CN104436163B - 孵化液酶及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及孵化液酶及其用途,特别是来自鱼孵化液的各种多肽、其编码核酸序列、包含所述多肽和核酸分子的药物组合物及其在对于皮肤的各种医疗或美容应用中的用途,尤其是用于保湿皮肤和/或用于剥离皮肤的角质层以治疗或预防动物的皮肤疾病或状况。
Description
本申请为国际申请日2010年11月30日、国际申请号PCT/EP2010/068509于2012年5月30日进入中国国家阶段、申请号201080054198.1、发明名称“孵化液酶及其用途”的分案申请。
技术领域
本发明涉及得自鱼孵化液的卵壳溶解素(choriolysin)和强酸性蛋白质(VAP)单独或组合地在针对皮肤的各种美容和医疗应用中的用途。本发明还涉及针对这些用途加以描述的强酸性蛋白质。
背景技术
皮肤是人体更脆弱的器官中的一种。尽管很少危及生命,但是皮肤疾病或状况能够让人不舒服并可能造成慢性失能。另外,由于皮肤是清晰可见的,所以皮肤疾病和状况能够导致产生心理压力。因此,一直存在有效治疗皮肤状况和疾病的需求。
皮肤形成人体的最大器官,占个人重量的约12~16%。作为外部世界和我们身体内受控环境之间的屏障和调节势力两者执行许多至关重要的作用。
皮肤由3层即表皮、真皮和皮下层构成。表皮是皮肤的最外部的上皮层。其充当物理屏障,防止从身体失水,并防止物质和有机体进入身体内。其厚度随身体位置而变化。
表皮由复层鳞状上皮构成,即其由平坦的细胞层构成。皮肤、头发和指甲是角质化的,意思是其具有由称作角蛋白的蛋白质构成的死亡的、硬化的疏水表面。表皮因为其与角化细胞相关的细胞外脂类内容物而不具有渗透性,尤其是在表皮的中层(透明层)中。粘膜(例如食道、口咽腔、生殖器等的粘膜)主要是非角质化的且是潮湿的。表皮具有三种类型的细胞,即角化细胞(皮肤细胞)、黑素细胞(产生色素的细胞)和朗氏细胞(免疫细胞)。梅克尔细胞是第四种,不占优势的表皮细胞。
角化细胞随着向外移动而成熟并随角蛋白的累积而分化。其最终脱落或擦落。它们形成四个或五个明显不同的层,从最浅表到最深处为:(i)具有无细胞核的死的、干透的硬细胞的角质层;(ii)具有含有嗜碱性颗粒的细胞并通过薄的透明层而与角质层向外隔开的颗粒层;(iii)刺状层(多刺、刺状或棘细胞层),其中细胞随着向上移动变得越来越扁平;和(iv)具有柱状(长)再生细胞的基底层。
紧挨在表皮下面的是基膜,其为位于表皮和真皮之间的特殊结构。
真皮是皮肤的纤维连接组织或支持层。主要纤维是交织的胶原纤维和弹性蛋白。
下皮层是紧接在真皮和表皮下面的脂肪层。也将其称作皮下组织、真皮或膜。所述下皮层主要由脂肪细胞、神经和血管构成。
在皮肤的下层颗粒层中产生新的上皮皮肤细胞。细胞随时间迁移到皮肤表面并变为更酸性。在其30天的迁移期间,其死亡并变得角蛋白饱和。角蛋白和相关的脂类是重要的,因为其保护皮肤防御外部因素。
生病、受伤、环境因素、年龄、激素水平、药物治疗、外敷或摄入材料、遗传状况或各种其他因素可导致皮肤的功能异常,导致不规律或异常。这些不规律或异常中的一部分可以单纯是美容性质的,如皮肤干燥、皱纹或色素沉着改变,或可以更严重地导致疼痛或不适,如湿疹和牛皮癣。
皮肤干燥是一种最普通的皮肤状况或异常。尽管某些个体更易于受到皮肤干燥的影响,但是所述状况能够影响任何人,而与年龄、性别或皮肤类型无关。
当皮肤外层(具有透明层的角质层)的水耗尽时,发生皮肤干燥。当这层被良好保湿时,其通过皮肤的失水最小并有助于抵御刺激物、过敏原和细菌。然而,当角质层干透时,其保护功能下降。这使得失水更多,导致皮肤易于受到环境因素的影响。
在正常条件下,角质层具有10%~30%的水含量。这种水使得皮肤柔软、平滑并具有柔性质地。所述水来自大气、皮肤的下层和汗。由皮肤腺产生的油和由皮肤细胞产生的脂肪物质充当天然的保湿剂,使得角质层封在水中。
身体通过蒸发从皮肤表面连续损失水。在正常条件下,损失速率缓慢,且水可充分更替。当失水超过水的更替且角质层的水含量低于10%时,发生皮肤干燥的特征性迹象和症状。
非常期望改善或消除皮肤干燥的保湿剂。尽管在本领域内已知许多保湿剂,但是仍需要有效且温和的天然产品。
另一种普遍的皮肤异常或状况是皮肤的角质层过量。这可能是由角质层蜕皮失败或由过量的角蛋白沉积在角质层中造成的。当皮肤磨蚀的天然过程变得不顺利时会造成前一种状况,使得皮肤具有干燥且粗糙的特性。良性过度增生型疾病包括表皮松懈性角化过度症(或皮肤皲裂)和毛囊角化症。一种普遍的良性过度增生型状况是在伤疤周围的外围过度增生和/或形成瘢痕疙瘩。其他过度增生型状况是鸡眼、老茧、过度角化的疣(尤其是寻常疣(veruca vulgaris))、鱼鳞癣和掌跖角化。
当前的治疗涉及剥落或在极端情况下的外科手术。通常通过软化角质层并将增厚的皮肤除去来治疗角化过度症。
还可使用剥落来除去损伤的表皮细胞,例如从出现色素沉着紊乱如肝斑的表皮上除去表皮细胞。
剥落除去表皮的外层以显示下面更新的皮肤细胞。可以通过物理手段(例如磨皮)或通过化学手段来实现剥落。化学剥落剂包括含有水杨酸、乙醇酸、水果酶、柠檬酸或苹果酸的磨砂剂且可由皮肤病医生以高浓度使用、或在非处方产品中以较低浓度应用。化学剥落可涉及使用含有α-羟基酸(AHA)或β-羟基酸(BHA)的产品、或使得在细胞连接处将细胞保持在一起的胶状物质松散的酶,使其易于除去。人们治疗痤疮推荐使用这种剥落。
剥落的最大劣势是用于实现所述剥落的一些产品和方法的价格高。剥落将导致皮肤开始时有些变红。在接近化学剥落结束时,皮肤将受冻,在皮肤表面上颜色从亮白色变为灰色。因此期望对皮肤更温和的更有效的方法。
由此仍需要适用于皮肤保湿和/或用于剥落皮肤角质层的治疗。
现在已经意外发现,在鱼孵化液中发现的某些分子是非常有效的保湿剂和剥落剂,即卵壳溶解素和新鉴定类别的强酸性蛋白质(VAP)。
鱼胚的孵化至少部分由所谓的孵化酶卵壳溶解素实现。卵壳溶解素是在鱼孵化液中发现的一种金属蛋白酶并发现通常有两种形式,即高卵壳裂解酶(卵壳溶解素H,HCE)和低卵壳裂解酶(卵壳溶解素L,LCE),它们在某些结构和催化特性方面类似且属于虾红素族,但具有明显不同的底物偏好。
在鲑鱼中,LCE与其他鱼种的已知卵壳溶解素相比相对不平常且可出于在下文描述的目的而加以应用。在下面的SEQ ID No.1中提出了鲑鱼LCE的序列。
如上所述,通过在80%丙酮中从其他组分中沉淀并通过对离心的沉淀团进行蒸发以除去丙酮,现在已经在鱼孵化液中鉴定了一类强酸性蛋白质(VAP),如实施例中所述。
在孵化期间通过孵化酶使得聚合和交联的卵壳发生蛋白水解性裂解,可产生这些VAP,且所述VAP是在卵子发生期间并入绒毛膜中的组分的片段如卵壳前体蛋白(choriogenin)H和L,下面进行更详细地说明。本文中称作VAP的卵壳前体蛋白质的这些片段在孵化期间释放入卵周液中,变为孵化液的组分。VAP可以呈现多种形式。当通过等电位聚焦进行分析时(参见实施例),VAP I、II和III(如下所述)分别出现在至少2、6和3异构体中。
发明内容
我们在此公开了已经鉴定的并具有下面描述的奇特性质的三种VAP。通过如实施例中所述的质谱分析确定了这些VAP的序列并示于SEQ ID Nos.2~4中。
本文中提及的VAP I、II和III分别具有在SEQ ID Nos.2、3和4中列出的序列。
VAP I是117个氨基酸大小并具有约15.5kDa的分子量和约3.5的pl。这种VAP是439个氨基酸的57kDa卵壳蛋白质(也称作放射带蛋白质,SEQ ID No.5)的片段。或者,VAP I可得自包括467氨基酸残基(SEQ ID No.8)的同源放射带蛋白质。
VAP II是261个氨基酸大小并具有约35kDa的分子量和约4.0的pl。这种VAP是524个氨基酸蛋白质、即68kDa卵壳前体蛋白Hβ的片段(SEQ ID No.6)。
VAP III是224个氨基酸大小并具有约29kDa的分子量和约5.2的pl。这种VAP是438个氨基酸蛋白质、即57kDa卵壳前体蛋白L的片段(SEQ ID No.7)。
如实施例和上述中所示,各种VAP可存在各种异构体中。
由此,在本发明的第一方面中提供一种多肽,其由以下所构成:
(i)在SEQ ID No.2~4中任一个所展示的氨基酸序列或与所述序列至少50%同一的序列、或任何所述序列的一部分;以及任选
(ii)在(i)的氨基酸序列的N和/或C端的侧翼氨基酸序列,其长度为1~100氨基酸。
本文中所指的“多肽”是具有优选50、100、150、200或250个以上残基和/或400、300、200或100个以下残基或选自其中的范围的分子。本文中所指的“部分”优选包含其所来源的序列的至少30、40、50、60、70、80、90、100、150、200或更多个氨基酸。所述部分可得自所述序列的中心或N-端或C-端部分。在优选方面中,所述部分由其所来源的全长度序列中除去、优选从N-端除去至少1、2、3、4或5个氨基酸残基构成。
