生型STI的密码子选择：(无3个甘氨酸残基和6个组氨酸残基和终止密码子)
gca  Ala(A)   4   #   cag   Gln(Q)   2   #   uug   Leu(L)   3   #   uaa   Ter(.)
0
gcc  Ala(A)   2   #   ---   Gln(Q)   5   #   ---   Leu(L)   15  #   uag   Ter(.)
0
gcg  Ala(A)   0   #   gaa   Glu(E)   7   #   aaa   Lys(K)   7   #   uga   Ter(.)
0
gcu  Ala(A)   2   #   gag   Glu(E)   6   #   aag   Lys(K)   3   #   ---   Ter(.)
0
---  Ala(A)   8   #   ---   Glu(E)   13  #   ---   Lys(K)   10  #   aca   Thr(T)
3
aga  Arg(R)   4   #   gga   Gly(G)   6   #   aug   Met(M)   2   #   acc   Thr(T)
2
agg  Arg(R)   1   #   ggc   Gly(G)   2   #   ---   Met(M)   2   #   acg   Thr(T)
1
cga  Arg(R)   1   #   ggg   Gly(G)   3   #   uuc   Phe(F)   4   #   acu   Thr(T)
1
cgc  Arg(R)   1   #   ggu   Gly(G)   5   #   uuu   Phe(F)   5   #   ---   Thr(T)
7
cgg  Arg(R)   0   #   ---   Gly(G)   16  #   ---   Phe(F)   9   #   ugg   Trp(W)
2
cgu  Arg(R)   2   #   cac   His(H)   0   #   cca   Pro(P)   4   #   ---   Trp(W)
2
---  Arg(R)   9   #   cau   His(H)   2   #   ccc   Pro(P)   0   #   uac   Tyr(Y)
0
aac  Asn(N)   4   #   ---   His(H)   2   #   ccg   Pro(P)   1   #   uau   Tyr(Y)
4
aau  Asn(N)   5   #   aua   Ile(I)   3   #   ccu   Pro(P)   5   #   ---   Tyr(Y)
4
---  Asn(N)   9   #   auc   Ile(I)   5   #   ---   Pro(P)   10  #   gua   Val(V)
0
gac  Asp(D)   3   #   auu   Ile(I)   6   #   agc   Ser(S)   1   #   guc   Val(V)
0
gau  Asp(D)   14  #   ---   Ile(I)   14  #   agu   Ser(S)   1   #   gug   Val(V)
8
---  Asp(D)   17  #   cua   Leu(L)   1   #   uca   Ser(S)   3   #   guu   Val(V)
6
ugc  Cys(C)   1   #   cuc   Leu(L)   3   #   ucc   Ser(S)   1   #   ---   Val(V)
14
ugu  Cys(C)   3   #   cug   Leu(L)   2   #   ucg   Ser(S)   1   #   nnn   ???(X)
0
---  Cys(C)   4   #   cuu   Leu(L)   5   #   ucu   Ser(S)   4   #   TOTAL
181
caa  Gln(Q)   3   #   uua   Leu(L)   1   #   ---   Ser(S)   11  #
                        表IV
黑曲霉密码子优化的STI的密码子选择：(无3个甘氨酸残基和6个组氨酸残基和终止密码子)
gca  Ala(A)     4    #    cag    Gln(Q)    2    #    uug    Leu(L)    0    #    uaa    Ter(.)
0
gcc  Ala(A)     2    #    ---    Gln(Q)    5    #    ---    Leu(L)    15   #    uag    Ter(.)
0
gcg  Ala(A)     0    #    gaa    Glu(E)    7    #    aaa    Lys(K)    7    #    uga    Ter(.)
0
gcu  Ala(A)     2    #    gag    Glu(E)    6    #    aag    Lys(K)    3    #    ---    Ter(.)
