KR20110084504A - 개질된 변이체 바우만 버크 프로테아제 저해제 - Google Patents

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KR20110084504A KR1020117008660A KR20117008660A KR20110084504A KR 20110084504 A KR20110084504 A KR 20110084504A KR 1020117008660 A KR1020117008660 A KR 1020117008660A KR 20117008660 A KR20117008660 A KR 20117008660A KR 20110084504 A KR20110084504 A KR 20110084504A
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브라이언 폭스
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다니스코 유에스 인크.
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Abstract

본 발명은 표적 단백질에 결합하는 펩티드를 포함하며, 비개질 BBPI (바우만 버크 프로테아제 저해제) 보다 더 큰 프로테아제 저해 활성을 갖고/갖거나 더 큰 수율로 생성되도록 추가로 개질된 개질 변이체 바우만 버크 프로테아제 저해제 단백질 (BBPI) 에 관한 것이다. 본 발명은 개질 변이체 BBPI 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터 및 폴리뉴클레오티드 구성물, 개질 변이체 BBPI 를 발현 및 생성하는 형질전환된 숙주 세포, 개질 변이체 BBPI 단백질, 개질 변이체 BBPI 를 포함하는 조성물, 및 개인 케어에서 개질 변이체 BBPI 를 생성하고 사용하는 방법을 포함한다.

Description

개질된 변이체 바우만 버크 프로테아제 저해제 {MODIFIED VARIANT BOWMAN BIRK PROTEASE INHIBITORS}
본 발명은 표적 단백질에 결합하는 펩티드를 포함하며, 비개질 BBPI (바우만 버크 프로테아제 저해제) 보다 더 큰 프로테아제 저해 활성을 갖고/갖거나 더 큰 수율로 생성되도록 추가로 개질된 개질 변이체 바우만 버크 프로테아제 저해제 단백질 (BBPI) 에 관한 것이다. 본 발명은 개질 변이체 BBPI 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터 및 폴리뉴클레오티드 구성물, 개질 변이체 BBPI 를 발현 및 생성하는 형질전환된 숙주 세포, 개질 변이체 BBPI 단백질, 개질 변이체 BBPI 를 포함하는 조성물, 및 개인 케어에서 개질 변이체 BBPI 를 생성하고 사용하는 방법을 포함한다.
프로테아제는 광범위한 생물학적 과정에 포함된다. 프로테아제와 프로테아제 저해제 사이 균형의 붕괴는 종종 병리학적 조직 파괴와 관련된다.
다양한 연구가 조직 상해에서의 프로테아제의 역할에 초점을 맞추어왔으며, 조직 무결성을 유지하는데 있어서 프로테이나아제와 프로테이나아제 저해제 사이 균형이 주요한 결정인자라고 여겨진다. 호중구를 포함하는 염증 세포로부터의 세린 프로테이나아제는 폐기종, 관절염, 아토피염 및 건선과 같은 다양한 염증 장애에 관련된다. 이러한 상태 및 기타 염증 상태는 종종 비조절된 수준의 사이토카인과 관련된다.
프로테아제는 또한 혈관 기저막을 파괴하며 세포외 매트릭스의 리모델링에 참여하여, 종양 혈관신생이 촉진되도록 세포 이동 및 침습을 용이하게 한다. 프로테아제는 세포외 매트릭스에 결합하는 혈관 신생 성장 인자를 방출하며, 그 다음으로 화학주성 및 분열촉진을 부여하는 세포외 매트릭스 성분 유래인 화학주성적으로 활성인 절편을 생성하고, 내피 세포, 평활근 및 섬유모세포를 조절적으로 활성화시켜 혈관신생 과정에 참여하게 한다. 생체내 혈관신생적으로 활성인 단백질 인자의 목록은 섬유모세포 성장 인자, 안지오제닌 (Angiogenin), 안지오포이에틴 (Angiopoietin)-1, EGF, HGF, NPY, VEGF, TNF-알파, TGF-베타, PD-ECGF, PDGF, IGF, IL8, 및 성장 호르몬을 포함한다. 현재의 사이토카인 차단제와 관련된 위험성은 심각한 감염, 아나필랙시스 및 루푸스성 증후군을 포함한다. 또한, 약물이 중지된 후 임상적 이익의 손실이 관찰되었고, 소비율의 환자에서 생물학적 작용제에 대한 항체가 발달되어, 반복 사용으로 이의 효능이 제한되는 것으로 보인다.
합성 및 천연 프로테아제 저해제는 생체내 및 시험관내에서 종양 촉진을 저해하는 것으로 나타났다. 이전의 연구 조사는 세린 프로테아제 저해제 또는 SERPINS 로 분류된 구조적으로 연관된 단백질 부류에 속하는 특정 프로테아제 저해제가 트립신, 카텝신 G, 트롬빈, 조직 칼리크레인 뿐 아니라 호중구 엘라스타아제를 포함하는 여러 프로테아제를 저해하는 것으로 알려진다는 것을 나타내었다. SERPINS 는 시험관내 발암 물질-유도 형질전환 및 동물 모델 시스템에서의 발암을 방지/억제하는데 있어서 지극히 효과적이다. 정제된 프로테아제 저해제의 전신 전달은 관절 염증 및 연골 및 골 파괴를 또한 감소시킨다.
프로테아제 저해제의 국소 투여는, 적은 면적으로 국지화될 수 있거나 신체의 큰 부분을 포함할 수 있는, 피부 염증의 통상적 형태인 아토피염과 같은 상태에서 사용된다. 프로테아제 저해제의 탈색 활성 및 자외선-유도 착색을 방지하는 이의 능력은 시험관내 및 생체내에서 모두 입증된 바 있다. Paine et al., Journal of Investigative Dermatology 116:587-595 [2001]. 또한, 프로테아제 저해제는 상처 치료를 돕는 것으로 나타난 바 있다 (http://www.sciencedaily.com/releases/2000/10/001002071718.htm). 분비 백혈구 프로테아제 저해제는 조직 파괴를 역전시키고 국소 적용시 상처 치료 과정을 가속화시키는 것으로 입증되었다. 추가로, 세린 프로테아제 저해제는 또한 홍반성 루푸스 환자에서의 통증을 감소시키는 것을 도울 수 있다 (미국 특허 제 6537968 호 참조).
자연 발생적 프로테아제 저해제는 시리얼 곡류 (귀리, 보리 및 옥수수), 양배추 (Brussels sprout), 양파, 비트 뿌리, 밀, 핑거 밀레 (finger millet) 및 땅콩과 같은 다양한 식품에서 발견될 수 있다. 한 관심원은 콩이다. 콩의 평균 수준은, 가장 중요한 프로테아제 저해제 중 두 개인 쿠니츠 (Kunitz) 및 바우만-버크 (Bowman-Birk) 에 대해 각각 약 1.4% 및 0.6% 이다. 이러한 낮은 수준은 임상적 적용을 위해 천연 프로테아제 저해제를 단리하기에 비실용적이 되도록 한다.
따라서, 단백질 치료법의 원하는 특징을 갖는 다량의 프로테아제 저해제를 생성하는 방법, 및 사용가능한 형태로 프로테아제 저해제를 효과적으로 전달하는 조성물이 필요하다.
본 발명에 따른 조성물 및 방법은 상기 필요성의 일부를 만족시키며, 특히 병리학적 및 비-병리학적 과정에 포함되는 사이토카인의 활성을 특이적으로 표적화하는 프로테아제 저해제를 제공하는데 있어서 이점을 제공한다.
발명의 요약
본 발명은 표적 단백질에 결합하는 펩티드를 포함하며, 비개질 BBPI (바우만 버크 프로테아제 저해제) 보다 더 큰 프로테아제 저해 활성을 갖고/갖거나 더 큰 수율로 생성되도록 추가로 개질된 개질 변이체 바우만 버크 프로테아제 저해제 단백질 (BBPI) 에 관한 것이다. 본 발명은 개질 변이체 BBPI 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터 및 폴리뉴클레오티드 구성물, 개질 변이체 BBPI 를 발현 및 생성하는 형질전환된 숙주 세포, 개질 변이체 BBPI 단백질, 개질 변이체 BBPI 를 포함하는 조성물, 및 개인 케어에서 개질 변이체 BBPI 를 생성하고 사용하는 방법을 포함한다.
한 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:187 의 변이체 BBPI 의 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 및 65 와 동등한 위치에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서 치환된 아미노산을 포함하며, BBPI 스캐폴드의 제 2 프로테아제 저해 루프가 결합 펩티드인, 단리된 개질 변이체 바우만 버크 프로테아제 저해제 (BBPI) 를 제공한다. 한 구현예에서, BBPI 스캐폴드는 하기의 스캐폴드에서 선택된다: BBI (SEQ ID NO:13), BBIt (SEQ ID NO:185), BBI-AV (SEQ ID NO:186), BBIt-AV (SEQ ID NO:187), BBIt-VEGK (SEQ ID NO:640), BBIt-VEGT (SEQ ID NO:641), BBIt-VEGKD (SEQ ID NO:642), BBdb (SEQ ID NO:449), BBsb3 (SEQ ID NO:450), BBtc (SEQ ID NO:451), BBdb-AV (SEQ ID NO:452), BBsb3-AV (SEQ ID NO:453) 및 BBtc-AV (SEQ ID NO:454). 또 다른 구현예에서, 결합 펩티드는 VEGF 결합 펩티드, FGF-5 결합 펩티드, TGFβ 결합 펩티드 및 TNFα 결합 펩티드에서 선택된다. 그 다음으로 VEGF-결합 펩티드는 하기에서 선택된다:
Figure pct00001
그 다음으로 FGF-5-결합 펩티드는 하기에서 선택된다:
Figure pct00002
그 다음으로 TGFβ 결합 펩티드는 하기에서 선택된다:
Figure pct00003
그 다음으로 TNFα 결합 펩티드는 하기에서 선택된다:
Figure pct00004
한 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:187 의 변이체 BBPI 의 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 및 65 와 동등한 위치에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서 치환된 아미노산을 포함하며, BBPI 스캐폴드의 제 2 프로테아제 저해 루프가 결합 펩티드인, 단리된 개질 변이체 바우만 버크 프로테아제 저해제 (BBPI) 를 제공한다. 일부 구현예에서, 위치 1 에서 치환된 아미노산은 1A 및 1C 에서 선택된다. 다른 구현예에서, 위치 4 에서 치환된 아미노산은 4V 이다. 다른 구현예에서, 위치 5 에서 치환된 아미노산은 P 및 A 에서 선택된다. 다른 구현예에서, 위치 13 에서 치환된 아미노산은 13Y, 13I, 13F, 13M, 13L, 13V, 13K 및 13R 에서 선택된다. 다른 구현예에서, 위치 18 에서 치환된 아미노산은 18I 및 18V 및 18L 에서 선택된다. 다른 구현예에서, 위치 25 에서 치환된 아미노산은 25K, 25N, 25W, 25I, 25A 및 25R 에서 선택된다. 다른 구현예에서, 위치 27 에서 치환된 아미노산은 27H, 27K, 27V, 27A 및 27Q 에서 선택된다. 다른 구현예에서, 위치에서 아미노산이 치환된다. 다른 구현에에서, 위치 29 에서 치환된 아미노산은 29R, 29K 및 29P 에서 선택된다. 다른 구현예에서, 위치 31 에서 치환된 아미노산은 31Q, 31H, 31E, 31A, 31R, 31W, 31K 및 31T 에서 선택된다. 다른 구현예에서, 위치 38 에서 치환된 아미노산은 38N, 38K 및 38R 에서 선택된다. 다른 구현예에서, 위치 40 에서 치환된 아미노산은 40H, 40K, 40Q, 40R 및 40Y 에서 선택된다. 다른 구현예에서, 위치 50 에서 치환된 아미노산은 50R, 50Q, 50K, 50T, 50V, 50M 및 50S 에서 선택된다. 다른 구현예에서, 위치에서 아미노산이 치환된다. 다른 구현예에서, 위치 52 에서 치환된 아미노산은 52K, 52T, 52R, 52Q, 52L, 52H, 52A, 52M, 52S 및 52E 에서 선택된다. 다른 구현예에서, 위치 55 에서 치환된 아미노산은 55M 이다. 다른 구현예에서, 위치 65 에서 치환된 아미노산은 65E, 65Q 및 65D 에서 선택된다.
다른 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:389 의 삽입물, SEQ ID NO:187 의 변이체 BBPI 의 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 및 65 와 동등한 위치에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서 치환된 아미노산을 포함하며, BBPI 스캐폴드의 제 2 프로테아제 저해 루프가 결합 펩티드인, 단리된 개질 변이체 바우만 버크 프로테아제 저해제 (BBPI) 를 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 기재된 개질 변이체 BBPI 중 임의 하나는 셀룰라아제, 큐티나아제 및 디술피드 이소머라아제에서 선택되는 촉매적 도메인을 포함하는 융합 단백질로서 발현된다. 대안적 구현예에서, 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:195 의 융합 단백질로서 발현된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:187 의 변이체 BBPI 의 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 및 65 와 동등한 위치에서 선택되는 2 개 이상, 3 개 이상, 4 개 이상, 5 개 이상, 6 개 이상, 7 개 이상 및 8 개 이상의 아미노산 치환의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:187 의 위치 50 및 52 와 동등한 아미노산 위치에서의 2 개 이상의 아미노산 치환의 조합을 포함한다. 위치 50 및 52 에서의 두 아미노산 치환의 조합을 포함하는 개질 변이체 BBPI 의 예는 SEQ ID NO:595 의 개질 변이체 BBPI 이다. 다른 구현예에서, 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:187 의 위치 25, 29, 40, 50 및 52 와 동등한 아미노산 위치에서의 2 개 이상의 아미노산 치환의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 3 개 이상의 아미노산의 조합은 조합 25L-50T-52A, 29P-50T-52A, 40K-50T-52A 에서 선택된다. 위치 25, 29, 40, 50 및 52 에서 선택되는 3 개 아미노산 치환의 조합을 포함하는 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:603, 607 및 609 의 개질 변이체 BBPI 이다. 다른 구현예에서, 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:187 의 위치 13, 29, 50 및 52 와 동등한 위치에서의 아미노산 치환에서 선택되는 4 개 이상의 아미노산 치환의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 4 개 이상의 아미노산의 조합은 조합 13I-25L-50T-52A, 13I-29P-50T-52A, 13I-A0K-50T-52A, 25L-29P-50T-52A, 25L-40K-50T-52A 및 29P-40K-50T-52A 에서 선택된다. 위치 13, 29, 50 및 52 에서 선택되는 4 개 아미노산 치환의 조합을 포함하는 개질 변이체 BBPI 의 예는 SEQ ID NO:596, 600, 602, 604, 606, 608 및 643 의 개질 변이체 BBPI 이다. 다른 구현예에서, 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:187 의 위치 13, 25, 29, 40, 50 및 52 와 동등한 위치에서의 아미노산 치환에서 선택되는 5 개 이상의 아미노산 치환의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 5 개 이상의 아미노산의 조합은 조합 13I-25L-29P-50T-52A, 13I-25L-40K-50T-52A, A13I-29P-40K-50T-52A, 25L-29P-40K-50T-52A, 13I-29P-40K-50K-52A 및 13I-29P-40K-50T-52T 에서 선택된다. 위치 13, 25, 29, 40, 50 및 52 에서 선택되는 5 개 아미노산 치환의 조합을 포함하는 개질 변이체 BBPI 의 예는 SEQ ID NO:432, 434, 443, 445, 446, 597, 599, 601, 605, 615, 620, 624 및 625 의 개질 변이체 BBPI 이다. 다른 구현예에서, 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:187 의 위치 1, 4, 5, 11, 13, 25, 29, 40, 50 및 52 와 동등한 위치에서의 아미노산 치환에서 선택되는 6 개 이상의 아미노산 치환의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 6 개 이상의 아미노산의 조합은 조합 13I-25L-29P-40K-50T-52A, 1C-13I-29P-40K-50T-52A, 4V-13I-29P-40K-50T-52A, 5P-13I-29P-40K-50T-52A, 11G-13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25R-29P-40K-50T-52A, 13I-27R-29P-40K-50T-52A, 13I-29P-31A-40K-50T-52A, 13I-29P-31R-40K-50T-52A, 13I-29P-38N-40K-50T-52A 및 13I-29P-40K-50T-52A-65E 에서 선택된다. 위치 1, 4, 5, 11, 13, 25, 29, 40, 50 및 52 에서 선택되는 6 개 아미노산 치환의 조합을 포함하는 개질 변이체 BBI 의 예는 SEQ ID NO:598, 611, 612, 613, 614, 616, 619, 621, 622, 623 및 626 의 개질 변이체 BBPI 이다. 다른 구현예에서, 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:187 의 위치 13, 25, 29, 31, 40, 50 및 52 와 동등한 위치에서의 아미노산 치환에서 선택되는 7 개 이상의 아미노산 치환의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 7 개 이상의 아미노산의 조합은 조합 13L-25R-29P-31A-40K-50T-52A, 13L-25R-29P-31R-40K-50T-52A 및 13I-27A-29P-31A-50K-52T 에서 선택된다. 위치 13, 25, 29, 31, 40, 50 및 52 에서 선택되는 7 개 아미노산 치환의 조합을 포함하는 개질 변이체 BBPI 의 예는 SEQ ID NO:491, 617, 618 및 632-639 의 개질 변이체 BBPI 이다. 다른 구현예에서, 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:187 의 위치 13, 25, 27, 31, 40, 50 및 52 와 동등한 위치에서의 아미노산 치환에서 선택되는 8 개의 아미노산 치환의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 8 개 아미노산의 조합은 조합 13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T, 13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q, 13I-25K-27R-29E-31A-40H-50R-52K, 13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L 및 13I-25K-27Q-29P-31E-40H-50R-52Q 에서 선택된다. 위치 13, 25, 27, 29, 31, 40, 50 및 52 에서 선택되는 8 개 아미노산 치환의 조합을 포함하는 개질 변이체 BBPI 의 예는 SEQ ID NO:627-631 의 개질 변이체 BBPI 이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 VEGF (VEGF-BBPI) 에 결합하는 단리된 개질 변이체 바우만 버크 프로테아제 저해제 (BBPI) 를 제공한다. VEGF-BBPI 는 SEQ ID NO:187 의 변이체 BBPI 의 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 및 65 와 동등한 위치에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서 치환된 아미노산을 포함하며, 제 2 프로테아제 저해 루프를 대체하는 VEGF-결합 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, VEGF-결합 펩티드는 SEQ ID NO:9, 458, 459, 460, 468, 469, 470, 471, 472 및 473 에서 선택된다. 일부 구현예에서, VEGF-BBPI 는 SEQ ID NO:601, 602, 627, 628, 630, 631, 643, 491, 632, 633, 634, 635 및 636 에서 선택되는 폴리펩티드 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명의 단리된 개질 변이체 BBPI 는 상응하는 비개질 전구체 변이체 BBPI 보다 더 큰 트립신 저해 활성을 갖는다. 다른 구현예에서, 본 발명의 단리된 개질 변이체 BBPI 는 상응하는 비개질 전구체 변이체 BBPI 다 더 큰 트립신 저해 활성 및 생성 수율을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:187 의 13, 25, 27, 29, 31, 40, 50 및 52 와 동등한 위치에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서 치환된 아미노산을 추가로 포함하며, VEGF-결합 펩티드가 FGF-5, TGFβ 및 TNFα 에서 선택되는 표적 단백질에 결합하도록 변이체 펩티드에 의해 대체되는, SEQ ID NO:187 의 단리된 개질 변이체 바우만 버크 프로테아제 저해제 (BBPI) 를 제공한다.
일부 구현예에서, SEQ ID NO:187 의 변이체 BBPI 에 포함되는 VEGF-결합 펩티드는 SEQ ID NO:430, 431, 670 및 671 에서 선택되는 서열을 갖는 FGF-결합 펩티드로 대체된다. 다른 구현예에서, VEGF-결합 펩티드는 SEQ ID NO:436, 437, 438, 672, 673 및 674 에서 선택되는 TGFβ 결합 펩티드로 대체된다. 다른 구현예에서, VEGF-결합 펩티드는 SEQ ID NO:474, 475 및 476 에서 선택되는 TNFα 결합 펩티드로 대체된다.
본 발명은 또한 VEGF-, FGF5-, TGFβ- 또는 TNFα-결합 펩티드를 포함하며, 상응하는 비개질 전구체 BBPI 보다 더 큰 트립신 저해 활성 및 생성 수율을 갖는 개질 변이체 BBPI 를 포함한다. 일부 구현예에서, FGF5-, TGFβ- 또는 TNFα-결합 펩티드를 포함하는 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:432, 434, 443, 445, 447, 637, 638 및 639 의 개질 변이체 BBPI 에서 선택된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 BBPI 융합 단백질을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. BBPI 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 효소의 촉매 단위를 인코딩하는 제 1 폴리뉴클레오티드 서열, 및 개질 변이체 BBPI 예를 들어 VEGF-결합 BBPI (VEGF-BBPI), FGF-결합 BBPI (FGF-BBPI), TGF-결합 BBPI (TGF-BBPI) 또는 TNF-결합 BBPI (TNF-BBPI) 를 인코딩하는 제 2 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제 1 폴리뉴클레오티드 서열은 셀룰라아제의 촉매 단위를 인코딩한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 세균 세포 내의 개질 변이체 BBPI 에 대한 방법을 제공하는데, 이는 SEQ ID NO:187 의 변이체 BBPI 의 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 및 65 와 동등한 위치에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 포함하는 개질 변이체 BBPI 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 구성물이 생성되도록 변이체 BBPI 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 돌연변이시키는 단계; 폴리뉴클레오티드 구성물을 세균 숙주 세포에 도입하는 단계; 이종 DNA 서열이 발현되게 하는 적합한 배양 조건 하에 상기 세균 세포를 배양하는 단계; 및 상응하는 비개질 전구체 변이체 BBPI 보다 더 큰 트립신 저해 활성을 갖는 개질 변이체 BBPI 를 생성하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 발현된 개질 변이체 BBPI 를 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 또한 개질 변이체 BBPI 를 활성화시키는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 개질 변이체 BBPI 는 상응하는 비개질 전구체 변이체 BBPI 보다 더 큰 트립신 저해 활성 및 생성 수율을 갖는다. 비개질 전구체 변이체 BBPI 는 BBI-AV (SEQ ID NO:186), BBIt-AV (SEQ ID NO:187), BBdb-AV (SEQ ID NO:452), BBsb3 (SEQ ID NO:453) 및 BBtc-AV (SEQ ID NO:454) 에서 선택된다. 일부 구현예에서, 개질 변이체 BBPI 의 제 2 프로테아제 저해 루프는 VEGF-결합 펩티드, FGF-5 결합 펩티드, TGFβ 결합 펩티드 및 TNFα 결합 펩티드에서 선택되는 표적 단백질 결합 펩티드이다.
본 발명의 방법에 의해 생성되는 개질 변이체 BBPI 는 비제한적으로, 3 개 치환 예를 들어 25L-50T-52A, 29P-50T-52A, 40K-50T-52A, 4 개 치환 예를 들어 13I-25L-50T-52A, 13I-29P-50T-52A, 13I-A0K-50T-52A, 25L-29P-50T-52A, 25L-40K-50T-52A, 29P-40K-50T-52A, 5 개 치환 예를 들어 13I-25L-29P-50T-52A, 13I-25L-40K-50T-52A, 25L-29P-40K-50T-52A, 13L-29P-40K-50T-52A, 13I-29P-40K-50K-52A, 및 13L-29P-40K-50T-52T, 6 개 치환 예를 들어 13I-25L-29P-40K-50T-52A, 1C-13I-29P-40K-50T-52A, 4V-13I-29P-40K-50T-52A, 5P-13I-29P-40K-50T-52A, 11G-13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25R-29P-40K-50T-52A, 13I-27R-29P-40K-50T-52A, 13I-29P-31A-40K-50T-52A, 13I-29P-31R-40K-50T-52A, 13I-29P-38N-40K-50T-52A, 13I-29P-40K-50T-52A-65E, 7 개 치환 예를 들어 13L-25R-29P-31A-40K-50T-52A, 13L-25R-29P-31R-40K-50T-52A, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 및 8 개 치환 13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T, 13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q, 13I-25K-27R-29E-31A-40H-50R-52K, 13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L, 13I-25K-27Q-29P-31E-40H-50R-52Q 의 조합에서 선택되는 아미노산 치환의 조합을 포함하는 개질 변이체 BBPI 를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 개질 변이체 BBPI 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 상기 기재된 바와 같이 개질 변이체 BBPI 는, 제 2 프로테아제 저해 루프가 표적 단백질 결합 펩티드로 대체되고, SEQ ID NO:187 의 변이체 BBPI 의 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 및 65 와 동등한 위치에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 포함하도록 추가로 개질된 바우만 버크 프로테아제 저해제이다. 일부 구현예에서, 개질 변이체 BBPI 의 제 2 프로테아제 저해 루프는 VEGF-결합 펩티드, FGF5-결합 펩티드, TGFβ-결합 펩티드 및 TNFα-결합 펩티드에서 선택되는 표적 단백질 결합 펩티드이다. 일부 구현예에서, 개질 BBPI 는 SEQ ID NO:195 의 폴리펩티드와 80% 이상 동일성을 갖는 단백질로서 발현된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본원에서 기재된 바와 같이 본 발명의 벡터로 형질전환되는 숙주 세포를 제공한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 세균 세포, 예를 들어 바실러스 (Bacillus) 종 숙주 세포이다.
한 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:187 의 변이체 BBI 의 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 및 65 와 동등한 위치에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, BBPI 의 스캐폴드의 제 2 프로테아제 저해 루프가 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 결합 펩티드, 섬유모세포 성장 인자-5 (FGF5) 결합 펩티드, 형질전환 성장 인자 β (TGFβ) 결합 펩티드 및 종양 괴사 인자 α (TNFα) 변이체 펩티드에서 선택되는 결합 펩티드인, 개질 변이체 바우만 버크 프로테아제 저해제 (BBPI) 를 포함하는 개인 케어 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 개질 변이체 BBPI 는 VEGF, FGF5, TGFβ 및 TNFα 에서 선택되는 표적 단백질에 결합한다. 일부 구현예에서, BBPI 스캐폴드는 하기에서 선택된다:
Figure pct00005
다른 구현예에서, 본 발명의 개질 변이체 BBPI 는 하기 조합에서 선택되는 아미노산 치환의 조합을 포함한다:
Figure pct00006
또 다른 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:187 의 변이체 BBI 의 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 및 65 와 동등한 위치에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, BBPI 의 스캐폴드의 제 2 프로테아제 저해 루프가 하기의 VEGF-결합 펩티드에서 선택되는 VEGF-결합 펩티드인, 개질 변이체 바우만 버크 프로테아제 저해제 (BBPI) 를 포함하는 개인 케어 조성물을 제공한다:
Figure pct00007
또 다른 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:187 의 변이체 BBI 의 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 및 65 와 동등한 위치에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, BBPI 의 스캐폴드의 제 2 프로테아제 저해 루프가 하기의 FGF-결합 펩티드에서 선택되는 FGF-결합 펩티드인 개질 변이체 바우만 버크 프로테아제 저해제 (BBPI) 를 포함하는 개인 케어 조성물을 제공한다:
Figure pct00008
또 다른 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:187 의 변이체 BBI 의 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 및 65 와 동등한 위치에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, BBPI 의 스캐폴드의 제 2 프로테아제 저해 루프가 하기의 TGF-결합 펩티드에서 선택되는 TGF-결합 펩티드인 개질 변이체 바우만 버크 프로테아제 저해제 (BBPI) 를 포함하는 개인 케어 조성물을 제공한다:
Figure pct00009
또 다른 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:187 의 변이체 BBI 의 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 및 65 와 동등한 위치에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, BBPI 의 스캐폴드의 제 2 프로테아제 저해 루프가 하기의 TNF-결합 펩티드에서 선택되는 VEGF-결합 펩티드인 개질 변이체 바우만 버크 프로테아제 저해제 (BBPI) 를 포함하는 개인 케어 조성물을 제공한다:
Figure pct00010
또 다른 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:187 의 변이체 BBI 의 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 및 65 와 동등한 위치에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, BBPI 의 스캐폴드의 제 2 프로테아제 저해 루프가 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 결합 펩티드, 섬유모세포 성장 인자-5 (FGF5) 결합 펩티드, 형질전환 성장 인자 β (TGFβ) 결합 펩티드 및 종양 괴사 인자 α (TNFα) 변이체 펩티드에서 선택되며 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.0001 내지 약 5 중량% 범위의 양으로 존재하는 결합 펩티드인, 개질 변이체 바우만 버크 프로테아제 저해제 (BBPI) 를 포함하는 개인 케어 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개인 케어 조성물에 포함되어 있는 개질 변이체 BBPI 는 상기 BBPI 의 상응하는 비개질 전구체 변이체 저해제보다 더 큰 트립신 저해 활성 및 생성 수율을 갖는다.
다른 구현예에서, SEQ ID NO:187 의 변이체 BBI 의 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 및 65 와 동등한 위치에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, BBPI 의 스캐폴드의 제 2 프로테아제 저해 루프가 SEQ ID NO:9, 458, 459, 460, 468, 469, 470, 471, 472 및 473 에서 선택되는 VEGF-결합 펩티드인 개질 변이체 바우만 버크 프로테아제 저해제 (BBPI) 를 포함하는 개인 케어 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 개질 변이체 BBPI 의 스캐폴드는 SEQ ID NO:187 의 BBIt-AV 이다. 다른 구현예에서, 본 발명의 개인 케어 조성물에 포함되어 있는 개질 변이체 BBPI 는 13I-40K-50T-52A, 13I-25K-29P-52K, 13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T, 13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q, 13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L 에서 선택되는 아미노산 치환의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 개인 케어 조성물은 SEQ ID NO:601, 602, 627, 628, 630, 631, 643, 491, 632, 633, 634, 635 및 636 에서 선택되는 VEGF-결합 BBPI (VEGF-BBPI) 를 포함한다. 일부 구현예에서, 개인 케어 조성물은 피부 크림, 로션, 스프레이, 에멀젼, 콜로이드성 현탁액, 거품, 에어로졸, 액체, 겔, 세럼 및 고체로 이루어지는 군에서 선택되는 피부 케어 조성물이다. 다른 구현예에서, 피부 케어 조성물은 보습 바디 워시, 바디 워시, 살균 세정제, 피부 보호 크림, 바디 로션, 얼굴 크림, 보습 크림, 얼굴 세정 에멀젼, 얼굴 겔, 얼굴 세럼, 계면활성제계 얼굴 세정제, 얼굴 박리 겔, 여드름 방지 처리제, 얼굴 토너, 박리 크림, 얼굴 마스크, 애프터 쉐이브 밤, 프리-쉐이브 밤, 태닝 조성물, 선스크린, 제모제, 헤어 성장 저해제 및 방사선 보호제에서 선택된다. 통상, 방사선 보호제는 비-내수성 선스크린, 지속 내수성 선스크린 및 W/S (water-in-silicone) 선스크린에서 선택되는 선스크린이다. 피부 케어 조성물은 국소 적용되는 비처방전 조성물, 진균 방지 처리제, 여드름 방지 처리제, 피부 보호제, 선스크린, 데오도란트 및 발한 억제제를 임의로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 미용 조성물은 하나 이상의 안료를 포함한다. 이러한 미용 조성물은 압축 파우더 제형 및 파운데이션을 포함한다. 미용 파운데이션 조성물은 유중수 (Water-in-Oil (W/O)) 파운데이션, W/S 파운데이션, 수중유 (Oil-in-Water (O/W)) 파운데이션, 무수 메이크업 스틱 및 크림-투-파우더 파운데이션에서 선택될 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명은 혈관신생 피부 장애 치료용 피부 케어 조성물을 제공한다. 상기 피부 케어 조성물은 SEQ ID NO:187 의 변이체 BBI 의 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 및 65 와 동등한 위치에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 가지며, BBPI 의 스캐폴드의 제 2 프로테아제 저해 루프가 SEQ ID NO:9, 458, 459, 460, 468, 469, 470, 471, 472 및 473 에서 선택되는 VEGF-결합 펩티드인 바우만 버크 프로테아제 저해제 (BBPI) 를 포함한다.
다른 구현예에서, 개인 케어 조성물은 건선, 경피증, 정맥 궤양, 여드름, 주사코, 사마귀, 습진, 혈관종 및 림프관신생에서 선택되는 피부 장애를 겪는 대상에서의 피부 외양 및/또는 상태를 향상시키는데 사용된다.
다른 구현예에서, 본 발명은 혈관신생 피부 장애 치료용 피부 케어 조성물을 제공한다. 피부 케어 조성물은 SEQ ID NO:187 의 변이체 BBI 의 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 및 65 와 동등한 위치에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 가지며, BBPI 의 스캐폴드의 제 2 프로테아제 저해 루프가 SEQ ID NO:9, 458, 459, 460, 468, 469, 470, 471, 472 및 473 에서 선택되는 VEGF-결합 펩티드인 바우만 버크 프로테아제 저해제 (BBPI) 를 포함한다. 헤어 케어 조성물은 샴푸, 컨디셔너, 헤어 스타일링 조성물, 헤어 색소, 퍼머넌트 웨이브 제형, 크림, 겔, 무스, 스프레이, 에멀젼, 콜로이드성 현탁액, 액체, 거품 및 고체의 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, 헤어 케어 조성물은 또한 방사선 보호제를 포함할 수 있다. 방사선 보호제의 예는 비-내수성 선스크린, 지속 내수성 선스크린 및 W/S 선스크린에서 선택되는 선스크린을 포함한다. 헤어 케어 조성물은 헤어 성장을 방지하는데 사용될 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:187 의 변이체 BBI 의 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 및 65 와 동등한 위치에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, BBPI 의 스캐폴드의 제 2 프로테아제 저해 루프가 SEQ ID NO:9, 458, 459, 460, 468, 469, 470, 471, 472 및 473 에서 선택되는 VEGF-결합 펩티드인 BBPI 를 포함하는 개인 조성물을 제공하고; 상기 조성물을 헤어 성장의 저해가 필요한 부위 내에서 대상에게 적용함으로써 헤어 성장을 저해하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 조성물은 수염, 겨드랑이 털, 다리 털, 몸통 털, 팔 털 및 머리 털 성장을 저해하기 위해 적용될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 SEQ ID NO:601, 602, 627, 628, 630, 631, 643, 491, 632, 633, 634, 635 및 636 에서 선택되는 VEGF-BBPI 를 포함하는 개인 케어 조성물을 사용한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:187 의 변이체 BBI 의 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 및 65 와 동등한 위치에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 가지며, BBPI 의 스캐폴드의 제 2 프로테아제 저해 루프가 SEQ ID NO:9, 458, 459, 460, 468, 469, 470, 471, 472 및 473 에서 선택되는 VEGF-결합 펩티드인 BBPI 를 포함하는 개인 조성물을 제공하고; 상기 조성물을 대상의 피부에 적용함으로써 혈관신생 피부 장애를 겪는 대상의 피부 외양 및/또는 상태를 향상시키는 방법을 제공한다. 혈관신생 피부 장애는 건선, 경피증, 정맥 궤양, 여드름, 주사코, 사마귀, 습진, 혈관종 및 림프관신생에서 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 SEQ ID NO:601, 602, 627, 628, 630, 631, 643, 491, 632, 633, 634, 635 및 636 에서 선택되는 VEGF-BBI 를 포함하는 개인 케어 조성물을 사용한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:187 의 변이체 BBI 의 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 및 65 와 동등한 위치에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 가지며, BBPI 의 스캐폴드의 제 2 프로테아제 저해 루프가 SEQ ID NO:430 및 431 에서 선택되는 FGF-결합 펩티드인 바우만 버크 프로테아제 저해제 (BBPI) 를 포함하는 개인 케어 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, BBPI 의 스캐폴드는 SEQ ID NO:187 의 BBIt-AV 이다. 다른 구현예에서, 본 발명의 개인 케어 조성물에 포함되어 있는 개질 변이체 BBPI 는 13I-40K-50T-52A, 13I-25K-29P-52K, 13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T, 13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q, 13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L 에서 선택되는 아미노산 치환의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 개인 케어 조성물은 FGF-결합 BBPI (FGF-BBPI) 가 SEQ ID NO:432 및 434 에서 선택되는 개질 변이체 BBPI 를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:187 의 변이체 BBI 의 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 및 65 와 동등한 위치에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 가지며, BBPI 의 스캐폴드의 제 2 프로테아제 저해 루프가 SEQ ID NO:430 및 431 에서 선택되는 FGF-결합 펩티드인 바우만 버크 프로테아제 저해제 (BBPI) 를 포함하는 헤어 케어 조성물을 제공한다. 헤어 케어 조성물은 샴푸, 컨디셔너, 헤어 스타일링 조성물, 헤어 색소, 퍼머넌트 웨이브 제형, 크림, 겔, 무스, 스프레이, 에멀젼, 콜로이드성 현탁액, 액체, 거품 및 고체의 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, 헤어 케어 조성물은 또한 방사선 보호제를 포함할 수 있다. 방사선 보호제의 예는 비-내수성 선스크린, 지속 내수성 선스크린 및 W/S 선스크린에서 선택되는 선스크린을 포함한다. 헤어 케어 조성물은 헤어 성장을 촉진하는데 사용될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:187 의 변이체 BBI 의 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 및 65 와 동등한 위치에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 가지며, BBPI 의 스캐폴드의 제 2 프로테아제 저해 루프가 SEQ ID NO:430 및 431 에서 선택되는 FGF-결합 펩티드인 바우만 버크 프로테아제 저해제 (BBPI) 를 포함하는 개인 케어 조성물을 제공하고; 상기 헤어 조성물을 헤어 성장이 필요한 부위 내에서 대상에게 적용함으로써 헤어 성장을 촉진하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 조성물은 수염, 겨드랑이 털, 다리 털, 몸통 털, 팔 털 및 머리 털 성장을 촉진하기 위해 적용될 수 있다. 일부 구현예에서, 헤어 성장-촉진 개인 케어 조성물은 헤어 손실을 포함하는 상태를 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 헤어 손실을 포함하며 본 발명의 헤어 케어 조성물을 사용하여 치료될 수 있는 상태는 염증성 탈모, 반흔성 탈모, 경피증, 진드기 교상, 편평 태선, 건선, 루푸스, 지루성 피부염, 느슨한 헤어 증후군, 혈색소침착증, 남성형 탈모 및 원형 탈모를 포함한다. 일부 구현예에서, 헤어 성장을 촉진하는데 사용될 수 있는 개인 케어 조성물은 SEQ ID NO:432 및 434 에서 선택되는 FGF-결합 BBPI (FGF-BBPI) 를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:187 의 변이체 BBI 의 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 및 65 와 동등한 위치에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, BBPI 의 스캐폴드의 제 2 프로테아제 저해 루프가 SEQ ID NO:436, 437, 438, 672, 673 및 674 에서 선택되는 TGF-결합 펩티드인 개질 변이체 바우만 버크 프로테아제 저해제 (BBPI) 를 포함하는 개인 케어 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, BBPI 의 스캐폴드는 SEQ ID NO:187 의 BBIt-AV 이다. 다른 구현예에서, 본 발명의 개인 케어 조성물에 포함되어 있는 개질 변이체 BBPI 는 13I-40K-50T-52A, 13I-25K-29P-52K, 13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T, 13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q, 13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L 에서 선택되는 아미노산 치환의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 개인 케어 조성물은 TGF-결합 BBPI (TGF-BBPI) 가 SEQ ID NO:443, 445 및 447 에서 선택되는 개질 변이체 BBPI 를 포함한다. 일부 구현예에서, 개인 케어 조성물은 헤어 성장을 촉진할 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:187 의 변이체 BBI 의 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 및 65 와 동등한 위치에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, BBPI 의 스캐폴드의 제 2 프로테아제 저해 루프가 SEQ ID NO:436, 437, 438, 672, 673 및 674 에서 선택되는 TGF-결합 펩티드인 개질 변이체 바우만 버크 프로테아제 저해제 (BBPI) 를 포함하는 헤어 케어 또는 피부 케어 조성물을 제공한다. 헤어 또는 피부 케어 조성물은 샴푸, 컨디셔너, 헤어 스타일링 조성물, 헤어 색소, 퍼머넌트 웨이브 제형, 크림, 겔, 무스, 스프레이, 에멀젼, 콜로이드성 현탁액, 액체, 거품 및 고체의 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물이 피부 케어 조성물인 경우, 이는 보습 바디 워시, 바디 워시, 살균 세정제, 피부 보호 크림, 바디 로션, 얼굴 크림, 보습 크림, 얼굴 세정 에멀젼, 얼굴 겔, 얼굴 세럼, 계면활성제계 얼굴 세정제, 얼굴 박리 겔, 여드름 방지 치료제, 얼굴 토너, 박리 크림, 얼굴 마스크, 애프터 쉐이브 밤, 프리-쉐이브 밤, 태닝 조성물, 선스크린 및 방사선 보호제의 형태일 수 있다. 피부 케어 조성물은 임의로는 국소 적용된 비처방전 조성물, 진균 방지 처리제, 여드름 방지 처리제, 피부 보호제, 선스크린, 데오도란트 및 발한 억제제를 추가로 포함할 수 있다. 피부 또는 헤어 케어 조성물에 포함되는 방사선 보호제는 비-내수성 선스크린, 지속 내수성 선스크린 및 W/S 선스크린에서 선택될 수 있는 선스크린이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:187 의 변이체 BBI 의 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 및 65 와 동등한 위치에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, BBPI 의 스캐폴드의 제 2 프로테아제 저해 루프가 SEQ ID NO:436, 437, 438, 672, 673 및 674 에서 선택되는 TGF-결합 펩티드인 개질 변이체 바우만 버크 프로테아제 저해제 (BBPI) 를 포함하는 미용 조성물을 제공한다. 미용 조성물의 예는 마스카라, 아이라이너, 압축 파우더 제형 및 파운데이션을 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:187 의 변이체 BBI 의 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 및 65 와 동등한 위치에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, BBPI 의 스캐폴드의 제 2 프로테아제 저해 루프가 SEQ ID NO:436, 437, 438, 672, 673 및 674 에서 선택되는 TGF-결합 펩티드인 개질 변이체 바우만 버크 프로테아제 저해제 (BBPI) 를 포함하고, 방사선 보호제를 추가로 포함하는 헤어 케어 조성물을 제공한다. 헤어 케어 조성물에 포함될 수 있는 방사선 보호제의 예는 지속 내수성 선스크린 및 W/S 선스크린과 같은 선스크린이다. 헤어 케어 조성물은 헤어 성장을 촉진할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:187 의 변이체 BBI 의 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 및 65 와 동등한 위치에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, BBPI 의 스캐폴드의 제 2 프로테아제 저해 루프가 SEQ ID NO:436, 437, 438, 672, 673 및 674 에서 선택되는 TGF-결합 펩티드인 개질 변이체 바우만 버크 프로테아제 저해제 (BBPI) 를 포함하는 개인 케어 조성물을 제공하고; 상기 조성물을 헤어 성장이 필요한 부위 내에서 대상에게 적용함으로써 헤어 성장을 촉진하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 조성물은 수염, 겨드랑이 털, 다리 털, 몸통 털, 팔 털 및 머리 털 성장을 촉진하기 위해 적용될 수 있다. 일부 구현예에서, 헤어 성장-촉진 개인 케어 조성물은 헤어 손실을 포함하는 상태를 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 헤어 손실을 포함하며 본 발명의 헤어 케어 조성물을 사용하여 치료될 수 있는 상태는 염증성 탈모, 반흔성 탈모, 경피증, 진드기 교상, 편평 태선, 건선, 루푸스, 지루성 피부염, 느슨한 헤어 증후군, 혈색소침착증, 남성형 탈모 및 원형 탈모를 포함한다. 일부 구현예에서, 헤어 성장을 촉진하는데 사용될 수 있는 개인 케어 조성물은 SEQ ID NO:443, 445 및 447 에서 선택되는 개질 변이체 TGF-BBPI 를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:187 의 변이체 BBI 의 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 및 65 와 동등한 위치에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, BBPI 의 스캐폴드의 제 2 프로테아제 저해 루프가 SEQ ID NO:436, 437, 438, 672, 673 및 674 에서 선택되는 TGF-결합 펩티드인 개질 변이체 바우만 버크 프로테아제 저해제 (BBPI) 를 포함하는 개인 케어 조성물을 제공하고; 상기 조성물을 대상에게 적용함으로써 피부 장애를 겪는 대상의 피부 외양 및/또는 상태를 향상시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물로 치료될 수 있는 피부 장애는 건선, 경피증 및 피부암을 포함한다. 일부 구현예에서, 개인 케어 조성물은 SEQ ID NO:443, 445 및 447 에서 선택되는 개질 변이체 TGF-BBPI 에서 선택되는 TGF-BBPI 를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:187 의 변이체 BBI 의 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 및 65 와 동등한 위치에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, BBPI 의 스캐폴드의 제 2 프로테아제 저해 루프가 SEQ ID NO:474, 475 및 476 에서 선택되는 TNF-결합 펩티드인 개질 변이체 바우만 버크 프로테아제 저해제 (BBPI) 를 포함하는 개인 케어 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, BBPI 의 스캐폴드는 SEQ ID NO:187 의 BBIt-AV 이다. 다른 구현예에서, 본 발명의 개인 케어 조성물에 포함되어 있는 개질 변이체 BBPI 는 13I-40K-50T-52A, 13I-25K-29P-52K, 13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T, 13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q, 13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L 에서 선택되는 아미노산 치환의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 개인 케어 조성물은 TNF-BBPI 가 SEQ ID NO:637, 638 및 639 에서 선택되는 개질 변이체 BBPI 를 포함한다. 개인 케어 조성물은 헤어 성장을 촉진하는데 사용될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:187 의 변이체 BBI 의 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 및 65 와 동등한 위치에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, BBPI 의 스캐폴드의 제 2 프로테아제 저해 루프가 SEQ ID NO:474, 475 및 476 에서 선택되는 TNF-결합 펩티드인 개질 변이체 바우만 버크 프로테아제 저해제 (BBPI) 를 포함하는 헤어 케어 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 헤어 케어 조성물은 건선을 겪는 대상에서의 헤어 성장을 촉진할 수 있다. 헤어 케어 조성물은 샴푸, 컨디셔너, 헤어 스타일링 조성물, 헤어 색소, 퍼머넌트 웨이브 제형, 크림, 겔, 무스, 스프레이, 에멀젼, 콜로이드성 현탁액, 액체, 거품 및 고체의 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, 헤어 케어 조성물은 방사선 보호제를 추가로 포함한다. 방사선 보호제의 예는 비-내수성 선스크린, 지속 내수성 선스크린 및 W/S 선스크린과 같은 선스크린을 포함한다. 일부 구현예에서, 헤어 케어 조성물은 헤어 성장을 촉진할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:187 의 변이체 BBI 의 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 및 65 와 동등한 위치에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, BBPI 의 스캐폴드의 제 2 프로테아제 저해 루프가 SEQ ID NO:474, 475 및 476 에서 선택되는 TNF-결합 펩티드인 개질 변이체 바우만 버크 프로테아제 저해제 (BBPI) 를 포함하는 피부 케어 조성물을 제공한다. 피부 케어 조성물은 건선 또는 경피증을 겪는 대상의 피부 외양 및/또는 상태를 향상시키는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 피부 케어 조성물은 피부 크림, 로션, 스프레이, 에멀젼, 콜로이드성 현탁액, 거품, 에어로졸, 액체, 겔, 세럼 및 고체의 형태일 수 있다. 대안적으로는, 피부 케어 조성물은 보습 바디 워시, 바디 워시, 살균 세정제, 피부 보호 크림, 바디 로션, 얼굴 크림, 보습 크림, 얼굴 세정 에멀젼, 얼굴 겔, 얼굴 세럼, 계면활성제계 얼굴 세정제, 얼굴 박리 겔, 여드름 방지 처리제, 얼굴 토너, 박리 크림, 얼굴 마스크, 애프터 쉐이브 밤, 프리-쉐이브 밤, 태닝 조성물, 피부 미백 조성물, 피부 발진 감소 조성물, 선스크린, 제모제 및 방사선 보호제의 형태이다. 임의로는, 피부 케어 조성물은 국소 적용된 비처방전 조성물, 진균 방지 처리제, 여드름 방지 처리제, 피부 보호제, 선스크린, 데오도란트 및 발한 억제제를 추가로 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:187 의 변이체 BBI 의 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 및 65 와 동등한 위치에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, BBPI 의 스캐폴드의 제 2 프로테아제 저해 루프가 SEQ ID NO:474, 475 및 476 에서 선택되는 TNF-결합 펩티드인 개질 변이체 바우만 버크 프로테아제 저해제 (BBPI) 를 포함하는 미용 조성물을 제공한다. 미용 조성물은 마스카라, 아이라이너, 압축 파우더 제형 및 파운데이션에서 선택된다. 일부 구현예에서, 미용 조성물은 하나 이상의 안료를 포함하는 미용 조성물이다. 하나 이상의 안료를 포함하는 미용 조성물은 마스카라이며, 상기 마스카라는 비-방수 마스카라, 방수 마스카라, 부피 증대 마스카라, 길이 연장 마스카라, 컬링 마스카라, 무수방수 마스카라, 수-기반 마스카라 및 속눈썹 또는 눈썹 처리제에서 선택된다. 다른 구현예에서, 미용 조성물은 루스 파우더, 블러쉬, 아이 섀도우 및 브론징 파우더에서 선택되는 압축 파우더 제형에서 선택되는 미용 조성물이다.
