KR101211444B1 - 프로테아제 저해자 및 그 변이체의 사상균 내에서의 발현 - Google Patents

프로테아제 저해자 및 그 변이체의 사상균 내에서의 발현 Download PDF

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Abstract

본원에서 기술한 것은 프로테아제 저해자, 그 변이체 및 그들의 생산방법이다.
사상균, 프로테아제 저해자, 보우만-버크 저해자, 대두 트립신 저해자

Description

프로테아제 저해자 및 그 변이체의 사상균 내에서의 발현 {EXPRESSION IN FILAMENTOUS FUNGI OF PROTEASE INHIBITORS AND VARIANTS THEREOF}
본 발명은 사상균 내에서의 프로테아제 저해자 (protease inhibitor, PI) 및 그 변이체 (variant) 의 발현방법에 관한 것이다. 본 발명은 프로테아제 저해자를 수득하기 위한 융합 핵산, 벡터, 융합 폴리펩티드, 및 과정을 개시한다.
프로테아제는 매우 다양한 생물학적 작용에 관여한다. 프로테아제 및 프로테아제 저해자 사이의 균형의 붕괴는 종종 병리적 조직 파괴와 관련한다.
다양한 연구가 조직 손상에서 프로테아제의 역할에 초점을 맞추었고, 프로테아제 및 프로테아제 저해자 사이의 균형이 조직 원형의 유지에 주요 결정인자인 것으로 생각된다. 호중성 백혈구 (neutrophil) 를 포함하는 염증성 세포로부터의 세린 프로테아제는 폐기종, 관절염, 아토피성 피부염 및 건선과 같은 다양한 염증성 장애에 연루된다.
프로테아제는 특정 암의 확산에도 또한 기능을 하는 것으로 나타난다. 정상 세포는 세포외부 기질 (extracellular matrix, ECM) 으로 불리는 복잡한 단백질 네트워크에 접촉하여 존재한다. ECM은 세포 이동의 방벽이고, 암 세포는 전이하기 위하여 그 부착을 단절하고, 분해하고, ECM을 통하여 이동하기 위한 방법을 고안하여야 한다. 프로테아제는 다른 단백질을 분해하는 효소이고, ECM을 파괴함으로써 종양 세포가 그 원래 위치에서 해방되는데 도움을 준다고 오랫동안 생각되었다. 최근의 연구는 이들이 프로테아제-활성화 수용체-2 (Protease-Activated Receptor-2, PAR2) 라 불리는 종양 세포막 내의 단백질의 활성화를 통해 세포 형태 변화 및 운동성을 촉진할 수 있다고 제시하였다. 이것은 세포의 운동성 기관을 활성화하는 세포내 반응의 일련의 흐름을 일으킨다. 따라서, 종양 전이의 첫번째 단계 중 하나는 이주의 방향을 향해 한쪽 모서리에서 뚜렷한 돌출을 형성하는 것과 같은 세포 형태의 재구성이라는 것이라는 가설이 세워진다. 세포는 이후 혈관 벽을 통하여 이주하고 멀리 떨어진 위치로 옮겨가고, 결국 재부착하여 전이성 종양을 형성한다. 예를 들어, 인간 전립선 상피 세포는 구성적으로 정장액의 일반적 성분인 칼리크레인 (Kallikrein) -유사 세린 프로테아제, 전립선-특이 항원 (prostate-specific antigen, PSA) 을 분비한다. 프로테아제는 세포외부 기질을 분해하도록 작용하고 암적인 세포의 침투를 용이하게 한다.
합성적 및 자연적 프로테아제 저해자는 인 비보 및 인 비트로에서 종양 촉진을 저해하는 것으로 나타난다. 이전의 연구 조사는 세린 프로테아제 저해자 또는 SERPINS로 분류된 구조적으로 관련된 단백질의 집단에 속하는 특정 프로테아제 저해자가 호중성 백혈구 엘라스타아제 (neutrophil elastase) 뿐만 아니라 트립신, 카텝신 G, 트롬빈, 조직 칼리크레인을 포함하는 몇몇 프로테아제를 저해하는 것으로 공지되어 있다는 것을 나타내었다. SERPINS는 인 비트로에서 칼시노겐-유도 변형 (transformation) 및 동물 모델 시스템에서 발암을 방지/억제하는데 극히 효과적이다. 정제된 프로테아제 저해자의 전신성 전달은 관절 염증 및 연골과 뼈 파괴를 또한 감소시킨다.
프로테아제 저해자의 국부적 투여는 신체의 약간의 부분에 국한되거나 넓은 부위에 수반할 수 있는 피부의 염증의 일반적 형태, 아토피성 피부염과 같은 증상에 사용된다. 프로테아제 저해자의 탈색소 활성 및 그의 자외선-유도 색소 착색을 방지하는 능력은 인 비트로 및 인 비보 모두에서 증명되었다 (Paine 등, Journal of Investigative Dermatology 116, 587-595 (2001)). 또한, 프로테아제 저해자가 상처 회복을 돕는 것이 발견되었다 (http://www.sciencedaily.com/releases/2000/10/001002071718.htm). 분비성 백혈구 프로테아제 저해자는 국부적으로 적용된 경우 상처 회복 과정을 빠르게 하고 조직 파괴를 되돌리는 것으로 증명되었다. 부가하여, 세린 프로테아제 저해자는 또한 홍반성 낭창 (lupus erythematosus) 환자에서 통증을 감소시키는데 도움을 줄 수 있다 (US 특허 제 6,537,968호 참조).
상기 적시한 대로, 프로테아제 저해자는 프로테아제의 활성을 방해한다. 자연적으로 발생하는 프로테아제 저해자는 곡물 (귀리, 보리 및 옥수수), 싹양배추, 양파, 근대 뿌리, 밀, 조, 및 땅콩과 같은 다양한 식품 내에서 발견될 수 있다. 하나의 흥미있는 출처는 대두이다. 대두 내의 평균 수준은 가장 중요한 프로테아제 저해자 중 두 가지인, 쿠니츠 (Kunitz) 및 보우만-버크 (Bowman-Birk) 각각에 대해 약 1.4 퍼센트 및 0.6 퍼센트이다. 이들 낮은 수준은 임상 적용을 위한 자연적 프로테아제 저해자를 단리하는 것을 비현실적인 것으로 만든 다.
따라서, 혈액계 전염성 인자 (이들 인자가 포유동물 조직 배양 세포 내에서 생산되는 경우) 와 관련한 위험을 또한 감소시키거나 제거할 수 있는 다량의 프로테아제 저해자 및 그 변이체의 생산방법에 대한 요구가 있다. 본원에서 준비된 독창적인 생산방법은 다량의 단백질 치료제의 제조를 가능하게 한다.
발명의 간략한 요약
프로테아제 저해자 및 그 변이체의 생산방법, 세포 및 핵산을 본원에서 제공한다.
첫번째 구현예에서, 기능성 프로테아제 저해자를 코딩하는 핵산이 제공된다. 하나의 국면에서, 첫번째, 두번째, 세번째 및 네번째 핵산 서열에 작동가능하게 (operably) 연결된 조절성 서열을 포함하는 핵산이 제공된다. 터미네이터 서열은 상기 네번째 핵산 서열에 이어서 제공된다.
두번째 국면에서, 상기 첫번째 핵산 서열은 첫번째 사상균 내에서 분비성 서열로 기능하는 신호 폴리펩티드 (signal polypeptide) 를 코딩하고, 상기 두번째 핵산은 상기 첫번째 또는 두번째 사상균으로부터 정상적으로 분비되는 분비되는 폴리펩티드 (secreted polypeptide) 또는 그 기능성 부분을 코딩하고, 상기 세번째 핵산은 절단될 수 있는 링커 (cleavable linker) 를 코딩하고, 상기 네번째 핵산은 프로테아제 저해자 또는 그 단편을 코딩한다.
세번째 국면에서, 프로테아제 저해자를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트 (cassette) 가 제공된다.
네번째 국면에서, 본 발명은 프로테아제 저해자 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 관련한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 루프가 변경된 보우만-버크 저해자 변이체를 코딩할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 루프가 변경된 대두 트립신 저해자 변이체를 코딩할 수 있다.
두번째 구현예에서, 기능성 프로테아제 저해자 또는 그 변이체의 발현방법이 제공된다. 하나의 국면에서, 숙주 세포는 (i) 프로테아제 저해자 또는 그 변이체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트로 형질전환되고, (ii) 프로테아제 저해자 또는 그 변이체를 발현할 적절한 조건 하에서 배양된다. 임의적으로, 상기 방법은 프로테아제 저해자 또는 그 변이체의 회수를 포함한다.
두번째 국면에서, 숙주 세포는 (i) 프로테아제 저해자 또는 그 변이체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 첫번째 발현 카세트로 형질전환되고, (ii) 샤페론(chaperone) 을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 두번째 발현 카세트로 형질전환되고, (iii) 프로테아제 저해자 또는 그 변이체를 발현할 적절한 조건 하에서 배양된다. 임의적으로 프로테아제 저해자 또는 그 변이체는 회수될 수 있다. 하나의 국면에서, 프로테아제 저해자 또는 그 변이체는 융합 단백질로서 발현된다. 임의적으로, 상기 방법은 프로테아제 저해자 또는 그 변이체의 회수를 포함한다.
세번째 구현예에서, 프로테아제 저해자 또는 그 변이체를 발현할 수 있는 세포가 제공된다. 숙주 세포는 프로테아제 저해자 또는 그 변이체를 코딩하는 발현 카세트로 형질전환된다. 숙주 세포는 아스퍼질러스 (Aspergillus ) 및 트리코더마 (Trichoderma ) 로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
네번째 구현예에서, 기능성 프로테아제 저해자 또는 그 변이체가 제공된다. 하나의 국면에서, 상기 기능성 프로테아제 저해자 또는 그 변이체는 글루코아밀라아제 신호 서열, 프로시퀀스 (prosequence), 촉매성 도메인 및 성숙 글루코아밀라아제의 아미노산 번호 502까지의 링커 영역, 이어서 아미노산 NVISKR 및 그리고 나서 이어서 성숙 프로테아제 저해자 또는 그 변이체로 이루어진 융합 단백질로서 발현된다.
두번째 국면에서, 발현된 단백질은 융합 단백질로부터 프로테아제 저해자 또는 그 변이체를 유리하기 위하여 프로테아제로 처리된다.
세번째 국면에서, 본 발명은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 프로테아제 저해 활성을 갖는 폴리펩티드를 제공한다:
a) 보우만-버크 저해자 변이체;
b) 대두 트립신 저해자 변이체;
c) 보우만-버크 저해자;
d) 대두 트립신 저해자; 및
e) 하나 이상의 변이체 서열을 포함하는 스카폴드 (scaffold).
본 발명의 다른 목적, 특징 및 장점은 하기 상세한 설명으로 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명의 범주와 정수 내에서의 다양한 변화와 조작이 이 상세한 설명으로부터 당업자에 명백하게 될 것이기 때문에, 본 발명의 바람직한 구현예를 나타내는 특정한 실시예 및 상세한 설명은 단지 설명의 방법으로 제공된다는 것이 이해되어야 한다.
상세한 설명
본 발명은 지금 오직 하기의 정의 및 예시를 사용하는 참조의 방식으로 상세하게 기술될 것이다. 본원에서 언급된 모든 특허 및 간행물 (그러한 특허 및 간행물 내에 개시된 모든 서열을 포함함) 은 명시적으로 참조문헌으로서 편입된다.
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다. 문헌 (Singleton, 등, DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 제2판, John Wiley and Sons, New York (1994) 및 Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991)) 은 본 발명 내에서 사용된 많은 용어의 일반적 어휘를 지닌 한 기술을 제공한다. 본원에서 기술된 것과 비슷하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있더라도, 바람직한 방법 및 물질이 기술된다. 숫자 범위는 범위를 정의하는 숫자들을 포함한다. 달리 표시하지 않는 한, 각각 핵산은 왼쪽에서 오른쪽으로 5'에서 3' 방향으로 서술되고; 아미노산 서열은 왼쪽에서 오른쪽으로 아미노에서 카복시 방향으로 서술된다. 실무자는 본 기술분야의 정의 및 용어에 대해 특히 문헌 (Sambrook 등, 1989 및 Ausubel FM 등, 1993) 으로 배울 수 있다. 본 발명은 기술된 특정한 방법론, 프로토콜, 및 시약으로 제한되지 않음이 이해되어야 하며, 이들은 다양할 수 있기 때문이다.
본원에서 제공된 표제는 총괄적으로 명세서에 대한 참조로서 제공된 본 발명의 다양한 국면 또는 구현예의 제한이 아니다. 따라서, 바로 하기에서 정의된 용어는 총괄적으로 명세서에 대한 참조로서 더욱 전체적으로 정의된다.
정의
"발현 카세트" 또는 "발현 벡터"는 표적 세포 내에서 특정 핵산의 전사를 허용하는 일련의 특정 핵산 요소로 재조합적으로 또는 합성적으로 생성된 핵산 구조체이다. 재조합 발현 카세트는 플라스미드, 염색체, 미토콘드리아 DNA, 색소체 (plastid) DNA, 바이러스, 또는 핵산 단편으로 혼입될 수 있다. 통상적으로, 발현 벡터의 재조합 발현 카세트 부분은, 다른 서열들 중 전사될 핵산 서열 및 프로모터를 포함한다. 발현 카세트는 DNA 구조체 및 그 문법적 등가체로 교환적으로 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 바에 따라, 용어 "벡터"는 세포 내로 핵산 서열을 전달하기 위해 고안된 핵산 구조체를 의미한다. "발현 벡터"는 외래 세포 내에서 이종기원의 (heterologus) DNA 단편을 혼입하고 발현하는 능력을 갖는 벡터를 의미한다. 많은 원핵 및 진핵 발현 벡터가 시판된다. 적절한 발현 벡터의 선택은 당업자의 지식 내이다.
본원에서 사용된 바에 따라, 용어 "플라스미드"는 클로닝 벡터로 사용되는 환형 이중-가닥 (double stranded, ds) DNA 구조체를 의미하고, 이는 일부 진핵생물 내에서 염색체외성 자가-복제 유전 인자를 형성하거나 숙주 염색체로 혼입된다.
용어 "핵산 분자" 또는 "핵산 서열"은 RNA, DNA 및 cDNA 분자를 포함한다. 유전적 코드의 축퇴성 (degeneracy) 의 결과로서, 주어진 단백질을 코딩하는 다수의 뉴클레오티드 서열이 생산될 수 있음이 이해되어야 한다.
본원에서 사용된 바에 따라, "융합 DNA 서열"은 5'에서 3'으로 첫번째, 두번째, 세번째 및 네번째 DNA 서열을 포함한다.
본원에서 사용된 바에 따라, "첫번째 핵산 서열" 또는 "첫번째 DNA 서열"은 첫번째 사상균 내에서 분비성 서열로서 기능하는 신호 펩티드를 코딩한다. 그러한 신호 서열은, 소 키모신, 인간 조직 플라스미노겐 활성자, 인간 인터페론 및 문헌 (Gwynne 등 (1987) Bio/Technology 5, 713-719) 에 기술된 바와 같은 합성적 콘센서스 (consensus) 진핵생물 신호 서열을 포함하는 진핵생물로부터의 신호 서열뿐만 아니라, 아스퍼질러스 니거 바. 아와모리 ( Aspergillus niger var. awamori ), 아스퍼질 러스 니거 ( Aspergillus niger ), 아스퍼질러스 오리지아 ( Aspergillus oryzae ) 로부터의 글루코아밀라아제, α-아밀라아제 및 아스파틸 프로테아제의 신호 서열, 트리코더마로부터의 셀로바이오히드로라아제 I, 셀로바이오히드로라아제 II, 엔도글루카나아제 I, 엔도글루카나아제 III의 신호 서열, 뉴로스포라 (Neurospora) 및 후미콜라 ( Humicola ) 로부터의 글루코아밀라아제의 신호 서열을 포함한다. 특히 바람직한 신호 서열은 융합 폴리펩티드를 발현하고 분비하도록 사용된 발현 숙주로부터 분비되는 폴리펩티드로부터 유래한 것들이다. 예를 들어, 아스퍼질러스 니거로부터의 글루코아밀라아제의 신호 서열은 아스퍼질러스 니거로부터 융합 폴리펩티드를 발현하고 분비하는 경우 바람직하다. 본원에서 사용된 바에 따라, 첫번째 아미노산 서열은 사상균 내에서 기능성인 분비 서열에 대응한다. 그러한 아미노산 서열은 정의된 대로 첫번째 DNA 서열에 의해 코딩된다.
본원에서 사용된 바에 따라, "두번째 DNA 서열"은 사상균으로부터 정상적으로 발현되는 "분비되는 폴리펩티드"를 코딩한다. 그러한 분비되는 폴리펩티드는 아스퍼질러스 니거 바. 아와모리 , 아스퍼질러스 니거 , 아스퍼질러스 오리지아로부터의 글루코아밀라아제, α-아밀라아제 및 아스파틸 프로테아제, 트리코더마로부터의 셀로바이오히드로라아제 I, 셀로바이오히드로라아제 II, 엔도글루카나아제 I, 엔도글루카나아제 III, 뉴로스포라 종 및 후미콜라 종으로부터의 글루코아밀라아제를 포함한다. 첫번째 DNA 서열과 같이, 바람직한 분비되는 폴리펩티드는 사상균 발현 숙주에 의해 자연적으로 분비되는 것이다. 따라서, 예를 들어 아스퍼질러스 니거를 사용하는 경우, 바람직한 분비되는 폴리펩티드는 아스퍼질러스 니거로부터의 글루코아밀라아제 및 α-아밀라아제이고, 가장 바람직하게는 글루코아밀라아제이다. 하나의 국면에서 글루코아밀라아제는 아스퍼질러스 글루코아밀라아제와 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 초과의 상동성이 있다.
아스퍼질러스 글루코아밀라아제가 두번째 DNA 서열에 의해 코딩되는 분비되는 폴리펩티드인 경우, 임의적으로 프로시퀀스를 포함하는 전체 단백질 또는 그 일부분이 사용될 수 있다. 따라서, 절단될 수 있는 링커 폴리펩티드는 468 - 509 위치로부터의 임의의 아미노산 잔기에서 글루코아밀라아제에 융합될 수 있다. 다른 아미노산 잔기는 융합부위일 수 있지만, 상기 잔기를 활용하는 것이 특히 유리하다.