0
---  Ala(A)     8    #    ---    Glu(E)    13   #    ---    Lys(K)    10   #    aca    Thr(T)
3
aga  Arg(R)     0    #    gga    Gly(G)    6    #    aug    Met(M)    2    #    acc    Thr(T)
2
agg  Arg(R)     1    #    ggc    Gly(G)    3    #    ---    Met(M)    2    #    acg    Thr(T)
1
cga  Arg(R)     1    #    ggg    Gly(G)    3    #    uuc    Phe(F)    4    #    acu    Thr(T)
1
cgc  Arg(R)     5    #    ggu    Gly(G)    4    #    uuu    Phe(F)    5    #    ---    Thr(T)
7
cgg  Arg(R)     0    #    ---    Gly(G)    16   #    ---    Phe(F)    9    #    ugg    Trp(W)
2
cgu  Arg(R)     2    #    cac    His(H)    0    #    cca    Pro(P)    0    #    ---    Trp(W)
2
---  Arg(R)     9    #    cau    His(H)    2    #    ccc    Pro(P)    0    #    uac    Tyr(Y)
4
aac  Asn(N)     4    #    ---    His(H)    2    #    ccg    Pro(P)    1    #    uau    Tyr(Y)
0
aau  Asn(N)     5    #    aua    Ile(I)    0    #    ccu    Pro(P)    9    #    ---    Tyr(Y)
4
---  Asn(N)     9    #    auc    Ile(I)    8    #    ---    Pro(P)    10   #    gua    Val(V)
0
gac  Asp(D)     3    #    auu    Ile(I)    6    #    agc    Ser(S)    1    #    guc    Val(V)
0
gau  Asp(D)     14   #    ---    Ile(I)    14   #    agu    Ser(S)    1    #    gug    Val(V)
8
---  Asp(D)     17   #    cua    Leu(L)    1    #    uca    Ser(S)    3    #    guu    Val(V)
6
ugc  Cys(C)     1    #    cuc    Leu(L)    3    #    ucc    Ser(S)    1    #    ---    Val(V)
14
ugu  Cys(C)     3    #    cug    Leu(L)    6    #    ucg    Ser(S)    1    #    nnn    ???(X)
0
---  Cys(C)     4    #    cuu    Leu(L)    5    #    ucu    Ser(S)    4    #    TOTAL
181
caa  Gln(Q)     3    #    uua    Leu(L)    0    #    ---    Ser(S)    11   #
[161]由MCLAB(South San Francisco)体外合成优化的DNA，其作为DNA片段包含三个限制性位点(在基因的5′端的Nhel和在3′端的Xhol以及BstEII)、kexB切割位点和位于N-端的三个甘氨酸残基以及位于C-端的六个组氨酸残基(SEQ I.D.NO：3)。该优化的基因被克隆到pCRII-TOPO载体中。按照在上面的实施例1中所述的步骤，通过限制性消化，从质粒中释放出Nhel至BstEII之间的片段，在琼脂糖凝胶上纯化该DNA片段并将其从中提取出来，将所述DNA片段克隆到pSLGAMpR2中，以产生表达质粒pSLGAMpR2-SBTI(Q107)。
[162]将表达质粒转化到dgr246ΔGAP：pyr2中。转化以及转化体的摇瓶测试如实施例1。测定了31个转化体，使用SDS凝胶检查蛋白质表达的水平。对来自顶部六个转化体的液体培养基，测定胰蛋白酶抑制活性。
                  实施例3
     Bowman-Birk抑制剂及其变异体在曲霉属中的表达
a.BBI与葡糖淀粉酶融合，具有kexB位点和位于N-端的三个甘氨酸以及位于C-端的六个组氨酸残基：
