CN105567766A - 一种使用耐热重组hnh型核酸内切酶切割dna的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种使用耐热重组HNH型核酸内切酶切割DNA的方法，包括以下步骤：1)以深海嗜热噬菌体GVE2基因组为模板进行PCR扩增；2)对PCR扩增产物和pET-30a载体进行双酶切反应；3)回收酶切后的PCR产物和pET-30a载体片段后进行连接反应；4)将连接产物转化到感受态细胞中后，挑取克隆，并测序验证；5)将基因序列正确的克隆质粒转化到感受态细胞中进行诱导表达；6)提取并纯化该耐热重组核酸内切酶；7)使用获得的GVE2HNH型核酸内切酶切割DNA：切割反应温度大于60℃，切割反应pH值大于5.5。该耐热重组核酸内切酶活力高，能够在大于60℃的高温条件下无特异性地切割DNA，在分子生物学、疫苗工业、蛋白和多糖类制药工业等涉及到核酸去除的催化领域有着广阔的应用前景。

Description

一种使用耐热重组HNH型核酸内切酶切割DNA的方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及基因工程技术，具体涉及构建能够过量表达耐热HNH型核酸内切酶的基因工程菌、并将其应用在高温条件下切割DNA的方法。
背景技术
核酸酶是一类水解核酸磷酸二酯键的酶，存在几乎在所有的生物体中。核酸酶在遗传机制的不同方面发挥重要的作用，例如避免突变、DNA修复、DNA复制和重组、为生长代谢清除核苷和磷酸、宿主防御外源的核酸分子、病毒感染宿主的建立和细胞凋亡等。除此之外，核酸酶还被广泛应用于分子生物学的各种研究中，例如核酸结构的检测、RNA的快速测序、蛋白纯化中去除核酸以及抗病毒试剂的应用等。
根据核酸酶作用的方式，核酸酶可以分为核酸内切酶和核酸外切酶。核酸内切酶从核酸的内部切开核酸，核酸外切酶从核酸的一端逐个切开核酸，作用时产生单核苷酸。此外，也有少数既作用于链的内部又作用于链的外部的核酸酶，例如小球菌核酸酶。根据核酸酶作用的底物，核酸酶可以分为RNA酶、DNA酶以及非特异性核酸酶。RNA酶只作用于RNA，DNA酶只作用于DNA，非特异性核酸酶对RNA、DNA两者均可切割。
HNH(Histine-Asparagine-Histine，组氨酸-天冬酰胺-组氨酸)型核酸内切酶具有两个高度保守的组氨酸(His)和一个高度保守的天冬酰胺(Asn)的结构域，该保守的结构域约由35个氨基酸组成，如图1所示。HNH型核酸内切酶包括大肠菌素E7和E9、S1和S2脓菌素和一些DNA限制性核酸内切酶，比如KpnI，PacI和Hpy99I。目前，关于源自于噬菌体HNH型核酸内切酶的报道，多数是从常温菌中发现。这些源自常温菌的HNH型核酸内切酶只能在常温条件例下切割DNA，不能在高温条件下发挥切割核酸的功能，使其应用受到了限制。现有技术中，关于该高温噬菌体HNH型核酸内切酶的表达及应用，尚未有研究和报道。
GVE2(GeobacillusvirusE2)是从分离于自东太平洋深海热液区的嗜热菌Geobacillussp.263分离出的一种高温噬菌体。GVE2能够生存在高温环境(例如：生长温度为60℃，LiuB,ZhangX.Deep-seathermophilicGeobacillusbacteriophageGVE2transcriptionalprofileandproteomiccharacterizationofvirions.ApplMicrobiolBiotechnol.200880(4):697-707)，是一个典型的Siphoviridae噬菌体，与λ噬菌体在形态上极其相似，但其基因组序列和预测的蛋白质序列与λ噬菌体同源性很低。目前，GVE2基因组的测序已经完成，其编码一种HNH型核酸内切酶。
发明内容
本发明的目的在于利用基因工程技术构建一株能够过量表达GVE2HNH型核酸内切酶的基因工程菌，通过诱导表达、热处理和镍离子亲和柱纯化等步骤，制备出可以在温度高于60℃的条件下高效切割双链DNA的电泳级耐热重组酶蛋白，以便于在高温环境下有效切割DNA，可以应用于如分子生物学、疫苗工业、蛋白和多糖类制药工业等涉及到核酸去除的催化领域。
