CN102245635B - 修饰的变体bowman birk蛋白酶抑制剂 - Google Patents

修饰的变体bowman birk蛋白酶抑制剂 Download PDF

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    • C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors

Abstract

本发明涉及经修饰的变体BOWMAN BIRK蛋白酶抑制剂蛋白(BBPI)，所述抑制剂包含结合靶蛋白的肽，并且经过进一步修饰而具有比未修饰的BBPI大的蛋白酶抑制活性和/或以更大的产量生产。本发明涵盖了含有编码经修饰的变体BBPI的多核苷酸序列的多核苷酸构建体和表达载体，表达和生产所述经修饰的变体BBPI的转化宿主细胞，经修饰的变体BBPI蛋白，包含经修饰的变体BBPI的组合物，以及用于制造和在个人护理中使用经修饰的变体BBPI的方法。

Description

修饰的变体BOWMAN BIRK蛋白酶抑制剂
1、发明领域
本发明涉及经修饰的变体BOWMAN BIRK蛋白酶抑制剂蛋白(BBPI)，所述抑制剂包含结合靶蛋白的肽，并且经过进一步修饰而具有比未修饰的BBPI更大的蛋白酶抑制活性和/或以更大的产量生产。本发明涵盖了包含编码经修饰的变体BBPI的多核苷酸序列的多核苷酸构建体和表达载体，表达和生产所述修饰的变体BBPI的转化的宿主细胞，修饰的变体BBPI蛋白，包含修饰的变体BBPI的组合物，以及用于制造和在个人护理中使用修饰的变体BBPI的方法。
2、发明背景
蛋白酶涉及多种生物学过程。蛋白酶和蛋白酶抑制剂之间平衡的破坏通常与病理性组织破坏相关。
多种研究已关注蛋白酶在组织损伤中的角色，可以预期，蛋白酶和蛋白酶抑制剂之间平衡是维持组织完整性的主要决定因素。来自炎性细胞(包括嗜中性粒细胞)的丝氨酸蛋白酶牵涉多种炎性疾病，例如肺气肿、关节炎、异位性皮炎和牛皮癣。上述及其他炎性适应症通常与细胞因子的失调水平相关。
蛋白酶还降解血管基膜，并参与胞外基质的重建，以利于细胞迁移和浸润，促进肿瘤血管发生。蛋白酶释放与胞外基质结合的血管生成性生长因子，并产生源自胞外基质组分的趋化性活性片段，其反过来发挥趋化性和促有丝分裂原性功能，调节激活内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞参与血管发生过程。体内的血管生成性活性的蛋白质因子列表包括成纤维细胞生长因子、血管生成素、促血管生成蛋白-1(Angiopoietin-1)、EGF、HGF、NPY、VEGF、TNF-α、TGF-β、PD-ECGF、PDGF、IGF、IL8和生长激素。与现有的细胞因子阻断试剂相关的风险包括严重的感染、过敏性反应和狼疮样综合征。此外，在药物停用后观察到临床功效的丧失，和少部分患者产生针对生物试剂的抗体，这可能限制它们重复使用的功效。
合成的和天然的蛋白酶抑制剂已表现出在体内和体外抑制肿瘤诱发。之前的研究探讨已提示某些属于结构相关蛋白质家族、分类为丝氨酸蛋白酶抑制剂或SERPINS的蛋白酶抑制剂，已知抑制若干蛋白酶，包括胰蛋白酶、组织蛋白酶G、凝血酶、组织激肽释放酶以及嗜中性粒细胞弹性蛋白酶。SERPINS对于预防/抑制致癌物诱导的体外转化和动物模型系统中的癌发生是特别有效的。全身递送纯化的蛋白酶抑制剂降低了关节炎症和软骨以及骨组织破坏。
局部施用蛋白酶抑制剂可用于此类适应症，如特应性皮炎，其为常见的皮肤炎症形式，可分布在身体的小块区域或牵连大部分。在体外和体内都证实了蛋白酶抑制剂的祛色素活性和它们预防紫外线诱导的色素沉着的能力。Paine等，Journal of InvestigativeDermatology 116：587-595[2001]。此外，蛋白酶抑制剂可用于帮助创伤愈合(错误！超链接引用无效。10/001002071718.htm)。已证实当局部应用时，分泌型白细胞蛋白酶抑制剂逆转组织破坏和加快创伤愈合过程。此外，丝氨酸蛋白酶抑制剂还可以帮助降低红斑狼疮患者的疼痛(见美国专利号6537968)。
天然存在的蛋白酶抑制剂可见于多种食品，例如谷类(燕麦、大麦和玉米)、球芽甘蓝、洋葱、甜菜、小麦、龙爪稷(finger millet)和花生。一种目标来源是大豆。大豆中Kunitz和Bowman-Birk的平均水平分别是约1.4％和0.6％，这是两种最重要的蛋白酶抑制剂。上述低水平使得分离天然的蛋白酶抑制剂进行临床应用是不切实际的。
因而，需要生产大量具有理想的蛋白酶治疗特征的蛋白酶抑制剂的方法，以及以可用形式有效递送蛋白酶抑制剂的组合物。
根据本发明的组合物和方法满足了一些上述需要，特别是提供了这样的优势，即提供特异性靶向涉及病理学和非病理学过程中的细胞因子活性的蛋白酶抑制剂。
3、发明概述
本发明涉及经修饰的变体Bowman Birk蛋白酶抑制剂蛋白(BBPI)，所述蛋白包含与靶蛋白结合的肽，并且是经进一步修饰具有比未修饰的BBPI更大的蛋白酶抑制剂活性和/或以更大的产量生产。本发明涵盖了多核苷酸构建体和表达载体，所述构建体和表达载体包含编码经修饰的变体BBPI的多核苷酸序列，表达和生产修饰的变体BBPI的经转化的宿主细胞、修饰的变体BBPI蛋白、包含修饰的变体BBPI的组合物，以及用于制造和在个人护理中使用修饰的变体BBPI的方法。
在一个实施方案中，本发明提供了分离的经修饰变体Bowman Birk蛋白酶抑制剂(BBPI)，所述抑制剂包含在至少一个氨基酸位置上的氨基酸取代，所述氨基酸位置是与SEQID NO：187的变体BBPI的1、4、5、11、13、18、25、27、29、31、38、40、50、52、55和65位等价的位置，并且其中BBPI支架的第二蛋白酶抑制环是结合肽。在一个实施方案中，BBPI支架选自支架：BBI(SEQ ID NO：13)、BBIt(SEQ ID NO：185)、BBI-AV(SEQ ID NO：186)、BBIt-AV(SEQ IDNO：187)、BBIt-VEGK(SEQ ID NO：640)、BBIt-VEGT(SEQ ID NO：641)、BBIt-VEGKD(SEQIDNO：642)、BBdb(SEQ ID NO：449)、BBsb3(SEQ ID NO：450)、BBtc(SEQ ID NO：451)、BBdb-AV(SEQ ID NO：452)、BBsb3-AV(SEQ IDNO：453)和BBtc-AV(SEQ ID NO：454)。在另一个实施方案中，结合肽选自VEGF结合肽、FGF-5结合肽、TGF β结合肽和TNF α结合肽。VEGF结合肽依次选自：
ACYNLYGWTC (SEQ ID NO：9)，KYYLYWW (SEQ ID NO：458)，TLWKSYW (SEQ IDNO：459)，DLYWW (SEQ ID NO：460)，SKHSQIT (SEQ ID NO：468)KTNPSGS (SEQID NO：469)RPTGHSL (SEQ ID NO：470)，KHSAKAE (SEQ ID NO：471)KPSSASS(SEQ ID NO：472)，PVTKRVH(SEQ ID NO：473)，TLHWWVT (SEQ ID NO：492)，PYKASFY (SEQ ID NO：493)，PLRTSHT (SEQID NO：494)，EATPROT (SEQ IDNO：495)，NPLHTLS (SEQ ID NO：496)，KHERIWS (SEQ ID NO：497)，ATNPPPM(SEQ ID NO：498)，STTSPNM (SEQ ID NO：499)，ADRSFRY (SEQ ID NO：500)，PKADSKQ (SEQ ID NO：501)，PNQSHLH (SEQ ID NO：502)，SGSETWM (SEQ IDNO：503)，ALSAPYS (SEQ ID NO：504)，KMPTSKV (SEQ ID NO：505)，ITPKRPY(SEQ ID NO：506)，KWIVSET (SEQ ID NO：507)，PNANAPS (SEQ ID NO：508)，NVQSLPL (SEQ ID NO：509)，TLWPTFW (SEQ ID NO：510)，NLWPHFW (SEQ IDNO：511)，SLWPAFW (SEQ ID NO：512)，SLWPHFW (SEQ ID NO：513)，APWNSHI(SEQ ID NO：514)，APWNLHI (SEQ ID NO：515)，LPSWHLR (SEQ ID NO：516)，PTILEWY(SEQ ID NO：517)，TLYPQFW(SEQ ID NO：518)，HLAPSAV(SEQ IDNO：519)，KYYLSWW (SEQ ID NO：520)，WYTLYKW(SEQ ID NO：521)，TYRLYWW(SEQ IDNO：522)，RYSLYYW(SEQ ID NO：523)，YYLYYWK(SEQ ID NO：524)，NYQLYGW(SEQ ID NO：525)，TKWPSYW(SEQ ID NO：226)，TLWKSYW(SEQ IDNO：527)，PLWPSYW (SEQ ID NO：528)，RLWPSYW(SEQ ID NO：529)，TLWPKYW(SEQ ID NO：530)，KYDLYWW(SEQ ID NO；531)，RYDLYWW(SEQ IDNO：532)，DYRLYWW (SEQ ID NO：533)，DYKLYWW(SEQ ID NO：534)，EYKLYWW(SEQ IDNO：535)，和RYPLYWW(SEQ ID NO：536).FGF-5-结合肽依次选自下述序列：CACRTQPYPLCF(MM007；SEQID NO：430)，CICTWIDSTPC(PS2；SEQ ID NO：431)，CYGLPFTRC(SEQ ID NO：537)，CEEIWTMLC(SEQ ID NO：538)，CWALTVKTC (SEQ ID NO：539)，CLTVLWTTC(SEQ ID NO：540)，CTLWNRSPC(SEQ ID NO：541)，CHYLLTNYC (SEQ ID NO：542)，CRIHLAHKC (SEQ IDNO：543)，TNIDSTP(SEQ ID NO：544)，HLQTTET (SEQ ID NO：545)，SLNNLTV(SEQ ID NO：546)，TNIDSTP(SEQ IDNO：547)，TNIDSTP(SEQ ID NO：548)，LRILANK(SEQ ID NO：549)，LLTPTLN(SEQ ID NO：550)，ALPTHSN (SEQ IDNO：551)，TNIDSTP (SEQ ID NO：552)，LCRRFEN (SEQ ID NO：553)，TNIDSTP(SEQ ID NO：554)，TNIDSTP(SEQ ID NO：555)，HLQTTET(SEQ ID NO：556)，PLGLCPP(SEQ ID NO：557)，GYFIPSI(SEQ ID NO：558)，TKIDSTP (SEQ IDNO：559)，HLQTTET (SEQ IDNO：560)，WNIDSTP(SEQ ID NO：561)，TWIDWTP(SEQ ID NO：562)，RTQPYPL(SEQ ID NO：670)和TWIDSTP(SEQ ID NO：671).The TGFβ结合肽依次选自下述序列：CLCPENINVLPCN(PEN3；SEQ IDNO：436)，CICKHNVDWLCF(MMO21W；SEQ ID NO：437)，CICWTQHIHNCF (WTQ；SEQ ID NO：438)，CVTTDWIEC (SEQ ID NO：563)，CYYSQFHQC(SEQ ID NO：564)，CPTLWTHMC (SEQ ID NO：565)，QSACIVYYVGRKPKVECASSD (SEQ IDNO：566)，QSACILYYIGKTPKIECASSD(SEQ ID NO：567)，QSACILYYVGRTPKVECASSD (SEQ ID NO：568)，乙酰基-LCPENDNVSPCY-cohn2(SEQ IDNO：569)，KHNVRLL (SEQ ID NO：570)，NDTPSYF(SEQ ID NO：571)，AKLYAGS(SEQ ID NO：572)，RGPAHSL (SEQ ID NO：573)，NSLAERR (SEQ IDNO：574)，HPLASPH (SEQ ID NO：575)，QPWNKLK(SEQ ID NO：576)，AWLr/Mipy(SEQ ID NO：577)，PTKPAQQ(SEQ ID NO：578)，PSLNRPQ(SEQ IDNO：579)，HHARQEW (SEQ IDNO：580)，RHHTPGP(SEQ ID NO：581)，ASAINPH(SEQ ID NO：582)，CHGYDRAPC(SEQ ID NO：644)，CFAPADQAC (SEQ IDNO：645)，CIPSRFITC(SEQ ID NO：646)，CHGHTKLAC (SEQ ID NO：647)，CNGKSKLAC(SEQ ID NO：648)，PENINVLP(SEQ ID NO；672)，KHNVDWL(SEQ IDNO：673)和WTQHIHNC(SEQ ID NO：674).The TNFα结合肽依次选自下述序列：RYWQDIP(T1；SEQ ID NO：474)，APEPILA(T2；SEQ ID NO：475)，DMIMVSI(T3；SEQ ID NO：476)，WTPKPTQ(SEQ ID NO：583)，ATFPNQS(SEQ IDNO：534)，ASTVGGL(SEQID NO：585)，T MLPYRP(SEQ ID NO：586)，AWHSPSV(SEQ ID NO：587)，TQSFSS(SEQ ID NO：588)，THKNTLR(SEQ ID NO：589)，GQTHFHV(SEQ ID NO：590)，LPILTQT(SEQ ID NO：591)，SILPVSH(SEQ IDNO：592)，SQPIPI(SEQ ID NO：593)，和QPLRKLP(SEQ ID NO：594)。
在一个实施方案中，本发明提供了分离的经修饰的变体Bowman Birk蛋白酶抑制剂(BBPI)，所述抑制剂在至少一个氨基酸位置上包含取代的氨基酸，所述氨基酸位置选自与SEQ ID NO：187的变体BBPI的1、4、5、11、13、18、25、27、29、31、38、40、50、52、55和65位等价的位置，并且其中BBPI支架的第二蛋白酶抑制环是结合肽。在一个实施方案中，在1位取代的氨基酸选自1A和1C。在其它实施方案中，在4位的取代的氨基酸是4V。在其它实施方案中，在5位的取代的氨基酸选自P和A。在其它实施方案中，在13位的取代的氨基酸选自13Y、13I、13F、13M、13L、13V、13K和13R。在其它实施方案中，18位的取代的氨基酸选自18I和18V和18L。在其它实施方案中，在25位的取代的氨基酸选自25K、25N、25W、25I、25A和25R。在其它实施方案中，在27位的取代的氨基酸选自27H、27K、27V、27A和27Q。在其它实施方案中，在29位的取代的氨基酸选自29R、29K和29P。在其它实施方案中，在31位的取代的氨基酸选自31Q、31H、31E、31A、31R、31W、31K和31T。在其它实施方案中，在38位的取代的氨基酸选自38N、38K和38R。在其它实施方案中，在40位的取代的氨基酸选自40H、40K、40Q、40R和40Y。在其它实施方案中，在50位的取代的氨基酸选自50R、50Q、50K、50T、50V、50M和50S。在其它实施方案中，在52位的取代的氨基酸选自52K、52T、52R、52Q、52L、52H、52A、52M、52S和52E。在其它实施方案中，在55位的取代的氨基酸是55M。在其它实施方案中，在65位的取代的氨基酸选自65E、65Q和65D。
在其它实施方案中，本发明提供了分离的经修饰的变体Bowman Birk蛋白酶抑制剂(BBPI)，所述抑制剂包含SEQ ID NO：389的插入物，在至少一个氨基酸位置上的取代的氨基酸，所述氨基酸位置选自与SEQ IDNO：187的变体BBPI的1、4、5、11、13、18、25、27、29、31、38、40、50、52、55和65位等价的位置，并且其中BBPI支架的第二蛋白酶抑制环是结合肽。
在一些实施方案中，上述任一项经修饰的变体BBPI是作为融合蛋白表达的，所述融合蛋白包含选自纤维素酶、角质酶(cutinase)和二硫化物异构酶的催化结构域。在替代的实施方案中，经修饰的变体BBPI是作为SEQ ID NO：195的融合蛋白表达的。
在一些实施方案中，本发明的经修饰的变体BBPI包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个，和至少8个氨基酸取代的组合，所述取代选自与SEQ ID NO：187的变体BBPI的1、4、5、11、13、18、25、27、29、31、38、40、50、52、55和65位等价的位置。在一些实施方案中，经修饰的变体BBPI包含在与SEQ ID NO：187的50和52位等价的氨基酸位置上的至少两个氨基酸取代的组合。一个经修饰的变体BBPI的实例是SEQ ID NO：595的经修饰的变体BBPI，其包含在50和52位的2个氨基酸取代的组合。在其他实施方案中，经修饰的变体BBPI包含在与SEQ ID NO：187之25、29、40、50和52位等价的氨基酸位置上的至少2个氨基酸取代的组合。在一些实施方案中，至少三个氨基酸的组合选自组合25L-50T-52A、29P-50T-52A、40K-50T-52A。经修饰的变体BBPI的实例是SEQ ID NO：603、607和609的经修饰的变体BBPI，所述经修饰的变体BBPI包含选自25、29、40、50和52位的三个氨基酸取代的组合。在其他实施方案中，经修饰的变体BBPI包含至少四个氨基酸取代的组合，所述取代在与SEQID NO：187的13、29、50和52位等价的位置上。在一些实施方案中，至少四个氨基酸的组合选自组合13I-25L-50T-52A、13I-29P-50T-52A、13I-A0K-50T-52A、25L-29P-50T-52A、25L-40K-50T-52A和29P-40K-50T-52A。经修饰的变体BBPI的实例是SEQ ID NO：596、600、602、604、606、608和643的经修饰的变体BBPI，所述经修饰的变体BBPI包含选自13、29、50和52位的四个氨基酸取代的组合。在其他实施方案中，经修饰的变体BBPI包含至少五个氨基酸取代的组合，所述取代在与SEQ ID NO：187的13、25、29、40、50和52位等价的位置上。在一些实施方案中，至少五个氨基酸的组合选自组合13I-25L-29P-50T-52A、13I-25L-40K-50T-52A、A13I-29P-40K-50T-52A、25L-29P-40K-50T-52A、13I-29P-40K-50K-52A和13I-29P-40K-50T-52T。经修饰的变体BBPI的实例是SEQ ID NO：432、434、443、445、446、597、599、601、605、615、620、624和625的经修饰的变体BBPI，所述经修饰的变体BBPI包含选自13、25、29、40、50和52位五个氨基酸取代的组合。在其他实施方案中，经修饰的变体BBPI包含至少六个氨基酸取代的组合，所述取代在与SEQ ID NO：187的1、4、5、11、13、25、29、40、50和52位等价的位置上。在一些实施方案中，至少六个氨基酸的组合选自组合13I-25L-29P-40K-50T-52A，1C-13I-29P40K-50T-52A，4V-13I-29P-40K-50T-52A，5P-13I-29P-40K-50T-52A，11G-13I-29P-40K-50T-52A，13I-25R-29P-40K-50T-52A，13I-27R-29P-40K-50T-52A，13I-29P-31A-40K-50T-52A，13I-29P-31R-40K-50T-52A，13I-29P-38N-40K-50T-52A和13I-29P-40K-50T-52A-65E。经修饰的变体BBPI的实例是SEQ ID NO：598、611、612、613、614、616、619、621、622、623和626的氨基酸序列，所述经修饰的变体BBPI包含选自1、4、5、11、13、25、29、40、50和52位的六个氨基酸取代的组合。在其他实施方案中，经修饰的变体BBPI包含至少七个氨基酸取代的组合，所述取代在与SEQ ID NO：187的13、25、29、31、40、50和52位等价的位置上。在一些实施方案中，至少七个氨基酸的组合选自组合13L-25R-29P-31A-40K-50T-52A、13L-25R-29P-31R-40K-50T-52A和13I-27A-29P-31A-50K-52T。经修饰的变体BBPI的实例是SEQ ID NO：491、617、618和632-639的经修饰的变体BBPI，所述经修饰的变体BBPI包含选自13、25、29、31、40、50和52位七个氨基酸取代的组合。在其他实施方案中，经修饰的变体BBPI包含至少八个氨基酸取代的组合，所述取代在与SEQ ID NO：187的13、25、27、31、40、50和52位等价的位置上。在一些实施方案中，八个氨基酸的组合选自组合13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T、13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q、13I-25K-27R-29E-31A-40H-50R-52K、13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L和13I-25K-27Q-29P-31E-40H-50R-52Q。经修饰的变体BBPI的实例是SEQ ID NO：627-631的经修饰的变体BBPI，所述经修饰的变体BBPI包含选自13、25、27、29、31、40、50和52位的八个氨基酸取代的组合。
在一些实施方案中，本发明提供了结合VEGF(VEGF-BBPI)的分离的经修饰的变体Bowman Birk蛋白酶抑制剂(BBPI)。VEGF-BBPI包含在至少一个氨基酸位置上的氨基酸取代，所述取代的氨基酸位置选自与SEQ ID NO：187的变体BBPI的1、4、5、11、13、18、25、27、29、31、38、40、50、52、55和65位等价的位置，并且VEGF-BBPI含有取代第二蛋白酶抑制环的VEGF结合肽。在一些实施方案中，VEGF结合肽选自SEQ ID NO：9、458、459、460、468、469、470、471、472和473。在一些实施方案中，VEGF-BBPI具有选自SEQ ID NO：601、602、627、628、630、631、643、491、632、633、634、635和636的多肽序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的经修饰的变体BBPI具有比相应的未经修饰的前体变体BBPI更大的胰蛋白酶抑制活性。在其他实施方案中，本发明的分离的经修饰的变体BBPI具有比相应的未经修饰的前体变体BBPI更大的胰蛋白酶抑制活性和产量。
在一些实施方案中，本发明提供了SEQ ID NO：187的分离的经修饰的变体BowmanBirk蛋白酶抑制剂(BBPI)，其还包含在至少一个氨基酸位置上的氨基酸取代，所述取代的氨基酸位置选自与SEQ ID NO：187的13、25、27、29、31、40、50和52位等价的位置，并且其中所述VEGF结合肽被选自FGF-5、TGF β和TNF α的与靶蛋白结合的变体肽取代。
在一些实施方案中，包含在SEQ ID NO：187的变体BBPI中的VEGF结合肽是用具有选自SEQ DI NO：430、431、670和671的序列的FGF结合肽替代的。在其他实施方案中，用选自SEQ ID NO：436、437、438、672、673和674的TGFβ结合肽替代VEGF结合肽。在其他实施方案中，用选自SEQ ID NO：474、475和476的TNF α结合肽替代VEGF结合肽。
本发明还涵盖了经修饰的变体BBPI，所述经修饰的变体BBPI包含VEGF-、FGF5-、TGF β-或TNF α-结合肽，具有比相应的未经修饰的前体BBPI更大的胰蛋白酶抑制活性和产量。在一些实施方案中，包含FGF5-、TGF β-或TNF α-结合肽的经修饰的变体BBPI选自SEQDI NO：432、434、443、445、447、637、638和639的经修饰的变体BBPI。
在另一个实施方案中，本发明提供了编码BBPI融合蛋白的分离的多核苷酸。编码BBPI融合蛋白的多核苷酸包含编码酶的催化单元的第一多核苷酸序列，和编码经修饰的变体BBPI的第二多核苷酸序列，例如，VEGF-结合BBPI(VEGF-BBPI)、FGF-结合BBPI(FGF-BBPI)、TGF-结合BBPI(TGF-BBPI)或TNF-结合BBPI(TNF-BBPI)。在一些实施方案中，第一多核苷酸序列编码纤维素酶的催化单元。
在另一个实施方案中，本发明提供了在细菌细胞中生产经修饰的变体BBPI的方法，所述方法包括突变编码变体BBPI的多核苷酸以产生编码经修饰的变体BBPI的多核苷酸构建体的步骤，所述经修饰的变体BBPI在至少一个氨基酸位置上包含氨基酸取代，所述氨基酸位置选自与SEQ IDNO：187的变体BBPI的1、4、5、11、13、18、25、27、29、31、38、40、50、52、55和65位等价的位置；将多核苷酸构建体导入细菌宿主细胞中的步骤；在合适的培养条件下培养所述细菌细胞，允许所述异源DNA序列表达的步骤；和生产所述经修饰的变体BBPI的步骤，其中所述经修饰的变体BBPI具有比相应的未经修饰的前体变体BBPI更大的胰蛋白酶抑制活性。在一些实施方案中，本发明的方法还包括回收所表达的经修饰的变体BBPI的步骤。在其它实施方案中，本发明的方法还包括激活经修饰的变体BBPI。
在一些实施方案中，经修饰的变体BBPI具有比相应的未经修饰的前体变体BBPI更大的胰蛋白酶抑制活性和产量。未经修饰的前体变体BBPI选自BBI-AV(SEQ ID NO：186)、BBIt-AV(SEQ ID NO：187)、BBdb-AV(SEQ ID NO：452)、BBsb3(SEQ ID NO：453)和BBtc-AV(SEQ IDNO：454)。在一些实施方案中，经修饰的变体BBPI的第二蛋白酶抑制环是靶蛋白结合肽，选自VEGF结合肽、FGF-5结合肽、TGF β结合肽和TNF α结合肽。
由本发明方法生产的经修饰的变体BBPI，包括但不限于经修饰的变体BBPI，所述经修饰的变体BBPI包含氨基酸取代的组合，所述组合选自3个取代的组合，例如25L-50T-52A、29P-50T-52A、40K-50T-52A；4个取代的组合，例如13I-25L-50T-52A、13I-29P-50T-52A、13I-A0K-50T-52A、25L-29P-50T-52A、25L-40K-50T-52A和29P-40K-50T-52A；5个取代的组合，例如13I-25L-29P-50T-52A、13I-25L-40K-50T-52A、25L-29P-40K-50T-52A、13L-29P-40K-50T-52A、13I-29P-40K-50K-52A和13L-29P-40K-50T-52T；6个取代的组合，例如13I-25L-29P-40K-50T-52A、1C-13I-29P-40K-50T-52A、4V-13I-29P-40K-50T-52A、5P-13I-29P-40K-50T-52A、11G-13I-29P-40K-50T-52A、13I-25R-29P-40K-50T-52A、13I-27R-29P-40K-50T-52A、13I-29P-31A-40K-50T-52A、13I-29P-31R-40K-50T-52A、13I-29P-38N-40K-50T-52A、13I-29P-40K-50T-52A-65E，7个取代的组合，例如13L-25R-29P-31A-40K-50T-52A和13L-25R-29P-31R-40K-50T-52A，和8个取代的组合，13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T、13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q、13I-25K-27R-29E-31A-40H-50R-52K、13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L、13I-25K-27Q-29P-31E-40H-50R-52Q。
在另一个实施方案中，本发明提供了表达载体，所述表达载体包含编码本发明的经修饰的变体BBPI的多核苷酸序列。如上文所述，经修饰的变体BBPI是这样的Bowman Birk蛋白酶抑制剂，所述抑制剂中的第二蛋白酶抑制环被靶蛋白结合肽取代，并且还经过进一步的修饰，在至少一个氨基酸位置上含有氨基酸取代，所述位置选自与SEQ ID NO：187的变体BBPI的1、4、5、11、13、18、25、27、29、31、38、40、50、52、55和65位等价的位置。在一些实施方案中，经修饰的变体BBPI的第二蛋白酶抑制环是靶蛋白结合肽，选自VEGF结合肽、FGF-5结合肽、TGF β结合肽和TNF α结合肽。在一些实施方案中，经修饰的变体BBPI是作为与SEQID NO：195的多肽具有至少80％同一性的蛋白质表达的。
在另一个实施方案中，本发明提供了用如本文所述的本发明的载体转化的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是细菌细胞，例如芽孢杆菌属的宿主细胞。
在一个实施方案中，本发明提供了包含经修饰的变体Bowman Birk蛋白酶抑制剂(BBPI)的个人护理组合物，所述抑制剂在至少一个氨基酸位置上包含氨基酸取代，所述氨基酸位置选自与SEQ ID NO：187的变体BBPI的1、4、5、11、13、18、25、27、29、31、38、40、50、52、55和65位等价的位置，并且其中所述BBPI支架的第二蛋白酶抑制环是靶蛋白结合肽，选自血管内皮生长因子(VEGF)结合肽、成纤维细胞生长因子-5(FGF5)结合肽、转化生长因子β(TGFβ)结合肽和肿瘤坏死因子α(TNFα)变体肽。在一些实施方案中，经修饰的变体BBPI结合选自VEGF、FGF5、TGFβ和TNFα的靶蛋白。在一些实施方案中，BBPI支架选自BBI(SEQ ID NO：13)、BBIt(SEQ ID NO：185)、BBI-AV(SEQID NO：186)、BBIt-AV(SEQ ID NO：187)、BBIt-VEGK(SEQ ID NO：640)、BBIt-VEGT(SEQ ID NO：641)、BBIt-VEGKD(SEQ ID NO：642)、BBdb(SEQID NO：449)、BBsb3(SEQ ID NO：450)、BBtc(SEQ ID NO：451)、BBdb-AV(SEQ ID NO：452)、BBsb3-AV(SEQ ID NO：453)和BBtc-AV(SEQ ID NO：454)。
在其他实施方案中，本发明的经修饰的变体BBPI包含氨基酸取代的组合，所述组合选自以下组合：50T-52A，25L-50T-52A，29P-50T-52A，40K-50T-52A，13I-25L-50T-52A，13I-29P-50T-52A，13I-40K-50T-52A，25L-29P-50T-52A，25L-40K-50T-52A，29P-40K-50T-52A，13I-25K-29P-52K，13I-25L-29P-50T-52A，13I-29P-40K-50T-52A，13I-25L-40K-50T-52A，25L-29P-40K-50T-52A，13L-29P-40K-50T-52A，13I-29K-40K-50T-52A，13I-29P-40K-50K-52A，13I-29P-40K-50T-52A，13I-25L-29P-40K-50T-52A，D1C-13I-29P-40K-50T-52A，S4V-13I-29P-40K-50T-52A，S5P-13I-29P-40K-50T-52A，11G-13I-29P-40K-50T-52A，13I-25R-29P-40K-50T-52A，13I-27R-29P-40K-50T-52A，13I-29P-31A-40K-50T-52A，13I-29P-31R-40K-50T-52A，13I-29P-38N-40K-50T-52A，13I-29P-40K-50T-52A-65E，13L-25R-29P-31A-40K-50T-52A，13L-25R-29P-31R-40K-50T-52A，13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T，13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T，13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q，13I-25K-27R-29E-31A-40H-50R-52K，13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L，和13I-25K-27Q-29P-31E-40H-50R-52Q。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含经修饰的变体Bowman Birk蛋白酶抑制剂(BBPI)的个人护理组合物，所述抑制剂在至少一个氨基酸位置上包含氨基酸取代，所述氨基酸位置选自与SEQ ID NO：187的变体BBPI的1、4、5、11、13、18、25、27、29、31、38、40、50、52、55和65位等价的位置，并且其中所述BBPI支架的第二蛋白酶抑制环是VEGF结合肽，选自下列VEGF结合肽：ACYNLYGWTC(SEQ IDNO：9)、KYYLYWW (SEQ ID NO：458)，TLWKSYW (SEQ IDNO：459)，DLYWW (SEQ IDNO：460)，SKHSQIT (SEQ ID NO：468)KTNPSGS (SEQ ID NO：469)RPTGHSL(SEQ ID NO：470)，KHSAKAE (SEQ ID NO：471)KPSSASS (SEQ ID NO：472)，PVTKRVH(SEQ ID NO：473)，TLHWWVT (SEQ ID NO：492)，PYKASFY (SEQ IDNO：493)，PLRTSHT (SEQID NO：494)，EATPROT (SEQ ID NO：495)NPLHTLS(SEQ ID NO：496)，KHERIWS (SEQ ID NO：497)，ATNPPPM (SEQ ID NO：498)，STTSPNM (SEQ ID NO：499)，ADRSFRY (SEQ ID NO：500)，PKADSKQ (SEQ IDNO：501)，PNQSHLH (SEQ ID NO：502)，SGSETWM (SEQ ID NO：503)，ALSAPYS(SEQ ID NO：504)，KMPTSKV (SEQ ID NO：505)，ITPKRPY (SEQ ID NO：506)，KWIVSET (SEQ ID NO：507)，PNANAPS (SEQ ID NO：508)，NVQSLPL (SEQ IDNO：509)，TLWPTFW (SEQ ID NO：510)，NLWPHFW (SEQ ID NO：511)，SLWPAFW(SEQ ID NO：512)，SLWPHFW (SEQ ID NO：513)，APWNSHI (SEQ ID NO：514)，APWNLHI (SEQ ID NO：515)，LPSWHLR (SEQ ID NO：516)，PTILEWY (SEQ IDNO：517)，TLYPQFW (SEQ ID NO：518)，HLAPSAV (SEQ ID NO：519)，KYYLSWW(SEQ ID NO：520)，WYTLYKW (SEQ ID NO：521)，TYRLYWW (SEQ ID NO：522)，RYSLYYW(SEQ ID NO：523)，YYLYYWK (SEQ ID NO：524)，NYQLYGW (SEQ IDNO：525)，TKWPSYW (SEQ ID NO：226)，TLWKSYW (SEQ ID NO：527)，PLWPSYW(SEQ ID NO：528)，RLWPSYW (SEQ ID NO：529)，TLWPKYW (SEQ ID NO：530)，KYDLYWW (SEQ ID NO；531)，RYDLYWW (SEQ ID NO：532)，DYRLYWW (SEQ IDNO：533)，DYKLYWW (SEQ ID NO：534)，EYKLYWW (SEQ ID NO：535)，和RYPLYWW (SEQ ID NO：536)。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含经修饰的变体Bowman Birk蛋白酶抑制剂(BBPI)的个人护理组合物，所述抑制剂在至少一个氨基酸位置上包含氨基酸取代，所述氨基酸位置选自与SEQ ID NO：187的变体BBPI的1、4、5、11、13、18、25、27、29、31、38、40、50、52、55和65位等价的位置，并且其中所述BBPI支架的第二蛋白酶抑制环是FGF结合肽，选自下列FGF结合肽：CACRTQPYPLCF(MM007；SEQID NO：430)，CICTWIDSTPC(PS2；SEQ ID NO：431)，CYGLPFTRC(SEQ IDNO：537)，CEEIWTMLC(SEQ ID NO：538)，CWALTVKTC(SEQ IDNO：539)，CLTVLWTTC(SEQ ID NO：540)，CTLWNRSPC(SEQ ID NO：541)，CHYLLTNYC(SEQ ID NO：542)，CRIHLAHKC(SEQ ID NO：543)，TNIDSTP(SEQ ID NO：544)，HLQTTET(SEQ ID NO：545)，SLNNLTV(SEQ ID NO：546)，TNIDSTP (SEQ IDNO：547)，TNIDSTP(SEQ ID NO：548)，LRILANK(SEQ ID NO：549)，LLTPTLN (SEQID NO：550)，ALPTHSN(SEQ ID NO：551)，TNIDSTP(SEQ IDNO：552)，LCRRFEN(SEQ ID NO：553)，TNIDSTP(SEQ ID NO：554)，TNIDSTP(SEQ ID NO：555)，HLQTTET(SEQ ID NO：556)，PLGLCPP (SEQ ID NO：557)，GYFI PSI(SEQ IDNO：558)，TKIDSTP(SEQ ID NO：559)，HLQTTET (SEQ ID NO：560)，WNIDSTP(SEQ ID NO：561)，TWIDWTP(SEQ IDNO：562)，RTQPYPL(SEQ ID NO：670)和TWIDSTP(SEQ ID NO：671)。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含经修饰的变体Bowman Birk蛋白酶抑制剂(BBPI)的个人护理组合物，所述抑制剂在至少一个氨基酸位置上包含氨基酸取代，所述氨基酸位置选自与SEQ ID NO：187的变体BBPI的1、4、5、11、13、18、25、27、29、31、38、40、50、52、55和65位等价的位置，并且其中所述BBPI支架的第二蛋白酶抑制环是TGF结合肽，选自下列TGF结合肽：CLCPENINVLPCN(PEN3；SEQ IDNO：436)，CICKHNVDWLCF(MIMO21W；SEQ IDNO：437)，CICWTQHIHNCF(WTQ；SEQ ID NO：438)，CVTTDWIEC(SEQ ID NO：563)，CYYSQFHQC(SEQ ID NO：564)，CPTLWTHMC(SEQ ID NO：565)，QSACIVYYVGRKPKVECASSD(SEQ IDNO：566)，QSACILYYIGKTPKIECASSD(SEQ ID NO：567)，QSACILYYVGRTPKVECASSD(SEQ ID NO：568)，乙酰基-LCPENDNVSPCY-cohn2(SEQ ID NO：569)，KHNVRLL(SEQ ID NO：570)，NDTPSYF(SEQ IDNO：571)，AKLYAGS(SEQ ID NO：572)，RGPAHSL(SEQ ID NO：573)，NSLAERR(SEQ IDNO：574)，HPLASPH(SEQ ID NO：575)，QPWNKLK(SEQ ID NO：576)，AWLr/Mipy(SEQ ID NO：577)，PTKPAQQ(SEQ ID NO：578)，PSLNRPQ(SEQ IDNO：579)，HHARQEW(SEQ ID NO：580)，RHHTPGP(SEQ ID NO：581)，ASAINPH(SEQ ID NO：582)，CHGYDRAPC (SEQ ID NO：644)，CFAPADQAC(SEQ IDNO：645)，CIPSRFITC(SEQ ID NO：646)，CHGHTKLAC (SEQ ID NO：647)，CNGKSKLAC(SEQ ID NO：648)，PENINVLP(SEQ ID NO；672)，KHNVDWL(SEQ IDNO：673)和WTQHIHNC(SEQID NO：674)。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含经修饰的变体Bowman Birk蛋白酶抑制剂(BBPI)的个人护理组合物，所述抑制剂在至少一个氨基酸位置上包含氨基酸取代，所述氨基酸位置选自与SEQ ID NO：187的变体BBPI的1、4、5、11、13、18、25、27、29、31、38、40、50、52、55和65位等价的位置，并且其中所述BBPI支架的第二蛋白酶抑制环是TNF结合肽，所述结合肽选自下列TNF结合肽：RYWQDIP(T1；SEQ IDNO：474)、APEPILA(T2；SEQ ID NO：475)，DMIMVSI(T3；SEQ ID NO：476)，WTPKPTQ(SEQID NO：583)，ATFPNQS(SEQ ID NO：584)，ASTVGGL(SEQ ID NO：585)，TMLPYRP(SEQ ID NO：586)，AWHSPSV(SEQ ID NO：587)，TQSFSS(SEQ ID NO：588)，THKNTLR(SEQ ID NO：589)，GQTHFHV(SEQ ID NO：590)，LPILTQT(SEQIDNO：591)，SILPVSH(SEQ ID NO：592)，SQPIPI(SEQ ID NO：593)，和QPLRKLP(SEQ ID NO：594)。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含经修饰的变体Bowman Birk蛋白酶抑制剂(BBPI)的个人护理组合物，所述抑制剂在至少一个氨基酸位置上包含氨基酸取代，所述氨基酸位置选自与SEQ ID NO：187的变体BBPI的1、4、5、11、13、18、25、27、29、31、38、40、50、52、55和65位等价的位置，并且其中所述BBPI的支架的第二蛋白酶抑制环是结合肽，所述结合肽选自血管内皮生长因子(VEGF)结合肽、成纤维细胞生长因子-5(FGF5)结合肽、转化生长因子β(TGFβ)结合肽和肿瘤坏死因子α(TNFα)变体肽，并且所述抑制剂存在的量的范围是按重量计，占组合物总重量的约0.0001％至约5％。在一些实施方案中，本发明的个人护理组合物中包含的经修饰的变体BBPI具有比所述BBPI的相应的未经修饰的前体变体抑制剂更大的胰蛋白酶抑制活性和产量。
在其他实施方案中，本发明提供了包含经修饰的变体Bowman Birk蛋白酶抑制剂(BBPI)的个人护理组合物，所述抑制剂在至少一个氨基酸位置上包含氨基酸取代，所述氨基酸位置选自与SEQ ID NO：187的变体BBPI的1、4、5、11、13、18、25、27、29、31、38、40、50、52、55和65位等价的位置，并且其中所述BBPI的支架的第二蛋白酶抑制环是选自SEQ IDNO：9、458、459、460、468、469、470、471、472和473的VEGF结合肽。在一些实施方案中，经修饰的变体BBPI的支架是SEQ IDNO：187的BBIt-AV。在其他实施方案中，包含在本发明的个人护理组合物中的经修饰的变体BBPI包含氨基酸取代的组合，所述组合选自13I-40K-50T-52A、13I-25K-29P-52K、13I-29P-40K-50T-52A、13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T、13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T、13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q、13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L。在一些实施方案中，个人护理组合物包含选自SEQ ID NO：601、602、627、628、630、631、643、491、632、633、634、635和636的VEGF结合BBPI(VEGF-BBPI)。在一些实施方案中，个人护理组合物是皮肤护理组合物，选自皮肤乳膏(cream)、化妆水、喷雾、乳状液、胶体悬浮液、泡沫、气溶胶、液体、凝胶、乳浆(sera)和固体。在其他实施方案中，皮肤护理组合物选自身体保湿洗液、身体洗液、抗菌清洁剂、皮肤保护性乳膏、爽身水、面霜、润肤霜膏、面部清洁乳状液、面部凝胶、面部乳浆、基于表面活性剂的面部清洁剂、面部去角质凝胶、抗痤疮治疗、面部色粉(facial toner)、去角质乳膏、面膜、须后膏(after shave balm)、须前膏、晒黑组合物(tanning composition)、防晒剂、脱毛剂、毛发生长抑制剂和防辐射剂。典型的，防辐射剂是防晒剂，选自不防水型防晒剂、高防水型防晒剂和硅油包水型(water-in-silicone)防晒剂。皮肤护理组合物可任选的包括局部施用的非处方组合物、抗真菌治疗、抗痤疮治疗、皮肤防护制品、防晒剂、除臭剂和止汗剂。在一些实施方案中，本发明的化妆品组合物包含至少一种色素。此类化妆品组合物包括粉饼配方和粉底化妆品。化妆品粉底化妆品组合物可选自油包水型粉底化妆品、硅油包水型粉底化妆品、水包油型粉底化妆品、无水化妆棒和粉霜粉底化妆品(cream-to-powder foundation)。
在其他实施方案中，本发明提供了用于治疗血管源性皮肤病的皮肤护理组合物。所述皮肤护理组合物包含在至少一个氨基酸位置具有氨基酸取代的Bowman Birk蛋白酶抑制剂(BBPI)，所述取代选自与SEQ IDNO：187的1、4、5、11、13、18、25、27、29、31、38、40、50、52、55和65位等价的位置，并且其中所述BBPI的支架的第二蛋白酶抑制环是选自SEQ IDNO：9、458、459、460、468、469、470、471、472和473的VEGF结合肽。
在其他实施方案中，个人护理组合物用于改善患皮肤病的受试者的皮肤外观和/或条件，所述疾病选自牛皮癣、硬皮病、静脉溃疡(venous ulcer)、痤疮、酒糟鼻、疣、湿疹、血管瘤和淋巴管生成(lymphangiogenesis)。
在其他实施方案中，本发明提供了用于治疗血管源性皮肤病的皮肤护理组合物。所述皮肤护理组合物包含在至少一个氨基酸位置具有氨基酸取代的Bowman Birk蛋白酶抑制剂，所述取代的氨基酸位置选自与SEQ IDNO：187的1、4、5、11、13、18、25、27、29、31、38、40、50、52、55和65位等价的位置，并且其中所述BBPI的支架的第二蛋白酶抑制环是选自SEQID NO：9、458、459、460、468、469、470、471、472和473的VEGF结合肽。毛发护理组合物可以是香波、护发素、头发定型组合物、染发剂、长效卷发配方、发膏(cream)、凝胶、摩丝、喷雾、乳状液、胶体悬浮液、液体、泡沫和固体的形式。在一些实施方案中，毛发护理组合物还可包括防辐射剂。防辐射剂的实例包括防晒剂，其选自不防水型防晒剂、高防水型防晒剂和硅油包水型防晒剂。毛发护理组合物可用于防止毛发生长。
在其他实施方案中，本发明提供了通过提供个人组合物用于抑制毛发生长的方法，所述个人组合物包含在至少一个氨基酸位置具有氨基酸取代的Bowman Birk蛋白酶抑制剂，所述取代的氨基酸位置选自与SEQ IDNO：187的变体BBPI的1、4、5、11、13、18、25、27、29、31、38、40、50、52、55和65位等价的位置，并且其中所述BBPI的支架的第二蛋白酶抑制环是选自SEQ ID NO：9、458、459、460、468、469、470、471、472和473的VEGF结合肽；并且将所述组合物施于受试者的需要抑制毛发生长的区域。例如，组合物可应用与抑制面部毛发、腋下毛发、腿部毛发、躯干毛发、手臂毛发和头发的生长。在一些实施方案中，方法使用包含选自SEQ ID NO：601、602、627、628、630、631、643、491、632、633、634、635和636的VEGF-BBPI的个人护理组合物。
在其他实施方案中，本发明提供了通过提供个人组合物而用于改善患血管源性皮肤病的受试者的皮肤的外观和/或条件的方法，所述个人组合物包含在至少一个氨基酸位置具有氨基酸取代的Bowman Birk蛋白酶抑制剂，所述取代的氨基酸位置选自与SEQ IDNO：187的变体BBPI的1、4、5、11、13、18、25、27、29、31、38、40、50、52、55和65位等价的位置，并且其中所述BBPI的支架的第二蛋白酶抑制环是选自SEQ ID NO：9、458、459、460、468、469、470、471、472和473的VEGF结合肽；并且将所述组合物施于受试者的皮肤。血管生成性的皮肤病可选自牛皮癣、硬皮病、静脉溃疡、痤疮、酒糟鼻、疣、湿疹、血管瘤和淋巴管生成。在一些实施方案中，方法使用包含选自SEQ ID NO：601、602、627、628、630、631、643、491、632、633、634、635和636的VEGF-BBPI的个人护理组合物。
在其他实施方案中，本发明提供了包含Bowman Birk蛋白酶抑制剂(BBPI)的个人护理组合物，所述抑制剂在至少一个氨基酸位置具有氨基酸取代，所述位置选自与SEQ IDNO：187的变体BBPI的1、4、5、11、13、18、25、27、29、31、38、40、50、52、55和65位等价的位置，并且其中BBPI的支架的第二蛋白酶抑制环是选自SEQ ID NO：430和431的FGF结合肽。在一些实施方案中，BBPI的支架是SEQ ID NO：187的BBIt-AV。在一些实施方案中，本发明的个人护理组合物包含经修饰的变体BBPI，其包含选自13I-40K-50T-52A、13I-25K-29P-52K、13I-29P-40K-50T-52A、13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T、13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T、13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q、13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L的氨基酸取代的组合。在一些实施方案中，个人护理组合物包含经修饰的变体BBPI，所述经修饰的变体BBPI是选自SEQ ID NO：432和434的FGF-结合BBPI(FGF-BBPI)。
在一些实施方案中，本发明提供了包含Bowman Birk蛋白酶抑制剂(BBPI)的毛发护理组合物，所述抑制剂在至少一个氨基酸位置具有氨基酸取代，所述位置选自与SEQ IDNO：187的变体BBPI的1、4、5、11、13、18、25、27、29、31、38、40、50、52、55和65位等价的位置，并且其中BBPI的支架的第二蛋白酶抑制环是选自SEQ ID NO：430和431的FGF结合肽。毛发护理组合物可以是香波、护发素、头发定型组合物、染发剂、长效卷发配方、发膏、凝胶、摩丝、喷雾、乳状液、胶体悬浮液、液体、泡沫和固体的形式。在一些实施方案中，毛发护理组合物可以包含防辐射剂。防辐射剂的实例包括防晒剂，选自不防水型防晒剂、高防水型防晒剂和硅油包水型防晒剂的防晒剂。毛发护理组合物可用于促进毛发生长。
在另一个实施方案中，本发明提供了提供个人护理组合物而用于促进毛发生长的方法，所述个人护理组合物包含在至少一个氨基酸位置具有氨基酸取代的Bowman Birk蛋白酶抑制剂(BBPI)，所述取代的氨基酸位置选自与SEQ ID NO：187的1、4、5、11、13、18、25、27、29、31、38、40、50、52、55和65位等价的位置，并且其中所述BBPI的支架的第二蛋白酶抑制环是选自SEQ ID NO：430和431的FGF结合肽；并且将所述组合物施于受试者的需要促进毛发生长的区域。例如，组合物可应用于促进面部毛发、腋下毛发、腿部毛发、躯干毛发、手臂毛发和头发的生长。在一些实施方案中，毛发生长促进性个人护理组合物可用于治疗涉及毛发丢失的适应症。例如，涉及毛发丢失并可使用本发明的毛发护理组合物治疗的适应症包括炎性脱发、假性斑秃、硬皮病、蜱叮咬、扁平苔癣、牛皮癣、狼疮、脂溢性皮炎、头发松散综合症、血色素沉着、雄激素性脱发和斑秃。在一些实施方案中，可用于促进毛发生长的个人护理组合物包含选自SEQ ID NO：432和434的FGF-结合肽(FGF-BBPI)。
在一些实施方案中，本发明提供了包含Bowman Birk蛋白酶抑制剂(BBPI)的个人护理组合物，所述抑制剂在至少一个氨基酸位置具有氨基酸取代，所述位置选自与SEQ IDNO：187的变体BBPI的1、4、5、11、13、18、25、27、29、31、38、40、50、52、55和65位等价的位置，并且其中BBPI的支架的第二蛋白酶抑制环是选自SEQ ID NO：436、437、438、672、673和674的TGF结合肽。在一些实施方案中，BBPI的支架是SEQ ID NO：187的BBIt-AV。在其他实施方案中，包含在本发明的个人护理组合物中的经修饰的变体BBPI包含选自13I-40K-50T-52A、13I-25K-29P-52K、13I-29P-40K-50T-52A、13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T、13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T、13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q、13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L的氨基酸取代的组合。在一些实施方案中，个人护理组合物包含经修饰的变体BBPI，所述经修饰的变体BBPI是选自SEQ DI NO：443、445和447的TGF结合BBPI(TGF-BBPI)。在一些实施方案中，个人护理组合物能够促进毛发生长。
在其他实施方案中，本发明提供了包含Bowman Birk蛋白酶抑制剂(BBPI)的毛发护理或皮肤护理组合物，所述抑制剂在至少一个氨基酸位置具有氨基酸取代，所述位置选自与SEQ ID NO：187的变体BBPI的1、4、5、11、13、18、25、27、29、31、38、40、50、52、55和65位等价的位置，并且其中BBPI的支架的第二蛋白酶抑制环是选自SEQ ID NO：436、437、438、672、673和674的TGF结合肽。毛发或皮肤护理组合物可以是香波、调理剂、头发定型组合物、染发剂、长效卷发配方、油膏、凝胶、摩丝、喷雾、乳状液、胶体悬浮液、液体、泡沫和固体的形式。在一些实施方案中，当所述组合物是皮肤护理组合物时，它可以是以下形式：身体保湿洗液、身体洗液、抗菌清洁剂、皮肤保护性乳膏、爽身水、面霜、润肤霜膏、面部清洁乳状液、面部凝胶、面部乳浆、基于表面活性剂的面部清洁剂、面部去角质凝胶、抗痤疮治疗、面部色粉、去角质乳膏、面膜、须后膏、须前膏、晒黑组合物、防晒剂和防辐射剂。皮肤护理组合物还可任选的包括局部施用的非处方组合物、抗真菌治疗、抗痤疮治疗、皮肤防护制品、防晒剂、除臭剂和止汗剂。皮肤或毛发护理组合物中包括的防辐射剂是选自不防水型防晒剂、高防水型防晒剂和硅油包水型防晒剂的防晒剂。
在其他实施方案中，本发明提供了包含Bowman Birk蛋白酶抑制剂(BBPI)的化妆品组合物，所述抑制剂在至少一个氨基酸位置具有氨基酸取代，所述位置选自与SEQ IDNO：187的变体BBPI的1、4、5、11、13、18、25、27、29、31、38、40、50、52、55和65位等价的位置，并且其中BBPI的支架的第二蛋白酶抑制环是选自SEQ ID NO：436、437、438、672、673和674的TGF结合肽。化妆品组合物的实例包括睫毛油、眼线笔、粉饼配方和粉底化妆品。
在其他实施方案中，本发明提供了包含Bowman Birk蛋白酶抑制剂(BBPI)和防辐射剂的毛发护理组合物，所述抑制剂在至少一个氨基酸位置具有氨基酸取代，所述位置选自与SEQ ID NO：187的变体BBPI的1、4、5、11、13、18、25、27、29、31、38、40、50、52、55和65位等价的位置，并且其中BBPI的支架的第二蛋白酶抑制环是选自SEQ ID NO：436、437、438、672、673和674的TGF结合肽。可包括在毛发护理组合物中的防辐射剂的实例是防晒剂，例如高防水型防晒剂和硅油包水型防晒剂。毛发护理组合物能够促进毛发生长。
在另一个实施方案中，本发明提供了通过提供个人护理组合物而促进毛发生长的方法，所述组合物包含Bowman Birk蛋白酶抑制剂(BBPI)，所述抑制剂在至少一个氨基酸位置具有氨基酸取代，所述位置选自与SEQID NO：187的变体BBPI的1、4、5、11、13、18、25、27、29、31、38、40、50、52、55和65位等价的位置，并且其中BBPI的支架的第二蛋白酶抑制环是选自SEQ ID NO：436、437、438、672、673和674的TGF结合肽；将所述组合物施于所述受试者的需要毛发生长的区域。例如，组合物可应用于促进面部毛发、腋下毛发、腿部毛发、躯干毛发、手臂毛发和头发的生长。在一些实施方案中，毛发生长促进性个人护理组合物可用于治疗涉及毛发丢失的适应症。例如，涉及毛发丢失并可使用本发明的毛发护理组合物治疗的适应症包括炎性脱发、假性斑秃、硬皮病、蜱叮咬、扁平苔癣、牛皮癣、狼疮、脂溢性皮炎、头发松散综合症、血色素沉着、雄激素性脱发和斑秃。在一些实施方案中，可用于促进毛发生长的个人护理组合物包含选自SEQ ID NO：443、445和447的经修饰的变体TGF-BBPI。
在另一个实施方案中，本发明提供了改善患皮肤病的受试者的皮肤外观和/或条件的方法，通过提供这样的个人护理组合物，所述组合物包含Bowman Birk蛋白酶抑制剂(BBPI)，所述抑制剂在至少一个氨基酸位置具有氨基酸取代，所述位置选自与SEQ ID NO：187的变体BBPI的1、4、5、11、13、18、25、27、29、31、38、40、50、52、55和65位等价的位置，并且其中BBPI的支架的第二蛋白酶抑制环是选自SEQ ID NO：436、437、438、672、673和674的TGF结合肽；将所述组合物施于所述受试者。在一些实施方案中，可使用所述组合物治疗的皮肤病包括牛皮癣、硬皮病和皮肤癌。在一些实施方案中，个人护理组合物包含选自SEQ IDNO：443、445和447的经修饰的变体TGF-BBPI的TGF-BBPI。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含Bowman Birk蛋白酶抑制剂(BBPI)的个人护理组合物，所述抑制剂在至少一个氨基酸位置具有氨基酸取代，所述位置选自与SEQID NO：187的变体BBPI的1、4、5、11、13、18、25、27、29、31、38、40、50、52、55和65位等价的位置，并且其中BBPI的支架的第二蛋白酶抑制环是选自SEQ ID NO：474、475和476的TNF结合肽。在一些实施方案中，BBPI的支架是SEQ ID NO：187的BBIt-AV。在其他实施方案中，包含在本发明的个人护理组合物中的经修饰的变体BBPI包含选自13I-40K-50T-52A、13I-25K-29P-52K、13I-29P-40K-50T-52A、13I-25R-27A-29P-31A -50K-52T、13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T、13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q、13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L的氨基酸取代的组合。在一些实施方案中，个人护理组合物包含经修饰的变体BBPI，所述经修饰的变体BBPI是选自SEQ ID NO：637、638和639的TNF-BBPI。所述个人护理组合物能够促进毛发生长。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含Bowman Birk蛋白酶抑制剂(BBPI)的毛发护理组合物，所述抑制剂在至少一个氨基酸位置具有氨基酸取代，所述位置选自与SEQID NO：187的变体BBPI的1、4、5、11、13、18、25、27、29、31、38、40、50、52、55和65位等价的位置，并且其中BBPI的支架的第二蛋白酶抑制环是选自SEQ ID NO：474、475和476的TNF结合肽。在一些实施方案中，毛发护理组合物能够促进患牛皮癣的受试者的毛发生长。毛发护理组合物可以是香波、护发素、头发定型组合物、染发剂、长效卷发配方、发膏、凝胶、摩丝、喷雾、乳状液、胶体悬浮液、液体、泡沫和固体的形式。在一些实施方案中，毛发护理组合物还包含防辐射剂。防辐射剂的实例包括防晒剂，例如不防水型防晒剂、高防水型防晒剂和硅油包水型防晒剂。在一些实施方案中，所述毛发护理组合物能够促进毛发生长。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含Bowman Birk蛋白酶抑制剂(BBPI)的皮肤护理组合物，所述抑制剂在至少一个氨基酸位置具有氨基酸取代，所述位置选自与SEQID NO：187的变体BBPI的1、4、5、11、13、18、25、27、29、31、38、40、50、52、55和65位等价的位置，并且其中BBPI的支架的第二蛋白酶抑制环是选自SEQ ID NO：474、475和476的TNF结合肽。皮肤护理组合物可用于改善患牛皮癣或硬皮病的受试者的皮肤外观和/或条件。在一些实施方案中，皮肤护理组合物可以是皮肤乳膏、化妆水、喷雾、乳状液、胶体悬浮液、泡沫、气溶胶、液体、凝胶、乳浆和固体的形式。可选的，皮肤护理组合物可以是身体保湿洗液、身体洗液、抗菌清洁剂、皮肤保护性乳膏、爽身水、面霜、润肤霜膏、面部清洁乳状液、面部凝胶、面部乳浆、基于表面活性剂的面部清洁剂、面部去角质凝胶、抗痤疮治疗、面部色粉、去角质乳膏、面膜、须后膏、须前膏、晒黑组合物、皮肤增艳组合物、缓解皮肤发红组合物、防晒剂、脱毛剂和防辐射剂的形式。任选的，皮肤护理组合物还包含局部施用的非处方组合物、抗真菌治疗、抗痤疮治疗、皮肤防护制品、防晒剂、除臭剂和止汗剂。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含Bowman Birk蛋白酶抑制剂(BBPI)的化妆品组合物，所述抑制剂在至少一个氨基酸位置具有氨基酸取代，所述位置选自与SEQ IDNO：187的变体BBPI的1、4、5、11、13、18、25、27、29、31、38、40、50、52、55和65位等价的位置，并且其中BBPI的支架的第二蛋白酶抑制环是选自SEQ ID NO：474、475和476的TNF结合肽。化妆品组合物选自睫毛油、眼线笔、粉饼配方和粉底化妆品。在一些实施方案中，化妆品组合物是包含至少一种色素的化妆品组合物。包含至少一种色素的化妆品组合物是睫毛油，选自非防水型睫毛油、防水型睫毛油、浓密型睫毛油、加长型睫毛油、卷翘睫毛油、无水的防水型睫毛油、基于水睫毛油和睫毛或眉毛处理。在其他实施方案中，化妆品组合物是选自粉饼配方，选自散粉、腮红、眼影和修容粉饼(bronzing powders)的化妆品组合物。
在其他实施方案中，化妆品组合物是选自油包水型粉底化妆品、硅油包水型粉底化妆品、水包油型粉底化妆品、无水化妆棒和粉霜粉底化妆品的粉底化妆品。
在另一个实施方案中，本发明提供了促进患牛皮癣的受试者的毛发生长的方法，包括步骤：提供包含Bowman Birk蛋白酶抑制剂(BBPI)的个人护理组合物，所述抑制剂在至少一个氨基酸位置具有氨基酸取代，所述位置选自与SEQ ID NO：187的变体BBPI的1、4、5、11、13、18、25、27、29、31、38、40、50、52、55和65位等价的位置，并且其中BBPI的支架的第二蛋白酶抑制环是选自SEQ ID NO：474、475和476的TNF结合肽；并将所述组合物施于所述受试者的需要促进毛发生长的区域。
例如，组合物可应用于促进面部毛发、腋下毛发、腿部毛发、躯干毛发、手臂毛发和头发的生长。在一些实施方案中，可用于促进毛发生长的个人护理组合物包含选自SEQ IDNO：637、638和639经修饰的TNF-BBPI。
在另一个实施方案中，本发明提供了改善患牛皮癣的受试者的皮肤的外观和/或条件的方法，包括步骤：提供包含Bowman Birk蛋白酶抑制剂(BBPI)的个人护理组合物，所述抑制剂在至少一个氨基酸位置具有氨基酸取代，所述位置选自与SEQ ID NO：187的变体BBPI的1、4、5、11、13、18、25、27、29、31、38、40、50、52、55和65位等价的位置，并且其中BBPI的支架的第二蛋白酶抑制环是选自SEQ ID NO：474、475和476的TNF结合肽；并将所述组合物施于所述受试者的皮肤。在一些实施方案中，方法包括提供包含选自SEQ ID NO：637、638和639的经修饰的TNF-BBPI的个人护理组合物。
4、附图简介
图1A-D提供了克隆到pJM103整合载体中的aprE-BCE103-BBI-Histag表达盒(EcoRI-HindIII)的DNA和氨基酸序列(SEQ ID NO：1和2)。
图2提供了pJM103BBIhis表达载体的示意图。
图3提供了12BBIck81的DNA和氨基酸序列，从BCE103融合位点(在BamHI处)至基因末端(SEQ ID NO：3和4)。CK37281肽序列(ACYNLYGWTC(SEQ ID NO：9)插入到胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶抑制环中。
图4提供了显示在培养的生长过程中，以给定浓度添加各种巯基还原试剂的活性2BBIck81和非活性2BBIck81的滴度图。条的白色部分代表活性2BBIck81的量(由胰蛋白酶抑制作用确定)，条的黑色部分代表非活性2BBIck81的量(由BCE103活性确定，假定BCE103和2BBIck 81是以1∶1的摩尔比生产)。活性2BBIck81的部分表示在条的顶部。在该图中，37C＝无添加、BME＝2-巯基乙醇、Cys＝半胱氨酸、Glut＝还原型谷胱甘肽、DTT＝二硫苏糖醇。
图5提供了显示在通过离子交换层析部分纯化BCE-lnk2-2BBck81融合蛋白后，用2-巯基乙醇(BME)激活2BBIck81的图。显示了在用3mM的2-巯基乙醇(BME)处理之前和之后，通过活性测定测量的BCE(黑色条)和2BBIck81(白色条)的浓度(μM)。
图6提供了显示2BBlck81与抗VegF抗体在BioVeris测定中与VegF结合的竞争测定的结果图。显示与CK37281肽的结合竞争供比较，并包括与野生型BBI的结合作为阴性对照。
图7A-C提供了插入到枯草芽孢杆菌BBI表达载体(使用BssHII和SacI位点)中的合成DNA片段的序列，以及氨基酸序列(SEQ ID NO：5和6)，所述片段携带了特异腐质霉(Humicola insolens)PDI(hiPDI)。
图8A-C提供了连接到p2JM103-lnk2-2BBIck81的EcoRI-BamHI位点中aprE-角质酶表达盒的DNA和氨基酸序列(SEQ ID NO：7和8)。
图9提供了未经修饰的BBIt-AV蛋白的氨基酸序列(SEQ IDNO：187)。在所有的编号氨基酸处构建位点饱和文库。标出了胰蛋白酶抑制环和VEGF结合肽环(斜体)，并通过连线显示二硫键。在底部，VEGF结合肽的序列与它所替换的sBBI中的胰凝乳蛋白酶抑制环相比。向下的箭头表示在胰凝乳蛋白酶反应位点P1和P1’残基之间的潜在蛋白酶切割位点。
图10提供了在29位进行的各种氨基酸取代的相对BBI∶BCE活性比。比例是生长在微滴度板中的四份平行的培养物在缺少(白色条)或存在(黑色条)2-巯基乙醇的条件下的平均值。包括了sBBI的活性比例作为阳性对照进行比较。根据BBIt-AV(SEQ ID NO：187)的野生型氨基酸确定的值(用水平线表示)将比例归一化，亮氨酸在缺少(有水平线的条)或存在(有对角线的条)2-巯基乙醇的条件下显示。
图11A-B分别提供了在50位(A)和37位(B)进行的氨基酸取代的相对BBI∶BCE活性比(白色条)。比例是在存在2-巯基乙醇的条件下的四份平行培养物的平均值。包括了sBBI的活性比例作为阳性对照进行比较(黑色条)。根据BBIt-AV(SEQ ID NO：187)的野生型氨基酸确定的值(用水平线表示)将比例归一化，并用对角线条显示。
图12提供了在胰蛋白酶抑制环中的P2’位(图9中的残基18，SEQ IDNO：187)的氨基酸取代的相对BBI∶BCE活性比。比例是在存在2-巯基乙醇的条件下的四份平行物的平均值(显示单个数据点)。sBBI(BBI；SEQID NO：13)、BBIt-AV(CT；SEQ ID NO：187)和BBIt-AV-F50T(F50T)的活性比例显示在水平线的右侧，并添加以供比较。根据BBIt-AV(CT)确定的值(通过水平线显示)将比例归一化。
图13提供了三种BBIt-AV的生产的比较，所述BBIt-AV含有8个氨基酸取代的组合：八重变体BBIt-AV-A13I-S25K-M27A-L29R-S31A-A40H-F50R-V52L(RL8；SEQ IDNO：630)、BBIt-AV-A13I-S25K-M27A-L29R-S31E-A40K-F50Q-V52Q(QQ8；SEQ ID NO：628)和BBIt-AV-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-A40H-F50K-V52T(KT8；SEQ ID NO：627)。在生长后(◆)、在用2-巯基乙醇激活后(■)和在酸/热处理后(▲)，通过胰蛋白酶抑制确定活性BBI种类的量。包括了BBIt-AV和五重变体BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A(TA5；SEQ ID NO：601)用于比较。
图14提供了在生长后(黑色条)、在用2-巯基乙醇激活后(对角线条)和在酸/热处理后(白色条)，在前体变体BBPI支架(称为母本(PT))中具有不同结合肽(三种TGFβ和两种FGF5结合子)与经修饰的变体BBIt-AV-A13I-L29P-F50T-V52A支架(Q；SEQ ID NO：600)的活性BBI(通过胰蛋白酶抑制)的比较。在所有支架中，结合肽取代了胰凝乳蛋白酶抑制环。PEN3(SEQ ID NO：436)、WTQ(SEQ ID NO：438)和MM021W(SEQ ID NO：437)是TGFβ结合肽，而MM007(SEQ ID NO：430)和FGFps2(SEQ ID NO：431)是FGF5结合肽。
图15提供了以下与变体BBI，BBIt-AV(SEQ ID NO：187)的序列相比对的氨基酸序列：来自二花扁豆(Dolichos biflorus)的变体Bowman Birk抑制剂支架(BBdb-AV，SEQ IDNO：452)，来自大豆(Glycine max)的变体蛋白酶抑制剂IV或D-II(BBsb3-AV，SEQ ID NO：453)，和来自巴西良木豆(Torresea (Amburana)cearensis)的变体蛋白酶抑制剂(BBtc-AV，SEQ ID NO：454)，其中用VEGF结合肽取代了胰凝乳蛋白酶抑制环。以粗体的下划线显示了C9和C58之间的BBIt-AV序列的差异。在所有的支架中，CK3781结合肽(ACYNLYGWT；SEQ IDNO：9)取代了第二蛋白酶抑制环。
图16提供了在用2-巯基乙醇激活后(白色条)和在酸/热处理后(黑色条)，BBIt-AV、BBdb-AV和BBtc-AV的活性BBI浓度(通过胰蛋白酶抑制)。
图17提供了未经修饰的变体BBIt-AV(SEQ ID NO：187)、BBdb-AV(SEQ ID NO：452)、BBsb3-AV(SEQ ID NO：453)和BBtc-AV(SEQ IDNO：454)和相应的未经修饰的前体BBIt(SEQ ID NO：187)、BBsb3(SEQID NO：449)、BBtc(SEQ ID NO：450)和BBdb(SEQ ID NO：451)BBPI的比对。星号(＊)标出不变的保守C残基。编号的残基标出被取代而产生本发明的经修饰的变体BBPI的氨基酸。
图18鉴别了野生型BBI中的T细胞表位。(A)将所有71个供体的刺激指数(SI)值平均并显示，带有误差条的标准偏差。(B)显示了20个wt BBI肽集中的每种肽的响应百分比。
5、发明详述
本发明涉及经修饰的变体BOWMAN BIRK蛋白酶抑制剂蛋白(BBPI)，所述抑制剂包含结合靶蛋白的肽，并且经过进一步经修饰而具有比未经修饰的BBPI更大的蛋白酶抑制活性和/或以更大的产量生产。本发明涵盖了包含编码经修饰的变体BBPI的多核苷酸序列的多核苷酸构建体和表达载体，表达和生产所述经修饰的变体BBPI的转化的宿主细胞，经修饰的变体BBPI蛋白，包含经修饰的变体BBPI的组合物，以及用于制造和在个人护理中使用经修饰的变体BBPI的方法。
除非另外指出，本发明实践涉及在分子生物学、微生物学、蛋白质纯化、蛋白质工程、蛋白质和DNA测序，以及重组DNA领域中普遍使用的常规技术，是本领域技术人员所掌握的。此类技术是本领域技术人员已知的，并描述在多种标准教科书和参考文献中。本文提及的所有专利、专利申请、文章和出版物都通过引用全文明确整合到本文中作为参考。
除非本文中另外定义，本文使用的所有技术和科学术语都具有本发明所述领域的普通技术人员通常理解的相同含义。包括本文囊括的术语的各种科技词典都是普遍已知的，且是本领域技术人员可获得的。虽然任何与本文所述相似或等价的方法和材料都可用于实践或测试本发明，但是本申请描述了一些优选的方法和材料。因此，通过将说明书作为整体来参考，可以更全面的描述下文直接定义的术语。可以理解，本发明不限于所述的特定方法学、规程和试剂，它们可根据本领域技术人员使用时的环境而改变。
如本文使用的，除非上下文明确指出，否则单数术语“一”、“一个”和“这个”包括了复数的指代。除非另外指出，核酸按5’至3’的方向由左至右书写，氨基酸序列按由氨基至羧基的方向由左至右书写。
本文提及的所有专利、专利申请和其他出版物，包括这类参考文献中公开的所有序列，都通过引用明确的整合，与每个独立的出版物、专利或专利申请都专门且分别指出通过参考而整合的程度相同。所有引用的文件的相关部分都通过引用整合到本文中作为参考。然而，任何文件的引用都不视为承认它是本发明相关的现有技术。
数值范围包含了定义范围的数字。这表示，在本说明书全文给出的每一个数值上限都包括了每一个较小的数值限定，如同此类较小的数值限定明确的记载在本文中一样。在本说明书全文给出的每一个数值下限都包括了每一个较大的数值限定，如同此类较大的数值限定明确的记载在本文中一样。在本说明书全文给出的每一个数值范围都可包括落入此类较宽的数值范围中的每一个较窄的数值范围，如同此类较窄的数值范围明确的记载在本文中一样。
本文提供的标题不是对本发明的各个方面或实施方案的限制，所述各个方面或实施方案可参照作为整体的说明书。因此，如上所示，下文直接定义的术语通过将说明书作为整体来参考可以更全面的定义。
5.1定义
如本文中使用的，术语“分离的”和“纯化的”指去除与其天然相关的至少一种组分的核酸或氨基酸(或其他组分)。
如本文中使用的，当指蛋白酶抑制剂(PI)例如Bowman Birk蛋白酶抑制剂(BBPI)时，术语“经修饰的”指具有源自未经修饰的“前体”或“母本”BBPI蛋白质的氨基酸序列的氨基酸序列的BBPI。未经修饰的前体BBPI可以是天然存在的或野生型蛋白，或变体BBPI。通过取代、删除或插入前体氨基酸序列的区域中的一个或多个氨基酸，经修饰的蛋白质的氨基酸序列“源自”前体蛋白质氨基酸序列。在一些实施方案中，至少一个氨基酸被取代而产生经修饰的蛋白酶抑制剂。在一些实施方案中，母本蛋白酶抑制剂是变体BBPI，含有被变体序列取代了的胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶环。变体前体BBPI的至少一个氨基酸的取代产生经修饰的变体BBPI蛋白酶抑制剂。在一些实施方案中，经修饰的变体BBPI在至少一个氨基酸位置包含氨基酸取代，所述位置等价于SEQ ID NO：187的1、4、5、11、13、18、25、27、29、31、38、40、50、52和65位(DDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCACYNLYGWTCFCVDITDFCYEPCKPSE：SEQ ID NO：187)。在其他实施方案中，经修饰的变体PI包含如本文所述的取代的组合。在其他实施方案中，经修饰的变体PI包含插入。此类修饰作用是编码前体蛋白酶抑制剂的氨基酸序列的“前体DNA序列”的，而非对前体蛋白酶抑制剂本身的操作。本文中经修饰的蛋白酶抑制剂涵盖了对不是反应环的区域内的任一个氨基酸残基，进行十九个天然存在的氨基酸中任一个的取代，所述反应环例如胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶环。编码经修饰的序列的多核苷酸称为“经修饰的多核苷酸”，编码前体蛋白酶抑制剂的多核苷酸称为“前体多核苷酸”。
如本文中使用的，术语“蛋白酶抑制剂”(PI)在本文中指代并与Bowman Birk蛋白酶抑制剂(BBPI)可互换的使用，所述BBPI是例如Prakash等[J mol Evol 42：560-569(1996)]所述的富含半胱氨酸的蛋白酶抑制剂。
如本文中使用的，术语“支架”指导入了变体序列的BBPI蛋白序列。在一些实施方案中，支架是变体支架，具有用结合肽序列取代的第一蛋白酶抑制环(例如，胰蛋白酶环)和/或第二蛋白酶抑制环(例如，胰凝乳蛋白酶)。在其他实施方案中，支架是野生型BBPI支架。术语“经修饰的变体支架”指在例如BBPI支架的骨架中包含例如氨基酸取代或插入的修饰的变体支架。
如本文中使用的，当用于指代变体BBPI支架时，术语“骨架”指变体BBPI在结合肽序列外部的部分，所述结合肽是经导入取代第一和/或第二蛋白酶抑制环，例如胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶环的部分。例如，SEQ IDNO：187的变体BBPI的骨架指氨基酸1-40和50-66，即，在41和49位氨基酸的非变体半胱氨酸残基的氨基酸N端和C端，包括了经导入取代了野生型BBPI(即，SEQ ID NO：13的BBI)中可见的胰凝乳蛋白酶环的VEGF结合序列(DDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCICALSYPAQCFCVDITDFCYEPCKPSEDDKEN；SEQID NO：13)。在一些实施方案中，支架与SEQ ID NO：187的BBIt的支架具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％的同一性。
如本文中使用的，术语“结合肽”、“结合序列”、“变体序列”和“变体肽”可互换使用，指取代蛋白酶抑制剂(例如Bowman Birk抑制剂)的第一和/或第二蛋白酶抑制环的短多肽序列。结合肽不需要与支架中它所取代的蛋白酶抑制环序列的长度相同，并且它与野生型BBPI的蛋白酶抑制环序列差别至少2个氨基酸。在一些实施方案中，对前体蛋白酶抑制剂的第一和/或第二蛋白酶抑制环(例如，胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶环)的取代，改变了野生型(SEQ ID NO：13)或变体SEQ ID NO：187BBPI中与覆盖氨基酸15至21(胰蛋白酶环)等价的序列，和/或与覆盖氨基酸42至48(胰凝乳蛋白酶环)等价的序列。结合肽是与蛋白酶抑制剂的序列异源的。结合肽结合靶蛋白。
“VEGF结合肽”、“FGF结合肽”、“TGF结合肽”和“TNF结合肽”在本文中指分别结合VEGF、FGF5、TGF β和TNF α的肽序列。
“VEGF组合物”、“FGF组合物”、“TGF组合物”和“TNF组合物”在本文中指分别包含VEGF-BBPI、FGF-BBPI、TGF-BBPI和TNF-BBPI的组合物，例如个人护理组合物。
当用于指代本文所述的配方时，“化合物”指经修饰的变体BBPI，例如VEGF-BBPI、FGF-BBPI、TGF-BBPI或TNF-BBPI。配方可包括多于一种类型的经修饰的变体BBPI，即，配方可包含VEGF-BBPI和TNF-BBPI，或者本文公开的所述四种类型的BBPI的任何其他组合。
当用于指代包含在个人护理组合物中的经修饰的变体BBPI时，术语“一种”在本文中指具有特定序列的经修饰的变体BBPI。“一种”在此上下文中，不限制个人护理组合物中所需的经修饰的变体BBPI分子的数量。
术语“胰凝乳蛋白酶环”和“第二蛋白酶抑制环”在本文中是可互换使用的，指这样的氨基酸序列，所述序列覆盖了与Bowman Birk家族的蛋白酶抑制剂的第二反应位点环对应的氨基酸序列。例如，来自大豆的野生型BBPI抑制剂(即，SEQ ID NO：13的BBI)的第二蛋白酶抑制环是覆盖了由半胱氨酸10和半胱氨酸11包括的第二反应位点环的肽序列(参见Prakash等，见上文)。C10和C11涵盖了与SEQ ID NO：187的变体BBIt-AV中跨越氨基酸42到氨基酸48的序列等价的氨基酸序列(图9)。变体BBPI(例如SEQ ID NO：187的BBIt-AV)的第二蛋白酶抑制环或胰凝乳蛋白酶抑制环与这样的氨基酸序列对应，所述序列跨越由41和49位的半胱氨酸(Prakash等所述的C10和C11等价的半胱氨酸残基)涵盖的氨基酸42-48。SEQID NO：13的野生型BBI的第二蛋白酶抑制环的氨基酸序列是胰凝乳蛋白酶抑制性肽，而SEQID NO：187的变体BBIt-AV的第二蛋白酶抑制环是VEGF结合肽。因而，术语“胰凝乳蛋白酶环”或“第二蛋白酶抑制环”在本文中指环的位置，并非意在暗示C10和C11之间的序列产生变体BBPI的蛋白酶抑制活性。相似的，术语“胰蛋白酶环”和“第一蛋白酶抑制环”在本文中可互换使用，并且指这样的氨基酸序列，所述序列覆盖了与Bowman Birk家族的蛋白酶抑制剂的第一反应位点环对应的氨基酸序列。例如，来自大豆的野生型BBPI抑制剂(即，SEQIDNO：13的BBI)的第一蛋白酶抑制环是跨越由半胱氨酸4和半胱氨酸5包括的第一反应位点环的肽序列(参见Prakash等，见上文)。C4和C5涵盖了与SEQ ID NO：187的变体BBIt-AV中跨氨基酸15至氨基酸21的序列等价的氨基酸序列(图9)。
如本文中使用的，术语“靶蛋白”指这样的蛋白质(例如，酶、激素等)，所述蛋白质的作用受变体肽结合的阻断。在一些实施方案中，当肽取代BBPI的胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶环时，变体肽结合靶蛋白。
如本文中使用的，“被取代”和“取代”指母本序列中氨基酸残基或核酸碱基的替换。在一些实施方案中，取代涉及天然存在的残基或碱基的替换。在一些实施方案中，两个或多个氨基酸被取代产生经修饰的BBPI，所述经修饰的BBPI包含氨基酸取代的组合。在一些实施方案中，通过进行取代的氨基酸的位置表示取代的组合。例如，用25-50-52表示的组合意味着在25、50和52位的三个氨基酸被取代。在其他实施方案中，通过氨基酸的位置和由取代获得的氨基酸来表示取代的组合。例如，包含13I-25L-50T-52A的取代组合的经修饰的BBPI是这样的经修饰的BBPI，其中，13位的氨基酸用异亮氨酸取代，25位的氨基酸用亮氨酸取代，50位的氨基酸用苏氨酸取代，而52位的氨基酸用丙氨酸取代。氨基酸位置是与SEQ IDNO：187的BBPI中编号的位置等价的位置。在一些实施方案中，在进行取代的支架的环境中给出取代的组合。例如SEQ ID NO：601的经修饰的变体BBPI也称为BBIt-AV-13I-29P-40K-50T-52A，表示修饰了BBIt-AV支架(SEQ ID NO：187)以含有在氨基酸13、29、40、50和52位所获得的取代。在一些实施方案中，标出了原始的和取代的氨基酸，例如，SEQ ID NO：601的经修饰的变体BBPI可称为BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A。
如本文中使用的，“修饰作用”和“经修饰”指氨基酸或核酸序列中的任何改变，包括但不限于缺失、插入、中断和取代。在一些实施方案中，修饰作用涉及天然存在的残基或碱基的取代。在其他实施方案中，修饰作用包含至少一个氨基酸取代的组合。在其他实施方案中，修饰作用包含插入，不论所述插入有或没有与至少一个氨基酸取代组合。
如本文中使用的，当用于指代在BBPI中的氨基酸残基或氨基酸残基位置时，术语“等价”指氨基酸残基在经修饰的BBPI中的位置与未经修饰的前体BBPI的一级序列中的位置对应。为了确立与BBPI中的氨基酸位置等价的位置，将经修饰的BBPI的氨基酸序列与SEQID NO：187的BBPI直接比较，特别是与已知在Bowman Birk抑制剂家族的蛋白酶抑制剂中不变的半胱氨酸残基相比(Prakash等，见上文)。在比对了保守的半胱氨酸残基后，允许插入和缺失从而保持匹配(即，避免通过主观的缺失或插入而消除了保守的半胱氨酸残基)，确定在与SEQ ID NO：187的BBPI序列中特定的氨基酸位置等价的位置上的残基。保守的半胱氨酸残基的比对优选应该保留100％的此类残基。例如，图17中比对了变体和野生型BBPI的氨基酸序列，提供氨基酸序列之间的最大量的同源性。这类序列的比较显示，不变的半胱氨酸残基是保守的。一级序列是用于确定本发明BBPI中等价氨基酸的位置的优选结构，同时，还可以通过在蛋白质BBPI的三级结构水平上确定同源性，来鉴别等价的残基。
等价的氨基酸位置定义为这样的位置，在比对后，目的蛋白与具有假设等价残基的蛋白质在所述位置上的特定氨基酸残基的两个或多个主链原子的原子坐标(N对N，CA对CA，C对C，以及O对O)是在0.13nm内，优选在0.1nm内。在定向并放置好以产生所分析蛋白质的非氢蛋白质原子之原子坐标的最大重叠的最佳模型后，实现比对。优选的模型是在可使用的最高解析度下，使用晶体学和蛋白质表征/分析学领域的技术人员已知的方法所确定的，使实验的衍射数据产生最低R因子的晶体学模型。已确定了大豆的Bowman Birk抑制剂的晶体结构(Hwang等，J Biol Chem.10；252(3)：1099-101[1977]；Wei等，J Biol Chem.10；254(11)：4892-4[1979]；Voss等，Eur J Biochem.15；242(1)：122-31[1996])，并可如上文概括的用于在三级结构水平确定等价的氨基酸位置。
如本文使用的，“融合多肽”、“融合蛋白”和“融合类似物”从氨基端起，编码在宿主细胞中作为分泌序列发挥功能的信号肽、通常从宿主细胞中分泌的分泌性多肽或其部分、可切割的接头多肽和目的多肽。在一些实施方案中，融合多肽包括位于分泌性序列和经分泌的多肽之间的间隔肽。在一些实施方案中，融合蛋白是通过宿主细胞酶(例如，蛋白酶)加工的，从融合蛋白中的其他蛋白质序列释放产生目的蛋白。如本文使用的，术语“融合类似物”、“融合多肽”和“融合蛋白”可互换使用。
如本文使用的，术语“活性”指与特定蛋白质相关的任何活性，例如与蛋白酶相关的酶促活性。在一些实施方案中，活性是生物学活性。在其他实施方案中，活性涵盖了蛋白质与受体的结合，导致可测量的下游效应(例如，VEGF与其相应受体的结合)。“生物学活性”指本领域技术人员通常归因于所述蛋白质的任何活性。
如本文使用的，“蛋白酶抑制活性”指BBPI在抑制蛋白酶的蛋白水解活性中的活性，即，抑制蛋白酶水解肽或具有肽键的底物的能力。
如本文使用的，术语“表达”指基于基因的核酸序列生产多肽的过程。过程包括转录和翻译。
指代BBPI的术语“生产”涵盖了全长蛋白酶的2个加工步骤，包括：1.去除信号肽，已知其在蛋白质分泌的过程中发生；和2.去除前区域，其创制了活性成熟形态的BBPI，并已知在成熟过程中发生(Wang等，Biochemistry 37：3165-3171(1998)；Power等，Proc NatlAcad Sci USA83：3096-3100(1986))。
如本文使用的，术语“产量”指未经修饰的和/或经修饰的变体蛋白酶抑制剂的生产水平，例如变体BBPI。产量越大，生产的蛋白酶抑制剂的水平或量越大。
如本文使用的，术语“有效的生产”在本文中指蛋白质如经修饰的变体BBPI的生产，并暗示所述蛋白质生产的水平大于未经修饰的或前体变体BBPI的生产水平。