[163]按照上面的实施例2中所述的步骤，编码BBI的DNA被优化，并被用于本实施例。由MCLAB体外合成DNA，其作为DNA片段含有三个限制性位点(在基因的5′端的NheI和在3′端的XhoI与BstEII)、kexB切割位点以及在N-端的三个甘氨酸残基和在C-端的六个组氨酸残基(SEQ ID NO：54)。所述DNA片段被克隆到pCRII-TOPO载体(Invitrogen)中。按照上面在实施例1中所述的步骤，通过限制性消化从质粒中释放Nhel至BstEII的片段，从琼脂糖凝胶中提取DNA片段，并将其克隆到pSLGAMpR2中，以产生表达质粒pSLGAMpR2-BBlkex+(Q104)。表达质粒被转化到dgr246ΔGAP：pyr2中。转化以及转化体的摇瓶测试与实施例1相同。产生28个转化体，在摇瓶中测定了25个转化体。使用SDS凝胶检查蛋白质表达的水平。对来自顶部转化体的液体培养基，测定胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶抑制活性。
b.BBI与葡糖淀粉酶融合，具有位于C-端的六个组氨酸残基：
[164]按照上面的实施例2中所述的步骤，编码BBI的DNA被优化，并被用于本实施例。由MCLAB体外合成DNA，其作为DNA片段含有三个限制性位点(在基因的5′端的Nhel和在3′端的Xhol与BstEII)以及在C-端的六个组氨酸残基(SEQ ID NO：42GCTAGCGACGATGAGAGCTCTAAGCCCTGTTGCGATCAGTGCGCGTGTACCAAATCGAACCCTCCGCAGTGTCGCTGCTCCGATATGCGTCTGAATTCCTGTCATAGCGCATGCAAGAGCTGTATCTGCGCCCTGAGCTACCCCGCGCAGTGTTTCTGCGTCGACATCACGGACTTCTGCTACGAGCCGTGTAAGCCCAGCGAGGACGATAAGGAGAACCATCATCACCATCACCATTAGCTCGAGGGTGACC)。所述DNA片段被克隆到pCRII-TOPO载体中。按照上面在实施例1中所述的步骤，通过限制性消化从质粒中释放Nhel至BstEII的片段，从琼脂糖凝胶中纯化并提取，将其克隆到pSLGAMpR2中，以产生表达质粒pSLGAMpR2-BBIkex-(Q105)。表达质粒被转化到dgr246ΔGAP：pyr2中。转化以及转化体的摇瓶测试与实施例1相同。产生38个转化体，在摇瓶中测定了25个转化体。使用SDS凝胶检查蛋白质表达的水平。对来自顶部转化体的液体培养基，测定胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶抑制活性。
c.BBI与葡糖淀粉酶融合，具有kexB位点和位于N-端的三个甘氨酸残基：
[165]由MCLAB体外合成的、被克隆到pCRII-TOPO载体中的质粒DNA(SEQ ID NO：5)，被用作DNA模板进行PCR扩增。设计两个引物：5′GGG CTA GCA ACG TCA TCT CCA AG 3′(SEQ ID NO：43)和5′GGG GTC ACC TAG TTC TCC TTA TCG TCC TCG CTG 3′(SEQ IDNO：44)。在下面的条件下，引物存在时，DNA被扩增：用Tris-EDTA缓冲液将DNA稀释10至100倍。将10微升稀释的DNA加入到反应混合物中，在微量离心管(eppendorf tube)中的总计为100微升的反应中，该反应混合物含有0.2mM的每种核苷酸(A、G、C和T)、1×反应缓冲液、0.5至0.6微克引物1(SEQ ID NO：43)和引物2(SEQ IDNO：44)。在100℃加热混合物5分钟之后，将2.5单位Taq DNA聚合酶加入反应混合物中。在95℃，PCR反应进行1分钟，在50℃，将引物与模板退火1分钟，在72℃延伸1分钟。重复该循环30次，并且在于4℃贮存用于进一步的应用之前，在68℃进行额外的延伸循环7分钟。然后将通过琼脂糖凝胶检测的PCR片段克隆到表达质粒pCRII-TOPO(Invitrogen)中。所形成的PCR片段含有与SEQ ID NO：54相同的序列，只是编码六个组氨酸残基的核苷酸和Xhol限制位点被去除。按照上面在实施例1中所述的步骤，PCR片段用限制酶Nhel和BstEII消化。消化的DNA片段用乙醇沉淀，并将其克隆到pSLGAMpR2中，以产生没有组氨酸标签(histag)的表达质粒pSLGAMpR2-BBI(Q108)。该表达质粒被转化到dgr246ΔGAP：pyr2中。转化以及转化体的摇瓶测试与在实施例1中所述相同。产生57个转化体，在摇瓶中测定了25个转化体。使用SDS凝胶检查蛋白质表达的水平。对来自上层转化体的液体培养基，测定胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶抑制活性。
d.BBI与葡糖淀粉酶融合，具有kexB位点：
[166]由MCLAB体外合成的、被克隆到pCRII-TOPO载体中的质粒DNA(SEQ ID NO：1)被用作DNA模板进行PCR扩增。设计两个引物：5′GGG GTC ACC TAG TTC TCC TTA TCG TCC TCG CTG 3′(SEQID NO：44)和5′GGG CTA GCA ACG TCA TCT CCA AGC GCG ACGATG AGA GCT CTA AG 3′(SEQ ID NO：45)。所形成的PCR片段含有与SEQ ID NO：54(图1C)相同的序列，只是编码三个甘氨酸残基和六个组氨酸残基的核苷酸和Xhol限制位点被去除。按照上面在实施例1中所述的步骤，PCR片段用限制酶NheI和BstEII消化。消化的DNA片段用乙醇沉淀，并将其克隆到pSLGAMpR2中，以产生没有3G和histag的表达质粒pSLGAMpR2-BBI(Q109)。该表达质粒被转化到dgr246ΔGAP：pyr2中。转化以及转化体的摇瓶试验与在实施例1中所述相同。产生127个转化体，在摇瓶中测定了42个转化体。使用SDS凝胶检查蛋白质表达的水平。对来自顶部转化体的液体培养基测定胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶抑制活性。