다른 구현예에서, 미용 조성물은 유중수 파운데이션, W/S 파운데이션, 수중유 파운데이션, 무수 메이크업 스틱 및 크림-투-파우더 파운데이션에서 선택되는 파운데이션이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:187 의 변이체 BBI 의 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 및 65 와 동등한 위치에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, BBPI 의 스캐폴드의 제 2 프로테아제 저해 루프가 SEQ ID NO:474, 475 및 476 에서 선택되는 TNF-결합 펩티드인 개질 변이체 바우만 버크 프로테아제 저해제 (BBPI) 를 포함하는 개인 케어 조성물을 제공하는 단계; 및 상기 조성물을 헤어 성장의 촉진이 필요한 부위 내에서 대상에게 적용하는 단계를 포함하는, 건선을 겪는 대상의 헤어 성장을 촉진하는 방법을 제공한다.
예를 들어, 상기 조성물은 수염, 겨드랑이 털, 다리 털, 몸통 털, 팔 털 및 머리 털 성장을 촉진하기 위해 적용될 수 있다. 일부 구현예에서, 헤어 성장을 촉진하는데 사용될 수 있는 개인 케어 조성물은 SEQ ID NO:637, 638 및 639 에서 선택되는 개질 TNF-BBPI 를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:187 의 변이체 BBI 의 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 및 65 와 동등한 위치에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, BBPI 의 스캐폴드의 제 2 프로테아제 저해 루프가 SEQ ID NO:474, 475 및 476 에서 선택되는 TNF-결합 펩티드인 개질 변이체 바우만 버크 프로테아제 저해제 (BBPI) 를 포함하는 개인 케어 조성물을 제공하는 단계; 및 상기 조성물을 대상의 피부에 적용하는 단계를 포함하는, 건선을 겪는 대상의 피부 외양 및/또는 상태를 향상시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 SEQ ID NO:637, 638 및 639 에서 선택되는 개질 TNF-BBPI 를 포함하는 개인 케어 조성물을 제공하는 것을 포함한다.
도 1 A-D 는 pJM103 융합 벡터에 클로닝된 aprE-BCE103-BBI-His표지 발현 카세트 (EcoRI-HindIII) 의 DNA 및 아미노산 서열을 제공한다 (SEQ ID NO:1 및 2).
도 2 는 pJM103BBIhis 발현 벡터의 도식적 지도를 제공한다.
도 3 은 BCE103 융합 위치 (BamHI 에서의) 로부터 유전자의 말단까지의 12BBIck81 의 DNA 및 아미노산 서열을 제공한다 (SEQ ID NO:3 및 4). CK37281 펩티드 서열 (ACYNLYGWTC (SEQ ID NO:9)) 은 트립신 및 키모트립신 저해 루프에 모두 삽입된다.
도 4 는 배양물의 성장 동안 주어진 농도에서 첨가된 다양한 티올 환원제를 갖는 활성 대 비활성 2BBIck81 의 역가를 나타내는 그래프를 제공한다. 막대의 백색 부분은 활성 2BBIck81 의 양 (트립신 저해에 의해 측정됨) 을 나타내고, 막대의 흑색 부분은 불활성 2BBIck81 의 양 (BCE103 활성으로부터 측정되며, BCE103 및 2BBIck81 이 1:1 몰비로 생성된다고 가정함) 을 나타낸다. 활성 2BBIck81 의 분획을 막대 상부에 표시하였다. 상기 도면에서, 37 C = 무첨가, BME = 2-머캅토에탄올, Cys = 시스테인, Glut = 환원된 글루타티온, DTT = 디티오트레이톨이다.
도 5 는 이온 교환 크로마토그래피에 의한 BCE-lnk2-2BBck81 융합 단백질의 부분적 정제 후 2-머캅토에탄올 (BME) 로의 2BBIck81 의 활성을 나타내는 그래프를 제공한다. 3 mM 2-머캅토에탄올 (BME) 로의 처리 전 및 이후에 활성 검정에 의해 측정된 BCE (흑색 막대) 및 2BBIck81 (백색 막대) 의 농도 (μM) 를 나타낸다.
도 6 은 BioVeris 검정에서 VegF 에 결합하기 위한 2BBlck81 대 항-VegF 항체의 경쟁 분석으로부터의 결과를 나타내는 그래프를 제공한다. CK37281 펩티드와의 결합 경쟁을 비교를 위해 나타내고, 야생형 BBI 와의 결합을 음성 대조군으로서 포함시켰다.
도 7A-C 는 B. 서브틸리스 BBI 발현 벡터에 삽입된 (BssHII 및 SacI 위치를 사용) H. 인솔렌스 (H. insolens) PDI-(hiPDI) 를 수반하는 합성 DNA 절편의 서열 뿐 아니라 아미노산 서열 (SEQ ID NO:5 및 6) 을 제공한다.
도 8 A-C 는 p2JM103-lnk2-2BBIck81 의 EcoRI-BamHI 위치에 라이게이션된 aprE-큐티나아제 발현 카세트의 DNA 및 아미노산 서열을 제공한다 (SEQ ID NO:7 및 8).
도 9 는 비개질 BBIt-AV 단백질의 아미노산 서열을 제공한다 (SEQ ID NO:187). 모든 번호 매긴 아미노산에서 위치-포화 라이브러리를 구성하였다. 트립신 저해 루프 및 VEGF 결합 펩티드 루프 (이탤릭체) 를 표시하고 결합선으로 디술피드 결합을 나타낸다. 하부에서, VEGF 결합 펩티드를 이것이 대체하는 sBBI 에서의 키모트립신 저해 루프와 비교한다. 하향 화살표는 키모트립신 반응성 위치의 P1 과 P1' 잔기 사이의 잠재적 프로테아제 절단 위치를 나타낸다.
도 10 은 위치 29 에서 생성된 각각의 아미노산 치환에 대한 상대적 BBI:BCE 활성비를 제공한다. 상기 비는 2-머캅토에탄올의 부재 (백색 막대) 또는 존재 (흑색 막대) 하에 마이크로타이터 플레이트에서 성장시킨 4 반복 배양물로부터 평균화된다. sBBI 에 대한 활성비는 양성 대조군으로서 비교를 위해 포함된다. 상기 비는, 2-머캅토에탄올의 부재 (수평선 친 막대) 또는 존재 (대각선 친 막대) 하에 나타낸, BBIt-AV (SEQ ID NO:187) (수평선으로 표시) 에서의 야생형 아미노산인 류신에 대해 측정된 값에 대해 정상화하였다.
도 11 A-B 는 각각 위치 50 (A) 및 위치 37 (B) (백색 막대) 에서 생성된 아미노산 치환에 대한 상대적 BBI:BCE 활성비를 제공한다. 상기 비는 2-머캅토에탄올의 존재 하에 4 반복 배양물로부터 평균화된다. sBBI 에 대한 활성비는 양성 대조군으로서 비교를 위해 포함된다 (흑색 막대). 상기 비는, BBIt-AV 에서의 야생형 아미노산 (SEQ ID NO:187) 에 대해 측정된 값 (수평선으로 표시) 에 대해 정상화되며, 대각선 친 막대로 나타낸다.
도 12 는 트립신 저해 루프에서의 P2' 위치에서의 아미노산 치환 (도 9 에서의 잔기 18, SEQ ID NO:187) 에 대한 상대적 BBI:BCE 활성비를 제공한다. 상기 비는 2-머캅토에탄올의 존재 하에 4 반복으로 측정되었다 (개별 데이터점을 나타냄). sBBI (BBI; SEQ ID NO:13), BBIt-AV (CT; SEQ ID NO:187) 및 BBIt-AV-F50T (F50T) 에 대한 활성비를 수평선의 우측에 나타내며 비교를 위해 부가하였다. 상기 비는 BBIt-AV (CT) 에 대해 측정된 값 (수평선으로 표시) 에 대해 정상화된다.
도 13 은 8 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하는 하기 3 개 BBIt-AVs 의 생성의 비교를 제공한다: 8 중 변이체 BBIt-AV-A13I-S25K-M27A-L29R-S31A-A40H-F50R-V52L (RL8; SEQ ID NO:630), BBIt-AV-A13I-S25K-M27A-L29R-S31E-A40K-F50Q-V52Q (QQ8; SEQ ID NO:628), 및 BBIt-AV-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-A40H-F50K-V52T (KT8; SEQ ID NO:627). 활성 BBI 종류의 양을 성장 후 (◆), 2-머캅토에탄올로의 활성화 후 (■), 및 산/열 처리 후 (▲) 트립신 저해에 의해 측정하였다. BBIt-AV, 5 중 변이체 BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A (TA5; SEQ ID NO:601) 및 sBBI 를 비교를 위해 포함시킨다.
도 14 는 전구체 변이체 BBPI 스캐폴드 (지정된 모체 (PT)) 대 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-L29P-F50T-V52A 스캐폴드 (Q; SEQ ID NO:600) 에서의 상이한 결합 펩티드 (3 개 TGFβ 및 2 개 FGF5 결합제) 의 성장 후 (흑색 막대), 2-머캅토에탄올로의 활성 후 (대각선 친 막대) 및 산/열 처리 후 (백색 막대) 활성 BBI 종류의 비교 (트립신 저해에 의한) 를 제공한다. 모든 스캐폴드에서, 결합 펩티드는 키모트립신 저해 루프를 대체하였다. PEN3 (SEQ ID NO:436), WTQ (SEQ ID NO:438) 및 MM021W (SEQ ID NO:437) 는 TGFβ 결합 펩티드이고, MM007 (SEQ ID NO:430) 및 FGFps2 (SEQ ID NO:431) 는 FGF5 결합 펩티드이다.
도 15 는 돌리코스 비플로루스 (Dolichos biflorus) 로부터의 변이체 바우만 버크 저해제 스캐폴드 (BBdb-AV, SEQ ID NO:452), 글리신 맥스 (Glycine max) (콩) 로부터의 변이체 프로테아제 저해제 IV 또는 D-II (BBsb3-AV, SEQ ID NO:453), 및 토레세아 (Torresea) (암부라나 (Amburana)) 세아렌시스 (cearensis) 로부터의 변이체 프로테아제 저해제 IV 또는 D-II (BBtc-AV, SEQ ID NO:454) 의 아미노산 서열 (키모트립신 루프가 변이체 BBI, BBIt-AV 의 서열 (SEQ ID NO:187) 에 대해 정렬되는 VEGF-결합 펩티드로 대체됨) 을 제공한다. C9 와 C58 사이의 BBIt-AV 서열에서의 차이점을 볼드체로 밑줄 그어 나타낸다. 모든 스캐폴드에서, CK3781 결합 펩티드 (ACYNLYGWT; SEQ ID NO:9) 는 제 2 프로테아제 저해 루프를 대체한다.
도 16 은 2-머캅토에탄올로의 활성화 후 (백색 막대) 및 산/열 처리 후 (흑색 막대) BBIt-AV, BBdb-AV 및 BBtc-AV 의 활성 BBI 농도의 비교 (트립신 저해에 의한) 를 제공한다.
도 17 은 비개질 변이체 BBIt-AV (SEQ ID NO:187), BBdb-AV (SEQ ID NO:452), BBsb3-AV (SEQ ID NO:453) 및 BBtc-AV (SEQ ID NO:454), 및 상응하는 비개질 전구체 BBIt (SEQ ID NO:187), BBsb3 (SEQ ID NO:449), BBtc (SEQ ID NO:450) 및 BBdb (SEQ ID NO:451) BBPI 의 정렬을 제공한다. 별표 기호 (*) 는 불변의 보존된 C 잔기를 나타낸다. 번호 매겨진 잔기는 본 발명의 개질 변이체 BBPI 가 생성되도록 치환되는 아미노산을 나타낸다.
도 18 은 야생형 BBI 에서의 T-세포 에피토프의 확인을 나타낸다. (A) 모든 71 개 공여체에 대한 자극 지표 (SI) 값을 평균화하고 오차 막대에서의 표준 편차와 함께 나타낸다. (B) 20 wt BBI 펩티드 집합에서의 각 펩티드에 대한 응답자 % 를 나타낸다.
상세한 설명
본 발명은 표적 단백질에 결합하는 펩티드를 포함하고, 비개질 BBPI (바우만 버크 프로테아제 저해제 단백질) 보다 더 큰 프로테아제 저해 활성을 가지고/가지거나 더 큰 수율로 생성되도록 개질되는 개질 변이체 바우만 버크 프로테아제 저해제 단백질 (BBPI) 에 관한 것이다. 본 발명은 개질 변이체 BBPI 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터 및 폴리뉴클레오티드 구성물, 개질 변이체 BBPI 를 발현 및 생성하는 형질전환된 숙주 세포, 개질 변이체 BBPI 단백질, 개질 변이체 BBPI 를 포함하는 조성물, 및 개인 케어에 있어서 개질 변이체 BBPI 를 생성하고 사용하는 방법을 포함한다.
다르게 나타내지 않는 한, 본 발명의 실행은 당업계의 지식 내에 있는 분자 생물학, 미생물학, 단백질 정제, 단백질 공학, 단백질 및 DNA 서열분석 및 재조합 DNA 분야에서 흔히 사용되는 통상적 기술을 포함한다. 이러한 기술은 당업자에게 알려져 있으며 수많은 표준 문헌 및 참고 문헌에 기재되어 있다. 본원에 언급되는 모든 특허, 특허 출원, 논문 및 출판물은 그 전체가 본원에 참고로 명백히 포함된다.
본원에서 다르게 정의하지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업계의 통상의 지식 중 하나에 의해 흔히 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 포함되는 용어를 포함하는 다양한 과학적 사전적 의미는 당업자에게 잘 알려져 있으며 이용가능하다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용되지만, 일부 바람직한 방법 및 물질이 기재된다. 따라서, 바로 이하에 정의된 용어들은 전체로서 명세서를 참조하여 보다 상세히 기재된다. 당업자에게 사용되는 맥락에 따라 다양할 수 있기 때문에, 본 발명이 특정 방법론, 프로토콜 및 기재된 시약에 제한되지 않는 것이 이해된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 다르게 명백히 나타내지 않는 한, 단수형 표현은 복수형 표현을 포함한다. 다르게 나타내지 않는 한, 핵산은 5' 에서 3' 방향으로 좌측에서 우측으로 표기하며, 아미노산 서열은 아미노에서 카르복시 방향으로 좌측에서 우측으로 각각 표기한다.
본원에서 나타낸 이러한 참고문헌 내에 개시되는 모든 서열을 포함하는 모든 특허, 특허 출원 및 기타 출판물은, 마치 각각의 개별적 출판물, 특허 또는 특허 출원이 참고로 포함되는 것으로 특이적이고 개별적으로 나타내어진 것과 동일한 정도로 명백히 참고로 포함된다. 관련 부분에서 인용된 모든 문헌은 본원에 참고로 포함된다. 그러나, 임의의 문헌의 인용은 이것이 본 발명에 대한 선행 기술이라는 허가로서 파악되지는 않는다.
수치 범위는 범위를 한정하는 수를 포함한다. 본 명세서를 통해 주어진 모든 최대 수치적 제한이, 마치 낮은 수치적 제한이 본원에서 명백히 표기된 것처럼 모든 이러한 낮은 수치적 제한을 포함하는 것으로 의도된다. 본 명세서를 통해 주어진 모든 최소 수치적 제한은, 마치 높은 수치적 제한이 본원에서 명백히 표기된 것처럼 모든 이러한 높은 수치적 제한을 포함할 것이다. 본 명세서를 통해 주어진 모든 수치적 범위는, 마치 좁은 수치적 범위가 본원에서 명백히 표기된 것처럼, 넓은 수치적 범위에 포함되는 모든 이러한 좁은 수치적 범위를 포함할 것이다.
추가로, 본원에 제공된 표제는 전체로서 본 명세서를 참조할 수 있는 본 발명의 다양한 양상 또는 구현예의 제한이 아니다. 따라서, 상기 나타낸 바와 같이, 바로 이하에 정의된 용어는 전체로서 본 명세서를 참조로 하여 더욱 상세히 정의된다.
5.1 정의
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단리된" 또는 "정제된" 은 자연적으로 연관되는 하나 이상의 성분으로부터 제거되는 핵산 또는 아미노산 (또는 다른 성분) 을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 프로테아제 저해제 (PI) 예를 들어 바우만 버크 프로테아제 저해제 (BBPI) 를 의미하는 경우 용어 "개질된" 은, 비개질 "전구체" 또는 "모체" BBPI 단백질의 아미노산 서열에서 유래한 아미노산 서열을 갖는 BBPI 를 의미한다. 비개질 전구체 BBPI 는 자연 발생적 또는 야생형 단백질이거나, 또는 변이체 BBPI 일 수 있다. 개질 단백질의 아미노산 서열은 전구체 아미노산 서열 부위의 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 삽입에 의해 전구체 단백질 아미노산 서열에서 "유래한다". 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산은 개질된 프로테아제 저해제가 생성되도록 치환된다. 일부 구현예에서, 모체 프로테아제 저해제는 변이체 서열로 대체된 트립신 및/또는 초트립신 (chotrypsin) 을 포함하는 변이체 BBPI 이다. 변이체 전구체 BBPI 의 하나 이상의 아미노산의 치환은 개질 변이체 BBPI 프로테아제 저해제를 생성시킨다. 일부 구현예에서, 개질 변이체 PI 는 SEQ ID NO:187 의 위치 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52 및 65 와 동등한 하나 이상의 위치에서의 아미노산 치환을 포함한다 (DDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCACYNLYGWTCFCVDITDFCYEPCKPSE: SEQ ID NO:187). 다른 구현예에서, 개질 변이체 PI 는 본원에 기재된 바와 같이 치환의 조합을 포함한다. 다른 구현예에서, 개질 변이체 PI 는 삽입을 포함한다. 이러한 개질은 전구체 프로테아제 저해제 자체의 조작보다는 전구체 프로테아제 저해제의 아미노산 서열을 인코딩하는 "전구체 DNA 서열" 의 개질이다. 본원의 개질 프로테아제 저해제는 반응성 루프 예를 들어 트립신 및/또는 키모트립신 루프(들) 외 부위에서의 아미노산 잔기 중 임의 하나에서의 임의의 19 개 자연 발생적 아미노산의 치환을 포함한다. 개질된 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 "개질 폴리뉴클레오티드" 로서 나타내어지며, 전구체 프로테아제 저해제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 "전구체 폴리뉴클레오티드" 로서 나타내어진다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "프로테아제 저해제" (PI) 는 본원에서, 예를 들어 Prakash et al. [J mol Evol 42:560-569 (1996)] 에 의해 기재되는 바와 같이 시스테인-풍부 프로테아제 저해제인 바우만 버크 프로테아제 저해제 (BBPI) 를 의미하며 이와 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "스캐폴드" 는 변이체 서열이 도입되는 BBPI 단백질 서열을 의미한다. 일부 구현예에서, 스캐폴드는 제 1 프로테아제 저해 루프 예를 들어 트립신 루프, 및/또는 제 2 프로테아제 저해 루프 예를 들어 결합 펩티드 서열로 대체된 키모트립신을 갖는 변이체 스캐폴드이다. 다른 구현예에서, 스캐폴드는 야생형 BBPI 스캐폴드이다. 용어 "개질 변이체 스캐폴드" 는 개질, 예를 들어 BBPI 스캐폴드의 골격 내 아미노산 치환 또는 삽입을 포함하는 변이체 스캐폴드이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 변이체 BBPI 스캐폴드를 참조로 사용하는 경우 용어 "골격" 은 제 1 및/또는 제 2 프로테아제 저해 루프, 즉 트립신 및/또는 키모트립신 루프를 대체하도록 도입된 결합 펩티드 서열의 외부인 변이체 BBPI 부분을 의미한다. 예를 들어, SEQ ID NO:187 의 변이체 BBPI 의 골격은 아미노산 1-40 및 50-66, 즉 아미노산 위치 41 및 49 에서의 불변의 시스테인 잔기에 대한 아미노산 N-말단 및 C-말단을 의미하며, 이는 야생형 BBPI, 즉 SEQ ID NO:13 의 BBI (DDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCICALSYPAQCFCVDITDFCYEPCKPSEDDKEN; SEQ ID NO:13) 에서 발견된 키모트립신 루프를 대체하도록 도입된 VEGF 결합 서열을 일괄한다. 일부 구현예에서, 스캐폴드는 SEQ ID NO:187 의 BBIt 의 스캐폴드와 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 동일성을 갖는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "결합 펩티드", "결합 서열", "변이체 서열" 및 "변이체 펩티드" 는 상호교환적으로 사용되며, 프로테아제 저해제 예를 들어 바우만 버크 저해제의 제 1 및/또는 제 2 프로테아제 저해 루프를 대체하는 짧은 폴리펩티드 서열(들) 을 의미한다. 결합 펩티드는 스캐폴드 내에서 대체되며, 2 개 이상의 아미노산에 의해 야생형 BBPI 의 프로테아제 저해 루프 서열과 상이한 프로테아제 저해 루프 서열과 동일한 길이일 필요가 없다. 일부 구현예에서, 전구체 프로테아제 저해제의 제 1 및/또는 제 2 프로테아제 저해 루프 예를 들어 트립신 및/또는 키모트립신 루프를 대체하는 것은 야생형 예를 들어 SEQ ID NO:13 또는 변이체 SEQ ID NO:187 BBPI 의 전장 아미노산 15 내지 21 (트립신 루프) 과 동등한 서열 및/또는 전장 아미노산 42 내지 48 (키모트립신 루프) 를 변경시킨다. 결합 펩티드 서열은 프로테아제 저해제의 것과 이종이다. 결합 펩티드는 표적 단백질에 결합한다.
본원의 "VEGF 결합 펩티드", "FGF 결합 펩티드", "TGF 결합 펩티드" 및 "TNF 결합 펩티드" 는 각각 VEGF, FGF5, TGFβ 및 TNFα 에 결합하는 펩티드 서열을 의미한다.
본원의 "VEGF 조성물", "FGF 조성물", "TGF 조성물" 및 "TNF 조성물" 은 조성물, 예를 들어 각각 VEGF-BBPI, FGF-BBPI, TGF-BBPI 및 TGF-BBPI 를 포함하는 개인 케어 조성물을 의미한다.
본원에서 기재된 제형을 참조로 사용되는 경우 "화합물" 은 개질 변이체 BBPI 예를 들어 VEGF-BBPI, FGF-BBPI, TGF-BBPI 또는 TNF-BBPI 를 의미한다. 제형은 변이체 BBPI 의 하나 초과의 유형을 포함할 수 있으며, 즉 상기 제형은 VEGF-BBPI 및 TNF-BBPI, 또는 본원에서 개시된 4 가지 유형의 BBPI 중 임의의 다른 조합을 포함할 수 있다.
개인 케어 조성물에 포함되어 있는 개질 변이체 BBPI 를 참조로 사용되는 경우 부정 관사 ("a") 는 본원에서 특정 서열을 갖는 개질 변이체 BBPI 를 의미한다. 이러한 맥락에서 부정 관사는 개인 케어 조성물에 필요한 개질 변이체 BBPI 분자의 수를 제한하지 않는다.
용어 "키모트립신 루프" 및 "제 2 프로테아제 저해 루프" 는 본원에서 상호교환적으로 사용되며 바우만 버크 패밀리의 프로테아제 저해제의 제 2 반응성 위치 루프에 상응하는 아미노산 서열에 미치는 아미노산 서열을 의미한다. 예를 들어, 글리신 맥스 (Glycine max) 로부터의 야생형 BBPI 저해제의 제 2 프로테아제 저해 루프, 즉 SEQ ID NO:13 의 BBI 는 시스테인 10 및 시스테인 11 에 의해 포함되는 제 2 반응성 위치 루프에 미치는 펩티드 서열이다 (상기 Prakash et al. 참조). C10 및 C11 은 SEQ ID NO:187 의 변이체 BBIt-AV 에서의 아미노산 42 에서 아미노산 48 에 미치는 것과 동등한 아미노산 서열을 포함한다 (도 9). 변이체 BBPI 의 제 2 프로테아제 저해 루프 또는 키모트립신 루프 예를 들어 SEQ ID NO:187 의 BBIt-AV 는 Prakash et al. 에 의해 기재되는 바와 같은 C10 및 C11 과 동등한 시스테인 잔기인 위치 41 및 49 에서의 시스테인에 의해 포함되는 아미노산 42-48 에 미치는 아미노산 서열에 상응한다. SEQ ID NO:13 의 야생형 BBI 의 제 2 프로테아제 저해 루프의 아미노산 서열이 키모트립신 저해 펩티드이지만, SEQ ID NO:187 의 변이체 BBIt-AV 의 제 2 프로테아제 저해 루프는 VEGF-결합 펩티드이다. 따라서, 본원에서 용어 "키모트립신 루프" 또는 "제 2 프로테아제 저해 루프" 는 루프의 위치를 의미하며, 변이체 BBPI 에 프로테아제 저해 활성을 부여하는 C10 과 C11 사이의 서열을 내포하는 것으로 의도되지 않는다. 유사하게, 용어 "트립신 루프" 및 "제 1 프로테아제 저해 루프" 는 본원에서 상호교환적으로 사용되며 바우만 버크 패밀리의 프로테아제 저해제의 제 1 반응성 위치 루프에 상응하는 아미노산 서열에 미치는 아미노산 서열을 의미한다. 예를 들어, 글리신 맥스로부터의 야생형 BBPI 저해제의 제 2 프로테아제 저해 루프, 즉 SEQ ID NO:13 의 BBI 는 시스테인 4 및 시스테인 5 에 의해 포함되는 제 2 반응성 위치 루프에 미치는 펩티드 서열이다 (상기 Prakash et al. 참조). C4 및 C5 는 SEQ ID NO:187 의 변이체 BBIt-AV 에서의 아미노산 15 에서 아미노산 21 에 미치는 것과 동등한 아미노산 서열을 포함한다 (도 9).
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "표적 단백질" 은 이의 작용이 변이체 펩티드의 결합에 의해 차단되는 단백질 (예를 들어 효소, 호르몬 등) 을 의미한다. 일부 구현예에서, 변이체 펩티드는 펩티드가 BBPI 의 트립신 및/또는 키모트립신 루프를 대체하는 경우 표적 단백질에 결합한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "치환된" 및 "치환" 은 모체 서열에서의 아미노산 잔기 또는 핵산 염기의 대체물(들) 을 의미한다. 일부 구현예에서, 치환은 자연 발생적 잔기 또는 염기의 대체물을 포함한다. 일부 구현예에서, 2 개 이상의 아미노산이 치환되어 아미노산 치환의 조합을 포함하는 개질 BBPI 가 생성된다. 일부 구현예에서, 치환의 조합은 치환이 생성되는 아미노산 위치에 의해 표시된다. 예를 들어, 25-50-52 에 의해 표시되는 조합은 위치 25, 50 및 52 에서의 3 개 아미노산이 치환된다는 것을 의미한다. 다른 구현예에서, 치환의 조합은 치환으로 야기된 아미노산 및 아미노산 위치에 의해 표시된다. 예를 들어, 치환 13I-25L-50T-52A 의 조합을 포함하는 개질 BBPI 는 위치 13 에서의 아미노산이 이소류신으로 치환되고, 위치 25 에서의 아미노산이 류신으로 치환되고, 위치 50 에서의 아미노산이 트레오닌으로 치환되고, 위치 52 에서의 아미노산이 알라닌으로 치환된 개질 BBPI 이다. 아미노산 위치는 SEQ ID NO:187 의 BBPI 에서 번호 매겨진 위치와 동등한 위치이다. 일부 구현예에서, 치환의 조합은 치환이 생성되는 스캐폴드의 맥락에서 주어진다. 예를 들어, SEQ ID NO:601 의 개질 변이체 BBPI 는 또한 BBIt-AV-13I-29P-40K-50T-52A 로서 나타내어지는데, 이는 BBIt-AV 스캐폴드 (SEQ ID NO:187) 가 아미노산 13, 29, 40, 50 및 52 에서 생성된 치환을 포함하도록 개질된 것을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본래 및 치환된 아미노산이 표시되며, 예를 들어 SEQ ID NO:601 의 개질 변이체 BBPI 는 BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A 로서 나타내어질 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "개질" 및 "개질하다" 는 결실, 삽입, 중절 및 치환을 비제한적으로 포함하는 아미노산 또는 핵산 서열에서의 임의의 변화(들) 를 의미한다. 일부 구현예에서, 개질은 자연 발생적 잔기 또는 염기의 대체물을 포함한다. 다른 구현예에서, 개질은 하나 이상의 아미노산 치환의 조합을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 개질은 하나 이상의 아미노산 치환과 조합되는 삽입을 갖거나 갖지 않는 삽입을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, BBPI 에서의 아미노산 잔기 또는 아미노산 잔기의 위치를 참조로 사용되는 경우 용어 "동등한" 은 비개질 전구체 BBPI 의 제 1 서열에서의 위치에 상응하는 개질 BBPI 에서의 아미노산 잔기의 위치를 의미한다. BBPI 에서의 동등한 아미노산 위치의 위치를 구축하기 위해, 개질되는 BBPI 의 아미노산 서열을 SEQ ID NO:187 의 BBPI, 및 특히 바우만 버크 저해제의 프로테아제 저해제에서 불변인 것으로 알려져 있는 시스테인 잔기 (상기 Prakash et al. 참조) 와 직접 비교한다. 보존된 시스테인 잔기를 정렬한 후, 정렬을 유지시키기 위해 삽입 및 결실을 허용하여 (즉, 자의적 결실 또는 삽입을 통해 보존된 시스테인 잔기의 제거를 회피함), SEQ ID NO:187 의 BBPI 의 서열에서의 특정 아미노산 위치와 동등한 위치에서의 잔기가 정의된다. 보존된 시스테인 잔기의 정렬은 바람직하게는 이러한 잔기의 100% 를 보존해야 한다. 예를 들어, 도 17 에서 변이체 및 야생형 BBPI 의 아미노산 서열은 아미노산 서열 사이에 최대량의 상동성이 제공되도록 정렬된다. 이러한 서열의 비교는 불변의 시스테인 잔기가 보존되는 것을 보여준다. 제 1 서열이 본 발명의 BBPI 에서의 동등한 아미노산 위치를 측정하기 위한 바람직한 구조이지만, 단백질 BBPI 단백질에 대한 3 차 구조의 수준에서의 상동성을 측정함으로써 동등한 잔기를 또한 확인할 수 있다.
동등한 아미노산 위치는 단백질의 특정 아미노산 잔기의 둘 이상의 주쇄 원자의 원자 배위가 추정되는 동등한 잔기를 가지며 관심 단백질 (N 에 대한 N, CA 에 대한 CA, C 에 대한 C 및 O 에 대한 O) 이 정렬 후 0.13 nm 내, 바람직하게는 0.1 nm 내에 있는 것들로서 정의된다. 정렬은 분석된 단백질의 비-수소 단백질 원자의 원자 배위의 최대 중첩이 주어지도록 최상의 모델이 기원 및 위치된 후 이루어진다. 바람직한 모델은, 결정학 및 단백질 평가/분석의 당업자에게 알려져 있는 방법을 사용하여 측정된, 이용가능한 최고 해상도에서의 실험적 분획 데이터에 대한 최저 R 인자가 수득되는 결정학적 모델이다. 콩에서의 바우만 버크 저해제의 결정 구조가 측정된 바 있으며 (Hwang et al. J Biol Chem. 10;252(3):1099-101 [1977], Wei et al., J Biol Chem. 10;254(11):4892-4 [1979], Voss et al. Eur J Biochem. 15;242(1):122-31 [1996]), 3 차 구조의 수준에서 동등한 아미노산 위치를 측정하기 위해 상기 개괄된 바와 같이 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "융합 폴리펩티드", "융합 단백질" 및 "융합 유사체" 는 아미노-말단으로부터, 숙주 세포에서 분비 서열 기능물로서 신호 펩티드 기능물, 숙주 세포에서 보통 분비되는 분비 폴리펩티드 또는 이의 부분, 절단가능 링커 폴리펩티드 및 원하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 융합 폴리펩티드는 분비 서열과 분비된 폴리펩티드 사이에 위치한 스페이서 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 숙주 세포 효소 (예를 들어 프로테아제) 에 의해 처리되어, 융합 단백질에서의 다른 단백질 서열이 없는 원하는 단백질이 수득된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "융합 유사체", "융합 폴리펩티드" 및 "융합 단백질" 은 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "활성" 은 프로테아제와 관련된 효소적 활성과 같은, 특정 단백질과 관련된 임의의 활성을 의미한다. 일부 구현예에서, 활성은 생물학적 활성이다. 추가적인 구현예에서, 활성은 측정가능한 하류 효과를 야기하는 수용체에 대한 단백질의 결합을 포함한다 (예를 들어 동족 수용체에 대한 VEGF 결합). "생물학적 활성" 은 당업자에 의해 상기 단백질에 통상 기인될 수 있는 임의의 활성을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "프로테아제 저해 활성" 은 프로테아제의 단백질분해 활성을 저해하는데 있어서의, 즉 펩티드 연결을 갖는 기질 또는 펩티드를 가수분해하기 위한 프로테아제의 능력을 저해하는데 있어서의 BBPI 의 활성을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "발현" 은 폴리펩티드가 유전자의 핵산 서열을 기준으로 생성되는 과정을 의미한다. 상기 방법은 전사 및 번역을 모두 포함한다.
BBPI 를 참조로 하는 용어 "생성" 은 하기를 포함하는 전체 길이 프로테아제의 2 가지 처리 단계를 포함한다: 1. 단백질 분비 동안 발생하는 것으로 알려져 있는 신호 펩티드의 제거; 및 2. BBPI 의 활성 성숙 형태를 생성시키며 성숙 과정 동안 발생하는 것으로 알려져 있는 프로 (pro) 부위의 제거 (Wang et al., Biochemistry 37:3165-3171 (1998); Power et al., Proc Natl Acad Sci USA 83:3096-3100 (1986)).
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "생성 수율" 은 비개질 및/또는 개질 변이체 프로테아제 저해제 예를 들어 변이체 BBPI 가 생성되는 수준을 의미한다. 생성 수율이 더 클수록, 생성되는 프로테아제 저해제의 수준 또는 양이 더 크다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "효과적 생성" 은 본원에서 단백질 예를 들어 개질 변이체 BBPI 의 생성을 의미하며, 상기 단백질이 비개질 또는 전구체 변이체 BBPI 보다 더 큰 수준으로 생성되는 것을 내포한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 본 발명의 단백질 또는 이의 절편에 적용되는 경우 용어 "실질적으로 순수한" 은 의도된 용도에 대해 실제적이고 적절한 정도로 다른 물질이 본질적으로 없는 단백질을 의미한다. 특히, 단백질은 예를 들어 단백질 서열분석 및/또는 약학 제제 생성에 있어서 유용하도록 충분히 순수하며 숙주 세포의 다른 생물학적 구성물이 충분히 없다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "실질적으로 없는" 은 원하는 폴리펩티드의 제제가 약 20% (건조 중량%) 미만의 다른 단백질 (즉, 오염 단백질), 약 10% 미만의 다른 단백질, 약 5% 미만의 다른 단백질, 또는 약 1% 미만의 다른 단백질을 갖는 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오티드", "핵산 분자" 및 "핵산 서열" 은 RNA, DNA 및 cDNA 분자를 비제한적으로 포함하는 핵산의 임의의 형태의 서열을 포함한다. 유전적 코드의 퇴화의 결과로서, 주어진 단백질을 인코딩하는 다수의 뉴클레오티드 서열이 생성될 수 있다는 것이 이해될 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "DNA 구성물", "폴리뉴클레오티드 구성물" 및 "형질전환 DNA" 는 숙주 세포 또는 생물에 서열을 도입하기 위해 사용되는 DNA 를 의미하는 것으로 상호교환적으로 사용된다. DNA 는 PCR 또는 당업자에게 알려져 있는 임의의 다른 적합한 기술(들) 에 의해 시험관내 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, DNA 구성물은 관심 서열 (예를 들어, 개질된 서열) 을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 서열은 제어 요소 (예를 들어 프로모터 등) 와 같은 추가적인 요소에 작동적으로 연결된다. 일부 구현예에서, DNA 구성물은 숙주 세포 염색체에 상동인 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, DNA 구성물은 비-상동 서열을 포함한다. DNA 구성물이 시험관내에서 결집되고 나면, 이는 숙주 세포 염색체의 부위를 돌연변이화시키는데 사용될 수 있다 (즉, 이종 서열로 내생성 서열을 대체함).
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "이종 DNA 서열" 은 숙주 세포에서 자연적으로 발생하지 않는 DNA 서열을 의미한다. 일부 구현예에서, 이종 DNA 서열은 조절 요소를 포함하는, 상이한 유전자의 일부로 이루어지는 키메라 DNA 서열이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "이종 단백질" 은 숙주 세포에서 자연적으로 발생하지 않는, 즉, 이종 서열에 의해 인코딩되는 단백질 또는 폴리펩티드를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "상동 단백질" 은 세포에서 선천적이거나 자연 발생적인 단백질 또는 폴리펩티드를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "벡터" 는 하나 이상의 세포 유형에 핵산을 도입하기 위해 설계된 폴리뉴클레오티드 구성물을 의미한다. 벡터는 클로닝 벡터, 발현 벡터, 셔틀 벡터 및 플라스미드를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 구성물은 개질 변이체 BBPI 를 인코딩하는 DNA 서열을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "발현 벡터" 는 외래 세포에서 이종 DNA 절편을 혼입시키고 발현시키는 능력을 갖는 벡터를 의미한다. 많은 원핵생물 및 진핵생물 발현 벡터가 시판된다. 적절한 발현 벡터의 선택은 당업자의 지식 내에 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "플라스미드" 는 클로닝 벡터로서 사용되고, 일부 진핵생물 또는 원핵생물에서 염색체외 자가 복제 유전적 요소를 형성하거나, 숙주 염색체에 융합되는 원형 이중 가닥 (ds) DNA 구성물을 의미한다.