如本文使用的，当用于本发明的蛋白质或其片段时，术语“基本纯的”意指所述蛋白质基本不含其他物质，达到可实践并适合其预期用途的程度。特别的是，蛋白质是充分纯的，且充分不含宿主细胞的其他生物学组分，因此可用于例如蛋白质测序和/或生产药物制品。
如本文使用的，术语“基本不含”涵盖了具有少于约20％(按干重计)的其他蛋白质(即污染性蛋白质)，少于约10％的其他蛋白质，少于约5％的其他蛋白质，或少于约1％的其他蛋白质的目的多肽的制品。
如本文使用的，术语“多核苷酸”、“核酸分子”和“核酸序列”包括任何形式的核酸序列，包括但不限于RNA、DNA和cDNA分子。可以理解，作为遗传密码简并性的结果，可以生产编码给定蛋白质的多个核苷酸序列。
如本文使用的，术语“DNA构建体”、“多核苷酸构建体”和“转化DNA”是可互换使用的，用于指在将序列导入宿主细胞或生物体中使用的DNA。DNA可以通过PCR或本领域已知的任何其他合适的技术在体外产生。在一些实施方案中，DNA构建体包含目的序列(例如，经修饰的序列)。在一些实施方案中，序列与其他元件有效连接，例如控制元件(如，启动子等)。在一些实施方案中，DNA构建体包含与宿主细胞染色体同源的序列。在其他实施方案中，DNA构建体包含非同源的序列。一旦在体外装配了DNA构建体，则可将其用于诱变宿主细胞染色体的区域(即，用异源序列替换内源序列)。
如本文使用的，术语“异源DNA序列”指不天然的存在于宿主细胞内的DNA序列。在一些实施方案中，异源DNA序列是包含不同基因的部分的嵌合DNA序列，包括调控元件。
如本文使用的，术语“异源蛋白质”指不天然的存在于宿主细胞内的蛋白质或多肽，即，由异源序列编码的。
如本文使用的，术语“同源蛋白质”指自然的或天然的存在于细胞内的蛋白质或多肽。
如本文使用的，术语“载体”指设计将核酸导入一种或多种细胞类型中的多核苷酸构建体。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体和质粒。在一些实施方案中，多核苷酸构建体包含编码经修饰的变体BBPI的DNA序列。
如本文使用的，术语“表达载体”指具有将异源DNA片段整合到外源细胞中并在细胞中表达的能力的载体。许多原核和真核的表达载体是可商购的。合适的表达载体的选择是在本领域技术人员的范围内的。
如本文使用的，术语“质粒”指用作克隆载体的环状双链(ds)DNA构建体，并且在一些真核细胞或原核细胞中形成染色体外的自主复制性遗传元件，或整合到宿主染色体中。
如本文使用的，在将核酸序列导入到细胞的语境下，术语“导入”指任何适合将核酸序列转移到细胞中的方法。此类用于导入的方法包括但不限于原生质体融合、转染、转化、接合和转导(见例如，Ferrari等，“Genetics，”在Hardwood等，(编著)Bacillus、PlenumPublishing Corp.，第57-72页[1989])。
如本文使用的，术语“转化的”和“稳定转化的”指具有整合到基因组中，或作为附加体质粒维持至少2个世代的非天然(异源)多核苷酸序列的细胞。
如本文使用的，当用于指代多核苷酸或多肽序列时，“百分比(％)序列同一性”或“百分比同源性”定义为候选序列中，与本文公开序列的核苷酸或氨基酸残基相同的核苷酸或氨基酸残基的百分比。通过本领域已知的方法，比对序列并确定同一性，而直接比较分子间的序列信息，来确定多核苷酸或多肽序列共享的百分比同一性。在一些实施方案中，比对包括在所比对的序列中导入空位。此外，对于含有比候选多核苷酸或多肽序列更多或更少的核苷酸或氨基酸的序列，可以理解，可以基于与核苷酸或氨基酸的总数相关的同源核苷酸或氨基酸的数目，来确定百分比同源性。因而，例如，可以使用较短序列中的核苷酸或氨基酸的数目，来确定比本文鉴别的序列更短的序列的同源性。该同源性是使用本领域已知的标准技术确定的(见例如，Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.，2：482[1981]；Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.，48：443[1970]；Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444[1988]；程序例如Wisconsin遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA(Genetics Computer Group、Madison、WI)；和Devereux等，Nucl.Acid Res.、12：387-395[1984])。
如本文使用的，“类似序列”是这样的序列，其中蛋白质的功能与指定的BowmanBirk蛋白酶抑制剂家族的蛋白酶抑制剂的功能基本相同。额外的，类似蛋白质包括与SEQID NO：187的变体BBPI的序列至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。类似序列是通过已知的序列比对方法确定的。常用的比对方法是BLAST，虽然如上下文所述，但其他方法也可用于比对序列中。
有效算法的一个实例是PILEUP。PILEUP使用渐进的配对比对，从一组相关序列获得多重序列比对。它还可以绘制显示用于产生比对的聚类相关性(clusteringrelationship)的树。PILEUP使用简化的Feng和Doolittle渐进比对方法(Feng和Doolittle，J.Mol.Evol.，35：351-360[1987])。该方法与Higgins和Sharp所述相似(Higgins和Sharp，CABIOS 5：151-153[1989])。有效的PILEUP参数包括默认的空位权重3.00，默认的空位长度权重0.10和加权的末端空位。
有用算法的另一个实例是BLAST算法，由Altschul等描述(Altschul等，J.Mol.Biol.，215：403-410，[1990]；和Karlin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787[1993])。特别有效的BLAST程序是WU-BLAST-2程序(见，Altschul等，Meth.Enzymol.，266：460-480[1996])。WU-BLAST-2使用若干搜索参数，大部分设置为默认值。可调节的参数用下列值设置：重叠间隙(overlap span)＝1，重叠分数＝0.125，字节阈值(T)＝11。HSPS和HSPS2参数是动态值，且是由程序自身根据特定序列的组成和目的序列针对其进行搜索的特定数据库的组成而确立的。然而，可以调节所述值以增加灵敏度。通过匹配的相同残基数除以比对区域中“较长”序列的残基总数，确定A％氨基酸序列同一性值。“较长”序列是在比对区域具有最多的实际残基的序列(忽略为了使比对分数最大化而由WU-Blast-2导入的空位)。优选的方法利用WU-Blast-2设置为默认参数的BLASTN模块，重叠间隙和重叠分数分别设为1和0.125。
“宿主细胞”指来自作为表达载体的宿主发挥作用的细胞的合适细胞，所述表达载体包含根据本发明的DNA。合适的宿主细胞可以是天然存在的或野生型的宿主细胞，或者可以是改变的宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是革兰氏阳性微生物。在一些优选的实施方案中，术语指芽孢杆菌属的细胞。
如本文中使用的，“芽孢杆菌属物种”包括本领域技术人员已知落入“芽孢杆菌”属中的所有物种，包括但不限于枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)，迟缓芽孢杆菌(B.lentus)，短芽孢杆菌(B.brevis)，嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)，嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)，解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)，克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)，耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)，巨大芽孢杆菌(B.megaterium)，凝结芽孢杆菌(B.coagulans)，环状芽孢杆菌(B.circulans)，灿烂芽孢杆菌(B.lautus)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。应认识到芽孢杆菌属不断进行着分类学重组。因而，预期所述属包括了已经重分类的物种，包括但不限于这样的生物体，如嗜热脂肪芽孢杆菌，现名为“嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)”。氧气存在下抵抗性的内生孢子被认为是芽孢杆菌属的定义性特征，虽然该特征也用于目前命名的脂环酸杆菌属(Alicyclobacillus)，双芽孢杆菌属(Amphibacillus)，解硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)，厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)，短芽孢杆菌属(Brevibacillus)，Filobacillus，薄壁芽孢杆菌属(Gracilibacillus)，喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)，类芽孢杆菌属(Paenibacillus)，需盐芽孢杆菌属(Salibacillus)，耐热芽孢杆菌属(Thermobacillus)，解脲芽孢杆菌属(Ureibacillus)和枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)。
如本文使用的，“启动子序列”指被细菌宿主出于表达的目的识别的DNA序列。在优选的实施方案中，它与编码融合多肽的DNA序列有效连接。此类连接包含相对于编码融合DNA序列的DNA序列的翻译起始密码子来放置启动子。在特别优选的实施方案中，启动子序列含有介导融合DNA序列表达的转录和翻译控制序列。
如本文使用的，当核酸以与另一种核酸序列处于功能性关系中时，核酸是“有效连接”的。例如，如果编码分泌前导子的DNA作为参与多肽分泌的前蛋白质表达，则它与多肽DNA是有效连接的；如果启动子或增强子影响序列的转录，则它与编码序列是有效连接的；或者，如果核糖体结合位点的放置促进翻译，则它与编码序列是有效连接的。有效连接的DNA序列通常是连续的，并且在分泌前导子的情况下，是以可读相连续的。然而，增强子不是必须连续的。通过在方便的限制性酶切位点接合而实现连接。如果不存在此类位点，则可以根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
如本文使用的，“重组”包括指代已通过导入异源核酸序列而得到修饰的细胞或载体，或者源自所述得到修饰的细胞的细胞。因而，例如，重组细胞表达在天然(非重组的)细胞类型中未见相同形式的基因，或者作为故意的人为干涉的结果表达天然的基因，该基因否则将异常表达，低表达或不表达。
如本文使用的，术语“个人护理组合物”指应用于皮肤，毛发，指甲，口腔和相关的膜的产品，出于改善，清洁，美化，治疗和/或护理上述表面和膜的目的。在一些实施方案中，个人护理组合物是乳化的载体的形式(如营养膏或化妆水)，稳定化凝胶或分散体系(如皮肤柔化剂)，营养乳液，营养膏，按摩膏，治疗浆液，脂质体递送系统，局部面部面纸(facialpack)或面膜，基于表面活性剂的清洁系统(如香波或身体洗液)，气溶胶化的或喷雾的分散液或乳状液，头发或皮肤调理剂，造型助剂或染色产品，如液态，膏状，固态，无水或笔状的化妆品。然而，这并非意将本发明限于任何特定的形式，如用于本发明的各种形式。
个人护理组合物可以分类为/描述为化妆品的，非处方(“OTC”)的化合物，可用于个人护理应用(例如，化妆，皮肤护理，口腔护理，头发护理，指甲护理)。在一些实施方案中，将经修饰的变体BPPI添加到个人护理组合物中，例如毛发护理组合物，皮肤护理组合物，指甲护理组合物，化妆品组合物，或其任意的组合。
如本文使用的，“皮肤护理组合物”指为了提供有益的性质而应用于皮肤的组合物，所述性质包括但不限于减少皱纹，消除皱纹，脱色，着色，皮肤柔化，皮肤光滑化，脱毛，清洁等。在一些优选的实施方案中，本发明提供了改善皮肤状态的皮肤护理组合物。在这些实施方案中，改善包括减少皱纹，光滑皮肤质地，修饰皮肤颜色和其他需要的美容效果。在其他实施方案中，皮肤护理组合物是选自身体洗液，身体保湿洗液，除臭身体洗液，抗菌清洁剂，皮肤保护性治疗，爽身水，面霜，补水霜，面部清洁乳状液，基于表面活性剂的面部清洁剂，面部去角质凝胶，面部色粉，去角质霜，面膜，须后水，香脂和/或防辐射剂组合物(例如，防晒剂)的形式。
如本文使用的，“化妆品组合物”指用于化妆的组合物。本文中使用食品药品和化妆品法案(FD&C法案)的定义。因而，化妆品是通过它们的预期用途定义的，如预期涂抹，倾倒，撒在，喷于，导入或其他方式应用于人体，进行清洁，美化，提升魅力或改变外观的物品。这些组合物提供了非治疗性的益处，并且不作为药物受控制。然而，在一些情况下，将化妆品组合物整合到药物组合物中，提供美容的益处(例如，治疗皮肤或头发疾病的产品，但也含有化妆品组合物用于着色或其他益处)。化妆品组合物包括本文定义的美容品组合物。本发明还意在涵盖在人以外的动物上使用化妆品。
如本文中使用的，术语“药物组合物”和“治疗性组合物”指不仅提供化妆的益处，还提供医学益处的组合物，例如药物。在美国，药物和治疗性组合物由食品和药品监督管理局批准用于治疗和/或预防特定适应症。
如本文中使用的，术语“药物”是根据FD&C法案的定义而定义的。因而，药物定义为预期用于诊断，治愈，减轻，治疗或预防疾病的物品，以及预期影响人体或其他动物体的结构或任何功能的物品(除食品以外)。
如本文中使用的，“留置”指将组合物应用于受试者且一段时期内不去除(例如，通过洗涤，清洗而清洁，等)，典型的是区域在暴露于清洁组合物之前至少若干小时(例如，4-12小时)。
如本文中使用的，“洗净的”组合物是应用并且在其应用后立即(通常在应用后约30分钟内)清洁(例如，通过洗涤，清洗等)的组合物。在一些优选的实施方案中，配制洗净的组合物使得在受治疗的区域沉积有效量的活性成分。
如本文中使用的，术语“美容益处”指由施用个人护理组合物导致的理想的化妆改变。美容益处包括但不限于皮肤，毛发，指甲和口腔条件的改善。在优选的实施方案中，通过本发明的皮肤护理组合物，毛发护理组合物，指甲护理组合物和美容组合物来提供至少一种美容益处。
如本文中使用的，“化妆品可接受的”指适合用于与人和/或其他动物的组织接触的材料，没有不必要的毒性，不兼容性，不稳定性，刺激性，过敏型反应等，与合理的风险收益比相符。
如本文中使用的，用于指代本发明的组合物的术语“色素”，“有色色素”和“染料”涵盖了向组合物提供颜色的，和/或将颜色赋予施用组合物的表面(例如，皮肤和/或头发)的任何化合物。
术语“防辐射剂”指能够阻断或过滤UV辐射的防晒剂和防护霜的物质。
如本文中使用的，“改善皮肤的外观和/或条件”指通过使用本发明的个人护理组合物实现的任何益处。益处的实例包括但不限于降低皮肤颜色的不完美和/或瑕疵，包括增亮皮肤的过度色素沉着区域和/或均衡皮肤的着色，缓解干燥，消除粗糙，干斑，改善皮肤保水的能力和/或保护皮肤自身免受环境胁迫，降低细纹和皱纹的出现，改善外观和皮肤状态，增加皮肤紧实度和/或柔软度，减少皮肤松弛，增加皮肤光泽和透明度，增加皮肤再生过程，和/或去除皮肤毫毛。改善皮肤的视觉外观也涵盖了调控皱纹，萎缩，皮肤增白，皮肤增黑，皮肤光滑化，和/或减少可视的毛孔。在一些实施方案中，改善皮肤的外观和/或条件导致皮肤的改善，是由于用本发明的个人护理组合物治疗皮肤病导致的。
术语“血管发生”指导致生物体组织中血管的发育和/或增加的血管形成的生物学过程。
术语“血管生成性疾病”，“血管生成性功能障碍”和“血管源性皮肤病”用于指代这样的疾病，通常是作为组织中增加的血管生成的结果而产生的皮肤病或相关的功能障碍，或者是导致组织中增加的血管生成的皮肤病或相关的功能障碍。通常，血管生成性疾病的病因是未知的。然而，不论血管发生是疾病状态的实际病因，或者只是疾病状态的适应症，都是不重要的，而是在治疗或逆转疾病状态或适应症中抑制血管发生才是本发明的一个重要方面。因而，本发明并非意在限制任何特定的作用机制。适合利用本发明的化合物治疗的血管源性皮肤病的实例包括但不限于牛皮癣，痤疮，酒渣鼻，疣，湿疹，血管瘤和淋巴管生成，Sturge-Weber综合征，多发性神经纤维瘤，结节性硬化症，慢性炎性疾病和关节炎。在本文中，任何具有作为主要或次要特征的增加的血管形成的皮肤病，都被认为是血管源性皮肤病。因而，由本发明提供的包含VEGF结合性BBPI(VEGF-BBPI)的个人护理组合物可用于治疗多种血管源性皮肤病和/或适应症。
术语“酒糟鼻”用于描述特征是血管和小囊扩张的痤疮，酒糟鼻或红斑皮炎(erythematosa)，通常涉及鼻子和颊的连续部分。酒糟鼻可以在非常轻微但持续的红斑至弥漫性皮脂腺增生之间变化，后者具有深在型丘疹和脓疱，并在受影响的红斑位置伴有毛细血管扩张。该适应症也称为“肥大性酒糟鼻”或“鼻赘(rhinophyma)”，取决于适应症的严重程度。术语意在涵盖所有的不同形式的适应症。
术语“牛皮癣”用于描述特征是受限，离散和汇合的发红，银色有鳞状斑丘疹的皮肤病。虽然本发明并非意在限制任何特定的身体区域，但牛皮癣损伤典型的发生在肘，膝，头皮和躯干部。显微镜下，这些损伤展现了角化不全和表皮突延长的特征。
术语“痤疮”用于描述特征是涉及皮脂腺器官的炎性泡状，丘疹和脓疱疹的皮肤病。虽然有多种类型的痤疮，但最普遍的形式称为单纯痤疮(acne simplex)或寻常痤疮，其特征是面部，上背部和胸部的出疹，并主要由炎性基底上的黑头粉刺，囊肿，丘疹和脓疱构成。该适应症主要在青春期和青少年期发生，由过度活跃的皮脂腺器官导致，据信是受激素活性的影响的。
术语“湿疹”是用于描述皮肤的急性或慢性炎性适应症的通称，典型的是红斑，水肿，丘疹，水泡和/或结痂。这类适应症通常后继苔藓样硬化，脱皮(scaling)和偶尔出现的红斑发暗，以及不常发生的色素沉着过多。湿疹通常伴随着瘙痒和烧灼的感觉。由于皮肤内棘细胞层水肿导致形成湿疹囊泡。湿疹有时通俗的称为“皮疹(tetter)”，“干性湿疹”和“鳞屑性湿疹”。有多种湿疹的亚类，所有的都可通过根据本发明的一种或多种化合物治疗。
术语“血管瘤”指内皮细胞(排列成血管的细胞)的自我复旧的良性肿瘤。血管瘤与循环系统相连接，并充满血液。其外观取决于位置。如果位于皮肤表面，则看似成熟的草莓，如果恰好位于皮肤下，则表现为带蓝色的隆起物。有时，它们生长在内部器官中，例如肝或喉。约80％位于面部和颈部，其次最广泛的分布是肝脏。本发明的个人护理组合物意在治疗皮肤的血管瘤，即，在皮肤表面的血管瘤和恰好处于皮肤下的血管瘤。
术语“硬皮病”在本文中指特征是胶原过度沉积在皮肤或其他器官中的慢性疾病。硬皮病影响皮肤，在更严重的情况下，它可以影响血管和内脏。最明显的症状通常是皮肤的硬化和相关的疤痕形成。皮肤可以表现出变紧，发红或有鳞屑。血管也可以更可见。在所述过程中重要的参与者是转化生长因子(TGFβ)。硬皮病的皮肤变化的局部治疗不改变疾病过程，但可以改善疼痛和溃烂。
如本文中使用的，“头发护理组合物”指应用于头发提供有益性质的组合物，所述性质例如增厚，变薄，着色，脱色，清洁，养护，软化，造型等。在一些实施方案中，头发护理组合物是选自香波，护发素，去屑治疗，造型助剂，造型护发素，头发修复或治疗浆液(sera)，洗液，发膏，润发脂和化学处理的形式。在其他实施方案中，造型助剂选自喷雾，摩丝，润丝，凝胶，泡沫及其组合。在其他实施方案中，化学处理选自长效卷发，松弛剂，以及永久，半永久，临时性染色处理及其组合。
如本文中使用的，“抑制头发生长”和“头发生长的抑制”指头发长度和/或厚度的可见的减少。因而，在一些优选的实施方案中，相比未施用本发明的个人护理组合物的区域，本发明的个人护理组合物的应用提供了减少头发长度和/或厚度的益处。在一些实施方案中，观察到的头发生长和/或厚度的降低相比未处理的区域是从少于1％至多于99％的范围，而在其他实施方案中，观察到的降低是从约100％至约90％，从约90％至约80％，从约80％至约70％，从约70％至约60％，从约60％至约50％，从约50％至约40％，从约40％至约30％，从约30％至约20％，从约20％至约10％，从约10％至约1％的范围。实际上，本术语并非意在限制任何特定的百分比降低，只要所述降低是通过视觉(即，通过眼睛)或其他手段可观察到的。本术语还意在涵盖“预防头发生长”至如上述的任意程度。本术语并非意在限于完全阻止头发的生长(即，没有观察到头发的生长)。
术语“皮肤病学炎性功能障碍”或“炎性皮肤病”指与皮肤发炎相关的皮肤适应症。在一些实施方案中，炎性皮肤病是与升高水平的炎性细胞因子(例如TNFa)相关的疾病。
如本文中使用的，在一些实施方案中，术语“化合物”指包含在本发明的个人护理组合物中的BBPI。
术语“有效量”在整个说明书中用于描述根据本发明的化合物的浓度或量，所述有效量可用于产生所治疗的疾病或适应症的有利改变，例如，不论所述改变是头发生长，阻止头发生长或用于缓解疾病导致或与疾病相关的适应症。如本文中使用的，“安全和有效的量”指材料这样的量，所述量足以显著的导致施用材料的区域的阳性修饰结果，但也不导致严重的副作用的产生(以合理的风险收益比)。材料的安全和有效的量可以随待治疗的特定皮肤或其他身体部分，待治疗的受试者的年龄，待治疗的适应症的严重程度，治疗的持续期，同步治疗的本质，所使用的特定材料，所利用的特定载体等而改变。本领域技术人员能够根据所需的组合物的应用，而调整本文提供的个人护理组合物的浓度。
如本文中使用的，“活性成分”(和复数的“活性成分”)指赋予待治疗的受试者益处的组合物。例如，在一些实施方案中，本发明提供了包含经修饰的变体BBPI(例如，经修饰的变体VEGF-BBPI)的个人护理组合物，所述经修饰的变体BBPI作为“主要活性成分”在施用它的区域发挥功能而提供益处。因而，在一些实施方案中，经修饰的变体VEGF-BBPI存在于皮肤护理组合物中，并发挥治疗患血管源性皮肤病的受试者皮肤的作用。本术语并非意在限于VEGF-BBPI，因为在本发明的赋予益处的个人护理组合物中有其他组分存在。在一些实施方案中，这些其他的组分是涵盖在名称“次要活性成分”中的。主要和次要活性成分在本文中集合的称为“活性成分”。本发明提供的其他“主要活性成分”包括FGF-BBPI，TGF-BBPI和TNF-BBPI。
如本文中使用的，“维生素B3化合物”意指具有通式：
的化合物，其中，R是-CONH2(即，烟酰胺)、-COOH(即烟酸)或-CH2OH(即，烟醇)；其衍生物；和任意前述物质的盐类。
如本文中使用的，“非血管舒张性的”意指在将组合物施用于受试者的皮肤后，通常不产生可见的潮红反应的酯类。虽然可以预期，一般人群的大部分不会经历可见的潮红反应，但是此类化合物可导致肉眼不可见的血管舒张。
如本文中使用的，“类视黄醇”包括维生素A的所有天然的和/或合成的类似物，和/或在皮肤内/上具有维生素A的生物学活性的视黄醇样化合物，以及这类化合物的几何异构体和立体异构体。然而，本术语并非意在限于这类化合物，因为所述术语涵盖了维生素A的醇类(视黄醇)及其衍生物，如维生素A醛(视黄醛)，维生素A酸(视黄酸)和维生素A酯(例如，视黄醇乙酸酯，视黄醇丙酸酯和视黄醇棕榈酸酯)等。本术语还意在涵盖全反视黄酸和13-顺式视黄酸，本术语还意在涵盖被胶囊化的以及以各种形式供使用的组合物。术语“视黄醇”和“视黄醛”优选的包括全反化合物。优选的用于本发明配方的类视黄醇是全反视黄醇，在本文中通常称为“视黄醇”。
如本文中使用的，“类胡萝卜素”用于单独指代β-胡萝卜素，番茄红素，叶黄素，虾青素，玉米黄质，隐黄质，桔黄素，角黄素，胭脂树橙，β-脂蛋白-4-胡萝卜素醛，β-脂蛋白-8-胡萝卜素醛，β-脂蛋白-8-胡萝卜酸酯，及其组合。优选使用的类胡萝卜素是β-胡萝卜素，番茄红素，叶黄素，虾青素，玉米黄质，桔黄素(citranaxanthin)和角黄素。在一些实施方案中，以结晶以及配方的形式利用类胡萝卜素，包括但不限于干燥的粉末(见例如，干燥的粉末，如EP0065193所述；在此通过引入本申请作为参考)。在一些实施方案中，在番茄红素，虾青素和角黄素的情况下，优选使用含番茄红素，虾青素和角黄素的干燥粉末，例如Pink和Red(分别是番茄红素，虾青素和角黄素的10％干燥粉末，可购自BASF AG，Ludwigshafen，Germany)。
如本文中使用的，术语“分散相”是与乳状液技术领域的技术人员使用的一样，指作为小颗粒或液滴悬浮在连续相中或由连续相包围而存在的相。分散相也称为“内部”相或“非连续”相。
如本文中使用的，“渗透增强剂”指促进通过上层的角质层屏障向深层的皮肤层渗透的组合物。渗透增强剂的实例包括但不限于丙二醇，氮酮，二乙二醇(ethoxydiglycol)，二甲基异山梨醇酯，尿素，乙醇，二甲基亚砜，微型乳状液，脂质体及纳米乳状液。
如本文中使用的，术语“乳化剂”和“表面活性剂”指将分散相分散和悬浮在材料的连续相中的化合物。表面活性剂可特别用于预期进行皮肤和/或头发清洁的产物中。在特定的实施方案中，术语“表面活性剂”用于指代表面活性的试剂，不论是用作乳化剂还是其他的表面活性剂目的，例如皮肤清洁。
在各个实施方案中，本发明还包括了“保护剂”，例如UV吸收剂(例如，甲氧基肉桂酸辛酯、2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮、二氧化钛和水杨酸辛酯)；成膜剂(例如，VP/二十碳烯(Eicosene)共聚物)；药妆试剂(例如，肽和蛋白质、α羟酸，以及视黄醇和视黄酸衍生物)；抗氧化剂(例如，生育酚及其衍生物，和抗坏血酸及其衍生物)；维生素(例如，B、D、K及其衍生物)；止汗性活性成分(例如，氢氧化铝和氢氧化锆)；脱毛剂(例如，巯基乙酸盐)；抗痤疮试剂(例如，水杨酸和过氧化苯甲酰)；研磨剂和去角质剂(例如，硅酸盐、浮石和聚乙烯)；以及植物、水果、蔬菜和/或海洋资源的提取物。
如本文中使用的，术语“生物活性”指在组合物和生物学系统之间的因果关系。因而，术语由生物技术和生物科学领域的技术人员用作这样的词组，所述词组描述了在分子组合物和活的生物学物质(例如，组织、细胞等)之间的因果关系。
在本文中作为名词使用，术语“生物活性成分”指在施用于活的生物学物质(例如，组织、细胞等)后，表现出生物活性的组合物。术语与“生物活性化合物”同义使用。
如本文中使用的，“硅胶”意指高分子量的硅烷，具有平均分子量超过约200,000，优选的从约200,000至约4,000,000。该定义意在涵盖非挥发性的聚烷基或聚芳基硅氧烷胶。
如本文中使用的，“包含经修饰的变体BBPI的组合物”广义的指任何含有给定的经修饰的变体BBPI的组合物。组合物可以是任何形式，特别是适合施用的形式。
如本文中使用的，当化合物可以通过任何理想的途径(例如，局部的、口服的，等)施用于人或其他动物时，称所述化合物是“以适合施用的形式的”。
如本文中使用的，“安全和有效的量”指材料这样的量，所述量足以显著的导致施用材料的区域的阳性修饰作用，但也不导致严重的副作用的产生(以合理的风险收益比)。材料的安全和有效的量可以随待治疗的特定皮肤或其他身体部分，待治疗的受试者的年龄，待治疗的适应症的严重程度，治疗的持续期，同步治疗的性质，所使用的特定材料，所利用的特定载体等而改变。本领域技术人员能够根据所需的组合物的应用，而调整本文提供的个人护理组合物的浓度。
5.2Bowman Birk蛋白酶抑制剂支架
Bowman Birk蛋白酶抑制剂蛋白(BBPI)是动力学和结构学上得到充分表征的小蛋白质家族(60-90个残基)，并仅在单子叶和双子叶植物的种子中发现，在植物的任何其他部分都未鉴别(见例如，Birk，Int.J.Pept.Protein Res.，25：113-131[1985])。已从单子叶和双子叶植物的种子中确定并分析了许多野生型BBPI支架的序列(Prakash等，J molEvol42：560-569[1996])。它们典型的具有两个三环结构域的对称结构，每个结构域含有独立的结合环，但是一些具有1个结构域，而一些具有多于2个的结构域。从大豆中分离的主要的8kDa Bowman Birk抑制剂(BBI)具有2个分离的反应位点环，环I抑制具有胰蛋白酶样特异性的蛋白酶，环II抑制具有胰凝乳蛋白酶样特异性的蛋白酶(见例如，Chen等，J.Biol.Chem.，267：1990-1994[1992]；Werner和Wemmer，Biochem.，31：999-1010[1992]；Lin等，Eur.J.Biochem.，212：549-555[1993]；Voss等，Eur.J.Biochem.，242：122-131[1996]；和Billings等，Pro.Natl.Acad.Sci.，89：3120-3124[1992])。这些结合区各自含有“典式环(canonical loop)”结构，所述结构是可见于多种丝氨酸蛋白酶抑制剂中的基序(Bode和Huber，Eur.J.Biochem.，204：433-451[1992])。在一些实施方案中，野生型BBPI支架作为野生型前体BBPI支架发挥作用，由其衍生出变体和经修饰的变体BBPI支架。
在一些实施方案中，本发明提供了变体BBPI支架，其中胰蛋白酶(环I)和/或胰凝乳蛋白酶环(环II)被变体肽取代。在一些实施方案中，用变体肽取代胰蛋白酶环获得的变体BBPI保留了胰凝乳蛋白酶抑制活性(CIA)。在其他实施方案中，用变体肽取代胰凝乳蛋白酶环，产生保留了胰蛋白酶抑制活性(TIA)的变体BBPI。在其他实施方案中，用变体肽同时取代了BBPI的胰蛋白酶环和胰凝乳蛋白酶环。用变体肽取代了胰蛋白酶环和/或胰凝乳蛋白酶环的BBPI支架的非限制性实例包括野生型和未经修饰的变体支架。野生型前体支架的实例包括但不限于Prakash(见上文)公开的支架，例如来自大豆(Glycine max)的大豆抑制剂的支架(BBI；SEQ ID NO：13)或其成熟的和截短的形式(SEQ ID NO：185；DDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCICALSYPAQCFCVDITDFCYEPCKPSE)、来自二花扁豆(Dolichos biflorus)的抑制剂(BBdb；SEQ ID NO：449；PSESSKPCCDQCACTKSIPPQCRCTDVRLNSCHSACSSCVCTFSIPAQCVCVDMKDFCYEPCK)、来自大豆的大豆抑制剂D-II(BBsb3；SEQ IDNO：450；DDEYSKPCCDLCMCTRSMPPQCSCEDIRLNSCHSDCKSCMCTRSQPGQCRCLDTNDFCYKPCKSRDD)和来自巴西良木豆(Torresea (Amburana)cearensis)的抑制剂(BBtc；SEQ ID NO：451；SSKWEACCDRCACTKSIPPQCHCADIRLNSCHSACESCACTHSIPAQCRCFDITDFCYKPCSG)。未经修饰的变体前体支架的实例包括但不限于其中胰凝乳蛋白酶环被VEGF结合性变体序列取代的支架，所述序列包括BBI-AV(SEQ ID NO：186；DDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCACYNLYGWTCFCVDITDFCYEPCKPSEDDKEN)、BBIt-AV(SEQ ID NO：187；DDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCACYNLYGWTCFCVDITDFCYEPCKPSE)、BBdb-AV(SEQ ID NO：452；DPSESSKPCCDQCACTKSIPPQCRCTDVRLNSCHSACSSCACYNLYGWTCVCVDMKDFCYEPCK)，、BBsb3-AV(SEQ ID NO：453；DPDDEYSKPCCDLCMCTRSMPPQCSCEDIRLNSCHSDCKSCACYNLYGWTCRCLDTNDFCYKPCKSRDD)，和BBtc-AV(SEQ ID NO：454；DPSSKWEACCDRCACTKSIPPQCHCADIRLNSCHSACESCACYNLYGWTCRCFDITDFCYKPCSG)，BBIt-VEGK(SEQ ID NO：640；DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDARPNACHSACKSCACKYYLYWWCKCTDITDFCYEPCKPSE)，BBIt-VEGT(SEQ ID NO：641；DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDARPNACHSACKSCAC TLWKSYWCKCTDITDFCYEPCKPSE)和BBIt-VEGKD(SE ID NO：642；DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDARPNACHSACKSCACKYDLYWWCKCTDITDFCYEPCKPSE)。在一些实施方案中，未经修饰的变体前体支架是这样的变体支架，其中变体肽替换了野生型BBPI的胰凝乳蛋白酶环，并且还在与SEQ ID NO：187的BBPI的40位等价的位置导入了氨基酸取代。例如，SEQ ID NO：187(BBIt-AV)的未经修饰的变体BBPI支架是源自SEQ ID NO：185的野生型前体支架，通过用SEQ ID NO：9的VEGF变体肽替换SEQ ID NO：185的胰凝乳蛋白酶环，除替换胰凝乳蛋白酶环外还导入了氨基酸取代I40A。修饰SEQ IDNO：187的未经修饰的变体BBPI，产生经修饰的变体BBPI，除替换胰凝乳蛋白酶环外，还包括如下所述的至少一个氨基酸取代。
已表征了BBI的多个异构体，SEQ ID NO：13是用于一些实施方案的野生型BBI支架的氨基酸序列的实例，包含约71个氨基酸残基(见实施例1)。在一些实施方案中，本发明提供了包括原区域的BBPI支架，例如SEQ ID NO：11，同时在其他实施方案中，本发明提供了从中去除了原肽的BBI支架，例如SEQ ID NO：185。在其他实施方案中，本发明提供了从N或C末端已去除了多达10个氨基酸的BBI支架。在一些实施方案中，本发明提供了去除了多达5个氨基酸的BBI支架，例如SEQ ID NO：187。可以理解，BBI支架的截短不会破坏BBI结合靶蛋白的能力。
在大豆中，BBPI(例如BBI)是作为具有N端原肽的原蛋白质生产的，所述原肽的长度是19个氨基酸。因而，在一些实施方案中，生产的BBI是具有原肽的全部或至少一部分。在一些实施方案中，截短了BBI，从N或C端去除了多至10个的氨基酸残基。例如，一旦种子干燥，一些BBPI分子去除了C端的9或10个氨基酸残基。因而，在初始二硫键之前和紧靠最后一个二硫键之后，通常高度耐受蛋白水解，其结果对于靶蛋白的结合通常不是致命的。然而可以理解，BBPI的任意一种异构体或截短的形式都可用于本发明的各个实施方案中。在一些实施方案中，可用于本发明的截短形式的BBPI是这样的变体BBIt，用如下所述的变体序列替换了其中的胰凝乳蛋白酶环。
5.3变体BBPI
如上所述，BBPI具有抑制蛋白酶的结合环(即，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶环)。本发明提供了这样的变体BBPI，所述变体BBPI源自野生型，或源自未经修饰的变体BBPI前体支架，其中BBPI的一个或多个反应位点(例如，环I(胰蛋白酶)和/或环II(胰凝乳蛋白酶))已用结合靶蛋白的变体肽替换。由包含在本发明的BBPI中的变体肽结合的靶蛋白的非限制性实例包括各种细胞因子，包括肿瘤坏死因子家族(TNF)的细胞因子，特别是TNF-α；转化生长因子家族的细胞因子，特别是TGFβ；成纤维细胞生长因子家族(FGF)的细胞因子，特别是FGF-5，以及血管内皮生长因子家族(VEGF)的细胞因子，特别是VEGF-A。此外，替换本发明的BBPI的一个或两个环的变体肽包括与补体通路的抑制剂(例如，C2、C3、C4或C5抑制剂)、Compstatin和其他的目的蛋白相互作用的肽。实际上，本发明并非意在限于取代到任一上述环中的任何特定的序列，因为任何合适的序列都可用于本发明中。
在一些实施方案中，用结合VEGF的变体序列替换BBPI前体支架的胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶环，产生变体VEGF-BBPI蛋白。在一些实施方案中，变体BBPI源自野生型或未经修饰的变体BBPI前体支架，所述支架选自来自大豆的大豆抑制剂的支架(BBI；SEQ IDNO：13)或其成熟的和截短的形式(SEQ ID NO：185)、来自二花扁豆的抑制剂的支架(BBdb；SEQ ID NO：449)、来自大豆的大豆抑制剂D-II的支架(BBsb3；SEQ IDNO：450)、来自巴西良木豆的抑制剂的支架(BBtc；SEQ ID NO：451)、SEQ ID NO：186的BBI-AV支架、SEQ ID NO：187的BBIt-AV支架、SEQID NO：452的BBdb-AV支架、SEQ ID NO：453的BBsb3-AV支架、SEQIDNO：454的BBtc-AV支架、SEQ ID NO：640的BBIt-VEGK支架、SEQ IDNO：641的BBIt-VEGT支架和SEQ ID NO：642的BBIt-VEGKD支架。此外，任何野生型的BBPI前体支架，例如Prakash等(见上文)公开的，可用于产生变体BBPI支架。
在一些实施方案中，VEGF变体序列包括但不限于在美国系列申请号09/832,723和10/984,270中公开的VEGF 结合肽，包括肽ACYNLYGWTC(SEQ I D NO：9)KYYLYWW(SEQ IDNO：458)，TLWKSYW(SEQ ID NO：459)，DLYWW(SEQ IDNO：460)，SKHSQIT(SEQ ID NO：468)KTNPSGS(SEQ ID NO：469)RPTGHSL(SEQ ID NO：470)，KHSAKAE(SEQ ID NO：471)KPSSASS(SEQ ID NO：472)，PVTKRVH(SEQ ID NO：473)，TLHWWVT(SEQ ID NO：492)，PYKASFY(SEQIDNO：493)，PLRTSHT(SEQ ID NO：494)，EATPROT(SEQ ID NO：495)，NPLHTLS(SEQ ID NO：496)，KHERIWS(SEQ ID NO：497)，ATNPPPM(SEQ ID NO：498)，STTSPNM(SEQ ID NO：499)，ADRSFRY(SEQ ID NO：500)，PKADSKQ(SEQ IDNO：501)，PNQSH LH(SEQ ID NO：502)，SGSETWM(SEQ I D NO：503)，ALSAPYS(SEQ ID NO：504)，KMPTSKV(SEQ ID NO：505)，ITPKRPY(SEQ IDNO：506)，KWIVSET(SEQ ID NO：507)，PNANAPS(SEQ ID NO：508)，NVQSLPL(SEQ IDNO：509)，TLWPTFW(SEQ ID NO：510)，NLWPHFW(SEQ ID NO：511)，SLWPAFW(SEQ ID NO：512)，SLWPHFW(SEQ ID NO：513)，APWNSHI(SEQ ID NO：514)，APWNLHI(SEQ ID NO：515)，LPSWHLR(SEQ IDNO：516)，PTILEWY(SEQ IDNO：517)，TLYPQFW(SEQ ID NO：518)，和HLAPSAV(SEQ ID NO：519)。在一些其他实施方案中，VEGF变体序列包括但不限于在美国系列申请号11/919,717中公开的VEGF 结合肽，包括肽KYYLSWW(SEQ ID NO：520)，WYTLYKW(SEQ ID NO：521)，TYRLYWW(SEQ ID NO：522)，RYSLYYW(SEQ ID NO：523)，YYLYYWK(SEQ ID NO：524)，NYQLYGW(SEQ ID NO：525)，TKWPSYW(SEQ ID NO：226)，TLWKSYW(SEQ IDNO：527)，PLWPSYW(SEQ IDNO：528)，RLWPSYW(SEQ ID NO：529)，TLWPKYW(SEQ ID NO：530)，KYDLYWW(SEQ ID NO；531)，RYDLYWW(SEQ ID NO：532)，DYRLYWW(SEQ ID NO：533)，DYKLYWW(SEQ ID NO：534)，EYKLYWW(SEQ IDNO：535)，和RYPLYWW(SEQ ID NO：536)。
在一些实施方案中，用与FGF5相互作用的变体序列替换BBPI前体支架的胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶环，产生变体FGF-BBPI蛋白。在一些实施方案中，变体BBPI源自野生型或未经修饰的变体BBPI前体支架，所述支架选自来自大豆的大豆抑制剂的支架(BBI；SEQID NO：13)或其成熟的和截短的形式(SEQ ID NO：185)、来自二花扁豆的抑制剂(BBdb；SEQID NO：449)、来自大豆的大豆抑制剂D-II(BBsb3；SEQ ID NO：450)、来自巴西良木豆的抑制剂(BBtc；SEQ ID NO：451)、SEQ ID NO：186的BBI-AV支架、SEQ ID NO：187的BBIt-AV支架、SEQ ID NO：452的BBdb-AV支架、SEQ ID NO：453的BBsb3-AV支架、SEQ ID NO：454的BBtc-AV支架、SEQ ID NO：640的BBIt-VEGK支架、SEQ ID NO：641的BBIt-VEGT支架和SEQ ID NO：642的BBIt-VEGKD支架。此外，任何野生型BBPI前体支架，例如Prakash等(见上文)公开的，可用于产生变体BBPI支架。
在一些实施方案中，用与FGF5相互作用的变体序列替换BBPI前体支架的胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶环。在一些实施方案中，FGF5变体序列包括但不限于在美国系列申请号10/984,410和12/033,848中公开的FGF5结合肽，包括肽：CACRTQPYPLCF(MM007；SEQ ID NO：430)，CICTWIDSTPC(PS2；SEQ ID NO：431)，CYGLPFTRC(SEQ ID NO：537)，CEEIWTMLC(SEQ IDNO：538)，CWALTVKTC(SEQ ID NO：539)，CLTVLWTTC(SEQ ID NO：540)，CTLWNRSPC(SEQ IDNO：541)，CHYLLTNYC(SEQ IDNO：542)，CRIHLAHKC(SEQ ID NO：543)，TNIDSTP(SEQ ID NO：544)，HLQTTET(SEQ ID NO：545)，SLNNLTV(SEQ ID NO：546)，TNIDSTP(SEQ ID NO：547)，TNIDSTP(SEQ ID NO：548)，LRILANK(SEQ ID NO：549)，LLTPTLN(SEQ IDNO：550)，ALPTHSN(SEQ ID NO：551)，TNIDSTP(SEQ ID NO：552)，LCRRFEN(SEQ ID NO：553)，TNIDSTP(SEQ IDNO：554)，TNIDSTP(SEQ ID NO：555)，HLQTTET(SEQ ID NO：556)，PLGLCPP(SEQ ID NO：557)，GYFIPSI(SEQ IDNO：558)，TKIDSTP(SEQ ID NO：559)，HLQTTET(SEQ ID NO：560)，WNIDSTP(SEQ ID NO：561)，TWIDWTP(SEQ ID NO：562)，RTQPYPL(SEQ ID NO：670)和TWIDSTP(SEQ IDNO：671)。
在一些实施方案中，用与TGFβ相互作用的变体序列替换BBPI前体支架的胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶环，产生变体TGF-BBPI蛋白。在一些实施方案中，变体BBPI源自野生型或未经修饰的变体BBPI前体支架，所述支架选自来自大豆的大豆抑制剂的支架(BBI；SEQID NO：13)或其成熟的和截短的形式(SEQ ID NO：185)、来自二花扁豆的抑制剂的支架(BBdb；SEQ ID NO：449)、来自大豆的大豆抑制剂D-II的支架(BBsb3；SEQ ID NO：450)、来自巴西良木豆的抑制剂的支架(BBtc；SEQ IDNO：451)、SEQ ID NO：186的BBI-AV支架、SEQ IDNO：187的BBIt-AV支架、SEQ ID NO：452的BBdb-AV支架、SEQ ID NO：453的BBsb3-AV支架、SEQ ID NO：454的BBtc-AV支架、SEQ ID NO：640的BBIt-VEGK支架、SEQ ID NO：641的BBIt-VEGT支架和SEQ ID NO：642的BBIt-VEGKD支架。此外，任何野生型BBPI前体支架，例如Prakash等(见上文)公开的，可用于产生变体BBPI支架。
在一些实施方案中，用与TGFβ相互作用的变体序列替换BBPI前体支架的胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶环。在一些实施方案中，TGFβ变体序列包括但不限于在美国系列申请号10/581，142中公开的TGFβ结合肽，包括
肽：CLCPENINVLPCN(PEN3；SEQ ID NO：436)，CICKHNVDWLCF(MMO21W；SEQ ID NO：437)，CICWTQHIHNCF(WTQ；SEQ ID NO：438)，CVTTDWIEC(SEQ IDNO：563)，CYYSQFHQC(SEQ IDNO：564)，CPTLWTHMC(SEQ ID NO：565)，QSACIVYYVGRKPKVECASSD(SEQ ID NO：566)，QSACILYYIGKTPKIECASSD(SEQ ID NO：567)，QSACILYYVGRTPKVECASSD(SEQ ID NO：568)，乙酰基-LCPENDNVSPCY-cohn2(SEQ ID NO：569)，KHNVRLL(SEQ ID NO：570)，NDTPSYF(SEQ IDNO：571)，AKLYAGS(SEQ ID NO：572)，RGPAHSL(SEQ IDNO：573)，NSLAERR(SEQ ID NO：574)，HPLASPH(SEQ ID NO：575)，QPWNKLK(SEQ ID NO：576)，AWLr/Mipy(SEQ ID NO：577)，PTKPAQQ(SEQ IDNO：578)，PSLNRPQ(SEQ ID NO：579)，HHARQEW(SEQ ID NO：580)，RHHTPGP(SEQ ID NO：581)，ASAINPH(SEQ ID NO：582)，CHGYDRAPC(SEQ ID NO：644)，CFAPADQAC(SEQID NO：645)，CIPSRFITC(SEQ ID NO：646)，CHGHTKLAC(SEQID NO：647)，CNGKSKLAC(SEQ IDNO：648)，PENINVLP(SEQ ID NO；672)，KHNVDWL(SEQ ID NO：673)和WTQHI HNC(SEQ ID NO：674)。
在一些实施方案中，用与TNFα相互作用的变体序列替换BBPI前体支架的胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶环，产生变体TNF-BBPI蛋白。在一些实施方案中，变体BBPI源自野生型或未经修饰的变体BBPI前体支架，所述支架选自来自大豆的大豆抑制剂的支架(BBI；SEQID NO：13)或其成熟的和截短的形式(SEQ ID NO：185)、来自二花扁豆的抑制剂的支架(BBdb；SEQ ID NO：449)、来自大豆的大豆抑制剂D-II的支架(BBsb3；SEQ ID NO：450)、来自巴西良木豆的抑制剂的支架(BBtc；SEQ IDNO：451)、SEQ ID NO：186的BBI-AV支架、SEQ IDNO：187的BBIt-AV支架、SEQ ID NO：452的BBdb-AV支架、SEQ ID NO：453的BBsb3-AV支架、SEQ ID NO：454的BBtc-AV支架、SEQ ID NO：640的BBIt-VEGK支架、SEQ ID NO：641的BBIt-VEGT支架和SEQ ID NO：642的BBIt-VEGKD支架。此外，任何野生型BBPI前体支架，例如Prakash等(见上文)公开的，可用于产生变体BBPI支架。
在一些实施方案中，用结合TNFα的变体序列替换BBPI前体支架的胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶环。在一些实施方案中，TNFα结合序列包括但不限于在美国系列申请号10/968,732中公开的TNF结合肽，包括肽RYWQDIP(T1；SEQ ID NO：474)，APEPILA(T2；SEQ IDNO：475)，DMIMVSI(T3；SEQ ID NO：476)，WTPKPTQ(SEQ ID NO：583)，ATFPNQS(SEQ IDNO：584)，ASTVGGL(SEQ ID NO：585)，TMLPYRP(SEQ ID NO：586)，AWHSPSV(SEQ ID NO：587)，TQSFSS(SEQ ID NO：588)，THKNTLR(SEQ ID NO：589)，GQTHFHV(SEQ ID NO：590)，LPILTQT(SEQ ID NO：591)，SILPVSH(SEQ IDNO：592)，SQPIPI(SEQ ID NO：593)，和QPLRKLP(SEQ IDNO：594)。
在一些实施方案中，变体BBPI还包含肽插入物，所述肽插入物置于经修饰的变体BBPI的N端。在一些实施方案中，肽插入物包含在1至15个氨基酸之间的序列。在其他实施方案中，肽插入物包含在5至10个氨基酸之间的序列。在一些实施方案中，肽插入物包含SEQID NO：389(DDEPSKPCCDPDP；SEQ ID NO：389)的肽。包含SEQ ID NO：389的肽插入物的经修饰的变体BBPI的实例是(DDEPSKPCCDPDPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCACYNLYGWTCFCVDITDFCYEPCKPSE；SEQ ID NO：390)的经修饰的变体4D13BBIt-AV，和SEQ ID NO：413(DPDDEPSKPCCDPDPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE；SEQ ID NO：413)的经修饰的变体BBIt-AV-4D13-13I-29P-40K-50T-52A。
在一些实施方案中，变体序列是通过本领域已知的各种方法选定的，包括但不限于噬菌体展示和其他合适的筛选方法。例如，将随机的肽基因文库与噬菌体PIII基因融合，使得噬菌体表面展示出肽文库。随后，将噬菌体展示文库暴露给靶蛋白，并用缓冲液洗涤以去除非特异性结合(该过程有时称为淘洗)。最后，分离结合的噬菌体，并PCR编码肽的DNA序列。
在大部分实施方案中，用变体序列替换1个环，即，长度通常为3-14个氨基酸的肽，5-10个氨基酸是优选的，产生变体BBPI。更长的序列也可用于本发明中，只要他们提供所需要的结合和/或抑制。此外，当包含在受约束的环(即，通过2个半胱氨酸残基之间存在的二硫键而形成的环)中时，适合作为结合环的替换而使用的肽优选采用有功能的构象。在一些特殊的实施方案中，肽的长度在7至9个氨基酸之间。在其他实施方案中，变体序列是长度为10个氨基酸的肽。
5.4经修饰的变体BBPI蛋白
5.4.1经修饰的变体BBPI：单个氨基酸取代
在一些实施方案中，本发明提供了经修饰的变体BBPI，所述经修饰的变体BBPI是在BBPI的骨架中进一步包含至少一个氨基酸取代的变体BBPI。因而，在一些实施方案中，经修饰的变体BBPI是含有替换了胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶环的结合靶蛋白的变体序列的变体BBPI，并且还通过在替换环的C端和/或N端包含至少一个氨基酸取代而进一步改变。因而，在一些实施方案中，经修饰的变体BBPI是在5.4节中描述的变体BBPI，所述变体BBPI中的胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶环已被变体肽替换，且还在至少一个位置包含取代的氨基酸，所述位置是与选自SEQ IDNO：187的1、4、5、11、13、18、25、27、29、31、38、40、50、52、55和65位等价的位置，如5.4节所述。
如果与特定的残基同源(即，在一级结构中的位置对应)，则经修饰的变体BBPI的氨基酸残基是处于与前体BBPI的残基位置等价的位置上。为了确立一级结构的同源性，将前体BBPI的氨基酸序列与一级氨基酸序列直接比较，特别是与在序列已知的BBPI中已知是保守的半胱氨酸残基的组合相比。图17显示了在示例性野生型和本文所述的变体前体BBPI之间保守的半胱氨酸残基。对本发明的经修饰的变体BBPI中被取代的等价残基进行编号。
前体BBPI可以是天然存在的BBPI或变体BBPI。特别的，此类经修饰的变体BBPI具有未见于自然界中的氨基酸序列，所述序列源自对前体BBPI的胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶环的替换，和源自用不同氨基酸对前体BBPI的至少一个氨基酸残基的替换。在一些实施方案中，至少一个氨基酸的替换产生了经修饰的变体BBPI，其具有比未经修饰的变体前体BBPI更大的蛋白酶抑制活性。在其他实施方案中，至少一个氨基酸的取代产生了经修饰的变体BBPI，其具有比未经修饰的变体前体BBPI更大的蛋白酶抑制活性和产量。
因而，经修饰的变体BBPI是源自对本文所述的任一个变体BBPI支架的骨架中至少一个氨基酸的取代。在一些实施方案中，分离的经修饰的变体Bowman Birk蛋白酶抑制剂(BBPI)含有替换了BBPI支架的胰凝乳蛋白酶环的变体肽，还在至少一个氨基酸位置包含取代的氨基酸，所述位置是选自与SEQ ID NO：187的变体BBPI的1、4、5、11、13、18、25、27、29、31、38、40、50、52、55和65位等价的位置。在其他实施方案中，分离的经修饰的变体BowmanBirk蛋白酶抑制剂(BBPI)含有替换了BBPI支架的胰蛋白酶环的变体肽，还在至少一个氨基酸位置包含取代的氨基酸，所述位置是选自与SEQ ID NO：187的变体BBPI的1、4、5、11、13、18、25、27、29、31、38、40、50、52、55和65位等价的位置。在其他实施方案中，分离的经修饰的变体Bowman Birk蛋白酶抑制剂(BBPI)含有替换了BBPI支架的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶环的变体肽，还在至少一个氨基酸位置包含取代的氨基酸，所述位置是与SEQ ID NO：187的变体BBPI的1、4、5、11、13、18、25、27、29、31、38、40、50、52、55和65位等价的位置。在一些实施方案中，BBPI支架选自来自大豆的大豆抑制剂的支架(BBI；SEQ ID NO：13)或其成熟的和截短的形式(SEQ ID NO：185)、来自二花扁豆的抑制剂的支架(BBdb；SEQ ID NO：449)、来自大豆的大豆抑制剂D-II的支架(BBsb3；SEQ IDNO：450)、来自巴西良木豆的抑制剂的支架(BBtc；SEQ ID NO：451)、SEQID NO：186的BBI-AV支架、SEQ ID NO：187的BBIt-AV支架、SEQID NO：452的BBdb-AV支架、SEQ ID NO：453的BBsb3-AV支架、SEQ ID NO：454的BBtc-AV支架、SEQ ID NO：640的BBIt-VEGK支架、SEQ ID NO：641的BBIt-VEGT支架和SEQ ID NO：642的BBIt-VEGKD支架。在一些实施方案中，包含在经修饰的变体BBPI中的变体肽选自VEGF结合肽、FGF-5结合肽、TGFβ结合肽和TNFα结合肽。在一些实施方案中，VEGF结合序列包括但不限于在美国系列申请号09/832,723和10/984,270中公开的VEGF结合肽，包括肽ACYNLYGWTC(SEQ ID NO：9)，KYYLYWW(SEQ ID NO：458)，TLWKSYW(SEQ ID NO：459)，DLYWW(SEQ IDNO：460)，SKHSQIT(SEQ ID NO：468)KTNPSGS(SEQ ID NO：469)RPTGHSL(SEQ ID NO：470)，KHSAKAE(SEQ ID NO：471)KPSSASS(SEQ ID NO：472)，PVTKRVH(SEQ ID NO：473)，TLHWWVT(SEQ ID NO：492)，PYKASFY(SEQ IDNO：493)，PLRTSHT(SEQ ID NO：494)，EATPROT(SEQ IDNO：495)，NPLHTLS(SEQ ID NO：496)，KHERIWS(SEQ ID NO：497)，ATNPPPM(SEQ ID NO：498)，STTSPNM(SEQ ID NO：499)，ADRSFRY(SEQ ID NO：500)，PKADSKQ(SEQ IDNO：501)，PNQSHLH(SEQ ID NO：502)，SGSETWM(SEQ ID NO：503)，ALSAPYS(SEQ ID NO：504)，KMPTSKV(SEQ IDNO：505)，ITPKRPY(SEQ ID NO：506)，KWIVSET(SEQ ID NO：507)，PNANAPS(SEQ ID NO：508)，NVQSLPL(SEQ IDNO：509)，TLWPTFW(SEQ ID NO：510)，NLWPHFW(SEQ ID NO：511)，SLWPAFW(SEQ ID NO：512)，SLWPHFW(SEQ ID NO：513)，APWNSHI(SEQ ID NO：514)，APWNLHI(SEQ IDNO：515)，LPSWHLR(SEQ ID NO：516)，PTILEWY(SEQ IDNO：517)，TLYPQFW(SEQ ID NO：518)，和HLAPSAV(SEQ ID NO：519)。在一些其他的实施方案中，VEGF变体序列包括但不限于在美国系列申请号11/919,717中公开的VEGF结合肽包括肽：KYYLSWW(SEQ ID NO：520)，WYTLYKW(SEQ ID NO：521)，TYRLYWW(SEQ ID NO：522)，RYSLYYW(SEQ ID NO：523)，YYLYYWK(SEQ IDNO：524)，NYQLYGW(SEQ ID NO：525)，TKWPSYW(SEQ ID NO：226)，TLWKSYW(SEQ IDNO：527)，PLWPSYW(SEQ ID NO：528)，RLWPSYW(SEQ ID NO：529)，TLWPKYW(SEQ ID NO：530)，KYDLYWW(SEQ ID NO；531)，RYDLYWW(SEQ ID NO：532)，DYRLYWW(SEQ ID NO：533)，DYKLYWW(SEQ IDNO：534)，EYKLYWW(SEQ IDNO：535)，和RYPLYWW(SEQ ID NO：536)。
在其他实施方案中，FGF5结合序列包括但不限于在美国系列申请号10/984,410和12/033,848中公开的FGF5结合肽，包括肽CACRTQPYPLCF(MM007；SEQ ID NO：430)，CICTWIDSTPC(PS2；SEQ ID NO：431)，CYGLPFTRC(SEQ ID NO：537)，CEEIWTMLC(SEQ ID NO：538)，CWALTVKTC(SEQ ID NO：539)，CLTVLWTTC(SEQ ID NO：540)，CTLWNRSPC(SEQ ID NO：541)，CHYLLTNYC(SEQ IDNO：542)，CRIHLAHKC(SEQ ID NO：543)，TNIDSTP(SEQ ID NO：544)，HLQTTET(SEQ ID NO：545)，SLNNLTV(SEQ ID NO：546)，TNIDSTP(SEQ ID NO：547)，TNIDSTP(SEQ ID NO：548)，LRILANK(SEQ ID NO：549)，LLTPTLN(SEQ IDNO：550)，ALPTHSN(SEQ IDNO：551)，TNIDSTP(SEQ ID NO：552)，LCRRFEN(SEQ ID NO：553)，TNIDSTP(SEQ ID NO：554)，TNIDSTP(SEQ ID NO：555)，HLQTTET(SEQ ID NO：556)，PLGLCPP(SEQ ID NO：557)，GYFIPSI(SEQ IDNO：558)，TKIDSTP(SEQ ID NO：559)，HLQTTET(SEQ ID NO：560)，WNIDSTP(SEQ IDNO：561)，TWIDWTP(SEQ ID NO：562)，RTQPYPL(SEQ ID NO：670)和TWIDSTP(SEQ ID NO：671)。
在其他实施方案中，变体肽是选自TGFβ结合序列的TGFβ结合肽，包括但不限于在美国系列申请号10/581,142中公开的TGFβ结合肽，包括肽：CLCPENINVLPCN(PEN3；SEQ IDNO：436)，CICKHNVDWLCF(MMO21W；SEQ ID NO：437)，CICWTQHIHNCF(WTQ；SEQ ID NO：438)，CVTTDWIEC(SEQ IDNO：563)，CYYSQFHQC(SEQ ID NO：564)，CPTLWTHMC(SEQ ID NO：565)，QSACIVYYVGRKPKVECASSD(SEQ ID NO：566)，QSACILYYIGKTPKIECASSD(SEQ ID NO：567)，QSACILYYVGRTPKVECASSD(SEQ ID NO：568)，乙酰基-LCPENDNVSPCY-cohn2(SEQ ID NO：569)，KHNVRLL(SEQ ID NO：570)，NDTPSYF(SEQ ID NO：571)，AKLYAGS(SEQ ID NO：572)，RGPAHSL(SEQ IDNO：573)，NSLAERR(SEQ ID NO：574)，HPLASPH(SEQ ID NO：575)，QPWNKLK(SEQ ID NO：576)，AWLr/Mipy(SEQ ID NO：577)，PTKPAQQ(SEQ IDNO：578)，PSLNRPQ(SEQ IDNO：579)，HHARQEW(SEQ ID NO：580)，RHHTPGP(SEQ ID NO：581)，ASAINPH(SEQ ID NO：582)，CHGYDRAPC(SEQ ID NO：644)，CFAPADQAC(SEQ ID NO：645)，CIPSRFITC(SEQ ID NO：646)，CHGHTKLAC(SEQID NO：647)，CNGKSKLAC(SEQ ID NO：648)，PENINVLP(SEQ ID NO；672)，KHNVDWL(SEQ ID NO：673)和WTQHIHNC(SEQ ID NO：674)。
在其他实施方案中，变体肽是选自TNFα结合序列的TNFα结合肽，包括但不限于在美国系列申请号10/968,732中公开的TNF结合肽，包括肽RYWQDIP(T1；SEQ ID NO：474)，APEPILA(T2；SEQ ID NO：475)，DMIMVSI(T3；SEQ ID NO：476)，WTPKPTQ(SEQ ID NO：583)，ATFPNQS(SEQ ID NO：584)，ASTVGGL(SEQ ID NO：585)，TMLPYRP(SEQ ID NO：586)，AWHSPSV(SEQ IDNO：587)，TQSFSS(SEQ ID NO：588)，THKNTLR(SEQ ID NO：589)，GQTHFHV(SEQ IDNO：590)，LPILTQT(SEQ ID NO：591)，SILPVSH(SEQ ID NO：592)，SQPIPI(SEQ ID NO：593)，和QPLRKLP(SEQ ID NO：594)。
在一些实施方案中，在至少一个位置上所含有的至少一个氨基酸取代导致了下列取代的氨基酸，其中所述位置选自与SEQ ID NO：187的1、4、5、11、13、18、25、27、29、31、38、40、50、52、55和65位等价的位置。在一个实施方案中，在与SEQ ID NO：187的1位等价的氨基酸位置上的取代的氨基酸选自A和C。在另一个实施方案中，在与SEQ ID NO：187的4位等价的氨基酸位置上的取代的氨基酸是V。在另一个实施方案中，在与SEQ ID NO：187的5位等价的氨基酸位置上的取代的氨基酸选自P和A。在另一个实施方案中，在与SEQ ID NO：187的11位等价的氨基酸位置上的取代的氨基酸是G。在另一个实施方案中，在与SEQ ID NO：187的13位等价的氨基酸位置上的取代的氨基酸选自Y、I、F、M、L、V、K和R。在另一个实施方案中，在与SEQ ID NO：187的18位等价的氨基酸位置上的取代的氨基酸包括I、V和L。在另一个实施方案中，在与SEQID NO：187的25位等价的氨基酸位置上的取代的氨基酸选自K、N、W、I、A和R。在另一个实施方案中，在与SEQ ID NO：187的27位等价的氨基酸位置上的取代的氨基酸包括R、K、V、A和Q。在另一个实施方案中，在与SEQ ID NO：187的29位等价的氨基酸位置上的取代的氨基酸选自R、K和P。在另一个实施方案中，在与SEQ ID NO：187的31位等价的氨基酸位置上的取代的氨基酸选自Q、H、E、A、R、W、K和T。在另一个实施方案中，在与SEQ ID NO：187的38位等价的氨基酸位置上的取代的氨基酸选自N、K和R。在另一个实施方案中，在与SEQ ID NO：187的40位等价的氨基酸位置上的取代的氨基酸选自H、K、Q、R和Y。在另一个实施方案中，在与SEQ ID NO：187的50位等价的氨基酸位置上的取代的氨基酸选自R、Q、K、T、V、M和S。在另一个实施方案中，在与SEQ ID NO：187的52位等价的氨基酸位置上的取代的氨基酸选自K、T、R、Q、L、H、A、M、S和E。在另一个实施方案中，在与SEQ ID NO：187的55位等价的氨基酸位置上的取代的氨基酸是M。在另一个实施方案中，在与SEQ ID NO：187的65位等价的氨基酸位置上的取代的氨基酸选自E、Q和D。在一些实施方案中，在变体BBPI中制造的单个氨基酸取代导致经修饰的变体BBPI具有比未经修饰的变体BBPI前体更大的蛋白酶抑制活性。在一些实施方案中，单个氨基酸取代产生了具有比未经修饰的前体变体BBPI更大的胰蛋白酶抑制活性(TIA)的经修饰的变体BBPI；而在其他实施方案中，单个氨基酸取代产生了具有比未经修饰的前体变体BBPI更大的胰凝乳蛋白酶抑制活性(CIA)的经修饰的变体BBPI。
在一个实施方案中，经修饰的变体BBPI是SEQ ID NO：187的变体BBPI(BBIt-AV；图9)，所述变体BBPI在胰凝乳蛋白酶环的位置含有VEGF变体肽，并且进一步经修饰而在至少一个位置含有氨基酸取代，产生经修饰的变体BBPI，所述位置选自SEQ ID NO：187的1、4、5、11、13、18、25、27、29、31、38、40、50、52、55和65位。任意一个上述的且在SEQ ID NO：187的BBPI变体BBIt-AV中制造的氨基酸取代，都产生了比未经修饰的前体变体BBIt-AV(SEQ IDNO：187；见实施例10)具有更大的胰蛋白酶抑制活性的经修饰的变体BBIt-AV BBPI。
5.4.2经修饰的变体BBPI：氨基酸取代的组合
本发明涵盖了经修饰的变体BBPI，所述经修饰的变体BBPI包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个和至少16个的氨基酸取代。在一些实施方案中，所述至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个和至少16个的氨基酸取代产生了具有比未经修饰的前体变体BBPI更大的TIA的经修饰的变体BBPI。在其他实施方案中，至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个氨基酸取代产生了具有比未经修饰的前体变体BBPI更大的TIA和产量的经修饰的变体BBPI。
在一些实施方案中，经修饰的变体BBPI包含2个氨基酸取代的组合，所述氨基酸是位于与SEQ ID NO：187的50和52位等价的位置上的氨基酸。在一些实施方案中，2个氨基酸取代的组合是50T-52A。本发明提供了5.3节所述的任意一种变体BBPI支架，并且还包含如5.4节所述的2个氨基酸取代50T-52A的组合。在一个实施方案中，变体支架的胰凝乳蛋白酶环是VEGF变体肽，例如SEQ ID NO：9，而变体支架经过改变进一步包含了3个氨基酸取代的组合，所述取代是在与SEQ ID NO：187的13、50和52位等价的位置上的，产生经修饰的变体BBPI支架。在一个实施方案中，包含2个氨基酸取代的组合的经修饰的变体BBPI是SEQ IDNO：595的经修饰的变体BBIt-AV-F50T-V52A(DPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCACYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE；SEQ ID NO：595)。
在一些实施方案中，经修饰的变体BBPI包含3个氨基酸取代的组合，所述氨基酸是位于与SEQ ID NO：187的13、50和52位等价的位置上的氨基酸。在一些实施方案中，3个氨基酸取代的组合选自在位置25-50-52、29-50-52、40-50-52和13-50-52的取代的组合。在一些实施方案中，3个氨基酸取代的组合选自25L-50T-52A、29P-50T-52A、40K-50T-52A和13I-50T-52A。本发明提供了5.3节所述的任意一种变体BBPI支架，并且还包含3个氨基酸取代的组合，所述取代选自25L-50T-52A、29P-50T-52A、40K-50T-52A和13I-50T-52A，如5.4节所述。在一个实施方案中，变体支架的胰凝乳蛋白酶环是VEGF变体肽，例如SEQ ID NO：9，而变体支架经过改变进一步包含了3个氨基酸取代的组合，所述取代是在与SEQ IDNO：187的13、50和52位等价的位置上的，产生经修饰的变体BBPI支架。在一个实施方案中，包含3个氨基酸取代的组合的经修饰的变体BBPI是选自SEQ ID NO：603的经修饰的变体BBIt-AV-S25L-F50T-V52A(DPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCLDMRLNSCHSACKSCACYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE；SEQ ID NO：603)，SEQ ID NO：607的经修饰的变体BBIt-AV-L29P-F50T-V52A(DPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCACYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE；SEQ IDNO：607)，SEQ ID NO：609的经修饰的变体BBIt-AV-A40K-F50T-V52A(DPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE；SEQ IDNO：609)。
在一些实施方案中，经修饰的变体BBPI包含4个氨基酸取代的组合，所述氨基酸是位于与SEQ ID NO：187的13、29、50和52位等价的位置上的氨基酸。在一些实施方案中，4个氨基酸取代的组合选自在位置13-25-50-52、13-29-50-52、25-29-50-52、13-40-50-52、25-40-50-52和29-40-50-52的取代的组合。在一些实施方案中，4个氨基酸取代的组合选自13I-25L-50T-52A、13I-29P-50T-52A、25L-29P-50T-52A、13I-40K-50T-52A、25L-40K-50T-52A和29P-40K-50T-52A。本发明提供了5.3节所述的任意一种变体BBPI支架，并且还包含4个氨基酸取代的组合，所述取代选自13I-25L-50T-52A、13I-29P-50T-52A、25L-29P-50T-52A、13I-40K-50T-52A、25L-40K-50T-52A和29P-40K-50T-52A，如5.4节所述。在一个实施方案中，变体支架的胰凝乳蛋白酶环是VEGF变体肽，例如SEQ ID NO：9和460，而变体支架经过改变进一步包含了4个氨基酸取代的组合，所述取代是在与SEQ ID NO：187的13、29、50和52位等价的位置上的，产生经修饰的变体BBPI支架。在一个实施方案中，包含4个氨基酸取代的组合的经修饰的变体BBPI选自SEQ ID NO：596的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-S25L-F50T-V52A：(DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCLDMRLNSCHSACKSCACYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE；SEQ ID NO：596)，SEQ ID NO：600的经修饰的变体：BBIt-AV-A13I-L29P-F50T-V52A(DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCACYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE；SEQ IDNO：600)，SEQ ID NO：602的经修饰的变体：BBIt-AV-A13I-A40K-F50T-V52A(DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE；SEQ IDNO：602)，SEQ I D NO：604的经修饰的变体：BBIt-AV-S25L-L29P-F50T-V52A(DPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCLDMRPNSCHSACKSCACYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE；SEQ IDNO：604)，SEQ ID NO：606的经修饰的变体：BBIt-AV-S25L-A40K-F50T-V52A(DPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCLDMRLNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE；SEQ IDNO：606)，SEQ ID NO：608的经修饰的变体：BBIt-AV-L29P-A40K-F50T-V52A(DPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE；SEQ IDNO：608)，SEQ ID NO：643的经修饰的变体：BBIt-VEGKD-A13I-S25K-L29P-V52K (DPDDESS KPCCDQCICTKSNPPQCRCKDMRPNSCHSACKSCICKYDLYWWCFCKDITDFCYEPCKPS E；SEQ I D NO：643)。
在另一个实施方案中，变体支架的胰凝乳蛋白酶环是选自SEQ DI NO：430和431的FGF5变体肽，并且改变所述变体支架进一步包含4个氨基酸取代的组合，所述氨基酸处于与SEQ ID NO：187的13、29、50和52位等价的位置上，产生经修饰的变体BBPI支架。在一个实施方案中，包含4个氨基酸取代的组合的经修饰的变体BBPI选自SEQ ID NO：432的经修饰的变体BBIt-MM007-Q-A13I-L29P-F50T-V52A，SEQ ID NO：434的经修饰的变体BBIt-FGFps2-Q-A13I-L29P-F50T-V52A。在另一个实施方案中，变体支架的胰凝乳蛋白酶环是选自SEQ IDNO：436、437、438、672、673和674的TGFβ变体肽，并且改变所述变体支架进一步包含4个氨基酸取代的组合，所述氨基酸处于与SEQ ID NO：187的13、29、50和52位等价的位置上，产生经修饰的变体BBPI支架。在一个实施方案中，包含4个氨基酸取代的组合的经修饰的变体BBPI选自SEQ ID NO：443的经修饰的变体BBIt-PEN3-Q-A13I-L29P-F50T-V52A、SEQ ID NO：445的经修饰的变体BBIt-MM021W-Q-A13I-L29P-F50T-V52A，和SEQ ID NO：447的经修饰的变体BBIt-WTQ-Q-A13I-L29P-F50T-V52A。
在一些实施方案中，经修饰的变体BBPI包含5个氨基酸取代的组合，所述氨基酸是位于与SEQ ID NO：187的13、29、40、50和52位等价的位置上的氨基酸。在一些实施方案中，5个氨基酸取代的组合选自在位置13-25-29-50-52、13-29-40-50-52、13-25-40-50-52、25-29-40-50-52和13-29-40-50-52的取代的组合。在一些实施方案中，5个氨基酸取代的组合选自：13I-25L-29P-50T-52A，13I-29P-40K-50T-52A，13I-25L-40K-50T-52A，25L-29P-40K-50T-52A，13L-29P-40K-50T-52A，13I-29K-40K-50T-52A，13I-29P-40K-50K-52A和13I-29P-40K-50T-52T。
本发明提供了5.3节所述的任意一种变体BBPI支架，并且还包含5个氨基酸取代的组合，所述取代选自13I-25L-29P-50T-52A、13I-29P-40K-50T-52A、13I-25L-40K-50T-52A、25L-29P-40K-50T-52A、13L-29P-40K-50T-52A、13I-29K-40K-50T-52A、13I-29P-40K-50K-52A和13I-29P-40K-50T-52T，如5.4节所述。在一个实施方案中，变体支架的胰凝乳蛋白酶环是VEGF变体肽，例如SEQ ID NO：9，而变体支架经过改变进一步包含了5个氨基酸取代的组合，所述取代是在与SEQ ID NO：187的13、29、40、50和52位等价的位置上的，产生经修饰的变体BBPI支架。在一个实施方案中，包含5个氨基酸取代的组合的经修饰的变体BBPI选自SEQ ID NO：597的经修饰的变体：BBIt-AV-A13I-S25L-L29P-F50T-V52A(DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCLDMRPNSCHSACKSCACYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE；SEQ IDNO：597)，SEQ ID NO：599的经修饰的变体：BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A(DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCLDMRLNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE；SEQ IDNO：599)，SEQ ID NO：601的经修饰的变体：BBIt-AV-A13I-S25L-A40K-F50T-V52A(DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE；SEQ IDNO：601)，SEQ ID NO：605的经修饰的变体：BBIt-AV-S25L-L29P-A40K-F50T-V52A(DPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCLDMRPNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE；SEQ IDNO：605)，SEQ ID NO：615的经修饰的变体：BBIt-AV-A13L-L29P-A40K-F50T-V52A(DPDDESSKPCCDQCLCTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE；SEQ IDNO：615)，SEQ ID NO：620的经修饰的变体：BBIt-AV-A13I-L29K-A40K-F50T-V52A(DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRKNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE；SEQ IDNO：620)，SEQ ID NO：624的经修饰的变体：BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50K-V52A(DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCKCYNLYGWTCKCADITDFCYEPCKPSE；SEQ IDNO：624)，SEQ ID NO：625的经修饰的变体：BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52T(DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCTDITDFCYEPCKPSE；SEQ IDNO：625)。
在一些实施方案中，经修饰的变体BBPI包含6个氨基酸取代的组合，所述氨基酸是位于与SEQ ID NO：187的13、25、29、40、50和52位等价的位置上的氨基酸。在一些实施方案中，6个氨基酸取代的组合选自在位置13-25-29-40-50-52，1-13-29-40-50-52，4-13-29-40-50-52，5-13-29-40-50-52，11-13-29-40-50-52，13-25-29-40-50-52，13-27-29-40-50-52，13-29-31-40-50-52，13-29-31-40-50-52，13-29-38-40-50-52，和13-29-38-40-50-52的取代的组合。在一些实施方案中，6个氨基酸取代的组合选自：13I-25L-29P-40K-50T-52A，1C-13I-29P-40K-50T-52A，4V-13I-29P-40K-50T-52A，5P-13I-29P-40K-50T-52A，11G-13I-29P-40K-50T-52A，13I-25R-29P-40K-50T-52A，13I-27R-29P-40K-50T-52A，13I-29P-31A-40K-50T-52A，13I-29P-31R-40K-50T-52A，13I-29P-38N-40K-50T-52A，and 13I-29P-38N-40K-50T-52A。本发明提供了5.3节所述的任意一种变体BB PI支架，并且还包含6个氨基酸取代的组合，所述6个氨基酸的取代选自如5.4节所述：13I-25L-29P-40K-50T-52A，1C-13I-29P-40K-50T-52A，4V-13I-29P-40K-50T-52A，5P-13I-29P-40K-50T-52A，11G-13I-29P-40K-50T-52A，13I-25R-29P-40K-50T-52A，13I-27R-29P-40K-50T-52A，13I-29P-31A-40K-50T-52A，13I-29P-31R-40K-50T-52A，13I-29P-38N-40K-50T-52A，和13I-29P-38N-40K-50T-52A。在一个实施方案中，变体支架的胰凝乳蛋白酶环是VEGF变体肽，例如SEQ IDNO：9，而变体支架经过改变进一步包含了6个氨基酸取代的组合，所述取代是在与SEQ IDNO：187的13、25、29、40、50和52位等价的位置上的，产生经修饰的变体BBPI支架。在一个实施方案中，包含6个氨基酸取代的组合的经修饰的变体BBPI选自SEQ ID NO：598的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-S25L-L29P-A40K-F50T-V52A(DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCLDMRPNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE；SEQ ID NO：598)，SEQ ID NO：611的经修饰的变体BBIt-AV-D1C-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A(DPDDEVSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE；SEQ ID NO：611)，SEQ ID NO：612的经修饰的变体BBIt-AV-S4V-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A(DPDDEVSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE；SEQ ID NO：612)，SEQ ID NO：613的经修饰的变体BBIt-AV-S5P-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A(DPDDESPKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE；SEQ ID NO：613)，SEQ ID NO：614的经修饰的变体BBIt-AV-Q11G-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A(DPDDESSKPCCDGCICTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE；SEQ ID NO：614)，SEQ ID NO：616的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-S25R-L29P-A40K-F50T-V52A-(DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDMRPNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE；SEQ ID NO：616)，SEQ ID NO：619的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-M27R-L29P-A40K-F50T-V52A(DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDRRPNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE；SEQ ID NO：619)，SEQ ID NO：621的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-L29P-S31A-A40K-F50T-V52A(DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNACHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE；SEQ ID NO：621)，SEQ ID NO：622的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-L29P-S31R-A40K-F50T-V52A(DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNRCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE；SEQ ID NO：622)，SEQ ID NO：623的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-L29P-S38N-A40K-F50T-V52A(DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKNCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE；SEQID NO：623)，SEQ ID NO：626的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-L29P-S38N-A40K-F50T-V52A(DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPEE；SEQ IDNO：626)。