                      实施例4
Bowman-Birk抑制剂及其变异体(通过其它结合物(binder)的环置换)在曲霉属中的表达
[167]使用在本领域中已知的标准步骤，将变异体序列引入BBI的一个或两个环中。根据制造商的指示，通过淘选(panning)商业可得的针对靶蛋白或底物的噬菌体肽文库PhD C7C(New England Biolabs，Beverly，MA)3轮，或者通过使用具有已知活性的序列，测定变异体序列。在下面所提供的序列中，被引入到环核苷酸序列中的改变由小写核苷酸表示。
a.在环I中具有a-VEGF(CK37281)的BBI
[168]由MCLAB体外合成的、被克隆到pCRII-TOPO载体中的质粒DNA(SEQ ID NO：1)被用作DNA模板进行PCR扩增。设计两个引物：
5′GTTGCGATCAGTGCGCGTGTtacaatctgtatggctggaccTGTCGCTGCT
3′(SEa ID NO：46)和
5′CGCATATCGGAGCAGCGACAggtccagccatacagattgtaACACGCGCA
C3′(SEQ ID NO：47)
以便引入结合到VEGF(表示为a-VEGF)肽序列，来抑制VEGF功能。通过下述程序进行PCR：在94℃加热混合物2分钟，之后进行30次反应循环：94℃加热30秒，63℃加热30秒以及72℃加热30秒。30次循环之后，在将混合物于4℃贮存之前，将混合物在72℃温育4分钟。通过DNA测序证实置换结合环。通过限制酶切消化，从质粒中释放出NheI至BstEII的DNA片段，纯化并将其克隆到pSLGAMpR2，以产生表达质粒pSLGAMpR2-BBI(CK37281)，于环I中(Q117)。该表达质粒被转化到dgr246ΔGAP：pyr2中，转化以及转化体的摇瓶试验与在实施例1中所述相同。产生了超过30个的转化体，在摇瓶中测定了42个转化体。使用SDS凝胶检查蛋白质表达的水平。
b.在环II中具有a-VEGF(CK37281)肽的BBI：
[169]对于质粒构建，获得真菌转化体以及在摇瓶中测定真菌转化体，我们使用与在上面的实施例中所述的相同的步骤，除了使用了下列两个引物：
5′CATGCAAGAGCTGTATCTGCtacaatctgtatggctggaccCAGTGTTTCTG
3′(SEQ ID NO：48)
5′GATGTCGACGCAGAAACACTGggtccagccatacagattgtaGCAGATACA
G3′.(SEQ ID NO：49)。
c.在环I和II中具有a-VEGF(CK37281)肽的BBI：
[170]对于质粒构建，获得真菌转化体以及在摇瓶中测定真菌转化体，我们采用同样的步骤，除了使用下列四个引物：
5′GTTGCGATCAGTGCGCGTGTtacaatctgtatggctggaccTGTCGCTGCT
3′(SEa ID NO：46)
5′CGCATATCGGAGCAGCGACAggtccagccatacagattgtaACACGCGCA
C3′(SEQ ID NO：47)
5′CATGCAAGAGCTGTATCTGCtacaatctgtatggctggaccCAGTGTTTCT
G3′(SEQ ID NO：48)
5′GATGTCGACGCAGAAACACTGggtccagccatacagattgtaGCAGATAC
AG3′.(SEQ ID NO：49)。
d.在环I中具有a-补体蛋白c2肽的BBI：
[171]对于质粒构建，获得真菌转化体以及在摇瓶中测定真菌转化体，我们采用同样的步骤，除了下面两个引物被用于引入结合到c2来抑制c2功能的肽序列(表示为a-c2)：
5′GCGATCAGTGCAGCTGTagctgcggcaggaagatccccatccagtgcTGTCGCT
GCTCCGATATGCGTC3′(SEQ ID NO：50)
5′GAGCAGCGACAgcactggatggggatcttcctgccgcagctACAGCTGCACTGA
TCGCAACAGGGC TTA3′(SEQ ID NO：51)。
e.在环I中具有a-补体蛋白c3肽的BBI：
[172]对于质粒构建，获得真菌转化体以及在摇瓶中测定真菌转化体，我们采用同样的步骤，除了下面两个引物被用于引入可结合到c3来抑制c3功能的肽序列(表示为a-c3)：
5′GCGATCAGTGCGGCTGTgccaggagcaacctcgacgagTGTCGCTGCTCC
GATATGCGTC 3′(SEQ ID NO：52)
5′GAGCAGCGACActcgtcgaggttgctcctggcACAGCCGCACTGATCGCAA
CAGGGCTTA 3′(SEQ ID NO：53)
f.在环I中具有a-补体蛋白c4肽的BBI：