"분비되는 폴리펩티드의 기능성 부분" 또는 문법적 등가체는 비록 말단절단 (truncated) 되기는 했지만 정상적 형상으로 폴딩하는 그 능력을 보유하는 말단절단된 분비되는 폴리펩티드를 의미한다. 예를 들어, 에이. 니거 바. 아와모리에 의한 소 키모신 생산의 경우에, 성숙 글루코아밀라아제의 11번째 아미노산에 이어지는 프로키모신의 융합이 프리프로키모신 (preprochymosin) 의 생산과 비교하여 아무런 이득을 내지 않음이 나타났다 (US 특허 제 5,364,770호). USSN 08/318,494에서, 성숙 글루코아밀라아제의 297번째 아미노산까지의 프리프로글루코아밀라아제 (preproglucoamylase) 의 C-말단에 더하여 성숙 글루코아밀라아제의 아미노산 1-11의 반복의 융합은 에이. 니거 바. 아와모리 내에서 아무런 분비되는 키모신을 산출하지 않았음이 나타났다. 후자의 경우에서 융합 단백질 내에 존재하는 글루코아밀라아제 촉매성 도메인의 부분 (약 63%) 이 정확하게 폴딩될 가망이 없고, 따라서 세포로부터 분비될 수 없는 비정상의 잘못-폴딩된 및/또는 불안정한 융합 단백질이 생산되었을 수 있다. 부분적 촉매성 도메인이 정확하게 폴딩하는 능력이 없는 것은 부착된 키모신의 폴딩을 방해하였을 수 있다. 따라서, 자연적으로 분비되는 폴리펩티드의 도메인의 충분한 잔기가, 그것이 부착한 목적 폴리펩티드의 그 정상적 형상으로 그것이 독립적으로 폴딩할 수 있도록 하기 위해 존재하여야 한다.
대부분의 경우에, 분비되는 폴리펩티드의 부분은 정확하게 폴딩되고, 그것의 부존재와 비교하여 증가된 분비로 귀착될 것이다.
유사하게, 대부분의 경우에, 분비되는 폴리펩티드의 말단절단은 기능성 부분이 생물학적 기능을 보유함을 의미한다. 바람직한 구현예에서, 다른 기능성 도메인이 사용될 수 있음에도 불구하고, 분비되는 폴리펩티드의 촉매성 도메인, 예를 들어 기질 결합 도메인이 사용된다. 아스퍼질러스 니거 및 아스퍼질러스 니거 바. 아와모리 글루코아밀라아제의 경우에, 바람직한 기능성 부분은 효소의 촉매성 도메인을 보유하고, 아미노산 1-471을 포함한다. 부가적으로 바람직한 구현예는 촉매성 도메인 및 링커 구역의 전체 또는 부분을 활용한다. 선택적으로, 아스퍼질러스 니거 및 아스퍼질러스 니거 바. 아와모리 글루코아밀라아제의 아미노산 509-616을 포함하는, 글루코아밀라아제의 녹말 결합 도메인이 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 바에 따라, "세번째 DNA 서열"은 절단될 수 있는 링커 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 포함한다. 그러한 서열은 글루코아밀라아제의 프로시퀀스, 소 키모신의 프로시퀀스, 서브틸리신 (subtilisin) 의 프로시퀀스, 인간 면역결핍 바이러스 프로테아제를 포함하는 레트로바이러스 프로테아제의 프로시퀀스를 코딩하는 것 및 트립신, 인자 Xa 콜라게나아제, 클로스트리핀 (clostripin), 서브틸리신, 키모신, 효모 KEX2 프로테아제, 아스퍼질러스 KEXB 등에 의해 인식되고 절단되는 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열 (예를 들어, Marston, F.A.O. (1986) Biol. Chem J. 240, 1-12 참조) 을 포함한다. 그러한 세번째 DNA 서열은 또한 시아노겐 브롬화물에 의해 선택적으로 절단될 수 있는 아미노산 메티오닌을 코딩할 수 있다. 세번째 DNA 서열은 융합 폴리펩티드의 절단을 야기하는 특정 효소 또는 화학적 작용제에 의해 인식되는데 필요한 아미노산 서열만을 코딩할 필요가 있다는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 예를 들어, 글루코아밀라아제, 키모신 또는 서브틸리신의 전체 프로시퀀스는 사용될 필요가 없다. 오히려, 적절한 효소에 의한 인식 및 절단에 필요한 프로시퀀스의 부분만이 요구된다.
세번째 핵산은 융합 폴리펩티드의 절단을 야기할 특정 효소 또는 화학적 작용제에 의해 인식되는데 필요한 아미노산 서열만을 코딩할 필요가 있음이 이해되어야 한다.
특히 바람직한 절단될 수 있는 링커는 고유의 아스퍼질러스 KEX2-유사 (KEXB) 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 KEX2 프로테아제 인식 부위 (Lys-Arg), Lys 및 Arg의 트립신 프로테아제 인식 부위, 및 엔도프로테아제-Lys-C에 대한 절단 인식 부위이다.
본원에서 사용된 바에 따라, "네번째 DNA 서열"은 "목적 폴리펩티드"를 코딩한다. 그러한 목적 폴리펩티드는 프로테아제 저해자 및 그 변이체를 포함한다.
대응하는 4 개의 아미노산 서열을 코딩하는 상기-정의된 4 개의 DNA 서열은 결합하여 "융합 DNA 서열"을 형성한다. 그러한 융합 DNA 서열은 첫번째, 두번째, 세번째 및 네번째 DNA 서열의 순서로 5' 말단부터 3' 말단으로 적합한 리딩 프레임 (reading frame) 으로 배열된다. 그렇게 배열된 대로, 상기 DNA 서열은 그 아미노-말단에서부터, 사상균 내의 분비성 서열로서 기능하는 신호 펩티드, 사상균으로부터 정상적으로 분비되는 분비되는 폴리펩티드 또는 그 일부분, 절단될 수 있는 링커 폴리펩티드 및 목적 폴리펩티드를 코딩하는 "융합 폴리펩티드" 또는 "융합 단백질" 또는 "융합 유사체"를 코딩할 것이다.
본원에서 사용된 바에 따라, 용어 "목적 단백질" 또는 "목적 폴리펩티드"는 분비 증강 구조체로 융합되지 않은 그 성숙 형태의 폴리펩티드 또는 단백질을 의미한다. 따라서, "목적 단백질" 또는 "목적 폴리펩티드"는 비-융합 형태의 숙주 세포에 의해 발현되고 분비될 단백질을 의미한다.
본원에서 사용된 바에 따라, "융합 폴리펩티드" 또는 "융합 단백질" 또는 "융합 유사체"는 그 아미노-말단에서부터, 숙주 세포에서 기능성인 분비 서열로서 기능하는 신호 펩티드, 숙주 세포로부터 정상적으로 분비되는 분비되는 폴리펩티드 또는 그 일부분, 절단될 수 있는 링커 폴리펩티드 및 목적 폴리펩티드를 코딩한다. 융합 단백질은 융합 단백질 내에서 다른 단백질 서열이 없는 목적 단백질을 산출하기 위하여 숙주 세포 효소, 예를 들어 프로테아제에 의해 가공될 수 있다. 본원에서 사용된 바에 따라, 용어 "융합 유사체" 또는 "융합 폴리펩티드" 또는 "융합 단백질"은 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 바에 따라, "프로모터 서열"은 발현 목적을 위해 특정 사상균에 의해 인식되는 DNA 서열이다. 그것은 상기 정의된 융합 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열에 작동가능하게 연결된다. 그러한 연결은 융합 DNA 서열을 코딩하는 DNA 서열의 번역 개시 코돈에 대하여 프로모터의 배치를 포함한다. 프로모터 서열은 융합 DNA 서열의 발현을 중재하는 전사 및 번역 조절 서열을 함유한다. 예를 들면 에이. 니거 바. 아와모리 또는 에이. 니거 글루코아밀라아제 유전자 (Nunberg, J.H. 등 (1984) Mol. Cell. Biol. 4, 2306-2315; Boel, E. 등 (1984) EMBO J. 3, 1581-1585), 에이. 오리지아, 에이. 니거 바. 아와모리 또는 에이. 니거 알파-아밀라아제 유전자, 리조무코어 미헤이 (Rhizomucor miehei) 카복시 프로테아제 유전자, 트리코더마 리세이 (Trichoderma reesei) 셀로바이오히드로라아제 I 유전자 (Shoemaker, S.P. 등 (1984) 유럽 특허 출원 제 EPO0137280A1), 에이. 니듈란스 (A. nidulans) trpC 유전자 (Yelton, M. 등 (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1470-1474; Mullaney, E.J. 등 (1985) Mol. Gen. Genet. 199, 37-45) 에이. 니듈란스 alcA 유전자 (Lockington, R.A. 등 (1986) Gene 33 137-149), 에이. 니듈란스 amdS 유전자 (McKnight, G.L. 등 (1986) Cell 46, 143-147), 에이. 니듈란스 amdS 유전자 (Hynes, M.J. 등 (1983) Mol. Cell Biol. 3, 1430-1439) 의 프로모터, 및 SV40 초기 프로모터와 같은 고등 진핵생물 프로모터 (Barclay, S.L. 및 E. Meller (1983) Molecular and Cellular Biology 3, 2117-2130) 가 포함된다.
마찬가지로 "터미네이터 서열"은 전사를 종결하도록 발현 숙주에 의해 인식되는 DNA 서열이다. 그것은 발현될 융합 폴리펩티드를 코딩하는 융합 DNA의 3' 말단에 작동가능하게 연결된다. 임의의 균 터미네이터가 본 발명에서 기능성일 것임에도 불구하고, 예를 들면 에이. 니듈란스 trpC 유전자 (Yelton, M. 등 (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1470-1474; Mullaney, E.J. 등 (1985) Mol. Gen. Genet. 199, 37-45), 에이. 니거 바. 아와모리 또는 에이. 니거 글루코아밀라아제 유전자 (Nunberg, J.H. 등 (1984) Mol. Cell. Biol. 4, 2306-253; Boel, E. 등 (1984) EMBO J. 3, 1581-1585), 에이. 오리지아 , 에이. 니거 바. 아와모리 또는 에이. 니거 알파-아밀라아제 유전자 및 리조무코어 미헤이 카복시 프로테아제 유전자 (EPO 공보 제 0 215 594호) 의 터미네이터가 포함된다.
"폴리아데닐화 (polyadenylation) 서열"은 전사될 때 전사되는 mRNA로 폴리아데노신 잔기를 부가하여 발현 숙주에 의해 인식되는 DNA 서열이다. 그것은 발현될 융합 폴리펩티드를 코딩하는 융합 DNA의 3' 말단에 작동가능하게 연결된다. 예를 들면 에이. 니듈란스 trpC 유전자 (Yelton, M. 등 (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1470-1474; Mullaney, E.J. 등 (1985) Mol. Gen. Genet. 199, 37-45), 에이. 니거 바. 아와모리 또는 에이. 니거 글루코아밀라아제 유전자 (Nunberg, J.H. 등 (1984) Mol. Cell. Biol. 4, 2306-2315) (Boel, E. 등 (1984) EMBO J. 3, 1581-1585), 에이. 오리지아 , 에이. 니거 바. 아와모리 또는 에이. 니 거 알파-아밀라아제 유전자 및 상기한 리조무코어 미헤이 카복시 프로테아제 유전자의 폴리아데닐화 서열이 포함된다. 그러나, 임의의 균의 폴리아데닐화 서열은 본 발명에서 기능성일 것이다.
본원에서 사용된 바에 따라, 용어 "선별가능 표지-코딩 뉴클레오티드 서열"은 균 세포 내에서 발현할 수 있고 선별가능 표지의 발현이 발현된 유전자를 함유하는 세포에 대응하는 선별 조건의 존재 내에서 생장하는 능력을 부여하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
핵산은, 그것이 또 다른 핵산 서열과 기능성 관계로서 배치된 경우 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들어, 분비 리더 (leader) 를 코딩하는 DNA는 만약 그것이 폴리펩티드의 분비에 참여하는 프리프로테인 (preprotein) 으로서 발현된다면 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되는 것이고; 프로모터나 인핸서는 그것이 서열의 전사에 영향을 준다면 코딩 서열에 작동가능하게 연결되는 것이며; 또는 리보솜 결합 부위는 그것이 번역을 용이하게 하도록 배치된다면 코딩 서열에 작동가능하게 연결되는 것이다. 일반적으로 "작동가능하게 연결"은 인접하여, 및 분비 리더의 경우 인접하고 리딩 프레임에 맞게, 연결된 DNA 서열을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접하여야만 하는 것은 아니다. 연결은 편리한 제한 부위에서 결착 (ligation) 으로 이루어진다. 만약 그러한 부위가 존재하지 않는다면, 통상의 기술에 따라 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (adaptor) 또는 링커가 사용된다.
본원에서 사용된 바에 따라, "재조합"은 이종 핵산 서열의 도입으로 조작된 세포 또는 벡터, 또는 상기 세포가 그렇게 조작된 세포로부터 유래한 것을 포함한다. 따라서, 예를 들어 재조합 세포는 상기 세포의 고유의 (비-재조합) 형태 내에서 동일한 형태로 발견되지 않는 유전자를 발현하거나, 또는 계획적인 인간의 관여의 결과로 달리 비정상적으로 발현되거나, 덜 발현되거나 또는 전혀 발현되지 않는 고유의 유전자를 발현한다.
본원에서 사용된 바에 따라, 용어 "발현"은 폴리펩티드가 유전자의 핵산 서열에 기초하여 생산되는 과정을 의미한다. 상기 과정은 전사 및 번역 모두를 포함한다. 그리고 용어 "프로테아제 저해자 발현"은 발현될 특정 프로테아제 저해자 및 그 변이체의 전사 및 번역을 의미하고, 그 생산물은 전구체 RNA, mRNA, 폴리펩티드, 번역-후 가공된 폴리펩티드, 및 그 유도체를 포함한다. 유사하게, "프로테아제 저해자 발현"은 도 6에 예시된 형태로 프로테아제 저해자 및 그 변이체의 전사, 번역 및 조립을 의미한다. 예를 들어, 프로테아제 저해자 발현에 대한 평가는 프로테아제 저해자 mRNA에 대한 노던 블랏 분석 및 리버스 트랜스크립타아제 폴리머라아제 연쇄 반응 (reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR) 평가뿐만 아니라, 적절한 조건에 노출된 때 균 군체의 검사, 프로테아제 저해자 단백질에 대한 웨스턴 블랏을 포함한다.
본원에서 사용된 바에 따라, 용어 "글리코실화된"은 올리고당 분자가 단백질의 특정 아미노산 잔기에 부가되는 것을 의미한다. "탈-글리코실화된" 단백질은 단백질로부터 올리고당 분자를 부분적으로 또는 완전히 제거하기 위하여 처리된 단백질이다. "아글리코실화된" 단백질은 단백질에 부가된 올리고당 분자를 갖지 않았었던 단백질이다. 이는 올리고당의 부가를 방해하는 단백질 내의 돌연변이에 기인할 수 있다.
"비-글리코실화된" 단백질은 단백질에 부착된 올리고당을 갖지 않는 단백질이다. 이는 단백질에 대한 올리고당의 부가를 책임지는 효소의 부존재를 포함하는 (이에 국한되지는 않음) 다양한 원인에 기인할 수 있다. 용어 "비-글리코실화된"은 단백질에 부가된 올리고당을 갖지 않는 단백질 및 올리고당이 부가되었었지만 이어서 제거된 단백질 양자 모두를 포함한다. "아글리코실화된" 단백질은 "비-글리코실화된" 단백질일 수 있다. "비-글리코실화된" 단백질은 "아글리코실화된" 단백질이거나 "탈글리코실화된" 단백질일 수 있다.
본원에서 사용된 바에 따른 용어 "단리된" 또는 "정제된"은 그것에 자연적으로 연합된 하나 이상의 성분으로부터 제거된 핵산 또는 폴리펩티드를 의미한다.
용어 "실질적으로 없는"은 약 20% (건조중량) 미만의 다른 단백질, 즉 오염 단백질, 약 10% 미만의 다른 단백질, 약 5% 미만의 다른 단백질, 또는 약 1% 미만의 다른 단백질을 갖는 목적 폴리펩티드의 제조물을 포함한다.
본 발명의 단백질 및 그 단편에 적용되는 경우, 용어 "실질적으로 순수한"은 단백질이 그 의도한 용도에 현실적이고 적절한 정도로 다른 물질이 본질적으로 없는 것을 의미한다. 특히, 예를 들어, 단백질 서열분석, 또는 약학적 제조물의 생산에 유용하게 되도록, 단백질은 숙주 세포의 다른 생물학적 구성분이 충분히 없고 충분히 순수하다.
본원에서 사용된 바에 따른 용어 "표적 단백질"은 본원에서 제공된 변이체 저해자의 결합에 의해 그 활성이 봉쇄되는 단백질, 예를 들어 효소, 호르몬 등을 의미한다.
용어 "변이체 서열" 또는 "변이체 서열들"은 야생형 프로테아제 저해자 또는 다른 스카폴드의 결합 루프를 대체하는 짧은 폴리펩티드 서열을 의미한다. 변이체 서열은 스카폴드 내에서 대체될 때 결합 루프 서열과 같은 길이가 될 필요가 없다.
용어 "스카폴드"는 변이체 서열이 도입될 수 있는 야생형 단백질 서열을 의미한다. 구현예에서, 스카폴드는 대체될 수 있는 부분, 예를 들어 루프를 가질 것이다. 예를 들어, 본원에서 사용된 STI 및 BBI 서열은 변이체 서열을 위한 스카폴드가 될 것이다.
프로테아제 저해자
쿠니츠-형태 트립신 저해자 (대두 트립신 저해자, STI) 및 보우만-버크 프로테아제 저해자 (BBI) (Birk, Int. J. Pept. Protein Res. 25: 113-131 (1985) 및 Kennedy, Am. J. Clin. Neutr. 68: 1406S-1412S (1998) 참조) 의 두 단백질 프로테아제 저해자가 대두로부터 단리되었다. 이들 저해자는 변이체 서열에 대해 스카폴드로 작용한다.
또한, 변이체 서열을 포함하는 스카폴드 내의 변경으로, 본원에서 사용된 다른 목적 단백질은 N-말단에 3 개의 글리신 잔기 및/또는 C-말단에 6 개의 히스티딘 잔기의 부가를 포함한다. 도 3 및 4를 참조한다.
대두 트립신 저해자 ( STI )
STI는 안정한 화학량론적 복합체의 형성에 의해 트립신의 단백질 가수분해 활성을 저해한다. 예를 들어 문헌 (Liu, K., Chemistry and Nutritional value of soybean components. In: Soybeans, chemistry, technology and utilization. pp. 32-35 (Aspen publishers, Inc., Gaithersburg, Md., 1999)) 을 참조한다. STI는 두 디술피드 연결이 있는 181 아미노산 잔기로 이루어지고 대략 구형의 형태이다. 문헌 (Song 등, J. Mol. Biol. 275: 347-63 (1998)) 을 참조한다. 2 디술피드 연결은 BBI에 대해 하기에서 기술된 것들과 비슷한 2 결합 루프를 형성한다.
쿠니츠-형태 대두 트립신 저해자 (STI) 는 프로테이나아제의 초기 연구에서 중요한 역할을 수행하였고, 프로테이나아제 저해자의 활성의 표준 기작의 정의를 이끌어낸 생화학적 및 역학적 연구에서 주요 대상으로서 사용되었다.
보우만 - 버크 저해자 ( BBI )
BBI 단백질은 콩과의 씨앗에서 단리된 역학적으로 및 구조적으로 잘-규명된 작은 단백질 (60-90 잔기) 군이다. 이는 각각 독립적인 결합 루프를 함유하는 2 개의 트리시클릭 도메인의 대칭적 구조를 갖는다. 루프 I은 통상적으로 트립신을 저해하고 루프 II은 키모트립신을 저해한다 (Chen 등, J. Biol. Chem. (1992) 267: 1990-1994; Werner & Wemmer, 1992; Lin 등, Eur. J. Biochem. (1993) 212: 549-555; Voss 등, Eur. J. Biochem. (1996) 242: 122-131). 이들 결합 구역은 다양한 세린 프로테아제 저해자에서 발견되는 모티프인 "규범적 루프 (canonical loop)" 구조를 각각 포함한다 (Bode & Huber, Eur. J. Biochem. (1992) 204: 433-451).