为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：
本发明提供了一种使用耐热重组HNH型核酸内切酶切割DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)利用具有如下核苷酸序列的扩增引物，以GVE2基因组为模板进行PCR扩增：
正向引物为：5'-GGAATTCCATATGCCAAGCAAACCACTGCGACC-3'，
反向引物为：5'-CCGCTCGAGCCCATACCGTCGCTTATCTTCCG-3'；
2)对步骤1)中得到的PCR扩增产物和pET-30a载体进行NdeI和XhoI双酶切反应；
3)回收并纯化步骤2)中所得的酶切后的PCR产物和pET-30a载体片段后，进行酶基因与载体的连接反应；
4)将步骤3)中所得的连接产物转化到感受态细胞中，随后涂布在含有卡那霉素的LB平板进行培养后挑取克隆，并提取质粒进行测序验证；
5)将步骤4)中获得的基因序列正确的克隆质粒转化到感受态细胞中进行诱导表达；
6)从步骤5)中所获得的细胞中提取并纯化该GVE2HNH型耐热重组核酸内切酶；
7)使用步骤6)中获得的GVE2HNH型核酸内切酶切割DNA：切割反应温度大于60℃，切割反应pH值大于5.5。
优选地，步骤7)中所述的切割反应温度为60-70℃。
优选地，步骤7)中所述切割反应pH值为大于7.5。
优选地，步骤7)中所述切割反应中加入Fe2+，Zn2+，Mn2+，Mg2+，Ca2+，Ni2+或者Co2+，以不同程度促进该酶切割DNA，其中，Mn2+是该酶切割反应的最佳金属离子。
优选地，步骤7)中所述切割反应中不使用盐，高盐会抑制该酶切割DNA的能力。
可选地，步骤6)中所述的提取并纯化处理方法为对所述细胞进行超声波破碎、热处理和镍离子亲和柱纯化。
可选地，步骤7)中使用GVE2HNH型核酸内切酶切割DNA的反应体系为20μL：200ng质粒pET-30aDNA或者λDNA、20mMTris–HClpH8.0、1mMDTT、100nMGVE2HNH型核酸内切酶、2mMMnCl2、0.1mg/mlBSA和10％甘油；切割反应时间为15分钟。
本发明达到了如下的有益效果：
(1)利用基因工程技术，构建了一种表达耐热GVE2HNH型核酸内切酶的基因工程菌,该基因工程菌能够高效的表达GVE2HNH型核酸内切酶，且后续的纯化步骤简单易行，很容易得到大量的该耐热重组酶蛋白(每升发酵液可得到2mg耐热重组酶蛋白)；
(2)该耐热重组核酸内切酶分子量为16.78kDa，活力高，具有非特异切割DNA的能力，能够在高温条件(大于60℃)下无特异性地切割DNA，能够作为培养细胞上清和细胞裂解液去粘度的首选酶制剂，在分子生物学、疫苗工业、蛋白和多糖类制药工业等涉及到核酸去除的催化领域有着广阔的应用前景。
附图说明
图1是部分HNH型核酸内切酶的氨基酸序列比对。HNH型核酸内切酶源自于高温噬菌体GVE2和常温噬菌体：Bacillusphagegamma，Bacillusphagephi105，Clostridiumphagephi3626，EnterobacteriaphageHK97。保守的氨基酸残基加粗表示。
图2是诱导前、诱导后、超声波破碎细胞、热处理和镍离子亲和纯化等步骤的SDS-PAGE结果图。
图3是GVE2HNH型核酸内切酶的质谱分析结果。
图4是反应温度对GVE2HNH型核酸内切酶切割DNA影响的电泳凝胶图。
图5是GVE2HNH型核酸内切酶热稳定性的电泳凝胶图。
图6是酶量对GVE2HNH型核酸内切酶切割DNA影响的电泳凝胶图。
图7是反应时间对GVE2HNH型核酸内切酶切割DNA影响的电泳凝胶图。
图8是反应pH对GVE2HNH型核酸内切酶切割DNA影响的电泳凝胶图。
图9是金属离子(Fe2+、Zn2+、Mn2+和Cu2+)对GVE2HNH型核酸内切酶切割DNA影响的电泳凝胶图。
图10是金属离子(Mg2+、Ca2+、Ni2+和Co2+)对GVE2HNH型核酸内切酶切割DNA影响的电泳凝胶图。
图11是盐浓度对GVE2HNH型核酸内切酶切割DNA影响的电泳凝胶图。
具体实施方式
为了阐明本发明的技术方案及技术目的，下面结合附图及具体实施方式对本发明做进一步的介绍。
