ES2741586T5 - Enzimas del líquido de eclosión y usos de las mismas - Google Patents

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Description

DESCRIPCIÓN
Enzimas del líquido de eclosión y usos de las mismas
La presente invención se refiere al uso de coriolisina que puede obtenerse del líquido de eclosión de peces en diversas aplicaciones cosméticas y médicas para la piel. En el presente documento también se describen proteínas muy ácidas que pueden obtenerse del líquido de eclosión de peces y su uso en diversas aplicaciones cosméticas y médicas para la piel.
La piel es uno de los órganos más vulnerables del cuerpo. Aunque raras veces tienen peligro para la vida, los trastornos o afecciones de la piel pueden ser incómodos y pueden provocar discapacidades crónicas. Además, debido a que la piel es muy visible, los trastornos y afecciones de la piel pueden conducir a estrés psicológico. Por lo tanto, existe una continua necesidad de tratamientos eficaces para afecciones y trastornos de la piel.
La piel forma el mayor órgano del cuerpo, representando aproximadamente el 12-16 por ciento del peso de una persona. Desempeña muchos papeles vitales como barrera y como influencia reguladora entre el mundo exterior y el entorno controlado dentro de nuestros cuerpos.
La piel consta de 3 capas, a saber, la epidermis, la dermis y el subcutis. La epidermis es la capa epitelial superior de la piel. Actúa como una barrera física, evitando la pérdida de agua del cuerpo y evitando la entrada de sustancias y organismos en el cuerpo. Su grosor varía según el sitio del cuerpo.
La epidermis consta de epitelio escamoso estratificado, es decir, consta de capas de células aplanadas. La piel, el cabello y las uñas están queratinizados, lo que significa que tienen una superficie hidrófoba endurecida, muerta, hecha de una proteína llamada queratina. La epidermis se hace impermeable debido a su contenido de lípidos extracelulares asociados con los queratinocitos, especialmente en la capa media de la epidermis (estrato lúcido). Las membranas mucosas (por ejemplo, del esófago, cavidad faríngea oral, órganos reproductivos y otros) son principalmente no queratinizadas y húmedas. La epidermis tiene tres tipos principales de células, a saber, queratinocitos (células cutáneas), melanocitos (células productoras de pigmento) y células de Langerhans (células inmunitarias). La célula de Merkel es una cuarta célula epidérmica, menos frecuente.
Los queratinocitos maduran y se diferencian con la acumulación de queratina a medida que se mueven hacia afuera. Con el tiempo se caen o se desprenden por rozamiento. Forman cuatro o cinco estratos distintos, que de lo más superficial a lo más profundo son (i) el estrato córneo (capa córnea) con células duras, secas y muertas sin núcleos, (ii) el estrato granuloso (capa granular) con células que contienen gránulos basófilos y separadas hacia fuera del estrato córneo por el estrato lúcido delgado, (iii) el estrato espinoso (capa espinosa o de células espinosas) en el que las células se aplanan cada vez más a medida que se mueven hacia arriba y (iv) el estrato basal (capa basal) con células regenerativas columnares (altas).
Inmediatamente debajo de la epidermis está la membrana basal, una estructura especializada que se encuentra entre la epidermis y la dermis.
La dermis es el tejido conectivo fibroso o capa de soporte de la piel. Las fibras principales son fibras de colágeno y elastina que están entretejidas.
El subcutis es la capa de grasa inmediatamente debajo de la dermis y la epidermis. También se llama tejido subcutáneo, hipodermis o panículo. El subcutis se compone principalmente de células grasas (adipocitos), nervios y vasos sanguíneos.
Se crean nuevas células epiteliales de la piel en la capa inferior de la piel, el estrato granuloso. Con el tiempo, las células migran a la superficie de la piel y se vuelven más ácidas. Durante su viaje de 30 días, mueren y se saturan de queratina. La queratina y los lípidos asociados son importantes porque protegen la piel de los elementos externos.
La enfermedad, la lesión, los factores ambientales, la edad, los niveles hormonales, la medicación, los materiales aplicados externamente o ingeridos, las condiciones genéticas o una diversidad de factores adicionales pueden conducir a un funcionamiento anómalo de la piel que da como resultado irregularidades o anomalías. Algunas de estas irregularidades o anomalías pueden ser de naturaleza puramente cosmética, por ejemplo, piel seca, arrugas o pigmentación alterada, o pueden ser más graves y provocar dolor o molestias, por ejemplo, eccema y psoriasis.
La piel seca es una de las afecciones o anomalías más comunes de la piel. Aunque determinados individuos son más susceptibles a la piel seca, la afección puede aquejar a cualquiera, independientemente de su edad, sexo o tipo de piel.
La piel seca se produce cuando se agota el agua de la capa externa de la piel (el estrato córneo con el estrato lúcido). Cuando esta capa está bien hidratada, minimiza la pérdida de agua a través de la piel y ayuda a impedir la entrada a irritantes, alérgenos y gérmenes. Sin embargo, cuando el estrato córneo se seca, se reduce su función protectora.
Esto permite mayor pérdida de agua, dejando la piel vulnerable a factores ambientales.
En condiciones normales, el estrato córneo tiene un contenido de agua del 10 % al 30 %. Esta agua otorga a la piel su textura blanda, suave y flexible. El agua proviene de la atmósfera, las capas subyacentes de la piel y el sudor. El aceite producido por las glándulas cutáneas y las sustancias grasas producidas por las células cutáneas actúan como hidratantes naturales, lo que permite que el estrato córneo selle agua en su interior.
El cuerpo pierde agua continuamente a través de la superficie de la piel por evaporación. En condiciones normales, la velocidad de pérdida es lenta y el agua se reemplaza adecuadamente. Aparecen señales y síntomas característicos de la piel seca cuando la pérdida de agua excede el reemplazo de agua y el contenido de agua del estrato córneo cae por debajo del 10 %.
Son muy deseables hidratantes que mejoren o erradiquen la piel seca. Aunque se conocen en la técnica muchos hidratantes, sigue existiendo la necesidad de productos naturales que sean eficaces pero suaves.
Otra anomalía o afección cutánea habitual son cantidades excesivas de la capa córnea de la piel. Esto puede resultar de la incapacidad de la capa córnea para desprenderse o por deposición excesiva de queratina en la capa córnea. La primera puede producirse cuando el proceso natural de erosión cutánea se hace irregular, lo que da a la piel un carácter seco y rugoso. Los trastornos hiperproliferativos benignos incluyen hiperqueratosis epidermolítica (o piel agrietada) y queratosis de los folículos pilosos. Una afección hiperproliferativa benigna habitual es la hipertrofia periférica alrededor de cicatrices y/o formación de queloides. Otras afecciones hiperproliferativas son helomas, callos, verrugas hiperqueratósicas (particularmente verruga vulgar), ictiosis y queratosis palmoplantares.
Los tratamientos actuales implican exfoliación o cirugía en casos extremos. La hiperqueratosis se trata habitualmente ablandado la capa córnea y retirando la piel engrosada.
También puede usarse exfoliación para retirar células epidérmicas alteradas, por ejemplo, células epidérmicas de una epidermis que muestra un trastorno de pigmentación, por ejemplo, manchas cutáneas.
La exfoliación retira los estratos externos de la epidermis para revelar las células cutáneas más nuevas que se encuentran debajo. Puede realizarse exfoliación mediante medios físicos (es decir abrasión de la piel) o mediante medios químicos. Los exfoliantes químicos incluyen exfoliantes que contienen ácido salicílico, ácido glicólico, enzimas frutales, ácido cítrico o ácido málico y pueden ser aplicados en altas concentraciones por un dermatólogo o en menores concentraciones en productos sin receta. La exfoliación química puede implicar el uso de productos que contienen alfa hidroxiácidos (AHA) o beta hidroxiácidos (BHA) o enzimas que actúan para aflojar las sustancias pegajosas que mantienen las células unidas en uniones celulares, permitiendo que se separen. Este tipo de exfoliación está recomendada para personas que se tratan de acné.
La mayor desventaja para la exfoliación es el alto precio de algunos de los productos y métodos usados para realizarla. La exfoliación conducirá a cierta rojez inicial en la piel. Hacia el final de las quimioexfoliaciones, la piel cambiará de color, variando los colores de blanco brillante a gris en la superficie cutánea. Son por lo tanto deseables métodos más eficaces que sean más suaves para la piel. Se desvelan composiciones que contienen péptidos y su uso en el tratamiento de afecciones cutáneas en el documento WO 2005/046709. El documento US 2009/0117093 desvela un fragmento de granulisina biológicamente activo para usar en la exfoliación de la piel. El documento WO 02/066624 desvela una proteasa humana que tiene diversas aplicaciones terapéuticas.
Por tanto sigue existiendo la necesidad de tratamientos adecuados para hidratar la piel y/o para exfoliación de la capa córnea de la piel.
Sorprendentemente, se ha descubierto ahora que determinadas moléculas que se encuentran en el líquido de eclosión de peces son hidratantes y exfoliantes notablemente eficaces, a saber, coriolisina y un grupo recientemente identificado de proteínas muy ácidas (VAP).