BBI는 개별적인 각각의 부위에서 프로테아제 트립신 및 키모트립신을 저해하는 8 k-Da 단백질이다. 문헌 (예를 들어 Billings 등., Pro. Natl. Acad. Sci. 89: 3120-3124 (1992)) 을 참조한다. STI 및 BBI는 오직 대두 씨앗 내에서만 발견되고, 상기 식물의 다른 부분에서는 전혀 발견되지 않는다. 문헌 (예를 들어 Birk, Int. J. Pept. Protein Res. 25: 113-131 (1985)) 을 참조한다.
BBI의 많은 이성체 (isoform) 가 규명되었음에도 불구하고, SEQ ID NO:7 (도 3) 은 약 71 아미노산 잔기를 포함하는 본원에서 사용된 BBI 골격의 아미노산 서열을 보여준다. 또한, BBI는 N-이나 C- 말단으로부터 10 개 이하의 아미노산 잔기가 말단절단될 수 있다. 예를 들어, 씨앗 탈수에 있어서, BBI는 9 또는 10 아미노산 잔기가 제거된 C- 말단을 가질 수 있다. 따라서, 단백질 가수분해는 최초 디술피드 이전 및 말단 디술피드 결합 바로 이후에는 높은 내성이 있고, 그 결과는 표적 단백질의 결합에 일반적으로 유해하지 않다. 그러나, 이성체 또는 말단절단된 형태의 임의의 것이 사용될 수 있음이 인식될 것이다.
프로테아제 저해자 변이체
상기 지적한 대로, STI 및 BBI 프로테아제 저해자는 프로테아제를 저해하는 결합 루프를 갖는다. 본원에서 제공되는 독창적인 프로테아제 저해자 변이체는 루프 I, 루프 II 또는 양자 모두에서 변경을 갖는다. 한 구현예에서, 루프는 표적 단백질과 상호작용하는 서열로 대체된다.
루프는 VEGF 결합 단백질, C2, C3, C4 또는 C5 저해자와 같은 보체 경로의 저해자, 코톤 (cotton) 결합 단백질, 콤스타틴 (compstatin) 등으로부터 유래한 서열로 대체될 수 있다. 선택적으로, 변이체 서열은, 예를 들어 파지 디스플레이 또는 다른 검출 방법과 같은 본 기술분야에 공지된 다양한 방법에 의해 선택될 수 있다. 예를 들어, 무작위 펩티드 유전자 라이브러리는 펩티드 라이브러리가 파지의 표면 상에 전시되도록 파지 PIII 유전자와 융합된다. 이어서, 파지 디스플레이 라이브러리는 표적 단백질로 노출되고 완충액으로 세척되어 비-특이적 결합이 제거된다 (이 과정은 때때로 패닝 (panning) 으로 언급됨). 마지막으로, 결합 파지 및 코딩된 펩티드에 대한 DNA 서열을 PCR한 것이 단리된다.
일반적으로, 루프는 변이체 서열, 즉 3 내지 14 아미노산 길이, 바람직하게는 5 내지 10 아미노산 길이의 펩티드로 대체될 것이다. 이들이 목적한 결합 및/또는 저해를 제공하는 한, 더 긴 서열이 사용될 수 있다. 또한, 결합 루프(들)의 대체로서 사용하기 적당한 펩티드는 제한된 루프, 즉 2 개의 시스테인 잔기 사이의 디술피드 결합의 존재에 의해 형성된 루프 내에 함유된 경우, 기능성 형태를 채용하여야 한다. 특정 구현예에서, 펩티드는 7 및 9 아미노산 길이 사이이다. 이 대체 서열은 또한 프로테아제 저해 또는 표적 단백질로의 결합을 제공한다.
일부 경우에는 단일 아미노산을 변경하는 것이 유리할 수 있다. 특히, 야생형 STI 또는 BBI의 잔기 13의 알라닌은 세린, 글리신 또는 글루타민으로 변화될 수 있다.
융합 단백질
각각의 프로테아제 저해자 및 그 변이체는 숙주 균 세포에 의해 융합 단백질로서 발현될 것이다. 목적 단백질의 방출을 위한 융합 폴리펩티드의 절단이 자주 유용할 것이라도, 그것은 필수적이지 않다. 융합 단백질로서 발현되고 분비되는 프로테아제 저해자 및 그 변이체는 그 기능을 놀랍도록 보유한다.
대응하는 4 개의 아미노산 서열을 코딩하는 상기 정의된 4 개의 DNA 서열은 결합하여 "융합 DNA 서열"을 형성한다. 그러한 융합 DNA 서열은 첫번째, 두번째, 세번째 및 네번째 DNA 서열의 순서로 5' 말단부터 3' 말단으로 적합한 리딩 프레임으로 배열된다. 그렇게 조립된 대로, 상기 DNA 서열은 그 아미노-말단으로부터 사상균 내의 분비성 서열로서 기능하는 신호 펩티드, 사상균으로부터 정상적으로 분비되는 분비되는 폴리펩티드 또는 그 일부분, 절단될 수 있는 링커 펩티드 및 목적 폴리펩티드, 예를 들어 프로테아제 저해자 및 그 변이체를 코딩하는 "융합 폴리펩티드"를 코딩할 것이다.
융합 단백질의 생산은, 예를 들어 US 특허 제 5,411,873호, 제 5,429,950호, 및 제 5,679,543호에 개시된 방법을 사용하여 이루어질 수 있다. 본 기술분야에서 다른 방법은 잘 공지되어 있다.
재조합 프로테아제 저해자의 발현
본 발명이 융합 단백질의 생산에 의존하는 한, 그것은 재조합 유전학 분야의 통상적 기술에 의존한다. 본 발명에서 사용된 일반적 방법을 개시하는 기본 출전은 문헌 (Sambrook 등, Molecular Cloning , A Laboratory Manual (제 2 판 1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression : A Laboratory Manual (1990); 및 Ausubel 등, eds., Current Protocols in Molecular Biology (1994)) 을 포함한다.
본 발명은 프로테아제 저해자-코딩 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질도입, 형질전환 또는 형질감염된 사상균 숙주 세포를 제공한다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 형질도입, 형질전환 또는 형질감염을 위해 모체 숙주 세포에 대해 종래에 사용된 것들이고 당업자에게 명백할 것이다.
기본적으로, 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 숙주 세포에서 기능하는 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된다. 이 프로모터-유전자 단위체는 이후 통상적으로 복제 및/또는 발현을 위해 숙주 세포 내로 형질전환되기 전 매개 벡터로 클로닝된다. 이들 매개 벡터는 통상적으로 원핵생물 벡터, 예를 들어 플라스미드, 또는 셔틀 벡터 (shuttle vector) 이다.
하나의 접근으로서, 사상균 세포주가 프로테아제 저해자를 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된, 숙주 세포주 내에서 기능하는 프로모터 또는 생물학적으로 활성이 있는 프로모터 단편 또는 하나 이상의 (예를 들어 일련의) 인핸서를 갖는 발현 벡터로 형질감염되어, 상기 프로테아제가 세포주 내에서 발현된다. 바람직한 구현예에서, 상기 DNA 서열은 프로테아제 저해자 또는 그 변이체를 코딩한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 프로모터는 조절 가능한 것이다.
A. 코돈 최적화
잘 발현하지 않는 유전자로 잘 발현하는 유전자 내의 코돈 사용의 최적화가 본 기술분야에서 알려져 있다. 문헌 (Barnett 등, GB2200118 및 Bergquist 등, Extremophiles (2002) 6: 177-184) 을 참조한다. 본원에서 사용된 바에 따라, 코돈 최적화는 아스퍼질러스 내에서 잘 발현되는 이종 단백질 및 고유의 분비 단백질을, 잘 발현되지 않는 이종 단백질에 대해 비교함에 기초하였다. 표 I을 참조한다.
Figure 112006025993389-pct00001
발현된 단백질 내에서 사용되지 않거나 자주 사용되지 않는 선별된 코돈은 자주 사용되는 코돈으로 변화될 것이다. 그러므로, 우리는 단지 일부 코돈만을 변화시켰다.
B. 핵산 구조체/발현 벡터
프로테아제 저해자를 코딩하는 자연적 또는 합성 폴리뉴클레오티드 단편 ("PI-코딩 핵산 서열") 은 사상균 세포 내로 도입되고 그 안에서 복제할 수 있는 이종 핵산 구조체 또는 벡터로 혼입될 수 있다. 본원에서 개시된 벡터 및 방법은 프로테아제 저해자 및 그 변이체의 발현을 위해 숙주 세포 내에서 사용되기 적당하다. 임의의 벡터는 그것이 도입되는 세포 내에서 복제할 수 있고 생존할 수 있는 한 사용될 수 있다. 다수의 적당한 벡터 및 프로모터가 당업자에 공지되었고, 시판되고 있다. 사상균 세포 내에서의 사용에 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 또한 본원에서 참조문헌으로 명시적으로 편입되는 문헌 (Sambrook 등, 1989, 및 Ausubel FM 등, 1989) 에 기술된다. 적절한 DNA 서열은 다양한 과정에 의해 플라스미드 또는 벡터 (집합적으로 본원에서는 "벡터"로서 언급됨) 내로 삽입될 수 있다. 일반적으로, 상기 DNA 서열은 표준 과정에 의해 적절한 제한 엔도뉴클레아제 부위(들) 내로 삽입된다. 그러한 과정 및 관련된 서브-클로닝 과정은 당업자의 지식의 범주 내에 있는 것으로 간주된다.
적절한 벡터는 통상적으로 선별가능 표지-코딩 핵산 서열, 삽입 부위, 및 종결 서열과 같은 적당한 조절 요소가 갖추어진다. 상기 벡터는, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된, 숙주 세포 내에서 (및/또는 조작된 용해성 단백질 코딩 서열이 정상적으로 발현되지 않는 숙주 세포 환경 또는 벡터 내에서) 코딩 서열의 발현에 효과적인, 예를 들어 인트론 및 조절 요소, 즉 프로모터 및 터미네이터 요소 또는 5' 및/또는 3' 비번역 구역과 같은 비-코딩 서열을 포함하는 조절성 서열을 포함할 수 있다. 다수의 적당한 벡터 및 프로모터는 당업자에 공지되었고, 이들 중 다수는 시판되고 있고 및/또는 문헌 (Sambrook, 등, (상기)) 내에 기술된다.
대표적인 프로모터는 구조성 프로모터와 유도성 프로모터 모두를 포함하고, 그 예는 CMV 프로모터, SV40 초기 프로모터, RSV 프로모터, EF-1α 프로모터, 문헌 (ClonTech 및 BASF) 에 기술된 바와 같은 tet-on 또는 tet-off 시스템 내의 tet 반응성 요소 (tet responsive element, TRE)를 함유하는 프로모터, 베타 액틴 프로모터 및 특정 금속 염의 부가에 의해 상위조절될 (upregulated) 수 있는 메탈로티오네인 (metallothionein) 프로모터를 포함한다. 본 발명의 하나의 구현예에서, glaA 프로모터가 사용된다. 상기 프로모터는 말토오스의 존재 하에서 유도된다. 그러한 프로모터는 당업자에 잘 공지되어 있다.
당업자는 자연적 프로모터가 그의 기능을 변화함이 없이 하나 이상의 뉴클레오티드의 대체, 치환, 부가 또는 삭제로 조작될 수 있음을 인식하고 있다. 본 발명의 실무는 상기 프로모터에 대한 변경을 포함하고 이에 국한되지 않는다.
유전적 구조체 내에서 사용된 프로모터의 선택은 당업자의 지식 내이다.
적합한 선별가능 표지의 선택은 숙주 세포에 의존하며, 다른 숙주에 대한 적절한 표지가 본 기술분야에서 잘 공지되어 있다. 통상적인 선별가능 표지 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 메토트렉세이트 (methotrexate), 테트라시클린, 네오마이신 (Southern 및 Berg, J., 1982), 미코페놀산 (Mulligan 및 Berg, 1980), 퓨로마이신, 제오마이신, 또는 히그로마이신 (Sugden 등, 1985) 에 대한 내성을 수여하는 또는 (b) 영양 요구성 돌연변이 또는 숙주 계통 내에서 자연적으로 발생하는 영양 결핍을 보완하는 단백질을 코딩한다. 바람직한 구현예에서, 균의 pyrG 유전자는 선별가능 표지로서 사용된다 (Ballance D.J. 등, 1983,_Biochem. Biophys. Res. Commun. 112:284-289). 또 다른 바람직한 구현예에서, 균의 amdS 유전자는 선별가능 표지로서 사용된다 (Tilburn, J. 등, 1983, Gene 26: 205-221).
선별된 PI 코딩 서열은 잘-알려진 재조합 기술에 따라 적당한 벡터 내로 삽입될 수 있고, PI를 발현할 수 있는 세포주의 형질전환에 사용된다. 유전적 코드의 내재적 축퇴성에 기인하여, 실질적으로 같은 또는 기능적으로 등가의 아미노산 서열을 코딩하는 다른 핵산 서열이, 상기 더욱 상세하게 서술한 바와 같이 특정 프로테아제 저해자를 클론 및 발현하는데 사용될 수 있다. 그러므로 코딩 구역 내의 그러한 치환은 본 발명에 포함되는 서열 변이체 내에 속함이 인식된다. 임의의 또는 전부의 이들 서열 변이체는 모체 PI-코딩 핵산 서열에 대해 본원에서 기술된 바와 같은 방식으로 활용될 수 있다. 당업자는 다른 PI는 다른 핵산 서열에 의해 코딩될 것임을 인식할 것이다.
프로테아제 저해자 핵산 서열, 동족체, 변이체 또는 그 단편의 목적 형태가 일단 수득되면, 그것은 다양한 방식으로 조작될 수 있다. 서열이 비-코딩 측면 구역을 포함하는 경우, 측면 구역은 절제, 돌연변이 유발 등의 대상이 될 수 있다. 따라서, 전이 (transition), 전환 (transversion), 결실, 및 삽입은 자연적으로 발생하는 서열 상에서 수행될 수 있다.
이종 핵산 구조체는 프로테아제 저해자, 또는 그 변이체, 단편 또는 스플라이스 (splice) 변이체에 대한 코딩 서열을 하기와 같이 포함할 수 있다: (i) 독립적으로; (ii) 융합 단백질 또는 신호 펩티드 코딩 서열과 같은 부가적 코딩 서열과 조합적으로 (여기서 PI 코딩 서열은 주요한 코딩 서열임); (iii) 적당한 숙주 내에서 코딩 서열의 발현에 효과적인 인트론, 및 프로모터 및 터미네이터 요소 또는 5' 및/또는 3' 비번역 구역과 같은 조절 요소와 같은 비-코딩 서열과 조합적으로; 및/또는 (iv) PI 코딩 서열이 이종 유전자인 숙주 환경 또는 벡터 내에서.
적절한 프로모터 및 조절 서열과 함께 상기한 바와 같은 적절한 핵산 코딩 서열을 함유하는 이종 핵산은, 세포가 프로테아제 저해자 또는 그 변이체를 발현함을 가능하게 하기 위하여 사상균 세포를 형질전환하는데 작용될 수 있다.
본 발명의 하나의 국면에서, 이종 핵산 구조체는, 바람직하게는 확립 세포주로, 인 비트로에서 세포 내로 PI-코딩 핵산 서열을 전달하기 위해 채택된다. 바람직하게는, 생산 숙주로 사용될 세포주는 안정적으로 혼입된 본 발명의 핵산 서열을 갖는다. 이어서 안정적 형질전환체를 생성하는데 효과적인 임의의 방법이 본 발명의 실시에 사용될 수 있다.
본 발명의 하나의 국면에서, 상기 첫번째 및 두번째 발현 카세트는 하나의 벡터 또는 독립된 벡터들 상에 존재할 수 있다.
달리 나타나지 않는 한, 본 발명의 실시는 본 기술분야 내의 분자생물학, 미생물학, 및 재조합 DNA의 전통적 기술을 채택할 것이다. 그러한 기술은 문헌 내에 모두 설명되었다. 예를 들어, 문헌 ("Molecular Cloning : A Laboratory Manual", 제 2 판 (Sambrook, Fritsch & Maniatis, 1989), "Animal Cell Culture" (R. l. Freshney, ed. , 1987); 및 "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel 등, eds. , 1987)) 을 참조한다. 하기 및 상기 모두에서 본원에서 언급된 모든 특허, 특허 출원, 기사 및 간행물은 이로써 참조문헌으로 본원에 명백히 편입된다.
프로모터 서열에 부가하여, 발현 카세트도 또한 효율적인 종결을 위해 제공할 구조적 유전자의 하류의 전사 종결 구역을 함유하여야 한다. 상기 종결 구역은 프로모터 서열과 같은 유전자로부터 수득될 수 있거나, 또한 당업자의 지식 내의 다른 유전자로부터 수득될 수 있다.
세포 내로 유전적 정보를 전달하기 위해 사용되는 특정 발현 벡터는 특별히 결정적이지 않다. 진핵 또는 원핵 세포 내의 발현을 위해 사용되는 임의의 통상적인 벡터가 사용될 수 있다. 표준 박테리아 발현 벡터는 pBR322 기재 플라스미드, pSKF, pET23D, 및 MBP, GST, 및 LacZ와 같은 융합 발현 시스템과 같은 플라스미드뿐만 아니라 박테리오파지 λ 및 M13을 포함한다. 예를 들어 c-myc의, 통상적인 단리방법을 제공하기 위해 에피토프 태그 (epitope tag) 가 재조합 단백질에 또한 부가될 수 있다.
발현 벡터에 통상적으로 포함된 요소는 레플리콘 (replicon), 재조합 플라스미드를 갖는 박테리아의 선별을 가능하게 하는 항생제 내성을 코딩하는 유전자, 및 이종 서열의 삽입을 허용하는 플라스미드의 비본질적 부분 내의 고유의 제한 부위를 또한 포함한다. 선택된 특정 항생제 내성 유전자는 결정적이지 않고, 본 기술분야에서 공지된 임의의 많은 내성 유전자가 적당하다.
C. 숙주 세포 및 배양 조건
본 발명은 프로테아제 저해자 및 그 변이체의 발현을 야기하는데 효과적인 방법으로 조작, 선별 및 배양된 세포를 포함하는 세포주를 제공한다.
PI 발현을 위해 처리 및/또는 조작될 수 있는 모체 세포주의 예는 사상균 세포를 포함하나, 이것에 국한되지는 않는다. 본 발명을 실시하는데 사용하기 위한 적절한 1차 세포 (primary cell) 형태의 예는 아스퍼질러스 및 트리코더마를 포함하나, 이것에 국한되지는 않는다.
프로테아제 저해자 발현 세포는 모체 세포주의 배양에 통상적으로 채택된 조건 하에서 배양된다. 일반적으로, 송아지 혈청과 같은 혈청 5-10%로 통상적으로 보완된, 표준 RPMI, MEM, IMEM 또는 DMEM과 같은 생리적 염 및 영양분을 함유하는 표준 배지에서 배양된다. 배양 조건은 또한 표준, 예를 들어 원하는 수준의 프로테아제 저해자 발현이 달성될 때까지 정적 또는 롤러 배양 하에서 37℃에서 배양된다.
