BR112012012909B1 - Composição farmacêutica ou cosmética, métodos cosméticos para esfoliar e/ou hidratar a pele de um animal e uso cosmético de um polipeptídeo - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA OU COSMÉTICA, MÉTODO COSMÉTICO OU NÃO COSMÉTICO, POLIPEPTÍDEO, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO, VETOR, MÉTODO PARA PREPARAR MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLÉICO RECOMBINANTES, MÉTODO PARA PREPARAR UM POLIPEPTÍDEO, CÉLULA CONTENDO UM POLIPEPTÍDEO, MÉTODO PARA ISOLAR UM OU MAIS POLIPPTÍDEOS, E, PROTEÍNA MUITO ÁCIDO (VAP). A presente invenção diz respeito a vários polipeptídeos de fluido de incubação de peixe, suas sequências de ácido nucleico codificadoras, composições farmacêuticas que compreendem os ditos polipeptídeos e moléculas de ácido nucleico e seu uso em várias aplicações medicinais e cosméticas à pele, particularmente para hidratar a pele e/ou para a exfoliação da camada áspera de pele para tratar ou prevenir distúrbios ou condições de pele em um animal.

Description

[001] A presente invenção diz respeito ao uso de coriolisina e proteínas muito ácidas (VAPs) deriváveis de fluido de incubação de peixe, sozinho ou em combinação em várias aplicações cosméticas e médicas à pele. A presente invenção também diz respeito às proteínas muito ácidas que são descritas para estes usos.

[002] A pele é um dos órgãos mais vulneráveis do corpo. Embora quase nunca seja letal, distúrbios ou condições de pele podem ser desconfortáveis e podem causar incapacidades crônicas. Além disso, porque a pele é muito visível, os distúrbios e condições de pele podem levar ao estresse psicológico. Existe, portanto uma necessidade contínua para tratamentos eficazes de condições e distúrbios de pele.

[003] A pele forma o maior órgão do corpo, sendo responsável por cerca de 12 a 16 por cento de um peso da pessoa. A mesma realiza muitos papéis vitais tanto como uma barreira quanto uma influência reguladora entre o mundo externo e o ambiente controlado dentro de nossos corpos.

[004] A pele consiste de 3 camadas, a saber a epiderme, derme e subcutis. A epiderme é a camada epitelial mais externa, da pele. O mesmo atua como uma barreira física, prevenindo a perda de água do corpo, e prevenir a entrada de substâncias e organismos no corpo. A sua espessura varia de acordo com o local do corpo.

[005] A epiderme consiste de epitélio escamoso estratificado, isto é, a mesma consiste de camadas de células achatadas. Pele, cabelo e unhas são queratinizados, significando que eles têm uma superfície morta, endurecida hidrofóbica fabricada de uma proteína chamada queratina. A epiderme é feita impermeável devido ao seu conteúdo de lipídeos extracelulares associados com queratinócitos, especialmente na camada intermediária da epiderme (stratum lucidum). Membranas mucósicas (por exemplo, do esôfago, cavidade faríngea oral, órgãos reprodutivos, e outros) são principalmente não queratinizados e úmidos. A epiderme tem três tipos principais de célula, a saber queratinócitos (células da pele), melanócitos (células que produzem pigmento) e células de Langerhans (células imune). A célula de Merkel é uma quarta célula epidérmica, menos prevalecente.

[006] Os queratinócitos maduros e diferenciados com acúmulo de queratina conforme eles se movem para fora. Eles eventualmente caem ou são removidos por esfregação. Eles formam quatro ou cinco estratos distintos, que do mais superficial até o mais profundo são (i) o Stratum corneum (camada córnea) com células mortas, secas duras sem núcleos, (ii) o Stratum granulosum (camada granular) com as células contendo grânulos basofílicos e externamente separada do Stratum corneum por este stratum lucidum fino, (iii) o Stratum spinulosum (camada de célula espinhosa, pontuda ou acúlea) em que as células se tornam crescentemente achatadas conforme elas se movem para cima e (iv) o Stratum basale (camada basal) com células regenerativas colunares (altas).

[007] Imediatamente abaixo da epiderme está a membrana de base, uma estrutura especializada que reside entre a epiderme e a derme.

[008] A derme é o tecido conectivo fibroso ou camada de sustentação da pele. As fibras maiores são fibras de colágeno e elastina que são entrelaçadas.

[009] A subcutis é a camada de gordura imediatamente abaixo da derme e epiderme. A mesma também é chamada de tecido subcutâneo, hipoderme ou panículo. A subcutis principalmente consiste de células gordurosas (adipócitos), nervos e vasos sanguíneos.

[0010] As novas células epiteliais da pele são criadas na camada inferior da pele, o stratum granulosum. Com o tempo, as células migram para a superfície da pele e tornam-se mais ácidas. Durante a sua jornada de 30 dias, elas morrem e tornam-se saturadas com queratina. A queratina e lipídeos associados são importantes porque eles protegem a pele de elementos externos.

[0011] Doença, lesão, fatores ambientais, idade, níveis hormonais, medicação, materiais externamente aplicados ou ingeridos, condições genéticas ou uma variedade de outros fatores podem levar ao funcionamento anormal da pele resultando em irregularidades ou anormalidades. Algumas destas irregularidades ou anormalidades podem ser puramente cosméticas por natureza, por exemplo pele seca, rugas ou pigmentação alterada, ou podem ser mais severas levando à dor ou desconforto, por exemplo eczema e psoríase.

[0012] A pele seca é uma das condições ou anormalidades de pele mais comuns. Embora certos indivíduos sejam mais suscetíveis à pele seca, a condição pode afetar qualquer um, independente da idade, gênero, ou tipo de pele.

[0013] A pele seca ocorre quando a camada externa da pele (o Stratum corneum com o stratum lucidum) é esgotado de água. Quando esta camada está bem umedecida, a mesma minimiza a perda de água através da pele e ajuda a manter longe os irritantes, alérgenos, e germes. Entretanto, quando o Stratum corneum seca, a sua função protetiva é reduzida. Isto permite maior perda de água, deixando a pele vulnerável aos fatores ambientais.

[0014] Sob as condições normais, o Stratum corneum tem um teor de água de 10 % a 30 %. Esta água comunica à pele a sua maciez, lisura, e textura flexível. A água vem da atmosfera, das camadas subjacentes de pele, e suor. O óleo produzido pelas glândulas da pele e substâncias graxas produzidas pelas células da pele atuam como hidratadores naturais, deixando o Stratum corneum encerrado em água.

[0015] O corpo continuamente perde água da superfície da pele pela evaporação. Sob condições normais, a taxa de perda é baixa, e a água é adequadamente substituída. Sinais e sintomas característicos de pele seca ocorrem quando a perda de água excede a substituição da água, e o teor de água do Stratum corneum cai abaixo de 10 %.

[0016] Hidratadores que melhoram ou erradicam a pele seca são altamente desejáveis. Embora muitos hidratadores sejam conhecidos na técnica, permanece uma necessidade quanto a produtos naturais que sejam eficazes contudo suaves.

[0017] Uma outra anormalidade ou condição de pele comum são quantidades excessivas da camada córnea da pele. Isto pode resultar da insuficiência da camada córnea para ser esfoliada ou através da deposição de queratina excessiva na camada córnea. A primeira pode resultar quando o processo natural de erosão da pele torna-se irregular, que dá à pele um caráter seco e áspero. Os distúrbios hiperproliferativo benignos incluem hiperqueratose epidermolítica (ou pele rachada) e queratose do folículo capilar. Uma condição hiperproliferativa benigna comum é a hipertrofia periférica em torno de cicatrizes e/ou formação de quelóides. Outras condições hiperproliferativas são calosidades, calos, verrugas hiperqueratóticas (particularmente verruga vulgar), ictioses e queratoses palmoplantares.

[0018] Os tratamentos correntes envolvem a exfoliação ou cirurgia em casos extremos. A hiperqueratose é usualmente tratada pelo amolecimento da camada córnea e remoção da pele espessada.

[0019] A exfoliação também pode ser usada para remover células epidérmicas prejudicadas, por exemplo células epidérmica de uma epiderme que exibe um distúrbio de pigmentação, por exemplo manchas senis.

[0020] A exfoliação remove o extrato externo da epiderme para revelar as células de pele mais novas por debaixo. A exfoliação pode ser obtida por meios físicos (isto é abrasão da pele) ou por meios químicos. Os exfoliantes químicos incluem agentes de abrasão contendo ácido salicílico, ácido glicólico, enzimas de fruta, ácido cítrico ou ácido málico e podem ser aplicados em altas concentrações por um dermatologista, ou em concentrações mais baixas em produtos de venda livre. A exfoliação química pode envolver o uso de produtos que contêm ácidos alfa hidróxi (AHAs) ou ácidos beta hidróxi (BHAs), ou enzimas que atuam para soltar as substâncias como cola que mantêm as células juntas nas junções de célula, permitindo que as mesmas relaxem. Este tipo de exfoliação é recomendada para pessoas que tratam da acne.

[0021] A maior desvantagem da exfoliação é o alto preço de alguns dos produtos e métodos usados para obtê-la. A exfoliação levará a alguma vermelhidão inicial da pele. Próximo ao final dos descascamentos químicos, a pele congelar-se-á, com cores variando de um branco brilhante ao cinza na superfície da pele. Métodos mais eficazes que sejam mais suaves para a pele são portanto desejáveis.

[0022] Permanece assim uma necessidade quanto a tratamentos adequados para hidratar a pele e/ou para a exfoliação da camada córnea da pele.

[0023] Certas moléculas que são encontradas no fluido de incubação de peixe foi agora surpreendentemente descoberto ser dos hidratantes e exfoliantes o mais eficaz, a saber a coriolisina e um grupo recém identificado de proteínas muito ácidas (VAPs).

[0024] A incubação de embriões de peixe é obtida, pelo menos em parte, pelas chamadas enzimas de incubação, as coriolisinas. A coriolisina é uma metaloproteinase encontrada no fluido de incubação de peixe e é no geral encontrada em duas formas, a saber a enzima coriolítica alta (coriolisina H, HCE) e a enzima coriolítica baixa (coriolisina L, LCE), que são similares em algumas características estruturais e catalíticas e pertencem à família da astacina mas com preferências de substrato acentuadamente diferentes.