Se logra la eclosión de embriones de peces, al menos en parte, por las llamadas enzimas de eclosión, coriolisinas. La coriolisina es una metaloproteinasa que se encuentra en el líquido de eclosión de peces y generalmente se encuentra en dos formas, a saber, la enzima coriolítica alta (coriolisina H, HCE) y la enzima coriolítica baja (coriolisina L, LCE), que son similares en algunas características estructurales y catalíticas y pertenecen a la familia de la astacina pero con preferencias de sustrato notablemente diferentes.
En el salmón, el LCE es relativamente infrecuente en comparación con coriolisinas conocidas de otras especies de peces y puede aplicarse para los fines que se describen a continuación en el presente documento. La secuencia de LCE de salmón se expone en la SEQ ID NO. 1, a continuación, y se divulga en la base de datos EMBL como número de referencia FJ824909.
Como se ha mencionado anteriormente, se ha identificado ahora un grupo de proteínas muy ácidas (VAP) en el líquido de eclosión de peces por precipitación de otros componentes en acetona al 80 % y eliminación de la acetona por evaporación del sedimento centrifugado como se describe en los Ejemplos.
Estas VAP se generan mediante la escisión proteolítica de la cáscara de huevo o corion polimerizado y reticulado mediante enzimas de eclosión durante la eclosión y son fragmentos de componentes incorporados al corion durante la oogénesis, tales como coriogenina H y L como se describe con más detalle a continuación en el presente documento. Se han desvelado proteínas de cáscara de huevo de salmón en Oppen-Berntsen et al. (Marine Biotechnology, 1999, vol. 1 pág. 252-260). Estos fragmentos de proteínas coriogénicas, que aquí se denominan VAP, se liberan en el líquido perivitelino durante la eclosión para convertirse en componentes del líquido de eclosión. Las VAP aparecen en diversas formas. Cuando se analizan por isoelectroenfoque (véase los Ejemplos), VAP I, II y III (como se analiza a continuación) aparecen en al menos 2, 6 y 3 isoformas, respectivamente.
Se divulgan en el presente documento tres VAP que se han identificado y que tienen propiedades sorprendentes como se describe a continuación en el presente documento. Las secuencias de estas v A p se han determinado mediante espectroscopia de masas como se describe en los Ejemplos y se presentan en las SEQ ID NO. 2-4.
VAP I, II y III como se denominan en el presente documento tienen las secuencias expuestas en las SEQ ID NO. 2, 3 y 4, respectivamente.
La VAP I tiene un tamaño de 117 aminoácidos y tiene un peso molecular de aproximadamente 15,5 kDa y μl de aproximadamente 3,5. Esta VAP es un fragmento de una proteína de cáscara de huevo de 439 aminoácidos, de 57 kDa (también conocida como proteína de zona pelúcida, SEQ ID NO. 5). VAP I puede proceder como alternativa de una proteína de zona pelúcida homóloga que comprende 467 residuos de aminoácidos (SEQ ID NO: 8).
La VAP II tiene un tamaño de 261 aminoácidos y tiene un peso molecular de aproximadamente 35 kDa y μl de aproximadamente 4,0. Esta VAP es un fragmento de una proteína de 524 aminoácidos, coriogenina H beta de 68 kDa (SEQ ID NO. 6).
La VAP III tiene un tamaño de 224 aminoácidos y tiene un peso molecular de aproximadamente 29 kDa y μl de aproximadamente 5,2. Esta VAP es un fragmento de una proteína de 438 aminoácidos, coriogenina L de 57 kDa (SEQ ID NO. 7).
Como se muestra en los Ejemplos y se ha analizado anteriormente, cada VAP puede existir en diversas isoformas.
Por tanto, se desvela un polipéptido en el presente documento que consiste en:
(i) una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de las SEQ ID NO. 2-4 o una secuencia que es al menos 50 % idéntica a dicha secuencia, o una parte de cualquiera de dichas secuencias; y opcionalmente (ii) una secuencia de aminoácidos flanqueante en el extremo N y/o C de la secuencia de aminoácidos en (i) que tiene de 1 a 100 aminoácidos de longitud.
Los "polipéptidos" como se denominan en el presente documento son moléculas preferentemente con más de 100, 150, 200 o 250 restos y/o menos de 400, 300 o 200 restos o un intervalo seleccionado de los mismos. Como se indica en el presente documento, una "parte" comprende preferentemente al menos 100, 150, 200 o más aminoácidos de la secuencia de la que procede. Dicha parte puede obtenerse de una parte central o N terminal o C terminal de la secuencia. En un aspecto preferido, dicha parte consiste en la secuencia de longitud completa de la que procede de la que se han eliminado al menos 1, 2, 3, 4 o 5 restos de aminoácidos, preferentemente del extremo N.
Como se indica en el presente documento, una "secuencia flanqueante" es una secuencia de aminoácidos que está unida en el extremo N o C terminal de la secuencia de aminoácidos central mediante enlaces peptídicos normales para formar una secuencia de aminoácidos continua (excepto como se modifica en equivalentes funcionales como se analiza a continuación en el presente documento). Una secuencia flanqueante puede estar presente en el extremo terminal N o C de la secuencia central de aminoácidos o puede estar presente en ambos extremos. La secuencia flanqueante puede ser tan corta como 1 aminoácido o tan larga como 100 aminoácidos, preferentemente de 1-50 (o de 5-100 o 10-50), por ejemplo, 1-25, por ejemplo, 1-5 aminoácidos de longitud. Cuando están presentes secuencias flanqueantes en los extremos terminales tanto N como C, estas pueden ser de la misma secuencia o de secuencias diferentes y pueden ser de la misma o diferente longitud. Las secuencias flanqueantes pueden proceder de la secuencia nativa de la que la VAP en cuestión es un fragmento o pueden tener menos de 80, 70, 60 o 50 % de identidad con la secuencia nativa en la parte comparable (véase, por ejemplo, secuencias nativas en relación con las SEQ ID NO. 2-4 provistas en las SEQ ID NO. 5-7, respectivamente y la SEQ ID NO: 8, que proporciona una secuencia nativa alternativa para la SEQ ID NO. 2).
La secuencia en la parte (i) anterior puede ser al menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntica a la secuencia (SEQ ID NO 2-8) con la que se compara.
La identidad de secuencia puede determinarse mediante, por ejemplo, el uso del banco de datos de secuencias de proteínas SWISS-PROT usando FASTA pep-cmp con un factor de pam variable y penalización de creación de hueco ajustada a 12,0 y penalización de extensión de hueco ajustada a 4,0 y una ventana de 2 aminoácidos. Preferentemente, dicha comparación se realiza sobre la longitud completa de la secuencia, pero puede realizarse sobre una ventana de comparación más pequeña, por ejemplo, menos de 200, 100 o 50 aminoácidos contiguos.
Preferentemente, dichos polipéptidos relacionados con la identidad de secuencia son funcionalmente equivalentes a los polipéptidos que se exponen en las SEQ ID NO. enumeradas. Dichos polipéptidos funcionalmente equivalentes pueden tomar la forma de derivados como se expone a continuación. De forma similar, los polipéptidos con secuencias como se exponen en las SEQ ID NO. pueden modificarse sin afectar a la secuencia del polipéptido como se describe a continuación.
Asimismo, las "partes" como se describen en el presente documento pueden ser funcionalmente equivalentes. Preferentemente, estas partes satisfacen las condiciones de identidad (en relación con una región comparable) mencionadas en el presente documento. Los polipéptidos desvelados en el presente documento, incluyendo partes y polipéptidos que incluyen las secuencias flanqueantes descritas anteriormente, pueden ser ácidos, por ejemplo, tener un μl de 3 a 5,5, preferentemente de 3,5 a 5,2.
Como se indica en el presente documento, para conseguir "equivalencia funcional" el polipéptido puede mostrar algo de eficacia reducida en la realización de la función médica o cosmética en relación con la molécula parental (es decir la molécula de la que procedió, por ejemplo, por sustitución de aminoácidos), pero preferentemente es tan eficaz o más. Por tanto, la equivalencia funcional se refiere a un polipéptido que es eficaz para tratar una afección o trastorno o para mejorar cosméticamente el estado y/o la apariencia de la piel como se indica en el presente documento, es decir, para reducir uno o más síntomas del paciente, por ejemplo, la apariencia, textura, grosor o contenido de humedad de la piel como se describe más adelante en el presente documento. Esto puede ensayarse por comparación de los efectos del polipéptido derivado en relación con el polipéptido del que procede de una manera cualitativa o cuantitativa, por ejemplo, realizando los análisis indicados en los Ejemplos. Cuando son posibles resultados cuantitativos, el derivado tiene al menos 30, 50, 70 o 90 % de eficacia del polipéptido parental.
Pueden obtenerse proteínas funcionalmente equivalentes que están relacionadas con o proceden de la proteína de origen natural modificando la secuencia de aminoácidos nativa mediante sustituciones, adiciones y/o supresiones de aminoácidos sencillas o múltiples (por ejemplo, 2-20, preferentemente 2-10) (siempre que satisfagan los requisitos de identidad de secuencia mencionados anteriormente), pero sin destruir la función de la molécula. Dichas proteínas están codificadas por "moléculas de ácido nucleico funcionalmente equivalentes" que se generan por sustitución, adición y/o supresión apropiada de una o más bases.