在一些实施方案中，经修饰的变体BBPI包含7个氨基酸取代的组合，所述氨基酸是位于与SEQ ID NO：187的13、25、29、31、40、50和52位等价的位置上的氨基酸。在一些实施方案中，7个氨基酸取代的组合选自下述位置的取代13-25-29-31-40-50-52，13-25-29-31-40-50-52，13-25-27-29-31-50-52，13-25-27-29-31-50-52，13-25-27-29-31-50-52，13-25-27-29-31-50-52，13-25-27-29-31-50-52，13-25-27-29-31-50-52，13-25-27-29-31-50-52，13-25-27-29-31-50-52，和13-25-27-29-31-50-52的组合。在一些实施方案中，7个氨基酸取代的组合选自13L-25R-29P-31A-40K-50T-52A、13L-25R-29P-31R-40K-50T-52A和13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T。本发明提供了5.3节所述的任意一种变体BBPI支架，并且还包含7个氨基酸取代的组合，所述取代选自13L-25R-29P-31A-40K-50T-52A，13L-25R-29P-31R-40K-50T-52A，13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T，13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T，13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T，13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T，13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T，13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T，13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T，13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T，和13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T，如5.4节所述。在一个实施方案中，变体支架的胰凝乳蛋白酶环是VEGF变体肽，例如SEQ ID NO：9，而变体支架经过改变进一步包含了7个氨基酸取代的组合，所述取代是在与SEQ ID NO：187的13、25、29、31、40、50和52位等价的位置上的，产生经修饰的变体BBPI支架。在一个实施方案中，包含7个氨基酸取代的组合的经修饰的变体BBPI选自SEQ ID NO：617的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-S25R-L29P-S31A-A40K-F50T-V52A(DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDMRPNACHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE；SEQ ID NO：617)，SEQ ID NO：618的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-S25R-L29P-S31R-A40K-F50T-V52A(DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDMRPNRCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE；SEQ ID NO：618)，经修饰的变体BBIt-VEGF-V1-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T SEQ ID NO：491(DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDARPNACHSACKSCACSKHSQITCKCT D I T D F C Y E P C K P S E；SEQ I D NO：491)，经修饰的变体BBIt-VEGF-V2-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T，SEQ ID NO：632(DPDDESSKPCCDQCICTK S N P P Q C RC R D A R P N A C H S A C K S C A C K T N PS G S C K C T D I T D F C Y E P CK P S E：SEQ ID NO：632)，SEQ ID NO：633的经修饰的变体BBIt-VEGF-V3-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T(D P DD E S S K P C C D Q C I C T K S N P P Q C R C RD A R P N A C H S A C K S C AC R P T G H S L C K C T D I T D F C Y E P C K PS E；SEQ I D NO：633)，SEQ ID NO：634的经修饰的变体BBIt-VEGF-V4-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A F50K-V52T(D P D D E S S K P C C D Q C I C T K S N P P Q C R C R D AR P N AC H S A C K S C A C K H S A K A E C K C T D I T D F C Y E P C K P S E；SEQ IDNO：634)，经修饰的变体BBIt-VEGF-V5-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T，SEQI D NO：635(D P D D E S S K P C C D Q C I C T K S N P P Q C R C RD A R P N A CH S A C K S C A C K P S S A S S C K C T D I T D F C Y E P C K P SE；SEQ ID NO：635)，经修饰的变体BBIt-VEGF-V6-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T，SEQ ID NO：636(D P D D E S S K P C C D Q C I C T K S N P PQ C R C R D A R P N A C H S AC K S C A C P V T K R V H C K C T D I T D F C YE P C K P S E；SEQ ID NO：636)，经修饰的变体BBIt-TNFα-T1-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T，SEQ ID NO：637(D PD D E S S K P C C D Q C I CT K S N P P Q C R C R D A R P N A C H S A C K S CA C R Y W Q D I P C K C T DI T D F C Y E P C K P S E；SEQ I D NO：637)，经修饰的变体BBIt-TNF α-T2-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T，SEQ ID NO：638(D P D D ES S K P CC D Q C I C T K S N P P Q C R C R D A R P N A C H S A C K S C A C AP E P I L AC K C T D I T D F C Y E P C K P S E；SEQ ID NO：638)，经修饰的变体BBIt-TNF α-T3-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T，SEQ ID NO：639(D PD D E S S KP C C D Q C I C T K S N P P Q C R C K D Q R P N E C H S A C K S CH C Y N L YG W T C R C Q D I T D F C Y E P C K P S E；SEQ I D NO：639)。
在一些实施方案中，经修饰的变体BBPI包含8个氨基酸取代的组合，所述氨基酸是位于与SEQ ID NO：187的13、25、27、29、31、40、50和52位等价的位置上的氨基酸。在一些实施方案中，8个氨基酸取代的组合选自在位置13-25-27-29-31-40-50-52、13-25-27-29-31-40-50-52、13-25-27-29-31-40-50-52、13-25-27-29-31-40-50-52和13-25-27-29-31-40-50-52的取代的组合。在一些实施方案中，8个氨基酸取代的组合选自13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T，13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q，13I-25K-27R-29E-31A-40H-50R-52K，13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L，和13I-25K-27Q-29P-31E-40H-50R-52Q。本发明提供了5.3节所述的任意一种变体BBPI支架，并且还包含8个氨基酸取代的组合，所述取代选自13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T、13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q、13I-25K-27R-29E-31A-40H-50R-52K、13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L和13I-25K-27Q-29P-31E-40H-50R-52Q，如5.4节所述。在一个实施方案中，变体支架的胰凝乳蛋白酶环是VEGF变体肽，例如SEQ ID NO：9，而变体支架经过改变进一步包含了8个氨基酸取代的组合，所述取代是在与SEQID NO：187的13、25、27、29、31、40、50和52位等价的位置上的，产生经修饰的变体BBPI支架。在一个实施方案中，包含8个氨基酸取代的组合的经修饰的变体BB PI是SEQ IDNO：627的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-A40H-F50K-V52T(D P D D ES S K P C C D Q C I C T K SN P P Q C R C R D A R P N A C H S A C K S C H C YN L Y G W T C K C T D I T DF C Y E P C K P S E；SEQ ID NO：627；KT8)，经修饰的变体：BBIt-AV-A13I-S25K-M27A-L29R-S31E-A40K-F50Q-V52Q，SEQ I D NO：628(D P D D E SS K PC C D Q C I C T K S N P P Q C R C K D A R R N E C H S A C K S C K C Y NL Y GW T C Q C Q D I T D F C Y E P C K P S E；SEQ ID NO：628；QQ8)，经修饰的变体BBIt-AV-A13I-S25K-M27R-L29E-S31A-A40H-F50R-V52K，SEQ ID NO：629(D P D D E S S KP C C D Q C I C T K S N P P Q C R C K D R R E N A C H S A C KS C H C Y N L YG W T C R C K D I T D F C Y E P C K P S E；SEQ I D NO：629；RK8)，经修饰的变体BBIt-AV-A13I-S25K-M27A-L29R-S31A-A40H-F50R-V52L：SEQ I D NO：630(D P D D E S SK P C C D Q C I C T K S N P P Q C R C K D A RR N A C H S A C K S C H C Y N LY G W T C R C L D I T D F C Y E P C K P SE；SEQ ID NO：630；RL8)和经修饰的变体：BBIt-AV-A13I-S25K-M27Q-L29P-S31E-A40H-F50R-V52Q：SEQ I D NO：631(D P D D E S SK P C C D Q C I C T KS N P P Q C R C K D Q R P N E C H S A C K S C H C Y N LY G W T C R C Q D I TD F C Y E P C K P S E；SEQ I D NO：631；RQ8)。
本发明还提供了经修饰的变体BBPI，所述经修饰的变体BBPI包含任意一种上述氨基酸取代的组合，并且具有比未经修饰的前体变体BBPI更大的蛋白酶抑制活性。在一些实施方案中，经修饰的变体BBPI具有比前体未经修饰的BBPI支架更大的胰蛋白酶抑制活性(TIA)，所述经修饰的变体BBPI含有变体肽替代相应的前体未经修饰的BBPI的胰凝乳蛋白酶环。在其他实施方案中，经修饰的变体BBPI具有比前体未经修饰的BBPI支架更大的胰凝乳蛋白酶抑制活性(CIA)，所述经修饰的变体BBPI含有变体肽替代相应的前体未经修饰的BBPI的胰蛋白酶环。
如实施例所示，在变体BBPI的骨架中至少一个氨基酸的取代产生了具有比未经修饰的变体BBPI更大产量的经修饰的变体BBPI。在一些实施方案中，包含2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代的组合的BBPI具有比未经修饰的前体BBPI更大的产量。因而，本发明提供了这样的经修饰的变体BBPI，所述经修饰的变体BBPI包含任意一种上述氨基酸取代的组合，并且具有比未经修饰的前体变体BBPI更大的产量(PY)。在其他实施方案中，本发明提供了这样的经修饰的变体BBPI，所述经修饰的变体BBPI包含任意一种上述氨基酸取代的组合，并且具有比未经修饰的前体变体BBPI的TIA和PY更大的胰蛋白酶抑制活性和更大的产量。
在一些实施方案中，经修饰的变体BBPI还包含位于经修饰的变体BBPI的N端的肽插入物。在一些实施方案中，肽插入物包含在1至15个氨基酸之间的序列。在其他实施方案中，肽插入物包含在5至10个氨基酸之间的序列。在一些实施方案中，肽插入物包含SEQ IDNO：389的肽(DDEPSKPCCDPDP；SEQ ID NO：389)。肽插入物是SEQ ID NO：389的经修饰的变体BBPI的实例是经修饰的变体4D13BBIt-AV(DDEPSKPCCDPDPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCACYNLYGWTCFCVDITDFCYEPCKPSE；SEQ ID NO：390)，SEQ ID NO：413的修饰变体BBIt-AV-4D 13-13I-29P-40K-50T-52A(DPDDEPSKPCCDPDPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE；SEQ ID NO：413)。
5.4.3BBPI融合蛋白
在一些实施方案中，各种经修饰的变体BBPI是作为包含催化结构域、切割位点和BBPI支架的融合蛋白表达的。催化结构域选自纤维素酶、角质酶和二硫键异构酶。在一些实施方案中，包含在BBPI融合蛋白中的催化结构域是SEQ ID NO：669的纤维素酶催化结构域DDYSVVEEHGQLSISNGELVNERGEQVQLKGMSSHGLQWYGQFVNYESMKWLRDDWGITVFRAAMYTSSGGYIDDPSVKEKVKETVEAAIDLGIYVIIDWHILSDNDPNIYKEEAKDFFDEMSELYGDYPNVIYEIANEPNGSDVTWDNQIKPYAEEVIPVIRDNDPNNIVIVGTGTWSQDVHHAADNQLADPNVMYAFHFYAGTHGQNLRDQVDYALDQGAAIFVSEWGTSAATGDGGVFLDEAQVWIDFMDERNLSWANWSLTHKDESSAALMPGANPTGGWTEAELSPSGTFVREKIRESAS(SEQ ID NO：669)。
通过蛋白酶或酸/热处理加工融合蛋白，释放经修饰的变体BBPI。在一些实施方案中，融合蛋白还包含至少一个接头序列。在一些实施方案中，接头序列选自SEQ ID NO：141-143。虽然切割融合多肽释放经修饰的变体BBPI通常是有效的，但并非必需的。作为融合蛋白表达和分泌的经修饰的变体BBPI令人惊讶的保留的它们的功能。
经修饰的变体BBPI融合蛋白是由宿主细菌细胞分别从融合多核苷酸序列表达的。此类融合多肽序列在正确的阅读框中从5’端至3’端装配，顺序为第一、第二、第三和第四多核苷酸序列。如此装配后，多核苷酸序列编码这样的“融合多肽”，所述融合多肽从它的氨基端起编码1、作为分泌序列在细菌物种中发挥功能的信号肽；2、一般从细菌物种中分泌的分泌多肽或其部分，例如纤维素酶或其部分；3、可切割的接头肽，和4、需要的多肽(例如，经修饰的变体BBPI)。在一些实施方案中，上述融合多核苷酸序列还包含了编码原肽的一部分的多核苷酸，所述原肽的一部分作为融合蛋白的第一和第二多核苷酸序列之间的间隔子发挥功能。间隔子的功能预期是增加第一和第二编码多肽之间的距离。在一些实施方案中，间隔子序列是1-10个氨基酸长。在其他实施方案中，上文定义的融合多核苷酸序列还包含了编码肽插入物的多核苷酸，所述肽插入物位于接头肽和经修饰的变体BBPI之间。在一些实施方案中，肽插入物包含在1至15个氨基酸之间的序列。在其他实施方案中，肽插入物包含在5至10个氨基酸之间的序列。在一些实施方案中，肽插入物包含SEQ ID NO：389的肽。
本领域技术人员已知各种用于融合蛋白生产的方法(见例如，美国专利5,411,873、5,429,950和5,679,543，都通过引用整合到本文中作为参考)。因而，预期任何合适的方法都可用于本发明中。
5.5Bowman Birk蛋白酶抑制剂多核苷酸
本发明对融合蛋白生产的依赖程度，取决于重组遗传学领域的常规技术。基础教科书公开了本发明中使用的一般方法，包括Sambrook等，Molecular Cloning，ALaboratoryManual(第2版，【1989】)；Kriegler，Gene Transfer and Expression：ALaboratory Manual(1990)；和Ausubel等，(编著)，Current Protocols in Molecular Biology(1994)。
本发明提供了这样的组合物，所述组合物包括使经修饰的变体BBPI能够表达的多核苷酸构建体、载体和宿主细胞。本发明的多核苷酸构建体包含启动子序列和融合多核苷酸序列，后者编码包含经修饰的变体BBPI的融合蛋白。如上所述，融合多核苷酸序列包含催化结构域、切割位点和BBPI支架。编码BBPI的天然的或合成的多核苷酸片段可以整合到多核苷酸构建体中。通过在至少一个密码子的位点饱和诱变，产生导入变体BBPI的至少一个氨基酸取代。在替代的实施方案中，至少一个氨基酸取代是由含有编码序列的DNA寡核苷酸编码的，并且所述寡核苷酸退火并连接到蛋白酶抑制剂DNA序列中。然后，分离目的DNA序列，并用于本文提供的方法中。
在一些实施方案中，本发明的多核苷酸构建体包含编码经修饰的变体BBPI的多核苷酸序列，所述经修饰的变体BBPI享有与未经修饰的前体变体BBPI的氨基酸序列至少约65％氨基酸序列同一性、至少约70％氨基酸序列同一性、至少约75％氨基酸序列同一性、至少约80％氨基酸序列同一性、至少约85％氨基酸序列同一性、至少约90％氨基酸序列同一性、至少约92％氨基酸序列同一性、至少约95％氨基酸序列同一性、至少约97％氨基酸序列同一性、至少约98％氨基酸序列同一性，和至少约99％氨基酸序列同一性，并且具有比未经修饰的前体变体BBPI更大的蛋白酶抑制活性。本发明还提供了编码经修饰的变体BBPI的多核苷酸，所述经修饰的变体BBPI包含任意一种上述的氨基酸取代的组合，并且具有比未经修饰的前体变体BBPI更大的蛋白酶抑制活性，例如胰蛋白酶抑制活性。
在一些实施方案中，本发明的多核苷酸构建体包含为了在所用的宿主细胞中表达经修饰的变体BBPI，而经过密码子优化的多核苷酸序列。由于列举了各种密码子在许多细胞中的使用的密码子用法表是本领域已知的(见例如，Nakamura等，Nucl.Acids Res.，28：292[2000])或可以方便的推断的，因此，考虑待表达的蛋白质的氨基酸序列，可以方便的设计此类核酸。
本发明还涵盖了包含编码经修饰的变体BBPI蛋白的编码序列的多核苷酸构建体，所述蛋白是通过结构上和/或功能上相似而相关的。在一些实施方案中，经修饰的变体BBPI是源自属于不同的属和/或种的天然存在的BBPI。在一些实施方案中，从相同的种提供相关蛋白。实际上，本发明并非意在限于任何特定来源的相关蛋白。此外，术语“相关蛋白”涵盖了三级结构同源物和一级序列同源物。例如，本发明涵盖了这样的同源物，包括但不限于例如Prakash等(J mol Evol 42：560-569[1996])描述的BBPI蛋白。
在一些实施方案中，包含在本发明的多核苷酸构建体中的启动子序列与BBPI编码多核苷酸有效连接。示例性的启动子包括组成型启动子和诱导型启动子。此类启动子是本领域技术人员普遍已知的。本领域技术人员也了解，可以通过替换、取代、添加或消除一个或多个核苷酸而不改变启动子的功能，来经修饰天然的启动子。本发明的实践涵盖但不限于对启动子的此类改变。用于遗传构建体中的启动子的选择是落入本领域熟练的技术人员的知识范围内的。
在一些实施方案中，可以从细菌来源获得启动子序列。在一些实施方案中，可以从革兰氏阳性菌中获得启动子序列，例如芽孢杆菌菌株(例如嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacilluslautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis))；或者链霉菌属菌株(例如，浅青紫链霉菌(Streptomyces lividan)或鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus))；或者来自革兰氏阴性细菌(例如，大肠杆菌(E.coli)或假单胞菌属物种(Pseudomonas))。
启动子可以是在选定的宿主生物体中具有转录活性的任何DNA序列，并可以源自与宿主生物体同源或异源的基因。可用于在细菌宿主中表达经修饰的变体BBPI的合适的启动子的实例包括但不限于大肠杆菌的lac操纵子的启动子、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)琼脂糖酶基因dagA启动子、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)的启动子、枯草芽孢杆菌的aprE启动子、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因(amyM)的启动子、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)的启动子、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子，以及源自乳球菌属物种(Lactococcus sp.)来源启动子的启动子，包括Pl70启动子。当编码化合物的基因在细菌物种(例如，大肠杆菌)中表达时，可以选自合适的启动子，例如，来自噬菌体启动子，包括T7启动子和噬菌体λ启动子。为了在真菌物种中转录，有效的启动子的实例是源自编码以下产物的基因的启动子：米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米黑根霉(Rhizomucor miehei)天门冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(A.niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定的α-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米黑根霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶和够巢曲霉(A.nidulans)乙酰胺酶。用于在酵母物种中表达的合适启动子的实例包括但不限于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的Gal1和Gal10启动子，和毕赤酵母(Pichia pastoris)的AOX1或AOX2启动子。
本发明还涵盖了这样的启动子，所述启动子相比相应的野生型启动子的活性，已经经突变而增加了启动子的活性，导致经修饰的变体BBPI蛋白的表达。因而，可以理解，定义枯草芽孢杆菌AprE启动子的序列变体可用于本发明的构建体中。在芽孢杆菌属中创制启动子变体的方法是本领域普遍已知的(见例如，Helmann等，2002.RNA polymerase andsigma factors，第289-312页，在A.L.Sonenshein，J.A.Hoch和R.Losick(编著)，Bacillussubtilis and its closest relatives：from genes to cells.American Society forMicrobiology，Washington，D.C.中)。本发明并非意在限于任何特定的启动子，本领域技术人员已知的任何合适的启动子都可用于本发明中。
在实施方案中，除启动子序列外，多核苷酸构建体还在结构基因的下游含有转录终止子，提供有效的终止。在一些实施方案中，终止子是从与启动子序列相同的基因中获得的，而在其它实施方案中，是从另一个基因获得的。合适的转录终止信号的选择是本领域技术人员普遍已知的。
5.6Bowman Birk蛋白酶抑制剂载体
本发明提供了包含本发明的多核苷酸构建体的载体。将载体导入宿主细胞中表达本发明的经修饰的变体BBPI蛋白。可以使用任何载体，只要它在所导入的细胞中是可复制的和可行的。大量合适的载体和启动子是本领域技术人员已知的，并且是可商购的。适当的克隆和表达载体还描述在本领域技术人员已知的各种参考文献中(见例如，Sambrook等，见上文和Ausubel等，见上文，明确通过引用整合到本文中作为参考)。通过任何合适的方法，将适当的BBPI编码性DNA序列插入到质粒或载体(在本文中统称为“载体”)中。一般而言，通过本领域技术人员已知的标准程序，将DNA序列插入到适当的限制性内切酶位点中。
适当的载体典型的配置了可选择的标志物编码核酸序列、插入位点和合适的控制元件，例如终止序列。在一些实施方案中，载体包含与编码序列有效连接的调控序列，包括例如控制元件(即，启动子和终止子元件，或5’和/或3’非翻译区)，所述控制元件对编码序列在宿主细胞中(和/或在载体或宿主细胞环境中，在所述环境中，经修饰的可溶性蛋白编码序列不能正常的表达)的表达是有效的。大量的合适载体和启动子是本领域技术人员已知的，其中许多是可商购的并且是本领域技术人员已知的。正确的可选择标志物的挑选取决于宿主细胞。对于不同的细菌宿主，适当的标志物是本领域普遍已知的。典型的可选择标志物基因编码(a)产生对抗生素或其他毒素(例如，青霉素、氨甲喋呤、四环素、新霉素、麦考酚酸、嘌呤霉素、zeomycin或潮霉素)的耐受性的蛋白；或(b)补充宿主菌株的营养缺陷型突变或天然存在的营养缺陷的蛋白。
在一些实施方案中，融合BBPI多肽的表达是一份或多份拷贝的相应融合多肽-编码多核苷酸的表达的结果，所述多核苷酸存在于已导入到宿主细胞中的多拷贝/复制性质粒上。在一些实施方案中，载体是多拷贝/复制性质粒载体，在宿主细胞中形成表达融合BBPI蛋白的染色体外自我复制的遗传元件。典型的，载体是质粒载体，所述载体携带可选择标志物基因，允许方便的选择含有所述质粒的宿主细胞。在宿主细胞中自主复制的载体包括这样的载体，所述载体包含复制起点，使载体能够在芽孢杆菌细胞中自主复制。细菌的复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌中复制的质粒pUB110、pC194、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。复制起点可以是具有突变的复制起点，使它在芽孢杆菌细胞中温度敏感的发挥功能(见例如，Ehrlich，Proceedings of the National Academyof Sciences USA 75：1433[1978])。可用于本发明的其他的细菌表达载体包括噬菌体λ和M13，和融合表达系统，例如MBP、GST和LaZ。在其他实施方案中，为了提供方便的分离方法，向重组蛋白添加表位标签(例如，c-myc)。
在一些实施方案中，从至少一份拷贝的BBPI融合蛋白-编码多核苷酸的表达，获得BBPI融合多肽的表达，所述多核苷酸整合到宿主细胞的基因组中。因而，在一些实施方案中，本发明提供了整合到整合载体中的BBPI编码多核苷酸构建体。因而，当所述载体导入到宿主细胞中时，就整合到基因组中，并随其整合的基因组一起复制。多个拷贝的BBPI基因可以在若干位置整合到宿主细胞的基因组中。可选的，可以通过单交换事件将可扩增表达盒整合到基因组中，其中所述可扩增表达盒携带了编码BBPI融合蛋白和可选择标志物(例如，抗菌剂耐受性标志物，如编码氯霉素乙酰转移酶的基因)的序列，然后，通过用递增浓度的适当抗菌剂(例如，氯霉素)活化(challenging)转化的宿主细胞，进行扩增。
5.7Bowman Birk蛋白酶抑制剂宿主细胞
在一个实施方案中，本发明提供了用包含编码经修饰的变体BBPI的多核苷酸序列的表达载体转化的宿主细胞。在将表达载体导入宿主细胞之后，在有利于编码目的BBPI融合蛋白的基因表达的条件下培养转化的宿主细胞。可以如上所述培养大批量的转化细胞。最后，使用本领域已知的技术从培养物中回收产物。
用于将DNA导入芽孢杆菌细胞的方法是普遍已知的，所述方法涉及质粒构建和将质粒转化到细菌宿主细胞中。在一些实施方案中，依次从大肠杆菌中分离出质粒，并转化到芽孢杆菌中。然而，使用中间微生物(intervening microorganism)例如大肠杆菌并不是必需的，在一些实施方案中，将DNA构建体或载体直接导入芽孢杆菌宿主中。本领域技术人员熟知用于将多核苷酸序列导入芽孢杆菌细胞中的方法(见例如，Ferrari等，“Genetics，”inHarwood等，(编著)，Bacillus，Plenum PublishingCorp.[1989]，第57-72页；Saunders等，J.Bacteriol.，157：718-726[1984]；Hoch等，J.Bacteriol.，93：1925-1937[1967]；Mann等，CurrentMicrobiol.，13：131-135[1986]；和Holubova，Folia Microbiol.，30：97[1985]；Chang等，Mol.Gen.Genet.，168：11-115[1979]；Vorobjeva等，FEMS Microbiol.Lett.，7：261-263[1980]；Smith等，Appl.Env.Microbiol.，51：634[1986]；Fisher等，Arch.Microbiol.，139：213-217[1981]；和McDonald，J.Gen.Microbiol.，130：203[1984])。实际上，方法例如转化，包括原生质体转化和中板集合(congression)、转导和原生质体融合是已知的，并且适合用于本发明中。转化的方法特别优选的用于将本发明的DNA构建体导入宿主细胞中。
除常规使用的方法外，在一些实施方案中，直接转化宿主细胞(即，在导入宿主细胞之前，不使用中间细胞扩增或者加工DNA构建体)。将DNA构建体导入宿主细胞包括本领域已知的物理和化学方法，所述方法在不插入质粒或载体中的条件下，将DNA导入到宿主细胞中。此类方法包括但不限于电穿孔、裸露的DNA插入或脂质体等。在其他的实施方案中，DNA构建体是与质粒共转的，没有插入到质粒中。在其他实施方案中，通过本领域已知的方法，从改变的芽孢杆菌菌株中删除选择性标志物(见例如，Stahl等，J.Bacteriol.，158：411-418[1984]；Palmeros等，Gene 247：255-264[2000])。
本领域已知用于转化芽孢杆菌的方法包括这样的方法，如质粒标志物RESCUE转化，涉及携带部分同源的固有质粒(resident plasmid)的感受态细胞对供体质粒的摄取(Contente等，Plasmid 2：555-571[1979]；Haima等，Mol.Gen.Genet.，223：185-191[1990]；Weinrauch等，J.Bacteriol.，154：1077-1087[1983]；和Weinrauch等，J.Bacteriol.，169：1205-1211[1987])。在该方法中，进入的供体质粒与驻留“辅助”质粒的同源区域在模拟染色体转化的过程中重组。
涉及通过原生质体转化的其他转化方法是本领域普遍已知的(见例如，Chang和Cohen，Mol.Gen.Genet.，168：111-115[1979]；Vorobjeva等，FEMS Microbiol.Lett.，7：261-263[1980]；Smith等，Appl.Env.Microbiol.，51：634[1986]；Fisher等，Arch.Microbiol.，139：213-217[1981]；McDonald[1984]J.Gen.Microbiol.，130：203[1984]；和Bakhiet等，49：577[1985])。此外，Mann等(Mann等，Curr.Microbiol.，13：131-135[1986])描述了芽孢杆菌原生质体的转化，Holubova(Holubova，Microbiol.，30：97[1985])描述了使用含DNA的脂质体，将DNA导入到原生质体中的方法。在一些实施方案中，为了表示目标基因是否存在于宿主细胞中，使用了标识物基因。在一些实施方案中，包含在本发明的载体中的BBPI融合多核苷酸序列编码具有SEQ ID NO：195的BBPI融合蛋白。除这些方法外，在其他实施方案中，直接转化宿主细胞。在“直接转化”中，不使用中间细胞来扩增或者加工在导入宿主(即，芽孢杆菌)细胞之前的经修饰的多核苷酸。经修饰的多核苷酸向宿主细胞中的导入包括本领域已知的那些物理的和化学的方法，用于在不插入到质粒或载体的条件下，将经修饰的多核苷酸导入到宿主细胞中。此类方法包括但不限于使用感受态细胞，以及使用“人工手段”，例如氯化钙沉淀、电穿孔等，来将DNA导入到细胞中。因而，本发明可以使用裸露的DNA、脂质体等。
合适的细菌宿主生物体的实例是革兰氏阳性物种，包括但不限于芽孢杆菌属的成员，芽孢杆菌科(例如，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌)；链霉菌物种(例如，鼠灰链霉菌(S.murinus)和浅青紫链霉菌(S.lividans))；乳酸细菌(例如，乳球菌属，如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)；乳杆菌属(Lactobacillus spp.)，包括路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)；明串珠菌属(Leuconostoc spp.)；片球菌属(Pediococcusspp.)和链球菌属(Streptococcus spp.))。可选的，属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)(例如，E.coli)的革兰氏阴性物种的菌株或假单胞菌科(Pseudomonadaceae)的成员也可用于本发明中。
在一些实施方案中，合适的酵母宿主生物体选自多种生物技术上有效的酵母物种，包括但不限于毕赤酵母属(Pichia sp.)、汉逊酵母属(Hansenula sp.)或克鲁维酵母(Kluyveromyces)、Yarrowinia、酿酒酵母(Saccharomyces)(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、裂殖酵母(Schizosaccharomyce)(例如，粟酒裂殖酵母(S.pombe))。在一些实施方案中，将甲基营养型酵母物种巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)用作宿主生物体，而在其他实施方案中，宿主生物体是汉逊酵母物种。在丝状真菌中，合适的宿主生物体包括曲霉的物种(例如，黑曲霉、米曲霉、A.tubigensis、泡盛曲霉(A.awamori)和构巢曲霉)。可选的，镰刀菌霉(Fusarium)物种(例如，尖孢镰刀菌霉(F.oxysporum))和根霉属(Rhizomucor)(例如，米黑根霉)可用作宿主生物体。其他合适的菌株包括但不限于嗜热真菌(Thermomyces)和毛霉菌属(Mucor)物种。
辅助蛋白例如巯基-二硫键氧化还原酶或分子伴侣可用于一些实施方案中，因为它们对帮助分泌蛋白折叠成其活性构型是有益的。巯基-二硫键氧化还原酶和蛋白质二硫键异构酶催化蛋白质中正确的二硫键形成。bdbDC操纵子在枯草芽孢杆菌中的过表达已表现出有益于具有二硫键的蛋白质的生产(见例如，Meima等，J.Biol.Chem.，277：6994-7001，[2002])。分子伴侣通过结合在未折叠状态下暴露的疏水区和阻止不利的相互作用，帮助分泌性蛋白质折叠，脯氨酰-肽基顺反异构酶帮助靠近脯氨酸残基的肽链的正确构象的形成。
在本发明的一个实施方案中，用编码至少一种巯基-二硫键氧化还原酶或分子伴侣的表达载体转化宿主细胞。本发明并非意在限于任意特定的巯基-二硫键氧化还原酶或分子伴侣，本领域技术人员已知的任何合适的巯基-二硫键氧化还原酶或分子伴侣都可用于本发明中。
在本发明的一些实施方案中，如下文所述，通过向生长培养基中添加还原/氧化二硫键的化学品，和/或改变常规的氧化还原电势的化学品，和/或添加改变溶剂性质的化学品，从而影响蛋白质构象和聚集，来增加正确折叠的分泌蛋白的分数。在特别优选的实施方案中，优选用还原二硫键的试剂，如2-巯基乙醇(βME)，来增加正确折叠的蛋白质的分数。然而，在其他实施方案中且取决于所用的培养基，其他二硫键还原或氧化试剂(例如，DTT、TCEP、还原和氧化的谷胱甘肽、半胱氨酸、胱氨酸、半胱胺、巯基乙酸盐、S2O3 2-、S2O4 2-、S2O5 2-、SO3 2-、S2O7 2-、Cu+，等)也可单独或组合的用于本发明中。可以预期，改变溶剂性质的其他辅助剂(例如，尿素、DMSO、等)单独添加或优选的与二硫键还原/氧化试剂(例如βME)组合添加到生长培养基中，也可以增加正确折叠的分泌蛋白的分数，并可用于本发明的多个实施方案中。在一些优选的实施方案中，BME使用的浓度范围是从0.5至4mM，而在其他实施方案中，浓度范围是从0.1mM至10mM。实际上，本领域技术人员已知如何选择最佳的生长培养基和生长条件，来优化所添加的巯基还原/氧化试剂和/或其他辅助剂的效果，以及巯基还原/氧化试剂和/或所使用的其他辅助剂的浓度。本发明并非意在限于任何特定的二硫键还原/氧化试剂或辅助剂，因为本领域技术人员已知的任何合适试剂都可用于本发明中。
5.7.1发酵参数
本发明依赖于培养细菌物种的发酵程序。通过细菌物种生产异源蛋白质的发酵程序是本领域普遍已知的。在包含含水矿物盐培养基、有机生长因子、碳源和能量源的材料、分子氧(对于好氧和兼性细菌)的生长培养基中实现培养，并且理所当然的，使用一种或多种特定待应用的微生物物种的起始接种物。
除碳源和能源、氧、可同化的氮和微生物的接种物外，必需提供合适量的正确比例的矿物营养，保证正确的微生物生长，在微生物转化过程中将细胞的碳源和能源的同化作用最大化，并用发酵培养基中最大的细胞密度来实现最大的细胞产量。
可用于本发明的各种培养基是本领域技术人员已知的。然而，标准的细菌培养基可用于本发明中。在一些优选的培养基配方中，除氮以外，培养基包括以合适的可溶性可同化离子和结合形式的合适量的磷、镁、钙、钾、硫和钠，还应该优选存在某些痕量元素，例如铜、锰、钼、锌、铁、硼和碘等，仍然以合适的可溶性可同化的形式，都是本领域已知的。
在一些实施方案中，发酵反应涉及好氧的过程，其中需要的分子氧是由含分子氧的气体供应的，例如空气、富氧空气，甚至基本纯的分子氧，以提供维持发酵容器的内容物具有合适的氧分压，有效帮助微生物物种以旺盛的形式生长。实际上，通过使用氧化的碳水化合物底物，降低了微生物生长所需的氧。无论如何，分子氧必须供应好氧生物的生长，可以较低的程度供应兼性生物的生长。
虽然通气速率可以在广泛的范围内改变，但通常进行通气的速率范围仍在约0.5-10以内，优选0.5-7，单位是每分钟发酵罐中的单位液体体积的含氧气体的体积(在所用压力和25℃下)。上述量是基于供应给反应器的普通氧含量的空气，在纯氧的情况下，各范围应为每分钟发酵罐中的单位液体体积的约0.1-1.7，或优选约0.1-1.3的氧体积(在所用压力和25℃下)。
用于微生物转化过程的压力范围可以很广。压力一般在约0至50psig，优选0至30psig的范围内，更优选至少轻微的高于大气压，只要实现了仪器和运行成本与氧的溶解度的平衡。大于大气压是有利的，这样的压力确实倾向于增加含水发酵物中的溶解氧浓度，反过来帮助增加细胞生长速率。与此同时，这也与这样的事实相平衡，即高的气压确实增加了仪器和运行成本。
发酵温度可以略微变化，但对于本发明使用的大部分细菌物种而言，温度一般落入约20℃至40℃的范围内，优选一般在约28℃至37℃的范围内，取决于选定的微生物菌株，如本领域技术人员已知的。
微生物还需要可同化的氮。可同化的氮源可以是任何含氮化合物，或能够释放适合微生物代谢利用的形式的氮的化合物。可以使用多种有机氮源化合物，例如蛋白质水解产物，同时通常也可以利用便宜的含氮化合物，例如铵、氢氧化铵、尿素和各种铵盐，如磷酸铵、硫酸铵、焦磷酸铵、氯化铵或各种其他的铵化合物。氨气本身对大规模操作是方便的，可以通过从含水发酵物(发酵培养基)中以合适的量鼓气泡来施用。与此同时，还可以施用此类铵帮助pH控制。
含水微生物发酵物(发酵混合物)的pH范围应该在约2.0至8.0的示例性范围内。然而，对某些微生物最优的pH范围在一定程度上取决于所使用的培养基，以及特定的微生物，因而随着培养基的改变而进行一定程度的改变对本领域技术人员是已知的。
发酵罐中的发酵混合物的平均滞留时间可以相当程度的改变，部分取决于所使用的发酵温度和培养物，如本领域已知的。
在一些实施方案中，发酵优选的以这样的方式进行，即可以控制含碳底物作为限制性因子，从而提供含碳底物向细胞的良好转化，且避免大量未转化底物对细胞的污染。使用水溶性底物时，后者不是问题，因为任何剩余的痕量物质都是可以方便移除的。然而，在水不溶性底物的情况下这可能是一个问题，并且需要添加产物处理步骤，例如合适的水洗步骤。达到该限制性底物水平所需的时间不是关键的，可随特定的微生物和进行发酵的过程而改变。然而，本领域普遍已知如何确定发酵培养基中的碳源浓度，以及确定是否达到了理想的碳源水平。
虽然在一些实施方案中，发酵是按分批的或连续操作来进行的，但通常分批补料操作是优选的，因为易于控制、生产均一量的产物，以及最经济的使用所有仪器。
如果需要，可以在将含水矿物培养基投入发酵罐之前，向含水矿物培养基中添加部分或全部的碳源和能源材料，和/或部分的可同化氮源(例如铵)。实际上，优选的以预定的速率，或者响应通过监控而可确定的需求，来控制各种导入反应器中的液流，所述监控例如碳底物和能量底物的浓度、pH、溶解的氧、发酵罐的尾气中的氧或二氧化碳、可通过光的透光度来测量的细胞密度等。可以改变各种材料的加料速率，从而获得尽可能快速的、与碳源和能源的有效利用一致的细胞生长速率，和获得相对于底物消耗尽可能高的微生物细胞产量，但更重要的是获得每单位体积的最高的目的蛋白生产。
在分批操作，或优选的分批补料操作中，将所有的仪器、反应器或发酵手段、器皿或容器、移液、伴随循环或冷却装置等初始消毒，通常通过使用例如约121℃的蒸汽至少约15分钟进行。然后在存在所有需要的营养物的条件下，用选定的微生物的培养物接种消毒的反应器，所述营养物包括氧和含碳底物。所使用的发酵器的类型不是关键的，但是在一些实施方案中，15L Biolafitte(Saint-Germain-en-Laye，France)是优选的。
5.8蛋白质分离
在一些实施方案中，用编码经修饰的蛋白酶的多核苷酸序列转化的宿主细胞培养在适合表达和从细胞培养物中回收所编码的蛋白质的条件下。由重组宿主细胞生产的蛋白质分泌到培养基中，所述蛋白质包含本发明的融合BBPI。在一些实施方案中，回收所分泌的融合BBPI。
在一些实施方案中，本发明提供了从蛋白质的融合类似物中分离目的蛋白质的方法。可以预期，本文所述方法可用于从融合类似物中分离经修饰的变体BBPI。
还可以使用本领域技术人员已知的的程序实现从发酵液体培养基中收集和纯化目的融合BBPI蛋白。发酵液体培养基一般含有细胞残渣，包括细胞、各种悬浮的固体和其他生物质污染物，以及目的蛋白质产物，所述蛋白质产物优选是通过本领域已知的手段从发酵液体培养基中移出。用于此类移出的合适方法包括常规的固液分离技术(例如，离心、过滤、透析、微滤、旋转真空过滤或其他已知的方法)，产生无细胞的滤液。在一些实施方案中，优选的在纯化和/或结晶过程之前，进一步浓缩发酵液体培养基或无细胞滤液，使用例如超滤、蒸发和/或沉淀的技术。
可以通过盐(例如，硫酸铵)或低pH(典型的低于3)的手段，实现上清液或滤液蛋白组分的沉淀，然后通过多种层析程序(例如，离子交换层析、亲和层析、疏水相互作用层析、疏水电导层析等)或类似的本领域认可的程序进行纯化。本发明并非意在限于任何特定的分离方法，因其可以预期，任何方法都可用于本发明。
在某些优选的实施方案中，当从细菌细胞分泌所表达的目的多肽时，从生长培养基中纯化所述多肽。在优选的实施方案中，在纯化多肽前从培养基中移出表达宿主细胞(例如，通过离心)。
当表达的重组目的多肽不从宿主细胞中分泌时，优选的作为纯化的第一阶段，破裂宿主细胞，并将多肽释放到含水“提取物”中。优选的，在细胞破裂前，从培养基中收集表达的宿主细胞(例如，通过离心)。可以通过使用本领域已知的任何合适的手段实施细胞破裂，例如溶菌酶或β-葡聚糖酶消化，或强迫细胞通过高压(见例如，Scobes，Protein Purification，第二版，Springer-Verlag)。
在一些实施方案中，其他重组构建包括向编码经修饰的变体BBPI多肽结构域的核苷酸序列添加利于纯化的结构域，所述结构域促进可溶性蛋白质的纯化(Kroll DJ等，(1993)DNA Cell Biol 12：441-53)。在一些实施方案中，向经修饰的变体BBPI的C端添加6个组氨酸残基(即，“His标签”)，用作目的蛋白质及其融合类似物的纯化的帮助。His标签用作纯化帮助是本领域普遍已知的(见例如，Hengen，TIBS 20：285-286[1995])。本领域技术人员已知，使用固定的金属离子亲和层析(IMAC)可简单的纯化6x His标签的蛋白质。其他利于纯化的结构域包括但不限于金属螯合肽，如允许在固定的金属上纯化的组氨酸-色氨酸模块(Porath J(1992)Protein Expr Purif 3：263-281)、允许在固定的免疫球蛋白上纯化的蛋白A结构域，和在FLAGS延伸/亲和纯化系统(Immunex Corp，Seattle WA)中利用的结构域。在纯化结构域和异源蛋白质之间包括可切割的接头序列，例如因子XA或肠激酶(Invitrogen，San Diego CA)，也可用于促进纯化。
因而，任何适合回收本发明的融合BBPI的方法都可用于本发明。实际上，本发明并非意在限于任何特定的纯化方法。
对于一些应用，使用本发明生产的蛋白酶抑制剂是高度纯化的(例如，具有高于99％的纯度)具有极大的重要性。无论何时，当目的蛋白质是用作治疗剂时这就是特别重要的，但对于其他应用也是必需的。本文所述的方法提供了生产基本纯的目的蛋白质的方式。本文所述的目的蛋白质在药物和个人护理组合物中是有用的。然而，可以预期，使用本发明的方法可以生产具有不同纯度水平的蛋白质，而使用本发明生产的蛋白质并非意在限于任何特定的纯度水平。
5.8.1在纯化过程中激活BBPI：蛋白酶抑制活性
在本发明的一些实施方案中，在纯化工艺的过程中生长之后，通过添加化学品增加蛋白质的活性，即蛋白酶抑制活性，所述化学品还原/氧化二硫键，和/或改变常规氧化还原电势，和/或所述化学品改变溶剂性质，从而影响蛋白质构象和聚集。在一些特别优选的实施方案中，还原二硫键的试剂的添加是用于增加蛋白质的活性的，例如2-巯基乙醇。然而，如本领域技术人员理解的，根据纯度和缓冲液组成，单独或组合的使用其他二硫键还原或氧化试剂(例如，DTT、TCEP、还原和氧化的谷胱甘肽、半胱氨酸、胱氨酸、半胱胺、巯基乙酸盐、S2O3 2-、S2O4 2-、S2O5 2-、SO3 2-、S2O7 2-、Cu+、蛋白质二硫键异构酶、蛋白质巯基-二硫键氧化还原酶，等)，也可用于本发明中。在纯化工艺的过程中，改变溶剂性质的其他辅助剂(例如，乙醇胺、DMSO、精氨酸、尿素，等)是单独添加，或优选与二硫键还原/氧化试剂(例如βME)组合添加，通过增加蛋白质的活性，也可用于本发明中。在某些优选的实施方案中，部分纯化的蛋白质在缓冲液中稀释(在一些特别优选的实施方案中，碱性pH的含的两性离子缓冲液)，并用βME和二硫键氧化试剂(在可选的优选实施方案中，氧化的谷胱甘肽或亚硫酸钠)激活。
此外，可以预期，为了确定BBPI蛋白的最优激活，在需要时可以筛选所述条件。例如，为了确定用于所用表达系统的最优条件，测试各种βME浓度(0.1-10mM)、氧化试剂浓度(0至1/20至20倍的βME浓度)、pH(7.5-9.5)、温度(15-40℃)、稀释度(1-20倍)、孵育时间(12-72h)、充气(在惰性气体下孵育至孵育在含氧气体的充分混合下)、缓冲液类型(Tris、CHES、CAPS、Tricine、TAPS、其他两性离子缓冲液，等)、缓冲液浓度(0.1-1M)和各种辅助剂的添加，所述辅助剂已知改变溶剂性质从而影响蛋白质构象和聚集(例如，乙醇胺、DMSO、精氨酸、尿素，等)。本发明并非意在限于任何特定的二硫键还原/氧化试剂、稀释度、温度、pH、缓冲液类型或组成或辅助剂，因本领域技术人员已知的任何合适试剂都可用于本发明。
通过测量未经修饰的变体BBPI蛋白酶抑制活性的增加，监控巯基还原剂和/或氧化剂对BBPI的最优激活。胰蛋白酶抑制活性是在变体BBPI中测定的蛋白酶抑制活性，所述变体BBPI中胰凝乳蛋白酶环已被变体肽替换，而胰凝乳蛋白酶抑制活性是在下述变体BBPI中测定的蛋白酶抑制活性，所述变体BBPI中胰蛋白酶环已被变体肽替换。在一些实施方案中，测定至少一个氨基酸取代对经修饰的BBPI的胰蛋白酶抑制活性的影响，并与未经修饰的前体BBPI的胰蛋白酶抑制活性相比较。
在一些实施方案中，包含至少一个氨基酸取代的经修饰的变体BBPI具有比未经修饰的前体BBPI更大的胰蛋白酶抑制活性。在一些实施方案中，产生具有比未经修饰的前体更大的TIA的经修饰的变体BBPI的单个氨基酸取代选自这样的位置，所述位置是与SEQ IDNO：187的1、4、5、11、13、18、25、27、29、31、38、40、50、52、55和65位等价的位置，获得下列取代的氨基酸。在一个实施方案中，在与SEQ ID NO：187的1位等价的氨基酸位置上的取代的氨基酸选自A和C。在另一个实施方案中，在与SEQ ID NO：187的4位等价的氨基酸位置上的取代的氨基酸是V。在另一个实施方案中，在与SEQ ID NO：187的5位等价的氨基酸位置上的取代的氨基酸选自P和A。在另一个实施方案中，在与SEQ ID NO：187的11位等价的氨基酸位置上的取代的氨基酸是G。在另一个实施方案中，在与SEQ ID NO：187的13位等价的氨基酸位置上的取代的氨基酸选自Y、I、F、M、L、V、K和R。在另一个实施方案中，在与SEQ ID NO：187的18位等价的氨基酸位置上的取代的氨基酸包括I、V和L。在另一个实施方案中，在与SEQID NO：187的25位等价的氨基酸位置上的取代的氨基酸选自K、N、W、I、A和R。在另一个实施方案中，在与SEQ ID NO：187的27位等价的氨基酸位置上的取代的氨基酸包括R、K、V、A和Q。在另一个实施方案中，在与SEQ ID NO：187的29位等价的氨基酸位置上的取代的氨基酸包括R、K和P。在另一个实施方案中，在与SEQ ID NO：187的31位等价的氨基酸位置上的取代的氨基酸选自Q、H、E、A、R、W、K和T。在另一个实施方案中，在与SEQ ID NO：187的38位等价的氨基酸位置上的取代的氨基酸选自N、K和R。在另一个实施方案中，在与SEQID NO：187的40位等价的氨基酸位置上的取代的氨基酸选自H、K、Q、R和Y。在另一个实施方案中，在与SEQ IDNO：187的50位等价的氨基酸位置上的取代的氨基酸选自R、Q、K、T、V、M和S。在另一个实施方案中，在与SEQ ID NO：187的52位等价的氨基酸位置上的取代的氨基酸选自K、T、R、Q、L、H、A、M、S和E。在另一个实施方案中，在与SEQ ID NO：187的55位等价的氨基酸位置上的取代的氨基酸是M。在另一个实施方案中，在与SEQ ID NO：187的65位等价的氨基酸位置上的取代的氨基酸选自E、Q和D。
在一些实施方案中，具有比相应的前体未经修饰的BBPI更大的TIA和PY的经修饰的变体BBPI都包含2个氨基酸取代的组合，所述氨基酸是位于与SEQ ID NO：187的50和52位等价的位置上的氨基酸。在一些实施方案中，2个氨基酸取代的组合是50T-52A。本发明提供了5.3节所述的任意一种变体BBPI支架，并且还包含2个氨基酸取代的组合50T-52A，如5.4节所述。在一个实施方案中，变体支架的胰凝乳蛋白酶环是VEGF变体肽，例如SEQ ID NO：9，而变体支架经过改变进一步包含了3个氨基酸取代的组合，所述取代是在与SEQ ID NO：187的13、50和52位等价的位置上的，产生经修饰的变体BBPI支架。在一个实施方案中，包含2个氨基酸取代的组合的经修饰的变体BBPI是SEQ ID NO：595的经修饰的变体BBIt-AV-F50T-V52A。
在一些实施方案中，具有比相应的前体未经修饰的BBPI更大的TIA和PY的经修饰的变体BBPI都包含3个氨基酸取代的组合，所述氨基酸是位于与SEQ ID NO：187的13、50和52位等价的位置上的氨基酸。在一些实施方案中，3个氨基酸取代的组合选自在位置25-50-52、29-50-52、40-50-52和13-50-52的取代的组合。在一些实施方案中，3个氨基酸取代的组合选自25L-50T-52A、29P-50T-52A、40K-50T-52A和13I-50T-52A。本发明提供了5.3节所述的任意一种变体BBPI支架，并且还包含3个氨基酸取代的组合，所述取代选自25L-50T-52A、29P-50T-52A、40K-50T-52A和13I-50T-52A，如5.4节所述。在一个实施方案中，变体支架的胰凝乳蛋白酶环是VEGF变体肽，例如SEQ ID NO：9，而变体支架经过改变进一步包含了3个氨基酸取代的组合，所述取代是在与SEQ ID NO：187的13、50和52位等价的位置上的，产生经修饰的变体BBPI支架。在一个实施方案中，包含3个氨基酸取代的组合的经修饰的变体BBPI是SEQ ID NO：603的经修饰的变体BBIt-AV-S25L-F50T-V52A、SEQ ID NO：607的经修饰的变体BBIt-AV-L29P-F50T-V52A，和SEQ ID NO：609的经修饰的变体BBIt-AV-A40K-F50T-V52A。
在一些实施方案中，具有比相应的前体未经修饰的BBPI更大的TIA和PY的经修饰的变体BBPI都包含4个氨基酸取代的组合，所述氨基酸是位于与SEQ ID NO：187的13、29、50和52位等价的位置上的氨基酸。在一些实施方案中，4个氨基酸取代的组合选自在位置13-25-50-52、13-29-50-52、25-29-50-52、13-40-50-52、25-40-50-52和29-40-50-52的取代的组合。在一些实施方案中，4个氨基酸取代的组合选自13I-25L-50T-52A、13I-29P-50T-52A、25L-29P-50T-52A、13I-40K-50T-52A、25L-40K-50T-52A和29P-40K-50T-52A。本发明提供了5.3节所述的任意一种变体BBPI支架，并且还包含4个氨基酸取代的组合，所述取代选自13I-25L-50T-52A、13I-29P-50T-52A、25L-29P-50T-52A、13I-40K-50T-52A、25L-40K-50T-52A和29P-40K-50T-52A，如5.4节所述。在一个实施方案中，变体支架的胰凝乳蛋白酶环是VEGF变体肽，选自SEQ ID NO：9和460，而变体支架经过改变进一步包含了4个氨基酸取代的组合，所述取代是在与SEQ ID NO：187的13、29、50和52位等价的位置上的，产生经修饰的变体BBPI支架。在一个实施方案中，包含4个氨基酸取代的组合的经修饰的变体BBPI选自SEQID NO：596的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-S25L-F50T-V52A、SEQ ID NO：600的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-L29P-F50T-V52A、SEQ ID NO：602的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-A40K-F50T-V52A、SEQ ID NO：604的经修饰的变体BBIt-AV-S25L-L29P-F50T-V52A、SEQ ID NO：606的经修饰的变体BBIt-AV-S25L-A40K-F50T-V52A、SEQ ID NO：608的经修饰的变体BBIt-AV-L29P-A40K-F50T-V52A，和SEQ ID NO：643的经修饰的变体BBIt-VEGKD-A13I-S25K-L29P-V52K。在另一个实施方案中，变体支架的胰凝乳蛋白酶环是选自SEQ DI NO：433和434的FGF5变体肽，并且改变所述变体支架进一步包含4个氨基酸取代的组合，所述氨基酸处于与SEQ ID NO：187的13、29、50和52位等价的位置上，产生经修饰的变体BBPI支架。在一个实施方案中，包含4个氨基酸取代的组合的经修饰的变体BBPI选自SEQ ID NO：432的经修饰的变体BBIt-MM007-Q-A13I-L29P-F50T-V52A，SEQ ID NO：434的经修饰的变体BBIt-FGFps2-Q-A13I-L29P-F50T-V52A。在另一个实施方案中，变体支架的胰凝乳蛋白酶环是选自SEQ IDNO：436、437和438的TGFβ变体肽，并且改变所述变体支架进一步包含4个氨基酸取代的组合，所述氨基酸处于与SEQ ID NO：187的13、29、50和52位等价的位置上，产生经修饰的变体BBPI支架。在一个实施方案中，包含4个氨基酸取代的组合的经修饰的变体BBPI选自SEQ IDNO：443的经修饰的变体BBIt-PEN3-Q-A13I-L29P-F50T-V52A、SEQ ID NO：445的经修饰的变体BBIt-MM021W-Q-A13I-L29P-F50T-V52A，和SEQ ID NO：447的经修饰的变体BBIt-WTQ-Q-A13I-L29P-F50T-V52A。
在一些实施方案中，具有比相应的前体未经修饰的BBPI更大的TIA的经修饰的变体BBPI都包含5个氨基酸取代的组合，所述氨基酸是位于与SEQ ID NO：187的13、29、40、50和52位等价的位置上的氨基酸。在一些实施方案中，5个氨基酸取代的组合选自在位置13-25-29-50-52、13-29-40-50-52、13-25-40-50-52、25-29-40-50-52、13-29-40-50-52、13-29-40-50-52、13-29-40-50-52和13-29-40-50-52的取代的组合。在一些实施方案中，5个氨基酸取代的组合选自13I-25L-29P-50T-52A、13I-29P-40K-50T-52A、13I-25L-40K-50T-52A、25L-29P-40K-50T-52A、13L-29P-40K-50T-52A、13I-29K-40K-50T-52A、13I-29P-40K-50K-52A和13I-29P-40K-50T-52T。本发明提供了5.3节所述的任意一种变体BBPI支架，并且还包含5个氨基酸取代的组合，所述取代选自13I-25L-29P-50T-52A、13I-29P-40K-50T-52A、13I-25L-40K-50T-52A、25L-29P-40K-50T-52A、13L-29P-40K-50T-52A、13I-29K-40K-50T-52A、13I-29P-40K-50K-52A和13I-29P-40K-50T-52T，如5.4节所述。在一个实施方案中，变体支架的胰凝乳蛋白酶环是VEGF变体肽，例如SEQ IDNO：9，而变体支架经过改变进一步包含了5个氨基酸取代的组合，所述取代是在与SEQ ID NO：187的13、29、40、50和52位等价的位置上的，产生经修饰的变体BBPI支架。在一个实施方案中，包含5个氨基酸取代的组合的经修饰的变体BBPI是SEQ ID NO：597的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-S25L-L29P-F50T-V52A、SEQ ID NO：599的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A、SEQ ID NO：601的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-S25L-A40K-F50T-V52A、SEQ ID NO：605的经修饰的变体BBIt-AV-S25L-L29P-A40K-F50T-V52A、SEQ ID NO：615的经修饰的变体BBIt-AV-A13L-L29P-A40K-F50T-V52A、SEQ ID NO：620的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-L29K-A40K-F50T-V52A、SEQ ID NO：624的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50K-V52A，和SEQ ID NO：625的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52T。
在一些实施方案中，具有比相应的前体未经修饰的BBPI更大的TIA的经修饰的变体BBPI包含6个氨基酸取代的组合，所述氨基酸是位于与SEQ ID NO：187的13、25、29、40、50和52位等价的位置上的氨基酸。在一些实施方案中，6个氨基酸取代的组合选自在下述位置的取代的组合：13-25-29-40-50-52，1-13-29-40-50-52，4-13-29-40-50-52，5-13-29-40-50-52，11-13-29-40-50-52，13-25-29-40-50-52，13-27-29-40-50-52，13-29-31-40-50-52，13-29-31-40-50-52，13-29-38-40-50-52，he 13-29-38-40-50-52。在一些实施方案中，6个氨基酸取代的组合选自13I-25L-29P-40K-50T-52A，1C-13I-29P-40K-50T-52A，4V-13I-29P-40K-50T-52A，5P-13I-29P-40K-50T-52A，11G-13I-29P-40K-50T-52A，13I-25R-29P-40K-50T-52A，13I-27R-29P-40K-50T-52A，13I-29P-31A-40K-50T-52A，13I-29P-31R-40K-50T-52A，13I-29P-38N-40K-50T-52A，和13I-29P-38N-40K-50T-52A。本发明提供了5.3节所述的任意一种变体BB PI支架，并且还包含6个氨基酸取代的组合，所述取代选自13I-25L-29P-40K-50T-52A，1C-13I-29P-40K-50T-52A，4V-13I-29P-40K-50T-52A，5P-13I-29P-40K-50T-52A，11G-13I-29P-40K-50T-52A，13I-25R-29P-40K-50T-52A，13I-27R-29P-40K-50T-52A，13I-29P-31A-40K-50T-52A，13I-29P-31R-40K-50T-52A，13I-29P-38N-40K-50T-52A，和13I-29P-38N-40K-50T-52A，如5.4节所述。在一个实施方案中，变体支架的胰凝乳蛋白酶环是VEGF变体肽，例如SEQ ID NO：9，而变体支架经过改变进一步包含了6个氨基酸取代的组合，所述取代是在与SEQ IDNO：187的13、25、29、40、50和52位等价的位置上的，产生经修饰的变体BBPI支架。在一个实施方案中，包含6个氨基酸取代的组合的经修饰的变体BBPI选自SEQ ID NO：598的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-S25L-L29P-A40K-F50T-V52A、SEQ ID NO：611的经修饰的变体BBIt-AV-D1C-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A、SEQ ID NO：612的经修饰的变体BBIt-AV-S4V-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A、SEQ ID NO：613的经修饰的变体BBIt-AV-S5P-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A、SEQ IDNO：614的经修饰的变体BBIt-AV-Q11G-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A、SEQ ID NO：616的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-S25R-L29P-A40K-F50T-V52A、SEQ ID NO：619的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-M27R-L29P-A40K-F50T-V52A、SEQ ID NO：621的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-L29P-S31A-A40K-F50T-V52A、SEQ IDNO：622的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-L29P-S31R-A40K-F50T-V52A、SEQ ID NO：623的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-L29P-S38N-A40K-F50T-V52A，和SEQ ID NO：626的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-L29P-S38N-A40K-F50T-V52A。
在一些实施方案中，具有比相应的前体未经修饰的BBPI更大的TIA的经修饰的变体BBPI都包含7个氨基酸取代的组合，所述氨基酸是位于与SEQ ID NO：187的13、25、29、31、40、50和52位等价的位置上的氨基酸。在一些实施方案中，7个氨基酸取代的组合选自在位置13-25-29-31-40-50-52，13-25-29-31-40-50-52，13-25-27-29-31-50-52，13-25-27-29-31-50-52，13-25-27-29-31-50-52，13-25-27-29-31-50-52，13-25-27-29-31-50-52，13-25-27-29-31-50-52，13-25-27-29-31-50-52，13-25-27-29-31-50-52，和13-25-27-29-31-50-52的取代的组合。在一些实施方案中，7个氨基酸取代的组合选自：13L-25R-29P-31A-40K-50T-52A，13L-25R-29P-31R-40K-50T-52A，13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T，13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T，13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T，13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T，13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T，13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T，13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T，13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T，和13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T。本发明提供了5.3节所述的任意一种变体BBPI支架，并且还包含7个氨基酸取代的组合，所述取代选自如5.4节所述的下述取代：13L-25R-29P-31A-40K-50T-52A，13L-25R-29P-31R-40K-50T-52A，13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T，13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T，13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T，13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T，13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T，13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T，13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T，13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T，和13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T。在一个实施方案中，变体支架的胰凝乳蛋白酶环是SEQID NO：9的VEGF变体肽，而变体支架经过改变进一步包含了7个氨基酸取代的组合，所述取代是在与SEQ ID NO：187的13、25、29、31、40、50和52位等价的位置上的，产生经修饰的变体BBPI支架。在一个实施方案中，包含7个氨基酸取代的组合的经修饰的变体BBPI是SEQIDNO：617的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-S25R-L29P-S31A-A40K-F50T-V52A、SEQ ID NO：618的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-S25R-L29P-S31R-A40K-F50T-V52A、SEQID NO：491的经修饰的变体BBIt-VEGF-V1-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T、SEQIDNO：632的经修饰的变体BBIt-VEGF-V2-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T、SEQIDNO：633的经修饰的变体BBIt-VEGF-V3-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T、SEQIDNO：634的经修饰的变体BBIt-VEGF-V4-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T、SEQIDNO：635的经修饰的变体BBIt-VEGF-V5-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T、SEQIDNO：636的经修饰的变体BBIt-VEGF-V6-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T、SEQIDNO：637的经修饰的变体BBIt-TNFα-T1-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T、SEQIDNO：638的经修饰的变体BBIt-TNFα-T2-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T，和SEQIDNO：639的经修饰的变体BBIt-TNFα-T3-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T。
在一些实施方案中，具有比相应的前体未经修饰的BBPI更大的TIA的经修饰的变体BBPI都包含8个氨基酸取代的组合，所述氨基酸是位于与SEQ ID NO：187的13、25、27、29、31、40、50和52位等价的位置上的氨基酸。在一些实施方案中，8个氨基酸取代的组合选自在下述位置的取代的组合：13-25-27-29-31-40-50-52，13-25-27-29-31-40-50-52，13-25-27-29-31-40-50-52，13-25-27-29-31-40-50-52，and 13-25-27-29-31-40-50-52。在一些实施方案中，所述8个氨基酸取代的组合选自下述
的组合：13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T，13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q，13I-25K-27R-29E-31A-40H-50R-52K，13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L，和13I-25K-27Q-29P-31E-40H-50R-52Q。本发明提供了5.3节所述的任意一种变体BBPI支架，并且还包含8个氨基酸取代的组合，该取代选自13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T，13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q，13I-25K-27R-29E-31A-40H-50R-52K，13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L，和13I-25K-27Q-29P-31E-40H-50R-52Q，如5.4节所述。在一个实施方案中，变体支架的胰凝乳蛋白酶环是VEGF变体肽，例如SEQ ID NO：9，而变体支架经过改变进一步包含了8个氨基酸取代的组合，所述取代是在与SEQ ID NO：187的13、25、27、29、31、40、50和52位等价的位置上的，产生经修饰的变体BBPI支架。在一个实施方案中，包含8个氨基酸取代的组合的经修饰的变体BBPI是SEQ ID NO：627的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-A40H-F50K-V52T、SEQIDNO：628的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-S25K-M27A-L29R-S31E-A40K-F50Q-V52Q、SEQIDNO：629的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-S25K-M27R-L29E-S31A-A40H-F50R-V52K、SEQIDNO：630的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-S25K-M27A-L29R-S31A-A40H-F50R-V52L，和SEQIDNO：631的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-S25K-M27Q-L29P-S31E-A40H-F50R-V52Q。
在一些实施方案中，具有比相应的前体未经修饰的BBPI更大的TIA的经修饰的变体BBPI都还包含肽插入物，所述肽插入物位于经修饰的变体BBPI的N端。在一些实施方案中，肽插入物包含在1至15个氨基酸之间的序列。在其他实施方案中，肽插入物包含在5至10个氨基酸之间的序列。在一些实施方案中，肽插入物包含SEQ ID NO：389的肽(DDEPSKPCCDPDP；SEQ ID NO：389)。肽插入物是SEQ ID NO：389的经修饰的变体BBPI的实例是SEQ ID NO：390的经修饰的变体4D13BBIt-AV(DDEPSKPCCDPDPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCACYNLYGWTCFCVDITDFCYEPCKPSE；SEQ ID NO：390)和SEQ ID NO：413的经修饰的变体BBIt-AV-4D13-13I-29P-40K-50T-52A。
胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶抑制活性增强的一种测量可以根据当相比未经修饰的变体BBPI时，在经修饰的变体BBPI中的酶活性比(即BCE∶BBPI)的增加来确定。BCE∶BBPI酶活性比是BBPI蛋白酶抑制活性(例如，胰蛋白酶抑制活性)与BCE(即，纤维素酶酶活性)的比例。未经修饰的变体BBPI的比例定为值1。经修饰的变体BBPI的比例等于或大于1表示经修饰的变体BBPI具有比未经修饰的前体BBPI更大的蛋白酶抑制活性，例如，胰蛋白酶抑制活性。在一些实施方案中，经修饰的变体BBPI的活性比是至少1、至少约1.05、至少约1.1、至少约1.2、至少约1.3、至少约1.4、至少约1.5、至少约1.6、至少约1.7、至少约1.8、至少约1.9，和至少约2。在其他实施方案中，活性比是至少约2.1、至少约2.2、至少约2.3、至少约2.4、至少约2.5、至少约2.6、至少约2.7、至少约2.8、至少约2.9和至少约3。在其他实施方案中，活性比是至少约3.5、至少约4.0和至少约5。因而，在一些实施方案中，经修饰的变体BBPI的蛋白酶抑制活性(例如，蛋白酶抑制活性)比相应的未经修饰的前体BBPI的活性大至少约0.5％、约1.0％、约1.5％、约2.0％、约2.5％、约3.0％、约4.0％、约5.0％、约8.0％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％或更多。在其他实施方案中，经修饰的变体BBPI的蛋白酶抑制活性(例如，蛋白酶抑制活性)比相应的未经修饰的前体BBPI的活性大至少约110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％，或多达至少约200％。
在其他实施方案中，包含氨基酸取代的组合的经修饰变体BBPI具有比未经修饰前体BBPI更大的胰蛋白酶抑制活性。在一些实施方案中，至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个，和至少8个氨基酸取代产生具有比未经修饰的前体变体BBPI更大的TIA的经修饰的变体BBPI。如5.4节所述，包含氨基酸取代的组合的所有的经修饰的变体BBPI都具有比相应的未经修饰的前体BBPI更大的胰蛋白酶抑制活性。
5.8.2BBPI产量
在一些实施方案中，测定在前体变体BBPI中制造的氨基酸取代使所获得的经修饰的变体BBPI具有更大的产量的能力，所述产量是大于未经修饰的前体BBPI所生产的产量，即，以大于生产未经修饰的前体BBPI的水平来生产经修饰的变体BBPI。在一些实施方案中，本发明提供了包含如5.4节所述氨基酸取代组合的经修饰的变体BBPI，所述变体BBPI具有比相应的未经修饰的前体BBPI更大的蛋白酶抑制活性(例如，胰蛋白酶抑制活性)和更大的产量。
具有比相应的前体未经修饰BBPI更大的TIA和PY的经修饰的变体BBPI都包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个和至少8个氨基酸取代(见实施例12、13、14和15)。
在一些实施方案中，具有比相应的前体未经修饰BBPI更大的TIA和PY的经修饰的变体BBPI都包含2个氨基酸取代的组合，所述氨基酸是位于与SEQ ID NO：187的50和52位等价的位置上的氨基酸。在一些实施方案中，2个氨基酸取代的组合是50T-52A。本发明提供了5.3节所述的任意一种变体BBPI支架，并且还包含2个氨基酸取代的组合50T-52A，如5.4节所述。在一个实施方案中，变体支架的胰凝乳蛋白酶环是VEGF变体肽，例如SEQ ID NO：9，而变体支架经过改变进一步包含了3个氨基酸取代的组合，所述取代是在与SEQ ID NO：187的13、50和52位等价的位置上的，产生经修饰的变体BBPI支架。在一个实施方案中，包含2个氨基酸取代的组合的经修饰的变体BBPI是SEQ ID NO：6595的经修饰的变体BBIt-AV-F50T-V52A。
在一些实施方案中，具有比相应的前体未经修饰BBPI更大的TIA和PY的经修饰的变体BBPI都包含3个氨基酸取代的组合，所述氨基酸是位于与SEQ ID NO：187的13、50和52位等价的位置上的氨基酸。在一些实施方案中，3个氨基酸取代的组合选自在位置25-50-52、29-50-52、40-50-52和13-50-52的取代的组合。在一些实施方案中，3个氨基酸取代的组合选自25L-50T-52A、29P-50T-52A、40K-50T-52A和13I-50T-52A。本发明提供了5.3节所述的任意一种变体BBPI支架，并且还包含3个氨基酸取代的组合，所述取代选自25L-50T-52A、29P-50T-52A、40K-50T-52A和13I-50T-52A，如5.4节所述。在一个实施方案中，变体支架的胰凝乳蛋白酶环是VEGF变体肽，例如SEQ ID NO：9，而变体支架经过改变进一步包含了3个氨基酸取代的组合，所述取代是在与SEQ ID NO：187的13、50和52位等价的位置上的，产生经修饰的变体BBPI支架。在一个实施方案中，包含3个氨基酸取代的组合的经修饰的变体BBPI是SEQ ID NO：603的经修饰的变体BBIt-AV-S25L-F50T-V52A、SEQ ID NO：607的经修饰的变体BBIt-AV-L29P-F50T-V52A，和SEQ ID NO：609的经修饰的变体BBIt-AV-A40K-F50T-V52A。
在一些实施方案中，具有比相应的前体未经修饰BBPI更大的TIA和PY的经修饰的变体BBPI都包含4个氨基酸取代的组合，所述氨基酸是位于与SEQ ID NO：187的13、29、50和52位等价的位置上的氨基酸。在一些实施方案中，4个氨基酸取代的组合选自在位置13-25-50-52、13-29-50-52、25-29-50-52、13-40-50-52、25-40-50-52和29-40-50-52的取代的组合。在一些实施方案中，4个氨基酸取代的组合选自13I-25L-50T-52A、13I-29P-50T-52A、25L-29P-50T-52A、13I-40K-50T-52A、25L-40K-50T-52A和29P-40K-50T-52A。本发明提供了5.3节所述的任意一种变体BBPI支架，并且还包含4个氨基酸取代的组合，所述取代选自13I-25L-50T-52A、13I-29P-50T-52A、25L-29P-50T-52A、13I-40K-50T-52A、25L-40K-50T-52A和29P-40K-50T-52A，如5.4节所述。在一个实施方案中，变体支架的胰凝乳蛋白酶环是VEGF变体肽，例如SEQ ID NO：9和460，而变体支架经过改变进一步包含了4个氨基酸取代的组合，所述取代是在与SEQ ID NO：187的13、29、50和52位等价的位置上的，产生经修饰的变体BBPI支架。在一个实施方案中，包含4个氨基酸取代的组合的经修饰的变体BBPI是SEQ IDNO：596的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-S25L-F50T-V52A、SEQ ID NO：600的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-L29P-F50T-V52A、SEQ ID NO：602的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-A40K-F50T-V52A、SEQ ID NO：604的经修饰的变体BBIt-AV-S25L-L29P-F50T-V52A、SEQ ID NO：606的经修饰的变体BBIt-AV-S25L-A40K-F50T-V52A、SEQ ID NO：608的经修饰的变体BBIt-AV-L29P-A40K-F50T-V52A，和SEQ ID NO：643的经修饰的变体BBIt-VEGKD-A13I-S25K-L29P-V52K。在另一个实施方案中，变体支架的胰凝乳蛋白酶环是选自SEQ DI NO：430和431的FGF5变体肽，并且改变所述变体支架进一步包含4个氨基酸取代的组合，所述氨基酸处于与SEQ ID NO：187的13、29、50和52位等价的位置上，产生经修饰的变体BBPI支架。在一个实施方案中，包含4个氨基酸取代的组合的经修饰的变体BBPI 选自SEQ ID NO：432的经修饰的变体BBIt-MM007-Q-A13I-L29P-F50T-V52A，SEQ ID NO：434的经修饰的变体BBIt-FGFps2-Q-A13I-L29P-F50T-V52A。在另一个实施方案中，变体支架的胰凝乳蛋白酶环是选自SEQ ID NO：436、437和438的TGFβ变体肽，并且改变所述变体支架进一步包含4个氨基酸取代的组合，所述氨基酸处于与SEQ ID NO：187的13、29、50和52位等价的位置上，产生经修饰的变体BBPI支架。在一个实施方案中，包含4个氨基酸取代的组合的经修饰的变体BBPI选自SEQ ID NO：443的经修饰的变体BBIt-PEN3-Q-A13I-L29P-F50T-V52A、SEQ ID NO：445的经修饰的变体BBIt-MM021W-Q-A13I-L29P-F50T-V52A，和SEQ ID NO：447的经修饰的变体BBIt-WTQ-Q-A13I-L29P-F50T-V52A。
在一些实施方案中，具有比相应的前体未经修饰的BBPI更大的TIA和PY的经修饰的变体BBPI都包含5个氨基酸取代的组合，所述氨基酸是位于与SEQ ID NO：187的13、29、40、50和52位等价的位置上的氨基酸。在一些实施方案中，5个氨基酸取代的组合选自在位置13-25-29-50-52、13-29-40-50-52、13-25-40-50-52、25-29-40-50-52、13-29-40-50-52、13-29-40-50-52、13-29-40-50-52和13-29-40-50-52的取代的组合。在一些实施方案中，5个氨基酸取代的组合选自13I-25L-29P-50T-52A、13I-29P-40K-50T-52A、13I-25L-40K-50T-52A、25L-29P-40K-50T-52A、13L-29P-40K-50T-52A、13I-29K-40K-50T-52A、13I-29P-40K-50K-52A和13I-29P-40K-50T-52T。本发明提供了5.3节所述的任意一种变体BBPI支架，并且还包含5个氨基酸取代的组合，所述取代选自13I-25L-29P-50T-52A、13I-29P-40K-50T-52A、13I-25L-40K-50T-52A、25L-29P-40K-50T-52A、13L-29P-40K-50T-52A、13I-29K-40K-50T-52A、13I-29P-40K-50K-52A和13I-29P-40K-50T-52T，如5.4节所述。在一个实施方案中，变体支架的胰凝乳蛋白酶环是VEGF变体肽，例如SEQ IDNO：9，而变体支架经过改变进一步包含了5个氨基酸取代的组合，所述取代是在与SEQ ID NO：187的13、29、40、50和52位等价的位置上的，产生经修饰的变体BBPI支架。在一个实施方案中，包含5个氨基酸取代的组合的经修饰的变体BBPI选自SEQ ID NO：597的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-S25L-L29P-F50T-V52A、SEQ ID NO：599的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A、SEQ IDNO：601的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-S25L-A40K-F50T-V52A、SEQ ID NO：605的经修饰的变体BBIt-AV-S25L-L29P-A40K-F50T-V52A、SEQ ID NO：615的经修饰的变体BBIt-AV-A13L-L29P-A40K-F50T-V52A、SEQ ID NO：620的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-L29K-A40K-F50T-V52A、SEQ ID NO：624的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50K-V52A，和SEQ ID NO：625的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52T。
