CN112553274B - 大豆提取物Bowman-Birk inhibitor切割DNA的方法 - Google Patents

大豆提取物Bowman-Birk inhibitor切割DNA的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了大豆提取物Bowman‑Birk inhibitor切割DNA的方法，属于医药技术领域。本发明提供了大豆Bowman‑Birk胰蛋白酶抑制剂BBI‑A的一种新应用，将BBI‑A应用于DNA的切割中，通过条件的优化，使得切割效率可达100％，可有效切割DNA。为制备DNA结构探针、并且为潜在制备抗肿瘤药物提供了新的可能。

Description

大豆提取物Bowman-Birk inhibitor切割DNA的方法
技术领域
本发明涉及大豆提取物Bowman-Birk inhibitor切割DNA的方法，属于医药技术领域。
背景技术
核酸是重要的生物大分子，是所有已知生命形式必不可少的组成物质，它在生物的生长、发育和繁殖等活动中，具有非常重要的作用。在核酸化学研究领域核酸切割剂具有至关重要的作用，在生物化学和分子生物学领域，核酸切割剂的研究受到人们广泛的关注，通过对核酸切割剂的研究可以获得生物体内的一些重要信息，提供生物体内核酸酶的作用机制，在医药及生物方向具有极大的研究价值。
Bowman–Birk inhibitor(BBI)是从大豆中分离出的一种典型的天然蛋白酶抑制剂,迄今为止，已从大豆中分离出五种BBI亚型(A、B、C-II、D-II和E-I)，据现有研究已知，在植物中的作用中BBI-A蛋白酶抑制剂与在人体中的作用α-1抗胰蛋白酶很相似，两者都因为这样的特点具有较高的抗癌活性，在对各自机体防护中起着至关重要的作用。正因BBI-A蛋白酶抑制剂有着这样与生命息息相关的活性，因此现在越来越多人们关注研究BBI-A。
据现有实验结果可知，国内外对BBI-A的研究主要集中在BBI-A本身的提取、分离、结构、生物活性和应用前景等，尤其是对抗炎、抗病毒领域研究较多，而在其他领域涉及较少。
因此，进一步挖掘BBI-A的潜在功能，将能够更加有助于更好地利用BBI-A。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明申请人提供了一种BBI-A来切割DNA，本发明的目的是提供一种BBI-A在质粒DNA切割方面的应用，实现了一种新的DNA切割方式。本发明BBI-A对DNA存在切割作用且确定BBI-A切割DNA的最佳条件。
本发明提供了一种DNA的切割方法，其特征在于，利用大豆Bowman-Birk胰蛋白酶抑制剂切割DNA。
在本发明的一种实施方式中，所述大豆Bowman-Birk胰蛋白酶抑制剂(BBI-A)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，在反应体系中加入1-15mg/mL的BBI-A。
在本发明的一种实施方式中，在反应体系中加入金属离子。
在本发明的一种实施方式中，所述金属离子的浓度为0.1-10mmol/L。
在本发明的一种实施方式中，所述金属离子包括Mg2+、Cu2+、Zn2+和/或Ca2+。
在本发明的一种实施方式中，反应时间不低于0.5h。
在本发明的一种实施方式中，反应温度为35-40℃。
本发明提供了一种DNA切割试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括缓冲液、大豆Bowman-Birk胰蛋白酶抑制剂和金属离子。
在本发明的一种实施方式中，所述金属离子包括Mg2+、Cu2+、Zn2+和/或Ca2+。
本发明提供了所述BBI-A，或所述方法，或所述试剂盒在切割DNA中的应用。
本发明的有益效果：