本文中所指的“侧翼序列”是通过一般的肽键连接在中心氨基酸序列的末端N或C端处以形成连续氨基酸序列的氨基酸序列(按下文中所述进行功能等同的修饰除外)。侧翼序列可存在于中心氨基酸序列的N或C末端或存在于两端上。所述侧翼序列可短至1个氨基酸或长至100个氨基酸,优选1~50(或5~100或10~50),如1~25,例如1~5个氨基酸长度。当侧翼序列存在于N和C两个末端时,其可以是相同或不同的序列且可以具有相同或不同的长度。所述侧翼序列可得自所研究的VAP是片段的天然序列或在可比部分中与所述天然序列的同一性小于80、70、60或50%(参见例如分别在SEQ ID No.5~7中提供的相对于SEQ IDNo.2~4的天然序列,和SEQ ID No.8,其提供了关于SEQ ID No.2的别种天然序列)。
优选地,在上述部分(i)中的所述序列与所比较的序列(SEQ ID No.2~8)至少55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%同一。
通过使用SWISS-PROT蛋白质序列数据库,利用例如具有可变pamfactor以及设定为12.0的间隙产生惩罚和设定为4.0的间隙延伸惩罚和2个氨基酸的窗口的FASTA pep-cmp,可确定序列的同一性。优选地,在所述序列的全长上进行所述比较,但可在更小的比较窗口、如小于200、100或50个连续氨基酸上进行所述比较。
优选地,这种序列同一性相关多肽与所述SEQ ID Nos.中所展示的多肽的功能等同。这种功能等同的多肽可采用如下所述的衍生物形式。类似地,可在不影响如下所述的多肽的序列的条件下对具有SEQ ID Nos.中列出的序列的多肽进行修饰。
此外,如本文中所述的“部分”可以是功能等同的。优选地,这些部分满足本文中所述的同一性(相对于可比区域)条件。包括部分的本发明的优选多肽和包括上述侧翼序列的多肽优选为酸性,例如具有3~5.5、优选3.5~5.2的pl。
如本文中所指的,为了实现“功能等同”,所述多肽相对于母体分子(即所述多肽例如通过氨基酸取代从该分子中衍生的分子),可在发挥医疗或美容功能方面可以显示功效有些下降,但优选同样有效或更有效。由此,功能等同涉及可有效治疗状况或疾病或从美容上改善本文中所指的状况和/或外观,即减轻患者的一种或多种症状,例如下文中所述的皮肤的外观、质地、厚度或水分含量。对此的检验可以例如通过执行实施实施例中所指的分析,将衍生多肽与其起源多肽的效果以定性或定量方式进行比较。在可能有定量结果的情况中,衍生物为母体多肽的功效的至少30、50、70或90%。
与天然存在的蛋白质有关的或其衍生的功能等同的蛋白质,在不破坏分子功能的条件下,可以通过一次或多次(例如2~20,优选2~10)氨基酸取代、添加和/或删除对天然氨基酸序列进行修饰(条件是其满足上面提到的序列同一性要求)而得到。这种蛋白质由“功能等同的核酸分子”编码,所述功能等同的核酸分子通过一个或多个碱基的适当取代、添加和/或删除产生。
优选的功能等价物是“添加”变体,其中产生的氨基和/或羧基末端融合蛋白质或多肽包含稠合到母体多肽上的另外的蛋白质或多肽。如上所述,添加至中心多肽上时形成连续氨基酸序列的任何序列限于如上所述的侧翼序列。
此外,优选的功能等价物是“删除”或“截断”变体,其中产生的蛋白质或多肽中已经从中心多肽上除去了氨基和/或羧基末端残基。在尤其优选的实施方案中,从氨基末端除去残基,其中除去至少1、2、3、4或5个氨基酸残基。这种功能等价物是如上所述的部分。
尤其优选的功能等价变体是天然生物变种(例如在物种内或在不同种属如植物、动物或细菌中的等位基因变体或地理变种,尤其是鱼,特别是源自鲑(Salmonidae)科,尤其是鲑鱼(salmo)和大马哈鱼(Oncorhynchus)亚科)和使用已知技术制备的衍生物。例如,编码功能等价蛋白质的核酸分子可以通过化学合成或使用包括删除、随机诱变或酶裂解和/或核酸连接的位已知点定向诱变技术以重组的形式产生。
本发明还提供由核苷酸序列构成的核酸分子,所述核苷酸序列仅对所述多肽或其互补序列进行编码。
在优选方面中,本发明由此提供一种核酸分子,所述核酸分子由以下所构成:
(i)SEQ ID Nos.10~12中任一个所展示的核苷酸序列;与所述序列至少50%同一的序列;或在室温下在6×SSC/50%甲酰胺的非严紧结合条件和在高度严紧的条件如2×SSC、65℃下进行洗涤仍与所述序列杂交的序列,其中SSC=0.15M的NaCl、0.015M柠檬酸钠、pH 7.2;或与任何上述序列互补的序列;或其一部分,以及任选
(ii)在(i)的氨基酸序列的N和/或C端的长度为1~100氨基酸的侧翼氨基酸序列,
或其互补序列。
优选地,所述核酸分子对上文中所述的多肽进行编码。
本文中所指的“核酸分子”是具有优选150、300、450、600或750个以上碱基和/或1200、900、600或300个以下碱基或从其选择的范围的分子。如上所指的“部分”优选包含其所来源的序列的至少90、120、150、180、210、240、270、300、450或600个核苷酸碱基。优选地,所述部分对如上所述的N-末端、中心或C-末端的肽进行编码。在优选方面中,所述部分由其所来源的全长度序列除去、优选从5’端除去至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个碱基而构成。
如本文中所指的,“侧翼序列”是指通过一般的磷酸二酯键连接在中心核苷酸序列的末端5’或3’端处以形成连续核苷酸序列的核苷酸序列(在如下所述功能等价物中进行修饰的除外)。侧翼序列可存在于中心核苷酸序列的5’或3’末端上或可以存在于两端上。所述侧翼序列可短至1个核苷酸或可长至300个核苷酸,优选1~150(或15~300或30~150),例如1~75,如1~15个核苷酸长度。当侧翼序列存在于5’和3’两个末端时,其可具有相同或不同的序列且可具有相同或不同的长度。所述侧翼序列可源自对所研究的VAP编码序列是其片段的天然序列或在可比部分中与所述天然编码序列的同一性小于80、70、60或50%(参见例如分别相对于SEQ ID Nos.10~12在SEQ ID Nos.13~15中提供的天然序列,和SEQ IDNo.16,其提供了关于SEQ ID No.10的别种天然序列)。
优选地,在上述部分(i)中的所述序列与所比较的序列(SEQ ID No.10~16)至少55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%同一。
通过例如使用GCG软件包,使用缺省值和可变pamfactor、间隙产生惩罚设定为12.0和间隙延伸惩罚设定为4.0以及6个核苷酸窗口的条件下,进行FASTA Search,可确定序列的同一性。
优选地,这种序列同一性相关或杂交的核酸分子与在所述SEQ ID Nos.中所展示的核酸分子的功能等同。这种功能等同的核酸分子可采取如下所示出的衍生物形式且如果它们编码的多肽根据上述试验被认为是功能等价的,则认为所述核酸分子是功能等价物。优选的功能等价物是对上述优选多肽进行编码的那些,例如对在与本文中所述的特定分子不同的属或物种中发现的多肽进行编码的核酸分子。
此外,如本文中所述的“部分”可以是功能等价物。优选这些部分满足本文中所述的同一性(相对于可比区域)或杂交条件。优选地,本发明的核酸分子、包括部分和包含上述侧翼序列的核苷酸序列优选对如上所述的酸性多肽进行编码。
本发明的并用于本发明的用途的核酸分子可以为单或双链的DNA、cDNA或RNA,优选DNA,且包括简并的、基本与上述同一和杂交的序列。然而,理想地,所述分子为DNA或cDNA。
本发明的或用于本发明的用途的多肽包括在不影响多肽序列的条件下进行修饰的那些多肽,例如通过化学修饰,包括通过去糖基化或糖基化。通过在不影响功能性的条件下对多肽进行合成/分离后修饰,如特殊残基的特定糖基化、甲基化等,可制备这类多肽。
本发明的或用于本发明用途的多肽也可采取肽模拟物的形式,所述肽模拟物可被认为是衍生物,其中保持了多肽的功能特征,但以不同的背景、例如非肽结构呈现。已经成功开发了这种肽模拟物并用于其他特殊医疗应用中。
通过各种工艺可产生肽模拟物,尤其是非肽分子,所述工艺包括基于构象的药物设计、筛分、集中的文库设计和经典药物化学。不仅可使用非天然氨基酸或其他有机结构单元的低聚物,还可通过本领域中已知的方法使用碳水化合物、杂环或大环化合物或任何有机分子,所述有机分子包含可提供分子静电表面的结构元素和构象,所述分子静电表面模拟肽的3维构象的相同性质。
由此,所述肽模拟物可能与肽主链很少或不类似。肽模拟物可包含完全合成的非肽形式(例如基于具有合适取代基的碳水化合物主链)或可保留肽作为其基础的一种或多种元素,例如通过衍生一种或多种氨基酸或利用替代的非肽成分代替一个或多个氨基酸。肽状模板包括假肽和环肽。可将对于肽功能被认为是冗余的结构元素最少化到仅保持骨架功能、或在适当时除去。
当肽模拟物保留一种或多种肽元素、即一种以上氨基酸时,这样的氨基酸可利用其非标准的或结构类似物代替。保留在序列中的氨基酸还可衍生或修饰(例如标记、糖基化或甲基化),只要保留了本发明的或用于本发明用途的多肽的功能性质即可。将肽模拟物称作“衍生自”特定的多肽序列。这是指,参考限定的多肽序列,对肽模拟物进行设计,使得其保留肽的功能必需的结构特征。其可以为多肽的特殊侧链、或所述结构的氢键电位。通过非肽成分或一种或多种氨基酸残基可提供这样的特征,或对连接多肽的所述氨基酸残基的键进行修饰以提高多肽的特定功能如稳定性或蛋白酶抗性,同时保留了多肽的功能必需的结构特征。
