MX2012006090A - Enzimas fluidas incubadas y usos de las mismas. - Google Patents

Enzimas fluidas incubadas y usos de las mismas.

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Abstract

La presente invención se refiere a varios polipéptidos del fluido de incubación de pescado, sus secuencias de ácido nucleico codificadas, composiciones farmacéuticas que comprenden los polipéptidos y moléculas de ácido nculeico y su uso en varias aplicaciones cosméticas a la piel, particularmente para humectar la piel y/o para exfoliación del estrato córneo de la piel para tratar o prevenir trastornos o afecciones de la piel en un animal.

Description

ENZIMAS FLUIDAS INCUBADAS Y USOS DE LAS MISMAS Descripción de la Invención La presente invención se relaciona al uso de coriolisina y proteínas muy ácidas (VAP, por sus siglas en inglés) derivadas del fluido incubado del pescado, solas o en combinación en varias aplicaciones médicas y cosméticas para la piel. La presente invención también se relaciona a las proteínas muy ácidas que se describen para estos usos.
La piel es uno de los órganos más vulnerables del cuerpo. Aunque rara vez ponen en riesgo la vida, los trastornos o condiciones de la piel pueden ser incómodos y pueden causar discapacidades crónicas. Además, debido a que la piel es muy visible, las afecciones y trastornos de la piel pueden conducir a estrés psicológico. Por lo tanto, hay una continua necesidad de tratamientos efectivos de los trastornos y afecciones de la piel.
La piel forma el órgano más grande del cuerpo, representando cerca de 12-16 por ciento del peso corporal de una persona. Ésta realiza muchas funciones vitales tanto como una barrera como una influencia reguladora entre el mundo exterior y el medio ambiente controlado dentro de nuestros cuerpos .
La piel consiste de 3 capas, llamadas epidermis, dermis Ref . :230923 y tejido subcutáneo. La epidermis es la capa epitelial que se encuentra más arriba de la piel . Actúa como una barrera física, previniendo la pérdida de agua del cuerpo, y previniendo la entrada de sustancias y organismos en el cuerpo. Su grosor varía de acuerdo al sitio del cuerpo.
La epidermis consiste de epitelios escamosos estratificados, es decir consiste de capas aplanadas. La piel, cabello y uñas están queratinizados , esto quiere decir que tiene una superficie hidrofóbica endurecida muerta hecha de una proteína llamada queratina. La epidermis está hecha impermeable debido a sus contenidos de lípidos extracelulares asociados con queratinocitos , especialmente en la capa media de la epidermis (estrato lúcido) . Las membranas mucosas (por ejemplo el esófago, la cavidad faríngea oral, órganos reproductivos, y otros) son principalmente húmedas y no queratinizadas . La epidermis tiene tres tipos de células principales, llamadas queratinocitos (células de la piel) , melanocitos (células productoras de pigmento) y las células Langerhans (células inmunitarias) . La célula Merkel es una cuarta célula epidérmica, menos frecuente.
Los queratinocitos maduran y se diferencian con la acumulación de queratina mientras se mueven hacia afuera. Eventualmente éstos se caen o se quitan. Éstos forman cuatro o cinco estratos distintos, que desde el más superficial al más profundo son (i) el estrato córneo (capa córnea) con células duras secas y muertas sin núcleo, (ii) el estrato granuloso (capa granulosa) con células que contienen gránulos basofílicos y separados hacia afuera del estrato córneo por el estrato delgado lúcido, (iii) el estrato espinoso (espinoso, capa de células de espina o espinosas) en la que las células se convierten en gran medida en aplanadas mientras se mueven hacia arriba y (iv) el estrato de referencia (capa basal) con células regenerativas en columnas (altas) .
Inmediatamente debajo de la epidermis está la membrana basal, una estructura especializada que se encuentra entre la epidermis y la dermis.
La dermis es el tejido conectivo fibroso o capa de apoyo de la piel. Las fibras mayores son fibras de colágeno y elastina que están entretejidas.
El tejido subcutáneo es la capa de grasa que está inmediatamente debajo de la dermis y la epidermis. También se le llama tejido subcutáneo, hipodermis o panículo. El tejido subcutáneo consiste principalmente de células de grasa (adipocitos) , nervios y vasos sanguíneos.
Las nuevas células de la piel epiteliales se crean en la capa más baja de la piel, el estrato granuloso. Con el tiempo, las células migran a la superficie de la piel y se vuelven más ácidas. Durante 30 días de viaje, mueren y se vuelven saturadas con queratina. La queratina y los lípidos asociados son importantes ya que protegen a la piel de elementos exteriores.
Enfermedad, daño, factores del medio ambiente, edad, niveles de hormonas, medicación, materiales ingeridos o aplicados de manera externa, afecciones genéticas o una variedad de otros factores pueden conducir al funcionamiento anormal de la piel resultando en irregularidades o anormalidades. Algunas de estas irregularidades o anormalidades pueden ser puramente de naturaleza cosmética en naturaleza, por ejemplo la piel seca, espinillas o pigmentación alterada, o puede ser más severa conduciendo a dolor o incomodidad, por ejemplo el eccema y la psoriasis.
La piel seca es una de las afecciones o anormalidades más comunes de la piel. Aunque ciertos individuos son más susceptibles a la piel seca, la condición puede afectar a cualquier persona, a pesar de la edad, género o tipo de piel. La piel seca ocurre cuando la capa exterior de la piel (el estrato córneo con el estrato lúcido) se agota de agua. Cuando esta capa está bien humedecida, minimiza la pérdida de agua a través de la piel y ayuda a mantener fuera los irritantes, alérgenos y gérmenes. Sin embargo, cuando el estrato córneo se seca, su función protectora se reduce. Esto permite la pérdida de agua en gran medida, dejando a la piel vulnerable a los factores ambientales.
Bajo condiciones normales, el estrato córneo tiene un contenido de agua de 10% a 30%. Esta agua imparte a la piel su suavidad y textura flexible. El agua viene de la atmósfera, las capas subyacentes de la piel, y el sudor. El aceite producido por las glándulas de la piel y las sustancias grasas producidas por las células de la piel actúan humectantes naturales, permitiendo al estrato córneo sellar en agua.
El cuerpo pierde continuamente agua de la superficie de la piel por evaporación. Bajo condiciones normales, la tasa de pérdida es lenta, y el agua se reemplaza adecuadamente. Los signos y síntomas característicos de la piel seca ocurren cuando la pérdida de agua excede el reemplazo de agua, y el contenido de agua del estrato córneo cae debajo del 10%.
Son altamente deseables los humectantes que mejoran o erradican la piel seca. Aunque son conocidos en la técnica muchos humectantes, aún queda la necesidad de productos naturales que sean eficaces y aún suaves.
Otra anormalidad o afección de la piel común son las cantidades excesivas de la capa córnea de la piel. Esto puede resultar de la falla de la capa córnea a ser desprendida o a través de deposición de queratina excesiva en la capa córnea. La primera puede resultar cuando el proceso natural de la erosión de la piel se vuelve desigual, lo que le da a la piel un carácter seco y áspero. Los trastornos hiperproliferativos incluyen hiperqueratosis epidermolítica (o piel agrietada) y queratosis folicular del cabello. Una condición hiperproliferativa benigna común es la hipertrofia periférica alrededor de cicatrices y/o formación de queloides. Otras afecciones hiperproliferativas son callos, callosidades, verrugas hiperqueratósicas (particularmente veruca vulgaris) , ictiosis y queratosis palmoplantar.
Los tratamientos actuales implican la exfoliación o cirugía en caso extremos. La hiperqueratosis usualmente se trata por el suavizado de la capa córnea y la remoción de la piel engrosada.
También puede usarse la exfoliación para remover las células epidérmicas debilitadas, por ejemplo las células epidérmicas de una epidermis que muestra un trastorno de pigmentación, por ejemplo manchas por la edad.
La exfoliación remueve el estrato exterior de la epidermis para revelar las células de la piel por debajo de las nuevas. La exfoliación puede lograrse por medios físicos (es decir por abrasión de la piel) o por medios químicos. Los exfoliantes químicos incluyen exfoliantes que contienen ácido salicílico, ácido glicólico, enzimas de frutas, ácido cítrico o ácido málico y pueden aplicarse en altas concentraciones por medio de un dermatólogo, o en bajas concentraciones en los productos sin receta. La exfoliación química puede implicar el uso de productos que contienen alfa hidroxiácidos (AHA, por sus siglas en inglés) o beta hidroxiácidos (BHA, por sus siglas en inglés) , o enzimas que actúan para aflojar las sustancias como pegamento que mantienen a las células juntas en uniones de células, permitiendo que se separen fácilmente. Este tipo de exfoliación se recomienda a la gente que está en tratamiento de acné .
La más grande desventaja de la exfoliación es el alto precio de algunos de los productos y métodos usados para lograrlo. La exfoliación conducirá a un enrojecimiento inicial de la piel. Cerca del extremo de' las exfoliaciones químicas, la piel se helará, con colores variando de un blanco brillante a un gris sobre la superficie de la piel.
Por lo tanto se desean más métodos efectivos que son más suaves en la piel .
Así queda una necesidad de tratamientos idóneos para la humectación de la piel y/o para la exfoliación de la capa córnea de la piel .
Ciertas moléculas que se encuentran en el fluido incubado del pescado sorprendentemente ahora se han encontrado que son notablemente humectantes y son exfoliantes efectivos, principalmente la coriolisina y un nuevo grupo identificado de proteínas muy ácidas (VAP) .
El incubado de embriones de pescado se logra, al menos en parte, por las así llamadas enzimas incubadas, coriolisinas . La coriolisina es una metaloproteinasa que se. encuentra en el fluido incubado de pescado y generalmente se encuentra en dos formas, llamada enzima coriolítica alta (coriolisina H, HCE) y la enzima coriolítica baja (coriolisina L, LCE) , que son similares en algunas características catalíticas y estructurales y pertenecen a la familia astacina pero con preferencias de sustrato marcadamente diferentes.
En el salmón la LCE es relativamente inusual comparada a coriolisinas conocidas de otras especies de peces y puede aplicarse para propósitos que se describen en lo sucesivo. La secuencia de salmón LCE se establece en SEQ ID No. 1, debajo .
Como se mencionó arriba, un grupo de proteínas muy ácidas (VAP) ahora ha sido identificado en fluidos incubados de pescado por precipitación de otros componentes en 80% acetona y remoción de acetona por evaporación del gránulo centrifugado como se describe en los Ejemplos.
Estas VAP se generan por división proteolítica de la cáscara de huevo o corión polimerizada al incubar las enzimas reticuladas durante la incubación y son fragmentos de componentes incorporados en el corion durante la ovogénesis como coriogenina H y L como se describe aquí abajo con más detalle. Estos fragmentos de proteínas coriogénicas , que aquí tiene el término de VAP, se liberan en el líquido perivitelino durante la incubación para volverse componentes del fluido incubado. Las VAP aparecen en varias formas. Cuando se analizan por enfoque isoeléctrico (véase los Ejemplos) , VAP I, II y III (como se discute abajo) aparecen en al menos 2, 6 y 3 isoformas, respectivamente.
En este documento se describe tres VAP que han sido identificadas y que tiene propiedades sorprendentes como se describe en lo sucesivo. Las secuencias de estas VAP han sido determinadas por espectroscopia de masa como se describe en los Ejemplos y se presentan en SEQ ID Nos. 2-4.
Las VAP I, II y III se refieren a este documento tienen secuencias como las establecidas en SEQ ID Nos. 2, 3 y 4, respectivamente .
La VAP I es de 117 aminoácidos en tamaño y tiene un peso molecular de alrededor de 15.5kDa y pl alrededor de 3.5. Esta VAP es un fragmento de 439 aminoácidos, proteína de cáscara de huevo de 57kDa (también referida como proteína zona radiata, SEQ ID No. 5) . VAP I puede ser alternativamente derivada de una proteína zona radiata homologa que comprende 467 residuos de aminoácidos (SEQ ID NO: 8) .
La VAP II es de 261 aminoácidos en tamaño y tiene un peso molecular de alrededor de 35kDa y pl alrededor de 4.0. Esta VAP es un fragmento de una proteína de 524 aminoácidos, beta H coriogenina de 68kDa (SEQ ID No. 6) .
La VAP III es de 224 aminoácidos en tamaño y tiene un peso molecular de alrededor de 29kDa y pl alrededor de 5.2. Esta VAP es un fragmento de una proteína de 438 aminoácidos, coriogenina L de 57kDa (SEQ ID No. 7) .
Como se muestra en los Ejemplos y se discutió arriba, cada VAP puede existir en varias isoformas.
Así, en un primer aspecto la presente invención proporciona un polipéptido que consiste de: (i) una secuencia de aminoácidos como se establece en cualquiera de SEQ ID Nos. 2-4 o una secuencia que es al menos 50% idéntica a la secuencia, o una porción de cualquiera de las secuencias; (ii) una secuencia de aminoácidos que flanquean en el terminal N y/o C de la secuencia de aminoácidos en (i) que es de 1 a 100 aminoácidos en longitud.
"Polipéptidos" Como se refiere aquí son moléculas con preferentemente más que 50, 100, 150, 200 o 250 residuos y/o menos que 400, 300, 200 o 100 residuos o un intervalo seleccionado de ahí. Como se refiere aquí una "porción" preferiblemente comprende al menos 30, -40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200 o más aminoácidos de la secuencia de la que se deriva. La porción puede obtenerse de un central o N-terminal o porción C-terminal de la secuencia. En un aspecto preferido la porción consiste de secuencia de longitud total de la que se deriva de la que al menos 1, 2, 3, 4 o 5 residuos de aminoácidos han sido removidos, preferiblemente de la terminal N.