在一些实施方案中，具有比相应的前体未经修饰的BBPI更大的TIA和PY的经修饰的变体BBPI包含6个氨基酸取代的组合，所述氨基酸是位于与SEQ ID NO：187的13、25、29、40、50和52位等价的位置上的氨基酸。在一些实施方案中，6个氨基酸取代的组合选自在位置13-25-29-40-50-52、1-13-29-40-50-52、4-13-29-40-50-52、5-13-29-40-50-52、11-13-29-40-50-52、13-25-29-40-50-52，13-27-29-40-50-52、13-29-31-40-50-52、13-29-31-40-50-52、13-29-38-40-50-52和13-29-38-40-50-52的取代的组合。在一些实施方案中，6个氨基酸取代的组合选自13I-25L-29P-40K-50T-52A、1C-13I-29P-40K-50T-52A、4V-13I-29P-40K-50T-52A、5P-13I-29P-40K-50T-52A、11G-13I-29P-40K-50T-52A、13I-25R-29P-40K-50T-52A、13I-27R-29P-40K-50T-52A、13I-29P-31A-40K-50T-52A、13I-29P-31R-40K-50T-52A、13I-29P-38N-40K-50T-52A和13I-29P-38N-40K-50T-52A。本发明提供了5.3节所述的任意一种变体BBPI支架，并且还包含6个氨基酸取代的组合，所述取代选自13I-25L-29P-40K-50T-52A，1C-13I-29P-40K-50T-52A，4V-13I-29P-40K-50T-52A，5P-13I-29P-40K-50T-52A，11G-13I-29P-40K-50T-52A，13I-25R-29P-40K-50T-52A，13I-27R-29P-40K-50T-52A，13I-29P-31A-40K-50T-52A，13I-29P-31R-40K-50T-52A，13I-29P-38N-40K-50T-52A，和13I-29P-38N-40K-50T-52A。本发明提供了5.3节所述的任意一种变体BBPI支架，并且还包含6个氨基酸取代的组合，所述氨基酸取代的组合选自：13I-25L-29P-40K-50T-52A，1C-13I-29P-40K-50T-52A，4V-13I-29P-40K-50T-52A，5P-13I-29P-40K-50T-52A，11G-13I-29P-40K-50T-52A，13I-25R-29P-40K-50T-52A，13I-27R-29P-40K-50T-52A，13I-29P-31A-40K-50T-52A，13I-29P-31R-40K-50T-52A，13I-29P-38N-40K-50T-52A，和13I-29P-38N-40K-50T-52A，如5.4节所述。在一个实施方案中，变体支架的胰凝乳蛋白酶环是VEGF变体肽，例如SEQ ID NO：9，而变体支架经过改变进一步包含了6个氨基酸取代的组合，所述取代是在与SEQ IDNO：187的13、25、29、40、50和52位等价的位置上的，产生经修饰的变体BBPI支架。在一个实施方案中，包含6个氨基酸取代的组合的经修饰的变体BBPI是选自SEQ ID NO：598的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-S25L-L29P-A40K-F50T-V52A、SEQ ID NO：611的经修饰的变体BBIt-AV-D1C-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A、SEQ ID NO：612的经修饰的变体BBIt-AV-S4V-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A、SEQ ID NO：613的经修饰的变体BBIt-AV-S5P-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A、SEQ IDNO：614的经修饰的变体BBIt-AV-Q11G-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A、SEQ ID NO：616的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-S25R-L29P-A40K-F50T-V52A、SEQ ID NO：619的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-M27R-L29P-A40K-F50T-V52A、SEQ ID NO：621的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-L29P-S31A-A40K-F50T-V52A、SEQ IDNO：622的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-L29P-S31R-A40K-F50T-V52A、SEQ ID NO：623的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-L29P-S38N-A40K-F50T-V52A，和SEQ ID NO：626的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-L29P-S38N-A40K-F50T-V52A。
在一些实施方案中，具有比相应的前体未经修饰的BBPI更大的TIA和PY的经修饰的变体BBPI都包含7个氨基酸取代的组合，所述氨基酸是位于与SEQ ID NO：187的13、25、29、31、40、50和52位等价的位置上的氨基酸。在一些实施方案中，7个氨基酸取代的组合选自在下述位置的取代的组合：13-25-29-31-40-50-52，13-25-29-31-40-50-52，13-25-27-29-31-50-52，13-25-27-29-31-50-52，13-25-27-29-31-50-52，13-25-27-29-31-50-52，13-25-27-29-31-50-52，13-25-27-29-31-50-52，13-25-27-29-31-50-52，13-25-27-29-31-50-52，和13-25-27-29-31-50-52。在一些实施方案中，7个氨基酸取代的组合选自下述组合：13L-25R-29P-31A-40K-50T-52A，13L-25R-29P-31R-40K-50T-52A，13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T，13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T，13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T，13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T，13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T，13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T，13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T，13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T，和13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T。本发明提供了5.3节所述的任意一种变体BBPI支架，并且还包含7个氨基酸取代的组合，所述7个氨基酸取代的组合选自如5.4节所述的下述组合：13L-25R-29P-31A-40K-50T-52A，13L-25R-29P-31R-40K-50T-52A，13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T，13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T，13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T，13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T，13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T，13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T，13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T，13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T，和13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T。在一个实施方案中，变体支架的胰凝乳蛋白酶环是SEQ ID NO：9的VEGF变体肽，而变体支架经过改变进一步包含了7个氨基酸取代的组合，所述取代是在与SEQ ID NO：187的13、25、29、31、40、50和52位等价的位置上的，产生经修饰的变体BBPI支架。在一个实施方案中，包含7个氨基酸取代的组合的经修饰的变体BBPI选自SEQ ID NO：617的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-S25R-L29P-S31A-A40K-F50T-V52A、SEQ ID NO：618的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-S25R-L29P-S31R-A40K-F50T-V52A、SEQ ID NO：491的经修饰的变体BBIt-VEGF-V1-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T、SEQIDNO：632的经修饰的变体BBIt-VEGF-V2-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T、SEQIDNO：633的经修饰的变体BBIt-VEGF-V3-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T、SE QIDNO：634的经修饰的变体BBIt-VEGF-V4-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T、SEQIDNO：635的经修饰的变体BBIt-VEGF-V5-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T、SEQIDNO：636的经修饰的变体BBIt-VEGF-V6-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T、SEQIDNO：637的经修饰的变体BBIt-TNFα-T1-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T、SEQIDNO：638的经修饰的变体BBIt-TNFα-T2-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T，和SEQ ID NO：639的经修饰的变体BBIt-TNFα-T3-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T。
在一些实施方案中，具有比相应的前体未经修饰的BBPI更大的TIA和PY的经修饰的变体BBPI都包含8个氨基酸取代的组合，所述氨基酸是位于与SEQ ID NO：187的13、25、27、29、31、40、50和52位等价的位置上的氨基酸。在一些实施方案中，8个氨基酸取代的组合选自在位置13-25-27-29-31-40-50-52、13-25-27-29-31-40-50-52、13-25-27-29-31-40-50-52、13-25-27-29-31-40-50-52和13-25-27-29-31-40-50-52的取代的组合。在一些实施方案中，8个氨基酸取代的组合选自下述8个氨基酸取代的组合：13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T，13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q，13I-25K-27R-29E-31A-40H-50R-52K，13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L，和13I-25K-27Q-29P-31E-40H-50R-52Q。本发明提供了5.3节所述的任意一种变体BBPI支架，并且还包含8个氨基酸取代的组合，所述取代选自13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T，13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q，13I-25K-27R-29E-31A-40H-50R-52K，13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L，和13I-25K-27Q-29P-31E-40H-50R-52Q，如5.4节所述。在一个实施方案中，变体支架的胰凝乳蛋白酶环是SEQ ID NO：9的VEGF变体肽，而变体支架经过改变进一步包含了8个氨基酸取代的组合，所述取代是在与SEQ ID NO：187的13、25、27、29、31、40、50和52位等价的位置上的，产生经修饰的变体BBPI支架。在一个实施方案中，包含8个氨基酸取代的组合的经修饰的变体BBPI选自SEQ IDNO：627的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-A40H-F50K-V52T、SEQIDNO：628的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-S25K-M27A-L29R-S31E-A40K-F50Q-V52Q、SEQIDNO：629的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-S25K-M27R-L29E-S31A-A40H-F50R-V52K、SEQIDNO：630的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-S25K-M27A-L29R-S31A-A40H-F50R-V52L，和SEQID NO：631的经修饰的变体BBIt-AV-A13I-S25K-M27Q-L29P-S31E-A40H-F50R-V52Q。
在一些实施方案中，经修饰的变体BBPI还包含肽插入物，所述肽插入物位于经修饰的变体BBPI的N端。在一些实施方案中，肽插入物包含在1至15个氨基酸之间的序列。在其他实施方案中，肽插入物包含在5至10个氨基酸之间的序列。在一些实施方案中，肽插入物包含SEQ IDNO：389的肽。肽插入物是SEQ ID NO：389的经修饰的变体BBPI的实例是SEQ IDNO：390的经修饰的变体4D13BBIt-AV和SEQ ID NO：413的经修饰的变体BBIt-AV-4D13-13I-29P-40K-50T-52A。
本发明还提供了具有比相应的前体未经修饰的BBPI更大的TIA和PY的经修饰的变体BBPI，所述变体BBPI都包含任一种上述氨基酸取代的组合，并且具有比未经修饰的前体BBPI更大的蛋白酶抑制活性。在一些实施方案中，经修饰的变体BBPI具有比前体未经修饰的BBPI支架更大的胰蛋白酶抑制活性(TIA)，所述变体BBPI含有替代了相应的前体未经修饰的BBPI的胰凝乳蛋白酶环的变体肽。在其他实施方案中，经修饰的变体BBPI具有比前体未经修饰的BBPI支架更大的胰凝乳蛋白酶抑制活性(CIA)，所述变体BBPI含有替代了相应的前体未经修饰的BBPI的胰蛋白酶环的变体肽。
如实施例中所示，在变体BBPI的骨架中至少一个氨基酸的取代产生了具有比未经修饰的变体BBPI更大产量的经修饰的变体BBPI。在一些实施方案中，包含2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代的组合的BBPI具有比未经修饰的前体BBPI更大的产量。因而，本发明提供了经修饰的变体BBPI，所述经修饰的变体BBPI包含任一种上述氨基酸取代的组合，并且具有比未经修饰的前体变体BBPI更大的产量(PY)。在其他实施方案中，本发明提供了经修饰的变体BBPI，所述经修饰的变体BBPI包含任一种上述氨基酸取代的组合，并且具有比未经修饰的前体变体BBPI的TIA和PY更大的胰蛋白酶抑制活性和更大的产量。
在一些实施方案中，具有比相应的前体未经修饰的BBPI更大的TIA和PY的经修饰的变体BBPI都进一步包含了位于经修饰的变体BBPI的N端的肽插入物。在一些实施方案中，肽插入物包含在1至15个氨基酸之间的序列。在其他实施方案中，肽插入物包含在5至10个氨基酸之间的序列。在一些实施方案中，肽插入物包含SEQ ID NO：389的肽。经修饰的变体BBPI的实例包括SEQ ID NO：390的经修饰的变体4D13BBIt-AV和SEQID NO：413的经修饰的变体BBIt-AV-4D13-13I-29P-40K-50T-52A。
产量增强的一种测量可以根据从BCE核心的C端切割BBPI后的游离BBPI水平的增加而确定。如上所述，在一些实施方案中，可以使用蛋白酶或通过化学手段切割BBPI融合蛋白。在其他实施方案中，可以通过酸/热处理从BBPI融合蛋白切割BBPI，所述酸/热处理切割存在于连接BCE和BBPI的CBD接头中的A-P键。在其他实施方案中，可以使用地衣芽孢杆菌的谷氨酰内肽酶I切割BBPI融合蛋白。在一些实施方案中，经修饰的变体BBPI的产量的增强是根据在激活融合BBPI后以及在酸热处理BBPI融合蛋白后，相比经历相同处理的、游离的未经修饰的前体BBPI的水平，游离经修饰的变体BBPI水平的增加而确定。在其他实施方案中，经修饰的变体BBPI的产量的增强是在未激活融合BBPE的条件下酸热处理BBPI融合蛋白后，相比经历相同处理的、相应的游离未经修饰的前体BBPI的水平，根据游离经修饰的变体BBPI水平的增加而确定。在一些实施方案中，游离的经修饰的变体BBPI具有比相应的前体BBPI更大的产量和更大的TIA。
在一些实施方案中，经修饰的变体BBPI的产量比相应的未经修饰的前体BBPI的产量大至少约0.5％、约1.0％、约1.5％、约2.0％、约2.5％、约3.0％、约4.0％、约5.0％、约8.0％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约40％、约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％或更多。在其他实施方案中，经修饰的变体BBPI的产量比相应的未经修饰的前体BBPI的产量大至少约110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％，以及多达至少约200％。
6、个人护理组合物
6.0.1包含经修饰的变体BBPI的个人护理组合物
本发明提供了包含至少一种经修饰的变体BBPI的个人护理组合物，用于医学和非医学的适应症。在一些实施方案中，本发明提供了个人护理组合物及其使用方法。在一些实施方案中，本发明通过用于皮肤护理的个人护理组合物。在其他实施方案中，个人护理组合物是用于毛发护理的。在一些实施方案中，用于皮肤护理的个人护理组合物包括化妆品组合物。在其他实施方案中，本发明的个人护理组合物用于治疗各种疾病。
如本文中更详细描述的，本发明提供了用于个人护理多个方面的组合物，包括但不限于毛发和皮肤护理，以及化妆(例如，美容)。例如，本发明提供了组合物，所述组合物可用于日常个人护理、皮肤护理、防晒(例如，防晒剂和晒黑剂)、毛发护理(例如，香波、留置和/或洗净型护发素、生发油、头发喷雾、凝胶、泡沫、摩丝、定型产品、染发剂、长效卷发配方、其他造型和清洁产品，等)、皮肤、头发和嘴唇的晒后护理、口腔护理(例如，牙膏和凝胶、漱口水、洗液(rinse)等)、洗浴(例如，洗液(wash)、沐浴香皂(shower soap)、洗浴皂(bathsoap)、浴盐、珍珠粉等)、皮肤增白剂、皮肤适应症的清洁处理(例如，丘疹、痤疮、皮肤调色剂等)、脱毛剂、湿巾、除臭剂、止汗剂、面膜、剃须(例如，剃须膏、凝胶等)、须后水、去角质产品(例如，磨砂膏)、贴身护理产品(例如，女性卫生用品)、个人清新剂和足部护理。本发明还提供了用于化妆品(例如，粉底化妆品、睫毛油、眼影、眼线、唇膏、透明高光亮唇膏、腮红，等)的组合物。此外，本发明提供了用于减轻与疾病相关的头发适应症的个人护理组合物。在其他实施方案中，个人护理组合物用于减轻与疾病相关的皮肤适应症。可以预期，本发明的组合物可以多种形式使用，包括但不限于：固体、液体、胶体悬浮液、乳状液、油、凝胶、气溶胶、泡沫、粉末、泵式喷雾等，以及与其他物品结合使用，例如湿巾等。实际上，可以预期，本发明可以以适合预期用途的任何形式使用。
在一些实施方案中，个人护理组合物包含经修饰的变体BBPI，所述变体BBPI包含变体肽和至少一个氨基酸取代，如上文5.4.1节所述。在其他实施方案中，个人护理组合物包含经修饰的变体BBPI，所述变体BBPI包含变体肽和氨基酸取代的组合，如上文5.4.2节所述。在一些实施方案中，个人护理组合物包含经修饰的变体BBPI，其中等价的胰凝乳蛋白酶环是VEGF结合肽。在其他实施方案中，个人护理组合物包含经修饰的变体BBPI，其中等价的胰凝乳蛋白酶环是FGF5结合肽。在其他实施方案中，个人护理组合物包含经修饰的变体BBPI，其中等价的胰凝乳蛋白酶环是TGFβ结合肽。在其他实施方案中，个人护理组合物包含经修饰的变体BBPI，其中等价的胰凝乳蛋白酶环是TNFα结合肽。在一些实施方案中，个人护理组合物中包含的经修饰的变体BBPI从约0.0001重量百分比至约5重量百分比，同时在替代实施方案中，个人护理组合物中包含的经修饰的变体BBPI从约0.001重量百分比至约0.5重量百分比，而在其他实施方案中，个人护理组合物中包含的经修饰的变体BBPI从约0.01重量百分比至约1重量百分比。
6.0.2包含经修饰的变体VEGF-BBPI的个人护理组合物
VEGF在促进血管发生以及影响多种细胞功能中发挥了关键性作用，所述细胞功能包括细胞存活、增殖和一氧化氮和前列腺环素的产生(Zachary等，Cardiovasc Res，49：568-81[2001])。认识到VEGF作为病理性适应症中血管发生的主要刺激，导致各种阻断VEGF活性的尝试。已提出将抑制性抗VEGF受体的抗体、可溶性受体构建体、反义对策、抗VEGF的RNA衔接子和低分子量VEGF受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂用于干扰VEGF信号传递(见Siemeister等，[1998])。实际上，抗VEGF的单克隆抗体已表现出抑制小鼠中的人肿瘤异种移植物生长和腹水形成(见Kim等，[1993]；Asano等，[1998]；Mesiano等，[1998]；Luo等，[1998a]和[1998b]；以及Borgstrom等，[1996]和[1998])。
涉及VEGF和RTK的血管发生不仅参与癌症发展，影响不同的生理系统的其他许多疾病或适应症也是血管发生依赖性的，例如关节炎和动脉粥样硬化斑块(骨和韧带)、糖尿病视网膜病变、新生血管性青光眼、黄斑变性、眼部疱疹、沙眼和角膜移植新生血管化(眼)和血管纤维瘤。在牛皮癣患者的增生表皮中，以及其他以增强的血管发生为特征的皮肤疾病中，VEGF表达是上调的(Detmar和Yeo等，[1995])，所述疾病包括硬皮病、酒糟鼻、血管瘤、接触性皮炎和皮肤的增生性疤痕。据报道，VEGF在转基因小鼠的表皮中的靶向过表达导致增强的皮肤血管化，所述血管化具有相等数量的弯曲且泄露的血管(见例如，Brown等，[1998])。此外，VEGF在小鼠皮肤中的慢性合成导致第一个与人的牛皮癣组织学等价的小鼠模型(Xia等，[2003])，所述模型对特异性针对VEGF的结合试剂是可逆的。此外，紫外辐射诱导角质化细胞中的VEGF生产，增强皮肤血管发生(Kim等，Soc.InvestigativeDermatol.126：2697[2006]；Blaudshun等，FEBS Let.474：195-200[2000]；Kosmadaki等，FASEB J.17：446-8[2003])。
此外，VEGF在小鼠毛囊的外根鞘中的表达发现与毛发生长初期的毛细血管增殖在时间和空间上相关。VEGF在外根鞘中的转基因过表达增加毛囊周围的血管化，导致脱发后加快的毛发生长，以及生长更长的毛发(Yano等，JClin Invest 107：409-17[2001])。
因而，VEGF涉及到与病理性和非病理性适应症相关的血管化。
本发明提供了包含经修饰的变体VEGF-BBPI的个人皮肤护理和/或毛发护理组合物。包含在本发明的个人护理组合物中的VEGF-BBPI是经修饰的变体BBPI，其中VEGF-BBPI的前体支架的等价胰凝乳蛋白酶环，已被VEGF变体肽替代，并且还包含如5.4.1和5.4.2节中描述的至少一个氨基酸取代。在本发明的一些实施方案中，经修饰的变体VEGF-BBPI与VEGF的结合阻止了来自增加的毛囊周围血管化的VEGF，并抑制了VEGF对毛发生长的促进。在其他实施方案中，经修饰的变体VEGF-BBPI与VEGF的结合阻止了来自受试者皮肤中增加的血管化的VEGF，所述受试者患血管源性皮肤病(例如血管瘤和扁平苔藓)。在其他实施方案中，经修饰的变体VEGF-BBPI与VEGF的结合阻止了VEGF对与炎性皮肤病相关的血管发生失调的促进作用，所述炎性皮肤病包括牛皮癣、硬皮病、静脉溃疡、痤疮、酒糟鼻、疣、湿疹和淋巴管生成。然而，本发明并非意在限于任何特定的机制。
在一些实施方案中，个人护理组合物包含其中胰凝乳蛋白酶环是选自美国系列申请号09/832,723和10/984,270的VEGF结合肽的VEGF-BBPI，包括肽：ACYNLYGWTC(SEQ IDNO：9)，KYYLYWW(SEQ ID NO：458)，TLWKSYW(SEQ IDNO：459)，DLYWW(SEQ ID NO：460)，SKHSQIT(SEQ ID NO：468)KTNPSGS(SEQID NO：469)RPTGHSL(SEQ ID NO：470)，KHSAKAE(SEQID NO：471)KPSSASS(SEQ ID NO：472)，PVTKRVH(SEQ ID NO：473)，TLHWWVT(SEQ ID NO：492)，PYKASFY(SEQ ID NO：493)，PLRTSHT(SEQ ID NO：494)，EATPROT(SEQ IDNO：495)，NPLHTLS(SEQ ID NO：496)，KHERIWS(SEQ ID NO：497)，ATNPPPM(SEQ ID NO：498)，STTSPNM(SEQ ID NO：499)，ADRSFRY(SEQ ID NO：500)，PKADSKQ(SEQ ID NO：501)，PNQSHLH(SEQ IDNO：502)，SGSETWM(SEQ IDNO：503)，ALSAPYS(SEQ ID NO：504)，KMPTSKV(SEQ ID NO：505)，ITPKRPY(SEQ ID NO：506)，KWIVSET(SEQ ID NO：507)，PNANAPS(SEQ ID NO：508)，NVQSLPL(SEQ ID NO：509)，TLWPTFW(SEQ ID NO：510)，NLWPHFW(SEQ IDNO：511)，SLWPAFW(SEQ IDNO：512)，SLWPHFW(SEQ ID NO：513)，APWNSHI(SEQ ID NO：514)，APWNLHI(SEQ ID NO：515)，LPSWHLR(SEQ ID NO：516)，PTILEWY(SEQ ID NO：517)，TLYPQFW(SEQ ID NO：518)，和HLAPSAV(SEQID NO：519)。在一些实施方案中，VE GF变体序列包括但不限于在美国系列申请号11/919,717中公开的VE GF结合肽，所述VE GF结合肽包括下述肽：KYYLSWW(SEQ IDNO：520)，WYTLYKW(SEQ IDNO：521)，TYRLYWW(SEQ ID NO：522)，RYSLYYW(SEQ ID NO：523)，YYLYYWK(SEQ ID NO：524)，NYQLYGW(SEQ ID NO：525)，TKWPSYW(SEQ ID NO：226)，TLWKSYW(SEQ ID NO：527)，PLWPSYW(SEQ ID NO：528)，RLWPSYW(SEQ IDNO：529)，TLWPKYW(SEQ IDNO：530)，KYDLYWW(SEQ ID NO；531)，RYDLYWW(SEQ ID NO：532)，DYRLYWW(SEQ ID NO：533)，DYKLYWW(SEQ ID NO：534)，EYKLYWW(SEQ ID NO：535)，和RYPLYWW(SEQ ID NO：536)。在其他实施方案中，VEGF结合肽选自SEQ ID NO：9、458、459、460、468、469、470、471、472和473。
其中导入变体VEGF肽来替换胰凝乳蛋白酶环的支架是选自：来自大豆的大豆抑制剂的支架(BBI；SEQ ID NO：13)或其成熟的和截短的形式(SEQ ID NO：185)、来自二花扁豆的抑制剂的支架(BBdb；SEQ IDNO：449)、来自大豆的大豆抑制剂D-II的支架(BBsb3；SEQ IDNO：450)、来自巴西良木豆的抑制剂的支架(BBtc；SEQ ID NO：451)、SEQ ID NO：186的BBI-AV支架、SEQ ID NO：187的BBIt-AV支架、SEQ ID NO：452的BBdb-AV支架、SEQ ID NO：453的BBsb3-AV支架、SEQ ID NO：454的BBtc-AV支架、SEQ ID NO：640的BBIt-VEGK支架、SEQ IDNO：641的BBIt-VEGT支架和SEQ ID NO：642的BBIt-VEGKD支架。此外，任何野生型BBPI前体支架，例如Prakash等(见上文)公开的，可用于产生变体BBPI支架。在一些实施方案中，VEGF-BBPI的支架是SEQ ID NO：187。
在一些实施方案中，经修饰的变体VEGF-BBPI的骨架在至少一个氨基酸位置包含至少一个氨基酸取代，所述位置选自与SEQ ID NO：187的变体BBPI的1、4、5、11、13、18、25、27、29、31、38、40、50、52、55和65位等价的位置，如5.4.1节所述。
在其他实施方案中，经修饰的变体VEGF-BBPI的骨架包含氨基酸取代的组合，所述组合选自2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代的组合，如5.4.2节所述。
在其他实施方案中，经修饰的变体VEGF-BBPI的骨架包含氨基酸取代的组合，所述组合选自以下的氨基酸取代的组合：13I-29P-50T-52A、13I-40K-50T-52A、13I-25K-29P-52K、13I-29P-40K-50T-52A、13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T、13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T、13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q、13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L。
在一些实施方案中，本发明的个人护理组合物包含这样的经修饰的变体BBPI，其中前体支架的等价胰凝乳蛋白酶环，已被选自SEQ ID NO：9、458、459、460、468、469、470、471、472和473的VEGF变体肽替代，其中所述支架是SEQ ID NO：187的支架，并且所述变体BBPI包含氨基酸取代的组合，所述取代选自13I-40K-50T-52A、13I-25K-29P-52K、13I-29P-40K-50T-52A、13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T，13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T、13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q、13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L。在一些实施方案中，个人护理组合物包含这样的VEGF-BBPI，所述VEGF-BBPI选自SEQ ID NO：601、602、627、628、629、630、631、643、491、632、633、634、635和636的VEGF-BBPI。
在一些实施方案中，本发明提供了包含与VEGF结合的VEGF-BBPI的个人护理组合物。在替代性实施方案中，VEGF-BBPI与VEGF的结合阻断了VEGF的下游活性。在一些实施方案中，组合物能够调节血管生成。
在一些实施方案中，个人护理组合物包含用于皮肤护理的经修饰的变体BBPI-VEGF。在一些实施方案中，皮肤护理组合物是用于改善皮肤外观的化妆用途。在其他实施方案中，皮肤护理组合物是用于改善患皮肤病患者的皮肤外观的治疗性用途。在一些实施方案中，皮肤病是血管源性皮肤病。在其他实施方案中，皮肤病至少是选自牛皮癣、硬皮病、静脉溃疡、痤疮、酒糟鼻、疣、湿疹、血管瘤和淋巴管生成中的至少一种。在一些实施方案中，皮肤病是酒糟鼻。在其他实施方案中，皮肤病是牛皮癣。
在一个实施方案中，包含VEGF-BBPI的个人护理组合物选自皮肤乳膏、化妆水、喷雾、乳状液、胶体悬浮液、泡沫、气溶胶、液体、凝，凝胶、乳浆和固体。在另一个实施方案中，个人护理组合物是皮肤护理组合物，选自身体保湿洗液、身体洗液、抗菌清洁剂、皮肤保护性乳膏、爽身水、面霜、润肤霜膏、面部清洁乳状液、面部凝胶、面部乳浆、基于表面活性剂的面部清洁剂、面部去角质凝胶、抗痤疮治疗、面部色粉、去角质乳膏、面膜、须后膏、须前膏、晒黑组合物(tanning composition)、皮肤增白组合物、降低皮肤潮红的组合物、防晒剂、脱毛剂、毛发生长抑制剂和防辐射剂。防辐射剂选自不防水型防晒剂、高防水型防晒剂和硅油包水型防晒剂。
在一个实施方案中，包含VEGF-BBPI的个人护理皮肤护理组合物包含局部施用的非处方组合物、抗真菌治疗、抗痤疮治疗、皮肤防护制品、防晒剂、除臭剂和止汗剂。在其他实施方案中，皮肤护理组合物能够减轻皮肤色调、降低发红、阻止皮肤色调暗沉或阻止色素沉积。
本发明还提供了是化妆品组合物的个人护理组合物。在一些优选的实施方案中，包含VEGF-BBPI的化妆品组合物选自粉饼配方和粉底化妆品。在一些优选的实施方案中，化妆品组合物包含至少1种色素。
在另外的实施方案中，美容组合物是粉饼配方，选自散粉、腮红和修容粉饼。在其他实施方案中，美容组合物是粉底化妆品，选自油包水型粉底化妆品、硅油包水型粉底化妆品、水包油型粉底化妆品、无水化妆棒和粉霜粉底化妆品。
在一些实施方案中，个人皮肤护理组合物包含经修饰的变体VEGF-BBPI(如本文所述)和生理学可接受的载体或赋形剂。优选的，VEGF-BBPI存在的量是按重量计，基于组合物总量的约0.0001％至约5％。还优选的，VEGF-BBPI存在的量是按重量计，基于组合物总量的约0.001％至约0.5％。组合物可以是乳化的载体的形式，例如营养乳液或化妆水、稳定的凝胶或分散系统、治疗乳浆、脂质体递送系统、局部贴剂或膜、基于表面活性剂的清洁系统，例如香波或身体洗液、气溶胶的或喷雾的分散液或乳状液、毛发或皮肤调理剂、造型辅助剂，或产生颜色的产品，例如彩妆，以及其他合适的美容和化妆品制品。在一些实施方案中，载体优选的是选自水、丙二醇、乙醇、丙醇、甘油、丁二醇和聚乙二醇的至少一种。
在其它一些实施方案中，本发明提供了包含经修饰的变体VEGF-BBPI的个人护理组合物，用于毛发护理。
在一些实施方案中，毛发护理组合物可用于抑制毛发生长。在其他实施方案中，毛发生长的抑制包括用于治疗至少一种疾病或适应症的毛发去除，对所述疾病或适应症而言，减少的毛发生长是理想的。在一些实施方案中，抑制和/或去除包括脱毛。在一些实施方案中，毛发选自面部毛发、腿部毛发、手臂毛发和躯干毛发。
在一个实施方案中，毛发护理组合物选自香波、护发素、头发定型组合物、染发剂、长效卷发配方、发膏、凝胶、摩丝、喷雾、乳状液、胶体悬浮液、液体、泡沫和固体的形式。在一些实施方案中，毛发护理组合物还包含防辐射剂。如同描述于个人皮肤护理组合物中的一样，防辐射剂是选自不防水型防晒剂、高防水型防晒剂和硅油包水型防晒剂的防晒剂。在其他实施方案中，防辐射剂是选自不防水型防晒剂、高防水型防晒剂和硅油包水型防晒剂的防晒剂。
在一些实施方案中，个人毛发护理组合物包含经修饰的变体VEGF-BBPI(如本文所述)和生理学可接受的载体或赋形剂。优选的，VEGF-BBPI存在的量是按重量计，基于组合物总量的约0.0001％至约5％。还优选的，VEGF-BBPI存在的量是按重量计，基于组合物总量的约0.001％至约1％。组合物可以是乳化的载体的形式，例如营养乳液或化妆水、稳定的凝胶或分散系统、治疗乳浆、脂质体递送系统、局部贴剂或膜、基于表面活性剂的清洁系统，例如香波或身体洗液、气溶胶的或喷雾的分散液或乳状液、毛发或皮肤乳膏、造型辅助剂，或产生颜色的产品，例如彩妆，以及其他合适的美容和化妆品制品。在一些实施方案中，载体优选的是选自水、丙二醇、乙醇、丙醇、甘油、丁二醇和聚乙二醇的至少一种。
在其它实施方案中，本发明的个人护理组合物用于治疗与升高水平的VEGF相关的各种疾病。
本发明还提供了用于抑制受试者的毛发生长的方法，包括以下步骤：提供本发明的个人护理VEGF毛发护理组合物；提供待治疗的受试者；和，将所述组合物施于受试者的需要抑制毛发生长的区域。在一些实施方案中，毛发生长的抑制包括抑制受试者的毛发的生长，其中受抑制的毛发选自面部毛发、腋下毛发、腿部毛发、躯干毛发、手臂毛发和头发的生长。在其他实施方案中，使用本发明的VEGF毛发护理组合物来抑制毛发生长的方法包括施用这样的个人护理组合物，所述组合物包含具有选自SEQ IDNO：601、602、627、628、629、630、631、643、491、632、633、634、635和636的氨基酸序列的VEGF-BBPI。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于改善患皮肤病的受试者的皮肤的外观和/或条件的方法，包括：提供本发明的个人护理组合物；提供待治疗的受试者；并且将所述组合物施于受试者的受影响的皮肤。在一些实施方案中，皮肤病选自牛皮癣、静脉溃疡、痤疮、酒糟鼻、疣、湿疹、血管瘤、皮肤扁平苔藓和淋巴管生成等。在一些特别优选的实施方案中，皮肤病是酒糟鼻。在其他实施方案中，皮肤病是牛皮癣。在其他实施方案中，使用本发明的VEGF皮肤护理组合物，改善皮肤病患者的皮肤外观和/或条件的方法包括这样的个人护理组合物，所述组合物包含具有选自SEQ IDNO：601、602、627、628、629、630、631、643、491、632、633、634、635和636的氨基酸序列的VEGF-BBPI。
6.0.3包含经修饰的变体FGF5-BBPI的个人护理组合物
成纤维细胞生长因子(FGF)家族是含有至少23个成员的生长因子超家族，许多都是细胞增殖、分化和细胞功能的强效调控子。所有的FGF都具有保守的120个氨基酸核心。家族成员共享保守的半胱氨酸残基，并在氨基酸水平享有30-50％序列同源性。FGF的分子量范围是从7kDa的FGF-1至38kDa的FGF-5。蛋白质的长度是从60个氨基酸的FGF-1剪切变体至288个氨基酸的FGF-2。与肝素的结合是FGF因子与细胞表面受体相互作用必需的关键步骤。FGF5是分泌性信号蛋白，由268个氨基酸组成，具有17个氨基酸的信号序列和251个氨基酸的成熟肽。人的基因还产生糖基化的选择性剪切形式，大小为18kDa，长度为123个氨基酸。克隆了FGF-5的小鼠同源物，它与人蛋白在氨基酸序列水平具有84％同源性。人的FGF-5由3个外显子组成，定位在染色体4q21，并与小鼠FGF-5交叉反应。
毛囊的形成涉及一系列复杂的步骤：生长(毛发生长初期)、消退(毛发生长中期)、静止(休止期)和脱落(脱落期)。已提示FGF-5作为毛发循环中从毛发生长初期向毛发生长中期转变的一个主要的驱动因子。从野生型小鼠的毛囊中检测到FGF-5的表达，在毛发生长初期过程中定位于外根鞘。预测的FGF-5无效等位基因fgf5neo纯合的小鼠具有异常长的毛发(见Hebert等，Cell 78：1017-25[1994])。所述表型表现得与纯合的自发突变angora(go)小鼠的表型相同。目前，已鉴别到FGF-5的部分序列FGF5S，据认为其与FGF-5竞争结合受体(见，Ito等，J.Cell Physiol.，197：272-83[2003])。
本发明提供了个人毛发护理组合物，所述组合物包含至少一种经修饰的变体FGF-BBPI，用于促进毛发生长和/或阻止毛发丢失。在一个实施方案中，本发明提供了用于个人皮肤护理的FGF-BBPI组合物。在其他实施方案中，本发明提供了用于毛发护理的FGF-BBPI组合物。包含在本发明的个人护理组合物中的FGF-BBPI是经修饰的变体BBPI，其中FGF-5-BBPI的前体支架的等价胰凝乳蛋白酶环，已被FGF-5变体肽替代，并且还包含如5.4.1和5.4.2节中描述的至少一个氨基酸取代。在本发明中，经修饰的变体FGF-BBPI与FGF-5的结合阻止了FGF-5与其相应受体相互作用，并抑制了从毛发生长初期向毛发生长中期的转变，促进毛发生长和阻止毛发丢失。然而，本发明并非意在限于任何特定的机制。
在一些实施方案中，个人护理组合物包含至少一种这样的FGF-BBPI，其中胰凝乳蛋白酶环是选自以下的FGF-5变体肽：CACRTQPYPLCF(MM007；SEQ ID NO：430)，CICTWIDSTPC(PS2；SEQ IDNO：431)，CYGLPFTRC(SEQ ID NO：537)，CEEIWTMLC(SEQ ID NO：538)，CWALTVKTC(SEQ ID NO：539)，CLTVLWTTC(SEQ ID NO：540)，CTLWNRSPC(SEQ ID NO：541)，CHYLLTNYC(SEQ ID NO：542)，CRIHLAHKC(SEQ IDNO：543)，TNIDSTP(SEQ ID NO：544)，HLQTTET(SEQ ID NO：545)，SLNNLTV(SEQ ID NO：546)，TNIDSTP(SEQ ID NO：547)，TNIDSTP(SEQ ID NO：548)，LRILANK(SEQ ID NO：549)，LLTPTLN(SEQ ID NO：550)，ALPTHSN(SEQIDNO：551)，TNIDSTP(SEQ ID NO：552)，LCRRFEN(SEQ ID NO：553)，TNIDSTP(SEQ ID NO：554)，TNIDSTP(SEQ ID NO：555)，HLQTTET(SEQ ID NO：556)，PLGLCPP(SEQ ID NO：557)，GYFIPSI(SEQ ID NO：558)，TKIDSTP(SEQ IDNO：559)，HLQTTET(SEQ ID NO：560)，WNIDSTP(SEQ ID NO：561)，TWIDWTP(SEQ ID NO：562)，RTQPYPL(SEQ ID NO：670)和TWIDSTP(SEQ IDNO：671)。在其他实施方案中，FGF变体肽选自SEQ ID NO：430、431、670和671。
导入了变体FGF肽替换胰凝乳蛋白酶环的支架选自：来自大豆的大豆抑制剂的支架(BBI；SEQ ID NO：13)或其成熟的和截短的形式(SEQ IDNO：185)、来自二花扁豆的抑制剂的支架(BBdb；SEQ ID NO：449)、来自大豆的大豆抑制剂D-II的支架(BBsb3；SEQ ID NO：450)、来自巴西良木豆的抑制剂的支架(BBtc；SEQ ID NO：451)、SEQ ID NO：186的BBI-AV支架、SEQ ID NO：187的BBIt-AV支架、SEQ ID NO：452的BBdb-AV支架、SEQ ID NO：453的BBsb3-AV支架、SEQ ID NO：454的BBtc-AV支架、SEQ ID NO：640的BBIt-VEGK支架、SEQ IDNO：641的BBIt-VEGT支架和SEQ ID NO：642的BBIt-VEGKD支架。此外，任何野生型BBPI前体支架，例如Prakash等(见上文)公开的，可用于产生变体BBPI支架。在一些实施方案中，VEGF-BBPI的支架是SEQ ID NO：187。
在一些实施方案中，经修饰的变体FGF-BBPI的骨架在至少一个氨基酸位置包含至少一个氨基酸取代，所述位置选自与SEQ ID NO：187的变体BBPI的1、4、5、11、13、18、25、27、29、31、38、40、50、52、55和65位等价的位置，如5.4.1节所述。在其他实施方案中，经修饰的变体FGF-BBPI的骨架包含氨基酸取代的组合，所述组合选自2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代的组合，如5.4.2节所述。在其他实施方案中，经修饰的变体FGF-BBPI的骨架包含氨基酸取代的组合，所述组合选自以下的氨基酸取代的组合：13I-29P-50T-52A，13I-40K-50T-52A，13I-25K-29P-52K，13I-29P-40K-50T-52A，13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T，13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T，13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q，13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L。在一些实施方案中，取代的组合是13I-29P-50T-52A。
在一些实施方案中，本发明的个人护理组合物包含这样的FGF-BBPI，其中前体支架的等价胰凝乳蛋白酶环，已被选自SEQ ID NO：433和434的FGF变体肽替代，其中所述支架是SEQ ID NO：187的支架，并且所述变体BBPI包含氨基酸取代13I-40K-50T-52A的组合。因而，在一些实施方案中，个人护理组合物包含这样的FGF-BBPI，所述FGF-BBPI选自SEQIDNO：439和441的FGF-BBPI。
在一些实施方案中，本发明提供了包含与FGF结合的FGF-BBPI的个人护理组合物。在替代性实施方案中，FGF-BBPI与FGF的结合阻断了FGF的下游活性。在一些实施方案中，组合物能够促进毛发生长。
在一些实施方案中，包含经修饰的变体BBPI-FGF的个人护理组合物是用于皮肤护理的。在一些实施方案中，皮肤护理组合物是用于促进毛发生长的化妆品组合物。在一些实施方案中，皮肤护理组合物是用于促进患有涉及毛发丢失的疾病或适应症的受试者中的毛发生长的。在一些上述实施方案中，疾病或适应症是选自炎性脱发、假性斑秃、硬皮病、蜱叮咬、扁平苔癣、牛皮癣、狼疮、脂溢性皮炎、头发松动综合症、血色素沉着、雄激素性脱发、斑秃、癌症、影响缺陷性毛发纤维生产的适应症，和影响毛发生产的环境因素中的至少一种。在优选的实施方案中，疾病是雄激素性脱发或斑秃。
在一个实施方案中，包含FGF-BBPI的个人护理组合物是皮肤护理组合物，选自皮肤乳膏(cream)、化妆水、喷雾、乳状液、胶体悬浮液、泡沫、气溶胶、液体、凝，凝胶、乳浆(sera)和固体。在另一个实施方案中，个人护理组合物是皮肤护理组合物，选自身体保湿洗液、身体洗液、抗菌清洁剂、皮肤保护性乳膏、爽身水、面霜、润肤霜膏、面部清洁乳状液、面部凝胶、面部乳浆、基于表面活性剂的面部清洁剂、面部去角质凝胶、抗痤疮治疗、面部色粉、去角质乳膏、面膜、须后膏、须前膏、晒黑组合物、皮肤增白组合物、减少皮肤潮红的组合物、防晒剂、脱毛剂、毛发生长抑制剂和防辐射剂。防辐射剂选自不防水型防晒剂、高防水型防晒剂和硅油包水型防晒剂。
在一个实施方案中，包含FGF-BBPI的个人护理组合物是皮肤护理组合物，包含局部施用的非处方组合物、抗真菌治疗、抗痤疮治疗、皮肤防护制品、防晒剂、除臭剂和止汗剂。
在一些实施方案中，个人皮肤护理组合物包含经修饰的变体VEGF-BBPI(如本文所述)和生理学可接受的载体或赋形剂。优选的，VEGF-BBPI存在的量是按重量计，基于组合物总量的约0.0001％至约5％。还优选的，VEGF-BBPI存在的量是按重量计，基于组合物总量的约0.001％至约0.5％。组合物可以是乳化的载体的形式，例如营养乳液或化妆水、稳定的凝胶或分散系统、治疗乳浆、脂质体递送系统、局部贴剂或膜、基于表面活性剂的清洁系统，例如香波或身体洗液、气溶胶的或喷雾的分散液或乳状液、毛发或皮肤调理剂、造型辅助剂，或产生颜色的产品，例如彩妆，以及其他合适的美容和化妆品制品。在一些实施方案中，载体优选的是选自水、丙二醇、乙醇、丙醇、甘油、丁二醇和聚乙二醇的至少一种。
在其它一些实施方案中，本发明提供了包含经修饰的变体FGF-BBPI的个人护理组合物，用于毛发护理。
在一些实施方案中，毛发护理组合物可用于促进毛发生长。在其他实施方案中，调节包括促进患有涉及毛发丢失的疾病或适应症的受试者的毛发生长。在上述一些实施方案中，疾病或适应症是选自炎性脱发、假性斑秃、硬皮病、蜱叮咬、扁平苔癣、牛皮癣、狼疮、脂溢性皮炎、头发松动综合症、血色素沉着、雄激素性脱发、斑秃、癌症、影响缺陷性毛发纤维生产的适应症，和影响毛发生产的环境因素中的至少一种。在优选的实施方案中，疾病是雄激素性脱发或斑秃。
在一个实施方案中，毛发护理组合物选自香波、护发素、头发定型组合物、染发剂、长效卷发配方、发膏、凝胶、摩丝、喷雾、乳状液、胶体悬浮液、液体、泡沫和固体。在一些实施方案中，毛发护理组合物还包含防辐射剂。当描述个人皮肤护理组合物时，防辐射剂是选自不防水型防晒剂、高防水型防晒剂和硅油包水型防晒剂的防晒剂。在其他实施方案中，防辐射剂是选自不防水型防晒剂、高防水型防晒剂和硅油包水型防晒剂的防晒剂。
在一些实施方案中，个人毛发护理组合物包含经修饰的变体FGF-BBPI(如本文所述)和生理学可接受的载体或赋形剂。优选的，FGF-BBPI存在的量是按重量计，基于组合物总量的约0.0001％至约5％。还优选的，FGF-BBPI存在的量是按重量计，基于组合物总量的约0.001％至约0.5％。组合物可以是乳化的载体的形式，例如营养乳液或化妆水、稳定的凝胶或分散系统、治疗乳浆、脂质体递送系统、局部贴剂或膜、基于表面活性剂的清洁系统，例如香波或身体洗液、气溶胶的或喷雾的分散液或乳状液、毛发或皮肤调理剂、造型辅助剂，或产生颜色的产品，例如彩妆，以及其他合适的美容和化妆品制品。在一些实施方案中，载体优选的是选自水、丙二醇、乙醇、丙醇、甘油、丁二醇和聚乙二醇的至少一种。
在其它实施方案中，本发明的个人护理FGF-BBPI组合物用于治疗与升高水平的FGF相关的各种疾病。
本发明还提供了用于促进受试者的毛发生长的方法，包括以下步骤：提供本发明的个人护理FGF毛发护理组合物；提供待治疗的受试者；和，将所述组合物施于受试者的需要促进毛发生长的区域。在一些实施方案中，FGF组合物是皮肤护理组合物。在其他实施方案中，FGF组合物是毛发(护理)组合物。在一些实施方案中，毛发生长的促进包括促进受试者的毛发的生长，其中受促进的毛发生长选自面部毛发、腋下毛发、腿部毛发、躯干毛发、手臂毛发和头发的生长。在其他实施方案中，使用本发明的FGF毛发护理组合物来促进毛发生长的方法包括施用这样的个人护理组合物，所述组合物包含具有选自SEQ ID NO：439和441的氨基酸序列的FGF-BBPI。
6.0.4包含经修饰的变体TGFβ-BBPI的个人护理组合物
几乎所有的细胞都合成转化生长因子-β(TGFβ)家族的蛋白质。TGFβ是一类稳定的、多功能的多肽生长因子，它们的活性包括环境特定的(context-specific)抑制和刺激细胞增殖、控制胞外基质、降解和控制胚胎发生过程中的间充质-上皮细胞相互作用、介导对损伤的细胞和组织应答、控制致癌作用和调节免疫抑制。实际上几乎所有的细胞(仅有少数例外)都合成TGFβ-1。最高浓度的TGFβ-1可见于人的血小板和哺乳动物骨骼中。TGFβ-1有许多功能，包括抑制细胞增殖、增强胞外基质沉积和生理学的免疫应答。还已确定TGFβ-1在毛囊发育中是生物学活性的。人的TGFβ-1是25.0kDa的蛋白质，具有每个亚基含约112个氨基酸的亚基。2种不同的受体蛋白涉及TGFβ-1结合和信号传递、即TGF-RβII和TGF-RβI。TGFβ-2在多种细胞中表达、包括角质形成细胞、成纤维细胞、破骨细胞、胸腺上皮细胞、骨骼肌细胞、前列腺上皮细胞、支气管上皮细胞、神经元和星形细胞、内脏平滑肌、巨噬细胞和各种其他细胞。TGFβ-2具有许多基础活性，包括作为大多数细胞的生长抑制剂、胞外基质沉积的增强剂和免疫抑制来发挥功能。成熟区与TGFβ-1在氨基酸水平上有71％相同，与TGFβ-3有80％相同，与同一蛋白质的小鼠同源物有97％相同。TGFβ-2二聚体化，在原(“pro”)区域之间以及在成熟区域之间形成二硫键。TGFβ-2是作为前原细胞因子合成的，具有19个氨基酸的信号序列，283个氨基酸的原区域，和112个氨基酸的成熟氨基酸片段。TGFβ-2的受体形成了具有2个I型信号转导受体和2个II型配体结合型受体的异四聚体复合体。
毛囊的形成涉及一系列复杂的步骤：生长(毛发生长初期)、消退(毛发生长中期)、静止(休止期)和脱落(脱落期)(见，Stenn和Paus，Physiol.Rev，Exp.Dermatol.，8：229-233[1999])。已提示TGFβ作为毛发循环中从毛发生长初期向毛发生长中期转变的一个主要的驱动因子(见例如，Foitzik等，FASEB J.，5：752-760[2000]；和Soma等，J.Infect.Dis.，J.Invest.Dermatol.，118：993-9997[2002])，TGFβ2则是小鼠毛囊形态建成必要且充分的诱导因素(见，Foitzik等，Develop.Biol.，212：278-289[1999])。TGFβ-1在转基因小鼠中的条件性表达证实它可以可逆的诱导脱发(见，Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：9139-9144[2001])。此外，TGFβ-1突变体与小鼠中毛发生长中期起始的延迟相关(见，Foitzik等，[2000]，见上文)。目前，已显示通过使用TGFβ-2抗体可以延迟毛发生长中期(见，Soma等，[2002]，见上文)。最后，雄激素诱导TGFβ-1在秃头的真皮乳头细胞中生产，可以抑制上皮细胞生长(Inui等，FASEB J.，14：1967-1969[2002])。
TGFβ也是结缔组织积累的潜在刺激因素，涉及硬皮病和其他纤维化的疾病的病理发生(Blobe等，N Engl J Med 342：1350-1358[2000])。硬皮病是慢性自身免疫病，特征是早期炎症和血管损伤，然后是皮肤和其他器官的渐进性纤维化(Kissin和Korn，Rheum DisClin North Am29：351-369[2003])。最明显的症状通常是皮肤和伴随疤痕的硬化。
TGFβ还涉及皮肤肿瘤的形成(Li等，Molecular Carcinogenesis45：389-396[2006])。TGFβ信号传递通路是维持上皮细胞内稳态的最重要的机制之一。导致该通路抑制或增强的改变已表现出影响癌症发展。虽然TGFβ抑制正常上皮细胞的生长，但它却在许多上皮癌症中反常的过表达。已假定TGFβ在癌症发生的早期阶段作为肿瘤抑制子发挥作用，但TGFβ在癌症发生的晚期阶段的过表达可能是肿瘤浸润和转移的关键性因子。
本发明提供了包含经修饰的变体TGF-BBPI的个人护理组合物。包含在本发明的个人护理组合物中的TGFβ-BBPI是经修饰的变体TGFβ-BBPI，其中TGF-BBPI的前体支架的胰凝乳蛋白酶环，已被TGFβ变体肽替代，并且还包含如5.4.1和5.4.2节中描述的至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中，经修饰的变体TGF-BBPI与TGFβ1和/或TGFβ2的结合阻止了TGFβ1和/或TGFβ2与其相应受体相互作用，并抑制了从毛发生长初期向毛发生长中期的转变，促进毛发生长和阻止毛发丢失。在其他实施方案中，经修饰的变体TGF-BBPI与TGFβ1和/或TGFβ2的结合阻止了TGFβ1和/或TGFβ2与其相应受体相互作用，以阻止了皮肤的纤维化，所述皮肤的纤维化是硬皮病的特征。在其他实施方案中，经修饰的变体TGF-BBPI与TGFβ1和/或TGFβ2的结合阻止了TGFβ1和/或TGFβ2与其相应受体相互作用，以阻止了良性向恶性皮肤损害的进展。然而，本发明并非意在限于任何特定的机制。
在一些实施方案中，包含在TGFβ-BBPI中的TGFβ变体肽是选自下述多肽：CLCPENINVLPCN(PEN3；SEQ ID NO：436)，CICKHNVDWLCF(MMO21W；SEQ ID NO：437)，CICWTQHIHNCF(WTQ；SEQ ID NO：438)，CVTTDWIEC(SEQ ID NO：563)，CYYSQFHQC(SEQ ID NO：564)，CPTLWTHMC(SEQ ID NO：565)，QSACIVYYVGRKPKVECASSD(SEQ ID NO：566)，QSACILYYIGKTPKIECASSD(SEQ ID NO：567)，QSACILYYVGRTPKVECASSD(SEQ ID NO：568)，乙酰基-LCPENDNVSPCY-cohn2(SEQ ID NO：569)，KHNVRLL(SEQ ID NO：570)，NDTPSYF(SEQ IDNO：571)，AKLYAGS(SEQ ID NO：572)，RGPAHSL(SEQ ID NO：573)，NSLAERR(SEQ ID NO：574)，HPLASPH(SEQ IDNO：575)，QPWNKLK(SEQ ID NO：576)，AWLr/Mipy(SEQ ID NO：577)，PTKPAQQ(SEQ ID NO：578)，PSLNRPQ(SEQ ID NO：579)，HHARQEW(SEQ IDNO：580)，RHHTPGP(SEQ IDNO：581)，ASAINPH(SEQ ID NO：582)，CHGYDRAPC(SEQ ID NO：644)，CFAPADQAC(SEQ ID NO：645)，CIPSRFITC(SEQ ID NO：646)，CHGHTKLAC(SEQ ID NO：647)，CNGKSKLAC(SEQ ID NO：648)，PENINVLP(SEQID NO；672)，KHNVDWL(SEQ ID NO：673)，和WTQHIHNC(SEQ ID NO：674)。SEQID NO：644-648是TGFβ1-结合肽，而SEQ ID NO：463、437、438、563-582是TGFβ2-结合肽。
在其他实施方案中，TGFβ变体肽选自SEQ ID NO：436、437和438。
导入了变体TGFβ肽替换等价的胰凝乳蛋白酶环的支架选自：来自大豆的大豆抑制剂的支架(BBI；SEQ ID NO：13)或其成熟的和截短的形式(SEQ ID NO：185)、来自二花扁豆的抑制剂的支架(BBdb；SEQ IDNO：449)、来自大豆的大豆抑制剂D-II的支架(BBsb3；SEQ IDNO：450)、来自巴西良木豆的抑制剂的支架(BBtc；SEQ ID NO：451)、SEQ ID NO：186的BBI-AV支架、SEQ ID NO：187的BBIt-AV支架、SEQ ID NO：452的BBdb-AV支架、SEQ ID NO：453的BBsb3-AV支架、SEQ ID NO：454的BBtc-AV支架、SEQ ID NO：640的BBIt-VEGK支架、SEQ IDNO：641的BBIt-VEGT支架和SEQ ID NO：642的BBIt-VEGKD支架。此外，任何野生型BBPI前体支架，例如Prakash等(见上文)公开的，可用于产生变体BBPI支架。在一些实施方案中，VEGF-BBPI的支架是SEQ ID NO：187。
在一些实施方案中，经修饰的变体TGFβ-BBPI的骨架在至少一个氨基酸位置包含至少一个氨基酸取代，所述位置选自与SEQ ID NO：187的变体BBPI的1、4、5、11、13、18、25、27、29、31、38、40、50、52、55和65位等价的位置，如5.4.1节所述。
在其他实施方案中，经修饰的变体TGFβ-BBPI的骨架包含氨基酸取代的组合，所述组合选自2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代的组合，如5.4.2节所述。
在其他实施方案中，经修饰的变体TGFβ-BBPI的骨架包含氨基酸取代的组合，所述组合选自以下的氨基酸取代的组合：13I-29P-50T-52A、13I-40K-50T-52A、13I-25K-29P-52K、13I-29P-40K-50T-52A、13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T、13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T、13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q、13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L。在一些实施方案中，取代的组合是13I-29P-50T-52A。在一些实施方案中，本发明的个人护理组合物包含这样的BBPI，其中前体支架的等价胰凝乳蛋白酶环，已被选自SEQ ID NO：436、437、438、672、673和674的TGFβ变体肽替代，其中所述支架是SEQ ID NO：187的支架，并且所述变体BBPI包含氨基酸取代13I-29P-50T-52A的组合。在一些实施方案中，个人护理组合物包含这样的FGF-BBPI，所述FGF-BBPI选自SEQ ID NO：443、445和447的TGFβ-BBPI。
在一些实施方案中，本发明提供了包含与TGFβ1和/或TGFβ2结合的TGFβ-BBPI的个人护理组合物。在替代性实施方案中，TGFβ-BBPI与TGFβ的结合阻断了TGFβ的下游活性。在一些实施方案中，组合物能够促进毛发生长。
在一些实施方案中，包含经修饰的变体TGFβ-BBPI的个人护理组合物是用于皮肤护理的。在一些实施方案中，皮肤护理组合物是用于促进毛发生长的化妆品组合物。
在一些实施方案中，皮肤护理组合物是用于促进患有涉及毛发丢失的疾病或适应症的受试者中的毛发生长的。在一些上述实施方案中，疾病或适应症是选自炎性脱发、假性斑秃、硬皮病、蜱叮咬、扁平苔癣、牛皮癣、狼疮、脂溢性皮炎、头发松动综合症、血色素沉着、雄激素性脱发、斑秃、癌症、影响缺陷性毛发纤维生产的适应症，和影响毛发生产的环境因素中的至少一种。在优选的实施方案中，疾病是雄激素性脱发或斑秃。
在其他实施方案中，包含经修饰的变体TGF-BBPI的个人护理组合物是用于改善硬皮病患者的皮肤外观和/或条件。在其他实施方案中，包含经修饰的变体TGF-BBPI的个人护理组合物是用于改善皮肤癌患者的皮肤外观和/或条件。
在一个实施方案中，包含TGFβ-BBPI的个人护理组合物是皮肤护理组合物，选自皮肤乳膏(cream)、化妆水、喷雾、乳状液、胶体悬浮液、泡沫、气溶胶、液体、凝胶、乳浆(sera)和固体。在另一个实施方案中，个人护理组合物是皮肤护理组合物，选自身体保湿洗液、身体洗液、抗菌清洁剂、皮肤保护性乳膏、爽身水、面霜、润肤霜膏、面部清洁乳状液、面部凝胶、面部乳浆、基于表面活性剂的面部清洁剂、面部去角质凝胶、抗痤疮治疗、面部色粉、去角质乳膏、面膜、须后膏、须前膏、晒黑组合物、皮肤增白组合物、减少皮肤潮红的组合物、防晒剂、脱毛剂、毛发生长抑制剂和防辐射剂。防辐射剂选自不防水型防晒剂、高防水型防晒剂和硅油包水型防晒剂。
在一个实施方案中，包含TGFβ-BBPI的个人护理组合物是皮肤护理组合物，包含局部施用的非处方组合物、抗真菌治疗、抗痤疮治疗、皮肤防护制品、防晒剂、除臭剂和止汗剂。
本发明还提供是化妆品组合物的个人护理组合物。在一些优选的实施方案中，化妆品组合物选自睫毛油、粉饼配方和粉底化妆品。在一些优选的实施方案中，化妆品组合物包含至少一种色素。
在一些优选的实施方案中，包含至少一种色素的化妆品组合物是睫毛油，选自不防水型睫毛油、防水型睫毛油、浓密型睫毛油、加长型睫毛油、卷翘型睫毛油、不含水的防水型睫毛油、基于水的睫毛油，和睫毛或眉毛处理。
在其他实施方案中，化妆品组合物是粉饼配方，选自散粉、腮红、眼影和修容粉饼。在其他实施方案中，化妆品组合物是粉底化妆品，选自油包水型粉底化妆品、硅油包水型粉底化妆品、水包油型粉底化妆品、无水化妆棒和粉霜粉底化妆品。
在一些实施方案中，个人皮肤护理组合物包含经修饰的变体TGF-BBPI(如本文所述)和生理学可接受的载体或赋形剂。优选的，TGF-BBPI存在的量是按重量计，基于组合物总量的约0.0001％至约5％。还优选的，TGF-BBPI存在的量是按重量计，基于组合物总量的约0.001％至约0.5％。组合物可以是乳化的载体的形式，例如营养乳液或化妆水、稳定的凝胶或分散系统、治疗乳浆、脂质体递送系统、局部贴剂或膜、基于表面活性剂的清洁系统，例如香波或身体洗液、气溶胶的或喷雾的分散液或乳状液、毛发或皮肤调理剂、造型辅助剂，或产生颜色的产品，例如彩妆，以及其他合适的美容和化妆品制品。在一些实施方案中，载体优选的是选自水、丙二醇、乙醇、丙醇、甘油、丁二醇和聚乙二醇的至少一种。
在其它实施方案中，本发明提供了包含经修饰的变体TGF-BBPI的个人护理组合物，用于毛发护理。在一些实施方案中，毛发护理组合物用于促进毛发生长。
在一些实施方案中，毛发护理组合物可用于促进毛发生长。在其他实施方案中，毛发护理组合物可用于促进毛发生长。在其他实施方案中，调节包括促进患有涉及毛发丢失的疾病或适应症的受试者中的毛发生长。在上述一些实施方案中，疾病或适应症是选自炎性脱发、假性斑秃、硬皮病、蜱叮咬、扁平苔癣、牛皮癣、狼疮、脂溢性皮炎、头发松动综合症、血色素沉着、雄激素性脱发、斑秃、癌症、影响缺陷性毛发纤维生产的适应症，和影响毛发生产的环境因素中的至少一种。在优选的实施方案中，疾病是雄激素性脱发或斑秃。
在一个实施方案中，毛发护理组合物选自香波、护发素、头发定型组合物、染发剂、长效卷发配方、发膏、凝胶、摩丝、喷雾、乳状液、胶体悬浮液、液体、泡沫和固体。在一些实施方案中，毛发护理组合物还包含防辐射剂。当描述个人皮肤护理组合物时，防辐射剂是选自不防水型防晒剂、高防水型防晒剂和硅油包水型防晒剂的防晒剂。在其他实施方案中，防辐射剂是选自不防水型防晒剂、高防水型防晒剂和硅油包水型防晒剂的防晒剂。
在一些实施方案中，个人毛发护理组合物包含经修饰的变体TGFβ-BBPI(如本文所述)和生理学可接受的载体或赋形剂。优选的，TGFβ-BBPI存在的量是按重量计，基于组合物总量的约0.0001％至约5％。还优选的，TGFβ-BBPI存在的量是按重量计，基于组合物总量的约0.001％至约0.5％。组合物可以是乳化的载体的形式，例如营养乳液或化妆水、稳定的凝胶或分散系统、治疗乳浆、脂质体递送系统、局部贴剂或膜、基于表面活性剂的清洁系统，例如香波或身体洗液、气溶胶的或喷雾的分散液或乳状液、毛发或皮肤乳膏、造型辅助剂，或产生颜色的产品，例如彩妆，以及其他合适的美容和化妆品制品。在一些实施方案中，载体优选的是选自水、丙二醇、乙醇、丙醇、甘油、丁二醇和聚乙二醇的至少一种。
在其它实施方案中，本发明的个人护理TGF-BBPI组合物用于治疗与升高水平的TGFβ1和/或TGFβ2相关的各种疾病。
本发明还提供了用于促进受试者的毛发生长的方法，包括以下步骤：提供本发明的个人护理TGF毛发护理组合物；提供待治疗的受试者；和，将所述组合物施于受试者的需要促进毛发生长的区域。在一些实施方案中，TGF组合物是皮肤护理组合物。在其他实施方案中，FGF组合物是毛发护理组合物。在一些实施方案中，毛发生长的促进包括促进受试者的毛发的生长，其中受促进的毛发生长选自面部毛发、腋下毛发、腿部毛发、躯干毛发、手臂毛发和头发的生长。在其他实施方案中，使用本发明的TGF毛发护理组合物来促进毛发生长的方法包括施用这样的个人护理组合物，所述组合物包含具有选自SEQ ID NO：443、445和447的氨基酸序列的TGF-BBPI。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于改善皮肤病患者的皮肤外观和/或条件的方法，包括：提供本发明的个人皮肤护理组合物；提供待治疗的受试者；和，将所述组合物施于受试者的受影响的皮肤。在一些实施方案中，皮肤病选自牛皮癣、硬皮病和皮肤癌。在其他实施方案中，使用本发明的TGF皮肤护理组合物来改善患皮肤病的受试者中的皮肤外观和/或条件的方法包括施用这样的个人护理组合物，所述组合物包含具有选自SEQ IDNO：443、445和447的氨基酸序列的TGF-BBPI。
6.0.5包含经修饰的变体TNFα-BBPI的个人护理组合物
组织坏死因子(TNF)家族的蛋白质是大型细胞因子家族的成员。组织坏死因子α(TNFα)是配体TNF家族的标准成员。它是由各种免疫细胞产生的，在免疫介导的炎性疾病中扮演了关键性的角色。
TNFα是由T淋巴细胞、B细胞、滑膜细胞、成纤维细胞和巨噬细胞合成的，最初为26kD的蛋白质。之后，由TNFα转化酶(金属蛋白酶，ADAMS 17)切割成17kD的单体分子。在生理条件下，三个这类分子形成非共价结合的、锥形的同三聚体，将存在2种异构体的膜结合受体交联，所述受体为：TNF受体I(TNF-RI)和TNF受体II(TNF-RII)。TNFα的天然功能是刺激嗜中性粒细胞和单核细胞向感染位点募集，激活这些细胞来消灭微生物，通过与位于多种细胞类型的表面上的相应TNF受体结合发挥功能。TNFα激活局部的血管内皮细胞，导致血管舒张和增加渗透性。上调血管内皮粘附分子(ICAM-1、VCAM-1、E-选择素)和MHC II型分子，导致募集促炎细胞，诱导免疫球蛋白和补体。血小板开始活化并“胶粘”，导致小血管闭塞，控制感染。此外，TNFα诱导巨噬细胞和内皮细胞分泌趋化因子，并促进靶细胞凋亡。TNFα具有潜在的旁分泌功能，(通过NFκB-介导的机制)诱导促炎细胞因子的分泌，例如IL-1、IL-6和GM-CSF，还刺激各种趋化因子的生产，包括RANTES、IL-8、MCP-1和MIP-1α。最后，TNFα在血管发生中发挥作用，对类风湿性滑膜的生长和增殖是关键性的。
免疫介导的炎性疾病(IMID)是由促炎细胞因子，包括TNFα的异常生产触发的。这类疾病包括：类风湿性关节炎(RA)、炎性肠病(IBD)如克氏病(Crohn’s disease)、慢性斑块状牛皮癣、牛皮癣关节炎、脉管炎和强直性脊柱炎。
免疫介导的炎性疾病治疗的新进展来自于对细胞因子表达和信号传递的基础研究，所述研究鉴别了在该类别若干疾病病理学中的2个关键性引子：TNFα和白介素-1(IL-1)。例如，已发现在患RA的患者的血清、滑膜和滑液中，上述两种细胞因子是升高的。此外，TNFα和IL-1能够诱导和增加关节炎的实验模型中的关节破坏。此类发现导致发展出对策来阻断/拮抗它们的效应，而通过生物试剂的特异性靶向在近年已成为可能。该第一代产物包括单克隆抗体(mAb)和可溶性受体融合蛋白，都与受体竞争结合细胞因子发挥作用。
迄今为止，US FDA已批准了3种TNFα抑制剂/阻断剂用于治疗一些IMID的临床应用，包括牛皮癣和牛皮癣关节炎。所述药剂是：Etanercept(Amgen-Wyeth)，TNFII型受体与人IgG1的Fc组分的完全的人的嵌合蛋白；Infliximab(Centocor)，嵌合的单克隆抗体，和Adalimumab(Abbott)，完全的人IgG1抗TNFα单克隆抗体。不得不针对疗效随时间而下降的担心、上述生物药剂的高成本以及上述试剂目前由针递送造成的限制，权衡上述试剂已证明的初始疗效和安全谱。
Boyman及其同事开发的动物模型(Boyman等，J.Exp.Med.199：731-736[2004])证实了固有T细胞和TNFα在牛皮癣的自发发展中的关键性作用。在该模型中，将无症状的前牛皮癣性人类皮肤损害移植到转基因的AGR129小鼠中。组显示，T细胞的阻断导致对牛皮癣发展的抑制。还显示应用中和性抗人TNFα单克隆抗体(英孚利昔单抗(Infliximab)，i.v.)或TNF受体融合蛋白(依那西普(Etanercept)，s.c.)导致牛皮癣表型发展的显著抑制。上述结果支持这样的观点，即TNFα拮抗剂对IMID疾病发展具有直接的影响。
不幸的是，超过三分之一的患有任意被认可的IMID指标的患者临床上不能受益于抗TNF治疗(Wong等，Clin.Immunol.126：121-136[2008])。继续致力于开发新型疗法，来解决该医学领域。目前，有多种“聪明的”TNFα拮抗剂处于临床实验中，包括：各种抗TNF单克隆抗体、聚乙二醇化的抗体片段或截短的TNF受体分子。此外，促进三聚体细胞因子的TNFα亚基解聚的小分子抑制剂在体外结果中已表现出前景(He等，Science 310：1022-1025[2005])，但尚未报到任何进一步的临床开发。
牛皮癣是常见的皮肤病，影响约2.8％的人群(Linden和WeinsteinAm.J.Med.107：595-605[1999])。估计在美国450万人患牛皮癣，150万人具有中度至严重的斑块状牛皮癣。该疾病的特征是皮肤的慢性炎症。炎症帮助驱使形成发红、瘙痒的皮肤斑块，所述皮肤斑块通常是疼痛和丑陋的。TNF-α在其形成和持续存在在扮演了关键性角色，因为它诱导了IL-1和IL-8的合成，触发了炎症。TNF-α在牛皮癣损害中的浓度高于牛皮癣患者的不受影响的皮肤中的浓度，并且在有效治疗后随损害的清除而下降(Mussi等，J.Biol.Regul.Homeost.Agents 11：115-118[1997])。TNF-α还促进了角质化细胞增殖和血管发生(Asadullah等，Drugs today35：913-924[1999])，因而抑制该细胞因子应该在多个阶段停止了疾病。
传统上，中度牛皮癣的一线治疗包括局部试剂，其通常比系统性治疗较少侵略性，具有低的最严重副作用的发生率，如肾衰竭或肝衰竭(Kincaid(2005)Drug discoverytoday 10：884)。一些试剂如：1，3-二硫脲、丙基硫尿嘧啶和甲硫咪唑，在治疗患牛皮癣的患者中是有效的，显著数量的患者在数周治疗后表现出其损害的清除或基本清除。使用新型抗TNFα的生物制品：Enbrel、Remicade和Humira的系统性治疗已获批准用于中度至严重的慢性斑块状牛皮癣。用此类试剂治疗的患者非常常见的表现出疾病的显著改善，在严重的情况下具有较多清除(Chaudhari等，Lancet357：1842-1847[2001]；Leonardi等，N.Engl.J.Med.349：2014-2022[2003])。但是目前，疾病的疗法不令人特别满意，许多目前使用的疗法与显著积累的毒性相关(Gottlieb等，J Am Acad Dermatol.48：829-835[2003])。与TNFα阻断试剂相关的风险包括严重的感染、恶性肿瘤、过敏性反应、乙型肝炎的再激活、脱髓鞘病、血细胞减少、心力衰竭和狼疮样综合症。此外，观察到停药后临床益处的消失，以及小部分患者发展出对生物试剂的抗体，可能限制了对他们重复用药的疗效。
由于尺寸显著较小，从而推测具有显著降低的免疫原性，蛋白质(如改造的经修饰变体BBPI)应该显著降低了对患者发展出中和抗体的担心。因为相比抗体或蛋白质融合体降低的分子量，BBPI分子可能更易于通过局部途径或通过较低侵入性的系统给药进行递送，所述系统给药如皮下注射或无针递送方法。
本发明提供了包含经修饰的变体TNF-BBPI的个人护理组合物，由于皮肤和/或毛发护理。在一些实施方案中，包含TNF-BBPI的个人护理组合物是用于促进患有皮肤炎性疾病的受试者的毛发生长和/或改善其皮肤适应症的。在一些实施方案中，皮肤炎性疾病选自皮炎、湿疹、牛皮癣、痤疮、酒糟鼻和荨麻疹。在一些实施方案中，皮肤炎性疾病是牛皮癣。因而，本发明提供了个人皮肤护理组合物和/或毛发护理组合物。包含在本发明的个人护理组合物中的TNF-BBPI是经修饰的变体BBPI，其中TNF-5-BBPI的前体支架的等价胰凝乳蛋白酶环，已被TNF变体肽替代，并且还包含如5.4.1和5.4.2节中描述的至少一个氨基酸取代。在本发明中，经修饰的变体TNF-BBPI与TNFα的结合转换了TNFα，使其免于与其相应受体相互作用，并抑制了TNFα诱导的头皮炎症，阻止毛发丢失。在一些实施方案中，经修饰的变体TNF-BBPI与TNFα的结合消除了皮肤炎症，改善了受试者中的皮肤的适应症，所述受试者患本文所论述的皮肤炎性疾病，例如牛皮癣。然而，本发明并非意在限于任何特定的机制。
在一些实施方案中，包含在TNF-BBPI中的TNF变体肽是选自下述的TNF变体肽：RYWQDIP(T1；SEQ I D NO：474)，APEPILA(T2；SEQ IDNO：475)，DMIMVSI(T3；SEQ ID NO：476)，WTPKPTQ(SEQ ID NO：583)，ATFPNQS(SEQ ID NO：584)，ASTVGGL(SEQ ID NO：585)，TMLPYRP(SEQ ID NO：586)，AWHSPSV(SEQ ID NO：587)，TQSFSS(SEQ ID NO：588)，THKNTLR(SEQ IDNO：589)，GQTHFHV(SEQ ID NO：590)，LPILTQT(SEQ ID NO：591)，SILPVSH(SEQIDNO：592)，SQPIPI(SEQ ID NO：593)，和QPLRKLP(SEQ ID NO：594)。在其他方案中，TNF变体肽选自SEQ ID NO：483、484和485。
导入了TNF肽替换等价的胰凝乳蛋白酶环的支架选自：来自大豆的大豆抑制剂的支架(BBI；SEQ ID NO：13)或其成熟的和截短的形式(SEQID NO：185)、来自二花扁豆的抑制剂的支架(BBdb；SEQ ID NO：449)、来自大豆的大豆抑制剂D-II的支架(BBsb3；SEQ ID NO：450)、来自巴西良木豆的抑制剂的支架(BBtc；SEQ ID NO：451)、SEQ ID NO：186的BBI-AV支架、SEQ ID NO：187的BBIt-AV支架、SEQ ID NO：452的BBdb-AV支架、SEQ ID NO：453的BBsb3-AV支架、SEQ ID NO：454的BBtc-AV支架、SEQ ID NO：640的BBIt-VEGK支架、SEQ IDNO：641的BBIt-VEGT支架和SEQ ID NO：642的BBIt-VEGKD支架。此外，任何野生型BBPI前体支架，例如Prakash等(见上文)公开的，可用于产生变体BBPI支架。在一些实施方案中，TNF-BBPI的支架是SEQ ID NO：187。在一些实施方案中，经修饰的变体TNF-BBPI的骨架在至少一个氨基酸位置包含至少一个氨基酸取代，所述位置选自与SEQ ID NO：187的变体BBPI的1、4、5、11、13、18、25、27、29、31、38、40、50、52、55和65位等价的位置，如5.4.1节所述。在其他实施方案中，经修饰的变体TNF-BBPI的骨架包含氨基酸取代的组合，所述组合选自2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代的组合，如5.4.2节所述。在其他实施方案中，经修饰的变体TNF-BBPI的骨架包含氨基酸取代的组合，所述组合选自以下的氨基酸取代的组合：13I-29P-50T-52A、13I-40K-50T-52A、13I-25K-29P-52K、13I-29P-40K-50T-52A、13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T、13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T、13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q、13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L在与SEQ ID NO：187等价的位置上。
在一些实施方案中，本发明的个人护理组合物包含这样的BBPI，其中前体支架的等价胰凝乳蛋白酶环已被选自SEQ ID NO：474、475和476的TNF变体肽替代，其中所述支架是SEQ ID NO：187的支架，并且包含氨基酸取代13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T的组合。
在一些实施方案中，个人护理组合物包含这样的TNF-BBPI，所述TNF-BBPI是选自SEQ ID NO：647、648和649的TNF-BBPI。
在一些实施方案中，本发明提供了包含与TNF结合的TNF-BBPI的个人护理组合物。在替代性实施方案中，TNF-BBPI与TNF的结合阻断了TNF的下游活性。在一些实施方案中，组合物能够调节炎症。
在一些实施方案中，包含经修饰的变体BBPI-TNF的个人护理组合物是用于皮肤护理的。在一些实施方案中，皮肤护理组合物是用于改善患皮肤病的受试者中的皮肤外观和/或条件的。因而，在一些实施方案中，用于皮肤护理的个人护理组合物包括化妆品组合物。在一些实施方案中，皮肤病是炎性皮肤病。在一些实施方案中，炎性皮肤病是牛皮癣。
在一个实施方案中，包含TNF-BBPI的个人护理组合物是皮肤护理组合物，选自皮肤乳膏(cream)、化妆水、喷雾、乳状液、胶体悬浮液、泡沫、气溶胶、液体、凝，凝胶、乳浆和固体。在另一个实施方案中，个人护理组合物是皮肤护理组合物，选自身体保湿洗液、身体洗液、抗菌清洁剂、皮肤保护性乳膏、爽身水、面霜、润肤霜膏、面部清洁乳状液、面部凝胶、面部乳浆、基于表面活性剂的面部清洁剂、面部去角质凝胶、抗痤疮治疗、面部色粉、去角质乳膏、面膜、须后膏、须前膏、晒黑组合物、皮肤增白组合物、减少皮肤潮红的组合物、防晒剂、脱毛剂、毛发生长抑制剂和防辐射剂。防辐射剂选自不防水型防晒剂、高防水型防晒剂和硅油包水型防晒剂。
在一个实施方案中，包含TNF-BBPI的个人护理组合物是皮肤护理组合物，包含局部施用的非处方组合物、抗真菌治疗、抗痤疮治疗、皮肤防护制品、防晒剂、除臭剂和止汗剂。在其他实施方案中，皮肤护理组合物能够减轻皮肤色调、降低发红、阻止皮肤色调暗沉或阻止色素沉积。
本发明还提供是化妆品组合物的个人护理组合物。在一些优选的实施方案中，化妆品组合物选自睫毛油、粉饼配方和粉底化妆品。在一些优选的实施方案中，美容组合物包含至少一种色素。
在一些优选的实施方案中，包含至少一种色素的美容组合物是睫毛油，选自不防水型睫毛油、防水型睫毛油、浓密型睫毛油、加长型睫毛油、卷翘型睫毛油、不含水的防水型睫毛油、基于水的睫毛油，和睫毛或眉毛处理。
在其他实施方案中，美容组合物是粉饼配方，选自散粉、腮红、眼影和修容粉饼。在其他实施方案中，美容组合物是粉底化妆品，选自油包水型粉底化妆品、硅油包水型粉底化妆品、水包油型粉底化妆品、无水化妆棒和粉霜粉底化妆品。
在一些实施方案中，个人皮肤护理组合物包含经修饰的变体TNF-BBPI(如本文所述)和生理学可接受的载体或赋形剂。优选的，TNF-BBPI存在的量是按重量计，基于组合物总量的约0.0001％至约5％。还优选的，TNF-BBPI存在的量是按重量计，基于组合物总量的约0.001％至约0.5％。组合物可以是乳化的载体的形式，例如营养乳液或化妆水、稳定的凝胶或分散系统、治疗乳浆、脂质体递送系统、局部贴剂或膜、基于表面活性剂的清洁系统，例如香波或身体洗液、气溶胶的或喷雾的分散液或乳状液、毛发或皮肤调理剂、造型辅助剂，或产生颜色的产品，例如彩妆，以及其他合适的美容和化妆品制品。在一些实施方案中，载体优选的是选自水、丙二醇、乙醇、丙醇、甘油、丁二醇和聚乙二醇的至少一种。
在其它实施方案中，本发明提供了包含经修饰的变体BBPI的个人护理组合物，用于毛发护理，所述经修饰的变体BBPI包含TNF变体肽(TNF-BBPI)。
在一些实施方案中，毛发护理组合物可用于改善患牛皮癣的患者中头皮皮肤的外观和/或条件。
在一个实施方案中，毛发护理组合物选自香波、护发素、头发定型组合物、染发剂、长效卷发配方、发膏、凝胶、摩丝、喷雾、乳状液、胶体悬浮液、液体、泡沫和固体。
在一些实施方案中，毛发护理组合物还包含防辐射剂。当描述个人皮肤护理组合物时，防辐射剂是选自不防水型防晒剂、高防水型防晒剂和硅油包水型防晒剂的防晒剂。在其他实施方案中，防辐射剂是选自不防水型防晒剂、高防水型防晒剂和硅油包水型防晒剂的防晒剂。
在一些实施方案中，个人毛发护理组合物包含经修饰的变体VEGF-BBPI(如本文所述)和生理学可接受的载体或赋形剂。优选的，VEGF-BBPI存在的量是按重量计，基于组合物总量的约0.0001％至约5％。还优选的，VEGF-BBPI存在的量是按重量计，基于组合物总量的约0.001％至约0.5％。组合物可以是乳化的载体的形式，例如营养乳液或化妆水、稳定的凝胶或分散系统、治疗乳浆、脂质体递送系统、局部贴剂或膜、基于表面活性剂的清洁系统，例如香波或身体洗液、气溶胶的或喷雾的分散液或乳状液、毛发或皮肤调理剂、造型辅助剂，或产生颜色的产品，例如彩妆，以及其他合适的美容和化妆品制品。在一些实施方案中，载体优选的是选自水、丙二醇、乙醇、丙醇、甘油、丁二醇和聚乙二醇的至少一种。
6.1.1配方
在其他优选的实施方案中，本发明提供了包含至少一种如本文所述的经修饰的变体BBPI的化妆品和/或药物组合物，以及生理学可接受的载体或赋形剂。优选的，化合物存在的量是按重量计，基于组合物总量的约0.0001％至约5％。还优选的，化合物存在的量是按重量计，基于组合物总量的约0.001％至约0.5％。组合物可以是乳化的载体的形式，例如营养乳液或化妆水、稳定的凝胶或分散系统、治疗乳浆、脂质体递送系统、局部贴剂或膜、基于表面活性剂的清洁系统，例如香波或身体洗液、气溶胶的或喷雾的分散液或乳状液、毛发或皮肤调理剂、造型辅助剂，或产生颜色的产品，例如彩妆。载体优选的是选自水、丙二醇、乙醇、丙醇、甘油、丁二醇和聚乙二醇的至少一种。
可以预期，本发明可用于多种个人护理组合物。本发明并非意在限于任何特性模式或类型的组合物。下列描述提供了包含下列发明的示例性而非限制性的组合物。
乳状液包含一类惯用的、常规使用的化妆品。术语“乳状液”一般用于指代两种液体的非均匀相体系，所述液体彼此是不可混溶的，或仅以有限的程度混溶，通常称作“相”。一种相典型的是液滴的形式(即，“分散的”、“不连续的”或“内部的”相)，而另一种液体形成连续的(即，“一致的”或“外部的”)相。较不常用的形式包括多重乳状液(即，分散(或不连续)相的液滴中的部分液滴还包含另一分散相，例如水/油/水(W/O/W)乳状液和油/水/油(O/W/O)乳状液)。
如果油相精细的分布在水相中，则这是水包油乳状液(O/W乳状液；例如牛奶)。O/W乳状液的基本特征是由水决定的。这类乳状液一般在皮肤上是少油腻的，比W/O(油包水)乳状液更适合(matting)皮肤，且被皮肤更快的吸收。
本领域技术人员熟知配制稳定的W/O制品的大量选择，所述W/O制品是用于化妆品和/或皮肤病学用途，包括例如乳膏和软膏的配方，所述配方在从室温至皮肤温度的范围内是可铺展的，以及在上述温度范围内更具流动性的化妆水和乳液。
乳状液的稳定性取决于它们的粘度，特别是外部相的粘度。当精细分散的颗粒聚集起来形成相对大的聚集物(aggregate)并且液滴处于连接的合并状态时，乳状液变得不稳定。该过程称为“聚结”。乳状液的外部相越粘稠，聚结的过程就越慢。多种化妆品(例如，皮肤护理化妆水、清洁化妆水、面部化妆水、手部化妆水，等)中使用了“液态”(＝可流动的)粘稠度的乳状液。这类组合物一般具有从约2000mpa至约10,000mpa的粘度。可流动的乳状液的稳定性值得特别关注，因为非常大的颗粒移动性促进更快的聚结。