实施例1
本实施例中，利用基因工程技术构建能够过量表达GVE2HNH型核酸内切酶的基因工程菌，通过诱导表达、热处理和镍离子亲和柱纯化等步骤，制备出可以在高温条件下高效切割双链DNA的电泳级耐热重组酶蛋白，并将该耐热重组HNH型核酸内切酶用于切割DNA时，包括以下步骤：
1、GVE2HNH型核酸内切酶基因的克隆：
1)从GenBank中下载GVE2HNH型核酸内切酶的基因序列，自行设计含有两个不同限制性核酸内切酶一对引物：
正向引物序列为：5'-GGAATTCCATATGCCAAGCAAACCACTGCGACC-3'，其中下划线序列为NdeI酶的酶切位点；
反向引物序列为：5'-CCGCTCGAGCCCATACCGTCGCTTATCTTCCG-3'，其中下划线序列为XhoI酶的酶切位点；
2)PCR扩增该酶基因：
a)利用该对引物，以GVE2基因组为模板进行PCR扩增；
其中，PCR反应体系为50μL，包括：5μL10xPCRbuffer(Mg2+plus)、4μL2.5mMdNTP、2μL10μM正向引物、2μL10μM反向引物、100ngGVE2基因组DNA以及0.5μlPfuDNA聚合酶，最后加ddH2O至50μL。
PCR反应循环参数为：94℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃3min，循环34次；72℃延伸10min。
b)通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增该酶基因的结果：反应结束后，取5μLPCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测；
c)PCR产物的纯化：采用OMEGAPCR试剂盒进行回收纯化，具体步骤见其说明书。利用Nanodrop2000测定PCR回收产物的浓度。
3)酶切该酶基因和质粒载体：分别对PCR产物和pET-30a载体进行双酶切反应；
其中，酶切反应体系为20μL，包括:16μLPCR产物或pET-30a载体、2μL10x酶切buffer(Mg2+plus)、1μLNdeI和1μLXhoI；37℃水浴，2小时。
酶切结束后，将酶切产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。采用OMEGA胶回收试剂盒进行切胶回收纯化，具体步骤见其说明书。采用Nanodrop2000测定其浓度。
4)连接该酶基因和载体：对酶切后的PCR产物和pET-30a载体片段，进行连接反应。
连接反应体系为10μL，包括:4μLddH2O、1μL10xLigationBuffer、1μL酶切后的pET-30a载体、3μL酶切后的PCR产物和1μLT4DNALigase；在22℃下，反应1小时。
5)重组体的转化：将步骤4)中获得的连接产物转化到感受态细胞E.coliDH5α中，并涂布在含有卡那霉素的LB平板进行培养；挑取克隆，并提取质粒进行测序验证。
取100μLE.coliDH5α感受态细胞与10μL连接后的DNA，混匀，冰浴放置10min；42℃静止水浴90sec，迅速放回冰中继续冰浴2min；加200μLLB液体培养基，于37℃摇床上150rpm培养1h；吸取100μL培养物涂布在含有终浓度为100μg/ml卡那霉素的LB培养基平板上，37℃培养12～16h，得到100～200个克隆。
随后，对阳性克隆进行验证：分别选取4个克隆，接种于5ml含有100μg/ml卡那霉素的LB培养基试管，37℃摇床上150rpm过夜培养；采用OMEGA质粒提取试剂盒，提取质粒，并进行测序；将测序结果与NCBI注释的序列比对，验证阳性克隆。
2、GVE2HNH型核酸内切酶的诱导表达及纯化：
1)以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂，诱导该酶的表达：将基因序列正确的克隆质粒转化到感受态细胞E.coliBL21(DE)3plysS细胞中进行诱导表达。