Como se refiere aquí una "secuencia flanqueadora" es una secuencia de aminoácidos que se adjunta al extremo terminal N o C de la secuencia de aminoácidos central por enlaces de péptido normales para formar una secuencia de aminoácidos continua (excepto cuando se modifica en equivalentes funcionales como se discute adelante) . Una secuencia flanqueadora puede presentarse en el extremo terminal N o C de la secuencia de aminoácidos central o puede presentarse en ambos extremos. La secuencia flanqueadora puede ser tan corta como 1 aminoácido o tan larga como 100 aminoácidos, preferiblemente de 1-50 (o de 5-100 o 10-50), por ejemplo 1-25, por ejemplo 1-5 aminoácidos en longitud. Cuando las secuencias flanqueadoras en ambos extremos del terminal N y C pueden ser de la misma o de diferente secuencia y pueden ser de la misma o diferente longitud. Las secuencias flanqueadoras pueden derivarse de la secuencia nativa de la que la VAP en cuestión es un fragmento o puede tener menos que 80, 70, 60 o 50% identidad a la secuencia nativa en la porción comparable (véase por ejemplo secuencias nativas relativas a SEQ ID Nos. 2-4 proporcionadas en SEQ ID Nos. 5-7, respectivamente y SEQ ID No: 8, que proporcionan una secuencia nativa alternativa para SEQ ID No. 2) .
Preferiblemente la secuencia en la parte (i) arriba es al menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% idéntica a la secuencia (SEQ ID Nos 2-8) a la que se compara.
La identidad de secuencia puede identificarse mediante, por ejemplo usando el banco de datos de secuencias de proteínas SWISS-PROT usando FASTA pep-cmp con un pamfactor variable, y una penalidad de creación de espacios puesta en 12.0 y penalidad de extensión de espacios puesta en 4.0, y una ventana de 2 aminoácidos. Preferentemente la comparación se hace sobre la longitud completa de la secuencia, pero puede hacerse sobre una ventana más pequeña de comparación, por ejemplo menos que 200, 100 o 50 aminoácidos continuos.
Preferentemente la identidad de secuencia relaciona a polipéptidos es funcionalmente equivalente a los polipéptidos que se establecen en la mencionada SEQ ID Nos. Los polipéptidos funcionalmente equivalentes pueden tomar la forma de derivados como se establece abajo. Similarmente, los polipéptidos con secuencias como las establecidas en SEQ ID Nos. Pueden modificarse sin afectar la secuencia del polipéptido como se describe abajo.
Además, "porciones" como se describe en este documento pueden ser funcionalmente equivalentes. Preferentemente estas porciones satisfacen las condiciones de identidad (relativa a la región comparable) mencionadas en este documento. Los polipéptidos preferidos de la invención incluyen porciones y polipéptidos que incluyen las secuencias flanqueadoras arriba descritas son preferentemente ácidas, por ejemplo tienen un pl de 3 a 5.5, preferentemente de 3.5 a 5.2.
Como se refiere en este documento, para lograr la "equivalencia funcional" el polipéptido puede mostrar algo de eficiencia reducida en el desempeño de la función médica o cosmética relativa a la molécula precursor (es decir la molécula de la que se derivó, por ejemplo por sustitución de aminoácidos) , pero preferentemente es tan eficiente o es muy eficiente. Así, la equivalencia funcional se relaciona a un polipéptido que es efectivo para tratar a una afección o trastorno o para mejorar cosméticamente la condición y/o apariencia de la piel como se refiere a este documento, es decir para reducir uno o más síntomas del paciente, por ejemplo la apariencia, textura, grosor o contenido de humedad de la piel como se describe en lo sucesivo. Esto puede probarse por comparación de los efectos del polipéptido derivado relativa al polipéptido del que se deriva en una manera cualitativa o cuantitativa, por ejemplo realizando los análisis referidos en los Ejemplos. Donde los resultados cuantitativos son posibles, el derivado es al menos 30, 50, 70 o 90% tan efectivo como el polipéptido precursor.
Las proteínas funcionalmente equivalentes que se relacionan o se derivan de la proteína que ocurre de manera natural, pueden obtenerse modificando la secuencia de aminoácidos nativa por sustituciones, adiciones y/o supresiones de aminoácidos sencillas o múltiples (por ejemplo 2-20, preferentemente 2-10) , (con tal de que satisfagan los requisitos de identidad de secuencia arriba mencionada) , pero sin destruir la función de la molécula. Las proteínas son codificadas por "moléculas de ácido nucleico funcionalmente equivalentes" que son generadas por sustitución generada, adición y/o supresión de una o más bases.
Los equivalentes funcionales preferidos son variantes de "adición" en las que se generan las proteínas de fusión del terminal carboxi y/o amino o polipéptidos , comprendiendo una proteína adicional o polipéptido fusionado al polipéptido precursor. Como se describió arriba, cualquier secuencia que cuando se agregue al polipéptido central forme una secuencia de aminoácido contigua se limita a las secuencias flanqueadoras como se describe arriba.
Además los equivalentes funcionales preferidos son variantes de "supresión" o "truncamiento" en los que las proteínas o polipéptidos se generan en donde los residuos terminales amino y/o carboxi han sido removidos del polipéptido central. En una modalidad particularmente preferida, los residuos son removidos del terminal amino, en donde al menos 1, 2, 3, 4 o 5 residuos de aminoácidos son removidos. Los equivalentes funcionales son porciones como se describió previamente.
Particularmente las variantes funcionalmente equivalentes preferidas son variaciones biológicas naturales (por ejemplo variantes alélicas o variaciones geográficas dentro de especies o alternativamente diferentes géneros, por ejemplo plantas, animales o bacterias, particularmente pescado, particularmente de la familia Salmonidae, especialmente las subfamilias Salmo y Oncorhynchus) y derivados preparados usando técnicas conocidas. Por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas funcionalmente equivalentes pueden ser producidas por síntesis química o en una forma recombinante usando las técnicas conocidas de la mutagénesis directa en un sitio incluyendo la supresión, mutagénesis aleatoria, o división enzimática y/o ligación de ácidos nucleicos.
La presente invención también proporciona una molécula de ácido nucleico que consiste de una secuencia nucleótido que codifica sólo al el polipéptido o una secuencia complementaria del mismo.
En un aspecto preferido, la presente invención así proporcionan una molécula de ácido nucleico que consiste de: (i) una secuencia de nucleótidos como se establece en cualquiera de SEQ ID Nos. 10-12, una secuencia que es al menos 50% idéntica a la secuencia, o una secuencia que hibridiza a la secuencia bajo condiciones de enlace no rigurosas de 6 x SSC/50% formamida a temperatura ambiente y lavando bajo condiciones de alta severidad, por ejemplo 2 x SSC, 65°C, donde SSC = 0.15 M NaCl, 0.015M citrato de sodio, pH 7.2, o una secuencia complementaria a cualquiera de las secuencias antedichas, o una porción de la misma; y opcionalmente (ii) una secuencia de nucleótidos flanqueadora en el 5 ' o 3' extremo de la secuencia nucleótido en (i) que es de 1 a 300 nucleótidos en longitud, o una secuencia complementaria del mismo.
Preferentemente la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido como se estableció previamente.
"Moléculas de ácido nucleico" Como se refiere aquí son moléculas con preferentemente más que 150, 300, 450, 600 o 750 bases y/o menos que 1200, 900, 600 o 300 bases o un intervalo seleccionado del mismo. Las "Porciones" como se refiere arriba, preferentemente comprenden al menos 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300, 450 o 600 bases nucleótidas de la secuencia de la que se derivan. Preferentemente las porciones codifican péptidos N-terminal, central o C-terminal como se describió aquí previamente. En un aspecto preferido la porción consiste de la secuencia de longitud completa de la que se deriva de la que al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 bases han sido removidas, preferentemente del extremo 5' .
Como se refiere aquí una "secuencia flanqueadora" es una secuencia de nucleótido que se adjunta al terminal 5' o extremo 3 ' de la secuencia nucleótido central por enlaces fosfodiéster para formar una secuencia nucleótido continua (excepto como se modifica en equivalentes funcionales como se discute aquí posteriormente) . Una secuencia flanqueadora puede estar presente en el extremo terminal 51 o 31 de la secuencia nucleótido central o puede presentarse en ambos extremos. La secuencia flanqueadora puede ser tan corta como 1 nucleótido o tan larga como 300 nucleótidos, preferentemente de 1-150 (o de 15-300 o 30-150), por ejemplo 1-75, por ejemplo 1-15 nucleótidos en longitud. Cuando las secuencia flanqueadoras se presentan en ambos extremos 5 ' y 3 ' pueden ser de la misma o diferentes longitudes. Las secuencia flanqueadoras pueden derivarse de la secuencia nativa de la que la secuencia codificadora VAP en cuestión es un fragmento o puede tener menos que 80, 70, 60 o 50% identidad a la secuencia codificadora nativa en la porción comparable (véase por ejemplo secuencias nativas relativas a SEQ ID Nos. 10-12 proporcionadas en SEQ ID Nos 13-15, respectivamente y SEQ ID No: 16, que proporciona una secuencia nativa alternativa para SEQ ID No. 10) .
Preferentemente la secuencia en parte (i) arriba es al menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% idéntica a la secuencia (SEQ ID Nos 10-16) a la que se compara .
La identidad de secuencia puede determinarse, por ejemplo, por Búsqueda FASTA usando paquetes GCG, con valores de defecto y un pamfactor variable, una penalidad de creación de espacio puesta en 12.0 y una penalidad de extensión de espacio puesta en 4.0 con una ventana de 6 nucleótidos.
Preferentemente tal identidad de secuencia relacionada o moléculas hibridizadoras de ácido nucleico son funcionalmente equivalentes a las moléculas de ácido nucleico que se establecen en la mencionada SEQ ID Nos. Las moléculas de ácido nucleico funcionalmente equivalentes pueden tomar la forma de derivados como se establecen debajo y se consideran funcionalmente equivalentes si codifican polipéptidos que serían considerados equivalentes funcionales de acuerdo a las pruebas descritas previamente. Los equivalentes funcionales preferidos son aquellos que codifican los polipéptidos preferidos como se establecen arriba, por ejemplo moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos encontrados en diferentes géneros o especies que las moléculas específicas mencionadas en este documento.
Además, "porciones" como se describe en este documento pueden ser funcionalmente equivalentes. Preferentemente estas porciones satisfacen las condiciones de identidad (relativa a la región comparable) mencionadas en este documento. Preferentemente las moléculas de ácido nucleico de la invención, incluyendo porciones y secuencias de nucleótidos incluyendo las arriba descritas secuencias flanqueadoras, preferentemente los polipéptidos ácidos codificadores como se describió en este documento previamente.
Las moléculas de ácido nucleico de acuerdo a la invención y para usar de acuerdo a la invención pueden ser de hebra doble o sencilla ADN, cADN o ARN, preferentemente ADN e incluyen secuencias degenerativas, sustancialmente idénticas e hibridizadoras como las arriba descritas. Sin embargo idealmente las moléculas son ADN o cADN.
Los polipéptidos de la invención, o para su uso de acuerdo a la invención, incluye a aquellos que son modificados sin afectar la secuencia del polipéptido, por ejemplo por modificación química, incluyendo por deglicosilación o glicosilación . Los polipéptidos pueden prepararse por modificación del polipéptido postsíntesis/aislamiento sin afectar la funcionalidad, por ejemplo cierta glicosilación, metilación etc. de residuos particulares .
Los polipéptidos de la invención, o para su uso de acuerdo a la invención, también pueden tomar la forma de peptidomiméticos que pueden considerarse derivados en los que las características funcionales del polipéptido se retienen pero se presentan en el contexto de una estructura diferente, por ejemplo no péptida. Los peptidomiméticos han sido exitosamente desarrollados y usados particularmente para aplicaciones médicas.
Los peptidomiméticos, particularmente moléculas no peptídicas pueden generarse a través de varios procesos, incluyendo diseño de fármaco basado en la conformación, representación gráfica, diseño enfocado de bibliotecas y química medica clásica. No solo pueden usarse oligómeros de aminoácidos no naturales u otros bloques de construcción orgánicos, sino también carbohidratos, compuestos heterocíclicos o macrocíclicos o cualquier molécula orgánica que comprenda elementos y conformación estructurales que proporcione una superficie electrostática molecular que imite las misma propiedades de la conformación 3 -dimensional del péptido puede usarse por métodos conocidos en la técnica.
Así los peptidomiméticos pueden sostener poco o nada de parecido a la columna vertebral del péptido. Los peptidomiméticos pueden comprender una forma no péptida enteramente sintética (por ejemplo basada en una columna vertebral de carbohidrato con sustituyentes) o puede retener uno o más elementos del péptido en el que se basa, por ejemplo derivando uno o más aminoácidos o reemplazando uno o más aminoácidos con componentes no péptidos alternativos. Las plantillas tipo péptido incluyen pseudopéptidos y péptidos cíclicos. Los elementos estructurales considerados redundantes para la función del péptido pueden minimizarse para retener sólo una función de andamio o removerla donde sea apropiado.
Cuando los peptidomiméticos retienen uno o más elementos péptidos, es decir más de un aminoácido, los aminoácidos deben de reemplazarse con un análogo no estándar o estructural del mismo. Los aminoácidos retenidos en las secuencias también deben de derivarse o modificarse (por ejemplo etiquetados, glicosilados o metilados) mientras se retengan las propiedades funcionales de los polipéptidos de la invención, o para su uso de acuerdo a la invención. Los peptidomiméticos se refieren como a ser "derivables de" una cierta secuencia de polipéptido. Por esto quiere decirse que peptidomimético se diseña con referencia a la secuencia de polipéptidos definida, de manera que retenga las características estructurales del péptido que son esenciales para su función. Este puede ser el lado particular de las cadenas de polipéptido, o el potencial de enlace hidrógeno de la estructura. Las características pueden ser proporcionadas por componentes no péptidos o uno o más de los residuos de aminoácidos o los enlaces que unen los residuos de aminoácidos del polipéptido pueden modificarse para mejorar ciertas funciones del polipéptido como la estabilidad o resistencia proteasa, mientras que la retención de las características estructurales del polipéptido las cuales son esenciales para su función.
Los ejemplos de aminoácidos análogos estructurales o no estándar que pueden usarse son aminoácidos D, amido isósteros (como N-metil amida, amida retro- inversa, tioamida, tioéster, fosfonato, quetometileno, hidroximetileno, fluorovinilo, (E) -vinilo, metilenamino, metilentio o alcano) , L-N ácidos metilamino, D-cc ácidos metilamino, D-N- ácidos metilamino. Los ejemplos de aminoácidos no convencionales se enlistan en la Tabla 1.