[173]对于质粒构建，获得真菌转化体以及在摇瓶中测定真菌转化体，我们采用同样的步骤，除了下面两个引物被用于引入可结合c4来抑制c4功能的肽序列(表示为a-c4)：
5′GCGATCAGTGCGCGTGTcagagggccctccccatcctcTGTCGCTGCTCC
GATATGCGTC 3′(SEQ ID NO：55)
5′GAGCAGCGACAgaggatggggagggccctctgACACGCGCACTGATCGCA
ACAGGGCTTA 3′(SEQ ID NO：56)
g.在环I中具有a-补体蛋白c5肽的BBI：
[174]对于质粒构建，获得真菌转化体以及在摇瓶中测定真菌转化体，我们采用同样的步骤，除了下面两个引物被用于引入可与c5结合来抑制c5功能的肽序列(表示为a-c5)：
5′GCGATCAGTGCCAGTGTggcaggctccacatgaagaccTGTCGCTGCTCC
GA T A TGCGTC 3′(SEQ ID NO：57)
5′GAGCAGCGACAggtcttcatgtggagcctgccACACTGGCACTGATCGCA
ACAGGGCTTAGA 3′(SEQ ID NO：58)
h.在环I中具有a-人互补因子B肽的BBI：
[175]对于质粒构建，获得真菌转化体以及在摇瓶中测定真菌转化体，我们采用同样的步骤，除了下面两个引物被用于引入可与因子B结合来抑制因子B功能的肽序列(表示为a-因子B)：
5′GCGATCAGTGCCAGTGTaagaggaagatcgtcctcgacTGTCGCTGCTCC
GATATGCGTC 3′(SEO ID NO：59)
5′GAGCAGCGACAgtcgaggacgatcttcctcttACACTGGCACTGATCGCAA
CAGGGCTTAGA 3′(SEO ID NO：60)
i.在环I中具有a-膜金属蛋白酶2(MMP2)肽的BBI：
[176]对于质粒构建，获得真菌转化体以及在摇瓶中测定真菌转化体，我们采用同样的步骤，除了下面两个引物被用于引入可与MMP2(表示为a-MMP2)结合来抑制MMP2功能的肽序列：
5′CAGTGCGCGTGTgccgccatgttcggccccgccTGTCGCTGCTCCGATAT
GCGTC 3′(SEQ ID NO：61)
5′GAGCAGCGACAggcggggccgaacatggcggcACACGCGCACTGATCGC
AACAG 3′(SEQ ID NO：62)
j.在环I中具有a-膜金属蛋白酶12(MMP12)肽的BBI：
[177]对于质粒构建、获得真菌转化体以及在摇瓶中测定真菌转化体，我们采用同样的步骤，除了下面两个引物被用于引入与MMP12(表示为a-MMP12)结合来抑制MMP12功能的肽序列：
5′CAGTGCGCGTGTggcgccctcggcctcttcggcTGTCGCTGCTCCGATAT
GCGTC 3′(SEO ID NO：63)
5′GAGCAGCGACAgccgaagaggccgagggcgccACACGCGCACTGATCGC
AACAG 3′(SEQ ID NO：64)
k.在环中具有棉花结合肽2314的BBI：
[178]对于质粒构建、获得真菌转化体以及在摇瓶中测定真菌转化体，我们采用同样的步骤，除了使用下面两个引物来引入与棉花结合的肽序列：
5′GTTGCGATCAGTGCGCGTGTgagcccctgatccaccagcgcTGTCGCTGCT
3′(SEO ID NO：65)
5′CGCATATCGGAGCAGCGACAgcgctggtggatcaggggctcACACGCGCA
C3′(SEO ID NO：66)
I.在环中具有棉花结合肽2317的BBI：
[179]对于质粒构建、获得真菌转化体以及在摇瓶中测定真菌转化体，我们采用同样的步骤，除了使用下面两个引物来引入与棉花结合的肽序列：
5′GTTGCGATCAGTGCGCGTGTagcgccttccgcggccccaccTGTCGCTGCT
3′(SEO ID NO：67)
5′CGCATATCGGAGCAGCGACAggtggggccgcggaaggcgctACACGCGCA
C3′(SEO ID NO：68)
m.在环I中具有compstatin环的BBI：
[180]对于质粒构建、获得真菌转化体以及在摇瓶中测定真菌转化体，我们采用同样的步骤，除了使用下面两个引物来引入compstatin肽序列：
5′GTTGCGATCAGTGCGCGTGTgttgttcaggactggggccaccaccgcTGTC
GCTGCT(SEQ ID NO：69)
5′CGCATATCGGAGCAGCGACAgcggtggtggccccagtcctgaacaacACACGC
GCAC(SEQ ID NO：70)
[181]在这种情况下，来自BBI胰蛋白酶结合环的7个氨基酸被来自compstatin结合环的9个氨基酸置换。
n.在环II中具有compstatin环的BBI：
[182]对于质粒构建、获得真菌转化体以及在摇瓶中测定真菌转化体，我们采用同样的步骤，只是使用下面两个引物来引入compstatin肽序列：
5′CATGCAAGAGCTGTATCTGCgttgttcaggactggggccaccaccgcTGTT
TCTGCG(SEQ ID NO：71)
5′GTGATGTCGACGCAGAAACAgcggtggtggccccagtcctgaacaacGCAGAT