已知目前通常使用的液态乳状液一般包含增稠剂，对于相对高的电解质浓度是不稳定的。这表现在组合物的相分离中。然而，在一些实施方案中，为了能够利用电解质的其他物理的、化学的或生理学的性质，使用某些电解质(例如，可溶于水的UV过滤材料(filters))是理想的。虽然在许多情况下，对乳状液体系的恰当选择可以提供一定程度的补救措施，但随后常常出现其他的缺点。
例如，一些由于乳化剂(如最终的任何化学物质)的事实导致的缺点，可以触发过敏反应或基于使用者的过度敏感(即，超敏(hypersensitivity))的反应。惯用的化妆品乳化剂的使用一般是完全没有风险的，但是对于一些个体，必需和/或优选“低过敏原性”组合物。实际上，在一些特别敏感的个体中，某些皮肤病是由暴露在特定乳化剂和同时暴露在阳光下触发的。因而，如本领域技术人员已知的，在一些组合物中，较不优选和/或避免特定的乳化剂。
可以制备不含乳化剂的制品。例如，一些制品具有含分散的水滴的油相(即，与W/O乳状液相似)。此类体系有时称为“水分散液(hydrodispersions)”或“油分散液(oleodispersions)”，根据何种是分散相以及何种是连续相而定。
然而，对于化妆品技术，完全免除乳化剂是既非必要也不可能的，特别是因为存在某些特别温和的乳化剂的选择。
在一些脂质体的实施方案中，脂质体包含水与一种或多种能够形成脂双层囊的成分，所述脂双层囊可以保持一种或多种功能性或活性成分。能够形成脂双层囊的非限制性实例包括：磷脂、氢化磷脂酰胆碱、卵磷脂、胆固醇和鞘脂类。优选的脂质体包括但不限于：a)脂类脂质体0003(包括水、卵磷脂和甘油)；b)脂类脂质体0300(包括水和磷脂酰胆碱)；c)脂类脂质体0111(包括水、银杏(Ginkgo biloba)叶提取物、变性酒精、氢化卵磷脂和胆固醇)；d)抗刺激性脂质体(包括水、苏丹可乐果(cola acuminata)种子提取物、红没药醇和磷脂)；e)维生素C和E脂质体(包括水、磷脂、生育酚醋酸酯和抗坏血酸棕榈酯)；f)紧肤脂质体(firming liposomes)(包括水、丁二醇、梨属(苹果)果实提取物、磷脂、生育酚醋酸酯和卡波姆(carbomer))；和g)保湿脂质体(包括水、PCA钠、生育酚醋酸酯、黄原胶、精氨酸、赖氨酸、甘氨酸和脯氨酸)。
在其他实施方案中，除本文提供的支架外，本发明的个人护理组合物进一步包含至少一种活性成分。本领域技术人员已知有多种活性成分可用于本发明的个人护理组合物中。实际上，可以预期，任何合适的活性成分或合适的活性成分的组合都可用于本发明(见例如，McCutcheon’sFunctional Materials，North American and InternationalEditions，由MCPublishing Co.出版，[2003])。例如，在一些实施方案中，按组合物的重量计，本文的个人护理组合物包含水平从约0.0001％至约20％的皮肤护理活性成分。在另一个实施方案中，按组合物的重量计，个人护理组合物包含从约0.001％至约0.5％的皮肤护理活性成分。在另一个实施方案中，按组合物的重量计，个人护理组合物包含从约0.01％至约2％的皮肤护理活性成分。
可以通过脂质体递送的功能性或活性成分的非限制性实例包括：维生素及其衍生物、抗氧化剂、蛋白质和肽、角质层分离剂、生物类黄酮(bioflavinoid)、萜类、植物化学品，以及植物、海洋生物或发酵来源的提取物。在优选的实施方案中，组合物进一步包含皮肤护理或毛发护理活性成分。活性成分可以包括任意的广泛种类的成分，如本领域已知的(见例如，McCutcheon’s Functional Materials，North American andInternationalEditions，(2003)，由MC Publishing Co.出版)。优选的，此类活性成分包括但不限于抗氧化剂如生育酚和抗坏血酸衍生物、生物类黄酮、萜类、合成化学品等、维生素和维生素衍生物、羟酸和多羟酸及其衍生物，如AHA和BHA及其反应产物、肽和多肽及其衍生物，如糖肽类和脂肽类(lipophilized peptides)、热休克蛋白和细胞因子、酶和酶抑制剂及其衍生物，如蛋白酶、MMP抑制剂、过氧化氢酶、葡萄糖氧化酶和超氧化物歧化酶、氨基酸及其衍生物、细菌、真菌和酵母发酵产物及其衍生物、包括蘑菇、藻类和海藻及其衍生物、植物甾醇类和植物和植物部分的提取物及其衍生物、磷脂及其衍生物、去头屑试剂如1-氧-2-巯基吡啶锌以及含有它们的递送系统，如本文提供的和/或本领域已知的。
在一些优选的实施方案中，皮肤护理活性成分选自维生素B3组分、泛醇、维生素E、维生素E醋酸酯、视黄醇、视黄醇丙酸酯、视黄醇棕榈酸酯、视黄酸、维生素C、可可碱、α-羟酸、法尼醇、phytrantriol、水杨酸、3-棕榈酰基五肽(palmityl peptapeptide-3)及其混合物。在一些优选的实施方案中，维生素B3组分是烟酰胺。在一些实施方案中，本文提供的组合物包含按重量计，水平从约0.0001％至约20％，优选从约0.001％至约0.5％，更优选从约0.01％至约1％的皮肤护理活性成分。
上述维生素B3化合物的示例性衍生物包括烟酸酯，包括烟酸的非血管舒张性酯类、烟酰(nicotinyl)氨基酸、羧酸的烟醇酯、烟酸氮氧化物和烟酰胺氮氧化物。烟酸的合适的酯类包括C1-C22，优选C1-C16，更优选C1-C16醇的烟酸酯。在上述实施方案中，醇类是合适的直链或支链、环状或非环状、饱和或不饱和(包括芳香族的)以及取代或不取代的。酯类优选是非血管舒张性的。
烟酸的非血管舒张性酯类包括烟酸维生素E和烟酸肌醇酯；烟酸维生素E是优选的。WO 98/22085中提供了对维生素B3化合物的更完整的描述。优选的维生素B3化合物包括烟酰胺和烟酸维生素E。
在其他实施方案中，皮肤护理活性成分包括至少一种类视黄醇。类视黄醇优选是视黄醇、视黄醇酯(例如视黄醇的C2-C22烷基酯，包括视黄醇棕榈酸酯、视黄醇乙酸酯、视黄醇丙酸酯)、视黄醛，和/或视黄酸(包括全反视黄酸和/或13-顺式视黄酸)，更优选的类视黄醇而非视黄酸。这类化合物是本领域普遍已知的，并且可从多个来源商购(例如，Sigma和Boehringer Mannheim)。优选的类视黄醇包括视黄醇、视黄醇棕榈酸酯、视黄醇乙酸酯、视黄醇丙酸酯、视黄醛、视黄酸及其组合。更优选的是视黄醇、视黄醇丙酸酯、视黄酸及视黄醇棕榈酸酯。在一些实施方案中，类视黄醇作为基本纯的材料包括在内，而在其他实施方案中，是作为提取物提供的，所述提取物是通过合适的物理和/或化学分离从天然(例如，植物)来源获得的。当本文的组合物包括了类视黄醇时，优选的包含从约0.005％至约2％，优选从约0.01％至约1％的类视黄醇。视黄醇优选使用的量是从约0.01％至约0.15％；视黄醇的酯优选使用的量是从约0.01％至约2％(例如，约1％)。
在本发明的其他实施方案中，抗氧化剂整合到个人护理组合物中。可以预期，任何合适的抗氧化剂都可用于本发明的个人护理组合物中。合适的抗氧化剂包括但不限于氨基酸(例如，甘氨酸、组氨酸、酪氨酸和色氨酸)及其衍生物、咪唑(例如，咪唑丙烯酸)及其衍生物、肽(例如，D，L-肌肽、D-肌肽和L-肌肽)及其衍生物(例如，鹅肌肽)、类胡萝卜素、胡萝卜素(例如，α-胡萝卜素、β-胡萝卜素和γ-番茄红素)及其衍生物、绿原酸及其衍生物、金硫葡萄糖、丙硫尿嘧啶及它的其他硫醇类(例如，硫氧还蛋白、谷胱甘肽、半胱氨酸、胱氨酸、胱胺及其糖基、N-乙酰基、甲基、乙基、丙基、戊基、丁基和月桂酰基、棕榈酰基、油酰基、γ-亚油酸基(g-linoleyl)、胆甾烯基和甘油基酯)及其盐、硫代二丙酸二月桂酯，硫代二丙酸二硬脂基酯，硫代二丙酸及其衍生物(例如，酯、醚、肽、脂类、核苷酸、核苷和盐)，以及非常低耐受剂量(如pmol至mmol/kg)的磺酰亚胺(sulfoximine)化合物(例如，丁硫堇(buthionine)磺酰亚胺，高半胱氨酸磺酰亚胺，丁硫堇砜，五-、六-、七硫堇磺酰亚胺)、螯合剂(例如，α-羟基脂肪酸、棕榈酸、植酸和乳铁蛋白)、α-羟酸(例如，柠檬酸、乳酸和苹果酸)、腐植酸、胆酸、胆汁提取物、胆红素、胆绿素、EDTA、EGTA及其衍生物、不饱和脂肪酸及其衍生物(例如，亚麻酸、亚油酸、油酸)、叶酸及其衍生物，亚糠基山梨糖醇(furfurylidenesorbitol)及其衍生物、泛醌和泛醇及其衍生物、维生素C及其衍生物(例如，抗坏血酸磷酸酯钠、棕榈酸抗坏血酸酯、抗坏血酸磷酸酯镁和乙酸抗坏血酸酯)、生育酚及其衍生物(例如，维生素E乙酸酯)、苯偶姻树脂的松柏基苯甲酸酯、阿魏酸、亚糠基葡萄糖醇、肌肽、丁羟基甲苯，丁羟基茴香醚，去甲二氢愈创木树酯酸，去甲二氢愈创木酸，三羟基丙基苯基酮、尿酸及其衍生物、甘露糖及其衍生物、锌及其衍生物(例如，ZnO、ZnSO4)、硒及其衍生物(例如，硒代甲硫氨酸)、均二苯代乙烯及其衍生物(如均二苯代乙烯氧化物，反式均二苯代乙烯氧化物)，以及所述适合用于本发明的特定实施方案的预期用途的活性成分的衍生物(例如，盐、酯、醚、糖类、核苷酸、核苷、肽和脂类)。
在一些实施方案中，本发明的组合物中的一种或多种抗氧化剂的浓度优选基于制品的总重量，按重量计从约0.001至约30％，特别优选按重量计从约0.05至约20％，和更优选按重量计从约1至约10％。在其他实施方案中，使用维生素E和/或其衍生物作为抗氧化剂时，优选的范围是基于配方的总重量，按重量计从约0.001至约10％。然而，本发明并非意在限于任何特定的抗氧化剂浓度，因各种浓度都可用于本发明的各种实施方案中。
在其他一些实施方案中，活性成分是儿茶素类、儿茶素类的胆酯，和/或来自植物或植物部分的含水或有机提取物，所述植物或植物部分具有一定含量的儿茶素类或儿茶素类的胆酯(例如，山茶科植物的叶，特别是茶(Camellia sinensis)[绿茶]物种)。它们的典型成分(例如，多酚类或儿茶素、咖啡因、维生素、糖、矿物质、氨基酸、脂类)可特别用于本发明的一些实施方案中。
在一些实施方案中，儿茶素类可用于本发明中。儿茶素类是一类视为氢化黄酮或花色素的化合物，并且是“儿茶素”的衍生物(儿茶酚、3，3’，4’，5，7-黄烷五醇(flavanpentol)、2-(3，4-二羟基苯基)苯并二氢吡喃-3，5，7-三醇)。表儿茶素((2R，3R)-3，3’，4’，5，7-黄烷五醇)也是可用于本发明的一些实施方案中的活性成分。
在其他实施方案中，具有一定含量的儿茶素的植物提取物，特别是绿茶的提取物(例如来自山茶属的植物的叶，特别是用作茶的，例如茶(C.sinensis)、普洱茶(C.assamica)、大理茶(C.taliensis)和滇缅茶(C.irrawadiensis)的植物的叶，以及这些物种与其他物种的杂交体的叶，例如山茶(C.japonica))可用于本发明的一些个人护理组合物中。
在其他一些实施方案中，优选的活性成分包括选自以下的多酚类和儿茶素类：(-)-儿茶素、(+)-儿茶素、(-)-儿茶素没食子酸酯、(-)-没食子儿茶素没食子酸酯、(+)-表儿茶素、(-)-表儿茶素、(-)-表儿茶素没食子酸酯、(-)-表没食子儿茶素，和(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯。
在本发明组合物的其他一些实施方案中，使用了黄酮及其衍生物(通常也统称“黄酮类”)。这些化合物具有下列基本结构(显示了取代位置)：
下文提供了可用于本发明的一些个人护理组合物中的一些更重要的黄酮类。然而，本发明并非意在限于任何特定的黄酮。
事实上，黄酮类通常以糖基化的形式存在。
在其他一些实施方案中，本发明的个人护理组合物包含至少一种具有以下共同结构公式的类黄酮：
其中Z1至Z7彼此独立的选自H、OH、烷氧基和羟基烷氧基，其中烷氧基和羟基烷氧基可以是支化的或未支化的，并具有1至18个碳原子，并且Gly选自单糖苷和寡糖苷基团。
在一些替代的实施方案中，本发明的个人护理组合物包含具有以下共同结构通式的至少一种类黄酮：
其中Z1至Z6彼此独立的选自H、OH、烷氧基和羟基烷氧基，其中烷氧基和羟基烷氧基可以是支化的或未支化的，并具有1至18个碳原子，并且Gly选自单糖苷和寡糖苷基团。
在一些优选的实施方案中，组合物具有以下共同结构通式：
其中，Gly1、Gly2和Gly3彼此独立的是单糖苷基团。Gly2和Gly3也可以独立的或共同的代表通过氢原子饱和。在一些优选的实施方案中，Gly1、Gly2和Gly3彼此独立的选自己糖基(hexosyl)，特别是鼠李糖基和葡萄糖基。然而，己糖基例如阿洛糖基(allosyl)、阿卓糖基(altrosyl)、半乳糖基、古洛糖基(gulosyl)、艾杜糖基(idosyl)、甘露糖基和塔罗糖基(talosyl)也可用于本发明的一些实施方案中。在其他实施方案中，戊糖基可用于本发明的一些个人护理组合物中。
在一些实施方案中，Z1至Z5彼此独立的有利的选自H、OH、甲氧基、乙氧基和2-羟基乙氧基，并且黄酮苷具有以下结构：
在一些实施方案中，本发明的一些个人护理组合物中提供的黄酮糖苷具有以下结构：
其中，Gly1、Gly2和Gly3彼此独立的是单糖苷基团。Gly2和Gly3也可以独立的或共同的代表通过氢原子饱和。在替代实施方案中，Gly1、Gly2和Gly3彼此独立的选自己糖基，特别是鼠李糖基基团和葡萄糖基基团。然而，其他己糖基基团例如阿洛糖基、阿卓糖基、半乳糖基、古洛糖基、艾杜糖基、甘露糖基和塔罗糖基也可用于本发明的一些实施方案中。此外，在一些实施方案中，戊糖基可用于本发明。在一些优选的实施方案中，本发明的个人护理组合物包含一种或多种黄酮糖苷，选自a-葡糖基芦丁、a-葡糖基杨梅酮、a-葡糖基异栎素、a-葡糖基异栎素和a-葡糖基槲皮素。在一些特别优选的实施方案中，黄酮糖苷是a-葡糖基芦丁。
在其他一些实施方案中，本发明的个人护理组合物包含至少一种柑橘苷(例如，橙色菌素(aurantin)、柑橘素-7-鼠李糖-葡糖苷)、橙皮苷3’，5，7-三羟基-4’-甲氧基黄酮-7-芸香糖苷、橙皮糖苷(hesperidoside)、橙皮苷-7-O-芸香糖苷、芸香苷(3，3’，4’，5，7-五羟基黄酮-3-芸香糖苷、栎素-3-芸香糖苷、槐苷、芦丁(birutan)、芦丁(rutabion)、taurutin、原芸香苷(phytomelin)、芸香苷(melin))、曲克芦丁(3，5-二羟基-3’，4’，7-三(2-羟基乙氧基)黄酮-3-(6-O-(6-脱氧-a-L-吡喃甘露糖基)-b-D-吡喃葡萄糖苷))、莫诺芦丁(3，3’，4’，5-四羟基-7-(2-羟基乙氧基)黄酮-3-(6-O-(6-脱氧-a-L-吡喃甘露糖基)-b-D-吡喃葡萄糖苷))、二羟刺槐乙素(3，3’，4’，5’，7-五羟基黄烷酮)、紫杉叶素(3，3’，4’，5，7-五羟基黄烷酮)、圣草酚-7-葡萄糖苷(3’，4’，5，7-四羟基黄烷酮-7-葡萄糖苷)、flavanomarein(3’，4’，7，8-四羟基黄烷酮-7-葡萄糖苷)，和/或异栎素(3，3’，4’，5，7-五羟基黄烷酮-3-(b-D-吡喃葡萄糖苷))。在一些其他的实施方案中，活性成分选自泛醌和质体醌。泛醌的特征是结构通式：
泛醌是分布最广和研究最多的生物醌类。根据与侧链相连的异戊二烯单元的数目，将泛醌称为Q-1、Q-2、Q-3等，或者根据碳原子的数目，称为U-5、U-10、U-15等。优选取自某些链长度(例如，在一些微生物和酵母中n＝6)。在大部分哺乳动物(包括人)中，Q10占主导地位。辅酶Q10特别用于本发明的一些实施方案中。其结构通式是：
质体醌具有共同的结构通式：
质体醌的异戊二烯基团数目不同，并相应的命名(例如，PQ-9[n＝9])。此外，一些实施方案中存在醌环上具有改变的取代基的其他质体醌。
在其他实施方案中，本发明提供了适合用作除臭剂和/或止汗剂的制品。可以预期，任何常规可用于此类制品中的活性成分也可用于本发明的各个实施方案中。常规可用于此类制品中的其他组分也可用于本发明的各个实施方案中。此类活性成分和非活性化合物的实例包括但不限于：掩味剂(例如，香料)、气味吸附剂(例如，DE-P 4009347中描述的页硅酸盐)；以及蒙脱土、高岭土、伊利石、贝得石、绿脱石、皂石、锂蒙脱石、膨润土、蒙脱石，和蓖麻油酸的锌盐。在本发明的一些实施方案中，此类制品中的活性成分(即，一种或多种化合物)的范围优选是按重量计从约0.001至约30％；更优选是按重量计从约0.05至约20％；最优选是按重量计在约1至约10％的范围内，基于制品的总重量。
在一些实施方案中，本发明的组合物包含安全和有效量的皮肤病学可接受的载体，所述载体适合局部施用于皮肤或毛发，其中整合了必要材料和任选的其他材料，使得必要材料和任选的组分能够以恰当的浓度递送至皮肤和毛发。因而，在一些实施方案中，对于必要组分，载体作为稀释剂、分散剂、溶剂等发挥作用，保证上述组分可以以恰当的浓度施用且均匀的分布于选定的目标。
在其他实施方案中，在待施用于角质材料(例如，指甲和毛发)上的组合物中也包括有效量的一种或多种本文所述化合物，所述组合物包括但不限于毛发喷雾组合物、发型组合物、洗发香波和/或护发素组合物、出于调控毛发生长的目的施用的组合物，以及出于治疗皮脂溢(seborrhoea)、皮炎和/或头皮屑的目的，施用于头发和头皮的组合物。
在其他实施方案中，在适用于皮肤或毛发局部施用的组合物中包括有效量的一种或多种本文所述化合物。这些组合物以任何合适的形式提供，包括但不限于：乳膏、化妆水、凝胶、悬浮液分散液、微乳状液、纳米分散液、微球体、水凝胶、乳状液(例如，水包油和油包水，以及多重乳状液)和多层凝胶等(见例如，Schlossman等，The Chemistry andManufacture of Cosmetics，[1998]，通过引用整合到本文中作为参考)。在一些实施方案中，组合物配制为含水或硅油组合物，而在其他实施方案中，其配制为一种或多种油相在含水连续相中(或者水相在油相中)的乳状液。
本发明中利用的载体类型取决于组合物目的产品类型。载体可以是固体、半固体或液体的。合适的载体包括液体、半固体(例如，乳膏、化妆水、凝胶、棒、软膏和膏(paste))、喷雾和摩丝。载体优选是化妆水、乳膏或凝胶的形式，更优选的具有充分的粘稠度或屈服点(yield point)以阻止颗粒沉淀。在一些实施方案中，载体是惰性的，而在其他实施方案中其提供皮肤病学的益处。在一些实施方案中将载体直接施用到皮肤和毛发上，而在其他实施方案中，通过纺织的或无纺的巾或布来施用。在其他实施方案中，是以贴剂、面膜或绷带(wrap)的形式。在其他实施方案中，将其气溶胶化或者喷雾或泵至皮肤和/或毛发上。选定的载体与本网所述的必要组分是物理和化学相容的，并且应该不会不恰当的损害与本发明组合物相关的稳定性、功效或其他使用益处。
优选的载体含有皮肤病学可接受的、亲水的稀释剂。合适的亲水的稀释剂包括水、有机亲水稀释剂例如C2-C10、优选C2-C6、优选C3-C6一元醇和低分子量的二元醇和多元醇，包括丙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、甘油、丁二醇、1，2，4-丁三醇、山梨醇酯、1，2，6-己三醇(hexametriol)、戊二醇、己二醇、山梨醇酯、乙氧基化醚、丙氧基化醚，及其组合。稀释剂优选是液体。水是优选的稀释剂。组合物优选包含至少约20％的亲水稀释剂。
在一些实施方案中，合适的载体还包含乳状液，所述乳状液包含亲水相，特别是含水相，和疏水相(例如，脂、油或油性材料)。如本领域技术人员普遍已知的，根据成分的组成，亲水相分散在疏米相中，或反之亦然，分别形成亲水的或疏水的分散相和连续相。术语“分散相”是乳状液技术领域的技术人员普遍已知的，用于指代作为分散在连续相中或被连续相包围的小颗粒或液滴存在的相。分散相也称为内部相或不连续相。乳状液可以是或者包含(例如，以三相或其他多相乳状液)水包油乳状液或油包水乳状液(例如硅油包水乳状液)。水包油乳状液典型的包含从约1％至约60％(优选约1％至约30％)的分散疏水相，和从约1％至约99％(优选约10％至约90％)的连续亲水相，而油包水乳状液典型的包含从约1％至约98％(优选约40％至约90％)的分散亲水相，和从约1％至约50％(优选约1％至约30％)的连续疏水相。
在其他实施方案中，载体还包括一种或多种促进从皮肤上部的角质层屏障渗透到皮肤下层的组分。渗透增强剂的实例包括但不限于：丙二醇、氮酮、乙氧基二甘醇、二甲基异山梨醇酯、尿素、乙醇和二甲基亚砜，以及微乳状液、脂质体和纳米乳状液。
在一些其他的实施方案中，本发明的组合物包含湿润剂(humectant)，优选存在的水平从约0.01％至约20％，优选从约0.1％至约15％和优选从约0.5％至约10％。优选的湿润剂包括但不限于选自以下的化合物：多元醇、山梨醇、甘油、尿素、甜菜碱、D-泛醇、DL-泛醇、泛酸钙、蜂王浆、泛硫乙胺(panthetine)、泛酰巯基乙胺(pantotheine)、泛酰醇乙醚、潘氨酸(pangamic acid)、吡哆醇、泛解基乳糖维生素B复合物、吡咯烷酮羧酸钠、己烷-1，2，6，-三醇、胍及其衍生物，及上述的混合物。
用于本文的合适的多元醇包括但不限于聚亚烷基二醇和优选烯化多元醇(alkylene polyol)及其衍生物，包括丙二醇、二丙二醇、聚丙二醇、聚乙二醇及其衍生物、山梨醇、羟丙基山梨醇、赤藓醇、苏糖醇、季戊四醇、木糖醇、葡萄糖醇、甘露糖醇、戊二醇、己二醇、丁二醇(例如，1，3-丁二醇)、己三醇(例如，1，2，6-己三醇)、三羟甲基丙烷、新戊二醇、甘油、乙氧基甘油、丙烷-1，3-二醇、丙氧基化甘油及其混合物。任意上述多元醇的烷氧基化衍生物也适合用于本文中。本发明优选的多元醇选自甘油、丁二醇、丙二醇、戊二醇、己二醇、二丙二醇、聚乙二醇、己三醇、乙氧基化甘油、丙氧基化甘油及其混合物。
用于本发明的合适的湿润剂是2-吡咯烷酮-5-羧酸钠(NaPCA)；胍；乙醇酸和乙醇酸盐(例如，铵盐和烷基季铵盐)；乳酸和乳酸盐(例如，铵盐和烷基季铵盐)；任意各种形式的芦荟(aloe vera)(例如，芦荟胶)；透明质酸及其衍生物(例如盐衍生物，如透明质酸钠)；乳酰胺单乙醇胺；乙酰胺单乙醇胺；尿素；甜菜碱；泛醇及其衍生物；及其混合物。
在一些实施方案中，至少一部分(按组合物的重量计，至多约5％)湿润剂以与微粒状交联的疏水丙烯酸或甲基丙烯酸共聚物混合的形式整合到本发明的组合物中，其自身存在的量从约0.1％至约10％，可以添加到水相或分散相中。该共聚物对降低光泽和控油是特别有价值的，同时帮助提供有效的保湿益处，进一步描述在WO96/03964中，后者通过引用整合到本文中作为参考。
在一些实施方案中，本发明的水包油和油包水组合物包含从约0.05％至约20％，优选从约1％至约15％，优选从约2％至约10％，优选从约2％至约5％的皮肤病学可接受的柔润剂。柔润剂倾向于润滑皮肤、增加皮肤的光滑度和柔软度，阻止或减轻皮肤干燥和/或保护皮肤。柔润剂典型的是不溶于水的，油性或蜡质的材料和柔润剂可以使局部组合物产生有美感的性质。多种合适的柔润剂是已知的(见例如，Sagarin，Cosmetics，Scienceand Technology，第2版，第1卷，第32-43页[1972]；和WO 00/24372)并用于本文中，含有适合作为柔润剂的材料的多个实例。其他柔润剂包括但不限于以下的：
i)具有约7至约40个碳原子的直链和支链碳氢化合物，例如矿物油、十二烷、角鲨烷、胆固醇、氢化聚异丁烯、异十六烷、异二十烷、异六十八烷(isooctahexacontane)、hexapentacontahectane，和C7-C40异构烷烃，其是C7-C40支化的碳氢化合物。用于本文的合适的支链碳氢化合物选自isopentacontaoctactane、凡士林及其混合物；
ii)C1-C30羧酸的C1-C30脂肪酸酯、C2-C30二羧酸的苯甲酸C12-C15烷酯，例如异壬酸异壬基酯、新戊酸异硬脂酸酯、辛酸异癸酯、异壬酸异癸酯、异壬酸十三烷酯、辛酸肉豆蔻酯、壬酸辛酯、异壬酸辛酯、肉豆蔻酸十四烷酯、新戊酸肉豆蔻酯、辛酸肉豆蔻酯、肉豆蔻酸异丙酯、丙酸肉豆蔻酯、硬脂酸异丙酯、异硬脂酸异丙酯、异硬脂酸甲酯、山嵛酸(behenylbehenate)、马来酸二辛酯、己二酸二异丙酯，和二聚亚油酸二异丙酯(diisopropyldilinoleate)及其混合物也可用于本发明中；
iii)糖和相关材料的C1-C30单酯和聚酯。这类酯源自糖或多元醇部分和一个或多个羧酸部分。根据构成的酸和糖，这类酯在室温下可以是液体或固体的形式。实例包括：葡萄糖四油酸酯、半乳糖油酸四酯、山梨醇四油酸酯、蔗糖四油酸酯、蔗糖五油酸酯、蔗糖六油酸酯、蔗糖七油酸酯、蔗糖八油酸酯、山梨醇六酯(sorbitol hexaester)。其他材料包括蔗糖的棉籽油或大豆油脂肪酸酯。此类此类的其他实例描述在WO 96/16636中，通过引用整合到本文中作为参考；
iv)植物油和氢化植物油。植物油和氢化植物油的实例包括红花油、葡萄籽油、椰子油、棉籽油、步鱼油、棕榈仁油、棕榈油、花生油、大豆油、菜籽油、亚麻籽油、米糠油、松油、坚果油、芝麻油、向日葵籽油、前述来源的部分或全部氢化的油，及其混合物；
v)可溶性或胶体状可溶性的保湿剂。实例包括透明质酸和硫酸软骨素。
术语“脂”通常用作指代脂肪、油、蜡等的总称。此外，术语“油相”和“脂相”也是同义使用的。然而，油和脂肪彼此极性不同，难以定义。已建议采用与水的界面张力作为油或油相的极性指数的测量。因而，可以预期，将界面张力视为对给定的油组分的极性的合适测量。“界面张力”是作用在两个相间界面上的长度为1米的假想线的力。在该测量中，油相和水之间的界面张力越低，待分析的油相的极性越大。该界面张力的物理单位是从力/长度关系常规计算的，通常以mN/m(毫牛顿除以米)表述。如果尽力降低界面，则具有正号，相反的情况下则具有负号。如本文使用的，如果与水的界面张力小于30mN/m，则将脂类视为“极性的”。
“极性油”包括来自卵磷脂和脂肪酸甘油三酯的那些，即，饱和和/或不饱和、支化和/或未支化的烷烃羧酸的甘油三酯，所述烷烃羧酸具有链长度为8至24个，特别是12至18个碳原子。在一些实施方案中，脂肪酸甘油三酯选自合成的、半合成的和天然的油(例如，橄榄油、向日葵油、豆油、花生油、菜籽油、杏仁油、棕榈油、椰子油、蓖麻油、麦胚油、葡萄籽油、蓟籽油、月见草油、澳洲坚果油等)。然而，本发明并非意在限于含有特定极性油的组合物。可用于本发明的极性油的其他实例包括链长为3-30个碳原子的饱和和/或不饱和、支化和/或未支化链烷羧酸与链长为3-30个碳原子的饱和和/或不饱和、支化和/或未支化醇的酯，芳族羧酸与链长为3-30个碳原子的饱和和/或不饱和、支化和/或未支化醇的酯。在一些实施方案中，此类酯油选自肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、硬脂酸异丙酯、油酸异丙酯、硬脂酸正丁酯、月桂酸正己酯、油酸正癸酯、硬脂酸异辛酯、硬脂酸异壬酯、异壬酸异壬酯、棕榈酸2-乙基己酯、月桂酸2-乙基己酯、硬脂酸2-己基癸酯、棕榈酸2-辛基十二烷基酯、油酸油酯、芥酸油酯、油酸瓢儿菜酯、芥酸瓢儿菜酯，和此类酯的合成的、半合成的和天然的混合物(例如，霍霍巴油)。
此外，在一些实施方案中，油相选自二烷基酯，以及饱和和/或不饱和、支化和/或未支化的醇类。在一些特别优选的实施方案中，优选的实施方案的组合物的油相还含有苯甲酸C12-15烷基酯，而在替代的实施方案中，优选的实施方案只含有后者。在其他实施方案中，油相选自格尔伯特(Guerbet)醇(即，以Marcel Guerbet的名字命名的醇类，他第一个描述了该类醇的制备)。这类醇根据下列方程式形成：
通过将醇氧化为醛，通过醛的醛醇缩合，从醇醛中除去水并将烯丙基醛氢化而形成。即使在低温下，格尔伯特醇也是液体，导致基本上没有皮肤刺激。因而，它们用作皮肤护理和毛发护理组合物中的加油剂、富油剂以及重新加油(refatting)的组分。实际上，格尔伯特醇的使用是化妆品领域已知的。在这类应用中，所述醇一般具有下列结构的特征；
在该结构中，R1和R2通常是未支化的烷基。在本发明的一些优选的实施方案中，下列格尔伯特醇可用于本发明中，其中：R1是丙基、丁基、戊基、己基、庚基或辛基，和/或R2是己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基或十四烷基。在其他实施方案中，优选的格尔伯特醇包括具有下列化学结构的2-丁基辛醇：
所述2-丁基辛醇是可商购的，例如以商标名12(CondeaChemie GmbH)，以及具有下列化学结构的2-己基癸醇：
所述2-己基癸醇是可商购的，例如以商标名16(CondeaChemie GmbH)。
在其他实施方案中，格尔伯特醇的混合物可用于本发明的组合物中。例如，2-丁基辛醇和2-己基癸醇的的混合物可用于一些实施方案中。在最终化妆品或皮肤病学制品中的格尔伯特醇的总量基于制品的总重量，选自按重量计多达约25.0％的范围，优选按重量计约0.5％至约15.0％。然而，本发明并非意在限于任何特定的浓度或浓度范围，因本领域技术人员已知如何制备具有合适浓度的组合物用于目的组合物及其用途。此外，可以预期，油和/或蜡组分的任何混合物都可用于本发明中。例如，在一些实施方案中，蜡(例如，棕榈酸十六醇酯)可用作油相的唯一脂类组分。在其他实施方案中，非极性油(例如，选自支化的和未支化的碳氢化合物和碳氢化合物类的蜡，特别是(即，凡士林)、石蜡油、角鲨烷(squalane)和角鲨烯、聚烯烃和氢化聚异丁烯)可用于本发明中。在一些含有聚烯烃的实施方案中，聚癸烯是优选的物质。
可用于本发明的实施方案中的脂肪和/或蜡组分包括但不限于植物蜡、动物蜡、矿物蜡和石油化学制品的蜡。特别优选的蜡的实例包括小烛树蜡、巴西棕榈蜡、野漆树蜡、西班牙草蜡、软木蜡、guaruma蜡、米胚油蜡、甘蔗蜡、浆果蜡、小冠巴西棕蜡、褐煤蜡、霍霍巴蜡、牛油树脂、蜂蜡、虫胶蜡、鲸蜡、羊毛脂(羊毛蜡)、尾臀油脂、纯地蜡、地蜡(地蜡)、石蜡和微晶蜡。
可用于本发明的其他脂肪和/或蜡组分包括化学改性的蜡和/或合成的蜡(例如，以商标名HRC(三-二十二烷酸甘油酯)和AW 1C(C18-C36脂肪酸)，从CRODA GmbH可商购获得)，和褐煤酯蜡、Sasol蜡、氢化霍霍巴蜡、合成或改性的蜂蜡(例如，含聚氧乙烯或聚氧丙烯侧链的聚二甲基硅氧烷蜂蜡和/或C30-50烷基蜂蜡)、聚亚烷基蜡，聚乙二醇蜡，以及化学改性的脂肪，例如氢化植物油(例如氢化蓖麻油和/或氢化椰子脂肪甘油酯)，甘油三酯，如三羟基三硬脂酸甘油酯，脂肪酸、脂肪酸酯和乙二醇酯，例如C20-40烷基硬脂酸酯、C20-40烷基羟基硬脂酰基硬脂酸酯和/或褐煤酸乙二醇酯。在其他实施方案中，本发明包含某些有机硅化合物，与特定的脂肪和/或蜡组分(例如，硬脂氧基三甲基硅烷)具有相似的物理性质。在其他实施方案中，单独的提供脂肪和/或蜡组分，而在其他实施方案中，作为混合物提供。实际上，预期此类脂肪和/或蜡组分的任何所需混合物都可用于本发明的各个实施方案中。
在一些实施方案中，油相选自异硬脂酸2-乙基己基酯、辛基十二烷醇、异壬酸异十三烷基酯、丁二醇二辛酸酯/二癸酸酯(isoeicosane)、椰油酸2-乙基己基酯、苯甲酸C12-C15烷基酯、三(辛酸/癸酸)甘油酯，和二辛基醚。在替代的实施方案中，提供了各种油相的混合物，包括但不限于包含下述一种或多种的混合物：辛基十二烷醇、三(辛酸/癸酸)甘油酯、二辛基醚、苯甲酸C12-C15烷基酯、异硬脂酸2-乙基己基酯、异壬酸异十三烷基酯。下表提供了脂类的列表，所述脂类可单独用于或与其他脂类组合用于本发明的各个实施方案中。最后一栏给出了与水的相应的界面张力。然而，本发明并非意在限于这些特定的组分，其他组分也可用于本发明的各个实施方案中，包括极性更大或更小的组分的混合物等。
在一些实施方案中，制品的一些或全部油相选自环状和/或线性的硅酮，通常也称为“硅油”。在一些实施方案中，这类硅酮或硅油以单体存在，一般特征是下列结构元件：
具有两个或多个甲硅氧烷基单元的硅烷用于本发明的一些实施方案中，一般特征是下列结构元件：
其中，硅原子可以被相同或不同的烷基和/或芳香基取代，一般用基团R1至R4表示，其中不同基团的数目不必然限于4，可以采用的值从2至200,000。
根据本发明有利的使用的环状硅烷一般的特征是具有以下的结构元件：
其中，硅原子可以被相同或不同的烷基和/或芳香基取代，一般用基团R1至R4表示，其中不同基团的数目不必然限于4，可以采用的值从3/2至20。考虑“n”为分数值是环中间可以存在不等数目的硅氧基。
在一些实施方案中，选择苯基三聚甲基硅氧烷作为硅油。适用于本发明的各个实施方案中的其他硅油包括但不限于聚二甲基硅氧烷、苯基聚二甲基硅氧烷、环状聚二甲基硅氧烷(八甲基环四硅氧烷)、六甲基环三硅氧烷、聚二甲基硅氧烷、聚(甲基苯基硅氧烷)、十六烷基聚二甲基硅氧烷和山嵛氧基聚二甲基硅氧烷。在替代的实施方案中，这类化合物的混合物可用于本发明中，包括但不限于环状聚二甲基硅氧烷和异壬酸异十三烷基酯的混合物，和环聚二甲基硅氧烷和异硬脂酸2-乙基己基酯的混合物。在其他实施方案中，相似组成的硅油，例如侧链已经衍生化的上文提及的化合物(例如，聚乙氧基化和/或聚丙氧基化)可用于本发明中。这包括但不限于这样的化合物，如聚硅氧烷-聚烷基-聚醚共聚物，例如含聚氧乙烯或聚氧丙烯侧链的十六烷基聚二甲基硅氧烷(即，含聚氧乙烯或聚氧丙烯侧链的十六烷基聚二甲基硅氧烷(和)异硬脂酸聚甘油(4)酯(和)己基月桂酸酯)。实际上，本发明并非意在限于任何特定的硅油或硅油的混合物，因多种油可用于本发明的各个实施方案中。
在其他实施方案中，油包水(W/O)乳状液可用于本发明中。在一些实施方案中，W/O乳状液与或不与其他辅助乳化剂一起使用。在其他实施方案中，本发明的W/O乳状液还包含一种或多种乳化剂，包括但不限于一种或多种的下列化合物：卵磷脂、羊毛脂、微晶蜡(Cera微晶蜡)与石蜡油(液体石蜡)的混合物、地蜡、氢化蓖麻油、油酸聚甘油(3)酯、羊毛蜡酸混合物、羊毛蜡醇混合物、季戊四醇异硬脂酸酯、二异硬脂酸聚甘油(3)酯、蜂蜡(白蜂蜡)和硬脂酸、二羟基鲸蜡磷酸钠与异丙基羟基鲸蜡醚的混合物、甲基葡萄糖二油酸酯、甲基葡萄糖二油酸酯与羟基硬脂酸和蜂蜡的混合物、矿物油与凡士林、地蜡、油酸甘油酯和羊毛醇酯的混合物、凡士林与地蜡、氢化蓖麻油、异硬脂酸甘油酯和三聚甘油油酸酯的混合物、聚氧乙烯(7)氢化蓖麻油、地蜡和氢化蓖麻油、异硬脂酸聚甘油(4)酯、异硬脂酸聚甘油(4)酯与含聚氧乙烯或聚氧丙烯侧链的十六烷基聚二甲基硅氧烷二油酸聚甘油(2)酯和月桂酸己酯的混合物、月桂酰基甲基硅氧烷共聚醇(laurylmethicone copolyol)、含聚氧乙烯或聚氧丙烯侧链的十六烷基聚二甲基硅氧烷二油酸聚甘油(2)酯、丙烯酸/C10-C30-烷基丙烯酸交流聚合物、Poloxamer 101、二聚羟基硬脂酸酯聚甘油(2)酯(polyglyceryl-2dipolyhydroxystearate)、二异硬脂酸聚甘油(3)酯、二聚羟基硬脂酸聚甘油(4)酯、聚氧乙烯(30)二聚羟基硬脂酸酯、二异硬脂酰基二异硬脂酸聚甘油(3)酯、二聚羟基硬脂酸聚甘油(2)酯、二聚羟基硬脂酸聚甘油(3)酯、二聚羟基硬脂酸聚甘油(4)酯、二油酸聚甘油(3)酯。
在本发明的其他实施方案中，本发明的W/O乳状液包含一种或多种辅助乳化剂、包括但不限于以下的：硬脂酸甘油酯与十六/十八醇聚氧乙烯(20)醚的混合物、十六/十八醇聚氧乙烯(25)醚、十六/十八醇聚氧乙烯(6)醚与硬脂酸醇的混合物、十六-十八醇(cetylstearyl alcohol)与聚氧乙烯(40)蓖麻油和十六-十八烷基硫酸钠的混合物、三(十六/十八醇聚氧乙烯(4)醚)磷酸酯、十六-十八烷硫酸钠、卵磷脂三(月桂基聚氧乙烯(4)醚)磷酸酯、月桂基聚氧乙烯(4)醚磷酸酯、硬脂酸、自乳化型硬脂酸丙二醇酯、聚氧乙烯(25)氢化蓖麻油、聚氧乙烯(54)氢化蓖麻油、甘油聚氧乙烯(6)醚辛酸/癸酸酯、甘油油酸酯与丙二醇的混合物、十六烷基聚氧乙烯(2)醚、十六烷基聚氧乙烯(20)醚、聚山梨醇酯60、硬脂酸甘油酯与硬脂酸聚乙二醇(100)酯的混合物、月桂基聚氧乙烯(4)醚、十六/十八醇聚氧乙烯(3)醚、异硬脂基甘油醚、十六-十八醇与十六-十八醇硫酸钠的混合物、月桂基聚氧乙烯(23)醚、硬酯基聚氧乙烯(2)醚、硬脂酸甘油酯与硬脂酸聚乙二醇(30)酯的混合物、硬脂酸聚乙二醇(40)酯、二硬脂酸甘油酯、聚氧癸基乙烯(4.5)聚氧乙烯(22)聚氧癸基乙稀(4.5)嵌段共聚物、聚甘油(2)聚氧乙烯(4)醚硬脂酸酯、十六/十八醇聚氧乙烯(20)醚、甲基葡糖倍半硬脂酸酯、硬酯基聚氧乙烯(10)醚、硬脂酸聚乙二醇(20)酯、硬酯基聚氧乙烯(2)醚与二硬脂酸聚乙二醇(8)酯的混合物、硬酯基聚氧乙烯(21)醚、硬酯基聚氧乙烯(20)醚、异硬酯基聚氧乙烯(20)醚、聚氧癸基乙烯(11)聚氧乙烯(45)聚氧癸基乙稀(11)嵌段共聚物、甲氧基-PEG-22/十二烷基甘醇共聚物、聚氧乙烯(20)甘油醚硬脂酸酯、PEG-8蜂蜡、月桂酸聚甘油(2)酯、琥珀酸异硬酯基双甘油酯、月桂酰胺基丙基二羟基丙基二甲基氯化铵磷酸酯、自乳化型硬脂酸甘油酯、十六烷基聚氧乙烯(20)醚、柠檬酸三乙酯、聚氧乙烯(20)甲基葡糖醚倍半硬脂酸、十六/十八烷基聚氧乙烯(12)醚、甘油硬脂酸酯柠檬酸酯、磷酸鲸蜡醇酯、三[十六/十八醇聚氧乙烯(4)醚]磷酸酯、三[月桂基聚氧乙烯(4)醚]磷酸酯、甲基葡糖二硬脂酸聚甘油酯、鲸蜡基磷酸钾(potassium cetyl phosphate)、异硬酯基聚氧乙烯(10)醚、倍半异硬脂酸聚甘油(2)酯、十六烷基聚氧乙烯(10)醚、油醇聚醚-20、异十六烷基聚氧乙烯(20)醚、硬脂酸甘油酯与十六/十八醇聚氧乙烯(20)醚的混合物、十六/十八醇聚氧乙烯(12)醚、十六-十八醇和棕榈酸十六醇酯、十六-十八醇与硬脂酸聚乙二醇(20)酯的混合物、硬脂酸聚乙二醇(30)酯、硬脂酸聚乙二醇(40)酯和硬脂酸聚乙二醇(100)酯。
在制品的油相至少部分包含硅油的其他实施方案中，使用硅氧烷乳化剂。在一些实施方案中，硅氧烷乳化剂选自界面活性物质、含聚氧乙烯或聚氧丙烯侧链的烷基聚甲基硅氧烷二油酸聚甘油(2)酯(alkylmethicone copolyol)和/或含聚氧乙烯或聚氧丙烯侧链的烷基聚二甲基硅氧烷二油酸聚甘油(2)酯(alkyl dimethicone copolyol)，特别是选自特征为下列化学结构的化合物：
其中，X和Y彼此独立的选自H、具有1至24个碳原子的支化和未支化的烷基、酰基和烷氧基，p是从0至200的数，q是从1至40的数，r是从1至100的数。可用于本发明中的硅氧烷乳化剂的一些实例包括但不限于含聚氧乙烯或聚氧丙烯侧链的聚二甲基硅氧烷(例如，B8842、B 8843、B 8847、B 8851、B 8852、B 8863、B 8873和B 88183，以上都可从Th.Goldschmidt AG商购获得)。可用于本发明中的界面活性物质的另一个实例包括含聚氧乙烯或聚氧丙烯侧链的十六烷基聚二甲基硅氧烷二油酸聚甘油(2)酯(EM 90)，以及环甲硅氧烷二甲硅氧烷共聚物(cyclomethiconedimethicone copolyol)(EM 97)，两者都可从Th.Goldschmidt AG商购获得。已证实在多个组合物中有效的另一种乳化剂是月桂基甲硅氧烷共聚物(laurylmethicone copolyol)(Dow5200Formulation Aid)，可从Dow Corning Ltd商购获得，所述组合物可用于本发明的实施方案中。
在本发明的优选的实施方案中，用于个人护理组合物(例如，化妆品或皮肤护理制品)中的乳化剂的总量基于制品的总重量，按重量计位于从约0.1至约10.0％的范围内，优选按重量计约0.5至约5.0％。然而，本发明并非意在限于任何特定浓度的乳化剂和/或辅助乳化剂，因本发明的各个实施方案具有不同的优选浓度和/或浓度范围。
在一些实施方案中，本发明提供了各种形式的乳状液，包括皮肤保护乳膏、皮肤化妆水、化妆用奶液、防晒剂和日光保护奶液。在一些优选的实施方案中，这类组合物包含脂肪、油、蜡，和/或其他脂肪性物质，以及水，和一种或多种惯用于此类型配方的乳化剂。
除本发明的卸妆化妆水和/或清洁乳膏的液体和更加固体一些的乳状液外，本发明还提供了喷雾型清洁制品(“清洁喷雾”)，用于例如去除彩妆或作为温和的洗液。此外，这类清洁喷雾可用于治疗有瑕疵的皮肤的应用中。这类清洁制品还可用作“洗净型制品”(即，在应用后，从皮肤上洗净产品)。
除上述组成外，本发明的各个实施方案包括额外的组分，例如助剂和添加物，包括但不限于基础剂(bodying agent)、过滤材料(filler)、香料、染料、乳化剂、其他活性成分(例如，维生素和蛋白质)、光保护试剂、稳定剂、昆虫防护剂、醇类、自晒黑物质、水、盐、抗微生物剂、蛋白酶，和/或角蛋白酶等。实际上，本发明并非意在限于任何特定的组分，只要包括了包含支架和肽的活性组分。还可以预期，本发明可用于多种多样的医学制品。
在一些实施方案中，本发明的组合物含有乳化剂和/或表面活性剂，一般帮助分散相在连续的水相中分散和悬浮。如果产物预期用于皮肤或毛发清洁，则表面活性剂也可以是有效的。为了后文便利，“乳化剂”涵盖在术语“表面活性剂”中。因而，如本文使用的，术语“表面活性剂”指表面活性的试剂，不论是否用作乳化剂或用于其他的表面活性剂目的，例如皮肤清洁。已知包括常规的表面活性剂可用于本发明中，只要选定的试剂与组合物的关键组分是化学和物理相容的，并且提供了所需特征(见例如，WO 00/24372)。合适的表面活性剂包括非硅氧烷衍生的材料、硅氧烷衍生的材料及其混合物。
在其他实施方案中，本发明的组合物包含优选从约0.05至约30％，更优选从约0.5至约15％，最优选从约1至约10％的表面活性剂或表面活性剂的混合物。所选的实际的表面活性剂或表面活性剂的混合物取决于组合物的pH、存在的其他组分和所需终产物的美感。
本文中有效的非离子型表面活性剂是可广义定义为长链醇(例如，C8-30醇类)与糖或淀粉多聚物(例如，糖苷)的缩合产物。其他有效的非离子型表面活性剂包括氧化烯与脂肪酸的缩合产物(例如，脂肪酸的氧化烯酯)。这类材料具有共同通式RCO(X)nOH，其中R是C1-30烷基，X是-OCH2CH2-(即，源自乙二醇或氧化乙烯)或-OCH2CHCH3-(即，源自丙二醇或氧化丙烯)，n是从约6至约200的整数。其他非离子型表面活性剂是氧化烯与2摩尔的脂肪酸的缩合产物(例如，脂肪酸的氧化烯二酯)。这类材料具有共同通式RCO(X)nOOCR，其中R是C10-30烷基，X是-OCH2CH2-(即，源自乙二醇或氧化乙烯)或-OCH2CHCH3-(即，源自丙二醇或氧化丙烯)，n是从约6至约100的整数。在一些实施方案中，用于本文中的乳化剂优选是基于山梨糖醇酐脂肪酸酯和蔗糖脂肪酸酯的脂肪酸酯混合物，特别是山梨糖醇酐硬脂酸酯和蔗糖椰油酸酯的混合物。其他合适的实例包括十六/十八醇和鲸蜡硬脂基葡萄糖苷的混合物。然而，本发明并非意在限于任何特定的乳化剂，如本领域已知的各种合适的乳化剂。
在其他实施方案中，本文中有效的亲水型表面活性剂可选的或额外的包括任意的广泛多种的阳离子型、阴离子型、两性离子型和两性表面活性剂，例如本领域已知的(见例如，McCutcheon′s，Emulsifiers andDetergents，North American and InternationalEditions，MC PublishingCo.[2003]；美国专利号5,011,681；美国专利号4,421,769；和美国专利号3,755,560)。
在一些额外的实施方案中，界面的和/或表面的活性剂包括在本发明的一些个人护理组合物中，包括但不限于阳离子型乳化剂(例如，季盐类表面活性剂)。
季盐类表面活性剂含有至少一个与4个烷基或芳香基共价结合的N原子。不论pH，这都导致正电荷。烷基甜菜碱、烷基酰胺丙基甜菜碱和烷基酰胺丙基羟磺基甜菜碱是可用于本发明的一些实施方案中的季盐类表面活性剂的实例。
在本发明的一些实施方案中提供的阳离子型表面活性剂还包括但不限于季铵类化合物，特别是苄基三烷基氯化铵或溴化铵(例如苄基二甲基硬脂酰基氯化铵)、烷基三烷基铵盐(例如，鲸蜡基三甲基氯化铵或溴化铵)、烷基二甲基羟乙基氯化铵或溴化铵、二烷基二甲基氯化铵或溴化铵、烷基酰胺基乙基三甲基醚硫酸铵、烷基吡啶盐(例如，月桂基-或鲸蜡基吡啶氯化物)、咪唑啉衍生物和具有阳离子特征的化合物，例如氧化胺(例如，烷基二甲基氧化胺或烷氨基乙基二甲基氧化胺)。在一些优选的实施方案中，鲸蜡基三甲基铵盐可用于本发明的一些个人护理组合物中。
在其他实施方案中，阳离子型聚合物(例如，C162(羟丙基瓜耳羟丙基三甲基氯化铵))、经修饰的硅酸镁铝(例如，二氢化牛油基二甲基氯化铵-水辉石，是可商购的(例如，38；Rheox))和/或硬酯基二甲基苄基氯化铵和水辉石的反应产物，是可商购的(例如，gel；Hüls AG)，都可用于本发明的一些个人护理组合物中。然而，本发明并非意在限于任何特定的阳离子型聚合物。
在一些其他的实施方案中，本发明的一些组合物包含油性增稠剂，从而改善乳状液的触觉性质。优选的油性增稠剂包括但不限于其他固体(例如，型的疏水性氧化硅，可购自Degussa AG)。有利的氧化级的实例包括OX50、130、150、200、300、380、MOX 80、MOX 170、COK84、R 202、R 805、R 812、R972、R 974和R976。
在一些其他的实施方案中，本发明的一些个人护理组合物包含至少一种“金属皂”(即，较高脂肪酸的盐，除碱金属盐以外)，其功能是作为油性增稠剂。此类金属皂的实例包括但不限于硬脂酸铝、硬脂酸锌和/或硬脂酸镁。
多种阴离子型表面活性剂也可用于本文中(见例如，美国专利号3,929,678)。示例性的阴离子型表面活性剂包括但不限于烷基羟乙磺酸盐(alkoyl isethionates，例如，C12-C30)、烷基和烷基醚硫酸盐及其盐、烷基和烷基醚磷酸盐及其盐、烷基甲基牛磺酸(例如，C12-C30)和脂肪酸的皂类(例如，取代的烷基胺和碱金属盐，如钠盐或钾盐)。
两性和兼性表面活性剂也可用于本文中。可用于本发明组合物的优选的两性和兼性表面活性剂的实例是广义的描述为脂肪族的仲铵和季铵的衍生物，其中脂肪族基团可以是直链或支链的，并且其中一个脂肪族取代基含有从约8至约22个碳原子(优选C8-C18)，而一个含有阴离子的水溶性基团(例如，羧基、磺酸基(sulfonate)、硫酸基(sulfate)、磷酸基(phosphate)或膦酸基(phosphonate))。实例包括但不限于烷基亚氨基乙酸盐和亚氨基二链烷酸酯和氨基链烷酸酯、咪唑啉和铵盐衍生物。其他合适的两性和兼性表面活性剂选自甜菜碱、磺基甜菜碱、羟基磺基甜菜碱，和支化的和未支化的烷酰肌氨酸，及其混合物。
在一些其他的实施方案中，一些个人护理组合物包含至少一种两性离子型和/或两性表面活性剂(例如，椰油酰氨基丙基甜菜碱)和/或增湿剂(例如，甜菜碱)。可用于本发明的一些实施方案的两性离子型表面活性剂的实例包括但不限于酰基/二烷基乙二胺(例如，两性醋酸酰基钠)、两性酰基二丙酸二钠、两性烷基醋酸二钠、两性酰基羟丙基磺酸钠、两性酰基二醋酸二钠、酰基丙酸钠、N-烷基氨基酸，例如，氨基丙基烷基谷氨酰胺、烷基氨基丙酸、烷基亚氨基二丙酸钠，和两性月桂酰基羧酸甘氨酸酯。
在一些实施方案中，制品中的表面或界面活性物质的量(一种或多种化合物)基于制品的总重量，优选按重量计在约0.001至约30％之间，更优选按重量计在约0.05至约20％之间，最优选按重量计在约1至约10％之间。
在一些其他的实施方案中，活性成分(一种或多种化合物)包含至少一种亲脂性活性成分。在一些实施方案中，这些亲脂性活性成分选自乙酰水杨酸、阿托品、甘菊环、氢化可的松及其衍生物(例如，氢化可的松-17-戊酸盐)、B族维生素、D族维生素、维生素B1、维生素B12、维生素D1、类视黄醇、红没药醇、不饱和脂肪酸(例如，必需脂肪酸通常也称为“维生素F”)、γ-亚麻酸、油酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸及其衍生物、氯霉素、咖啡因、前列腺素、麝香草酚、樟脑、植物和动物来源的提取物或其他产物(例如，月见草油、紫草油或黑加仑籽油、鱼油、鱼肝油)，和神经酰胺和神经酰胺样化合物，等。在一些实施方案中，活性成分是加脂性(refatting)物质(例如，purcellin油、如/或)。
在其他实施方案中，本发明的一些乳状液包括了含硅氧烷的乳化剂或表面活性剂。多种硅氧烷乳化剂可用于本文中。这类硅氧烷乳化剂典型的是有机改性的有机聚硅氧烷，本领域技术人员也已知是硅氧烷表面活性剂。优选的硅氧烷乳化剂包括但不限于含聚氧乙烯或聚氧丙烯侧链的聚二甲基硅氧烷。这类材料是经改性包括了聚醚侧链的多二甲基硅氧烷，例如聚氧化乙烯链、聚氧化丙烯链、上述链的混合物，以及含有同时源自环氧乙烷和环氧丙烷的部分的聚醚链。其他实例包括烷基经修饰的含聚氧乙烯或聚氧丙烯侧链的聚二甲基硅氧烷(即，含有C2-C30悬挂侧链的化合物)。其他有效的含聚氧乙烯或聚氧丙烯侧链的聚二甲基硅氧烷包括具有各种阳离子、阴离子、两性离子和兼性悬挂部分的材料。
在一些实施方案中，本发明的组合物包含至少一种增稠剂聚合物。在本文中有效的增稠剂聚合物优选具有大于约20,000，更优选大于约50,000，最优选大于约100,000的平均分子量。在一些实施方案中，按组合物的重量计，本发明的组合物包含从约0.01％至约10％，优选从约0.1％至约8％和更优选从约0.2％至约5％的增稠剂聚合物或其混合物。
用于本文中的优选增稠剂聚合物包括但不限于非离子型增稠剂和阴离子型增稠剂，或其混合物。合适的非离子型增稠剂包括但不限于聚丙烯酰胺聚合物、交联的聚(N-乙烯吡咯烷酮)、多糖、天然的或合成的胶、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇。合适的阴离子型增稠剂包括但不限于丙烯酸/丙烯酸乙酯共聚物、羧基乙烯聚合物，和烷基乙烯醚与马来酸酐的交联共聚物。可商购的增稠剂(例如，Carbopol；Noveon)可用于本发明的一些实施方案中。合适的卡波普树脂可以是经疏水修饰的，其他合适的树脂描述在WO98/22085中，或其混合物。
在本发明的一些实施方案中，水相具有凝胶特征，除有效含量的化合物和溶剂(需要时)外，优选的包含水、其他有机和/或无机增稠剂，和/或水状胶体。
在一些实施方案中，无机增稠剂选自改性的、未改性的、天然存在的和合成的页硅酸盐(Phyllosilicates)。虽然一般优选使用纯的组分，但在一些实施方案中，不同的经改性的和/或未经改性的页硅酸盐的混合物可用于本发明的各个组合物中。如本领域普遍已知的，页硅酸盐是硅酸盐和铝硅酸盐(alumosilicate)，其中硅酸盐和铝酸盐单元通过三个Si-O-或Al-O-键交联在一起，形成蜡质的片状或层状结构。第四个Si-O-或Al-O-原子价是通过阳离子饱和的。在每层之间存在相对弱的静电相互作用(例如，氢键)。层结构大部分由强的、共价的键定义。对于纯的硅酸盐结构，片层硅酸盐的化学计量学是(Si2O5 2-)，而对于铝硅酸盐，则为(AlmSi2- mO5 (2+m)-)，其中“m”是大于0且小于2的数。在缺少纯硅酸盐而存在铝硅酸盐的一些实施方案中，每个被Al3+取代的Si4+基需要另一个单电荷的阳离子来中和电荷。优选通过H+、碱金属离子或碱土金属离子来配平电荷平衡。在替代的实施方案中，使用铝作为平衡离子。与铝硅酸盐相反，这类化合物称作“硅酸铝(aluminum silicate)”。“铝硅酸铝”可用于本发明的一些实施方案中，其中铝既存在于硅酸盐网络中，也作为平衡离子。
页硅酸盐是本领域普遍已知的(见例如，Hollemann等，Lehrbuch derAnorganischen Chemie[无机化学教科书]，第91-100版，Walter deGruyter-Verlag[1985]；Remy，Lehrbuch der Anorganischen Chemie，第12版，AkademischeVerlagsgesellschaft，Leipzig[1965])。蒙脱石的层结构也是已知的(见Chemie-Lexikon，Franckh’scheVerlagshandlung，W.Keller&Co.，Stuttgart，第8版，[1985]，第2668页)。页状硅酸盐的实例包括以下(蒙脱石是包含天然存在的膨润土(bentonites)的主要矿物)：
蒙脱石 Na0.33((Al1.67Mg0.33)(OH)2(Si4O10))
常简化为：Al2O3＊4SiO2＊H2O＊nH2O或
Al2[(OH)2/Si4O10]·n H2O
高岭石 Al2(OH)4(Si2O5)
伊利石 (K，H3O)y(Mg3(OH)2(Si4-yAlyO10))或
(K，H3O)y(Al2(OH)2(Si4-yAlyO10))
其中，y＝0.7-0.9
贝得石 (Ca，Na)0.3(Al2(OH)2(Al0.5Si3.5O10))
绿脱石 Na0.33(Fe2(OH)2(Al0.33Si3.67O10))
皂石 (Ca，Na)033((Mg，Fe)3(OH)2(Al0.33Si3.67O10))
锂蒙脱石 Na0.33((Mg，Li)3(OH，F)2(Si4O10))
在一些优选的实施方案中，无机凝胶形成因素包括但不限于硅酸铝，例如蒙脱石(膨润土、水辉石及其衍生物，如二氢化牛油基二甲基氯化铵与膨润土的反应物、二氢化牛油基二甲基氯化铵与水辉石的反应物、硬酯基二甲基苄基氯化铵与膨润土的反应物和硬酯基二甲基苄基氯化铵与水辉石的反应物)、以及硅酸铝镁(级)和硅酸钠镁(级)也可用于本发明。
蒙脱石代表了粘土矿物，是一类双八面体蒙脱石，并且在水中膨胀但不成塑性的团块。在蒙脱石的三层结构中的层包(layer packet)可以由于水(以2至7倍的量)与其他物质的可逆整合而膨胀，所述其他物质例如醇、二醇、吡啶、甲基吡啶、铵化合物、羟基铝硅酸盐离子等。上文给出的化学通式只提供了粗略估计的通式，因蒙脱石具有很大的离子交换容量。例如，Al可以被Mg、Fe2+、Fe3+、Zn、Pb(例如，来自废水中的有害物质)、Cr、Cu和其他元素替换。获得的八面体层的负电荷由在中间层的位置存在的阳离子补偿，特别是Na+(即，钠蒙脱石)和Ca2+(即，钙蒙脱石，只能非常小程度膨胀的化合物)。
在替代的实施方案中，合成的硅酸镁和/或膨润土可用于本发明中，包括但不限于此类可商购的化合物，如(Süd-Chemie)。如上所示，在一些实施方案中，硅酸铝可用于本发明中，例如可商购的(R.T.Vanderbilt Comp.，Inc)。下文提供了可用于本发明的各个实施方案中的各种级。
上述产品在水中膨胀，形成粘性凝胶，其具有碱性反应。蒙脱石或膨润土的亲有机化(organophilization)(层间阳离子与季烷基铵离子的交换)产生产物(bentones)，其优选用于分散在有机溶剂、油、脂肪、软膏、油墨、表面涂层和清洁剂中。
是各种中性和化学惰性的胶凝剂的商品名，由长链有机铵盐和特异类型的蒙脱石构建而得。胶凝剂在有机介质中溶胀，导致所述介质也溶胀。所述凝胶对稀酸和稀碱具有耐性，但是在与强酸和强碱长时间接触后部分丧失胶凝性能。由于其亲有机特性，胶凝剂用水仅仅润湿都是有困难的。存在各种可商购的胶凝剂等级，包括由KroNO Titan以下述名称出售的：一种有机改性的蒙脱石；(二甲基二辛基铵膨润土；根据美国专利2,531,427制备，该专利通过引用整合到本文中作为参考，因为它的亲脂基团，它在亲脂介质中比在水中更容易膨胀)；一种有机改性的蒙脱石，可以奶油色至白色的粉末获得；LT，一种纯化的粘土矿物；Gel MIO，一种有机改性的蒙脱石，以在矿物油中的极细的悬浮液供应(SUS-71)(10％膨润土、86.7％矿物油和3.3％的湿润剂)；Gel IPM，一种有机改性的蒙脱石，其悬浮在十四烷酸异丙酯中(10％膨润土、86.7％十四烷酸异丙酯、3.3％湿润剂)；Gel CAO，一种有机改性的蒙脱石，其在蓖麻油中被吸收(10％膨润土、86.7％蓖麻油和3.3％湿润剂)；Gel Lantrol，一种有机改性的蒙脱石，其预计以膏(paste)的形式用于进一步加工，特别是用于化妆品组合物的制备；10％膨润土、64.9(羊毛蜡油)、22.0十四烷酸异丙酯、3.0湿润剂和0.1对羟基苯甲酸丙酯；Gel Lan I，一种在羊毛蜡USP和棕榈酸异丙酯的混合物中的10％浓度的膏；Gel Lan II，一种在纯液体羊毛蜡中的膨润土膏；Gel NV，一种在邻苯二甲酸二丁酯中的15％浓度的膏；Gel OMS，一种在Shellsol T.中的膨润土膏；Gel OMS 25，一种在异构烷烃()中的膨润土膏；以及Gel IPP，一种在棕榈酸异丙酯中的膨润土膏。
“水胶体(hydrocolloid)”是更准确的名称“亲水胶体(hydrophillic coIloid)”的技术性缩写。水胶体是大分子，其具有大的线性结构和分子间的相互作用力，该相互作用力允许在单独分子之间的次价键和主价键形成网状结构。一些水胶体是水溶性的天然或合成的聚合物，其在含水体系中形成凝胶或粘性溶液。通过结合水分子(水合)，或通过将水吸收和包裹入它们的交织的大分子中，同时限制水的运动，这些化合物增加水的粘度。这些可溶于水的聚合物代表一大类天然和合成的聚合物，其在化学上非常不同，但在它们在水或含水溶液中的溶解性上具有共同的特征。其先决条件是这些聚合物具有足以维持水中溶解度的大量亲水基团，并且所述基团之间不大量交联。这些亲水基团本质上可以是非离子的、阴离子的或阳离子的，例如下列：
在一些优选的实施方案中，化妆品和皮肤病学相关水胶体的组分为下列几组：有机天然化合物(例如，琼脂、角叉菜胶、黄蓍胶、阿拉伯胶、藻酸盐、果胶、多糖类、瓜耳粉(guar flour)、角豆粉(carob bean flour)、淀粉、糊精、明胶和酪蛋白)；改性的有机天然物(例如，羧甲基纤维素和其它纤维素醚、羟乙基纤维素和羟丙基纤维素和微晶纤维素)；完全合成的有机化合物(例如，聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸化合物、乙烯聚合物、聚羧酸、聚醚、聚酰亚胺(polyimine)、聚酰胺和聚氨基甲酸酯)；以及无机化合物(例如，聚硅酸，粘土矿物质，例如蒙脱石、沸石和二氧化硅)。
在替代的实施方案中，乙基纤维素在本发明的组合物中可用作稳定剂。乙基纤维素由下面的结构表征。在该结构中，R是乙基或氢原子。
在一些优选的实施方案中，乙基纤维素中的乙基化程度从约2.0至约3.0，对应约40％至约55％，并且更优选约48.0％至约49.5％的乙基化。优选的选择这样的平均分子量，使得在25℃下在80份甲苯和20份乙醇的混合物中大约5％浓度的溶液的粘度为3到110mPas，更优选9到11mPas。在一些特别优选的实施方案中，平均摩尔质量为从约100,000g/mol至约400,000g/mol。在一些优选的实施方案中，在本发明的组合物中乙基纤维素的浓度为基于制剂的总重量，按重量计从约0.1％至约10％。各种乙基纤维素可用于本发明中，包括但不限于可商购的(例如，Standard 10Premium；Dow Chemicals)。
在另外的实施方案中，微晶纤维素可用作本发明组合物中的水胶体。各种微晶纤维素制剂可用于本发明中，包括但不限于那些可商购的(例如，例如RC-591，以及RC/CL；CE-15；和FMC Corporation Food and Pharmaceutical Products)。在一些特别优选的实施方案中，RC-591(一种改性的微晶纤维素，其由89％微晶纤维素和11％的羧甲基纤维素纳制成)可用于本发明中。
可用于本发明中的其他水胶体包括甲基纤维素(即，纤维素的甲基酯)。这些化合物的特征是下列结构式：
其中R可以是氢或甲基。
纤维素混合醚(cellulose mixed ether)(通常称为甲基纤维素，除了占主要量的甲基之外，还含有2-羟乙基、2-羟丙基或2-羟丁基)也可用于本发明的一些实施方案中。在一些优选的实施方案中，羟丙基甲基-纤维素(例如，E4M；Dow ChemicalCo.)可用于本发明中。
在其他实施方案中，羧甲基纤维素钠(即，纤维素的乙二醇醚的钠盐，对于该钠盐，上述结构式中的R可以是氢和/或CH2-COONa)可用于本发明中。在一些优选的实施方案中，羧甲基纤维素钠，有时也称为“纤维素胶”(例如，Plus 330CS；Aqualon)，发现可用于本发明中。
在其他实施方案中，黄原胶(xanthan)(CAS No.11138-66-2)，(即黄原胶)可用于本发明中，黄原胶是阴离子杂多糖，其通常由玉米糖发酵形成，并作为钾盐进行分离。它在需氧条件下由野油菜黄单孢菌(Xanthomonas campestris)和一些其它物种产生，并具有2×106至24×106的分子量。黄原胶由具有含侧链的纤维素的链形成。该亚组的结构由葡萄糖、甘露糖、葡糖醛酸、乙酸酯和丙酮酸酯组成。丙酮酸酯单元的数目决定黄原胶的粘度。
在仍进一步的实施方案中，角叉菜胶被用作本发明的组合物中的凝胶形成剂。该化合物是来自北大西洋红藻(真红藻纲(Florideae)；皱波角叉菜(Chondrus crispus)和星芒杉藻(Gigartina stellata))的提取物，其具有类似琼脂结构的结构。术语“角叉菜胶(carrageen)”被频繁用于指干燥的藻类产品，而“角叉菜聚糖(carrageenan)”被用于指其提取物。从藻类的热水提取物中沉淀的角叉菜胶是无色至沙色的粉末，分子量范围是从约100,000至约800,000，且硫酸盐含量为约25％。非常容易在温水中溶解的角叉菜胶，在冷却后形成触变胶体，即使水含量为95-98％亦是如此。该胶体的硬度受角叉菜胶的双螺旋结构的影响。
在角叉菜聚糖的情况下，三种主要成分是不同的。形成凝胶的“κ部分”由D-半乳糖-4-硫酸盐和3，6-无水-α-D-半乳糖组成，其在1，3-和1，4位置具有可选的糖苷键(相比之下，琼酯含有3，6-无水-α-L-半乳糖)。非胶凝“λ部分”由1，3-糖苷键连接的D-半乳糖-2-硫酸盐和1，4-键合的D-半乳糖-2，6-二硫酸盐基团组成，并且其在冷水中是容易溶解的。最后，由处于1，3键中的D-半乳糖-4-硫酸盐和处于1，4键中的3，6-无水-α-D-半乳糖-2-硫酸盐组成的“ι-角叉菜聚糖”不但可溶于水并且还形成凝胶。存在的任何阳离子(K+、NH4 +、Na+、Mg2+、Ca2+)的性质也影响角叉菜胶的溶解度。
在仍另外的实施方案中，脱乙酰壳多糖(即，部分脱乙酰化的壳多糖)可用于本发明的各种组合物中。脱乙酰壳多糖具有成膜性质，并且特征在于在皮肤上具有柔滑感。对于一些使用的一个缺点是：其在施用期间，在皮肤上临时(通常)出现严重的粘着现象。由于该粘着现象，一些制剂不被消费者所接受。然而，脱乙酰壳多糖可用于一些制剂中，包括毛发护理组合物，因为它在增稠和/或稳定以及改善聚合膜的粘着性和防含水方面优于壳多糖。脱乙酰壳多糖的使用对于个人护理领域的技术人员而言是熟知的(见例如，Fiedler，Lexikon der Hilfsstoffe für Pharmazie，Kosmetik und angrenzende Gebiete，[Lexikon of auxiliaries for pharmacy，cosmetics and related fields]，第3版，Editio Cantor，Aulendorf，[1989]，第293页)。脱乙酰壳多糖由以下结构式表征：
其中设想n取可达约10000的值，而X是乙酰基或氢。通过壳多糖的脱乙酰化和部分解聚(水解)，形成脱乙酰壳多糖，壳多糖由以下结构式表征：
壳多糖是节肢动物(例如，昆虫、蟹和蜘蛛)外骨骼的必要成分，还可见于其它生物体(例如软体动物、藻类、和真菌)的结缔和/或支持组织中。在约pH＜6的区域，脱乙酰壳多糖带正电，并且在该范围中，也是可溶于含水体系的。它与阴离子原材料不相容。由于该原因，为了制备含脱乙酰壳多糖的水包油化妆水，非离子型乳化剂的使用是合适的(见例如EP776657)。在一些优选的实施方案中，本发明的组合物含有至少一种脱乙酰化程度至少约＞25％的脱乙酰壳多糖，更优选地，具有从约55％至约99％范围的脱乙酰化程度(如通过1H-NMR测定)。在一些实施方案中，分子量在约10,000至约1,000,000之间，特别是分子量在100,000至1,000,000之间(利用凝胶渗透层析测定)的脱乙酰壳多糖，可用于本发明。
在仍进一步的实施方案中，聚丙烯酸酯可用作一些本发明组合物中的胶凝剂。合适的聚丙烯酸酯包括但不限于丙烯酸酯-丙烯酸烷酯共聚物，特别是选自卡波姆或共聚物(B.F.Goodrich Co.)。具体而言，可用于本发明的一些实施方案的丙烯酸酯-丙烯酸烷酯共聚物具有下列结构：
其中，R’是长链烷基，而x和y表示代表每一种共聚单体各自的化学计量比例的数目。
在一些实施方案中，丙烯酸酯共聚物和/或丙烯酸酯-丙烯酸烷基酯共聚物，包括但不限于那些可商购的(例如，1382、981、和5984；B.F.Goodrich Co.，以及具体而言，来自CARBOPOL grades 980、981、1382、2984、5984和Carbomer 2001的聚丙烯酸酯)。在另外的实施方案中，丙烯酸C10-30-烷基酯和丙烯酸的一种或多种单体的共聚物、与蔗糖的烯丙醚或季戊四醇的烯丙醚交联的甲基丙烯酸或其酯的一种或多种单体的共聚物可用于本发明的一些实施方案中。
INCI名为“丙烯酸酯类/丙烯酸C10-30-烷基酯交联聚合物”的化合物也可用于本发明的一些实施方案中。在一些实施方案中，可商购的聚合物(例如，TR1和TR2；B.F.Goodrich Co.)可用于本发明的一些实施方案中，尽管本发明并非意在限于任何含具体的丙烯酸酯的组合物。
在另外的实施方案中，INCI名为“丙烯酰二甲基牛磺酸铵/乙烯基吡咯烷酮共聚物(ammonium acryloyldimethyltaurates/vinylpyrrolidone copolymers)”的化合物可用于本发明中。这些丙烯酰二甲基牛磺酸铵/乙烯基吡咯烷酮共聚物具有经验公式[C7H16N2SO4]n[C6H9NO]m，其与下面的结构相对应：
该化合物的优选种类以登记号58374-69-9、13162-05-5和88-12-0列在化学文摘(Chemical Abstracts)中，并且是商购可得的(例如，ClariantGmbH)。然而，本发明并非意在限于任何特定的种类。在本发明的另外的实施方案中，含有丙烯酰二甲基牛磺酸盐(或酯)的共聚物/交聚物(例如，EG和EG；Seppic S.A.)可用于本方面的一些组合物中。
可用于本发明的另外的完全合成的水胶体包括但不限于阴离子聚氨基甲酸酯，其在水中是可溶的或可分散的，并且可从下列物质有利的获得：
Aa)至少一种化合物，该化合物的每个分子含有两个或多个活性氢原子，
Ab)至少一种含有酸或盐基团的二醇，和
Ac)至少一种二异氰酸酯。
在一些优选的实施方案中，具体而言，成分Aa)是二醇、氨基醇、二胺、聚酯醇(polyesterol)、聚醚醇(polyetherol)--每种情况下都具有至多3000的数均分子量，或它们的混合物，其中至多3mol％的所述化合物可以被三醇或三胺替换。优选二醇和聚酯二醇。具体而言，成分Aa)包括基于成分Aa)的总重量按重量计至少50％的聚酯二醇。合适的聚酯二醇是所有通常用于制备聚氨基甲酸酯的那些，具体而言是下列物质的反应产物：苯二甲酸和二甘醇、间苯二甲酸和1，4-丁二醇、间苯二甲酸/己二酸和1，6-己二醇、以及己二酸和乙二醇或者5-NaSO3-间苯二甲酸、苯二甲酸、己二酸和1，6-己二醇的反应产物。
可用于本发明的一些实施方案中的二醇的例子包括但不限于乙二醇、丙二醇、丁二醇、新戊二醇、聚醚醇(例如，分子量可达3000的聚乙二醇)、具有数均分子量可达3000的环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物、以及环氧乙烷、环氧丙烷和环氧丁烷的嵌段共聚物，所述嵌段共聚物含有随机分布方式或嵌段形式的共聚化氧化烯单元。优选乙二醇、新戊二醇、二甘醇、三甘醇、四甘醇、五甘醇或六甘醇。有用的其它二醇包括聚(α-羟基羧酸)二醇。
可用于本发明的一些实施方案中的合适的氨基醇包括但不限于2-氨基乙醇、2-(N-甲氨基)乙醇、3-氨基丙醇和4-氨基丁醇。
在一些实施方案中，二胺例如乙二胺、丙二胺、1，4-二氨基丁烷、1，6-二氨基己烷以及α，ω-二胺，可用于本发明的一些组合物中，其中所述二胺可以通过用氨对聚烷氧烃进行氨化加以制备。
具体而言，成分Ab)是二羟甲基丙酸或具有下式的化合物：
和
其中RR在每种情况下是C2-C18-亚烷基，而Me是Na或K。
具体而言，成分Ac)是六亚甲基二异氰酸酯、异佛尔酮二异氰酸酯、甲基二苯基异氰酸酯(MDI)和/或甲苯二异氰酸酯。
在一些实施方案中，通过在70到130℃的温度下，在惰性气体气氛下的惰性溶剂中，使组Aa)和Ab)的化合物与组Ac)的化合物反应，获得聚氨基甲酸酯。为了制备具有相对高的分子量的聚氨基甲酸酯，在合适的情况下，该反应可以在增链剂存在下进行。如在聚氨基甲酸酯的制备中所常见的，有利地以0.8至1.1∶1的摩尔浓度比使用成分[(Aa)+(Ab)]∶Ac。聚氨基甲酸酯的酸值由成分(Aa)和(Ab)的混合物中的成分(Ab)的化合物的组成和浓度决定。
在一些实施方案中，根据H.Fikentscher，聚氨基甲酸酯的K值(在25℃和pH 7下，在按重量计0.1％浓度的N-甲基吡咯烷酮溶液中测定)为从约15至约100，优选约25至约50。K值(即，“特性粘度”)是易于利用聚合物溶液的粘度测量而确定的参数，并从而经常用在工业中，以表征聚合物。可用于本方面的一些实施方案中的含酸性基团的聚氨基甲酸酯，包括但不限于，在部分或完全中和之后、在没有乳化剂帮助的情况下可溶于水或可分散的聚氨基甲酸酯。在水中，聚氨基甲酸酯的盐通常比未中和的聚氨基甲酸酯具有更好的溶解度或可分散性。可用于中和聚氨基甲酸酯的碱包括的碱金属的碱(例如，氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾或碳酸氢钾)和碱土金属的碱(例如，氢氧化钙、氧化钙、氢氧化镁或碳酸镁、以及氨和胺)。在一些实施方案中，2-氨基-2-甲基丙醇、二乙氨基丙胺和三异丙醇胺发现在含酸性基团的聚氨基甲酸酯的中和中特别有用。在另外的实施方案中，使用两种或多种碱的混合物(例如，氢氧化钠溶液和三异丙醇胺的混合物)，进行含酸性基团的聚氨基甲酸酯的中和。根据目标用途，中和是部分的(例如，约20％至约40％)或完全的(即，100％)。这些聚合物和它们的制备更详细地描述于DE-A-4225045中，其通过引入整合到本文中作为参考。
B.下列物质的水溶性或可分散的阳离子聚氨基甲酸酯和聚脲：
Ba)至少一种二异氰酸酯，其可以已经预先与一种或多种化合物反应，所述化合物的每一分子含有两个或更多个活性氢原子；和
Bb)至少一种二醇、伯氨基醇或仲氨基醇、伯二胺或仲二胺或者伯三胺或仲三胺，其具有一个或多个叔氨基氮原子、季氨基氮原子或质子化的叔氨基氮原子。
优选的二异氰酸酯如上在A)下给出。具有两个或更多个活性氢原子的化合物是二醇、氨基醇、二胺、聚酯醇、聚酰胺二胺和聚醚醇。该类型合适的化合物如上在A)下给出。
如上在A)下所述，制备聚氨基甲酸酯。通过质子化(例如，用羧酸质子化，如乳酸)，或通过季铵化作用(例如，用烷化剂，如C1-C4-烷基卤化物)或硫酸盐，带电的阳离子基团可以在聚脲中从存在的叔氨基氮原子产生。此类烷化剂的例子包括但不限于乙基氯、乙基溴、甲基氯、甲基溴、硫酸二甲酯和硫酸二乙酯。这些聚合物和它们的制备在DE-A-4241118中更详细地加以描述，其通过引用整合到本文中作为参考。
C.下列物质的含羧酸酯基团的线性聚氨基甲酸酯：
Ca)下式的2，2-羟甲基取代的羧酸：
其中，RR’是氢原子或C1-C20-烷基，其以这样的量使用，该量满足在每克聚氨基甲酸酯存在的约0.35至约2.25毫当量的羧基，
Cb)基于聚氨基甲酸酯的重量，按重量计约10％至约90％的一种或多种具有不超过两个活性氢原子的有机化合物，和
Cc)一种或多种有机异二氰酸酯。
在一些优选的实施方案中，在聚氨基甲酸酯中存在的羧基最终用合适的碱至少部分中和。这些聚合物和它们的制备在EP-A-619111中更详细地加以描述，其通过引用整合到本文中作为参考。
D.三羧酸或四羧酸的酸酐和二醇、二胺或氨基醇的含羧基缩聚产物(聚酯、聚酰胺或聚酯酰胺)。这些聚合物和它们的制备更详细的描述在DE-A-4224761中，其通过引用整合到本文中作为参考。
E.聚丙烯酸酯和聚甲基丙烯酸酯，如在DE-A-4314305、3627970和2917504中更详细地加以描述，其都通过引用整合到本文中作为参考。
在本发明的一些实施方案中使用的聚合物具有从约15至约100，优选从约25至约50的K值。该聚合物在组合物中通常以基于组合物的总重量按重量计从约0.2％至约20％的量存在。盐以有效改善所述聚合物的可交换性的量被使用。盐通常以基于所述组合物的总重量按重量计从约0.02％至约10％的量存在，更优选按重量计从约0.05％至约5％，以及特别地，按重量计从约0.1％至约3％的量使用。
本发明的个人护理组合物的一些实施方案中的一种或多种水胶体的总量为基于制剂的总量，按重量计在约5％以下，优选按重量计在约0.05％至约3％之间，并且更优选按重量计在约0.1％至约1.0％之间。
在一些实施方案中，本发明的组合物包含至少一种硅油相。硅油相一般占组合物的从约0.1％至约20％，优选从约0.5％至约10％，更优选从约0.5％至约5％。硅油相优选包含从一种或多种硅氧烷组分。
在一些实施方案中，硅氧烷组分是液体，包括直链、支化的和环状的硅氧烷。可用于本文中的合适的硅氧烷流体包括这样的硅氧烷，所述硅氧烷包括了聚烷基硅氧烷流体、聚芳香基硅氧烷流体、环状和线性的聚烷基硅氧烷、聚烷氧基化硅氧烷、氨基和季铵基改性的硅氧烷、聚烷基芳基硅氧烷或聚醚硅氧烷共聚物及其混合物。本文中可使用挥发的以及不挥发的硅氧烷流体。硅氧烷流体一般具有小于约200,000的平均分子量。在优选的实施方案中，合适的硅氧烷流体具有约100,000或更低，优选约50,000或更低，更优选约10,000或更低的分子量。优选的，硅氧烷流体选自具有平均分子量从约100至约50,000，和优选从约200至约40,000的范围内的重量的硅氧烷流体。一般而言，25℃下，硅氧烷流体具有的粘度范围是从约0.65至约600,000mm2s-1，优选从约0.65至约10,000mm2s-1。粘度可以通过DowCorning Corporate Test Method CTM0004于1970年7月29日提出的玻璃毛细管粘度计的手段测量。可用于本文中的合适的聚二甲基硅氧烷包括商购可得的化合物(例如，来自General Electric Company和DowCorning)。还可用的是基本不挥发的聚烷基芳基硅氧烷，例如聚甲基苯基硅氧烷，所述硅氧烷在25℃下具有从约0.65至约30,000mm2s-1的粘度(General Electric Company或来自Dow Corning)。适用于本文中的环状聚二甲基硅氧烷是具有从约3至约7个(CH3)2SiO部分，优选约5个或更多个(CH3)2SiO部分的整合了的环状结构的硅氧烷。
在其他实施方案中，硅橡胶纯胶料可用于本发明中。在一些优选的实施方案中，硅油相含有硅橡胶纯胶料或包含硅橡胶纯胶料的硅氧烷混合物。典型地，硅橡胶纯胶料在25℃下具有超过约1,000,000mm2S-1的粘度。硅橡胶纯胶料包括本领域已知的聚二甲基硅氧烷(见例如美国专利4,152,416；和Noll，Chemistry and Technology of Silicones，Academic Press ，New York[1968])。例如在General Electric Silicone RubberProduct Data Sheets SE 30、SE 33、SE 54和SE 76中描述的硅橡胶纯胶料，也可用于本发明中。硅橡胶纯胶料的具体例子包括聚二甲基硅氧烷、(聚二甲基硅氧烷)(甲基乙烯基硅氧烷)共聚物、聚(二甲基硅氧烷)(二苯基)(甲基乙烯基硅氧烷)共聚物及其混合物。本文使用的优选的硅橡胶纯胶料是分子量从约200,000至约4,000,000的硅橡胶纯胶料，选自聚二甲基硅烷醇、含聚氧乙烯或聚氧丙烯侧链的聚二甲基硅氧烷、聚二甲基硅氧烷及其混合物。
在一些实施方案中，此处的硅氧烷相优选包括掺入所述组合物作为硅橡胶纯胶料-流体掺合物的一部分的硅橡胶纯胶料。当硅橡胶纯胶料被掺入作为硅橡胶纯胶料-流体掺合物的一部分时，按硅橡胶纯胶料-流体掺合物的重量计，硅橡胶纯胶料优选构成从约5％至约40％，特别是约10％至约20％。本文合适的硅橡胶纯胶料-流体掺合物是基本上由下述组成的混合物：
(i)分子量为约200,000至约4,000,000的硅氧烷，选自聚二甲基硅烷醇、氟硅氧烷和聚二甲基硅氧烷以及它们的混合物；和
(ii)载体，其是硅氧烷流体，该载体具有从约0.65mm2S-1至约100mm2S-1的粘度，
其中，i)与ii)的比率为大约10∶90到大约20∶80，并且其中所述基于硅橡胶纯胶料的组分具有从约100mm2S-1至约100,000mm2S-1，优选从500mm2S-1至约10,000mm2S-1的终粘度。
其他适用于本文的硅油相中的硅氧烷组分包括交联的有机聚硅氧烷(polyorganosiloxane)聚合物，其任选地分散在流体载体中。一般而言，当存在时，交联的有机聚硅氧烷聚合物和其载体(如果存在的话)一起构成组合物的从约0.1％至约20％，优选从约0.5％至约10％，更优选从约0.5％至约5％。这类聚合物包括由交联剂交联的有机聚硅氧烷聚合物(见例如WO98/22085)。适于本文使用的有机聚硅氧烷聚合物包括但不限于甲基乙烯基聚二甲基硅氧烷、甲基乙烯基二苯基聚二甲基硅氧烷以及甲基乙烯基苯基甲基二苯基聚二甲基硅氧烷。
适于用在本文硅油相的另一类硅氧烷组分包括含有至少一种有机聚二硅氧烷片段和至少一种聚氧化烯片段的有机聚二硅氧烷-聚氧化烯共聚物(见例如WO98/22085)。合适的有机聚二硅氧烷-聚氧化烯共聚物可从Wacker-Chemie GmbH以商品名BELSIL获得。本文使用的特别优选的共聚物流体掺合物包括Dow Corning DC3225C，其具有CTFA名称聚二甲基硅氧烷/含聚氧乙烯或聚氧丙烯侧链的聚二甲基硅氧烷。
在进一步的实施方案中，本发明的组合物包括有机防晒剂。在一些实施方案中，合适的防晒剂具有UVA吸收特性，而其它防晒剂具有UVB吸收特性，并且其它防晒剂包括它们的混合特性。防晒活性物的确切量根据所需的组合物防晒系数(即“SPF”)以及所需的UV防护水平而变化。SPF是通常使用的防晒剂预防红斑的光线防护的量度。SPF被定义为：在同一个体中，在受保护皮肤上产生最小红斑所需的紫外线能量与未受保护皮肤上产生相同的最小红斑所需的紫外线能量的比值。所使用的防晒剂的量优选为从约2％至约20％，并且更优选从约4％至约14％。合适的防晒剂包括但不限于在美国、日本、欧洲和澳大利亚中批准使用的那些。本发明的组合物优选包括约2至约30，优选从约4至约30，更优选从约4至约15的SPF。
在一些实施方案中，本发明的组合物包含一种或多种UVA吸收防晒活性物，其吸收波长从约320nm至约400nm的UV辐射。合适的UVA吸收防晒活性物包括但不限于二苯甲酰甲烷(见例如Lowe and Shaath(编著)，Sunscreens：Development，Evaluation，and Regulatory Aspects，Marcel Dekker，Inc.)衍生物、邻氨基苯甲酸酯衍生物例如甲基邻氨基苯甲酸酯和同甲基(homomethyl)的、1-N-乙酰基邻氨基苯甲酸酯，及其混合物。UVA吸收防晒活性物优选以这样的量存在，该量足以单独的或与所述组合物中存在的其它UV防护活性物组合的提供广谱UVA防护。
合适的UVA防晒活性物包括二苯甲酰基甲烷类防晒活性物及其衍生物。包括但不限于选自以下的活性物：2-甲基二苯甲酰基甲烷、4-甲基二苯甲酰基甲烷、4-异丙基二苯甲酰基甲烷、4-叔丁基二苯甲酰基甲烷、2，4-二甲基二苯甲酰基甲烷、2，5-二甲基二苯甲酰基甲烷、4，4’-二异丙基二苯甲酰基甲烷、4-(1，1-二甲基乙基)-4’-甲氧基二苯甲酰基甲烷、2-甲基-5-异丙基-4’-甲氧基二苯甲酰基甲烷、2-甲基-5-叔丁基-4’-甲氧基-二苯甲酰基甲烷、2，4-二甲基-4’-甲氧基二苯甲酰基甲烷、2，6-二甲基-4’-叔丁基-4’-甲氧基二苯甲酰基甲烷，及其混合物。优选的二苯甲酰防晒活性物包括选自4-(1，1-二甲基乙基)-4’-甲氧基二苯甲酰基甲烷、4-异丙基二苯甲酰基甲烷，及其混合物的物质。优选的防晒活性物是4-(1，1-二甲基乙基)-4’-甲氧基二苯甲酰基甲烷。
防晒活性物4-(1，1-二甲基乙基)-4’-甲氧基二苯甲酰基甲烷，也被称为丁基甲氧基二苯甲酰甲烷或“阿伏苯宗”，是从Givaudan Roure(International)S.A.以名称1789商购得到的，以及从Merck&amp；Co.，Inc.以9020商购得到的。防晒剂4-异丙基二苯甲酰基甲烷，也被称为异丙基二苯甲酰基甲烷，是从Merck以名称8020商购得到的。
在一些实施方案中，本发明的组合物进一步包括一种或多种UVB防晒活性物，其吸收波长从约290nm至约320nm的UV辐射。该组合物包括一定量的UVB防晒活性物，其安全有效地单独提供或与其它可以在该组合物中存在的UV防护活性物组合提供UVB防护。该组合物包括按重量计约0.1％至约20％、优选从约0.1％至约12％、以及更优选从约0.5％至约8％的每一种UVB吸收有机防晒剂，或者按相关管理机构的规定。
多种UVB防晒活性物适用于本文中(见例如美国专利5,087,372；美国专利5,073,371；美国专利5,073,372；美国专利4,937,370；和美国专利4,999,186)。优选的UVB防晒活性物选自2-乙基己基-2-氰基-3，2-乙基己基N，N-二甲基-对-氨基苯甲酸酯、对氨基苯甲酸、2-羟基-4-甲氧基二苯酮、水杨酸三甲环己酯、水杨酸辛酯、4，4’-甲氧基-叔丁基二苯甲酰甲烷、4-异丙基二苯甲酰甲烷、3-苯亚甲基樟脑、3-(4-甲基苯亚甲基)樟脑、3-二苯基丙烯酸酯、2-苯基-苯并咪唑-5-磺酸(PBSA)、肉桂酸酯及其衍生物例如2-乙基己基-对甲氧基肉桂酸酯、水杨酸酯及其衍生物例如三乙醇胺水杨酸酯、乙基己基水杨酸酯、辛基二甲基对氨基苯甲酸、樟脑衍生物及其衍生物，以及它们的混合物。优选的有机防晒活性物包括2-乙基己基-2-氰基-3，3-二苯基丙烯酸酯、2-苯基-苯并咪唑-5-磺酸(PBSA)、辛基-对甲氧基肉桂酸酯，以及它们的混合物。酸性防晒剂的盐和酸中和形式也可用于本文中。
因而，在一些实施方案中，本发明提供包含任何有机的UV-A和UV-B过滤材料的组合物，所述过滤材料例如但不限于以下的：
在一些实施方案中，至少一种试剂被加入到可用于本发明的任何组合物中，稳定UVA防晒剂，防止其暴露于UV辐射时光降解，从而保持它的UVA保护功效。据报道，大量的化合物具有这些稳定特性，并应该从中选择，以补充UVA防晒剂和从整体上补充组合物(见例如美国专利5,972,316；5,968,485；5,935,556；5,827,508；和WO 00/06110)。用于本发明的稳定剂的优选实例包括2-乙基己基-2-氰基-3，3-二苯基丙烯酸酯、乙基-2-氰基-3，3-二苯基丙烯酸酯、2-乙基己基-3，3-二苯基丙烯酸酯、乙基-3，3-双(4-甲氧基苯基)丙烯酸酯、二乙基己基2，6-萘酸盐以及它们的混合物(Symrise Chemical Company)。
在一些优选的实施方案中，本发明提供了化妆品和/或皮肤防护霜、清洁乳、防晒化妆水、营养霜、日霜、晚霜等的化妆品和/或局部皮肤病学制剂。在一些实施方案中，本发明可用作药物(即，药学上的)组合物的成分。在另外的实施方案中，本发明可用于装饰化妆品(例如，美容配方)。
在一些特别优选的实施方案中，本发明提供可用于化妆品和/或护肤制品的防晒剂。除了根据本发明的实施方案使用的活性成分之外，在一些实施方案中，这些制剂优选另外包含至少一种光谱滤光剂(broadband filter)和/或至少一种UVA滤光剂和/或至少一种UVB滤光剂和/或至少一种无机颜料。
在仍进一步的实施方案中，本发明提供了个人护理组合物，其具有UV防护组分，但其主要不是防晒剂。例如，在一些实施方案中，在日霜和/或毛发护理组合物中掺入UV-A和UV-B滤光剂。
在另外的实施方案中，本发明的个人护理组合物包括化妆活性成分、助剂和/或添加剂，如通常用于此类制剂的(例如，抗氧化剂、防腐剂、杀菌剂、香料、消泡剂、染料、具有增色作用的颜料、增稠剂、表面活性物、乳化剂、润肤剂、保湿剂和/或湿润剂、脂肪、油、蜡或化妆品或皮肤病学配方的其它常用组分，例如醇、多元醇、聚合物、泡沫稳定剂、电解质、有机溶剂或硅氧烷衍生物)。实际上，可以预期，当适于产品和使用者时，各种化合物将可用于本发明的各种实施方案中。
在一些实施方案中，至少一种试剂被加入到在本发明中有用的任何组合物中，以改善这些组合物的皮肤牢固性(substantivity)，尤其是增强其抗水洗脱或抗擦拭的能力。例子包括但不限于丙烯酸酯/甲基丙烯酸C12-22烷基酯共聚物、丙烯酸酯/丙烯酸酯共聚物、聚二甲基硅氧烷、聚二甲基硅烷醇、接枝共聚物(graft-copoly)(二甲基硅氧烷/甲基丙烯酸异丁酯)、月桂基聚二甲基硅氧烷、PVP/十六烷共聚物、PVP/二十碳烯共聚物、二十三碳烷基-PVP(Tricontanyl-PVP)和三甲氧基甲硅烷氧基硅酸酯。
除了有机防晒剂，在一些实施方案中，本发明的组合物另外包括无机物理防晒剂(sunblock)(见例如TFA International Cosmetic Ingredient Dictionary，第6版，第1026-28和1103页[1995]；Sayre等，J.Soc.Cosmet.Chem.，41：103-109[1990]；和Lowe等，见上文)。优选的无机物理防晒剂包括氧化锌和二氧化钛，及其混合物。
当在优选的实施方案中使用时，物理防晒剂以一定量存在，所述量使本组合物在皮肤上是透明的(即，非增白)，按重量计优选从约0.5％至约20％，优选从约0.5％至约10％，更优选从约0.5％至约5％。当使用二氧化钛时，它可以具有锐钛矿、金红石或无定形结构。用于防晒剂的微粉级二氧化钛和氧化锌的制造商包括但不限于Tayca Corporation、Uniqema、Shinetsu Chemical Corporation、Kerr-McGee、Nanophase、Nanosource、Sachtleben、Elementis、和BASF Corporation，及其分销商和那些进一步加工所述材料用于防晒剂用途的公司。物理防晒颗粒(例如，二氧化钛和氧化锌)可以不涂覆或涂覆各种材料，包括但不限于氨基酸、铝化合物例如氧化铝、硬脂酸铝、月桂酸铝等等；羧酸及其盐(例如，硬脂酸及其盐)；磷脂例如卵磷脂；有机硅化合物；无机硅化合物例如二氧化硅和硅酸盐及其混合物。在一些优选的实施方案中，本发明的组合物包括按重量计约0.1％至约15％，优选从约0.1％至约7％，以及更优选从约0.5％至约5％的无机防晒剂。
除了一些乳化剂的有害效应外，也已知暴露于其它因素损害皮肤和毛发。例如，太阳辐射的紫外部分对皮肤的有害效应是广为人知的。尽管波长在290nm以下的射线(即，UVC区)被地球大气的臭氧层吸收，但是在290nm和320nm范围之间的射线(即，UVB区)导致程度各异的红斑、单纯晒黑或者甚至灼伤。阳光的最大红斑活性为在308nm附近相对窄的区域。
已知许多化合物提供防有害UVB照射的保护。最常见地，这些化合物是3-亚苄基-樟脑的衍生物、4-氨基苯甲酸的衍生物、肉桂酸的衍生物、水杨酸的衍生物、2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮的衍生物，和2-苯基-苯并咪唑的衍生物。
对于在约320nm至约400nm之间的范围--UVA区，具有可利用的滤光物质也是重要的，因为UVA区的射线也可以导致损伤。长期以来，波长在320nm至400nm之间的长波UV-A辐射被错误地假设为仅具有可忽略的生物学作用，而相应地UV-B射线是对人类皮肤造成大多数日光性损伤的原因。然而，近来的许多研究已经表明，对于在皮肤中引发光动力学的，尤其是光毒性的反应和慢性变化方面，UV-A辐射比UV-B辐射有害的多。此外，通过暴露于UV-A辐射，UV-B辐射的有害效应可以被进一步增强。
已经表明，UV-A辐射本身以及在非常正常的日常条件下的UV-A辐射，足以在短期内损伤对皮肤的结构和强度非常重要的胶原和弹性蛋白纤维。这导致皮肤中慢性的光诱导的变化，使得皮肤过早“老化”。由光线导致的皮肤老化的临床表现通常包括增加的皱纹和线条，以及异常的有皱纹的轮廓。此外，受光诱导的皮肤老化影响的皮肤区域通常表现出异常的色素沉着。在一些情况下，产生褐斑、角质物、癌或恶性黑素瘤。由日常UV暴露导致的皮肤过早老化的特征还可以是具有降低的朗格罕细胞活性和轻微的慢性炎症。
大约90％的到达地球的紫外辐射是由UV-A射线组成的。尽管到达地球的UV-B辐射的量根据多种因素(例如，年和日的时间和/或纬度)而广泛变化，但是，无论年日时间因素还是地理因素如何，每日到达地球的UV-A辐射水平保持相对恒定。此外，大部分UV-A辐射穿透活表皮，而约70％的UV-B射线被角质层截留。针对UV-A射线的预防性保护，例如，通过对皮肤施用化妆品或皮肤病学配方形式的光防护过滤物质，因此是相当重要的。
一般而言，光防护过滤物质的光吸收行为是广为人知的并且被文件记载，主要原因在于如下事实：大多数工业国对于此类物质的使用具有肯定清单(positive list)，导致对每种含该些物质的产品所附带的文件具有非常严格的标准。对于所述物质在成品配方中的浓度，吸收值提供了指导，因为与皮肤中的物质或皮肤表面本身的相互作用经常呈现出变数，该变数可能影响组合物在每个个体上执行的性能。然而，通常难以预先评估该过滤物质在皮肤角质层内和皮肤角质层上分布的均匀性和厚度。
为测试UV-A防护性能，通常使用本领域技术人员已知的IPD法(IPD 5立即晒黑(IPD 5immediate pigment darkening))。该方法类似于阳光防护因素的确定，并提供这样的方法，所述方法指示：在发生与未保护的皮肤产生的色素沉着相同的色素沉着之前，受光防护组合物保护的皮肤可以耐受的UV-A照射时间长多久。
已经在全欧洲建立的另一种测试方法是澳大利亚标准AS/NZS 2604：1997。在该方法中，测量制品在UV-A区的吸收。为了满足该标准，所述制品必须吸收在320-360nm区域内至少90％的UV-A照射。
对防晒组合物配方所关心的是，已知在UV-A区中也表现出高过滤作用的光防护过滤物质的使用浓度通常受这样的事实限制，即，它们所组合的其它物质是固体的形式。因而，某些配方难以将达到相对高的阳光防护因子和UV-A防护性能相关联。然而，在本领域中的技术人员通常熟知克服和/或弥补这些困难的手段。
由于光防护过滤物质通常是昂贵的，并且一些光防护过滤物质额外难以以相对高的浓度掺入化妆品和/或皮肤病学制剂中，所以本发明的一些实施方案设计为提供简易且成本低廉的制剂，尽管所述制剂具有异常低浓度的常规UV-A光防护过滤物质，但是达到了可接受的或者甚至高的UV-A防护性能。