TABLA 1 Aminoácido no Código An noácido no Código Convencional convencional oí-ácido aminobutirico Abu L-N-metilalanina Nmala o<- ámino-a-metilbutirato Mgabu L-N-metilarginina Nmarg aminc iclcpropano- Cpro L-N-metilasparagina Nmasn carboxilato ácido L-N-metilaspartico Nmasp ácido aminoisibutirico Aib L-N-metilcisteína Nmcys arrd_ncnorbonilo- Norb L-N-metilglutamina Nmgln carboxilato ácido L-N-metilglutamico Nmglu ciclchexilalaniña Chexa L-N-metil stidina Nnribis ciclqpentilalanina Cpen L-N-metilisol leucina Nmile D-alanina Dal L-N-metil leucina Nmleu D-arginina Darg L-N- metil lisina Nmlys D-ácido aspártico Dasp L-N-metilrreticnina Nmmet D-cisteína Dcys L-N-metilnorleucina Nmnle D-glutamina Dgln L-N-metilnorvalina Nmnva Ácido D-glutámico Dglu L-N-metilornitina Nmom D-histidina Dhis L-N-metilfenilalanina Nmphe D-isoleucina Dile L-N-metilprolina Nmpro D-leucina Dleu L-N-metilserina Nmser D-lisina Dlys L-N-metiltrecciina Nmthr D-metionina Emet L-N-metiltriptofan Nmtrp D-omitina Dom L-N-mstiltirosina Nmtyr D-fenilanina Dphe L-N-metilvalina Nmval D-prolina Dpro L-N-metiletilglicina Nmetg D-serina Dser L-N-mstil-t-butilglicina Nmtbug D-treonina Dthr L-norleucina Nle D-triptofan Dtrp L-norvalina Nva D-tirosina Dtyr a-meti1-aminoisobutirato Maib D-valina Dval a-metil-?-arninobutirato Mgabu D- -netilalanina Dmala a-tmtilciclohexilalanina Mchexa D-a-nietilarginina Dmarg a-metilcilcopentilalanina Mcpen D- -metilasparagina Dmasn a-metil-a-naftilalaniña Manap D-a-metilaspartato Dmasp a-metilpenicil lamina Mpen D-a-metilcisteína Dmcys N- (4-anundbutil) glicina Nglu D-a-netilglutamina Dmgln N- (2-aminoetil) glicina Naeg D- -metiUistidina Dhis N- (3-andnopropil) glicina Nom D-a-metilisoleucina Dmile N-amino- -metilbutirata Nmaabu D- -metil leucina Dmleu a-naptilalanina Anap D- -metil lisina Dmlys N-bencilglicina Nphe D-a-metilmetionina Dmmet N- (2-carbamiletil) glicina Ngln D-a-metil lomitina Dmom N- (carbamilmetil) glicina Nasn D-a-metilfenilalaniña Dmphe N- (2-carboxiletil) glicina Nglu D-a-metilprolina Dmpro N- ((^rboximetil) glicina Nasp D-a-metilserina Dmser N-cicldbutilglicina Ncbut D-a-rtetiltreanina Dmthr N-ciclcheptilglicina Ncbut D-a-metiltriptofano Dmtrp N-ciclohexilglicina Nchex D-a-metilmetiltirosina Dmty N-ciclodecilglicina Ncdec D-a-mstilvalina Dmval N-ciclodecilglicina Ncdod D-N-metilalanina Dnmala N-cicloctilglicina Ncoct D-N-metilarginina Dnmarg N-ciclcpropilglicina Ncpro D-N-metilasparagina Dnmasn N-cicloundecilglicina Ncund D-N-metilaspartato Dnmasp N- (2, 2-difeniletil) glicina Nbhm D-N-mstilcisteína Dnmcys N- (3,3-difenilprcpil) glicina Nbhe D-N-mstilglutamina Dnmgln N- (3-guanidincprcpil) glicina Narg D-N-metilglutamato Dnmglu N- (1- droxietil) glicina Nthr D-N-metilhistidina Dnmbis N- (hidrnxietil) glicina Nser D-N-metilisoleucina Dnmile N- (imidazoliletil) glicina Nhis D-N-metil leucina Dnmleu N- (3-indolilietil) glicina Nhtrp D-N- metil lisina Dnmyls N-metil-y-aminobutirato Nmgabu N-metilciclohexilalanina Nmchexa D-N-metilnetianina Dnmmet D-N-metilornitina Dnmorn N-netilciclcpentilalanina Nmcpen N-metilglicina Nala D-N-metilfenilalanina Dnmphe N-iretilaminoisobutirato Nmaib D-N-metilprolina Dnmpro N- (l-metilprqpil) glicina Nile D-N-tnetilserina Dnmser N- (2-raetilprcpil) glicina leu D-N-metiltreonina Dnmthr D-N-metiltriptofano Dnmtrp N- (1-metiletil) glicina Nval D-N-metiltirosina Dnmyr N-metila-naptilalanina Nmanap D-N-metilvalina Dnmval N-mstilpenicil lamina Niipen ácido ?-andxiobutírico Gau N- (p-hidraxifenil) glicina Nhtyr L-t-butilglicina Tbug N- (tiometil) glicina Neys L-etilglicina Etg penicil lamina Pen L-hcmofenilalanina Hphe L- -mstilalanina Mala L-a-mstilarginina Marg L- -metilasparagina Masn L-a-metilaspartato Masp L-o-metil-t-butilglicina Mtbug L-a-metilcisteina Mcys L-etiletilglicina Metg L- -metilglutamina Mgln L-oi-metilglutamato Mglu L-a-metilMstidina Mhis L-of-metiltenofenilalanina Mhphe L-a-metilisoleucina Mile N- (2-metiltioetil) glicina Nmet L- -metil leucina Mleu L-a-metil lisina Mlys L- -metilmeticnina Mmet L-a-metilnorleuc na Mnle L-a-metilnorvalina Mnva L-a-metilornitina Mom L-a-netilfenilalanina Mphe L-a-metilprOlina Mpro L-a-metilserina Mser L-a-rretiltrecnina Mthr L- -metiltriptofano Mtrp L-a-metiltirosina Mtyr L- -metilvalina Mval L-N-inetilhomofenilalanina Nmhphe N- (N- (2, 2-difeniletil) Itobhm N- (N- (3,3-difenilprcpil) Nnbhe carbamstil)glicina carbamilmetil) glicina 1-carbcKÍl-l- (2, 2, -difenil- mbe L-O-metil serina Omser etilamino) ciclqpropano L-O-metil homoserina Orrihser Los aminoácidos no estándar que pueden usarse incluyen análogos conformacionalmente restringidos, por ejemplo como Tic (para reemplazar F) , Aib (para reemplazar A) o ácido pipecólico (para reemplazar Pro) .
Los polipéptidos y moléculas de ácido nucleico discutidos arriba también incluyen derivados que han sido modificados, por ejemplo para facilitar su uso en aplicaciones farmacéuticas (discutidas abajo), por ejemplo por la adición de grupos funcionales u objetivos, por ejemplo para mejorar la lipofilicidad, facilitar el transporte celular, solubilidad y/o estabilidad. Así los oligosacáridos , ácidos grasos, alcoholes grasos, aminoácidos, péptidos o polipéptidos pueden conjugarse para los polipéptidos o moléculas de ácido nucleico arriba mencionados. Las moléculas de ácido nucleico pueden estar presentes en un portador viral como se describe en este documento en lo sucesivo.
Los polipéptidos también abarcan los derivados en la forma de "pro-fármacos" o "pro-péptidos" de manera que el componente agregado pueda removerse por división de un substituyente agregado una vez administrado, por ejemplo por división de un sustituyente agregado a través de la estratificación que puede removerse por la acción de esterasas . Los pro-fármacos incluyen precursores nativos de proteínas que ocurren naturalmente que son troceadas por ejemplo por proteólisis para producir el polipéptido de interés. Los precursores pueden estar inactivos en la forma del precursor pero pueden estar activados por división proteolítica . Sin embargo, cualquier secuencia que cuando se agregue al polipéptido central forme una secuencia de aminoácido contigua se limita a secuencias flanqueadoras como se describe arriba. Alternativamente pueden tener secuencias flanqueadoras más largas proporcionando que no se extiendan a moléculas que son la secuencia nativa de la que se deriva el fragmento VAP (por ejemplo SEQ ID Nos. 5-8 en relación a las secuencias de aminoácidos y SEQ ID Nos. 13-16 para las secuencias nucleótidas) o una secuencia con al menos 50, 60, 70, 80 o 90% identidad de secuencia a esa secuencia en la porción comparable.
Las moléculas de ácido nucleico de la invención, o para su uso de acuerdo a la invención, así similarmente abarcan las moléculas que codifican los pro-fármacos o precursores. Sin embargo, cualquier secuencia que cuando se agregue al polipéptido central forme una secuencia de aminoácido contigua se limita a secuencias flanqueadoras como se describe arriba. Alternativamente pueden tener secuencias flanqueadoras más largas proporcionando que no se extiendan a moléculas que son la secuencia nativa de la que se deriva el fragmento VAP o una secuencia con al menos 50, 60, 70, 80 o 90% identidad de secuencia a esa secuencia en la porción comparable .
Los polipéptidos modificados o moléculas de ácido nucleico como se describe arriba pueden probarse para asegurar que mantienen actividad funcional relativa a la molécula no modificada determinando si tienen los mismos o parecidos efectos médicos o cosméticos.
Las moléculas de ácido nucleico descritas arriba pueden estar operativamente vinculadas a una secuencia de control de expresión, o un vehículo de clonación de ADN recotnbinante o un vector que contenga tal molécula de ADN recombinante . Esto permite la expresión intracelular del polipéptido de la invención, o para su uso de acuerdo a la invención, como un producto gen, la expresión del que es dirigido por el/los gen (es) introducido en las células de interés. El gen de expresión es dirigido de un promotor active en las células de interés y puede ser insertado en cualquier forma de vector ADN circular o lineal para la incorporación en el genoma o para re aplicación independiente o transfección/expresión transitoria. Las técnicas de transfección o transformación idóneas están bien descritas en la bibliografía. Alternativamente, la molécula de ADN desnuda puede introducirse directamente en la célula para los usos descritos en el presente documento.
Los vectores de expresión apropiados incluyen secuencias de control apropiadas como elementos de control traduccional (por ejemplo iniciar y detener los codones, sitios de unión ribosomal) y transcripcional (por ejemplo regiones de operación de promotores, secuencias de detención de la terminación) vinculados en un marco de lectura combinado con las moléculas de ácido nucleico requeridas para el desempeño del método de la invención como se describe en este documento de manera posterior. Los vectores apropiados pueden incluir plásmidos y virus (incluyendo tanto virus bacteriófagos como eucarióticos) . Los vectores virales idóneos incluyen baculovirus y también adenovirus, virus asociado al adeno, herpes y vaccinia/virus de viruela. Muchos otros vectores virales se describen en la técnica. Los vectores preferidos incluyen vectores de mamífero y bacterias de expresiones pGEX-KG, pEF-neo y pEF-HA. Convenientemente la molécula de ácido nucleico puede fusionarse con ADN que codifique un polipéptido adicional, por ejemplo glutation-S-transíerasa, para producir una proteína de fusión sobre la expresión.
Así visto desde un aspecto adicional, la presente invención proporciona un vector, preferentemente un vector de expresión, que comprende una molécula de ácido nucleico como se define arriba.
Otros aspectos de la invención incluyen métodos para preparar moléculas de ácido nucleico recombinantes de acuerdo a la invención, que comprender insertar las secuencias nucleótidas de la invención que codifican los polipéptidos de la invención en el ácido nucleico vector.
En métodos como se describe en este documento de manera posterior, los polipéptidos pueden administrarse a una. célula por transfección de una célula con una molécula de ácido nucleico de la invención, o para su uso de acuerdo a la invención. Como se mencionó arriba, la presente invención así extiende a las moléculas de ácido nucleico que consisten de, o comprenden, una secuencia que codifica los polipéptidos de la invención como se describe en este documento y su uso en métodos descritos en este documento. Preferentemente las moléculas de ácido nucleico están contenidas en un vector, por ejemplo un vector de expresión.
Las moléculas de ácido nucleico de la invención, o para su uso de acuerdo a la invención, preferentemente contenidas en un vector, pueden introducirse en una célula por cualquier medio apropiado. Las técnicas de transfección o transformación idónea están bien descritas en la bibliografía. Una variedad de técnicas se conoce y puede usarse para introducir los vectores en células procarióticas o eucarióticas para expresión. Las células hospederas preferidas para este propósito incluyen líneas celulares de insectos, líneas celulares eucarióticas o E. coli, como cepa BL21/DE3. La invención también extiende a células hospederas eucarióticas o procarióticas transformadas o transíectadas que contienen una molécula de ácido nucleico, particularmente un vector como se definió arriba.
Un aspecto adicional de la invención proporciona un método para preparar un polipéptido de la invención como se define anteriormente, que comprende cultivar una célula hospedera que contiene una molécula de ácido nucleico como se define antes, bajo condiciones que por ello expresan el polipéptido y recuperar la molécula así producida. El polipéptido expresado forma un aspecto adicional de la invención .
La invención también extiende a un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico como se describió previamente. Esto puede producirse por expresión de una célula hospedera como se describió arriba.
Las células que producen y secretan polipéptidos de la invención, pero que han sido modificadas con relación a las células nativas por expresión de codificación de material de ácido nucleico, forman aspectos futuros de la invención.
Los polipéptidos o moléculas de ácido nucleico usadas en las composiciones y usos de la invención como se describe en este documento abajo pueden obtenerse o derivarse de las fuentes que ocurren de manera natural o pueden generarse entera o parcialmente de manera sintética.
Convenientemente los polipéptidos y moléculas de ácido nucleico se aislan de acuerdo a los protocolos descritos en los Ejemplos y abajo o como están descritos en Yasumasu et al., 1989, J. Biochem. , 105, p212-218 en relación a la coriolisina, que se incorpora en este documento como referencia, particularmente en relación a la metodología de aislamiento. Los métodos y los productos de los métodos mientras se relacionen a las VAP descritas en este documento forman aspectos futuros de la invención.