[0025] No salmão a LCE é relativamente incomum comparada com as coriolisinas conhecidas de outras espécies de peixe e pode ser aplicada para os propósitos que são descritos a seguir. A sequência da LCE de salmão é apresentada na SEQ ID NO. 1, abaixo.

[0026] Como mencionado acima, um grupo de proteínas muito ácidas (VAPs) foram agora identificadas no fluido de incubação de peixe pela precipitação de outros componentes em 80 % de acetona e remoção da acetona pela evaporação da pelota centrifugada como descrito nos Exemplos.

[0027] Estas VAPs são geradas pela clivagem proteolítica da casca do ovo polimerizada e reticulada ou córion pelas enzimas da incubação durante a incubação e são fragmentos de componentes incorporados no córion durante a ovogênese, tais como a coriogenina H e L como descritas abaixo em mais detalhes. Estes fragmentos de proteínas coriogênicas, que aqui são chamadas VAPs, são liberados no fluido perivitelino durante a incubação para se tornar componentes do fluido de incubação. As VAPs aparecem em várias formas. Quando analisadas pela focalização isoelétrica (ver os Exemplos), VAPs I, II e III (como debatidos abaixo) aparecem em pelo menos 2, 6 e 3 isoformas, respectivamente.

[0028] Nós divulgamos aqui três VAPs que foram identificadas e que têm propriedades surpreendentes como descrito a seguir. As sequências destas VAPs foram determinadas pela espectroscopia de massa como descrito nos Exemplos e são apresentados nas SEQ ID NOS. 2 a 4.

[0029] As VAPs I, II e III como aqui aludidas têm as sequências como apresentadas nas SEQ ID NOS. 2, 3 e 4, respectivamente.

[0030] A VAP I tem 117 aminoácidos no tamanho e tem um peso molecular em torno de 15,5 kDa e pI em torno de 3,5. Esta VAP é um fragmento de uma proteína da casca do ovo de 439 aminoácidos, 57 kDa (também aludido como proteína da zona radiata, SEQ ID NO. 5). A VAP I alternativamente pode ser derivada de uma proteína da zona radiata homóloga que compreende 467 resíduos de aminoácido (SEQ ID NO: 8).

[0031] A VAP II tem 261 aminoácidos no tamanho e tem um peso molecular em torno de 35 kDa e pI em torno de 4,0. Esta VAP tem um fragmento de uma proteína de 524 aminoácidos, 68 kDa da coriogenina H beta (SEQ ID No. 6).

[0032] A VAP III tem 224 aminoácidos no tamanho e tem um peso molecular em torno de 29 kDa e pI em torno de 5,2. Esta VAP é um fragmento de uma proteína de 438 aminoácidos, 57 kDa de coriogenina L (SEQ ID No. 7).

[0033] Como mostrado nos Exemplos e debatidos acima, cada VAP pode existir em várias isoformas.

[0034] Assim, em um primeiro aspecto a presente invenção fornece um polipeptídeo que consiste de: (i) uma sequência de aminoácido como apresentada em qualquer uma das SEQ ID Nos. 2 a 4 ou uma sequência que é pelo menos 50 % idêntica à dita sequência, ou uma porção de qualquer uma das ditas sequências; e opcionalmente (ii) uma sequência de aminoácido flanqueadora no terminal N e/ou C da sequência de aminoácido em (i) que é de 1 a 100 aminoácidos no comprimento.

[0035] Os “polipeptídeos” como aqui aludidos são moléculas preferivelmente com mais do que 50, 100, 150, 200 ou 250 resíduos e/ou menos do que 400, 300, 200 ou 100 resíduos ou uma faixa selecionada dos mesmos. Como aqui aludido uma “porção” preferivelmente compreende pelo menos 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200 ou mais aminoácidos da sequência a partir da qual a mesma é derivada. A dita porção pode ser obtida de uma porção central ou do terminal N ou terminal C da sequência. Em um aspecto preferido a dita porção consiste da sequência de tamanho natural a partir da qual a mesma é derivada da qual pelo menos 1, 2, 3, 4 ou 5 resíduos de aminoácido foram removidos, preferivelmente do terminal N.

[0036] Como aqui aludido uma “sequência flanqueadora” é uma sequência de aminoácido que é ligada à extremidade do terminal N ou C da sequência de aminoácido central via ligações peptídicas normais para formar uma sequência de aminoácido contínua (exceto como modificado em equivalentes funcionais como debatidos abaixo). Uma sequência flanqueadora pode estar presente na extremidade de terminal N ou C da sequência de aminoácido central ou pode estar presente em ambas as extremidades. A sequência flanqueadora pode ser tão curta quanto 1 aminoácido ou tão longa quanto 100 aminoácidos, preferivelmente de 1 a 50 (ou de 5 a 100 ou 10 a 50), por exemplo de 1 a 25, por exemplo 1 a 5 aminoácidos no comprimento. Quando as sequências flanqueadoras estão presentes em ambas as extremidades de terminal N e C elas podem ser da mesma ou de sequências diferentes e podem ser do mesmo ou de comprimentos diferentes. As sequências flanqueadoras podem ser derivadas da sequência nativa da qual a VAP em questão é um fragmento ou pode ter menos do que 80, 70, 60 ou 50 % de identidade com a sequência nativa na porção comparável (ver por exemplo as sequências nativas em relação às SEQ ID Nos. 2 a 4 fornecidas nas SEQ ID Nos. 5 a 7, respectivamente e SEQ ID No: 8, que fornece uma sequência nativa alternativa para a SEQ ID No. 2).

[0037] Preferivelmente a dita sequência na parte (i) acima é pelo menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99 % idêntica à sequência (SEQ ID Nos 2 a 8) com a qual a mesma é comparada.

[0038] A identidade de sequência pode ser determinada, por exemplo pelo uso do banco de dados da sequência de proteína SWISS-PROT usando FASTA pep-cmp com um pamfactor variável, e ajuste da penalidade de criação de intervalo em 12,0 e ajuste da penalidade de extensão de intervalo em 4,0, e uma janela de 2 aminoácidos. Preferivelmente a dita comparação é feita no tamanho natural da sequência, mas pode ser feito em uma janela menor de comparação, por exemplo menos do que 200, 100 ou 50 aminoácidos contíguos.

[0039] Preferivelmente tais polipeptídeos relacionados com a identidade de sequência são funcionalmente equivalentes aos polipeptídeos que são apresentadas nas SEQ ID Nos citadas. Tais polipeptídeos funcionalmente equivalentes podem tomar a forma de derivados como apresentados abaixo. Similarmente, os polipeptídeos com sequências como apresentadas nas SEQ ID Nos. podem ser modificados sem afetar a sequência do polipeptídeo como descrito abaixo.

[0040] Além disso, as “porções” como aqui descritas podem ser funcionalmente equivalentes. Preferivelmente estas porções satisfazem as condições de identidade (relativa a uma região comparável) aqui mencionadas. Os polipeptídeos preferidos da invenção incluindo porções e polipeptídeos que incluem as sequências flanqueadoras descritas acima são preferivelmente ácidas, por exemplo têm um pI de 3 a 5,5, preferivelmente de 3,5 a 5,2.

[0041] Como aqui aludido, para se obter “equivalência funcional” o polipeptídeo pode apresentar alguma eficácia reduzida na realização da função médica ou cosmética em relação à molécula precursora (isto é a molécula a partir da qual a mesma foi derivada, por exemplo pela substituição de aminoácido), mas preferivelmente é tão eficiente ou é mais eficiente. Assim, a equivalência funcional diz respeito a um polipeptídeo que é eficaz para tratar uma condição ou distúrbio ou para melhorar cosmeticamente a condição e/ou aparência da pele como aqui aludidas, isto é para reduzir um ou mais sintomas do paciente, por exemplo a aparência, textura, espessura ou teor de umidade da pele como descrito a seguir. Isto pode ser testado pela comparação dos efeitos do polipeptídeo derivado em relação ao polipeptídeo do qual o mesmo é derivado em uma maneira qualitativa ou quantitativa, por exemplo pela realização das análises aludidas nos Exemplos. Onde resultados quantitativos são possíveis, o derivado é de pelo menos 30, 50, 70 ou 90 % tão eficazes quanto o polipeptídeo precursor.

[0042] As proteínas funcionalmente equivalentes que são relacionadas com ou derivadas da proteína que ocorre naturalmente, podem ser obtidas pela modificação da sequência de aminoácido nativa pelas substituições, adições e/ou deleções de aminoácido únicas ou múltiplas (por exemplo de 2 a 20, preferivelmente de 2 a 10) (contanto que elas satisfaçam as exigências de identidade de sequência mencionadas acima), mas sem destruir a função da molécula. Tais proteínas são codificadas pelas “moléculas de ácido nucleico funcionalmente equivalentes” que são geradas pela substituição, adição e/ou deleção apropriadas de uma ou mais bases.

[0043] Os equivalentes funcionais preferidos são variantes de “adição” em que as proteínas de fusão ou polipeptídeos de terminal amino e/ou carbóxi são geradas, que compreendem uma proteína ou polipeptídeo adicionais fundidos ao polipeptídeo precursor. Como descrito acima, quaisquer sequências que quando adicionadas ao polipeptídeo central formam uma sequência de aminoácido contígua são limitadas pelas sequências flanqueadoras como descrito acima.

[0044] Outros equivalentes funcionais preferidos são variantes de “deleção” ou “truncagem” em que as proteínas ou polipeptídeos são gerados em que os resíduos de terminal amino e/ou carbóxi foram removidos do polipeptídeo central. Em uma forma de realização particularmente preferida, os resíduos são removidos do terminal amino, em que pelo menos 1, 2, 3, 4 ou 5 resíduos de aminoácido são removidos. Tais equivalentes funcionais são porções como descrito mais acima.