将表达载体pET30a-GVE2-HNH以热激转化转入E.coliBL21(DE3)pLysS的表达菌株中，再将表达菌株单菌落接种于含50μg/ml卡那霉素和34μg/ml氯霉素的LB液体培养基试管中，37℃过夜培养，按1％接种量转接于含50μg/ml卡那霉素和34μg/ml氯霉素的250mlLB液体培养基三角瓶中，于37℃摇动培养至OD600约为0.6时加入IPTG至0.1mM，室温继续培养12小时，表达耐热重组酶蛋白。
2)利用超声波破碎含有该酶的细胞，并通过热处理和镍离子亲和柱等步骤，纯化该耐热重组核酸内切酶。
收集菌体，悬浮于缓冲液A(20mMTris-HClpH8.0、500mMNaCl和10％甘油)中；超声波破碎细胞，20000rpm、10℃离心30min；所得上清液经60℃热处理20min，20000rpm、10℃离心30min；上清液过经缓冲液B(20mMTris-HClpH8.0、500mMNaCl、10％甘油和10mM咪唑)平衡好的Histrapchelating亲和柱，用缓冲液C(20mMTris-HClpH8.0、500mMNaCl、10％甘油和500mM咪唑)梯度洗脱；分部收集组分，150-250mM咪唑处的组分为GVE2HNH核酸内切酶；进行SDS-PAGE凝胶电泳，合并组分，对缓冲液F(20mMTris-HClpH8.0、0.1mMEDTA、1mMDTT(dithiothreitol，二硫苏糖醇)、50mMKCl和50％甘油)透析，-80℃冻存。
采用BradfordProteinAssayKit(Bio-Rad)测定蛋白浓度。图2为诱导表达、超声波破碎细胞、热处理和镍离子亲和纯化等步骤的SDS-PAGE结果。通过上述步骤，得到了电泳级的耐热重组GVE2HNH型核酸内切酶。
3、GVE2HNH型核酸内切酶的质谱分析：
随后，对所获得的耐热重组核酸内切酶进行质谱分析，以确定其分子量：将200μLGVE2HNH型核酸内切酶(2mg/ml)的水溶液转移到色谱专用2ml样品瓶中，加入0.1％甲酸水溶液20μL和甲醇20μL，混匀；打开maXis质谱仪并预热10分钟，质量扫描范围m/z300-3000，用三氟乙酸钠标准溶液校准质谱仪质量轴，质荷比误差小于2ppm或者2mDa、液相色谱自动进样器进样20μL，流动相为(乙腈+0.1％甲酸水溶液＝30+70)流速0.3ml/min；采集并记录质谱图，导出质谱图的数据，去卷积得出多电荷质谱峰的电荷数，依据质荷比和电荷数计算蛋白分子量。如图3所示，该耐热重组核酸内切酶的分子量为16.78kDa。
实施例2
测试1：反应温度对GVE2HNH型核酸内切酶切割DNA的影响：
反应体系为20μL：200ng质粒pET-30aDNA、20mMTris–HClpH8.0、1mMDTT、100nMGVE2HNH型核酸内切酶、2mMMnCl2、0.1mg/mlBSA和10％甘油。反应温度分别为30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃和85℃，反应时间为15min。反应结束后，加入100mMEDTA终止反应，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳，分离酶切产物。结果如图4所示，GVE2HNH型核酸内切酶能够在30℃-85℃温度下切割DNA，其中，该酶能够在30℃-55℃把共价闭合环状DNA(covalentlyclosedcircular，CCC)主要切割成开环环状(opencircular，OC)和线性(Linear，L)小片段DNA；在大于55℃至75℃的温度范围内，该酶能够把共价闭合环状DNA主要切割成线性(Linear，L)小片段DNA；在大于75℃至85℃的温度范围内，该酶能够把共价闭合环状DNA主要切割成开环环状DNA。由图4可见，该酶最适反应温度为60℃-70℃。
测试2：GVE2HNH型核酸内切酶的热稳定性的分析：