Así en un aspecto futuro la presente invención proporciona un método de aislamiento de uno o más polipéptidos (VAP o secuencias relacionadas) como se describe en este documento del fluido de incubación (por ejemplo de salmón) comprendiendo al menos los pasos de: a) suspender huevos en un volumen mínimo de agua (por ejemplo menos que el volumen de los huevos) ; b) inducir la incubación rápida y sincronizada de los huevos, (Preferentemente de manera que la incubación se complete dentro de menos de 3 horas para más que 95% de los embriones) ; c) filtrar los huevos de incubación para obtener fluido incubado; d) agregar acetona al fluido de incubación a una concentración extrema de 80% v/v; y e) sujetar el fluido a centrifugación de velocidad baja en donde el polipéptido (s) está presente en el gránulo así formado; y opcionalmente f) separar los polipéptidos presentes en el gránulo del paso e) aislar los polipéptidos individuales, por ejemplo por medio del uso de una columna de intercambio de iones.
Una columna de intercambio de iones preferida es una columna DEAE-Sepharose® CL-6B, sin embargo están fácilmente disponibles alternativas idóneas.
Preferentemente el fluido de incubación es de pescado, especialmente Salmonidae, particularmente Salmo, por ejemplo Salmo salar (salmón del Atlántico) and Oncorhynchus (salmón del Pacífico) .
La invención se extiende más a los polipéptidos preparados por el método descrito arriba.
Los polipéptidos o moléculas de ácido nucleico de la invención, o para su uso de acuerdo a la invención, son preferentemente sustancialmente libres de cualquier componente contaminante derivado del material fuente o materiales usados en el procedimiento de aislamiento o en su preparación sintética. De manera especial preferentemente el compuesto se purifica a un grado de pureza de más de 50 o 60 %, por ejemplo >70, 80 o 90%, preferentemente más de 95 o 99% de pureza medida p/p (peso seco) . Los niveles de pureza corresponden a las moléculas específicas de interés, pero incluyen sus productos de degradación. Donde es apropiado, pueden usarse las preparaciones enriquecidas que tienen pureza más baja, por ejemplo contienen más que 1, 2, 5 o 10% de la molécula de interés, por ejemplo más que 20 o 30%. Los polipéptidos de la invención, o para su uso de acuerdo a la invención, pueden purificarse como, por ejemplo, cromatografía (por ejemplo HPLC, exclusión de tamaño, intercambio de iones, afinidad, interacción hidrofóbica, fase de reversa) o electroforesis capilar.
Los polipéptidos de la invención, o para su uso de acuerdo a la invención, pueden generarse sintéticamente, por ejemplo por ligación de péptidos más pequeños sintéticamente generados o más convenientemente por expresión recombinante de una molécula de ácido nucleico codificando el polipéptido como se describió en este documento previamente.
Las moléculas de ácido nucleico de la invención, o para su uso de acuerdo a la invención, pueden generarse sintéticamente, por ejemplo por amplificación de una secuencia de ácido nucleico como se describe en este documento. Los polipéptidos VAP y las moléculas de ácido nucleico descritos en este documento pueden usarse como se describe en este documento aquí abajo a efecto de varios efectos cosméticos y/o médicos y forman moléculas preferidas para este propósito.
Además, las proteínas más grandes (y sus secuencias codificadoras) que incluyen los fragmentos descritos arriba, como las proteínas nativas de longitud completa, pueden usarse para los procesos descritos aquí abajo. Así, para los usos descritos debajo el polipéptido que puede usarse y extenderse a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como está establecida en cualquiera de las Secuencias Nos. 2-8 o una secuencia que es al menos 50% idéntica a la secuencia, o una porción de cualquiera de las secuencias .
Las definiciones como se relacionan á los polipéptidos, porciones, identidad de secuencia y proteínas funcionalmente similares similarmente aplican y los valores de identidad de frecuencia preferida como los establecidos son aplicables. Preferentemente los polipéptidos son fragmentos de proteínas nativas (opcionalmente con secuencias flanqueadoras) como se describió en este documento previamente. De manera similar, para los usos descritos abajo las moléculas de ácido nucleico que pueden utilizarse para ampliar moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia nucleótido que codifica a un polipéptido de la invención o a un polipéptido más largo como se describe arriba o una secuencia complementaria de la misma. Preferentemente los usos se realizan con fragmentos de las secuencias codificadoras nativas (opcionalmente con secuencias flanqueadoras) como se describió en este documento previamente .
Así, para los usos descritos abajo la molécula de ácido nucleico que puede usarse para ampliar una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleótida como la establecida en cualquiera SEQ ID Nos. 10-16 o una secuencia que es al menos 50% idéntica a la secuencia, o una secuencia que hibridiza a la secuencia bajo condiciones de enlace no estrictas de 6 x SSC/50% formamida a temperatura ambiente y lavando bajo condiciones altas de severidad, por ejemplo 2 x SSC, 65°C, donde SSC = 0.15 M NaCl, 0.015M citrato de sodio, pH 7.2, o una secuencia complementaria a cualquiera de las secuencias antes mencionadas, o una porción de cualquiera de las secuencias.
Como se refiere a este documento en lo sucesivo en relación a los usos de la invención, la referencia a los polipéptidos y moléculas de ácido nucleico se refiere a esta amplia definición, es decir es decir no sólo fragmentos de las moléculas nativas que opcionalmente contienen secuencias flanqueadoras como se describió arriba.
En adición a las VAP arriba descritas, también se ha encontrado que además una proteína encontrada en el fluido de incubación de pescado tienen usos ventajosos cosméticos y/o médicos que son complementario a aquellos de las VAP, llamado coriolisina L como se discutió aquí previamente.
Así, los polipéptidos o moléculas de ácido nucleico como se describen en este pueden usarse ex vivo o in vitro, en partes de animales o productos, por ejemplo muestras de piel, particularmente cuando se contempla que estas serán reintroducidas en el cuerpo de las que se derivan, por ejemplo en la forma de un injerto de piel.
Sin embargo, los polipéptidos y moléculas de ácido nucleico como se describen en este documento se prefieren para su uso in vivo como se discute a mayor detalle aquí abajo.
Los polipéptidos y moléculas de ácido nucleico como se describe en este documento tienen aplicaciones para el tratamiento de varias anormalidades, trastornos o afecciones como se describe en este documento de manera sucesiva.
La presente invención así se amplia a una composición farmacéutica que comprende un polipéptido o molécula de ácido nucleico como se describió en este documento previamente y uno o más excipientes y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables .
Alternativamente especificado, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende: (i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como la establecida en SEQ ID No. l o una secuencia que es al menos 50% idéntica a la secuencia, o una porción de cualquiera de las secuencias; (ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como la establecida en SEQ ID No. 2 o una secuencia que es al menos 50% idéntica a la secuencia, o una porción de cualquiera de las secuencias; (iii) un polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos como la establecida en SEQ ID No. 3 o una secuencia que es al menos 50% idéntica a la secuencia, o una porción de cualquiera de las secuencias; y/o (iv) un polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos como la establecida en SEQ ID No. 4 o una secuencia que es al menos50% idéntica a la secuencia, o una porción de cualquiera de las secuencias; y uno o más excipientes y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables .
En un aspecto preferido, cuando se contempla el uso de secuencias más largas que aquellas presentadas en SEQ ID Nos. 2-4, en la lista de arriba, SEQ ID Nos. 2-4 puede reemplazarse con SEQ ID Nos. 5-7, respectivamente y en donde SEQ ID NO: 2 puede alternativamente ser reemplazada con SEQ ID NO: 8.
Los polipéptidos preferidos son como ya se describió en este documento, particularmente, en relación a las VAP, fragmentos de secuencias nativas, que opcionalmente contienen secuencias flanqueadoras . Las referencias a la composición farmacéutica en este documento pueden leerse mientras abarquen las composiciones cosméticas.
Alternativamente, o adicionalmente la composición puede comprender la secuencia codificadora del polipéptido, es decir moléculas de ácido nucleico como se describió previamente este documento (por ejemplo (v) una o más moléculas de ácido nucleico codificando un polipéptido como la establecida en cualquiera de (i) a (iv) arriba o una secuencia complementaria de la misma) . Las moléculas preferidas de ácido nucleico son como se describieron en este documento de manera previa, es decir con referencia a SEQ ID Nos. 9-16, preferentemente 9-12.
En un aspecto preferido, la composición comprende una combinación de los componentes, por ejemplo componentes (ii) a (iv) arriba (es decir todas las VAP descritas) o cualquier combinación de 4 componentes enlistados arriba.
Por "farmacéuticamente aceptable" o "fisiológicamente aceptable" quiere decir que el ingrediente debe de ser compatible con otros ingredientes en la composición así como también fisiológicamente aceptables al receptor.
El ingrediente activo para la administración puede modificarse apropiadamente para su uso en una composición farmacéutica. Por ejemplo los compuestos usados de acuerdo con la invención pueden estabilizarse contra la degradación por el uso de derivados descritos arriba.
El ingrediente activo también puede estabilizarse en las composiciones por ejemplo por el uso de aditivos apropiados como sales o no electrolitos, acetato, EDTA (para VAPS y polipéptidos relacionados) , citrato (para VAPS y polipéptidos relacionados), Tris, fosfato o acetato amortiguadores, manitol, glicina, HSA (albúmina de suero humano) o polisorbato .
La molécula de ácido nucleico o polipéptido como se describe en este documento puede presentarse en las composiciones como el ingrediente activo único o puede estar combinado con otros ingredientes, particularmente otros ingredientes activos, por ejemplo para aumentar el efecto terapéutico o para hacer la composición más atractiva al consumidor. El componente puede ser uno de los 4 componentes opcionales descritos arriba o un componente alternativo.
La composición que comprende uno o más polipéptidos o moléculas de ácido nucleico descrita en este documento también puede comprender impurezas, por ejemplo después de la preparación de los uno o más polipéptidos o moléculas de ácido nucleico de la invención de fuentes naturales. En composiciones que comprenden el uno o más polipéptidos o moléculas de ácido nucleico como se describe en este documento, cada uno del (s) polipéptido (s) o moléculas de ácido nucleico (s) pueden presentarse en un intervalo de 0.0001 a 30% p/p de la composición farmacéutica. Preferentemente el polipéptido ( s) o molécula (s) de ácido nucleico (s) se presentan en un intervalo de 0.01-10% o como se describe en este documento en lo sucesivo.
En un aspecto futuro de la invención, las composiciones como se describen en este documento son para su uso en terapia .
Como se mencionó arriba, los polipéptidos y moléculas de ácido nucleico de la invención exhiben propiedades terapéuticas en el tratamiento de las anormalidades de la piel, trastornos o afecciones, por humectación y/o exfoliación de la piel.
Las anormalidades de la piel preferidas, afecciones o trastornos a ser tratados son piel seca, la piel en la cual la capa córnea es más gruesa de lo que se desea, por ejemplo en afecciones de hiperqueratosis , o piel con pigmentación no deseada en la epidermis, por ejemplo manchas por la edad, hepáticas, sol o cafés. El tratamiento puede ser cosmético, por ejemplo el tratamiento de piel seca pero normal o piel engrosada (como callosidades, callos o verrugas hiperqueratósicas) , o tratamiento de trastornos de pigmentación, como manchas hepáticas, o terapéutico, por ejemplo para tratar el acné, eczema, psoriasis o verrugas que resultan dolorosas.
Como se refiere en este documento un "trastorno" se pretende referir a un trastorno patológico subyacente en un organismo con síntomas o sin síntomas relativo a un organismo normal, que puede resultar, por ejemplo, desde una infección o una imperfección genética congénita o adquirida. Una "anormalidad" o "condición" se refiere a una irregularidad o defecto en la piel relativa a la piel óptima normal pero que no es resultado de un trastorno patológico. El defecto/irregularidad puede resultar en lugar de la edad, daño, factores ambientales, niveles hormonales, medicación, materiales ingeridos o aplicados de manera externa, afecciones genéticas o una. variedad e otros factores que llevan a funcionamiento anormal de la piel resultando en irregularidades .
El trastorno, anormalidad o condición puede ser puramente cosmético o no cosmético requiriendo de tratamiento médico, o una combinación de los mismos.
Como se refiere aquí "cosmético" pretende referirse a un tratamiento que no cura, trata o previene una enfermedad o trastorno pero en su lugar sirve como un producto de cuidado de la piel o para modificar o mejorar la apariencia de la piel, por ejemplo el color, textura o contenido de humedad de la piel.
Un ingrediente "no cosmético" (o médico) usado en tratamientos médicos como se describe en este documento sirve para curar, mitigar, tratar o prevenir uno o más síntomas del trastorno, por ejemplo dolor o incomodidad.
La base de los tratamientos descritos en el presente documento es la humectación de la piel y los efectos de la exfoliación de las VAP y/o coriolisina como se describen en este documento. Estos efectos se han mostrado en los efectos proporcionados en este documento.
Así se contemplan los tratamientos basados en las propiedades de humectación y/o exfoliación de VAP y/o coriolisina .
Así, la invención proporciona un método cosmético o no cosmético de exfoliación y/o humectación de la piel de un animal, donde un polipéptido, molécula de ácido nucleico y composición farmacéutica como se describió previamente en este documento se administra al animal.
Así, con referencia a lo anterior, la presente invención proporciona un método cosmético o no cosmético de exfoliación y/o humectación de la piel de un animal, donde un polipéptido, molécula de ácido nucleico y composición farmacéutica como se describió previamente en este documento se administra al animal, donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos como la establecida en cualquiera de las Secuencias Nos. 1-8 (Preferentemente 1-4) o una secuencia que es al menos 50% idéntica a la secuencia, o una porción de cualquiera de las secuencias; la molécula de ácido nucleico codifica el polipéptido o es una secuencia complementaria de la misma (por ejemplo una secuencia nucleótido como la establecida en cualquiera de SEQ ID Nos. 9-16 (Preferentemente 9-12) o una secuencia que es al menos 50% idéntica a la secuencia, o una secuencia que hibridiza a la secuencia bajo condiciones de enlace no severas de 6 x SSC/50% formamida a temperatura ambiente y lavado bajo condiciones de alta severidad, por ejemplo 2 x SSC, 65°C, donde SSC = 0.15 M NaCl, 0.015M citrato de sodio, pH 7.2, o una secuencia complementaria para cualquiera de las secuencias anteriormente mencionadas, o una porción de cualquiera de las secuencias) y la composición farmacéutica comprende uno o más de los polipéptidos o moléculas de ácido nucleico y uno o más excipientes y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables.