1.本发明以BBI-A与质粒pUC19 DNA为主要材料，将其混合反应，并通过使用DNA琼脂糖凝胶电泳技术检测BBI-A对DNA反应结果，探究BBI-A与DNA的相互作用。同时更改反应物浓度、反应时间等，通过凝胶电泳法测定反应结果，确定BBI-A与DNA相互作用的最佳条件，使得切割率可达到100％。
2.本发明的BBI-A具有核酸酶活性，能够在一定程度上切割DNA，对探索BBI-A与DNA的作用以及设计新的DNA结构探针等方面具有一定的指导意义，并使其在药物研发领域作为新的抗肿瘤药物成为可能。
附图说明
图1为BBI-A切割DNA的最佳辅助金属离子结果示意图；(A)中的泳道1：DNA对照组；泳道2：Mg2+，0.1mM；泳道3：Zn2+，0.1mM；泳道4：Cu2+，0.1mM；泳道5：Ca2+，0.1mM；泳道6：添加蛋白、不含离子；(B)为不同离子条件下的切割结果。
图2为BBI-A切割DNA的最佳辅助金属离子浓度示意图；(A)中的泳道1：DNA对照组；泳道2-6中的Cu2+终浓度分别为：0.1mM，0.5mM，1mM，5mM，10mM；(B)为各Cu2+浓度条件下的切割结果。
图3为BBI-A切割DNA的最佳蛋白浓度的结果示意图；(A)中的泳道1-5分别为1mg/L，3mg/L，5mg/L，10mg/L，15mg/L的BBI-A；(B)为不同BBI-A浓度条件下的切割结果。
图4为BBI-A切割DNA的最佳反应时间的结果示意图；(A)中的泳道1为DNA对照组；泳道2-6中的反应时间分别为：0.5h，1h，1.5h，2h，2.5h；(B)分别是不同反应时间下的切割结果。
图5为混合体系BBI-A切割图；泳道1-2分别为DNA对照组、BBI-A切割组、4；泳道3：BBI-A切割组，加入DMSO；泳道4：BBI-A切割组，加入正丁醇；泳道5：BBI-A切割组，加入KI；泳道6：BBI-A切割组，加入NaN3。
图6为切割后DNA的连接图；泳道1-3分别为对DNA对照组、BBI-A切割组、连接组。
具体实施方式
下述实施例中所使用的BBI-A为大豆Bowman-Birk胰蛋白酶抑制剂，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例1：离子种类对BBI-A切割DNA的影响
利用不同的离子种类及浓度进行实验，可以找到切割DNA效果最好的最佳离子种类
(1)配制样品：向1.5mL的EP管中加入，依次加入10.5μL的BR缓冲液(120mmol/L，pH7.0)，5μL的蛋白溶液(20mg/ml)，2μL的1mmol/L的金属离子溶液，我们选择Mg2+，Zn2+，Cu2+和Ca2+这四种离子进行实验。通过涡旋混匀仪使其充分混合均匀，离心后加入2.5μL的100ng/μL的pUC19 DNA质粒，反应体系共20μL，做好编号标记后经混合均匀再用离心机离心，密封置于37℃恒温金属浴反应2h。
(2)1％琼脂糖凝胶的制备：称取1g的琼脂糖固体加入到已装有100mL的1×TAE溶液的250mL的锥形瓶中，用微波炉反复加热再摇匀使固体完全溶解，直至溶液呈澄清透明状。将琼脂糖溶液置于室温下逐渐冷却至60℃以下时，加入7μL的EB溶液(溴化乙锭)，震荡锥形瓶使得溶液混合均匀，再将琼脂糖溶液缓慢倒入已准备好的水平胶框中，插入梳子。让凝胶自然晾干成形，将挡板和梳子拔掉。
(3)加样：从恒温器中取出完全反应的样品，用移液枪吸取4μL的6×LoadingBuffer缓冲液加入离心管中，用旋涡混匀仪充分振荡混合均匀后再进行离心。溶液混合均匀后，吸取样品加入到点样孔槽。
pUC19 DNA：250ng，蛋白溶液终浓度：5mg/mL，37℃，2h。图1中，泳道1：DNA control(处理前质粒pUC19 DNA)；泳道2-5：分别是终浓度均为0.1mmol/L的Mg2+，Zn2+，Cu2+，Ca2+；泳道6：不含金属离子。
(4)电泳：将电泳仪盖子按正确方向合紧，打开开关通电，调节电压至100V，电流为260mA，跑胶时间40min，让被切割的pUC19质粒DNA及其碎片在琼脂糖凝胶中迁移。