핵산 서열을 세포에 도입하는 맥락에서 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "도입된" 은 핵산 서열을 세포에 이동시키는데 적합한 임의의 방법을 의미한다. 도입을 위한 이러한 방법은 비제한적으로, 원형질체 융합, 트랜스펙션, 형질전환, 컨쥬게이션 및 형질도입을 포함한다 (예를 들어, Ferrari et al., "Genetics," in Hardwood et al, (eds.), Bacillus, Plenum Publishing Corp., 페이지 57-72, [1989] 참조).
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "형질전환된" 및 "안정하게 형질전환된" 은 두 세대 이상 동안 유지되는 에피솜 플라스미드로서, 또는 이의 게놈에 융합된 비-선천적 (이종) 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 세포를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열을 참조로 사용되는 경우 "퍼센트 (%) 서열 동일성" 또는 "% 상동성" 은 본원에서 개시되는 서열의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드와 동일한 후보 서열에서의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 백분율로서 정의된다. 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열에 의해 공유되는 % 동일성은 당업계에 알려져 있는 방법에 의해 서열을 정렬하고 동일성을 측정함으로써 분자들 사이 서열 정보의 직접적 비교에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, 정렬은 정렬되는 서열에서의 갭의 도입을 포함한다. 추가로, 후보 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열보다 더 많거나 더 적은 뉴클레오티드 또는 아미노산을 포함하는 서열에 대해, 뉴클레오티드 또는 아미노산의 총 수에 대한 상동 뉴클레오티드 또는 아미노산의 수를 기준으로 상동성 백분율이 측정될 것이라는 점이 이해된다. 따라서, 예를 들어, 더 짧은 서열에서의 뉴클레오사이트 또는 아미노산의 수를 사용하여, 본원에서 확인되는 서열의 것보다 짧은 서열의 상동성을 측정할 것이다. 이러한 상동성은 당업계에 알려져 있는 표준 기술을 사용하여 측정된다 (예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 [1981]; Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 [1970]; Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 [1988]; Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group, Madison, WI) 에서의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA 와 같은 프로그램; 및 Devereux et al., Nucl. Acid Res., 12:387-395 [1984] 참조).
본원에서 사용되는 바와 같이, "유사 서열" 은 단백질의 기능이 프로테아제 저해제의 바우만 버크 패밀리에 대해 지정된 것과 본질적으로 동일한 것이다. 추가적으로, 유사 단백질은 SEQ ID NO:187 의 변이체 BBPI 의 서열과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 포함한다. 유사 서열은 서열 정렬의 알려져 있는 방법에 의해 측정된다. 상기 및 하기에서 나타낸 바와 같이 통상적으로 사용되는 정렬 방법은 BLAST 이지만, 다른 방법들이 또한 서열 정렬에 있어서 사용된다.
유용한 알고리즘의 한 예는 PILEUP 이다. PILEUP 은 점진적, 쌍별 (pairwise) 정렬을 사용하여 관련 서열 군으로부터 다수의 서열 정렬을 생성시킨다. 이는 또한 정렬을 생성시키는데 사용된 다발화 관계를 나타내는 트리를 그려낼 수 있다. PILEUP 은 Feng 과 Doolittle 의 점진적 정렬 방법의 단순화를 사용한다 (Feng and Doolittle, J. Mol. Evol., 35:351-360 [1987]). 상기 방법은 Higgins 와 Sharp 에 의해 기재되는 것과 유사하다 (Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-153 [1989]). 유용한 PILEUP 매개변수는 3.00 의 디폴트 갭 중량, 0.10 의 디폴트 갭 길이 중량 및 칭량된 말단 갭을 포함한다.
유용한 알고리즘의 또 다른 예는 Altschul et al. 에 의해 기재된 BLAST 알고리즘이다 (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410, [1990]; 및 Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 [1993]). 특히 유용한 BLAST 프로그램은 WU-BLAST-2 프로그램이다 (Altschul et al., Meth. Enzymol., 266:460-480 [1996] 참조). WU-BLAST-2 는 여러 탐색 매개변수를 사용하는데, 이의 대부분은 디폴트 값으로 설정된다. 조정가능한 매개변수는 하기의 값으로 설정된다: 오버랩 스팬 (overlap span) = 1, 오버랩 분획 (overlap fraction) = 0.125, 단어 역치 (T) = 11. HSP S 및 HSP S2 매개변수는 동적 값이며 탐색되는 관심 서열에 대한 특정 데이터베이스의 조성물 및 특정 서열의 조성물에 따라 프로그램 자체에 의해 구축된다. 그러나, 상기 값은 민감도가 증가되도록 조정될 수 있다. % 아미노산 서열 동일성 값은 매치되는 동일한 잔기 수를 정렬된 부위에서의 "더 긴" 서열의 잔기의 총 수로 나누어 측정된다. "더 긴" 서열은 정렬된 부위에서의 가장 실제적 잔기를 갖는 것이다 (정렬 스코어를 최대화하기 위해 WU-Blast-2 에 의해 도입된 갭은 무시함). 바람직한 방법은 디폴트 매개변수로 설정되고 오버랩 스팬 및 오버랩 분획이 각각 1 및 0.125 로 설정된 WU-BLAST-2 의 BLASTN 모듈을 이용한다.
"숙주 세포" 는 본 발명에 따른 DNA 를 포함하는 발현 벡터용 숙주로서 역할하는 세포로부터의 적합한 세포를 의미한다. 적합한 숙주 세포는 자연 발생적 또는 야생형 숙주 세포일 수 있거나, 변경된 숙주 세포일 수 있다. 한 구현예에서, 숙주 세포는 그람 양성 미생물이다. 일부 바람직한 구현예에서, 상기 용어는 바실러스 속 (genus Bacillus) 에서의 세포를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "바실러스 종 (Bacillus sp.)" 은 B. 서브틸리스 (B. subtilis), B. 리체니포르미스 (B. licheniformis), B. 렌투스 (B. lentus), B. 브레비스 (B. brevis), B. 스테아로써모필루스 (B. stearothermophilus), B. 알칼로필루스 (B. alkalophilus), B. 아밀로리쿠에파시엔스 (B. amyloliquefaciens), B. 클라우시 (B. clausii), B. 할로두란스 (B. halodurans), B. 메가테리움 (B. megaterium), B. 코아굴란스 (B. coagulans), B. 써큘란스 (B. circulans), B. 라우투스 (B. lautus) 및 B. 투린지엔시스 (B. thuringiensis) 를 비제한적으로 포함하는, 당업자에게 알려져 있는 바와 같은 "바실러스" 속 내의 모든 종을 포함한다. 바실러스 속은 지속적인 분류학적 개편을 거치는 것으로 인지된다. 따라서, 상기 속에는 이제는 "제오바실러스 스테아로써모필루스 (Geobacillus stearothermophilus)" 라고 불리는 B. 스테아로써모필루스 (B. stearothermophilus) 와 같은 이러한 생물을 비제한적으로 포함하는, 재분류된 종이 포함되는 것으로 의도된다. 산소의 존재 하에서의 내성 내생포자의 생성은, 상기 특성이 또한 현재 명칭 알리시클로바실러스 (Alicyclobacillus), 암피바실러스 (Amphibacillus), 아네우리니바실러스 (Aneurinibacillus), 아녹시바실러스 (Anoxybacillus), 브레비바실러스 (Brevibacillus), 필로바실러스 (Filobacillus), 그라실리바실러스 (Gracilibacillus), 할로바실러스 (Halobacillus), 파에니바실러스 (Paenibacillus), 살리바실러스 (Salibacillus), 써모바실러스 (Thermobacillus), 우레이바실러스 (Ureibacillus) 및 비르지바실러스 (Virgibacillus) 에 적용됨에도 불구하고, 바실러스 (Bacillus) 속의 특징을 정의하는 것으로 간주된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "프로모터 서열" 은 발현 목적을 위해 세균 숙주에 의해 인지되는 DNA 서열을 의미한다. 바람직한 구현예에서, 이는 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 서열에 작동적으로 연결된다. 이러한 연결은 융합 DNA 서열을 인코딩하는 DNA 서열의 번역 개시 코돈에 대한 프로모터의 위치화를 포함한다. 특히 바람직한 구현예에서, 프로모터 서열은 융합 DNA 서열의 발현을 매개하는 전사 및 번역 제어 서열을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 핵산은, 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓이는 경우 "작동적으로 연결된다". 예를 들어, 폴리펩티드의 분비에 참여하는 프리 (pre) 단백질로 발현된다면 분비 리더를 인코딩하는 DNA 는 폴리펩티드에 대한 DNA 에 작동적으로 연결되고; 서열의 전사에 영향을 미친다면 프로모터 또는 인핸서는 코딩 서열에 작동적으로 연결되고; 또는 번역을 촉진하도록 위치된다면 리보솜 결합 위치는 코딩 서열에 작동적으로 연결된다. 작동적으로 연결된 DNA 서열은 통상 인접하며, 분비 리더의 경우 인접하고 판독 상에 있다. 그러나, 인핸서는 인접할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 위치에서의 라이게이션에 의해 이루어진다. 이러한 위치가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커를 통상적 실행에 따라 사용한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "재조합" 은 이종 핵산 서열의 도입에 의해 개질된 세포 또는 벡터 또는 그렇게 변형된 세포로부터 유래한 세포에 대한 참조를 포함한다. 따라서, 예를 들어, 재조합 세포는 세포의 선천적 (비-재조합) 형태 내에서 동일한 형태로 발견되지 않은 유전자를 발현하거나, 고의의 인간 개입의 결과로서 다르게는 비정상적으로 발현되는, 하향 발현되는 또는 전혀 발현되지 않는 선천적 유전자를 발현한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "개인 케어 조성물" 은 피부, 헤어, 손톱, 구강 및 관련 막에 대한, 이러한 표면 및 막에 대한 향상, 세정, 미화, 처리 및/또는 케어를 목적으로 한 적용을 위한 생성물을 의미한다. 일부 구현예에서, 개인 케어 조성물은 에멀젼화 비히클, 예컨대 영양 크림 또는 로션, 안정화 겔 또는 분산 시스템, 예컨대 피부 유연제, 영양 에멀젼, 영양 크림, 마사지 크림, 처리제 세럼, 리포솜 전달 시스템, 국소 얼굴 팩 또는 마스크, 계면활성제계 세정 시스템 예컨대 샴푸 또는 바디 워시, 에어로졸화 또는 분무 분산액 또는 에멀젼, 헤어 또는 피부 컨디셔너, 스타일링 보조제, 또는 착색 제품 예컨대 액체, 크림, 고체, 무수 또는 연필형의 메이크업의 형태이다. 그러나, 본 발명에서 다양한 형태가 사용되기 때문에, 본 발명이 임의의 특정한 형태에 제한되는 것으로 의도되지는 않는다.
개인 케어 생성물은 개인 케어 적용물 (예를 들어 화장품, 피부 케어, 구강 케어, 헤어 키어, 손톱 케어) 에서 사용되는 미용, 비처방전 ("OTC") 화합물로서 분류/기재될 수 있다. 일부 구현예에서, 개질 변이체 BBPI 는 개인 케어 조성물 예컨대 헤어 케어 조성물, 피부 케어 조성물, 손톱 케어 조성물, 미용 조성물, 또는 이의 임의의 조합에 첨가된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "피부 케어 조성물" 은, 주름 최소화, 주름 제거, 탈색, 착색, 피부 유연, 피부 평활화, 제모, 세정 등을 비제한적으로 포함하는 유리한 특성을 제공하기 위해 피부에 적용되는 조성물을 의미한다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명은 피부 톤을 향상시키는 피부 케어 조성물을 제공한다. 이러한 구현예에서, 향상은 주름 완화, 피부 감촉 평활화, 피부 색 개질, 및 다른 바람직한 미용 이익을 포함한다. 추가적인 구현예에서, 피부 케어 조성물은 바디 워시, 보습 바디 워시, 데오도란트 바디 워시, 살균 세정제, 피부 보호 처리제, 바디 로션, 얼굴 크림, 보습 크림, 얼굴 세정 에멀젼, 계면활성제계 얼굴 세정제, 얼굴 박리 겔, 얼굴 토너, 박리 크림, 얼굴 마스크, 애프터 쉐이브 로션, 밤 및/또는 방사선 보호 조성물 (예를 들어, 선스크린) 로 이루어지는 군에서 선택되는 형태이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "미용 조성물" 은 화장품에서 사용되는 조성물을 의미한다. 식품ㆍ의약품ㆍ화장품법 (FD&C Act) 정의가 본원에서 사용된다. 따라서, 화장품은 세정, 미화, 매력 촉진, 또는 외양 변화를 위해 인간 신체에 문질러지고, 부어지고, 뿌려지거나 분무되고, 이에 도입되거나, 다르게는 이에 적용되는 것으로 의도된 물품으로서, 이의 의도된 용도에 의해 정의된다. 이러한 조성물은 비-치료적 이익을 제공하며 약학물로서 규제되지 않는다. 그러나, 일부 입장에서, 미용 이익 (예를 들어, 피부 또는 헤어 질환을 치료할 뿐 아니라 이의 착색 또는 다른 이익을 위해 미용 조성물을 함유하는 생성물) 을 제공하기 위해 미용 조성물이 약학 조성물에 혼입된다. 미용 조성물은 본원에서 정의된 바와 같은 메이크업 조성물을 포함한다. 또한, 본 발명은 인간 외의 동물에 대한 화장품의 사용을 포함하는 것으로 의도된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약학 조성물" 및 "치료 조성물" 은 단독 미용 이익보다는 의학적 이익을 제공하는 약물과 같은 조성물을 의미한다. 미국에서, 약학 및 치료 조성물은 특정 상태의 치료 및/또는 예방을 위해 식약청에 의해 승인된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약물" 은 FD&C Act 정의에서와 같이 정의된다. 따라서, 약물은 질환의 진단, 치유, 경감, 치료 또는 예방에서의 사용을 위해 의도된 물품, 및 인간 또는 다른 동물의 신체의 구조 또는 임의의 기능에 영향을 주도록 의도된 물품 (식품 외) 으로서 정의된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "리브-온" 은 대상에게 적용되고 조성물에 노출된 부위가 세정되기 전 통상 적어도 수 시간 (예를 들어 4-12 시간) 동안 제거되지 않는 (예를 들어 세척, 헹굼 등에 의해 세정되지 않는) 조성물을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "린스-오프" 조성물은 적용되고 이의 적용 후 곧 (일반적으로 적용의 약 30 분 이내) 세정되는 (예를 들어 세척, 헹굼 등에 의해) 조성물이다. 일부 바람직한 구현예에서, 린스-오프 조성물은 처리되는 부위 상에 유효량의 활성물(들) 이 침착되도록 제형화된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "미용 이익" 은 개인 케어 조성물의 투여에서 야기되는 바람직한 미용 변화를 의미한다. 미용 이익은 비제한적으로 피부, 헤어, 손톱 및 구강의 상태에서의 향상을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 미용 이익은 본 발명의 피부 케어, 헤어 케어, 손톱 케어 및 메이크업 조성물에 의해 제공된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "미용적으로 허용가능한" 은 합리적인 이익/위험성 비율에 상응하는, 지나친 독성, 비혼화성, 불안정성, 자극, 알레르기 반응 등이 없이 인간 및/또는 다른 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 물질을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 본 발명의 조성물을 참조로 사용되는 용어 "안료", "색 안료" 및 "염료" 는 조성물에 색을 제공하고/하거나 조성물이 적용되는 표면 (예를 들어 피부 및/또는 헤어) 에 색을 부여하는 임의의 화합물을 포함한다.
용어 "방사선 보호제" 는 차단 또는 여과할 수 있는 물질을 의미한다. UV 조사 선스크린 및 선블럭이 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "피부 외양 및/또는 상태를 향상시키는" 은 본 발명의 개인 케어 조성물을 사용하여 달성되는 임의의 이익을 의미한다. 이익의 예는 비제한적으로, 피부의 과다색소침착된 부위를 미백시키고/시키거나 피부 색을 균일하게 하고, 건조함을 경감시키고, 거친 것, 건조한 곳을 제거하고, 피부의 수분 보유 능력 및/또는 환경적 스트레스로부터의 자체 보호 능력을 향상시키고, 미세 선 및 주름의 출현을 감소시키고, 외양 및 피부 톤을 향상시키고, 피부 견실 및/또는 유연을 증가시키고, 피부 처짐을 감소시키고, 피부 윤기 및 청명을 증가시키고, 피부 재생 과정을 증가시키고/시키거나 솜털을 제거하는 것을 포함하는, 피부 색에서의 결점 및/또는 흠을 감소시키는 것을 포함한다. 피부의 시각적 외양을 향상시키는 것은 또한 주름, 위축증, 피부 미백, 피부 다크닝, 피부 매끈함을 조절하고/하거나 모공의 시각적 외양을 감소시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 피부 외양 및/또는 상태를 향상시키는 것은 본 발명의 개인 케어 조성물로의 피부 장애 치료로 인한 피부 향상을 야기한다.
용어 "혈관신생" 은 생물에서의 조직의 혈관화 증가 및/또는 혈관의 발생을 야기하는 생물학적 과정을 의미한다.
용어 "혈관신생성 질환", "혈관신생 장애" 및 "혈관신생 피부 장애" 는 장애, 일반적으로 조직에서의 증가된 혈관화의 결과로서 발생하거나 이를 야기하는 피부 장애 또는 관련 장애를 참조로 사용된다. 종종, 혈관신생성 질환의 병인을 알려져 있지 않다. 그러나, 혈관신생이 질환 형세의 실제적 원인이거나 단순히 질환 형세의 상태가 중요하지 않건 간에, 질환 형세 또는 상태를 치료 또는 역전시키는데 있어서의 혈관신생의 저해는 본 발명의 중요한 양상이다. 따라서, 본 발명이 작용의 임의 특정한 메카니즘에 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 본 발명의 화합물을 이용하는 치료에 적합한 혈관신생 피부 장애의 예는 비제한적으로, 건선, 여드름, 주사코, 사마귀, 습진, 혈관종 및 림프관신생, 스터지-웨버 증후군 (Sturge-Weber syndrome), 신경섬유종증, 결절성 경화증, 만성 염증 질환 및 관절염을 포함한다. 1 차 또는 2 차 특징, 증가된 혈관화를 갖는 임의의 피부 장애는 본원에서 혈관신생 피부 장애로 간주된다. 따라서, 본 발명에 의해 제공되는 VEGF-결합 BBPI (VEGF-BBPI) 를 포함하는 개인 케어 조성물은 다양한 혈관신생 피부 장애 및/또는 상태의 치료에 사용된다.
용어 "주사코" 는 코 및 볼의 인접 부위를 통상 포함하는 혈관 및 소포 확장을 특징으로 하는 여드름, 주사코 또는 홍반을 설명하는데 사용된다. 주사코는 매우 경증이지만 지속적인 홍반에서부터 고질적인 구진 및 농포를 갖는 피지선의 광범위한 과형성까지 다양할 수 있으며, 영향받는 홍반성 위치에서 모세혈관 확장증을 수반한다. 이러한 상태는 또한 상태의 중증도에 따라 "비대 주사코" 또는 "딸기코" 로서 나타내어진다. 상기 용어가 상태의 모든 다양한 형태를 포함하는 것으로 의도된다.
용어 "건선" 은 외접한, 별개의, 그리고 합류하는, 적색을 띤, 은빛 비늘의 반구진 (maculopapule) 의 발진을 특징으로 하는 피부 상태를 설명하는데 사용된다. 본 발명이 임의의 특정 신체 부위에 제한되는 것으로 의도되지 않으나, 건선 병변은 통상 팔꿈치, 무릎, 두피 및 몸통에서 발생한다. 현미경적으로, 이러한 병변은 특징적 부전각화증 및 표피 능선 (rete ridge) 의 신장을 입증한다.
용어 "여드름" 은 염증성 소포, 구진성 및 농포성 발진 (피지체 포함) 을 특징으로 하는 피부 상태를 설명하는데 사용된다. 다양한 형태의 여드름이 존재하지만, 가장 흔한 형태는 얼굴, 상부 등 및 가슴의 발진을 특징으로 하며 주로 염증성 기부에서의 면포, 낭종, 구진 및 농포로 이루어지는 단순 여드름 (acne simplex) 또는 심상성 여드름 (acne vulgaris) 으로서 알려져 있다. 상기 상태는 호르몬 활성에 의해 영향받는 것으로 여겨지는 과활성 피지체로 인해 사춘기 및 청년기에 주로 발생한다.
용어 "습진" 은 피부의 급성 또는 만성 염증 상태, 통상 홍반, 부종, 구진, 소수포 및/또는 딱지를 설명하는데 사용되는 일반적 용어이다. 이러한 상태에는 종종 태선화, 비늘 제거, 및 가끔씩은 홍반의 거뭇함, 및 드물게는 과다색소침착이 뒤따른다. 습진은 종종 가려움 및 작열감의 감각을 수반한다. 표피내 해면화로 인해 습진 소수포가 형성된다. 습진은 가끔 "피진 (tetter)", "건성 피진 (dry tetter)" 및 "마른 버짐 (scaly tetter)" 으로서 구어적으로 나타내어진다. 습진의 다양한 하위범주가 존재하며, 이들 모두는 본 발명에 따른 화합물 중 하나 이상으로 치료된다.
용어 "혈관종" 은 내피 세포 (혈관을 받치는 세포) 의 양성 자가-소퇴성 (self-involuting) 종양을 의미한다. 혈관종은 순환계와 연결되며 혈액으로 채워진다. 외양은 위치에 의존적이다. 이들이 피부 표면 상에 있는 경우 이는 익은 딸기처럼 보이며, 이들이 피부 바로 밑에 있는 경우 이는 푸르스름한 부기로서 존재한다. 때때로 이는 간 또는 후두와 같은 내부 기관에서 성장한다. 대략 80% 가 얼굴 및 목에 위치하며, 그 다음으로 가장 우세한 위치는 간이다. 본 발명의 개인 케어 조성물은 피부의 혈관종, 즉 피부 표면 상에 있는 혈관종 및 피부 바로 밑의 혈관종을 치료하는 것으로 의도된다.
본원에서 용어 "경피증" 은 피부 또는 다른 기관에서의 콜라겐의 과다 침착을 특징으로 하는 만성 질환을 의미한다. 경피증은 피부에 영향을 주며, 보다 심각한 경우에서는 혈관 및 내부 기관에 영향을 줄 수 있다. 가장 명백한 증상은 통상 피부의 경화 및 관련 흉터이다. 피부는 굳어지며, 붉은색을 띠거나 비늘성으로 나타날 수 있다. 혈관은 또한 보다 가시적이 될 수 있다. 상기 과정에서의 중요한 역할자는 형질전환 성장 인자 (TGFβ) 이다. 경피증의 피부 변화에 대한 국소적 처리는 질환 진행을 변경시키지 않으나 통증 및 궤양화를 향상시킬 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "헤어 케어 조성물" 은 비후화, 박화, 착색, 탈색, 세정, 컨디셔닝, 유연화, 쉐이핑 등과 같은 유리한 특성이 제공되도록 헤어에 적용되는 조성물을 의미한다. 일부 구현예에서, 헤어 케어 조성물은 샴푸, 컨디셔너, 비듬 방지 처리제, 스타일링 보조제, 스타일링 컨디셔너, 헤어 손상 또는 처리 세럼, 로션, 크림, 포마드 및 화학적 처리제로 이루어지는 군에서 선택되는 형태의 것이다. 다른 구현예에서, 스타일링 보조제는 스프레이, 무스, 린스, 겔, 거품 및 이의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된다. 추가적인 구현예에서, 화학적 처리제는 퍼머넌트 웨이브, 릴랙서, 및 퍼머넌트, 세미-퍼머넌트, 일시적 색 처리제 및 이의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "헤어 성장을 저해하는" 및 "헤어 성장의 저해" 는 헤어 길이 및/또는 두께의 관찰된 감소를 의미한다. 따라서, 일부 바람직한 구현예에서, 본 발명의 개인 케어 조성물의 적용은, 본 발명의 개인 케어 조성물이 적용되지 않은 부위와 비교하여 헤어 길이 및/또는 두께를 감소시키는데 있어서의 이익을 제공한다. 일부 구현예에서, 헤어 성장 및/또는 두께의 관찰된 감소는 비처리된 부위와 비교하여 1% 미만 내지 99% 초과의 범위인 한편, 다른 구현예에서, 관찰된 감소는 약 100% 내지 약 90%, 약 90% 내지 약 80%, 약 80% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 60%, 약 60% 내지 약 50%, 약 50% 내지 약 40%, 약 40% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 20%, 약 20% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 1% 이다. 실제로, 감소가 시각적으로 (즉, 육안으로) 또는 다른 수단으로 관찰가능한 한, 상기 용어가 임의의 특정 백분율 감소에 제한되는 것으로 의도되지는 않는다. 또한, 상기 기재된 바와 같이, 상기 용어가 임의의 정도로 "헤어 성장을 방지하는" 것을 포함하는 것으로 의도된다. 상기 용어가 헤어 성장의 완전한 방지 (즉, 헤어 성장이 관찰되지 않음) 에 제한되는 것으로 의도되지는 않는다.
용어 "피부과적 염증 장애" 또는 "염증 피부 장애" 는 피부의 염증과 관련되는 피부 상태를 의미한다. 일부 구현예에서, 염증 피부 장애는 염증성 사이토카인 예를 들어 TNFα 의 상승된 수준과 관련되는 장애이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 일부 구현예에서, 용어 "화합물" 은 본 발명의 개인 케어 조성물에 포함되어 있는 BBPI 를 의미한다.
용어 "유효량" 은 치료되는 질환 또는 상태에서의 바람직한 변화를 생성하기 위해, 예를 들어 상기 변화가 헤어 성장이면, 헤어 성장의 방지, 또는 장애로 야기되거나 이와 연관된 상태 개선을 위해 사용될 수 있는 본 발명에 따른 화합물의 농도 또는 양을 설명하기 위해 명세서를 통해 사용된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "안전 및 유효량" 은 물질이 적용되는 부위에 대해 긍정적인 변형을 유의하게 유도하고, 또한 심각한 부작용의 생성을 야기하지 않는 (합리적인 위험성/이익 비율에서) 물질의 충분량을 의미한다. 물질의 안전 및 유효량은 치료하는 특정 피부 또는 다른 신체 부위, 치료하는 대상의 연령, 치료하는 상태의 중증도, 치료 지속기간, 병발 치료요법의 성질, 사용되는 특정 물질, 이용되는 특정 담체 등에 따라 다양할 수 있다. 당업자는 조성물의 바람직한 적용을 위해 본원에 제공되는 개인 케어 조성물의 농도를 조정할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "활성물(들)" 은 치료하는 대상에게 이익을 부여하는 조성물을 의미한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 발명은 개질 변이체 BBPI, 예를 들어 개질 변이체 VEGF-BBPI, 적용되는 부위에 이익을 제공하는 기능을 하는 "1 차 활성물" 을 포함하는 개인 케어 조성물을 제공한다. 따라서, 일부 구현예에서, 개질 변이체 VEGF-BBPI 는 피부 케어 제형에 존재하며 혈관신생 피부 장애를 겪는 대상의 피부를 치료하는 역할을 한다. 상기 용어가 VEGF-BBPI 에 제한되는 것으로 의도되지는 않는데, 이는 이익을 부여하는 본 발명의 개인 케어 조성물에 추가적인 구성물이 존재하기 때문이다. 일부 구현예에서, 이러한 추가적인 구성물은 명칭 "2 차 활성물" 에 의해 포함된다. 1 차 및 2 차 활성물은 본원에서 집합적으로 "활성물" 로서 나타내어진다. 본 발명에 의해 제공되는 다른 "1 차 활성물" 은 FGF-BBPI, TGF-BBPI 및 TNF-BBPI 를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "비타민 B3 화합물" 은 하기 화학식을 갖는 화합물; 이의 유도체; 및 하기의 것 중 임의의 것의 염을 의미한다:
Figure pct00011
[식 중,
R 은 -CONH2 (즉, 니아신아미드), -COOH (즉, 니코틴산) 또는 -CH2OH (즉, 니코티닐 알코올) 임].
본원에서 사용되는 바와 같이, "비-혈관이완" 은 통상 대상 조성물로의 피부 적용 후 시각적 홍조 반응을 산출시키지 않는 에스테르를 의미한다. 이러한 화합물이 육안으로 관찰가능하지 않은 혈관이완화를 일으킬 수 있으나, 대다수의 일반 집단이 시각적 홍조 반응을 경험하지 않을 것으로 예기된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "레티노이드" 는 피부 내/상에서 비타민 A 의 생물학적 활성을 갖는 비타민 A 및/또는 레티놀성 화합물의 모든 자연적 및/또는 합성 유사체 뿐 아니라 이러한 화합물의 기하학적 이성질체 및 입체이성질체를 포함한다. 그러나, 상기 용어가 이러한 화합물에 제한되는 것으로 의도되지 않는데, 이는 상기 용어가 비타민 A 알코올 (레티놀) 및 이의 유도체 예컨대 비타민 A 알데히드 (레티날), 비타민 A 산 (레티노산) 및 비타민 A 에스테르 (예를 들어, 레티닐 아세테이트, 레티닐 프로피오네이트 및 레티닐 팔미테이트) 등을 포함하기 때문이다. 상기 용어가 모든-트랜스-레티노산 및 13-시스-레티노산을 포함하는 것으로 또한 의도된다. 또한, 상기 용어가 캡슐화될 뿐 아니라 다양한 형태로 사용하기 위해 제공되는 조성물을 포함하는 것으로 의도된다. 용어 "레티놀" 및 "레티날" 은 바람직하게는 모든-트랜스 화합물을 포함한다. 본 발명의 제형에 바람직하게 사용되는 레티노이드는 모든-트랜스-레티놀이며, 일반적으로 본원에서 "레티놀" 로서 나타내어진다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "카로테노이드" 는 단독 뿐 아니라 조합으로의 β-카로텐, 리코펜, 루테인, 아스타잔틴, 제아잔틴, 크립토잔틴, 시트라나잔틴, 칸타잔틴, 빅신, β-아포-4-카로테날, β-아포-8-카로테날, β-아포-8-카로텐 에스테르를 참조로 사용된다. 바람직하게 사용되는 카로테노이드는 β-카로텐, 리코펜, 루테인, 아스타잔틴, 제아잔틴, 시트라나잔틴 및 칸타잔틴이다. 일부 구현예에서, 카로테노이드는 결정질 형태 뿐 아니라, 건조 분말을 비제한적으로 포함하는 제형으로 이용된다 (예를 들어, 참고로 포함되는 EP 0　065　193 에서 기재된 바와 같은 건조 분말 참조). 일부 구현예에서, 리코펜, 아스타잔틴 및 칸타잔틴의 경우 바람직한 사용은 리코펜-, 아스타잔틴- 및 칸타잔틴-함유 건조 분말, 예를 들어 LYCOVIT
Figure pct00012
, LUCANTIN
Figure pct00013
Pink 및 LUCANTIN
Figure pct00014
Red (각각 리코펜, 아스타잔틴 및 칸타잔틴의 10% 건조 분말, BASF AG, Ludwigshafen, Germany 에서 시판됨) 의 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "분산상" 은 상기 상이 연속상에 의해 둘러싸이고 이에 현탁된 작은 입자 또는 액적으로 존재하는 바 대로, 에멀젼 기술 업계의 당업자에 의한 바와 같이 사용된다. 상기 분산상은 또한 "내부" 또는 "불연속" 상으로서 알려져 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "침투 증강제" 는 상부 각질층을 통한 깊은 피부층으로의 침투를 촉진하는 조성물을 의미한다. 침투 증강제의 예는 비제한적으로, 프로필렌 글리콜, 아존, 에톡시디글리콜, 디메틸 이소소르비드, 우레아, 에탄올, 디메틸 술폭시드, 마이크로에멀젼, 리포솜 및 나노에멀젼을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "에멀젼화제" 및 "계면활성제" 는 물질의 연속상 내에 분산상을 분산 및 현탁시키는 화합물을 의미한다. 계면활성제는 특히 피부 및/또는 헤어 세정용으로 의도되는 생성물에 사용된다. 특정 구현예에서, 용어 "계면활성제(들)" 는 에멀젼화제로서 또는 다른 계면활성제 목적 예컨대 피부 세정을 위해 사용되는지의 여부에 따라 표면-활성제를 참조로 사용된다.
다양한 구현예에서, 본 발명은 또한 "보호제" 예컨대 UV 흡수제 (예를 들어, 옥틸 메톡시신나메이트, 벤조페논-3, 티타늄 디옥시드 및 옥틸 살리실레이트); 필름-형성제 (예를 들어, VP/에이코센 공중합체); 코스메슈티컬제 (예를 들어, 펩티드 및 단백질, 알파 히드록시산, 및 레티놀 및 레티노산 유도체); 항산화제 (예를 들어, 토코페롤 및 이의 유도체, 및 아스코르브산 및 이의 유도체); 비타민 (예를 들어, B, D, K 및 이의 유도체); 발한 억제 활성물 (예를 들어, 수산화알루미늄 및 수산화지르코늄); 제모제 (예를 들어, 티오글리콜레이트 염); 여드름 방지제 (예를 들어, 살리실산 및 벤조일 퍼옥시드); 부식제 및 박리제 (예를 들어, 실리케이트, 푸미스 및 폴리에틸렌); 및 식물, 과일, 야채 및/또는 해양원의 추출물을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "생물활성" 은 조성물과 생물계 사이의 관계를 유발하고 이에 영향을 주는 것을 의미한다. 따라서, 상기 용어는 분자 조성물과 살아있는 생물학적 물질 (예를 들어 조직, 세포 등) 사이의 관계를 유발하고 이에 영향을 주는 것을 설명하는 어구로서 생물 공학 및 생물 과학의 당업자에 의한 바와 같이 사용된다.
명사로서 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "생물활동성" 은 살아있는 생물학적 물질 (예를 들어 조직, 세포 등) 에 투여시 생물활성을 나타내는 조성물을 의미한다. 상기 용어는 "생물활동성 화합물" 과 동의어로 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "실리콘 검" 은 약 200,000, 바람직하게는 약 200,000 내지 약 4,000,000 을 넘는 평균 분자량을 갖는 고분자량 실리콘을 의미한다. 상기 정의가 비-휘발성 폴리알킬 및 폴리아릴 실록산 검을 포함하는 것으로 의도된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "개질 변이체 BBPI 를 포함하는 조성물" 은 주어진 개질 변이체 BBPI 를 포함하는 임의의 조성물을 광범위하게 의미한다. 조성물은 임의의 형태, 특히 투여에 적합한 형태일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 화합물이 임의의 바람직한 경로 (예를 들어 국소, 경구 등) 에 의해 인간 또는 다른 동물에게 투여될 수 있는 경우, 상기 화합물은 "투여에 적합한 형태" 라고 일컬어진다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "안전 및 유효량" 은 물질이 적용되는 부위에 대해 긍정적인 변형을 유의하게 유도하고, 또한 심각한 부작용의 생성을 야기하지 않는 (합리적인 위험성/이익 비율에서) 물질의 충분량을 의미한다. 물질의 안전 및 유효량은 치료하는 특정 피부 또는 다른 신체 부위, 치료하는 대상의 연령, 치료하는 상태의 중증도, 치료 지속기간, 병발 치료요법의 성질, 사용되는 특정 물질, 이용되는 특정 담체 등에 따라 다양할 수 있다. 당업자는 조성물의 바람직한 적용을 위해 본원에 제공되는 개인 케어 조성물의 농도를 조정할 수 있다.
5.2 바우만 버크 프로테아제 저해제 스캐폴드
바우만 버크 프로테아제 저해제 단백질 (BBPI) 은 소단백질 (60-90 잔기) 의 운동학적 및 구조적으로 잘 분석된 부류이며, 단자엽 및 쌍자엽 식물의 종자에서만 발견되고, 식물의 임의의 다른 부분에서는 확인된 바 없다 (예를 들어, Birk, Int. J. Pept. Protein Res., 25:113-131 [1985] 참조). 많은 야생형 BBPI 스캐폴드의 서열이 단자엽 및 쌍자엽 종자 모두에서 측정되고 분석된 바 있다 (Prakash et al., J mol Evol 42:560-569 [1996]). 이는 통상, 일부가 1 개의 도메인을 가지고 일부가 2 개 초과의 도메일을 가지지만, 독립적 결합 루프를 각각 포함하는 2 개의 트리시클릭 도메인의 대칭적 구조를 갖는다. 콩으로부터 단리된 주요한 ~ 8 kDa 바우만 버크 저해제 (BBI) 는 2 개의 별개의 반응성 위치 루프를 갖는데, 루프 I 은 트립신과 같은 특이성을 갖는 프로테아제를 저해하고 루프 II 는 키모트립신과 같은 특이성을 갖는 프로테아제를 저해한다 (예를 들어, Chen et al., J. Biol. Chem., 267:1990-1994 [1992]; Werner and Wemmer, Biochem., 31:999-1010 [1992]; Lin et al., Eur. J. Biochem., 212:549-555 [1993]; Voss et al., Eur. J. Biochem., 242:122-131 [1996]; 및 Billings et al., Pro. Natl. Acad. Sci., 89:3120-3124 [1992] 참조). 이러한 결합 부위는 각각 "정준 (canonical) 루프" 구조를 포함하는데, 이는 다양한 세린 프로테이나아제 저해제에서 발견되는 모티프이다 (Bode and Huber, Eur. J. Biochem., 204:433-451 [1992]). 일부 구현예에서, 야생형 BBPI 스캐폴드는 변이체 및 개질 변이체 BBPI 스캐폴드가 이로부터 유래하는 야생형 전구체 BBPI 스캐폴드로서 역할한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 트립신 (루프 I) 및/또는 키모트립신 루프(들) (루프 II) 가 변이체 펩티드로 대체되는 변이체 BBPI 스캐폴드를 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 트립신 루프는 변이체 펩티드로 대체되어 키모트립신 저해 활성 (CIA) 을 유지하는 변이체 BBPI 가 야기된다. 다른 구현예에서, 키모트립신 루프는 변이체 펩티드로 대체되어 트립신 저해 활성 (TIA) 을 유지하는 변이체 BBPI 가 생성된다. 다른 구현예에서, BBPI 의 트립신 및 키모트립신 루프 모두는 각각 변이체 펩티드로 대체된다. 트립신 및/또는 키모트립신 루프가 변이체 펩티드 서열로 대체되는 BBPI 스캐폴드의 비제한적 예는 야생형 및 비개질 변이체 스캐폴드를 포함한다. 야생형 전구체 스캐폴드의 예는 비제한적으로, Prakash (상기 참조) 에 의해 개시되는 스캐폴드, 예컨대 글리신 맥스로부터의 콩 저해제의 스캐폴드 (BBI; SEQ ID NO:13) 또는 이의 성숙 및 절단형 (SEQ ID NO:185; DDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCICALSYPAQCFCVDITDFCYEPCKPSE), 돌리코스 비플로루스 (Dolichos biflorus) 로부터의 저해제 (BBdb; SEQ ID NO:449; PSESSKPCCDQCACTKSIPPQCRCTDVRLNSCHSACSSCVCTFSIPAQCVCVDMKDFCYEPCK); 글리신 맥스로부터의 콩 저해제 D-II (BBsb3; SEQ ID NO:450; DDEYSKPCCDLCMCTRSMPPQCSCEDIRLNSCHSDCKSCMCTRSQPGQCRCLDTNDFCYKPCKSRDD) 및 토레세아 (Torresea (암부라나 (Amburana)) 세아렌시스 (cearensis) 로부터의 저해제 (BBtc; SEQ ID NO:451; SSKWEACCDRCACTKSIPPQCHCADIRLNSCHSACESCACTHSIPAQCRCFDITDFCYKPCSG) 를 포함한다. 비개질 변이체 전구체 스캐폴드의 예는 비제한적으로, 키모트립신 루프가 하기를 포함하는 VEGF 결합 변이체 서열로 대체된 스캐폴드를 포함한다:
Figure pct00015
일부 구현예에서, 비개질 변이체 전구체 스캐폴드는 변이체 펩티드가 야생형 BBPI 의 키모트립신 루프를 대체하며 또한 SEQ ID NO:187 의 BBPI 의 위치 40 과 동등한 위치에서 아미노산 치환을 도입하는 변이체 스캐폴드이다. 예를 들어, SEQ ID NO:187 의 비개질 변이체 BBPI 스캐폴드 (BBIt-AV) 는, SEQ ID NO:185 의 키모트립신 루프를 SEQ ID NO:9 의 VEGF 변이체 펩티드로 대체함으로써 (이는 키모트립신 루프를 대체하는 것에 추가로 아미노산 치환 I40A 를 도입함) SEQ ID NO:185 의 야생형 전구체 스캐폴드로부터 유래하였다. SEQ ID NO:187 의 비개질 변이체 BBPI 는, 대체된 키모트립신 루프에 추가로, 하기 기재된 바와 같은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 개질 변이체 BBPI 가 생성되도록 개질된다.
BBI 의 수많은 동종형이 분석된 바 있으나, SEQ ID NO:13 은 대략 71 개 아미노산 잔기를 포함하는 일부 구현예에서 사용되는 야생형 BBI 스캐폴드의 아미노산 서열의 예이다 (실시예 1 참조). 일부 구현예에서, 본 발명은 프로 (pro) 부위를 포함하는 BBPI 스캐폴드 예를 들어 SEQ ID NO:11 을 제공하는 한편, 다른 구현예에서, 본 발명은 프로 펩티드가 제거된 BBI 스캐폴드, 예를 들어 SEQ ID NO:185 를 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 10 개 이하의 아미노산이 N- 또는 C-말단에서 제거된 BBI 스캐폴드를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 5 개 이하인 BBI 스캐폴드 예를 들어 SEQ ID NO:187 을 제공한다. BBI 스캐폴드의 절단이 표적 단백질에 결합하는 BBI 의 능력을 파괴하지 않을 것이 이해될 것이다.
콩에서, BBPI 예를 들어 BBI 는 19 개 아미노산 길이인 N-말단 프로-펩티드를 갖는 프로-단백질로서 생성된다. 따라서, 일부 구현예에서, BBI 는 모든 또는 일부 이상의 프로펩티드로 생성된다. 일부 구현예에서, BBI 는 N- 또는 C-말단에서 제거되는 10 개 아미노산 잔기 만큼 절단된다. 예를 들어, 종자 건조시, 일부 BBPI 분자는 9 또는 10 개 아미노산 잔기가 제거된 C-말단을 갖는다. 따라서, 단백질 분해는 일반적으로 처음 디술피드 이전 및 말단 디술피드 결합 직후에 고도로 용인되어, 이의 결과는 표적 단백질에 대한 결합에 통상 불리하지 않다. 그러나, 동종형 또는 절단형 중 임의 하나가 본 발명의 다양한 구현예에 사용된다는 것이 이해될 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명에서 사용되는 BBPI 의 절단형은 키모트립신 루프가 하기 기재된 바와 같이 변이체 서열로 대체되는 변이체 BBIt 이다.