주어진 세포주에 대한 바람직한 배양 조건은 과학 문헌 및/또는 세포주의 출처 (예를 들어 American Type Culture Collection (ATCC; "http://www.atcc.org/")) 로부터 찾을 수 있다. 통상적으로, 세포 생장이 확립된 후, 상기 세포는 프로테아제 및 그 변이체의 발현을 야기하거나 저해하는데 효과적인 조건에 노출된다.
바람직한 구현예에서, PI 코딩 서열이 유도성 프로모터의 조절 하에 있는 경우, 유도 인자, 예를 들어 탄수화물, 금속 염 또는 항생제가 프로테아제 저해자 발현을 유도하는데 효과적인 농도로 배지에 첨가된다.
D. 숙주 세포 내로 프로테아제 저해자-코딩 핵산 서열의 도입
사용된 형질전환 방법은 사상균의 게놈 내로 형질전환 벡터의 전체 또는 부분의 안정적 혼입을 야기할 수 있다. 그러나, 자가-복제하는 외부-염색체성 형질전환 벡터의 유지를 야기하는 형질전환도 또한 예상된다.
본 발명은 외인성으로 (exogenously) 제공된 PI-코딩 핵산 서열을 포함하도록 유전적으로 조작된 세포 및 세포 조성물을 추가로 제공한다. 모체 세포 또는 세포주는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터로 유전적으로 조작될 (즉, 형질도입될, 형질전환될 또는 형질감염될) 수 있다. 상기 벡터는, 예를 들어 상기 추가로 기술된 바 대로 플라스미드, 바이러스 입자, 파지 등의 형태일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 플라스미드가 사상균 세포를 형질감염하는데 사용된다. 형질전환은 연속적이거나 공동-형질전환 (co-transformation) 일 수 있다.
다양한 방법이 인 비트로에서 세포 내로 발현 벡터의 전달을 위해 채택될 수 있다. 이종 핵산 서열의 발현을 위해 세포 내로 핵산을 도입하는 방법은 당업자에 또한 공지되어 있으며, 전기천공법; 핵 미세주입 또는 단일 세포 내로의 직접적 미세주입; 완전한 세포 (intact cell) 의 원형질 융합; 다가양이온 (polycation), 예를 들어 폴리브렌 (polybrene) 또는 폴리오르니틴 (polyornithine) 의 사용; 또는 PEG; 리포좀과의 막 융합, 리포펙타민 또는 리포펙션-매개 형질감염, DNA-코팅된 미세발사체로 고속 포격; 칼슘 포스페이트-DNA 침전물과의 배양; DEAE-덱스트란 매개 형질감염; 조작된 바이러스 핵산으로 감염; 아그로박테리움 ( Agrobacterium ) -매개 DNA 전달; 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 또한, PI-코딩 핵산 서열을 포함하는 이종 핵산 구조체는 인 비트로에서 전사될 수 있고, 생성된 RNA는 잘-알려진 방법, 예를 들어 주입에 의해 숙주 세포에 도입될 수 있다.
프로테아제 저해자에 대한 코딩 서열을 포함하는 이종 핵산 구조체의 도입에 이어서, 유전적으로 조작된 세포는 프로모터를 활성화하고, 형질전환체를 선별하거나, PI-코딩 핵산 서열의 발현을 증폭하는데 적절하도록 조작된 통상의 영양 배지 내에서 배양될 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현을 위해 선별된 숙주 세포에 대해 종래에 사용된 것들이며, 당업자에 명백할 것이다.
그러한 이종 핵산 구조체가 도입된 세포의 후손은 이종 핵산 구조체 내에서 발견되는 PI-코딩 핵산 서열을 포함하는 것으로 일반적으로 여겨진다.
E. 균의 발현
적절한 숙주 세포는 사상균 세포를 포함한다. 발현 숙주 및 첫번째 및 두번째 핵산의 출처 모두로서 작용하는 본 발명의 "사상균 (filamentous fungi)"은 진핵 미생물이고 유미코티나 (Eumycotina) 아문의 모든 사상 형태를 포함한다 (Alexopoulos, C.J. (1962), Introductory Mycology, New York: Wiley). 이들 균은 키틴, 글루칸, 및 다른 복잡한 다당류로 구성된 세포 벽이 있는 무성 균사체로 특징지어진다. 본 발명의 사상균은 형태학적으로, 생리학적으로, 및 유전적으로 효모와 구별된다. 사상균의 무성 생장은 균사의 신장에 의한다. 반면에, 에스 . 세레비시에 (S. cerevisiae ) 와 같은 효모의 무성 생장은 단일 세포 엽상체의 발아에 의한다. 에스 . 세레비시에 및 사상균 사이의 차이의 세부 사항은 에스 . 세레비시에가 아스퍼질러스 및 트리코더마 인트론을 가공하지 못하는 것 및 사상균의 많은 전사 조절자를 인식하지 못하는 것을 포함한다 (Innis, M.A. 등 (1985) Science, 228, 21-26).
하기 속들을 포함하는 사상균의 다양한 종은 발현 숙주로서 사용될 수 있다: 아스퍼질러스, 트리코더마 , 뉴로스포라 , 페니실리움 ( Penicillium ), 세팔로스포리 움 ( Cephalosporium ), 아클리아 ( Achlya ), 파네로채트 ( Phanerochaete ), 포도스포라 (Podospora ), 엔도티아 ( Endothia ), 무코어 ( Mucor ), 푸사리움 , 후미콜라, 및 크리소스포리움 ( Chrysosporium ). 특정한 발현 숙주는 에이. 니듈란스 (Yelton, M., 등 (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81,1470-1474; Mullaney, E.J. 등 (1985) Mol. Gen. Genet. 199, 37-45; John, M.A. 및 J.F. Peberdy (1984) Enzyme Microb. Technol. 6, 386-389; Tilburn, 등 (1982) Gene 26, 205-221; Ballance, D.J. 등, (1983) Biochem. Biophys. Res. Comm. 112, 284-289; Johnson, I.L. 등 (1985) EMBO J. 4, 1307-1311), 에이. 니거 (Kelly, J.M. 및 M. Hynes (1985) EMBO 4, 475-479), 에이. 니거 바. 아와모리, 예를 들어 NRRL 3112, ATCC 22342, ATCC 44733, ATCC 14331 및 UVK 143f 계통, 에이. 오리지아, 예를 들어 ATCC 11490, N. crassa (Case, M.E. 등 (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 5259-5263; Lambowitz U.S. 특허 제 4,486,553호; Kinsey, J.A. 및 J.A. Rambosek (1984) Molecular and Cellular Biology 4, 117-122; Bull, J.H. 및 J.C. Wooton (1984) Nature 310, 701-704), 트리코더마 리세이, 예를 들어 NRRL 15709, ATCC 13631, 56764, 56765, 56466, 56767, 및 트리코더마 비리데 ( Trichoderma viride ), 예를 들어 ATCC 32098 및 32086을 포함한다. 바람직한 발현 숙주는 주요하게 분비되는 아스파틸 프로테아제를 코딩하는 유전자가 삭제된 에이. 니거 바. 아와모 리이다. 상기 바람직한 발현 숙주의 생산은 1988년 7월 1일에 접수된 미국 특허 출원 제 214,237호에 기술되어 있고, 참조문헌으로 본원에 명확히 편입된다.
진핵생물인 균 내에서 분비 과정 중, 분비되는 단백질은 세포질로부터 소포체 (endoplasmic reticulum, ER) 의 루멘 (lumen) 내로 막을 통과한다. 여기가 단백질이 폴딩되고 디술피드 결합이 형성되는 곳이다. BiP와 같은 샤페론 단백질 및 단백질 디술피드 이소머라아제와 같은 단백질이 이 가공에 도움을 준다. 글리코실화 단백질을 생산하도록 당 쇄가 단백질에 부착되는 것이 또한 이 단계이다. 당은 통상적으로 N-연결 글리코실화로서 아스파라긴 잔기에 또는 O-연결 글리코실화로서 세린 또는 트레오닌 잔기에 부가된다. 정확하게 폴딩되고 글리코실화된 단백질은 ER로부터 당 쇄가 조작되고 효모 및 균의 KEX2 또는 KEXB 프로테아제가 내재하는 골지체로 들어간다. 균 내에서 생산된 분비되는 단백질에 부가되는 N-연결 글리코실화는 포유동물 세포에 의해 부가되는 것과 다르다.
사상균 숙주 세포에 의해 생산되는 프로테아제 저해자 및 그 변이체는 글리코실화되거나 또는 비-글리코실화 (즉, 아글리코실화 또는 탈글리코실화) 될 수 있다. 균의 글리코실화 양상은 포유동물 세포에 의해 생산되는 것과 다르기 때문에, 프로테아제 저해자는 프로테아제 저해자를 탈글리코실화하기 위한 효소로 처리될 수 있다. 그러한 N-연결 탈글리코실화에 유용한 효소는 엔도글리코시다아제 H, 엔도글리코시다아제 F1, 엔도글리코시다아제 F2, 엔도글리코시다아제 A, PNGase F, PNGase A 및 PNGase At이다. 그러한 O-연결 탈글리코실화에 유용한 효소는 엑소글리코시다아제들, 특히 알파-만노시다아제 (예를 들어, 알파-만노시다아제 (아스퍼질러스 사이토 ( Aspergillus saito ), iGKX-5009), 알파(1-2, 3, 6) - 만노시다아제 (작두콩, GKX-5010) 알파-만노시다아제/MANase VI (크산토모나스 마니호티 (Xanthomonas manihoti ) 로부터 재조합, GKX80070), 모두 Glyko (Prozyme), San Leandro, California에서 입수) 이다.
우리는 놀랍게도 고유의 분비되는 단백질과 융합된 때, 높은 수준의 프로테아제 저해자 및 그 변이체가 균 내에서 만들어질 수 있다는 것을 발견하였다. 상기 제공된 정보로부터, 글루코아밀라아제가 여전히 N-말단에 부착된 때, 프로테아제 저해자 및 그 변이체는 ER 내에서 조립될 것이 기대됨이 명백하다. 이는 56 kD 초과의 큰 단백질을 생산할 것이다. 글루코아밀라아제는 그것이 추가의 조작 없이 골지체를 통과할 때 목적 단백질로부터 절단될 것으로 기대되지 않을 것이다.
본 발명의 방법 및 숙주 세포를 사용하여, 우리는 놀랄만한 발현의 수준을 획득하였다. 본원에서 활용된 시스템은 0.5 g/l 초과의 프로테아제 저해자의 발현 및 분비의 수준을 달성하였다.
발현 벡터가 세포 내로 도입된 후, 형질감염된 세포는 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 발현에 유리한 조건 하에서 배양된다. 형질전환된 세포의 큰 일군은 상기한 바와 같이 배양될 수 있다. 마지막으로, 생산물은 본 기술분야에서 공지된 기술을 사용한 배양으로 회수된다.
샤페론
상기 지적한 대로, ER 내에서의 분비 단백질의 폴딩 및 글리코실화는 샤페론이라 불리는 많은 ER-내재 단백질에 의해 도움을 받는다. BiP (GRP78), GRP94 또는 효모 Lhs1p와 같은 샤페론은 폴딩되지 않은 상태에서 노출된 소수성 구역에 결합하고 불리한 상호작용을 방지함에 의하여 분비성 단백질이 폴딩되는 것을 돕는다 (Blond- Elguindi 등, 1993, Cell 75: 717-728). 샤페론은 또한 ER 막을 통한 단백질의 전위 (translocation) 에 있어서 중요하다. 단백질 디술피드 이소머라아제 (pdi) 및 그의 동족체 및 프롤릴-펩티딜 cis-trans 이소머라아제와 같은 폴다아제 (foldase) 단백질은 각각 디술피드 연결의 형성 및 프롤린 잔기에 인접한 펩티드 쇄의 정확한 형상의 형성에 도움을 준다.
본 발명의 하나의 국면에서 숙주 세포는 샤페론을 코딩하는 발현 벡터로 형질전환된다. 샤페론은 pdiA 및 prpA로 이루어진 군으로부터 선택된다.
발효 파라미터
본 발명은 균 배양을 위한 발효 과정에 의존한다. 이종 단백질의 생산을 위한 발효 과정은 본 기술분야에서 그 자체로 공지되어 있다. 예를 들어, 단백질은 뱃치 (batch), 페드-뱃치 (fed-batch) 및 연속흐름 (continuous-flow) 공정을 포함하는 액내 (submerged) 또는 고체 배양에 의해 생산될 수 있다.
배양은 수성 미네랄 염 배지, 유기 생장 인자, 탄소 및 에너지원 물질, 분자적 산소, 및 물론 채택될 하나 이상의 특정 미생물 종의 개시 접종원을 포함하는 배양 배지 내에서 이루어진다.
탄소 및 에너지원, 산소, 동화할 수 있는 질소, 및 미생물의 접종원에 부가하여, 적합한 미생물 생장을 보장하고, 미생물의 변환 과정에서 세포에 의한 탄소 및 에너지원의 동화를 최대화하고, 발효 배지 내에서 최대 세포 밀도로 최대 세포성 산출을 달성하기 위해서, 미네랄 영양분을 적합한 비율로 적당한 양을 공급하는 것이 필수적이다.
수성 미네랄 배지의 조성은 채택된 기질 및 미생물에 부분적으로 의존하여, 본 기술분야에서 공지된 바와 같이 넓은 범위에 걸쳐 다양하다. 미네랄 배지는, 질소에 부가하여, 적당한 용해성의 동화할 수 있는 이온성 및 화합된 형태의, 적당한 양의 인, 마그네슘, 칼슘, 칼륨, 황, 및 나트륨을 포함하고, 또한 바람직하게는 역시 적당한 용해성의 동화할 수 있는 형태의 구리, 망간, 몰리브덴, 아연, 철, 붕소, 및 요오드 등과 같은 특정 미량 원소가 존재하여야 하며, 모두는 본 기술분야에서 공지되었다.
발효 반응은, 미생물 종이 번성하는 양식으로 생장하도록 도움을 주는데 효과적인 적당한 산소 부분압으로 발효 용기의 내용물을 유지하기 위해 제공되는, 공기, 산소-강화 공기, 또는 심지어 실질적으로 순수한 산소 분자와 같은 산소 분자-함유 기체에 의해 필요한 산소 분자가 공급되는 호기성 반응이다. 그 효과에서, 산소가 첨가된 탄화수소 기질을 사용함으로써, 미생물의 생장에 대한 산소 유구치가 감소한다. 그럼에도 불구하고, 기질의 동화 및 대응하는 미생물의 생장은 부분적으로 산화 과정이기 때문에, 산소 분자는 생장을 위하여 공급되어야 한다.
공기노출 비율은 상당한 범위에 걸쳐 다양할 수 있지만, 공기노출은 일반적으로 분당 발효기 내의 액체 부피당 산소-함유 기체의 부피 (25℃ 가압하) 로, 약 0.5 내지 10, 바람직하게는 약 0.5 내지 7의 범위 내의 비율에서 수행된다. 이 양은 반응기로 공급되는 정상 산소 함량의 공기에 기초하고, 순수한 산소의 조건에서 각 범위는 분당 발효기 내의 액체 부피당 산소의 부피 (25℃ 가압하) 로, 약 0.1 내지 1.7, 또는 바람직하게는 약 0.1 내지 1.3일 것이다.
미생물의 변환 과정을 위해 채택된 압력은 넓은 범위일 수 있다. 압력은 일반적으로, 달성되는 산소 용해도에 대한 장비 및 작동 비용의 균형에 따라, 약 0 내지 50 psig, 상당히 바람직하게는 약 0 내지 30 psig, 더욱 바람직하게는 적어도 대기압보다 약간 높은 범위 내이다. 대기압 초과인 것은 그러한 압력이 수성 발효체 내의 용해된 산소 농도를 증가시키는 경향이 있고, 따라서 세포 생장률을 증가시키는데 도움을 줄 수 있기 때문에 유리하다. 동시에, 이것은 높은 대기압은 장비 및 작동 비용을 증가시키는 사실과 균형을 이룬다.
발효 온도는 어느 정도 다양할 수 있으나, 아스퍼질러스 니거 바. 아와모리와 같은 사상균에 대해서는, 선택된 미생물의 계통에 따라 온도는 일반적으로 약 20℃ 내지 40℃ 범위 내, 일반적으로 바람직하게는 약 28℃ 내지 37℃ 범위 내일 것이다.
미생물은 또한 동화할 수 있는 질소원을 필요로 한다. 동화할 수 있는 질소원은 미생물에 의해 물질대사로 활용되기 적당한 형태로 질소를 낼 수 있는 임의의 질소-함유 화합물 또는 화합물들일 수 있다. 단백질 가수분해물과 같은 다양한 유기 질소원 화합물이 채용될 수 있고, 통상 암모니아, 암모늄 수화물, 우레아, 및 암모늄 포스페이트, 암모늄 설페이트, 암모늄 피로포스페이트, 암모늄 클로라이드와 같은 다양한 암모늄 염, 또는 다양한 다른 암모늄 화합물과 같은 값싼 질소-함유 화합물이 활용될 수 있다. 암모니아 기체 자체는 대용량 실시에 대해 편리하고, 적당한 양으로 수성 발효체 (발효 배지) 를 통한 기포 형성으로 적용될 수 있다. 동시에, 그러한 암모니아는 pH 조절에 도움을 주기 위해 또한 적용될 수 있다.
수성 미생물 발효체 (발효 부가혼합물) 내의 pH 범위는 약 2.0 내지 8.0의 대표적인 범위 내이어야 한다. 사상균에 대해, pH는 일반적으로 약 2.5 내지 8.0의 범위 내이고; 아스퍼질러스 니거 바. 아와모리에 대해, pH는 일반적으로 약 4.5 내지 5.5의 범위 내이다. 특정 미생물에 대한 pH 범위 선호는 특정 미생물 뿐만 아니라 채용된 매질에도 어느 정도 의존하며, 따라서 당업자에 의해 용이하게 판단될 수 있는 정도의 배지의 변화로 어느 정도 변화한다.
발효기 내의 발효 부가혼합물의 평균 체류 시간은 부분적으로 채택된 배양 및 발효 온도에 따라 상당히 다양할 수 있으며, 일반적으로 그것은 약 24 내지 500 시간, 상당히 바람직하게는 약 24 내지 400 시간의 범위 내일 것이다.
바람직하게는, 발효는 탄소-함유 기질이 제한 인자로서 조절될 수 있는 것과 같은 양식으로 수행됨으로써, 세포에 탄소-함유 기질의 양호한 전환을 제공하고 비전환된 기질의 실질적 양으로 세포의 오염을 피하게 한다. 임의의 잔류 미량물이 용이하게 세척되기 때문에, 후자는 수-용해성 기질에서는 문제가 아니다. 그러나, 그것은 비-수-용해성 기질의 경우에는 문제일 수 있고, 적당한 세척 단계와 같은 추가의 생산물-처리 단계를 필요로 한다.