Como se describió arriba y se refiere en el presente documento, el polipéptido arriba descrito y las secuencias de nucleótidos definidas por referencia a SEQ ID Nos. 2-8 y 10-16 son VAP o secuencias relacionadas y aquellas definidas por referencia a SEQ ID Nos. 1 y 9 son coriolisina o secuencias relacionadas.
Como se refiere en este documento, "exfoliación" se refiere a la remoción de células superficiales de una superficie del epitelio que en la piel es igual a la ampliación o descamación de la capa córnea de la epidermis. "Humectación" Como se refiere aquí cubre los humectantes que previenen la pérdida de agua de la piel así como también los humectantes que atraen y retienen el agua cuando se aplican a la piel y emolientes (que mejoran la descamación defectiva) .
Alternativamente especificado, la presente invención proporciona un polipéptido, molécula de ácido nucleico o composición farmacéutica como se describe en este documento para usar en la exfoliación y/o humectación de la piel de un animal. (El compuesto o composición puede usarse alternativamente para preparar un medicamento para ese propósito) .
Como se mencionó arriba, las propiedades de exfoliación y/o humectación son ventajosas para el tratamiento o prevención de una variedad de anormalidades de la piel, trastornos y afecciones.
En un aspecto preferido, la anormalidad de la piel, afección o trastorno a ser tratado o prevenido es la piel seca. Esto puede tratarse por exfoliación y/o humectación.
La "piel seca" como se refiere aquí se refiere a una epidermis a la que le falta humedad o sebo, frecuentemente caracterizado por un patrón de líneas finas, escamadura, y comezón. La piel seca puede ocurrir como una condición de la piel en si misma (por ejemplo debido a la edad, calor/frío/daño seco) o puede ser síntoma de un trastorno de la piel o una afección como daño por el sol, eczema, dermatitis de contacto, psoriasis o ictiosis (una condición heredada causando descamación de la piel) .
En un aspecto adicional preferido, la anormalidad, afección o trastorno a ser tratado o prevenido es el engrosamiento de las capas córneas de la piel . Esto puede tratarse por humectación y/o exfoliación.
El engrosamiento de las capas corneas de la piel puede ocurrir en afecciones como callosidades o callos que son almohadillas protectoras hechos del grosor de la capa superior de la piel debido al frotamiento repetido del área o verrugas de la piel. Los métodos también pueden usarse para tratar o prevenir el acné que implica queratinización en su patología. Las capas corneas engrosadas de la piel pueden ser la propia condición o pueden ser un síntoma de afección o trastorno de la piel.
En un aspecto adicional preferido, la anormalidad, afección o trastorno a ser tratado o prevenido es un trastorno de pigmentación o anormalidad de la piel. Esto puede tratarse por exfoliación.
Los trastornos o anormalidades de la pigmentación de la piel pueden ocurrir como resultado de la edad, cambios hormonales, factores genéticos, enfermedad o por el sol u otro daño. La pigmentación alterada puede resultar de un exceso local de melanocitos o incremento de actividad de los melanocitos, o ambas. Los trastornos de pigmentación incluyen, manchas hepáticas, del sol o de la edad (lentigo solar) y otras manchas como pecas.
Alternativamente especificado, la presente invención así proporcionan un método cosmético o no cosmético de tratamiento o de prevención de una afección o trastorno de la piel de un animal en donde la piel es anormalmente seca, la capa córnea de la piel es anormalmente gruesa o la piel tiene un trastorno de pigmentación, en donde un polipéptido, ácido nucleico o composición farmacéutica como se describió previamente en este documento se administra al animal . Los trastornos o< afecciones son preferentemente como se describieron previamente en este documento.
Como se refiere aquí "anormal" se determina relativa a la condición óptima de la piel, es decir saludable, hidratada, normalmente pigmentada y no piel no avejentada.
En una declaración alternativa adicional, la invención proporciona un polipéptido, molécula de ácido nucleico o composición farmacéutica como se describe en la presente para uso en un método cosmético o no cosmético para tratar o prevenir una afección o trastorno de la piel de un animal en donde la piel está anormalmente seca, la capa callosa de la piel está anormalmente engrosada o la piel tiene un trastorno de pigmentación. (El compuesto o composición puede alternativamente usarse para preparar un medicamento para tal propósito . ) En un aspecto preferido los usos médicos y/o cosméticos se alcanzan por administración tópica a la piel.
Preferiblemente, para indicaciones médicas o cosméticas que dependen, al menos en parte, de los efectos de exfoliación de los ingredientes activos, las composiciones farmacéuticas usadas para este propósito comprenden uno o más VAP (o sus secuencias relacionadas como se describe en la presente) y/o coriolisina (o sus secuencias relacionadas como se describe en la presente) .
Preferiblemente, para indicaciones médicas o cosméticas dependiendo, al menos en parte, en los efectos de humectación de los ingredientes activos, las composiciones farmacéuticas usadas para este propósito comprenden uno o más VAP (o sus secuencias relacionadas como se describe en la presente) .
De esta manera en un aspecto particularmente preferido, uno o más VAP (o sus secuencias relacionadas como se describe en la presente) y/o coriolisina (o sus secuencias relacionadas como se describe en la presente) pueden usarse para tratar trastornos en los cuales la piel está anormalmente seca, la capa callosa de la piel está anormalmente engrosada o en los cuales un defecto de pigmentación está presente, por ejemplo callosidades, granos, verrugas, eczema, dermatitis por contacto, psoriasis, ictiosis, acné y manchas hepáticas.
En un aspecto particularmente preferido adicional, uno o más VAP (o sus secuencias relacionadas como se describe en la presente) pueden usarse para tratar trastornos en los cuales la piel está anormalmente seca.
Como se usa en la presente, "tratar" se refiere a la reducción, alivio o eliminación, preferiblemente a niveles normales, de uno o más de los síntomas o efectos de la afección o trastorno por ejemplo presencia o extensión de piel seca o engrosada, extensión o área de pigmentación, comezón o dolor etc. con relación a los síntomas o efectos presentes en una parte diferente del cuerpo del individuo donde la piel no sufre de la afección o trastorno y no se somete al tratamiento o en un individuo normal correspondiente que no se somete al tratamiento.
"Prevenir" se refiere a prevención absoluta, o reducción o alivio de la extensión o distribución (por ejemplo retraso) del comienzo de tal síntoma o efecto. Por ejemplo las afecciones tipificadas por piel seca, engrosada o anormalmente pigmentada pueden prevenirse por aplicación regular de las composiciones de la invención antes de la aparición de tal afección.
Preferiblemente los tratamientos se alcanzan usando métodos de polipéptidos de la invención. Sin embargo, el uso de los polinucleótidos codificados también se contempla. Esto puede alcanzarse, por ejemplo, por métodos de terapia génica, por ejemplo uso de secuencias de sentido para permitir la expresión de las moléculas deseadas en la piel.
El método de tratamiento o prevención de acuerdo a la invención puede combinarse ventajosamente con administración de uno o más ingredientes activos que son efectivos en al tratar o prevenir los trastornos o afecciones y/o para alcanzar hidratación o exfoliación. De esta manera, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden contener adicionalmente uno o más de tales ingredientes activos.
De acuerdo a un aspecto aún adicional de la invención se proporcionan productos que contienen uno o más polipéptidos o moléculas de ácido nucleico como se define en la presente y opcionalmente uno o más ingredientes activos adicionales como una preparación combinada para uso simultáneo, separado o secuencial en terapia humana o animal, preferiblemente como se describe en la presente.
Las composiciones de la invención pueden formularse en una manera convencional con uno o más portadores, excipientes y/o diluyentes fisiológicamente aceptables, de acuerdo a técnicas bien conocidas en el arte usando ingredientes ya disponibles .
De esta manera, el ingrediente activo puede incorporarse, opcionalmente junto con otras sustancias activas como una preparación combinada, con uno o más portadores, diluyentes y/o excipientes convencionales, para producir preparaciones galénicas convencionales tales como gránulos, pildoras, polvos, pastillas, sobrecitos, saquitos, elíxires, suspensiones (como fluidos de inyección o infusión), emulsiones, soluciones, jarabes, aerosoles (como un sólido o en un medio líquido) , ungüentos, cápsulas de gelatina suave y dura, supositorios, soluciones inyectables estériles, polvos empacados estériles, y similares. Los polímeros biodegradables (tales como poliésteres, polianhídridos , ácido poliláctico, o ácido poliglicólico) también pueden usarse para implantes sólidos. Las composiciones pueden estabilizarse por el uso de secado por congelado, subenfriamiento o Permazyme.
Los excipientes, portadores o diluyentes adecuados son lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidones, goma acacia, fosfato de calcio, carbonato de calcio, lactosa de calcio, almidón de maíz, alginatos, tragacanto, gelatina, silicato de calcio, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, celulosa, jarabe de agua, agua, agua/etanol, agua/glicol, agua/polietilenglicol, propilenglicol , metil celulosa, metilhidroxibenzoatos, propil hidroxibenzoatos , talco, estearato de magnesio, aceite mineral o sustancias grasas tales como grasa dura o mezclas adecuadas de los mismos. Los agentes para obtener formulaciones de liberación sostenida, tales como carboxipolimetileno, carboximetil celulosa, ftalato de acetato de celulosa, o polivinilacetato también pueden usarse.
Las composiciones pueden adicionalmente incluir agentes lubricantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes que incrementan la viscosidad, agentes granulantes, agentes desintegrantes, agentes de enlace, agentes activos osmóticos, agentes de suspensión, agentes de conservación, agentes edulcorantes, agentes saborizantes , potenciados de adsorción (por ejemplo agentes que penetran la superficie o para suministro nasal, por ejemplo sales biliares, lecitinas, tensoactivos , ácidos grasos, queladores) , agentes que imparten tono café, solvente orgánico, antioxidante, agentes estabilizantes, emolientes, silicón, ácido alfa-hidroxi , demulcente, agente anti-espumado, agente hidratante, vitamina, fragancia, espesantes iónicos o no iónicos, tensoactivos, rellenador, espesante iónico o no iónico, secuestrante, polímero, propelente, agentes alcalinizante o adicificantes , opacificador, agentes colorantes y compuestos grasos y similares.
Las composiciones de la invención pueden formularse así como para proporcionar liberación rápida, sostenida o retrasada del ingrediente activo después de la administración al cuerpo al emplear técnicas bien conocidas en el arte.
La composición puede estar en cualquier forma de dosificación apropiada para permitir suministro o para direccionar las células o tejidos particulares, por ejemplo como una emulsión o en liposomas, niosomas, microesferas, nanopartículas o similares con los cuales el ingrediente activo puede absorberse, adsorberse, incorporarse o enlazarse. Esto puede convertir efectivamente el producto a una forma insoluble. Estas formas en partículas pueden superar tanto problemas de estabilidad (por ejemplo degradación) como suministro.
Estas partículas pueden portar moléculas de superficie apropiadas para mejorar el tiempo de circulación (por ejemplo componentes de suero, tensoactivos , polioxamina 908, PEG etc.) o porciones para direccionamiento específico al sitio, tales como ligandos para receptores resistentes a la célula particulares. Las técnicas apropiadas para suministro de fármaco y para direccionamiento son bien conocidas en el arte y se describen en W099/62315.
El uso de soluciones, suspensiones, geles y emulsiones se prefieren, por ejemplo el ingrediente activo puede portarse en agua, un gas, un líquido basado en agua, un aceite, un gel, una emulsión, una emulsión aceite en agua o agua en aceite, una dispersión o una mezcla de los mismos.
Las composiciones pueden ser para administración tópica (esto es a la piel), oral o parenteral, por ejemplo por inyecció .
Las composiciones y administración tópicas sin embargo son preferidas, e incluyen geles, cremas, ungüentos, rocíos, lociones, bálsamos, barras, jarabes, polvos, películas, aerosoles, gotas, espumas, soluciones, emulsiones, suspensiones, dispersiones por ejemplo dispersiones de vesícula no iónicas, leches y cualquiera de otras formas farmacéuticas o cosméticas convencionales en la técnica.
Los ungüentos, geles y cremas pueden, por ejemplo, formularse con una base acuosa o aceitosa con la adición de agentes espesantes y/o gelificantes adecuados. Las lociones pueden formularse con una base acuosa o aceitosa y, en general, también contendrán uno o más agentes emulsionantes, dispersantes, de suspensión, espesantes o colorantes. Los polvos pueden formarse con la ayuda de cualquier base en polvo adecuada. Las gotas y soluciones pueden formularse con una base acuosa o no acuosa que comprenden también uno o más agentes de dispersión, solubilización o suspensión. Los rocíos en aerosol se suministran convencionalmente de paquetes presurizados , con el uso de un propelente adecuado.
Alternativamente, las composiciones se pueden proporcionar en una forma adaptada para administración oral o parenteral . Las formas farmacéuticas alternativas de esta manera incluyen gránulos planos o recubiertos, cápsulas, suspensiones y soluciones que contienen el componente activo opcionalmente junto con uno o más portadores y/o diluyentes convencionales inertes, por ejemplo con almidón de maíz, lactosa, sacarosa, celulosa microcristalina, estearato de magnesio, polivinilpirrolidona, ácido cítrico, ácido tartárico, agua, agua/etanol, agua/glicerol , agua/sorbitol , agua/polietilenglicol , propilenglicol , alcohol estearílico, carboximetilcelulosa o sustancias grasas tales como grasa dura o mezclas adecuadas de los mismos.