5.3 변이체 BBPI
상기 나타내는 바와 같이, BBPI 는 프로테아제를 저해하는 결합 루프 (즉, 트립신 및 키모트립신 루프) 를 갖는다. 본 발명은 BBPI 의 하나 이상의 반응성 위치 (예를 들어, 루프 I (트립신) 및/또는 루프 II (키모트립신)) 가 표적 단백질에 결합하는 변이체 펩티드로 대체된 비개질 변이체 BBPI 전구체 스캐폴드 또는 야생형 BBPI 전구체 스캐폴드에서 유래하는 변이체 BBPI 를 제공한다. 본 발명의 BBPI 에 포함되어 있는 변이체 펩티드에 의해 결합되는 표적 단백질의 비제한적 예는, 종양 괴사 인자 (TNF) 패밀리, 특히 TNF-α 의 사이토카인; 형질전환 성장 인자 패밀리, 특히 TGFβ 의 사이토카인; 섬유모세포 성장 인자 패밀리 (FGF), 특히 FGF-5 의 사이토카인, 및 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 패밀리, 특히 VEGF-A 의 사이토카인을 포함하는 다양한 사이토카인을 포함한다. 또한, 본 발명의 BBPI 의 한 루프 또는 두 루프 모두를 대체하는 변이체 펩티드는 C2, C3, C4 또는 C5 저해제, 콤프스타틴 (Compstatin), 및 기타 관심 단백질과 같은 보체 통로의 저해제와 상호작용하는 펩티드를 포함한다. 실제로, 임의의 적합한 서열이 본 발명에서 사용되기 때문에, 본 발명이 이들 루프 중 어느 하나에 치환된 임의의 특정 서열로 제한되는 것으로 의도되지는 않는다.
일부 구현예에서, BBPI 전구체 스캐폴드의 트립신 및/또는 키모트립신 루프(들) 는 VEGF 에 결합하는 변이체 서열로 대체되어 변이체 VEGF-BBPI 단백질이 생성된다. 일부 구현예에서, 변이체 BBPI 는 글리신 맥스로부터의 콩 저해제의 스캐폴드 (BBI; SEQ ID NO:13) 또는 이의 성숙 및 절단형 (SEQ ID NO:185), 돌리코스 비플로루스로부터의 저해제 (BBdb; SEQ ID NO:449), 글리신 맥스로부터의 콩 저해제 D-II (BBsb3; SEQ ID NO:450), 토레세아 (암부라나) 세아렌시스로부터의 저해제 (BBtc; SEQ ID NO:451), (SEQ ID NO:186) 의 BBI-AV 스캐폴드, (SEQ ID NO:187) 의 BBIt-AV 스캐폴드, (SEQ ID NO:452) 의 BBdb-AV 스캐폴드, (SEQ ID NO:453) 의 BBsb3-AV 스캐폴드, (SEQ ID NO:454) 의 BBtc-AV 스캐폴드, (SEQ ID NO:640) 의 BBIt-VEGK 스캐폴드, (SEQ ID NO:641) 의 BBIt-VEGT 스캐폴드 및 (SEQ ID NO:642) 의 BBIt-VEGKD 스캐폴드에서 선택되는 비개질 변이체 BBPI 전구체 스캐폴드 또는 야생형 BBPI 전구체 스캐폴드에서 유래한다. 또한, Prakash et al. (상기 참조) 에 의해 개시된 것들과 같은 임의의 야생형 BBPI 전구체 스캐폴드가, 변이체 BBPI 스캐폴드를 생성하는데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, VEGF 변이체 서열은 비제한적으로, 하기 펩티드를 포함하는, 미국 출원 일련 번호 제 09/832,723 호 및 제 10/984,270 호에서 개시되는 VEGF-결합 펩티드를 포함한다:
Figure pct00016
일부 다른 구현예에서, VEGF 변이체 서열은 비제한적으로, 하기 펩티드를 포함하는, 미국 출원 일련 번호 제 11/919,717 호에서 개시되는 VEGF-결합 펩티드를 포함한다:
Figure pct00017
일부 구현예에서, BBPI 전구체 스캐폴드의 트립신 및/또는 키모트립신 루프(들) 는 변이체 FGF-BBPI 단백질이 생성되도록 FGF5 와 상호작용하는 변이체 서열로 대체된다. 일부 구현예에서, 변이체 BBPI 는 글리신 맥스로부터의 콩 저해제의 스캐폴드 (BBI; SEQ ID NO:13) 또는 이의 성숙 및 절단형 (SEQ ID NO:185), 돌리코스 비플로루스로부터의 저해제 (BBdb; SEQ ID NO:449), 글리신 맥스로부터의 콩 저해제 D-II (BBsb3; SEQ ID NO:450), 토레세아 (암부라나) 세아렌시스로부터의 저해제 (BBtc; SEQ ID NO:451), (SEQ ID NO:186) 의 BBI-AV 스캐폴드, (SEQ ID NO:187) 의 BBIt-AV 스캐폴드, (SEQ ID NO:452) 의 BBdb-AV 스캐폴드, (SEQ ID NO:453) 의 BBsb3-AV 스캐폴드, (SEQ ID NO:454) 의 BBtc-AV 스캐폴드, (SEQ ID NO:640) 의 BBIt-VEGK 스캐폴드, (SEQ ID NO:641) 의 BBIt-VEGT 스캐폴드 및 (SEQ ID NO:642) 의 BBIt-VEGKD 스캐폴드에서 선택되는 비개질 변이체 BBPI 전구체 스캐폴드 또는 야생형 BBPI 전구체 스캐폴드에서 유래한다. 또한, Prakash et al. (상기 참조) 에 의해 개시된 것들과 같은 임의의 야생형 BBPI 전구체 스캐폴드가, 변이체 BBPI 스캐폴드가 생성되도록 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, BBPI 전구체 스캐폴드의 트립신 및/또는 키모트립신 루프(들) 는 FGF5 와 상호작용하는 변이체 서열로 대체된다. 일부 구현예에서, FGF5 변이체 서열은 비제한적으로, 하기 펩티드를 포함하는, 미국 출원 일련 번호 제 10/984,410 호 및 제 12/033,848 호에서 개시되는 FGF5-결합 펩티드를 포함한다:
Figure pct00018
일부 구현예에서, BBPI 전구체 스캐폴드의 트립신 및/또는 키모트립신 루프(들) 는 변이체 TGF-BBPI 가 생성되도록 TGFβ 와 상호작용하는 변이체 서열로 대체된다. 일부 구현예에서, 변이체 BBPI 는 글리신 맥스로부터의 콩 저해제의 스캐폴드 (BBI; SEQ ID NO:13) 또는 이의 성숙 및 절단형 (SEQ ID NO:185), 돌리코스 비플로루스로부터의 저해제 (BBdb; SEQ ID NO:449), 글리신 맥스로부터의 콩 저해제 D-II (BBsb3; SEQ ID NO:450), 토레세아 (암부라나) 세아렌시스로부터의 저해제 (BBtc; SEQ ID NO:451), (SEQ ID NO:186) 의 BBI-AV 스캐폴드, (SEQ ID NO:187) 의 BBIt-AV 스캐폴드, (SEQ ID NO:452) 의 BBdb-AV 스캐폴드, (SEQ ID NO:453) 의 BBsb3-AV 스캐폴드, (SEQ ID NO:454) 의 BBtc-AV 스캐폴드, (SEQ ID NO:640) 의 BBIt-VEGK 스캐폴드, (SEQ ID NO:641) 의 BBIt-VEGT 스캐폴드 및 (SEQ ID NO:642) 의 BBIt-VEGKD 스캐폴드에서 선택되는 비개질 변이체 BBPI 전구체 스캐폴드 또는 야생형 BBPI 전구체 스캐폴드에서 유래한다. 또한, Prakash et al. (상기 참조) 에서 개시된 것들과 같은 임의의 야생형 BBPI 전구체 스캐폴드가, 변이체 BBPI 스캐폴드가 생성되도록 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, BBPI 전구체 스캐폴드의 트립신 및/또는 키모트립신 루프(들) 는 TGFβ 와 상호작용하는 변이체 서열로 대체된다. 일부 구현예에서, TGFβ 변이체 서열은 비제한적으로, 하기 펩티드를 포함하는, 미국 출원 일련 번호 제 10/581,142 호에서 개시되는 TGFβ 결합 펩티드를 포함한다:
Figure pct00019
일부 구현예에서, BBPI 전구체 스캐폴드의 트립신 및/또는 키모트립신 루프(들) 는 TNFα 와 상호작용하는 변이체 서열로 대체되어 변이체 TNF-BBPI 를 생성한다. 일부 구현예에서, 변이체 BBPI 는 글리신 맥스 (Glycine max) 로부터의 콩 저해제의 스캐폴드 (BBI; SEQ ID NO:13) 또는 그의 성숙 및 절단된 형태 (SEQ ID NO:185), 돌리코스 비플로루스 (Dolichos biflorus) 로부터의 저해제 (BBdb; SEQ ID NO:449), 글리신 맥스로부터의 콩 저해제 D-II (BBsb3; SEQ ID NO:450), 토레세아 (암부라나) 세아렌시스 (Torresea (Amburana) cearensis) 로부터의 저해제 (BBtc; SEQ ID NO:451), (SEQ ID NO:186) 의 BBI-AV 스캐폴드, (SEQ ID NO:187) 의 BBIt-AV 스캐폴드, (SEQ ID NO:452) 의 BBdb-AV 스캐폴드, (SEQ ID NO:453) 의 BBsb3-AV 스캐폴드, (SEQ ID NO:454) 의 BBtc-AV 스캐폴드, (SEQ ID NO:640) 의 BBIt-VEGK 스캐폴드, (SEQ ID NO:641) 의 BBIt-VEGT 스캐폴드 및 (SEQ ID NO:642) 의 BBIt-VEGKD 스캐폴드로부터 선택되는 비개질 변이체 BBPI 전구체 스캐폴드 또는 야생형 BBPI 전구체 스캐폴드에서 유래한다. 또한, Prakash et al. (상기 참조) 에 의해 개시된 것들과 같은 임의의 야생형 BBPI 전구체 스캐폴드가 사용되어 변이체 BBPI 스캐폴드를 생성할 수 있다.
일부 구현예에서, BBPI 전구체 스캐폴드의 트립신 및/또는 키모트립신 루프(들) 는 TNFα 에 결합하는 변이체 서열로 대체된다. 일부 구현예에서, TNF α 결합 서열은 펩티드 RYWQDIP (T1; SEQ ID NO:474), APEPILA (T2; SEQ ID NO:475), DMIMVSI (T3; SEQ ID NO:476), WTPKPTQ (SEQ ID NO:583), ATFPNQS (SEQ ID NO:584), ASTVGGL (SEQ ID NO:585), TMLPYRP (SEQ ID NO:586), AWHSPSV (SEQ ID NO:587), TQSFSS (SEQ ID NO:588), THKNTLR (SEQ ID NO:589), GQTHFHV (SEQ ID NO:590), LPILTQT (SEQ ID NO:591), SILPVSH (SEQ ID NO:592), SQPIPI (SEQ ID NO:593) 및 QPLRKLP (SEQ ID NO:594) 를 포함하는, 미국 출원 일련 번호 10/968,732 에 개시된 TNF-결합 펩티드를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 변이체 BBPI 는 개질 변이체 BBPI 의 N-말단에 위치하는 펩티드 삽입물을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 펩티드 삽입물은 1 내지 15 개 아미노산의 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 펩티드 삽입물은 5 내지 10 개 아미노산의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 펩티드 삽입물은 SEQ ID NO:389 (DDEPSKPCCDPDP; SEQ ID NO:389) 의 펩티드를 포함한다. SEQ ID NO:389 의 펩티드 삽입물을 포함하는 개질 변이체 BBPI 의 예는 SEQ ID NO:390 의 개질 변이체 4D13BBIt-AV (DDEPSKPCCDPDPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCACYNLYGWTCFCVDITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:390), 및 SEQ ID NO:413 의 개질 변이체 BBIt-AV-4D13-13I-29P-40K-50T-52A (DPDDEPSKPCCDPDPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:413) 이다.
일부 구현예에서, 변이체 서열은 파지 디스플레이 및 다른 적합한 스크리닝 방법을 제한없이 포함하는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 선택된다. 예를 들어, 무작위 펩티드 유전자 라이브러리가 파지 PIII 유전자와 융합되어 펩티드 라이브러리가 파지의 표면 상에 디스플레이될 것이다. 그 뒤에, 파지 디스플레이 라이브러리가 표적 단백질에 노출되고, 완충액으로 세척되어 비특이적 결합이 제거된다 (이 과정은 때때로 패닝 (panning) 으로 언급됨). 마지막으로, 결합 파지 및 PCR 로, 인코딩된 펩티드에 대한 DNA 서열이 단리된다.
대부분의 구현예에서, 루프 중 하나가 변이체 서열 즉, 길이가 보통 3 내지 14 개 아미노산, 바람직하게는 5 내지 10 개 아미노산인 펩티드로 대체되어 변이체 BBPI 를 생성한다. 바람직한 결합 및/또는 저해를 제공하는 한, 더 긴 서열이 본 발명에 이용된다. 또한, 결합 루프(들) 의 대체물로서 사용하기에 적합한 펩티드는 바람직하게는 속박된 루프 (즉, 2 개의 시스테인 잔기 사이의 디술피드 결합의 존재에 의해 형성된 루프) 내에 포함되는 경우 기능적 배좌를 취한다. 일부 특정 구현예에서, 펩티드는 길이가 7 내지 9 개 아미노산이다. 다른 구현예에서, 변이체 서열은 길이가 10 개 아미노산인 펩티드이다.
5.4 개질 변이체 BBPI 단백질
5.4.1 개질 변이체 BBPI : 단일 아미노산 치환
일부 구현예에서, 본 발명은 BBPI 의 골격 내에 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하는 변이체 BBPI 인 개질 변이체 BBPI 를 제공한다. 따라서, 일부 구현예에서, 개질 변이체 BBPI 는 표적 단백질에 결합하는 변이체 서열에 의해 대체된 트립신 및/또는 키모트립신 루프(들) 를 함유하고, 대체된 루프의 C-말단 및/또는 N-말단에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함함으로써 추가로 변경된 변이체 BBPI 이다. 따라서, 일부 구현예에서, 개질 변이체 BBPI 는 그 안의 트립신 및/또는 키모트립신 루프(들) 가 변이체 펩티드에 의해 대체된, 그러나 섹션 5.4 에서 기술된 바와 같이 SEQ ID NO:187 의 위치 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 및 65 와 동등한 위치로부터 선택되는 위치와 동등한 하나 이상의 위치에서 치환된 아미노산을 추가로 포함하는, 섹션 5.4 에서 기술된 변이체 BBPI 이다.
특정 잔기와 상동인 경우 (즉 1 차 구조에서 위치가 일치하는 경우) 개질 변이체 BBPI 의 아미노산 잔기는 전구체 BBPI 의 잔기의 위치와 동등한 곳에 있다. 1 차 구조와의 상동성을 확인하기 위해, 전구체 BBPI 의 아미노산 서열은 1 차 아미노산 서열과, 특히 그에 대한 서열이 공지된 BBPI 내에 보존된 것으로 알려진 시스테인 잔기의 세트와 직접 비교된다. 도 17 은 본원에서 기술된 전형적인 야생형 및 변이체 전구체 BBPI 중 보존된 시스테인 잔기를 나타낸다. 본 발명의 개질 변이체 BBPI 내의 치환되는 동등한 잔기가 번호매겨진다.
전구체 BBPI 는 천연 BBPI 또는 변이체 BBPI 일 수 있다. 구체적으로, 상기 개질 변이체 BBPI 는 자연에서 발견되지 않은 아미노산 서열을 갖고, 전구체 BBPI 의 트립신 및/또는 키모트립신 루프의 대체에 의해 및 전구체 BBPI 의 하나 이상의 아미노산 잔기의 상이한 아미노산에 의한 대체에 의해 유래된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산의 치환은 비개질 변이체 전구체 BBPI 보다 더 큰 프로테아제 저해 활성을 갖는 개질 변이체 BBPI 를 생성한다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 아미노산의 치환은 비개질 변이체 전구체 BBPI 보다 더 큰 프로테아제 저해 활성 및 생산 수율을 갖는 개질 변이체 BBPI 를 생성한다.
따라서, 개질 변이체 BBPI 는 본원에서 언급된 바와 같은 임의의 하나의 변이체 BBPI 스캐폴드의 골격 내에서 하나 이상의 아미노산을 치환함으로써 유래된다. 일부 구현예에서, 단리된 개질 변이체 바우만 버크 프로테아제 저해제 (BBPI) 는 BBPI 스캐폴드의 키모트립신 루프를 대체하는 변이체 펩티드를 포함하고, SEQ ID NO:187 의 변이체 BBI 의 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 및 65 와 동등한 위치로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서 치환된 아미노산을 추가로 포함한다. 다른 구현예에서, 단리된 개질 변이체 바우만 버크 프로테아제 저해제 (BBPI) 는 BBPI 스캐폴드의 트립신 루프를 대체하는 변이체 펩티드를 포함하고, SEQ ID NO:187 의 변이체 BBI 의 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 및 65 와 동등한 위치로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서 치환된 아미노산을 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서, 단리된 개질 변이체 바우만 버크 프로테아제 저해제 (BBPI) 는 BBPI 스캐폴드의 트립신 및 키모트립신 루프를 대체하는 변이체 펩티드를 포함하고, SEQ ID NO:187 의 변이체 BBI 의 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 및 65 와 동등한 위치로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서 치환된 아미노산을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, BBPI 스캐폴드는 글리신 맥스로부터의 콩 저해제의 스캐폴드 (BBI; SEQ ID NO:13) 또는 그의 성숙 및 절단된 형태 (SEQ ID NO:185), 돌리코스 비플로루스로부터의 저해제 (BBdb; SEQ ID NO:449), 글리신 맥스로부터의 콩 저해제 D-II (BBsb3; SEQ ID NO:450), 토레세아 (암부라나) 세아렌시스로부터의 저해제 (BBtc; SEQ ID NO:451), (SEQ ID NO:186) 의 BBI-AV 스캐폴드, (SEQ ID NO:187) 의 BBIt-AV 스캐폴드, (SEQ ID NO:452) 의 BBdb-AV 스캐폴드, (SEQ ID NO:453) 의 BBsb3-AV 스캐폴드, (SEQ ID NO:454) 의 BBtc-AV 스캐폴드, (SEQ ID NO:640) 의 BBIt-VEGK 스캐폴드, (SEQ ID NO:641) 의 BBIt-VEGT 스캐폴드 및 (SEQ ID NO:642) 의 BBIt-VEGKD 스캐폴드로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 개질 변이체 BBPI 내에 포함된 변이체 펩티드는 VEGF-결합 펩티드, FGF-5-결합 펩티드, TGFβ-결합 펩티드 및 TNFα-결합 펩티드로부터 선택된다. 일부 구현예에서, VEGF-결합 서열은 펩티드 ACYNLYGWTC (SEQ ID NO:9), KYYLYWW (SEQ ID NO:458), TLWKSYW (SEQ ID NO:459), DLYWW (SEQ ID NO:460),SKHSQIT (SEQ ID NO:468) KTNPSGS (SEQ ID NO:469) RPTGHSL (SEQ ID NO:470), KHSAKAE (SEQ ID NO:471) KPSSASS (SEQ ID NO:472), PVTKRVH (SEQ ID NO:473), TLHWWVT (SEQ ID NO:492), PYKASFY (SEQ ID NO:493), PLRTSHT (SEQ ID NO:494), EATPROT (SEQ ID NO:495), NPLHTLS (SEQ ID NO:496), KHERIWS (SEQ ID NO:497), ATNPPPM (SEQ ID NO:498), STTSPNM (SEQ ID NO:499), ADRSFRY (SEQ ID NO:500), PKADSKQ (SEQ ID NO:501), PNQSHLH (SEQ ID NO:502), SGSETWM (SEQ ID NO:503), ALSAPYS (SEQ ID NO:504), KMPTSKV (SEQ ID NO:505), ITPKRPY (SEQ ID NO:506), KWIVSET (SEQ ID NO:507), PNANAPS (SEQ ID NO:508), NVQSLPL (SEQ ID NO:509), TLWPTFW (SEQ ID NO:510), NLWPHFW (SEQ ID NO:511), SLWPAFW (SEQ ID NO:512), SLWPHFW (SEQ ID NO:513), APWNSHI (SEQ ID NO:514), APWNLHI (SEQ ID NO:515), LPSWHLR (SEQ ID NO:516), PTILEWY (SEQ ID NO:517), TLYPQFW (SEQ ID NO:518) 및 HLAPSAV (SEQ ID NO:519) 를 포함하는, 미국 출원 일련 번호 제 09/832,723 호 및 제 10/984,270 호에서 개시된 VEGF-결합 펩티드를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 다른 구현예에서, VEGF 변이체 서열은 펩티드 KYYLSWW (SEQ ID NO:520), WYTLYKW (SEQ ID NO:521), TYRLYWW (SEQ ID NO:522), RYSLYYW (SEQ ID NO:523), YYLYYWK (SEQ ID NO:524), NYQLYGW (SEQ ID NO:525), TKWPSYW (SEQ ID NO:226), TLWKSYW (SEQ ID NO:527), PLWPSYW (SEQ ID NO:528), RLWPSYW (SEQ ID NO:529), TLWPKYW (SEQ ID NO:530), KYDLYWW (SEQ ID NO;531), RYDLYWW (SEQ ID NO:532), DYRLYWW (SEQ ID NO:533), DYKLYWW (SEQ ID NO:534), EYKLYWW (SEQ ID NO:535) 및 RYPLYWW (SEQ ID NO:536) 을 포함하는, 미국 출원 일련 번호 제 11/919,717 호에서 개시된 VEGF-결합 펩티드를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
다른 구현예에서, FGF5-결합 서열은 펩티드 CACRTQPYPLCF (MM007; SEQ ID NO:430), CICTWIDSTPC (PS2; SEQ ID NO:431), CYGLPFTRC (SEQ ID NO:537), CEEIWTMLC (SEQ ID NO:538), CWALTVKTC (SEQ ID NO:539), CLTVLWTTC (SEQ ID NO:540), CTLWNRSPC (SEQ ID NO:541), CHYLLTNYC (SEQ ID NO:542), CRIHLAHKC (SEQ ID NO:543), TNIDSTP(SEQ ID NO:544), HLQTTET (SEQ ID NO:545), SLNNLTV (SEQ ID NO:546), TNIDSTP (SEQ ID NO:547), TNIDSTP (SEQ ID NO:548), LRILANK (SEQ ID NO:549), LLTPTLN (SEQ ID NO:550), ALPTHSN (SEQ ID NO:551), TNIDSTP (SEQ ID NO:552), LCRRFEN (SEQ ID NO:553), TNIDSTP (SEQ ID NO:554), TNIDSTP (SEQ ID NO:555), HLQTTET (SEQ ID NO:556), PLGLCPP (SEQ ID NO:557), GYFIPSI (SEQ ID NO:558), TKIDSTP (SEQ ID NO:559), HLQTTET (SEQ ID NO:560), WNIDSTP (SEQ ID NO:561), TWIDWTP (SEQ ID NO:562), RTQPYPL (SEQ ID NO:670) 및 TWIDSTP (SEQ ID NO:671) 를 포함하는, 미국 출원 일련 번호 제 10/984,410 호 및 제 12/033,848 호에서 개시된 FGF5-결합 펩티드를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
다른 구현예에서, 변이체 펩티드는 펩티드 CLCPENINVLPCN (PEN3; SEQ ID NO:436), CICKHNVDWLCF (MMO21W; SEQ ID NO:437), CICWTQHIHNCF (WTQ; SEQ ID NO:438), CVTTDWIEC (SEQ ID NO:563), CYYSQFHQC (SEQ ID NO:564), CPTLWTHMC (SEQ ID NO:565), QSACIVYYVGRKPKVECASSD (SEQ ID NO:566), QSACILYYIGKTPKIECASSD (SEQ ID NO:567), QSACILYYVGRTPKVECASSD (SEQ ID NO:568), 아세틸-LCPENDNVSPCY-cohn2 (SEQ ID NO:569), KHNVRLL (SEQ ID NO:570), NDTPSYF (SEQ ID NO:571), AKLYAGS (SEQ ID NO:572), RGPAHSL (SEQ ID NO:573), NSLAERR (SEQ ID NO:574), HPLASPH (SEQ ID NO:575), QPWNKLK (SEQ ID NO:576), AWLr/Mipy (SEQ ID NO:577), PTKPAQQ (SEQ ID NO:578), PSLNRPQ (SEQ ID NO:579), HHARQEW (SEQ ID NO:580), RHHTPGP (SEQ ID NO:581), ASAINPH (SEQ ID NO:582), CHGYDRAPC (SEQ ID NO:644), CFAPADQAC (SEQ ID NO:645), CIPSRFITC (SEQ ID NO:646), CHGHTKLAC (SEQ ID NO:647), CNGKSKLAC (SEQ ID NO:648), PENINVLP (SEQ ID NO;672), KHNVDWL (SEQ ID NO:673) 및 WTQHIHNC (SEQ ID NO:674) 를 포함하는, 미국 출원 일련 번호 제 10/581,142 호에서 개시된 TGFβ-결합 펩티드를 포함하나 이에 제한되지 않는 TGFβ-결합 서열에서 선택되는 TGFβ-결합 펩티드이다.
또 다른 구현예에서, 변이체 펩티드는 펩티드 RYWQDIP (T1; SEQ ID NO:474), APEPILA (T2; SEQ ID NO:475), DMIMVSI (T3; SEQ ID NO:476), WTPKPTQ (SEQ ID NO:583), ATFPNQS (SEQ ID NO:584), ASTVGGL (SEQ ID NO:585), TMLPYRP (SEQ ID NO:586), AWHSPSV (SEQ ID NO:587), TQSFSS (SEQ ID NO:588), THKNTLR (SEQ ID NO:589), GQTHFHV (SEQ ID NO:590), LPILTQT (SEQ ID NO:591), SILPVSH (SEQ ID NO:592), SQPIPI (SEQ ID NO:593) 및 QPLRKLP (SEQ ID NO:594) 를 포함하는, 미국 출원 일련 번호 제 10/968,732 호에서 개시된 TNF-결합 펩티드를 포함하나 이에 제한되지 않는 TNFα-결합 서열로부터 선택되는 TNFα-결합 펩티드이다.
일부 구현예에서, SEQ ID NO:187 의 위치 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 및 65 와 동등한 위치로부터 선택되는 하나 이상의 동등한 위치에서 포함된 하나 이상의 아미노산 치환은 하기 치환된 아미노산을 초래한다. 한 구현예에서, SEQ ID NO:187 의 위치 1 과 동등한 아미노산 위치에서 치환된 아미노산은 A 및 C 로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, SEQ ID NO:187 의 위치 4 와 동등한 아미노산 위치에서 치환된 아미노산은 V 이다. 또 다른 구현예에서, SEQ ID NO:187 의 위치 5 와 동등한 아미노산 위치에서 치환된 아미노산은 P 및 A 로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, SEQ ID NO:187 의 위치 11 과 동등한 아미노산 위치에서 치환된 아미노산은 G 이다. 또 다른 구현예에서, SEQ ID NO:187 의 위치 13 과 동등한 아미노산 위치에서 치환된 아미노산은 Y, I, F, M, L, V, K 및 R 로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, SEQ ID NO:187 의 위치 18 과 동등한 아미노산 위치에서 치환된 아미노산은 I, V 및 L 을 포함한다. 또 다른 구현예에서, SEQ ID NO:187 의 위치 25 와 동등한 아미노산 위치에서 치환된 아미노산은 K, N, W, I, A 및 R 로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, SEQ ID NO:187 의 위치 27 과 동등한 아미노산 위치에서 치환된 아미노산은 R, K, V, A 및 Q 를 포함한다. 또 다른 구현예에서, SEQ ID NO:187 의 위치 29 와 동등한 아미노산 위치에서 치환된 아미노산은 R, K 및 P 로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, SEQ ID NO:187 의 위치 31 과 동등한 아미노산 위치에서 치환된 아미노산 위치는 Q, H, E, A, R, W, K 및 T 로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, SEQ ID NO:187 의 위치 38 과 동등한 아미노산 위치에서 치환된 아미노산은 N, K 및 R 로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, SEQ ID NO:187 의 위치 40 과 동등한 아미노산 위치에서 치환된 아미노산은 H, K, Q, R 및 Y 로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, SEQ ID NO:187 의 위치 50 과 동등한 아미노산 위치에서 치환된 아미노산은 R, Q, K, T, V, M 및 S 로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, SEQ ID NO:187 의 위치 52 와 동등한 아미노산 위치에서 치환된 아미노산은 K, T, R, Q, L, H, A, M, S 및 E 로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, SEQ ID NO:187 의 위치 55 와 동등한 아미노산 위치에서 치환된 아미노산은 M 이다. 또 다른 구현예에서, SEQ ID NO:187 의 위치 65 와 동등한 아미노산 위치에서 치환된 아미노산은 E, Q 및 D 로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 변이체 BBPI 내에 만들어진 단일 아미노산 치환은 전구체 비개질 변이체 BBPI 보다 더 큰 프로테아제 저해 활성을 갖는 개질 변이체 BBPI 를 초래한다. 일부 구현예에서, 단일 아미노산 치환은 비개질 전구체 변이체 BBPI 보다 더 큰 트립신 저해 활성 (TIA) 을 갖는 개질 변이체 BBPI 를 생성하는 한편; 다른 구현예에서, 단일 아미노산 치환은 비개질 전구체 변이체 BBPI 보다 더 큰 키모트립신 저해 활성 (CIA) 을 갖는 개질 변이체 BBPI 를 생성한다.
한 구현예에서, 개질 변이체 BBPI 는 키모트립신 루프 대신 VEGF 변이체 펩티드를 포함하고, SEQ ID NO:187 의 위치 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 및 65 로부터 선택되는 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함하도록 추가로 개질되어 개질 변이체 BBI 를 생성하는, SEQ ID NO:187 의 변이체 BBI (BBIt-AV; 도 9) 이다. 상기 기술된 SEQ ID NO:187 의 변이체 BBIt-AV BBPI 내에 만들어진 임의의 하나의 단일 아미노산 치환은 비개질 전구체 변이체 BBIt-AV 보다 더 큰 트립신 저해 활성을 갖는 개질 변이체 BBIt-AV BBPI (SEQ ID NO:187; 실시예 10 참조) 를 생성했다.
5.4.2 개질 변이체 BBPI : 아미노산 치환의 조합
본 발명은 2 개 이상, 3 개 이상, 4 개 이상, 5 개 이상, 6 개 이상, 7 개 이상, 8 개 이상, 9 개 이상, 10 개 이상, 11 개 이상, 12 개 이상, 13 개 이상, 14 개 이상, 15 개 이상 및 16 개 이상의 아미노산 치환을 포함하는 개질 변이체 BBPI 를 포함한다. 일부 구현예에서, 2 개 이상, 3 개 이상, 4 개 이상, 5 개 이상, 6 개 이상, 7 개 이상, 8 개 이상, 9 개 이상, 10 개 이상, 11 개 이상, 12 개 이상, 13 개 이상, 14 개 이상, 15 개 이상 및 16 개 이상의 아미노산 치환은 비개질 전구체 변이체 BBPI 보다 더 큰 TIA 를 갖는 개질 변이체 BBPI 를 생성한다. 다른 구현예에서, 2 개 이상, 3 개 이상, 4 개 이상, 5 개 이상, 6 개 이상, 7 개 이상 및 8 개 이상 아미노산 치환은 비개질 전구체 변이체 BBPI 보다 더 큰 TIA 및 생산 수율을 갖는 개질 변이체 BBPI 를 생성한다.
일부 구현예에서, 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:187 의 위치 50 및 52 와 동등한 아미노산 위치에서 2 개의 아미노산 치환의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 2 개의 아미노산 치환의 조합은 50T-52A 이다. 본 발명은 섹션 5.4 에 기술된 바와 같이 2 개의 아미노산 치환의 조합 50T-52A 를 추가로 포함하는, 섹션 5.3 에 기술된 임의의 하나의 변이체 BBPI 스캐폴드를 제공한다. 한 구현예에서, 변이체 스캐폴드의 키모트립신 루프는 VEGF 변이체 펩티드 예를 들어 SEQ ID NO:9 이고, 변이체 스캐폴드는 SEQ ID NO:187 의 위치 13, 50 및 52 와 동등한 위치에서 3 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하도록 추가로 변경되어 개질 변이체 BBPI 스캐폴드를 생성한다. 한 구현예에서, 2 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하는 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:595 의 개질 변이체 BBIt-AV-F50T-V52A (DPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCACYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:595) 이다.
일부 구현예에서, 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:187 의 위치 13, 50 및 52 와 동등한 아미노산 위치에서 3 개의 아미노산 치환의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 3 개의 아미노산 치환의 조합은 위치 25-50-52, 29-50-52, 40-50-52 및 13-50-52 에서의 치환의 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 3 개의 아미노산 치환의 조합은 25L-50T-52A, 29P-50T-52A, 40K-50T-52A 및 13I-50T-52A 로부터 선택된다. 본 발명은 섹션 5.4 에서 기술된 바와 같이 25L-50T-52A, 29P-50T-52A, 40K-50T-52A 및 13I-50T-52A 로부터 선택되는 3 개의 아미노산 치환의 조합을 추가로 포함하는, 섹션 5.3 에서 기술된 임의의 하나의 변이체 BBPI 스캐폴드를 제공한다. 한 구현예에서, 변이체 스캐폴드의 키모트립신 루프는 VEGF 변이체 펩티드 예를 들어 SEQ ID NO:9 이고, 변이체 스캐폴드는 SEQ ID NO:187 의 위치 13, 50 및 52 와 동등한 위치에서 3 개의 아미노산 치환의 조합을 추가로 포함하도록 변경되어 개질 변이체 BBPI 스캐폴드를 생성한다. 한 구현예에서, 3 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하는 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:603 의 개질 변이체 BBIt-AV-S25L-F50T-V52A (DPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCLDMRLNSCHSACKSCACYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:603), SEQ ID NO:607 의 개질 변이체 BBIt-AV-L29P-F50T-V52A (DPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCACYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:607) 및 SEQ ID NO:609 의 개질 변이체 BBIt-AV-A40K-F50T-V52A (DPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:609) 로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:187 의 위치 13, 29, 50 및 52 와 동등한 아미노산 위치에서 4 개의 아미노산 치환의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 4 개의 아미노산 치환의 조합은 위치 13-25-50-52, 13-29-50-52, 25-29-50-52, 13-40-50-52, 25-40-50-52 및 29-40-50-52 에서의 치환의 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 4 개의 아미노산 치환의 조합은 13I-25L-50T-52A, 13I-29P-50T-52A, 25L-29P-50T-52A, 13I-40K-50T-52A, 25L-40K-50T-52A 및 29P-40K-50T-52A 로부터 선택된다. 본 발명은 섹션 5.4 에서 기술된 바와 같이 13I-25L-50T-52A, 13I-29P-50T-52A, 25L-29P-50T-52A, 13I-40K-50T-52A, 25L-40K-50T-52A 및 29P-40K-50T-52A 로부터 선택되는 4 개의 아미노산 치환의 조합을 추가로 포함하는, 섹션 5.3 에서 기술된 임의의 하나의 변이체 BBPI 스캐폴드를 제공한다. 한 구현예에서, 변이체 스캐폴드의 키모트립신 루프는 SEQ ID NO:9 및 460 으로부터 선택되는 VEGF 변이체 펩티드이고, 변이체 스캐폴드는 SEQ ID NO:187 의 위치 13, 29, 50 및 52 와 동등한 위치에서 4 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하도록 추가로 변경되어 개질 변이체 BBPI 스캐폴드를 생성한다. 한 구현예에서, 4 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하는 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:596 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-S25L-F50T-V52A (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCLDMRLNSCHSACKSCACYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:596), SEQ ID NO:600 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-L29P-F50T-V52A (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCACYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:600), SEQ ID NO:602 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-A40K-F50T-V52A (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:602), SEQ ID NO:604 의 개질 변이체 BBIt-AV-S25L-L29P-F50T-V52A (DPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCLDMRPNSCHSACKSCACYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:604), SEQ ID NO:606 의 개질 변이체 BBIt-AV-S25L-A40K-F50T-V52A (DPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCLDMRLNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:606), SEQ ID NO:608 의 개질 변이체 BBIt-AV-L29P-A40K-F50T-V52A (DPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:608) 및 SEQ ID NO:643 의 개질 변이체 BBIt-VEGKD-A13I-S25K-L29P-V52K (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCKDMRPNSCHSACKSCICKYDLYWWCFCKDITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:643) 으로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, 변이체 스캐폴드의 키모트립신 루프는 SEQ ID NO:430 및 431 로부터 선택되는 FGF5 변이체 펩티드이고, 변이체 스캐폴드는 SEQ ID NO:187 의 위치 13, 29, 50 및 52 와 동등한 위치에서 4 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하도록 추가로 변경되어 개질 변이체 BBPI 스캐폴드를 생성한다. 한 구현예에서, 4 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하는 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:432 의 개질 변이체 BBIt-MM007-Q-A13I-L29P-F50T-V52A 및 SEQ ID NO:434 의 개질 변이체 BBIt-FGFps2-Q-A13I-L29P-F50T-V52A 로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, 변이체 스캐폴드의 키모트립신 루프는 SEQ ID NO:436, 437, 438, 672, 673 및 674 로부터 선택되는 TGFβ 변이체 펩티드이고, 변이체 스캐폴드는 SEQ ID NO:187 의 위치 13, 29, 50 및 52 와 동등한 위치에서 4 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하도록 추가로 변경되어 개질 변이체 BBPI 스캐폴드를 생성한다. 한 구현예에서, 4 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하는 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:443 의 개질 변이체 BBIt-PEN3-Q-A13I-L29P-F50T-V52A, SEQ ID NO:445 의 개질 변이체 BBIt-MM021W-Q-A13I-L29P-F50T-V52A 및 SEQ ID NO:447 의 개질 변이체 BBIt-WTQ-Q-A13I-L29P-F50T-V52A 로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:187 의 위치 13, 29, 40, 50 및 52 와 동등한 아미노산 위치에서 5 개의 아미노산 치환의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 5 개의 아미노산 치환의 조합은 위치 13-25-29-50-52, 13-29-40-50-52, 13-25-40-50-52, 25-29-40-50-52 및 13-29-40-50-52 에서의 치환의 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 5 개의 아미노산 치환의 조합은 13I-25L-29P-50T-52A, 13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25L-40K-50T-52A, 25L-29P-40K-50T-52A, 13L-29P-40K-50T-52A, 13I-29K-40K-50T-52A, 13I-29P-40K-50K-52A 및 13I-29P-40K-50T-52T 로부터 선택된다. 본 발명은 섹션 5.4 에서 기술된 바와 같이 13I-25L-29P-50T-52A, 13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25L-40K-50T-52A, 25L-29P-40K-50T-52A, 13L-29P-40K-50T-52A, 13I-29K-40K-50T-52A, 13I-29P-40K-50K-52A 및 13I-29P-40K-50T-52T 로부터 선택되는 5 개의 아미노산 치환의 조합을 추가로 포함하는, 섹션 5.3 에서 기술된 임의의 하나의 변이체 BBPI 스캐폴드를 제공한다. 한 구현예에서, 변이체 스캐폴드의 키모트립신 루프는 SEQ ID NO:9 의 VEGF 변이체 펩티드이고, 변이체 스캐폴드는 SEQ ID NO:187 의 위치 13, 29, 40, 50 및 52 와 동등한 위치에서 5 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하도록 추가로 변경되어 개질 변이체 BBPI 스캐폴드를 생성한다. 한 구현예에서, 5 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하는 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:597 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-S25L-L29P-F50T-V52A (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCLDMRPNSCHSACKSCACYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:597), SEQ ID NO:599 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCLDMRLNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:599), SEQ ID NO:601 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-S25L-A40K-F50T-V52A (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:601), SEQ ID NO:605 의 개질 변이체 BBIt-AV-S25L-L29P-A40K-F50T-V52A (DPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCLDMRPNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:605), SEQ ID NO:615 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13L-L29P-A40K-F50T-V52A (DPDDESSKPCCDQCLCTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:615), SEQ ID NO:620 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-L29K-A40K-F50T-V52A (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRKNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:620), SEQ ID NO:624 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50K-V52A (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCKCYNLYGWTCKCADITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:624) 및 SEQ ID NO:625 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52T (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCTDITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:625) 로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:187 의 위치 13, 25, 29, 40, 50 및 52 와 동등한 아미노산 위치에서 6 개의 아미노산 치환의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 6 개의 아미노산 치환의 조합은 위치 13-25-29-40-50-52, 1-13-29-40-50-52, 4-13-29-40-50-52, 5-13-29-40-50-52, 11-13-29-40-50-52, 13-25-29-40-50-52, 13-27-29-40-50-52, 13-29-31-40-50-52, 13-29-31-40-50-52, 13-29-38-40-50-52 및 13-29-38-40-50-52 에서의 치환의 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 6 개의 아미노산 치환의 조합은 13I-25L-29P-40K-50T-52A, 1C-13I-29P-40K-50T-52A, 4V-13I-29P-40K-50T-52A, 5P-13I-29P-40K-50T-52A, 11G-13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25R-29P-40K-50T-52A, 13I-27R-29P-40K-50T-52A, 13I-29P-31A-40K-50T-52A, 13I-29P-31R-40K-50T-52A, 13I-29P-38N-40K-50T-52A 및 13I-29P-38N-40K-50T-52A 로부터 선택된다. 본 발명은 섹션 5.4 에서 기술된 바와 같이 13I-25L-29P-40K-50T-52A, 1C-13I-29P-40K-50T-52A, 4V-13I-29P-40K-50T-52A, 5P-13I-29P-40K-50T-52A, 11G-13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25R-29P-40K-50T-52A, 13I-27R-29P-40K-50T-52A, 13I-29P-31A-40K-50T-52A, 13I-29P-31R-40K-50T-52A, 13I-29P-38N-40K-50T-52A 및 13I-29P-38N-40K-50T-52A 로부터 선택되는 6 개의 아미노산 치환의 조합을 추가로 포함하는, 섹션 5.3 에서 기술된 임의의 하나의 변이체 BBPI 스캐폴드를 제공한다. 한 구현예에서, 변이체 스캐폴드의 키모트립신 루프는 SEQ ID NO:9 의 VEGF 변이체 펩티드이고, 변이체 스캐폴드는 SEQ ID NO:187 의 위치 13, 25, 29, 40, 50 및 52 와 동등한 위치에서 6 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하도록 추가로 변경되어 개질 변이체 BBPI 스캐폴드를 생성한다. 한 구현예에서, 6 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하는 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:598 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-S25L-L29P-A40K-F50T-V52A (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCLDMRPNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:598), SEQ ID NO:611 의 개질 변이체 BBIt-AV-D1C-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A (DPDDEVSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:611), SEQ ID NO:612 의 개질 변이체 BBIt-AV-S4V-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A (DPDDEVSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:612), SEQ ID NO:613 의 개질 변이체 BBIt-AV-S5P-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A (DPDDESPKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:613), SEQ ID NO:614 의 개질 변이체 BBIt-AV-Q11G-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A (DPDDESSKPCCDGCICTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:614), SEQ ID NO:616 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-S25R-L29P-A40K-F50T-V52A - (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDMRPNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:616), SEQ ID NO:619 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-M27R-L29P-A40K-F50T-V52A (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDRRPNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:619), SEQ ID NO:621 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-L29P-S31A-A40K-F50T-V52A (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNACHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:621), SEQ ID NO:622 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-L29P-S31R-A40K-F50T-V52A (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNRCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:622), SEQ ID NO:623 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-L29P-S38N-A40K-F50T-V52A (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKNCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:623) 및 SEQ ID NO:626 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-L29P-S38N-A40K-F50T-V52A (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPEE; SEQ ID NO:626) 로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:187 의 위치 13, 25, 29, 31, 40, 50 및 52 와 동등한 아미노산 위치에서 7 개의 아미노산 치환의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 7 개의 아미노산 치환의 조합은 위치 13-25-29-31-40-50-52, 13-25-29-31-40-50-52, 13-25-27-29-31-50-52, 13-25-27-29-31-50-52, 13-25-27-29-31-50-52, 13-25-27-29-31-50-52, 13-25-27-29-31-50-52, 13-25-27-29-31-50-52, 13-25-27-29-31-50-52, 13-25-27-29-31-50-52 및 13-25-27-29-31-50-52 에서의 치환의 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 7 개의 아미노산 치환의 조합은 13L-25R-29P-31A-40K-50T-52A, 13L-25R-29P-31R-40K-50T-52A 및 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T 로부터 선택된다. 본 발명은 섹션 5.4 에서 기술된 바와 같이 13L-25R-29P-31A-40K-50T-52A, 13L-25R-29P-31R-40K-50T-52A, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T 및 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T 로부터 선택되는 6 개의 아미노산 치환의 조합을 추가로 포함하는, 섹션 5.3 에서 기술된 임의의 하나의 변이체 BBPI 스캐폴드를 제공한다. 한 구현예에서, 변이체 스캐폴드의 키모트립신 루프는 SEQ ID NO:9 의 VEGF 변이체 펩티드이고, 변이체 스캐폴드는 SEQ ID NO:187 의 위치 13, 25, 29, 31, 40, 50 및 52 와 동등한 위치에서 7 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하도록 추가로 변경되어 개질 변이체 BBPI 스캐폴드를 생성한다. 한 구현예에서, 7 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하는 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:617 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-S25R-L29P-S31A-A40K-F50T-V52A (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDMRPNACHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:617), SEQ ID NO:618 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-S25R-L29P-S31R-A40K-F50T-V52A (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDMRPNRCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:618), SEQ ID NO:491 의 개질 변이체 BBIt-VEGF-V1-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDARPNACHSACKSCACSKHSQITCKCTDITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:491), SEQ ID NO:632 의 개질 변이체 BBIt-VEGF-V2-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDARPNACHSACKSCACKTNPSGSCKCTDITDFCYEPCKPSE: SEQ ID NO:632), SEQ ID NO:633 의 개질 변이체 BBIt-VEGF-V3-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDARPNACHSACKSCACRPTGHSLCKCTDITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:633), SEQ ID NO:634 의 개질 변이체 BBIt-VEGF-V4-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDARPNACHSACKSCACKHSAKAECKCTDITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:634), SEQ ID NO:635 의 개질 변이체 BBIt-VEGF-V5-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDARPNACHSACKSCACKPSSASSCKCTDITDFCYEPCKPSE;SEQ ID NO:635), SEQ ID NO:636 의 개질 변이체 BBIt-VEGF-V6-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDARPNACHSACKSCACPVTKRVHCKCTDITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:636), SEQ ID NO:637 의 개질 변이체 BBIt-TNFα-T1-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDARPNACHSACKSCACRYWQDIPCKCTDITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:637), SEQ ID NO:638 의 개질 변이체 BBIt-TNFα-T2-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDARPNACHSACKSCACAPEPILACKCTDITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:638) 및 SEQ ID NO:639 의 개질 변이체 BBIt-TNFα-T3-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCKDQRPNECHSACKSCHCYNLYGWTCRCQDITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:639) 로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:187 의 위치 13, 25, 27, 29, 31, 40, 50 및 52 와 동등한 아미노산 위치에서 8 개의 아미노산 치환의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 8 개의 아미노산 치환의 조합은 위치 13-25-27-29-31-40-50-52, 13-25-27-29-31-40-50-52, 13-25-27-29-31-40-50-52, 13-25-27-29-31-40-50-52 및 13-25-27-29-31-40-50-52 에서의 치환의 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 8 개의 아미노산 치환의 조합은 조합 13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T, 13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q, 13I-25K-27R-29E-31A-40H-50R-52K, 13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L 및 13I-25K-27Q-29P-31E-40H-50R-52Q 로부터 선택된다. 본 발명은 섹션 5.4 에서 기술된 바와 같이 조합 13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T, 13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q, 13I-25K-27R-29E-31A-40H-50R-52K, 13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L 및 13I-25K-27Q-29P-31E-40H-50R-52Q 로부터 선택되는 8 개의 아미노산 치환의 조합을 추가로 포함하는, 섹션 5.3 에서 기술된 임의의 하나의 변이체 BBPI 스캐폴드를 제공한다. 한 구현예에서, 변이체 스캐폴드의 키모트립신 루프는 SEQ ID NO:9 의 VEGF 변이체 펩티드이고, 변이체 스캐폴드는 SEQ ID NO:187 의 위치 13, 25, 27, 29, 31, 40, 50 및 52 와 동등한 위치에서 7 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하도록 추가로 변경되어 개질 변이체 BBPI 스캐폴드를 생성한다. 한 구현예에서, 8 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하는 개질 변이체 BBPI 은 SEQ ID NO:627 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-A40H-F50K-V52T (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDARPNACHSACKSCHCYNLYGWTCKCTDITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:627; KT8), SEQ ID NO:628 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-S25K-M27A-L29R-S31E-A40K-F50Q-V52Q (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCKDARRNECHSACKSCKCYNLYGWTCQCQDITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:628; QQ8), SEQ ID NO:629 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-S25K-M27R-L29E-S31A-A40H-F50R-V52K (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCKDRRENACHSACKSCHCYNLYGWTCRCKDITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:629; RK8), SEQ ID NO:630 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-S25K-M27A-L29R-S31A-A40H-F50R-V52L (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCKDARRNACHSACKSCHCYNLYGWTCRCLDITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:630; RL8) 및 SEQ ID NO:631 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-S25K-M27Q-L29P-S31E-A40H-F50R-V52Q (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCKDQRPNECHSACKSCHCYNLYGWTCRCQDITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:631; RQ8) 로부터 선택된다.