Los equivalentes funcionales pueden ser variantes de "adición" en las que se generan proteínas o polipéptidos de fusión amino y/o carboxilo terminales, que comprenden una proteína o polipéptido adicional fusionado con el polipéptido parental. Como se ha descrito anteriormente, cualquier secuencia que, cuando se añade al polipéptido central, forma una secuencia de aminoácidos contigua está limitada a las secuencias flanqueantes como se ha descrito anteriormente.
Otros equivalentes funcionales pueden ser variantes de "supresión" o "truncamiento" en las que se generan proteínas o polipéptidos en los que se han eliminado restos amino y/o carboxilo terminales del polipéptido central. Por ejemplo, pueden eliminarse restos del extremo amino, en donde se eliminan al menos 1, 2, 3, 4 o 5 restos de aminoácidos. Dichos equivalentes funcionales son partes como las descritas anteriormente en el presente documento.
Las variantes funcionalmente equivalentes pueden ser variaciones biológicas naturales (por ejemplo, variantes alélicas o variaciones geográficas dentro de una especie o como alternativa en diferentes géneros, por ejemplo, plantas, animales o bacterias, particularmente peces, particularmente de la familia Salmonidae, especialmente las subfamilias Salmo y Oncorhynchus) y derivados preparados utilizando técnicas conocidas. Por ejemplo, pueden producirse moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas funcionalmente equivalentes mediante síntesis química o en forma recombinante utilizando las técnicas conocidas de mutagénesis dirigida, incluyendo supresión, mutagénesis aleatoria o escisión enzimática y/o ligamiento de ácidos nucleicos.
También se desvela en el presente documento una molécula de ácido nucleico que consta de una secuencia de nucleótidos que codifica solo un polipéptido como se ha descrito anteriormente o una secuencia complementaria de la misma.
Por ejemplo, en el presente documento se desvela una molécula de ácido nucleico que consiste en:
(i) una secuencia de nucleótidos como se expone en una cualquiera de las SEQ ID NO. 10-12, una secuencia que es al menos 50 % idéntica a dicha secuencia o una secuencia que hibrida con dicha secuencia en condiciones de unión no rigurosas de SSC 6 x/formamida al 50 % a temperatura ambiente y lavado en condiciones de alta rigurosidad, por ejemplo, SSC 2 x, 65 °C, donde SSC = NaCl 0,15 M, citrato de sodio 0,015 M, pH 7,2, o una secuencia complementaria de cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente, o una parte de las mismas; y opcionalmente
(ii) una secuencia de nucleótidos flanqueante en el extremo 5 'o 3' de la secuencia de nucleótidos en (i) que tiene una longitud de 1 a 300 nucleótidos,
o una secuencia complementaria de la misma.
Las "moléculas de ácido nucleico" como se denominan en el presente documento son moléculas preferentemente con más de 300, 450, 600 o 750 bases y/o menos de 1200, 900 o 600 bases o un intervalo seleccionado de los mismos. Las "partes" como se ha indicado anteriormente, preferentemente comprenden al menos 300, 450 o 600 bases de nucleótidos de la secuencia de la que proceden. Preferentemente, dichas partes codifican péptidos N-terminales, centrales o C-terminales como se ha descrito anteriormente en el presente documento. En un aspecto preferido, dicha parte consta de la secuencia de longitud completa de la que procede de la que se han eliminado al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 bases, preferentemente del extremo 5'.
Como se indica en el presente documento, una "secuencia flanqueante" es una secuencia de nucleótidos que está unida en el extremo 5' o 3' terminal de la secuencia de nucleótidos central mediante enlaces fosfodiéster normales para formar una secuencia de nucleótidos continua (excepto como se modifica en equivalentes funcionales como se analiza a continuación en el presente documento). Una secuencia flanqueante puede estar presente en el extremo 5' o 3' terminal de la secuencia de nucleótidos central o puede estar presente en ambos extremos. La secuencia flanqueante puede ser tan corta como 1 nucleótido o tan larga como 300 nucleótidos, preferentemente de 1-150 (o de 15-300 o 30-150), por ejemplo, 1-75, por ejemplo, 1-15 nucleótidos de longitud. Cuando están presentes secuencias flanqueantes en los extremos terminales tanto 5' como 3', estas pueden ser de la misma secuencia o de secuencias diferentes y pueden ser de la misma o diferente longitud. Las secuencias flanqueantes pueden proceder de la secuencia nativa de la que la secuencia codificante de VAP en cuestión es un fragmento o pueden tener menos de 80, 70, 60 o 50 % de identidad con la secuencia codificante nativa en la parte comparable (véase, por ejemplo, secuencias nativas en relación con las SEQ ID NO. 10-12 provistas en las SEQ ID NO 13-15, respectivamente y la SEQ ID NO: 16, que proporciona una secuencia nativa alternativa para la SEQ ID NO. 10).
La secuencia en la parte (i) anterior puede ser al menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntica a la secuencia (SEQ ID NO 10-16) con la que se compara.
La identidad de secuencia puede determinarse mediante, por ejemplo, búsqueda de FASTA usando paquetes GCG, con valores por defecto y un factor de pam variable, y penalización de creación de huecos establecida en 12,0 y penalización de extensión de huecos establecida en 4,0 con una ventana de 6 nucleótidos.
Preferentemente, dichas moléculas de ácido nucleico relacionadas con la identidad de secuencia o hibridantes son funcionalmente equivalentes a las moléculas de ácido nucleico que se exponen en las SEQ ID NO. enumeradas. Dichas moléculas de ácido nucleico funcionalmente equivalentes pueden tomar la forma de derivados como se expone posteriormente y se consideran funcionalmente equivalentes si codifican polipéptidos que se considerarían equivalentes funcionales según los ensayos descritos anteriormente en el presente documento. Son equivalentes funcionales preferidos los que codifican los polipéptidos preferidos como se ha expuesto anteriormente, por ejemplo, moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos hallados en géneros o especies diferentes a las moléculas específicas mencionadas en el presente documento.
Asimismo, las "partes" como se describen en el presente documento pueden ser funcionalmente equivalentes. Preferentemente, estas partes satisfacen las condiciones de identidad (en relación con una región comparable) o hibridación mencionadas en el presente documento. Las moléculas de ácido nucleico desveladas en el presente documento, incluyendo partes y secuencias de nucleótidos que incluyen las secuencias flanqueantes descritas anteriormente, pueden codificar polipéptidos ácidos como se ha descrito anteriormente en el presente documento.
Las moléculas de ácido nucleico desveladas en el presente documento pueden ser ADN monocatenario o bicatenario, ADNc o ARN, preferentemente ADN e incluyen secuencias degradadas, sustancialmente idénticas e hibridantes como se ha descrito anteriormente. Sin embargo, idealmente las moléculas son ADN o ADNc.
Los polipéptidos desvelados en el presente documento incluyen los que se modifican sin afectar a la secuencia del polipéptido, por ejemplo, por modificación química, incluyendo por desglucosilación o glucosilación. Dichos polipéptidos pueden prepararse mediante modificación posterior a la síntesis/aislamiento del polipéptido sin afectar a la funcionalidad, por ejemplo, determinada glucosilación, metilación, etc. de restos particulares.
Los polipéptidos desvelados en el presente documento también pueden tomar la forma de peptidomiméticos que pueden considerarse derivados en los que se conservan las características funcionales del polipéptido pero se presentan en el contexto de una estructura diferente, por ejemplo, no peptídica. Dichos peptidomiméticos se han desarrollado y utilizado con éxito para otras aplicaciones médicas particulares.
Los peptidomiméticos, particularmente moléculas no peptídicas pueden generarse mediante diversos procesos, incluyendo diseño de fármacos basado en la conformación, exploración, diseño de bibliotecas centrado y química medicinal clásica. No solo se pueden utilizar oligómeros de aminoácidos no naturales u otros componentes básicos orgánicos, sino que también se pueden utilizar carbohidratos, compuestos heterocíclicos o macrocíclicos o cualquier molécula orgánica que comprenda elementos estructurales y conformación que proporcione una superficie electrostática molecular que imite las mismas propiedades de la conformación tridimensional del péptido mediante métodos conocidos en la técnica.
Por tanto, los peptidomiméticos pueden tener poco o ningún parecido con una cadena principal peptídica. Los peptidomiméticos pueden comprender una forma no peptídica completamente sintética (por ejemplo, basada en una cadena principal de carbohidratos con sustituyentes apropiados) o pueden conservar uno o más elementos del péptido en el que se basa, por ejemplo, derivatizando uno o más aminoácidos o reemplazando uno o más aminoácidos con componentes alternativos no peptídicos. Los moldes de tipo peptídico incluyen pseudopéptidos y péptidos cíclicos. Los elementos estructurales considerados redundantes para la función del péptido pueden minimizarse para conservar una función de armazón solamente o eliminarse cuando sea apropiado.