(5)拍照及数据分析：通过使用凝胶成像仪对琼脂糖凝胶拍照并保存原文件，用软件对原文件进行分析，由图1可知，在pH7.0的BR缓冲液体系中，在离子浓度1mmol/L条件下，四种离子对辅助BBI-A切割DNA的效果影响差别不大，基本都可以达到43％，其中Cu2+辅助BBI-A切割pUC19 DNA质粒的效果较好于其他三种离子，达到52.8％的切割率。因此，选择四种金属离子中效果较好的Cu2+作为实验辅助离子来进行实验。
实施例2：离子浓度对BBI-A切割DNA的影响
使用凝胶电泳法检测离子浓度对BBI-A切割DNA的影响。选择Cu2+作为反应的辅助离子，并利用不同的离子浓度(0.1mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L、5mmol/L、10mmol/L)来进行实验。
(1)配制样品：向1.5mL的EP管中加入，依次加入10.5μL的BR缓冲液(120mmol/L，pH7.0)，5μL的目标化合物溶液(20mg/ml)，2μL的不同浓度的硫酸铜溶液(1mmol/L、5mmol/L、10mmol/L、50mmol/L、100mmol/L)。通过涡旋混匀仪使其充分混合均匀，离心后加入2.5μL的100ng/μL的pUC19 DNA质粒，做好编号标记后经混合均匀再用离心机离心，密封置于37℃恒温金属浴反应2h。
(2)1％琼脂糖凝胶的制备：称取1g的琼脂糖固体加入到已装有100mL的1×TAE溶液的250mL的锥形瓶中，用微波炉反复加热再摇匀使固体完全溶解，直至溶液呈澄清透明状。将溶液置于室温下逐渐冷却至60℃以下时，加入7μL的EB溶液(溴化乙锭)，震荡锥形瓶使得溶液混合均匀，再将琼脂糖溶液缓慢倒入已准备好的水平胶框中，插入梳子。让凝胶自然晾干成形，将挡板和梳子拔掉。
(3)加样：从恒温器中取出完全反应的样品，用移液枪吸取4μL的6×LoadingBuffer缓冲液加入离心管中，用旋涡混匀仪充分振荡混合均匀后再进行离心。溶液混合均匀后，吸取20μL的样品垂直小心加入到点样孔槽。
pUC19 DNA：250ng，蛋白溶液终浓度：5mg/mL，37℃，反应2h。图2中，泳道1：DNAcontrol(处理前质粒pUC19 DNA)；泳道2-6：Cu2+浓度分别为0.1mmol/L，0.5mmol/L，1mmol/L，5mmol/L，10mmol/L。
(4)电泳：将电泳仪盖子按正确方向合紧，打开开关通电，调节电压至100V，电流为260mA，跑胶时间40min，让被切割的DNA及其碎片在琼脂糖凝胶中迁移。
(5)拍照及数据分析：通过使用凝胶成像仪对琼脂糖凝胶拍照并保存原文件，用软件对原文件进行分析，由图2可以看出，不同浓度的Cu2+(由0.1mmol/L～10mmol/L)对辅助BBI-A切割DNA的结果影响区别不大。
实施例3：无离子条件下BBI-A浓度变化对切割DNA的影响
由于离子对于DNA的切割效率并未有很大的提升，因此，选择在无离子条件下对反应体系进一步优化。
(1)配制样品：向1.5mL的EP管中加入，将20mg/ml的蛋白质溶液依次加入1μL、3μL、5μL、10μL、15μL，然后用BR缓冲液(120mmol/L，pH7.0)补足到17.5μL。通过涡旋混匀仪使其充分混合均匀，离心后加入2.5μL的100ng/μL的pUC19 DNA质粒，做好编号标记后经混合均匀再用离心机离心，密封置于37℃恒温金属浴反应2h。
(2)1％琼脂糖凝胶的制备：称取1g的琼脂糖固体加入到已装有100mL的1×TAE溶液的250mL的锥形瓶中，用微波炉反复加热再摇匀使固体完全溶解，直至溶液呈澄清透明状。将溶液置于室温下逐渐冷却至60℃以下时，加入7μL的EB溶液(溴化乙锭)，震荡锥形瓶使得溶液混合均匀，再将琼脂糖溶液缓慢倒入已准备好的水平胶框中，插入梳子。让凝胶自然晾干成形，将挡板和梳子拔掉。