La concentración del ingrediente activo en composiciones de la invención, depende de la naturaleza del compuesto usado (esto es el polipéptido o molécula de ácido nucleico) , el modo de administración, el curso del tratamiento, la edad y peso del paciente, la indicación médica, el cuerpo o área corporal a tratarse y puede variarse o ajustarse de acuerdo a la elección. Generalmente sin embargo, los intervalos de concentración para el compuesto descrito en la presente es 0.0001, 0.0005, 0.001 o 0.01 hasta 25%, por ejemplo 0.0005-15%, por ejemplo 0.01 hasta 10%, tales como 0.1 o 0.5 hasta 5, por ejemplo 1-5% (p/p de la preparación final para administración, particularmente para administración tópica) .
Cuando más de un compuesto está presente, por ejemplo 3 VAP (o moléculas relacionadas) como se describe en la presente, cada compuesto puede estar presente en las cantidades descritas arriba. Las concentraciones se determinan en referencia a la cantidad del compuesto por sí mismo y de esta manera las asignaciones apropiadas deben hacerse para tomar en cuenta la pureza de la composición. Las dosis sencillas efectivas para VAP (y moléculas relacionadas) pueden permanecer en el intervalo desde 0. l-100mg/cm2/día, preferiblemente 0. l-10mg/cm2/día, cuando se aplica tópicamente, dependiendo del animal que se trata, tomadas como una dosis sencilla. Para coriolisina (y moléculas relacionadas) las dosis sencillas efectivas pueden permanecer en el intervalo desde 0. l-100mU/cm2/día, preferiblemente 0.5-10, por ejemplo l-5mU/cm/dí .
La administración puede ser por cualquier método adecuado conocido en las técnicas médicas, incluyendo por ejemplo administración oral, intestinal, percutánea, bucal, rectal o tópica o administración por inhalación. Las formas de administración preferidas se administrarán oralmente, o lo más preferiblemente tópicamente. Como se apreciará la administración oral tiene sus limitaciones si el ingrediente activo es digestible. Para superar tales problemas, los ingredientes pueden estabilizarse como se menciona previamente.
Se apreciará que ya que el ingrediente activo para realización de la invención toma una variedad de formas, por ejemplo molécula de ácido nucleico (que puede estar en un vector) o polipéptido, la forma de la composición y ruta de suministro variará. Preferiblemente sin embargo las soluciones líquidas, cremas o suspensiones deben emplearse, particularmente por ejemplo para suministro oral o administración tópica.
Ya sea el polipéptido o moléculas de ácido nucleico de la invención pueden usarse para las indicaciones médicas mencionadas arriba. En los últimos métodos de terapia de gen, las moléculas de ácido nucleico preferiblemente se proporcionan en vectores que son adecuados para transfección/transformación como se describe arriba, por ejemplo vectores víricos tales como adenovirus usando métodos de terapia del gen conocidos en la técnica para aplicaciones médicas .
Los animales a los cuales las composiciones pueden aplicarse o administrarse incluyen mamíferos, reptiles, pájaros, insectos y pez particularmente durante acuicultura de peces (por ejemplo salmón o bacalao) . Preferiblemente los animales a los cuales las composiciones de la invención se aplican son mamíferos, particularmente primates, animales domésticos, ganado y animales de laboratorio. De esta manera los animales preferidos incluyen ratones, ratas, conejos, cerdos de guinea, gatos, perros, monos, cerdos, vacas, cabras, ovejas y caballos. De forma especial preferiblemente las composiciones se aplican, o administran, a humanos.
Los siguientes ejemplos se dan a manera de ilustración únicamente en los cuales las Figuras referidas son como sigue : La Figura 1 muestra una focalización isoeléctrica de los VAP después de su purificación; Las Figuras 2A-2C muestran los efectos de VAP de salmón del Atlántico en epitelio humano en la cual A y B muestran el cultivo de piel expuesto a VAP, y C muestra el cultivo de la piel de control; y Las Figuras 3A y 3B muestran los efectos de coriolisina L de salmón del Atlántico en epitelio humano en la cual A muestra el cultivo de piel expuesto a coriolisina L, y B muestra el cultivo de piel de control.
Ejemplo 1; Identificación y caracterización de VAP Aislamiento de proteínas Durante el curso de analizar componentes de fluido de incubación del salmón del Atlántico, se identificaron nuevas proteínas presentes en el fluido de incubación.
Un método para preparar fluido parcialmente de incubación (del cual la zonasa puede prepararse) que puede usarse como el material de partida para aislar los VAP de la invención (o sus secuencias precursoras) se proporciona en 099/29836 que se incorpora por ello como referencia (particularmente Ejemplo 1 del método descrito, pero opcionalmente sin la etapa de urea) .
De esta manera, el siguiente método se ha usado para aislamiento. Los VAP se aislaron de fluido de incubación (crudo o filtrado a través de filtro de 0.45µp?). Posteriormente los VAP se precipitaron al agregar 4x volúmenes de acetona a temperatura ambiente o a 4°C. Después de 20-30 minutos los VAP precipitados se recolectaron como un peletizado después de la centrifugación en velocidad baja (alrededor de 5000xg) y se volvieron a suspender en la solución amortiguadora apropiada (por ejemplo TrisHCl lOmM, pH8.0 o PBS) .
La Figura 1 muestra 2D PAGE de los VAP después de su purificación como se describe arriba.
Análisis de secuencias Los VAP nuevamente identificados se sometieron a caracterización por análisis MS de las manchas tripsinizadas . El análisis MS fue MALDI -TOF-TOF (desorción/ionización láser asistida por matriz. Tiempo de vuelo x2 ) .
Los siguientes resultados se obtuvieron para el mejor emparejamiento como se refleja por el registro superior.
VAP I gi|185133695 Masa: 49859 Registro: 419 Esperado: 8.2e-36 Consultas igualadas: 7 Proteina de cascara de huevo [Salmo salar] Observado Mr(esp) Mr(calc) Delta Inicio Fin Fallo Iones Péptido SEQ ID No 1105.6858 1104.6785 1104.5928 0.0857 126 135 0 56 K.DGQ FWWSR. D 17 5 1439.6891 1438.6818 1438.6300 0.0519 210 220 0 102 R.DSHYDLVFQCR.Y 18 1538 8765 1537.8693 1537.8239 0.0453 221 234 0 — R.YTGTSVETLVIEVK.T 19 1785.9341 1784.9269 1784.8767 0.0501 193 209 0 — R.MSSSYWGIGPFGDITR.D 20 R.MSSSYWGIGPFGDITR.D + Oxidación (M) 1801.9253 1800.9180 1800.8717 0.0464 193 209 0 130 21 2023.1099 2022.1027 2022.0569 00458 118 135 1 93 K.TVA/QCTKDGQ FWWSR. D 22 2311.1242 2310.1169 2310.0686 0.0484 173 192 0 — K.VTECGTWTEEPDTIVYENR.M 23 15 VAP II qi|158132194 Masa: 59145 Registro: 502 Esperado: 4.1& 4 igualadas: 12 Coriogenina H beta [Oncorhynchus masou] Observado r(esp) Mr(calc) Delta Inicio Fin Falla Iones Péptido SEQ ID No 1089 .6560 1088 6488 1088. .5979 0 .0509 211 220 0 52 K.DGQFWWAR.D 24 5 1198 .6832 1197 .6759 1197. 6717 0 .0042 385 395 0 80 R.TDPNIVLTLGR.C 25 1346 .7405 1345 7333 1345. .7354 -0 0021 370 380 1 48 .VLRDPVYTEVR. I 26 1432 .6125 1431 .6052 1431. .6089 -0 0037 295 305 0 62 R.DSQYDLTFQCR.Y 27 1688 .7701 1687 .7629 1687. .7772 -0 0143 450 463 0 — K. FTFVDPMSMTPLR.E + Oxidación (M) 28 1704 .7646 1703 7573 1703 .7721 -0 0149 450 463 0 — K.MFTFVDPMSMTPLR.E + 2 Oxidación (M) 29 1720 .7581 1719. 7508 1719. .7671 -0 0162 450 463 0 — K.MFTFVDPMSMTPLR.E + 3 Oxidación (M) 30 10 1772 .8510 1771. .8438 1771. 8563 -0 .0126 278 294 0 93 R.MSSSYQVGVGPFGSITR.D 31 1788 .8447 1787. .8374 1787. 8513 -0. 0138 278 294 0 (88) R.MSSSYQVGVGPFGSITR.D + Oxidación (M) 32 1977 .0356 1976 .0284 1976 0514 -0. 0230 203 220 1 129 K.AVTVQCTKDGQFWWAR.D 33 2361 .0236 2360 0163 2360 0512 -0. .0349 258 277 0 — K.VTECGTVMTEETDTIIYENR.M 34 2377 .0210 2376 .0137 2376 .0461 -0. 0324 258 277 0 .— K.VTECGTVMTEETDTUYENR. M + Oxidación (M) 35 15 VAP III Comparación para péptidos de coriogenina (Oncorhynchus masou) Inicio- Fin Observado r(esp) Mr(calc) Delta Fallo Secuencia SEQ ID No 103 - 115 1572.7675 1571.7602 1571.7184 0.0418 1 R.AECRENMVHVEAK.H (No match) 36 103 - 115 1588.7668 1587.7596 1587.7133 0.0462 1 R.AECRENMVHVEAK.H Oxidación (M) (No igualado) 37 188 - 201 1733.8167 1732.8094 1732.7661 0.0434 0 R.TNDAMINIECHYPR.K (No igualado) 38 188 - 201 1749.8474 1748.8401 1748.7610 0.0791 0 R.TNDAMINIECHYPR.K Oxidación (M) (registro de iones 39 82) 222 - 232 1421.7118 1420.7045 1420.6696 0.0348 0 K.YAEELLYFSMR.L (No igualado) 40 222 - 232 1437.7161 1436.7088 1436.6646 0.0443 0 K.YAEELLYFSMR.L Oxidación (M) (Registro de iones 33) 41 233 - 242 1312.6294 1311.6221 1311.5918 0.0304 0 R.LMTADWQYER.A (No igualado) 42 233 - 242 1328.6293 1327.6220 1327.5867 0.0354 0 R.LMTADWQYER.A Oxidación (M) (Registro de iones 37) 43 269 - 287 2130.1 112 2129.1039 2129.0575 0.0464 0 R.IFVDSCVATLEPNINANPR.Y (Registro de iones 143) 44 10 302 - 312 1278.6242 1277.6169 1277.5645 0.0524 0 K.MTGSHSQFMPR.S (No igualado) 45 318 - 326 1172.6300 1171.6228 1171.6026 0.0202 0 K.LYFQVEAFR.F (Registro de iones 78) 46 15 De los resultados de arriba, las secuencias de los VAP se generaron al identificar péptido en la secuencia VAP por MS y luego insertar las secuencias intervenidas usando porciones relevantes de la secuencia nativa conocida a la cual la comparación se hizo. Las secuencias VAP identificadas por este proceso se establecen en SEQ ID Nos. 2-4 y las secuencias nativas contra las cuales se compararon se proporcionan en SEQ ID Nos. 5-8.
Ejemplo 2: Aplicaciones médicas/cosméticas de VAP in vitro Materiales y Métodos Los siguientes estudios se llevaron a cabo usando los VAP de salmón del Atlántico preparados como se describe en el Ejemplo 1.
Los cultivos de epitelio de piel humana diferenciados se obtuvieron de SkinEthics (Nice, Francia) en el día 16 después de la siembra en sustratos de crecimientos plásticos con microporos que permiten que los nutrientes accedan al tejido epitelial de a continuación. Tales cultivos muestran morfología de piel normal después de la diferenciación durante el periodo de cultivo a 37°C. Estos cultivos se mantuvieron durante dos días más in vitro de manera que el córneo de estrato superior se expuso a aire, y de referencia del estrato para el substrato de crecimiento.
Los cultivos paralelos se movieron hasta 30 °C atmosfera húmeda y presentaron con un medio de solución amortiguadora salida de fosfato que contiene Ca, Mg durante 6 horas con o sin la presencia de VAP a 0.5mg/ml (medido en OD280) . Los cultivos se fijaron en forraalina e incrustaron en parafina de acuerdo a procedimientos estándares, y tiñeron con hematoxilina/eosina.
Resultados A. Efectos Humectantes Los resultados se muestran en las Figuras 2A-2C en la cual A y B muestra el cultivo de piel expuesto a VAP y C muestra el cultivo de piel de control. Estas figuras muestran que los VAP provocan las láminas de córneo de estrato de la piel para separar, de esta manera ocurre la "deslaminación" . Las láminas no quitan, o exfolian, simplemente se separan una de la otra.
Esta separación se provoca por proteínas anfifílicas altamente cargadas que se intercalan en el córneo del estrato, y que debido a su carácter anfifílico porta agua para separar las láminas de piel . El agua por lo tanto se superpone en el córneo del estrato por los VAP reduciendo la pérdida de agua trans-epidérmica (TEWL, por sus siglas en inglés) .
Ejemplo 3: Aplicaciones médicas/cosméticas de coriolisina L in vitro Materiales y Métodos Los siguientes estudios se llevaron a cabo usando la coriolisina L de salmón del Atlántico preparada como se describe en Yasumasu et al., 1989, supra, de fluido de incubación de salmón.
Los cultivos de epitelio de la piel humana se prepararon como se describe en el Ejemplo 2 y coriolisina L de fluido de incubación de salmón se aplicó en 0.15mU/ml durante 6 horas a 30°C.
Resultados A. Efectos de exfoliación Los resultados se muestran en la Figuras 3A y 3B en las cuales la Figura 3A muestra el cultivo de piel expuesto a coriolisina L de salmón y la Figura 3B muestra el cultivo de piel de control. Los resultados muestran que coriolisina L provoca deslaminación y ruptura de láminas de la piel.
La exfoliación también puede analizarse al evaluar el sobrenadante de cultivos de piel para evaluar la cantidad de células epiteliales que se remueven de los cultivos de piel durante el tratamiento. Ya que coriolisina L se inhibe por EDTA lmM, sus efectos pueden inhibirse fácilmente para probar su acción en la piel.
Ejemplo 4; Aplicaciones médicas/cosméticas de VAP y coriolisina L in vivo Aplicaciones cosméticas A los individuos que padecen de piel seca y/o piel que requiere exfoliación (por ejemplo callosidades o granos) se les administran cremas cosméticas o de placebo como se describe a continuación. El tratamiento se repite periódicamente, por ejemplo cada 8 horas.