[0045] As variantes funcionalmente equivalente particularmente preferidas são variações biológicas naturais (por exemplo variantes alélicas ou variações geográficas dentro de uma espécie ou alternativamente em gêneros diferentes, por exemplo plantas, animais ou bactérias, particularmente peixe, particularmente da família Salmonidae, especialmente as sub-famílias Salmo e Oncorhynchus) e derivados preparados usando técnicas conhecidas. Por exemplo, moléculas de ácido nucleico que codificam proteínas funcionalmente equivalentes podem ser produzidas pela síntese química ou na forma recombinante usando as técnicas conhecidas de mutagênese loco dirigida incluindo deleção, mutagênese aleatória, ou clivagem enzimática e/ou ligação de ácidos nucleicos.

[0046] A presente invenção também fornece uma molécula de ácido nucleico que consiste de uma sequência de nucleotídeo que codifica apenas o dito polipeptídeo ou uma sequência complementar desta.

[0047] Em um aspecto preferido, a presente invenção fornece assim uma molécula de ácido nucleico que consiste de: (i) uma sequência de nucleotídeo como apresentada em qualquer uma das SEQ ID Nos. 10 a 12, uma sequência que é pelo menos 50 % idêntica à dita sequência, ou uma sequência que hibridiza à dita sequência sob condições de ligação não severas de 6 x SSC/50 % de formamida na temperatura ambiente e lavando sob condições de alta severidade, por exemplo 2 x SSC, 65° C, onde SSC = 0,15 M de NaCl, 0,015 M de citrato de sódio, pH 7,2, ou uma sequência complementar a qualquer uma das sequências anteriormente mencionadas, ou uma porção deste; e opcionalmente (ii) uma sequência de nucleotídeo flanqueadora na extremidade 5’ ou 3’ da sequência de nucleotídeo em (i) que é de 1 a 300 nucleotídeos no comprimento, ou uma sequência complementar desta.

[0048] Preferivelmente a dita molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo como apresentada acima.

[0049] As “moléculas de ácido nucleico” como aqui aludidas são moléculas preferivelmente com mais do que 150, 300, 450, 600 ou 750 bases e/ou menos do que 1200, 900, 600 ou 300 bases ou uma faixa selecionada da mesma. As “porções” como aludidas acima, preferivelmente compreendem pelo menos 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300, 450 ou 600 bases de nucleotídeo da sequência a partir da qual a mesma é derivada. Preferivelmente as ditas porções codificam os peptídeos de terminal N, central ou de terminal C como descritos mais acima. Em um aspecto preferido a dita porção consiste da sequência de tamanho natural a partir da qual a mesma é derivada da qual pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 bases foram removidas, preferivelmente da extremidade 5’.

[0050] Como aqui aludida uma “sequência flanqueadora” é uma sequência de nucleotídeo que é ligada aos terminais 5’ ou 3’ da sequência de nucleotídeo central via ligações de fosfodiéster normais para formar uma sequência de nucleotídeo contínua (exceto como modificado em equivalentes funcionais como debatidos a seguir). Uma sequência flanqueadora pode estar presente na extremidade de terminal 5’ ou 3’ da sequência de nucleotídeo central ou pode estar presente em ambas as extremidades. A sequência flanqueadora pode ser tão curta quanto 1 nucleotídeo ou tão longa quanto 300 nucleotídeos, preferivelmente de 1 a 150 (ou de 15 a 300 ou de 30 a 150), por exemplo de 1 a 75, por exemplo de 1 a 15 nucleotídeos no comprimento. Quando as sequências flanqueadoras estão presentes em ambas as extremidades de terminal 5’ e 3’ elas podem ser da mesma ou de sequências diferentes e podem ser do mesmo ou de comprimentos diferentes. As sequências flanqueadoras podem ser derivadas da sequência nativa da qual a sequência que codifica VAP em questão é um fragmento ou pode ter menos do que 80, 70, 60 ou 50 % de identidade com a sequência codificadora nativa na porção comparável (ver por exemplo sequências nativas em relação às SEQ ID Nos. 10 a 12 fornecidas nas SEQ ID Nos 13 a 15, respectivamente e SEQ ID No: 16, que fornece uma sequência nativa alternativa para a SEQ ID No. 10).

[0051] Preferivelmente a dita sequência na parte (i) acima é pelo menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99 % idêntica à sequência (SEQ ID Nos 10 a 16) com a qual a mesma é comparada.

[0052] A identidade de sequência pode ser determinada, por exemplo pela Pesquisa FASTA usando pacotes GCG, com valores de default e um pamfactor variável, e ajuste de penalidade de criação de intervalo em 12,0 e ajuste de penalidade de extensão de intervalo em 4,0 com uma janela de 6 nucleotídeos.

[0053] Preferivelmente tal identidade de sequência relacionada ou moléculas de ácido nucleico hibridizadoras são funcionalmente equivalentes às moléculas de ácido nucleico que são apresentadas nas SEQ ID Nos citadas. Tais moléculas de ácido nucleico funcionalmente equivalentes podem tomar a forma de derivados como apresentados abaixo e são consideradas equivalentes funcionais se elas codificam polipeptídeos que seriam considerados funcionalmente equivalentes de acordo com os testes descritos mais acima. Os equivalentes funcionais preferidos são aqueles que codificam os polipeptídeos preferidos como apresentados acima, por exemplo moléculas de ácido nucleico que codificam polipeptídeos encontrados em gêneros ou espécies diferentes que não as moléculas específicas aqui mencionadas.

[0054] Além disso, “porções” como aqui descritas podem ser funcionalmente equivalentes. Preferivelmente estas porções satisfazem a identidade (relativa a uma região comparável) ou condições de hibridização aqui mencionadas. Preferivelmente as moléculas de ácido nucleico da invenção, incluindo porções e sequências de nucleotídeo incluindo as sequências flanqueadoras descritas acima, preferivelmente codificam polipeptídeos ácidos como descrito mais acima.

[0055] As moléculas de ácido nucleico de acordo com a invenção e para o uso de acordo com a invenção podem ser DNA, cDNA ou RNA de filamento único ou duplo, preferivelmente DNA e incluem sequências degeneradas, substancialmente idênticas e de hibridização como descritas acima. Idealmente entretanto as moléculas são DNA ou cDNA.

[0056] Os polipeptídeos da invenção, ou para o uso de acordo com a invenção, incluem aqueles que são modificados sem afetar a sequência do polipeptídeo, por exemplo pela modificação química, incluindo pela desglicosilação ou glicosilação. Tais polipeptídeos podem ser preparados pela modificação pós-síntese/isolação do polipeptídeo sem afetar a funcionalidade, por exemplo certa glicosilação, metilação etc. de resíduos particulares.

[0057] Os polipeptídeos da invenção, ou para o uso de acordo com a invenção, também podem tomar a forma de peptidomiméticos que podem ser considerados derivados em que as características funcionais do polipeptídeo são retidos nas são apresentados no contexto de uma estrutura diferente, por exemplo não peptídeo. Tais peptidomiméticos foram desenvolvidos com êxito e particularmente usados para outras aplicações médicas.

[0058] Peptidomiméticos, particularmente moléculas não peptídicas podem ser geradas através de vários processos, incluindo planejamento de medicamento com base conformacional, triagem, planejamento de biblioteca focalizada e química medicinal clássica. Não apenas os oligômeros de aminoácidos não naturais ou outros blocos de construção orgânicos podem ser usados, mas também carboidratos, compostos heterocíclico ou macrocíclico ou qualquer molécula orgânica que compreende elementos estruturais e conformacionais que fornecem uma superfície eletrostática molecular que imita as mesmas propriedades da conformação 3-dimensional do peptídeo pode ser usada pelos métodos conhecidos na técnica.

[0059] Assim os peptidomiméticos podem carregar pouca ou nenhuma semelhança com uma cadeia principal de peptídeo. Os peptidomiméticos podem compreender uma forma não peptídica totalmente sintética (por exemplo com base em uma cadeia principal de carboidrato com substituintes apropriados) ou podem reter um ou mais elementos do peptídeo no qual o mesmo está fundamentado, por exemplo pela derivatização de um ou mais aminoácidos ou substituição de um ou mais aminoácidos com componentes não peptídicos alternativos. Os padrões como peptídeo incluem pseudopeptídeos e peptídeos cíclicos. Os elementos estruturais considerados redundantes para a função do peptídeo podem ser minimizados para reter apenas uma função de armação ou removida onde apropriado.

[0060] Quando peptidomiméticos retêm um ou mais elementos peptídicos, isto é mais do que um aminoácido, tais aminoácidos podem ser substituídos com um de seus análogos não padrão ou estruturais. Os aminoácidos retidos nas sequências também podem ser derivatizados ou modificados (por exemplo rotulados, glicosilados ou metilados) contanto que as propriedades funcionais dos polipeptídeos da invenção, ou para o uso de acordo com a invenção, sejam retidos. Os peptidomiméticos são aludidos como sendo “deriváveis de” uma certa sequência de polipeptídeo. Por isto é intencionado que o peptidomimético seja designado com referência a uma sequência de polipeptídeo definida, tal que a mesma retenha as características estruturais do peptídeo que são essenciais para a sua função. Isto pode ser as cadeias laterais particulares do polipeptídeo, ou potencial de ligação de hidrogênio da estrutura. Tais características podem ser fornecidas pelos componentes não peptídicos ou um ou mais dos resíduos de aminoácido ou das ligações que ligam os ditos resíduos de aminoácido do polipeptídeo podem ser modificados de modo a melhorar certas funções do polipeptídeo tais como estabilidade ou resistência à protease, enquanto retêm as características estruturais do polipeptídeo que são essenciais para a sua função.Os exemplos de aminoácidos análogos não padronizados ou estruturais que podem ser usados são D aminoácidos, isósteros de amida (tais como N-metil amida, amida retro-inversa, tioamida, tioéster, fosfonato, cetometileno, hidroximetileno, fluorovinila, (E)-vinila, metilenoamino, metilenotio ou alcano), L-N metilaminoácidos, D-α metilaminoácidos, D-N-metilaminoácidos. Os exemplos de aminoácidos não convencionais estão listados na Tabela 1.