ACAG(SEQ ID NO：72)
[183]在这种情况下，来自BBI胰蛋白酶结合环的7个氨基酸被来自compstatin结合环的9个氨基酸置换。
                        实施例5
 Bowman-Birk抑制剂及其变异体在里氏木霉中的表达
[184]按照上面在实施例2中所述的步骤，编码BBI的DNA被优化，并被用于本实施例。使用质粒pSLGAMpR2-BBI或在环I和II中具有a-VEGF(CK37281)肽的pSLGAMpR2-BBI作为模板，两个引物被设计用于扩增DNA片段：
5′GGA CTA GTA AGC GCG ACG ATG AGA GCT CT 3′(SEQ IDNO：73)
5′AAG GCG CGC CTA GTT CTC CTT ATC GTC CT 3′(SEQ ID NO：74)
当与上述引物#2(SEQ ID NO：74)联合使用时，第三个引物被也使用，以产生在BBI蛋白质的N-端含有三个甘氨酸残基的PCR片段。
5′GGA CTA GTA AGC GCG GCG GTG GCG ACG ATG AGA GCT CT
3′(SEQ ID NO：75)
[185]按照上面在实施例2中所述的同样的步骤，编码BBI的DNA被最优化，并被用于本实施例，PCR片段用限制酶SpeI和AscI切割，并被连接到木霉属表达质粒pTrex4(图8)上，以产生表达质粒，所述木霉属表达质粒pTrex4是pTREX2(参见图9)的修饰版本，而pTREX2是pTEX的修饰版本，参见PCT公布号WO 96/23928有关pTEX载体制备的完整描述，该PCT公布通过参考引入本文，所述木霉属表达质粒pTrex4含有用于基因表达的CBHI启动子和终止子，以及作为转化体的选择标记的木霉属pyr4基因。在pTrex4质粒中，BBI基因被融合到CBH I核心(CBH I core)的C-端以及来自里氏木霉的连接子上。在真菌转化期间，来自构巢曲霉菌的amdS基因被用作选择标记。表达质粒被转化到里氏木霉中。用乙酰胺作氮源，在木霉菌属基础板(minimal plate)上分离稳定的转化体。将转化体生长在amd减量平板(amd minus plate)上，该amd减量平板含有1ml/l 1000×盐、20g/l纯净琼脂、1.68g/l CsCl、20g/l葡萄糖、15g/l KH2PO4、0.6g/l MgSO4·7H2O、0.6g/l CaCl2·2H2O和0.6g/l乙酰胺。终pH被调整为4.5。1000×盐含有5g/l FeSO4、1.6g/l MnSO4、1.4g/l ZnSO4和1g/l CoCl2。将它过滤灭菌。在28℃温育三天之后，将转化体转移到新鲜的amd减量平板上，并在28℃再生长三天。
[186]然后，在250ml摇瓶中，将转化体接种到里氏木霉proflo培养基(每个转化体50ml)。里氏木霉proflo培养基含有30g/lα-乳糖、6.5g/l(NH4)2SO4、2g/l KH2PO4、0.3g/l MgSO4·7H2O、0.2g/l CaCl2、1ml/l1000×TRI微量盐、2ml/l 10％Tween 80、22.5g/l Proflo和0.72g/l CaCO3。1000×TRI微量盐含有5g/l FeSO4·7H2O、1.6g/l MnSO4·H2O和1.4g/lZnSO4·7H2O。在30℃生长两天之后，将4ml培养物转移到确定成分培养基中，该培养基含有5g/l(NH4)2SO4、33g/l PIPPS缓冲液、9g/l酪蛋白氨基酸(CASAMINO ACIDS)、4.5g/l KH2PO4、1g/l CaCl2、1g/lMgSO4·7H2O、5ml/l MAZU和2.5ml/l 400×里氏木霉TRACE。它的pH被调整到5.5，灭菌后，加入40ml/l 40％乳糖。400×里氏木霉TRACE含有175g/l柠檬酸(无水)、200g/l FeSO4·7H2O、16g/l ZnSO4·7H2O、3.2g/l CuSO4·5H2O、1.4g/l MmSO4·H2O和0.8g/l H3BO3(硼酸)。
[187]在板上产生了大约40个转化体，20个转化体在摇瓶中进行了测定。培养物的上清液被用于SDS-PAGE分析，并被测定胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶抑制活性。蛋白质印迹也显示融合(Cbhl-BBI)以及单独的BBI存在。
                  实施例6
Bowman-Birk抑制剂与分泌性侣伴蛋白在曲霉属中的共表达
[188]下面的实施例描述了分泌如何被增强。在它们的三级结构中，STI蛋白质含有两个二硫键，而BBI含有7个二硫键，并且这些二硫键对于它们的功能是重要的。已知，具有二硫键的蛋白质的折叠需要蛋白质二硫键异构酶(PDI)或者ER中的其它侣伴蛋白。
[189]通过两种质粒的共转化或者通过两种质粒的顺序转化，研究了STI或BBI表达的增强，其中两种质粒中的一种含有STI或BBI表达盒，而另一种含有PDI基因或侣伴蛋白基因。首先，我们将没有3G和histag的质粒pSLGAMpR2-BBI(Q109)与质粒Q51共转化到同一菌株(dgr246ΔGAP：pyr2)中，其中质粒Q51含有4.6kb基因组DNA，该基因组DNA包含在载体pUC219中的来自黑曲霉的pdiA基因。获得51个转化体，在摇瓶中筛选了47个转化体。选择转化体#14，因为基于SDS凝胶数据，它产生了最高量的BBI蛋白质。在共转化的菌株中的BBI蛋白质的表达水平高于仅含有无3G和histag的质粒pSLGAMpR2-BBI(Q109)的菌株。图7图解了增强的BBI表达。此菌株也进行了孢子纯化并再次在摇瓶中测试。