상기한 바에 따라, 이 한계 기질 수준에 도달하는 시간은 결정적이지 않고 특정 미생물 및 수행되는 발효 과정에 따라 다양할 수 있다. 그러나, 발효 배지 내에서 탄소원 농도 및 목적한 수준의 탄소원을 달성하였는지 여부를 측정하는 방법에 대해서는 본 기술분야에 잘 공지되어 있다.
비록 발효가 뱃치 또는 연속 공정으로서 수행될 수 있음에도 불구하고, 페드 뱃치 실시는 일반적으로 조절의 용이, 균일한 양의 생산물의 생산, 및 모든 장비의 가장 경제적인 사용으로 인해 바람직하다.
필요하다면, 탄소 및 에너지원 물질의 일부 또는 전체 및/또는 암모니아와 같은 동화할 수 있는 질소원의 일부는 발효기에 수성 미네랄 배지를 공급하기 전 수성 미네랄 배지에 첨가될 수 있다.
반응기 내로 도입되는 각각의 흐름은 바람직하게는 예정된 비율로, 또는 탄소 및 에너지 기질의 농도, pH, 용존 산소, 배양기로부터의 배출-기체 내의 산소 또는 이산화탄소, 빛 투과성에 의해 측정가능한 세포 밀도 등과 같은 모니터링에 의해 결정될 수 있는 필요성에 대응하여 조절된다. 충전 기질에 대해 가능한 한 높은 미생물 세포의 수율을 얻기 위하여, 더욱 중요하게는 단위 부피당 목적 단백질의 가장 높은 생산을 얻기 위하여, 탄소 및 에너지원의 효율적인 활용과 일맥상통하는 가능한 한 급속한 세포 생장율을 얻기 위하여, 다양한 물질의 공급 비율은 다양할 수 있다.
뱃치 또는 바람직한 페드 뱃치 실시에서, 모든 장비, 반응기 또는 발효 수단, 그릇 또는 용기, 배관, 부대적인 순환 또는 냉각 장치 등은, 예를 들어 약 15 분 이상 약 121℃에서와 같은 증기를 채택함으로써 일반적으로 처음에 살균된다. 살균된 반응기는 이후 산소 및 탄소-함유 기질을 포함하는 모든 필요한 영양분의 존재 하에서 선별된 미생물의 배양체로 접종된다. 상당히 바람직한 것은 15L 바이오라피테 (Biolafitte, Saint-Germain-en-Laye, France) 하에서의 실시임에도 불구하고, 채택된 발효기의 유형은 결정적이지는 않다.
단백질 분리
일단 목적 단백질이 발현되고, 임의적으로 분비되면, 목적 단백질의 회수가 필수적일 수 있다. 본 발명은 그 융합 유사체로부터 목적 단백질을 분리하는 방법을 제공한다. 본원에 기술된 방법은 융합 유사체로부터 프로테아제 저해자 및 변이체의 분리에 대해 유용한 것으로 특히 인식된다.
발효 배양액으로부터 목적 단백질의 수집 및 정제는 본 기술분야에서 그 자체에 대해 공지된 절차로 또한 행해질 수 있다. 발효 배양액은 목적 단백질 생산물 뿐만 아니라 본 기술분야에서 공지된 수단으로 발효 배양액으로부터 바람직하게는 제거되는, 세포, 다양한 현탁된 고체 및 다른 바이오매스 (biomass) 오염물을 포함하는 세포 잔해물을 일반적으로 함유할 것이다.
그러한 제거에 적당한 방법은 원심분리, 여과, 투석, 미세여과, 회전 진공 여과 또는 다른 공지된 방법과 같은, 무-세포 여과액을 생산하기 위한 통상의 고체-액체 분리 기술을 포함한다. 초원심분리, 증발 또는 침전과 같은 기술을 사용한, 결정화 이전에 발효 배양액 또는 무-세포 여과액을 추가로 농축하는 것이 바람직할 수 있다.
상청액 또는 여과액의 단백질성 성분의 침전은, 염, 예를 들어 암모늄 설페이트 또는 pH를 2 내지 3으로 조정하고 이후 2 시간 동안 80℃에서 배양액의 열처리의 수단, 이어서 다양한 크로마토그래피 절차, 예를 들어 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 그로마토그래피 또는 유사한 본 기술분야에서 인식된 절차에 의한 정제로 달성될 수 있다.
발현된 목적 폴리펩티드가 분비되는 때, 폴리펩티드는 생장 배지로부터 정제될 수 있다. 바람직하게는 발현 숙주 세포는 폴리펩티드의 정제 전에 (예를 들어 원심분리에 의해) 배지로부터 제거된다.
발현된 재조합 목적 폴리펩티드가 숙주 세포로부터 분비되지 않는 때, 숙주 세포는 바람직하게는 파쇄되고 폴리펩티드는 정제의 첫번째 단계인 수성 "추출물"로 방출된다. 바람직하게는 발현 숙주 세포는 세포 파쇄 전에 (예를 들어 원심분리에 의해) 배지로부터 수집된다.
세포 파쇄는 리소자임 또는 베타-글루카나아제 소 또는 세포의 고압의 힘을 가하는 것과 같은 전통적인 기술에 의해 수행될 수 있다. 그러한 세포 파쇄 기술의 추가적 설명에 대하여 문헌 (Robert K. Scobes, Protein Purification, 제 2 판, Springer-Verlag) 을 참조한다.
C-말단에 6 개의 히스티딘 잔기, 즉 His 태그 (tag) 의 부가는 또한 목적 단백질 및 그 융합 유사체의 정제에 도움이 될 수 있다. 정제 보조체로서 His 태그의 사용은 본 기술분야에서 잘 공지되어 있다. 예를 들어 문헌 (Hengen (1995) TIBS 20(7): 285- 286) 을 참조한다. 6X his-태깅된 단백질은 고정 금속 이온 친화성 크로마토그래피 (Immobilized Metal ion Affinity Chromatography, IMAC) 를 사용하여 용이하게 정제된다.
프로테아제 저해자 및 그 변이체는 소수성 전하 유도 크로마토그래피 (hydrophobic charge induction chromatography, HCIC) 의 조합을 사용하여 수성 단백질 용액, 예를 들어 전체 세포 발효 배양액 또는 정화된 배양액으로부터 정제될 수 있음이 특히 인식된다. HCIC는 목적 단백질을 배양액으로부터 및 그의 융합 유사체로부터 분리하는 능력을 제공한다.
용도
목적 단백질의 몇몇 적용에 있어서, 프로테아제 저해자가 극히 순수한, 예를 들어 99% 초과의 순도를 갖는 것이 매우 중요하다. 이는 목적 단백질이 치료제로서 사용되는 때마다 특히 그러하지만, 또한 다른 적용에 대해서도 필수적이다. 본원에서 기술된 방법은 실질적으로 순수한 목적 단백질을 생산하는 방식을 제공한다. 본원에서 기술된 목적 단백질은 약제 및 개인 치료 조성물에 있어 유용하다.
도 1은 대두 보우만-버크 형태 프로테아제 저해자 (Bowman-Birk type protease inhibitor, BBI) 에 대한 코돈 최적화 뉴클레오티드 서열이다 (SEQ ID NO:1). 이 서열은 NVISKR (점선 밑줄) 을 코딩하는 뉴클레오티드, 융합 단백질에 대한 절단 부위 및 발현 플라스미드 내로 클로닝을 위한 3 개의 제한효소 부위를 포함한다. 5' 말단에 NheI 부위와 3' 말단에 XhoI 부위는 밑줄이 있고, 표지되어 있다. 3' 말단에 BstEII 부위는 # 기호로 명시되어 있다. 종결 코돈은 별표로 명시되어 있다. 이것은 융합 단백질로서 발현되기 때문에 개시 코돈은 없다. 성숙 BBI 코딩 서열은 이중 밑줄로 표시되어 있다 (SEQ ID NO:2). 성숙 BBI 코딩 서열 전의 3 개의 글리신 잔기를 코딩하는 뉴클레오티드의 부가 (도 1B) 는 도 2에 표시된 3 개의 글리신 잔기를 코딩하는 서열을 사용하여 행해질 수 있다 (SEQ ID NO:5). BBI, 3 개의 제한 부위, kex2 부위, N-말단에 3 개의 글리신 잔기 및 C-말단에 6 개의 히스티딘 잔기를 코딩하는 서열이 도 1C에 나타난다 (SEQ ID NO:54).
도 2는 대두 트립신 저해자 (Soybean Trypsin Inhibitor, STI), 쿠니츠 형태 프로테아제 저해자의 코돈 최적화 뉴클레오티드 서열이다 (SEQ ID NO:3). 이 서열은 NVISKR (점선 밑줄) 을 코딩하는 뉴클레오티드 (SEQ ID NO:4), 융합 단백질의 절단 부위, 및 C-말단에 6 개의 히스티딘 잔기 (점으로 표시됨) 를 코딩하는 서열을 포함한다. 발현 플라스미드 내로 클로닝을 위한 3 개의 제한효소 부위 (5' 말단에 NheI 및 3' 말단에 BstEII 및 XhoI, 도 1에 대해 기술된 대로 표시됨) 가 또한 포함된다. kex2 부위 (NVISKR) 이후의 3 개의 글리신 잔기가 굵게 표시된다. 성숙 STI를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 파선 밑줄로 표시된다 (SEQ ID NO:6).
도 3A는 BBI에 대한 성숙 아미노산 서열이다 (SEQ ID NO:7). 도 3B는 N-말단의 3 개의 글리신 잔기가 있는 BBI이다 (SEQ ID NO:8). 도 3C는 N-말단에 3 개의 글리신 잔기 및 C-말단에 6 개의 히스티딘 잔기가 있는 BBI이다 (SEQ ID NO:9). 도 3A-C에서 루프1은 밑줄친 아미노산 잔기로 표시되고, 루프 II 아미노산 잔기는 굵은 형태로 표시된다.
도 4A는 N-말단에 3 개의 글리신 잔기가 있고 C-말단에 6 개의 히스티딘 잔기가 있는 성숙 STI이다 (SEQ ID NO:10). 도 4B는 N-말단에 3 개의 글리신 잔기가 있는 STI이다 (SEQ ID NO:11). 도 4C는 STI에 대한 성숙 아미노산 서열이다 (SEQ ID NO:12). 루프1은 밑줄친 아미노산 잔기로 표시된다 (SEQ ID NO:13). 루프 II 아미노산 잔기는 굵은 형태로 표시된다 (SEQ ID NO:14).
도 5는 발현 플라스미드 pSLGAMpR2-BBI의 도해이다. 이 플라스미드는 에이.니거 글루코아밀라아제 프로모터, 촉매성 코어 및 터미네이터, 표지 유전자 (에이. 니거 pyrG) 및 소 프로키모신 유전자를 삽입함에 의하여 pSL1180으로부터 유래한 pSLGAMpR2에 기초한다. pSL1180 플라스미드는 Amersham Bioscience (Piscataway, NJ) 로부터 입수할 수 있다. pSLGAMpR2 플라스미드는 소 프로키모신 유전자가 BBI 유전자 자리에 위치하는 것을 제외하고는, pSLGAMpR2-BBI에 대해 나타난 바와 같은 상대적 위치에 삽입된 상기 열거된 요소를 갖는다. 그러므로, BBI 유전자는 pSLGAMpR2-BBI를 산출하기 위하여 pSLGAMpR2 내에서 BBI 유전자가 프로키모신 유전자를 대체한다.
도 6은 야생형 BBI에 대한 아미노산 서열 (SEQ ID NO:7) 및 BBI의 선별된 변이체 (SEQ ID NO:15 내지 29) 이다. 야생형 BBI는 밑줄친 루프를 갖는다. 야생형으로부터 변이체의 차이는 굵고/밑줄치거나 (루프 I) 굵게 (루프II) 로서 나타난다. 몇몇 변이체, 예를 들어 C2, C3, C4, C5 및 인자 B에서, 13 위치의 알라닌 (2 개의 시스테인 사이) 은 또한 "세린", "글리신" 또는 "글루타민"으로 또한 변화되었다. 또한 콤스타틴 (compstatin) 펩티드는 7 개 대신에 9 개의 아미노산을 갖는다. 변이체 서열이 또한 나타난다 (SEQ ID NO:30 내지 40).
도 7은 단백질 SDS 젤의 사진이다. 레인 1은 분자량 표지를 함유한다. 레인 2는 형질전환되지 않은 모체 계통 (parental strain) 이다. 레인 3은 BBI-코딩 DNA로 형질전환된 모체 계통이다. 레인 4는 BBI-코딩 벡터 및 샤페론 (pdiA)-코딩 벡터로 공동-형질전환된 모체 계통이다. 레인 15는 BBI-코딩 벡터 및 샤페론 (prpA)-코딩 벡터로 공동-형질전환된 모체 계통이다. 목적 단백질, 예를 들어 BBI의 발현은 샤페론의 존재 하에서 증가되었다.
도 8은 플라스미드 pTrex4의 도해이다.
도 9 A-D는 pTrex2에 대한 핵산 서열이다 (SEQ ID NO:41).
하기 실험적 개시에서, 하기 약어가 적용된다: eq (등가물); M (몰의); μM (마이크로몰의); N (노르말); mol (몰); mmol (밀리몰); μmol (마이크로몰); nmol (나노몰); g (그램); mg (밀리그램); kg (킬로그램); μg (마이크로그램); L (리터); ml (밀리리터); μl (마이크로리터); cm (센티미터); mm (밀리미터); μm (마이크로미터); nm (나노미터); ℃. (도 섭씨); h (시간); min (분); sec (초); msec (밀리초); Ci (큐리) mCi (밀리큐리); μCi (마이크로큐리); TLC (박층 아크로마토그래피, thin layer achromatography); Ts (토실); Bn (벤질); Ph (페닐); Ms (메실); Et (에틸), Me (메틸). PI (프로테아제 저해자), BBI (보우만-버크 저해자), STI (대두 트립신 저해자).
본 발명은 청구된 발명의 범위를 어떤 방식으로라도 제한하려는 의도가 아닌 하기의 실시예로서 더욱 상세하게 기술된다. 첨부된 도는 본 발명의 설명 및 명세서의 필수적 부분으로서 인식되는 것으로 의미된다. 언급된 모든 참조문헌은 그 안에 기술된 모두에 대하여 참조문헌으로서 본원에 특히 편입된다. 하기 실시예는 청구된 발명을 설명하기 위하여 제공되지만, 청구된 발명을 제한하지 않는다.
실시예 1
대두 트립신 저해자를 코딩하는 DNA 의 클로닝
본 실시예는 STI를 위한 발현 벡터의 개발을 설명한다.
일반적으로, 목적 단백질을 코딩하는 유전자는 STI 종결 코돈인 TAG에 이어지는, N-말단에 NheI 제한효소 부위 및 C-말단에 BstEII 제한효소 부위를 통해 가공된 kexB 절단 부위 (NVISKR) 와 함께 글루코아밀라아제의 링커 구역을 코딩하는 DNA로 융합된다. 대두 STI를 코딩하는 유전자는 2 개의 제한 부위, kexB 절단 부위 및 N-말단에 3 개의 글리신 잔기 및 C-말단에 6 개의 히스티딘 잔기를 함유하는 DNA 단편으로서 인 비트로에서 MCLAB (South San Francisco, California) 에 의해 합성된다 (SEQ ID NO:3, 도 2에 나타난 유전자). 본원에서 사용되는 모든 PCR-생성 DNA 단편은 pCRII-TOPO 벡터 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 로 처음에 클로닝된다. 이. 콜라이 [E. coli, Invitrogen의 One Shot®TOP10 세포] 를 통상의 플라스미드 단리 및 플라스미드 유지를 위해 사용하였다. NheI 및 BstEII 부위를 pCRII-TOPO 벡터로부터 PCR 생산물을 잘라내는데 사용하였고, 생성된 DNA 단편은 이후 발현 벡터인 pSL1180-GAMpR-2로 결착되었다 (도 5 참조). 발현 벡터인 pSL1180-GAMpR2는 아스퍼질러스 니거 글루코아밀라아제 프로모터, 글루코아밀라아제 촉매성 도메인 및 터미네이터 구역을 함유한다. 발현 플라스미드는 또한 선별 표지로서 에이. 니거 pyrG 유전자를 함유한다. 그러므로, 발현 카세트가 있는 형질전환체의 검출은 우리딘-결핍 배지 상의 생장에 의해 이루어진다.
STI 펩티드를 코딩하는 유전자 (아미노산 서열에 대해: 도 4A, SEQ ID NO:10; 뉴클레오티드 서열에 대해: 도 2 및 SEQ ID NO:6) 를 합성하였고 MCLAB에 의해 pCRII-TOPO 벡터 (Invitrogen) 내로 클로닝하였다. NheI 부터 BstEII 의 단편을 제한 절단에 의해 플라스미드로부터 유리하였고, 아가로스 젤로부터 DNA 단편을 추출하였고, 발현 플라스미드 pSLGAMpR2-SBTI/nonopti (Q110) 을 생성하기 위해 WO 9831821에 상세하게 기술되어 있는 글루코아밀라아제-키모신 발현 벡터인 pSLGAMpR2 내로 클로닝하였다.
발현 플라스미드를 dgr246ΔGAP:pyr2- 내로 형질전환하였다. 이 계통은 pepA 유전자가 삭제된 계통 dgr246 P2로부터 유래하고, pyrG가 없고 이종 유전자 산물의 개선된 생산을 위해 몇 회의 돌연변이 생성 및 검사 또는 선별을 거쳤다 (Ward, M. 등, 1993, Appl. Microbiol. Biotech. 39: 738-743 및 그것의 참조문헌). 계통 dgr246ΔGAP:pyr2-를 생성하기 위하여, glaA (글루코아밀라아제) 유전자를 완전히 같은 삭제 플라스미드 (pΔGAM NB-Pyr) 및 문헌 (Fowler, T. 등 (1990) Curr. Genet., 18: 537-545) 에 의해 보고된 바와 같은 절차를 사용하여 dgr246 P2로부터 삭제하였다. 간단하게, 삭제를 양 말단에 glaA 측면 서열을 갖는 선형 DNA 단편으로 및 선별가능 표지로서 아스퍼질러스 니듈란스 pyrG 유전자에 의해 교체된 glaA 유전자의 프로모터 및 코딩 구역의 부분으로 형질전환에 의해 달성하였다. glaA 측면 서열을 함유하는 선형 단편 및 pyrG 유전자가 염색체의 glaA 유전자자리에 혼입된 형질전환체를 서던 블랏 분석으로 확인하였다. 이 변화는 형질전환된 계통 dgr246ΔGAP 내에서 발생하였다. 이 형질전환체의 포자를 플루오로오로틱산을 함유하는 배지 위로 평판 배양하였고 자발적 내성 돌연변이를 문헌 (van Hartingsveldt, W. 등 (1987) Mol. Gen. Genet. 206: 71-75) 에 의해 기술된 바에 따라 수득하였다. 이들 중 하나인 dgr246ΔGAP:pyr2-는 야생형 pyrG 유전자를 포함한 플라스미드로 형질전환에 의해 보완될 수 있는 우리딘 영양 요구체 계통으로 나타났다.