[0061] Os aminoácidos não padrão que podem ser usados incluem análogos conformacionalmente restringido, por exemplo tais como Tlc (para substituir F), Alb (substitui A) ou ácido pipecólico (substitui Pro).

[0062] Os polipeptídeos e moléculas de ácido nucleico debatidos acima também incluem derivados que foram modificados, por exemplo para facilitar o seu uso em aplicações farmacêuticas (debatidos abaixo), por exemplo pela adição de grupos de alvejamento ou grupos funcionais, por exemplo para melhorar a lipofilicidade, ajudar no transporte de célula, solubilidade e/ou estabilidade. Assim os oligossacarídeos, ácidos graxos, alcoóis graxos, aminoácidos, peptídeos ou polipeptídeos podem ser conjugados aos polipeptídeos ou moléculas de ácido nucleico anteriormente mencionados. As moléculas de ácido nucleico podem estar presentes em um carregador viral como descrito a seguir.

[0063] Os polipeptídeos também abrangem derivados na forma de “pró-medicamentos” ou “pró-peptídeos” tal que o componente adicionado podem ser removidos pela clivagem uma vez administrados, por exemplo pela clivagem de um substituinte adicionado através da esterificação que pode ser removido pela ação de esterases. Tais pró-medicamentos incluir precursores nativos das proteínas que ocorrem naturalmente que são clivados por exemplo pela proteólise para produzir o polipeptídeo de interesse. Tais precursores podem ser inativos na forma precursora mas pode ser ativada pela clivagem proteolítica. Entretanto, quaisquer sequências que quando adicionadas ao polipeptídeo central formam uma sequência de aminoácido contígua são limitadas às sequências flanqueadoras como descrito acima. Alternativamente elas podem ter sequências flanqueadoras mais longas contanto que elas não se estendam para as moléculas que são a sequência nativa a partir da qual o fragmento VAP é derivado (por exemplo SEQ ID Nos. 5 a 8 em relação às sequências de aminoácido e SEQ ID Nos. 13 a 16 para as sequências de nucleotídeo) ou uma sequência com pelo menos 50, 60, 70, 80 ou 90 % de identidade de sequência com aquela sequência na porção comparável.

[0064] As moléculas de ácido nucleico da invenção, ou para o uso de acordo com a invenção, assim similarmente abrangem moléculas que codificam tais pró-medicamentos ou precursores. Entretanto, quaisquer sequências que quando adicionadas ao polinucleotídeo central formam uma sequência de nucleotídeo contígua são limitadas às sequências flanqueadoras como descritas acima. Alternativamente, elas podem ser sequências flanqueadoras mais longa contanto que não se estendam às moléculas que são a sequência nativa a partir das quais o fragmento VAP é derivado ou uma sequência com pelo menos 50, 60, 70, 80 ou 90 % de identidade de sequência com aquela sequência na porção comparável.

[0065] Os polipeptídeos modificados ou moléculas de ácido nucleico como descritas acima podem ser testados para garantir que elas retenham a atividade funcional relativa à molécula não modificada pela determinação se elas têm os mesmos efeitos medicinais ou cosméticos ou similares.

[0066] As moléculas de ácido nucleico descritas acima podem ser operativamente ligadas a uma sequência de controle de expressão, ou um veículo ou vetor de clonagem de DNA recombinante contendo uma tal molécula de DNA recombinante. Isto permite a expressão intracelular do polipeptídeo da invenção, ou para o uso de acordo com a invenção, como um produto de gene, a expressão do qual é direcionada pelo(s) gene(s) introduzido(s) nas células de interesse. A expressão de gene é direcionada a partir de um promotor ativo nas células de interesse e pode ser inserido em qualquer forma de vetor de DNA linear ou circular para a incorporação no genoma ou para a replicação independente ou transfecção/expressão transitórias. As técnicas de transformação ou transfecção adequadas são bem descritas na literatura. Alternativamente, a molécula de DNA nua pode ser introduzida diretamente dentro da célula para os usos aqui descritos.

[0067] Os vetores de expressão apropriados incluem sequências de controle apropriadas tais como por exemplo elementos de controle translacional (por exemplo códons de partida e parada, sítios de ligação de ribossoma) e elementos de controle transcricional (por exemplo regiões de promotor-operador, sequências de parada de terminação) ligadas na matriz de leitura emparelhada com as moléculas de ácido nucleico requeridas para o desempenho do método da invenção como descrito a seguir. Os vetores apropriados podem incluir plasmídeos e vírus (incluindo vírus tanto de bacteriófago e eucariótico). Os vetores virais adequados incluem baculovírus e também adenovírus, vírus associado a adeno, vírus do herpes e varíola. Muitos outros vetores virais são descritos na técnica. Os vetores preferidos incluem vetores de expressão bacteriano e de mamífero pGEX-KG, pEF-neo e pEF-HA. A molécula de ácido nucleico pode ser convenientemente fundido com DNA que codifica um polipeptídeo adicional, por exemplo glutationa-S- transferase, para produzir uma proteína de fusão na expressão.

[0068] Assim observado de um outro aspecto, a presente invenção fornece um vetor, preferivelmente um vetor de expressão, que compreende uma molécula de ácido nucleico como definido acima.

[0069] Outros aspectos da invenção incluem métodos para preparar moléculas de ácido nucleico recombinantes de acordo com a invenção, que compreendem inserir as sequências de nucleotídeo da invenção que codificam os polipeptídeos da invenção dentro de ácido nucleico vetorial.

[0070] Nos métodos como descritos a seguir, os polipeptídeos podem ser administrados a uma célula pela transfecção de uma célula com uma molécula de ácido nucleico da invenção, ou para o uso de acordo com a invenção. Como mencionado acima, a presente invenção estende-se assim às moléculas de ácido nucleico que consistem de, ou que compreendem, uma sequência que codifica os polipeptídeos da invenção como aqui descrito e seu uso nos métodos aqui descritos. Preferivelmente as ditas moléculas de ácido nucleico estão contidas em um vetor, por exemplo um vetor de expressão.

[0071] As moléculas de ácido nucleico da invenção, ou para o uso de acordo com a invenção, preferivelmente contidas em um vetor, podem ser introduzidas dentro de uma célula por qualquer um dos meios apropriados. As técnicas de transformação ou transfecção adequadas são bem descritas na literatura. Uma variedade de técnicas são conhecidas e podem ser usadas para introduzir tais vetores em células procarióticas ou eucarióticas para a expressão. As células hospedeiras preferidas para este propósito incluem linhagens de célula de inseto, as linhagens de célula eucariótica ou E. coli, tais como cepa BL21/DE3. A invenção também se estende às células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas transformadas ou transfectadas contendo uma molécula de ácido nucleico, particularmente um vetor como definido acima.

[0072] Um outro aspecto da invenção fornece um método de preparar um polipeptídeo da invenção como mais acima definido, que compreende cultivar uma célula hospedeira contendo uma molécula de ácido nucleico como definida acima, sob condições por meio das quais o dito polipeptídeo é expressado e recuperar a dita molécula assim produzida. As formas de polipeptídeo expressadas são um outro aspecto da invenção.

[0073] A invenção também se estende a um polipeptídeo codificado por uma molécula de ácido nucleico como mais acima descrita. Isto pode ser produzido pela expressão de uma célula hospedeira como descrito acima.

[0074] As células que produzem e secretam polipeptídeos da invenção, mas que foram modificadas em relação às células nativas pela expressão de material de ácido nucleico codificador, formam outros aspectos da invenção.

[0075] Os polipeptídeos ou moléculas de ácido nucleico usados nas composições e usos da invenção como descrito abaixo podem ser obtidos ou derivados de fontes que ocorrem naturalmente ou podem ser geradas total ou parcialmente de modo sintético.

[0076] Convenientemente os polipeptídeos e moléculas de ácido nucleico são isoladas de acordo com os protocolos descritos nos Exemplos e abaixo ou como descritos em Yasumasu et al., 1989, J. Biochem., 105, p212218 em relação à coriolisina, que é por meio deste incorporada por referência, particularmente em relação à metodologia de isolação. Tais métodos e os produtos de tais métodos conforme eles dizem respeito às VAPs aqui descritas formam outros aspectos da invenção.

[0077] Assim em um outro aspecto a presente invenção fornece um método de isolar um ou mais polipeptídeos (VAPs ou sequências relacionadas) como aqui descritos a partir do fluido de incubação (por exemplo de salmão) que compreende pelo menos as etapas de: a) colocar em suspensão ovos em um volume mínimo de água (por exemplo menos do que o volume dos ovos); b) induzir a incubação sincronizada, rápida dos ditos ovos (preferivelmente tal que a incubação esteja completa dentro de menos do que 3 horas por mais do que 95 % dos embriões); c) filtrar os ovos da incubação para obter o fluido de incubação; d) adicionar acetona ao dito fluido de incubação a uma concentração final de 80 % v/v; e e) submeter o dito fluido à centrifugação de velocidade baixa em que o(s) dito(s) polipeptídeo(s) está(ão) presente(s) na pelota assim formada; e opcionalmente f) separar os polipeptídeos presentes na pelota da etapa e) para isolar polipeptídeos individuais, por exemplo pelo uso de uma coluna de troca de íon.

[0078] Uma coluna de troca de íon preferida é uma coluna DEAE- Sepharose® CL-6B, entretanto alternativas adequadas são prontamente disponíveis.

[0079] Preferivelmente o dito fluido de incubação é de peixe, especialmente Salmonidae, particularmente Salmo, por exemplo Salmo salar (salmão do Atlântico) e Oncorhynchus (salmão do Pacífico).

[0080] A invenção estende-se ainda aos polipeptídeos preparados pelo método descrito acima.