본 발명은 상기 기술된 아미노산 치환의 임의의 하나의 조합을 포함하고, 비개질 전구체 변이체 BBPI 보다 더 큰 프로테아제 저해 활성을 갖는 개질 변이체 BBPI 를 추가로 제공한다. 일부 구현예에서, 상응하는 전구체 비개질 BBPI 의 키모트립신 루프 대신 변이체 펩티드를 포함하는 개질 변이체 BBPI 는 전구체 비개질 BBPI 스캐폴드보다 더 큰 트립신 저해 활성 (TIA) 을 갖는다. 다른 구현예에서, 상응하는 전구체 비개질 BBPI 의 트립신 루프 대신 변이체 펩티드를 포함하는 개질 변이체 BBPI 는 전구체 비개질 BBPI 스캐폴드보다 더 큰 키모트립신 저해 활성 (TIA) 을 갖는다.
실시예에서 나타난 바와 같이, 변이체 BBPI 의 골격 내 하나 이상의 아미노산의 치환은 비개질 변이체 BBPI 보다 더 큰 생산 수율을 갖는 개질 변이체 BBPI 를 생성한다. 일부 구현예에서, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하는 BBPI 는 비개질 전구체 BBPI 보다 더 큰 생산 수율을 갖는다. 따라서, 본 발명은 상기 기술된 아미노산 치환의 임의의 하나의 조합을 포함하고, 비개질 전구체 변이체 BBPI 보다 더 큰 생산 수율 (PY) 을 갖는 개질 변이체 BBPI 를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 상기 기술된 아미노산 치환의 임의의 하나의 조합을 포함하고, 비개질 전구체 변이체 BBPI 의 TIA 및 PY 보다 더 큰 트립신 저해 활성 및 더 큰 생산 수율을 갖는 개질 변이체 BBPI 를 제공한다.
일부 구현예에서, 개질 변이체 BBPI 는 개질 변이체 BBPI 의 N-말단에 위치하는 펩티드 삽입물을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 펩티드 삽입물은 1 내지 15 개 아미노산의 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 펩티드 삽입물은 5 내지 10 개 아미노산의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 펩티드 삽입물은 SEQ ID NO:389 의 펩티드 (DDEPSKPCCDPDP; SEQ ID NO:389) 를 포함한다. SEQ ID NO:389 의 펩티드 삽입물을 포함하는 개질 변이체 BBPI 의 예는 SEQ ID NO:390 의 개질 변이체 4D13BBIt-AV (DDEPSKPCCDPDPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCACYNLYGWTCFCVDITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:390) 및 SEQ ID NO:413 의 개질 변이체 BBIt-AV-4D13-13I-29P-40K-50T-52A (DPDDEPSKPCCDPDPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:413) 이다.
5.4.3 BBPI 융합 단백질
일부 구현예에서, 각각의 개질 변이체 BBPI 는 촉매 도메인, 절단 위치 및 BBPI 스캐폴드를 포함하는 융합 단백질로서 발현된다. 촉매 도메인은 셀룰라아제, 큐티나아제 및 디술피드 이소머라아제로부터 선택된다. 일부 구현예에서, BBPI 융합 단백질 내에 포함된 촉매 도메인은 SEQ ID NO:669 의 셀룰라아제 촉매 도메인 DDYSVVEEHGQLSISNGELVNERGEQVQLKGMSSHGLQWYGQFVNYESMKWLRDDWGITVFRAAMYTSSGGYIDDPSVKEKVKETVEAAIDLGIYVIIDWHILSDNDPNIYKEEAKDFFDEMSELYGDYPNVIYEIANEPNGSDVTWDNQIKPYAEEVIPVIRDNDPNNIVIVGTGTWSQDVHHAADNQLADPNVMYAFHFYAGTHGQNLRDQVDYALDQGAAIFVSEWGTSAATGDGGVFLDEAQVWIDFMDERNLSWANWSLTHKDESSAALMPGANPTGGWTEAELSPSGTFVREKIRESAS (SEQ ID NO:669) 이다.
융합 단백질은 프로테아제 또는 산/열 처리에 의해 가공되어 개질 변이체 BBPI 를 유리시킨다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 하나 이상의 링커 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 링커 서열은 SEQ ID NO:141-143 으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 개질 변이체 BBPI 를 유리시키기 위한 융합 폴리펩티드의 절단은 보통 유용할 것이나, 필수적이지는 않다. 융합 단백질로서 발현되고 분비된 개질 변이체 BBPI 는 놀랍게도 그의 기능을 보유한다.
개질 변이체 BBPI 융합 단백질은 융합 폴리뉴클레오티드 서열로부터 숙주 세균 세포에 의해 각각 발현된다. 상기 융합 폴리뉴클레오티드 서열은 5' 말단에서 3' 말단으로 제 1, 2, 3 및 4 폴리뉴클레오티드 서열의 순서로 적절한 판독 프레임 내에 조립된다. 그렇게 조립된 폴리뉴클레오티드 서열은 그의 아미노-말단으로부터 1. 세균 종 내에서 분비 서열로서 기능하는 신호 펩티드, 2. 세균 종으로부터 정상적으로 분비되는 분비된 폴리펩티드 또는 이의 일부 예를 들어 셀룰라아제 또는 이의 일부, 3. 절단가능 링커 펩티드 및 4. 원하는 폴리펩티드 (예를 들어, 개질 변이체 BBPI) 를 인코딩하는 "융합 폴리펩티드" 를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 상기 규정된 융합 폴리뉴클레오티드 서열은 융합 단백질의 제 1 및 제 2 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 스페이서로서 기능하는 프로펩티드의 일부를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 스페이서의 기능은 제 1 및 제 2 인코딩된 폴리펩티드 사이의 거리를 증가시키려는 것이다. 일부 구현예에서, 스페이서 서열은 1-10 개 아미노산 길이이다. 다른 구현예에서, 상기 규정된 융합 폴리뉴클레오티드 서열은 링커 펩티드 및 개질 변이체 BBPI 사이에 펩티드 삽입물을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 펩티드 삽입물은 1 내지 15 개 아미노산의 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 펩티드 삽입물은 5 내지 10 개 아미노산의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 펩티드 삽입물은 SEQ ID NO:389 의 펩티드를 포함한다.
융합 단백질의 생산에 대한 다양한 방법이 당업자에게 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 제 5,411,873 호, 제 5,429,950 호 및 제 5,679,543 호 참조, 이들 모두가 본원에 참고로 포함됨). 따라서, 임의의 적합한 방법이 본 발명에 사용된다.
5.5 바우만 버크 프로테아제 저해제 폴리뉴클레오티드
본 발명이 융합 단백질의 생산에 의존하는 범위에서, 본 발명은 재조합 유전학 분야의 일상적 기술에 의존한다. 본 발명에 유용한 일반적 방법을 개시하는 기초 문헌은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual ((2nd ed.) [1989]); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); 및 Ausubel et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (1994) 를 포함한다.
본 발명은 개질 변이체 BBPI 의 발현을 가능케 하는 폴리뉴클레오티드 구성물, 벡터 및 숙주 세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 구성물은 프로모터 서열 및, 개질 변이체 BBPI 를 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 융합 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 기술된 바와 같이, 융합 폴리뉴클레오티드 서열은 촉매 도메인, 절단 위치 및 BBPI 스캐폴드를 포함한다. BBPI 를 인코딩하는 천연 또는 합성 폴리뉴클레오티드 절편이 폴리뉴클레오티드 구성물 내로 혼입될 수 있다. 변이체 BBPI 내로 도입된 하나 이상의 아미노산 치환은 하나 이상의 코돈 내 위치 포화 돌연변이유발에 의해 생성된다. 대안적 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 인코딩 서열을 포함하는 DNA 올리고뉴클레오티드에 의해 인코딩되고, 이는 어닐링되고 프로테아제 저해제 DNA 서열로 라이게이션된다. 그 후 원하는 DNA 서열이 단리되어 본원에서 제공된 방법에 사용된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 구성물은 비개질 전구체 변이체 BBPI 의 아미노산 서열과 약 65% 이상 아미노산 서열 동일성, 약 70% 이상 아미노산 서열 동일성, 약 75% 이상 아미노산 서열 동일성, 약 80% 이상 아미노산 서열 동일성, 약 85% 이상 아미노산 서열 동일성, 약 90% 이상 아미노산 서열 동일성, 약 92% 이상 아미노산 서열 동일성, 약 95% 이상 아미노산 서열 동일성, 약 97% 이상 아미노산 서열 동일성, 약 98% 이상 아미노산 서열 동일성 및 약 99% 이상 아미노산 서열 동일성을 공유하고, 비개질 전구체 변이체 BBPI 보다 더 큰 프로테아제 저해 활성을 갖는 개질 변이체 BBPI 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 발명은 상기 기술된 아미노산 치환의 임의의 하나의 조합을 포함하고, 비개질 전구체 변이체 BBPI 보다 더 큰 프로테아제 저해 활성 예를 들어 트립신 저해 활성을 갖는 개질 변이체 BBPI 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 구성물은 사용된 숙주 세포 내 개질 변이체 BBPI 의 발현에 대해 코돈 최적화될 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 많은 세포에서의 각각의 코돈의 사용을 열거하는 코돈 사용 표가 당업계에 공지되어 있거나 (예를 들어, Nakamura et al., Nucl. Acids Res., 28:292 [2000] 참조) 용이하게 유도가능하므로, 상기 핵산은 발현될 단백질의 아미노산 서열을 제공하도록 용이하게 설계될 수 있다.
본 발명은 또한 구조적으로 및/또는 기능적으로 유사하여 관련되는 개질 변이체 BBPI 단백질을 인코딩하는 코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 구성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 개질 변이체 BBPI 는 상이한 속 및/또는 종에 속하는 천연 BBPI로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 관련된 단백질은 동일한 종으로부터 제공된다. 실제로, 본 발명은 임의의 특정 공급원(들)로부터의 관련된 단백질에 제한되지 않는다. 또한, 용어 "관련된 단백질" 은 3 차 구조적 상동체 및 1 차 서열 상동체를 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 Prakash 등에 의해 기술된 것 (J mol Evol 42:560-569 [1996]) 과 같은 상기 BBPI 단백질을 제한없이 포함하는 상기 상동체를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 구성물 내에 포함된 프로모터 서열은 BBPI-인코딩 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된다. 예시적 프로모터는 항시발현 프로모터 및 유도성 프로모터를 모두 포함한다. 상기 프로모터는 당업자에게 공지되어 있다. 당업자는 또한 천연 프로모터가 그의 기능을 변화시키지 않으면서 하나 이상의 뉴클레오티드의 대체, 치환, 부가 또는 제거에 의해 개질될 수 있음을 안다. 본 발명의 실시는 프로모터에 대한 상기 변경을 포함하며 그에 의해 제한되지 않는다. 유전적 구성물 내에 사용되는 프로모터의 선택은 당업자의 지식 내에 있다.
일부 구현예에서, 프로모터 서열은 세균 공급원으로부터 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터 서열은 그람-양성 세균 예컨대 바실러스 균주 (예를 들어, 바실러스 알칼로필루스 (Bacillus alkalophilus), 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스, 바실러스 브레비스 (Bacillus brevis), 바실러스 써큘란스, 바실러스 클라우시이 (Bacillus clausii), 바실러스 코아굴란스 (Bacillus coagulans), 바실러스 피르무스 (Bacillus firmus), 바실러스 라우투스 (Bacillus lautus), 바실러스 렌투스 (Bacillus lentus), 바실러스 리체니포르미스, 바실러스 메가테리움, 바실러스 푸밀루스 (Bacillus pumilus), 바실러스 스테아로써모필루스, 바실러스 서브틸리스, 또는 바실러스 투린지엔시스); 또는 스트렙토마이세스 균주 (예를 들어, 스트렙토마이세스 리비단스 (Streptomyces lividans) 또는 스트렙토마이세스 무리누스 (Streptomyces murinus)) 로부터; 또는 그람 음성 세균 (예를 들어, E. 콜리 또는 슈도모나스 종 (Pseudomonas sp.)) 으로부터 수득될 수 있다.
프로모터는 선택되는 숙주 생물에서 전사 활성을 갖는 임의의 DNA 서열일 수 있고, 숙주 생물과 상동 또는 이종인 유전자로부터 유래될 수 있다. 세균 숙주에서 개질 변이체 BBPI 를 발현시키는데 사용될 수 있는 적합한 프로모터는 E. 콜리의 lac 오페론의 프로모터, 스트렙토마이세스 코엘리콜로르 아가라제 유전자 dagA 프로모터, 바실러스 리체니포르미스 α-아밀라아제 유전자의 프로모터 (amyL), 바실러스 서브틸리스의 aprE 프로모터, 바실러스 스테아로써모필루스 말토제닉 아밀라아제 유전자의 프로모터 (amyM), 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스 α-아밀라아제 유전자의 프로모터 (amyQ), 바실러스 서브틸리스 xylA 및 xylB 유전자의 프로모터 및 Pl70 프로모터를 포함하는 락토코쿠스 종 (Lactococcus sp.)-유래 프로모터로부터 유래된 프로모터를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 화합물을 인코딩하는 유전자가 E. 콜리와 같은 세균 종에서 발현되는 경우, 예를 들어 T7 프로모터 및 파지 람다 프로모터를 포함하는 박테리오파지 프로모터로부터 적합한 프로모터가 선택될 수 있다. 진균 종에서의 전사를 위한 유용한 프로모터의 예는 아스퍼질루스 오리자애 (Aspergilus oryzae) TAKA 아밀라아제, 리조무코르 미에헤이 (Rhizomucor miehei) 아스파르틱 프로테이나아제, A. 니게르 (A. niger) 중성 α-아밀라아제, A. 니게르 산 안정성 α-아밀라아제, A. 니게르 글루코아밀라아제, 리조무코르 미에헤이 리파아제, A. 오리자애 알칼리성 프로테아제, A. 오리자애 트리오스 포스페이트 이소머라아제 및 A. 니둘란스 (A. nidulans) 아세타미다아제를 인코딩하는 유전자로부터 유래된 것이다. 효모 종에서의 발현에 적합한 프로모터의 예는 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 의 Gal 1 및 Gal 10 프로모터 및 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) AOX1 또는 AOX2 프로모터를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한 개질 변이체 BBPI 단백질의 발현을 초래하는 상응하는 야생형 프로모터의 활성과 비교할 때 프로모터의 활성을 증가시키도록 돌연변이된 프로모터 서열을 포함한다. 따라서, B. 서브틸리스 AprE 프로모터를 정의하는 서열의 변이체가 본 발명의 구성물에 유용하다고 이해된다. 바실러스 종 내에서 프로모터 변이체를 생성하는 방법이 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, Helmann et al., 2002. RNA polymerase and sigma factors, pp289-312 In A. L. Sonenshein, J. A. Hoch and R. Losick (ed), Bacillus Subtilis and its closest relatives: from genes to cells. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 참조). 당업자에게 공지된 임의의 적합한 프로모터가 본 발명에 이용되므로, 본 발명은 임의의 특정 프로모터에 제한되지 않는다.
구현예들에서, 프로모터 서열에 더하여, 폴리뉴클레오티드 구성물은 또한 구조적 유전자의 하류에 전사 종결 부위를 포함하여 효과적인 종결을 제공한다. 일부 구현예에서, 종결 부위는 프로모터 서열과 동일한 유전자로부터 수득되는 한편, 다른 구현예에서는 또 다른 유전자로부터 수득된다. 적합한 전사 종결 신호의 선택은 당업자에게 공지되어 있다.
5.6 바우만 버크 프로테아제 저해제 벡터
본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 구성물을 포함하는 벡터를 제공한다. 벡터는 숙주 세포 내로 도입되어 본 발명의 개질 변이체 BBPI 단백질을 발현한다. 도입될 세포 내에서 복제가능하고 생존가능한 한, 임의의 벡터가 사용될 수 있다. 다수의 적합한 벡터 및 프로모터가 당업자에게 공지되어 있고, 상업적으로 입수가능하다. 적당한 클로닝 및 발현 벡터가 당업자에게 공지된 다양한 참조에 기술되어 있다 (예를 들어, 상기 Sambrook 등 및 상기 Ausubel 등 참조, 본원에서 참조로 명확히 포함됨). 적당한 BBPI-인코딩 DNA 서열이 임의의 적합한 방법에 의해 플라스미드 또는 벡터 (본원에서 집합적으로 "벡터" 로 언급됨) 내로 삽입된다. 일반적으로, DNA 서열은 당업자에게 공지된 표준 절차에 의해 적당한 제한 엔도뉴클레아제 위치(들) 내로 삽입된다.
적당한 벡터에는 전형적으로 선택가능 마커-인코딩 핵산 서열, 삽입 위치, 및 적합한 제어 요소, 예컨대 종결 서열이 구비되어 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 코딩 서열에 작동적으로 연결된, 숙주 세포에서 (및/또는 개질 가용성 단백질 코딩 서열이 정상적으로는 발현되지 않는 벡터 또는 숙주 세포 환경에서) 코딩 서열의 발현에 효과적인, 예를 들어 제어 요소 (즉, 프로모터 및 터미네이터 요소 또는 5' 및/또는 3' 미번역된 부위) 를 포함하는 조절 서열을 포함한다. 다수의 적합한 벡터 및 프로모터가 당업자에게 공지되어 있고, 그 중 다수가 상업적으로 입수가능하고 당업자에게 공지되어 있다. 적절한 선택가능 마커의 선택은 숙주 세포에 따라 달라질 것이다. 상이한 세균 숙주에 적당한 마커는 당업계에 공지되어 있다. 전형적인 선택가능 마커 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소 (예를 들어, 암피실린, 메토트렉세이트, 테트라사이클린, 네오마이신 마이코페놀산, 푸로마이신, 제오마이신 또는 히그로마이신) 에 대한 내성을 부여하거나; 또는 (b) 숙주 균주 내 영양요구성 돌연변이 또는 자연 발생적 영양 결핍을 보완하는 단백질을 인코딩한다.
일부 구현예에서, 융합 BBPI 폴리펩티드의 발현은 숙주 세포 내로 도입된 멀티카피/복제 플라스미드 상에 존재하는 상응하는 융합 폴리펩티드-인코딩 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 카피의 발현으로부터 초래된다. 일부 구현예에서, 벡터는 숙주 세포 내에서 융합 BBPI 단백질을 발현하는 염색체외 자가-복제 유전적 요소를 형성하는 멀티카피/복제 플라스미드 벡터이다. 전형적으로, 벡터는 플라스미드를 포함하는 숙주 세포의 용이한 선택을 가능케 하는 선택가능 마커 유전자를 보유하는 플라스미드 벡터이다. 숙주 세포 내에서 자가 복제하는 벡터는 벡터가 바실러스 세포에서 자가 복제할 수 있게 하는 복제 기점을 포함하는 벡터를 포함한다. 세균 복제 기점의 예는 E. 콜리에서의 복제를 가능케 하는 플라스미드 pBR322, pUC19, pACYC177 및 pACYC184, 및 바실러스에서의 복제를 가능케 하는 pUB110, pC194, pE194, pTA1060 및 pAMβ1 의 복제 기점이다. 복제 기점은 바실러스 세포에서 그의 기능을 온도-감수성으로 만드는 돌연변이를 갖는 것일 수 있다 (예를 들어, Ehrlich, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:1433 [1978] 참조). 본 발명에 이용되는 추가의 세균 발현 벡터는 박테리오파지 γ 및 M13, 및 융합 발현 시스템 예컨대 MBP, GST 및 LaZ 를 포함한다. 추가의 구현예에서, 편리한 단리 방법을 제공하기 위해 에피토프 표지가 재조합 단백질에 부가된다 (예를 들어, c-myc).
일부 구현예에서, BBPI 융합 폴리펩티드의 발현은 숙주 세포의 게놈 내로 통합되는 BBPI 융합-인코딩 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 카피의 발현으로부터 초래된다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명은 융합 벡터 내로 혼입되는 BBPI 인코딩 폴리뉴클레오티드 구성물을 제공한다. 따라서, 벡터가 숙주 세포 내로 도입될 때, 벡터는 게놈 내로 통합되고, 통합된 게놈과 함께 복제된다. BBPI 유전자의 다중 카피는 숙주 세포의 게놈의 여러 위치에서 통합될 수 있다. 대안적으로, BBPI 융합 단백질을 인코딩하는 서열 및 선택가능 마커 (예를 들어, 살균 내성 마커, 예컨대 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자) 를 보유하는 증폭가능 발현 카세트가 단일 교차 사건을 통해 게놈 내로 통합된 후, 형질전환된 숙주 세포에 적당한 살균제 (예를 들어, 클로람페니콜) 를 농도를 증가시키면서 투여함으로써 증폭될 수 있다.
5.7 바우만 버크 프로테아제 저해제 숙주 세포
한 구현예에서, 본 발명은 개질 변이체 BBPI 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다. 발현 벡터가 숙주 세포 내로 도입된 후, 형질전환된 숙주 세포는 원하는 BBPI 융합 단백질을 인코딩하는 유전자의 발현에 유리한 조건 하에 배양된다. 형질전환된 세포의 큰 배치 (batch) 들이 상기 기술된 바와 같이 배양될 수 있다. 마지막으로, 당업계에 공지된 기술을 사용하여 배양으로부터 생성물이 회수된다.
플라스미드 구성물 및 세균 숙주 세포의 플라스미드에 의한 형질전환을 수반하는 바실러스 세포 내로 DNA 를 도입하는 방법이 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 그 뒤에 E. 콜리로부터 단리되고 바실러스 내로 형질전환된다. 그러나, E. 콜리와 같은 개재 미생물을 사용하는 것은 필수적이지 않고, 일부 구현예에서, DNA 구성물 또는 벡터가 바실러스 숙주 내로 직접 도입된다. 당업자는 바실러스 세포 내로 폴리뉴클레오티드 서열을 도입하는 적합한 방법을 잘 안다 (예를 들어, Ferrari et al., "Genetics", in Harwood et al. (ed.), Bacillus, Plenum Publishing Corp. [1989], pages 57-72; Saunders et al., J. Bacteriol., 157:718-726 [1984]; Hoch et al., J. Bacteriol., 93:1925-1937 [1967]; Mann et al., Current Microbiol., 13:131-135 [1986]; and Holubova, Folia Microbiol., 30:97 [1985]; Chang et al., Mol. Gen. Genet., 168:11-115 [1979]; Vorobjeva et al., FEMS Microbiol. Lett., 7:261-263 [1980]; Smith et al., Appl. Env. Microbiol., 51:634 [1986]; Fisher et al., Arch. Microbiol., 139:213-217 [1981]; 및 McDonald, J. Gen. Microbiol.,130:203 [1984] 참조). 실제로, 원형질체 형질전환 및 컨그레션 (congression), 형질도입 및 원형질체 융합을 포함하는 형질전환과 같은 방법이 공지되어 있고 본 발명에서의 사용에 적합하다. 본 발명에 의해 제공된 DNA 구성물을 숙주 세포 내로 도입하는데 형질전환 방법이 특히 바람직하다.
통상적으로 사용되는 방법에 더하여, 일부 구현예에서, 숙주 세포는 직접 형질전환된다 (즉, 숙주 세포 내로 도입하기 전에 DNA 구성물을 증폭시키거나 아니면 가공하기 위해 중간 세포가 사용되지 않음). 숙주 세포 내로의 DNA 구성물의 도입은 플라스미드 또는 벡터 내로의 삽입 없이 숙주 세포 내로 DNA 를 도입하는 당업계에 공지된 물리적 및 화학적 방법을 포함한다. 상기 방법은 전기천공, 네이키드 DNA 또는 리포솜 등의 삽입을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 추가의 구현예에서, DNA 구성물은 플라스미드 내로 삽입됨 없이 플라스미드로 동시-형질전환된다. 추가의 구현예에서, 선택적 마커는 변경된 바실러스 균주로부터 당업계에 공지된 방법에 의해 결실된다 (Stahl et al., J. Bacteriol., 158:411-418 [1984]; and Palmeros et al., Gene 247:255-264 [2000] 참조).
바실러스를 형질전환시키는 당업계에 공지된 방법은, 부분적으로 상동인 상주 플라스미드를 보유하는 적격 세포에 의한 공여자 플라스미드의 섭취를 수반하는 플라스미드 마커 구조 형질전환과 같은 방법을 포함한다 (Contente et al., Plasmid 2:555-571 [1979]; Haima et al., Mol. Gen. Genet., 223:185-191 [1990]; Weinrauch et al., J. Bacteriol., 154:1077-1087 [1983]; 및 Weinrauch et al., J. Bacteriol., 169:1205-1211 [1987]). 상기 방법에서, 염색체 형질전환을 모방하는 과정에서 들어오는 공여자 플라스미드는 상주 "조력" 플라스미드의 상동 부위와 재조합한다.
원형질체 형질전환에 의한 형질전환을 수반하는 다른 방법이 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, Chang and Cohen, Mol. Gen. Genet., 168:111-115 [1979]; Vorobjeva et al., FEMS Microbiol. Lett., 7:261-263 [1980]; Smith et al., Appl. Env. Microbiol.,51:634 [1986]; Fisher et al., Arch. Microbiol., 139:213-217 [1981]; McDonald [1984] J. Gen. Microbiol., 130:203 [1984]; 및 Bakhiet et al., 49:577 [1985] 참조). 또한, Mann 등 (Mann et al., Curr. Microbiol., 13:131-135 [1986]) 은 바실러스 원형질체의 형질전환을 기술하고, Holubova (Holubova, Microbiol., 30:97 [1985]) 는 DNA-포함 리포솜을 사용하여 원형질체 내로 DNA 를 도입하는 방법을 기술한다. 일부 구현예에서, 관심의 유전자가 숙주 세포 내에 존재하는지 여부를 지시하기 위해 마커 유전자가 사용된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 벡터 내에 포함된 BBPI 융합 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:195 를 갖는 BBPI 융합 단백질을 인코딩한다. 상기 방법에 더하여, 다른 구현예에서, 숙주 세포는 직접 형질전환된다. "직접적 형질전환" 에서, 숙주 (즉, 바실러스) 세포 내로 도입하기 전에 개질 폴리뉴클레오티드를 증폭시키거나, 아니면 가공하기 위해 중간 세포가 사용되지 않는다. 개질 폴리뉴클레오티드의 숙주 세포 내로의 도입은 플라스미드 또는 벡터 내로의 삽입 없이 숙주 세포 내로 개질 폴리뉴클레오티드를 도입하는 당업계에 공지된 물리적 및 화학적 방법을 포함한다. 상기 방법은 적격 세포의 사용 뿐만 아니라, 세포 내로 DNA 를 도입하는 "인공적 수단" 예컨대 염화칼슘 침전, 전기천공 등을 제한없이 포함한다. 따라서, 본 발명은 네이키드 DNA, 리포솜 등을 사용한다.
적합한 세균 숙주 생물의 예는 바실라세아애 (Bacillaceae) 인 바실러스 종 (예를 들어, B. 서브틸리스, B. 리체니포르미스, B. 렌투스, B. 브레비스, B. 스테아로써모필루스, B. 알칼로필루스, B. 아밀로리쿠에파시엔스, B. 클라우시이, B. 할로두란스, B. 코아굴란스, B. 써큘란스, B. 라우투스, B. 메가테리움 및 B. 투린지엔시스), 스트렙토마이세스 종 (예를 들어, S. 무리누스 및 S. 리비단스) 락트산 세균 (예를 들어, 락토코쿠스 종 예컨대 락토코쿠스 락티스 (Lactococcus lactis); 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) 를 포함하는 락토바실러스 종 (Lactobacillus spp.); 류코노스톡 종 (Leuconostoc spp.); 페디오코쿠스 종 (Pediococcus spp.); 및 스트렙토코쿠스 종 (Streptococcus spp.)) 의 일원을 제한없이 포함하는 그람 양성 종이다. 대안적으로, 엔테로박테리아세아애 (Enterobacteriaceae) 에 속하는 그람 음성 종의 균주 (예를 들어, E. 콜리) 또는 슈도모나다세아애 (Pseudomonadaceae) 의 일원이 본 발명에 이용된다.
일부 구현예에서, 적합한 효모 숙주 생물은 피치아 종 (Pichia sp.), 한세눌라 종 (Hansenula sp) 또는 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 야로위니아 (Yarrowinia), 사카로마이세스 (Saccharomyces) (예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)), 스키조사카로마이세 (Schizosaccharomyce) (예를 들어, S. 폼베 (S. pombe)) 를 제한없이 포함하는 다양한 생명공학적으로 유용한 효모 종으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 메틸요구성 효모 종 피치아 파스토리스의 균주가 숙주 생물로서 사용되는 한편, 다른 구현예에서 숙주 생물은 한세눌라 종이다. 사상균 중에서 적합한 숙주 생물은 아스퍼질루스의 종 (예를 들어, A. 니게르, A. 오리자애, A. 투비젠시스 (A. tubigensis), A. 아와모리 (A. awamori) 및 아스퍼질루스 니둘란스) 을 포함한다. 대안적으로, 푸사리움 (Fusarium) 종의 균주 (예를 들어 F. 옥시스포룸 (F. oxysporum)) 및 리조무코르 (Rhizomucor) (예를 들어, 리조무코르 미에헤이) 가 숙주 생물로서 사용된다. 부가적인 적합한 균주는 써모마이세스 (Thermomyces) 및 무코르 (Mucor) 종을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서 티올-디술피드 옥시도리덕타아제 또는 샤페론과 같은 부 단백질이 이용되는데, 이는 분비 단백질이 그의 활성 입체구조로 접히는 것을 돕는데 유익할 수 있기 때문이다. 티올-디술피드 옥시도리덕타아제 및 단백질 디술피드 이소머라아제는 단백질 내 정확한 디술피드 결합의 형성을 촉진한다. B. 서브틸리스 내 bdbDC 오페론의 과발현은 디술피드 결합을 갖는 단백질의 생산에 유익한 것으로 밝혀졌다 (예를 들어, Meima et al., J. Biol. Chem., 277:6994-7001, [2002] 참조). 샤페론은 접히지 않은 상태에서 노출된 소수성 부위에 결합하고 바람직하지 않은 상호작용을 방지함으로써 분비 단백질이 접히는 것을 돕고, 프로필-펩티딜 시스-트랜스 이소머라아제는 프롤린 잔기에 인접한 펩티드 사슬의 적절한 입체구조의 형성을 돕는다.
본 발명의 일부 구현예에서, 숙주 세포는 하나 이상의 티올-디술피드 옥시도리덕타아제 또는 샤페론을 인코딩하는 발현 벡터로 형질전환된다. 당업자에게 공지된 임의의 적합한 티올-디술피드 옥시도리덕타아제 또는 샤페론이 본 발명에 이용되므로, 본 발명은 임의의 특정 티올-디술피드 옥시도리덕타아제 또는 샤페론에 제한되지 않는다.
본 발명의 일부 구현예에서, 그리고 하기 추가로 기술된 바와 같이, 디술피드 결합을 환원/산화하는 및/또는 전체적 산화환원 전위를 변경하는 화학약품, 및/또는 용매 특성을 변경하여 단백질 입체구조 및 응집에 영향을 미치는 화학약품을 성장 배지에 첨가함으로써 적절히 접힌 분비 단백질의 분획이 증가된다. 특히 바람직한 구현예에서, 디술피드 결합을 환원시키는 시약, 예컨대 2-머캅토에탄올 (βME) 이 올바르게 접힌 단백질의 분획을 증가시키는데 바람직하다. 그러나, 다른 구현예에서 및 사용된 배지에 따라, 다른 디술피드 환원 또는 산화제 (예를 들어, DTT, TCEP, 환원된 및 산화된 글루타치온, 시스테인, 시스틴, 시스테아민, 티오글리콜레이트, S2O3 2 -, S2O4 2 -, S2O5 2 -, SO3 2 -, S2O7 2 -, Cu+ 등) 가 단독으로 또는 조합되어 본 발명에 사용된다. 단독으로 또는 바람직하게는 βME 과 같은 디술피드 환원/산화제와 조합되어 성장 배지에 부가되는, 용매 특성을 변경하는 다른 아주반트 (예를 들어, 우레아, DMSO, TWEEN®-80 등) 가 또한 올바르게 접힌 분비 단백질의 분획을 증가시키고 본 발명의 다양한 구현예에 사용될 것으로 고찰된다. 일부 바람직한 구현예에서, BME 은 0.5 내지 4 mM 범위의 농도로 사용되는 한편, 다른 구현예에서 농도는 0.1 mM 내지 10 mM 범위이다. 실제로, 당업자는 부가된 티올 환원/산화제 및/또는 다른 아주반트의 효과를 최적화하는 최상의 성장 배지 및 성장 조건 뿐만 아니라, 사용할 티오 환원/산화제 및/또는 다른 아주반트의 농도를 어떻게 선택하는지를 안다. 당업자에게 공지된 임의의 적합한 시약이 본 발명에 사용되므로, 본 발명은 임의의 특정 디술피드 환원/산화제 또는 아주반트에 제한되지 않는다.
5.7.1 발효 매개변수
본 발명은 세균 종을 배양하기 위해 발효 절차에 의존한다. 세균 종에 의한 이종 단백질의 생산을 위한 발효 절차가 당업계에 공지되어 있다. 배양은 수성 미네랄 염 배지, 유기 성장 인자, 탄소 및 에너지 공급 물질, 산소 분자 (호기성 및 융통 세균에 대해) 및 물론 이용될 하나 이상의 특정 미생물 종의 시작 접종물을 포함하는 성장 배지 내에서 수행된다.
탄소 및 에너지 공급원, 산소, 동화가능 질소 및 미생물의 접종물에 더하여, 적절한 미생물 성장을 보장하고, 미생물 전환 과정에서 세포에 의한 탄소 및 에너지 공급원의 동화를 최대화하고, 발효 배지 내의 최대 세포 밀도와 함께 최대 세포 수율을 달성하기 위해, 적절한 양의 미네랄 영양소를 적절한 비율로 공급하는 것이 필요하다.
당업자에게 공지된 다양한 배양 배지가 본 발명에 사용된다. 그러나, 표준 세균 배양 배지가 본 발명에 사용된다. 일부 바람직한 배지 제형에서, 배지는 질소에 더하여 적합한 양의 인, 마그네슘, 칼슘, 칼륨, 황 및 나트륨을 적합한 가용성 동화가능 이온 및 조합된 형태로 포함하고, 또한 바람직하게는 특정 미량 요소 예컨대 구리, 망간, 몰리브덴, 아연, 철, 붕소 및 요오드 등이 적합한 가용성 동화가능 형태로 존재해야 하며, 이는 모두 당업계에 공지되어 있다.
일부 구현예에서, 발효 반응은 미생물 종이 번성하는 방식으로 성장하는 것을 돕는데 효과적인 적합한 산소 부분압으로 발효 용기의 함량을 유지하도록 제공되는, 산소 분자 함유 기체 예컨대 공기, 산소가 풍부한 공기, 또는 심지어 실질적으로 순수한 산소 분자에 의해 필요한 산소 분자가 공급되는 유산소 과정을 수반한다. 실제로, 산화 탄화수소 기질을 사용함으로써, 미생물의 성장에 필요한 산소가 감소된다. 그럼에도 불구하고, 호기성 및 더 적은 정도로, 임의성 (facultative) 생물의 성장을 위해 산소 분자가 공급되어야 한다.
통기 속도는 상당한 범위에 걸쳐 다양할 수 있지만, 일반적으로 통기는 약 0.5 내지 10, 바람직하게는 약 0.5 내지 7 범위의 속도 (분 당 발효기 내 액체 부피 당 산소 함유 기체의 부피 (이용된 압력에서 및 25℃ 에서)) 로 수행된다. 상기 양은 반응기로 공급될 정상 산소 함량의 공기에 기초하고, 순수 산소에 대해 각각의 범위는 약 0.1 내지 1.7, 또는 바람직하게는 약 0.1 내지 1.3 (분 당 발효기 내 액체 부피 당 산소의 부피 (이용된 압력에서 및 25℃ 에서)) 일 것이다.
미생물 전환에 이용되는 압력은 광범위하게 다양할 수 있다. 일반적으로 압력은 장비 및 작업 비용 대 달성된 산소 용해도의 균형으로서, 약 0 내지 50 psig, 현재 바람직하게는 약 0 내지 30 psig, 더욱 바람직하게는 적어도 약간 대기압 초과의 범위 내이다. 대기압 초과가 유리한데, 이는 그러한 압력이 수성 발효소 내 용해된 산소 농도를 증가시키는 경향이 있고, 이는 다시 세포 성장 속도를 증가시키는 것을 도울 수 있기 때문이다. 동시에, 이는 고기압이 장비 및 작업 비용을 증가시킨다는 사실에 의해 균형이 유지된다.
발효 온도는 다소 다를 수 있지만, 본 발명에 사용된 대부분의 세균 종의 경우, 온도는 당업자에게 공지된 바와 같이 선택된 미생물의 균주에 따라 일반적으로 약 20℃ 내지 40℃ 의 범위 내, 일반적으로 바람직하게는 약 28℃ 내지 37℃ 의 범위일 것이다.
미생물은 또한 동화가능 질소의 공급원을 요구한다. 동화가능 질소의 공급원은 미생물에 의한 대사적 이용에 적합한 형태로 질소를 방출할 수 있는 임의의 질소 함유 화합물 또는 화합물들일 수 있다. 다양한 유기 질소 공급원 화합물, 예컨대 단백질 가수분해물이 이용될 수 있는 한편, 통상적으로 저렴한 질소 함유 화합물 예컨대 암모니아, 암모늄 히드록시드, 우레아, 및 다양한 암모늄 염 예컨대 암모늄 포스페이트, 암모늄 술페이트, 암모늄 파이로포스페이트, 암모늄 클로라이드, 또는 다양한 다른 암모늄 화합물이 이용될 수 있다. 암모니아 기체 자체는 대규모 작업에 편리하고, 적합한 양으로 수성 발효소 (발효 배지) 를 통해 버블링함으로써 이용될 수 있다. 동시에, 상기 암모니아는 또한 pH 조절을 돕는데 이용될 수 있다.