(3)加样：从恒温器中取出完全反应的样品，用移液枪吸取4μL的6×LoadingBuffer缓冲液加入离心管中，用旋涡混匀仪充分振荡混合均匀后再进行离心。溶液混合均匀后，吸取20μL的样品垂直小心加入到点样孔槽。
pUC19 250ng，37℃，2h。图3中，泳道1:DNA control；泳道2-6：BBI-A溶液终浓度分别为1mmol/L，3mmol/L，5mmol/L，10mmol/L，15mmol/L。
(4)电泳：将电泳仪盖子按正确方向合紧，打开开关通电，调节电压至100V，电流为260mA，跑胶时间40min，让被切割的DNA及其碎片在琼脂糖凝胶中迁移。
(5)拍照及数据分析：通过使用凝胶成像仪对琼脂糖凝胶拍照并保存原文件，用软件对原文件进行分析，如图3可知，在无离子的条件下，随着浓度的增加，切割效果也明显越来越好，在蛋白浓度达到15mmol/L时，切割率可达到100％。
实施例4：反应时间对BBI-A切割DNA的影响
探究反应时间对BBI-A切割DNA的影响。
(1)配制样品：向1.5mL的EP管中加入，依次加入10.5μL的BR缓冲液(120mmol/L，pH7.0)，5μL的蛋白(20mg/mL)溶液，2μL的1mmol/L的硫酸铜溶液。通过涡旋混匀仪使其充分混合均匀，离心后加入2.5μL的100ng/μL的pUC19 DNA质粒，终浓度为5mg/mL的蛋白，做好编号标记后经混合均匀再用离心机离心，密封置于37℃恒温金属浴分别反应0.5～2.5h。
(2)1％琼脂糖凝胶的制备：称取1g的琼脂糖固体加入到已装有100mL的1×TAE溶液的250mL的锥形瓶中，用微波炉反复加热再摇匀使固体完全溶解，直至溶液呈澄清透明状。将溶液置于室温下逐渐冷却至60℃以下时，加入7μL的EB溶液(溴化乙锭)，震荡锥形瓶使得溶液混合均匀，再将琼脂糖溶液缓慢倒入已准备好的水平胶框中，插入梳子。让凝胶自然晾干成形，将挡板和梳子拔掉。
(3)加样：从恒温器中取出完全反应的样品，用移液枪吸取4μL的6×LoadingBuffer缓冲液加入离心管中，用旋涡混匀仪充分振荡混合均匀后再进行离心。溶液混合均匀后，吸取20μL的样品垂直小心加入到点样孔槽。
图4中，泳道1：DNA control(处理前质粒pUC19 DNA)；泳道2-6：0.5h，1h，1.5h，2h，2.5h。
(4)电泳：将电泳仪盖子按正确方向合紧，打开开关通电，调节电压至100V，电流为260mA，跑胶时间40min，让被切割的DNA及其碎片在琼脂糖凝胶中迁移。
(5)拍照及数据分析：通过使用凝胶成像仪对琼脂糖凝胶拍照并保存原文件，用软件对原文件进行分析。如上图4可以看出，随着反应时间的延长，BBI-A对DNA的切割效果越来越明显。且从图中我们可以看到control组DNA几乎没有发生断裂，而添加了BBI-A的样品即便仅仅反应2h，其对DNA的切割率也已经达到了52.4％，可见BBI-A对DNA具有较好的切割作用。
实施例5：DNA切割机理验证
(1)切割实验
在反应体系中添加自由基清除剂观察切割结果的变化来判断BBI-A切割DNA的机理。其中含BR缓冲液(120mmol/L，pH7.0)，DNA浓度为100ng/μL，蛋白溶液浓度为20mg/ml，DMSO、正丁醇、KI和NaN3溶液浓度为1M。按照下表将试剂依次添加完毕后，震荡离心后置于恒温水浴箱于37℃恒温反应2h。
表1切割机理探讨的反应体系
Figure BDA0002812641220000061
如图5可知，在羟基自由基淬灭剂如DMSO及叔丁醇的存在下，BBI-A切割DNA并没有被抑制，说明BBI-A混合物中没有羟基自由基，不属于自由基切割机理。而在单线态氧淬灭剂叠氮化钠和超氧化物淬灭剂碘化钾的存在下，BBI-A对DNA的切割明显收到了抑制。因此我们可以初步判定BBI-A切割DNA的切割机理有可能是水解裂解或是氧化裂解，具体情况可以结合DNA重新连接试验结果观察。
(2)连接实验