[0081] Os polipeptídeos ou moléculas de ácido nucleico da invenção, ou para o uso de acordo com a invenção, são de modo preferível substancialmente isento de quaisquer componentes contaminantes derivados do material ou materiais fontes usados no procedimento de isolação ou na sua preparação sintética. De modo especialmente preferível o composto é purificado a um grau de pureza de mais do que 50 ou 60 %, por exemplo >70, 80 ou 90 %, preferivelmente mais do que 95 ou 99 % de pureza como avaliado p/p (peso seco). Tais níveis de pureza correspondem às moléculas específicas de interesse, mas incluem os seus produtos de degradação. Onde apropriado, preparações enriquecidas podem ser usadas que têm pureza mais baixa, por exemplo contêm mais do que 1, 2, 5 ou 10 % das molécula de interesse, por exemplo mais do que 20 ou 30 %. Os polipeptídeos da invenção, ou para o uso de acordo com a invenção, podem ser purificados, por exemplo, pela cromatografia (por exemplo HPLC, exclusão de tamanho, troca de íon, afinidade, interação hidrofóbica, fase reversa) ou eletroforese capilar.

[0082] Os polipeptídeos da invenção, ou para o uso de acordo com a invenção, podem ser gerados sinteticamente, por exemplo pela ligação de peptídeos menores sinteticamente gerados ou mais convenientemente pela expressão recombinante de uma molécula de ácido nucleico que codifica o dito polipeptídeo como descrito mais acima.

[0083] As moléculas de ácido nucleico da invenção, ou para o uso de acordo com a invenção, podem ser geradas sinteticamente, por exemplo pela amplificação de uma sequência de ácido nucleico como aqui descrita. Os polipeptídeos e moléculas de ácido nucleico de VAP aqui descritas podem ser usadas como descrito abaixo para efetuar vários efeitos cosméticos e/ou médicos e formam as moléculas preferidas para este propósito.

[0084] Além disso, proteínas mais longas (e as suas sequências codificadoras) que incluem os fragmentos descritos acima, tais como as proteínas nativas de tamanho natural, podem ser usadas para os processos descritos aqui abaixo. Assim, para os usos descritos abaixo o polipeptídeo que pode ser usado estende-se a um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácido como apresentada em qualquer uma das Sequências Nos. 2 a 8 ou uma sequência que é pelo menos 50 % idêntica à dita sequência, ou uma porção de qualquer uma das ditas sequências.

[0085] As definições como elas dizem respeito aos polipeptídeos, porções, identidade de sequência e proteínas funcionalmente equivalentes similarmente se aplicam e valores de identidade de sequência preferidos como apresentado acima também são aplicáveis. Preferivelmente os polipeptídeos são fragmentos das proteínas nativas (opcionalmente com sequências flanqueadoras) como descritas mais acima. Similarmente, para os usos descritos abaixo as moléculas de ácido nucleico que podem ser usadas estendem-se às moléculas de ácido nucleico que compreendem uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo da invenção ou um polipeptídeo mais longo como descrito acima ou uma de suas sequências complementares. Preferivelmente os usos são realizados com fragmentos das sequências codificadoras nativas (opcionalmente com as sequências flanqueadoras) como descrito mais acima.

[0086] Assim, para os usos descritos abaixo a molécula de ácido nucleico que pode ser usada estende-se a uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeo como apresentada em qualquer uma das SEQ ID Nos. 10 a 16 ou uma sequência que é pelo menos 50 % idêntica à dita sequência, ou uma sequência que hibridiza à dita sequência sob condições de ligação não severas de 6 x SSC/50 % de formamida na temperatura ambiente e lavando sob condições de alta severidade, por exemplo 2 x SSC, 65° C, onde SSC = 0,15 M de NaCl, 0,015 M de citrato de sódio, pH 7,2, ou uma sequência complementar a qualquer uma das sequências anteriormente mencionadas, ou uma porção de qualquer uma das ditas sequências.

[0087] Como aludido a seguir em relação aos usos da invenção, referência aos polipeptídeos e moléculas de ácido nucleico refere-se a esta definição mais ampla, isto é não apenas fragmentos das moléculas nativas que opcionalmente contêm as sequências flanqueadoras como descritas acima.

[0088] Além das VAPs descritas acima, também foi descoberto que uma outra proteína encontrada no fluido de incubação de peixe tem uso cosméticos e/ou medicinais vantajosos que são complementares a aqueles das VAPs, a saber a coriolisina L como debatido mais acima.

[0089] Assim, os polipeptídeos ou moléculas de ácido nucleico como aqui divulgados podem ser usado ex vivo ou in vitro, em partes de animal ou produtos, por exemplo amostras de pele, particularmente quando é considerado que estas serão reintroduzidas no corpo a partir do qual as mesmas são derivadas, por exemplo na forma de um enxerto de pele.

[0090] Entretanto, os polipeptídeos e moléculas de ácido nucleico como aqui divulgados são preferidos para o uso in vivo como debatido em mais detalhes abaixo.

[0091] Os polipeptídeos e moléculas de ácido nucleico como aqui descritos têm aplicações para o tratamento de várias anormalidades, distúrbios ou condições como descritos a seguir.

[0092] A presente invenção assim estende-se a uma composição farmacêutica que compreende um polipeptídeo ou molécula de ácido nucleico como descritos mais acima e um ou mais excipientes e/ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis.

[0093] Alternativamente estabelecida, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende: (i) um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID No. 1 ou uma sequência que é pelo menos 50 % idêntica à dita sequência, ou uma porção de qualquer uma das ditas sequências; (ii) um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID No. 2 ou uma sequência que é pelo menos 50 % idêntica à dita sequência, ou uma porção de qualquer uma das ditas sequência; (iii) um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID No. 3 ou uma sequência que é pelo menos 50 % idêntica à dita sequência, ou uma porção de qualquer uma das ditas sequências; e/ou (iv) um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID No. 4 ou uma sequência que é pelo menos 50 % idêntica à dita sequência, ou uma porção de qualquer uma das ditas sequências; e um ou mais excipientes e/ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis.

[0094] Em um aspecto preferido, quando o uso de sequências mais longas do que aquelas apresentadas nas SEQ ID Nos. 2 a 4 são consideradas, na lista acima, as SEQ ID Nos. 2 a 4 podem ser substituídas com as SEQ ID Nos. 5 a 7, respectivamente e em que a SEQ ID NO: 2 alternativamente pode ser substituída com a SEQ ID NO: 8.

[0095] Os polipeptídeos preferidos são como descritos mais acima, particularmente, em relação às VAPs, fragmentos de sequências nativas, opcionalmente contendo sequências flanqueadoras. Referências a uma composição farmacêutica aqui podem ser lidas como abrangendo composições cosméticas.

[0096] Alternativa ou adicionalmente a dita composição pode compreender a sequência codificadora do dito polipeptídeo, isto é moléculas de ácido nucleico como descritas mais acima (por exemplo (v) uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam um polipeptídeo como apresentado em qualquer um de (i) a (iv) acima ou uma de suas sequências complementares). As moléculas de ácido nucleico preferidas são como descritas mais acima, isto é com referência às SEQ ID Nos. 9 a 16, preferivelmente 9 a 12.

[0097] Em um aspecto preferido, a dita composição compreende uma combinação dos ditos componentes, por exemplo componentes de (ii) a (iv) acima (isto é todas as VAPs descritas) ou qualquer combinação dos ditos 4 componentes listados acima.

[0098] Por “farmaceuticamente aceitável” ou “fisiologicamente aceitável” é intencionado que o ingrediente deve ser compatível com outros ingredientes na composição assim como fisiologicamente aceitável para o receptor.

[0099] O ingrediente ativo para a administração pode ser apropriadamente modificado para o uso em uma composição farmacêutica. Por exemplo os compostos usados de acordo com a invenção podem ser estabilizados contra a degradação pelo uso de derivados como descritos acima.

[00100] O ingrediente ativo também pode ser estabilizado nas composições por exemplo pelo uso de aditivos apropriados tais como sais ou não eletrólitos, acetato, EDTA (para VAPS e polipeptídeos relacionados), citrato (para VAPS e polipeptídeos relacionados), Tris, tampões de fosfato ou acetato, manitol, glicina, HSA (albumina sérica humana) ou polissorbato.

[00101] A molécula de ácido nucleico ou polipeptídeo como aqui descrita pode estar presente nas ditas composições como o único ingrediente ativo ou pode ser combinado com outros ingredientes, particularmente outros ingredientes ativos, por exemplo para aumentar o efeito terapêutico ou para tornar a composição mais atraente para o consumidor. O dito outro componente pode ser um dos 4 componentes opcionais descritos acima ou um componente alternativo.

[00102] A composição que compreende um ou mais polipeptídeos ou moléculas de ácido nucleico aqui descritos também pode compreender impurezas, por exemplo depois da preparação do dito um ou mais polipeptídeos ou moléculas de ácido nucleico da invenção de fontes naturais. Nas composições que compreendem os ditos um ou mais polipeptídeos ou moléculas de ácido nucleico como aqui descritos, cada um dos ditos polipeptídeos ou moléculas de ácido nucleico pode estar presente na faixa de 0,0001 a 30 % p/p da composição farmacêutica. Preferivelmente o(s) dito(s) polipeptídeo(s) ou molécula(s) de ácido nucleico estão presentes em uma faixa de 0,01 a 10 % ou como descrito a seguir.

[00103] Em outro aspecto da invenção, as composições como aqui descritas são para o uso em terapia.

[00104] Como mencionado acima, os polipeptídeos e moléculas de ácido nucleico da invenção exibem propriedades terapêuticas no tratamento de anormalidades da pele, distúrbios ou condições, pela hidratação e/ou exfoliação da pele.

[00105] As anormalidades, condições ou distúrbios de pele preferidas para serem tratados são pele seca, pele em que a camada córnea é mais espessa do que o desejável, por exemplo nas condições de hiperqueratose, ou pele com pigmentação indesejada na epiderme, por exemplo fígado, idade, sol ou manchas marrons. Os tratamentos podem ser cosméticos, por exemplo o tratamento de pele normal mas seca ou pele espessada (tal como calosidades, calos ou verrugas hiperqueratóticas) ou tratamento de distúrbios de pigmentação, tais como manchas senis, ou terapêutico, por exemplo para tratar a acne, eczema, psoríase ou verrugas que resultam em dor.