可使用的非标准的或结构类似的氨基酸的实例是D氨基酸、酰胺等排体(例如N-甲基酰胺、反向-翻转酰胺、硫酰胺、硫酯、磷酸酯、酮亚甲基、羟基亚甲基、氟代乙烯基、(E)-乙烯基、亚甲基氨基、亚甲基硫基或链烷)、L-N甲基氨基酸、D-α甲基氨基酸、D-N-甲基氨基酸。非常规的氨基酸的实例列于表1中。
表1
可使用的非标准氨基酸包括构象限制的类似物如Tic(用于代替F)、Aib(用于代替A)或哌啶甲酸(用于代替Pro)。
上述多肽和核酸分子还包括例如经过修饰以例如促进其在药学应用中的用途(如下所述)的衍生物,例如通过加入靶向或功能基团从而例如改进亲脂性、协助细胞运输、可溶性和/或稳定性。因此可以将寡糖、脂肪酸、脂肪醇、氨基酸、肽或多肽接合到上述多肽或核酸分子。如下文所述,核酸分子可以存在于病毒载体中。
多肽也包括“药物前体”或“前体肽”形式的衍生物,使得所添加成分在施用时可以通过切割而去除,例如切割通过酯化加入的取代基,所述取代基可以在酯酶的作用下被去除。这样的药物前体包括天然存在的蛋白质的天然前体,通过例如蛋白水解将其切割以获得目的多肽。但是,被加入到中心多肽时形成连续氨基酸序列的任何序列限于上述侧翼序列。或者它们可以具有更长的侧翼序列,只要侧翼序列不扩大到VAP片段所来源的天然序列(例如涉及氨基酸序列的SEQ ID Nos.5-8和核酸序列SEQ ID Nos.13-16)或者与可比部分的序列的序列同一性为至少50、60、70、80或90%的序列的分子即可。
因此,本发明的或者用于本发明用途的核酸分子同样包括编码这样的药物前体或前体的分子。但是,被加入到中心多肽时形成连续核苷酸序列的任何序列限于上述侧翼序列。或者它们可以具有更长的侧翼序列,只要侧翼序列不扩大到VAP片段所来源的天然序列或者与可比部分中序列的序列同一性为至少50、60、70、80或90%的序列的分子即可。
可以检测如上所述的被修饰的多肽或核酸分子,通过确定它们是否具有相同或相似的医疗或美容作用来确保其保留了与未修饰分子相关的功能活性。
可以将上述核酸分子可操作地连接至表达控制序列、或重组DNA克隆载体或含有这样的重组DNA分子的载体。这样使得可以作为基因产物表达本发明的或者用于本发明的用途的多肽,其表达是由导入目的细胞的基因所指导。基因表达是由在目的细胞中有活性的启动子所引导,并且可以为了整合入基因组或者为了独立复制或瞬时转染/表达而以线状或环状DNA载体的任何形式插入。文献中很好描述了适当的转化或转染技术。或者,为了本文所述的用途,可以将裸露的DNA分子直接导入细胞。
适当的表达载体包括适当的控制序列,例如与执行下文所述的本发明的方法所需要的核酸分子一起连接在匹配的阅读框中的翻译(例如起始和终止密码子、核糖体结合位点)和转录控制元件(例如启动子-操纵子区域、终止序列)。适当的载体可包括质粒和病毒(包括噬菌体和真核病毒)。合适的病毒载体包括杆状病毒以及腺病毒、腺相关病毒、疱疹和痘苗/痘病毒。现有技术中描述了许多其他病毒载体。优选的载体包括细菌和哺乳动物表达载体pGEX-KG、pEF-neo和pEF-HA。可以便利地将核酸分子与编码其它多肽、例如谷胱甘肽-S-转移酶的DNA融合,从而在表达时产生融合蛋白。
因此从另一方面看,本发明提供含有上述核酸分子的载体,优选表达载体。
本发明的另一方面包括制备根据本发明的重组核酸分子的方法,其包括将编码本发明的多肽的本发明的核酸序列插入载体核酸。
在下文所述的方法中,通过用本发明的或者用于本发明的用途的核酸分子转染细胞,可以向细胞施用多肽。如上所述,本发明进而扩展到由编码本文所述的本发明多肽的序列所构成的或者包含它们的核酸分子,及其在本文所述的方法中的用途。优选地,所述核酸分子包含在载体、例如表达载体中。
可以通过任何适当的方法将优选包含在载体中的本发明的或者用于本发明用途的核酸分子导入到细胞中。文献中充分描述了合适的转化或转染技术。已知多种技术,可以将其用于将这样的载体导入到用于表达的原核或真核细胞中。用于这种用途的优选的宿主细胞包括昆虫细胞系、真核细胞系或者大肠杆菌(E.coli),如BL21/DE3细胞株。本发明还扩展到含有核酸分子、尤其是上述载体的被转化或被转染的原核或真核宿主细胞。
本发明的另一方面提供了制备如上所定义的本发明的多肽的方法,其包括在表达所述多肽的条件下培养含有如上所定义的核酸分子的宿主细胞,并回收由此产生的所述分子。所表达的多肽构成本发明的又一方面。
本发明还扩展到由如上所述的核酸分子所编码的多肽。其可以通过如上所述的宿主细胞的表达而生产。
产生和分泌本发明的多肽、但是相对于天然细胞已通过表达编码核酸物质而被修饰的细胞构成本发明的又一方面。
在下文所述的本发明的组合物和用途中所使用的多肽或核酸分子,可以从天然存在的来源获得或衍生,或者可以通过完全或部分合成而产生。
多肽和核酸分子按照实施例和下文所述的方案或者按照Yasumasu等.,1989,J.Biochem.,105,p212-218有关卵壳溶解素所述来便利地分离,所述文献被并入本文作为参考,尤其是关于其分离方法。这样的方法和这样的方法的产物由于与本文所述的VAPs相关而构成本发明的又一方面。
因此本发明的另一方面提供了从孵化液(例如鲑鱼的)中分离本文所述的一种或多种多肽(VAPs或相关序列)的方法,其至少包括以下步骤:
a)将卵悬浮在最少体积的水中(例如小于卵的体积);
b)诱导所述卵同步、快速孵化(优选使得在少于3小时内超过95%的胚胎完成孵化);
c)过滤孵化的卵,从而获得孵化液;
d)向所述孵化液中加入丙酮至终浓度为80%v/v;和
e)将所述液体进行低速离心,其中所述多肽存在于由此形成的沉淀团中;和任选地
f)通过例如使用离子交换柱分离存在于步骤e)的沉淀团中的多肽,以分离各个多肽。
优选的离子交换柱是CL-6B柱,但是易于获得合适的替代品。
优选的所述孵化液来自鱼,尤其是鲑科(Salmonidae),特别是鲑(Salmo),例如大西洋鲑(Salmo salar)和太平洋鲑(Oncorhynchus)。
本发明还扩展到用上述方法所制备的多肽。
优选,本发明的或者用于本发明的用途的多肽或核酸分子基本没有来自在分离过程或其合成制备中所使用的原材料的任何污染成分。尤其优选,将化合物纯化至以w/w(干重)评估纯度超过50或60%,例如>70、80或90%,优选超过95或99%的纯度。这样的纯度水平对应于具体目的分子,但是包括其降解产物。在合适情况下,可以使用富集制剂,其纯度较低,例如含有超过1、2、5或10%、例如超过20或30%的目的分子。可以用例如色谱法(例如HPLC、尺寸排阻、离子交换、亲和、疏水相互作用、反相)或毛细管电泳法纯化本发明的或者用于本发明的用途的多肽。
本发明的或者用于本发明的用途的多肽可以是合成产生的,例如通过连接较小的合成产生的多肽而产生,或者更便利地通过重组表达如上所述的编码所述多肽的核酸分子而产生。
本发明的或者用于本发明的用途的核酸分子可以是合成产生的,例如通过扩增本文所述的核酸分子而产生。可以如下文所述使用本文所述的VAP多肽和核酸分子来实现美容和/或医疗作用和形成用于此目的的优选的分子。
此外,对于下文所述的方法,可以使用包括上述片段的更长的蛋白质(与其编码序列),如全长天然蛋白质。因此,对于下文所述的用途,可以使用的多肽扩展到含有序列Nos.2-8中任一个所示的氨基酸序列、或者与所述序列至少50%同一的序列、或者任何所述序列中的一部分的多肽。
涉及多肽、部分、序列同一性和功能等同蛋白质的定义同样适用,并且如上所述的优选的序列同一性值也适用。优选地,多肽是上述天然蛋白质的片段(任选具有侧翼序列)。类似地,对于下述用途,可以使用的核酸分子扩展到含有编码本发明的多肽或上述更长的多肽的核苷酸序列或其互补序列的核酸分子。优选地,用上述天然编码序列的片段(任选具有侧翼序列)执行所述用途。
因此,对于下述用途,可以使用的核酸分子扩展到含有SEQ ID Nos.10-16中任一个所示的核苷酸序列、或者与所述序列至少50%同一的序列、或者与所述序列杂交的序列、或者与任何上述序列互补的序列、或者任何所述序列的一部分的核酸分子,所述杂交是在6×SSC/50%甲酰胺和室温的非严紧结合条件下进行,并在高度严紧的条件、例如2×SSC、65℃下洗涤,其中SSC=0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠、pH7.2。
在后文涉及本发明的用途提到时,提到多肽和核酸分子是指这种较宽的定义,即不仅是上述任选含有侧翼序列的天然分子的片段。
除上述VAPs外,还已经发现,鱼孵化液中所发现的其它蛋白质具有有利的美容和/或医疗用途,其补充VAPs、即前面讨论的卵壳溶解素L的用途。
因此,对于动物部位或产物,例如皮肤样品,可以离体(ex vivo)或体外使用本文所公开的多肽或核酸分子,尤其是在考虑例如以皮肤移植物的形式将它们重新引入其所来源的身体中时。