Cuando los peptidomiméticos conservan uno o más elementos peptídicos, es decir, más de un aminoácido, dichos aminoácidos pueden reemplazarse con un análogo no convencional o estructural del mismo. Los aminoácidos conservados en las secuencias también pueden derivatizarse o modificarse (por ejemplo, marcarse, glucosilarse o metilarse) siempre que se conserven las propiedades funcionales de los polipéptidos desvelados en el presente documento. Se indica que los peptidomiméticos "pueden obtenerse de" una determinada secuencia polipeptídica. Con esto se quiere decir que el peptidomimético está diseñado en referencia a una secuencia polipeptídica definida, de modo que conserva las características estructurales del péptido que son esenciales para su función. Estas pueden ser las cadenas laterales particulares del polipéptido o el potencial de enlace de hidrógeno de la estructura. Dichas características pueden ser proporcionadas por componentes no peptídicos o uno o más de los restos de aminoácidos o los enlaces que unen dichos restos de aminoácidos del polipéptido pueden modificarse para mejorar determinadas funciones del polipéptido tales como estabilidad o resistencia a la proteasa, conservando al mismo tiempo las características estructurales del polipéptido que son esenciales para su función.
Son ejemplos de aminoácidos análogos no convencionales o estructurales que pueden usarse aminoácidos D, isósteros de amida (tales como N-metil amida, amida retro-inversa, tioamida, tioéster, fosfonato, cetometileno, hidroximetileno, fluorovinilo, (E)-vinilo, metilenamino, metilentio o alcano), L-N metilaminoácidos, D-a metilaminoácidos, D-N-metilaminoácidos. Se enumeran ejemplos de aminoácidos no convencionales en la Tabla 1.
TABLA 1
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(continuación)
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Los aminoácidos no convencionales que pueden usarse incluyen análogos restringidos conformacionalmente, por ejemplo, tales como Tic (para reemplazar F), Aib (para reemplazar A) o ácido pipecólico (para reemplazar Pro).
Los polipéptidos y las moléculas de ácido nucleico analizadas anteriormente también incluyen derivados que se han modificado, por ejemplo, para facilitar su uso en aplicaciones farmacéuticas (analizadas posteriormente), por ejemplo, mediante la adición de grupos de dirección o funcionales, por ejemplo, para mejorar la lipofilia, ayudar al transporte celular, la solubilidad y/o la estabilidad. Por tanto, pueden conjugarse oligosacáridos, ácidos grasos, alcoholes grasos, aminoácidos, péptidos o polipéptidos con los polipéptidos o moléculas de ácido nucleico mencionados anteriormente. Las moléculas de ácido nucleico pueden estar presentes en un vehículo vírico como se describe posteriormente en el presente documento.
Los derivados polipeptídicos pueden estar en forma de "profármacos" o "propéptidos" de modo que el componente añadido se pueda eliminar mediante escisión una vez administrado, por ejemplo, mediante escisión de un sustituyente añadido mediante esterificación que puede eliminarse por la acción de esterasas. Dichos profármacos incluyen precursores nativos de las proteínas de origen natural que se escinden, por ejemplo, por proteólisis para producir el polipéptido de interés. Dichos precursores pueden estar inactivos en la forma precursora, pero pueden activarse mediante escisión proteolítica. Sin embargo, cualquier secuencia que, cuando se añade al polipéptido central, forma una secuencia de aminoácidos contigua está limitada a las secuencias flanqueantes como se ha descrito anteriormente. Como alternativa, pueden tener secuencias flanqueantes más largas, siempre que no se extiendan a moléculas que son la secuencia nativa de la que procede el fragmento de VAP (por ejemplo, las SEQ ID NO. 5-8 en relación con las secuencias de aminoácidos y las SEQ ID NO. 13-16 para las secuencias de nucleótidos) o una secuencia con al menos 50, 60, 70, 80 o 90 % de identidad de secuencia con esa secuencia en la parte comparable.
Las moléculas de ácido nucleico desveladas en el presente documento pueden codificar por tanto dichos profármacos o precursores. Sin embargo, cualquier secuencia que, cuando se añade al polinucleótido central, forme una secuencia de nucleótidos contigua está limitada a secuencias flanqueantes como se ha descrito anteriormente. Como alternativa, pueden ser secuencias flanqueantes más largas, siempre que no se extiendan a moléculas que son la secuencia nativa de la que procede el fragmento de VAP o una secuencia con al menos 50, 60, 70, 80 o 90 % de identidad de secuencia con esa secuencia en la parte comparable.
Los polipéptidos o las moléculas de ácido nucleico modificados como se ha descrito anteriormente pueden ensayarse para asegurar que conservan la actividad funcional en relación con la molécula no modificada determinando si tienen los mismos o similares efectos médicos o cosméticos.
Las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente se pueden unir operativamente con una secuencia de control de expresión o un vehículo o vector de clonación de ADN recombinante que contiene dicha molécula de ADN recombinante. Esto permite la expresión intracelular de un polipéptido desvelado en el presente documento como un producto génico, cuya expresión está dirigida por el (los) gen(es) introducido(s) en células de interés. La expresión génica se dirige desde un promotor activo en las células de interés y puede insertarse en cualquier forma de vector de ADN lineal o circular para su incorporación en el genoma o para replicación independiente o transfección/expresión transitoria. Están bien descritas en la bibliografía técnicas adecuadas de transformación o transfección. Como alternativa, la molécula de ADN desnuda puede introducirse directamente en la célula para los usos descritos en el presente documento.
Los vectores de expresión apropiados incluyen secuencias de control apropiadas tales como, por ejemplo, elementos de control de la traducción (por ejemplo, codones de inicio y parada, sitios de unión a ribosomas) y de la transcripción (por ejemplo, regiones promotor-operador, secuencias de parada de terminación) unidas en un marco de lectura correspondiente con las moléculas de ácido nucleico necesarias para la ejecución del método como se describe más adelante en el presente documento. Los vectores apropiados pueden incluir plásmidos y virus (incluyendo virus tanto bacteriófagos como eucariotas). Los vectores víricos adecuados incluyen baculovirus y también adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes y vaccinia/viruela. Se describen en la técnica muchos otros vectores víricos. Los vectores preferidos incluyen vectores de expresión bacterianos y de mamíferos pGEX-KG, pEF-neo y pEF-HA. La molécula de ácido nucleico puede fusionarse convenientemente con ADN que codifica un polipéptido adicional, por ejemplo, glutatión-S-transferasa, para producir una proteína de fusión tras su expresión.
Por tanto, se desvela en el presente documento un vector, preferentemente un vector de expresión, que comprende una molécula de ácido nucleico como se ha definido anteriormente.
Se desvelan en el presente documento métodos para preparar moléculas de ácido nucleico recombinante, que comprenden insertar secuencias de nucleótidos descritas anteriormente que codifican los polipéptidos desvelados en el presente documento en ácido nucleico de vector.
En métodos como los descritos a continuación en el presente documento, los polipéptidos pueden administrarse a una célula mediante transfección de una célula con una molécula de ácido nucleico como se describe en el presente documento.
Puede introducirse moléculas de ácido nucleico desveladas en el presente documento, preferentemente contenidas en un vector, en una célula por cualquier medio apropiado. Están bien descritas en la bibliografía técnicas adecuadas de transformación o transfección. Se conocen una diversidad de técnicas y estas pueden usarse para introducir dichos vectores en células procariotas o eucariotas para expresión. Las células hospedadoras preferidas para este fin incluyen líneas celulares de insectos, líneas celulares eucariotas o E. coli, tales como la cepa BL21/DE3. Por tanto, se desvelan en el presente documento células hospedadoras procariotas o eucariotas transformadas o transfectadas que contienen una molécula de ácido nucleico, particularmente un vector como se ha definido anteriormente.
Se desvela en el presente documento un método para preparar un polipéptido como se ha definido anteriormente en el presente documento, que comprende cultivar una célula hospedadora que contiene una molécula de ácido nucleico como se ha definido anteriormente, en condiciones por las que dicho polipéptido se expresa y recuperar dicha molécula producida de este modo.
También se desvelan en el presente documento células que producen y secretan polipéptidos descritos anteriormente, pero que se han modificado en relación con las células nativas mediante la expresión de material de ácido nucleico codificante.
Los polipéptidos o moléculas de ácido nucleico utilizados en composiciones y usos de la invención como se describe a continuación en el presente documento pueden obtenerse o proceder de fuentes de origen natural o pueden generarse total o parcialmente de forma sintética.
Convenientemente, los polipéptidos y las moléculas de ácido nucleico se aíslan de acuerdo con los protocolos descritos en los Ejemplos y a continuación o como se describe en Yasumasu et al., 1989, J. Biochem., 105, p212-218 en relación con coriolisina.
Por tanto, se desvela en el presente documento un método para aislar uno o más polipéptidos (VAP o secuencias relacionadas) como se describe en el presente documento a partir del líquido de eclosión (por ejemplo, de salmón) que comprende al menos las etapas de:
a) suspender huevos en un volumen mínimo de agua (por ejemplo, menos que el volumen de los huevos); b) inducir la eclosión rápida, sincronizada de dichos huevos (preferentemente de modo que la eclosión se complete en menos de 3 horas para más del 95 % de los embriones);
c) filtrar los huevos en eclosión para obtener líquido de eclosión;
d) añadir acetona a dicho líquido de eclosión a una concentración final de 80 % v/v; y
e) someter dicho líquido a centrifugación a baja velocidad en donde dicho(s) polipéptido(s) está(n) presente(s) en el sedimento formado de este modo; y opcionalmente
f) separar los polipéptidos presentes en el sedimento de la etapa e) para aislar polipéptidos individuales, por ejemplo, mediante el uso de una columna de intercambio iónico.