[00106] Como aqui aludido um “distúrbio” refere-se a um distúrbio patológico subjacente em um organismo sintomático ou assintomático relativo a um organismo normal, que pode resultar, por exemplo, de infecção ou uma imperfeição genética adquirida ou congênita. Uma “anormalidade” ou “condição” refere-se a uma irregularidade ou defeito na pele em relação à pele ideal normal mas que não é como o resultado de um distúrbio patológico. O defeito/irregularidade podem ao invés resultar da idade, lesão, fatores ambientais, níveis hormonais, medicação, materiais externamente aplicados ou ingeridos, condições genéticas ou uma variedade de outros fatores que levam ao funcionamento anormal da pele resultando em irregularidades.

[00107] O distúrbio, anormalidade ou condição podem ser meramente cosméticas ou não cosméticas requerendo tratamento médico, ou uma combinação destes.

[00108] Como aqui aludido “cosmético” é intencionado a se referir a um tratamento que não cura, trata ou previne uma doença ou distúrbio, mas ao invés serve como um produto de cuidado da pele ou para modificar ou melhorar a aparência da pele, por exemplo a cor, textura ou teor de umidade da pele.

[00109] Um ingrediente “não cosmético” (ou médico) usado em tratamentos médicos como aqui descrito serve para curar, mitigar, tratar ou prevenir um ou mais sintomas do distúrbio, por exemplo dor ou desconforto.

[00110] A base dos tratamentos aqui descritos é a hidratação da pele e efeitos de exfoliação dos VAPs e/ou coriolisina como aqui divulgados. Estes efeitos são mostrados nos Exemplos aqui fornecidos.

[00111] Assim os tratamentos com base nas propriedades de hidratação e/ou exfoliação de VAPs e/ou coriolisina são consideradas.

[00112] A invenção fornece assim um método cosmético ou não cosmético de exfoliação e/ou hidratação da pele de um animal, em que um polipeptídeo, molécula de ácido nucleico ou composição farmacêutica como descritos mais acima são administrados ao dito animal.

[00113] Assim, com referência ao acima, a presente invenção fornece um método cosmético ou não cosmético de esfoliar e/ou hidratar a pele de um animal, em que um polipeptídeo, molécula de ácido nucleico ou composição farmacêutica são administrados ao dito animal, em que o dito polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácido como apresentada em qualquer uma das Sequências Nos. 1 a 8 (preferivelmente 1 a 4) ou uma sequência que seja pelo menos 50 % idêntica à dita sequência, ou uma porção de qualquer uma das ditas sequências; a dita molécula de ácido nucleico codifica o dito polipeptídeo ou é uma se suas sequências complementares (por exemplo uma sequência de nucleotídeo como apresentada em qualquer uma das SEQ ID Nos. 9 a 16 (preferivelmente de 9 a 12) ou uma sequência que seja pelo menos 50 % idêntica à dita sequência, ou uma sequência que hibridiza à dita sequência sob condições de ligação não severas de 6 x SSC/50 % de formamida na temperatura ambiente e lavando sob condições de alta severidade, por exemplo 2 x SSC, 65° C, onde SSC = 0,15 M de NaCl, 0,015 M de citrato de sódio, pH 7,2, ou uma sequência complementar a qualquer uma das sequências anteriormente mencionadas, ou uma porção de qualquer uma das ditas sequências) e a dita composição farmacêutica compreende um ou mais dos ditos polipeptídeos ou moléculas de ácido nucleico e um ou mais excipientes e/ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis.

[00114] Como descrito acima e aqui aludido, o polipeptídeo e sequências de nucleotídeo descritas acima definidas pela referência às SEQ ID Nos. 2 a 8 e 10 a 16 são VAPs ou sequências relacionadas e aquelas definidas pela referência às SEQ ID Nos. 1 e 9 são coriolisina ou sequências relacionadas.

[00115] Como aqui aludidas, “exfoliação” refere-se à remoção de células superficiais de uma superfície epitelial que na pele equivalem à escamação ou descamação da camada córnea da epiderme. “Hidratação” como aqui aludida abrange hidratadores que impedem a perda de água da pele assim como hidratadores (umectantes) que atraem e retêm água quando aplicados à pele e emolientes (que melhoram a descamação defeituosa).

[00116] Alternativamente estabelecida, a presente invenção fornece um polipeptídeo, molécula de ácido nucleico ou composição farmacêutica como aqui descritos para o uso na exfoliação e/ou hidratação da pele de um animal. (O composto ou composição alternativamente podem ser usados para preparar um medicamento para este propósito).

[00117] Como mencionado acima, tais propriedades exfoliantes e/ou hidratantes são vantajosas para tratar ou prevenir uma variedade de anormalidades, distúrbios ou condições da pele.

[00118] Em um aspecto preferido, a anormalidade, condição ou distúrbio de pele a serem tratados ou prevenidos é a pele seca. Isto pode ser tratado pela hidratação e/ou exfoliação.

[00119] A “pele seca” como aqui aludida refere-se a uma epiderme que carece de umidade ou sebo, frequentemente caracterizada por um padrão de linhas finas, escamação, e coceira. A pele seca pode ocorrer como uma condição pele por si própria (por exemplo devido à idade, dano pelo calor/frio/secura) ou pode ser o sintoma de um distúrbio ou condição de pele tais como dano pelo sol, eczema, dermatite de contato, psoríase ou ictiose (uma condição herdada que causa floculação acentuada da pele).

[00120] Em um outro aspecto preferido, a anormalidade, condição ou distúrbio a serem tratados ou prevenidos são camadas da pele ásperas espessadas. Isto pode ser tratado pela hidratação e/ou exfoliação.

[00121] Tais camadas da pele ásperas espessadas podem ocorrer em condições tais como calosidades ou calos que são almofadas protetivas fabricadas acima da camada superior espessada de pele devido à esfregação repetida da área ou verrugas na pele. Tais métodos também podem ser usados para tratar ou prevenir a acne que envolve a queratinização na sua patologia. As camadas da pele ásperas espessadas podem ser a própria condição ou pode ser um sintoma de uma condição ou distúrbio de pele.

[00122] Em outros aspectos preferidos, a anormalidade, condição ou distúrbio a serem tratados ou prevenidos são um distúrbio de pigmentação ou anormalidade da pele. Isto pode ser tratado pela exfoliação.

[00123] Distúrbios ou anormalidades de pigmentação da pele podem ocorrer como um resultado da idade, mudanças hormonais, fatores genéticos, doença ou sol ou outro dano. A pigmentação alterada pode resultar de um excesso local de melanócitos ou aumentos na atividade de melanócito, ou ambos. Os distúrbios de pigmentação incluem lentigo senil, manchas de sol ou idade (lentigo solar) e outro manchas tais como sardas.

[00124] Alternativamente estabelecido, a presente invenção fornece assim um método cosmético ou não cosmético de tratar ou prevenir uma condição ou distúrbio de pele de um animal em que a dita pele é anormalmente seca, a camada da pele áspera é anormalmente espessada ou a pele tem um distúrbio de pigmentação, em que um polipeptídeo, molécula de ácido nucleico ou composição farmacêutica como descritos mais acima são administrados ao dito animal. As ditas condições ou distúrbios são preferivelmente como descritos mais acima.

[00125] Como aqui aludido “anormal” é determinado em relação a pele ideal normal, isto é a pele saudável, hidratada, normalmente pigmentada e não envelhecida.

[00126] Em um outro relato alternativo, a invenção fornece um polipeptídeo, molécula de ácido nucleico ou composição farmacêutica como aqui descritos para o uso em um método cosmético ou não cosmético de tratar ou prevenir uma condição ou distúrbio de pele de um animal em que a dita pele é anormalmente seca, a camada da pele áspera é anormalmente espessada ou a pele tem um distúrbio de pigmentação. (O composto ou composição alternativamente podem ser usados para preparar um medicamento para este propósito).

[00127] Em um aspecto preferido os usos médicos e/ou cosméticos são obtidos pela administração tópica à pele.

[00128] Preferivelmente, para as indicações médicas ou cosméticas dependente, pelo menos em parte, dos efeitos de exfoliação dos ingredientes ativos, as composições farmacêuticas usadas para este propósito compreende um ou mais VAPs (ou suas sequências relacionados como aqui descritas) e/ou coriolisina (ou suas sequências relacionadas como aqui descritas).

[00129] Preferivelmente, para as indicações médicas ou cosméticas dependentes, pelo menos em parte, dos efeitos de hidratação dos ingrediente ativos, as composições farmacêuticas usadas para este propósito compreendem uma ou mais VAPs (ou suas sequências relacionadas como aqui descritas).

[00130] Assim em um aspecto particularmente preferido, uma ou mais VAPs (ou suas sequências relacionadas como aqui descritas) e/ou coriolisina (ou suas sequências relacionadas como aqui descritas) podem ser usadas para tratar distúrbios em que a pele é anormalmente seca, a camada áspera da pele é anormalmente espessada ou em que um defeito de pigmentação está presente, por exemplo calosidades, calos, verrugas, eczema, dermatite de contato, psoríase, ictiose, acne e lentigo senil.

[00131] Em um outro aspecto particularmente preferido, uma ou mais VAPs (ou suas sequências relacionadas como aqui descritas) podem ser usadas para tratar distúrbios em que a pele é anormalmente seca.

[00132] Como aqui usado, “tratar” refere-se à redução, alívio ou eliminação, preferivelmente aos níveis normais, de um ou mais dos sintomas ou efeitos da dita condição ou distúrbio por exemplo presença ou grau de pele seca ou espessada, grau ou área de pigmentação, coceira ou dor, etc. em relação aos sintomas ou efeitos presentes em uma parte diferente do corpo do dito indivíduo onde a pele não sofre da dita condição ou distúrbio e não submetido ao dito tratamento ou em um indivíduo normal correspondente não submetido ao dito tratamento.

[00133] “Prevenir” refere-se à prevenção ou redução ou alívio absolutos do grau ou cronometragem (por exemplo retardo) do início deste sintoma ou efeito. Por exemplo, as condições tipificadas pela pele seca, espessada ou anormalmente pigmentada pode ser impedida pela aplicação regular de composições da invenção antes da aparência de uma tal condição.