수성 미생물 발효소 (발효 혼합물) 내 pH 범위는 약 2.0 내지 8.0 의 전형적 범위 내여야 한다. 그러나, 특정 미생물에 대한 최적 pH 범위는 어느 정도 이용된 배지 뿐만 아니라 특정 미생물에 따라 다르므로, 당업자에게 알려진 바와 같이 배지 내 변화에 따라 다소 변화한다.
한편 발효기 내 발효 혼합물의 평균 체류 시간은 당업계에 공지된 바와 같이 어느 정도 이용된 발효 온도 및 배양물에 따라 상당히 다를 수 있다.
일부 구현예에서, 발효는 바람직하게는 탄소 함유 기질이 제한 인자로서 통제될 수 있는 방식으로 수행됨으로써, 탄소 함유 기질의 세포로의 양호한 전환을 제공하고 상당한 양의 미전환된 기질에 의한 세포의 오염을 방지한다. 임의의 잔류 미량이 용이하게 제거되므로, 후자는 수용성 기질에 대해 문제가 아니다. 그러나, 그것은 비-수용성 기질의 경우에 문제가 되어, 적합한 세척 단계와 같은 부가된 생성물-처리 단계가 필요할 수 있다. 상기 제한 기질 수준에 도달하는데 필요한 시간은 중요하지 않고, 특정 미생물 및 수행될 발효 과정에 따라 다를 수 있다. 그러나, 발효 배지 내 탄소 공급원 농도 및 탄소 공급원의 원하는 수준이 달성되었는지 여부를 측정하는 방법이 당업계에 공지되어 있다.
일부 구현예에서, 발효는 회분식 또는 연속식 공정으로서 수행되지만, 통제의 용이성, 균일한 양의 생성물의 생산, 및 모든 장비의 가장 경제적인 이용을 위해 유가식 공정이 일반적으로 바람직하다.
원하는 경우, 발효기 내로 수성 미네랄 배지를 공급하기 전에 탄소 및 에너지 공급원 물질의 일부 또는 전부 및/또는 동화가능 질소 공급원 예컨대 암모니아의 일부가 수성 미네랄 배지에 첨가될 수 있다. 실제로, 반응기 내로 도입된 각각의 스트림은 바람직하게는 소정의 속도로, 또는 예컨대 탄소 및 에너지 기질의 농도, pH, 용해된 산소, 반응기로부터의 오프가스 내 산소 또는 이산화탄소, 광 투과도에 의해 측정가능한 세포 밀도 등을 모니터링함으로써 측정가능한 필요에 반응하여 제어된다. 다양한 물질의 공급 속도는 탄소 및 에너지 공급원의 효율적 이용과 일치되게, 가능한 한 빠른 세포 성장 속도를 수득하도록, 기질 변화에 비해 미생물 세포의 가능한 한 높은 수율을 수득하도록, 그러나 더욱 중요하게는 단위 부피 당 원하는 단백질의 최고 생산을 수득하도록 달라질 수 있다.
회분식, 또는 바람직한 유가식 공정에서, 모든 장비, 반응기, 또는 발효 수단, 용기 또는 컨테이너, 배관, 부수적 순환 또는 냉각 장치 등은 통상적으로 예컨대 약 15 분 이상 동안 약 121℃ 에서 스팀을 이용함으로써 초기에 살균된다. 그 후 살균된 반응기는 산소를 포함하는 모든 필요한 영양소, 및 탄소 함유 기질의 존재 하에 선택되는 미생물의 배양물로 접종된다. 이용되는 반응기의 유형은 중요하지 않지만, 일부 구현예에서 15L Biolafitte (Saint-Germain-en-Laye, France) 가 바람직하다.
5.8 단백질 분리
일부 구현예에서, 개질 프로테아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열로 형질전환된 숙주 세포가 세포 배양으로부터의 인코딩된 단백질의 발현 및 회수에 적합한 조건 하에 배양된다. 본 발명의 융합 BBPI 를 포함하는 재조합 숙주 세포에 의해 생산된 단백질은 배양 배지 내로 분비된다. 일부 구현예에서, 분비된 융합 BBPI 는 회수된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 그의 융합 유사체로부터 원하는 단백질을 분리하는 방법을 제공한다. 본원에서 기술된 방법은 융합 유사체로부터의 개질 변이체 BBPI 의 분리에 사용될 것으로 고찰된다.
발효 브로쓰로부터의 원하는 융합 BBPI 단백질의 수집 및 정제는 또한 당업자에게 공지된 절차를 사용하여 달성될 수 있다. 발효 브로쓰는 일반적으로 원하는 단백질 생성물 뿐만 아니라, 세포를 포함하는 세포 잔해, 다양한 현탁된 고체 및 다른 생물량 오염원을 포함할 것이고, 이는 바람직하게는 당업계에 공지된 방법에 의해 발효 브로쓰로부터 제거된다. 상기 제거에 적합한 과정은 무세포 여과액을 생성하는 종래의 고체-액체 분리 기술 (예를 들어, 원심분리, 여과, 투석, 미세여과, 회전 진공 여과, 또는 다른 공지된 과정) 을 포함한다. 일부 구현예에서, 미세여과, 증발 및/또는 침전과 같은 기술을 사용하여 정제 및/또는 결정화 과정에 앞서 발효 브로쓰 또는 무세포 여과액을 추가로 농축시키는 것이 바람직하다.
상청액 또는 여과액의 단백질성 성분의 침전은 염 (예를 들어, 암모늄 술페이트) 또는 낮은 pH (전형적으로 3 미만) 의 방법에 의해, 그 후 다양한 크로마토그래피 절차 (예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 소수성 전하 유도 크로마토그래피 등) 또는 유사한 기술 인지된 절차에 의한 정제에 의해 달성될 수 있다. 임의의 방법이 본 발명에 이용될 것으로 고찰되므로, 본 발명은 임의의 특정 분리 방법에 제한되지 않는다.
특정 바람직한 구현예에서, 발현된 원하는 폴리펩티드가 세균 세포로부터 분비될 때, 폴리펩티드는 성장 배지로부터 정제된다. 바람직한 구현예에서, 폴리펩티드의 정제 (예를 들어 원심분리에 의함) 이전에 발현 숙주 세포가 배지로부터 제거된다.
발현된 재조합 원하는 폴리펩티드가 숙주 세포로부터 분비되지 않을 때, 숙주 세포는 바람직하게는 파열되고, 폴리펩티드는 수성 "추출물" 내로 방출되는데, 이는 정제의 제 1 단계이다. 바람직하게는, 세포 파열 (예를 들어 원심분리에 의함) 이전에 배지로부터 발현 숙주 세포가 수집된다. 세포 파열은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해, 예컨대 라이소자임 또는 베타-글루카나아제 소화에 의해 또는 세포에 고압을 가함으로써 수행될 수 있다 (예를 들어, Scobes, Protein Purification, Second edition, Springer-Verlag 참조).
일부 구현예에서, 다른 재조합 구성은 가용성 단백질의 정제를 촉진하는 개질 변이체 BBPI 폴리펩티드 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대한 정제 촉진 도메인의 부가를 포함한다 (Kroll DJ et al (1993) DNA Cell Biol 12:441-53). 일부 구현예에서, 원하는 단백질 및 그의 융합 유사체의 정제의 보조로서 개질 변이체 BBPI 의 C-말단에 대한 6 개의 히스티딘 잔기 (즉, "His 표지") 의 부가가 사용된다. 정제 보조로서의 His 표지의 사용은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, Hengen, TIBS 20:285-286 [1995] 참조). 6× his-표지된 단백질은 당업자에게 공지된 고정화된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 (Immobilized Metal ion Affinity Chromatography, IMAC) 를 사용하여 용이하게 정제된다. 다른 정제 촉진 도메인은, 고정화된 금속 상의 정제를 가능케 하는 히스티딘-트립토판 모듈과 같은 금속 킬레이팅 펩티드 (Porath J (1992) Protein Expr Purif 3:263-281), 고정화된 면역글로불린 상의 정제를 가능케 하는 단백질 A 도메인, 및 FLAGS 확장/친화성 정제 시스템에 이용되는 도메인 (Immunex Corp, Seattle WA) 을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 정제 도메인 및 이종 단백질 사이에 Factor XA 또는 엔테로키나아제 (Invitrogen, San Diego CA) 와 같은 절단가능 링커 서열의 포함이 정제를 촉진하는데 또한 사용된다.
따라서, 본 발명의 융합 BBPI 의 회수에 적합한 임의의 방법이 본 발명에 사용된다. 실제로, 본 발명은 임의의 특정 정제 방법에 제한되지 않는다.
일부 적용의 경우, 본 발명을 사용하여 생산된 프로테아제 저해제가 고도로 순수 (예를 들어 99% 이상의 순도를 가짐) 한 것이 매우 중요하다. 이는 원하는 단백질이 치료제로서 사용될 경우 특히 그러하지만, 다른 적용의 경우에도 또한 필요하다. 본원에서 기술된 방법은 상당히 순수한 원하는 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 본원에서 기술된 원하는 단백질은 약학 조성물 및 개인 케어 조성물에 유용하다. 그러나, 본 발명의 방법을 사용하여 다양한 순도 수준의 단백질이 생성될 것으로 고찰되고, 본 발명을 사용하여 생성된 단백질은 임의의 특정 수준의 순도에 제한되지 않는다.
5.8.1 정제 동안 BBPI 의 활성화: 프로테아제 저해 활성
본 발명의 일부 구현예에서, 정제 과정 동안 성장 이후, 디술피드 결합을 환원/산화시키는 및/또는 전체적 산화환원 전위를 변경하는 화학약품, 및/또는 용매 특성을 변경함으로써 단백질 입체구조 및 응집에 영향을 미치는 화학약품의 첨가에 의해 단백질의 활성 즉, 프로테아제 저해 활성이 증가된다. 일부 특정 바람직한 구현예에서, 단백질의 활성을 증가시키기 위해 2-머캅토에탄올과 같이 디술피드 결합을 환원시키는 시약의 첨가가 사용된다. 그러나, 당업자가 이해하는 바와 같이, 순도 및 완충액 조성에 따라, 다른 디술피드 환원 또는 산화제 (예를 들어, DTT, TCEP, 환원된 및 환원된 및 산화된 글루타치온, 시스테인, 시스틴, 시스테아민, 티오글리콜레이트, S2O3 2 -, S2O4 2 -, S2O5 2 -, SO3 2 -, S2O7 2 -, Cu+, 단백질 디술피드 이소머라아제, 단백질 티올-디술피드 옥시도리덕타아제 등) 가 단독으로 또는 조합되어 본 발명에 사용된다. 정제 과정 동안 단독으로 또는 바람직하게는 디술피드 환원/산화제, 예컨대 βME 와 조합되어 첨가되는, 용매 특성을 변경하는 다른 아주반트 (예를 들어 에탄올아민, DMSO, TWEEN®-80, 아르기닌, 우레아 등) 가 또한 단백질의 활성을 증가시킴으로써 본 발명에 사용된다. 특정 바람직한 구현예에서, 부분적으로 정제된 단백질이 완충액 (일부 특정 바람직한 구현예에서, 염기성 pH 인 TWEEN®-80 을 함유하는 쯔비터이온성 완충액) 내에 희석되고, βME 및 디술피드 산화제 (대안적인 바람직한 구현예에서, 산화된 글루타치온 또는 나트륨 술파이트) 로 활성화된다.
또한, 원하는 경우 BBPI 단백질의 최적 활성화를 결정하기 위해 조건들이 검색될 것으로 고찰된다. 사용된 발현 시스템에 대한 최적의 조건을 결정하기 위해 예를 들어, 다양한 βME 농도 (0.1 - 10 mM), 산화제 농도 (βME 농도의 0 내지 1/20 내지 20 배), pH (7.5 - 9.5), 온도 (15 - 40℃), 희석 (1 - 20 배), 인큐베이션 시간 (12 - 72 시간), 통기 (불활성 기체 하의 인큐베이션 내지 산소 함유 기체 하의 강한 혼합), 완충액 유형 (Tris, CHES, CAPS, 트리신, TAPS, 다른 쯔비터이온성 완충액 등), 완충액 농도 (0.1 - 1 M), 및 용매 특성을 변경함으로써 단백질 입체구조 및 응집에 영향을 미치는 공지된 다양한 아주반트 (예를 들어, 에탄올아민, DMSO, TWEEN®-80, 아르기닌, 우레아 등) 의 첨가가 시험된다. 당업자에게 공지된 임의의 적합한 시약이 본 발명에 사용되므로, 본 발명은 임의의 특정 디술피드 환원/산화제, 희석액, 온도, pH, 완충액 유형 또는 조성, 또는 아주반트에 제한되지 않는다.
비개질 변이체 BBPI 의 프로테아제 저해 활성의 증가를 측정함으로써 티올 환원제 및/또는 산화제에 의한 BBPI 의 최적 활성화가 모니터링된다. 트립신 저해 활성은 키모트립신 루프가 변이체 펩티드에 의해 대체된 변이체 BBPI 에서 검정되는 프로테아제 저해인 한편, 키모트립신 저해 활성은 트립신 루프가 변이체 펩티드에 의해 대체된 변이체 BBPI 에서 검정되는 프로테아제 저해이다. 일부 구현예에서, 개질 BBPI 의 트립신 저해 활성에 대한 하나 이상의 아미노산 치환의 효과가 검정되고, 비개질 전구체 BBPI 의 트립신 저해 활성과 비교된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 개질 변이체 BBPI 는 비개질 전구체 BBPI 보다 더 큰 트립신 저해 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 비개질 전구체보다 더 큰 TIA 를 갖는 개질 변이체 BBPI 를 생성하는 단일 아미노산 치환은 SEQ ID NO:187 의 위치 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 및 65 와 동등한 위치로부터 선택되는 동등한 위치로부터 선택되고, 하기 치환된 아미노산을 초래한다. 한 구현예에서, SEQ ID NO:187 의 위치 1 과 동등한 아미노산 위치에서 치환된 아미노산은 A 및 C 로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, SEQ ID NO:187 의 위치 4 와 동등한 아미노산 위치에서 치환된 아미노산은 V 로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, SEQ ID NO:187 의 위치 5 와 동등한 아미노산 위치에서 치환된 아미노산은 P 및 A 로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, SEQ ID NO:187 의 위치 11 과 동등한 아미노산 위치에서 치환된 아미노산은 G 로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, SEQ ID NO:187 의 위치 13 과 동등한 아미노산 위치에서 치환된 아미노산은 Y, I, F, M, L, V, K 및 R 로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, SEQ ID NO:187 의 위치 18 과 동등한 아미노산 위치에서 치환된 아미노산은 I, V 및 L 을 포함한다. 또 다른 구현예에서, SEQ ID NO:187 의 위치 25 와 동등한 아미노산 위치에서 치환된 아미노산은 K, N, W, I, A 및 R 로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, SEQ ID NO:187 의 위치 27 과 동등한 아미노산 위치에서 치환된 아미노산은 R, K, V, A 및 Q 를 포함한다. 또 다른 구현예에서, SEQ ID NO:187 의 위치 29 와 동등한 아미노산 위치에서 치환된 아미노산은 R, K 및 P 로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, SEQ ID NO:187 의 위치 31 과 동등한 아미노산 위치에서 치환된 아미노산은 Q, H, E, A, R, W, K 및 T 로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, SEQ ID NO:187 의 위치 38 과 동등한 아미노산 위치에서 치환된 아미노산은 N, K 및 R 로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, SEQ ID NO:187 의 위치 40 과 동등한 아미노산 위치에서 치환된 아미노산은 H, K, Q, R 및 Y 로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, SEQ ID NO:187 의 위치 50 과 동등한 아미노산 위치에서 치환된 아미노산은 R, Q, K, T, V, M 및 S 로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, SEQ ID NO:187 의 위치 52 와 동등한 아미노산 위치에서 치환된 아미노산은 K, T, R, Q, L, H, A, M, S 및 E 로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, SEQ ID NO:187 의 위치 55 와 동등한 아미노산 위치에서 치환된 아미노산은 M 이다. 또 다른 구현예에서, SEQ ID NO:187 의 위치 65 와 동등한 아미노산 위치에서 치환된 아미노산은 E, Q 및 D 로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상응하는 전구체 비개질 BBPI 보다 더 큰 TIA 및 PY 를 갖는 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:187 의 위치 50 및 52 와 동등한 아미노산 위치에서 2 개의 아미노산 치환의 조합을 각각 포함한다 . 일부 구현예에서, 2 개의 아미노산 치환의 조합은 50T-52A 이다. 본 발명은 섹션 5.4 에서 기술된 바와 같이 2 개의 아미노산 치환의 조합 50T-52A 를 추가로 포함하는, 섹션 5.3 에서 기술된 임의의 하나의 변이체 BBPI 스캐폴드를 제공한다. 한 구현예에서, 변이체 스캐폴드의 키모트립신 루프는 VEGF 변이체 펩티드 예를 들어 SEQ ID NO:9 이고, 변이체 스캐폴드는 SEQ ID NO:187 의 위치 13, 50 및 52 와 동등한 위치에서 3 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하도록 추가로 변경되어 개질 변이체 BBPI 스캐폴드를 생성한다. 한 구현예에서, 2 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하는 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:595 의 개질 변이체 BBIt-AV-F50T-V52A 이다.
일부 구현예에서, 상응하는 전구체 비개질 BBPI 보다 더 큰 TIA 및 PY 를 갖는 개질 변이체 BBPI 는 아미노산 SEQ ID NO:187 의 위치 13, 50 및 52 와 동등한 아미노산 위치에서 3 개의 아미노산 치환의 조합을 각각 포함한다. 일부 구현예에서, 3 개의 아미노산 치환의 조합은 위치 25-50-52, 29-50-52, 40-50-52 및 13-50-52 에서의 치환의 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 3 개의 아미노산 치환의 조합은 25L-50T-52A, 29P-50T-52A, 40K-50T-52A 및 13I-50T-52A 로부터 선택된다. 본 발명은 섹션 5.4 에서 기술된 바와 같이 25L-50T-52A, 29P-50T-52A, 40K-50T-52A 및 13I-50T-52A 로부터 선택되는 3 개의 아미노산 치환의 조합을 추가로 포함하는, 5.3 에서 기술된 임의의 하나의 변이체 BBPI 스캐폴드를 제공한다. 한 구현예에서, 변이체 스캐폴드의 키모트립신 루프는 VEGF 변이체 펩티드 예를 들어 SEQ ID NO:9 이고, 변이체 스캐폴드는 SEQ ID NO:187 의 위치 13, 50 및 52 와 동등한 위치에서 3 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하도록 추가로 변경되어 개질 변이체 BBPI 스캐폴드를 생성한다. 한 구현예에서, 3 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하는 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:603 의 개질 변이체 BBIt-AV-S25L-F50T-V52A, SEQ ID NO:607 의 개질 변이체 BBIt-AV-L29P-F50T-V52A, 및 SEQ ID NO:609 의 개질 변이체 BBIt-AV-A40K-F50T-V52A 로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상응하는 전구체 비개질 BBPI 보다 더 큰 TIA 를 갖는 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:187 의 위치 13, 29, 50 및 52 와 동등한 아미노산 위치에서 4 개의 아미노산 치환의 조합을 각각 포함한다. 일부 구현예에서, 4 개의 아미노산 치환의 조합은 위치 13-25-50-52, 13-29-50-52, 25-29-50-52, 13-40-50-52, 25-40-50-52 및 29-40-50-52 에서의 치환의 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 4 개의 아미노산 치환의 조합은 13I-25L-50T-52A, 13I-29P-50T-52A, 25L-29P-50T-52A, 13I-40K-50T-52A, 25L-40K-50T-52A 및 29P-40K-50T-52A 로부터 선택된다. 본 발명은 섹션 5.4 에서 기술된 바와 같이 13I-25L-50T-52A, 13I-29P-50T-52A, 25L-29P-50T-52A, 13I-40K-50T-52A, 25L-40K-50T-52A 및 29P-40K-50T-52A 로부터 선택되는 4 개의 아미노산 치환의 조합을 추가로 포함하는, 섹션 5.3 에서 기술된 임의의 하나의 변이체 BBPI 스캐폴드를 제공한다. 한 구현예에서, 변이체 스캐폴드의 키모트립신 루프는 SEQ ID NO:9 및 460 으로부터 선택되는 VEGF 변이체 펩티드이고, 변이체 스캐폴드는 SEQ ID NO:187 의 위치 13, 29, 50 및 52 와 동등한 위치에서 4 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하도록 추가로 변경되어 개질 변이체 BBPI 스캐폴드를 생성한다. 한 구현예에서, 4 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하는 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:596 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-S25L-F50T-V52A, SEQ ID NO:600 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-L29P-F50T-V52A, SEQ ID NO:602 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-A40K-F50T-V52A, SEQ ID NO:604 의 개질 변이체 BBIt-AV-S25L-L29P-F50T-V52A, SEQ ID NO:606 의 개질 변이체 BBIt-AV-S25L-A40K-F50T-V52A, SEQ ID NO:608 의 개질 변이체 BBIt-AV-L29P-A40K-F50T-V52A, 및 SEQ ID NO:643 의 개질 변이체 BBIt-VEGKD-A13I-S25K-L29P-V52K 로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, 변이체 스캐폴드의 키모트립신 루프는 SEQ ID NO:433 및 434 로부터 선택되는 FGF5 변이체 펩티드이고, 변이체 스캐폴드는 SEQ ID NO:187 의 위치 13, 29, 50 및 52 와 동등한 위치에서 4 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하도록 추가로 변경되어 개질 변이체 BBPI 스캐폴드를 생성한다. 한 구현예에서, 4 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하는 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:432 의 개질 변이체 BBIt-MM007-Q-A13I-L29P-F50T-V52A 및 SEQ ID NO:434 의 개질 변이체 BBIt-FGFps2-Q-A13I-L29P-F50T-V52A 로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, 변이체 스캐폴드의 키모트립신 루프는 SEQ ID NO:436, 437 및 438 로부터 선택되는 TGFβ 변이체 펩티드이고, 변이체 스캐폴드는 SEQ ID NO:187 의 위치 13, 29, 50 및 52 와 동등한 위치에서 4 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하도록 추가로 변경되어 개질 변이체 BBPI 스캐폴드를 생성한다. 한 구현예에서, 4 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하는 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:443 의 개질 변이체 BBIt-PEN3-Q-A13I-L29P-F50T-V52A, SEQ ID NO:445 의 개질 변이체 BBIt-MM021W-Q-A13I-L29P-F50T-V52A 및 SEQ ID NO:447 의 개질 변이체 BBIt-WTQ-Q-A13I-L29P-F50T-V52A 로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상응하는 전구체 비개질 BBPI 보다 더 큰 TIA 를 갖는 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:187 의 위치 13, 29, 40, 50 및 52 와 동등한 아미노산 위치에서 5 개의 아미노산 치환의 조합을 각각 포함한다. 일부 구현예에서, 5 개의 아미노산 치환의 조합은 위치 13-25-29-50-52, 13-29-40-50-52, 13-25-40-50-52, 25-29-40-50-52, 13-29-40-50-52, 13-29-40-50-52, 13-29-40-50-52 및 13-29-40-50-52 에서의 치환의 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 5 개의 아미노산 치환의 조합은 13I-25L-29P-50T-52A, 13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25L-40K-50T-52A, 25L-29P-40K-50T-52A, 13L-29P-40K-50T-52A, 13I-29K-40K-50T-52A, 13I-29P-40K-50K-52A 및 13I-29P-40K-50T-52T 로부터 선택된다. 본 발명은 섹션 5.4 에서 기술된 바와 같이 13I-25L-29P-50T-52A, 13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25L-40K-50T-52A, 25L-29P-40K-50T-52A, 13L-29P-40K-50T-52A, 13I-29K-40K-50T-52A, 13I-29P-40K-50K-52A 및 13I-29P-40K-50T-52T 로부터 선택되는 5 개의 아미노산 치환의 조합을 추가로 포함하는, 섹션 5.3 에서 기술된 임의의 하나의 변이체 BBPI 스캐폴드를 제공한다. 한 구현예에서, 변이체 스캐폴드의 키모트립신 루프는 SEQ ID NO:9 의 VEGF 변이체 펩티드이고, 변이체 스캐폴드는 SEQ ID NO:187 의 위치 13, 29, 40, 50 및 52 와 동등한 위치에서 5 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하도록 추가로 변경되어 개질 변이체 BBPI 스캐폴드를 생성한다. 한 구현예에서, 5 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하는 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:597 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-S25L-L29P-F50T-V52A, SEQ ID NO:599 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A, SEQ ID NO:601 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-S25L-A40K-F50T-V52A, SEQ ID NO:605 의 개질 변이체 BBIt-AV-S25L-L29P-A40K-F50T-V52A, SEQ ID NO:615 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13L-L29P-A40K-F50T-V52A, SEQ ID NO:620 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-L29K-A40K-F50T-V52A, SEQ ID NO:624 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50K-V52A 및 SEQ ID NO:625 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52T 로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상응하는 전구체 비개질 BBPI 보다 더 큰 TIA 를 갖는 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:187 의 위치 13, 25, 29, 40, 50 및 52 와 동등한 아미노산 위치에서 6 개의 아미노산 치환의 조합을 각각 포함한다. 일부 구현예에서, 6 개의 아미노산 치환의 조합은 위치 13-25-29-40-50-52, 1-13-29-40-50-52, 4-13-29-40-50-52, 5-13-29-40-50-52, 11-13-29-40-50-52, 13-25-29-40-50-52, 13-27-29-40-50-52, 13-29-31-40-50-52, 13-29-31-40-50-52, 13-29-38-40-50-52 및 13-29-38-40-50-52 에서의 치환의 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 6 개의 아미노산 치환의 조합은 13I-25L-29P-40K-50T-52A, 1C-13I-29P-40K-50T-52A, 4V-13I-29P-40K-50T-52A, 5P-13I-29P-40K-50T-52A, 11G-13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25R-29P-40K-50T-52A, 13I-27R-29P-40K-50T-52A, 13I-29P-31A-40K-50T-52A, 13I-29P-31R-40K-50T-52A, 13I-29P-38N-40K-50T-52A 및 13I-29P-38N-40K-50T-52A 로부터 선택된다. 본 발명은 섹션 5.4 에서 기술된 바와 같이 13I-25L-29P-40K-50T-52A, 1C-13I-29P-40K-50T-52A, 4V-13I-29P-40K-50T-52A, 5P-13I-29P-40K-50T-52A, 11G-13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25R-29P-40K-50T-52A, 13I-27R-29P-40K-50T-52A, 13I-29P-31A-40K-50T-52A, 13I-29P-31R-40K-50T-52A, 13I-29P-38N-40K-50T-52A 및 13I-29P-38N-40K-50T-52A 로부터 선택되는 6 개의 아미노산 치환의 조합을 추가로 포함하는, 섹션 5.3 에서 기술된 임의의 하나의 변이체 BBPI 스캐폴드를 제공한다. 한 구현예에서, 변이체 스캐폴드의 키모트립신 루프는 SEQ ID NO:9 의 VEGF 변이체 펩티드이고, 변이체 스캐폴드는 SEQ ID NO:187 의 위치 13, 25, 29, 40, 50 및 52 와 동등한 위치에서 6 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하도록 추가로 변경되어 개질 변이체 BBPI 스캐폴드를 생성한다. 한 구현예에서, 6 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하는 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:598 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-S25L-L29P-A40K-F50T-V52A, SEQ ID NO:611 의 개질 변이체 BBIt-AV-D1C-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A, SEQ ID NO:612 의 개질 변이체 BBIt-AV-S4V-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A, SEQ ID NO:613 의 개질 변이체 BBIt-AV-S5P-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A, SEQ ID NO:614 의 개질 변이체 BBIt-AV-Q11G-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A, SEQ ID NO:616 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-S25R-L29P-A40K-F50T-V52A -, SEQ ID NO:619 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-M27R-L29P-A40K-F50T-V52A, SEQ ID NO:621 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-L29P-S31A-A40K-F50T-V52A, SEQ ID NO:622 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-L29P-S31R-A40K-F50T-V52A, SEQ ID NO:623 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-L29P-S38N-A40K-F50T-V52A 및 SEQ ID NO:626 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-L29P-S38N-A40K-F50T-V52A 로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상응하는 전구체 비개질 BBPI 보다 더 큰 TIA 를 갖는 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:187 의 위치 13, 25, 29, 31, 40, 50 및 52 와 동등한 아미노산 위치에서 7 개의 아미노산 치환의 조합을 각각 포함한다. 일부 구현예에서, 7 개의 아미노산 치환의 조합은 위치 13-25-29-31-40-50-52, 13-25-29-31-40-50-52, 13-25-27-29-31-50-52, 13-25-27-29-31-50-52, 13-25-27-29-31-50-52, 13-25-27-29-31-50-52, 13-25-27-29-31-50-52, 13-25-27-29-31-50-52, 13-25-27-29-31-50-52, 13-25-27-29-31-50-52 및 13-25-27-29-31-50-52 에서의 치환의 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 7 개의 아미노산 치환의 조합은 13L-25R-29P-31A-40K-50T-52A, 13L-25R-29P-31R-40K-50T-52A, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T 및 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T 로부터 선택된다. 본 발명은 섹션 5.4 에서 기술된 바와 같이 13L-25R-29P-31A-40K-50T-52A, 13L-25R-29P-31R-40K-50T-52A, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T 및 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T 로부터 선택되는 6 개의 아미노산 치환의 조합을 추가로 포함하는, 섹션 5.3 에서 기술된 임의의 하나의 변이체 BBPI 스캐폴드를 제공한다. 한 구현예에서, 변이체 스캐폴드의 키모트립신 루프는 SEQ ID NO:9 의 VEGF 변이체 펩티드이고, 변이체 스캐폴드는 SEQ ID NO:187 의 위치 13, 25, 29, 31, 40, 50 및 52 와 동등한 위치에서 7 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하도록 추가로 변경되어 개질 변이체 BBPI 스캐폴드를 생성한다. 한 구현예에서, 7 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하는 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:617 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-S25R-L29P-S31A-A40K-F50T-V52A, SEQ ID NO:618 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-S25R-L29P-S31R-A40K-F50T-V52A, SEQ ID NO:491 의 개질 변이체 BBIt-VEGF-V1-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T, SEQ ID NO:632 의 개질 변이체 BBIt-VEGF-V2-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T, SEQ ID NO:633 의 개질 변이체 BBIt-VEGF-V3-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T, SEQ ID NO:634 의 개질 변이체 BBIt-VEGF-V4-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T, SEQ ID NO:635 의 개질 변이체 BBIt-VEGF-V5-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T, SEQ ID NO:636 의 개질 변이체 BBIt-VEGF-V6-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T, SEQ ID NO:637 의 개질 변이체 BBIt-TNFα-T1-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T, SEQ ID NO:638 의 개질 변이체 BBIt-TNFα-T2-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T 및 SEQ ID NO:639 의 개질 변이체 BBIt-TNFα-T3-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T 로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상응하는 전구체 비개질 BBPI 보다 더 큰 TIA 를 갖는 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:187 의 위치 13, 25, 27, 29, 31, 40, 50 및 52 와 동등한 아미노산 위치에서 8 개의 아미노산 치환의 조합을 각각 포함한다. 일부 구현예에서, 8 개의 아미노산 치환의 조합은 위치 13-25-27-29-31-40-50-52, 13-25-27-29-31-40-50-52, 13-25-27-29-31-40-50-52, 13-25-27-29-31-40-50-52 및 13-25-27-29-31-40-50-52 에서의 치환의 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 8 개의 아미노산 치환의 조합은 조합 13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T, 13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q, 13I-25K-27R-29E-31A-40H-50R-52K, 13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L 및 13I-25K-27Q-29P-31E-40H-50R-52Q 로부터 선택된다. 본 발명은 섹션 5.4 에서 기술된 바와 같이 조합 13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T, 13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q, 13I-25K-27R-29E-31A-40H-50R-52K, 13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L 및 13I-25K-27Q-29P-31E-40H-50R-52Q 로부터 선택되는 8 개의 아미노산 치환의 조합을 추가로 포함하는, 섹션 5.3 에서 기술된 임의의 하나의 변이체 BBPI 스캐폴드를 제공한다. 한 구현예에서, 변이체 스캐폴드의 키모트립신 루프는 SEQ ID NO:9 의 VEGF 변이체 펩티드이고, 변이체 스캐폴드는 SEQ ID NO:187 의 위치 13, 25, 27, 29, 31, 40, 50 및 52 와 동등한 위치에서 7 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하도록 추가로 변경되어 개질 변이체 BBPI 스캐폴드를 생성한다. 한 구현예에서, 8 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하는 개질 변이체 BBPI 은 SEQ ID NO:627 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-A40H-F50K-V52T, SEQ ID NO:628 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-S25K-M27A-L29R-S31E-A40K-F50Q-V52Q, SEQ ID NO:629 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-S25K-M27R-L29E-S31A-A40H-F50R-V52K, SEQ ID NO:630 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-S25K-M27A-L29R-S31A-A40H-F50R-V52L 및 SEQ ID NO:631 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-S25K-M27Q-L29P-S31E-A40H-F50R-V52Q 로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상응하는 전구체 비개질 BBPI 보다 더 큰 TIA 를 갖는 개질 변이체 BBPI 는 개질 변이체 BBPI 의 N-말단에 위치하는 펩티드 삽입물을 각각 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 펩티드 삽입물은 1 내지 15 개 아미노산의 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 펩티드 삽입물은 5 내지 10 개 아미노산의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 펩티드 삽입물은 SEQ ID NO:389 의 펩티드 (DDEPSKPCCDPDP; SEQ ID NO:389) 를 포함한다. SEQ ID NO:389 의 펩티드 삽입물을 포함하는 개질 변이체 BBPI 의 예는 SEQ ID NO:390 의 개질 변이체 4D13BBIt-AV (DDEPSKPCCDPDPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCACYNLYGWTCFCVDITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:390) 및 SEQ ID NO:413 의 개질 변이체 BBIt-AV-4D13-13I-29P-40K-50T-52A 이다.
트립신 및/또는 키모트립신 저해 활성의 증강의 한 측정은 비개질 변이체 BBPI 의 경우와 비교되는 경우 개질 변이체 BBPI 내 효소 활성비 즉 BCE:BBPI 의 증가로서 측정될 수 있다. BCE:BBPI 효소 활성비는 BCE 즉 셀룰라아제 효소 활성에 대한 BBPI 프로테아제 저해 활성 예를 들어 트립신 저해 활성의 비이다. 비개질 변이체 BBPI 의 비에는 값 1 이 부여된다. 개질 변이체 BBPI 에 대한 1 이상의 비는 개질 변이체 BBPI 가 비개질 전구체 BBPI 보다 더 큰 프로테아제 저해 활성 예를 들어 트립신 저해 활성을 가짐을 지시한다. 일부 구현예에서, 개질 변이체 BBPI 의 활성비는 1 이상, 약 1.05 이상, 약 1.1 이상, 약 1.2 이상, 약 1.3 이상, 약 1.4 이상, 약 1.5 이상, 약 1.6 이상, 약 1.7 이상, 약 1.8 이상, 약 1.9 이상 및 약 2 이상이다. 다른 구현예에서, 활성비는 약 2.1 이상, 약 2.2 이상, 약 2.3 이상, 약 2.4 이상, 약 2.5 이상, 약 2.6 이상, 약 2.7 이상, 약 2.8 이상, 약 2.9 이상 및 약 3 이상이다. 또 다른 구현예에서, 활성비는 약 3.5 이상, 약 4.0 이상 및 약 5 이상이다. 따라서, 일부 구현예에서, 개질 변이체 BBPI 의 프로테아제 저해 활성 예를 들어 트립신 저해 활성은 상응하는 비개질 전구체 BBPI 보다 약 0.5% 이상, 약 1.0%, 약 1.5%, 약 2.0%, 약 2.5%, 약 3.0%, 약 4.0%, 약 5.0%, 약 8.0%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 100% 이상 더 크다. 다른 구현예에서, 개질 변이체 BBPI 의 프로테아제 저해 활성 예를 들어 트립신 저해 활성은 상응하는 비개질 전구체 BBPI 보다 적어도 약 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 및 약 200% 이상까지 더 크다.
다른 구현예에서, 아미노산 치환의 조합을 포함하는 개질 변이체 BBPI 는 비개질 전구체 BBPI 보다 더 큰 트립신 저해 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 2 개 이상, 3 개 이상, 4 개 이상, 5 개 이상, 6 개 이상, 7 개 이상 및 8 개 이상의 아미노산 치환은 비개질 전구체 변이체 BBPI 보다 더 큰 TIA 를 갖는 개질 변이체 BBPI 를 생성한다. 섹션 5.4 에서 기술된 바와 같이 아미노산 치환의 조합을 포함하는 모든 개질 변이체 BBPI 는 상응하는 비개질 전구체 BBPI 보다 더 큰 트립신 저해 활성을 갖는다.
5.8.2 BBPI 생산 수율
일부 구현예에서, 전구체 변이체 BBPI 내에 만들어진 아미노산 치환은 생성된 개질 변이체 BBPI 가 비개질 전구체 BBPI 가 생성되는 수율보다 더 큰 생산 수율을 갖는 능력 즉 개질 변이체 BBPI 가 비개질 전구체 BBPI 가 생성되는 수율보다 더 큰 수준으로 생성되는 것에 대해 평가된다. 일부 구현예에서, 본 발명은 상응하는 비개질 전구체 BBPI 보다 더 큰 프로테아제 저해 활성 예를 들어 트립신 저해 활성 및 더 큰 생산 수율을 갖는 섹션 5.4 에서 기술된 바와 같이 아미노산 치환의 조합을 포함하는 개질 변이체 BBPI 를 제공한다.
상응하는 전구체 비개질 BBPI 보다 더 큰 TIA 및 PY 를 갖는 개질 변이체 BBPI 는 2 개 이상, 3 개 이상, 4 개 이상, 5 개 이상, 6 개 이상, 7 개 이상 및 8 개 이상의 아미노산 치환을 각각 포함한다 (실시예 12, 13, 14 및 15 참조).
일부 구현예에서, 상응하는 전구체 비개질 BBPI 보다 더 큰 TIA 및 PY 를 갖는 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:187 의 위치 50 및 52 와 동등한 아미노산 위치에서 2 개의 아미노산 치환의 조합을 각각 포함한다. 일부 구현예에서, 2 개의 아미노산 치환의 조합은 50T-52A 이다. 본 발명은 섹션 5.4 에서 기술된 바와 같이 2 개의 아미노산 치환의 조합 50T-52A 를 추가로 포함하는, 섹션 5.3 에서 기술된 임의의 하나의 변이체 BBPI 스캐폴드를 제공한다. 한 구현예에서, 변이체 스캐폴드의 키모트립신 루프는 VEGF 변이체 펩티드 예를 들어 SEQ ID NO:9 이고, 변이체 스캐폴드는 SEQ ID NO:187 의 위치 13, 50 및 52 와 동등한 위치에서 3 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하도록 추가로 변경되어 개질 변이체 BBPI 스캐폴드를 생성한다. 한 구현예에서, 2 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하는 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:595 의 개질 변이체 BBIt-AV-F50T-V52A 이다.