[190]按照上面所述的步骤，我们也决定将没有histag的质粒pSLGAMpR2-BBI(Q108)与含有pdiA基因的质粒Q51(与上述相同)共转化到同一菌株(dgr246ΔGAP：pyr2)中。在摇瓶中筛选出34个转化体。选择了一个转化体，因为基于SDS凝胶数据，它能够产生最高水平的BBI蛋白质。此BBI蛋白质的表达水平要高于仅含有无histag的质粒pSLGAMpR2-BBI(Q108)的菌株。
[191]按照上面所述的步骤，我们也决定将没有3G和histag的质粒pSLGAMpR2-BBI(Q109)与质粒Q124共转化到同一菌株(dgr246ΔGAP：pyr2)中，其中质粒Q124含有1623bp基因组DNA，该基因组DNA包含在载体pUC219中的来自黑曲霉的prpA基因。在摇瓶中筛选出28个转化体。选择一个转化体，因为基于SDS凝胶数据，它能够产生最高量的BBI蛋白质。在共转化的菌株中的BBI蛋白质的表达水平高于仅含有无3G和histag的质粒pSLGAMpR2-BBI(Q109)的菌株。图7图解了增强的BBI表达(泳道15对泳道3)。此菌株也进行孢子纯化并再次在摇瓶中测试。
                    实施例7
            重组蛋白酶抑制剂变异体保留活性
[192]检验使用上述方法所产生的STI、BBI及其变异体的活性，例如蛋白酶活性的抑制。
a.蛋白酶抑制
[193]将950μl Tris-缓冲盐+0.02％Tween 20与20μl蛋白酶(100μg/ml，在1mM HCl中(牛胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶))以及20μl样品组合。将溶液混合并在室温下温育30分钟。加入10μl底物(对于胰蛋白酶：琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-精氨酸-N-对硝基酰苯胺(succinyl-ala-ala-pro-arg-paranitroanilide)，10mg/ml，于DMSO中；对于胰凝乳蛋白酶：琥珀酰丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-N-对硝基酰苯胺(succinyl ala-ala-pro-phe-paranitroanilide)，10mg/ml，在DMSO中)，并混合溶液。监测405nm处的吸收，并测定速率(A405/min)。通过与对照样品空白比较，确定所抑制的蛋白酶活性分数，并根据下面的方程进行计算：
Figure A20048003194200541
b.通过VEGF肽的HUVEC增殖的抑制
[194]并根据制造商的指示，将HUVE细胞(Cambrex，East Rutherford，NJ)传代1-5次并保藏。用0.03至20ng/ml VEGF刺激HUVEC生长，在10ng/ml VEGF165(R & D Systems)时，其具有最高增殖；该浓度被用在随后的试验中。将0.00052μM至25μM的一系列a-VEGF肽(参见实施例4)和抗-VEGF MAb对照(R & D Systems)与10ng/mL VEGF混合，之后加入到以三等分接种在96孔板中的HUVECs。通过掺入3H-胸苷，测量细胞增殖。观察到显著的抑制(数据未显示)。
[195]应当理解，此处所述的实施例和实施方案仅仅用于示例性目的，且对其进行的各种微小的修改或者改变会被本领域普通技术人员想到，并将被包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求书的范围之内。在此所引用的所有出版物、专利和专利申请的全部内容被引入作为参考，用于所有目的。

Claims (27)

1.一种用于在丝状真菌细胞中生产蛋白酶抑制剂的方法，包括：
(a)将DNA构建物引入丝状真菌细胞中，其中所述DNA构建物包含启动子，所述启动子在所述丝状真菌细胞中显示出转录活性，并且所述启动子被可操作连接到异源DNA序列上，所述异源DNA序列编码衍生自大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)、Bowman-Birk抑制剂(BBI)的蛋白酶抑制剂及其变异体，
(b)在合适的培养条件下培养所述丝状真菌细胞，以允许所述异源DNA序列的表达，和
(b)产生所述蛋白酶抑制剂。
2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括回收所述蛋白酶抑制剂。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述丝状真菌细胞选自曲霉属(Aspergillus)菌株、青霉属(Penicillium)菌株、镰孢菌属(Fusarium)菌株或木霉属(Trichoderma)菌株。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述木霉菌属菌株是里氏木霉(T.reesei)。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述曲霉属菌株是黑曲霉(A.niger)、构巢曲霉(A.nidulans)、泡盛曲霉(A.awamori)或米曲霉(A.oryzea)。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白酶抑制剂选自