[00134] Preferivelmente, os ditos tratamentos são obtidos usando métodos de polipeptídeo da invenção. Entretanto, o uso dos polinucleotídeos codificadores também são considerados.

[00135] Isto pode ser obtido, por exemplo, pelos métodos de terapia de gene, por exemplo uso de sequências de sentido para permitir a expressão das moléculas desejadas na pele.

[00136] O método de tratamento ou prevenção de acordo com a invenção pode ser vantajosamente combinado com a administração de um ou mais ingredientes ativos que são eficazes no tratamento ou prevenção dos distúrbios ou condições e/ou para obter hidratação ou exfoliação. Assim, as composições farmacêuticas da invenção podem adicionalmente conter um ou mais de tais ingredientes ativos.

[00137] De acordo ainda com um outro aspecto da invenção nós fornecemos produtos contendo um ou mais polipeptídeos ou moléculas de ácido nucleico como aqui definidas e opcionalmente um ou mais ingredientes ativos adicionais como uma preparação combinada para o uso simultâneo, separado ou sequencial na terapia humana ou animal, preferivelmente como aqui descrito.

[00138] As composições da invenção podem ser formulados em uma maneira convencional com um ou mais carregadores, excipientes e/ou diluentes fisiologicamente aceitáveis, de acordo com técnicas bem conhecidas no ramo usando ingredientes prontamente disponíveis.

[00139] Assim, o ingrediente ativo pode ser incorporado,opcionalmente junto com outras substâncias ativas como uma preparação combinada, com um ou mais carregadores, diluentes e/ou excipientes convencionais, para produzir preparações galênicas convencionais tais como tabletes, pílulas, pós, pastilhas, sachês, cápsulas, elixires, suspensões (como injeção ou fluidos de infusão), emulsões, soluções, xaropes, aerossóis (como um sólido ou em um meio líquido), unguentos, cápsulas de gelatina mole e dura, supositórios, soluções injetáveis estéreis, pós embalados estéreis, e os seus semelhantes. Polímeros biodegradáveis (tais como poliésteres, polianidridos, ácido poliláctico, ou ácido poliglicólico) também podem ser usados para implantes sólidos. As composições podem ser estabilizadas pelo uso da secagem por congelamento, subesfriamento ou Permazyme.

[00140] Os excipientes, carregadores ou diluentes adequados são lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, amidos, goma acácia, fosfato de cálcio, carbonato de cálcio, lactose cálcica, amido de milho, alginatos, tragacanto, gelatina, silicato de cálcio, celulose microcristalina, polivinilpirrolidona, celulose, xarope aquoso, água, água/etanol, água/glicol, água/polietileno, glicol, propileno glicol, metil celulose, metilhidróxi- benzoatos, hidroxibenzoatos de propila, talco, estearato de magnésio, óleo mineral ou substâncias graxas tais como banha ou suas misturas adequadas. Os agentes para a obtenção de formulações de liberação prolongada, tais como carboxipolimetileno, carboximetil celulose, acetato ftalato de celulose, ou acetato de polivinila também podem ser usados.

[00141] As composições podem adicionalmente incluir agentes lubrificantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes, agentes que aumentam a viscosidade, agentes de granulação, agentes desintegrantes, agentes de ligação, agentes osmoticamente ativos, agentes de suspensão, agentes preservantes, agentes adoçantes, agentes flavorizantes, realçadores de absorção (por exemplo agentes penetrantes de superfície ou para a liberação nasal, por exemplo sais biliares, lecitinas, tensoativos, ácidos graxos, queladores), agentes de bronzeamento, solvente orgânico, antioxidante, agentes estabilizantes, emolientes, silicona, alfa-hidróxi ácido, demulcente, agente anti-espumação, agente umectante, vitamina, fragrância, espessantes iônicos ou não iônicos, tensoativos, enchedores, espessantes iônicos ou não iônicos, sequestrantes, polímero, propelente, agente alcalinizante ou acidificante, opacificador, agentes corantes e compostos graxos e os seus semelhantes.

[00142] As composições da invenção podem ser formuladas de modo a fornecer liberação rápida, prolongada ou demorada do ingrediente ativo depois da administração ao corpo pela utilização de técnicas bem conhecidas no ramo.

[00143] A composição pode ser em qualquer forma de dosagem apropriada para permitir a liberação ou para o alvejamento de células ou tecidos particulares, por exemplo como uma emulsão ou em lipossomas, niossomas, microesferas, nanopartículas ou seus semelhantes com os quais o ingrediente ativo pode ser absorvido, adsorvido, incorporado ou ligado. Isto pode eficazmente converter o produto a uma forma insolúvel. Estas formas particuladas podem superar os problemas tanto de estabilidade (por exemplo degradação) e liberação.

[00144] Estas partículas podem carregar moléculas de superfície apropriado para melhorar o tempo de circulação (por exemplo componentes séricos, tensoativos, polioxamina908, PEG etc.) ou porções para o alvejamento específico de sítio, tal como ligandos para receptores que transportam célula particulares. As técnicas apropriadas para a liberação de medicamento e para o alvejamento são bem conhecidas na técnica e são descritas na WO99/62315.

[00145] O uso de soluções, suspensões, géis e emulsões são preferidos, por exemplo o ingrediente ativo pode ser carregado em água, um gás, um líquido com base em água, um óleo, um gel, uma emulsão, uma emulsão de óleo em água ou água em óleo, uma dispersão ou uma mistura destes.

[00146] As composições podem ser para a administração tópica (isto é à pele), oral ou parenteral, por exemplo pela injeção.

[00147] As composições e administração tópicas são entretanto preferidas, e incluem géis, cremes, unguentos, pulverizações, loções, pomadas, bastões, sabões, pós, películas, aerossóis, gotas, espumas, soluções, emulsões, suspensões, dispersões por exemplo dispersões de vesícula não iônicas, leites e qualquer outra das formas farmacêutica ou cosmética convencionais na técnica.

[00148] Unguentos, géis e cremes, por exemplo, podem ser formulados com uma base aquosa ou oleosa com a adição de espessamento adequado e/ou agentes formadores de gel. As loções podem ser formuladas com uma base aquosa ou oleosa e, no geral, também conterá um ou mais agentes emulsificantes, dispersantes, de suspensão, espessamento ou corantes. Os pós podem ser formados com o auxílio de qualquer base em pó adequada. As gotas e soluções podem ser formuladas com uma base aquosa ou não aquosa que compreende também um ou mais agentes de dispersão, solubilização ou suspensão. As pulverizações de aerossol são convenientemente liberadas a partir de embalagens pressurizadas, com o uso de um propelente adequado. Alternativamente, as composições podem ser fornecidas em uma forma adaptada para a administração oral ou parenteral. As formas farmacêuticas alternativas incluem assim tabletes simples ou revestidos, cápsulas, suspensões e soluções contendo o componente ativo opcionalmente junto com um ou mais carregadores e/ou diluentes inertes convencionais, por exemplo com amido de milho, lactose, sacarose, celulose microcristalina, estearato de magnésio, polivinilpirrolidona, ácido cítrico, ácido tartárico, água, água/etanol, água/glicerol, água/sorbitol, água/ polietileno glicol, propileno glicol, álcool estearílico, carboximetilcelulose ou substâncias graxas tais como banha ou misturas adequadas destes.

[00149] A concentração de ingrediente ativo nas composições da invenção, depende da natureza do composto usado (isto é do polipeptídeo ou molécula de ácido nucleico), do modo de administração, do curso de tratamento, da idade e peso do paciente, da indicação médica, do corpo ou área corporal a ser tratada e pode ser variada ou ajustada de acordo com a escolha. No geral entretanto, as faixas de concentração para o composto aqui descrito é de 0,0001, 0,0005, 0,001 ou 0,01 a 25 %, por exemplo de 0,0005 a 15 %, por exemplo de 0,01 a 10 %, tal como de 0,1 ou 0,5 a 5, por exemplo de 1 a 5 % (p/p da preparação final para a administração, particularmente para a administração tópica).

[00150] Quando mais do que um composto está presente, por exemplo 3 VAPs (ou moléculas relacionadas) como aqui descritas, cada composto pode estar presente nas quantidades descritas acima. As ditas concentrações são determinadas por referência à quantidade do próprio composto e assim tolerâncias apropriadas devem ser realizadas para se levar em conta a pureza da composição. As dosagens únicas eficazes para VAPs (e moléculas relacionadas) podem residir na faixa de 0,1 a 100 mg/cm2/dia, preferivelmente de 0,1 a 10 mg/cm2/dia, quando aplicados topicamente, dependendo do animal que é tratado, administrado como uma dose única. Para a coriolisina (e moléculas relacionadas) as doses únicas eficazes podem residir na faixa de 0,1 a 100 mU/cm2/dia, preferivelmente de 0,5 a 10, por exemplo de 1 a 5 mU/cm2/dia.

[00151] A administração pode ser por qualquer método adequado conhecido nas técnicas médicas, incluindo por exemplo a administração oral, intestinal, percutânea, bucal, retal ou tópica ou administração pela inalação. As formas de administração preferidas serão administradas oralmente, ou mais preferivelmente topicamente. Como será avaliado, a administração oral tem as suas limitações se o ingrediente ativo é digerível. Para superar tais problemas, os ingredientes podem ser estabilizados como anteriormente mencionado.

[00152] Será avaliado que visto que o ingrediente ativo para o desempenho da invenção toma uma variedade de formas, por exemplo molécula de ácido nucleico (que pode estar em um vetor) ou polipeptídeo, a forma da composição e a via de liberação variará. Preferivelmente entretanto soluções líquidas, cremes ou suspensões seria utilizadas, particularmente por exemplo para a liberação oral ou administração tópica.

[00153] O polipeptídeo ou moléculas de ácido nucleico da invenção podem ser usadas para as indicações médicas acima mencionadas. Nos últimos métodos de terapia de gene, as moléculas de ácido nucleico são preferivelmente fornecidas em vetores que são adequados para a transfecção/transformação como descritas acima, por exemplo vetores virais tais como adenovírus usando os métodos de terapia de gene conhecidos na técnica para as aplicações médicas.