일부 구현예에서, 상응하는 전구체 비개질 BBPI 보다 더 큰 TIA 및 PY 를 갖는 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:187 의 위치 13, 50 및 52 와 동등한 아미노산 위치에서 3 개의 아미노산 치환의 조합을 각각 포함한다. 일부 구현예에서, 3 개의 아미노산 치환의 조합은 위치 25-50-52, 29-50-52, 40-50-52 및 13-50-52 에서의 치환의 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 3 개의 아미노산 치환의 조합은 25L-50T-52A, 29P-50T-52A, 40K-50T-52A 및 13I-50T-52A 로부터 선택된다. 본 발명은 섹션 5.4 에서 기술된 바와 같이 25L-50T-52A, 29P-50T-52A, 40K-50T-52A 및 13I-50T-52A 로부터 선택되는 3 개의 아미노산 치환의 조합을 추가로 포함하는, 섹션 5.3 에서 기술된 임의의 하나의 변이체 BBPI 스캐폴드를 제공한다. 한 구현예에서, 변이체 스캐폴드의 키모트립신 루프는 VEGF 변이체 펩티드 예를 들어 SEQ ID NO:9 이고, 변이체 스캐폴드는 SEQ ID NO:187 의 위치 13, 50 및 52 와 동등한 위치에서 3 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하도록 추가로 변경되어 개질 변이체 BBPI 스캐폴드를 생성한다. 한 구현예에서, 3 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하는 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:603 의 개질 변이체 BBIt-AV-S25L-F50T-V52A, SEQ ID NO:607 의 개질 변이체 BBIt-AV-L29P-F50T-V52A 및 SEQ ID NO:609 의 개질 변이체 BBIt-AV-A40K-F50T-V52A 로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상응하는 전구체 비개질 BBPI 보다 더 큰 TIA 및 PY 를 갖는 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:187 의 위치 13, 29, 50 및 52 와 동등한 아미노산 위치에서 4 개의 아미노산 치환의 조합을 각각 포함한다. 일부 구현예에서, 4 개의 아미노산 치환의 조합은 위치 13-25-50-52, 13-29-50-52, 25-29-50-52, 13-40-50-52, 25-40-50-52 및 29-40-50-52 에서의 치환의 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 4 개의 아미노산 치환의 조합은 13I-25L-50T-52A, 13I-29P-50T-52A, 25L-29P-50T-52A, 13I-40K-50T-52A, 25L-40K-50T-52A 및 29P-40K-50T-52A 로부터 선택된다. 본 발명은 섹션 5.4 에서 기술된 바와 같이 13I-25L-50T-52A, 13I-29P-50T-52A, 25L-29P-50T-52A, 13I-40K-50T-52A, 25L-40K-50T-52A 및 29P-40K-50T-52A 로부터 선택되는 4 개의 아미노산 치환의 조합을 추가로 포함하는, 섹션 5.3 에서 기술된 임의의 하나의 변이체 BBPI 스캐폴드를 제공한다. 한 구현예에서, 변이체 스캐폴드의 키모트립신 루프는 SEQ ID NO:9 및 460 으로부터 선택되는 VEGF 변이체 펩티드이고, 변이체 스캐폴드는 SEQ ID NO:187 의 위치 13, 29, 50 및 52 와 동등한 위치에서 4 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하도록 추가로 변경되어 개질 변이체 BBPI 스캐폴드를 생성한다. 한 구현예에서, 4 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하는 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:596 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-S25L-F50T-V52A, SEQ ID NO:600 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-L29P-F50T-V52A, SEQ ID NO:602 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-A40K-F50T-V52A, SEQ ID NO:604 의 개질 변이체 BBIt-AV-S25L-L29P-F50T-V52A, SEQ ID NO:606 의 개질 변이체 BBIt-AV-S25L-A40K-F50T-V52A, SEQ ID NO:608 의 개질 변이체 BBIt-AV-L29P-A40K-F50T-V52A 및 SEQ ID NO:643 의 개질 변이체 BBIt-VEGKD-A13I-S25K-L29P-V52K 로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, 변이체 스캐폴드의 키모트립신 루프는 SEQ ID NO:430 및 431 로부터 선택되는 FGF5 변이체 펩티드이고, 변이체 스캐폴드는 SEQ ID NO:187 의 위치 13, 29, 50 및 52 와 동등한 위치에서 4 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하도록 추가로 변경되어 개질 변이체 BBPI 스캐폴드를 생성한다. 한 구현예에서, 4 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하는 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:432 의 개질 변이체 BBIt-MM007-Q-A13I-L29P-F50T-V52A 및 SEQ ID NO:434 의 개질 변이체 BBIt-FGFps2-Q-A13I-L29P-F50T-V52A 로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, 변이체 스캐폴드의 키모트립신 루프는 SEQ ID NO:436, 437 및 438 로부터 선택되는 TGFβ 변이체 펩티드이고, 변이체 스캐폴드는 SEQ ID NO:187 의 위치 13, 29, 50 및 52 와 동등한 위치에서 4 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하도록 추가로 변경되어 개질 변이체 BBPI 스캐폴드를 생성한다. 한 구현예에서, 4 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하는 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:443 의 개질 변이체 BBIt-PEN3-Q-A13I-L29P-F50T-V52A, SEQ ID NO:445 의 개질 변이체 BBIt-MM021W-Q-A13I-L29P-F50T-V52A 및 SEQ ID NO:447 의 개질 변이체 BBIt-WTQ-Q-A13I-L29P-F50T-V52A 로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상응하는 전구체 비개질 BBPI 보다 더 큰 TIA 및 PY 를 갖는 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:187 의 위치 13, 29, 40, 50 및 52 와 동등한 아미노산 위치에서 5 개의 아미노산 치환의 조합을 각각 포함한다. 일부 구현예에서, 5 개의 아미노산 치환의 조합은 위치 13-25-29-50-52, 13-29-40-50-52, 13-25-40-50-52, 25-29-40-50-52, 13-29-40-50-52, 13-29-40-50-52, 13-29-40-50-52 및 13-29-40-50-52 에서의 치환의 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 5 개의 아미노산 치환의 조합은 13I-25L-29P-50T-52A, 13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25L-40K-50T-52A, 25L-29P-40K-50T-52A, 13L-29P-40K-50T-52A, 13I-29K-40K-50T-52A, 13I-29P-40K-50K-52A 및 13I-29P-40K-50T-52T 로부터 선택된다. 본 발명은 섹션 5.4 에서 기술된 바와 같이 13I-25L-29P-50T-52A, 13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25L-40K-50T-52A, 25L-29P-40K-50T-52A, 13L-29P-40K-50T-52A, 13I-29K-40K-50T-52A, 13I-29P-40K-50K-52A 및 13I-29P-40K-50T-52T 로부터 선택되는 5 개의 아미노산 치환의 조합을 추가로 포함하는, 섹션 5.3 에서 기술된 임의의 하나의 변이체 BBPI 스캐폴드를 제공한다. 한 구현예에서, 변이체 스캐폴드의 키모트립신 루프는 SEQ ID NO:9 의 VEGF 변이체 펩티드이고, 변이체 스캐폴드는 SEQ ID NO:187 의 위치 13, 29, 40, 50 및 52 와 동등한 위치에서 5 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하도록 추가로 변경되어 개질 변이체 BBPI 스캐폴드를 생성한다. 한 구현예에서, 5 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하는 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:597 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-S25L-L29P-F50T-V52A, SEQ ID NO:599 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A, SEQ ID NO:601 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-S25L-A40K-F50T-V52A, SEQ ID NO:605 의 개질 변이체 BBIt-AV-S25L-L29P-A40K-F50T-V52A, SEQ ID NO:615 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13L-L29P-A40K-F50T-V52A, SEQ ID NO:620 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-L29K-A40K-F50T-V52A, SEQ ID NO:624 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50K-V52A 및 SEQ ID NO:625 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52T 로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상응하는 전구체 비개질 BBPI 보다 더 큰 TIA 및 PY 를 갖는 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:187 의 위치 13, 25, 29, 40, 50 및 52 와 동등한 아미노산 위치에서 6 개의 아미노산 치환의 조합을 각각 포함한다. 일부 구현예에서, 6 개의 아미노산 치환의 조합은 위치 13-25-29-40-50-52, 1-13-29-40-50-52, 4-13-29-40-50-52, 5-13-29-40-50-52, 11-13-29-40-50-52, 13-25-29-40-50-52, 13-27-29-40-50-52, 13-29-31-40-50-52, 13-29-31-40-50-52, 13-29-38-40-50-52 및 13-29-38-40-50-52 에서의 치환의 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 6 개의 아미노산 치환의 조합은 13I-25L-29P-40K-50T-52A, 1C-13I-29P-40K-50T-52A, 4V-13I-29P-40K-50T-52A, 5P-13I-29P-40K-50T-52A, 11G-13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25R-29P-40K-50T-52A, 13I-27R-29P-40K-50T-52A, 13I-29P-31A-40K-50T-52A, 13I-29P-31R-40K-50T-52A, 13I-29P-38N-40K-50T-52A 및 13I-29P-38N-40K-50T-52A 로부터 선택된다. 본 발명은 섹션 5.4 에서 기술된 바와 같이 13I-25L-29P-40K-50T-52A, 1C-13I-29P-40K-50T-52A, 4V-13I-29P-40K-50T-52A, 5P-13I-29P-40K-50T-52A, 11G-13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25R-29P-40K-50T-52A, 13I-27R-29P-40K-50T-52A, 13I-29P-31A-40K-50T-52A, 13I-29P-31R-40K-50T-52A, 13I-29P-38N-40K-50T-52A 및 13I-29P-38N-40K-50T-52A 로부터 선택되는 6 개의 아미노산 치환의 조합을 추가로 포함하는, 섹션 5.3 에서 기술된 임의의 하나의 변이체 BBPI 스캐폴드를 제공한다. 한 구현예에서, 변이체 스캐폴드의 키모트립신 루프는 SEQ ID NO:9 의 VEGF 변이체 펩티드이고, 변이체 스캐폴드는 SEQ ID NO:187 의 위치 13, 25, 29, 40, 50 및 52 와 동등한 위치에서 6 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하도록 추가로 변경되어 개질 변이체 BBPI 스캐폴드를 생성한다. 한 구현예에서, 6 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하는 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:598 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-S25L-L29P-A40K-F50T-V52A, SEQ ID NO:611 의 개질 변이체 BBIt-AV-D1C-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A, SEQ ID NO:612 의 개질 변이체 BBIt-AV-S4V-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A, SEQ ID NO:613 의 개질 변이체 BBIt-AV-S5P-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A, SEQ ID NO:614 의 개질 변이체 BBIt-AV-Q11G-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A, SEQ ID NO:616 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-S25R-L29P-A40K-F50T-V52A -, SEQ ID NO:619 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-M27R-L29P-A40K-F50T-V52A, SEQ ID NO:621 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-L29P-S31A-A40K-F50T-V52A, SEQ ID NO:622 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-L29P-S31R-A40K-F50T-V52A, SEQ ID NO:623 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-L29P-S38N-A40K-F50T-V52A 및 SEQ ID NO:626 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-L29P-S38N-A40K-F50T-V52A 로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상응하는 전구체 비개질 BBPI 보다 더 큰 TIA 및 PY 를 갖는 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:187 의 위치 13, 25, 29, 31, 40, 50 및 52 와 동등한 아미노산 위치에서 7 개의 아미노산 치환의 조합을 각각 포함한다. 일부 구현예에서, 7 개의 아미노산 치환의 조합은 위치 13-25-29-31-40-50-52, 13-25-29-31-40-50-52, 13-25-27-29-31-50-52, 13-25-27-29-31-50-52, 13-25-27-29-31-50-52, 13-25-27-29-31-50-52, 13-25-27-29-31-50-52, 13-25-27-29-31-50-52, 13-25-27-29-31-50-52, 13-25-27-29-31-50-52 및 13-25-27-29-31-50-52 에서의 치환의 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 7 개의 아미노산 치환의 조합은 13L-25R-29P-31A-40K-50T-52A, 13L-25R-29P-31R-40K-50T-52A, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T 및 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T 로부터 선택된다. 본 발명은 섹션 5.4 에서 기술된 바와 같이 13L-25R-29P-31A-40K-50T-52A, 13L-25R-29P-31R-40K-50T-52A, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T 및 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T 로부터 선택되는 6 개의 아미노산 치환의 조합을 추가로 포함하는, 섹션 5.3 에서 기술된 임의의 하나의 변이체 BBPI 스캐폴드를 제공한다. 한 구현예에서, 변이체 스캐폴드의 키모트립신 루프는 SEQ ID NO:9 의 VEGF 변이체 펩티드이고, 변이체 스캐폴드는 SEQ ID NO:187 의 위치 13, 25, 29, 31, 40, 50 및 52 와 동등한 위치에서 7 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하도록 추가로 변경되어 개질 변이체 BBPI 스캐폴드를 생성한다. 한 구현예에서, 7 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하는 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:617 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-S25R-L29P-S31A-A40K-F50T-V52A, SEQ ID NO:618 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-S25R-L29P-S31R-A40K-F50T-V52A, SEQ ID NO:491 의 개질 변이체 BBIt-VEGF-V1-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T, SEQ ID NO:632 의 개질 변이체 BBIt-VEGF-V2-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T, SEQ ID NO:633 의 개질 변이체 BBIt-VEGF-V3-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T, SEQ ID NO:634 의 개질 변이체 BBIt-VEGF-V4-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T, SEQ ID NO:635 의 개질 변이체 BBIt-VEGF-V5-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T, SEQ ID NO:636 의 개질 변이체 BBIt-VEGF-V6-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T, SEQ ID NO:637 의 개질 변이체 BBIt-TNFα-T1-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T, SEQ ID NO:638 의 개질 변이체 BBIt-TNFα-T2-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T 및 SEQ ID NO:639 의 개질 변이체 BBIt-TNFα-T3-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T 로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상응하는 전구체 비개질 BBPI 보다 더 큰 TIA 및 PY 를 갖는 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:187 의 위치 13, 25, 27, 29, 31, 40, 50 및 52 와 동등한 아미노산 위치에서 8 개의 아미노산 치환의 조합을 각각 포함한다. 일부 구현예에서, 8 개의 아미노산 치환의 조합은 위치 13-25-27-29-31-40-50-52, 13-25-27-29-31-40-50-52, 13-25-27-29-31-40-50-52, 13-25-27-29-31-40-50-52 및 13-25-27-29-31-40-50-52 에서의 치환의 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 8 개의 아미노산 치환의 조합은 조합 13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T, 13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q, 13I-25K-27R-29E-31A-40H-50R-52K, 13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L 및 13I-25K-27Q-29P-31E-40H-50R-52Q 로부터 선택된다. 본 발명은 섹션 5.4 에서 기술된 바와 같이 조합 13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T, 13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q, 13I-25K-27R-29E-31A-40H-50R-52K, 13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L 및 13I-25K-27Q-29P-31E-40H-50R-52Q 로부터 선택되는 8 개의 아미노산 치환의 조합을 추가로 포함하는, 섹션 5.3 에서 기술된 임의의 하나의 변이체 BBPI 스캐폴드를 제공한다. 한 구현예에서, 변이체 스캐폴드의 키모트립신 루프는 SEQ ID NO:9 의 VEGF 변이체 펩티드이고, 변이체 스캐폴드는 SEQ ID NO:187 의 위치 13, 25, 27, 29, 31, 40, 50 및 52 와 동등한 위치에서 7 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하도록 추가로 변경되어 개질 변이체 BBPI 스캐폴드를 생성한다. 한 구현예에서, 8 개의 아미노산 치환의 조합을 포함하는 개질 변이체 BBPI 는 SEQ ID NO:627 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-A40H-F50K-V52T, SEQ ID NO:628 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-S25K-M27A-L29R-S31E-A40K-F50Q-V52Q, SEQ ID NO:629 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-S25K-M27R-L29E-S31A-A40H-F50R-V52K, SEQ ID NO:630 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-S25K-M27A-L29R-S31A-A40H-F50R-V52L 및 SEQ ID NO:631 의 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-S25K-M27Q-L29P-S31E-A40H-F50R-V52Q 로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 개질 변이체 BBPI 는 개질 변이체 BBPI 의 N-말단에 위치하는 펩티드 삽입물을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 펩티드 삽입물은 1 내지 15 개 아미노산의 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 펩티드 삽입물은 5 내지 10 개 아미노산의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 펩티드 삽입물은 SEQ ID NO:389 의 펩티드를 포함한다. SEQ ID NO:389 의 펩티드 삽입물을 포함하는 개질 변이체 BBPI 의 예는 SEQ ID NO:390 의 개질 변이체 4D13BBIt-AV 및 SEQ ID NO:413 의 개질 변이체 BBIt-AV-4D13-13I-29P-40K-50T-52A 이다.
본 발명은 상기 기술된 아미노산 치환의 임의의 하나의 조합을 각각 포함하는, 상응하는 전구체 비개질 BBPI 보다 더 큰 TIA 및 PY 를 갖고 비개질 전구체 변이체 BBPI 보다 더 큰 프로테아제 저해 활성을 갖는 개질 변이체 BBPI 를 추가로 제공한다. 일부 구현예에서, 상응하는 전구체 비개질 BBPI 의 키모트립신 루프 대신 변이체 펩티드를 포함하는 개질 변이체 BBPI 는 전구체 비개질 BBPI 스캐폴드보다 더 큰 트립신 저해 활성 (TIA) 을 갖는다. 다른 구현예에서, 상응하는 전구체 비개질 BBPI 의 트립신 루프 대신 변이체 펩티드를 포함하는 개질 변이체 BBPI 는 전구체 비개질 BBPI 스캐폴드보다 더 큰 키모트립신 저해 활성 (TIA) 을 갖는다.
실시예에서 나타난 바와 같이, 변이체 BBPI 의 골격 내 하나 이상의 아미노산의 치환은 비개질 변이체 BBPI 보다 더 큰 생산 수율을 갖는 개질 변이체 BBPI 를 생성한다. 일부 구현예에서, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 개 아미노산 치환의 조합을 포함하는 BBPI 는 비개질 전구체 BBPI 보다 더 큰 생산 수율을 갖는다. 따라서, 본 발명은 상기 기술된 아미노산 치환의 임의의 하나의 조합을 포함하고, 비개질 전구체 변이체 BBPI 보다 더 큰 생산 수율 (PY) 을 갖는 개질 변이체 BBPI 를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 상기 기술된 아미노산 치환의 임의의 하나의 조합을 포함하고, 비개질 전구체 변이체 BBPI 의 TIA 및 PY 보다 더 큰 트립신 저해 활성 및 더 큰 생산 수율을 갖는 개질 변이체 BBPI 를 제공한다.
일부 구현예에서, 상응하는 전구체 비개질 BBPI 보다 더 큰 TIA 및 PY 를 갖는 개질 변이체 BBPI 는 개질 변이체 BBPI 의 N-말단에 위치하는 펩티드 삽입물을 각각 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 펩티드 삽입물은 1 내지 15 개 아미노산의 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 펩티드 삽입물은 5 내지 10 개 아미노산의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 펩티드 삽입물은 SEQ ID NO:389 의 펩티드를 포함한다. 개질 변이체 BBPI 의 예는 SEQ ID NO:390 의 개질 변이체 4D13BBIt-AV 및 SEQ ID NO:413 의 개질 변이체 BBIt-AV-4D13-13I-29P-40K-50T-52A 를 포함한다.
생산 수율의 증강의 한 측정은 BCE 코어의 C-말단으로부터 BBPI 의 절단 이후 자유 BBPI 의 수준의 증가로서 측정될 수 있다. 상기 기술된 바와 같이, 일부 구현예에서, BBPI 융합 단백질은 프로테아제를 사용하여 또는 화학적 수단에 의해 절단될 수 있다. 다른 구현예에서, BCE 를 BBPI 에 연결하는 CBD 링커 내에 존재하는 A-P 결합을 절단하는 산/열 처리에 의해 BBPI 융합 단백질로부터 BBPI 가 절단될 수 있다. 또 다른 구현예에서, BBPI 융합 단백질은 B. 리체니포르미스로부터의 글루타밀 엔도펩티다아제 I 를 사용하여 절단될 수 있다. 일부 구현예에서, 개질 변이체 BBPI 의 생산 수율의 증강은 동일한 처리가 가해진 자유 비개질 전구체 BBPI 의 수준과 비교되는 경우 융합 BBPI 의 활성화 이후 및 BBPI 융합 단백질의 산 열 처리 이후 자유 개질 변이체 BBPI 의 수준의 증가로서 측정된다. 다른 구현예에서, 개질 변이체 BBPI 의 생산 수율의 증강은 동일한 처리가 가해진 상응하는 자유 비개질 전구체 BBPI 의 수준과 비교되는 경우 융합 BBPI 의 활성화 없이 및 BBPI 융합 단백질의 산 열 처리 이후 자유 개질 변이체 BBPI 의 수준의 증가로서 측정된다. 일부 구현예에서, 자유 개질 변이체 BBPI 는 상응하는 전구체 BBPI 보다 더 큰 생산 수율 및 더 큰 TIA 를 갖는다.
일부 구현예에서, 개질 변이체 BBPI 의 생산 수율은 상응하는 비개질 전구체 BBPI 보다 약 0.5% 이상, 약 1.0%, 약 1.5%, 약 2.0%, 약 2.5%, 약 3.0%, 약 4.0%, 약 5.0%, 약 8.0%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상 및 약 100% 이상 더 크다. 다른 구현예에서, 개질 변이체 BBPI 의 생산 수율은 상응하는 비개질 전구체 BBPI 보다 적어도 약 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% 및 약 200% 이상까지 더 크다.
6. 개인 케어 조성물
6.0.1 개질 변이체 BBPI 를 포함하는 개인 케어 조성물
본 발명은 의학적 및 비의학적 상태를 위한 하나 이상의 개질 변이체 BBPI 를 포함하는 개인 케어 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 개인 케어 조성물 및 그의 사용 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 피부 케어용 개인 케어 조성물을 제공한다. 다른 구현예에서, 개인 케어 조성물은 헤어 케어용이다. 일부 구현예에서, 피부 케어용 개인 케어 조성물은 미용 조성물을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 개인 케어 조성물은 다양한 장애의 치료용이다.
본원에서 더욱 상세히 기술된 바와 같이, 본 발명은 헤어 및 피부 케어를 제한없이 포함하는 다양한 양상의 개인 케어 뿐만 아니라 화장품 (예를 들어, 메이크업) 용 조성물을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 일상 개인 케어, 피부 케어, 선 케어 (예를 들어, 선스크린 뿐만 아니라, 태닝제), 헤어 케어 (예를 들어, 샴푸, 리브-온 및/또는 린스 오프 컨디셔너, 양모제, 헤어 스프레이, 겔, 거품, 무스, 세팅 제품, 헤어 색소, 퍼머넌트 제형, 다른 스타일링 및 세정 제품 등), 피부, 헤어 및 입술용 애프터-선 케어, 구강 케어 (예를 들어, 치약 및 겔, 구강세정제, 린스 등), 목욕 (예를 들어, 세정제, 샤워 비누, 목욕 비누, 소금, 진주광택제 등), 피부 미백제, 피부 상태를 위한 세정 처리제 (예를 들어, 여드름 (pimple), 여드름 (acne), 피부 토너 등), 제모제, 물티슈, 데오도란트, 발한 억제제, 얼굴 마스크, 면도 (예를 들어, 면도 크림, 겔 등), 애프터-쉐이브, 피부 박리 (예를 들어, 박리제), 은밀한 케어 제품 (예를 들어, 여성 위생 제품), 개인 청정제 및 발 케어에 사용되는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 화장품 (예를 들어, 파운데이션, 마스카라, 아이 섀도우, 아이라이너, 립스틱, 립글로스, 블러셔 등) 용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 장애와 연관된 헤어 상태 개선용 개인 케어 조성물을 제공한다. 다른 구현예에서, 개인 케어 조성물은 장애와 연관된 피부 상태 개선용이다. 본 발명은 고체, 액체, 콜로이드성 현탁액, 에멀젼, 오일, 겔, 에어로졸, 거품, 파우더, 펌프 스프레이 등 뿐만 아니라, 물티슈와 같은 물품과 함께 사용되는 것 등을 제한없이 포함하는 다양한 형태로 사용될 것으로 고찰된다. 실제로, 본 발명은 의도된 용도(들) 에 적합한 임의의 형태로 사용될 것으로 고찰된다.
일부 구현예에서, 개인 케어 조성물은 상기 섹션 5.4.1 에서 기술된 바와 같이 변이체 펩티드 및 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 개질 변이체 BBPI 를 포함한다. 다른 구현예에서, 개인 케어 조성물은 상기 섹션 5.4.2 에서 기술된 바와 같이 변이체 펩티드 및 아미노산 치환의 조합을 포함하는 개질 변이체 BBPI 를 포함한다. 일부 구현예에서, 개인 케어 조성물은 그 안의 동등한 키모트립신 루프가 VEGF-결합 펩티드인 개질 변이체 BBPI 를 포함한다. 다른 구현예에서, 개인 케어 조성물은 그 안의 동등한 키모트립신 루프가 FGF5 결합 펩티드인 개질 변이체 BBPI 를 포함한다. 다른 구현예에서, 개인 케어 조성물은 그 안의 동등한 키모트립신 루프가 TGFβ-결합 펩티드인 개질 변이체 BBPI 를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 개인 케어 조성물은 그 안의 동등한 키모트립신 루프가 TNFα-결합 펩티드인 개질 변이체 BBPI 를 포함한다. 일부 구현예에서, 개질 변이체 BBPI 는 약 0.0001 중량% 내지 약 5 중량% 의 개인 케어 조성물을 포함하는 한편, 대안적 구현예에서, 개질 변이체 BBPI 는 약 0.001 중량% 내지 약 0.5 중량% 의 개인 케어 조성물을 포함하고, 또 추가의 구현예에서, 개질 변이체 BBPI 는 약 0.01 중량% 내지 약 1 중량% 의 개인 케어 조성물을 포함한다.
6.0.2 개질 변이체 VEGF - BBPI 를 포함하는 개인 케어 조성물
VEGF 는 혈관신생을 촉진하는 것 뿐만 아니라 세포 생존, 증식 및, 산화질소 및 프로스타사이클린의 생성을 포함하는 다양한 세포 기능에 영향을 미치는데 있어서 중요한 역할을 한다 (Zachary et al., Cardiovasc Res, 49: 568-81 [2001]). 병적 상태에서 혈관신생의 1 차 자극으로서의 VEGF 의 인지는 VEGF 활성을 차단하려는 다양한 시도를 낳았다. 저해성 항-VEGF 수용체 항체, 가용성 수용체 구성물, 안티센스 전략, VEGF 에 대한 RNA 압타머 및 저분자량 VEGF 수용체 타이로신 키나아제 (RTK) 저해제는 모두 VEGF 신호전달을 간섭하는 용도로 제안되었다 (Siemeister et al., [1998] 참조). 실제로, VEGF 에 대한 단일클론 항체는 마우스에서 인간 종양 이종이식 성장 및 복수 형성을 저해하는 것으로 나타났다 (Kim et al., [1993]; Asano et al., [1998]; Mesiano et al., [1998]; Luo et al., [1998a] 및 [1998b]; 및 Borgstrom et al., [1996] 및 [1998] 참조).
VEGF 및 RTK 를 수반하는 혈관신생은 암 발달에 관여할 뿐만 아니라, 상이한 생리적 시스템에 영향을 미치는 많은 다른 질환 또는 상태 예컨대 관절염 및 죽상경화 판 (뼈 및 인대), 당뇨 망막병증, 신생혈관녹내장, 황반변성, 안구 포진, 트라코마 및 각막 이식 신생혈관화 (안구) 및 혈관섬유종이 혈관신생-의존적이다. VEGF 발현은 건선 환자의 과다형성 표피에서 (Detmar and Yeo et al. [1995]), 및 경피증, 주사코, 혈관종, 접촉피부염 및 피부의 비후 흉터형성을 포함하는 증강된 혈관신생이 특징인 다른 피부 질환에서 상향조절된다. 트랜스제닉 마우스의 표피에서 VEGF 의 표적화된 과발현은 동등한 수의 사행 및 누출 혈관과 함께 증강된 피부 혈관화를 초래하는 것으로 보고되었다 (예를 들어, Brown et al., [1998] 참조). 또한, 마우스 피부에서 VEGF 의 만성 합성은 VEGF 에 특이적인 결합 물질에 의해 되돌려질 수 있는 인간 건선의 첫번째 조직학적 동등 쥐과 모델을 초래한다 (Xia et al., [2003]). 또한, 자외선 조사는 각질형성세포에서 VEGF 생산을 유도하고 피부 혈관신생을 증강시킨다 (Kim et al., Soc. Investigative Dermatol. 126:2697 [2006]; Blaudshun et al., FEBS Let. 474:195-200 [2000]; Kosmadaki et al., FASEB J. 17:446-8 [2003]).
또한, 쥐과 모낭의 바깥뿌리집에서 VEGF 의 발현은 성장기 동안 모세혈관 증식과 일시적으로 및 공간적으로 연관되는 것으로 밝혀졌다. 바깥뿌리집에서 VEGF 의 트랜스제닉 과발현은 모낭주위 혈관화를 증가시켰고, 제모 이후 가속된 헤어 성장 및 더 많은 헤어의 성장을 초래했다 (Yano et al. J Clin Invest 107: 409-17 [2001]).
따라서, VEGF 는 병적 및 비병적 상태와 연관된 혈관화에 관여한다.
본 발명은 개질 변이체 VEGF-BBPI 를 포함하는 개인 피부 케어 및/또는 헤어 케어 조성물을 제공한다. 본 발명의 개인 케어 조성물 내에 포함된 VEGF-BBPI 는, 그 안의 VEGF-BBPI 의 전구체 스캐폴드의 동등한 키모트립신 루프가 VEGF 변이체 펩티드에 의해 대체되고, 섹션 5.4.1 및 5.4.2 에서 기술된 바와 같이 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하는 개질 변이체 BBPI 이다. 본 발명의 일부 구현예에서, VEGF 에 대한 개질 변이체 VEGF-BBPI 의 결합은 VEGF 가 모낭주위 혈관화를 증가시키는 것을 방지하고, VEGF 가 헤어 성장을 촉진하는 것을 저해한다. 다른 구현예에서, VEGF 에 대한 개질 변이체 VEGF-BBPI 의 결합은 VEGF 가 혈관신생 피부 장애 예를 들어 혈관종 및 편평 태선을 겪는 대상에서 피부의 혈관화를 증가시키는 것을 방지한다. 또 다른 구현예에서, VEGF 에 대한 개질 변이체 VEGF-BBPI 의 결합은 VEGF 가 건선, 경피증, 정맥 궤양, 여드름, 주사코, 사마귀, 습진 및 림프관신생을 포함하는 염증성 피부 장애와 연관된 이상조절된 혈관신생을 촉진하는 것을 방지한다. 그러나, 본 발명은 임의의 특정 메카니즘에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 개인 케어 조성물은 그 안의 키모트립신 루프가 펩티드 ACYNLYGWTC (SEQ ID NO:9), KYYLYWW (SEQ ID NO:458), TLWKSYW (SEQ ID NO:459), DLYWW (SEQ ID NO:460),SKHSQIT (SEQ ID NO:468) KTNPSGS (SEQ ID NO:469) RPTGHSL (SEQ ID NO:470), KHSAKAE (SEQ ID NO:471) KPSSASS (SEQ ID NO:472), PVTKRVH (SEQ ID NO:473), TLHWWVT (SEQ ID NO:492), PYKASFY (SEQ ID NO:493), PLRTSHT (SEQ ID NO:494), EATPROT (SEQ ID NO:495), NPLHTLS (SEQ ID NO:496), KHERIWS (SEQ ID NO:497), ATNPPPM (SEQ ID NO:498), STTSPNM (SEQ ID NO:499), ADRSFRY (SEQ ID NO:500), PKADSKQ (SEQ ID NO:501), PNQSHLH (SEQ ID NO:502), SGSETWM (SEQ ID NO:503), ALSAPYS (SEQ ID NO:504), KMPTSKV (SEQ ID NO:505), ITPKRPY (SEQ ID NO:506), KWIVSET (SEQ ID NO:507), PNANAPS (SEQ ID NO:508), NVQSLPL (SEQ ID NO:509), TLWPTFW (SEQ ID NO:510), NLWPHFW (SEQ ID NO:511), SLWPAFW (SEQ ID NO:512), SLWPHFW (SEQ ID NO:513), APWNSHI (SEQ ID NO:514), APWNLHI (SEQ ID NO:515), LPSWHLR (SEQ ID NO:516), PTILEWY (SEQ ID NO:517), TLYPQFW (SEQ ID NO:518) 및 HLAPSAV (SEQ ID NO:519) 를 포함하는, 미국 출원 일련 번호 제 09/832,723 호 및 제 10/984,270 호로부터 선택되는 VEGF-결합 펩티드인, VEGF-BBPI 를 포함한다. 일부 다른 구현예에서, VEGF 변이체 서열은 펩티드 KYYLSWW (SEQ ID NO:520), WYTLYKW (SEQ ID NO:521), TYRLYWW (SEQ ID NO:522), RYSLYYW (SEQ ID NO:523), YYLYYWK (SEQ ID NO:524), NYQLYGW (SEQ ID NO:525), TKWPSYW (SEQ ID NO:226), TLWKSYW (SEQ ID NO:527), PLWPSYW (SEQ ID NO:528), RLWPSYW (SEQ ID NO:529), TLWPKYW (SEQ ID NO:530), KYDLYWW (SEQ ID NO;531), RYDLYWW (SEQ ID NO:532), DYRLYWW (SEQ ID NO:533), DYKLYWW (SEQ ID NO:534), EYKLYWW (SEQ ID NO:535) 및 RYPLYWW (SEQ ID NO:536) 을 포함하는, 미국 출원 일련 번호 제 11/919,717 호에 개시된 VEGF-결합 펩티드를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 다른 구현예에서, VEGF 결합 펩티드는 SEQ ID NO:9, 458, 459, 460, 468, 469, 470, 471, 472 및 473 으로부터 선택된다.
그 안에 변이체 VEGF 펩티드가 도입되어 키모트립신 루프를 대체하는 스캐폴드는 글리신 맥스로부터의 콩 저해제의 스캐폴드 (BBI; SEQ ID NO:13) 또는 그의 성숙 및 절단된 형태 (SEQ ID NO:185), 돌리코스 비플로루스로부터의 저해제 (BBdb; SEQ ID NO:449), 글리신 맥스로부터의 콩 저해제 D-II (BBsb3; SEQ ID NO:450), 토레세아 (암부라나) 세아렌시스로부터의 저해제 (BBtc; SEQ ID NO:451), (SEQ ID NO:186) 의 BBI-AV 스캐폴드, (SEQ ID NO:187) 의 BBIt-AV 스캐폴드, (SEQ ID NO:452) 의 BBdb-AV 스캐폴드, (SEQ ID NO:453) 의 BBsb3-AV 스캐폴드, (SEQ ID NO:454) 의 BBtc-AV 스캐폴드, (SEQ ID NO:640) 의 BBIt-VEGK 스캐폴드, (SEQ ID NO:641) 의 BBIt-VEGT 스캐폴드 및 (SEQ ID NO:642) 의 BBIt-VEGKD 스캐폴드로부터 선택된다. 또한, 임의의 야생형 BBPI 전구체 스캐폴드, 예컨대 Prakash 등에 의해 개시된 것 (상기) 이 변이체 BBPI 스캐폴드를 생성하는데 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, VEGF-BBPI 의 스캐폴드는 SEQ ID NO:187 의 것이다.
일부 구현예에서, 개질 변이체 VEGF-BBPI 의 골격은 섹션 5.4.1 에서 기술된 바와 같이 SEQ ID NO:187 의 변이체 BBI 의 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 및 65 와 동등한 위치로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 다른 구현예에서, 개질 변이체 VEGF-BBPI 의 골격은 섹션 5.4.2 에서 상기 언급된 바와 같이 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 개의 아미노산 치환의 조합으로부터 선택되는 아미노산 치환의 조합을 포함한다. 다른 구현예에서, 개질 변이체 VEGF-BBPI 의 골격은 13I-29P-50T-52A, 13I-40K-50T-52A, 13I-25K-29P-52K, 13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T, 13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q, 13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L 로부터 선택되는 아미노산 치환의 조합으로부터 선택되는 아미노산 치환의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 개인 케어 조성물은 그 안의 전구체 스캐폴드의 동등한 키모트립신 루프가 SEQ ID NO:9, 458, 459, 460, 468, 469, 470, 471, 472 및 473 으로부터 선택되는 VEGF 변이체 펩티드로 대체되고 (이 경우 스캐폴드는 SEQ ID NO:187 의 것임), 13I-40K-50T-52A, 13I-25K-29P-52K, 13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T, 13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q, 13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L 로부터 선택되는 아미노산 치환의 조합을 포함하는, 개질 변이체 BBPI 를 포함한다. 일부 구현예에서, 개인 케어 조성물은 SEQ ID NO:601, 602, 627, 628, 629, 630, 631, 643, 491, 632, 633, 634, 635 및 636 의 VEGF-BBPI 로부터 선택되는 VEGF-BBPI 를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 VEGF 에 결합하는 VEGF-BBPI 를 포함하는 개인 케어 조성물을 제공한다. 대안적 구현예에서, VEGF 에 대한 VEGF-BBPI 의 결합은 VEGF 의 하류 활성을 차단한다. 일부 구현예에서, 조성물은 혈관신생을 조정할 수 있다.
일부 구현예에서, 개인 케어 조성물은 피부 케어용 개질 변이체 BBPI-VEGF 를 포함한다. 일부 구현예에서, 피부 케어 조성물은 피부의 외양을 향상시키는 미용 용도를 위한 것이다. 다른 구현예에서, 피부 케어 조성물은 피부 장애를 겪는 대상에서 피부의 외양을 향상시키는 치료적 용도를 위한 것이다. 일부 구현예에서, 피부 장애는 혈관신생 피부 장애이다. 추가의 구현예에서, 피부 장애는 건선, 경피증, 정맥 궤양, 여드름, 주사코, 사마귀, 습진, 혈관종 및 림프관신생으로부터 선택되는 하나 이상의 것이다. 일부 구현예에서, 피부 장애는 주사코이다. 다른 구현예에서, 피부 장애는 건선이다.
한 구현예에서, VEGF-BBPI 를 포함하는 개인 피부 케어 조성물은 피부 크림, 로션, 스프레이, 에멀젼, 콜로이드성 현탁액, 거품, 에어로졸, 액체, 겔, 세럼 및 고체로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, 개인 케어 조성물은 보습 바디 워시, 바디 워시, 살균 세정제, 피부 보호 크림, 바디 로션, 얼굴 크림, 보습 크림, 얼굴 세정 에멀젼, 얼굴 겔, 얼굴 세럼, 계면활성제계 얼굴 세정제, 얼굴 박리 겔, 여드름 방지 처리제, 얼굴 토너, 박리 크림, 얼굴 마스크, 애프터 쉐이브 밤, 프리-쉐이브 밤, 태닝 조성물, 피부 미백 조성물, 피부 발진 감소 조성물, 선스크린, 제모제, 헤어 성장 저해제 및 방사선 보호제로부터 선택되는 피부 케어 조성물이다. 방사선 보호제는 비-내수성 선스크린, 지속 내수성 선스크린 및 W/S 선스크린으로부터 선택된다.
한 구현예에서, VEGF-BBPI 를 포함하는 개인 케어 피부 케어 조성물은 국소적으로 적용되는 비처방전 조성물, 진균 방지 처리제, 여드름 방지 처리제, 피부 보호제, 선스크린, 데오도란트 및 발한 억제제를 포함한다. 다른 구현예에서, 피부 케어 조성물은 피부 톤을 밝히고, 발진을 감소시키고, 피부 톤을 어둡게하는 것을 방지하고 또는 색 발달을 방지할 수 있다.
본 발명은 미용 조성물인 개인 케어 조성물을 또한 제공한다. 일부 바람직한 구현예에서, VEGF-BBPI 를 포함하는 미용 조성물은 압축 파우더 제형 및 파운데이션으로부터 선택된다. 일부 바람직한 구현예에서, 미용 조성물은 하나 이상의 안료를 포함한다.
또 추가의 구현예에서, 메이크업 조성물은 루스 파우더, 블러쉬 및 브론징 파우더로부터 선택되는 압축 파우더 제형이다. 또 추가의 구현예에서, 메이크업 조성물은 유중수 파운데이션, W/S 파운데이션, 수중유 파운데이션, 무수메이크업 스틱 및 크림-투-파우더 파운데이션으로부터 선택되는 파운데이션이다.
일부 구현예에서, 개인 피부 케어 조성물은 본원에서 제시된 바와 같은 개질 변이체 VEGF-BBPI, 및 생리적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 바람직하게는, VEGF-BBPI 는 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.0001 중량% 내지 약 5 중량% 의 양으로 존재한다. 또한 바람직하게는, VEGF-BBPI 는 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.001 중량% 내지 약 0.5 중량% 의 양으로 존재한다. 조성물은 에멀젼화 비히클, 예컨대 영양 크림 또는 로션, 안정화된 겔 또는 분산 시스템, 처리제 세럼, 리포솜 전달 시스템, 국소적 팩 또는 마스크, 계면활성제계 세정 시스템 예컨대 샴푸 또는 바디 워시, 에어로졸화된 또는 분무된 분산액 또는 에멀젼, 헤어 또는 피부 컨디셔너, 스타일링 보조제, 또는 색조 제품 예컨대 메이크업, 뿐만 아니라 다른 적합한 메이크업 및 미용 제제의 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, 담체는 바람직하게는 물, 프로필렌 글리콜, 에탄올, 프로판올, 글리세롤, 부틸렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 것이다.
일부 다른 구현예에서, 본 발명은 개질 변이체 VEGF-BBPI 를 포함하는 헤어 케어용 개인 케어 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 헤어 케어 조성물은 헤어 성장의 저해에 사용된다. 다른 구현예에서, 헤어 성장의 저해는 감소된 헤어 성장이 바람직한 하나 이상의 질환 또는 상태의 치료를 위한 헤어 제거를 포함한다. 일부 구현예에서, 저해 및/또는 제거는 제모를 포함한다. 일부 구현예에서, 헤어는 수염, 다리 털, 팔 털 및 몸통 털로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 구현예에서, 헤어 케어 조성물은 샴푸, 컨디셔너, 헤어 스타일링 조성물, 헤어 색소, 퍼머넌트 웨이브 제형, 크림, 겔, 무스, 스프레이, 에멀젼, 콜로이드성 현탁액, 액체, 거품 및 고체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 헤어 케어 조성물은 방사선 보호제를 추가로 포함한다. 개인 피부 케어 조성물에 대해 기술된 바와 같이 방사선 보호제는 비-내수성 선스크린, 지속 내수성 선스크린 및 W/S 선스크린으로부터 선택되는 선스크린이다. 다른 구현예에서, 방사선 보호제는 비-내수성 선스크린, 지속 내수성 선스크린 및 W/S 선스크린으로부터 선택되는 선스크린이다.
일부 구현예에서, 개인 헤어 케어 조성물은 본원에서 제시된 바와 같은 개질 변이체 VEGF-BBPI, 및 생리적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 바람직하게는, VEGF-BBPI 는 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.0001 중량% 내지 약 5 중량% 의 양으로 존재한다. 또한 바람직하게는, VEGF-BBPI 는 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.001% 내지 약 1 중량% 의 양으로 존재한다. 조성물은 에멀젼화 비히클, 예컨대 영양 크림 또는 로션, 안정화된 겔 또는 분산 시스템, 처리제 세럼, 리포솜 전달 시스템, 국소적 팩 또는 마스크, 계면활성제계 세정 시스템 예컨대 샴푸 또는 바디 워시, 에어로졸화된 또는 분무된 분산 또는 에멀젼, 헤어 또는 피부 컨디셔너, 스타일링 보조제, 또는 색조 제품 예컨대 메이크업, 뿐만 아니라 다른 적합한 메이크업 및 미용 제제의 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, 담체는 바람직하게는 물, 프로필렌 글리콜, 에탄올, 프로판올, 글리세롤, 부틸렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 것이다.
다른 구현예에서, 본 발명의 개인 케어 조성물은 상승된 수준의 VEGF 와 연관된 다양한 질환의 치료용이다.
본 발명은 또한 본 발명의 개인 케어 VEGF 헤어 케어 조성물을 제공하는 단계; 처리할 대상을 제공하는 단계; 및 상기 조성물을 헤어 성장의 저해가 필요한 부위 내에서 대상에게 적용하는 단계를 포함하는 대상의 헤어 성장의 저해 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 헤어 성장의 저해는 저해될 헤어가 얼굴 털, 겨드랑이 털, 다리 털, 몸통 털, 팔 털 및 머리 털로 이루어진 군으로부터 선택되는 대상의 헤어의 성장의 저해를 포함한다. 추가의 구현예에서, 본 발명의 VEGF 헤어 케어 조성물을 사용하는 헤어 성장의 저해 방법은 SEQ ID NOS SEQ ID NO:601, 602, 627, 628, 629, 630, 631, 643, 491, 632, 633, 634, 635 및 636 으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VEGF-BBPI 를 포함하는 개인 케어 조성물을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 개인 케어 조성물을 제공하는 단계; 처리할 대상을 제공하는 단계; 및 상기 조성물을 대상의 영향받은 피부에 적용하는 단계를 포함하는 피부 장애를 겪는 대상에서 피부 외양 및/또는 상태를 향상시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 피부 장애는 건선, 정맥 궤양, 여드름, 주사코, 사마귀, 습진, 혈관종, 피부 편평 태선 및 림프관신생 등으로부터 선택된다. 일부 특정 바람직한 구현예에서, 피부 장애는 주사코이다. 다른 구현예에서, 피부 장애는 건선이다. 추가의 구현예에서, 본 발명의 VEGF 피부 케어 조성물을 사용하여 피부 장애를 겪는 대상에서 피부 외양 및/또는 상태를 향상시키는 방법은 SEQ ID NO:601, 602, 627, 628, 629, 630, 631, 643, 491, 632, 633, 634, 635 및 636 로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VEGF-BBPI 를 포함하는 개인 케어 조성물을 포함한다.
6.0.3 개질 변이체 FGF -5- BBPI 를 포함하는 개인 케어 조성물
섬유모세포 성장 인자 (Fibroblast Growth Factor, FGF) 패밀리는 그중 다수가 세포 증식, 분화 및 세포 기능의 강한 조절제인 23 개 이상의 일원을 포함하는 성장 인자의 슈퍼패밀리이다. 모든 FGF 는 보존된 120 개 아미노산 코어를 갖는다. 패밀리의 일원은 아미노산 수준에서 보존된 시스테인 잔기 및 30-50% 서열 상동성을 공유한다. FGF 의 분자량은 FGF-1 의 경우 7　kDa 에서 FGF-5 의 경우 38　kDa 의 범위이다. 단백질의 길이는 FGF-1 스플라이스 변이체의 경우 60 개 아미노산에서 FGF-2 의 경우 288 개 아미노산이다. 헤파린에 대한 결합은 FGF 인자가 세포 표면 수용체와 상호작용하는데 필요한 본질적 단계이다. FGF5 는 17 개 아미노산 신호 서열 및 251 개 아미노산 성숙 펩티드를 포함하는 268 개 아미노산으로 이루어진 분비된 신호 단백질이다. 인간 유전자는 또한 크기가 18 kDa 이고 길이가 123　개 아미노산인 글리코실화된 교대 스플라이스 형태를 생성한다. FGF-5 의 쥐과 상동체가 클로닝되고 아미노산 서열 수준에서 인간 단백질과 84% 상동인 것으로 밝혀졌다. 인간 FGF-5 는 3 개의 엑손으로 이루어지고, 염색체 4q21 에 해당하고, 쥐과 FGF-5 와 교차-반응한다.