对照组含250ng DNA；切割组含2.5μL的DNA(100ng/μL)，BBI-A溶液10μL(20mg/mL)，7.5μL的BR缓冲液(120mmol/L，pH7.0)；连接组为切割组经纯化后，浓缩样品体积到15μL并加到离心管中，再加入2μL的连接酶缓冲液，0.5μL T4 DNA连接酶，再补充2.5μL去离子水形成总体积为20μL的样品进行重新连接实验。
表2连接反应体系
Figure BDA0002812641220000071
如图6所示，1号为DNA对照，实验组1为没有添加DNA T4连接酶正常反应的一组，实验组2则为纯化后添加了DNA T4连接酶反应2h的一组，如实验结果可知，泳道2是切割后纯化再连接的实验结果，从泳道2条带情况可知没有比切割条带迁移率更慢的条带出现，证明没有再产生连接产物DNA，这说明添加的T4 DNA连接酶没有产生作用，被切割的DNA没有被再次连接起来。已知水解切割只是破坏磷酸二酯键，并不会造成DNA彻底的损坏，且被切割后的DNA可由T4 DNA连接酶重新连接起来。由此可知，BBI-A切割DNA是由单线态氧和超氧化物引起的，属于氧化裂解。
实施例6：DNA切割试剂盒的制备
试剂盒中包含BR缓冲液(120mmol/L，pH 7.0)、BBI-A、及金属离子，金属离子包括Mg2+，Cu2+、Zn2+或Ca2+；在使用时，BBI-A的终浓度加至1-15mg/mL，金属离子浓度优选为0.1～10mM。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 大豆提取物Bowman-Birk inhibitor切割DNA的方法
<130> BAA201233A
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 71
<212> PRT
<213> Soybeans
<400> 1
Asp Asp Glu Ser Ser Lys Pro Cys Cys Asp Gln Cys Ala Cys Thr Lys
1 5 10 15
Ser Asn Pro Pro Gln Cys Arg Cys Ser Asp Met Arg Leu Asn Ser Cys
20 25 30
His Ser Ala Cys Lys Ser Cys Ile Cys Ala Leu Ser Tyr Pro Ala Gln
35 40 45
Cys Phe Cys Val Asp Ile Thr Asp Phe Cys Tyr Glu Pro Cys Lys Pro
50 55 60
Ser Glu Asp Asp Lys Glu Asn
65 70

Claims (5)

1. 一种DNA的体外切割方法，其特征在于，利用大豆Bowman-Birk胰蛋白酶抑制剂切割DNA；所述大豆Bowman-Birk胰蛋白酶抑制剂的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；在反应体系中加入1-15mg/mL的大豆Bowman-Birk胰蛋白酶抑制剂，反应时间不低于0.5 h。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在反应体系中加入金属离子。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述金属离子的浓度为0.1-10mmol/L。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述金属离子包括Mg2+、Cu2+、Zn2+和/或Ca2+。
5. 大豆Bowman-Birk胰蛋白酶抑制剂，或权利要求1-4任一所述方法在体外切割DNA中的应用；所述大豆Bowman-Birk胰蛋白酶抑制剂的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
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