[00154] Os animais aos quais as composições podem ser aplicadas ou administradas incluem mamíferos, répteis, pássaros, insetos e peixe particularmente durante a aquacultura de peixe (por exemplo salmão ou bacalhau). Preferivelmente os animais aos quais as composições da invenção são aplicadas são mamíferos, particularmente primatas, animais domésticos, animais de criação e de laboratório. Assim os animais preferidos incluem camundongos, ratos, coelhos, porquinhos da Índia, gatos, cães, macacos, porcos, vacas, cabras, ovelhas e cavalos. De modo especialmente preferível as composições são aplicadas, ou administradas, aos seres humanos.

[00155] Os seguintes Exemplos são dados apenas por via de ilustração em que as Figuras aludidas são como segue: A Figura 1 mostra a focalização isoelétrica das VAPs depois da sua purificação; A Figura 2 mostra os efeitos das VAPs de salmão do Atlântico sobre o epitélio humano em que A e B mostram a cultura de pele exposta às VAPs, e C mostra a cultura de pele de controle; e A Figura 3 mostra os efeitos da coriolisina L de salmão do Atlântico sobre o epitélio humano em que A mostra a cultura de pele exposta à coriolisina L, e B mostra a cultura de pele de controle.

Exemplo 1: Identificação e caracterização de VAPs Isolação da Proteína

[00156] Durante o curso de analisar os componentes do fluido de incubação de salmão do Atlântico, novas proteínas presentes no fluido de incubação foram identificadas.

[00157] Um método para preparar parcialmente o fluido de incubação (a partir do qual zonase pode ser preparada) que pode ser usada como o material de partida para isolar as VAPs da invenção (ou suas sequências precursoras) é fornecido na WO99/29836 que é por meio deste incorporada por referência (particularmente o Exemplo 1 do método descrito, mas opcionalmente sem a etapa da ureia).

[00158] Assim, o seguinte método foi usado para a isolação. As VAPs foram isoladas do fluido de incubação (bruto ou filtrado através de filtros de 0,45 μm). Subsequentemente as VAPs foram precipitadas pela adição de 4x volumes de acetona na temperatura ambiente ou a 4° C. Depois de 20 a 30 minutos as VAPs precipitadas foram coletadas como uma pelota depois da centrifugação em baixa velocidade (em torno de 5000xg) e recolocadas em suspensão no tampão apropriado (por exemplo 10 mM de Tris HCl, pH 8,0 ou PBS).

[00159] A Figura 1 mostra 2D PAGE das VAPs depois da sua purificação como descrito acima.

Análise de Sequência

[00160] As VAPs recém identificadas foram submetidas à caracterização pela análise de MS das manchas tripsinizadas. A análise de MS foi MALDI-TOF-TOF (dessorção/ionização a laser assistida por matriz. Tempo de vôo x2).

[00161] Os seguintes resultados foram obtidos para o melhor emparelhamento como refletido pela contagem de topo.

[00162] A partir dos resultados acima, as sequências das VAPs foram geradas pela identificação dos peptídeos na sequência de VAP pela MS e depois inserindo as sequências intercaladas usando porções relevantes da sequência nativa conhecida com a qual a comparação foi feita. As sequências de VAP identificadas por este processo são apresentadas nas SEQ ID Nos. 2 a 4 e as sequências nativas contra as quais elas foram comparadas são fornecidas nas SEQ ID Nos. 5 a 8.

Exemplo 2: Aplicações medicinais/cosméticas de VAPs in vitro Materiais e Métodos

[00163] Os seguintes estudos foram realizados usando as VAPs de salmão do Atlântico preparadas como descrito no Exemplo 1.

[00164] As culturas de epitélio de pele humana diferenciadas foram obtidas da SkinEthics (Nice, França) no dia 16 depois semear sobre substratos de cultivo plásticos com microporos permitindo que os nutrientes tenham acesso ao tecido epitelial por debaixo. Tais culturas exibem morfologia de pele normal depois da diferenciação durante o período de cultivo a 37° C. Estas culturas foram mantidas por mais dois dias in vitro de modo que o Stratum corneum superior fosse exposto ao ar, e o stratum basalis ao substrato de cultivo.

[00165] Culturas paralelas foram movidas para atmosfera úmida a 30° C e apresentadas com um meio de solução salina tamponada com fosfato contendo Ca, Mg por 6 horas com ou sem a presença de VAPs a 0,5 mg/ml (medida na OD280). As culturas foram fixadas em formalina e embutidas em parafina de acordo com procedimentos padrão, e tingidas com hematoxilina/ eosina.

Resultados A. Efeitos da Hidratação

[00166] Os resultados são mostrados na Figura 2A-C em que A e B mostram a cultura de pele exposta às VAPs e C mostra a cultura de pele de controle. Estas figuras mostram que as VAPs fazem com que as lâminas do Stratum corneum da pele se separem, assim a “delaminação” ocorre. As lâminas não se descolam, ou exfoliam, elas simplesmente se separam umas das outras.

[00167] Esta separação é causada pelas proteínas anfifílicas altamente carregadas que se intercalam no Stratum corneum, e que devido ao seu caráter anfifílico carregam água para separar as lâminas de pele. A água é portanto adicionada no Stratum corneum pelas VAPs reduzindo a perda de água trans- epidérmica (TEWL).

Exemplo 3: Aplicações medicinais/cosméticas de coriolisina L in vitro Materiais e Métodos

[00168] Os seguintes estudos foram realizados usando a coriolisina L de salmão do Atlântico preparada como descrito em Yasumasu et al., 1989, supra, a partir do fluido de incubação de salmão.

[00169] As culturas de epitélio de pele humana foram preparadas como descrito no Exemplo 2 e coriolisina L de fluido de incubação de salmão foi aplicada a 0,15 mU/ml por 6 horas a 30° C.

Resultados A. Efeitos de exfoliação

[00170] Os resultados são mostrados na Figura 3A e B em que A mostra a cultura de pele exposta à coriolisina L de salmão e B mostra a cultura de pele de controle. Os resultados mostram que a coriolisina L causa a deslaminação e ruptura das lamelas de pele.

[00171] A exfoliação também pode ser analisada avaliando-se o sobrenadante de culturas de pele para avaliar a quantidade de células epiteliais que são removidas das culturas de pele durante o tratamento. Visto que a coriolisina L é inibida pelo EDTA a 1 mM, os seus efeitos podem ser facilmente inibidos para provar a sua ação sobre a pele.

Exemplo 4: Aplicações medicinais/cosméticas de VAPs e coriolisina L in vivo Aplicações Cosméticas

[00172] Os indivíduos que sofrem de pele seca e/ou pele que requer exfoliação (por exemplo calosidade ou calos) são administrados cremes cosméticos ou placebos como descrito abaixo. O tratamento é repetido periodicamente, por exemplo a cada 8 horas.

[00173] Os efeitos do creme sobre a pele são analisados com base nos efeitos qualitativos tais como aparência e sensação (por exemplo coceira) ou pode ser analisado mais quantitativamente, por exemplo no teor de água ou espessura.

Aplicações Medicinais

[00174] Os indivíduos que sofrem de uma condição ou anormalidade da pele tal como acne, eczema ou psoríase são administrados com cremes de tratamento ou placebo como descrito abaixo. O tratamento é repetido periodicamente, por exemplo a cada 8 horas.

[00175] Os efeitos do creme sobre a pele são analisados com base nos efeitos qualitativos tais como aparência, sensação (por exemplo dor) ou cor ou podem ser analisados mais quantitativamente, por exemplo no tamanho da anormalidade remanescente, grau de inflamação ou espessura.Creme de Placebo:Creme cosmético/tratamento com 10 % de ingrediente ativo:

Sequências:

[00176] SEQ ID No. 1: Coriolisina L - salmão do Atlântico

Claims (9)

1. Composição farmacêutica ou cosmética, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID No. 1; e (b) uma quantidade eficaz de um agente estabilizante adicionado; e (c) um ou mais excipientes e/ou diluentes farmacêutica ou cosmeticamente aceitáveis.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição é um gel, creme, unguento, loção, espuma, solução não-aquosa, aerossol, pomada, bastão, sabão, pó, películas, emulsão, suspensão ou dispersão.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que é para o uso em terapia.

4. Método cosmético para esfoliar e/ou hidratar a pele de um animal, caracterizado pelo fato de que: (a) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID No. 1; ou (b) uma composição cosmética compreendendo um polipeptídeo de (a) e um ou mais excipientes e/ou diluentes cosmeticamente aceitáveis, é administrado ao dito animal.

5. Uso de (a) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID No. 1; ou (b) uma composição farmacêutica compreendendo um polipeptídeo de (a) e um ou mais excipientes e/ou diluentes farmacêutica ou cosmeticamente aceitáveis, caracterizado pelo fato de que ser na manufatura de um medicamento para esfoliar e/ou hidratar a pele de um animal.

6. Método cosmético para tratar ou prevenir uma condição ou distúrbio de pele de um animal em que a dita pele é anormalmente seca, a camada da pele áspera é anormalmente espessa ou a pele tem um distúrbio de pigmentação, caracterizado pelo fato de que: (a) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID No. 1; ou (b) uma composição cosmética compreendendo um polipeptídeo de (a) e um ou mais excipientes e/ou diluentes cosmeticamente aceitáveis, é administrado ao dito animal.

7. Uso de (a) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID No. 1; ou (b) uma composição farmacêutica compreendendo um polipeptídeo de (a) e um ou mais excipientes e/ou diluentes farmacêutica ou cosmeticamente aceitáveis, caracterizado pelo fato de que são para manufatura de um medicamento para tratar ou prevenir uma condição ou distúrbio de pele de um animal em que a dita pele é anormalmente seca, a camada da pele áspera é anormalmente espessa ou a pele tem um distúrbio de pigmentação.

8. Uso, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a condição ou distúrbio de pele a serem tratados ou prevenidos é eczema, dermatite de contato, psoríase, ictiose ou acne.

9. Método ou uso cosméticos, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que a condição ou distúrbio de pele a serem tratados ou prevenidos é calosidade, calos, verrugas ou lentigo senil.