(a)与SEQ ID NO：7具有至少90％的序列同一性的蛋白酶抑制剂，
(b)与SEQ ID NO：7具有至少90％的序列同一性的蛋白酶抑制剂，其中残基15-21和/或残基42-47已经用变异体序列置换，
(c)与SEQ ID NO：12具有至少90％的序列同一性的蛋白酶抑制剂，和
(d)与SEQ ID NO：12具有至少90％的序列同一性的蛋白酶抑制剂，其中残基39-85和/或残基137-144已经用变异体序列置换。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述蛋白酶抑制剂与SEQ IDNO：7具有至少90％的序列同一性，其中残基15-21和/或残基42-47已经用变异体序列置换。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述蛋白酶抑制剂选自SEQID NOs.7和15-29。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述编码蛋白酶抑制剂的DNA序列，包括已被优化用于在所述丝状真菌细胞中表达的密码子。
10.根据权利要求1所述的方法，进一步包括将编码侣伴蛋白的第二个核酸序列引入所述丝状真菌细胞中。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述侣伴蛋白是pdiA或prpA。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白酶抑制剂作为融合蛋白被表达。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述融合蛋白包括葡糖淀粉酶信号序列、葡糖淀粉酶催化结构域、切割位点和所述蛋白酶抑制剂。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述融合蛋白被蛋白酶加工，以释放所述蛋白酶抑制剂。
15.蛋白酶抑制剂组合物，包括根据权利要求1所述的方法产生的所述蛋白酶抑制剂。
16.一种抑制靶蛋白的蛋白水解活性的方法，包括将所述靶蛋白与权利要求15所述的蛋白酶抑制剂组合物接触并结合所述靶蛋白，其中所述靶蛋白的所述蛋白水解活性被抑制。
17.编码蛋白酶抑制剂的分离的多核苷酸，所述蛋白酶抑制剂选自在SEQ ID NOs：15-29中阐述的多肽序列。
18.编码大豆胰蛋白酶抑制剂或Bowman Birk抑制剂的改变的野生型多核苷酸，包括已被优化用于在丝状真菌细胞中表达的密码子。
19.表达载体，包括
(a)编码蛋白酶抑制剂的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列与SEQID NO：12具有至少90％的序列同一性，其中残基39-85和/或残基137-144已经用变异体序列置换，
(b)蛋白酶抑制剂，所述蛋白酶抑制剂与SEQ ID NO：7具有至少90％的序列同一性，其中残基15-21和/或42-47已经用变异体序列置换。
20.权利要求19所述的表达载体，从5′端至3′端进一步包括：
第一个核酸序列，其编码在丝状真菌中功能为分泌性序列的信号多肽，
第二个核酸序列，其编码分泌多肽或其功能部分，
第三个核酸序列，其编码可切割的连接子，和
DNA序列，其编码所述蛋白酶抑制剂。
21.宿主细胞，其用权利要求19所述的载体转化。
22.权利要求21所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是木霉属细胞。
23.权利要求21所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是曲霉属细胞。
24.一种用于增强蛋白酶抑制剂在丝状真菌细胞中的表达的方法，包括
a)用DNA构建物转化丝状真菌细胞，所述DNA构建物包含启动子，所述启动子在所述丝状真菌细胞中显示出转录活性，并且所述启动子被可操作性地连接到异源DNA序列上，所述异源DNA序列编码衍生自大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)；Bowman-Birk抑制剂(BBI)的蛋白酶抑制剂及其变异体，
b)用含有侣伴蛋白基因的多核苷酸序列转化所述丝状真菌细胞，和
c)在合适的培养条件下培养所述丝状真菌细胞，以允许编码所述蛋白酶抑制剂的异源DNA序列的表达和分泌，
其中，与仅按照步骤a)转化的相应的丝状真菌细胞相比，所述蛋白酶抑制剂的表达被增强。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述转化步骤a)和转化步骤b)是共转化。
26.根据权利要求24所述的方法，其中所述转化步骤a)和转化步骤b)是顺序转化。
27.根据权利要求24所述的方法，其中所述丝状真菌细胞是曲霉属细胞或木霉属细胞。
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