但是,本文所公开的多肽和核酸分子优选按照下面更详细的说明进行体内使用。
本文所述的多肽和核酸分子具有下文所述的治疗各种异常、疾病或状况的用途。
因此,本发明扩展到包含前面所述的多肽或核酸分子和一种或多种药学上可接受的赋形剂和/或稀释剂的药物组合物。
或者说,本发明提供了药物组合物,其包含;
(i)包括SEQ ID No.1所示氨基酸序列、或者与所述序列至少50%同一的序列、或者任何所述序列中的一部分的多肽;
(ii)包括SEQ ID No.2所示氨基酸序列、或者与所述序列至少50%同一的序列、或者任何所述序列中的一部分的多肽;
(iii)包括SEQ ID No.3所示氨基酸序列、或者与所述序列至少50%同一的序列、或者任何所述序列中的一部分的多肽;和/或
(iv)包括SEQ ID No.4所示氨基酸序列、或者与所述序列至少50%同一的序列、或者任何所述序列中的一部分的多肽;
以及一种或多种药学上可接受的赋形剂和/或稀释剂。
在优选的方面,在考虑使用比SEQ ID Nos.2-4所示序列更长的序列时,在以上列举中,可以分别用SEQ ID Nos.5-7替换SEQ ID Nos.2-4,并且其中SEQ ID.No:2或者可以用SEQ ID No:8替换。
优选的多肽如上所述,尤其是涉及VAPs时,是天然序列的片段,其任选含有侧翼序列。本文中提到药物组合物可以理解为包括美容组合物。
替代地或者附加地,所述组合物可以包括所述多肽的编码序列,即前面所述的核酸序列(例如(v)编码以上(i)至(iv)中任一个所示的多肽的一种或多种核酸分子或者其互补序列)。优选的核酸分子如上所述,即参考SEQ ID Nos.9-16、优选9-12。
在优选的方面,所述组合物包括所述成分的组合,例如以上成分(ii)至(iv)(即所有所描述的VAPs)或者以上所列出的所述4种成分的任何组合。
“药学上可接受”或者“生理上可接受”是指其成分必须与组合物中的其它成分相容,并且对于接受者是生理上可接受的。
可以将所施用的活性成分适当修饰,以用于药物组合物。例如,通过使用上述衍生物可以使本发明所使用的化合物稳定以对抗降解。
例如,还可以通过使用合适的添加剂,使组合物中的活性成分稳定,所述添加剂如盐或非电解质、乙酸盐、EDTA(用于VAPs和相关多肽)、柠檬酸盐(用于VAPs和相关多肽)、Tris、磷酸或乙酸缓冲液、甘露醇、氨基乙酸、HSA(人类血清蛋白)或聚山梨醇酯。
在所述组合物中,本文所述的核酸分子或多肽可以作为唯一的活性成分存在,或者为了例如增强疗效或者使组合物更吸引用户,而与其他成分、尤其是其它活性成分组合。所述其它成分可以是上述4种任选成分中的一种或替代成分。
包含本文所述的一种或多种多肽或核酸分子的组合物还可以包含杂质,例如,在从天然来源制备所述一种或多种本发明的多肽或核酸分子后。在包含本文所述的一种或多种多肽或核酸分子的组合物中,每种所述多肽或核酸分子可以在药物组合物的0.0001至30%w/w的范围内存在。优选地,所述多肽或核酸分子在0.01-10%的范围内存在或者如下文所述。
在本发明的再一方面,本文所述的组合物被用于治疗。
如上所述,本发明的多肽和核酸分子在治疗皮肤异常、疾病或状况中通过皮肤保湿和/或剥落表现出治疗特性。
待治疗的优选的皮肤异常、状况或疾病为皮肤干燥、皮肤角质层比预期的厚例如处于角化过度状态、或者皮肤的表皮中具有不希望的色素沉着例如黄褐斑、老年斑、日晒斑或褐斑。治疗可以是美容性的,例如治疗正常的但是干燥和加厚的皮肤(如硬茧、鸡眼或角化过度的疣)或治疗色素沉着紊乱,如黄褐斑,或者是治疗性的,例如治疗引起疼痛的痤疮、湿疹、牛皮癣或疣。
如本文所述,“疾病”是指相对于正常生物体有症状的或无症状的生物体内的潜在病理障碍,其可能是由于例如感染或者获得性或先天性遗传缺陷所致。“异常”或“状况”是指皮肤相对于正常的理想皮肤的反常或缺陷,但是其不是病理障碍的结果。所述缺陷/反常可能是由于年老、受伤、环境因素、激素水平、药物治疗、外部施加的或吸收的物质、遗传状况或者导致皮肤功能异常引起反常的其他各种因素。
疾病、异常或状况可以仅仅是需要医疗的美容或非美容性的,或者其组合。
如本文所述,“美容”意图是指不治愈、治疗或预防疾病或病,而是充当护肤品或者改变或改善例如皮肤的颜色、质地或水分含量等皮肤外观的治疗。
如本文所述,医用治疗中所使用的“非美容”(或医疗)成分用于治愈、减轻、治疗或预防疾病的一种或多种症状,例如疼痛或不适。
如本文所述的治疗的基础是本文所公开的VAPs和/或卵壳溶解素的皮肤保湿和剥落作用。本文所提供的实施例中说明了这些作用。
因此设想了基于VAPs和/或卵壳溶解素的保湿和/或剥落特性的治疗。
因此,本发明提供了动物皮肤剥落和/或保湿的美容或非美容方法,其中向所述动物施用本文所述的多肽、核酸分子或药物组合物。
因此,参照以上内容,本发明提供了动物皮肤剥落和/或保湿的美容或非美容方法,其中向所述动物施用多肽、核酸分子或药物组合物,其中所述多肽包括序列Nos.1-8(优选1-4)中任一个所示的氨基酸序列、或者与所述序列至少50%同一的序列、或者任何所述序列中的一部分;所述核酸分子编码所述多肽或者是其互补序列(例如SEQ ID Nos.9-16(优选9-12)中任一个所示的核苷酸序列、或者与所述序列至少50%同一的序列、或者与所述序列杂交的序列、或者与任何上述序列中互补的序列、或者任何所述序列中的一部分,所述杂交是在6×SSC/50%甲酰胺和室温的非严紧结合条件下进行,并在高度严紧的条件、例如2×SSC、65℃下洗涤,其中SSC=0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠、pH7.2),并且所述药物组合物包含所述多肽或核酸分子中的一种或多种以及一种或多种药学上可接受的赋形剂和/或稀释剂。
如上所述和在本文中提到时,参照SEQ ID Nos.2-8和10-16所定义的上述多肽和核苷酸序列是VAPs或相关序列,并且参照SEQ ID.Nos.1和9所定义的序列是卵壳溶解素或相关序列。
如本文所述,“剥落”指去除上皮表面的浅层细胞,其在皮肤中相当于剥落或剥离表皮的角质层。本文所述的“保湿”包括防止皮肤丧失水分的保湿剂,以及在涂到皮肤上时吸收和保持水分的保湿剂(润湿剂),和软化剂(改善剥落缺陷)。
或者说,本发明提供了本文所述的多肽、核酸分子或药物组合物用于动物皮肤剥落和/或保湿。(或者,所述化合物或组合物可以用于制备用于该用途的药物)。
如上所述,这样的剥落和/或保湿特性对于治疗或预防各种皮肤异常、疾病或状况是有利的。
在优选的方面,待治疗或预防的皮肤异常、状况或疾病是皮肤干燥。其可以通过保湿和/或剥落而治疗。
本文所述的“皮肤干燥”是指缺乏水分或皮脂的表皮,特征常为细纹形式、剥落和瘙痒。皮肤干燥可以作为皮肤状况本身发生(例如由于老化、热/冷/干损伤),或者可以是如日晒损伤、湿疹、接触性皮炎、牛皮癣或鱼鳞癣(导致显著的皮肤片状剥落的遗传状况)等皮肤疾病或状况的症状。
在另一个优选的方法中,待治疗或预防的异常、状况或疾病是皮肤的角质层增厚。其可以通过保湿和/或剥落而治疗。
皮肤的这种角质层增厚可以发生于诸如硬茧或鸡眼等状况中,所述硬茧或鸡眼是由于反复摩擦皮肤上的区域或疣引起的由增厚的皮肤上层所组成的保护垫。这样的方法也可以用于治疗或预防在病理上涉及角质化的痤疮。增厚的皮肤角质层可以是状况本身或者可以是皮肤状况或疾病的症状。
在另一个优选的方面,待治疗或预防的异常、状况或疾病是皮肤色素沉着症或异常,其可以通过剥落而治疗。
皮肤色素沉着症或异常可能是由于老化、激素变化、遗传因素、疾病或者日晒或其他损伤而产生。色素沉着改变可能是由于局部的黑素细胞过量或黑素细胞活性增加、或者上述两种原因所致。色素沉着紊乱包括黄褐斑、晒斑或老年斑(日光性黑子(solarlentigo))以及其它斑点,例如雀斑。
或者说,因此,本发明提供治疗或预防动物皮肤的状况或疾病的美容或非美容方法,其中所述皮肤异常干燥、皮肤的角质层异常增厚或者皮肤具有色素沉着紊乱,其中向所述动物施用上述多肽、核酸分子或药物组合物。所述状况或疾病优选如上文所述。
如本文所述,“异常”是相对于正常的理想皮肤、即健康、含水的、色素正常和未老化的皮肤而确定的。
也就是说,本发明提供用于治疗或预防动物皮肤的状况或疾病的美容或非美容方法的如上所述的多肽、核酸分子和药物组合物,其中所述皮肤异常干燥、皮肤的角质层异常增厚或者皮肤具有色素沉着紊乱。(或者,所述化合物或组合物可以用于制备用于该目的的药物。)
在优选的方面,通过向皮肤局部施用而实现该医疗和/或美容用途。
优选地,对于依赖于、至少部分依赖于活性成分的剥落作用的医疗或美容适应症,用于该目的的药物组合物包含一种或多种VAPs(或本文所述的其相关序列)和/或卵壳溶解素(或本文所述的其相关序列)。
优选地,对于依赖于、至少部分依赖于活性成分的剥落作用的医疗或美容适应症,用于该该目的的药物组合物包含一种或多种VAPs(或本文所述的其相关序列)。
因此,在特别优选的方面,可以将一种或多种VAPs(或本文所述的其相关序列)和/或卵壳溶解素(或本文所述的其相关序列)用于治疾病,所述疾病中皮肤异常干燥、皮肤的角质层异常增厚或者存在色素沉着缺陷,如硬茧、鸡眼、疣、湿疹、接触性皮炎、牛皮癣、鱼鳞癣、痤疮和黄褐斑。