Los efectos de la crema en la piel se analizan basados en efectos cualitativos tales como apariencia y sensación (por ejemplo picazón) o pueden analizarse más cuantitativamente, por ejemplo en contenido de agua o grosor.
Aplicaciones médicas Los individuos que padecen de una afección o anormalidad de la piel tales como acné, eczema o psoriasis se les administra tratamiento o cremas de placebo como se describe a continuación. El tratamiento se repite periódicamente, por ejemplo cada 8 horas .
Los efectos de la crema en la piel se analizan basados en efectos cualitativos tales como apariencia, sensación (por ejemplo dolor) o color o pueden analizarse más cuantitativamente, por ejemplo en tamaño de la anormalidad restante, extensión de inflamación o grosor.
Crema placebo: Crema cosmética/de tratamiento con ingrediente activo al 10%: Secuencias : SEQ ID No. 1: Coriolisina L - salmón del Atlántico MDHRPTLSLL LLLLLLGLSQ ASGNEFHDEP DHVSITSVIL KSNNGTNELL LDGDILAPRT RNAMKCFSSQ YSCL KKSSD GLVYVPYILS AVYSSLEVET lETAMKYFQG KTCIRFIPRK TQTAYLDIQS SGGCFGTVGT VGDRQTLSLA QFGCVQHGII QHELLHALGF YHEHNRSDRE QYIRIN QYI YDYAVGNFQK EDTNNLHTAY DYSSVMHYDR TAYTNDYGKE TITPIPDPSV AIGQRLGMSD IDVLKVNKLY QC SEQ ID No. 2: VAP I - salmón del Atlántico TVTVQCTKDG QFVWVSRDA TLPNLELDSI SLLGANGAHC TPVGTTSAFA IYQFKVTECG TWTEEPDTI VYENRMSSSY WGIGPFGDI TRDSHYDLVF QCRYTGTSVE TLVIEVK SEQ ID No. 3: VAP II - Salmón AVTVQCTKDG QFWWARDA TLPSLELDSI SLLGTNGPHC HAIGTTSVFA IYQFKVTECG TVMTEETDTI IYENRMSSSY QVGVGPFGSI TRDSQYDLTF QCRYKGSTIV AWIDVKPVP PPNPDIAPGP LTVELRLGSG TCLTKGCNEE EVAYTSYYTE ADYPVTKVLR DPVYTEVRIL ARTDPNIVLT LGRCWATTNP NPLSLPQWDL LIDGCPYQDD RYLTTPINVG PSSGLSFPTH YRRFVLKMFT FVDPMSMTPL R SEQ ID No. 4: VAP III - Salmón AECRENMVHV EAKHDLLGIG QLIQLEDLTL GDCPMSGFDN INQVLIFESP LQSCGSQLRM TTNSLIYIFT LYYKPKPLAN TPLIRTNDAM INIECHYPRK H VSSLALIP TWTPFSAAKY AEELLYFSMR LMTADWQYER AGNMYVLGDM VNIEASVMQY FHVPLRIFVD SCVATLEPNI NA PRYAFIE NHGCLIDAKM TGSHSQFMPR SADYKLYFQV EAFR SEQ ID No. 5: Proteína zr de longitud completa - salmón del Atlántico MKWSAVCLVA VATLGWLCDA QNFLEKPGWP PIQTPPSWPP QTPQRPVQPL PQRPAQPFLQ KPAQPIPQRI PYTEDDTKQT CEWDKDKVS CGLSGITAAQ CQAISCCFDG RMCFYGKTVT VQCTKDGQFV VWSRDATLP NLELDSISLL GANGAHCTPV GTTSAFAIYQ FKVTECGTW TEEPDTIVYE NRMSSSYWG IGPFGDITRD SHYDLVFQCR YTGTSVETLV IEVKTYPNPN PWTVDAVLN VELRLANGRC LSKGCDEMQE AYTSYYTVAD YPVTKVLRDP VYAEVRILG TDPNWLTLE QCWATIDPTG DRLPR DLLV NGCPYQDDRY LTVPIASDSS YIPPGEFLSH YKRFVFKMFT FVDPTSMVPL QENVYIHCRA TVCHALAGSC EQRCNRQRRD LSAQGQKKTK GDVWSSQKV IMIDPSLYA SEQ ID No. 6: Coriogenina H de longitud completa - salmón del Pacífico MKWSAVCLVA VATLGWLCDA QIYLEKPGWP PIQTPASWPA QPPEKPVQPP QRPAQPPQWP AQPPQWPAQP PQRPAQPPQR PAQTQQWPGQ PPQRPAQPPQ WPAQPPQRPA QPPQRPAQPP QRPAQPPPRP AQPPQWPVHP PQWPVQPGTP LQRPKFPSDP GSKQSCDVDS QHKVQCGLPD ITAAHCDAIN CCFDGRMCFY GKAVTVQCTK DGQFWWAR DATLPSLELD SISLLGTNGP HCHAIGTTSV FAIYQFKVTE CGTVMTEETD TIIYENRMSS SYQVGVGPFG SITRDSQYDLTFQCRYKGST IVAWIDVKP VPPPNPDIAP GPLTVELRLG SGTCLTKGCN EEEVAYTSYY TEADYPVTKV LRDPVYTEVR ILARTDPNIV LTLGRC ATT NPNPLSLPQ DLLIDGCPYQ DDRYLTTPIN VGPSSGLSFP THYRRFVLKM FTFVDPMSMT PLRETVFIHC NTAVCLPSHG DSCEPRCYRK RRDIPAAVQK TTRIKSNLVS SGELILTDPR ELTN SEQ ID No. 7: Coriogenina L de longitud completa - salmón del Pacífico MAMKWSWCL VAVAMLGCLC VAQIWPPSIK PVQQPFRPNR PPPQQPQQPP YQKPRIPPKD QTQAKQKFET PLDWTYPLDP KPEPKIIGGS EARTPVAANS VRAECRENMV HVEAKHDLLG IGQLIQLEDL TLGDCPMSGF DNINQVLIFE SPLQSCGSQL RMTTNSLIYI FTLYYKPKPL ANTPLIRTND AMINIECHYP RKHNVSSLAL IPTWTPFSAA KYAEELLYFS MRLMTADWQY ERAGNMYVLG DMVNIEASVM QYFHVPLRIF VDSCVATLEP NINANPRYAF IENHGCLIDA KMTGSHSQFM PRSADYKLYF QVEAFRFQSQ RGSDPIIPQK TKIPFQPAAD YPATLDMIFL TCHLKATTIA FPIDFEYKAC SFINT REAG GNDGVCGCCD STCSNRKGRD TTTHQKPANI EGDVQLGPI FISEKVEQ SEQ ID No. 8: Proteína z alternativa - salmón del Atlántico K SYQLPQKL AQPLPQKPAQ PLPQWPVQPL PQRPAEPLPQ RPAQPLPQWP VQPLPQRPAE PLPQRPAQPL PQRPVQPLPQ RPAQPFLQKP AQPIPQRIPY TKDDTKQTCE WDKDKVSCG LSGITAAQCQ AISCCFDGR CFYGKTVTFQ CTKDGQFVW VSRDATLPNL ELDSISLLGA NGAHCTPVGT TSAFAIYQFK VTECGTWTE EPDTIVYENR MSSSYWGIG PFGDITRDSH YDLVFQCRYT GTSVETLVIE VKTYPNPNPV VTVDAVLNVE LRLANGRCLS KGCDEMQEAY TSYYTVADYP VTKVLRDPVY AEVRILGMTD PNWLTLEQC WATTDPTGDR LPRWDLLVNG CPYQDDRYLT VPIASDSSYI PPGEFLSHYK RFVFKMFTFV DPTSMVPLQE NVYIHCRATV CHALAGSCEQ RCNRQRRDLS AQGQKKTKGD VWSSQKVIM IDPSLYA SEQ ID No. 9: Secuencias de nucleótido, coriolisina L, salmón del Atlántico atggaccacagacccactcttagcctgcttctgctgctgctgctgctgggcctatcacaggcc agtggaaatgagttccatgatgagccggaccatgtgtccatcacttcagtaatcctgaagtcc aacaacggaaccaatgagctactgctggatggagacattctagctcctagaaccaggaacgcc atgaagtgctttagcagccagtacagctgtctctggaagaagtcatctgacggcttggtgtac gtgccttacatcctcagcgctgtatattccagcttggaggtagagactattgagacggccatg aagtacttccaaggcaagacctgcatccgcttcattccacgtaagacacagactgcctacctg gacattcagagcagcggcgggtgttttggtaccgtggggactgttggggacaggcagacattg tctcttgcacagtttggctgtgttcaacatggtatcatccagcatgagctgcttcacgccctg ggcttctaccacgagcacaacaggagtgaccgtgaacagtatatcaggatcaactggcaatac atctatgactacgccgttgggaacttccagaaggaggacaccaacaacctgcacactgcatac gactactcctctgtcatgcactatgatagaaccgcttacactaacgactacggaaaggaaacc atcactcccatcccagacccatctgtggccattggacagagactgggcatgtccgacattgat gtcctgaaggtcaacaagctctaccaatgctaagaggaagagcgccattgttgaaaatgtgtg atgctggatgtgctgtcatgtgctgatgtattttattgttggaagtttgtatgtatcctttta atcacattggtaataataaagcatggttatggtaaaaaaaaa SEQ ID No. 10: Secuencia de nucleótidos que codifica la SEQ ID No. 2, VAP I acagtgactgtccagtgtaccaaggatggccagtttgtggtggtggtttccagggatgcca ctctgcccaaccttgagctagattccatcagcctgctaggggcaaacggagcccactgcac ccctgtcggcaccacatctgcctttgccatctaccagttcaaagttactgaatgtggaact gtggtgacggaggaacctgatactattgtctatgagaacaggatgtcctcttcatatgtag tggggattggacccttcggcgacattaccagggacagccactatgacctggtcttccagtg tcggtatactgggacttccgttgagacattggttatcgaggtgaaa SEQ ID No. 11: Secuencia de nucleótidos que codifica la SEQ ID No. 3, VAP II gcagtgactgttcagtgtaccaaggatggccagtttgtggtggtggtggccagggatgcca ctctgcccagcctggaactggactccatcagcctgctggggacaaacggaccccactgcca tgctattggcacaacttctgtctttgccatctaccagtttaaagtcactgaatgtggaact gtcatgacggaggaaactgatactattatctatgagaataggatgtcctcttcatatcaag tgggggttggcccctttggctccatcaccagggacagccaatatgatctaacattccagtg cagatataagggcagtaccattgtggctgtggttattgatgtgaagccggttcctcctcca aatcctgatatagctcctggacccctcacagttgagctcagactcggcagcggaacatgcc ttaccaagggatgtaatgaagaggaagtggcctacacctcttactacacagaggcagacta ccctgtcaccaaggtcc caggga cctgtgtacactgaggttcgcatcctggcgaggaca gatcccaacattgtgctgaccctgggtcgctgctgggctaccacaaacccaaaccctctca gcctgccccagtgggaccttctcattgatggatgtccttaccaggatgaccgttacctgac cactcccatcaatgtgggaccctcttcgggtctgtccttcccaacccactacaggcgcttc gtccttaagatgttcacctttgtggatccaatgtctatgacccccctgagg SEQ ID No. 12: Secuencia de nucleótidos que codifica la SEQ ID No. 4, VAP III gctgagtgcagggagaacatggtccacgtggaagcgaagcatgacctgctggggatcggcc agttgatccagctagaagacctcactttgggagactgccctatgtctggattcgacaatat caaccaggtgctcatctttgagtctccgctgcagtcatgtggcagccagctaaggatgact accaactccctcatctacatcttcactctatattacaaacccaaacctctggcaaacaccc ccctcatcaggacaaatgacgcgatgatcaatattgagtgccactatccaaggaaacacaa tgtgagcagcctggccctgatcccaacctggacccctttctccgctgctaagtatgcagag gaactcctgtacttctccatgaggctcatgactgctgactggcagtatgagagggccggta acatgtacgtgttgggtgatatggtgaacatcgaggcctctgtcatgcagtacttccacgt tcccctgcgtatctttgtggacagctgtgtggccaccctggaacccaacataaacgccaat cccagatatgccttcattgagaatcatgggtgtctgatcgatgccaaaatgacaggttccc actcccagttcatgcctcgttccgcagactacaagctgtatttccaggtggaggctttcag 9 SEQ ID No. 13: Secuencia de nucleótidos de longitud completa que codifica la SEQ ID No. 5, salmón del Atlántico de proteína zr atgaagtggagtgcagtttgtctagtggcagtggccacgcttggctggctgtgtgatgctc agaatttcttggaaaaaccagggtggccacccatccagacaccaccgtcatggcctcccca aacccctcagaggcctgtccaaccccttcctcagagacctgctcaaccctttcttcagaag cctgcccaacccatacctcaacggataccctacaccgaagacgacacaaaacagacctgtg aggttgtggacaaggacaaggtgtcgtgtggactttctggcatcactgctgcccaatgcca ggccatcagctgctgttttgatggacggatgtgcttctacgggaaaacagtgactgtccag tgtaccaaggatggccagtttgtggtggtggtttccagggatgccactctgcccaaccttg agctagattccatcagcctgctaggggcaaacggagcccactgcacccctgtcggcaccac atctgcctttgccatctaccagttcaaagttactgaatgtggaactgtggtgacggaggaa cctgatactattgtctatgagaacaggatgtcctcttcatatgtagtggggattggaccct tcggcgacattaccagggacagccactatgacctggtcttccagtgtcggtatactgggac ttccgttgagacattggttatcgaggtgaaaacgtatccaaaccccaacccagtggtcact gttgatgcagttctcaacgtggagctccgactggccaatggacgttgtctctccaagggat gtgatgaaatgcaagaagcatacacctcttactacacggtggcagactaccctgtcaccaa ggtcctcagggatcccgtgtacgctgaggttcgcatcctggggatgacagatcccaatgtt gtcctgacactggagcagtgctgggccaccatagaccccacaggtgataggctgccccggt gggacctactagttaatgggtgtccctaccaggatgaccgttacctgaccgtgcccatcgc ctcggacagctcctatatccctccgggagaattcttatcccactacaagcgcttcgtcttc aagatgttcacctttgtggatccgacatctatggtccccctgcaggagaacgtgtacatcc actgtcgtgcaacagtgtgccacgctctagcaggatcctgtgaacaaaggtgcaacaggca aaggagagatctttctgctcaaggccaaaagaagactaaaggagatgttgtggtttccagt caaaaagtcatcatgattgacccaagtctttatgcttaa SEQ ID No. 14: Secuencia de nucleótidos de longitud completa que codifica la SEQ ID No. 6, coriogenina H - salmón del Pacífico atgaagtggagtgcagtttgtctagtggcagtggccacgcttggctggctgtgtgatgctc agatttacttggaaaaaccagggtggccacccatccagacaccagcgtcatggcctgccca accccctgagaagcctgttcaaccccctcagaggcctgcccagccccctcagtggcctgcc cagccccctcagtggcctgcccagccccctcagaggcctgcccagccccctcagaggcctg cccaaacccagcagtggcctggccaaccccctcagaggcctgcccagccccctcagtggcc tgcccaaccccctcagaggcctgcccaaccccctcaaagacctgcccaaccccctcagagg cctgcccaaccccctccgaggcctgcccaaccccctcagtggcctgttcatceceetcagt ggcctgtccaacccggtacgccgcttcagaggcctaaattcccctctgacccaggctcaaa gcagagctgtgatgttgatagccaacacaaggtgcagtgtggacttcctgacatcactgcc gcccattgtgatgccattaactgctgttttgatggacggatgtgcttctacggaaaagcag tgactgttcagtgtaccaaggatggccagtttgtggtggtggtggccagggatgccactct gcccagcctggaactggactccatcagcctgctggggacaaacggaccccactgccatgct attggcacaacttctgtctttgccatctaccagtttaaagtcactgaatgtggaactgtca tgacggaggaaactgatactattatctatgagaataggatgtcctcttcatatcaagtggg ggttggcccctttggctccatcaccagggacagccaatatgatctaacattccagtgcaga tataagggcagtaccattgtggctgtggttattgatgtgaagccggttcctcctccaaatc ctgatatagctcctggacccctcacagttgagctcagactcggcagcggaacatgccttac caagggatgtaatgaagaggaagtggcctacacctcttactacacagaggcagactaccct gtcaccaaggtcctcagggatcctgtgtacactgaggttcgcatcctggcgaggacagatc ccaacattgtgctgaccctgggtcgctgctgggctaccacaaacccaaaccctctcagcct gccccagtgggaccttctcattgatggatgtccttaccaggatgaccgttacctgaccact cccatcaatgtgggaccctcttcgggtctgtccttcccaacccactacaggcgcttcgtcc ttaagatgttcacctttgtggatccaatgtctatgacccccctgagggagacggtgttcat ccattgtaatacagctgtgtgtctgccatcccatggagacagctgtgaaccaagatgctac agaaagaggagagacattcctgctgcagtccagaagaccaccagaatcaagtctaatttgg tttccagtggcgaactgatcctgactgacccaagggagctcaccaactag SEQ ID No . 