然而，如本领域已知的，UV照射还可以导致光化学反应，所述反应产生干扰皮肤代谢的产物。这些光化学反应产物主要是自由基化合物(例如，羟基自由基)。由于其高反应性，在皮肤本身中形成的未限定自由基光化产物还可以表现出不受控制的次级反应。然而，在UV照射期间也可以产生单态氧--氧分子的非自由基激发态，如同短期环氧化物和许多其它物质一样。例如，由于其增加的反应性，单态氧不同于正常的三重态氧(自由基基态)。然而，也存在激发的、反应性“自由基”三重态的氧分子。因而，为了防止这些反应，抗氧化剂和/或自由基清除剂可用于化妆品和/或皮肤病学配方。
常用作化妆品和/或皮肤病学光防护配方中的光防护剂的化合物的特征通常是提供良好的光防护。然而，它们具有这样的缺点，即，有时难以将它们以令人满意的方式掺入期望的配方中。
如上所述，防晒系数(sun protection factor，SPF)表明：在出现与未保护的皮肤相同的红斑反应之前，用光防护组合物保护的皮肤能够忍受的照射时间长多久(即，对于SPF＝10，与未保护的皮肤相比，时间长十倍)。消费者很清楚“SPF”的含义，并基于产品所示的SPF值选择皮肤和/或毛发护理组合物。消费者期望从制造商得到关于防晒系数的可靠信息，原因主要在于公众越来越意识到过度的日晒与皮肤癌以及过早老化之间的关联。此外，在世界的一些地区，臭氧层的分解成为主要的关注点。根据皮肤类型和期望的阳光暴露，消费者选择具有较低或较高SPF的产品。然而，消费者似乎倾向于选择相对高的SPF系数，特别是对于应用于儿童和皮肤白皙个体的产品。在一些实施方案中，本发明提供了这样的组合物，所述组合物具有相对低浓度的常规光防护过滤物质，但仍具有消费者可接受的SPF值。
在一些优选的实施方案中，本发明提供的防晒制剂的基本成分包括：水溶液或含水溶液；含水乙醇溶液；天然油和/或化学改性的天然油和/或合成油；脂肪、蜡、和其它天然和合成脂肪物，优选脂肪酸与低碳数醇的酯(例如与异丙醇、丙二醇或丙三醇的酯)、或脂肪醇与低碳数的链烷酸的酯或与脂肪酸的酯；醇、二醇或低碳数的多元醇、和它们的醚，优选乙醇、异丙醇、丙二醇、丙三醇、乙二醇、乙二醇一乙基醚或一丁基醚、丙二醇一甲基醚、一乙基醚或一丁基醚、二甘醇一甲基醚或一乙基醚和类似产品。在可选的优选实施方案中，这些组分中的两种或更多种的混合物可用于本发明。
在一些优选的实施方案中，本发明的组合物还包括防腐剂。这类防腐剂包括但不限于戊二醇、乙二胺四乙酸(EDTA)及其盐、氯己定(及其二乙酸盐、二盐酸盐、二葡萄糖酸盐衍生物)、1，1，1-三氯-2-甲基-2-丙醇、对氯间二甲苯酚、聚六亚甲基双胍盐酸盐、脱氢乙酸、N-(羟甲基)-N-(1，3-双羟甲基-2，5-二氧-4-咪唑烷基)-N’-(羟甲基)脲、2，4-二氯苄醇、4，4-二甲基-1，3-噁唑烷、甲醛(例如，37％水溶液，含10-15％甲醇，以避免聚合)、戊二醛、二甲基乙内酰脲(dimethylidantoin)、咪唑烷基脲、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、邻苯基苯酚、4-羟基苯甲酸酯(例如，“对羟基苯甲酸酯”(paraben))及其甲酯、乙酯、丙酯、异丙酯、丁酯和异丁酯、三氯生、2-苯氧乙醇、苯基醋酸汞、硼酸盐、硝酸盐、季铵盐-15、水杨酸酯、水杨酸及其盐、钙、山梨酸钙、山梨酸及其盐、碘代丙烷基丁基氨基甲酸酯、2-巯基吡啶氧化锌、苄醇、5-溴-5-硝基-1，3-二噁烷、2-溴-2-硝基丙烷-1，3-二醇、苯甲酸及其盐、亚硫酸盐、焦亚硫酸盐(bisulfite)、苯氧乙醇、氯二甲酚、N-(羟甲基)-N-(1，3-双羟甲基-2，5-二氧-4-咪唑烷基)-N’-(羟甲基)脲、对羟基苯甲酸甲酯、对羟苯甲酸丙酯、对羟苯甲酸异丙酯、对羟苯甲酸异丁酯、对羟苯甲酸丁酯、对羟苯甲酸乙酯、苯氧乙醇PG和氯苄烷铵。
在仍进一步的实施方案中，防腐剂，例如用于食品和饲料应用中的，可用于本发明的各种组合物中。下表提供了这类化合物的清单，以及每个化合物的E数。然而，本发明并非意在限于这些具体的防腐剂，因为可以预期，另外的防腐剂可用于本发明的各种实施方案中。
可用于各种实施方案的另外的防腐剂包括但不限于二溴二氰基丁烷(2-溴-2-溴甲基戊二腈)、3-碘-2-丙炔基丁基氨基甲酸酯、2-溴-2-硝基丙烷-1，3-二醇、咪唑烷基脲、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、2-氯乙酰胺、苯扎氯胺、苄醇、以及甲醛供体。可用于本发明的各种实施方案中的进一步的防腐剂包括苯基羟基烷基醚，特别是被称为“苯氧乙醇”的化合物，原因在于它们对许多微生物具有杀菌和杀真菌效应。
各种任选的成分例如中和剂、香料和香料增溶剂以及着色剂也可用于本文的一些组合物中。优选的是，任何添加的成分都增强产品的皮肤柔软度/光滑度益处。此外，优选的是，任何这类成分不负面的影响产品的美观特性。
其它任选的物质包括角质层分离剂，以及优选在约0.1％至约5％的水平下的水溶性和/或可溶性防腐剂(例如，Germall 115，羟基苯甲酸的甲酯、乙酯、丙酯和丁酯，苄醇，从Lonza以商品名Glydant Plus获得的DMDM乙内酰脲碘丙烷基丁基氨基甲酸酯；EDTA，K400，Bromopol(2-溴-2-硝基丙烷-1，3-二醇)和苯氧基丙醇)；抗菌剂(例如，)和苯氧基乙醇(优选在约0.1％至约5％的水平)；以及可溶性或胶体可溶性的保湿剂，例如透明质酸、硫酸软骨素和淀粉接枝的聚丙烯酸钠(例如，IM-1000、IM-1500和IM-2500，可从CelaneseSuperabsorbent Materials，Portsmith，VA获得，见例如美国专利4,076,663)；维生素例如维生素A、维生素C、维生素E及其衍生物和它们的结构单元如植三醇(phytantriol)、以及维生素K和及其成分如脂肪醇如十二碳三烯甘油酯；α和β羟基酸；芦荟；鞘氨醇和植物鞘氨醇、胆固醇；皮肤增白剂；N-乙酰基半胱氨酸；着色剂；抗菌剂如TCC/TCS，也称为三氯生和三氯烃；香料和香料增溶剂。α羟基酸的实例包括羟基乙酸、乳酸、马来酸、柠檬酸、与羟基乙酸铵(ammonium glycolate)结合的羟基乙酸、α-羟基乙酸、α-羟基辛酸(alpha-hydroxyoctanoic acid)、α-羟基辛酸(alpha-hydroxycaprylic acid)、羟基辛酸、混合果酸、三α羟基果酸、三重果酸、甘蔗提取物、α羟基和植物组分(alpha hydroxy and botanicals)、1-α-羟基酸和交联脂肪酸(例如，α-nutrium)中的glycomer。α羟基酸的优选例子是羟基乙酸和乳酸。优选的是，α羟基酸以至多约10％的水平使用。本发明并非意在限于衍生自任何特定来源的任何特定化合物，因为任何合适的添加剂化合物--无论天然来源或通过实验室合成获得--都可用于本发明中。
其它任选的物质包括在约0.1％至约5％的水平下的水溶性或可溶性防腐剂，例如Germall 115，羟基苯甲酸的甲酯、乙酯、丙酯和丁酯，苄醇，从Lonza以商品名Glydant Plus获得的DMDM乙内酰脲碘丙烷基丁基氨基甲酸酯，EDTA，EUXYL(RTM)K400，Bromopol(2-溴-2-硝基丙烷-1，3-二醇)，戊二醇和苯氧基丙醇；抗菌剂如Irgasan(RTM)和苯氧基乙醇(优选在0.1％至约5％的水平)；抗菌剂如TCC/TCS，也称为三氯生和三氯烃，也可用于本发明的组合物中。
另外的其它抗微生物剂同样适于本发明的各种实施方案中，包括但不限于2，4，4’-三氯-2’-羟基二苯醚(即，)、1，6-二(4-氯苯基二胍基)己烷(即，CHLORHEXIDIN)、3，4，4’-三氯N-碳酰苯胺、季铵化合物、丁香油、薄荷油、百里香油、柠檬酸三乙酯、(3，7，11-三甲基-2，6，10-十二烷三烯-1-醇)以及描述在下述文献中的活性成分和/或活性成分组合DE-3740186，DE-3938140，DE-4204321，DE-4229707，DE-4309372，DE-4411664，DE-19541967，DE-19543695，DE-19543696，DE-19547160，DE-19602108，DE-19602110，DE-19602111，DE-19631003，DE-19631004，DE-19634019，DE-4229737，DE-4237081，DE-4324219，DE-4429467，DE-4423410、和DE-19516705中，上述文献都通过引用整合到本文中作为参考。在仍进一步的实施方案中，碳酸氢钠也被包括在本发明的一些组合物中。然而，本发明并非意在限于任何具体的抗微生物剂，或抗微生物剂的组合，因为具有这种效应的各种化合物可用于本发明的各种实施方案中。
在本发明的个人护理组合物的另外的实施方案中，包括了化合物例如抗刺激剂和/或抗炎性活性物。在一些实施方案中，包括了鲨肝醇(a-十八烷基甘油醚)、鲨油醇(a-9-十八烯基甘油醚)、鲛肝醇(a-十六烷基甘油醚)、红没药醇和/或泛醇。然而，本发明并非意在限于掺入任何具体的(一种或多种)抗刺激剂和/或抗炎性活性物，因为适于这类应用的各种化合物可用于本发明。
本文中适用于中和含酸性基团的亲含水胶凝剂的中和剂，包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、单乙醇胺、二乙醇胺、氨基甲基丙醇、tris缓冲液和三乙醇胺。
可用于本发明的其它任选物质包括本领域技术人员已知的各种功能性和/或活性成分(见例如McCutcheon’s Functional Materials，North American and InternationalEditions，MC Publishing Co.[2003])。如上所述，非限制性的例子包括：角质层分离剂；可溶的或胶体可溶的保湿剂，例如透明质酸和硫酸软骨素；维生素例如维生素A、维生素C、维生素E、维生素K及其衍生物和它们的结构单元；植三醇；脂肪醇如十二碳三烯醇；α和β羟基酸；芦荟；鞘氨醇和植物鞘氨醇、胆固醇；皮肤增白剂；N-乙酰基半胱氨酸；着色剂；α羟基酸的例子包括羟基乙酸、乳酸、马来酸和柠檬酸(无论合成得到或从天然来源得到，以及无论单独还是结合使用)和它们的酯或相关的缓冲组合。α-羟基酸的其它例子包括：α-羟基乙酸、α-羟基辛酸(alpha-hydroxyoctanoic acid)、α-羟基辛酸(alpha-hydroxycaprylicacid)和羟基辛酸。α羟基酸的优选例子是羟基乙酸和乳酸。优选的是，α羟基酸以至多约10％的水平使用。
任选的材料包括色素，当其是水不溶性时，构成油相成分总水平并被包括在油相成分总水平中。适用于本发明组合物中的色素可以是有机和/或无机色素。术语“色素”还包括具有低色泽或光泽的物质，例如材料抛光剂、光散射剂、和剂型助剂如云母、seracites和碳酸盐。合适色素的进一步的例子包括二氧化钛、氧化铁、谷氨酸盐氧化铁(glutamateiron oxide)、氧化锌、氯氧化铋、群青(所有这些都可以进行或不进行预分散和/或预涂覆)D&C染料和色淀、FD&C颜料、天然色素添加剂例如洋红、及其混合物。根据组合物的类型，在本发明的优选实施方案中，通常使用色素的混合物。从保湿、皮肤感觉、皮肤外观和乳状液相容性的观点来看，用于本文中的优选色素为处理过的色素。在一些实施方案中，该色素用化合物处理，包括但不限于氨基酸、硅氧烷、卵磷脂和酯油。
在一些实施方案中，本发明提供包含色素的组合物，包括但不限于这样的无机色素，所述无机色素基于金属氧化物和/或其它轻微溶于水或不溶的金属化合物，例如锌的氧化物(ZnO)、钛的氧化物(TiO2)、铁的氧化物(例如Fe2O3)、锆的氧化物(ZrO2)、硅的氧化物(SiO2)、锰的氧化物(例如MnO)、铝的氧化物(Al2O3)、铈的氧化物(例如Ce2O3)、相应金属的混合氧化物和这类氧化物的混合物。在一些优选的实施方案中，金属氧化物是超细的，而在可选的优选实施方案中，金属氧化物是颜料级的。在仍另外的实施方案中，色素是“涂覆的”，使得它们经过表面处理。在一些优选的实施方案中，涂层包括薄的疏水膜层，而在其它实施方案中，涂层包括薄的亲水膜层。
如本文所使用，用于指代本发明的组合物时，术语“色素”、“彩色色素”和“染料”涵盖了为组合物提供颜色的，和/或赋予施用所述组合物的表面(例如，皮肤和/或毛发)以颜色的任何化合物。在一些实施方案中，染料和色素选自由Cosmetics Directive或EC提供的化妆用着色剂清单中。在大多数情况下，这些染料和色素与被批准用于食品的染料是相同的。优选的色素/染料包括例如二氧化钛、云母、氧化铁(例如Fe2O3、Fe3O4、FeO(OH))和/或氧化锡。有利的色素/染料包括例如洋红、柏林蓝、氧化铬绿、群青和/或锰紫。在一些优选的实施方案中，色素/染料包括但不限于下表中的。本领域中已知的那些染料索引号(ColourIndex Numbers(CIN))(见，Society ofDyers and Colourists，Rowe Colour Index，第3版，Bradford，England，[1971])。
在仍进一步的实施方案中，本发明的组合物进一步包括来自以下的一种或多种物质：2，4-二羟基偶氮基苯、1-(2’-氯-4’硝基-1’-苯偶氮基)-2-羟基萘、油溶红、2-(4-磺基-1-萘偶氮基)-1-萘酚-4-磺酸、2-羟基-1，2’-偶氮萘-1’-磺酸的钙盐、1-(2-磺基-4-甲基-1-苯偶氮基)-2-萘基羧酸的钙盐和钡盐、1-(2-磺基-1-萘偶氮基)-2-羟基萘-3-羧酸的钙盐、1-(4-磺基-1-苯偶氮基)-2-萘酚-6-磺酸的铝盐、1-(4-磺基-1-萘偶氮基)-2-萘酚-3，6-二磺酸的铝盐、1-(4磺基-1-萘偶氮基)-2-萘酚-6，8-二磺酸、4-(4-磺基-1-苯偶氮基)-1-(4-磺苯基)-5-羟基吡唑啉酮-3-羧酸的铝盐、4，5-二溴荧光素的铝盐和锆盐、2，4，5，7-四溴荧光素的铝盐和锆盐、3’，4’，5’，6’-四氯-2，4，5，7-四溴荧光素及其铝盐、2，4，5，7-四碘荧光素的铝盐、喹酞酮二磺酸的铝盐、靛蓝二磺酸的铝盐、氧化铁红和氧化铁黑(CIN：77491(红)和77499(黑))、氧化铁水合物(CIN：77492)、二磷酸锰铵以及二氧化钛。
在仍进一步的实施方案中，油溶的天然染料例如辣椒粉抽提物、β-胡萝卜素或胭脂红(cochenille)可用于本发明中。
在仍另外的实施方案中，本发明的凝胶膏组合物包括珠光颜料。在一些优选的实施方案中，各种珠光颜料可用于本发明中，包括但不限于“天然珠光颜料”(例如，“珠光粉(pearl essence)”[来自鱼鳞的鸟嘌呤/次黄嘌呤的混合晶体]、“珍珠母(mother ofpearl)”[碾碎的贻贝壳(ground mussel shells)])、和“单晶珠光颜料(monocrystallinepearlescent pigment)”(例如氯氧化铋[BiOCl])；以及“层基底颜料(layer substratepigment)”(例如，云母/金属氧化物)。
珠光颜料的底基包括但不限于粉状颜料、氯氧化铋和/或二氧化肽的蓖麻油分散体、云母上的氯氧化铋和/或二氧化肽。例如，以CIN 77163列出的闪光颜料是特别有利的。
下文提供了可特别用于本发明中的另外一组基于云母/金属氧化物的珠光颜料。
在一些优选的实施方案中，以商品名Timiron、Colorona或Dichrona从Merck获得的珠光颜料可用于本发明。然而，本发明并非意在限于本文所列的具体颜料。实际上，可以从许多来源获得用于本发明中的珠光颜料。例如，可以用另外的金属氧化物涂覆除云母外的其它底材，例如二氧化硅等。由Merck出售的、用例如TiO2和Fe2O3涂覆的SiO2颗粒(“ronasphere”)，特别适用于细线的光学降低(optical reduction of fine lines)，可用于本发明中。
在可选的实施方案中，不包括底材(例如，云母)。在一些优选的实施方案中，特别优选用SiO2制备的珠光颜料。这种颜料是可得的，例如以商品名Sicopearl Fantastico从BASF获得，所述颜料还可以另外具有角等色效应(goniochromatic effects)。
在另外的实施方案中，还可以使用从Engelhard/Mearl获得的基于硼硅酸钙钠的颜料，所述颜料已经用二氧化钛涂覆。这些可以商品名Reflcks获得。除颜色外，作为它们从40nm到180nm的粒径的结果，它们具有闪光效应。
在仍进一步的实施方案中，可从Flora Tech以商品名MetasomesStandard/Glitter获得的各种颜色(黄、红、绿、蓝)的效应色素，所述颜料可用于本发明的组合物中。在此，闪光颗粒存在于与各种辅助剂和染料(例如，染料索引(CI)号为19140、77007、77289、77491的染料)的混合物中。
在一些实施方案中，染料和颜料单独存在或以混合物存在。在可选的实施方案中，它们互相涂覆，不同的涂层厚度一般产生不同的颜色效应。在一些实施方案中，染料和给予色彩的颜料的总量选自一定的浓度范围(例如，从按重量计从约0.1％到按重量计约30％；优选按重量计从约0.5％至约15％；以及最优选按重量计从约1.0％至约10％，每种情况都基于制剂的总重量)。
在优选的实施方案中，本文中的组合物的pH在约3.5至约10的范围内，优选从约4至约8，以及更优选从约5至约7，其中，取决于组合物的形式和所述化合物的pH要求，根据需要加入酸式盐、碱式盐或缓冲盐，调节最终组合物的pH。
通过本领域的技术人员熟知的标准方法，制备本发明的组合物。一般而言，分开制备水相和油相，其中以任意顺序加入具有类似相分离的材料。如果最终产物是乳状液，则如果需要，采用强烈的搅拌和/或均化作用混合两相，以减少内部相液滴的大小。制剂中任何具有高挥发性、或易于水解或高温降解的成分可以在该方法的最后在轻微搅拌下加入，如果可行的话，在乳化后加入。剂量频率和数量将取决于所期望的性能标准。
在本发明的一些实施方案中，提供了减少VEGF活性的方法。在这些实施方案中，方法包括将有效量的任一种本文所述化合物施用给需要它的生物体。在另外的优选实施方案中，本发明提供了化合物，用于治疗需要它的生物体，包括人和其它动物。
在一些仍进一步的实施方案中，本发明包含至少一种肌酸和/或肌酸衍生物。肌酸具有下列结构：
在本发明的个人护理组合物的一些优选实施方案中，可使用磷酸肌酸、硫酸肌酸、乙酸肌酸、抗坏血酸肌酸，和/或在羧基上与单官能团或多官能团醇酯化的衍生物。
在一些另外的实施方案中，本发明的个人护理组合物含有L-肉碱[3-羟基-4-(三甲铵基)丁内盐]。酰基肉碱具有下面的通式：
其中R选自可达10个碳原子的支化和未支化的烷基，并可用于本发明的一些实施方案中。在一些优选的实施方案中，可使用丙酰基肉碱和/或乙酰基肉碱。两种对映体(D和L型)，以及D-和L-型的混合物和外消旋物可用于本发明的一些个人护理组合物中。
在一些进一步的实施方案中，本发明的活性成分包括但不限于sericoside、吡哆醇、维生素K、生物素和芳香物质。此外，存在于本发明的个人护理组合物中的活性成分并非意在限于活性物质的任何特定组分和/或(一种或多种)混合物。实际上，预计各种活性物和活性物的混合物可用于本发明的各种实施方案中。此类活性物的浓度也并非意在限于任何特定的水平。在一些实施方案中，基于制剂的总重量，浓度是按重量计从约0.001％至约30％，而在其它实施方案中，是按重量计从约0.05％至约20％，以及在又进一步的实施方案中，它为按重量计从约0.1％至约10％。可以进一步预期，本领域技术人员将以适合组合物的预计用途的活性物浓度，来配制本发明的个人护理组合物。
在仍进一步的实施方案中，本发明提供了制备本发明的组合物的方法。在一些实施方案中，这些方法包括分别组合并加热油相和/或水相的多个组分，然后在搅拌下将它们组合在一起。在一些优选的实施方案中，所述相被均质化。在一些特别优选的实施方案中，用中等或高的能量输入搅拌组合物，有利地使用齿轮辋分散仪(gear rim dispersingmachine)，转数最高可达10000rpm(优选在约2500至约7700rpm的范围内)。
6.2实验
下列实施例进一步详述了本发明，而并非以任何方式限制要求保护的本发明的范围。附图意味着视为本发明的说明书的组成部分并用于描述本发明。所引用的所有参考文献中描述的所有内容，都通过引用具体的整合到本文中作为参考。下列实施例仅供示例，并非限制要求保护的发明
在后面的实验公开中，使用下列简写：PI(蛋白酶抑制剂)，BBI(来自大豆Acc.No.P01055的Bowman-Birk抑制剂)，BBI-AV(Bowman-Birk抑制剂抗-VegF)、STI(来自大豆的大豆胰蛋白酶抑制剂)；VEGF和VegF(血管内皮生长因子)；BBdb(来自二花扁豆Acc.No.AAK97765的Bowman-Birk抑制剂)、BBsb3(来自大豆蛋白酶抑制剂IV或D-II的Bowman-Birk抑制剂)和BBtc(来自巴西良木豆的Bowman-Birk抑制剂)；FGF-5(成纤维细胞生长因子5)，TGFβ(转化生长因子β)，TNFα(肿瘤坏死因子α)，ppm(每百万的份数)；M(摩尔浓度)；mM(毫摩尔浓度)；μM(微摩尔浓度)；nM(纳摩尔浓度)；mol(摩尔)；mmol(毫摩尔)；μmol(微摩尔)；nmol(纳摩尔)；gm(克)；mg(毫克)；μg(微克)；pg(皮克)；L(升)；ml和mL(毫升)；μl和μL(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；μm(微米)；nm(纳米)；U(单位(unit))；V(伏特)；MW(分子量)；sec(秒)；min(分钟)；h和hr(小时)；℃(摄氏度)；QS(足够量(quantity sufficient))；ND(未进行)；NA(不适用)；rpm(每分钟转数)；H2O(水)；dH2O(去离子水)；HCl(盐酸)；aa(氨基酸)；bp(碱基对)；kb(千碱基对)；kD(千道尔顿)；cDNA(拷贝或互补DNA)；DNA(脱氧核糖核苷酸)；ssDNA(单链DNA)；dsDNA(双链DNA)；dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸)；RNA(核糖核酸)；MgCl2(氯化镁)；NaCl(氯化钠)；w/v(重量体积比)；v/v(体积比)；g(重力)；OD(光密度)；Dulbecco磷酸缓冲液(DPBS)；SOC(2％Bacto-胰蛋白胨，0.5％Bacto酵母提取物，10mMNaCl，2.5mM KCl)；Terrific Broth(TB；12g/l Bacto胰蛋白胨，24g/l甘油，2.31g/lKH2PO4，和12.54g/l K2HPO4)；OD280(在280nm处的光密度)；OD600(在600nm处的光密度)；A405(在405nm处的吸光度)；Vmax(酶催化反应的最大初速度)；PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)；PBS(磷酸盐缓冲盐水[150mM NaCl，10mM磷酸钠缓冲液，pH 7.2])；PBST(PBS+0.25％20)；PEG(聚乙二醇)；PCR(聚合酶链式反应)；RT-PCR(逆转录PCR)；SDS(十二烷基硫酸钠)；Tris(三[羟甲基]氨基甲烷)；HEPES(N-[2-羟乙基]哌嗪N-[2-乙烷磺酸])；HBS(HEPES缓冲盐水)；SDS(十二烷基硫酸钠)；bME、BME和βME(β-巯基乙醇或2-巯基乙醇)；Tris-HCl(三[羟甲基]氨基甲烷-盐酸)；Tricine(N-[三-(羟甲基)-甲基]-甘氨酸)；CHES(2-(N-环己氨基)乙醇磺酸)；TAPS(3-{[三-(羟甲基)-甲基]-氨基}-丙烷磺酸)；CAPS(3-(环-己氨基)-丙烷-磺酸；DMSO(二甲亚砜)；DTT(1，4-二硫代-DL-苏糖醇)；Glut和GSH(还原型谷胱甘肽)；GSSG(氧化型谷胱甘肽)；TCEP(三[2-羧乙基]膦)；Ci(居里)；mCi(毫居里)；μCi(微居里)；TLC(薄层色谱)；Ts(甲苯磺酰基)；Bn(苄基)；Ph(苯基)；Ms(甲磺酰基)；Et(乙基)，Me(甲基)；Taq(水生栖热菌(Thermus aquaticus)DNA聚合酶)；Klenow(DNA聚合酶I大(Klenow)片段)；rpm(每分钟转数)；EGTA(乙二醇-双(β-氨基乙基醚)N，N，N’，N’-四乙酸)；EDTA(乙二胺四乙酸)；bla(β-内酰胺酶或氨苄青霉素抗性基因)；GE Healthcare(GE Healthcare，ChalfontSt.Giles，UnitedKingdom)；DNA2.0(DNA2.0，Menlo Park，CA)；OXOID(Oxoid，Basingstoke，Hampshire，UK)；Megazyme(Megazyme International Ireland Ltd.，Bray BusinessPark，Bray，Co.，Wicklow，Ireland)；Corning(Corning Life Sciences，Corning，NY)；(NEN(NEN Life Science Products，Boston，MA)；Pharma AS(Pharma AS，Oslo，Norway)；Dynal(Dynal，Oslo，Norway)；Bio-Synthesis(Bio-Synthesis，Lewisville，TX)；ATCC(美国典型培养物收藏中心，Rockville，MD)；Gibco/BRL(Gibco/BRL，GrandIsland，NY)；Sigma(SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)；Pharmacia(PharmaciaBiotech，Pisacataway，NJ)；NCBI(国立生物技术信息中心)；Applied Biosystems(Applied Biosystems，Foster City，CA)；Clontech(CLONTE CHLaboratories，Palo Alto，CA)；Operon Technologies(OperonTechnologies，Inc.，Alameda，CA)；MWG Biotech(MWG Biotech，High Point，NC)；Oligos Etc(Oligos Etc.Inc，Wilsonville，OR)；Bachem(Bachem Bioscienee，Inc.，Kingof Prussia，PA)；Difco(DifcoLaboratories，Detroit，MI)；Mediatech(Mediatech，Herndon，VA；Santa Cruz(Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Santa Cruz，CA)；BioVeris(BioVeris Corp.，Gaithersburg，MD)；Oxoid(Oxoid Inc.，Ogdensburg，NY)；Worthington(Worthington Biochemical Corp.，Freehold，NJ)；GIBCO BRL或Gibco BRL(LifeTechnologies，Inc.，Gaithersburg，MD)；Millipore(Millipore，Billerica，MA)；Bio-Rad(Bio-Rad，Hercules，CA)；Invitrogen(Invitrogen Corp.，San Diego，CA)；NEB(NewEngland Biolabs，Beverly，MA)；Sigma(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)；Pierce(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)；Takara(Takara Bio Inc.Otsu，Japan)；Roche(Hoffmann-La Roche，Basel，Switzerland)；EM Science (EMScience，Gibbstown，NJ)；Qiagen(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)；Biodesign(Biodesign Intl.，Saco，Maine)；Aptagen(Aptagen，Inc.，Herndon，VA)；Molecular Devices (Molecular Devices，Corp.，Sunnyvale，CA)；R&D Systems(R&D Systems，Minneapolis，MN)；Stratagene(StratageneCloning Systems，La Jolla，CA)；Marsh(Marsh Biosciences，Rochester，NY)；Bio-Tek(Bio-Tek Instruments，Winooski，VT)；(Biacore(Biacore，Inc.，Piscataway，NJ)；PeproTech(PeproTech，Rocky Hill，NJ)；SynPep(SynPep，Dublin，CA)；and Microsoft(Microsoft，Inc.，Redmond，WA)。
实施例1
在枯草芽孢杆菌中生产BCE103-BBI融合蛋白
在该实施例中，描述了在枯草芽孢杆菌中进行BCE103-BBI融合蛋白生产的实验。编码用于这些实施方案中的具有C端六聚组氨酸标签的原BBI蛋白(pro-BBI)的合成基因(Operon Technologies)的DNA序列是：AACCTGCGTCTGTCTAAGCTTGGCCTGCTTATGAAATCAGACCATCAGCACAGCAATGACGATGAGAGCTCTAAACCCTGTTGCGATCAATGCGCATGTACGAAATCAAATCCTCCACAGTGTCGGTGTTCCGATATGCGTCTGAATAGCTGTCATAGTGCATGCAAAAGCTGTATCTGCGCCCTGAGTTATCCAGCTCAATGTTTTTGCGTCGACATCACGGACTTCTGCTATGAGCCATGTAAACCAAGCGAGGACGATAAAGAGAACCATCATCACCATCACCAT(SEQ ID NO：10)
由上述合成基因编码的、具有C端六聚组氨酸标签的原BBI的蛋白质序列是：
NLRLSKLGLLMKSDHQHSNDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCICALSYPAQCFCVDITDFCYEPCKPSEDDKENHHHHHH(SEQ ID NO：11)
编码主要的成熟形态的BBI的合成基因的DNA序列部分是：
GACGATGAGAGCTCTAAACCCTGTTGCGATCAATGCGCATGTACGAAATCAAATCCTCCACAGTGTCGGTGTTCCGATATGCGTCTGAATAGCTGTCATAGTGCATGCAAAAGCTGTATCTGCGCCCTGAGTTATCCAGCTCAATGTTTTTGCGTCGACATCACGGACTTCTGCTATGAGCCATGTAAACCAAGCGAGGACGATAAAGAGAAC(SEQ ID NO：12)
由上述合成基因编码的、主要的成熟形态的BBI的蛋白质序列是：
DDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCICALSYPAQCFCVDITDFCYEPCKPSEDDKEN(SEQID NO：13)
用于扩增与pJ103载体中的BCE103纤维素酶表达盒融合的BBI基因的PCR引物是：
BBIfusion_FW：5’CAGCACGGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCC3’(SEQ IDNO：14)
BBIHindIII_RV：5′CTGCAGAAGCTTAAAAATAAAAAAACGGATTTCCTTCAGGAAATCCGTCCTCTGTTAACTTTTAGTTCTCTTTATCGTCCTCGC 3′(SEQ IDNO：15)
BBIHIS-HindIII_RV：5’CTGCAGAAGCTTAAAAATAAAAAAACGGATTTCCTTCAGGAAATCCGTCCTCTGTTAACTTTTAATGGTGATGGTGATGATGGTTCTC 3’(SEQ ID NO：16)
图1中提供了克隆到pJM103整合载体中的aprE-BCE103-BBI-HisTag表达盒(EcoRI-HindIII)的序列。图2中提供了pJM103BBIHis表达载体的示意质粒图。
与枯草芽孢杆菌aprE启动子和信号序列融合的碱性纤维素酶(BCE103)基因(见van Soligen，美国专利6,063,611，通过引入整合到本文中作为参考)，是从pUCAPR103(Shaw等，J.Mol.Biol.，320：303-309[2002])中作为EcoRI-BamHI片段(即，仅携带BCE103催化结构域的编码序列和第一纤维素结合结构域接头的片段)克隆到pJM103中的(Perego，“Integrational vectors for genetic manipulation in Bacillus subtilis”In，Bacillus subtilis and Other Gram-positive Bacteria：Biochemistry，Physiology，and Molecular Genetics，Sonenshein，Hoch和Losick(编著)，American Society forMicrobiology，Washington D.C.，第615-624页[1993])。通过Operon Technologies(见上面的DNA序列)，合成编码具有C端六聚组氨酸标签(His-Tag)的、大豆Bowman-Birk蛋白酶抑制剂(BBI)(Swiss-Prot登录号#P01055；见Odani和Ikenaka，J.Biochem.，71：839-848[1972])的基因。使用引物(所有引物通过MWG Biotech，Oligos Etc.或OperonTechnologies合成)，通过PCR扩增BBI基因，其在具有BCE103基因的正确阅读框中产生了5’BamHI位点，在具有3’HindIII位点的BBI基因末端之后导入3’端强转录终止子(LAT，来自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因)，该酶切位点用于克隆到pJM103载体中。
使用合成的BBI基因作为模板，分别用引物BBIfusion FW(SEQ ID NO：14)和BBIHISHindIII RV(SEQ ID NO：16)或者BBIfusion FW(SEQ ID NO：14)和BBI-HindIILRV(SEQ ID NO：15)，产生含有或不含有C端His-Tag的PCR片段。除非另外指出，使用高保真Platinum Taq聚合酶(Invitrogen)，根据供应商的说明，通常在热循环仪上进行30个循环的PCR反应(退火温度55℃)。PCR片段以BamHI-HindIII片段克隆到携带aprE-BCE103表达盒的pJM103中。通过DNA测序，确认正确的基因序列。
因此，如图1所示，BBI基因(含有或不含有His-Tag)的成熟编码区的N端与由BCE103纤维素酶基因编码的第一CBD(纤维素结合结构域)接头序列的C端编码区框内融合。如此，在最终的表达载体pJM103BBI或pJM103BBIhis中，BCE103的两个CBD(Shaw等，见上文)被BBI置换(见，图2)。aprE启动子调控BCE103-BBI基因融合体的表达(见，Ferrari等，J.Bact.，170：289-295[1988]；以及Henner等，J.Bact.，170：296-300[1988])。
用表达质粒pJM103BBI或pJM103BBIhis转化感受态的枯草芽孢杆菌细胞BG3934comK(degUHy32，oppA，ΔspollE3501，ΔaprE，ΔnprE，Δepr，ΔispA，Δbpr，amyE::xylRPxylAcomK-phleo)。在木糖诱导型启动子(Hahn等，Mol.Microbiol.、21：763-775[1996])的调控下，通过诱导comK基因，使该细菌成为感受态。在含有5μg/ml氯霉素的LuriaBroth琼酯(LA)板上选择转化子。为通过基因扩增增加表达，将克隆在含有25μg/ml氯霉素的LA板上划线并且生长若干次，直到在抗生素下的生长速率类似于不存在氯霉素时的生长速率。通过在TSB培养基(来自OXOID的胰蛋白胨大豆液体培养基(Tryptone Soya Broth)，30g/L)中或在MBD培养基中(基于MOPS的已知成分的培养基)中，37℃下在摇瓶中生长，产生BCE103-BBI融合蛋白。基本如所述制备MBD培养基(Neidhardt等，J.Bacteriol.，119：736-747[1974])，除了省去基础培养基中的NH4Cl2、FeSO4和CaCl2外，使用3mM K2HPO4，并且用60mM脲、75g/L葡萄糖和1％大豆蛋白胨(soytone)补充该基础培养基。此外，以1升中含有400mg FeSO4·7H2O、100mg MnSO4·H2O、100mg ZnSO4·7H2O、50mg CuCl2·2H2O、100mgCoCl2·6H2O、100mg NaMoO4·2H2O、100mg Na2B4O7·10H2O、10ml 1M CaCl2和10ml 0.5M柠檬酸钠制备成微量营养素(micronutrient)的100×储液。
通过使用标准蛋白质染料(例如，GelCode Blue Stain Reagent；Pierce)，可以轻易的将无细胞上清液(在TSB培养基中生长24小时后，或在MBD培养基中生长48h后)样品中的BCE103-BBI融合蛋白可视化为SDS-PAGE凝胶(在MES缓冲液中的10％NuPAGE，如生产商Invitrogen所述运行)上的主要蛋白条带，作为～44kDa泳动。使用生产商(BM ChromogenicWestern Blotting Kit；Roche Applied Science使用抗-HisTag抗体或抗-BCE103纤维素酶多克隆抗体进行检测)提供的规程，通过SDS-PAGE凝胶的免疫印迹，确认BCE103-BBI融合蛋白的身份。
为确定BCE103活性，在LA纤维素酶指示板(含用0.2％Congo Red或用0.5％偶氮基-CM-纤维素、Megazyme染色的1％羧甲基纤维素)上定性评估纤维素酶降解活性；或者使用本领域已知的方法(见例如van Tilbeurgh等，Meth.Enzymol.，160：45-59[1988])，使用合成底物4-硝基苯基β-D-纤维二糖苷(Sigma)，在培养基上，通过在测定缓冲液(100mMTris pH 8.6，0.005％Tween-80)中直接测定来定量评估纤维素酶降解活性。
在测定缓冲液中进行胰蛋白酶抑制实验，确定BBI活性。具体而言，通过制备十一次1∶1连续稀释(100μL BBI+100μL测定缓冲液)的2μg/mL标准BBI溶液，生成标准曲线。使用疏水相互作用柱(POROS HP2，Phenyl柱，Applied Biosystems)，在20mM pH 6.0的MES中，从1mg/ml胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶抑制剂(Sigma目录号T-9777)溶液，纯化BBI标准物。用20mMMES pH 6.0平衡柱，用5mg抑制剂上样，用平衡缓冲液洗涤，然后用水洗脱BBI。如果需要，在抑制测定中稀释待测的未知BBI样品，使两个或多个数据点将落入标准曲线内(通常检测1∶10、1∶100、1∶200、1∶1000、1∶2000的样品稀释液，然后，如果必要，精细调节稀释度)。将20μL的每一稀释的BBI标准物或样品加入到80μL的50ng/ml牛胰腺胰蛋白酶中(Worthington)(通过在测定缓冲液中稀释所储存的1mg/mL胰蛋白酶溶液而制备)。为了方便起见，将标准物和样品排列在96孔微量滴定板上。混合反应液，并在25℃孵育15分钟。孵育后，添加100μL的0.5mg/ml胰蛋白酶底物(在测定缓冲液中稀释100mg/ml的DMSO溶液)，Suc-AAPR-pNA(琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Arg-对硝基苯胺，Bachem)，混合，并监测OD(A405)15分钟，其中使用Spectra Max 250(Molecular Devices)每12秒记录1个时间点。使用所述数据点确定每一反应的Vmax。将Vmax对BBI浓度绘图，生成标准曲线，并拟合成四参数曲线。使用生产商(Molecular Devices)提供的软件，进行所有的数据拟合。从标准曲线计算未知样品的BBI浓度。可选地，使用相同的规程，但通过测定牛胰腺胰凝乳蛋白酶(Worthington)抑制作用来测量BBI活性(使用与胰蛋白酶相同浓度的胰凝乳蛋白酶，通过加入100μL的0.4mg/ml胰凝乳蛋白酶底物--琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-对硝基苯胺，Bachem--测量胰凝乳蛋白酶活性)。
通过摇瓶运行(500ml MBD培养基，在2.8L Fernbach 6挡板瓶(baffled flask)中，37℃，225rpm，生长60小时后收获)的滴度典型的在0.4-0.9mg/ml BCE活性和40-150μg/ml BBI胰蛋白酶抑制活性的范围内。然而，预期通过优化细菌菌株、培养基和生长条件(通风、温度、收获时间等)，可以进一步改善滴度。
除与野生型BBI融合的BCE103外，使用上文概述的方法，生产与BBI变体融合的融合蛋白，以及在BCE103和BBI之间具有各种接头的融合蛋白，如在下列实施例所述。此外，当BBI与第二个CBD接头融合(BCE-cbdD-BBI；见实施例4)，使得能够使用第一个CBD帮助纯化过程时，也可以生产融合蛋白。
实施例2
生产取代BBI反应位点环成为BCE103-BBI融合蛋白的肽
在本实施例中，描述了实施用于生产取代BBI反应位点环成为BCE103-BBI融合蛋白的肽的实验。下文提供了引物，以及用于这些实验的各个步骤中的其它序列。图3提供了从BCE103融合位点(BamHI位点)至该基因末端的12BBIck81序列。将CK37281肽序列(ACYNLYGWTC(SEQ ID NO：9)插入到胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶抑制环中。
使用定点诱变(Stratagene)，用于在BBI基因中导入EcoRI位点的引物是：
BowBeco-F
5’-GATATGCGTCTGAATTCCTGTCATAGTGCAT(SEQ ID NO：17)
BowBeco-R
5’-ATGCACTATGACAGGAATTCAGACGCATATC(SEQ ID NO：18)
退火并克隆到BBI基因(SacI-EcoRI)中，以用VegF结合肽CK37281替换胰蛋白酶抑制环的DNA寡核苷酸序列是：
1BBck81+
5’-CTAAACCCTGTTGCGATCAATGCGCATGTTATAATTTGTATGGGTGGACTTGTCGCTGCAGCGATATGCGTCTG(SEQ ID NO：19)
1BBck81-
5’-AATTCAGACGCATATCGCTGCAGCGACAAGTCCACCCATACAAATTATAACATGCGCATTGATCGCAACAGGGTTTAGAGCT(SEQ I D NO：20)
退火并克隆到BBI基因(EcoRI-SalI)中，以用VegF结合肽CK37281替换胰凝乳蛋白酶抑制环的DNA寡核苷酸序列是：
2BBck81+
5’-AATTCCTGTCATAGTGCCTGCAAAAGCTGCGCATGTTATAACCTGTACGGGTGGACCTGTTTTTGCG(SEQ ID NO：21)
2BBck81-
5’-TCGACGCAAAAACAGGTCCACCCGTACAGGTTATAACATGCGCAGCTTTTGCAGGCACTATGACAGG(SEQ ID NO：22)
下文提供了寡核苷酸对的DNA序列，所述寡核苷酸对用于制备将肽导入合成BBI基因的胰蛋白酶(SacI和EcoRI限制性位点)或胰凝乳蛋白酶(EcoRI和SalI限制性位点)反应位点环中的盒。然后，将这些肽编码序列作为SacI-SalI片段移入p2JM103BBI表达载体中。
Comstatin(第一环)
CTAAACCCTGTTGCGATCAATGCGCATGTGTTGTTCAGGACTGGGGTCACCACCGTTGTCGCTGCAGCGATATGCGTCTG(SEQ ID NO：23)
和
AATTCAGACGCATATCGCTGCAGCGACAACGGTGGTGACCCCAGTCCTGAACAACACATGCGCATTGATCGCAACAGGGTTTAGAGCT(SEQ ID NO：24)
Comstatin(第二环)
CAAAAGCTGTATCTGCGTTGTTCAGGACTGGGGTCACCACCGTTGTTTTTGCG(SEQ ID NO：25)
和
TCGACGCAAAAACAACGGTGGTGACCCCAGTCCTGAACAACGCAGATACAGCTTTTGCATG(SEQ IDNO：26)
C2c(第一环)
CTAAACCCTGTTGCGATCAATGCAGCTGTGGTCGTAAAATCCCGATCCAGTGTCGCTGCAGCGATATGCGTCTG(SEQ ID NO：27)
和
AATTCAGACGCATATCGCTGCAGCGACACTGGATCGGGATTTTACGACCACAGCTGCATTGATCGCAACAGGGTTTAGAGCT(SEQ ID NO：28)
C3c(第一环)
CTAAACCCTGTTGCGATCAATGCGGTTGTGCTCGTTCTAACCTGGACGAATGTCGCTGCAGCGATATGCGTCTG(SEQ ID NO：29)
和
AATTCAGACGCATATCGCTGCAGCGACATTCGTCCAGGTTAGAACGAGCACAACCGCATTGATCGCAACAGGGTTTAGAGCT(SEQ ID NO：30)
C4c(第一环)
CTAAACCCTGTTGCGATCAATGCGGTTGTCAGCGTGCTCTGCCGATCCTGTGTCGCTGCAGCGATATGCGTCTG(SEQ ID NO：31)
和
AATTCAGACGCATATCGCTGCAGCGACACAGGATCGGCAGAGCACGCTGACAACCGCATTGATCGCAACAGGGTTTAGAGCT(SEQ ID NO：32)
C5c(第一环)
CTAAACCCTGTTGCGATCAATGCCAGTGTGGTCGTCTGCACATGAAAACCTGTCGCTGCAGCGATATGCGTCTG(SEQ ID NO：33)
和
AATTCAGACGCATATCGCTGCAGCGACAGGTTTTCATGTGCAGACGACCACACTGGCATTGATCGCAACAGGGTTTAGAGCT(SEQ ID NO：34)
Xa1(第二环)
AATTCCTGTCATAGTGCCTGCAAAAGCTGTATCTGCGCCCGTAGTTTGCCAGCTCAATGTTTTTGCG(SEQ ID NO：35)
和
TCGACGCAAAAACATTGAGCTGGCAAACTACGGGCGCAGATACAGCTTTTGCAGGCACTATGACAGG(SEQ ID NO：36)
hSCC1(第一环)
CTAAACCCTGTTGCGATCAATGCAACTGTACGTACTCAACCCCTCCACAGTGTCGCTGCAGCGATATGCGTCTG(SEQ ID NO：37)
和
AATTCAGACGCATATCGCTGCAGCGACACTGTGGAGGGGTTGAGTACGTACAGTTGCATTGATCGCAACAGGGTTTAGAGCT(SEQ ID NO：38)
下文提供了寡核苷酸引物对的DNA序列，所述引物对用于使用IIXL定点诱变试剂盒(Stratagene)将肽序列导入胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶反应位点环中。反应如制造商概述的和本实施例中的描述进行。进行二十个循环，在68℃延伸6分钟，95℃变性50s，以及在55℃退火50s。循环后，在68℃下进行20分钟的最终延伸。
1A(第二环)
CTGTATCTGCAAACGCTCAAAATCTCGTGGCTGTTTTTGCGTCGACATCAC (SEQID NO：39)
和
CGCAAAAACAGCCACGAGATTTTGAGCGTTTGCAGATACAGCTTTTGCATG(SEQ ID NO：40)
2B(第二环)
CTGTATCTGCTGGTATAATCAAATGACAACATGTTTTTGCGTCGACATCAC (SEQID NO：41)
和
CGCAAAAACATGTTGTCATTTGATTATACCAGCAGATACAGCTTTTGCATG (SEQID NO：42)
4A(第二环)
CTGTATCTGCCATCAACTTGGCCCGAATTCATGTTTTTGCGTCGACATCAC(SEQID NO：43)
和
CGCAAAAACATGAATTCGGGCCAAGTTGATGGCAGATACAGCTTTTGCATG(SEQ ID NO：44)
5A(第二环)
CTGTATCTGCCATCCGTGGGCACCGTATTCTTGTTTTTGCGTCGACATCAC(SEQ ID NO：45)
和
CGCAAAAACAAGAATACGGTGCCCACGGATGGCAGATACAGCTTTTGCATG(SEQ ID NO：46)
6-1A(第二环)
CTGTATCTGCAATCTTCATTATCTTCAACAGTGTTTTTGCGTCGACATCAC(SEQID NO：47)
和
CGCAAAAACACTGTTGAAGATAATGAAGATTGCAGATACAGCTTTTGCATG (SEQID NO：48)
7A(第二环)
CTGTATCTGCACACCGTCTCTTTATCGCCCGTGTTTTTGCGTCGACATCAC (SEQID NO：49)
和
CGCAAAAACACGGGCGATAAAGAGACGGTGTGCAGATACAGCTTTTGCATG(SEQ ID NO：50)
8B(第二环)
CTGTATCTGCCTTACAGATCAATCTAAACCGTGTTTTTGCGTCGACATCAC (SEQID NO：51)
和
CGCAAAAACACGGTTTAGATTGATCTGTAAGGCAGATACAGCTTTTGCATG(SEQ ID NO：52)
9A (第二环)
CTGTATCTGCGTTACAACATCAATGGGCATGTGTTTTTGCGTCGACATCAC(SEQID NO：53)
和
CGCAAAAACACATGCCCATTGATGTTGTAACGCAGATACAGCTTTTGCATG(SEQ ID NO：54)
10B(第二环)
CTGTATCTGCCGCGCATCACCGTATGATTGGTGTTTTTGCGTCGACATCAC(SEQ ID NO：55)
和
CGCAAAAACACCAATCATACGGTGATGCGCGGCAGATACAGCTTTTGCATG(SEQ ID NO：56)
11-1A (第二环)
CTGTATCTGCTCAACACAAAAAATTCCGCAATGTTTTTGCGTCGACATCAC (SEQID NO：57)
和
CGCAAAAACATTGCGGAATTTTTTGTGTTGAGCAGATACAGCTTTTGCATG(SEQID NO：58)
12B(第二环)
CTGTATCTGCACACAATTTCGCTCTGCAACATGTTTTTGCGTCGACATCAC (SEQID NO：59)
和
CGCAAAAACATGTTGCAGAGCGAAATTGTGTGCAGATACAGCTTTTGCATG(SEQ ID NO：60)
13A(第二环)
CTGTATCTGCCCGGATCATGTTCCGCATCTTTGTTTTTGCGTCGACATCAC (SEQID NO：61)
和
CGCAAAAACAAAGATGCGGAACATGATCCGGGCAGATACAGCTTTTGCATG(SEQ ID NO：62)
15-1A(第二环)
CTGTATCTGCTCAGGCTTTCCGCTTTCTACATGTTTTTGCGTCGACATCAC (SEQID NO：63)
和
CGCAAAAACATGTAGAAAGCGGAAAGCCTGAGCAGATACAGCTTTTGCATG(SEQ ID NO：64)
1A6(第一环)
TCAATGCGCATGTGAAGAGATCTGGACTATGCTTTGCCGGTGTTCCGATATGCGTC(SEQ ID NO：65)
和
CGGAACACCGGCAAAGCATAGTCCAGATCTCTTCACATGCGCATTGATCGCAACAGG(SEQ ID NO：66)
1A6(第二环)
CAAAAGCTGTGCTTGTGAAGAGATCTGGACTATGCTTTGCTTTTGCGTCGACATCACGG(SEQ IDNO：67)
和
ACGCAAAAGCAAAGCATAGTCCAGATCTCTTCACAAGCACAGCTTTTGCATGCACTATG(SEQ IDNO：68)
1C2(第一环)
TCAATGCGCATGTTGGGCCCTTACTGTCAAAACATGCCGGTGTTCCGATATGCGTC(SEQ ID NO：69)
和
CGGAACACCGGCATGTTTTGACAGTAAGGGCCCAACATGCGCATTGATCGCAACAGG (SEQ ID NO：70)
1C2(第二环)
CAAAAGCTGTGCTTGTTGGGCCCTTACTGTCAAAACATGCTTTTGCGTCGACATCACGG(SEQ IDNO：71)
和
ACGCAAAAGCATGTTTTGACAGTAAGGGCCCAACAAGCACAGCTTTTGCATGCACTATG(SEQ IDNO：72)
2E2(第一环)
TCAATGCGCATGTCTTACAGTACTGTGGACTACATGCCGGTGTTCCGATATGCGTC(SEQ ID NO：73)
和
CGGAACACCGGCATGTAGTCCACAGTACTGTAAGACATGCGCATTGATCGCAACAGG(SEQ ID NO：74)
2E2(第二环)
CAAAAGCTGTGCTTGTCTTACAGTACTGTGGACTACATGCTTTTGCGTCGACATCACGG(SEQ IDNO：75)
和
ACGCAAAAGCATGTAGTCCACAGTACTGTAAGACAAGCACAGCTTTTGCATGCACTATG(SEQ IDNO：76)
2E5(第一环)
TCAATGGGCATGTACTCTTTGGAACAGATCTCCTTGCCGGTGTTCCGATATGCGTC(SEQ ID NO：77)
和
CGGAACACCGGCAAGGAGATCTGTTCCAAAGAGTACATGCGCATTGATCGCAACAGG(SEQ ID NO：78)
2E5(第二环)
CAAAAGCTGTGCTTGTACTCTTTGGAATCGATCTCCTTGCTTTTGCGTCGACATCACGG(SEQ IDNO：79)
和
ACGCAAAAGCAAGGAGATCGATTCCAAAGAGTACAAGCACAGCTTTTGCATGCACTATG(SEQ IDNO：80)
FGFns (第一环)
TCAATGCGCATGTACAAACATCGATTCTACTCCTTGCCGGTGTTCCGATATGCGTC(SEQ ID NO：81)
和
CGGAACACCGGCAAGGAGTAGAATCGATGTTTGTACATGCGCATTGATCGCAACAGG(SEQ ID NO ：82)
FGFns(第二环)
CAAAAGCTGTGCTTGCACAAACATCGATTCTACTCCTTGTTTTTGCGTCGACATCACGG(SEQ IDNO：83)
和
ACGCAAAAACAAGGAGTAGAATCGATGTTTGTGCAAGCACAGCTTTTGCATGCACTATG(SEQ IDNO：84)
FGFkr(第一环)
TCAATGCGCATGTACAAAAATCGATCGTACTCCTTGCCGGTGTTCCGATATGCGTC(SEQ ID NO：85)
和
CGGAACACCGGCAAGGAGTACGATCGATTTTTGTACATGCGCATTGATCGCAACAGG(SEQ ID NO：86)
FGFkr(第二环)
CAAAAGCTGTGCTTGCACAAAAATCGATCGTACTCCTTGTTTTTGCGTCGACATCACGG(SEQ IDNO：87)
和
ACGCAAAAACAAGGAGTACGATCGATTTTTGTGCAAGCACAGCTTTTGCATGCACTATG(SEQ IDNO：88)
FGFhI(第一环)
TCAATGCGCATGTCACCTGCAGACAACTGAAACATGCCGGTGTTCCGATATGCGTC(SEQ ID NO：89)
和
CGGAACACCGGCATGTTTCAGTTGTCTGCAGGTGACATGCGCATTGATCGCAACAGG(SEQ ID NO：90)
FGFhI(第二环)
CAAAAGCTGTGCTTGCCACCTGCAGACAACTGAAACATGTTTTTGCGTCGACATCACGG(SEQ IDNO：91)
和
ACGCAAAAACATGTTTCAGTTGTCTGCAGGTGGCAAGCACAGCTTTTGCATGCACTATG(SEQ IDNO：92)
FGFgy (第一环)
TCAATGCGCATGTGGCTACTTCATCCCATCGATTTGCCGGTGTTCCGATATGCGTC(SEQ ID NO：93)
和
CGGAACACCGGCAAATCGATGGGATGAAGTAGCCACATGCGCATTGATCGCAACAGG(SEQ ID NO：94)
FGFgy (第二环)
CAAAAGCTGTGCTTGCGGCTACTTCATCCCATCGATTTGTTTTTGCGTCGACATCACGG(SEQ IDNO：95)
和
ACGCAAAAACAAATCGATGGGATGAAGTAGCCGCAAGCACAGCTTTTGCATGCACTATG(SEQ IDNO：96)
MM005(第一环)
TCAATGCGCATGTTTACGTATCCTTGCTAACAAATGCCGGTGTTCCGATATGCGTC(SEQ ID NO：97)
和
CGGAACACCGGCATTTGTTAGCAAGGATACGTAAACATGCGCATTGATCGCAACAGG(SEQ ID NO：98)
MM005(第二环)
CAAAAGCTGTGCTTGCTTACGTATCCTTGCTAACAAATGTTTTTGCGTCGACATCACGG(SEQ IDNO：99)
和
ACGCAAAAACATTTGTTAGCAAGGATACGTAAGCAAGCACAGCTTTTGCATGCACTATG(SEQ IDNO：100)
MM007(第一环)
GCGATCAATGCGCCTGCAGAACTCAACCATATCCTTTATGTCGGTGTTCCGATATGCGTC(SEQ IDNO：101)
和
GGAACACCGACATAAAGGATATGGTTGAGTTCTGCAGGCGCATTGATCGCAACAGGGTTT(SEQ IDNO：102)
MM007(第二环)
CAAAAGCTGTGCCTGCAGAACACAACCTTACCCACTTTGTTTTTGCGTCGACATCACGG(SEQ IDNO：103)
和
ACGCAAAAACAAAGTGGGTAAGGTTGTGTTCTGCAGGCACAGCTTTTGCATGCACTATG(SEQ IDNO：104)
MM009(第二环)
CAAAAGCTGTGCCTGCCTGTTAACACCTACTCTTAACTGTTTTTGCGTCGACATCACGG(SEQ IDNO：105)
和
ACGCAAAAACAGTTAAGAGTAGGTGTTAACAGGCAGGCACAGCTTTTGCATGCACTATG(SEQ IDNO：106)
MM010(第一环)
TCAATGCGCATGCGCTCTTCCAACTCATTCTAACTGTCGGTGTTCCGATATGCGTCT(SEQ ID NO：107)
和
CGGAACACCGACAGTTAGAATGAGTTGGAAGAGCGCATGCGCATTGATCGCAACAGG(SEQ ID NO：108)
MM010(第二环)
CAAAAGCTGTGCCTGCGCGCTTCCTACACACTCTAACTGTTTTTGCGTCGACATCACGG(SEQ IDNO：109)
和
ACGCAAAAACAGTTAGAGTGTGTAGGAAGCGCGCAGGCACAGCTTTTGCATGCACTATG(SEQ IDNO：110)
MM017(第二环)
CAAAAGCTGTGCCTGCCCTTTAGGCCTTTGCCCACCTTGTTTTTGCGTCGACATCACGG(SEQ IDNO：111)
和
ACGCAAAAACAAGGTGGGCAAAGGCCTAAAGGGCAGGCACAGCTTTTGCATGCACTATG(SEQ IDNO：112)
FGFps1(第二环)
AAGCTGTATCTGCTGGAACATCGATTCTACACCTTGTTTTTGCGTCGACATCACGG(SEQ ID NO：113)
和
ACGCAAAAACAAGGTGTAGAATCGATGTTCCAGCAGATACAGCTTTTGCATGCACT(SEQ ID NO：114)
FGFps2(第一环)
GCGATCAATGCATCTGTACTTGGATTGACAGTACTCCTTGTCGGTGTTCCGATATGCGTC(SEQ IDNO：115)
和
GGAACACCGACAAGGAGTACTGTCAATCCAAGTACAGATGCATTGATCGCAACAGGGTTT(SEQ IDNO：116)
FGFps2(第二环)
AAGCTGTATCTGCACATGGATCGATAGTACTCCTTGTTTTTGCGTCGACATCACGG(SEQ ID NO：117)
和
ACGCAAAAACAAGGTGTAGAATCGATCCATGTGCAGATACAGCTTTTGCATGCACT(SEQ ID NO：118)
FGFpsB(第二环)
AAGCTGTATCTGTACATGGATCGATTGGACACCTTGTTTTTGCGTCGACATCACGG(SEQ ID NO：119)
和
ACGCAAAAACAAGGTGTCCAATCGATCCATGTACAGATACAGCTTTTGCATGCACT(SEQ ID NO：120)
1A8(第二环)
CAAAAGCTGCGCATGTGTTACTACAGATTGGATCGAATGTTTTTGCGTCGACATCACGG(SEQ IDNO：121)
和
ACGCAAAAACATTCGATCCAATCTGTAGTAACACATGCGCAGCTTTTGCATGCACTATG(SEQ IDNO：122)
1A12(第二环)
CAAAAGCTGTGCCTGCCCAACACTTTGGACTCATATGTGTTTTTGCGTCGACATCACGGAC(SEQ I DNO：123)
和
ACGCAAAAACACATATGAGTCCAAAGTGTTGGGCAGGCACAGCTTTTGCATGCACTATGAC(SEQ IDNO：124)
1E11(第二环)
CAAAAGCTGCGCATGTTACTACTCTCAATTCCACCAATGTTTTTGCGTCGACATCACGG(SEQ IDNO：125)
和
ACGCAAAAACATTGGTGGAATTGAGAGTAGTAACATGCGCAGCTTTTGCATGCACTATG(SEQ IDNO：126)
TGFps1(第二环)
CAAAAGCTGTCTTTGTCCGGAAAACGATAACGTTTCTCCTTGTAATTGCGTCGACATCACGGACTTCTG(SEQ ID NO：127)
和
TGTCGACGCAATTACAAGGAGAAACGTTATCGTTTTCCGGACAAAGACAGCTTTTGCATGCACTATGAC(SEQ ID NO：128)
下文提供了寡核苷酸对的DNA序列，所述寡核苷酸对用于制备将MM021肽导入p2JM103-lnk2-BBI表达载体的胰凝乳蛋白酶反应位点环的盒。所述盒连接到载体中的SphI和SalI限制性位点中。
MM021(第二环)
CAAAAGCTGTGCTTGTAAACACAACGTACGTCTTTTATGTTTTTGCG (SEQ IDNO：129)
和
TCGACGCAAAAACATAAAAGACGTACGTTGTGTTTACAAGCACAGCTTTTGCATG(SEQ ID NO：130)
由半胱氨酸受限制性肽制成的文库是用于选择与目标底物结合的肽的常见试剂(例如，可商购的PhD-C7C噬菌体展示肽文库试剂盒；NEB)。BBI具有两个半胱氨酸受限制性活性位点环，其在结构上类似于在用于选择肽结合剂的各种方法中展示的肽环。因此，一旦选定半胱氨酸受限制性结合肽，则BBI适合用作在结合反应中呈现肽的支架。
通过使用DNA寡核苷酸盒，用CK37281肽序列(ACYNLYGWTC)(SEQ ID NO：9)替换胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或两者的反应位点环，将VEGF结合肽CK37281(见例如于2003年11月13日提交的共同未决美国临时专利申请系列号60/520,403，通过引用整合到本文中作为参考)移植到BBI中。为了促进构建，通过定点诱变，使用制造商(Stratagene)描述的方法，利用如上所示的引物BowBeco-F和BowBeco-R，在胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性位点环之间的BBI基因编码区(通过Operon Technologies定制合成；见实施例1)中导入EcoRI位点(在反应中使用0.5pmol的每种引物；在97℃初始变性3分钟的步骤之后，进行18个PCR循环：68℃下12分钟，95℃下30秒，以及55℃下1分钟，随后在68℃下进行最终的延伸反应15分钟)。
为了替换胰蛋白酶抑制肽环，将两个DNA寡核苷酸(1BBCK81+和1BBCk81-)退火并连接到SacI和EcoRI限制性位点中。同样的，为了替换胰凝乳蛋白酶抑制肽环，使用EcoRI和SalI位点插入通过寡核苷酸(2BBck81+和2BBck81-)退火制备的DNA盒。在CK37281肽替换胰蛋白酶环后，通过在胰凝乳蛋白酶环中插入CK37281肽(使用寡核苷酸(2BBck81+和2BBck81-))，将CK37281肽移植到两个环中。将在胰蛋白酶环(1BBIck81)中具有CK37281肽的BBI作为SacI-SphI片段移入pJM103BBI表达载体中。将在胰凝乳蛋白酶环(2BBIck81)或两个环(12BBIck81)中具有CK37281的BBI作为SacI-SalI片段移入pJM103BBI中。通过DNA测序确认正确的序列(图3中显示了12BBIck81基因的序列)。获得的载体pJM103-1BBIck81、pJM103-2BBIck81或pJM103-12BBIck81用于转化枯草芽孢杆菌BG3934comK，如上文实施例1确定BCE融合蛋白的产物。
通过SDS-PAGE检测泳动至～44kDa处的融合蛋白，所述蛋白质是在无细胞发酵液中存在的主要蛋白质。但是在一些情况下，BBI部分存在显著降解(可达50％)(特别是在MBD培养基中生长＞48h之后)，如观察到泳动至～34kDa处的显著蛋白条带，所述条带与BCE103催化核心对应。在这些情况下，BCE103纤维素酶的滴度类似于与野生型BBI融合时测量的滴度(实施例1)，但BBI的活性(用2BBIck81抑制胰蛋白酶，或用1BBIck81抑制胰凝乳蛋白酶)通常小约两倍。
为减少生长期间BBI变体的蛋白水解降解(即，相比于融合蛋白，减少在SDS-PAGE凝胶上存在的BCE103纤维素酶核心的量)，使用具有九个蛋白酶基因缺失的枯草芽孢杆菌菌株BG6006(degUHy32，oppA，ΔspollE3501，ΔaprE，ΔnprE，Δepr，ΔispA，Δbpr，ΔvprΔwprA，Δmpr-ybjF，ΔnprB，amyE::xylRPxylAcomK-ermC)作为表达宿主，并降低生长温度(35℃)和通气(200rpm)。在这些变化下，在SDS-PAGE凝胶上观察到主要的融合蛋白条带(～44kDa)，在预计是BCE催化核心蛋白质的分子量处(～34kDa)存在不显著的条带。
除CK37281肽外，当取代了与BCE103纤维素酶C端融合的BBI的胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶的活性位点环时，产生了许多其它的半胱氨酸受限制性肽。具体的例子包括：
(1)设计或选择作为补体拮抗剂的肽，导入第一或第二反应位点环的compstatin(见，Sahu等，J.Immunol.，157：884-891，[1996])；C2c(第一环)，C3c(第一环)，C4c(第一环)和C5c(第一环)；或在B因子结合反应中选择的肽，1B、2B、4A、5A、6-1A、7A、8B、9A、10B、11-1A、12B、13A和15-1A(所有都在第二环中)；
(2)设计分别与蛋白酶因子Xa或角质层胰凝乳蛋白酶Xa1(第二环)或hSCC1(第一环)结合的肽；
(3)在FGF5结合反应中选择的肽，1A6(第一或第二环)、1C2(第一或第二环)、2E2(第一或第二环)、2E5(第一、第二或两个环)、FGFns(第一或第二环)、FGFkr(第一或第二环)、FGFhl(第一或第二环)、FGFgy(第一或第二环)、MM005(第一或第二环)、MM007(第一、第二或两个环)、MM009(第二环)、MM010(第一、第二或两个环)、MM017(第二环)、FGFps1(第二环)、FGFps2(第一、第二或两个环)、和FGFpsB(第二环)；和
(4)在TGFβ-1结合反应中选择的肽，1A8(第二环)、1A12(第二环)、1E11(第二环)、TGFps1(第二环)、和MM021(第二环)。
上文提供了用于将这些肽导入胰蛋白酶(第一环)或胰凝乳蛋白酶(第二环)反应位点环的寡核苷酸，以及用于将这些肽移植到BBI中的方法。在所有情况下，通过SDS-PAGE凝胶确定所生产的融合蛋白。然而，在一些取代肽的情况下，通过如上对于CK37281取代肽所述的降低蛋白水解降解，增加完整的融合蛋白的量。
实施例3
通过硫醇还原/氧化剂激活BBI
在生长后，BBI的活性(通过胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶的抑制)通常比从在无细胞上清液中测量的BCE103纤维素酶的预期活性低5-20倍(在融合蛋白中，两个分子应该以1∶1的摩尔比存在)。通过加入βME，通常在接种后约14小时向MBD生长培养基中添加1-4mM的浓度，可以常规的获得在BCE103-BBI融合蛋白中BBI活性的增加(通过测量胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶的抑制)。当结合肽(例如，VegF结合肽CK37281)分别取代胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶反应位点环时，融合蛋白中的BBI的胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶抑制活性也低于预期值。和野生型BBI相同，通过用βME处理，可以增加抑制活性。出乎预料的是，在这些实验中，生长期间其它硫醇还原剂(例如，半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、DL-二硫苏糖醇和三[2-羧乙基]膦)对BBI的活化作用具有小的或可忽略的效应。同样，向生长培养基加入抗氧化剂(例如，抗坏血酸或DL-α-生育酚乙酸酯)或其它佐剂(例如，异亮氨酸、大豆油、Tween-80)、或在30℃下生长，不显著提高BCE103：BBI活性比。
具体而言，为确定生长期间的BBI的活化作用，在37℃下，在250ml摇瓶中，在40mlMBD培养基中培养用p2JM103-E3-2BBIck81(见，下文实施例4)转化的枯草杆菌BG6006的培养物13小时。然后，添加按图4提供的图表所示的巯基还原剂，并在生长62小时之后收获细胞上清液。向生长培养基中添加试剂2-巯基乙醇(BME)、半胱氨酸(Cys)、还原型谷胱甘肽(Glut)和DL-二硫苏糖醇(DTT)至图4表格所示的终浓度。浓度5mM的βME可以产生更好的BCE103：BBI活性比，但通常导致BCE103和BBI的滴度总体下降(见，图4)，原因至少部分在于由加入的试剂导致细菌生长下降。使用在实施例1中描述的测定，确定BCE103和2BBIck81的滴度。
在通过Q-Sepharose离子交换层析部分纯化了融合蛋白(例如，BCE-lnk2-2BBIck81；见，下文实施例4)之后，也实现了BBI活化。
从获自摇瓶或发酵罐的无细胞发酵液纯化融合蛋白。过滤发酵液，在水中稀释5至10倍，并调节pH至pH 7.5-8.0。将稀释的样品上样到用Q-Sepharose树脂(GE Healthcare)填充的柱上。用50mM Tris pH 7.5洗涤该柱，并在含有300mM NaCl的相同缓冲液中再次洗涤。在含有700mM NaCl的相同缓冲液中洗脱融合蛋白。
为了激活BBI，在测定缓冲液(Assay Buffer)中将收集的融合蛋白级分稀释十倍，然后在室温下，在搅拌盘或振荡平台上，在持续混合下，用2mM βME和0.2mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)处理约24h。基于测量的BCE103纤维素酶浓度，BBI通常可以活化至预期胰蛋白酶抑制活性的约70-100％。尽管上面概述的活化方法通常产生最好的结果，但是在一些情况下，为了使给定样品的活化最大化，在96孔板中进行筛选，以确定最优条件。最初，所筛选的典型条件是测定缓冲液中的稀释度(例如，2-50倍稀释梯度)、βME浓度(例如，在0.5-5mM之间的梯度)和氧化型谷胱甘肽浓度(例如，0mM，然后是1/20至1/2的一系列βME浓度)。
图5显示了融合蛋白BCE-lnk2-2BBIck81的活化。在该具体实例中，Q-Sepharose纯化的融合蛋白在含有0.005％的Dulbecco’s PBS(Mediatech)中1∶10稀释。添加β巯基乙醇达到3mM的最终浓度，并在振荡器中室温孵育过夜。在磁力搅拌台上，室温下剧烈搅拌，进一步温育样品约60h。通过纤维素酶测定和胰蛋白酶抑制测定，分别测定BCE103和2BBIck81的滴度(在βME处理之前和之后)。
在一些实施方案中，例如为了激活来自大体积发酵的无细胞发酵液中的BBI或其变体，需要降低激活反应中的稀释度和βME浓度。这可以通过使用更高浓度的缓冲液(500mMTris pH 8.6)，或改成两性离子缓冲液例如CHES(还有，CAPS、Tricine、TAPS和其它合适的两性离子缓冲液)来完成。例如，在含有0.005％的375mM CHES pH 8.6中1∶1稀释无细胞发酵液(或通过离子交换层析纯化的融合蛋白级分)，然后用1mM βME和10mMNa2SO3激活，并在室温下搅拌孵育约24h。通过该方法，常规地激活BBI或其变体(作为BCE103纤维素酶融合蛋白)，达到期望值的70-100％(基于BCE103纤维素酶活性)。
实施例4
通过切割BCE103-BBI融合蛋白释放游离的BBI/变体
本实施例描述了这样的实验，所述实验被开发用于通过切割BCE103-BBI融合蛋白释放游离的BBI或其变体。
下文提供了DNA寡核苷酸对的序列，所述寡核苷酸对经退火并连接到pJM103-BBI的BamHI和SacI位点中，以在培养生长期间在BCE103催化结构域和BBI之间产生潜在切割位点：
BCEsubBBI(枯草杆菌蛋白酶型敏感肽序列)
GATCCAGGTGGAGCTGCTTTAGTTGACGATGAGAGCT(SEQ ID NO：131)
和
CTCATCGTCAACTAAAGCAGCTCCACCTG(S EQ ID NO：132)
BCEcbdLBBI(第一CBD的部分)
GATCCAGGTGAACCTGACCCAACTCCTCCATCTGATCCTGGAGAATACCCAGCTTGGGACGATGAGAGCT(SEQ IDNO：133)
和
CTCATCGTCCCAAGCTGGGTATTCTCCAGGATCAGATGGAGGAGTTGGGTCAGGTTCACCTG(SEQ IDNO：134)
BCEproBBI(BBII的完整原肽)
GATCCGGCGAACCTGCGTCTGTCTAAGCTTGGCCTGCTTATGAAATCAGACCATCAGCACAGCAATGACGATGAGAGCT(SEQ ID NO：135)
和
CTCATCGTCATTGCTGTGCTGATGGTCTGATTTCATAAGCAGGCCAAGCTTAGACAGACGCAGGTTCGCCG(SEQID NO：136)
BCEshortproB BI(BBI的原肽的C端部分))
GATCCAAAATCAGACCATCAGCACAGCAATGACGATGAGAGCT(SEQ IDNO：137)
和
CTCATCGTCATTGCTGTGCTGATGGTCTGATTTTG(SEQ ID NO：138)
下文提供了DNA寡核苷酸对的序列，该寡核苷酸对被退火并连接到p2JM103-BBI的BamHI和SacI位点中，以将BBI与BCE103纤维素酶的第二CBD接头融合。
BCEcbd DBBI
GATCCAGGAGAACCGGACCCAACGCCCCCAAGTGATCCAGGAGAGTATCCAGCATGGGATTCAAATCAAATTTACACAAATGAAATTGTGTATCATAACGGTCAGTTATGGCAAGCGAAATGGTGGACACAAAATCAAGAGCCAGGTGACCCATACGGTCCGTGGGAACCACTCAAATCTGACCCAGATTCAGACGATGAGAGCT(SEQ IDNO：139)
和
CTCATCGTCTGAATCTGGGTCAGATTTGAGTGGTTCCCACGGACCGTATGGGTCACCTGGCTCTTGATTTTGTGTCCACCATTTCGCTTGCCATAACTGACCGTTATGATACACAATTTCATTTGTGTAAATTTGATTTGAATCCCATGCTGGATACTCTCCTGGATCACTTGGGGGCGTTGGGTCCGGTTCTCCTG(SEQ ID NO：140)
下文提供了在天冬氨酸和脯氨酸残基之间易受酸切割的肽序列。
接头1-WGDPHY(SEQ ID NO：141)(Lidell等，J.Biol.Chem.278：13944-51[2003])
接头2-DNNDPI(SEQ ID NO：142)(Segalas等，FEBS Lett，371：171-175[1995])
接头3-VVADPN(SEQ ID NO：143)(Kemperman等，Appl.Env.Microbiol.，69：1589-1597[2003])
下文提供了寡核苷酸引物，所述引物用于通过定点诱变将BssHII位点引入pJM103BBI。
BCEbss-F
5’-TGGCGTTCAGCAACATGAGCGCGCAGGCTGATGATTA(S EQ I D NO：144)BCEbss-R
5’-TAATCATCAGCCTGCGCGCTCATGTTGCTGAACGCCA(SEQ ID NO：145)
下文提供了DNA寡核苷酸的序列，所述DNA寡核苷酸被退火成盒(Sall-HindIII)，以在BBI的终止密码子后引入Hin dIII和XhoI位点，在LAT后导入PacI位点，以及除去原始的HindIII位点。
BCEterm+
5’-GACATCACGGACTTCTGCTATGAGCCATGTAAACCAAGCGAGGACGATAAAGAGAACTAAAAGCTTAACTCGAGGTTAACAGAGGACGGATTTCCTGAAGGAAATCCGTTTTTTTATTTTTAATTAAG(SEQ ID NO：146)
BCEterm-
5’-AGCTCTTAATTAAAAATAAAAAAACGGATTTCCTTCAGGAAATCCGTCCTCTGTTAACCTCGAGTTAAGCTTTTAGTTCTCTTTATCGTCCTCGCTTGGTTTACATGGCTCATAGCAGAAGTCCGTGATG(SEQ ID NO：147)
下外提供了PCR引物，所述引物用于产生上面提供的酸不稳定接头(即，接头1、接头2和接头3)，所述接头插入在BCE103催化结构域和BBI之间。
BCE103coreBssHII_FW
5’-CAGCAACATGAGCGCGCAGGCTG(SEQ ID NO：148)接头WGDPHYRV
5’-ATCGTCTGGATCCGGATAGTGGGGGTCTCCCCAAGATGCTGATTCTCTTATTTTTTCCC(SEQ IDNO：149)
接头DNNDPl_RV
5’-ATCGTCTGGATCCGGTATGGGATCATTGTTGTCAGATGCTGATTCTCTTATTTTTTCCC(SEQ IDNO ：150)
接头VVADPN_RV
5’-ATCGTCTGGATCCGGGTTGGGATCTGCAACTACAGATGCTGATTCTCTTATTTTTTCCC(SEQ IDNO：151)
PCR引物，其用于产生插入第一CBD接头中的上面提供的酸不稳定接头(即，接头1、接头2和接头3)。
BCE103corePstl_FW
GCATAAGGATGAGTCATCTGCAGCG(SEQ ID NO：152)
LplusWGDPHY_RV
5’-ATCGTCTGGATCCGGATAGTGGGGGTCTCCCCACGGTTCTCCTGGATCAGATGGCGG(SEQ IDNO：153)
LplusDNNDPI_RV
5’-ATCGTCTGGATCCGGTATGGGATCATTGTTGTCCGGTTCTCCTGGATCAGATGGCGG(SEQIDNO：154)
LplusVVADPN_RV
5’-ATCGTCTGGATCCGGGTTGGGATCTGCAACTACCGGTTCTCCTGGATCAGATGGCGG(SEQ IDNO：155)
下面提供了BCE103催化结构域和BBI之间插入的酸不稳定接头的蛋白质序列。以粗体表示酸不稳定接头，而来自第一CBD结构域的序列加下划线。
接头1
BCE-WGDPHY-PDP-BBI(SEQ ID NO：156)
接头2
BCE-DNNDPI-PDP-BBI(SEQ ID NO：157)
接头3
BCE-VVADPN-PDP-BBI(SEQ ID NO：158)
接头+1
BCE-IPPSDPTPPSDPGEP-WGDPHY-PDP-BBI(SEQ ID NO：159)
接头+2
BCE-IPPSDPTPPSDPGEP-DNNDPI-PDP-BBI(SEQ ID NO：160)
接头+3
BCE-IPPSDPTPPSDPGEP-VVADPN-PDP-BBI(SEQ ID NO：161)
下面提供了DNA寡核苷酸对的序列，所述寡核苷酸对退火并连接到pJM103-BBI的BamHI和SacI位点中，在纯化过程期间在BCE103催化结构域和BBI之间产生潜在切割位点。
BCEentBBI(肠肽酶切割位点)
GATCCAGGTGGAGACGACGATGACAAAGACGATGAGAGCT(SEQ ID NO：162)和
CTCATCGTCTTTGTCATCGTCGTCTCCACCTG(SEQ ID NO：163)
BCEgenen1BBI(Genenase I切割位点)
GATCCAGGTGCTGCTCATTACGACGATGAGAGCT(SEQ ID NO：164)
和
CTCATCGTCGTAATGAGCAGCACCTG(SEQ ID NO：165)
下面提供了DNA寡核苷酸对的序列，所述寡核苷酸对退火并连接到pJM103-lnk2-1BBIck81的BamHI和SacI位点中，在纯化过程期间在BCE103催化结构域和BBI之间产生潜在切割位点。
BCEfurinBBI(弗林蛋白酶/Bliisterase切割位点)
GATCCACGTGCTAAAAGAGACGATGAGAGCT(SEQ ID NO：166)
和
CTCATCGTCTCTTTTAGCACGTG(SEQ ID NO：167)
BCEgenen2BBI(Genenase I切割位点)
GATCCAGGCGCTGCACACTACAACGACGATGAGAGCT(SEQ ID NO：168)
和
CTCATCGTCGTTGTAGTGTGCAGCGCCTG(SEQ ID NO：169)
BC EfleBBI(MPr切割位点)
GATCCATTCCTTGAAGACGATGAGAGCT(SEQ ID NO： 170)
和
CTCATCGTCTTCAAGGAATG(SEQ ID NO：171)
下面提供了寡核苷酸引物对的序列，所述引物对用于通过QuikChange定点诱变(Stratagene)将E和E3接头导入接头2中。
BCE-Elnk-BBI(Mpr切割位点)
CCCATACCGGAGCCAGACGATGAGAGCTC(SEQ ID NO：172)
和
CATCGTCTGGCTCCGGTATGGGATCATTGTTG(SEQ ID NO：173)
在BCE103催化结构域和BBI之间的E3接头的蛋白序列为DNNDPIPEPDDESFNMPIPEP(SEQ ID NO：174)。在该序列中，E接头加下划线，而以粗体显示通过大肠杆菌中错误重组产生的序列。Mpr(或V8蛋白酶)所致的切割可以在E3接头中存在的三个谷氨酸的任何一个之后发生。因而，结构是BCE-(SEQ ID NO：174)-BBI。
下面提供了DNA寡核苷酸对的序列，所述寡核苷酸对退火并连接到p2JM103-lnk2-2BBIck81的BamHI和SacI位点中，在BCE103催化结构域和BBI之间产生潜在的Genenase I切割位点。
BCEgenen3BBI
GATCCAGGCGCTGCACACTACAAATCAGACCATCAGCACAGCAATGACGATGAGAGCT(SEQ ID NO：175)
和
CTCATCGTCATTGCTGTGCTGATGGTCTGATTTGTAGTGTGCAGCGCCTG (SEQID NO：176)
BCEgenen4BBI
GATCCAGGCGCTGCACACTACGTAGAATTTCAAGACGATGAGAGCT (S EQ IDNO：177)
和
CTCATCGTCTTGAAATTCTACGTAGTGTGCAGCGCCTG(S EQ I D NO：178)
插入BCE103催化结构域和BBI之间的Genenase I敏感切割位点(也是酸和Mpr敏感的)的蛋白序列为DNNDPIPDPGAAHYVEFQ(SEQ ID NO：179)。Genenase I位点(Gen4连接)为粗体(切割发生在酪氨酸和缬氨酸之间)(NEB)，而接头2加下划线。Mpr的切割也可以发生在Gen4接头中紧跟缬氨酸的谷氨酸之后。本文使用的序列是BCE-SEQ ID NO：179)-BBI。
下面指示了BCE103-lnk2-2BBIck81融合蛋白中的切割位点。显示了BCE103催化结构域的C端七个氨基酸(加下划线)、接头2序列(粗体)和2BBIck81序列。用实心箭头指示酸/热不稳定的Asp-Pro键，而用线箭头指示在谷氨酸之后的Mpr敏感键。
...KIR ASDNNIPDDSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCACYNLYGWTCFCVDITDFCYEPCKPSDKEN(SEQ ID NO：180)
为了分离游离BBI或其变体，需要从BCE103-BBI融合蛋白切掉BBI部分。在一些实施方案中，这在生长期间通过由枯草芽孢杆菌内在生产的蛋白酶完成。在一些可选的实施方案中，该切割发生在生长之后的纯化过程期间(例如，通过酸/热或蛋白水解切割)。设计在生长期间潜在的易受切割的接头(见上，sub、cbdL、pro、shortpro和cbdD)，并以BamHI-SacI盒克隆到pJM103BBI或p2JM103BBI表达载体中。如实施例1所述，在SDS-PAGE凝胶上分析融合蛋白对BCE103催化结构域的生产。
对于除原接头(pro linker)外的所有这类接头，几乎观察不到融合蛋白的切割，所述原接头几乎被完全切割，以至于在凝胶上观察到极少的完整融合蛋白，但是存在与BCE103催化核心对应的大条带。不幸地是，生长期间的所述切割导致无细胞上清液中测量出可忽略的BBI活性，并且在SDS-PAGE凝胶上没有可被鉴别的BBI条带。尽管本发明并非意在限于任何特定的机理或理论，但可能的是，无活性形式的BBI对于蛋白水解降解特别敏感。因而，在活化之后的纯化过程期间的切割通常是优选的。
在一些实施方案中，如本领域已知的，在酸性pH下，通过热处理切割在天冬氨酸和脯氨酸残基之间的键(见例如Landon，Meth.Enzymol.，47：145-149[1977])。BCE103纤维素酶中的第一CBD接头具有三个Asp-Pro二肽序列(见，图1)，其具有被酸/热处理切割的潜力。然而，发现在这些位点上通过酸/热处理进行切割是低效率的。文献中已经描述了对于酸/热特别不稳定的蛋白序列，三个这样的序列为WGDPHY(SEQ ID NO：141)，DNN DPI(SEQ IDNO：142)，and VVADPN(SEQ IDNO：143)(即，接头1、2和3)。
在将这些酸不稳定接头导入BCE103-BBI表达载体pJM103BBI之前，通过XL(Stratagene)诱变(使用制造商的方法；并且描述在上文实施例2中，排除使用8分钟的延伸和1分钟的变性步骤)，使用寡核苷酸引物BCEbss-F和BCEbss-R(上文提供)，在aprE信号序列编码区中导入BssHII位点。然后，通过将寡核苷酸盒(BCEterm+和BCEterm-；上文提供)插SalI和初始的HindIII位点中，将HindIII和XhoI位点插入到LAT终止子之前(BBI终止密码子之后)，而在终止子之后(除去LAT终止子后的初始HindIII位点)添加PacI位点。该新载体称为“p2JM103BBI”。