Una columna de intercambio iónico preferida es una columna DEAE-Sepharose® CL-6B, sin embargo, están fácilmente disponibles alternativas adecuadas.
Preferentemente, dicho líquido de eclosión es de peces, especialmente Salmonidae, particularmente Salmo, por ejemplo, Salmo salar (salmón del Atlántico) y Oncorhynchus (salmón del Pacífico).
Los polipéptidos o las moléculas de ácido nucleico desvelados en el presente documento están preferentemente sustancialmente libres de cualquier componente contaminante procedente del material o materiales fuente utilizados en el procedimiento de aislamiento o en su preparación sintética. Especialmente de forma preferente el compuesto se purifica hasta un grado de pureza de más de 50 o 60 %, por ejemplo, > 70, 80 o 90 %, preferentemente más de 95 o 99 % de pureza como se ha evaluado p/p (peso seco). Dichos niveles de pureza corresponden a las moléculas específicas de interés, pero incluyen sus productos de degradación. Cuando sea adecuado, pueden usarse preparaciones que tengan menor pureza, por ejemplo, que contengan más de 1, 2, 5 o 10 % de la molécula de interés, por ejemplo, más de 20 o 30 %. Los polipéptidos desvelados en el presente documento pueden purificarse mediante, por ejemplo, cromatografía (por ejemplo, HPLC, de exclusión por tamaño, de intercambio iónico, de afinidad, de interacción hidrófoba, de fase inversa) o electroforesis capilar.
Los polipéptidos pueden generarse de forma sintética, por ejemplo, mediante ligamiento de péptidos generados sintéticamente más pequeños o más convenientemente mediante expresión recombinante de una molécula de ácido nucleico que codifica dicho polipéptido como se ha descrito anteriormente en el presente documento.
Las moléculas de ácido nucleico pueden generarse de forma sintética, por ejemplo, mediante amplificación de una secuencia de ácido nucleico como se describe en el presente documento. Los polipéptidos de VAP y las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento pueden usarse como se describe posteriormente en el presente documento para efectuar diversos efectos cosméticos y/o médicos.
Además, pueden usarse proteínas más largas (y sus secuencias codificantes) que incluyen los fragmentos descritos anteriormente, tales como las proteínas nativas de longitud completa, para los procesos descritos posteriormente en el presente documento. Por tanto, para los usos descritos posteriormente, el polipéptido que puede usarse se extiende a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de las secuencias N.° 2-8 o una secuencia que es al menos 50 % idéntica a dicha secuencia, o una parte de cualquiera de dichas secuencias.
Las definiciones en lo que se refiere a polipéptidos, partes, identidad de secuencia y proteínas funcionalmente equivalentes se aplican de manera similar y también son aplicables valores de identidad de secuencia preferidos como se ha expuesto anteriormente. Preferentemente, los polipéptidos son fragmentos de las proteínas nativas (opcionalmente con secuencias flanqueantes) como se ha descrito anteriormente en el presente documento. De forma similar, para los usos descritos posteriormente, las moléculas de ácido nucleico que pueden utilizarse se extienden a moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido como se ha descrito anteriormente o un polipéptido más largo como se ha descrito anteriormente o una secuencia complementaria del mismo. Los usos pueden realizarse con fragmentos de las secuencias codificantes nativas (opcionalmente con secuencias flanqueantes) como se ha descrito anteriormente en el presente documento.
Por tanto, para los usos descritos posteriormente, la molécula de ácido nucleico que puede usarse se extiende a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos como se expone en una cualquiera de las SEQ ID NO. 10-16 una secuencia que es al menos 50 % idéntica a dicha secuencia o una secuencia que hibrida con dicha secuencia en condiciones de unión no rigurosas de SSC 6 x/formamida al 50 % a temperatura ambiente y lavado en condiciones de alta rigurosidad, por ejemplo, SSC 2 x, 65 °C, donde SSC = NaCl 0,15 M, citrato de sodio 0,015 M, pH 7,2, o una secuencia complementaria de cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente, o una parte de cualquiera de dichas secuencias.
Además de las VAP descritas anteriormente, también se ha descubierto que una proteína adicional que hallada en el líquido de eclosión de peces tiene usos cosméticos y/o médicos ventajosos que son complementarios de los de las vAp , a saber, coriolisina L como se ha analizado anteriormente en el presente documento.
Por tanto, pueden usarse polipéptidos o moléculas de ácido nucleico como se ha desvelado en el presente documento ex vivo o in vitro, en partes o productos animales, por ejemplo, muestras cutáneas, particularmente cuando se contempla que estos se reintroducirán en el cuerpo del que proceden, por ejemplo, en forma de un injerto cutáneo.
Sin embargo, los polipéptidos y las moléculas de ácido nucleico como se desvelan en el presente documento se prefieren para su uso in vivo como se analiza en más detalle a continuación.
Los polipéptidos y las moléculas de ácido nucleico como se describen en el presente documento tienen aplicaciones para el tratamiento de diversas anomalías, trastornos o afecciones como se describe posteriormente en el presente documento.
Por tanto, se desvela una composición farmacéutica en el presente documento que comprende un polipéptido o una molécula de ácido nucleico como se ha descrito anteriormente en el presente documento y uno o más excipientes y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables.
En consecuencia, la presente invención proporciona una composición farmacéutica o cosmética que comprende un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO. 1 y uno o más excipientes y/o diluyentes farmacéutica o cosméticamente aceptables, en donde la composición es un gel o emulsión.
Las referencias a una composición farmacéutica en el presente documento pueden entenderse como inclusivas de composiciones cosméticas.
Por "farmacéuticamente aceptable" o "fisiológicamente aceptable" se entiende que el ingrediente debe ser compatible con otros ingredientes en la composición, así como fisiológicamente aceptable para el receptor.
El principio activo para administración puede modificarse de forma apropiada para su uso en una composición farmacéutica. Por ejemplo, los compuestos utilizados de acuerdo con la invención pueden estabilizarse contra la degradación mediante el uso de derivados como se ha descrito anteriormente.
El principio activo también puede estabilizarse en las composiciones, por ejemplo, mediante el uso de aditivos apropiados tales como sales o no electrolitos, tampones de acetato, Tris, fosfato o acetato, manitol, glicina, HSA (seroalbúmina humana) o polisorbato.
La molécula de ácido nucleico o el polipéptido como se describe en el presente documento puede estar presente en dicha composición como el único principio activo o puede combinarse con otros ingredientes, particularmente otros principios activos, por ejemplo, para aumentar el efecto terapéutico o para hacer que la composición sea más atractiva para el consumidor. Dicho otro componente puede ser una de las VAP descritas anteriormente o un componente alternativo.
La composición que comprende uno o más polipéptidos o moléculas de ácido nucleico descritos en el presente documento también puede comprender impurezas, por ejemplo, después de la preparación de dichos uno o más polipéptidos o moléculas de ácido nucleico de fuentes naturales. En composiciones que comprenden dichos uno o más polipéptidos o moléculas de ácido nucleico como se describe en el presente documento, cada uno de dichos polipéptido(s) o molécula(s) de ácido nucleico puede estar presente en el intervalo de 0,0001 a 30 % p/p de la composición farmacéutica. Preferiblemente dicho(s) polipéptido(s) o molécula(s) de ácido nucleico está(n) presente(s) en un intervalo de 0,01-10 % o como se describe posteriormente en el presente documento.
En un aspecto adicional la invención proporciona una composición farmacéutica o cosmética que comprende un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO. 1 y uno o más excipientes y/o diluyentes farmacéutica o cosméticamente aceptables, para su uso en terapia.
Como se ha mencionado anteriormente, los polipéptidos y las moléculas de ácido nucleico descritos en el presente documento presentan propiedades terapéuticas en el tratamiento de anomalías, trastornos o dolencias cutáneos, hidratando y/o exfoliando la piel.
Las anomalías, afecciones o trastornos cutáneos preferidos para tratar son piel seca, piel en la que la capa córnea es más gruesa de lo deseable, por ejemplo, en afecciones de hiperqueratosis, o piel con pigmentación indeseable en la epidermis, por ejemplo, manchas cutáneas, de la edad, solares u oscuras. Los tratamientos pueden ser cosméticos, por ejemplo el tratamiento de piel normal pero seca o engrosamiento de la piel (tal como callos, helomas o verrugas hiperqueratóticas) o tratamiento de trastornos de pigmentación, tales como manchas cutáneas, o terapéuticos, por ejemplo, para tratar el acné, eccema, psoriasis o verrugas que provocan dolor.
Como se indica en el presente documento, un "trastorno" se refiere a una alteración patológica subyacente en un organismo sintomático o asintomático en relación con un organismo normal, que puede resultar, por ejemplo, de infección o una imperfección genética adquirida o congénita. Una "anomalía" o "afección" se refiere a una irregularidad o un defecto en la piel en relación con piel óptima normal pero que no es el resultado de una alteración patológica. El defecto/irregularidad puede resultar en su lugar de la edad, la lesión, los factores ambientales, los niveles hormonales, la medicación, los materiales aplicados externamente o ingeridos, condiciones genéticas o una diversidad de factores adicionales que conducen al funcionamiento anómalo de la piel que da como resultado irregularidades.