在特别优选的方面,可以将一种或多种VAPs(或本文所述的其相关序列)用于治疗皮肤异常干燥的疾病症。
如本文所述,“治疗”是指相对于在所述个体的皮肤没有罹患所述状况或疾病且没有进行所述治疗的不同身体部位或者在没有进行所述治疗的相应的正常个体中所存在的症状或影响,所述状况或疾病的一种或多种症状或影响降低、减轻或消除、优选到正常水平,所述症状或影响如皮肤干燥或增厚的存在或程度、色素沉着的程度或面积、瘙痒或疼痛等。
“预防”是指绝对防止、或者降低或减轻症状或影响发作的程度或时间(例如延迟)。例如,在典型为皮肤干燥、增厚或色素异常的状况出现之前常规使用本发明的组合物,可以预防这样的状况。
优选地,使用本发明的多肽方法达到所述治疗。但是,还考虑使用编码多核苷酸。这可以例如通过基因疗法,例如使用有义序列从而允许在皮肤中表达所需分子得以实现。
本发明的治疗或预防方法可以有利地结合施用有效治疗或预防所述疾病或状况和/或实现保湿或剥落的一种或多种活性成分。因此,本发明的药物组合物可以另外含有一种或多种这样的活性成分。
根据本发明的又一方面,我们提供了含有本文所述的一种或多种多肽或核酸分子并且任选地含有一种或多种其他活性成分的产品作为联合制剂用于在人类或动物治疗中同时、分别或顺序施用,优选如本文所述,。
按照本领域公知的技术,使用易于获得的成分,可以用常规方法以一种或多种生理上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂配制本发明的组合物。
因此,可以将活性成分、任选与作为联合制剂的其他活性物质一起、与一种或多种常规载体、稀释剂和/或赋形剂混合,从而制备常规的盖伦制剂,如片剂、丸剂、粉剂、菱锭、袋剂、扁囊剂、酏剂、悬浮液(作为注射或输注液)、乳液、溶液、糖浆、气溶胶剂(作为固体或在液体基质中)、软膏剂、软或硬明胶胶囊、栓剂、无菌注射液、无菌包装的粉剂等。对于固体移植物还可以使用生物可降解聚合物(如聚酯、聚酐、聚乳酸或聚乙醇酸)。通过采用冻干、过冷或Permazyme可以使组合物稳定。
合适的赋形剂、载体或稀释剂是乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、碳酸钙、乳酸钙、玉米淀粉、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水糖浆、水、水/乙醇、水/乙二醇、水/聚乙烯、乙二醇、丙二醇、甲基纤维素、甲基羟基苯甲酸酯、丙基羟基苯甲酸酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油或者脂肪物质例如固体脂肪,或其合适的混合物。还可以使用用于获得缓释剂的作用剂,如羧基聚亚甲基、羧甲基纤维素、醋酸纤维素邻苯二甲酸酯或聚乙酸乙烯酯。
组合物可以另外包括润滑剂、润湿剂、乳化剂、增粘剂、成粒剂、崩解剂、粘结剂、渗透活性剂、悬浮剂、防腐剂、甜味剂、调味剂、吸附增强剂(例如表面渗透剂或用于经鼻给药,例如胆盐、卵磷脂、表面活性剂、脂肪酸、螯合剂)、棕色着色剂、有机溶剂、抗氧化剂、稳定剂、软化剂、有机硅、α-羟基酸、缓和剂、消泡剂、保湿剂、维生素、香精、离子型或非离子型增稠剂、表面活性剂、填充剂、离子型或非离子型增稠剂、多价螯合剂、聚合物、推进器、碱化剂或酸化剂、乳浊剂、着色剂和脂肪化合物等。
可以采用本领域公知的技术配制本发明的组合物,从而实现在向身体施用后快速、持续或延迟释放活性成分。
组合物可以是任何的合适剂型,从而允许递送或靶向特定细胞或组织,例如乳剂或吸收、吸附、混入或结合了活性成分的脂质体、非离子表面活性剂泡囊(niosomes)、微球、纳米粒子等。这样可以有效地将产品转化为不溶形态。这些微粒形式可以克服稳定性(例如降解)和递送问题。
这些颗粒可以携带合适的表面分子以提高循环时间(例如血清成分、表面活性剂、polyoxamine908、PEG等),或者携带靶向特异性位点的部分,如特定细胞携带的受体的配体。用于药物递送或用于靶向的合适的技术在本领域是公知的,WO99/62315中对其有说明。
优选使用溶液、悬浮液、凝胶或乳液,例如可以在水、气体、水基液体、油、凝胶、乳液、水包油或油包水乳液、分散体或其混合物中携带活性成分。
组合物可以用于局部(即用于皮肤)、经口或等肠胃外给药例如注射。
但是优选的是局部组合物和给药,并且包括凝胶、霜剂、软膏剂、喷雾剂、洗剂、油膏剂、贴剂、皂剂、粉剂、膜、气溶胶剂、滴剂、泡沫、溶液、乳液、悬浮液、分散体如非离子型泡囊分散体、乳和本领域的任何其它常规药物或化妆品形式。
可以例如用水性或油性基质同时添加合适的增稠剂和/或胶凝剂来配制软膏剂、凝胶和霜剂。可以用水性或油性基质配制洗剂,并且一般来说其还可以含有一种或多种乳化剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂或着色剂。可以在任何合适的粉末基质的协助下形成粉剂。可以用水性或非水性基质配制滴剂和溶液,其还含有一种或多种分散剂、增溶剂或悬浮剂。使用合适的推进器,可以便利地从加压包中递送气溶胶喷雾剂。
或者,可以采用适于经口或肠胃外给药的形式提供该组合物。因此供选的药物形式包括含有活性成分和任选一种或多种惰性常规载体和/或稀释剂的普通或包衣片剂、胶囊、悬浮液和溶液,所述载体和/或稀释剂如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、微晶纤维素、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、柠檬酸、酒石酸、水、水/乙醇、水/甘油、水/山梨醇、水/聚乙二醇、丙二醇、硬脂醇、羧甲基纤维素或脂肪物质如固体脂肪,或者其合适的混合物。
在本发明的组合物中活性成分的浓度取决于所使用的化合物(即多肽或核酸分子)的性质、给药方式、治疗过程、患者的年龄和体重、医疗适应症、待治疗的身体或身体区域,并可以根据选择加以变化或调整。但是,本文所述的化合物的浓度范围通常是0.0001、0.0005、0.001或0.01至25%,例如0.0005-15%,例如0.01至10%,如0.1或0.5至5,例如1-5%(用于给药、尤其是局部给药的最终制剂的w/w)。
当存在超过一种化合物、例如本文所述的3种VAPs(或相关分子)时,每种化合物可以按上述的量存在。所述浓度是参照化合物本身的量而确定,因此应当考虑组合物的纯度给出适当的给予量。当局部使用时,根据被治疗的动物,VAPs(和相关分子)的有效单剂量可以在0.1-100mg/cm2/天的范围内,优选0.1-10mg/cm2/天,作为单剂量。对于卵壳溶解素(和相关分子),有效单剂量可以在0.1-100mU/cm2/天的范围内,优选0.5-10,例如1-5mU/cm2/天。
给药可以是用医学领域已知的任何合适的方法,其包括例如经口、肠、经皮、颊、直肠或局部给药,或者通过吸入给药。优选的给药方式可以是口服给药,或者更优选局部给药。应当理解的是,如果活性成分是可消化的,口服给药具有局限性。为了克服这样的问题,可以如上所述使成分稳定。
应当理解的是,由于用于本发明性能的活性成分采取各种形式,例如核酸分子(其可以是在载体中)或多肽,组合物的形式和递送途径将不同。但是,优选采用液体溶液、霜剂或悬浮液,尤其是例如用于经口给药或局部给药。
可以将本发明的多肽或核酸分子用于上述医学适应症。在后者的基因疗法中,利用本领域已知用于医学应用的基因疗法,优选如上所述在适于转染/转化的载体中提供核酸分子,所述载体是例如病毒载体,如腺病毒。
可以使用或施用所述组合物的动物包括哺乳动物、爬行动物、鸟类、昆虫和鱼类,尤其是在鱼类水产养殖中的鱼类(例如鲑鱼或鳕鱼)。优选地,使用本发明的组合物的动物是哺乳动物,尤其是灵长类、家养动物、家畜和实验动物。因此,优选的动物包括小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猫、狗、猴子、猪、牛、山羊、绵羊和马。尤其优选对人类使用或施用该组合物。
附图说明
提供下面的实施例只是作为说明,其中参考的图如下:
图1显示了VAPs在纯化后的等电聚焦;
图2显示了大西洋鲑VAPs对人类上皮的作用,其中A和B显示暴露于VAPs的皮肤培养物,C显示了对照皮肤培养物;和
图3显示了大西洋鲑卵壳溶解素L对人类上皮的作用,其中A显示了暴露于卵壳溶解素L的皮肤培养物,B显示了对照皮肤培养物。
具体实施方式
实施例1:VAPs的鉴别和表征
蛋白质分离
在分析大西洋鲑的孵化液成分的过程中,鉴别出了存在于孵化液中的新的蛋白质。
WO99/29836中提供了制备部分孵化液(从中可以制备zonase)的方法,所述部分孵化液可以用作分离本发明的VAPs(或其前体序列)的起始材料,该文献被并入本文作为参考(尤其是所述方法的实施例1,但是任选没有尿素步骤)。