反应体系20μL：20mMTris-ClpH8.0、200ng质粒pET-30aDNA、100nMGVE2HNH型核酸内切酶(分别在80℃，90℃和100℃，保温30min)、1mMDTT、2mMMnCl2、0.1mg/mlBSA和10％甘油；60℃分别反应1min、5min和10min。反应结束后，加入100mMEDTA终止反应，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳，分离酶切产物。结果如图5所示，在上述反应条件下，经过80℃和90℃热处理的GVE2HNH型核酸内切酶具有相似的切割结果，即反应5min时，切割产物主要为开环环状DNA和少量线性DNA；反应10min时，切割产物主要为开环DNA，且线性DNA增多。100℃热处理的GVE2HNH型核酸内切酶在反应1-10min时，其切割产物主要为开环环状DNA。因此，GVE2HNH型核酸内切酶能够在100℃处理30min后，仍具有切割DNA的能力，进一步说明该酶是热稳定的核酸内切酶。
测试3：酶量对GVE2HNH型核酸内切酶切割DNA的影响：
反应体系20μL：20mMTris-ClpH8.0、200ngλDNA或者质粒pET-30aDNA、不同浓度的GVE2HNH型核酸内切酶、1mMDTT、2mMMnCl2、0.1mg/mlBSA和10％甘油；其中，使用λDNA作为底物时，酶量分别为5nM、20nM、50nM、100nM、200nM或者400nM；使用质粒pET-30aDNA作为底物时，酶量分别为5nM、20nM、50nM、100nM或者200nM；60℃下分别反应15min。反应结束后，加入100mMEDTA终止反应，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳，分离酶切产物。结果如图6所示，在上述反应条件下，从酶量为20nM开始，该酶就可以开始将闭合环状DNA切割成开环环状DNA，当酶量达到50nM时，GVE2HNH型核酸内切酶作用15min即可完全切割200ngλDNA或者把200ng闭合环状的质粒pET-30aDNA主要切割成开环环状DNA。
测试4：反应时间对GVE2HNH型核酸内切酶切割λDNA的影响：
反应体系20μL：20mMTris-ClpH8.0、200ngλDNA、20nMGVE2HNH型核酸内切酶、1mMDTT、2mMMnCl2、0.1mg/mlBSA和10％甘油；60℃下分别反应5min、10min、20min、30min、40min、50min和60min。反应结束后，加入100mMEDTA终止反应，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳，分离酶切产物。结果如图7所示，在上述反应条件下，20nMGVE2HNH型核酸内切酶只需作用30min即可完全切割200ngDNA。
测试5：反应pH对GVE2HNH型核酸内切酶切割DNA的影响：
反应体系为20μL：200ng质粒pET-30aDNA、1mMDTT、100nMGVE2HNH型核酸内切酶、2mMMnCl2、0.1mg/mlBSA、10％甘油和不同的缓冲液(20mM)：醋酸钠缓冲液(pH5.0和pH5.5)、磷酸钠缓冲液(pH6.0-7.5)、Tris/HCl缓冲液(pH8.0和pH8.5)或者甘氨酸氢氧化钠(pH9.0)；60℃反应15min。反应结束后，加入100mMEDTA终止反应，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳，分离酶切产物。结果如图8所示，GVE2HNH型核酸内切酶能够在pH5.5-9.0的范围内切割DNA，其中，该酶能够在pH5.5-7.5的范围内把共价闭合环状DNA切割成线性和开环环状DNA，而当pH值大于7.5时，该酶能够把共价闭合和开环环状DNA切割成线性小片段DNA。因此，该酶切割DNA的最适反应pH为大于7.5。
测试6：二价金属离子对GVE2HNH型核酸内切酶切割DNA的影响：
反应体系为20μL：200ng质粒pET-30aDNA、20mMTris–HClpH8.0、1mMDTT、100nMGVE2HNH型核酸内切酶、0.1mg/mlBSA和10％甘油，以及不同的二价金属离子(Fe2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+、Mg2+、Ca2+、Ni2+或者Co2+，其中二价金属离子的终浓度分别为0.1mM、0.5mM和2mM)或者10mMEDTA；60℃反应10min。反应结束后，加入100mMEDTA终止反应，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳，分离酶切产物。结果如图9和图10所示，Cu2+抑制GVE2HNH型核酸内切酶切割DNA，而Fe2+、Zn2+、Mn2+、Mg2+、Ca2+、Ni2+或者Co2+能够不同程度促进该酶切割DNA。Mn2+(0.1mM-2mM)和0.1mMFe2+能够促进该酶把共价闭合环状DNA切割成线性小片段DNA，而所测试的其他六种二价金属离子促进该酶把共价闭合环状DNA切割成线性开环环状DNA。因此，Mn2+是该酶切割反应的最佳金属离子。