El trastorno, anomalía o afección puede ser únicamente cosmético o no cosmético que requiera tratamiento médico, o una combinación de los mismos.
Como se indica en el presente documento, se entiende que "cosmético" se refiere a un tratamiento que no cura, trata ni previene una enfermedad o trastorno, sino que en su lugar actúa como un producto de cuidado de la piel o para modificar o mejorar la apariencia de la piel, por ejemplo, el color, la textura o el contenido de humedad de la piel.
Un ingrediente "no cosmético" (o médico) usado en tratamientos médicos como se describe en el presente documento sirve para curar, mitigar, tratar o prevenir uno o más síntomas del trastorno, por ejemplo, dolor o incomodidad.
La base de los tratamientos descritos en el presente documento es los efectos hidratantes y exfoliantes de la piel de las VAP y/o coriolisina como se desvela en el presente documento. Estos efectos se han mostrado en los Ejemplos proporcionados en el presente documento.
Por tanto, se desvelan en el presente documento tratamientos basados en las propiedades hidratantes y/o exfoliantes de las VAP y/o coriolisina.
La invención proporciona por tanto un método cosmético de exfoliación y/o hidratación de la piel de un animal, en donde un polipéptido o composición farmacéutica se administra a dicho animal, en donde:
(a) dicho polipéptido comprende un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO. 1; y
(b) dicha composición farmacéutica comprende el polipéptido de (a) y uno o más excipientes y/o diluyentes farmacéutica o cosméticamente aceptables.
Como se indica en el presente documento, "exfoliar" se refiere a retirar células superficiales de una superficie de epitelio que en la piel equivale a raspado o descamación de la capa córnea de la epidermis. "Hidratar" como se indica en el presente documento abarca hidratantes que evitan la pérdida de agua de la piel así como hidratantes (humectantes) que atraen y retienen agua cuando se aplica a la piel y emolientes (que mejoran la descamación defectuosa).
Dicho de manera alternativa, un polipéptido o composición farmacéutica desvelado en el presente documento puede encontrar utilidad para exfoliar y/o hidratar la piel de un animal en donde:
(a) dicho polipéptido comprende un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO. 1; y
(b) dicha composición farmacéutica comprende el polipéptido de (a) y uno o más excipientes y/o diluyentes farmacéutica o cosméticamente aceptables.
Como se ha mencionado anteriormente, dichas propiedades exfoliantes y/o hidratantes son ventajosas para tratar o prevenir una diversidad de anomalías, trastornos o afecciones cutáneos.
En un aspecto preferido, la anomalía, afección o trastorno cutáneo para tratar o prevenir es piel seca. Este puede tratarse mediante hidratación y/o exfoliación.
La "piel seca" como se indica en el presente documento se refiere a una epidermis que carece de humedad o sebo, con frecuencia caracterizada por un patrón de líneas finas, descamación y prurito. La piel seca puede aparecer como una afección cutánea en sí misma (por ejemplo, debido a la edad, daño por calor/frío/sequedad) o puede ser el síntoma de un trastorno o afección cutáneo tal como daño por el sol, eccema, dermatitis de contacto, psoriasis o ictiosis (una afección heredada que provoca descamación notable de la piel).
En un aspecto preferido adicional, la anomalía, afección o trastorno para tratar o prevenir es el engrosamiento de las capas córneas de la piel. Este puede tratarse mediante hidratación y/o exfoliación.
Dichas capas córneas engrosadas de la piel pueden aparecer en afecciones tales como callos o helomas que son almohadillas protectoras compuestas de la capa superior engrosada de la piel debido a roce repetido del área o verrugas en la piel. Dichos métodos también pueden usarse para tratar o prevenir el acné que implica queratinización en su patología. Las capas córneas engrosadas de la piel pueden ser la afección en sí misma o pueden ser un síntoma de una afección o trastorno cutáneo.
En un aspecto preferido adicional, la anomalía, afección o trastorno para tratar o prevenir es un trastorno o anomalía de la pigmentación de la piel. Este puede tratarse mediante exfoliación.
Los trastornos o anomalías de la pigmentación de la piel pueden producirse como resultado de la edad, cambios hormonales, factores genéticos, enfermedad o el sol u otro daño. La pigmentación alterada puede resultar de un exceso local de melanocitos o aumentos de la actividad de los melanocitos, o ambos. Los trastornos de la pigmentación incluyen manchas cutáneas, solares o de la edad (léntigo solar) y otras imperfecciones tales como pecas.
Como se indica en el presente documento, "anómalo" se determina en relación con piel óptima normal, es decir, piel sana, hidratada, con pigmentación normal y no envejecida.
En una exposición alternativa adicional, la invención proporciona un polipéptido, molécula de ácido nucleico o composición farmacéutica para su uso en el tratamiento o prevención de una afección o trastorno de la piel de un animal en donde dicha piel está anormalmente seca, la capa córnea de la piel está anormalmente engrosada o la piel tiene un trastorno de la pigmentación o eccema, dermatitis de contacto, psoriasis, ictiosis o acné, en donde:
(a) dicho polipéptido comprende un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO. 1; y
(b) dicha composición farmacéutica comprende el polipéptido de (a) y uno o más excipientes y/o diluyentes farmacéutica o cosméticamente aceptables.
En un aspecto preferido, los usos médicos y cosméticos se consiguen mediante la administración tópica a la piel.
Preferentemente, para indicaciones médicas o cosméticas dependientes, al menos en parte, de los efectos de exfoliación de los principios activos, las composiciones farmacéuticas usadas para este fin comprenden coriolisina (o sus secuencias relacionadas como se describe en el presente documento).
Preferentemente, para indicaciones médicas o cosméticas dependientes, al menos en parte, de los efectos hidratantes de los principios activos, las composiciones farmacéuticas usadas para este fin también comprenden una o más VAP (o sus secuencias relacionadas como se describe en el presente documento).
Por tanto, en un aspecto particularmente preferido, la coriolisina puede usarse para tratar trastornos en los que la piel está anormalmente seca, la capa córnea de la piel está anormalmente engrosada o en los que está presente un defecto de la pigmentación, por ejemplo, callos, helomas, verrugas, eccema, dermatitis de contacto, psoriasis, ictiosis, acné y manchas cutáneas.
Se pueden usar una o más VAP (o sus secuencias relacionadas como se describe en el presente documento) para tratar trastornos en los que la piel está anormalmente seca.
Como se usa en el presente documento, el "tratamiento" se refiere a la reducción, alivio o eliminación, preferentemente hasta niveles normales, de uno o más de los síntomas o efectos de dicha afección o trastorno, por ejemplo la presencia o alcance de sequedad o engrosamiento de la piel, alcance o área de pigmentación, prurito o dolor, etc. en relación con los síntomas o efectos presentes en una parte diferente del cuerpo de dicho individuo donde la piel no padece dicha afección o trastorno y no sometido a dicho tratamiento o en un individuo normal correspondiente no sometido a dicho tratamiento.
La "prevención" se refiere a la prevención absoluta o reducción o alivio del alcance o momento (por ejemplo retardo) de la aparición de ese síntoma o efecto. Por ejemplo, las afecciones tipificadas por sequedad, engrosamiento o pigmentación anómala de la piel pueden prevenirse mediante la aplicación regular de composiciones de la invención antes de la aparición de dicha afección.
Dichos tratamientos se consiguen usando polipéptidos desvelados en el presente documento.
El método de tratamiento o prevención desvelado en el presente documento puede combinarse provechosamente con la administración de uno o más principios activos que son eficaces en el tratamiento o la prevención de los trastornos o afecciones y/o para conseguir hidratación o exfoliación. Por tanto, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden contener adicionalmente uno o más de dichos principios activos.
También se desvelan productos que contienen uno o más polipéptidos o moléculas de ácido nucleico como se definen en el presente documento y opcionalmente uno o más principios activos adicionales como una preparación combinada para su uso simultáneo, separado o secuencial en terapia humana o animal, preferentemente como se describe en el presente documento.
Las composiciones de la invención se pueden formular de una manera convencional con uno o más vehículos, excipientes y/o diluyentes fisiológicamente aceptables, según técnicas bien conocidas en este campo usando ingredientes fácilmente disponibles.
Por tanto, se puede incorporar el principio activo, opcionalmente junto con otras sustancias activas como una preparación combinada, con uno o más vehículos, diluyentes y/o excipientes convencionales, para producir preparaciones galénicas convencionales tales como comprimidos, píldoras, polvos, grageas, sobrecitos, obleas, elixires, suspensiones (como líquidos de inyección o infusión), emulsiones, soluciones, jarabes, aerosoles (como un sólido o en un medio líquido), pomadas, cápsulas de gelatina blanda y dura, supositorios, soluciones inyectables estériles, polvos envasados estériles y similares. También pueden usarse polímeros biodegradables (tales como poliésteres, polianhídridos, ácido poliláctico o ácido poliglicólico) para implantes sólidos. Las composiciones pueden estabilizarse mediante el uso de liofilización, subenfriamiento o Permazyme.