아스퍼질러스 형질전환 프로토콜은 캠벨 방법 (Campbell 등 (1989). Curr. Genet. 16: 53-56) 의 변형이었다. 모든 용액 및 배지를 가압살균하거나 0.2 마이크론 필터를 통해 필터 살균하였다. 에이. 니거 바. 아와모리의 포자를 복합물 배지 아가 (complex media agar, CMA) 평판으로부터 채취하였다. CMA는 20 g/l 덱스트로스, 20 g/l 딥코 브랜드 (Difco Brand) 맥아 추출물, 1 g/l 박토 펩톤 (Bacto Peptone), 20 g/l 박토 아가(Bacto agar), 20 ml/l 의 100 mg/ml 아르기닌 및 20 ml/l 의 100 mg/ml 우리딘을 함유하였다. 포자의 약 1.5 제곱cm 의 아가 마개를 100 ml 의 액체 CMA (박토 아가가 제외된 것을 제외하고는 CMA에 대한 조제법과 같음) 를 접종하는데 사용하였다. 플라스크를 밤새 250-275 rpm 에서 진탕기 상에서 37℃에서 배양하였다. 균사체를 무균 미라클로쓰 (Miracloth, Calbilchem, San Diego, CA, USA) 를 통하여 채취하였고 50 ml의 용액 A (10 ml 의 나트륨 포스페이트 내의 0.8 M MgS04, pH 5.8) 로 세척하였다. 세척된 균사체를 20 ml 의 용액 A 내의 300 mg 의 베타-D-글루카나아제 (interspex Products, San Mateo, CA) 의 무균 용액 내에 위치시켰다. 이를 무균의 250 ml 플라스틱 병 (Corning Inc, Corning, New York) 내에서 2 시간 동안 200 rpm 에서 28℃ 내지 30℃에서 배양하였다. 배양 후, 이 원형질체 용액을 무균의 50 ml 코니칼 튜브 (Sarstedt, USA) 내로 무균의 미라클로쓰를 통하여 걸렀다. 원형질체를 함유하는 생성된 액체를 두 개의 50 ml 코니칼 튜브로 동일하게 분할하였다. 40 ml 의 용액 B (1.2 M 소르비톨, 50 mM CaCl2, 10 mM 트리스, pH 7.5) 를 각 튜브로 첨가하였고 5 분간 최대 속력으로 테이블형 임상 원심분리기 (Damon IEC HN SII 원심분리기) 내에서 원심분리하였다. 각 튜브의 상청액을 버렸고 20 ml 의 새 용액 B를 하나의 튜브에 첨가하였고, 섞은 뒤, 모든 펠렛이 재현탁될 때까지 다음 튜브로 부었다. 이후 상기 튜브를 5분간 원심분리하였다. 상청액을 버렸고, 20 ml 의 새 용액 B를 첨가하였고, 튜브를 5분간 원심분리하였다. 세척은 0.5-1.0 X 107 원형질체/100ul의 밀도에서 용액 B 내에서 세척된 원형질체를 재현탁하기 전에 마지막으로 한번 수행하였다. 무균의 15 ml 코니칼 튜브 (Sarstedt, USA) 내의 원형질체 각각 100 ul 로, 10 ul 의 형질전환 플라스미드 DNA를 첨가하였다. 이것으로, 12.5 ul 의 용액 C (50% PEG 4000, 50 mM CaCl2, 10 mM 트리스 pH 7.5) 를 첨가하고, 튜브를 20 분간 얼음 상에 위치시켰다. 1 ml 의 용액 C를 첨가하였고 튜브를 얼음으로부터 상온으로 옮겼고 천천히 흔들었다. 2 ml 의 용액 B를 용액 C를 희석하기 위해 즉시 첨가하였다. 형질전환 혼합물을 45℃ 수조 내에 보관하였던 3 개 튜브의 용융된 MMS 오버레이 (6 g/l NaN03, 0.52 g/l KCl, 1.52 g/l KH2PO4, 218.5 g/l D-소르비톨, 1.0 ml/l 미량 원소-LW, 10 g/l 시플라크 (SeaPlaque) 아가로스 (FMC Bioproducts, Rook1 and, Maine, USA) 20 ml/l 50% 글루코스, 2.5 ml/l 20% MgS04. 7H20, NaOH로 pH를 6.5로 맞춤) 에 동등하게 첨가하였다. 미량 원소-LW은 1 g/l FeSO4.7H2O, 8.8 g/l ZnS04.7H20, 0.4 g/l CuSO4.5H20, 0.15 g/l MnS04.4H20, 0.1 g Na2B407.10H2O, 50 mg/l (NH4)6Mo7O24.4H20, 250 ml H20,200 ul/l 농축 HCl로 구성되었다. 형질전환 혼합물이 있는 용융된 오버레이는 아가 평판 상에 직접적으로 첨가된 333 ul/평판의 100 mg/ml의 아르기닌으로 보완된 3 개의 MMS 평판 (MMS 오버레이 제조법과 같지만 10 g/l 의 시플라크 아가로스 대신 20 g/l 의 박토 아가의 예외가 있음) 에 즉시 부었다. 아가로스가 고 체화된 후, 평판을 형질전환체가 생장할 때까지 30℃에서 배양하였다.
포자를 형성하는 형질전환체를 최소 배지 + 글루코스 (MM) 의 평판으로 무균 이쑤시개로 골라냈다. MM은 6 g/l NaN03, 0.52 g/l KCl, 1.52 g/l KH2PO4, 1 ml/l 미량 원소-LW, 20 g/l 박토 아가, NaOH로 pH를 6.5로 맞춤, 25 ml/l 의 40 % 글루코스, 2.5 ml/l 의 20% MgS04.7H20 및 20 ml/l 의 100 mg/ml 아르기닌으로 구성되었다. 일단 MM 상에서 형질전환체가 생장하면 이들을 CMA 평판으로 이전시켰다.
각각의 형질전환체의 평판 배양으로부터의 1.5 제곱cm 아가 마개를 250 ml 진동 플라스크 내의 50 ml 의 프로모소이 스페셜 (Promosoy special) 이라 불리는 생산 배지로 첨가하였다. 이 배지는 하기 성분을 가졌다: 70 g/l 나트륨 시트레이트, 15 g/l (NH4)2S04, 1 g/l NaH2PO4.H20, 1 g/l MgS04, 1 ml Tween 80, NaOH으로 pH를 6.5로 맞춤, 2 ml/l Mazu DF60-P, 45 g/l 프로모소이 100 (Central Soya, Fort Wayne, IN), 120 g/l 말토오스. 상기 생산 배지 플라스크를 5 일간 200 rpm, 30℃에서 배양하였고 상청액 시료를 채취하였다. 형질전환체는 생산된 단백질의 양에 기초하여 형질전환체를 선별하기 위하여 SDS 젤 상에서 단백질 생산에 대하여 평가하였다. 상위 형질전환체로부터의 배양액을 트립신 또는 키모트립신 저해 활성에 대하여 평가하였다.
각각의 형질전환체의 평판 배양으로부터의 1.5 제곱cm 아가 마개를 또한 250 ml 진동 플라스크 내의 50 ml 의 변경된 CSS로 불리는 생산 배지로 첨가하였다. 이 배지는 하기 성분을 가졌다: 50 g/l 콘 스트립 솔리드 (Corn Streep Solids), 1 g/l NaH2PO4*H2O, 0.5 g/l MgSO4 (무수), 50 g/l 스탈리 (Staley) 7350 (55%) 및 8 g/l Na 시트레이트. 상기 생산 배지 플라스크를 3 일간 200 rpm, 36℃에서 배양하였고, 상청액 시료를 채취하였고, SDS 젤 상에서 단백질의 생산에 대해 평가하였다. 상위 형질전환체로부터의 배양액을 트립신 또는 키모트립신 저해 활성에 대하여 평가하였다.
실시예 2
대두 트립신 저해자를 코딩하는 DNA 의 코돈 최적화
하기 실시예는 어떻게 STI-코딩 DNA를 사상균 내에서 최적화된 발현을 위해 변경하였는지를 상세하게 설명한다.
합성 유전자 (MCLAB에 의해 합성된 실시예 1의 개시 물질) 로부터의 코돈을 이후 아스퍼질러스 내의 많이 발현되는 유전자의 코돈 사용에 따라 최적화하였다. 기본적으로, 글루코아밀라아제, 알파-아밀라아제 및 프로키모신과 같은 잘 발현되는 단백질을 인간 NEP 및 DPP4와 같은 아스퍼질러스 내에서 잘 발현하지 않는 단백질과 비교하였다. 표 I을 참조한다. 아스퍼질러스 내의 단백질 발현의 두 가지 형태 모두의 코돈 사용 표가 표 II에 있다.
Figure 112006025993389-pct00002
Figure 112006025993389-pct00003
Figure 112006025993389-pct00004
많은 코돈이 잘 발현하는 유전자 내에서 사용되지 않거나 자주 사용되지 않음이 명백하다. 이들 코돈은 잘 발현하지 않는 유전자 내에서 더욱 더 자주 발견되었다 (표 II 내에서 별표로 표시됨). STI 유전자 내에서, 우리는 다른 잘 발현되는 단백질에 의해 사용되지 않거나 자주 사용되지 않는 몇몇의 그러한 코돈을 확인하였고 상기 코돈을 잘 발현되는 단백질 내에서 더 자주 사용되는 코돈으로 바꾸었다. 표 III 및 IV를 참조한다.
Figure 112006025993389-pct00005
Figure 112006025993389-pct00006
Figure 112006025993389-pct00007
최적화된 DNA는 3 개의 제한 부위 (유전자의 5' 말단에 NheI 및 3' 말단에 BstEII 및 XhoI), kexB 절단 부위 및 N-말단에 3 개의 글리신 잔기 및 C-말단의 6 개에 히스티딘 잔기를 함유하는 DNA 조각으로서 인 비트로에서 MCLAB (South San Francisco) 에 의해 합성되었다 (SEQ I.D. NO:3). 이 최적화된 유전자를 pCRII-TOPO 벡터로 클로닝하였다. 상기 실시예 1에 기술된 절차를 따라, NheI 내지 BstEII 단편을 제한 절단으로 플라스미드로부터 유리하였고 DNA 단편을 아가로스 젤 상에서 정제하였고 그로부터 추출하였고, 발현 플라스미드 pSLGAMpR2-SBTI (Q107) 을 생성하기 위하여 pSLGAMpR2 내로 클로닝하였다.
발현 플라스미드를 dgr246ΔGAP:pyr2 내로 형질전환하였다. 형질전환 및 형질전환체의 진동 플라스크 검사는 실시예 1에 기재된 바와 같았다. 31 개의 형질전환체를 평가하였고 SDS 젤을 단백질 발현의 수준을 점검하기 위해 사용하였다. 상위 6 개의 형질전환체로부터의 배양액을 트립신 저해 활성에 대하여 평가하였다.
실시예 3
아스퍼질러스 내의 보우만 - 버크 저해자 및 그것의 변이체의 발현
a. kexB 부위 및 N-말단에 3 개의 글리신 및 C-말단에 6 개의 히스티딘 잔기가 있는 글루코아밀라아제로 BBI 융합:
상기 실시예 2에 기술된 절차를 따라, BBI-코딩 DNA를 최적화하였고 이 실시예에 대하여 사용하였다. 상기 DNA는 3 개의 제한 부위 (유전자의 5' 말단에 NheI 및 3' 말단에 BstEII 및 XhoI), kexB 절단 부위 및 N-말단에 3 개의 글리신 잔기 및 C-말단에 6 개의 히스티딘 잔기를 함유하는 DNA 조각으로서 인 비트로에서 MCLAB에 의해 합성되었다 (SEQ ID NO:54). 그것을 pCRII-TOPO 벡터 (Invitrogen) 내로 클로닝하였다. 상기 실시예 1에 기술된 절차를 따라, NheI 내지 BstEII 단편을 제한 절단으로 플라스미드로부터 유리하였고 DNA 단편을 아가로스 젤로부터 추출하였고, 발현 플라스미드 pSLGAMpR2-BBIkex+ (Q104) 을 생성하기 위하여 pSLGAMpR2 내로 클로닝하였다. 발현 플라스미드를 dgr246ΔGAP:pyr2 내로 형질전환하였다. 형질전환 및 형질전환체의 진동 플라스크 검사는 실시예 1에 기재된 바와 같았다. 28 개의 형질전환체가 생성되었고 25 개의 형질전환체를 진동 플라스크 내에서 평가하였다. SDS 젤을 단백질 발현의 수준을 점검하기 위해 사용하였다. 상위 형질전환체로부터의 배양액을 트립신 또는 키모트립신 저해 활성에 대하여 평가하였다.
b. C-말단에 6 개의 히스티딘 잔기가 있는 글루코아밀라아제로 BBI 융합:
상기 실시예 2에 기술된 절차를 따라, BBI-코딩 DNA를 최적화하였고 이 실시예에 대하여 사용하였다. 상기 DNA는 3 개의 제한 부위 (유전자의 5' 말단에 NheI 및 3' 말단에 BstEII 및 XhoI), 및 C-말단에 6 개의 히스티딘 잔기를 함유하는 DNA 조각으로서 인 비트로에서 MCLAB에 의해 합성되었다 (SEQ ID NO:42: 서열은 하기한 바와 같음):
Figure 112006025993389-pct00008
그것은 pCRII-TOPO 벡터로 클로닝되었다. 상기 실시예 1에 기술된 절차를 따라, NheI 내지 BstEII 단편을 제한 절단으로 플라스미드로부터 유리하였고, 아가로스 젤로부터 정제 및 추출하였고, 발현 플라스미드 pSLGAMpR2-BBIkex-(Q105) 을 생성하기 위하여 pSLGAMpR2 내로 클로닝하였다. 발현 플라스미드를 dgr246ΔGAP:pyr2 내로 형질전환하였다. 형질전환 및 형질전환체의 진동 플라스크 검사는 실시예 1에 기재된 바와 같았다. 38 개의 형질전환체가 생성되었고 25 개의 형질전환체를 진동 플라스크 내에서 평가하였다. SDS 젤을 단백질 발현의 수준을 점검하기 위해 사용하였다. 상위 형질전환체로부터의 배양액을 트립신 또는 키모트립신 저해 활성에 대하여 평가하였다.
c. kexB 부위 및 N-말단에 3 개의 글리신 잔기가 있는 글루코아밀라아제로 BBI 융합:
pCRII-TOPO 벡터 내로 클로닝된 인 비트로에서 MCLAB에 의해 합성된 플라스미드 DNA (SEQ ID NO:5) 를 PCR 증폭을 위한 DNA 주형으로서 사용하였다. 2 개의 프라이머를 고안하였다: 5' GGG CTA GCA ACG TCA TCT CCA AG 3' (SEQ ID NO : 43) 및 5' GGG GTC ACC TAG TTC TCC TTA TCG TCC TCG CTG 3' (SEQ ID NO : 44). 상기 DNA를 하기 조건 하에서 프라이머의 존재 내에서 증폭하였다: DNA를 트리스-EDTA 완충액으로 10 내지 100 배 희석하였다. 10 마이크로리터의 희석된 DNA를 에펜도르프 튜브 내의 전체 100 마이크로리터 반응 내의 0.2 mM 의 각 뉴클레오티드 (A, G, C 및 T), 1x 반응 완충액, 0.5 내지 0.6 마이크로그램의 프라이머 1 (SEQ ID NO:43) 및 프라이머 2 (SEQ ID NO:44) 를 함유한 반응 혼합물로 첨가하였다. 5 분간 100℃로 혼합물을 가열한 후, 2.5 유닛의 Taq DNA 중합효소를 반응 혼합물로 첨가하였다. PCR 반응을 1 분간 95℃에서 수행하였고, 프라이머를 1 분간 50℃에서 주형에 부착시켰고, 신장을 1 분간 72℃에서 행하였다. 이 순환을 30 회 반복하였고, 이후의 사용을 위하여 4℃에 보관하기 전 7 분간 68℃에서 신장의 부가적인 순환이 있었다. 아가로스 젤에 의해 검출된 PCR 단편을 이후 플라스미드 벡터 pCRII-TOPO (Invitrogen) 내로 클로닝하였다. 생성된 PCR 단편은 6 개 히스티딘 잔기를 코딩하는 뉴클레오티드 및 XhoI 제한 부위가 제거된 것을 제외하고는 SEQ ID NO:54와 동일한 서열을 함유한다. 상기 실시예 1에 기술된 절차를 따라, PCR 단편을 제한효소 NheI 및 BstEII으로 절단하였다. 절단된 DNA 단편을 에탄올로 침전시키고, his태그가 없는 발현 플라스미드 pSLGAMpR2-BBI (Q108) 을 생성하기 위하여 pSLGAMpR2 내로 클로닝하였다. 발현 플라스미드를 dgr246ΔGAP:pyr2 내로 형질전환하였다. 형질전환 및 형질전환체의 진동 플라스크 검사는 실시예 1에 기재된 바와 같았다. 57 개의 형질전환체가 생성되었고 25 개의 형질전환체를 진동 플라스크 내에서 평가하였다. SDS 젤을 단백질 발현의 수준을 점검하기 위해 사용하였다. 상위 형질전환체로부터의 배양액을 트립신 또는 키모트립신 저해 활성에 대하여 평가하였다.
d. kexB 부위가 있는 글루코아밀라아제로 BBI 융합:
pCRII-TOPO 벡터 내로 클로닝된 인 비트로에서 MCLAB에 의해 합성된 플라스미드 DNA (SEQ ID NO:1) 를 PCR 증폭을 위한 DNA 주형으로서 사용하였다. 두 개의 프라이머를 고안하였다: 5' GGG GTC ACC TAG TTC TCC TTA TCG TCC TCG CTG 3' (SEQ ID NO:44) 및 5' GGG CTA GCA ACG TCA TCT CCA AGC GCG ACG ATG AGA GCT CTA AG 3' (SEQ ID NO:45). 생성된 PCR 단편은 3 개의 글리신 잔기 및 6 개의 히스티딘 잔기 및 XhoI 제한 부위가 제거된 것을 제외하고는 SEQ ID NO:54 (도 1C) 와 동일한 서열을 함유한다. 상기 실시예 1에 기술된 절차를 따라, PCR 단편을 제한효소 NheI 및 BstEII으로 절단하였다. 절단된 DNA 단편을 에탄올로 침전시키고, 3G 및 his태그가 없는 발현 플라스미드 pSLGAMpR2-BBI (Q109) 을 생성하기 위하여 pSLGAMpR2 내로 클로닝하였다. 발현 플라스미드를 dgr246ΔGAP:pyr2 내로 형질전환하였다. 형질전환 및 형질전환체의 진동 플라스크 검사는 실시예 1에 기재된 바와 같았다. 127 개의 형질전환체가 생성되었고 42 개의 형질전환체를 진동 플라스크 내에서 평가하였다. SDS 젤을 단백질 발현의 수준을 점검하기 위해 사용하였다. 상위 형질전환체로부터의 배양액을 트립신 또는 키모트립신 저해 활성에 대하여 평가하였다.
실시예 4
아스퍼질러스 내에서 보우만 - 버크 저해자 및 그 변이체 (다른 결합자에 의한 루프 교체) 의 발현
변이체 서열을 본 기술분야에서 공지된 표준 절차를 사용하여 BBI의 하나 또는 양자 모두의 루프 내로 도입하였다. 제조자의 지시에 따라 3 회 동안 표적 단백질 또는 기질에 대하여 시판되는 파지 펩티드 라이브러리 PhD C7C (New England BioLabs, Beverly, MA) 를 패닝함에 의하여, 또는 공지된 활성이 있는 서열을 사용하여 변이체 서열을 측정하였다. 하기 제공된 서열에서, 루프 뉴클레오티드 서열 내로 도입된 변경은 소문자 뉴클레오티드로 표시된다.
a. 루프 I 내의 a- VEGF ( CK37281 ) 이 있는 BBI
pCRII-TOPO 벡터 내로 클로닝된 인 비트로에서 MCLAB에 의해 합성된 플라스미드 DNA (SEQ ID NO:1) 를 PCR 증폭을 위한 DNA 주형으로서 사용하였다. VEGF 기능을 저해하기 위하여 VEGF에 결합하는 펩티드 서열 (a-VEGF로 나타냄) 을 도입하기 위하여 2 개의 프라이머를 고안하였다:
Figure 112006025993389-pct00009
PCR을 2 분간 94℃에서 혼합물의 가열, 이후 30 초간 94℃, 30 초간 63℃ 및 30 초간 72℃에서 30 순환의 반응에 의하여 수행하였다. 30 순환 후, 혼합물을 그것을 4℃에서 보관하기 전에 4 분간 72℃에서 배양하였다. 교체 결합 루프는 DNA 서열분석에 의하여 증명하였다. NheI 내지 BstEII DNA 단편을 제한 절단으로 플라스미드로부터 해방하였고, 정제하였고, 루프1 내의 발현 플라스미드 pSLGAMpR2-BBI (CK37281) (Q117) 을 생성하기 위하여 pSLGAMpR2 내로 클로닝하였다. 발현 플라스미드를 dgr246ΔGAP:pyr2 내로 형질전환하였다. 형질전환 및 형질전환체의 진동 플라스크 검사는 실시예 1에 기재된 바와 같았다. 30 개 초과의 형질전환체가 생성되었고 42 개의 형질전환체를 진동 플라스크 내에서 평가하였다. SDS 젤을 단백질 발현의 수준을 점검하기 위해 사용하였다.
b. 루프 II 내의 a- VEGF ( CK37281 ) 펩티드가 있는 BBI
플라스미드 구축, 균의 형질전환체의 수득 및 진동 플라스크 내에서의 균의 형질전환체의 평가를 위하여, 우리는 하기 2 개의 프라이머가 사용된 것을 제외하고는 상기 실시예에 기술된 것과 같은 절차를 따른다:
Figure 112006025993389-pct00010
c. 루프 I 및 II 내의 a- VEGF ( CK37281 ) 펩티드가 있는 BBI
플라스미드 구축, 균의 형질전환체의 수득 및 진동 플라스크 내에서의 균의 형질전환체의 평가를 위하여, 우리는 하기 4 개의 프라이머가 사용된 것을 제외하고는 같은 절차를 따른다:
Figure 112006025993389-pct00011
d. 루프 I 내의 a- 보체 단백질 c2 펩티드가 있는 BBI
플라스미드 구축, 균의 형질전환체의 수득 및 진동 플라스크 내에서의 균의 형질전환체의 평가를 위하여, 우리는 c2 기능을 저해하기 위하여 c2에 결합하는 펩티드 서열 (a-c2로 나타냄) 을 도입하기 위하여 하기 2 개의 프라이머가 사용된 것을 제외하고는 같은 절차를 따른다:
Figure 112006025993389-pct00012
e. 루프 I 내의 a- 보체 단백질 c3 펩티드가 있는 BBI
플라스미드 구축, 균의 형질전환체의 수득 및 진동 플라스크 내에서의 균의 형질전환체의 평가를 위하여, 우리는 c3 기능을 저해하기 위하여 c3에 결합하는 펩티드 서열 (a-c3으로 나타냄) 을 도입하기 위하여 하기 2 개의 프라이머가 사용된 것을 제외하고는 같은 절차를 따른다:
Figure 112006025993389-pct00013
f. 루프 I 내의 a- 보체 단백질 c4 펩티드가 있는 BBI
플라스미드 구축, 균의 형질전환체의 수득 및 진동 플라스크 내에서의 균의 형질전환체의 평가를 위하여, 우리는 c4 기능을 저해하기 위하여 c4에 결합하는 펩티드 서열 (a-c4로 나타냄) 을 도입하기 위하여 하기 2 개의 프라이머가 사용된 것을 제외하고는 같은 절차를 따른다:
Figure 112006025993389-pct00014
g. 루프 I 내의 a- 보체 단백질 c5 펩티드가 있는 BBI
플라스미드 구축, 균의 형질전환체의 수득 및 진동 플라스크 내에서의 균의 형질전환체의 평가를 위하여, 우리는 c5 기능을 저해하기 위하여 c5에 결합하는 펩티드 서열 (a-c5로 나타냄) 을 도입하기 위하여 하기 2 개의 프라이머가 사용된 것을 제외하고는 같은 절차를 따른다:
Figure 112006025993389-pct00015
h. 루프 I 내의 a-인간 보체 인자 B 펩티드가 있는 BBI
플라스미드 구축, 균의 형질전환체의 수득 및 진동 플라스크 내에서의 균의 형질전환체의 평가를 위하여, 우리는 인자 B 기능을 저해하기 위하여 인자 B에 결합하는 펩티드 서열 (a-인자 B로 나타냄) 을 도입하기 위하여 하기 2 개의 프라이머가 사용된 것을 제외하고는 같은 절차를 따른다:
Figure 112006025993389-pct00016
i. 루프 I 내의 a-막 메탈로프로테아제 2 (MMP2) 펩티드가 있는 BBI
플라스미드 구축, 균의 형질전환체의 수득 및 진동 플라스크 내에서의 균의 형질전환체의 평가를 위하여, 우리는 MMP2 기능을 저해하기 위하여 MMP2에 결합하는 펩티드 서열 (a-MMP2로 나타냄) 을 도입하기 위하여 하기 2 개의 프라이머가 사용된 것을 제외하고는 같은 절차를 따른다:
Figure 112006025993389-pct00017
j. 루프 I 내의 a-막 메탈로프로테아제 12 ( MMP12 ) 펩티드가 있는 BBI
플라스미드 구축, 균의 형질전환체의 수득 및 진동 플라스크 내에서의 균의 형질전환체의 평가를 위하여, 우리는 MMP12 기능을 저해하기 위하여 MMP12에 결합하는 펩티드 서열 (a-MMP12로 나타냄) 을 도입하기 위하여 하기 2 개의 프라이머가 사용된 것을 제외하고는 같은 절차를 따른다:
Figure 112006025993389-pct00018
k. 루프 I 내의 코톤 결합 펩티드 2314가 있는 BBI
플라스미드 구축, 균의 형질전환체의 수득 및 진동 플라스크 내에서의 균의 형질전환체의 평가를 위하여, 우리는 코톤에 결합하는 펩티드 서열을 도입하기 위하여 하기 2 개의 프라이머가 사용된 것을 제외하고는 같은 절차를 따른다:
Figure 112006025993389-pct00019
l. 루프 I 내의 코톤 결합 펩티드 2317이 있는 BBI
플라스미드 구축, 균의 형질전환체의 수득 및 진동 플라스크 내에서의 균의 형질전환체의 평가를 위하여, 우리는 코톤에 결합하는 펩티드 서열을 도입하기 위하여 하기 2 개의 프라이머가 사용된 것을 제외하고는 같은 절차를 따른다:
Figure 112006025993389-pct00020
m. 루프 I 내의 콤스타틴 루프가 있는 BBI
플라스미드 구축, 균의 형질전환체의 수득 및 진동 플라스크 내에서의 균의 형질전환체의 평가를 위하여, 우리는 콤스타틴 펩티드 서열을 도입하기 위하여 하기 2 개의 프라이머가 사용된 것을 제외하고는 같은 절차를 따른다:
Figure 112006025993389-pct00021
이 경우에, BBI 트립신 결합 루프로부터의 7 개의 아미노산은 콤스타틴 결합 루프로부터의 9 개의 아미노산으로 교체되었다.
n. 루프 II 내의 콤스타틴 루프가 있는 BBI
플라스미드 구축, 균의 형질전환체의 수득 및 진동 플라스크 내에서의 균의 형질전환체의 평가를 위하여, 우리는 콤스타틴 펩티드 서열을 도입하기 위하여 하기 2 개의 프라이머가 사용된 것을 제외하고는 같은 절차를 따른다:
Figure 112006025993389-pct00022
이 경우에, BBI 트립신 결합 루프로부터의 7 개의 아미노산은 콤스타틴 결합 루프로부터의 9 개의 아미노산으로 교체되었다.
실시예 5
트리코더마 리세이 내에서 보우만 - 버크 저해자 및 그것의 변이체의 발현
상기 실시예 2에 기술된 절차를 따라, BBI-코딩 DNA를 최적화하였고 이 실시예에 대하여 사용하였다. 주형으로서 루프 I 및 II 내에 a-VEGF (CK37281) 이 있는 플라스미드 pSLGAMpR2-BBI 또는 pSLGAMpR2-BBI를 사용하여 DNA 단편을 증폭하기 위하여 2 개의 프라이머를 고안하였다:
Figure 112006025993389-pct00023
상기 프라이머 #2 (SEQ ID NO:74) 와 합동으로 사용된 경우 BBI 단백질의 N-말단에 3 개의 글리신 잔기를 함유하는 PCR 단편을 생성하기 위하여 또한 세번째 프라이머를 사용하였다.
Figure 112006025993389-pct00024
상기 실시예 2에 기술된 같은 절차를 따라, 발현 벡터를 생성하기 위하여, BBI-코딩 DNA를 최적화하였고 이 실시예에 대하여 사용하였고, PCR 단편을 제한효소 SpeI 및 AscI으로 잘랐고, 유전자 발현을 위한 CBHI 프로모터 및 터미네이터 및 형질전환체에 대한 선별 표지로서의 트리코더마 pyr4 유전자를 함유하는 pTEX (pTEX 벡터의 제조의 완전한 설명을 위해서는 참조문헌으로서 본원에 편입되는 PCT 공보 제 WO 96/23928 참조) 의 변경된 형태인 트리코더마 발현 벡터 pTREX2 (도 9 참조) 의 변경된 형태인 pTrex4 (도 8) 로 결착하였다. pTrex4 플라스미드에서, BBI 유전자를 티. 리세이로부터의 링커 및 CBH I 코어의 C-말단으로 융합하였다. 에이. 니듈란스로부터의 amdS 유전자를 균의 형질전환 중의 선별 표지로서 사용하였다. 발현 플라스미드를 트리코더마 리세이 내로 형질전환하였다. 안정적 형질전환체를 질소원으로서 아세트아미드가 있는 트리코더마 최소 평판 상으로 단리하였다. 형질전환체를 1 ml/l 1000X 염, 20 g/l 노블 아가 (Noble Agar), 1.68 g/l CsCl, 20 g/l 글루코스, 15 g/l KH2PO4, 0.6 g/l MgS04*7H20, 0.6 g/l CaCl2*2H20 및 0.6 g/l 아세트아미드를 함유하는 amd 마이너스 평편 상에서 생장시켰다. 최종 pH는 4.5로 조정되었다. 1000x 염은 5 g/l FeS04, 1.6 g/l MnS04, 1.4 g/l ZnS04 및 1 g/l CoCl2를 함유한다. 그것을 필터 살균하였다. 28℃에서 3일 배양한 후, 형질전환체를 새로운 amd 마이너스 평판으로 이전하였고 28℃에서 3일 동안 더 생장시켰다.
형질전환체를 이후 250-ml 진동 플라스크 내의 티. 리세이 프로플로 (proflo) 배지 (각 형질전환체에 대하여 50 ml) 내로 접종하였다. 티. 리세이 프로플로 배지는 30 g/l 알파-락토오스, 6.5 g/l (NH4)2SO4, 2 g/l KH2PO4, 0.3 g/l MgSO4*7H20, 0.2 g/l CaCl2, 1 ml/l 1000x TRI 미량 염, 2 ml/l 10% Tween 80, 22.5 g/l 프로플로 및 0.72 g/l CaC03를 함유한다. 1000x TRI 미량 염은 5 g/l FeS04*7H20, 1.6 g/l MnS04*H20 및 1.4 g/l ZnS04*7H20을 함유한다. 2일 동안 30℃에서 생장한 후, 배양액 4 ml 을 5 g/l (NH4)2SO4, 33 g/l PIPPS 완충액, 9 g/l CASAMINO ACIDS, 4.5 g/l KH2P04, 1 g/l CACL2, 1 g/l MgS04*7H20, 5 ml/l MAZU 및 2.5 ml/l 400X 티. 리세이 TRACE를 함유하는 정의된 배지 내로 이전하였다. 그것의 pH를 5.5로 조정하였고 40 ml/l 40% 락토오스를 살균 후 첨가하였다. 400X 티. 리세이 TRACE는 175 g/l 시트르산 (무수), 200 g/l FeS04*7H20, 16 g/l ZnS04*7H20, 3.2 g/l CuS04*5H20, 1.4 g/l MnS04*H20 및 0.8 g/l H3BO3 (붕산) 을 함유한다.
약 40 개의 형질전환체가 평판 상에 생성되었고 20 개를 진동 플라스크 내에서 평가하였다. 배양액의 상청액을 SDS-PAGE 조사를 위해 사용하였고 트립신 또는 키모트립신 저해 활성에 대해 평가하였다. 웨스텃 블랏은 또한 융합 (Cbhl-BBI) 및 BBI 단독 모두의 존재를 나타냈다.
실시예 6
아스퍼질러스 내에서 보우만 - 버크 저해자 및 분비성 샤페론의 공동-발현
하기 실시예는 어떻게 분비가 증가할 수 있는지 상세하게 설명한다. 그 3차 구조 내에서 BBI는 7 개의 디술피드 결합을 함유하고 STI 단백질은 2 개의 디술피드 결합을 함유하며, 이들 디술피드 결합은 그들의 기능에 있어서 중요하다. 디술피드 결합이 있는 단백질의 폴딩은 ER 내의 단백질 디술피드 이소머라아제 (Protein Disulfide Isomerase, PDI) 또는 다른 샤페론을 필요로 함이 공지되어 있다.
STI 또는 BBI 발현의 증가를, 하나는 STI 또는 BBI 발현 카세트를 함유하고 다른 하나는 PDI 유전자 또는 샤페론 유전자를 함유하는 두 플라스미드의 공동-형질전환 또는 두 플라스미드의 연속적인 형질전환에 의해 연구하였다. 첫번째로, 우리는 벡터 pUC219 내의 아스퍼질러스 니거로부터의 pdiA 유전자의 4.6 kb 게놈 DNA를 포함하는 구역을 함유하는 플라스미드 Q51과 3G 및 his태그가 없는 플라스미드 pSLGAMpR2-BBI (Q109) 를 같은 계통 (dgr246ΔGAP:pyr2) 내로 공동-형질전환한다. 51 개의 형질전환체를 수득하였고 47 개의 형질전환체를 진동 플라스크 내에서 검사하였다. SDS 젤 데이터에 기초하여 형질전환체 #14가 가장 높은 양의 BBI 단백질을 생산하였기 때문에 형질전환체 #14를 선택하였다. BBI 단백질의 발현 수준은 단지 3G 및 his태그가 없는 플라스미드 pSLGAMpR2-BBI (Q109) 만을 함유하는 계통보다 공동-형질전환된 계통에서 더 높았다. 도 7은 증가된 BBI 발현을 나타낸다. 이 계통을 또한 포자 정제하였고 진동 플라스크 내에서 다시 검사하였다.
상기 기술된 절차를 따라, 우리는 또한 pdiA 유전자 (상기한 바와 같음) 를 함유하는 플라스미드 Q51과 his태그가 없는 플라스미드 pSLGAMpR2-BBI (Q108) 를 같은 계통 (dgr246ΔGAP:pyr2) 내로 공동-형질전환하기로 결정한다. 34 개의 형질전환체를 진동 플라스크 내에서 검사하였다. SDS 젤 데이터에 기초하여 가장 높은 수준으로 BBI 단백질을 생산하는 그 능력에 의해 하나의 형질전환체를 선별하였다. BBI 단백질의 발현 수준은 단지 his태그가 없는 플라스미드 pSLGAMpR2-BBI (Q108) 만을 함유하는 계통보다 더 높았다.
상기 기술된 절차를 따라, 우리는 또한 벡터 pUC219 내의 아스퍼질러스 니거로부터의 prpA 유전자의 1623 bp 게놈 DNA를 포함하는 구역을 함유하는 플라스미드 Q124와 3G 및 his태그가 없는 플라스미드 pSLGAMpR2-BBI (Q109) 를 같은 계통 (dgr246ΔGAP:pyr2) 내로 공동-형질전환하기로 결정한다. 28 개의 형질전환체를 진동 플라스크 내에서 검사하였다. SDS 젤 데이터에 기초하여 가장 높은 수준으로 BBI 단백질을 생산하는 그 능력에 의해 하나의 형질전환체를 선별하였다. BBI 단백질의 발현 수준은 단지 3G 및 his태그가 없는 플라스미드 pSLGAMpR2-BBI (Q109) 만을 함유하는 계통보다 공동-형질전환된 계통에서 더 높았다. 도 7은 상기 증가를 나타낸다 (레인 15 vs 레인 3). 이 계통을 포자 정제하였고 진동 플라스크 내에서 다시 검사하였다.
실시예 7
재조합 프로테아제 저해자 변이체는 활성을 보유한다
상기 기술된 방법을 사용하여 생산된 STI, BBI 및 그 변이체를 그 활성, 예를 들어 프로테아제 활성의 저해에 대하여 검사하였다.
a. 프로테아제 저해
950 μl 의 트리스-완충 염수 + 0.02% Tween 20 을 20 μl 프로테아제 (1 mM HCl 내의 100 μg/ml (소 트립신 또는 키모트립신)) 및 20 μl 시료와 합쳤다. 상기 용액을 혼합하였고 상온에서 30 분간 배양하였다. 10 μl 기질 (트립신에 대해: 숙시닐-ala-ala-pro-arg-파라니트로아닐리드, DMSO 내에서 10 mg/ml; 키모트립신에 대해: 숙시닐-ala-ala-pro-phe-파라니트로아닐리드, DMSO 내에서 10 mg/ml) 을 첨가하고 용액을 섞었다. 405 nm 에서 흡광도를 관찰하였고 비율을 측정하였다 (A405/분). 저해된 프로테아제 활성의 분획은 대조군 시료 블랭크와 비교함에 의하여 측정하였고 하기 수학식 1에 따라 계산하였다.
Figure 112006025993389-pct00025
b. aVEGF 펩티드에 의한 HUVEC 증식의 저해
HUVE 세포 (Cambrex, East Rutherford, NJ) 를 1-5 회 계대배양하고 제조자 지시에 따라 유지하였다. HUVEC 생장을 0.03 내지 20 ng/ml VEGF에 의하여 촉진하였고, 10 ng/ml VEGF165 (R&D systems) 에서 가장 높은 증식이 있었다; 이 농도를 하기 실험에서 사용하였다. 0.00052 μM 내지 25 μM 의 일련의 a-VEGF 펩티드들 (실시예 4 참조) 및 항-VEGF MAb 대조군 (R&D systems) 을 96-웰 평판 내에 3중으로 시딩한 (seeded) HUVEC에 첨가하기 전 10 ng/mL VEGF와 혼합하였다. 세포 증식을 3H-티미딘 혼입에 의하여 측정하였다. 현저한 저해가 관찰되었다 (데이터를 나타내지 않음).