因此,使用以下方法进行分离。从孵化液(粗制的或经过0.45μm过滤器过滤的)中分离VAPs。然后在室温或4℃下通过加入4×体积的丙酮使VAPs沉淀。20-30分钟后,收集所沉淀的VAPs,其在低速(约5000×g)离心后成为沉淀团,并且将其重新悬浮在合适的缓冲液(例如10mM TrisHCl,pH8.0或PBS)中。
图1显示了经过上述纯化后的VAPs的2D PAGE。
序列分析
通过对于胰蛋白酶化印迹的MS分析而表征新鉴别出的VAPs,该MS分析是MALDI-TOF-TOF(基质辅助激光解吸/电离,飞行时间×2)。
对于由峰值所反映的最佳匹配获得了以下结果。
从以上结果可以看出,用MS鉴别VAP序列中的肽,然后使用进行比较的已知天然序列的相应部分插入间插序列,从而产生VAPs的序列。SEQ ID Nos.2-4示出了用这种方法鉴别出的VAP序列,SEQ ID Nos.5-8提供了它们与之进行比较的天然序列。
实施例2:VAPs的体外医疗/美容应用
材料和方法
用按照实施例1所述而制备的大西洋鲑鱼VAPs进行以下研究。
从SkinEthics(Nice,法国)获得分化的人类皮肤上皮培养物,所述培养物是在接种到具有微孔允许营养物从下方到达上皮组织的塑料生长基质上之后16天时获得。在37℃培养期间,这样的培养物在分化后表现出正常的皮肤形态。将这些培养物在体外再维持2天,使得上部角质层暴露于空气中,且基底层暴露于生长基质。
将平行培养物移至30℃潮湿气氛中且提供含Ca、Mg的磷酸缓冲盐水基质的培养基中,持续6小时,其中存在或没有0.5mg/ml VAPs(在OD280下测量)。按照标准程序将培养物用福尔马林固定并用石蜡包埋,并且用苏木精/曙红染色。
结果
A.保湿作用
图2A-C中显示了其结果,其中A和B显示了暴露于VAPs的皮肤培养物,并且C显示对照皮肤培养物。这些图表明,VAPs导致皮肤角质层分离,因此发生“分层”。该层不脱落或剥落,其仅仅彼此分离。
这种分离是由于插入角质层中的高度带电的两性蛋白质造成的,由于其两亲特性携带水分而分离皮肤层。因此通过VAPs而将水分携带到角质层中,降低了经皮水分损失(TEWL)。
实施例3:卵壳溶解素L在体内的医疗/美容应用
材料和方法
使用大西洋鲑的卵壳溶解素L进行以下研究,所述卵壳溶解素L是按照Yasumasu等1989,同上,所述,从鲑鱼孵化液制备。
如实施例2中所述制备人类皮肤上皮培养物,并且施加0.15mU/ml来自鲑鱼孵化液的卵壳溶解素L,在30℃下持续6小时。
结果
A.剥落作用
图3A和B中显示了结果,其中A显示了暴露于鲑鱼卵壳溶解素L的皮肤培养物,B显示了对照皮肤培养物。结果表明,卵壳溶解素L导致皮肤层分层和裂开。
还可以通过评定皮肤培养物的上清液,以评估在处理期间从皮肤培养物中去除的上皮细胞的量,从而分析剥落作用。由于卵壳溶解素L被1mM EDTA所抑制,可以轻易抑制其作用来证明其对皮肤的作用。
实施例4:VAPs和卵壳溶解素L在体内的医疗/美容应用
美容应用
对患有皮肤干燥和/或需要剥落的皮肤(例如硬茧或鸡眼)的个体施用如下所述的美容或安慰剂乳霜。定期重复治疗,例如每8小时。
基于定性影响,如外观和感觉(如瘙痒),分析乳霜对皮肤的作用,或者可以更加量化地分析,例如基于水分含量和厚度。
医疗应用
对患有皮肤状况或异常例如痤疮、湿疹或牛皮癣的个体施用如下所述的治疗或安慰剂乳霜。定期重复治疗,例如每8小时。
基于定性影响,如外观、感觉(如疼痛)或颜色,分析乳霜对皮肤的作用,或者可以更加量化地分析,例如残留异常的大小、发炎程度或厚度。
安慰剂乳霜:
名称 | INCI名称 | % | 相/温度(℃) |
Cetiol V | 油酸癸酯 | 4 | A/75 |
Dynacerin 660 | 芥酸油烯酯 | 6 | A/75 |
CUTINA GMS V | 硬脂酸甘油酯 | 3 | A/75 |
Cire da lanol CTO | 鲸蜡硬脂醇&Cteareth 33 | 2 | A/75 |
Nacol 16-95 | 鲸蜡醇 | 1 | A/75 |
Edenor L2SM GS | 硬脂酸&棕榈酸 | 3 | A/75 |
Nacol 18-94 | 鲸蜡醇 | 1 | A/75 |
Radia 7730 | 豆蔻酸异丙酯 | 4 | A/75 |
dH2O | 25 | B/75 | |
甘油4810 | 甘油 | 3 | B/75 |
Optiphen | 1 | B/75 | |
85%三乙醇胺 | 0.4 | B/75 | |
dH2O | 46.3 | C/75 | |
Nipa Biopure 100 | 咪唑烷基脲 | 0.3 | C/25 |
具有10%活性成分的美容/治疗乳霜:
名称 | INCI名称 | % | 相/温度(℃) |
Cetiol V | 油酸癸酯 | 4 | A/75 |
Dynacerin 660 | 芥酸油烯酯 | 6 | A/75 |
CUTINA GMS V | 硬脂酸甘油酯 | 3 | A/75 |
Cire da lanol CTO | 鲸蜡硬脂醇&Cteareth 33 | 2 | A/75 |
Nacol 16-95 | 鲸蜡醇 | 1 | A/75 |
Edenor L2SM GS | 硬脂酸&棕榈酸 | 3 | A/75 |
Nacol 18-94 | 鲸蜡醇 | 1 | A/75 |
Radia 7730 | 豆蔻酸异丙酯 | 4 | A/75 |
dH2O | 25 | B/75 | |
甘油4810 | Glyerin | 3 | B/75 |
Optiphen | 1 | B/75 | |
85%三乙醇胺 | 0.4 | B/75 | |
dH2O | 36.3 | C/75 | |
Nipa Biopure 100 | 咪唑烷基脲 | 0.3 | C/25 |
VAP和/或卵壳溶解素L | 10 | 25 |
序列:
SEQ ID No.1:卵壳溶解素L–大西洋鲑鱼
SEQ ID No.2:VAP I-大西洋鲑鱼
SEQ ID No.3:VAP II–鲑鱼
SEQ ID No.4:VAP III-鲑鱼
SEQ ID No.5:全长zr蛋白质-大西洋鲑鱼
SEQ ID No.6:全长卵壳前体蛋白H-太平洋鲑鱼
SEQ ID No.7:全长卵壳前体蛋白L-太平洋鲑鱼
SEQ ID No.8:别种zr-蛋白-大西洋鲑鱼
SEQ ID No.9:核苷酸序列,卵壳溶解素L,大西洋鲑鱼
atggaccacagacccactcttagcctgcttctgctgctgctgctgctgggcctatcacaggccagtggaaatgagttccatgatgagccggaccatgtgtccatcacttcagtaatcctgaagtccaacaacggaaccaatgagctactgctggatggagacattctagctcctagaaccaggaacgccatgaagtgctttagcagccagtacagctgtctctggaagaagtcatctgacggcttggtgtacgtgccttacatcctcagcgctgtatattccagcttggaggtagagactattgagacggccatgaagtacttccaaggcaagacctgcatccgcttcattccacgtaagacacagactgcctacctggacattcagagcagcggcgggtgttttggtaccgtggggactgttggggacaggcagacattgtctcttgcacagtttggctgtgttcaacatggtatcatccagcatgagctgcttcacgccctgggcttctaccacgagcacaacaggagtgaccgtgaacagtatatcaggatcaactggcaatacatctatgactacgccgttgggaacttccagaaggaggacaccaacaacctgcacactgcatacgactactcctctgtcatgcactatgatagaaccgcttacactaacgactacggaaaggaaaccatcactcccatcccagacccatctgtggccattggacagagactgggcatgtccgacattgatgtcctgaaggtcaacaagctctaccaatgctaagaggaagagcgccattgttgaaaatgtgtgatgctggatgtgctgtcatgtgctgatgtattttattgttggaagtttgtatgtatccttttaatcacattggtaataataaagcatggttatggtaaaaaaaaa
SEQ ID No.10:编码SEQ ID No.2VAP I的核苷酸序列
acagtgactgtccagtgtaccaaggatggccagtttgtggtggtggtttccagggatgccactctgcccaaccttgagctagattccatcagcctgctaggggcaaacggagcccactgcacccctgtcggcaccacatctgcctttgccatctaccagttcaaagttactgaatgtggaactgtggtgacggaggaacctgatactattgtctatgagaacaggatgtcctcttcatatgtagtggggattggacccttcggcgacattaccagggacagccactatgacctggtcttccagtgtcggtatactgggacttccgttgagacattggttatcgaggtgaaa