Son excipientes, vehículos o diluyentes adecuados lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidones, goma arábiga, fosfato de calcio, carbonato de calcio, lactosa de calcio, almidón de maíz, alginatos, tragacanto, gelatina, silicato de calcio, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, celulosa, jarabe acuoso, agua, agua/etanol, agua/glicol, agua/polietileno, glicol, propilenglicol, metilcelulosa, hidroxibenzoatos de metilo, hidroxibenzoatos de propilo, talco, estearato de magnesio, aceite mineral o sustancias grasas tales como grasa dura o mezclas adecuadas de los mismos. También pueden usarse agentes para obtener formulaciones de liberación sostenida, tales como carboxipolimetileno, carboximetilcelulosa, acetato ftalato de celulosa o polivinilacetato.
Las composiciones pueden incluir adicionalmente agentes lubricantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes que aumentan la viscosidad, agentes de granulación, agentes disgregantes, agentes aglutinantes, agentes osmoticoactivos, agentes de suspensión, agentes conservantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, potenciadores de la adsorción (por ejemplo, agentes de penetración de superficie o para administración nasal, por ejemplo, sales biliares, lecitinas, tensioactivos, ácidos grasos, quelantes), agentes de oscurecimiento, disolvente orgánico, antioxidante, agentes estabilizantes, emolientes, silicona, alfa-hidroxiácido, demulcente, agente antiespumante, agente hidratante, vitamina, aroma, espesantes iónicos o no iónicos, tensioactivos, carga, espesante iónico o no iónico, secuestrante, polímero, propulsor, agente alcalinizante o acidificante, opacificante, agentes colorantes y compuestos grasos y similares.
Las composiciones de la invención pueden formularse para proporcionar una liberación rápida, sostenida o retardada del principio activo después de la administración al cuerpo empleando técnicas bien conocidas en este campo.
La composición puede estar en cualquier forma farmacéutica apropiada para permitir el suministro o para dirigirse a células o tejidos particulares, por ejemplo, como una emulsión o en liposomas, niosomas, microesferas, nanopartículas o similares con las que puede absorberse, adsorberse, incorporarse o unirse el principio activo. Esta puede convertir eficazmente el producto en una forma insoluble. Estas formas en partículas pueden superar problemas tanto de estabilidad (por ejemplo degradación) como de suministro.
Estas partículas pueden portar moléculas superficiales apropiadas para mejorar el tiempo en circulación (por ejemplo, componentes del suero, tensioactivos, polioxamina 908, p Eg , etc.) o restos para dirección específica de sitio, tales como ligandos para receptores particulares portadas por células. Se conocen bien en este campo técnicas apropiadas para la administración de fármacos y para la dirección y se describen en el documento WO99/62315.
Se prefiere el uso de soluciones, suspensiones, geles y emulsiones, por ejemplo, el principio activo puede portarse en agua, un gas, un líquido de base acuosa, un aceite, un gel, una emulsión, una emulsión de aceite en agua o de agua en aceite, una dispersión o una mezcla de los mismos.
Las composiciones pueden ser para administración tópica (es decir, a la piel), oral o parenteral, por ejemplo, mediante inyección.
Sin embargo, se prefieren las composiciones y la administración tópicas, e incluyen geles, cremas, pomadas, pulverizaciones, lociones, bálsamos, barras, jabones, polvos, películas, aerosoles, gotas, espumas, soluciones, emulsiones, suspensiones, dispersiones, por ejemplo, dispersiones de vesículas no iónicas, leches y cualquier otra forma farmacéutica o cosmética convencional en la técnica.
Las pomadas, geles y cremas pueden, por ejemplo, formularse con una base acuosa u oleosa con la adición de agentes espesantes y/o gelificantes adecuados. Las lociones pueden formularse con una base acuosa o aceitosa y, en general, también contendrán uno o más agentes emulsionantes, dispersantes, de suspensión, espesantes o colorantes. Los polvos pueden formarse con la ayuda de cualquier base de polvo adecuada. Las gotas y soluciones pueden formularse con una base acuosa o no acuosa que también comprende uno o más agentes dispersantes, solubilizantes o de suspensión. Las pulverizaciones en aerosol se suministran convenientemente a partir de envases presurizados, con el uso de un propulsor adecuado.
Como alternativa, las composiciones pueden proporcionarse en una forma adaptada para administración oral o parenteral. Las formas farmacéuticas alternativas incluyen por tanto comprimidos sencillos o recubiertos, cápsulas, suspensiones y soluciones que contienen el componente activo opcionalmente junto con uno o más vehículos convencionales inertes y/o diluyentes, por ejemplo, con almidón de maíz, lactosa, sacarosa, celulosa microcristalina, estearato de magnesio, polivinilpirrolidona, ácido cítrico, ácido tartárico, agua, agua/etanol, agua/glicerol, agua/sorbitol, agua/polietilenglicol, propilenglicol, alcohol estearílico, carboximetilcelulosa o sustancias grasas tales como grasa dura o mezclas adecuadas de los mismos.
La concentración de principio activo en composiciones de la invención depende de la naturaleza del compuesto utilizado (es decir, el polipéptido), el modo de administración, la evolución del tratamiento, la edad y el peso del paciente, la indicación médica, el cuerpo o área corporal para tratar y puede variarse o ajustarse según la elección. En general, sin embargo, los intervalos de concentración para el compuesto descrito en el presente documento son 0,0001, 0,0005, 0,001 o 0,01 a 25 %, por ejemplo, 0,0005-15 %, por ejemplo, de 0,01 a 10 %, tal como 0,1 o de 0,5 a 5, por ejemplo, 1-5 % (p/p de la preparación final para administración, en particular para administración tópica).
Cuando hay más de un compuesto presente, por ejemplo, coriolisina y una o más VAP (o moléculas relacionadas) como se describe en el presente documento, cada compuesto puede estar presente en las cantidades descritas anteriormente. Dichas concentraciones se determinan por referencia a la cantidad del compuesto en sí mismo y, por tanto, se debe tener en cuenta la pureza de la composición. Las dosis individuales eficaces para VAP (y moléculas relacionadas) pueden estar en el intervalo de 0,1-100 mg/cm2/día, preferentemente 0,1-10 mg/cm2/día, cuando se aplica por vía tópica, dependiendo del animal que se trate, tomadas como una única dosis. Para coriolisina (y moléculas relacionadas), las dosis individuales eficaces pueden estar en el intervalo de 0,1-100 mU/cm2/día, preferentemente 0,5-10, por ejemplo, 1-5 mU/cm2/día.
La administración puede ser mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica médica, incluyendo, por ejemplo, administración oral, intestinal, percutánea, bucal, rectal o tópica o administración por inhalación. Las formas de administración preferidas se administrarán por vía oral o, más preferentemente, por vía tópica. Como se apreciará, la administración oral tiene sus limitaciones si el principio activo es digerible. Para solucionar dichos problemas, los ingredientes pueden estabilizarse como se ha mencionado previamente.
La forma de la composición y la vía de administración pueden variar. Preferentemente, sin embargo, se emplearían soluciones líquidas, cremas o suspensiones, particularmente, por ejemplo, para administración oral o administración tópica.
El polipéptido de la invención se usa para las indicaciones médicas mencionadas anteriormente.
Los animales a los que pueden aplicarse o administrarse las composiciones incluyen mamíferos, reptiles, aves, insectos y peces particularmente durante la acuicultura de peces (por ejemplo, salmón o bacalao). Preferentemente, los animales a los que se aplican las composiciones de la invención son mamíferos, particularmente primates, animales domésticos, ganado y animales de laboratorio. Por tanto, los animales preferidos incluyen ratones, ratas, conejos, cobayas, gatos, perros, monos, cerdos, vacas, cabras, ovejas y caballos. De forma especialmente preferente, las composiciones se aplican, o se administran, a seres humanos.
Los siguientes ejemplos se proporcionan solamente como ilustración en la que las figuras a las que se hace referencia son las siguientes:
La Figura 1 muestra el isoelectroenfoque de los VAP después de su purificación;
La Figura 2 muestra los efectos de las VAP del salmón del Atlántico sobre el epitelio humano en el que A y B muestran el cultivo cutáneo expuesto a las VAP y C muestra el cultivo cutáneo de control; y
La Figura 3 muestra los efectos de coriolisina L del salmón del Atlántico sobre el epitelio humano en el que A muestra el cultivo cutáneo expuesto a coriolisina L y B muestra el cultivo cutáneo de control.
Ejemplo 1: Identificación y caracterización de VAP
Aislamiento de proteínas
Durante el transcurso del análisis de los componentes del líquido de eclosión del salmón del Atlántico, se identificaron nuevas proteínas presentes en el líquido de eclosión.
Se proporciona un método para preparar líquido de eclosión parcial (a partir del cual se puede preparar zonasa) que puede usarse como material de partida para aislar las VAP desveladas en el presente documento (o sus secuencias precursoras) en el documento WO99/29836 (particularmente el Ejemplo 1 del método descrito, pero opcionalmente sin la etapa de urea).
Por tanto, se ha usado el siguiente método para aislamiento. Se aislaron VAP del líquido de eclosión (en bruto o filtrado a través de filtros de 0,45 μm). Posteriormente, las VAP se precipitaron añadiendo 4 volúmenes de acetona a temperatura ambiente o a 4 °C. Después de 20-30 minutos, los VAP precipitados se recogieron como un sedimento después de centrifugación a baja velocidad (aproximadamente 5000xg) y se resuspendieron en el tampón apropiado (por ejemplo, TrisHCl 10 mM, pH 8,0 o PBS).
La Figura 1 muestra PAGE bidimensional de las VAP después de su purificación como se ha descrito anteriormente.
Análisis de secuencia
Las VAP recientemente identificadas fueron sometidas a caracterización por análisis de EM de los puntos tripsinizados. El análisis de EM fue MALDI-TOF-TOF (desorción/ionización por láser asistida por matriz. Tiempo de vuelo x2).
Los siguientes resultados se obtuvieron para la mejor coincidencia, como lo refleja la puntuación más alta.
Figure imgf000017_0001
Figure imgf000018_0001
VAP III
Comparación con péptidos de coriogenina (Oncorhynchus masou)
Figure imgf000019_0001
A partir de los resultados anteriores, las secuencias de las VAP se generaron identificando péptidos en la secuencia de VAP por EM e insertando después las secuencias intermedias usando partes relevantes de la secuencia nativa conocida con la que se realizó la comparación. Las secuencias de VAP identificadas por este proceso se exponen en la SEQ ID NO. 2-4 y las secuencias nativas con las que se compararon se proporcionan en las SEQ ID NO. 5-8. Ejemplo 2: Aplicaciones médicas/cosméticas de VAP in vitro.
Materiales y métodos
Los siguientes estudios se llevaron a cabo utilizando las VAP de salmón del Atlántico preparadas como se ha descrito en el Ejemplo 1.
Se obtuvieron cultivos diferenciados de epitelio cutáneo humano de SkinEthics (Niza, Francia) el día 16 después de sembrar en sustratos de crecimiento de plástico con microporos lo que permite el acceso de nutrientes al tejido epitelial desde abajo. Dichos cultivos presentan una morfología cutánea normal después de la diferenciación durante el periodo de cultivo a 37 °C. Estos cultivos se mantuvieron durante dos días más in vitro de modo que el estrato córneo superior quedara expuesto al aire y el estrato basal al sustrato de crecimiento.
Se trasladaron cultivos paralelos a atmósfera húmeda a 30 °C y se expusieron a una solución salina tamponada con fosfato que contenía Mg, Ca medio durante 6 horas con o sin la presencia de VAP a 0,5 mg/ml (medido a DO280). Los cultivos se fijaron en formalina y se incluyeron en parafina según los procedimientos convencionales y se tiñeron con hematoxilina/eosina.
Resultados
A. Efectos hidratantes
Los resultados se muestran en la Figura 2A-C en la que A y B muestran el cultivo cutáneo expuesto a VAP y C muestra el cultivo cutáneo de control. Estas figuras muestran que las VAP hacen que las láminas del estrato córneo de la piel se separen, de modo que se produce "deslaminación". Las láminas no se desprenden ni exfolian, simplemente se separan una de las otras.
Esta separación está causada por proteínas anfifílicas muy cargadas que se intercalan en el estrato córneo y que, debido a su carácter anfifílico, transportan agua para separar las láminas de la piel. Por lo tanto, el agua es transportada al estrato córneo por las VAP lo que reduce la pérdida de agua transepidérmica (PATE).
Ejemplo 3: Aplicaciones médicas/cosméticas de coriolisina L in vitro
Materiales y métodos
Los siguientes estudios se llevaron a cabo utilizando la coriolisina L del salmón del Atlántico preparada como se describe en Yasumasu et al., 1989, mencionado anteriormente, a partir del líquido de eclosión del salmón.
Los cultivos de epitelio de la piel humana se prepararon como se ha descrito en el Ejemplo 2 y se aplicó coriolisina L del líquido de eclosión de salmón a 0,15 mU/ml durante 6 horas a 30 °C.
Resultados
A. Efectos de exfoliación
Los resultados se muestran en la Figura 3A y B en la que A muestra el cultivo cutáneo expuesto a coriolisina L de salmón y B muestra el cultivo cutáneo de control. Los resultados muestran que la coriolisina L provoca deslaminación y ruptura de las láminas de la piel.
La exfoliación también puede analizarse evaluando el sobrenadante de cultivos cutáneos para evaluar la cantidad de células epiteliales que se eliminan de los cultivos cutáneos durante el tratamiento. Ya que la coriolisina L es inhibida por EDTA 1 mM, sus efectos pueden inhibirse fácilmente para demostrar su acción sobre la piel.
Ejemplo 4: Aplicaciones médicas/cosméticas de VAP y coriolisina L in vivo
Aplicaciones cosméticas
A individuos que padecen piel seca y/o piel que necesita exfoliación (por ejemplo, callos o helomas) se les administran cremas cosméticas o placebo como se describe posteriormente. El tratamiento se repite periódicamente, por ejemplo, cada 8 horas.
Los efectos de la crema en la piel se analizan basándose en efectos cualitativos como apariencia y sensación (por ejemplo, prurito) o se pueden analizar de forma más cuantitativa, por ejemplo, en contenido de agua o grosor.
Aplicaciones médicas
A individuos que padecen una afección o anomalía de la piel tal como acné, eccema o psoriasis se les administran cremas de tratamiento o placebo como se describe posteriormente. El tratamiento se repite periódicamente, por ejemplo, cada 8 horas.
Los efectos de la crema en la piel se analizan basándose en efectos cualitativos como apariencia, sensación (por ejemplo, dolor) o color o pueden analizarse de forma más cuantitativa, por ejemplo, según el tamaño de la anomalía restante, el grado de inflamación o grosor.
r m l :
Figure imgf000020_0001
r m m i r mi n n 1 rin i i iv :
Figure imgf000021_0004
Secuencias:
SEQ ID NO.1: Coriolisina L - Salmón del Atlántico
Figure imgf000021_0001
SEQ ID NO.2: VAP I - Salmón del Atlántico
Figure imgf000021_0002
SEQ ID NO.3: VAP II - Salmón
Figure imgf000021_0003
SEQ ID NO.4: VAP III - Salmón
Figure imgf000022_0001
SEQ ID NO. 5: Proteína zr de longitud completa - salmón del Atlántico
Figure imgf000022_0002
SEQ ID NO. 6: Coriogenina H de longitud completa - salmón del Pacífico
Figure imgf000022_0003
SEQ ID NO. 7: Coriogenina L de longitud completa - salmón del Pacífico
Figure imgf000023_0001
SEQ ID NO. 8: Proteína zr alternativa - salmón del Atlántico
Figure imgf000023_0002
SEQ ID NO. 9: Secuencia de nucleótidos, coriolisina L, salmón del Atlántico
Figure imgf000023_0003
SEQ ID NO. 10: Secuencia de nucleótidos que codifica la SEQ ID NO. 2, VAP I
Figure imgf000024_0001
SEQ ID NO. 11: Secuencia de nucleótidos que codifica la SEQ ID NO. 3, VAP II
Figure imgf000024_0002
SEQ ID NO. 12: Secuencia de nucleótidos que codifica la SEQ ID NO. 4, VAP III
Figure imgf000024_0003
SEQ ID NO. 13: Secuencia de nucleótidos de longitud completa que codifica la SEQ ID NO. 5, proteína zr salmón del Atlántico
Figure imgf000025_0001
SEQ ID NO. 14: Secuencia de nucleótidos de longitud completa que codifica la SEQ ID NO. 6, coriogenina H -salmón del Pacífico
Figure imgf000025_0002
Figure imgf000026_0001
SEQ ID NO. 15: Secuencia de nucleótidos de longitud completa que codifica la SEQ ID NO. 7, coriogenina L -salmón del Pacífico
Figure imgf000026_0002

Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. Una composición farmacéutica o cosmética que comprende un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO. 1 y uno o más excipientes y/o diluyentes farmacéutica o cosméticamente aceptables, en donde la composición es un gel o emulsión.
2. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO. 1 y uno o más excipientes y/o diluyentes farmacéutica o cosméticamente aceptables, para su uso en terapia.
3. Un método cosmético para exfoliar y/o hidratar la piel de un animal en donde:
(a) un polipéptido como se define en la reivindicación 1; o
(b) composición farmacéutica que comprende un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO. 1 y uno o más excipientes y/o diluyentes farmacéutica o cosméticamente aceptables,
se administran a dicho animal.
4. Un polipéptido como se define en la reivindicación 1 o composición farmacéutica que comprende un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO. 1 y uno o más excipientes y/o diluyentes farmacéutica o cosméticamente aceptables,
para su uso en el tratamiento o prevención de eccema, dermatitis de contacto, psoriasis, ictiosis o acné.
5. Un polipéptido como se define en la reivindicación 1 o composición farmacéutica que comprende un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO. 1 y uno o más excipientes y/o diluyentes farmacéutica o cosméticamente aceptables,
para su uso en el tratamiento o prevención de una afección o trastorno de la piel de un animal en donde dicha piel está anormalmente seca, la capa córnea de la piel está anormalmente engrosada o la piel tiene un trastorno de la pigmentación.
6. El polipéptido o composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 5, en donde la afección o trastorno cutáneo para tratar o prevenir es callos, helomas, verrugas o manchas cutáneas.
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