使用正向引物BCE103coreBssHII_FW与每个反向引物，接头WGDPHY_R、接头DNNDPI_RV或接头VVADPN_RV(上文提供了所有上述序列)以及p2JM103BBI作为模板，通过PCR产生酸不稳定的接头片段(见例如，实施例1的PCR规程)。用BamHI和PstI消化970bp的PCR片段，在电泳后，从琼脂糖凝胶中分离编码所述酸不稳定接头片段的154bp片段，并连接到用BamHI和PstI消化的p2JM103载体中，所述载体也已经从凝胶纯化。通过DNA测序，验证最终表达载体p2JM103lnk1-BBI、p2JM103lnk2-BBI和p2JM103lnk3-BBI中的接头序列。
用所述质粒转化感受态枯草芽孢杆菌菌株BG3934comK或BG6006，在5μg/ml氯霉素LA平板上选择克隆，并扩大到25μg/ml氯霉素，如实施例1所述。
类似地，将酸不稳定接头插入到第一CBD接头中。具体而言，使用正向引物BCE103corePstI_FW，与反向引物LplusWGDPHY_RV、LplusDNNDPI_RV或LplusVVADPN_RV(见上文的序列)，以p2JM103BBI作为模板，产生PCR片段。用BamHI和PstI消化约150bp的PCR片段，纯化并连接到用BamHI和PstI消化的p2JM103BBI载体中。通过DNA测序，验证正确的序列，而将质粒p2JM103pllnk1-BBI、p2JM103pllnk2-BBI和p2JM103pllnk3-BBI用于转化枯草芽孢杆菌菌株，如上所述。
在MBD培养基中生长之后，基本上如上面所述(见，实施例2)，通过离子交换层析纯化融合蛋白。通过在10％甲酸中55℃处理16h，切割融合蛋白。在酸处理过程中沉淀BCE103催化结构域，并通过离心除去。在SpeedVac上，将上清液中的游离BBI干燥过夜。在上样到SDS-PAGE凝胶之前，将样品悬浮在50mM Tris pH8中。通过分析蛋白质染色的SDS-PAGE凝胶，观察到在BCE103催化结构域和BBI之间插入接头2的融合蛋白(BCE-DNNDPI-PDP-BBI)中，酸切割非常有效。发现在75℃下的20mM甘氨酸pH 2中，该接头于几个小时内被切割。
在可选的实施方案中，融合蛋白在纯化过程期间通过蛋白酶处理而切割。接头被设计为含有谷氨酸特异性蛋白酶(例如，Mpr或V8蛋白酶)、弗林蛋白酶/Blisterase、Genenase I和肠肽酶(肠激酶)的切割位点。这些接头是使用BamHI和SacI位点，作为寡核苷酸盒(关于所述序列见上文)导入到表达载体的BCE103催化核心和BBI之间的(见图1)。在原始表达载体(pJM103BBI)的编码区中，在第一CBD域以及在BBI中的第三个残基处存在谷氨酸残基(见图1)，预期易于被谷氨酸特异性蛋白酶例如枯草杆菌Mpr(BsMpr)或V8蛋白酶切割。然而，发现在这些位点上，BsMpr和V8蛋白酶都未非常有效的切割BCE-BBI融合蛋白。因而，必须设计对这些蛋白酶的切割敏感的其它接头。
测试上述六个酸不稳定接头被BsMpr切割的情况。在室温下，通过用16μg BsMpr处理16h，切割这些融合蛋白。在切割后，通过添加10％甲酸，沉淀BCE103催化结构域，并通过离心除去。在SpeedVac上，将上清液中的游离BBI干燥过夜。在上样到SDS-PAGE之前，将样品悬浮在50mM Tris pH 8中。类似于酸切割，比起任何其它接头，BCE-DNNDPI-PDP-BBI(接头2)融合蛋白被BsMpr更有效地切割。因此发现，通过酸/热处理或用谷氨酸特异性蛋白酶(如BsMpr)的蛋白水解消化，从BCE-DNNDPI-PDP-BBI融合蛋白中有效地释放出BBI及其变体。测试了设计通过Mpr切割的若干个其它接头(例如，E、E3接头和fle，如上提供)，但相对于接头2，无一具有任何优势(E3接头是通过用定点诱变反应转化后的大肠杆菌的错误重组产生的，所述反应是设计用于构建E接头)。如上所示，在接头2中存在两个酸/热不稳定的切割位点，以及3个对Mpr切割敏感的位点。
测试设计用于通过弗林蛋白酶或Blisterase(NEB)(BCEfurinBBI)、或肠肽酶(肠激酶，NEB)(BCEentBBI)进行切割的接头，但这些序列无一能被合适的蛋白酶有效切割。还设计了四个接头(BCEgenen1BBI、BCEgenen2BBI、BCEgenen3BBI和BCEgenen4BBI)，并测试通过Genenase I(NEB)的切割。仅在具有Gen4接头(BCEgenen4BBI)的情况下，观察到融合蛋白的有效切割。还发现BsMpr也有效地切割Gen4接头。
在激活纯化的BCE-lnk2-2BBIck81融合蛋白后，根据SDS-PAGE凝胶的判断，通过BsMpr的切割并不完全。然而发现：通过使用分离自地衣芽孢杆菌的Mpr蛋白酶(BlMpr)，在激活具有接头2(或Gen4接头)的BCE-BBI融合蛋白后，可实现完全切割。尽管本发明并非意在限于任何特定的机制，但成熟BBI中第三个氨基酸后的切割似乎对BlMpr更敏感，而从BBI的C端的第六个氨基酸后的切割对BsMpr切割更敏感。
在一些实施方案中，在切割后，通过如上所述的选择性酸沉淀(pH 3或更低)BCE103催化结构域、离子交换层析(见，实施例5)、或通过在无水胰蛋白酶-琼脂糖(Sigma)柱上选择性结合BBI，从BCE103催化结构域中纯化BBI，所述柱在50mM Tris pH 8.0中上样，用含150mMNaCl的50mM Tris pH 8.0洗涤，然后用含有300mM NaCl的50mM甘氨酸pH 2.2洗脱结合的BBI。
实施例5
BBIck81与VegF的结合
在本实施例中，描述了对BBIck81与VegF的结合进行评估的实验。如实施例2所述，在枯草芽孢杆菌中生产BCE103-lnk2-2BBIck81融合蛋白。纯化融合蛋白，并如实施例3所述，通过用βME和氧化型谷胱甘肽处理，增加BBI胰蛋白酶抑制活性。通过BsMpr蛋白酶切割融合蛋白(见实施例4)，并使用Q-Sepharose柱，通过离子交换层析，从BCE103催化结构域中纯化游离的2BBIck81。
简而言之，在切割后，将切割样品的pH调节至5.5，然后，将样品上样到柱上(用25mM MES pH 5.5平衡)。使用25mM乙酸钠pH 5.0通过洗涤该柱而释放游离的2BBIck81，而BCE103催化核心保持与树脂结合。通过超滤，浓缩2BBIck81级份，并使用基于电化学发光(ECL)的结合测定(BioVeris)进行分析。如制造商(BioVeris)所述，用电化学发光染料和生物素分别标记抗VegF抗体(Santa Cruz)和VegF(PeproTech)。所有材料都在补充了0.1％的Dulbecco’s PBS(Mediatech)中。在结合测定中测试抗VegF抗体(125、250和500ng/ml)和VegF(100、150、200和250ng/ml)的初始稀释梯度，确定每一个产生强ECL信号的浓度。
为了检测2BBIck81结合，将50μL的500ng/ml ECL标记的抗VegF抗体、50μL的250ng/ml生物素化VegF和100μL 2BBIck81(12.5、15、31.25、62.5、125、250或500ng/ml的梯度)在室温下振荡孵育2小时。然后，加入50μL的0.2mg/ml链霉抗生物素蛋白包被珠，在室温下孵育反应30分钟。如制造商(BioVeris)所述，使用BioVeris M8/384Analyzer测量ECL信号。如图6所示，ECL信号随浓度增加的2BBIck81取代更多的被标记的抗VegF抗体而降低，所述标记抗VegF抗体与附着在磁珠上的VegF结合。
因而，在微摩尔浓度下，当移植到BBI的胰凝乳蛋白酶抑制环(2BBIck81)上时，CK37281肽与抗VegF抗体竞争结合VegF。事实上，2BBIck81比合成的CK37281肽本身更好地竞争结合VegF(见图6)。在BioVeris测定中，插入到胰蛋白酶抑制环1BBIck81中的CK37281肽也与抗VegF抗体竞争。因而，BBI可用作支架，以呈现通过各种筛选方法选择的活性结合肽。
实施例6
使用可选的融合配偶体产生2BBIck81
在本实施例中，描述了为评价可选的融合伙伴而进行的实验。下面提供了用于从pET-40b(+)中扩增dsbC基因(E.coli)的寡核苷酸引物的DNA序列。这些引物在5’端产生BssHII位点，在3’端产生BamHI位点，用于克隆到p2JM103-Gen4-2BBIck81中。
DsbCBBI-F
AACATGAGCGCGCAGGCTGATGACGCGGCAATTCAACAAACGTTAG (SEQ IDNO：181)
DsbCBBI-R
TCGTCTGGATCCGGTATGGGATCATTGTTGTCACCAGAACCACTAGTTGATCCTTTACCGCTGGTCATTTTTTGGTG(SEQ ID NO：182)
下面提供了寡核苷酸的DNA序列，所述寡核苷酸经共同退火产生表达盒(Alw44I-BamHI)，用于利用接头2将门多萨假单胞菌(P.mendocina)角质酶基因与BBI融合。
CutinaseBBI+
TGCACTTCTCTGCTTTGGTCTGTTGAACGCAGAGGTCTTGACAACAATGATCCTATTCCG(SEQ IDNO：183)
Cuti naseBBI-
GATCCGGAATAGGATCATTGTTGTCAAGACCTCTGCGTTCAACAGACCAAAGCAGAGAAG(SEQ IDNO：184)
因为BBI部分具有七个二硫键，可以预期使用除BCE103纤维素酶催化结构域之外的融合蛋白将获得较高滴度的活性BBI。例如，在一些实施方案中，组合物(例如巯基-二硫键氧化还原酶和/或蛋白质二硫键异构酶)可用作融合蛋白，帮助产生正确折叠的BBI部分。在该实施方案中，大多数情况下不需要另外的活化步骤。在另外的实施方案中，在枯草芽孢杆菌中高滴度产生的其它蛋白也可用作融合配偶体。例如，来自真菌特异腐质霉(Humicolainsolens)的热稳定性蛋白质二硫键异构酶(hiPDI)已用作融合配偶体，在短芽孢杆菌中产生免疫球蛋白G(2个二硫键)的轻链(见，Kaj ino等，Appl.Env.Microbiol.、66：638-642[2000])。
为确定对于BBI的生产，hiPDI是否可能是比BCE103更好的融合配偶体，合成该hiPDI基因(DNA2.0)，并作为BssHII-SacI片段克隆到表达载体p2JM103-lnk2-2BBIck81中(见实施例4)。在设计该合成基因中，除了导入或删除限制性位点的情况外，选择在高表达的枯草芽孢杆菌基因中高频出现的密码子。在最终的构建物中，成熟hiPDI基因的N端与aprE信号序列融合，而C端与含有肠肽酶切割位点的接头融合(Kajino等，Appl.Env.Microbiol.、66：638-642[2000])，其再与2BBIck81融合(见图7)。该表达载体p2JM-PDI-EK-2BBIck81用于转化枯草芽孢杆菌BG6006，并在MBD培养基中确定融合蛋白的生产(如实施例1所述)，所述培养基在接种14小时后添加或不添加2mM的BME。
如通过SDS-PAGE凝胶电泳确定的，PDI-2BBIck81融合蛋白的生产通常略低于生长在相同条件下的BCE-2BBck81。从PDI-2BBIck81无细胞上清液测量的BBI滴度(胰蛋白酶抑制)通常也低于BCE-2BBIck81融合蛋白。和与BCE103融合的情况相同，与PDI融合时所测量的BBI活性当生长在2mM BME中时更高，并且当生长在无BME培养基中时，在生长后向无细胞上清添加BME可增加BBI活性(如实施例3所述)。因而，PDI的巯基-二硫键氧化还原酶活性似乎不显著增加融合蛋白中的活性2BBIck81的滴度，或未排除对激活BBI分子的要求。
为了增加融合蛋白的还原电位--其被考虑用于增加生长期间的BBI滴度，使用来自大肠杆菌的DsbC作为2BBIck81的融合配偶体。如制造商(Stratagene)所述，使用Herculase Enhanced DNA聚合酶，使用DsbCBBI-F和DsbCBBI-R作为引物(上面所示序列)以及pET-40b(+)(Novagen)作为模板，通过PCR扩增dsbC基因。分离的PCR片段作为BssHII-BamHI片段克隆到载体p2JM103-Gen4-2BBIck81中(见实施例4)。通过DNA测序，验证融合基因的正确序列。在这种情况下，根据在SDS-PAGE凝胶上的判断，DsbC-2BBIck81融合蛋白的滴度显著低于BCE-2BBIck81融合蛋白，并且通过胰蛋白酶抑制测量的活性2BBIck81滴度也小得多。
在枯草芽孢杆菌中高滴度生产的其它蛋白质可用作BBI生产的融合配偶体。一个此类蛋白是来自门多萨假单胞菌的角质酶(cutinase)，其已经利用来自枯草杆菌的aprE启动子进行高滴度表达(见例如，美国专利5,429,950，通过引用整合到本文中作为参考)。aprE-角质酶基因融合物作为EcoRI-Alw44I片段(来自pAK-15)与Alw44I-BamHI接头寡核苷酸盒(见上文的序列)连接到用EcoRI和BamHI切割的p2JM103-lnk2-2BBIck81中(见实施例4)。该角质酶-接头2-2BBIck81表达载体(见图8的EcoRI-BamHI aprE-角质酶-接头2序列)用于转化枯草杆菌BG6006细胞，并如前关于其它融合蛋白所述(见实施例1)，在MBD培养基中生产融合蛋白。在该情况下，角质酶-接头2-2BBIck81融合蛋白不是在SDS-PAGE凝胶上观察到的主要条带，并且测量的脂肪酶滴度(如使用美国专利5,429,950中提供的方法所测量)和BBI滴度比用BCE-2BBIck81融合蛋白发现的滴度小得多(约20倍)。同样，当将3mM βME加入生长培养基中时，并未显著提高角质酶融合蛋白中的BBI滴度。因而，通过激活BCE-2BBIck81融合蛋白，始终获得最高滴度的活性2BBIck81。尽管如此，预期各种融合配偶体将可用于本发明中。
实施例7
截短的BBI-AV(BBIt-AV；SEQ ID NO：187)的表达
本实施例描述了为提高2BBIck81BBI蛋白(BBI-AV；SEQ IDNO：186)的生产而进行的实验。
DDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCACYNLYGWTCFCVDITDFCYEPCKPSEDDKEN(SEQID NO：18)。
上述实施例和Vogtentanz等，2007(Protein Expr Purif 55：40-52[2007])的期刊文章描述了用于生产融合蛋白的方法，所述融合蛋白包含与BCE103纤维素酶催化结构域(BCE)的C端融合的大豆Bowman-Birk蛋白酶抑制剂(BBI)。如上所述，该系统已用于生产具有各种变体肽替换胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶抑制环的BBI分子。例如，生产了这样的BBI分子，即，含有VEGF结合肽CK37281(ACYNLYGWTC；SEQ IDNO：9)的BBI-AV(SEQ ID NO：186)，所述CK37281替换了天然的胰凝乳蛋白酶抑制环(ICALSYPAQC；SEQ ID NO：388)，纯化，并在基于电化学发光(ECL)的结合测定(BioVeris)中表现出与单克隆抗体竞争结合VEGF。然而，变体BBI-AV的回收产量低于野生型BBI的回收产量，最可能是由于具有错误形成的二硫键的分子的初始的较高百分比导致。
SEQ ID NO：186的截短形态的BBI-AV(即，SEQ ID NO：187的BBIT-AV)：
DDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCACYNLYGWTCFCVDITDFCYEPCKPSE(SEQ ID NO：187)，其缺少SEQ ID NO：186的5个C端氨基酸，在ECL(BioVeris)测定中，表现出比全长分子(即，未截短的分子)更好的结合VEGF，所述测定使用标记的抗VEGF单克隆抗体作为竞争剂。C-截短形态的BBI-AV，称为BBIt-AV(SEQ ID NO：187)，可以通过用GluBL蛋白酶(来自地衣芽孢杆菌的谷氨酰内肽酶I)修整C末端，在纯化过程中生产。可选的，可以如下通过使用改造的寡核苷酸盒导入终止密码子来获得BBIt-AV。
将下列BBI-trunc+和BBI-trunc-寡核苷酸退火，产生寡核苷酸盒：
BBI-trunc+
5’-TCGACATCACGGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCAAGCGAGTAAA(SEQ ID NO：188)
和
BBI-trunc-
5’-AGCTTTTACTCGCTTGGTTTACATGGTTCATAGCAGAAGTCCGTGATG (SEQID NO：189)
然后，将寡核苷酸盒连接到表达载体P2JM103-lnk2-2BBIck81的SalI和HindIII位点中，验证正确的序列，所获得的表达载体称为P2JM103-lnk2-BBit-AV。
为了提高表达，使用定点诱变试剂盒(Stratagene)，将编码aprE原肽(SEQ ID NO：191)(美国专利5,429,950)的前三个氨基酸AGK的多核苷酸序列(SEQ IDNO：190GCTGGTAAA)插入到aprE信号序列的末端和成熟的BCE103纤维素酶的起点之间。基本如制造商所述，进行定点诱变，使用p2JM103-lnk2-BBit-AV作为模板，使用寡核苷酸引物：
BCE-AGK-F：
5’-GCGCGCAGGCAGCTGGTAAAGATGATTATTCAGTTGTAGA(SEQ ID NO：192)和
BCE-AGK-R：
5’-AATAATCATCTTTACCAGCTGCCTGCGCGCTCATGTTGCT(SEQ ID NO：193)通过DNA测序验证正确的插入，获得的表达载体称为p2JMagk103-lnk2-BBIt-AV(SEQ ID NO：194)。
GAATTCTCCATTTTCTTCTGCTATCAAAATAACAGACTCGTGATTTTCCAAACGAGCTTTCAAAAAAGCCTCTGCCCCTTGCAAATCGGATGCCTGTCTATAAAATTCCCGATATTGGTTAAACAGCGGCGCAATGGCGGCCGCATCTGATGTCTTTGCTTGGCGAATGTTCATCTTATTTCTTCCTCCCTCTCAATAATTTTTTCATTCTATCCCTTTTCTGTAAAGTTTATTTTTCAGAATACTTTTATCATCATGCTTTGAAAAAATATCACGATAATATCCATTGTTCTCACGGAAGCACACGCAGGTCATTTGAACGAATTTTTTCGACAGGAATTTGCCGGGACTCAGGAGCATTTAACCTAAAAAAGCATGACATTTCAGCATAATGAACATTTACTCATGTCTATTTTCGTTCTTTTCTGTATGAAAATAGTTATTTCGAGTCTCTACGGAAATAGCGAGAGATGATATACCTAAATAGAGATAAAATCATCTCAAAAAAATGGGTCTACTAAAATATTATTCCATCTATTACAATAAATTCACAGAATAGTCTTTTAAGTAAGTCTACTCTGAATTTTTTTAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCAGCTTGTTGTTTGCGTTAACGTTAATCTTTACGATGGCGTTCAGCAACATGAGCGCGCAGGCAGCTGGTAAAGATGATTATTCAGTTGTAGAGGAACATGGGCAACTAAGTATTAGTAACGGTGAATTAGTCAATGAACGAGGCGAACAAGTTCAGTTAAAAGGGATGAGTTCCCATGGTTTGCAATGGTACGGTCAATTTGTAAACTATGAAAGCATGAAATGGCTAAGAGATGATTGGGGAATAACTGTATTCCGAGCAGCAATGTATACCTCTTCAGGAGGATATATTGACGATCCATCAGTAAAGGAAAAAGTAAAAGAGACTGTTGAGGCTGCGATAGACCTTGGCATATATGTGATCATTGATTGGCATATCCTTTCAGACAATGACCCGAATATATATAAAGAAGAAGCGAAGGATTTCTTTGATGAAATGTCAGAGTTGTATGGAGACTATCCGAATGTGATATACGAAATTGCAAATGAACCGAATGGTAGTGATGTTACGTGGGACAATCAAATAAAACCGTATGCAGAAGAAGTGATTCCGGTTATTCGTGACAATGACCCTAATAACATTGTTATTGTAGGTACAGGTACATGGAGTCAGGATGTCCATCATGCAGCCGATAATCAGCTTGCAGATCCTAACGTCATGTATGCATTTCATTTTTATGCAGGAACACATGGACAAAATTTACGAGACCAAGTAGATTATGCATTAGATCAAGGAGCAGCGATATTTGTTAGTGAATGGGGGACAAGTGCAGCTACAGGTGATGGTGGTGTGTTTTTAGATGAAGCACAAGTGTGGATTGACTTTATGGATGAAAGAAATTTAAGCTGGGCCAACTGGTCTCTAACGCATAAGGATGAGTCATCTGCAGCGTTAATGCCAGGTGCAAATCCAACTGGTGGTTGGACAGAGGCTGAACTATCTCCATCTGGTACATTTGTGAGGGAAAAAATAAGAGAATCAGCATCTGACAACAATGATCCCATACCGGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCCTGTTGCGATCAATGCGCATGTACGAAATCAAATCCTCCACAGTGTCGGTGTTCCGATATGCGTCTGAATTCCTGTCATAGTGCCTGCAAAAGCTGCGCATGTTATAACCTGTACGGGTGGACCTGTTTTTGCGTCGACATCACGGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCAAGCGAGTAAAAGCTTAACTCGAGGTTAACAGAGGACGGATTTCCTGAAGGAAATCCGTTTTTTTATTTTTAATTAAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGGGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGGTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATAGATCTGGAGCTGTAATATAAAAACCTTCTTCAACTAACGGGGCAGGTTAGTGACATTAGAAAACCGACTGTAAAAAGTACAGTCGGCATTATCTCATATTATAAAAGCCAGTCATTAGGCCTATCTGACAATTCCTGAATAGAGTTCATAAACAATCCTGCATGATAACCATCACAAACAGAATGATGTACCTGTAAAGATAGCGGTAAATATATTGAATTACCTTTATTAATGAATTTTCCTGCTGTAATAATGGGTAGAAGGTAATTACTATTATTATTGATATTTAAGTTAAACCCAGTAAATGAAGTCCATGGAATAATAGAAAGAGAAAAAGCATTTTCAGGTATAGGTGTTTTGGGAAACAATTTCCCCGAACCATTATATTTCTCTACATCAGAAAGGTATAAATCATAAAACTCTTTGAAGTCATTCTTTACAGGAGTCCAAATACCAGAGAATGTTTTAGATACACCATCAAAAATTGTATAAAGTGGCTCTAACTTATCCCAATAACCTAACTCTCCGTCGCTATTGTAACCAGTTCTAAAAGCTGTATTTGAGTTTATCACCCTTGTCACTAAGAAAATAAATGCAGGGTAAAATTTATATCCTTCTTGTTTTATGTTTCGGTATAAAACACTAATATCAATTTCTGTGGTTATACTAAAAGTCGTTTGTTGGTTCAAATAATGATTAAATATCTCTTTTCTCTTCCAATTGTCTAAATCAATTTTATTAAAGTTCATTTGATATGCCTCCTAAATTTTTATCTAAAGTGAATTTAGGAGGCTTACTTGTCTGCTTTCTTCATTAGAATCAATCCTTTTTTAAAAGTCAATATTACTGTAACATAAATATATATTTTAAAAATATCCCACTTTATCCAATTTTCGTTTGTTGAACTAATGGGTGCTTTAGTTGAAGAATAAAAGACCACATTAAAAAATGTGGTCTTTTGTGTTTTTTTAAAGGATTTGAGCGTAGCGAAAAATCCTTTTCTTTCTTATCTTGATAATAAGGGTAACTATTGCCGGATCGTCCTCAGGAGTAGGCGACATCGCTAAATAATGATCTATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT(SEQ ID NO：194)
使用p2JMagk103-lnk2-BBIt-AV表达载体转化细菌细胞，表达与BCE蛋白融合的BBIt-AV(SEQ ID NO：195)：
AGKDDYSVVEEHGQLSISNGELVNERGEQVQLKGMSSHGLQWYGQFVNYESMKWLRDDWGITVFRAAMYTSSGGYIDDPSVKEKVKETVEAAIDLGIYVIIDWHILSDNDPNIYKEEAKDFFDEMSELYGDYPNVIYEIANEPNGSDVTWDNQIKPYAEEVIPVIRDNDPNNIVIVGTGTWSQDVHHAADNQLADPNVMYAFHFYAGTHGQNLRDQVDYALDQGAAIFVSEWGTSAATGDGGVFLDEAQVWIDFMDERNLSWANWSLTHKDESSAALMPGANPTGGWTEAELSPSGTFVREKIRESASDNNDPIPDPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCACYNLYGWTCFCVDITDFCYEPCKPSESEQ IDNO：195)
实施例8
BBIT-AV位点饱和文库
本实施例描述了通过构建位点饱和文库，从未经修饰的BBIt-AV产生经修饰的变体BBPI而进行的实验，所述文库包含在图9显示的BBIt-AV分子(SEQ ID NO：187)的39个氨基酸位置中每一个位置上的取代。
基本如Amin等(Biotechniques 35：1134-1140，[2003])所述，如下使用经修饰版本的Stratagene的QuikChange多位点诱变(QCMS)试剂盒(La Jolla，CA)，产生BBIt-AV位点饱和文库。为每个选定的位点设计重叠的正向和反向引物，所述引物具有中间的NNS密码子和17-20个侧翼碱基，而BBIt-AV分子中的66个氨基酸位置中的每一个的正向(F)和反向(R)引物的序列显示在表1中。每个诱变反应含有50-100ng模板质粒(p2JMagk103-lnk2-BBIt-AV；SEQ ID NO：194)、0.5μl正向引物(25μM)、0.5μl反向引物(25μM)、1μldNTP(QCMS试剂盒)、2.5μl10x QCMS反应缓冲液、18.5μl去离子水和1μl酶掺合物(QCMS试剂盒)，总体积为25μl。对于位点10、11、13和25的BBI-AV文库，在没有反向引物的条件下，只使用1μl正向引物(25μM)。对于残基6、37、38、50和53的文库，用0.5μl正向诱变引物组合另一种与载体序列互补的引物(5′-CTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTAC；SEQ ID NO：328)进行诱变反应。对于诱变反应，使用的热循环程序是在95℃下2min进行1个循环，然后95℃下30sec、55℃下1min和68℃下10分钟进行29个循环(MJResearch thermocycler)。通过添加0.5-1μlDpnI(来自QCMS试剂盒)，并在37℃孵育1-4小时，消化模板DNA，之后是再添加0.5-1μl DpnI并在37℃再孵育1-4小时。模板DNA是从E.coli dam+菌株获得的，例如TOP10(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，确保对DpnI消化是易感的。
为了有效转化枯草芽孢杆菌，使用Amersham的Templiphi试剂盒，通过滚环扩增(RCA)扩增每种诱变反应中的DNA。具体而言，将1μL未稀释的QCMS反应物与5μL的Templiphi试剂盒的样品缓冲液混合。混合物在95℃加热3分钟，将DNA变性。将反应物置于冰上冷却2分钟。然后，将5μL的反应缓冲液和0.2μL的phi29聚合酶添加到反应物中，并在MJ Research热循环仪上30℃孵育5小时。最后，通过在MJ Research热循环仪上65℃孵育10min，热失活反应中的phi29酶。将扩增的DNA稀释10-100倍，使用1μL转化100μL的感受态枯草芽孢杆菌BG6006细胞(Vogtentanz等，2007)。将等分的25μL或75μL转化混合物置于补充了5μg/ml氯霉素的Luria琼脂平板上。在生长后，挑取单个转化子，接种到96孔微滴度板的每个孔中，所述每个孔具有200μl补充了5μg/ml氯霉素的Luria液体培养基。培养物在37℃和270rpm的湿润和通风的箱子(Innova 4230incubator，New Brunswick Scientific)中生长。在生长后，向每个孔添加80μl的50％甘油，并混合。通过从每个孔移出140μl所述培养物并置于新的微滴度板中，产生一式两份的平板。所有平板都储存在-80℃。一个平板保留作为质控(master)，而其他的进行单个突变体的DNA测序(Cogenics，Huston，TX)。关于DNA测序，将微滴度板中生长的每个克隆的过夜培养物稀释10-40倍，在使用AmershamBiosciencesReady-to-go PCR珠和引物BBI-PCR-F和BBI-PCR-R的PCR反应中，使用2μL。热循环条件是在95℃下5min进行1个循环，然后95℃下1分钟、55℃下1分钟和72℃下1分钟进行30个循环，以及在72℃进行7分钟的最终循环。用核酸外切酶I和虾碱性磷酸酶(EXOSAP-IT，AmershamBiosciences)处理PCR产物，或者在用M13反向引物测序前进行柱纯化。
表1
NNS诱变引物
解冻每个质控平板中的培养物，并使用针式复制器(pin replicator)接种新的无菌微滴度板，所述微滴度板在每个孔中含有150μl含5μg/ml氯霉素的Luria液体培养基。如上所述，平板在加湿和通气的箱子中生长～10hr。出于对照，用同时生长在15ml培养管(5ml含5μg/ml氯霉素的Luria液体培养基)中的BBI和BBI-AV培养物替代两个孔中的培养物。在培养物生长后，使用针式复制器，将平板用于接种2个一式两份的96孔过滤平板(Millipore，MSGV2210)，所述平板的每个孔中含有150μl含5μg/ml氯霉素的MBD培养基(Vogtentanz等，2007)。将复制的平板生长～14小时(如上所述，在垛叠的平板之间放置塑料间隔器，允许平板周围充分的空气流动)，然后，向1个平板的每个孔中添加2-巯基乙醇，至终浓度2mM。然后，平板生长另外～46小时。然后，测定含培养液(添加或未添加2-巯基乙醇)的96孔过滤平板的BBI和BCE活性。
实施例9
BBIt-AV变体的初筛：确定具有最高BBIt-AV∶BCE活性比例的变体的BBI和BCE活性 测定
在该实施例中，提供了用于评估导入经修饰的变体BBIt-AV中的氨基酸取代的影响的方法，所述变体是根据位点饱和方法产生的。测量通过上述位点饱和方法产生的经修饰BBIt-AV的胰蛋白酶抑制活性，并与对照野生型BBI(SEQ ID NO：13；BBI-wt或sBBI)和对照未经修饰的BBIt-AV(SEQ ID NO：187)的胰蛋白酶抑制活性进行比较。本发明并非意在限于这些具体的方法，也可使用其他合适的方法。
胰蛋白酶抑制测定：BBI活性的确定
如上所述，通过胰蛋白酶抑制测定，确定活性对照和经修饰的BBIt-AV的相对浓度，使用纯化的Sbbi作为标准。对于一些样品，根据Flecker(Flecker，P.FEBS Lett.252：153-157[1989]；Vogtentanz等，见上文)描述的方法，通过剩余的胰蛋白酶活性测量活化的BBI浓度。
使用稀释的生长在96孔板中的培养物来分析文库。典型的，在测定缓冲液(100mMTris pH 8.6，0.005％Tween 80)中稀释来自每个孔的培养物液体培养基(200倍)，并转移至第2个微滴度板(CoStar 9017，Corning，Inc.，Corning，NY)中。然后，将20μl稀释的样品转移至第3个微滴度板。通过向空白的孔添加20、10、5或2.5μl稀释的sBBI(SEQ ID NO：13)对照培养物，制备标准曲线。然后，向平板的每个孔中添加80μL的50ng/ml胰蛋白酶(牛胰腺胰蛋白酶，Worthington Biochemical Corp.，Lakewood，NJ)(从1mg/mL储液稀释到测定缓冲液中而制备)。混合反应物，并在室温孵育15min。在孵育后，向每个孔添加100μL的0.5ng/ml胰蛋白酶底物(琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Arg-对硝基苯胺(nitroanilide)，BachemBioscience，Inc.，King of Prussia，PA)，所述底物是通过将在DMSO中的100mg/ml溶液稀释在测定缓冲液中而制备的，混合，并监控405nm的吸光值15分钟，使用Spectra Max250(Molecular Devices)每12sec记录1个时间点。使用所述数据点确定每个反应的速率。通过反应速率相对于BBI体积绘图，来产生标准曲线，并拟合为四参数方程式。所有数据拟合都是使用制造商(Molecular Devices Corp.，Sunnyvale，CA)提供的软件进行的。从标准曲线计算每个BBIt-AV变体的活性。因而，相对于sBBI对照(BBI-WT)培养物的活性，确定所有经修饰变体蛋白质的活性。如果大部分数据未落入标准曲线的IC50的附近，则制备新的稀释平板并测定。
纤维素酶活性测定：BCE测定
如上文和Vogtentanz等，2007所述，使用纯化的BCE作为标准，通过活性测定来确定BCE的浓度。为了分析在96孔微滴度板中生长的文库，将20μl的培养物液体培养基转移至新的微滴度板的各个孔中。通过向空白的孔添加20、10、5或2.5μl稀释的BBI-WT对照培养物，制备标准曲线。然后，向平板中添加180μL的BCE底物(0.25μg/ml于测定缓冲液中)、4-硝基苯基-β-D-纤维二糖苷(Sigma，St.Louis，MO)。混合平板，并监控405nm的吸光值15分钟，使用Spectra Max 250(Molecular DevicesCorp.，Sunnyvale，CA)每12s记录1个时间点。使用所述数据点确定每个反应的速率。通过速率相对培养物体积绘图，来产生标准曲线，并拟合为二次曲线。相对于标准对照培养物确定每个变体培养物的BCE浓度。
酶活性比例：BBIt-AV∶BCE比例
根据微滴度板测定的结果，通过用相对的BBIt-AV胰蛋白酶抑制活性值除以相对的BCE活性值，来确定每个孔的BBIt-AV∶BCE活性比例。基于BBIt-AV∶BCE活性比例储存数据。选择具有最高的BBIt-AV∶BCE活性比例的经修饰的变体，并进行下述的次级筛选(secondary screening)。
分析酶活性比例BBIt-AV∶BCE--变体的次级筛选
在本实施例中，在次级筛选中一式四份的排列并测定经修饰的BBIt-AV，如初筛中确定的，当生长在存在或缺少还原剂(2-巯基乙醇)的条件下时，所述经修饰的BBIt-AV相对于对照未经修饰的BBIt-AV具有提高的BBIt-AV∶BCE活性。最初，仅测序这样的多核苷酸，所述多核苷酸编码在次级筛选中确定具有最大的BBIt-AV∶BCE比例的每一种经修饰的BBIt-AV。之后，测序所有的BBIt-AV克隆。
在微滴度板中一式四份的测试--次级筛选
对于每个平板，将22个含有选自初筛的经修饰的BBIt-AV的培养物样品和2个含有sBBI和未经修饰的BBIt-AV的对照培养物样品，在15ml培养管中，在5ml含5ppm氯霉素的Luria液体培养基中生长～10hr(37℃，250rpm)。然后，将150μl的24种培养物中的每一种一式四份的排列在96孔微滴度板上。然后，通过使用针式复制器，使用该排列好的平板接种一式两份的过滤平板(Millipore，MSGV2210)，所述过滤平板每个孔含有150μl含5μg/ml氯霉素的MBD培养基。培养放置的培养物(在存在或缺少2-β-巯基乙醇(βME)的条件下)，并如上所述确定和分析BBIt-AV∶BCE比例。
图10显示了在SEQ ID NO：187的29位上，所有可能的19种氨基酸取代对经修饰的变体BBIt的胰蛋白酶抑制活性的影响的实例。数据显示了BBI和BCE活性的比例，所述活性是从对在SEQ ID NO：187的29位上具有单个氨基酸取代的经修饰BBI-AV之BCE和胰蛋白酶活性一式四份的测量中确定。
实施例10
选择具有已知的氨基酸取代的改良的经修饰BBIt-AV
在本实施例中，构建位点饱和文库，产生在初筛中鉴别的位点上的整套氨基酸取代，所述位点导致BBIt-AV相比未经修饰的母本BBI-AV的胰蛋白酶抑制活性时，具有提高的胰蛋白酶抑制活性。此外，通过定点诱变，在之前尚未用所有可能的19个氨基酸取代的位点，产生整套氨基酸取代。产生共计39个位点饱和文库，并分析了一式四份的BBI胰蛋白酶抑制活性和BCE活性的活性测量，确定导致经修饰的BBIt-AV分子的单个取代，所述经修饰的BBIt-AV分子具有大于对照BBI分子(即，sBBI和未经修饰的BBIt-AV)活性的胰蛋白酶抑制活性。图9中显示了在未经修饰的BBIt-AV中取代的氨基酸的位置。
在位点18、38和61构建第二套位点饱和文库
首先，为了帮助文库构建，合成合成的基因，在2BBIck81编码区中，用SphI位点替换编码胰蛋白酶抑制环的区域和编码胰凝乳蛋白酶抑制环的区域之间的EcoRI位点(图3中显示了EcoRI位点的分布)。合成的基因序列是：5’-GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCTTGTTGCGATCAATGCGCTTGTACAAAATCAAACCCTCCACAATGTCGTTGTTCTGATATG CGTTTAAATAGCTGTCATTCTGCATGCAAATCATGTGCTTGCTATAACCTTTACGGTTGGACATGTTTCTGCGTCGACATCACTGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCTTCTGAATAAAAGCTT(SEQID NO：329)。将该合成的基因作为BamHI-HindIII片段克隆到p2JMagk103-lnk2-BBIt-AV 中，所获得的载体称为p2JMagk103-lnk2-BBIt-AVsph。
使用寡核苷酸盒，如下构建位于18、37和61位的位点饱和文库。
通过将寡核苷酸5’-
GTACAAAATCAN NSCCTCCACAATGTCGTTGTTCTGATATGCGTTTAAATAGCTGTCATTCTGCATG(SEQ I D NO：330)和5’-CAGAATGACAGCTATTTAAACGCATATCAGAACAACGACATTGTGGAGGSNNTGATTTT(SEQ ID NO：331)退火，并将获得的盒连接到p2JMagk103-lnk2-BBI-AVsph的BsrGI和SphI位点中，构建位点18的位点饱和文库。
通过将寡核苷酸5’-TCGACGCAGAAACATGTCCAACCGTAAAGGTTATAGCAAGCACATGASNNGCATG(SEQ ID NO：332)和5’-CNNSTCATGTGCTTGCTATAACCTTTACGGTTGGACATGTTTCTGCG(SEQ IDNO：333)退火，并将获得的盒连接到p2JMagk103-lnk2-BBI-AVsph的SalI和SphI位点中，构建位点37的位点饱和文库。
通过将寡核苷酸5’-TCGACATCACTGACTTCTGCTATGAANNSTGTAAACCTTCTGAATAAA(SEQ IDNO：334)与两条寡核苷酸：5’-TTCATAGCAGAAGTCAGTGATG(SEQ IDNO：335)和5’-AGCTTTTATTCAGAAGGTTTACA(SEQ ID NO：336)退火，并将所述盒连接到p2JMagk103-lnk2-BBI-AVsph的SalI和HindIII位点中，构建位点61的位点饱和文库。
将连接混合物用于转化E.coli TOP10细胞(Invitrogen)。选择96个转化子，通过DNA测序确定每个克隆中存在的氨基酸取代。然后，将分离自每种单个氨基酸取代的质粒用于转化枯草芽孢杆菌。
通过定点诱变产生氨基酸取代
通过使用合适的限制性位点，将寡核苷酸或寡核苷酸盒连接到p2JMagk103-lnk2-BBI-AVsph载体中，构建选定位点的氨基酸取代。所使用的取代、寡核苷酸序列和限制性位点显示在表2中。
表2
用于定点诱变的寡核苷酸
单个氨基酸取代的次级筛选：在微滴度板中一式四份的测试
对于每个选定的位点，对应单个氨基酸取代选择克隆。将这些克隆与作为对照的BBI-WT、BBIt-AV和BBIt-AV-F50T培养物一起，在15ml的Luria培养管中，37℃下生长在5ml含5ppm氯霉素的Luria液体培养基中(37℃，250rpm)～10hr。将每种培养物的150微升等分试样排列在96孔微滴度板的孔中，每个氨基酸取代和每个对照各4孔。然后，通过使用针式复制器，将生长在排列的平板中的每种培养物用于接种一式两份的过滤平板(Millipore，MSGV2210)，所述过滤平板的每个孔含有150μl含5μg/ml氯霉素的MBD培养基。在存在和缺少2-巯基乙醇的条件下生长平板中的培养物，并如上述进行分析。BBIt-AV-F50T是经修饰的BBIt-AV，经鉴别，在激活前，它具有与未经修饰的BBIt-AV母本相当的初始BBIt-AV∶BCE活性比，但在用还原剂(例如2-巯基乙醇)激活后，具有比未经修饰的BBIt-AV高3倍的BBIt-AV∶BCE活性比。
对于每个位点，确定每个孔的BBI∶BCE活性比，并计算一式四份测量的平均值。将单个氨基酸取代的活性比与未经修饰的母本BBIt-AV(SEQID NO：187)、野生型BBI(SEQ IDNO：13)和名为BBIt-AV-F50T的、经修饰的BBIt-AV所计算的比例相比较。
图11A和11B分别显示了对于50和37位的每一种取代，相对于sBBI的确定值，BBI∶BCE比例的一式四份确定值的均值，所述BBI∶BCE比例是在存在2-巯基乙醇(BME)的条件下确定的。
整体而言，数据显示在母本BBIt-AV分子的66个位置/位点中的16位所产生的单个氨基酸取代导致BBIt-AV变体具有与前体BBIt-AV相等或更大的胰蛋白酶抑制活性(数据概括在表3中)。在所有的单位点取代中，F50R导致最佳BBIt-AV∶BCE活性比，而在50位的若干取代生产的经修饰变体BBIt-AV具有比前体未经修饰的BBIt-AV高4倍的BBIt-AV∶BCE活性比，并且可与野生型抑制剂的活性比相比(图11A-B)。
上述数据显示，BBI-AV分子中的单个取代可以对BBI-AV的活性具有显著影响。
表3
导致经修饰的BBIt-AV分子具有比未经修饰的BBIt-AV更大的BBI∶BCE活性比的取代
实施例11
选择具有提高的纯化产量的经修饰的变体
在本实施例中，所述方法用于鉴别含有单个氨基酸取代的经修饰的BBIt-AV，所述经修饰的BBIt-AV保留了胰蛋白酶抑制活性，同时以高于相应的未经修饰的前体BBIt-AV的产量生产。
在摇瓶筛选中进一步测试选择的如下经修饰的BBI-AV，所述经修饰的BBI-AV具有在一式四份平板筛选中最高的BBIt-AV∶BCE活性比，所述摇瓶筛选设计为模拟在纯化期间用于从BCE：BBIt-AV融合蛋白中切割BBIt-AV的酸/热处理。因而，鉴别出可以高于未经修饰的前体BBIt-AV的产量来生产的经修饰的BBIt-AV，所述经修饰的BBIt-AV在酸/热处理后保留了大于未经修饰的BBI-AV的BBI∶BCE活性比。
在用还原剂(例如，2-巯基乙醇)激活后，较高的BBIt-AV∶BCE活性比表示给定的氨基酸取代显著地增加了具有至少正确折叠的胰蛋白酶抑制环的分子的级分。然而，具有相似的BBIt-AV∶BCE活性比的2个不同的氨基酸取代在纯化后具有稍微不同的产量。例如，V52L和M27A激活至相似的水平，但在酸/热处理后，M27A具有高约40％的产量。因而，通过第二种标准进一步评估在第一轮筛选中选为“良好的激活子”的变体，所述第二种标准发展为更好的预测纯化产量。
摇瓶筛选：测试纯化产量
为了增加表达，通过在含25μg/ml氯霉素的Luria琼脂平板上连续划线克隆，直到生长速率与不含氯霉素的Luria琼脂平板上的生长相似，扩增选定的克隆的基因拷贝。在15ml管中，将选定的变体和对照的培养物生长在3ml含25μg/ml氯霉素的Luria液体培养基中～10h。然后，将这些培养物(30μ)用于接种在250ml挡板瓶中的30ml MBD培养基中，并在37℃和225rpm下生长～60h。
为了选择具有最佳产量的变体，如下加工培养物液体培养基。首先，通过将20ml液体培养基与20ml的0.25M甘氨酸缓冲液(pH 9.3)混合，并用50％NaOH调节pH至9.0，激活液体培养基。然后，向稀释的培养物中添加2-巯基乙醇至终浓度为2mM，并且在室温下轻柔振荡过夜，孵育培养物。然后，通过酸/热处理，从融合蛋白上切出BBIt-AV部分，所述处理是通过先用硫酸调节激活的液体培养基的pH至pH 1.9-2.0，然后在60℃振荡孵育16小时来实现的。在pH2时，BBIt-AV-BCE融合蛋白和BCE催化结构域是不可溶的，而游离的BBI种类则是可溶的。在切割反应后，通过离心(3,000rpm下5min)去除不可溶的材料，如上所述分析上清液的胰蛋白酶抑制活性。还确定起始材料和激活后采集的样品的BBI活性。仍如上所述确定起始材料的BCE活性。然后在处理过程的每一步骤计算BBIt-AV∶BCE活性比。选择在酸/热处理后以最高产量生产的经修饰的BBIt-AV进行进一步研究。
发现在酸/热处理后，在位点13、25、27、29、31、40、50和52的氨基酸取代显著提高了BBIt-AV产量。在酸/热处理后，具有提高的产量的其他取代是D1C(当不激活时)、S4V、S5P、Q11G、S38N和S65E。在酸/热处理后，通过没有预期到的引物(在用于制造位点4的位点饱和文库的QuikChange反应期间)复制而生产的另一变体也具有较高的BBIt-AV∶BCE活性比。在该变体中，在接头和BBIt-AV(SEQ ID NO：187)的N端之间插入氨基酸序列DDEPSKPCCDPDP(SEQ ID NO：389)(称为4D13插入)，产生与SEQ ID NO：391中的接头融合的经修饰的BBIt-AV。
DNNDP/PDPddepskpccdpdpDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCACYNLYGWTCFCVDITDFCYEPCKPSE(SEQ ID NO：391)。
接头显示为斜体字，插入物以小写字母书写，而与SEQ ID NO：187对应的BBIt-AV以大写字母书写。4D13经修饰的BBIt-AV的序列是：
DDEPSKPCCDPDPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCACYNLYGWTCFCVDITDFCYEPCKPSE(SEQ ID NO：390)。
编码SEQ ID NO：390的4D13-BBIt-AV的合成基因是：
GGATCCAGATGACGAACCGAGCAAACCTTGCTGTGATCCAGACCCTGACGATGAGAGCTCTAAACCCTGTTGCGATCAATGCATTTGTACGAAATCAAATCCTCCACAGTGTCGGTGTTCCGATATGCGTCCGAATTCCTGTCATAGTGCCTGCAAAAGCTGCAAGTGTTATAACCTGTACGGGTGGACCTGTACATGCGCCGACATCACGGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCAAGCGAGTAAAAGCTT(SEQ ID NO：394)。
实施例12
突变的组合
在本实施例中，组合单个氨基酸取代，产生具有比携带单个氨基酸取代的经修饰的BBIt-AV更高的BBIt-AV∶BCE活性比和/或产量的经修饰的BBIt-AV，所述单个氨基酸取代是导致BBIt-AV在平板筛选或摇瓶筛选中具有提高的BBI∶BCE活性比的取代。
在上文的实施例9和10描述的初级和次级筛选后，鉴别出分别含有单个氨基酸取代A13I、F50T和V52A的3种经修饰的BBIt-AV，其相对于各自的对照具有提高的BBI∶BCE活性比。构建文库，选择上述三种取代的最佳组合。在反应混合物中，使用等摩尔浓度的下列引物，通过上述诱变规程制备文库：在反应混合物中，引物5’-CTGTTGCGATCAATGCATTTGTACGAAATC(SEQ ID NO：395)用于产生A13I取代；引物5’-CTGTACGGGTGGACCTGTACATGCGYCGACATCACGGACTTC(SEQ ID NO：396)用于产生F50T和F50T-V52A取代；引物5’-GACCTGTTTTTGCGYCGACATCACGGAC (SEQ ID NO：397)用于产生V52A取代。选择克隆并在微滴度板中筛选，并且筛选如上所述。
获得了含有F50T和V52A取代的经修饰的双重变体BBIt-AV(BBIt-AV-F50T-V52A； SEQ ID NO：595)，经确定其具有SEQ IDNO：398的多核苷酸序列。
BBIt-AV-F50T-V52A
GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCCTGTTGCGATCAATGCGCATGTACGAAATCAAATCCTCCACAGTGTCGGTGTTCCGATATGCGTCTGAATTCCTGTCATAGTGCCTGCAAAAGCTGCGCATGTTATAACCTGTACGGGTGGACCTGTACATGCGCCGACATCACGGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCAAGCGAGTAAAAGCTT(SEQ ID NO：398)
DPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCACYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE(SEQ ID NO：595)。
产生含有3、4和5个氨基酸取代的经修饰的BBIt-AV
在BBIt-AV-F50T-V52A双重变体中，制备四个有效取代A13I、S25L、L29P和A40K的组合，在如上文实施例9和10所述的筛选中鉴别。通过使用合成的基因并克隆到p2JMagk103lnk2BBIt-AV载体的BamHI和HindIII位点中组合上述取代。下文给出编码经修饰的BBIt-AV的相应氨基酸序列的多核苷酸序列，所述经修饰的BBIt-AV包含取代的组合。
BBIt-AV-A13I-S25L-F50T-V52A
GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCCTGTTGCGATCAATGCATTTGTACGAAATCAAATCCTCCACAGTGTCGGTGTCTTGATATGCGTCTGAATTCCTGTCATAGTGCCTGCAAAAGCTGCGCATGTTATAACCTGTACGGGTGGACCTGTACATGCGCCGACATCACGGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCAAGCGAGTAAAAGCTT(SEQ ID NO：399)
DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCLDMRLNSCHSACKSCACYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE(SEQ ID NO：596)
BBIt-AV-A13I-S25L-L29P-F50T-V52A
GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCCTGTTGCGATCAATGCATTTGTACGAAATCAAATCCTCCACAGTGTCGGTGTCTTGATATGCGTCCGAATTCCTGTCATAGTGCCTGCAAAAGCTGCGCATGTTATAACCTGTACGGGTGGACCTGTACATGCGCCGACATCACGGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCAAGCGAGTAAAAGCTT(SEQ ID NO：400)
DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCLDMRPNSCHSACKSCACYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE(SEQ ID NO：597)。
BBIt-AV-A13I-S25L-L29P-A40K-F50T-V52A
GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCCTGTTGCGATCAATGCATTTGTACGAAATCAAATCCTCCACAGTGTCGGTGTCTTGATATGCGTCCGAATTCCTGTCATAGTGCCTGCAAAAGCTGCAAGTGTTATAACCTGTACGGGTGGACCTGTACATGCGCCGACATCACGGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCAAGCGAGTAAAAGCTT(SEQ ID NO：401)
DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCLDMRPNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE(SEQ ID NO：598)
BBIt-AV-A13I-S25L-A40K-F50T-V52A
GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCCTGTTGCGATCAATGCATTTGTACGAAATCAAATCCTCCACAGTGTCGGTGTCTTGATATGCGTCTGAATTCCTGTCATAGTGCCTGCAAAAGCTGCAAGTGTTATAACCTGTACGGGTGGACCTGTACATGCGCCGACATCACGGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCAAGCGAGTAAAAGCTT(SEQ ID NO：402)
DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCLDMRLNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE(SEQ ID NO：599)
BBIt-AV-A13I-L29P-F50T-V52A
GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCCTGTTGCGATCAATGCATTTGTACGAAATCAAATCCTCCACAGTGTCGGTGTTCCGATATGCGTCCGAATTCCTGTCATAGTGCCTGCAAAAGCTGCGCATGTTATAACCTGTACGGGTGGACCTGTACATGCGCCGACATCACGGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCAAGCGAGTAAAAGCTT(SEQ ID NO：403)
DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACASCACYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE(SEQ ID NO：600)
BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A (TA5)
GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCCTGTTGCGATCAATGCATTTGTACGAAATCAAATCCTCCACAGTGTCGGTGTTCCGATATGCGTCCGAATTCCTGTCATAGTGCCTGCAAAAGCTGCAAGTGTTATAACCTGTACGGGTGGACCTGTACATGCGCCGACATCACGGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCAAGCGAGTAAAAGCTT(SEQ ID NO：404)
DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE(SEQ ID NO：601)
BBIt-AV-A13I-A40K-F50T-V52A
GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCCTGTTGCGATCAATGCATTTGTACGAAATCAAATCCTCCACAGTGTCGGTGTTCCGATATGCGTCTGAATTCCTGTCATAGTGCCTGCAAAAGCTGCAAGTGTTATAACCTGTACGGGTGGACCTGTACATGCGCCGACATCACGGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCAAGCGAGTAAAAGCTT(SEQ ID NO：405)
DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE(SEQ ID NO：602)
BBIt-AV-S25L-F50T-V52A
GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCCTGTTGCGATCAATGCGCATGTACGAAATCAAATCCTCCACAGTGTCGGTGTCTTGATATGCGTCTGAATTCCTGTCATAGTGCCTGCAAAAGCTGCGCATGTTATAACCTGTACGGGTGGACCTGTACATGCGCCGACATCACGGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCAAGCGAGTAAAAGCTT(SEQ ID NO：406)
DPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCLDMRLNSCHSACKSCACYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE(SEQ ID NO：603)
BBIt-AV-S25L-L29P-F50T-V52A
GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCCTGTTGCGATCAATGCGCATGTACGAAATCAAATCCTCCACAGTGTCGGTGTCTTGATATGCGTCCGAATTCCTGTCATAGTGCCTGCAAAAGCTGCGCATGTTATAACCTGTACGGGTGGACCTGTACATGCGCCGACATCACGGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCAAGCGAGTAAAAGCTT(SEQ ID NO：407)
DPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCLDMRPNSCHSACKSCACYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE(SEQ ID NO：604)
BBIt-AV-S25L-L29P-A40K-F50T-V52A
GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCCTGTTGCGATCAATGCGCATGTACGAAATCAAATCCTCCACAGTGTCGGTGTCTTGATATGCGTCCGAATTCCTGTCATAGTGCCTGCAAAAGCTGCAAGTGTTATAACCTGTACGGGTGGACCTGTACATGCGCCGACATCACGGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCAAGCGAGTAAAAGCTT(SEQ ID NO：408)
DPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCLDMRPNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE(SEQ ID NO：605)
BBIt-AV-S25L-A40K-F50T-V52A
GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCCTGTTGCGATCAATGCGCATGTACGAAATCAAATCCTCCACAGTGTCGGTGTCTTGATATGCGTCTGAATTCCTGTCATAGTGCCTGCAAAAGCTGCAAGTGTTATAACCTGTACGGGTGGACCTGTACATGCGCCGACATCACGGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCAAGCGAGTAAAAGCTT(SEQ ID NO：409)
DPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCLDMRLNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE(SEQ ID NO：606)
BBIt-AV-L29P-F50T-V52A
GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCCTGTTGCGATCAATGCGCATGTACGAAATCAAATCCTCCACAGTGTCGGTGTTCCGATATGCGTCCGAATTCCTGTCATAGTGCCTGCAAAAGCTGCGCATGTTATAACCTGTACGGGTGGACCTGTACATGCGCCGACATCACGGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCAAGCGAGTAAAAGCTT(SEQ ID NO：410)
DPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCACYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE(SEQ ID NO：607)
BBIt-AV-L29P-A40K-F50T-V52A
GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCCTGTTGCGATCAATGCGCATGTACGAAATCAAATCCTCCACAGTGTCGGTGTTCCGATATGCGTCCGAATTCCTGTCATAGTGCCTGCAAAAGCTGCAAGTGTTATAACCTGTACGGGTGGACCTGTACATGCGCCGACATCACGGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCAAGCGAGTAAAAGCTT(SEQ ID NO：411)
DPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE(SEQ ID NO：608)
BBIt-AV-A40K-F50T-V52A
GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCCTGTTGCGATCAATGCGCATGTACGAAATCAAATCCTCCACAGTGTCGGTGTTCCGATATGCGTCTGAATTCCTGTCATAGTGCCTGCAAAAGCTGCAAGTGTTATAACCTGTACGGGTGGACCTGTACATGCGCCGACATCACGGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCAAGCGAGTAAAAGCTT(SEQ ID NO：412)
DPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE(SEQ ID NO：609)
产生含有6和7个氨基酸取代的经修饰的BBIt-AV
产生其他包含以下突变的经修饰BBIt-AV，所述突变包括4D13插入、单个氨基酸取代D1C、S4V、S5P、Q11G、I13L、S25R、M27R、P29K、S31A、S31R、S38N、T50K、A52T、S65E，和双氨基酸取代(包括S25R-S31R和S25R-S31)，以及由SEQ ID NO：404的多核苷酸编码的五重变体(BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A)中存在的取代。
使用以下寡核苷酸，用在末端具有BamHI和SacI限制性位点的寡核苷酸盒将4D13肽插入到基于p2JM103的载体中，所述载体经构建用于表达BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A(SEQ ID NO：404)：
5’-
GATCCAGATGACGAACCGAGCAAACCTTGCTGTGATCCAGACCCTGACGATGAGAGCT(SEQ ID NO：392)和
5’-CTCATCGTCAGGGTCTGGATCACAGCAAGGTTTGCTCGGTTCGTCATCTG(SEQ ID NO：393)。
BBIt-AV-4D13插入-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A的氨基酸序列：
DPDDEPSKPCCDPDPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE(SEQ I D NO：413)
通过将合成基因克隆到p2JM103-lnk2的BamHI和HindIII位点中，制备其他变体。表4中给出了每种合成基因的多核苷酸序列，与所获得的经修饰变体BBIt-AV的经修饰的氨基酸序列。
表4
包含基于BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A变体(SEQ ID NO：601)的取代/修饰的BBIt-AV
如上所述确定经修饰的变体BBIt-AV的BBI∶BCE比例，并计算每一种经修饰的变体BBIt-AV 的产量。经修饰的BBIt-AVS BBIt-AV-A13I-S25R-L29P-S31R-A40K-F50T-V52A(SEQ ID NO：618)，BBIt-AV-A13I-S25R-L29P-S31A-A40K-F50T-V52A(SEQ IDNO：617)，BBIt-AV-A13I-S25R-L29P-A40K-F50T-V52A(SEQ ID NO：616)，BBIt-AV-A13I-L29P-S31R-A40K-F50T-V52A(SEQ ID NO：622)在酸/热处理后，具有比五重变体BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A(SEQ ID NO：601)显著更高的产量，而BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50K-V52A(SEQ ID NO：624)，BBIt-AV-A13L-L29P-A40K-F50T-V52A(SEQ ID NO：615)和BBIt-AV-4D13插入-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A(SEQ ID NO：413)具有比BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A(SEQ ID NO：601)略微较高的产量。经修饰的BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A-S65E(SEQ IDNO：626)和BBIt-AV-A13I-L29P-S38N-A40K-F50T-V52A(SEQ IDNO：623)具有与BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52(SEQ ID NO：624)相似的产量，BBIt-AV-A13I-M27R-L29P-A40K-F50T-V52A(SEQ IDNO：619)、BBIt-AV-A13I-L29P-S31A-A40K-F50T-V52A(SEQ ID NO：621)和BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52T(SEQ ID NO：625)略低，而BBIt-AV-S4V-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A(SEQ ID NO：612)、BBIt-AV-Q11G-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A(SEQ ID NO：614)、BBIt-AV-A13I-L29K-A40K-F50T-V52A(SEQ ID NO：620)和BBIt-AV-S5P-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A(SEQ ID NO：611)在酸-热处理后，都具有比BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A(SEQ ID NO：601)显著低的产量。在缺少激活的条件下，BBIt-AV-D1C-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A(SEQ ID NO：611)的产量也比BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A(SEQ ID NO：601)的产量低得多。然而，当未激活时，BBIt-AV-D1C-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A(SEQID NO：611)的酸/热处理后的产量比激活的BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A(SEQ ID NO：601)高约2倍，但与未激活时的BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A(SEQ ID NO：601)的产量相似。因而，没有发现可以在不激活的条件下产生高产量的取代。
产生含有8个氨基酸取代的经修饰的BBI-AV：八重变体
在测试基于五重的经修饰BBI-AV之后，产生其他的含有八个氨基酸取代的经修饰的变体BBI(八重变体)。如上所述确定八重变体的活性和纯化产量。如上所述，使用表5所示的合成基因实现八重经修饰的BBIt-AV的构建。
表5
八重修饰的变体BBIt-AVs
基本如上所述，在纯化过程中测试在摇瓶筛选中选择的最佳八重变体，包括下列改变：1)在生长后，将培养物2倍稀释于甘氨酸缓冲液(125mM终浓度，且pH调至9.0)而非CHES缓冲液中；2)只用2mM的2-巯基乙醇(不添加亚硫酸钠)激活样品；3)将酸沉淀的融合蛋白重悬在100ml的125mM甘氨酸(而不是350ml的40mM甘氨酸)中；和4)将酸/热处理后收集的沉淀用10ml水洗涤，过滤，将该“洗涤的沉淀”滤液与起始滤液组合。浓缩最终的滤液，如上所述用GIu-BL修整。
结果显示，八重变体BBIt-AV分子QQ8(SEQ ID NO：628)和KT8(SEQ ID NO：627)获得的纯化产量高于五重经修饰变体BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A变体(SEQ ID NO：601)的产量。经修饰的八重变体BBIt-AV-A13I-S25K-M27A-L29R-S31A-A40H-F50R-V52L(RL8；SEQ ID NO：630)，BBIt-AV-A13I-S25K-M27A-L29R-S31E-A40K-F50Q-V52Q(QQ8；SEQID NO：628)和BBIt-AV-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-A40H-F50K-V52T(KT8；SEQ ID NO：627)获得的产量优于野生型sBBI分子/蛋白质的产量(图13)。
实施例13
携带FGF5或TGFβ1结合肽的BBI支架的改善生产
在本实施例中，测试了相同的氨基酸取代(导致具有改善的胰蛋白酶抑制活性和/或纯化产量的经修饰的变体BBIt-AV，见实施例7-13)对变体BBI支架的胰蛋白酶抑制活性的改善和/或对纯化产量的改善，所述变体BBI支架中的胰凝乳蛋白酶环被FGF-5或TGFβ1结合肽替换。
产生变体和经修饰的变体BBI-FGF-5蛋白：
通过将合成基因连接到载体p2JMagk103-lnk2-BBIt-AV的BamHI和HindIII位点中，构建经修饰的变体BBI-FGF-5蛋白酶抑制剂，所述抑制剂包含取代A13I-L29P-F50T-V52A与替换胰凝乳蛋白酶环的FGF-5结合肽MM007：RTQPYPL(SEQ ID NO：670)或FGF-5结合肽FGFps2：TWIDSTP(SEQ ID NO：671)的组合(都在40位具有丙氨酸)。分别编码所获得的经修饰的变体MM007-Q-BBIt-FGF-5(SEQ ID NO：432；SEQID NO：433)和经修饰的变体FGFps2-Q-BBIt-FGF-5(SEQ ID NO：434SEQ ID NO：435)的合成基因的氨基酸序列和DNA序列如下：
MM007-Q-BBIt-FGF-5合成基因
GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCTTGTTGCGATCAATGCATTTGTACTAAATCAAATCCTCCACAATGTCGTTGTTCTGATATGCGTCCTAATAGCTGTCATTCTGCATGCAAATCATGTGCTTGCCGTACTCAACCATACCCTCTTTGTACATGCGCAGACATCACTGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCATCTGAATAAAAGCTT (SEQID NO：433)
MM007-Q-BBIt-FGF-5蛋白
DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCACRTQPYPLCTCADITDFCYEPCKPSE(SEQ ID NO：432)
FGFps2-Q-BBIt-FGF-5
GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCTTGTTGCGATCAATGCATTTGTACTAAATCAAATCCTCCACAATGTCGTTGTTCTGATATGCGTCCTAATAGCTGTCATTCTGCATGCAAATCATGTGCTTGCACTTGGATTGATTCAACACCATGTACATGCGCAGACATCACTGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCATCTGAATAAAAGCTT (SEQID NO：435)
DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCACTWIDSTPCTCADITD FCYEPCKPSE(SEQ ID NO：434)
产生变体和经修饰的变体BBI-TGFβ蛋白：
根据实施例2所述方法如下，用TGFβ1结合肽PEN3：CLCPENINVLPCN (SEQ ID NO：436)、TGFβ1结合肽MM021W：CICKHNVDWLCF(SEQ ID NO：437)或TGFβ1结合肽WTQ：CICWTQHIHNCF(SEQ ID NO：438)替代SEQ ID NO：187的BBIt-AV的胰凝乳蛋白酶抑制环，产生变体BBPI。
寡核苷酸对用于制备盒，以用TGFβ1结合肽PEN3、MM021W或WTQ替换由p2JM103-lnk2-2BBI-FGFhl表达载体编码的胰凝乳蛋白酶反应位点环中的FGFhI结合肽。使用实施例2所述的引物(SEQ ID NO：91和SEQ ID NO：92)和方法，构建p2JM103-lnk2-2BBI-FGFhl。将TGFβ结合盒连接到载体p2JM103lnk2-2BBI-FGFhl的SphI和SalI限制性位点中，分别构建变体BBI分子PEN3-BBIt-TGFβ1、MM021W-BBIt-TGFβ和WTQ-BBIt-TGFβ1。下文显示了用于制备盒的寡核苷酸的DNA序列。
PEN3(第二环)
CAAAAGCTGTCTTTGTCCTGAAAATATTAACGTTCTTCCTTGTAACTGCG (SEQID NO：439)
和
TCGACGCAGTTACAAGGAAGAACGTTAATATTTTCAGGACAAAGACAGCTTTTGCATG(SEQ I DNO：440)
MM021W(第二环)
CAAATCATGCATTTGTAAACACAACGTAGATTGGTTATGTTTTTGCG (SEQ IDNO：129)
和
TCGACGCAAAAACATAACCAATCTACGTTGTGTTTACAAATGCATGATTTGCATG(SEQ ID NO：130)
WTQ (第二环)
CAAATCATGCATTTGTTGGACACAACATATCCACAACTGTTTTTGCG (SEQ IDNO：441)
和
TCGACGCAAAAACAGTTGTGGATATGTTGTGTCCAACAAATGCATGATTTGCATG(SEQ ID NO：442)
此外，通过将合成基因连接到载体p2JMagk103-lnk2-BBIt-AV的BamHI和HindIII位点中，构建经修饰的变体BBPI-TGFβ1变体，所述变体包含取代A13I-L29P-V52A(都还在40位具有丙氨酸，在50位具有苏氨酸)和替换胰凝乳蛋白酶环的TGFβ1结合肽PEN3-Q：CPENINVLPC(SEQ ID NO：672)、MM021W-Q：CKHNVDWLC(SEQ ID NO：673)或WTQ-Q：CWTQHIHNC(SEQ ID NO：674)的组合。编码所获得的经修饰的变体PEN3-Q-BBIt-TGFβ1(SEQ ID NO：443；SEQ ID NO：444)、经修饰的变体MM021W-BBI-TGF β1(SEQ ID NO：445；SEQ ID NO：446)和经修饰的变体WTQ-BBI-TGFβ1(SEQ ID NO：447；SEQ ID NO：448)的合成基因的氨基酸序列和DNA序列如下。
PEN3-Q-BBIt-TGFβ1(SEQ ID NO：443)
DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCACPENINVLPCTCADITDFCYEPCKPSE
PEN3-Q-BBIt-TGF1(SEQ ID NO：444)
GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCTTGTTGCGATCAATGCATTTGTACTAAATCAAATCCTCCACAATGTCGTTGTTCTGATATGCGTCCTAATAGCTGTCATTCTGCATGCAAATCATGTGCTTGCCCAGAAAACATCAACGTTCTTCCTTGTACATGCGCAGACATCACTGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCATCTGAATAAAAGCTT
MM021W-Q-BBIt-TGFβ1(SEQ ID NO：445)
DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCACKHNVDWLCTCADITDFCYE PCKPSE
MM021W-Q-BBIt-TGFβ1(SEQ ID NO：446)
GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCTTGTTGCGATCAATGCATTTGTACTAAATCAAATCCTCCACAATGTCGTTGTTCTGATATGCGTCCTAATAGCTGTCATTCTGCATGCAAATCATGTGCTTGCAAACATAACGTTGATTGGCTTTGTACATGCGCAGACATCACTGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCATCTGAATAAAAGCTT
WTQ-Q-BBIt-TGFβ1(SEQ ID NO：447)
DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCACKHNVDWLCTCADITDFCYE PCKPSE
WTQ-Q-BBIt-TGF1(SEQ ID NO：448)
GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCTTGTTGCGATCAATGCATTTGTACTAAATCAAATCCTCCACAATGTCGTTGTTCTGATATGCGTCCTAATAGCTGTCATTCTGCATGCAAATCATGTGCTTGCTGGACACAACATATCCACAACTGTACATGCGCAGACATCACTGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCATCTGAATAAAAGCTT
使用10种载体转化枯草芽孢杆菌BG6006宿主细胞，所述载体包含变体和含有FGF-5或TGFβ结合肽的经修饰变体BBI。如上所述，生长转化子，并测试通过宿主细胞生产的改造的BBI的胰蛋白酶抑制活性和产量。
图14显示了下述蛋白质的的胰蛋白酶抑制活性：未经修饰的变体母本MM007-PT-BBIt-FGF-5(SEQ ID NO：678)：
(DDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCAC RTQPYPLCFCVDITDFCYEPCKPSE；SEQ ID NO：678)，
未经修饰的变体母本FGFps2-PT-BBIt-FGF5(SEQ ID NO：679)：
(DDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCAC TWIDSTPCFCVDITDFCYEPCKPSE；SEQ ID NO：679)，
未经修饰的变体母本PEN3-PT-BBIt-TGFβI(SEQ I D NO：680)：(DDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCACPENINVLPCFCVDITDFCYEPCKPSE；SEQ ID NO：680)，
未经修饰的变体母本WTQ-PT-TGFβI(SEQ ID NO：681)：(DDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCAC WTQHIHNCFCFCVDITDFCYEPCKPSE；SEQ ID NO：681)，
和未经修饰的变体母本MM0021W-PT-TGFβI(SEQ ID NO：682)：(DDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCAC KHNVDWLCFCVDITDFCYEPCKPSE；SEQ IDNO：682)，(在图14中命名为PT)和相应的经修饰的变体MM007-Q-BBIt-FGF-5(SEQ ID NO：432)，经修饰的变体FGFps2-Q-BBIt-FGF5(SEQ ID NO：434)，经修饰的变体PEN3-Q-BBIt-TGFβ1(SEQ ID NO：443)，经修饰的变体WTQ-Q-BBIt-TGFβ1(SEQ IDNO：445)，和经修饰的变体MM0021W-Q-BBIt-TGFβ1(SEQ ID NO：447)蛋白的胰蛋白酶抑制活性(在图14中命名为Q)，所述抑制活性是在生长后、在用2-巯基乙醇激活后，和酸/热处理后测量的。数据显示，当氨基酸13I-29P-40A-50T-52A的组合存在于携带FGF-5或TGFβ1结合肽的BBI支架中时，相比携带结合肽的相应母本BBI支架，提高了在生长和激活后的胰蛋白酶抑制活性，以及在酸/热处理后的产量。
数据还证实，表现出提高经修饰的变体BBI(其中VEGF结合肽替代了胰凝乳蛋白酶环)的胰蛋白酶抑制活性和/或产量的取代不是BBI-AV特异性的，因为在胰凝乳蛋白酶环被其他结合肽(例如，FGF-5结合肽和TGFβ1结合肽)替换的BBI中，相同的取代也提高了BBI的胰蛋白酶抑制活性和/或产量。
因此，预计在BBI支架中制备的氨基酸取代一般可应用于携带其他结合肽的BBI支架，所述取代增加了BBIt-AV的产量和/或胰蛋白酶活性。
实施例14
Bowman Birk抑制剂支架的性能
在本实施例中，通过取代BBIt-AV支架中在Bowman Birk抑制剂序列之间不保守的氨基酸，测试了预测氨基酸取代对变体Bowman Birk抑制剂(例如，BBIt-AV，SEQ ID NO：187)的胰蛋白酶活性和/或产量的影响的能力，所述抑制剂序列来自二花扁豆(BBdb，Acc.No.AAK97765；SEQID NO：449)：
PSESSKPCCDQCACTKSIPPQCRCTDVRLNSCHSACSSCVCTFSIPAQCVCVDMKDFCYEPCK(SEQID NO：449)，
大豆(大豆)蛋白酶抑制剂IV或D-II(BBsb3，Acc.No.P01064；SEQ IDNO：450)：
DDEYSKPCCDLCMCTRSMPPQCSCEDIRLNSCHSDCKSCMCTRSQPGQCRCLDTNDFCYKPCKSRDD(SEQ ID NO：450)，
和巴西良木豆(BBtc，Acc.No.P83283；SEQ ID NO：451)SSKWEACCDRCACTKSIPPQCHCADIRLNSCHSACESCACTHSIPAQCRCFDITDFCYKPCSG(SEQ ID NO：451)。
通过用VEGF结合肽CK37281(ACYNLYGWTC；SEQ ID NO：9)替换来自二花扁豆(BBdb，Acc.No.AAK97765；SEQ ID NO：449)的Bowman Birk抑制剂的第二蛋白酶抑制环、来自大豆(大豆)蛋白酶抑制剂IV或D-II(BBsb3，Acc.No.P01064；SEQ ID NO：450)的Bowman Birk抑制剂的第二蛋白酶抑制环，和来自巴西良木豆(BBtc，Acc.No.P83283；SEQ ID NO：451)的Bowman Birk抑制剂的第二蛋白酶抑制环，产生变体Bowman Birk抑制剂，以产生相应的变体BBdb-AV(SEQ ID NO：452)、BBsb3-AV(SEQ ID NO：453)和BBtc-AV(SEQ ID NO：454)。
如图15所示，比对序列，鉴别了在与SEQ ID NO：187的BBPI(BBIt-AV)的11、13、18、23、25、27、35、37、52、54和55位等价的位置上的氨基酸在四种抑制剂之间是不保守的，选定用于修饰BBIt-AV支架。
将编码BBdb-AV(SEQ ID NO：455)和BBsb3-AV(SEQ ID NO：456)的合成基因，作为BamHi-HindIII片段，连接到p2JMagk103-lnk2-BBIt-AV中。为了克隆BBtc-AV基因，首先用BfrI消化所述基因，用T4DNA聚合酶和dNTP补平悬臂，纯化DNA，然后用BamHI消化。将该片段连接到已用HindIII消化的p2JMagk103-lnk2-BBIt-AV载体中，用T4DNA聚合酶和dNTP补平悬臂，纯化DNA，然后用BamHI消化。变体PI的DNA序列和相应的氨基酸序列如下。
BBdb-AV