본원에 기술된 실시예 및 구현예는 단지 설명적인 목적만을 위함이며 그의 다양한 가벼운 변경 또는 변화는 당업자에 의해 제시될 것이고 본 출원의 정수 및 영역 및 첨부한 청구항의 범주 내에 포함될 것임이 이해되어야 한다. 본원에서 언급된 모든 출원, 특허 및 특허 출원은 여기서 모든 목적에 대한 그들의 전체로서 참조문헌으로 편입된다.
<110> GENENCOR INTERNATIONAL, INC. <120> Expression in Filamentous Fungi of Protease Inhibitors and Variants Thereof <130> GC815-PCT <150> US60/518,154 <151> 2003-11-06 <160> 76 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 253 <212> DNA <213> Glycine max <400> 1 gctagcaacg tcatctccaa gcgcgacgat gagagctcta agccctgttg cgatcagtgc 60 gcgtgtacca aatcgaaccc tccgcagtgt cgctgctccg atatgcgtct gaattcctgt 120 catagcgcat gcaagagctg tatctgcgcc ctgagctacc ccgcgcagtg tttctgcgtc 180 gacatcacgg acttctgcta cgagccgtgt aagcccagcg aggacgataa ggagaactag 240 ctcgagggtg acc 253 <210> 2 <211> 213 <212> DNA <213> Glycine max <400> 2 gacgatgaga gctctaagcc ctgttgcgat cagtgcgcgt gtaccaaatc gaaccctccg 60 cagtgtcgct gctccgatat gcgtctgaat tcctgtcata gcgcatgcaa gagctgtatc 120 tgcgccctga gctaccccgc gcagtgtttc tgcgtcgaca tcacggactt ctgctacgag 180 ccgtgtaagc ccagcgagga cgataaggag aac 213 <210> 3 <211> 610 <212> DNA <213> Glycine max <400> 3 gctagcaacg tcatctccaa gcgcggcggt ggcgatttcg tgctcgataa tgaaggcaac 60 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Ser Cys Ile Cys Ala Leu Ser Tyr Pro Ala Gln 35 40 45 Cys Phe Cys Val Asp Ile Thr Asp Phe Cys Tyr Glu Pro Cys Lys Pro 50 55 60 Ser Glu Asp Asp Lys Glu Asn 65 70 <210> 8 <211> 74 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 8 Gly Gly Gly Asp Asp Glu Ser Ser Lys Pro Cys Cys Asp Gln Cys Ala 1 5 10 15 Cys Thr Lys Ser Asn Pro Pro Gln Cys Arg Cys Ser Asp Met Arg Leu 20 25 30 Asn Ser Cys His Ser Ala Cys Lys Ser Cys Ile Cys Ala Leu Ser Tyr 35 40 45 Pro Ala Gln Cys Phe Cys Val Asp Ile Thr Asp Phe Cys Tyr Glu Pro 50 55 60 Cys Lys Pro Ser Glu Asp Asp Lys Glu Asn 65 70 <210> 9 <211> 80 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 9 Gly Gly Gly Asp Asp Glu Ser Ser Lys Pro Cys Cys Asp Gln Cys Ala 1 5 10 15 Cys Thr Lys Ser Asn Pro Pro Gln Cys Arg Cys Ser Asp Met Arg Leu 20 25 30 Asn Ser Cys His Ser Ala Cys Lys Ser Cys Ile Cys Ala Leu Ser Tyr 35 40 45 Pro Ala Gln Cys Phe Cys Val Asp Ile Thr Asp Phe Cys Tyr Glu Pro 50 55 60 Cys Lys Pro Ser Glu Asp Asp Lys Glu Asn His His His His His His 65 70 75 80 <210> 10 <211> 190 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 10 Gly Gly Gly Asp Phe Val Leu Asp Asn Glu Gly Asn Pro Leu Glu Asn 1 5 10 15 Gly Gly Thr Tyr Tyr Ile Leu Ser Asp Ile Thr Ala Phe Gly Gly Ile 20 25 30 Arg Ala Ala Pro Thr Gly Asn Glu Arg Cys Pro Leu Thr Val Val Gln 35 40 45 Ser Arg Asn Glu Leu Asp Lys Gly Ile Gly Thr Ile Ile Ser Ser Pro 50 55 60 Tyr Arg Ile Arg Phe Ile Ala Glu Gly His Pro Leu Ser Leu Lys Phe 65 70 75 80 Asp Ser Phe Ala Val Ile Met Leu Cys Val Gly Ile Pro Thr Glu Trp 85 90 95 Ser Val Val Glu Asp Leu Pro Glu Gly Pro Ala Val Lys Ile Gly Glu 100 105 110 Asn Lys Asp Ala Met Asp Gly Trp Phe Arg Leu Glu Arg Val Ser Asp 115 120 125 Asp Glu Phe Asn Asn Tyr Lys Leu Val Phe Cys Pro Gln Gln Ala Glu 130 135 140 Asp Asp Lys Cys Gly Asp Ile Gly Ile Ser Ile Asp His Asp Asp Gly 145 150 155 160 Thr Arg Arg Leu Val Val Ser Lys Asn Lys Pro Leu Val Val Gln Phe 165 170 175 Gln Lys Leu Asp Lys Glu Ser Leu His His His His His 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gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag 7680 aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt 7740 accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc 7800 ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa 7860 gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg 7920 aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa 7980 taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac 8040 cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtctcgc 8100 gcgtttcggt gatgacggtg aaaacctctg acacatgcag ctcccggaga cggtcacagc 8160 ttgtctgtaa gcggatgccg ggagcagaca agcccgtcag ggcgcgtcag cgggtgttgg 8220 cgggtgtcgg ggctggctta actatgcggc atcagagcag attgtactga gagtgcacca 8280 taaaattgta aacgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 8340 attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagcccga 8400 gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 8460 caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 8520 caaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 8580 cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 8640 agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 8700 cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtac tatggttgct ttgacgtatg 8760 cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggcg ccattcgcca 8820 ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag 8880 ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga ttaagttggg taacgccagg gttttcccag 8940 tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgcc 8970 <210> 42 <211> 253 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 42 gctagcgacg atgagagctc taagccctgt tgcgatcagt gcgcgtgtac caaatcgaac 60 cctccgcagt gtcgctgctc cgatatgcgt ctgaattcct gtcatagcgc atgcaagagc 120 tgtatctgcg ccctgagcta ccccgcgcag tgtttctgcg tcgacatcac ggacttctgc 180 tacgagccgt gtaagcccag cgaggacgat aaggagaacc atcatcacca tcaccattag 240 ctcgagggtg acc 253 <210> 43 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 gggctagcaa cgtcatctcc aag 23 <210> 44 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 ggggtcacct agttctcctt atcgtcctcg ctg 33 <210> 45 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 gggctagcaa cgtcatctcc aagcgcgacg atgagagctc taag 44 <210> 46 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 gttgcgatca gtgcgcgtgt tacaatctgt atggctggac ctgtcgctgc t 51 <210> 47 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 cgcatatcgg agcagcgaca ggtccagcca tacagattgt aacacgcgca c 51 <210> 48 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 catgcaagag ctgtatctgc tacaatctgt atggctggac ccagtgtttc tg 52 <210> 49 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 gatgtcgacg cagaaacact gggtccagcc atacagattg tagcagatac ag 52 <210> 50 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 gcgatcagtg cagctgtagc tgcggcagga agatccccat ccagtgctgt cgctgctccg 60 atatgcgtc 69 <210> 51 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 gagcagcgac agcactggat ggggatcttc ctgccgcagc tacagctgca ctgatcgcaa 60 cagggctta 69 <210> 52 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 gcgatcagtg cggctgtgcc aggagcaacc tcgacgagtg tcgctgctcc gatatgcgtc 60 60 <210> 53 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 53 gagcagcgac actcgtcgag gttgctcctg gcacagccgc actgatcgca acagggctta 60 60 <210> 54 <211> 280 <212> DNA <213> Glycine max <400> 54 gctagcaacg tcatctccaa gcgcggcggt ggcgacgatg agagctctaa gccctgttgc 60 gatcagtgcg cgtgtaccaa atcgaaccct ccgcagtgtc gctgctccga tatgcgtctg 120 aattcctgtc atagcgcatg caagagctgt atctgcgccc tgagctaccc cgcgcagtgt 180 ttctgcgtcg acatcacgga cttctgctac gagccgtgta agcccagcga ggacgataag 240 gagaaccacc atcaccatca ccactagctc gagggtgacc 280 <210> 55 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 55 gcgatcagtg cgcgtgtcag agggccctcc ccatcctctg tcgctgctcc gatatgcgtc 60 60 <210> 56 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 56 gagcagcgac agaggatggg gagggccctc tgacacgcgc actgatcgca acagggctta 60 60 <210> 57 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 57 gcgatcagtg ccagtgtggc aggctccaca tgaagacctg tcgctgctcc gatatgcgtc 60 60 <210> 58 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 58 gagcagcgac aggtcttcat gtggagcctg ccacactggc actgatcgca acagggctta 60 ga 62 <210> 59 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 59 gcgatcagtg ccagtgtaag aggaagatcg tcctcgactg tcgctgctcc gatatgcgtc 60 60 <210> 60 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 60 gagcagcgac agtcgaggac gatcttcctc ttacactggc actgatcgca acagggctta 60 ga 62 <210> 61 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 61 cagtgcgcgt gtgccgccat gttcggcccc gcctgtcgct gctccgatat gcgtc 55 <210> 62 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 62 gagcagcgac aggcggggcc gaacatggcg gcacacgcgc actgatcgca acag 54 <210> 63 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 63 cagtgcgcgt gtggcgccct cggcctcttc ggctgtcgct gctccgatat gcgtc 55 <210> 64 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 64 gagcagcgac agccgaagag gccgagggcg ccacacgcgc actgatcgca acag 54 <210> 65 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 65 gttgcgatca gtgcgcgtgt gagcccctga tccaccagcg ctgtcgctgc t 51 <210> 66 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 66 cgcatatcgg agcagcgaca gcgctggtgg atcaggggct cacacgcgca c 51 <210> 67 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 67 gttgcgatca gtgcgcgtgt agcgccttcc gcggccccac ctgtcgctgc t 51 <210> 68 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 68 cgcatatcgg agcagcgaca ggtggggccg cggaaggcgc tacacgcgca c 51 <210> 69 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 69 gttgcgatca gtgcgcgtgt gttgttcagg actggggcca ccaccgctgt cgctgct 57 <210> 70 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 70 cgcatatcgg agcagcgaca gcggtggtgg ccccagtcct gaacaacaca cgcgcac 57 <210> 71 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 71 catgcaagag ctgtatctgc gttgttcagg actggggcca ccaccgctgt ttctgcg 57 <210> 72 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 72 gtgatgtcga cgcagaaaca gcggtggtgg ccccagtcct gaacaacgca gatacag 57 <210> 73 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 73 ggactagtaa gcgcgacgat gagagctct 29 <210> 74 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 74 aaggcgcgcc tagttctcct tatcgtcct 29 <210> 75 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 75 ggactagtaa gcgcggcggt ggcgacgatg agagctct 38 <210> 76 <211> 6 <212> PRT <213> Glycine max <400> 76 Asn Val Ile Ser Lys Arg 1 5

Claims (27)

  1. 하기를 포함하는, 사상균 세포 내에서 프로테아제 저해자를 생산하는 방법:
    a) 사상균 세포 내로 DNA 구조체를 도입하고,
    여기서 상기 DNA 구조체는 사상균 세포 내에서 전사 활성을 나타내는 프로모터를 포함하고, 보우만-버크 저해자 (Bowman-Birk Inhibitor, BBI)를 코딩하는 이종 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 것이며,
    상기 보우만-버크 저해자는 SEQ ID NO: 7로 이루어진 것이거나, 또는
    SEQ ID NO: 7 에서 잔기 13 이 알라닌이거나, 또는 세린, 글리신 또는 글루타민으로 변경되고, 잔기 15 - 21, 42 - 47, 또는 양자 모두는 변이체 서열 [여기서, 상기 변이체 서열은 YNLYGWT (SEQ ID NO: 30 내), GRKIPIQ (SEQ ID NO: 31 내), ARSNLDE (SEQ ID NO: 32 내), QRALPIL (SEQ ID NO: 33 내), GRLHMKT (SEQ ID NO: 34 내), KRKIVLD (SEQ ID NO: 35 내), AAMFGPA (SEQ ID NO: 36 내), GALGLFG (SEQ ID NO: 37 내), EPLIHQR (SEQ ID NO: 38 내), SAFRGPT (SEQ ID NO: 39 내) 및 VVQDWGHHR (SEQ ID NO: 40 내)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것임] 로 교체된 것인 SEQ ID NO: 7 을 포함하는 것이고;
    b) 상기 이종 DNA 서열의 발현을 가능하게 하는 적당한 배양 조건 하에서 상기 사상균 세포를 배양함; 및
    c) 상기 프로테아제 저해자를 생산함.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 프로테아제 저해자의 회수를 추가로 포함하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 사상균 세포가 아스퍼질러스 ( Aspergillus ) 계통, 페니실리움 ( Penicillium ) 계통, 푸사리움 ( Fusarium ) 계통 또는 트리코더마 (Trichoderma) 계통으로부터 선택되는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 트리코더마 계통이 티. 리세이 (T. reesei ) 인 방법.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 아스퍼질러스 계통이 에이. 니거 (A. niger ), 에이. 니듈란스 (A. nidulans ), 에이. 아와모리 (A. awamori ) 또는 에이. 오리지아 (A. oryzea) 인 방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 프로테아제 저해자를 코딩하는 DNA 서열이 사상균 세포 내의 발현에 대해 최적화된 코돈을 포함하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 사상균 세포 내로 샤페론 (chaperone) 을 코딩하는 두번째 핵산 서열을 도입하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 샤페론이 pdiA 또는 prpA인 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 프로테아제 저해자가 융합 단백질로서 발현되는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 융합 단백질이 글루코아밀라아제 신호 서열, 글루코아밀라아제 촉매성 도메인, 절단 부위, 및 상기 프로테아제 저해자를 포함하는 방법.
  14. 제 12 항에 있어서, 상기 융합 단백질이 프로테아제 저해자를 유리하기 위하여 프로테아제에 의해 가공되는 방법.
  15. 제 1 항의 방법에 따라 생산된 프로테아제 저해자를 포함하는 프로테아제 저 해자 조성물.
  16. 제 15 항의 프로테아제 저해자 조성물을 표적 단백질과 접촉시키고 표적 단백질에 결합시켜 상기 표적 단백질의 단백질 가수분해 활성이 저해되는 것을 포함하는, 생체외에서 표적 단백질의 단백질 가수분해 활성의 저해방법.
  17. SEQ ID NO: 15 - 29에 나타난 폴리펩티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로테아제 저해자를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  18. 사상균 세포 내에서의 발현에 대해 최적화된 코돈을 포함하는 보우만 버크 저해자를 코딩하는 변경된 야생형 폴리뉴클레오티드.
  19. 보우만-버크 저해자 (Bowman-Birk Inhibitor, BBI)를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터로서,
    상기 보우만-버크 저해자는, SEQ ID NO: 7 에서 잔기 13 이 알라닌이거나, 또는 세린, 글리신 또는 글루타민으로 변경되고, 잔기 15 - 21, 42 - 47, 또는 양자 모두는 변이체 서열 [여기서, 상기 변이체 서열은 YNLYGWT (SEQ ID NO: 30 내), GRKIPIQ (SEQ ID NO: 31 내), ARSNLDE (SEQ ID NO: 32 내), QRALPIL (SEQ ID NO: 33 내), GRLHMKT (SEQ ID NO: 34 내), KRKIVLD (SEQ ID NO: 35 내), AAMFGPA (SEQ ID NO: 36 내), GALGLFG (SEQ ID NO: 37 내), EPLIHQR (SEQ ID NO: 38 내), SAFRGPT (SEQ ID NO: 39 내) 및 VVQDWGHHR (SEQ ID NO: 40 내)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것임] 로 교체된 것인 SEQ ID NO: 7 을 포함하는 것인 발현벡터.
  20. 제 19 항에 있어서, 5' 말단에서 3' 말단으로,
    사상균 내에서 분비성 서열로서 기능하는 신호 펩티드를 코딩하는 첫번째 핵산 서열,
    분비되는 폴리펩티드 또는 그 기능성 부분을 코딩하는 두번째 핵산 서열,
    절단될 수 있는 링커를 코딩하는 세번째 핵산 서열, 및
    상기 프로테아제 저해자를 코딩하는 상기 DNA 서열을 추가로 포함하는 발현 벡터.
  21. 제 19 항의 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
  22. 제 21 항에 있어서, 상기 숙주 세포가 트리코더마 세포인 숙주 세포.
  23. 제 21 항에 있어서, 상기 숙주 세포가 아스퍼질러스 세포인 숙주 세포.
  24. 하기를 포함하는, 사상균 세포 내에서 프로테아제 저해자의 발현을 증가시키는 방법:
    a) 사상균 세포 내에서 전사 활성을 나타내는 프로모터를 포함하고, 보우만-버크 저해자 (BBI)를 코딩하는 이종 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 구조체로 사상균 세포를 형질전환하고,
    상기 보우만-버크 저해자는 SEQ ID NO: 7로 이루어진 것이거나, 또는
    SEQ ID NO: 7 에서 잔기 13 이 알라닌이거나, 또는 세린, 글리신 또는 글루타민으로 변경되고, 잔기 15 - 21, 42 - 47, 또는 양자 모두는 변이체 서열 [여기서, 상기 변이체 서열은 YNLYGWT (SEQ ID NO: 30 내), GRKIPIQ (SEQ ID NO: 31 내), ARSNLDE (SEQ ID NO: 32 내), QRALPIL (SEQ ID NO: 33 내), GRLHMKT (SEQ ID NO: 34 내), KRKIVLD (SEQ ID NO: 35 내), AAMFGPA (SEQ ID NO: 36 내), GALGLFG (SEQ ID NO: 37 내), EPLIHQR (SEQ ID NO: 38 내), SAFRGPT (SEQ ID NO: 39 내) 및 VVQDWGHHR (SEQ ID NO: 40 내)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것임] 로 교체된 것인 SEQ ID NO: 7 을 포함하는 것임;
    b) 샤페론 유전자를 함유하는 폴리뉴클레오티드 서열로 상기 사상균 세포를 형질전환함; 및
    c) 상기 프로테아제 저해자를 코딩하는 이종 DNA 서열의 발현 및 분비를 가능하게 하는 적당한 배양 조건 하에서 상기 사상균 세포를 배양함;
    여기서, 상기 프로테아제 저해자의 발현은 단계 a)만에 따라 형질전환된 대응하는 사상균 세포에 비교하여 증가됨.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 형질전환 단계 a) 및 단계 b)가 공동-형질전환 (co-transformation) 인 방법.
  26. 제 24 항에 있어서, 상기 형질전환 단계 a) 및 단계 b)가 연속적 형질전환 (sequential transformation) 인 방법.
  27. 제 24 항에 있어서, 상기 사상균 세포가 아스퍼질러스 세포 또는 트리코더마 세포인 방법.
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