测试7：盐浓度对GVE2HNH型核酸内切酶切割DNA的影响：
反应体系为20μL：200ngλDNA、20mMTris–HClpH8.0、1mMDTT、100nMGVE2HNH型核酸内切酶、2mMMnCl2、0.1mg/mlBSA、10％甘油和不同浓度的NaCl(50mM、100mM、200mM、400mM和800mM)；60℃反应15min。反应结束后，加入100mMEDTA终止反应，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳，分离酶切产物。结果如图11所示，随着盐浓度的增加，酶切产物逐渐减少，并发现当NaCl浓度大于400mM时，大幅度抑制了GVE2HNH型核酸内切酶切割DNA。因此，在使用GVE2HNH型核酸内切酶切割DNA时，最好不加入NaCl。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

Claims (7)

1.一种使用耐热重组HNH型核酸内切酶切割DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)利用具有如下核苷酸序列的扩增引物，以深海嗜热噬菌体GVE2基因组为模板进行PCR扩增：
正向引物为：5'-GGAATTCCATATGCCAAGCAAACCACTGCGACC-3'，
反向引物为：5'-CCGCTCGAGCCCATACCGTCGCTTATCTTCCG-3'；
2)对步骤1)中得到的PCR扩增产物和pET-30a载体进行NdeI和XhoI双酶切反应；
3)回收并纯化步骤2)中所得的酶切后的PCR产物和pET-30a载体片段后，进行酶基因与载体的连接反应；
4)将步骤3)中所得的连接产物转化到感受态细胞中，随后涂布在含有卡那霉素的LB平板进行培养后挑取克隆，并提取质粒进行测序验证；
5)将步骤4)中获得的基因序列正确的克隆质粒转化到感受态细胞中进行诱导表达；
6)从步骤5)中所获得的细胞中提取并纯化该耐热重组核酸内切酶；
7)使用步骤6)中获得的GVE2HNH型核酸内切酶切割DNA：切割反应温度大于60℃，切割反应pH值大于5.5。
2.如权利要求1所述的一种使用耐热重组HNH型核酸内切酶切割DNA的方法，其特征在于，步骤7)中所述切割反应温度为60-70℃。
3.如权利要求1所述的一种使用耐热重组HNH型核酸内切酶切割DNA的方法，其特征在于，步骤7)中所述切割反应pH值为大于7.5。
4.如权利要求1所述的一种使用耐热重组HNH型核酸内切酶切割DNA的方法，其特征在于，步骤7)中所述切割反应中加入金属离子Fe2+、Zn2+、Mn2+、Mg2+、Ca2+、Ni2+或者Co2+。
5.如权利要求1所述的一种使用耐热重组HNH型核酸内切酶切割DNA的方法，其特征在于，步骤7)中所述切割反应中不使用盐。
6.如权利要求1所述的一种使用耐热重组HNH型核酸内切酶切割DNA的方法，其特征在于，步骤7)中使用GVE2HNH型核酸内切酶切割DNA的反应体系为20μL：200ng质粒pET-30aDNA或者λDNA、20mMTris–HClpH8.0、1mMDTT、100nMGVE2HNH型核酸内切酶、2mMMnCl2、0.1mg/mlBSA和10％甘油；切割反应时间为15分钟。
7.如权利要求1所述的一种使用耐热重组HNH型核酸内切酶切割DNA的方法，其特征在于，步骤6)中所述的提取并纯化处理方法为对所述细胞进行超声波破碎、热处理和镍离子亲和柱纯化。
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