SEQ ID No.11:编码SEQ ID No.3,VAP II的核苷酸序列
gcagtgactgttcagtgtaccaaggatggccagtttgtggtggtggtggccagggatgccactctgcccagcctggaactggactccatcagcctgctggggacaaacggaccccactgccatgctattggcacaacttctgtctttgccatctaccagtttaaagtcactgaatgtggaactgtcatgacggaggaaactgatactattatctatgagaataggatgtcctcttcatatcaagtgggggttggcccctttggctccatcaccagggacagccaatatgatctaacattccagtgcagatataagggcagtaccattgtggctgtggttattgatgtgaagccggttcctcctccaaatcctgatatagctcctggacccctcacagttgagctcagactcggcagcggaacatgccttaccaagggatgtaatgaagaggaagtggcctacacctcttactacacagaggcagactaccctgtcaccaaggtcctcagggatcctgtgtacactgaggttcgcatcctggcgaggacagatcccaacattgtgctgaccctgggtcgctgctgggctaccacaaacccaaaccctctcagcctgccccagtgggaccttctcattgatggatgtccttaccaggatgaccgttacctgaccactcccatcaatgtgggaccctcttcgggtctgtccttcccaacccactacaggcgcttcgtccttaagatgttcacctttgtggatccaatgtctatgacccccctgagg
SEQ ID No.12:编码SEQ ID No.4,VAP III的核苷酸序列
gctgagtgcagggagaacatggtccacgtggaagcgaagcatgacctgctggggatcggccagttgatccagctagaagacctcactttgggagactgccctatgtctggattcgacaatatcaaccaggtgctcatctttgagtctccgctgcagtcatgtggcagccagctaaggatgactaccaactccctcatctacatcttcactctatattacaaacccaaacctctggcaaacacccccctcatcaggacaaatgacgcgatgatcaatattgagtgccactatccaaggaaacacaatgtgagcagcctggccctgatcccaacctggacccctttctccgctgctaagtatgcagaggaactcctgtacttctccatgaggctcatgactgctgactggcagtatgagagggccggtaacatgtacgtgttgggtgatatggtgaacatcgaggcctctgtcatgcagtacttccacgttcccctgcgtatctttgtggacagctgtgtggccaccctggaacccaacataaacgccaatcccagatatgccttcattgagaatcatgggtgtctgatcgatgccaaaatgacaggttcccactcccagttcatgcctcgttccgcagactacaagctgtatttccaggtggaggctttcagg
SEQ ID No.13:编码SEQ ID No.5,zr-蛋白质-大西洋鲑鱼的全长核苷酸序列
atgaagtggagtgcagtttgtctagtggcagtggccacgcttggctggctgtgtgatgctcagaatttcttggaaaaaccagggtggccacccatccagacaccaccgtcatggcctccccaaacccctcagaggcctgtccaaccccttcctcagagacctgctcaaccctttcttcagaagcctgcccaacccatacctcaacggataccctacaccgaagacgacacaaaacagacctgtgaggttgtggacaaggacaaggtgtcgtgtggactttctggcatcactgctgcccaatgccaggccatcagctgctgttttgatggacggatgtgcttctacgggaaaacagtgactgtccagtgtaccaaggatggccagtttgtggtggtggtttccagggatgccactctgcccaaccttgagctagattccatcagcctgctaggggcaaacggagcccactgcacccctgtcggcaccacatctgcctttgccatctaccagttcaaagttactgaatgtggaactgtggtgacggaggaacctgatactattgtctatgagaacaggatgtcctcttcatatgtagtggggattggacccttcggcgacattaccagggacagccactatgacctggtcttccagtgtcggtatactgggacttccgttgagacattggttatcgaggtgaaaacgtatccaaaccccaacccagtggtcactgttgatgcagttctcaacgtggagctccgactggccaatggacgttgtctctccaagggatgtgatgaaatgcaagaagcatacacctcttactacacggtggcagactaccctgtcaccaaggtcctcagggatcccgtgtacgctgaggttcgcatcctggggatgacagatcccaatgttgtcctgacactggagcagtgctgggccaccatagaccccacaggtgataggctgccccggtgggacctactagttaatgggtgtccctaccaggatgaccgttacctgaccgtgcccatcgcctcggacagctcctatatccctccgggagaattcttatcccactacaagcgcttcgtcttcaagatgttcacctttgtggatccgacatctatggtccccctgcaggagaacgtgtacatccactgtcgtgcaacagtgtgccacgctctagcaggatcctgtgaacaaaggtgcaacaggcaaaggagagatctttctgctcaaggccaaaagaagactaaaggagatgttgtggtttccagtcaaaaagtcatcatgattgacccaagtctttatgcttaa
SEQ ID No.14:编码SEQ ID No.6,卵壳前体蛋白H-太平洋鲑鱼的全长核苷酸序列
atgaagtggagtgcagtttgtctagtggcagtggccacgcttggctggctgtgtgatgctcagatttacttggaaaaaccagggtggccacccatccagacaccagcgtcatggcctgcccaaccccctgagaagcctgttcaaccccctcagaggcctgcccagccccctcagtggcctgcccagccccctcagtggcctgcccagccccctcagaggcctgcccagccccctcagaggcctgcccaaacccagcagtggcctggccaaccccctcagaggcctgcccagccccctcagtggcctgcccaaccccctcagaggcctgcccaaccccctcaaagacctgcccaaccccctcagaggcctgcccaaccccctccgaggcctgcccaaccccctcagtggcctgttcatccccctcagtggcctgtccaacccggtacgccgcttcagaggcctaaattcccctctgacccaggctcaaagcagagctgtgatgttgatagccaacacaaggtgcagtgtggacttcctgacatcactgccgcccattgtgatgccattaactgctgttttgatggacggatgtgcttctacggaaaagcagtgactgttcagtgtaccaaggatggccagtttgtggtggtggtggccagggatgccactctgcccagcctggaactggactccatcagcctgctggggacaaacggaccccactgccatgctattggcacaacttctgtctttgccatctaccagtttaaagtcactgaatgtggaactgtcatgacggaggaaactgatactattatctatgagaataggatgtcctcttcatatcaagtgggggttggcccctttggctccatcaccagggacagccaatatgatctaacattccagtgcagatataagggcagtaccattgtggctgtggttattgatgtgaagccggttcctcctccaaatcctgatatagctcctggacccctcacagttgagctcagactcggcagcggaacatgccttaccaagggatgtaatgaagaggaagtggcctacacctcttactacacagaggcagactaccctgtcaccaaggtcctcagggatcctgtgtacactgaggttcgcatcctggcgaggacagatcccaacattgtgctgaccctgggtcgctgctgggctaccacaaacccaaaccctctcagcctgccccagtgggaccttctcattgatggatgtccttaccaggatgaccgttacctgaccactcccatcaatgtgggaccctcttcgggtctgtccttcccaacccactacaggcgcttcgtccttaagatgttcacctttgtggatccaatgtctatgacccccctgagggagacggtgttcatccattgtaatacagctgtgtgtctgccatcccatggagacagctgtgaaccaagatgctacagaaagaggagagacattcctgctgcagtccagaagaccaccagaatcaagtctaatttggtttccagtggcgaactgatcctgactgacccaagggagctcaccaactag
SEQ ID No.15:编码SEQ ID No.7,卵壳前体蛋白L-太平洋鲑鱼的全长核苷酸序列
atggcgatgaagtggagtgtagtttgtctcgtggcagtggccatgcttggctgtctgtgtgttgctcagatttggccaccctccattaaaccagtgcagcaacccttcagacccaatcgtccaccacctcagcagcctcagcaaccaccgtatcagaaacccaggatcccaccaaaagaccaaacccaggccaagcagaagtttgagacaccattggattggacctatcctctggacccaaagccagagcccaagattattgggggctcagaggcgagaacccctgtggctgccaattcagtgagggctgagtgcagggagaacatggtccacgtggaagcgaagcatgacctgctggggatcggccagttgatccagctagaagacctcactttgggagactgccctatgtctggattcgacaatatcaaccaggtgctcatctttgagtctccgctgcagtcatgtggcagccagctaaggatgactaccaactccctcatctacatcttcactctatattacaaacccaaacctctggcaaacacccccctcatcaggacaaatgacgcgatgatcaatattgagtgccactatccaaggaaacacaatgtgagcagcctggccctgatcccaacctggacccctttctccgctgctaagtatgcagaggaactcctgtacttctccatgaggctcatgactgctgactggcagtatgagagggccggtaacatgtacgtgttgggtgatatggtgaacatcgaggcctctgtcatgcagtacttccacgttcccctgcgtatctttgtggacagctgtgtggccaccctggaacccaacataaacgccaatcccagatatgccttcattgagaatcatgggtgtctgatcgatgccaaaatgacaggttcccactcccagttcatgcctcgttccgcagactacaagctgtatttccaggtggaggctttcaggttccagagccagagggggagtgacccaattattccgcagaaaacaaagataccttttcagcctgcggcagattatcccgctacgctcgacatgatcttccttacctgtcacctgaaggcaaccacaatcgctttccccattgattttgagtacaaggcctgctctttcattaatacgtggagggaggctggtgggaatgatggagtgtgtggctgctgtgactccacctgtagcaacaggaagggacgcgataccactacacatcaaaaaccagcaaatatatgggagggagatgttcagcttggtcccatctttatctcggaaaaggttgagcaataa
SEQ ID No.16:编码SEQ ID No.8,替代zr-蛋白质-大西洋鲑鱼的全长核苷酸序列
gaagtggtcttaccaactccctcagaagcttgcccaaccccttcctcagaagcctgcccaacctcttcctcagtggcctgtccaaccccttcctcagaggcctgctgaaccccttcctcagaggcctgctcaaccccttcctcagtggcctgtccaaccccttcctcagaggcctgctgaaccccttcctcagaggcctgctcaaccccttcctcagaggcctgtccaaccccttcctcagagacctgctcaaccctttcttcagaagcctgcccaacccatacctcaacggataccctacaccaaagacgacacaaaacagacctgtgaggttgtggacaaggacaaggtgtcgtgtggactttctggcatcactgctgcccaatgccaggccatcagctgctgttttgatggacggatgtgcttctacgggaaaacagtgactttccagtgtaccaaggatggccagtttgtggtggtggtttccagggatgccactctgcccaaccttgagctagattccatcagcctgctaggggcaaacggagcccactgcacccctgtcggcaccacatctgcctttgccatctaccagttcaaagttactgaatgtggaactgtggtgacggaggaacctgatactattgtctatgagaacaggatgtcctcttcatatgtagtggggattggacccttcggcgacattaccagggacagccactatgacctggtcttccagtgtcggtatactgggacttccgttgagacattggttatcgaggtgaaaacgtatccaaaccccaacccagtggtcactgttgatgcagttctcaacgtggagctccgactggccaatggacgttgtctctccaagggatgtgatgaaatgcaagaagcatacacctcttactacacggtggcagactaccctgtcaccaaggtcctcagggatcccgtgtacgctgaggttcgcatcctggggatgacagatcccaatgttgtcctgacactggagcagtgctgggccaccacagaccccacaggtgataggctgccccggtgggacctactagttaatgggtgtccctaccaggatgaccgttacctgaccgtgcccatcgcctcggacagctcctatatccctccgggagaattcttatcccactacaagcgcttcgtcttcaagatgttcacctttgtggatccgacatctatggtccccctgcaggagaacgtgtacatccactgtcgtgcaacagtgtgccacgctctagcaggatcctgtgaacaaaggtgcaacaggcaaaggagagatctttctgctcaaggccaaaagaagactaaaggagatgttgtggtttccagtcaaaaagtcatcatgattgacccaagtctttatgcttaa
Claims (3)
1.用于使动物皮肤保湿或用于治疗或预防异常干燥的动物皮肤的状况或疾病的药物或美容组合物,其包含:
(i)由SEQ ID No.2所示氨基酸序列构成的酸性多肽;
(ii)由SEQ ID No.3所示氨基酸序列构成的酸性多肽;和
(iii)由SEQ ID No.4所示氨基酸序列构成的酸性多肽,
和一种或多种药用或美容用赋形剂和/或稀释剂。
2.出于非治疗目的使动物皮肤保湿的美容方法,其中向所述动物施用如权利要求1所述的组合物。
3.如权利要求1所述的组合物在制备用于使动物皮肤保湿的药物中的应用。
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