15: Secuencia de nucleótidos de longitud completa que codifica la SEQ ID No. 7, coriogenina L - salmón del Pacífico atggcgatgaagtggagtgtagtttgtctcgtggcagtggccatgcttggctgtctgtgtg ttgctcagatttggccaccctccattaaaccagtgcagcaacccttcagacccaatcgtcc accacctcagcagcctcagcaaccaccgtatcagaaacccaggatcccaccaaaagaccaa acccaggccaagcagaagtttgagacaccattggattggacctatcctctggacccaaagc cagagcccaagattattgggggctcagaggcgagaacccctgtggctgccaattcagtgag ggctgagtgcagggagaacatggtccacgtggaagcgaagcatgacctgctggggatcggc cagttgatccagctagaagacctcactttgggagactgccctatgtctggattcgacaata tcaaccaggtgctcatctttgagtctccgctgcagtcatgtggcagccagctaaggatgac taccaactccctcatctacatcttcactctatattacaaacccaaacctctggcaaacacc cccctcatcaggacaaatgacgcgatgatcaatattgagtgccactatccaaggaaacaca atgtgagcagcctggccctgatcccaacctggacccctttctccgctgctaagtatgcaga ggaactcctgtacttctccatgaggctcatgactgctgactggcagtatgagagggccggt aacatgtacgtgttgggtgatatggtgaacatcgaggcctctgtcatgcagtacttccacg ttcccctgcgtatctttgtggacagctgtgtggccaccctggaacccaacataaacgccaa tcccagatatgccttcattgagaatcatgggtgtctgatcgatgccaaaatgacaggttcc cactcccagttcatgcctcgttccgcagactacaagctgtatttccaggtggaggctttca ggttccagagccagagggggagtgacccaattattccgcagaaaacaaagataccttttca gcctgcggcagattatcccgctacgctcgacatgatcttccttacctgtcacctgaaggca accacaatcgctttccccattgattttgagtacaaggcctgctctttcattaatacgtgga gggaggctggtgggaatgatggagtgtgtggctgctgtgactccacctgtagcaacaggaa gggacgcgataccactacacatcaaaaaccagcaaatatatgggagggagatgttcagctt ggtcccatctttatctcggaaaaggttgagcaataa SEQ ID No. 16: Secuencia de nucleótidos de longitud completa que codifica la SEQ ID No. 8, salmón del Atlántico de proteína zr alternativo gaagtggtcttaccaactccctcagaagcttgcccaaccccttcctcagaagcctgcccaa cctcttcctcagtggcctgtccaaccccttcctcagaggcctgctgaaccccttcctcaga ggcctgctcaaccccttcctcagtggcctgtccaaccccttcctcagaggcctgctgaacc ccttcctcagaggcctgctcaaccccttcctcagaggcctgtccaaccccttcctcagaga cctgctcaaccctttcttcagaagcctgcccaacccatacctcaacggataccctacacca aagacgacacaaaacagacctgtgaggttgtggacaaggacaaggtgtcgtgtggactttc tggcatcactgctgcccaatgccaggccatcagctgctgttttgatggacggatgtgcttc tacgggaaaacagtgactttccagtgtaccaaggatggccagtttgtggtggtggtttcca gggatgccactctgcccaaccttgagctagattccatcagcctgctaggggcaaacggagc ccactgcacccctgtcggcaccacatctgcctttgccatctaccagttcaaagttactgaa tgtggaactgtggtgacggaggaacctgatactattgtctatgagaacaggatgtcctctt catatgtagtggggattggacccttcggcgacattaccagggacagccactatgacctggt cttccagtgtcggtatactgggacttccgttgagacattggttatcgaggtgaaaacgtat ccaaaccccaacccagtggtcactgttgatgcagttctcaacgtggagctccgactggcca atggacgttgtctctccaagggatgtgatgaaatgcaagaagcatacacctcttactacac ggtggcagactaccctgtcaccaaggtcctcagggatcccgtgtacgctgaggttcgcatc ctggggatgacagatcccaatgttgtcctgacactggagcagtgctgggccaccacagacc ccacaggtgataggctgccccggtgggacctactagttaatgggtgtccctaccaggatga ccgttacctgaccgtgcccatcgcctcggacagctcctatatccctccgggagaattctta tcccactacaagcgcttcgtcttcaagatgttcacctttgtggatccgacatctatggtcc ccctgcaggagaacgtgtacatccactgtcgtgcaacagtgtgccacgctctagcaggatc ctgtgaacaaaggtgcaacaggcaaaggagagatctttctgctcaaggccaaaagaagact aaaggagatgttgtggtttccagtcaaaaagtcatcatgattgacccaagtctttatgctt aa Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (21)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Una composición farmacéutica o cosmética caracterizada porque comprende: i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID No. 1 o una secuencia que es al menos 50% idéntica a la secuencia, o una porción de cualquiera de la secuencia; (ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID No. 2 o una secuencia que es al menos 50% idéntica a la secuencia, o una porción de cualquiera de la secuencia; (iii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID No. 3 o una secuencia que es al menos 50% idéntica a la secuencia, o una porción de cualquiera de la secuencia; (iv) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID No. o una secuencia que es al menos 50% idéntica a la secuencia, o una porción de cualquiera de la secuencia; y/o (v) una o más moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido como se establece en cualquiera de (i) hasta (iv) anterior o una secuencia complementaria del mismo, y uno o más excipientes y/o diluyentes farmacéuticamente o cosméticamente aceptables.
2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico de (v) comprende una secuencia de nucleótidos como se establece en cualquiera de SEQ ID Nos. 9-12 o una secuencia que es al menos 50% idéntica a la secuencia, o una secuencia que hibridiza a la secuencia bajo condiciones de enlace no severas de 6 x SSC/50% formamida a temperatura ambiente y lavado bajo condiciones de alta severidad, o una secuencia complementaria a cualquiera de las secuencias anteriormente mencionadas, o una porción de cualquiera de la secuencias.
3. La composición de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque comprende más de uno de los polipéptidos y/o sus secuencias codificadas, preferiblemente un polipéptido como se establece en cada una de (ii) hasta (iv) .
4. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 3 , caracterizada porque cada uno de los polipéptidos establecidos en (ii) hasta (iv) , cuando se presenta, consiste de: (a) una secuencia de aminoácidos como se establece en cualquiera de SEQ ID Nos. 2-4 o una secuencia que es al menos 50% idéntica a la secuencia, o una porción de cualquiera de la secuencias; y opcionalmente (b) una secuencia de aminoácidos de flanqueo en la terminal N y/o C de la secuencia de aminoácidos en (i) que es desde 1 hasta 100 aminoácidos en longitud, y en donde cada una de las secuencias de ácido nucleico que codifica un polipéptido establecido en (ii) hasta (iv) consiste de una secuencia de nucleótido que codifica sólo el polipéptido o una secuencia complementaria del mismo.
5. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizada porque es para uso en la terapia .
6. Un método cosmético o no cosmético para exfoliar y/o humectar la piel de un animal, caracterizado porque el polipéptido, molécula de ácido nucleico o composición farmacéutica como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 5 se administra al animal.
7. Un polipéptido, molécula de ácido nucleico o composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizados porque son para uso en exfoliar y/o humectar la piel de un animal.
8. Un método cosmético o no cosmético para tratar o prevenir una afección o trastorno de la piel de un animal en donde la piel es anormalmente seca, el estrato córneo de la piel es anormalmente grueso o la piel tiene un trastorno de pigmentación, caracterizado porque un polipéptido, molécula de ácido nucleico o composición farmacéutica como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-5 se administra al animal .
9. Un polipéptido, molécula de ácido nucleico o composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizados porque son para uso en un método cosmético o no cosmético para tratar o prevenir una afección o trastorno de la piel de un animal, caracterizado porque la piel es anormalmente seca, el estrato córneo de la piel es anormalmente grueso o la piel tiene un trastorno de pigmentación .
10. Un método, polipéptido, molécula de ácido nucleico o composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 8 o 9, caracterizados porque la afección o trastorno de la piel a tratarse o prevenirse es eczema, dermatitis por contacto, psoriasis, ictiosis o acné.
11. Un método, polipéptido, molécula de ácido nucleico o composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 8 o 9, caracterizados porque la afección o trastorno de la piel a tratarse o prevenirse es callosidades, callos, verrugas o manchas hepáticas.
12. Un polipéptido, caracterizado porque consiste de: (i) una secuencia de aminoácidos como se establece en cualquiera de SEQ ID Nos. 2-4 o una secuencia que es al menos 50% idéntica a la secuencia, o una porción de cualquiera de la secuencias; y opcionalmente (ii) una secuencia de aminoácidos de flanqueo en el N y/o C terminal de la secuencia de aminoácidos en (i) que es desde 1 hasta 100 aminoácidos en longitud.
13. Una molécula de ácido nucleico, caracterizada porque consiste de una secuencia de nucleótido que sólo codifica un polipéptido de conformidad con la reivindicación 12 o una secuencia complementaria del mismo.
14. Una molécula de ácido nucleico, caracterizada porque consiste de: (i) una secuencia de nucleótido como se establece en cualquiera de SEQ ID Nos. 10-12, una secuencia que es al menos 50% idéntica a la secuencia, o una secuencia que hibridiza a la secuencia bajo condiciones de enlace no severas de 6 x SSC/50% formamida a temperatura ambiente y lavado bajo condiciones de alta severidad, o una secuencia complementaria a cualquiera de las secuencias anteriormente mencionadas, o una porción del mismo; y opcionalmente (ii) una secuencia de nucleótido de flanqueo en el extremo 5' o 3' de la secuencia de nucleótido en (i) que es desde 1 hasta 300 nucleótidos en longitud, o una secuencia complementaria del mismo.
15. Un vector, preferiblemente un vector de expresión, caracterizado porque comprende una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 13 o 14.
16. Un método para preparar moléculas de ácido nucleico recombinantes de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque comprende insertar secuencias de nucleótido de conformidad con la reivindicación 13 o 14 en el ácido nucleico del vector.
17. Un método para preparar un polipéptido de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque comprende cultivar una célula hospedera que contiene una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 13 o 14, bajo condiciones por medio de las cuales el polipéptido se expresa y se recupera la molécula así producida.
18. Un polipéptido, caracterizado porque es preparado por el método de conformidad con la reivindicación 17.
19. Una célula que contiene un polipéptido de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la célula se ha modificado con relación a las células nativas por expresión de material de ácido nucleico codificado.
20. Un método para aislar uno o más polipéptidos de conformidad con la reivindicación 12 del fluido de incubación, caracterizado porque comprende al menos las etapas de : a) suspender huevos en un volumen mínimo de agua; b) inducir la incubación rápida, sincronizada, de los huevos ; c) filtrar los huevos incubados para obtener el fluido de incubación; d) agregar acetona al fluido de incubación hasta una concentración final de 80% v/v; e) someter el fluido a centrifugación de baja velocidad en donde el VAP se presenta en el peletizado así formado; y opcionalmente f) separar los polipéptidos presentes en el peletizado de la etapa e) para aislar los polipéptidos individuales aislados.
21. Un VAP, caracterizado porque es preparado por el método de conformidad con la reivindicación 20.
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