GGATCCTTCTGAGAGCTCTAAACCATGCTGTGATCAATGCGCTTGTACAAAATCTATCCCTCCACAATGCCGTTGCACTGATGTTCGTCTTAACTCATGTCACTCTGCATGCAGCTCATGCGCTTGTTACAACCTTTACGGTTGGACATGCGTTTGCGTCGACATGAAAGATTTCTGCTACGAACCTTGTAAATAAAAGCTT(SEQ ID NO：455)
BBdb-AV(SEQ ID NO：452)
DPSESSKPCCDQCACTKSIPPQCRCTDVRLNSCHSACSSCACYNLYGWTCVCVDMKDFCYEPCK
BBsb3-AV
GGATCCAGATGACGAATACTCTAAACCTTGCTGTGATCTTTGCATGTGTACACGTTCTATGCCACCTCAATGCTCATGTGAAGACATCCGCCTTAACTCTTGCCACTCAGATTGCAAAAGCTGCGCTTGTTACAACCTTTACGGTTGGACATGCCGTTGTTTAGATACTAAC GATTTCTG CTACAAAC CTTG CAAATCTCGTGATGATTAAAAGCTT(SEQ IDNO：456)
BBsb3-AV AA(SEQ ID NO：453)
DPDDEYSKPCCDLCMCTRSMPPQCSCEDIRLNSCHSDCKSCACYNLYGWTCRCLDTNDFCYKPCKSRDD
BBtc-AV
GGATCCTTCTTCAAAATGGGAAGCTTGCTGTGATCGTTGCGCATGCACAAAATCTATCCCTCCACAATGCCACTGCGCTGATATCCGTCTTAACTCATGCCATTCTGCATGCGAAAGCTGCGCTTGTTACAACCTTTACGGTTGGACATGCCGTTGCTTCGATATCACTGATTTCTGTTACAAACCTTGCTCTGGCTAAAAGCTTAAAAGGAGACCGTTAATCTAAAATCATTATTTGAGGCCCGAGCTTAAAGCTTAAG(SEQ ID NO：457)
BBtc-AV AA(SEQ I D NO：454)
DPSSKWEACCDRCACTKSIPPQCHCADIRLNSCHSACESCACYNLYGWTCRCFDITDFCYKPCSG
包含变体抑制剂序列的3种表达载体用于转化枯草芽孢杆菌宿主细胞BG6006。
典型的，在N端和C端末端的取代对胰蛋白酶抑制活性和/或纯化产量具有小的影响，所述取代是在第一二硫键(C8-C62)外侧的。因而，仅研究了在C8和C62之间位置上的氨基酸取代。该研究靶向的取代显示在图15中(粗体和下划线)。
如实施例8和10所述，构建BBIt-AV(SEQ ID NO：187)的11、13、18、23、25、27、35、37、50、52、54、55和60位上的单个氨基酸取代。如实施例9和10所述，通过在微滴定板(有或无还原剂)中筛选，分析上述取代。下表6中概括了结果。
表6
存在于BBtc-AV，BBdb-AV和BBsb3-AV支架中的单个氨基酸取代对经修饰的变体BBIt-AV的胰蛋白酶活性的影响
＊wt表示在该位置上的氨基酸与BBIt-AV支架(SEQ ID NO：187)中的相同。
＊＊(+/-)表示在存在还原剂的条件下，相对BBI∶BCE活性比与BBIt-AV的活性比无显著差异。
＊＊＊(+)表示在存在还原剂的条件下，相对BBI∶BCE活性比大于BBIt-AV的活性比；“+”的数目越多，差异越大。
＊＊＊＊(-)表示在存在还原剂的条件下，相对BBI∶BCE活性比小于BBIt-AV的活性比；“-”的数目越多，差异越大。
假设氨基酸取代的影响是累积的，表6提供的数据预测变体BBItc-AV的性能将显著优于BBIt-AV，而BBIsb3-AV的表现应该显著差于BBIt-AV。此外，可以预测，在用还原剂激活的情况下，就活性而言，BBIdb-AV的性能略优于BBIt-AV。
为了测试上述预测，使用实施例11描述的摇瓶筛选测试BBIdb-AV、BBIsb3-AV和BBItc-AV的胰蛋白酶活性和产量，并将其活性与未经修饰的变体BBIt-AV相比较。
如预测的，图16中显示的数据显示出BBItc-AV在激活后具有最高的胰蛋白酶抑制活性，而BBIdb-AV抑制活性也高于BBIt-AV抑制剂的活性，但低于BBItc-AV抑制剂的活性。此外，如预测的，BBIsb3-AV具有非常低的胰蛋白酶抑制活性，并且用还原剂不能激活(抑制活性太低以至于不能在图16中显示出来)。此外，BBItc-AV和BBIdb-AV不仅在激活后具有比BBIt-AV更高的抑制活性，而且它们在酸/热处理后也具有更高的抑制活性，提示提高的产量。
因此，结果表示，当测试BBIt-AV中的单个氨基酸取代时，所获得的活性数据可用于预测其他Bowman Birk抑制剂当用作支架时的性能，所述支架具有替代了第二蛋白酶抑制环的结合肽。
实施例15
经修饰的变体BBI与靶蛋白的结合
在本实施例中，测试了当变体肽移植到经修饰的Bowman Birk抑制剂支架上替代胰凝乳蛋白酶环时，所述变体肽保留它们结合相应的靶蛋白的能力。
在上文的实施例1中描述了用于BBI的表达载体的构建，以及实施例13中描述了用于含有VEGF-结合肽CK37281(SEQ ID NO：9)、FGF-5-结合肽MM007(SEQ ID NO：430)或FGF-5结合肽FGF5ps2(SEQ IDNO：431)替代了胰凝乳蛋白酶抑制序列的变体BBI的载体的构建。实施例12中描述了用于构建表达载体的方法，所述表达载体编码具有各种氨基酸取代的组合的经修饰的变体BBIt-AV，而实施例13中描述了用于构建FGF5和TGFβ-结合BBI的方法。
通过将寡核苷酸盒连接到p2JM103-lnk2-2BBIck81的SphI和SalI中，将称为VegK(KYYLYWW；SEQ ID NO：458)、VegT(TLWKSYW；SEQ ID NO：459)和VegKD(KYDLYWW；SEQ ID NO：460)的VEGF结合肽导入胰凝乳蛋白酶抑制环中。用于产生经修饰的变体VEGK和VEGT BBPI的寡核苷酸的序列如下所示。
VegK：
CAAATCTTGCGCATGTAAATATTACCTTTACTGGTGGTGTTTTTGCG(SEQ IDNO：461)
和
TCGACGCAAAAACACCACCAGTAAAGGTAATATTTACATGCGCAAGATTTGCATG(SEQ ID NO：462)
BBIT-VEGK
DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDARPNACHSACKSCACKYYLYWWCKCTDITDFCYEPCKPSE(SEQ ID NO：640)
VegT：
CAAATCTTGCGCGTGCACACTTTGGAAATCTTACTGGTGTTTTTGCG (S EQ IDNO：463)
和
TCGACGCAAAAACACCAGTAAGATTTCCAAAGTGTGCACGCGCAAGATTTGCATG(SEQ ID NO：464)
BBIt-VEGT
DPDDESSKPCCDQCICTKSN PPQCRCRDARPNACHSACKSCACTLWKSYWCKCTDITDFCYEPCKPSE(SEQ ID NO：641)
VegKD：
CAAATCTTGCATCTGTAAATATGATCTTTACTGGTGGTGTTTTTGCG (SEQ IDNO：465)
和
TCGACGCAAAAACACCACCAGTAAAGATCATATTTACAGATGCAAGATTTGCATG(SEQ ID NO：466)
通过将合成基因(VegKD-Q)连接到p2JMagk103-lnk2-2BBIck81的BamHI和HindIII中，将称为VegKD的VEGF结合肽导入变体BBI-A13I-S25K-L29P-V52K中。显示了合成基因的序列和编码的BBPI显示如下。
VegKD-Q：
GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCTTGTTGCGATCAATGCATCTGTACAAAATCAAACCCTCCACAATGTCGTTGTAAAGATATGCGTCCTAATAGCTGTCATTCTGCATGCAAATCATGTATCTGCAAATATGACCTTTACTGGTGGTGTTTCTGCAAAGACATCACTGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCTTCTGAATAAAAGCTT(SEQID NO：467)
DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDARPNACHSACKSCACKYDLYWWCKCTDITDFCYEPCKPSE(SEQ ID NO：642)
通过将合成基因连接到p2JMagk103-lnk2-2BBIck81的BamHI和HindIII位点中，将VEGF-结合肽V1(SKHSQIT；SEQ ID NO：468)，V2(KTNPSGS；SEQID NO：469)，V3(RPTGHSL；SEQID NO：470)，V4(KHSAKAE；SEQ ID NO：471)，V5(KPSSASS；SEQ ID NO：472)和V6(PVTKRVH；SEQ ID NO：473)，以及TNF□-结合肽T1(RYWQDIP；SEQ ID NO：474)，T2(APEPILA；SEQ IDNO：475)和T3(DMIMVSI；SEQ ID NO：476)，导入经修饰的BBIt的胰凝乳蛋白酶抑制环中所述经修饰的BBIt含有氨基酸取代A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-I40A-F50K-V52T。编码所获得的经修饰的BBI的合成基因的DNA序列显示如下。
BBIt-AV-V1：
GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCTTGTTGCGATCAATGCATCTGTACAAAATCAAACCCTCCACAATGTCGTTGTAGAGATGCTCGTCCTAATGCATGTCATTCTGCATGCAAATCATGTGCTTGCAGCAAACACTCTCAAATTACTTGTAAATGCACAGACATCACTGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCTTCTGAATAAAAGCTT(SEQID NO：477)
DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDARPNACHSACKSCACSKHSQITCKCTDITDFCYEPCKPSE(SEQ ID NO：491)
BBIt-AV-V2：
GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCTTGTTGCGATCAATGCATCTGTACAAAATCAAACCCTCCACAATGTCGTTGTAGAGATGCTCGTCCTAATGCATGTCATTCTGCATGCAAATCATGTGCTTGCAAAACAAACCCAAGCGGTTCTTGTAAATGCACAGACATCACTGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCTTCTGAATAAAAGCTT(SEQID NO：478)
DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDARPNACHSACKSCACKTNPSGSCKCTDITDFCYEPCKPSE(SEQ ID NO：632)
BBIt-AV-V3：
GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCTTGTTGCGATCAATGCATCTGTACAAAATCAAACCCTCCACAATGTCGTTGTAGAGATGCTCGTCCTAATGCATGTCATTCTGCATGCAAATCATGTGCTTGCAGACCAACTGGTCACAGCCTTTGTAAATGCACAGACATCACTGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCTTCTGAATAAAAGCTT (SEQID NO：479)
DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDARPNACHSACKSCACRPTGHSLCKCTDITDFCYEPCKPSE(SEQ ID NO：633)
BBIt-AV-V4：
GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCTTGTTGCGATCAATGCATCTGTACAAAATCAAACCCTCCACAATGTCGTTGTAGAGATGCTCGTCCTAATGCATGTCATTCTGCATGCAAATCATGTGCTTGCAAACACAGCGCTAAAGCAGAATGTAAATGCACAGACATCACTGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCTTCTGAATAAAAGCTT(SEQID NO：480)
DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDARPNACHSACKSCACKHSAKAECKCTDITDFCYEPCKPSE(SEQ ID NO：634)
BBIt-AV-V5：
GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCTTGTTGCGATCAATGCATCTGTACAAAATCAAACCCTCCACAATGTCGTTGTAGAGATGCTCGTCCTAATGCATGTCATTCTGCATGCAAATCATGTGCTTGCAAACCAAGCTCTGCTTCATCTTGTAAATGCACAGACATCACTGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCTTCTGAATAAAAGCTT(SEQID NO：481)
DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDARPNACHSACKSCACKPSSASSCKCTDITDFCYEPCKPSE(SEQ ID NO：635)
BBIt-AV-V6：
GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCTTGTTGCGATCAATGCATCTGTACAAAATCAAACCCTCCACAATGTCGTTGTAGAGATGCTCGTCCTAATGCATGTCATTCTGCATGCAAATCATGTGCTTGCCCAGTTACTAAAAGAGTACACTGTAAATGCACAGACATCACTGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCTTCTGAATAAAAGCTT(SEQID NO：482)
DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDARPNACHSACKSCACPVTKRVHCKCTDITDFCYEPCKPSE(SEQ ID NO：636)
BBIt-TNF-T1：
GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCTTGTTGCGATCAATGCATCTGTACAAAATCAAACCCTCCACAATGTCGTTGTAGAGATGCTCGTCCTAATGCATGTCATTCTGCATGCAAATCATGTGCTTGCAGATACTGGCAAGATATTCCATGTAAATGCACAGACATCACTGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCTTCTGAATAAAAGCTT(SEQDINO：483)
DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDARPNACHSACKSCACRYWQDIPCKCTDITDFCYEPCKPSE(SEQ ID NO：637)
BBIt-TNF-T2：
GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCTTGTTGCGATCAATGCATCTGTACAAAATCAAACCCTCCACAATGTCGTTGTAGAGATGCTCGTCCTAATGCATGTCATTCTGCATGCAAATCATGTGCTTGCGCACCAGAACCTATTCTTGCTTGTAAATGCACAGACATCACTGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCTTCTGAATAAAAGCTT(SEQID NO：484)
DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDARPNACHSACKSCACAPEPILACKCTDITDFCYEPCKPSE(SEQ I D NO：638)
BBIt-TN F-T3：
GGATCCAGACGATGAGαAGCTCTAAACCTTGTTGCGATCAATGCATCTGTACAAAATCAAACCCTCCACAATGTCGTTGTAGAGATGCTCGTCCTAATGCATGTCATTCTGCATGCAAATCATGTGCTTGCGATATGATTATGGTTAGCATCTGTAAATGCACAGACATCACTGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCTTCTGAATAAAAGCTT (SEQIDNO：485)
DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDARPNACHSACKSCACDMIMVSICKCTDITDFCYEPCKPSE(SEQ ID NO：639)
所获得的载体用于转化枯草芽孢杆菌BG6006宿主细胞。将培养物生长在500ml的MBD培养基中，基本如上文和Vogtentanz等，2007(Protein Expr Purif 55：40-52[2007])所述，纯化BBI种类。基本按制造商和实施例5所概述的，实施BioVeris结合测定。使用结合测定测量经修饰的变体BBI与其各自的靶蛋白的结合，所述结合测定是在存在或缺少标记的竞争剂的条件下，确定经修饰的变体BBI与其靶蛋白(例如，VEGF、FGF5、TGFβ和TNFα)的结合的竞争测定。竞争剂可以是针对靶蛋白的标记的单克隆抗体，或者靶蛋白的标记的天然受体。基本如实施例5所述，实施电化学发光结合测定。通过确定降低一半BioVeris信号所需的BBI种类的浓度，从结合数据确定表观IC50。将胰凝乳蛋白酶抑制环中没有靶结合肽的BBI支架用作阴性对照。
下表7中概括了所述结果。
表7
经修饰的变体Bowman Birk抑制剂的结合活性，所述抑制剂中的胰凝乳蛋白酶抑制环被VEGF-，FGF-5-，TGFβ-或TNFα-结合性变体肽替代
●用于替换BBIt支架的胰凝乳蛋白酶环的结合肽。
▲替换SEQ ID NO：187的BBIt的42-48氨基酸的结合肽的氨基酸序列。
＊(+++)表示约2-10μM的IC50值；(++)表示约10-50μM的IC50值；(+)表示约50-250μM的IC50值；而(-)表示大于约250μM的IC50值。
这些数据显示，经修饰的变体BBPI特异地结合它们的靶蛋白，即VEGF，在所述经修饰的变体BBPI中，胰凝乳蛋白酶环已被不同的VEGF结合肽替代，并且在支架的骨架中进一步包含至少一个氨基酸取代。相似的，经修饰的变体BBPI也特异地结合它们相应的靶蛋白，即，FGF、TGF和TNF，在所述经修饰的变体BBPI中，胰凝乳蛋白酶环被其他的变体肽替代，例如FGF-5、TGFβ和TNFα。此外，其他的BBPI支架(即，BBtc、BBsb3和BBdb)也能够特异地结合VEGF靶蛋白，在所述BBPI支架中，胰凝乳蛋白酶环已被变体肽替代，例如VEGF变体肽。
总而言之，上述数据显示，经修饰的变体BBPI支架保留了结合靶蛋白的能力，其中所述支架包含至少一个氨基酸取代并携带不同的替换了胰凝乳蛋白酶环的变体肽，所述靶蛋白被游离(未移植的)结合肽结合。因而，数据表示，不同的结合肽序列可用于替代经修饰的BBI蛋白的胰凝乳蛋白酶抑制环，并预期结合其相应的靶蛋白，其中所述结合肽序列之前表现出结合它们相应的靶蛋白。
实施例16
鉴别wt BBI中的肽T细胞表位
使用天然的人T细胞实施测定，鉴别野生型BBI中的肽T细胞表位，如WO9953038A2和Stickler等，2000(J.Immunotherapy，23(6)，654-660，[2000])中所述。基于野生型BBI氨基酸序列DDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCICALSYPAQCFCVDITDFCYEPCKPSEDDKEN(SEQ ID NO：13)制备用于测定的肽。根据BBI的全长氨基酸序列，由Mimotopes US West(San Diego，CA)合成制备15mer肽。每个15mer肽序列设计为除3个残基外，与之前和之后的15mer重叠。用于筛选与野生型BBI序列对应的T细胞表位的20种肽是：
P1 DDESSKPCCDQCACT(P1；SEQ ID NO：649)
P2 SSKPCCDQCACTKSN(P2；SEQ ID NO：650)
P3 PCCDQCACTKSNPPQ(P3；SEQ ID NO：651)
P4 DQCACTKSNPPQCRC(P4；SEQ ID NO：652)
P5 ACTKSNPPQCRCSDM(P5；SEQ ID NO：653)
P6 KSNPPQCRCSDMRLN(P6；SEQ ID NO：654)
P7 PPQCRCSDMRLNSCH(P7；SEQ ID NO：655)
P8 CRCSDMRLNSCHSAC(P8；SEQ ID NO：656)
P9 SDMRLNSCHSACKSC(P9；SEQ ID NO：657)
P10 RLNSCHSACKSCICA(P10；SEQ ID NO：658)
P11 SCHSACKSCICALSY(P11；SEQ ID NO：659)
P12 SACKSCICALSYPAQ(P12；SEQ ID NO：660)
P13 KSCICALSYPAQCFC(P13；SEQ ID NO：661)
P14 ICALSYPAQCFCVDI(P14；SEQ ID NO：662)
P15 LSYPAQCFCVDITDF(P15；SEQ ID NO：663)
P16 PAQCFCVDITDFCYE(P16；SEQ ID NO：664)
P17 CFCVDITDFCYEPCK(P17；SEQ ID NO：665)
P18 VDITDFCYEPCKPSE(P18；SEQ ID NO：666)
P19 TDFCYEPCKPSEDDK(P19；SEQ ID NO：667)
P20 FCYEPCKPSEDDKEN(20；SEQ ID NO：668)
简而言之，将人CD4+T细胞与树突状细胞和用于完整的肽组合的肽共培养，使用图Y中显示的肽。如Strickler等，2000所述，将每个实验中的细胞因子应答平均化，如果刺激指数(SI)大于2.95，则对肽的应答列表显示为正值(图18A)。对于每种肽组合，将各个供体的SI值汇编，并在图18B中显示了响应每种肽的供体百分比。百分比背景应答2.89％是根据组合中所有肽的平均百分比响应者来确定的。该数据集合的标准差是2.21％。主要表位定义为具有是背景3倍或更多的百分比应答。根据图18A和18B中显示的数据，基于关于具有低背景应答率的未暴露供体群体的统计学方法，没有肽应答是显著的。
因此，上述数据表示，可以预期野生型BBI分子在人体中具有低免疫原性潜力。
实施例17
个人护理组合物
在本实施例中，包含本发明的任何经修饰的变体BBPI化合物的各种个人护理组合物提供如下。在这些配方中，除非另外说明，否则按总组成的百分比给出所述量。同样的，除非另外说明，在下列配方中，BBI-AV(下面也称为“化合物”)的浓度在约0.01％至约1.0％的范围内。在一些配方中，优选的浓度在约0.1％至约0.2％的范围内，而在其它配方中，优选的浓度在约0.05％至约0.1％的范围内(例如，对于一些毛发生长抑制实施方案)；从约0.02％至约0.1％(例如，对于一些皮肤增白实施方案)；从约0.5％至约1.0％(例如，对于一些皮肤增白实施方案)；或在大于约0.1％的浓度(例如，对于一些酒糟鼻治疗实施方案)。对于每一种产品，本领域的技术人员已知如何确定BBI-AV的合适(即，最优)浓度。在下文提供的一些组合物中，“化合物”的量表示为“SA”。这表示制剂师(formulator)应该使用上文说明的合适浓度的BBI-AV，或者对具体配方合适的浓度。
保湿身体洗液(pH 7)
身体洗液
润丝膏(pH 4)
滋润型护发素/护理(pH 6)
调理香波
去头屑香波
在仍进一步的实施方案中，本发明包括至少一种无机色素。在一些优选的实施方案中，这些无机色素是基于金属氧化物和/或其它轻微溶于水的或不溶的金属化合物的，包括但不限于这样的化合物，例如氧化锌(ZnO)、二氧化钛(TiO2)、氧化铁(例如，Fe2O3)、二氧化锆(ZrO2)、二氧化硅(SiO2)、氧化锰(例如，MnO)、氧化铝(Al2O3)、氧化铯(例如，Ce2O3)、和这些氧化物的混合氧化物、及其掺合物。在一些实施方案中，金属氧化物是超细级的，而在其它实施方案中，金属氧化物是色素级的。在进一步的实施方案中，金属氧化物是超细级和色素级的混合物。
在另外的实施方案中，涂覆了无机色素(即，将它们在表面上进行处理)。在一些特别优选实施方案中，用薄的疏水膜涂覆表面。在一些其它特别优选的实施方案中，用薄的亲水膜涂覆表面。在另外的实施方案中，本发明提供了包括各种化妆品和化妆组分的组合物。例如，在一些实施方案中，本发明提供了各种染料和/或色素。在一些实施方案中，有效的颜料包括但不限于二氧化钛、云母、氧化铁(例如，Fe2O3、Fe3O4、FeO(OH)等)和/或锡的氧化物。本发明进一步提供了着色剂，包括但不限于洋红、蓝色、氧化铬(chromooxide)、群青和/或锰紫(purplemanganese)。一些最优选的实施方案的着色剂和色素是本领域技术人员已知的，且以前已提供(见例如，Colour Index Nummern(CIN)、Rowe Colour Index，第3版，Society of Dyers and Colourists、Bradford、England[1971])。
在另外的实施方案中，可用基于云母/金属氧化物的珠光色素，如上所述。然而，本发明并非意在限于这些特定的色素，因为本发明的各个实施方案可使用其他的珠光色素。
下列配方提供了本发明用途的其他实例。
下列配方提供了包含本发明的BBI-AV的须后产品的实例。
生产：称量A相的组分并混合。溶解B相，将其搅拌入A相，并充分均化。
测量值：
粘度：18500mPa s Brookfield RVD II+
pH值：5.8
下列配方提供了包含本发明的BBI-AV的须前产品的实例。
生产：称出相应重量的A相的成分并将它们完全溶解。
上面提供的须后和须前配方含有足以提供(一种或多种)期望效应的BBI-AV(化合物)。在一些实施方案中，BBI-AV的浓度在约1,000ppm至约10,000ppm的范围内。在下面的配方中，所使用的典型BBI-AV浓度在约100ppm至约1,000ppm之间，或从约1,000ppm至约10,000ppm。然而，本发明并非意在限于该具体的浓度范围，因为其它浓度范围可用于本发明的其它实施方案中。
下列配方提供了含有本发明的BBI-AV的晒后产品的实例。
下列配方提供了含有本发明的BBI-AV的洁面奶(facial cleanser)产品的例子。
生产：溶解A相，然后在B相中搅拌。混入C相。溶解D相，并将其搅拌入混合的A+B+C相，均化并再次搅拌15分钟。
测量值：
粘度：7200mPa s Brookfield RVT
pH值：5.8
下面的配方提供了SPF为8的含有本发明BBI-AV的日常护理身体喷剂(daily carebody spray)产品的例子。
生产：对A相的组分称量并将它们完全溶解。
测量值：
SPF：8Colipa Task Force“防晒测量(Sun Protection Measurement)”
下面的配方提供了SPF为27的含有本发明的BBI-AV的日常护理防晒液(dailycare sun care lotion)产品的例子。
生产：分别将A相和B相加热至约80℃。将B相搅拌入A相，同时均化。将C相加热至约80℃，并将其搅拌入混合的A+B相，同时均化。冷却至约40℃，加入D相，并再次均化。
测量值：
粘度：3200mPa s Brookfield RVD II+
pH值：6.0
SPF： 27Colipa Task Force“防晒测量”
生产：将A相加热到80℃，加入B相并均化3分钟。加热C相至约80℃，并将其搅拌入混合的A+B相，同时均化。冷却至约40℃，加入D相，并均化。
测量值：
粘度：5000mPa s Brookfield RVD II+
pH值：7.5
SPF： 24Colipa Task Force“防晒测量”
下面的配方提供了SPF为28的含有本发明BBI-AV的防晒乳状液产品的例子。
生产：将A相加热到80℃，加入B相并均化3分钟。加热C相至约80℃，并将其搅拌入混合的A+B相，同时均化。冷却至约40℃，加入D相，并均化。
测量值：
浓度：7500mPa s Brookfield RVD II+
pH值：6.6
SPF：28Colipa Task Force“防晒测量”
下面的配方提供了含有本发明的BBI-AV的足膏(foot balm)产品的例子。
生产：分别加热A相和B相至约80℃。将B相搅拌入A相中，同时均化。
冷却至约40℃，加入C和D相，并再次均化。冷却到室温。
测量值：
粘度：20500mPa s Brookfield RVD II+
pH值：6.0
下面的配方提供了含有本发明的BBI-AV的足部清新胶(refreshing foot gel)产品的例子。
生产：A相：散布Carbopol并使其沉淀在烧杯底部。溶解B相并将其搅拌入A相。
测量值：
粘度：14500mPa s Brookfield RVD II+
pH值：7.5
下面的配方提供了含有本发明的BBI-AV的皮肤调理胶(skin conditioning gel)产品的例子。
生产：完全溶解A相。使B相溶胀，并用C相中和。将A相搅拌入中和的B相并均化。
测量值：
粘度：57600mPa s Brookfield RVD II+
pH值：7.7
下面的配方提供了含有本发明的BBI-AV的W/O乳状液的例子。
生产：分别加热A相和B相至约85℃。将B相搅拌入A相中，并均化。冷却至约40℃，同时搅拌，加入C相并再次均化。冷却到室温。
测量值：
粘度：37500mPa s Brookfield RVD II+
下面的配方提供了含有本发明的BBI-AV的O/W乳状液的例子。
生产：分别加热A相和B相至约80℃。将B相搅拌入A相中，并均化。将C相搅拌入混合的A+B相并均化。冷却至约40℃，加入D相，然后用E相调节pH值至6.5。加入F相并均化。冷却到室温。
测量值：
粘度：37500mPa s Brookfield RVD II+
pH值：6.3
下面的配方提供了含有本发明的BBI-AV的防护日霜(protective day cream)产品的例子。
生产：分别加热A相和B相至约80℃。将B相搅拌入A相中，并均化。将C相搅拌入混合的A+B相并均化。冷却至约40℃，加入D相，然后用E相调节pH值至6.5并均化。冷却到室温。
测量值：
粘度：24000mPa s Brookfield RVD II+
pH值6.4
下面的配方提供了含有本发明的BBI-AV的毛发护理产品(hair care product)的例子。
生产：将所有化合物加入A相并搅拌均化。装入合适的容器并装入B相。
生产：将所有化合物加入A相并搅拌均化。装入合适的容器并装入B相。
生产：将所有化合物加入A相并搅拌均化。装入合适的容器并装入B相。
生产：称出A相的化合物的重量并将它们混合。溶解B相，将其搅拌入A相中并均化。装入合适的容器中，并装入C相。
生产：称出A相的化合物的重量并将它们混合。溶解B相，将其搅拌入A相中并均化。装入合适的容器中，并装入C相。
定型泡沫
％成分(INCI)
A 2.0椰油基三甲基硫酸甲酯铵
QS 香料
B 7.70聚季铵盐-44
生产：称出A相的化合物的重量并将它们混合。溶解B相，将其搅拌入A相中并均化。条件pH至6-7。装入合适的容器中，并装入C相。
生产：称出A相的化合物的重量并将它们混合。溶解B相，将其搅拌入A相中并均化。添加C相并再次均化。调节pH至6-7。装入合适的容器中，并装入D相。
生产：称出A相的化合物的重量并将它们混合。溶解B相，将其搅拌入A相中并均化。添加C相并再次均化。调节pH至6-7。装入合适的容器中，并装入D相。
生产：称出A相的化合物的重量并将它们混合。溶解B相，将其搅拌入A相中并均化。调节pH至6-7。装入合适的容器中，并装入C相。
生产：称出A相的化合物的重量并将它们混合。溶解B相，将其搅拌入A相中并均化。调节pH至6-7。装入合适的容器中，并装入C相。
生产：称出A相的化合物的重量并将它们混合。溶解B相，将其搅拌入A相中并均化。调节pH至6-7。装入合适的容器中，并装入C相。
生产：称出A相的化合物的重量并将它们混合。溶解B相，将其搅拌入A相中并均化。调节pH至6-7。装入合适的容器中，并装入C相。
生产：称出A相的化合物的重量并将它们混合。用柠檬酸将pH调节至6-7。
生产：称出A相的化合物的重量并将它们混合。用柠檬酸将pH调节至6-7。
生产：称出A相的化合物的重量并将它们混合。用柠檬酸将pH调节至6-7。
生产：称出A相的化合物的重量并将其混合。调节pH至6-7。加入B相并加热到最大值40℃。
生产：分别将A相和B相加热至约40℃。将B相加入A相并通过搅拌均化。将C相加入混合的A相和B相并再次均化。用D相将pH调节至6-7。通过搅拌均化，并冷却至室温。
生产：分别将A相和B相加热至约80℃。将B相加入A相并通过搅拌均化。冷却到40℃并加入C相。再次均化，并冷却至室温。
生产：将所有化合物加入A相，并搅拌均化。装入合适的容器并装入B相。
生产：将所有化合物加入A相，并搅拌以均化。装入合适的容器并装入B相。
生产：将所有化合物加入A相，并搅拌以均化。装入合适的容器并装入B相。
生产：称出A相的化合物的重量并将它们混合。溶解B相，将其搅拌入A相中并均化。装入合适的容器中，并装入C相。
生产：称出A相的化合物的重量并将它们混合。溶解B相，将其搅拌入A相中并均化。装入合适的容器中，并装入C相。
生产：称出A相的化合物的重量，并将它们混合。溶解B相，将其搅拌入A相并均化。调节pH至6-7。装入合适的容器中，并装入C相。
生产：称出A相的化合物的重量，并将它们混合。溶解B相，将其搅拌入A相并均化。加入C相并再次均化。调节pH至6-7。装入合适的容器中，并装入D相。
生产：称出A相的化合物的重量，并将它们混合。溶解B相，将其搅拌入A相并均化。加入C相并再次均化。调节pH至6-7。装入合适的容器中，并装入D相。
生产：称出A相的化合物的重量，并将它们混合。溶解B相，将其搅拌入A相并均化。调节pH至6-7。装入合适的容器中，并装入C相。
生产：称出A相的化合物的重量并将其混合。溶解B相，将其搅拌入A相并均化。调节pH至6-7。装入合适的容器并装入C相。
生产：称出A相的化合物的重量，并将它们混合。溶解B相，将其搅拌入A相并均化。调节pH至6-7。装入合适的容器中，并装入C相。
生产：称出A相的化合物的重量，并将它们混合。溶解B相，将其搅拌入A相并均化。调节pH至6-7。装入合适的容器中，并装入C相。
生产：称出A相的化合物的重量并将它们混合。用柠檬酸将pH调节至6-7。
生产：称出A相的化合物的重量并将它们混合。用柠檬酸将pH调节至6-7。
生产：称出A相的化合物的重量并混合它们。用柠檬酸调节pH至6-7。
生产：称出A相的化合物的重量并将其混合。调节pH至6-7。加入B相并加热到最大值40℃。
生产：分别将A相和B相加热至约40℃。将B相加入A相并通过搅拌均化。将C相加入混合的A相和B相并再次均化。用D相调节pH至6-7。通过搅拌均化，并冷却至室温。
生产：分别将A相和B相加热至约80℃。将B相加入A相并通过搅拌均化。冷却到40℃并加入C相。再次均化，并冷却至室温。
生产：分别加热A相和B相至约80℃。将B相加入A相并通过搅拌均化。将C相加入混合的A相和B相并再次均化。冷却至约40℃并加入D相。用E相调节pH至约6.5。通过搅拌均化，并冷却至室温。
日用皮肤防护霜O/W(PROTECTIVE DAY SKIN CREME O/W)
生产：分别加热A相和B相至约80℃。将B相加入A相并通过搅拌均化。将C相加入混合的A相和B相并再次均化。冷却至约40℃并加入D相。用E相调节pH至约6.5。通过搅拌均化，并冷却至室温。
生产：溶解A相，将B相加入A相，并通过搅拌均化。将C相加入混合的A相和B相并再次均化。将D相加入混合的A、B和C相并再次均化。溶解D相，加入A、B和C相并再次均化。搅拌15分钟。
生产：称量A相的所有成分，并通过搅拌将其完全溶解。
生产：溶解A相。溶胀B相并用C相中和。将A相加到B相和C相，并通过搅拌均化。
生产：溶解A相。溶解B相并加到A相。通过搅拌均化。
生产：溶解A相。溶解B相并加到A相。通过搅拌均化。通过添加C相中和A相和B相，并再次均化。
生产：将A相和B相分别加热至约80℃。将B相加入A相并通过搅拌均化。将C相加热到80℃，将其加入到混合的A相和B相，并再次均化。冷却至约40℃并加入D相。再次均化。
生产：将A相和B相分别加热至约80℃。将B相加入A相，并通过搅拌均化。将C相加热到80℃，将其加入到混合的A相和B相，并再次均化。冷却至约40℃并加入D相。再次均化。
生产：将A相和B相分别加热至约80℃。将B相加入A相，并通过搅拌均化。将C相加热到80℃，将其加入到混合的A相和B相，并再次均化。冷却至约40℃并加入D相。再次均化。
生产：将A相和B相分别加热至约80℃。将B相加入A相并通过搅拌均化。冷却至约40℃并加入C和D相。通过搅拌均化，并冷却至室温。
生产：将A相和B相分别加热至约85℃。将B相加入A相，并通过搅拌均化。冷却至约40℃并加入C相。通过搅拌均化，并冷却至室温。
生产：将A相和B相分别加热至约80℃。将B相加入A相，并通过搅拌均化。冷却到40℃并加入C和D相。通过搅拌均化，并冷却至室温。
将颜料(AS 5811、5131、5146、5126和50230；Color Techniques)和对羟基苯甲酸丙酯分散于Silcare 31M50SV(Clariant)，搅拌直至润湿。然后，在紧密的设置(tightsetting)下，使该混合物通过三辊滚轧机(three roll mill)上，直到粒径＜10μm。然后，将DC 9011Elastomer Blend(弹性体掺合物)(Dow Corning)和DC 245Fluid在终容器(finishing vessel)内混合，搅拌直至均匀。在均化器缓慢搅拌下，加入细磨颜料(colorgrind)。将水称量入单独的容器中，并在螺旋桨式搅拌下缓慢加入化合物，搅拌直到溶解。将对羟基苯甲酸甲酯和苯甲酸加入丁二醇中。稍微对该混合物加温，并搅拌直到溶解。使混合物冷却到30℃并加入到含化合物的容液中。在快速搅拌下，将水相缓慢加入到油相中。当添加完成时，均化该制剂五分钟。该制剂可用作美容粉底化妆品，施用于皮肤。
睫毛油配方(MASCARA FORMULATION)
对照制剂和含2％的睫毛油的成分如下：
为生产睫毛油制剂，在螺旋桨式搅拌下混合蜡相8，并加热到85-90℃。通过将化合物加入水中，同时进行螺旋桨式混合，制备10％的化合物溶液。将相1的水加入配衡的不锈钢烧杯(过量加入约50g，以弥补损失)中。将相2的对羟基苯甲酸甲酯加入到丁二醇中，并在蒸汽浴顶部温热下搅拌，直至溶解，然后，在缓慢均相混合机搅拌下加入水中。然后，加入相4的氧化铁黑，同时保持搅拌。然后，喷洒入Natrosol，同时维持搅拌。加入10％KOH，并开始加热到85℃，其中尽可能紧密的覆盖烧杯。当Natrosol溶解后，逐滴加入10％的柠檬酸，保持温度和搅拌。然后，缓慢加入Arlacel 165，并混合至少5分钟，确保溶解。在85-90℃下，将蜡相缓慢加入水相中，同时均相混合。保持该温度和搅拌10分钟。将该批从蒸汽浴移开，允许冷却，同时通过偶尔的手动刮擦烧杯壁进行均质混合。在55℃下，将该批次称重，检查水的损失。继续混合，并且如果需要的话，将水加回。在45℃下，加入相9和10。使用冷水，继续冷却到30℃。此时，必需连续的手动刮擦烧杯壁。
在该制备中，少量的KOH(在相5中)用于增加pH，以分散Natrosol，Natrosol用乙二醛涂覆，以减缓润湿，并防止聚集。在相7中，缓慢加入柠檬酸，调节pH至～5.5，即，在氧化铁的等电点之下。在相7和8中，Arlacel 165在水相和油相之间分开，因为在两相中都具有表面活性剂的情况下，乳化作用更易于进行。在相9中，向对照批次中加入去离子水，代替化合物。加工乳状液的同时制备化合物溶液，如此，其是绝对新鲜的。该制剂提供了适于用作睫毛油的配方。
实施例18
毛发生长抑制
在该实施例中，描述了测定本发明的组合物抑制毛发生长的能力的实验。具体而言，为了评价本发明的组合物在通过刮剃或使用脱毛膏或上蜡(waxing)进行脱毛作用之后降低毛发生长的能力，而进行这些实验。
根据以下配方(A)制备这样的化妆水(lotion)，所述化妆水用于抑制毛发生长，并含有经修饰的变体BBPI，其中母本BBPI的胰凝乳蛋白酶环被VEGF结合肽替代：
组合物包括选自SEQ ID NO：601、602、627-631、643、491、632-636的至少一种类型的VEGF-BBPI。在一些实施方案中，组合物包含选自SEQID NO：601、602、627-631、643、491、632-636的至少2种，至少3种，至少4种或至少5种不同类型的VEGF-BBPI。
如下生产包含VEGF-BBPI的配方：
1)在60℃，优选70℃或更高的温度下，将脂肪醇乳化剂和凝油剂(oil gellingagent)一起掺合成融化相；
2)将融化相乳化到水相中，在乳化作用前，水相的温度是50℃，优选60℃，更优选70℃或更高，从而形成乳状液；
3)将乳状液冷却至35℃或更低的温度；
4)将香料、防腐剂、柠檬酸溶液缓冲液分散在乳状液中。
5)以相同的方式添加VEGF-BBPI溶液，用缓冲溶液整理(finishing)超过约5分钟。
6)进一步搅拌混合物10分钟。
根据所述用于制备配方A的方法制备对照配方(B)，但排除VEGF-BBPI。
脸毛实验
在这些实验中，测试了一组(例如，5个)具有Fitzpatrick皮肤分类II型的男(雄)性受试者。在开始实验之前，要求受试者不使用任何的局部脸部处理。在第1天，肉眼评价脸毛生长，并照相。在该评价和照相之后，以所需浓度(一种或多种)施用待测试的组合物以及载体对照。从第2天开始，个体在刮完之后立即施用组合物。在实验期间，不进行其它刮前或刮后处理。在大多数情况下，实验继续进行30至45天的时间期间。在实验期间，每隔三天对脸毛生长进行肉眼评价和照相。利用计算机成像分析，测量毛发的数量以及毛干长度和宽度。在优选的实施方案中，由于应用测试化合物，毛发数量、毛发厚度和/或毛发长度降低。
腿毛实验
在这些实验中，测试了一组(例如，5个)具有Fitzpatrick皮肤分类II型的女(雌)性受试者。在开始实验之前，要求受试者不进行局部腿部处理。在第1天，在每一个体的两腿区域上做标记，以及肉眼评价腿毛生长，并照相。在该评价和照相之后，以所需浓度(一种或多种)施用待测试的组合物(一种或多种)。在该评价和照相之后，以所需浓度(一种或多种)施用待测试的组合物(即，含有所需浓度的VEGF-BBPI的测试化合物)以及载体对照。在一些方法中，为每一个体提供两个管，一个含有VEGF-BBPI，而另一个含有载体对照。这些管被标上“左”和“右”。在实验的每一天，受试者对各个腿施用两个管中的组合物。在施用7天后，肉眼评价个体并进行照相。然后，刮剃两条腿，或暴露于脱毛剂，并且测试个体继续如前施用组合物。然后，每两天对腿部适宜的区域肉眼评价腿毛生长并照相。在10天后，再次刮腿，而测试受试者继续如前施用组合物。在一些方法中，该实验进行3个循环，并肉眼评价腿毛生长和进行照相。然后，继续该实验另外的8天。在优选的实施方案中，由于在标记的区域施用测试化合物，毛发数量、毛发厚度和/或毛发长度降低。
从第2天开始，个体在刮完之后立即施用组合物。在实验期间，不进行其它刮前或刮后处理。在大多数情况下，实验持续进行30至45天的时间期间。在实验期间，每隔三天对脸毛生长进行肉眼评价和照相。利用计算机成像分析，测量毛发的数量以及毛干长度和宽度。在优选的实施方案中，由于应用测试化合物，毛发数量、毛发厚度和/或毛发长度降低。

Claims (142)

1.分离的经修饰变体Bowman Birk蛋白酶抑制剂(BBPI)，其中，BBPI支架的第二个蛋白酶抑制环是结合肽，其中所述BBPI支架为由SEQ ID NO:187所示的BBIt-AV，并且所述BBIt-AV的位置41-位置49处的结合肽选自VEGF结合肽、FGF-5结合肽、TGFβ结合肽或TNFα结合肽；其中所述经修饰的变体BBPI中的氨基酸取代选自：
1A、1C、4V、5P、5A、11G、13Y、13I、13F、13M、13L、13V、13K、13R、18I、18V、18L、25K、25N、25W、25I、25A、25R、27H、27K、27V、27A、27Q、29R、29K、29P、31Q、31H、31E、31A、31R、31W、31K、31T、38N、38K、38R、40H、40K、40Q、40R、40Y、50R、50Q、50K、50T、50V、50M、50S、52K、52T、52R、52Q、52L、52H、52A、52M、52S、52E、55M、65E、65Q或65D；或者
F50T-V52A、
A40L-F50N、
A13I-S25L-F50T-V52A、
A13I-S25L-L29P-F50T-V52A、
A13I-S25L-L29P-A40K-F50T-V52A、
A13I-L29P-A40K-F50T-V52A、
A13I-L29P-F50T-V52A、
A13I-S25L-A40K-F50T-V52A、
A13I-A40K-F50T-V52A、
S25L-F50T-V52A、
S25L-L29P-F50T-V52A、
S25L-L29P-A40K-F50T-V52A、
S25L-A40K-F50T-V52A、
L29P-F50T-V52A、
L29P-A40K-F50T-V52A、
A40K-F50T-V52A、
A13I-L29P-F50T-V52A、
A13I-S25K-L29P-V52K、
D1C-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A、
S4V-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A、
S5P-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A、
Q11G-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A、
A13L-L29P-A40K-F50T-V52A、
A13I-S25R-L29P-A40K-F50T-V52A、
A13I-S25R-L29P-S31A-A40K-F50T-V52A、
A13I-S25R-L29P-S31R-A40K-F50T-V52A、
A13I-M27R-L29P-A40K-F50T-V52A、
A13I-L29K-A40K-F50T-V52A、
A13I-L29P-S31A-A40K-F50T-V52A
A13I-L29P-S31R-A40K-F50T-V52A、
A13I-L29P-S38N-A40K-F50T-V52A、
A13I-L29P-A40K-F50K-V52A、
A13I-L29P-A40K-F50T-V52T、
A13I-L29P-S38N-A40K-F50T-V52A、
A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T、
A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-A40H-F50K-V52T、
A13I-S25K-M27A-L29R-S31E-A40K-F50Q-V52Q、
A13I-S25K-M27R-L29E-S31A-A40H-F50R-V52K、
A13I-S25K-M27A-L29R-S31A-A40H-F50R-V52L、
A13I-S25K-M27Q-L29P-S31E-A40H-F50R-V52Q，或
A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T；
其中所述的氨基酸位置选自等价于SEQ ID NO:187的1、4、5、11、13、18、25、27、29、31、38、40、50、52、55和65位的位置。
2.权利要求1的分离的经修饰的变体BBPI，其中所述结合肽是VEGF结合肽，其选自
ACYNLYGWTC(SEQ ID NO:9),KYYLYWW(SEQ ID NO:458),TLWKSYW(SEQ ID NO:459),DLYWW(SEQ ID NO:460),SKHSQIT(SEQ ID NO:468),KTNPSGS(SEQ ID NO:469),RPTGHSL(SEQ ID NO:470),KHSAKAE(SEQ ID NO:471),KPSSASS(SEQ ID NO:472),PVTKRVH(SEQ IDNO:473),TLHWWVT(SEQ ID NO:492),PYKASFY(SEQ ID NO:493),PLRTSHT(SEQ ID NO:494),EATPROT(SEQ ID NO:495),NPLHTLS(SEQ ID NO:496),KHERIWS(SEQ ID NO:497),ATNPPPM(SEQ ID NO:498),STTSPNM(SEQ ID NO:499),ADRSFRY(SEQ ID NO:500),PKADSKQ(SEQ IDNO:501),PNQSHLH(SEQ ID NO:502),SGSETWM(SEQ ID NO:503),ALSAPYS(SEQ ID NO:504),KMPTSKV(SEQ ID NO:505),ITPKRPY(SEQ ID NO:506),KWIVSET(SEQ ID NO:507),PNANAPS(SEQ ID NO:508),NVQSLPL(SEQ ID NO:509),TLWPTFW(SEQ ID NO:510),NLWPHFW(SEQ IDNO:511),SLWPAFW(SEQ ID NO:512),SLWPHFW(SEQ ID NO:513),APWNSHI(SEQ ID NO:514),APWNLHI(SEQ ID NO:515),LPSWHLR(SEQ ID NO:516),PTILEWY(SEQ ID NO:517),TLYPQFW(SEQ ID NO:518),HLAPSAV(SEQ ID NO:519),KYYLSWW(SEQ ID NO:520),WYTLYKW(SEQ IDNO:521),TYRLYWW(SEQ ID NO:522),RYSLYYW(SEQ ID NO:523),YYLYYWK(SEQ ID NO:524),NYQLYGW(SEQ ID NO:525),TKWPSYW(SEQ ID NO:226),TLWKSYW(SEQ ID NO:527),PLWPSYW(SEQ ID NO:528),RLWPSYW(SEQ ID NO:529),TLWPKYW(SEQ ID NO:530),KYDLYWW(SEQ IDNO:531),RYDLYWW(SEQ ID NO:532),DYRLYWW(SEQ ID NO:533),DYKLYWW(SEQ ID NO:534),EYKLYWW(SEQ ID NO:535),和RYPLYWW(SEQ ID NO:536)。
3.权利要求1的分离的经修饰的变体BBPI，其中所述结合肽是FGF-5结合肽，选自:CACRTQPYPLCF(MM007；SEQ ID NO:430)，CICTWIDSTPC(PS2；SEQ ID NO:431),CYGLPFTRC(SEQ ID NO:537),CEEIWTMLC(SEQ ID NO:538),CWALTVKTC(SEQ ID NO:539),CLTVLWTTC(SEQ ID NO:540),CTLWNRSPC(SEQ ID NO：541),CHYLLTNYC(SEQ ID NO:542),CRIHLAHKC(SEQ ID NO:543),TNIDSTP(SEQ ID NO:544),HLQTTET(SEQ ID NO:545),SLNNLTV(SEQ IDNO:546),TNIDSTP(SEQ ID NO：547),TNIDSTP(SEQ ID NO:548),LRILANK(SEQ ID NO:549),LLTPTLN(SEQ ID NO:550),ALPTHSN(SEQ ID NO:551),TNIDSTP(SEQ ID NO:552),LCRRFEN(SEQ ID NO:553),TNIDSTP(SEQ ID NO:554),TNIDSTP(SEQ ID NO:555),HLQTTET(SEQ IDNO:556),PLGLCPP(SEQ ID NO:557),GYFIPSI(SEQ ID NO:558),TKIDSTP(SEQ ID NO:559),HLQTTET(SEQ ID NO:560),WNIDSTP(SEQ ID NO:561),TWIDWTP(SEQ ID NO:562),RTQPYPL(SEQ ID NO:670)和TWIDSTP(SEQ ID NO:671)。
4.权利要求1的分离的经修饰的变体BBPI，其中所述结合肽是TGFβ结合肽，选自:CLCPENINVLPCN(PEN3；SEQ ID NO:436)，CICKHNVDWLCF(MMO21W；SEQ ID NO:437),CICWTQHIHNCF(WTQ；SEQ ID NO:438),CVTTDWIEC(SEQ ID NO：563),CYYSQFHQC(SEQ ID NO：564),CPTLWTHMC(SEQ ID NO:565),QSACIVYYVGRKPKVECASSD(SEQ ID NO:566),QSACILYYIGKTPKIECASSD(SEQ ID NO:567),QSACILYYVGRTPKVECASSD(SEQIDNO:568),乙酰基-LCPENDNVSPCY-cohn2(SEQ ID NO：569),KHNVRLL(SEQ ID NO:570),NDTPSYF(SEQ IDNO:571),AKLYAGS(SEQ ID NO:572),RGPAHSL(SEQ ID NO:573),NSLAERR(SEQ ID NO:574),HPLASPH(SEQ ID NO:575),QPWNKLK(SEQ ID NO:576),AWLr/Mipy(SEQ ID NO:577),PTKPAQQ(SEQ ID NO:578),PSLNRPQ(SEQ ID NO:579),HHARQEW(SEQ ID NO:580),RHHTPGP(SEQ ID NO:581),ASAINPH(SEQ ID NO：582),CHGYDRAPC(SEQ ID NO:644),CFAPADQAC(SEQID NO:645),CIPSRFITC(SEQ ID NO:646),CHGHTKLAC(SEQ ID NO:647),CNGKSKLAC(SEQ IDNO:648),PENINVLP(SEQ ID NO；672),KHNVDWL(SEQ ID NO:673)和WTQHIHNC(SEQ ID NO:674)。
5.权利要求1的分离的经修饰的变体BBPI，其中所述结合肽是TNFα结合肽，选自：RYWQDIP(T1；SEQ ID NO:474)，APEPILA(T2；SEQ ID NO:475),DMIMVSI(T3；SEQ ID NO：476),WTPKPTQ(SEQ ID NO:583),ATFPNQS(SEQ ID NO：584),ASTVGGL(SEQ ID NO：585),TMLPYRP(SEQ ID NO：586),AWHSPSV(SEQ ID NO:587),TQSFSS(SEQ ID NO:588),THKNTLR(SEQ ID NO:589),GQTHFHV(SEQ ID NO：590),LPILTQT(SEQ ID NO:591),SILPVSH(SEQ IDNO:592),SQPIPI(SEQ ID NO:593),和QPLRKLP(SEQ ID NO：594)。
6.权利要求1的分离的经修饰的变体BBPI，还包含SEQ ID NO:389的插入物。
7.权利要求1的分离的经修饰的变体BBPI，其中所述经修饰的变体BBPI是作为融合蛋白表达的，所述融合蛋白包含选自纤维素酶、角质酶和二硫键异构酶的催化结构域。
8.权利要求1的分离的经修饰的变体BBPI，其中所述经修饰的变体BBPI由SEQ ID NO:595的氨基酸序列组成。
9.权利要求1的分离的经修饰的变体BBPI，其中所述取代选自组合25L-50T-52A、29P-50T-52A、40K-50T-52A。
10.权利要求1的分离的经修饰的变体BBPI，其中所述经修饰的变体BBPI由选自SEQ IDNOS:603、607和609的氨基酸序列组成。
11.权利要求1的分离的经修饰的变体BBPI，其中所述取代选自组合13I-25L-50T-52A,13I-29P-50T-52A,13I-40K-50T-52A,25L-29P-50T-52A,25L-40K-50T-52A和29P-40K-50T-52A。
12.权利要求11的分离的经修饰的变体BBPI，其中所述经修饰的变体BBPI由选自SEQID NO:596、600、602、604、606、608和643的氨基酸序列组成。
13.权利要求1的分离的经修饰的变体BBPI，其中所述取代选自组合13I-25L-29P-50T-52A,13I-25L-40K-50T-52A,A13I-29P-40K-50T-52A,25L-29P-40K-50T-52A,13I-29P-40K-50K-52A和13I-29P-40K-50T-52T。
14.权利要求13的分离的经修饰的变体BBPI，其中所述经修饰的变体BBPI由选自SEQID NOS:432、434、443、445、597、599、601、605、615、620、624和625的氨基酸序列组成。
15.权利要求1的分离的经修饰的变体BBPI，其中所述取代选自组合13I-25L-29P-40K-50T-52A,1C-13I-29P-40K-50T-52A,4V-13I-29P-40K-50T-52A,5P-13I-29P-40K-50T-52A,11G-13I-29P-40K-50T-52A,13I-25R-29P-40K-50T-52A,13I-27R-29P-40K-50T-52A,13I-29P-31A-40K-50T-52A,13I-29P-31R-40K-50T-52A,13I-29P-38N-40K-50T-52A,和13I-29P-40K-50T-52A-65E。
16.权利要求15的分离的经修饰的变体BBPI，其中所述经修饰的变体BBPI由选自SEQID NOS:598、611、612、613、614、616、619、621、622、623和626的氨基酸序列组成。
17.权利要求1的分离的经修饰的变体BBPI，其中所述取代选自组合13L-25R-29P-31A-40K-50T-52A,13L-25R-29P-31R-40K-50T-52A和13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T。
18.权利要求1的分离的经修饰的变体BBPI，其中所述经修饰的变体BBPI由选自SEQ IDNOS:491、617、618和632-639的氨基酸序列组成。
19.权利要求1的分离的经修饰的变体BBPI，其中所述取代选自组合13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T,13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q,13I-25K-27R-29E-31A-40H-50R-52K,13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L和13I-25K-27Q-29P-31E-40H-50R-52Q。
20.权利要求1的分离的经修饰的变体BBPI，其中所述经修饰的变体BBPI由选自SEQ IDNOS:627-631的氨基酸序列组成。
21.权利要求1的分离的经修饰的变体BBPI，其中所述经修饰的变体BBPI结合VEGF。
22.权利要求1的分离的经修饰的变体BBPI，其中所述VEGF结合肽选自SEQ ID NO:9、458、459、460、468、469、470、471、472和473。
23.权利要求1的分离的经修饰的变体BBPI，其中所述经修饰的变体BBPI是选自SEQ IDNO:601、602、627、628、630、631、643、491、632、633、634、635和636的VEGF-BBPI。
24.权利要求1的分离的经修饰的变体BBPI，其中所述分离的经修饰的变体抑制剂具有比相应的未经修饰的前体变体BBPI大的胰蛋白酶抑制活性。
25.权利要求1的分离的经修饰的变体BBPI，其中所述分离的经修饰的变体BBPI具有比相应的未经修饰的前体变体BBPI大的胰蛋白酶抑制活性和产量。
26.SEQ ID NO:187的分离的经修饰的变体BBPI，其中所述变体BBPI中的氨基酸取代选自
13Y、13I、13F、13M、13L、13V、13K、13R、
25K、25N、25W、25I、25A、25R、
27H、27K、27V、27A、27Q、
29R、29K、29P、
31Q、31H、31E、31A、31R、31W、31K、31T、
40H、40K、40Q、40R、40Y、
50R、50Q、50K、50T、50V、50M、50S、
52K、52T、52R、52Q、52L、52H、52A、52M、52S或52E；或者
F50T-V52A、
A50L-F50N、
A13I-S25L-F50T-V52A、
A13I-S25L-L29P-F50T-V52A、
A13I-S25L-L29P-A50K-F50T-V52A、
A13I-L29P-A50K-F50T-V52A、
A13I-L29P-F50T-V52A、
A13I-S25L-A50K-F50T-V52A、
A13I-A50K-F50T-V52A、
S25L-F50T-V52A、
S25L-L29P-F50T-V52A、
S25L-L29P-A50K-F50T-V52A、
S25L-A50K-F50T-V52A、
L29P-F50T-V52A、
L29P-A50K-F50T-V52A、
A50K-F50T-V52A、
A13I-L29P-F50T-V52A、
A13I-S25K-L29P-V52K、
A13L-L29P-A50K-F50T-V52A、
A13I-S25R-L29P-A50K-F50T-V52A、
A13I-S25R-L29P-S31A-A50K-F50T-V52A、
A13I-S25R-L29P-S31R-A50K-F50T-V52A、
A13I-M27R-L29P-A50K-F50T-V52A、
A13I-L29K-A50K-F50T-V52A、
A13I-L29P-S31A-A50K-F50T-V52A
A13I-L29P-S31R-A50K-F50T-V52A、
A13I-L29P-A50K-F50K-V52A、
A13I-L29P-A50K-F50T-V52T、
A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T、
A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-A50H-F50K-V52T、
A13I-S25K-M27A-L29R-S31E-A50K-F50Q-V52Q、
A13I-S25K-M27R-L29E-S31A-A50H-F50R-V52K、
A13I-S25K-M27A-L29R-S31A-A50H-F50R-V52L、
A13I-S25K-M27Q-L29P-S31E-A50H-F50R-V52Q，或
A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T；
其中所述的氨基酸位置选自等价于SEQ ID NO:187的13、25、27、29、31、40、50和52位的位置；
并且其中所述BBPI的VEGF变体肽被选自FGF-5、TGFβ和TNFα的与靶蛋白结合的变体肽取代。
27.权利要求26的分离的经修饰的变体BBPI，其中所述变体肽是选自SEQ ID NO:430、431、670和671的FGF5结合肽。
28.权利要求26的分离的经修饰的变体BBPI，其中所述结合肽是选自SEQ ID NO:436、437、438、672、673和674的TGFβ结合肽。
29.权利要求26的分离的经修饰的变体BBPI，其中所述结合肽是选自SEQ ID NO:474、475和476的TNFα结合肽。
30.权利要26的分离的经修饰的变体BBPI，其中所述经修饰的变体BBPI具有比相应的未经修饰的前体BBPI大的胰蛋白酶抑制活性和产量。
31.权利要求26的分离的经修饰的变体BBPI，其中所述变体Bowman Birk抑制剂选自SEQ ID NO:432、434、443、445、447、637、638和639。
32.编码BBPI融合蛋白的分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码酶的催化单元的第一多核苷酸序列，和编码权利要求1-31中任一项的分离的经修饰的变体BBPI的第二多核苷酸序列。
33.权利要求32的分离的多核苷酸，其中所述第一序列编码纤维素酶的催化单元。
34.在细菌细胞中生产经修饰的变体BBPI的方法，所述方法包括：
a)突变编码变体BBPI的多核苷酸，产生编码经修饰的变体BBPI的多核苷酸构建体，所述经修饰的变体BBPI为权利要求1-31中任一项所述的经修饰的变体BBPI；
b)将所述多核苷酸构建体导入细菌宿主细胞中；
c)在合适的培养条件下培养所述细菌细胞，使得所述多核苷酸表达；和
d)生产所述经修饰的变体BBPI，其中所述经修饰的变体BBPI具有比相应的未经修饰的前体变体BBPI大的胰蛋白酶抑制活性；
其中所述经修饰的变体BBPI的第二蛋白酶抑制环是靶蛋白结合肽，选自VEGF结合肽、FGF-5结合肽、TGFβ结合肽和TNFα结合肽。
35.权利要求34的方法，其中所述经修饰的变体BBPI具有比相应的未经修饰的前体变体BBPI大的胰蛋白酶抑制活性和产量。
36.权利要求34的方法，还包括回收所述经修饰的变体BBPI。
37.权利要求34的方法，还包括激活所述经修饰的变体BBPI。
38.权利要求34的方法，其中所述经修饰的变体BBPI中的氨基酸取代选自组合(3)25L-50T-52A，29P-50T-52A,40K-50T-52A,(4)13I-25L-50T-52A,13I-29P-50T-52A,13I-A0K-50T-52A,25L-29P-50T-52A,25L-40K-50T-52A,和29P-40K-50T-52A,(5)13I-25L-29P-50T-52A,13I-25L-40K-50T-52A,25L-29P-40K-50T-52A,13L-29P-40K-50T-52A,13I-29P-40K-50K-52A,和13L-29P-40K-50T-52T,(6)13I-25L-29P-40K-50T-52A,1C-13I-29P-40K-50T-52A,4V-13I-29P-40K-50T-52A,5P-13I-29P-40K-50T-52A,11G-13I-29P-40K-50T-52A,13I-25R-29P-40K-50T-52A,13I-27R-29P-40K-50T-52A,13I-29P-31A-40K-50T-52A,13I-29P-31R-40K-50T-52A,13I-29P-38N-40K-50T-52A,13I-29P-40K-50T-52A-65E,(7)13L-25R-29P-31A-40K-50T-52A,和13L-25R-29P-31R-40K-50T-52A,(8)13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T,13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q,13I-25K-27R-29E-31A-40H-50R-52K,13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L,13I-25K-27Q-29P-31E-40H-50R-52Q。
39.表达载体，其包含编码权利要求1-31中任一项的经修饰的变体BBPI的多核苷酸序列。
40.权利要求39的表达载体，其中所述经修饰的变体BBPI是作为与SEQ ID NO:195的多肽具有至少80％同一性的融合蛋白表达的。
41.用权利要求39或40的载体转化的宿主细胞。
42.权利要求41的宿主细胞，其中所述宿主细胞是芽孢杆菌属的宿主细胞。
43.包含经修饰的变体BBPI的个人护理组合物，其中所述经修饰的变体BBPI为权利要求1-31中任一项所述的经修饰的变体BBPI。
44.权利要求43的个人护理组合物，其中所述经修饰的变体BBPI中的氨基酸取代的组合选自50T-52A,25L-50T-52A,29P-50T-52A,40K-50T-52A,13I-25L-50T-52A,13I-29P-50T-52A,13I-40K-50T-52A,25L-29P-50T-52A,25L-40K-50T-52A,29P-40K-50T-52A,13I-25K-29P-52K,13I-25L-29P-50T-52A,13I-29P-40K-50T-52A,13I-25L-40K-50T-52A,25L-29P-40K-50T-52A,13L-29P-40K-50T-52A,13I-29K-40K-50T-52A,13I-29P-40K-50K-52A,13I-29P-40K-50T-52A,13I-25L-29P-40K-50T-52A,D1C-13I-29P-40K-50T-52A,S4V-13I-29P-40K-50T-52A,S5P-13I-29P-40K-50T-52A,11G-13I-29P-40K-50T-52A,13I-25R-29P-40K-50T-52A,13I-27R-29P-40K-50T-52A,13I-29P-31A-40K-50T-52A,13I-29P-31R-40K-50T-52A,13I-29P-38N-40K-50T-52A,13I-29P-40K-50T-52A-65E,13L-25R-29P-31A-40K-50T-52A,13L-25R-29P-31R-40K-50T-52A,13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T,13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T,13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q,13I-25K-27R-29E-31A-40H-50R-52K,13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L,和13I-25K-27Q-29P-31E-40H-50R-52Q。
45.权利要求43或44的个人护理组合物，其中所述经修饰的变体BBPI结合靶蛋白，其选自VEGF、FGF5、TGFβ和TNFα。
46.权利要求43或44的个人护理组合物，其中所述经修饰的变体BBPI占所述个人护理组合物的从约0.0001重量百分比至约5重量百分比。
47.权利要求43或44的个人护理组合物，其中所述分离的经修饰的变体抑制剂具有比所述BBPI的相应未经修饰的前体变体抑制剂大的胰蛋白酶抑制活性和产量。
48.权利要求45的个人护理组合物，其中所述结合肽是选自SEQ ID NO:9、458、459、460、468、469、470、471、472和473的VEGF结合肽。
49.权利要求48的个人护理组合物，其中所述经修饰的变体BBPI中氨基酸取代的组合选自13I-40K-50T-52A,13I-25K-29P-52K,13I-29P-40K-50T-52A,13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T,13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T, 13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q,13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L。
50.权利要求43的个人护理组合物，其中所述经修饰的变体BBPI是选自SEQ ID NOS:601、602、627、628、630、631、643、491、632、633、634、635和636的VEGF结合BBPI(VEGF-BBPI)。
51.权利要求43、44和48-50的任一项的个人护理组合物，其中所述个人护理组合物是皮肤护理组合物，所述皮肤护理组合物选自皮肤乳膏、喷雾、泡沫、气溶胶、液体、凝胶、和固体。
52.权利要求43、44和48-50的任一项的个人护理组合物，其中所述个人护理组合物是皮肤护理组合物，其选自化妆水、乳状液、胶体悬浮液和乳浆。
53.权利要求43、44和48-50的任一项的个人护理组合物，其中所述个人护理组合物是皮肤护理组合物，所述皮肤护理组合物选自身体洗液、抗菌清洁剂、皮肤保护性乳膏、爽身水、面霜、润肤霜膏、面部清洁乳状液、面部凝胶、面部乳浆、基于表面活性剂的面部清洁剂、面部去角质凝胶、抗痤疮治疗剂、面部色粉、去角质乳膏、面膜、须后膏、须前膏、晒黑组合物、防晒剂、脱毛剂、毛发生长抑制剂和防辐射剂。
54.权利要求43、44和48-50的任一项的个人护理组合物，其中所述个人护理组合物是皮肤护理组合物，其为身体保湿洗液。
55.权利要求53的个人护理组合物，其中所述皮肤护理组合物还包括局部施用的非处方组合物、抗真菌治疗剂、抗痤疮治疗剂、皮肤防护制品、防晒剂、除臭剂和止汗剂。
56.权利要求53的个人护理组合物，其中所述防辐射剂是选自不防水型防晒剂、高防水型防晒剂和硅酮包水型防晒剂的防晒剂。
57.权利要求43、44和48-50的任一项的个人护理组合物，其中所述个人护理组合物是选自粉饼配方和粉底化妆品的化妆品组合物。
58.权利要求57的个人护理组合物，其中所述化妆品组合物包含至少一种色素。
59.权利要求57的个人护理组合物，其中所述化妆品组合物是选自散粉、腮红和修容粉饼的粉饼配方。
60.权利要求57的个人护理组合物，其中所述化妆品组合物是选自油包水型粉底化妆品、水包油型粉底化妆品、无水化妆棒和粉霜粉底化妆品的粉底化妆品。
61.权利要求57的个人护理组合物，其中所述化妆品组合物是粉底化妆品，其为硅酮包水型粉底化妆品。
62.权利要求43、44和48-50的任一项的个人护理组合物，其中所述个人护理组合物是用于治疗血管源性皮肤病的皮肤护理组合物。
63.权利要求43、44和48-50的任一项的个人护理组合物，其中所述个人护理组合物是用于改善患皮肤病的受试者的皮肤的外观和/或条件的皮肤护理组合物，所述皮肤病选自牛皮癣、硬皮病、静脉溃疡、痤疮、酒糟鼻、疣、湿疹、血管瘤和淋巴管生成。
64.权利要求43、44和48-50的任一项的个人护理组合物，其中所述个人护理组合物是毛发护理组合物。
65.权利要求64的个人护理组合物，其中所述毛发护理组合物选自液体、泡沫和固体。
66.权利要求64的个人护理组合物，其中所述毛发护理组合物选自香波、护发素、头发定型组合物、染发剂、长效卷发配方、发膏、凝胶、摩丝、喷雾、乳状液、和胶体悬浮液。
67.权利要求64的个人护理组合物，其中所述毛发护理组合物还包含防辐射剂。
68.权利要求67的个人护理组合物，其中所述防辐射剂是选自不防水型防晒剂、高防水型防晒剂和硅酮包水型防晒剂的防晒剂。
69.权利要求64的个人护理组合物，其中所述个人护理组合物能够防止毛发生长。
70.权利要求45的个人护理组合物，其中所述变体肽是选自SEQ ID NO:430和431的FGF变体肽。
71.权利要求70的个人护理组合物，其中所述支架是SEQ ID NO:187的BBIt-AV。
72.权利要求70的个人护理组合物，其中所述经修饰的变体BBPI中的氨基酸取代的组合选自：
13I-40K-50T-52A,13I-25K-29P-52K,13I-29P-40K-50T-52A,13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T,13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T,13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q,13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L。
73.权利要求43的个人护理组合物，其中所述经修饰的变体BBPI是选自SEQ ID NO:432和434的FGF-结合BBPI(FGF-BBPI)。
74.权利要求43-44和70-73的任一项的个人护理组合物，其中所述个人护理组合物是毛发护理组合物。
75.权利要求74的个人护理组合物，其中所述毛发护理组合物选自液体、泡沫和固体。
76.权利要求74的个人护理组合物，其中所述毛发护理组合物选自香波、护发素、头发定型组合物、染发剂、长效卷发配方、发膏、凝胶、摩丝、喷雾、乳状液、和胶体悬浮液。
77.权利要求74的个人护理组合物，其中所述毛发护理组合物还包含防辐射剂。
78.权利要求77的个人护理组合物，其中所述防辐射剂是选自不防水型防晒剂、高防水型防晒剂和硅酮包水型防晒剂的防晒剂。
79.权利要求74的个人护理组合物，其中所述个人护理组合物能够促进毛发生长。
80.权利要求45的个人护理组合物，其中所述变体肽是选自SEQ ID NO:436、437、438、672、673和674的TGF变体肽。
81.权利要求80的个人护理组合物，其中所述支架是SEQ ID NO:187的BBIt-AV。
82.权利要求80的个人护理组合物，其中所述经修饰的变体BBPI中氨基酸取代的组合选自
13I-40K-50T-52A,13I-25K-29P-52K,13I-29P-40K-50T-52A,13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T,13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T,13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q,13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L。
83.权利要求43的个人护理组合物，其中所述经修饰的变体BBPI是选自SEQ ID NO:443、445和447的TGF结合BBPI(TGF-BBPI)。
84.权利要求43-44和80-83的任一项的个人护理组合物，其中所述个人护理组合物是毛发护理或皮肤护理组合物。
85.权利要求84的个人护理组合物，其中所述毛发护理或皮肤护理组合物选自液体、泡沫和固体。
86.权利要求84的个人护理组合物，其中所述毛发护理或皮肤护理组合物选自香波、护发素、头发定型组合物、染发剂、长效卷发配方、发膏、凝胶、摩丝、喷雾、乳状液、和胶体悬浮液。
87.权利要求84的个人护理组合物，其中所述个人护理组合物是皮肤护理组合物，选自身体保湿洗液、身体洗液、抗菌清洁剂、皮肤保护性乳膏、爽身水、面霜、润肤霜膏、面部清洁乳状液、面部凝胶、面部乳浆、基于表面活性剂的面部清洁剂、面部去角质凝胶、抗痤疮治疗剂、面部色粉、去角质乳膏、面膜、须后膏、须前膏、晒黑组合物、防晒剂和防辐射剂。
88.权利要求84的个人护理组合物，其中所述皮肤护理组合物还包括局部施用的非处方组合物、抗真菌治疗剂、抗痤疮治疗剂、皮肤防护制品、防晒剂、除臭剂和止汗剂。
89.权利要求87的个人护理组合物，其中所述防辐射剂是选自不防水型防晒剂、高防水型防晒剂和硅酮包水型防晒剂的防晒剂。
90.权利要求43-44和80-83的任一项的个人护理组合物，其中所述个人护理组合物是化妆品组合物。
91.权利要求90的个人护理组合物，其中所述化妆品组合物选自睫毛油、眼线膏、粉饼配方和粉底化妆品。
92.权利要求84的个人护理组合物，其中所述毛发护理组合物还包含防辐射剂。
93.权利要求92的个人护理组合物，其中所述防辐射剂是选自不防水型防晒剂、高防水型防晒剂和硅酮包水型防晒剂的防晒剂。
94.权利要求84的个人护理组合物，其中所述个人护理组合物能够促进毛发生长。
95.权利要求45的个人护理组合物，其中所述变体肽是选自SEQ ID NO:474、475和476的TNF变体肽。
96.权利要求95的个人护理组合物，其中所述支架是SEQ IDNO:187的BBIt-AV。
97.权利要求95的个人护理组合物，其中所述经修饰的变体BBPI中氨基酸取代的组合选自
13I-40K-50T-52A,13I-25K-29P-52K,13I-29P-40K-50T-52A,13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T,13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T,13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q,13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L。
98.权利要求43的个人护理组合物，其中所述经修饰的变体BBPI是选自SEQ ID NO:637、638和639的TNF-BBPI。
99.权利要求43-44和95-98的任一项的个人护理组合物，其中所述个人护理组合物是毛发护理组合物。
100.权利要求99的个人护理组合物，其中所述毛发护理组合物能够促进患牛皮癣的受试者的毛发生长。
101.权利要求99的个人护理组合物，其中所述毛发护理组合物选自液体、泡沫和固体。
102.权利要求99的个人护理组合物，其中所述毛发护理组合物选自香波、护发素、头发定型组合物、染发剂、长效卷发配方、发膏、凝胶、摩丝、喷雾、乳状液和胶体悬浮液。
103.权利要求101或102的个人护理组合物，其中所述毛发护理组合物还包含防辐射剂。
104.权利要求103的个人护理组合物，其中所述防辐射剂选自不防水型防晒剂、高防水型防晒剂和硅酮包水型防晒剂的防晒剂。
105.权利要求99的个人护理组合物，其中所述个人护理组合物能够促进毛发生长。
106.权利要求43-44和95-98的任一项的个人护理组合物，其中所述个人护理组合物是皮肤护理组合物。
107.权利要求106的个人护理组合物，其中所述皮肤护理组合物能够改善患牛皮癣或硬皮病的受试者的皮肤外观和/或条件。
108.权利要求106的个人护理组合物，其中所述个人护理组合物是皮肤护理组合物，所述皮肤护理组合物选自皮肤乳膏、喷雾、泡沫、气溶胶、液体、凝胶、和固体。
109.权利要求106的个人护理组合物，其中所述个人护理组合物是皮肤护理组合物，所述皮肤护理组合物选自化妆水、乳状液、胶体悬浮液和乳浆。
110.权利要求106的个人护理组合物，其中所述个人护理组合物是皮肤护理组合物，选自身体洗液、抗菌清洁剂、皮肤保护性乳膏、爽身水、面霜、润肤霜膏、面部清洁乳状液、面部凝胶、面部乳浆、基于表面活性剂的面部清洁剂、面部去角质凝胶、抗痤疮治疗剂、面部色粉、去角质乳膏、面膜、须后膏、须前膏、晒黑组合物、皮肤增白组合物、降低皮肤潮红的组合物、防晒剂、脱毛剂和防辐射剂。
111.权利要求106的个人护理组合物，其中所述个人护理组合物是皮肤护理组合物，其为身体保湿洗液。
112.权利要求108或109的个人护理组合物，其中所述皮肤护理组合物还包含局部施用的非处方组合物、抗真菌治疗剂、抗痤疮治疗剂、皮肤防护制品、防晒剂、除臭剂和止汗剂。
113.权利要求43-44和95-98的任一项的个人护理组合物，其中所述个人护理组合物是化妆品组合物。
114.权利要求113的个人护理组合物，其中所述化妆品组合物选自睫毛油、眼线膏、粉饼配方和粉底化妆品。
115.权利要求114的个人护理组合物，其中所述化妆品组合物包含至少一种色素。
116.权利要求115的任一项的个人护理组合物，其中所述包含至少一种色素的化妆品组合物是睫毛油，所述睫毛油选自非防水型睫毛油、防水型睫毛油、浓密型睫毛油、加长型睫毛油、卷翘睫毛油、无水的防水型睫毛油、基于水型睫毛油和睫毛或眉毛处理剂。
117.权利要求115的个人护理组合物，其中所述化妆品组合物是粉饼配方，所述粉饼配方选自散粉、腮红、眼影和修容粉饼。
118.权利要求115的个人护理组合物，其中所述化妆品组合物是选自油包水型粉底化妆品、硅酮包水型粉底化妆品、水包油型粉底化妆品、无水化妆棒和粉霜粉底化妆品的粉底化妆品。
119.权利要求43-50中的任一项的个人护理组合物在制备用于抑制受试者的毛发生长的组合物中的用途，其中将所述组合物施于所述受试者的需要抑制毛发生长的区域。
120.权利要求119的用途，其中生长待被抑制的毛发选自面部毛发、腋下毛发、腿部毛发、躯干毛发、手臂毛发和头发。
121.权利要求119的用途，其中所述个人护理组合物包含VEGF-BBPI，选自SEQ ID NO:601、602、627、628、630、631、643、491、632、633、634、635和636。
122.权利要求43-50中的任一项的个人护理组合物在制备用于改善患血管源性皮肤病的受试者的皮肤的外观和/或条件的组合物中的用途，其中所述组合物被施用给所述受试者的皮肤。
123.权利要求122的用途，其中所述血管源性皮肤病选自牛皮癣、硬皮病、静脉溃疡、痤疮、酒糟鼻、疣、湿疹、血管瘤和淋巴管生成。
124.权利要求122的用途，其中所述个人护理组合物包含选自SEQ ID NO:601、602、627、628、630、631、643、491、632、633、634、635和636的VEGF-BBI。
125.权利要求43-47和70-73的任一项的个人护理组合物在制备促进受试者的毛发生长的组合物中的用途，其中将所述组合物施于所述受试者的需要促进毛发生长的区域。
126.权利要求125的用途，其中生长待被促进的毛发选自面部毛发、腋下毛发、腿部毛发、躯干毛发、手臂毛发和头发。
127.权利要求125的用途，其中所述受试者患有涉及毛发丢失的适应症。
128.权利要求125的用途，其中所述适应症选自炎性脱发、假性斑秃、硬皮病、蜱叮咬、扁平苔癣、牛皮癣、狼疮、脂溢性皮炎、头发松散综合症、血色素沉着、雄激素性脱发和斑秃。
129.权利要求125的用途，其中所述个人护理组合物包含选自SEQ ID NO:432和434的FGF-结合肽(FGF-BBPI)。
130.权利要求43-47和80-83的任一项的个人护理组合物在制备用于促进受试者的毛发生长的组合物中的用途，其中将所述组合物施于所述受试者的需要促进毛发生长的区域。
131.权利要求130的用途，其中生长待被促进的毛发选自面部毛发、腋下毛发、腿部毛发、躯干毛发、手臂毛发和头发。
132.权利要求130的用途，其中所述受试者患有涉及毛发丢失的适应症。
133.权利要求130的用途，其中所述适应症选自炎性脱发、假性斑秃、硬皮病、蜱叮咬、扁平苔癣、牛皮癣、狼疮、脂溢性皮炎、头发松散综合症、血色素沉着、雄激素性脱发和斑秃。
134.权利要求130的用途，其中所述个人护理组合物包含选自SEQ ID NO:443、445和447的经修饰的变体TGF-BBPI。
135.权利要求43-47和80-83的任一项的个人护理组合物在制备用于改善患皮肤病的受试者的皮肤外观和/或条件的组合物中的用途，其中将所述组合物施于所述受试者的皮肤。
136.权利要求135的用途，其中所述皮肤病选自牛皮癣、硬皮病和皮肤癌。
137.权利要求135的用途，其中所述个人护理组合物包含选自经修饰的变体TGF-BBPI的TGF-BBPI，所述变体TGF-BBPI选自SEQ ID NO:443、445和447。
138.权利要求43-44和95-98的任一项的个人护理组合物在制备用于促进患牛皮癣的受试者的毛发生长的组合物中的用途，其中将所述组合物施于所述受试者的需要促进毛发生长的区域。
139.权利要求138的用途，其中待促进的毛发的生长选自面部毛发、腋下毛发、腿部毛发、躯干毛发、手臂毛发和头发。
140.权利要求138的用途，其中所述个人护理组合物包含选自SEQ ID NO:637、638和639的经修饰的TNF-BBPI。
141.权利要求43-44和95-98的任一项的个人护理组合物在制备用于改善患牛皮癣的受试者的皮肤的外观和/或条件的组合物中的用途，其中将所述组合物施于所述受试者的皮肤。
142.权利要求141的用途，其中所述个人护理组合物包含选自SEQ ID NO:637、638和639的经修饰的TNF-BBPI。
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