모낭의 형성은 하기 복합적 일련의 단계를 수반한다: 성장 (성장기), 퇴행 (퇴행기), 안정 (휴지기) 및 탈락 (탈락기). FGF-5 는 헤어 사이클에서 성장기로부터 퇴행기로의 이행의 주요 조종자 중 하나로 시사되었다. FGF-5 의 발현은 야생형 마우스로부터의 모낭에서 탐지되고, 성장기 동안 바깥 뿌리집에 국소화된다. FGF-5 의 예측된 널 (null) 대립유전자, fgf5neo 에 대한 동종접합 마우스는 비정상적으로 긴 털을 갖는다 (Hebert et al., Cell 78: 1017-25 [1994] 참조). 표현형은 자발적 돌연변이 앙고라 (go) 에 대한 동종접합 마우스의 표현형과 동일한 것으로 나타난다. 최근, 수용체에 대한 결합에서 FGF-5 와 경쟁하는 것으로 여겨지는 부분적 FGF-5 서열, FGF5S 가 확인되었다 (Ito et al., J. Cell Physiol., 197:272-83 [2003] 참조).
본 발명은 하나 이상의 개질 변이체 FGF-BBPI 를 포함하는 헤어 성장의 촉진 및/또는 헤어 손실의 방지용 개인 헤어 케어 조성물을 제공한다. 한 구현예에서, 본 발명은 개인 피부 케어용 FGF-BBPI 조성물을 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 헤어 케어용 FGF-BBPI 조성물을 제공한다. 본 발명의 개인 케어 조성물 내에 포함된 FGF-BBPI 는 그 안의 FGF-5-BBPI 의 전구체 스캐폴드의 동등한 키모트립신 루프가 FGF-5 변이체 펩티드에 의해 대체되고, 섹션 5.4.1 및 5.4.2 에서 기술된 바와 같이 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하는 개질 변이체 BBPI 이다. 본 발명에서, FGF-5 에 대한 개질 변이체 FGF-BBPI 의 결합은 FGF-5 가 그의 동족 수용체와 상호작용하는 것을 방지하고, 성장기로부터 퇴행기로의 이행을 저해하여 헤어 성장을 촉진하고 헤어 손실을 방지한다. 그러나, 본 발명은 임의의 특정 메카니즘에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 개인 케어 조성물은 그 안의 키모트립신 루프가 CACRTQPYPLCF (MM007; SEQ ID NO:430), CICTWIDSTPC (PS2; SEQ ID NO:431), CYGLPFTRC (SEQ ID NO:537), CEEIWTMLC (SEQ ID NO:538), CWALTVKTC (SEQ ID NO:539), CLTVLWTTC (SEQ ID NO:540), CTLWNRSPC (SEQ ID NO:541), CHYLLTNYC (SEQ ID NO:542), CRIHLAHKC (SEQ ID NO:543), TNIDSTP(SEQ ID NO:544), HLQTTET (SEQ ID NO:545), SLNNLTV (SEQ ID NO:546), TNIDSTP (SEQ ID NO:547), TNIDSTP (SEQ ID NO:548), LRILANK (SEQ ID NO:549), LLTPTLN (SEQ ID NO:550), ALPTHSN (SEQ ID NO:551), TNIDSTP (SEQ ID NO:552), LCRRFEN (SEQ ID NO:553), TNIDSTP (SEQ ID NO:554), TNIDSTP (SEQ ID NO:555), HLQTTET (SEQ ID NO:556), PLGLCPP (SEQ ID NO:557), GYFIPSI (SEQ ID NO:558), TKIDSTP (SEQ ID NO:559), HLQTTET (SEQ ID NO:560), WNIDSTP (SEQ ID NO:561), TWIDWTP (SEQ ID NO:562), RTQPYPL (SEQ ID NO:670) 및 TWIDSTP (SEQ ID NO:671) 로부터 선택되는 FGF-5 변이체 펩티드인 하나 이상의 FGF-BBPI 를 포함한다. 다른 구현예에서, FGF 변이체 펩티드는 SEQ ID NO:430, 431, 670 및 671 로부터 선택된다.
그 안에 변이체 FGF 펩티드가 도입되어 키모트립신 루프를 대체하는 스캐폴드는 글리신 맥스로부터의 콩 저해제의 스캐폴드 (BBI; SEQ ID NO:13) 또는 그의 성숙 및 절단된 형태 (SEQ ID NO:185), 돌리코스 비플로루스로부터의 저해제 (BBdb; SEQ ID NO:449), 글리신 맥스로부터의 콩 저해제 D-II (BBsb3; SEQ ID NO:450), 토레세아 (암부라나) 세아렌시스로부터의 저해제 (BBtc; SEQ ID NO:451), (SEQ ID NO:186) 의 BBI-AV 스캐폴드, (SEQ ID NO:187) 의 BBIt-AV 스캐폴드, (SEQ ID NO:452) 의 BBdb-AV 스캐폴드, (SEQ ID NO:453) 의 BBsb3-AV 스캐폴드, (SEQ ID NO:454) 의 BBtc-AV 스캐폴드, (SEQ ID NO:640) 의 BBIt-VEGK 스캐폴드, (SEQ ID NO:641) 의 BBIt-VEGT 스캐폴드 및 (SEQ ID NO:642) 의 BBIt-VEGKD 스캐폴드로부터 선택된다. 또한, 임의의 야생형 BBPI 전구체 스캐폴드, 예컨대 Prakash et al. (상기 참조) 에 의해 개시된 것들이 변이체 BBPI 스캐폴드를 생성하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, VEGF-BBPI 의 스캐폴드는 SEQ ID NO:187 의 것이다.
일부 구현예에서, 개질 변이체 FGF-BBPI 의 골격은 섹션 5.4.1 에서 언급된 바와 같이 SEQ ID NO:187 의 변이체 BBI 의 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 및 65 와 동등한 위치로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 다른 구현예에서, 개질 변이체 FGF-BBPI 의 골격은 섹션 5.4.2 에서 언급된 바와 같이 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 개의 아미노산 치환의 조합으로부터 선택되는 아미노산 치환의 조합을 포함한다. 다른 구현예에서, 개질 변이체 FGF-BBPI 의 골격은 13I-29P-50T-52A, 13I-40K-50T-52A, 13I-25K-29P-52K, 13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T, 13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q, 13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L 로부터 선택되는 아미노산 치환의 조합으로부터 선택되는 아미노산 치환의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 치환의 조합은 13I-29P-50T-52A 이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 개인 케어 조성물은 그 안에서 전구체 스캐폴드의 동등한 키모트립신 루프가 SEQ ID NO:433 및 434 로부터 선택되는 FGF 변이체 펩티드로 대체되고 (여기서 스캐폴드는 SEQ ID NO:187 의 것임), 아미노산 치환의 조합 13I-40K-50T-52A 를 포함하는 FGF-BBPI 를 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 개인 케어 조성물은 SEQ ID NO:439 및 441 의 FGF-BBPI 로부터 선택되는 FGF-BBPI 를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 FGF 에 결합하는 FGF-BBPI 를 포함하는 개인 케어 조성물을 제공한다. 대안적 구현예에서, FGF 에 대한 FGF-BBPI 의 결합은 FGF 의 하류 활성을 차단한다. 일부 구현예에서, 조성물은 헤어 성장을 촉진할 수 있다.
일부 구현예에서, 개질 변이체 BBPI-FGF 를 포함하는 개인 케어 조성물은 피부 케어용이다. 일부 구현예에서, 피부 케어 조성물은 헤어 성장 촉진용 미용 조성물이다. 일부 구현예에서, 피부 케어 조성물은 헤어 손실을 수반하는 질환 또는 상태를 겪는 대상에서 헤어 성장을 촉진하는 용도를 위한 것이다. 상기 구현예 중 일부에서, 질환 또는 상태는 염증성 탈모, 반흔성 탈모, 경피증, 진드기 교상, 편평 태선, 건선, 루푸스, 지루성 피부염, 느슨한 모발 증후군, 혈색소침착증, 남성형 탈모, 원형 탈모, 암, 결손 헤어 섬유 생성에 영향을 미치는 상태 및 헤어 생성에 영향을 미치는 환경적 인자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 것이다. 바람직한 구현예에서, 질환은 남성형 탈모 또는 원형 탈모이다.
한 구현예에서, FGF-BBPI 를 포함하는 개인 케어 조성물은 피부 크림, 로션, 스프레이, 에멀젼, 콜로이드성 현탁액, 거품, 에어로졸, 액체, 겔, 세럼 및 고체로부터 선택되는 피부 케어 조성물이다. 또 다른 구현예에서, 개인 케어 조성물은 보습 바디 워시, 바디 워시, 살균 세정제, 피부 보호 크림, 바디 로션, 얼굴 크림, 보습 크림, 얼굴 세정 에멀젼, 얼굴 겔, 얼굴 세럼, 계면활성제계 얼굴 세정제, 얼굴 박리 겔, 여드름 방지 처리제, 얼굴 토너, 박리 크림, 얼굴 마스크, 애프터 쉐이브 밤, 프리-쉐이브 밤, 태닝 조성물, 피부 미백 조성물, 피부 발진 감소 조성물, 선스크린, 제모제, 헤어 성장 저해제 및 방사선 보호제로부터 선택되는 피부 케어 조성물이다. 방사선 보호제는 비-내수성 선스크린, 지속 내수성 선스크린 및 W/S 선스크린으로부터 선택된다.
한 구현예에서, FGF-BBPI 를 포함하는 개인 피부 케어 조성물은 국소적으로 적용되는 비처방전 조성물, 진균 방지 처리제, 여드름 방지 처리제, 피부 보호제, 선스크린, 데오도란트 및 발한 억제제를 포함하는 피부 케어 조성물이다.
일부 구현예에서, 개인 피부 케어 조성물은 본원에서 제시된 바와 같은 개질 변이체 VEGF-BBPI, 및 생리적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 바람직하게는, VEGF-BBPI 는 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.0001 중량% 내지 약 5 중량% 의 양으로 존재한다. 또한 바람직하게는, VEGF-BBPI 는 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.001 중량% 내지 약 0.5 중량% 의 양으로 존재한다. 조성물은 에멀젼화 비히클, 예컨대 영양 크림 또는 로션, 안정화된 겔 또는 분산 시스템, 처리제 세럼, 리포솜 전달 시스템, 국소적 팩 또는 마스크, 계면활성제계 세정 시스템 예컨대 샴푸 또는 바디 워시, 에어로졸화된 또는 분무된 분산 또는 에멀젼, 헤어 또는 피부 컨디셔너, 스타일링 보조제, 또는 색조 제품 예컨대 메이크업, 뿐만 아니라 다른 적합한 메이크업 및 미용 제제의 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, 담체는 바람직하게는 물, 프로필렌 글리콜, 에탄올, 프로판올, 글리세롤, 부틸렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 것이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 개질 변이체 FGF-BBPI 를 포함하는 헤어 케어용 개인 케어 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 헤어 케어 조성물은 헤어 성장을 촉진하는데 사용된다. 다른 구현예에서, 조정은 헤어 손실을 수반하는 질환 또는 상태를 겪는 대상에서 헤어 성장을 촉진하는 것을 포함한다. 상기 구현예 중 일부에서, 질환 또는 상태는 염증성 탈모, 반흔성 탈모, 경피증, 진드기 교상, 편평 태선, 건선, 루푸스, 지루성 피부염, 느슨한 모발 증후군, 혈색소침착증, 남성형 탈모, 원형 탈모, 암, 결손 헤어 섬유 생산에 영향을 미치는 상태 및 헤어 생산에 영향을 미치는 환경적 인자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 것이다. 바람직한 구현예에서, 질환은 남성형 탈모 또는 원형 탈모이다.
한 구현예에서, 헤어 케어 조성물은 샴푸, 컨디셔너, 헤어 스타일링 조성물, 헤어 색소, 퍼머넌트 웨이브 제형, 크림, 겔, 무스, 스프레이, 에멀젼, 콜로이드성 현탁액, 액체, 거품 및 고체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 헤어 케어 조성물은 방사선 보호제를 추가로 포함한다. 개인 피부 케어 조성물에 대해 기술된 바와 같이 방사선 보호제는 비-내수성 선스크린, 지속 내수성 선스크린 및 W/S 선스크린으로부터 선택되는 선스크린이다. 다른 구현예에서, 방사선 보호제는 비-내수성 선스크린, 지속 내수성 선스크린 및 W/S 선스크린으로부터 선택되는 선스크린이다.
일부 구현예에서, 개인 헤어 케어 조성물은 본원에서 제시된 바와 같은 개질 변이체 FGF-BBPI, 및 생리적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 바람직하게는, FGF-BBPI 는 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.0001 중량% 내지 약 5 중량% 의 양으로 존재한다. 또한 바람직하게는, FGF-BBPI 는 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.001 중량% 내지 약 0.5 중량% 의 양으로 존재한다. 조성물은 에멀젼화 비히클, 예컨대 영양 크림 또는 로션, 안정화된 겔 또는 분산 시스템, 처리제 세럼, 리포솜 전달 시스템, 국소적 팩 또는 마스크, 계면활성제계 세정 시스템 예컨대 샴푸 또는 바디 워시, 에어로졸화된 또는 분무된 분산 또는 에멀젼, 헤어 또는 피부 컨디셔너, 스타일링 보조제, 또는 색조 제품 예컨대 메이크업, 뿐만 아니라 다른 적합한 메이크업 및 미용 제제의 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, 담체는 바람직하게는 물, 프로필렌 글리콜, 에탄올, 프로판올, 글리세롤, 부틸렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 것이다.
다른 구현예에서, 본 발명의 개인 케어 FGF-BBPI 조성물은 상승된 수준의 FGF 와 연관된 다양한 질환의 치료용이다.
본 발명은 또한 본 발명의 개인 케어 FGF 조성물을 제공하는 단계; 처리할 대상을 제공하는 단계; 상기 조성물을 헤어 성장의 촉진이 필요한 부위 내에서 대상에게 적용하는 단계를 포함하는 대상의 헤어 성장의 촉진 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, FGF 조성물은 피부 케어 조성물이다. 다른 구현예에서, FGF 조성물은 헤어 조성물이다. 일부 구현예에서, 헤어 성장의 촉진은 성장이 촉진될 헤어가 얼굴 털, 겨드랑이 털, 다리 털, 몸통 털, 팔 털 및 머리 털로부터 선택되는 대상의 헤어의 성장을 촉진하는 것을 포함한다. 추가의 구현예에서, 본 발명의 FGF 헤어 케어 조성물을 사용하는 헤어 성장의 촉진 방법은 SEQ ID NO:439 및 441 로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 FGF-BBPI 를 포함하는 개인 케어 조성물을 적용하는 것을 포함한다.
6.0.4 개질 변이체 TGF β BBPI 를 포함하는 개인 케어 조성물
형질전환 성장 인자-β (Transforming Growth Factor-β, TGFβ) 패밀리의 단백질은 거의 모든 세포에 의해 합성된다. TGFβ 는 안정정, 다중기능적 폴리펩티드 성장 인자의 군이고, 그의 활성은 특히 세포 증식의 정황-특이적 저해 및 자극, 세포외 매트릭스의 제어, 배아발생 동안 중간엽-상피 상호작용의 분해 및 제어, 상해에 대한 세포 및 조직 반응의 매개, 발암의 제어 및 면역 반응의 조정을 포함한다. TGFβ-1 은 거의 모든 세포에 의해 합성된다 (오직 일부의 예외가 있음). TGFβ-1 은 인간 혈소판 및 포유류 뼈에서 최고 농도로 발견되었다. TGFβ-1 은 세포 증식의 억제, 세포외 매트릭스 침착의 증강 및 생리적 면역억제를 포함하는 많은 기능을 갖는다. TGFβ-1 은 또한 모낭 발달에서 생물학적으로 활성인 것으로 확인되었다. 인간 TGFβ-1 은 서브유닛 당 약 112 개 아미노산을 포함하는 서브유닛을 갖는 25.0 kDa 단백질이다. 2 개의 상이한 수용체 단백질, 즉 TGF-RβII 및 TGF-RβI 이 TGFβ-1 결합 및 신호전달에 관여한다. TGFβ-2 는 각질세포, 섬유모세포, 골모세포, 흉선 상피, 골격근 세포, 전립선 상피, 기관지 상피, 뉴런 및 별아교세포, 내장 평활근, 대식세포 및 다양한 다른 세포를 포함하는 다양한 세포에서 발현된다. TGFβ-2 는 대부분의 세포에 대한 성장 저해제, 세포외 매트릭스의 침착에 대한 증강제로서의 기능 및 면역억제를 포함하는 많은 기본적 활성을 갖는다. 성숙 부위는 아미노산 수준에서 TGFβ-1 와 71% 동일하고, TGFβ-3 과 80% 동일하고, 동일한 단백질의 마우스 상동체와 97% 동일하다. TGFβ-2 는 이합체화하여 '프로' 부위 사이의 디술피드 결합 및 성숙 부위 사이의 디술피드 결합을 형성한다. TGFβ-2 는 19 개 아미노산 신호 서열, 283 개 프로-부위 및 112 개 성숙 아미노산 분절을 갖는 프리-프로사이토카인으로서 합성된다. TGFβ-2 에 대한 수용체는 2 개의 유형 I 신호-형질도입 수용체 및 2 개의 유형 II 리간드-결합 수용체의 이종사합체를 형성한다.
모낭의 형성은 하기 복합적 일련의 단계를 수반한다: 성장 (성장기), 퇴행 (퇴행기), 안정 (휴지기) 및 탈락 (탈락기) (Stenn and Paus, Physiol. Rev, Exp. Dermatol., 8:229-233 [1999] 참조). TGFβ 는 헤어 사이클에서 성장기로부터 퇴행기로의 이행의 주요 조종자 중 하나로 시사되었고 (예를 들어, Foitzik et al, FASEB J., 5:752-760 [2000]; 및 Soma et al. J. Infect. Dis., J. Invest. Dermatol., 118:993-9997 [2002] 참조), TGFβ2 는 쥐과 모낭 형태발생의 필요충분한 유도자이다 (Foitzik et al., Develop. Biol., 212:278-289 [1999] 참조). 트랜스제닉 마우스에서 조건적 TGFβ-1 발현은 탈모를 가역적으로 유도할 수 있음을 입증한다 (Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:9139-9144 [2001] 참조). 또한, TGFβ-1 돌연변이체는 마우스에서 퇴행기 개시의 지연과 연관되었다 (상기 Foitzik et al, [2000] 참조). 최근 TGFβ-2 항체의 사용을 통해 퇴행기가 지연될 수 있음이 밝혀졌다 (상기 Soma et al., [2002] 참조). 마지막으로, 머리가 벗겨지기 시작하는 진피 유두 세포에서 TGFβ-1 생산을 유도하는 안드로겐은 상피 세포 성장을 저해할 수 있다 (Inui et al., FASEB J., 14:1967-1969 [2002]).
TGFβ 는 또한 결합 조직 축적의 강한 자극이고, 경피증 및 다른 섬유증 장애의 발병기전에 연루된다 (Blobe et al., N Engl J Med 342:1350-1358 [2000]). 경피증은 조기 염증 및 혈관 상해 이후, 피부 및 다른 기관의 진행성 섬유증이 특징인 만성 자가면역 질환이다 (Kissin and Korn, Rheum Dis Clin North Am 29:351-369 [2003]). 가장 명백한 증상은 통상적으로 피부의 경화 및 연관된 흉터형성이다.
TGFβ 는 또한 피부 종양의 형성에 연루된다 (Li et al., Molecular Carcinogenesis 45:389-396 [2006]). TGFβ 신호전달 경로는 상피 항상성의 유지에서 가장 중요한 메카니즘 중 하나이다. 상기 경로의 퇴행 또는 증강을 초래하는 변경은 암 발달에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. TGFβ 가 정상적 상피 세포의 성장을 저해함에도 불구하고, 그것은 역설적으로 많은 상피 암에서 과발현된다. TGFβ 가 발암의 조기 단계에서 종양 억제자로서 작용하는 것으로 가정되었지만, 발암의 후기 단계에서 TGFβ 의 과발현은 종양 침입 및 전이에 대한 중요한 인자일 수 있다.
본 발명은 개질 변이체 TGF-BBPI 를 포함하는 개인 케어 조성물을 제공한다. 본 발명의 개인 케어 조성물 내에 포함된 TGFβ-BBPI 는 그 안에서 TGF-BBPI 의 전구체 스캐폴드의 키모트립신 루프가 TGFβ 변이체 펩티드에 의해 대체되고, 섹션 5.4.1 및 5.4.2 에서 기술된 바와 같이 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하는 개질 변이체 TGFβ-BBPI 이다. 일부 구현예에서, TGFβ1 및/또는 TGFβ2 에 대한 개질 변이체 TGF-BBPI 의 결합은 TGFβ1 및/또는 TGFβ2 가 그의 동족 수용체와 상호작용하는 것을 방지하고, 성장기로부터 퇴행기로의 이행을 저해하여 헤어 성장을 촉진하고 헤어 손실을 방지한다. 다른 구현예에서, TGFβ1 및/또는 TGFβ2 에 대한 개질 변이체 TGF-BBPI 의 결합은 TGFβ1 및/또는 TGFβ2 가 그의 동족 수용체와 상호작용하는 것을 방지하여 경피증의 특징인 피부의 섬유증을 방지한다. 다른 구현예에서, TGFβ1 및/또는 TGFβ2 에 대한 개질 변이체 TGF-BBPI 의 결합은 TGFβ1 및/또는 TGFβ2 가 그의 동족 수용체와 상호작용하는 것을 방지하여 양성에서 악성 피부 병변으로의 진행을 방지한다. 그러나, 본 발명은 임의의 특정 메카니즘에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, TGFβ-BBPI 내에 포함된 TGFβ 변이체 펩티드는 CLCPENINVLPCN (PEN3; SEQ ID NO:436), CICKHNVDWLCF (MMO21W; SEQ ID NO:437), CICWTQHIHNCF (WTQ; SEQ ID NO:438), CVTTDWIEC (SEQ ID NO:563), CYYSQFHQC (SEQ ID NO:564), CPTLWTHMC (SEQ ID NO:565), QSACIVYYVGRKPKVECASSD (SEQ ID NO:566), QSACILYYIGKTPKIECASSD (SEQ ID NO:567), QSACILYYVGRTPKVECASSD (SEQ ID NO:568), 아세틸-LCPENDNVSPCY-cohn2 (SEQ ID NO:569), KHNVRLL (SEQ ID NO:570), NDTPSYF (SEQ ID NO:571), AKLYAGS (SEQ ID NO:572), RGPAHSL (SEQ ID NO:573), NSLAERR (SEQ ID NO:574), HPLASPH (SEQ ID NO:575), QPWNKLK (SEQ ID NO:576), AWLr/Mipy (SEQ ID NO:577), PTKPAQQ (SEQ ID NO:578), PSLNRPQ (SEQ ID NO:579), HHARQEW (SEQ ID NO:580), RHHTPGP (SEQ ID NO:581), ASAINPH (SEQ ID NO:582), CHGYDRAPC (SEQ ID NO:644), CFAPADQAC (SEQ ID NO:645), CIPSRFITC (SEQ ID NO:646), CHGHTKLAC (SEQ ID NO:647), CNGKSKLAC (SEQ ID NO:648), PENINVLP (SEQ ID NO;672), KHNVDWL (SEQ ID NO:673) 및 WTQHIHNC (SEQ ID NO:674) 로부터 선택된다. SEQ ID NO:644-648 은 TGFβ1-결합 펩티드인 한편, SEQ ID NO:463, 437, 438, 563-582 는 TGFβ2-결합 펩티드이다.
다른 구현예에서, TGFβ 변이체 펩티드는 SEQ ID NO:436, 437 및 438 로부터 선택된다.
그 안에 변이체 TGFβ 펩티드가 도입되어 동등한 키모트립신 루프를 대체하는 스캐폴드는 글리신 맥스로부터의 콩 저해제의 스캐폴드 (BBI; SEQ ID NO:13) 또는 그의 성숙 및 절단된 형태 (SEQ ID NO:185), 돌리코스 비플로루스로부터의 저해제 (BBdb; SEQ ID NO:449), 글리신 맥스로부터의 콩 저해제 D-II (BBsb3; SEQ ID NO:450), 토레세아 (암부라나) 세아렌시스로부터의 저해제 (BBtc; SEQ ID NO:451), (SEQ ID NO:186) 의 BBI-AV 스캐폴드, (SEQ ID NO:187) 의 BBIt-AV 스캐폴드, (SEQ ID NO:452) 의 BBdb-AV 스캐폴드, (SEQ ID NO:453) 의 BBsb3-AV 스캐폴드, (SEQ ID NO:454) 의 BBtc-AV 스캐폴드, (SEQ ID NO:640) 의 BBIt-VEGK 스캐폴드, (SEQ ID NO:641) 의 BBIt-VEGT 스캐폴드 및 (SEQ ID NO:642) 의 BBIt-VEGKD 스캐폴드로부터 선택된다. 또한, 임의의 야생형 BBPI 전구체 스캐폴드, 예컨대 Prakash et al. (상기 참조) 에 의해 개시된 것들이 변이체 BBPI 스캐폴드를 생성하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, VEGF-BBPI 의 스캐폴드는 SEQ ID NO:187 의 것이다.
일부 구현예에서, 개질 변이체 TGFβ-BBPI 의 골격은 섹션 5.4.1 에서 언급된 바와 같이 SEQ ID NO:187 의 변이체 BBI 의 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 및 65 와 동등한 위치로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 다른 구현예에서, 개질 변이체 TGFβ-BBPI 의 골격은 섹션 5.4.2 에서 언급된 바와 같이 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 개의 아미노산 치환의 조합으로부터 선택되는 아미노산 치환의 조합을 포함한다. 다른 구현예에서, 개질 변이체 TGFβ-BBPI 의 골격은 13I-29P-50T-52A, 13I-40K-50T-52A, 13I-25K-29P-52K, 13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T, 13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q, 13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L 로부터 선택되는 아미노산 치환의 조합으로부터 선택되는 아미노산 치환의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 치환의 조합은 13I-29P-50T-52A 이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개인 케어 조성물은 그 안에서 전구체 스캐폴드의 동등한 키모트립신 루프가 SEQ ID NO: 436, 437, 438, 672, 673 및 674 로부터 선택되는 TGFβ 변이체 펩티드로 대체되고 (여기서 스캐폴드는 SEQ ID NO:187 의 것임), 아미노산 치환의 조합 13I-29P-50T-52A 를 포함하는 BBPI 를 포함한다. 일부 구현예에서, 개인 케어 조성물은 SEQ ID NO:443, 445 및 447 의 TGFβ-BBPI 로부터 선택되는 FGF-BBPI 를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 TGFβ1 및/또는 TGFβ2 에 결합하는 TGFβ-BBPI 를 포함하는 개인 케어 조성물을 제공한다. 대안적 구현예에서, TGFβ 에 대한 TGFβ-BBPI 의 결합은 TGFβ 의 하류 활성을 차단한다. 일부 구현예에서, 조성물은 헤어 성장을 촉진할 수 있다.
일부 구현예에서, 개질 변이체 TGF-BBPI 를 포함하는 개인 케어 조성물은 피부케어용이다. 일부 구현예에서, 피부 케어 조성물은 헤어 성장 촉진용 미용 조성물이다.
일부 구현예에서, 피부 케어 조성물은 헤어 손실을 수반하는 질환 또는 상태를 겪는 대상에서 헤어 성장을 촉진하는데 사용된다. 상기 구현예 중 일부에서, 질환 또는 상태는 염증성 탈모, 반흔성 탈모, 경피증, 진드기 교상, 편평 태선, 건선, 루푸스, 지루성 피부염, 느슨한 모발 증후군, 혈색소침착증, 남성형 탈모, 원형 탈모, 암, 결손 헤어 섬유 생산에 영향을 미치는 상태 및 헤어 생산에 영향을 미치는 환경적 인자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 것이다. 바람직한 구현예에서, 질환은 남성형 탈모 또는 원형 탈모이다.
다른 구현예에서, 개질 변이체 TGF-BBPI 를 포함하는 개인 케어 조성물은 경피증을 겪는 대상의 피부 외양 및/또는 상태를 향상시키는데 사용된다. 또 다른 구현예에서, 개질 변이체 TGF-BBPI 를 포함하는 개인 케어 조성물은 피부암을 겪는 대상의 피부 외양 및/또는 상태를 향상시키는데 사용된다.
한 구현예에서, TGFβ-BBPI 를 포함하는 개인 케어 조성물은 피부 크림, 로션, 스프레이, 에멀젼, 콜로이드성 현탁액, 거품, 에어로졸, 액체, 겔, 세럼 및 고체로부터 선택되는 피부 케어 조성물이다. 또 다른 구현예에서, 개인 케어 조성물은 보습 바디 워시, 바디 워시, 살균 세정제, 피부 보호 크림, 바디 로션, 얼굴 크림, 보습 크림, 얼굴 세정 에멀젼, 얼굴 겔, 얼굴 세럼, 계면활성제계 얼굴 세정제, 얼굴 박리 겔, 여드름 방지 처리제, 얼굴 토너, 박리 크림, 얼굴 마스크, 애프터 쉐이브 밤, 프리-쉐이브 밤, 태닝 조성물, 피부 미백 조성물, 피부 발진 감소 조성물, 선스크린, 제모제, 헤어 성장 저해제 및 방사선 보호제로부터 선택되는 피부 케어 조성물이다. 방사선 보호제는 비-내수성 선스크린, 지속 내수성 선스크린 및 W/S 선스크린으로부터 선택된다.
한 구현예에서, TGFβ-BBPI 를 포함하는 개인 케어 조성물은 국소적으로 적용되는 비처방전 조성물, 진균 방지 처리제, 여드름 방지 처리제, 피부 보호제, 선스크린, 데오도란트 및 발한 억제제를 포함하는 피부 케어 조성물이다.
본 발명은 또한 미용 조성물인 개인 케어 조성물을 제공한다. 일부 바람직한 구현예에서, 미용 조성물은 마스카라, 압축 파우더 제형 및 파운데이션으로부터 선택된다. 일부 바람직한 구현예에서, 메이크업 조성물은 하나 이상의 안료를 포함한다.
일부 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 안료를 포함하는 메이크업 조성물은 비-방수 마스카라, 방수 마스카라, 부피 증대 마스카라, 길이 연장 마스카라, 컬링 마스카라, 무수 방수 마스카라, 수-기반 마스카라 및 속눈썹 또는 눈썹 처리제로부터 선택되는 마스카라이다.
또 추가의 구현예에서, 메이크업 조성물은 루스 파우더, 블러쉬, 아이 섀도우 및 브론징 파우더로부터 선택되는 압축 파우더 제형이다. 또 추가의 구현예에서, 메이크업 조성물은 유중수 파운데이션, W/S 파운데이션, 수중유 파운데이션, 무수메이크업 스틱 및 크림-투-파우더 파운데이션으로부터 선택되는 파운데이션이다.
일부 구현예에서, 개인 피부 케어 조성물은 본원에서 제시된 바와 같은 개질 변이체 TGF-BBPI, 및 생리적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 바람직하게는, TGF-BBPI 는 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.0001 중량% 내지 약 5 중량% 의 양으로 존재한다. 또한 바람직하게는, TGF-BBPI 는 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.001 중량% 내지 약 0.5 중량% 의 양으로 존재한다. 조성물은 에멀젼화 비히클, 예컨대 영양 크림 또는 로션, 안정화된 겔 또는 분산 시스템, 처리제 세럼, 리포솜 전달 시스템, 국소적 팩 또는 마스크, 계면활성제계 세정 시스템 예컨대 샴푸 또는 바디 워시, 에어로졸화된 또는 분무된 분산 또는 에멀젼, 헤어 또는 피부 컨디셔너, 스타일링 보조제, 또는 색조 제품 예컨대 메이크업, 뿐만 아니라 다른 적합한 메이크업 및 미용 제제의 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, 담체는 바람직하게는 물, 프로필렌 글리콜, 에탄올, 프로판올, 글리세롤, 부틸렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 것이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 개질 변이체 TGF-BBPI 를 포함하는 헤어 케어용 개인 케어 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 헤어 케어 조성물은 헤어 성장 촉진용이다.
일부 구현예에서, 헤어 케어 조성물은 헤어 성장 촉진에 사용된다. 다른 구현예에서, 조정은 헤어 손실을 수반하는 질환 또는 상태를 겪는 대상에서 헤어 성장을 촉진하는 것을 포함한다. 상기 구현예 중 일부에서, 질환 또는 상태는 염증성 탈모, 반흔성 탈모, 경피증, 진드기 교상, 편평 태선, 건선, 루푸스, 지루성 피부염, 느슨한 모발 증후군, 혈색소침착증, 남성형 탈모, 원형 탈모, 암, 결손 헤어 섬유 생산에 영향을 미치는 상태 및 헤어 생산에 영향을 미치는 환경적 인자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 것이다. 바람직한 구현예에서, 질환은 남성형 탈모 또는 원형 탈모이다.
한 구현예에서, 헤어 케어 조성물은 샴푸, 컨디셔너, 헤어 스타일링 조성물, 헤어 색소, 퍼머넌트 웨이브 제형, 크림, 겔, 무스, 스프레이, 에멀젼, 콜로이드성 현탁액, 액체, 거품 및 고체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 헤어 케어 조성물은 방사선 보호제를 추가로 포함한다. 개인 피부 케어 조성물에 대해 기술된 바와 같이 방사선 보호제는 비-내수성 선스크린, 지속 내수성 선스크린 및 W/S 선스크린으로부터 선택되는 선스크린이다. 다른 구현예에서, 방사선 보호제는 비-내수성 선스크린, 지속 내수성 선스크린 및 W/S 선스크린으로부터 선택되는 선스크린이다.
일부 구현예에서, 개인 헤어 케어 조성물은 본원에서 제시된 바와 같은 개질 변이체 TGFβ-BBPI, 및 생리적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 바람직하게는, TGFβ-BBPI 는 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.0001 중량% 내지 약 5 중량% 의 양으로 존재한다. 또한 바람직하게는, TGFβ-BBPI 는 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.001 중량% 내지 약 0.5 중량% 의 양으로 존재한다. 조성물은 에멀젼화 비히클, 예컨대 영양 크림 또는 로션, 안정화된 겔 또는 분산 시스템, 처리제 세럼, 리포솜 전달 시스템, 국소적 팩 또는 마스크, 계면활성제계 세정 시스템 예컨대 샴푸 또는 바디 워시, 에어로졸화된 또는 분무된 분산 또는 에멀젼, 헤어 또는 피부 컨디셔너, 스타일링 보조제, 또는 색조 제품 예컨대 메이크업, 뿐만 아니라 다른 적합한 메이크업 및 미용 제제의 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, 담체는 바람직하게는 물, 프로필렌 글리콜, 에탄올, 프로판올, 글리세롤, 부틸렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 것이다.
다른 구현예에서, 본 발명의 개인 케어 TGF-BBPI 조성물은 상승된 수준의 TGFβ1 및/또는 TGFβ2 와 연관된 다양한 질환의 치료용이다.
본 발명은 또한 본 발명의 개인 케어 TGF 조성물을 제공하는 단계; 처리할 대상을 제공하는 단계; 및 상기 조성물을 헤어 성장의 촉진이 필요한 부위 내에서 대상에게 적용하는 단계를 포함하는 대상의 헤어 성장의 촉진 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, TGF 조성물은 피부 케어 조성물이다. 다른 구현예에서, FGF 조성물은 헤어 조성물이다. 일부 구현예에서, 헤어 성장의 촉진은 성장이 촉진될 헤어가 얼굴 털, 겨드랑이 털, 다리 털, 몸통 털, 팔 털 및 머리 털로부터 선택되는 대상의 헤어의 성장을 촉진하는 것을 포함한다. 추가의 구현예에서, 본 발명의 TGF 헤어 케어 조성물을 사용하는 헤어 성장의 촉진 방법은 SEQ ID NO:443, 445 및 447 로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 TGF-BBPI 를 포함하는 개인 케어 조성물을 적용하는 것을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 개인 피부 케어 조성물을 제공하는 단계; 처리할 대상을 제공하는 단계; 및 상기 조성물을 대상의 영향받은 피부에 적용하는 단계를 포함하는 피부 장애를 겪는 대상에서 피부 외양 및/또는 상태를 향상시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 피부 장애는 건선, 경피증 및 피부암으로부터 선택된다. 추가의 구현예에서, 본 발명의 TGF 피부 케어 조성물을 사용하여 피부 장애를 겪는 대상에서 피부 외양 및/또는 상태를 향상시키는 방법은 SEQ ID NO: 443, 445 및 447 로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 TGF-BBPI 를 포함하는 개인 케어 조성물을 포함한다.
6.0.5 개질 변이체 TNF α- BBPI 를 포함하는 개인 케어 조성물
조직 괴사 인자 (Tissue Necrosis Factor, TNF) 패밀리의 단백질은 대형 사이토카인 패밀리의 일원이다. 조직 괴사 인자 알파 (Tissue Necrosis Factor α, TNFα) 는 리간드의 TNF 패밀리의 원형 일원이다. TNFα 는 다양한 면역 세포에 의해 생산되고, 면역-매개 염증성 질환에서 핵심적 역할을 한다.
TNFα 는 T-림프구, B 세포, 윤활막세포, 섬유모세포 및 대식세포에 의해 초기에 26kD 단백질로서 합성된다. 그 후 TNFα 는 TNFα 전환 효소 (메탈로프로테이나아제, ADAMS 17) 에 의해 단량체성 17-kD 분자로 절단된다. 상기 분자 중 3 개가 생리적 조건 하에 비공유적으로 결합된 원뿔 형상의 동종삼합체를 형성하고, 이는 2 개의 동종형: TNF 수용체 I (TNF-RI) 및 TNF 수용체 II (TNF-RII) 로 존재하는 막-결합 수용체를 교차-연결한다. TNFα 의 자연적 기능은 감염된 위치로 중성구 및 단핵구의 동원을 자극하고, 이들 세포를 활성화하여 미생물을 근절하는 것이며, 다수의 세포 유형의 표면 상에서 그의 상응하는 TNF 수용체에 결합함으로써 그의 기능을 발휘한다. TNFα 는 혈관 내피를 국부적으로 활성화하여, 혈관확장 및 증가된 투과성을 야기한다. 혈관 내피 부착 분자 (ICAM-1, VCAM-1, E-selectin) 및 MHC 클래스 II 가 상향조절되어 염증촉진성 세포의 동원, 및 면역글로불린 및 보체의 유도를 초래한다. 혈소판이 활성화되고 "더 끈적거리게" 되어, 소형 혈관 폐색 및 감염의 근절을 야기한다. 또한, TNFα 는 대식세포 및 내피 세포가 케모카인을 분비하는 것을 유도하고, 표적 세포의 세포자멸사를 촉진한다. TNFα 는 염증촉진성 사이토카인 예컨대 IL-1, IL-6 및 GM-CSF 의 분비를 유도하는 (NFĸB-매개 메카니즘을 통해) 강한 주변분비 기능을 갖고, 또한 RANTES, IL-8, MCP-1 및 MIP-1α 를 포함하는 다양한 케모카인의 생산을 자극한다. 마지막으로, TNFα 는 류마티스 윤활막의 성장 및 증식에 중요한 혈관신생에서 하나의 역할을 한다.
면역-매개 염증성 질환 (IMID) 은 TNFα 를 포함하는 염증촉진성 사이토카인의 비정상적 생산에 의해 유발된다. 이들 질환은 류마티스 관절염 (RA), 염증성 창자 질환 (IBD) 예컨대 크론병, 만성 판상 건선, 건선 관절염, 혈관염 및 강직척추염을 포함한다.
상기 카테고리 내 여러 질환의 병리생리학에 있어서 2 개의 핵심적 역할자인 TNFα 및 인터루킨 인터루킨-1 (IL-1) 이 확인된, 사이토카인 발현 및 신호전달에 관한 기초적 연구로부터 염증-매개 염증성 질환의 치료에 새로운 발전이 이루어졌다. 예를 들어, RA 를 앓는 환자의 세럼, 윤활막 및 윤활액에서 상기 사이토카인 모두가 상승되는 것으로 밝혀졌다. 더욱이, TNFα 및 IL-1 은 관절염의 실험 모델에서 관절 손상을 유도하고 증대시킬 수 있다. 상기 발견은 그들의 효과를 차단/길항작용하는 전략의 개발을 초래했고, 생물학적 물질에 의한 특이적 표적화가 근래에 가능해졌다. 이러한 1 세대 제품은 사이토카인의 결합에 대해 수용체와 경쟁하는 작용을 하는 단일클론 항체 (mAb) 및 가용성 수용체 융합 단백질을 포함한다.
지금까지, US FDA 는 건선 및 건선 관절염을 포함하는 여러 IMID 의 치료에 있어서의 의료적 용도에 대해 3 개의 TNFα 저해제/차단제를 승인했다. 그들은 에타네르셉트 (Etanercept) (Enbrel®, Amgen-Wyeth), 인간 IgG1 의 Fc 성분에 융합된 TNF 수용체 II 의 완전 인간 키메라 단백질, 인플릭시맙 (Infliximab) (Remicade®, Centocor), 키메라 단일클론 항체, 및 아달리무맙 (Adalimumab) (Humira®, Abbott) 완전 인간 IgG1 항-TNFα 단일클론 항체이다. 상기 물질들의 증명된 초기 효능 및 안전성 프로파일은 시간의 흐름에 따른 효능의 감소, 상기 생물약제학적 물질의 고비용 및 상기 물질에 대한 현재의 바늘 전달에 의해 부과되는 제한에 관한 염려에 대해 평가되어야 한다.
Boyman 과 동료들에 의해 개발된 동물 모델 (Boyman et al., J. Exp. Med. 199:731-736 [2004]) 은 건선의 자발적 발달에 있어서 상주 T-세포 및 TNFα 에 대한 본질적 역할을 입증했다. 이러한 모델에서, 무증상 전-건선 인간 피부 병변이 트랜스제닉 AGR129 마우스로 이식되었다. 이들은 T 세포의 차단이 건선 발달의 저해를 초래함을 밝혔다. 또한 중화 항-인간 TNFα 단일클론 항체 (Infliximab, 정맥내) 또는 TNF 수용체 융합 단백질 (Etanercept, 피하) 의 적용이 건선 표현형 발달의 극적인 저해를 초래함이 밝혀졌다. 이들 결과는 TNFα 길항제가 IMID 질환 발달에 직접적 효과를 갖는다는 생각을 지지하는 역할을 했다.
불행히도, 임의의 입증된 IMID 징후를 겪는 환자의 3 분의 1 이상이 항-TNF 치료로부터 의료적으로 이익을 얻지 못한다 (Wong et al., Clin. Immunol. 126:121-136 [2008]). 이러한 의료적 영역에 접근하는 신규한 치료제의 개발에 있어서 노력이 지속된다. 다양한 항-TNF 단일클론 항체, peg화된 (pegylated) 항체 절편 또는 절단된 TNF 수용체 분자를 포함하는 다수의 "스마트" TNFα 길항제가 현재 임상 시험 중이다. 또한, 삼합체성 사이토카인의 TNFα 서브유닛 소단위 해체를 촉진하는 소형 분자 저해제가 시험관내 결과를 보증하는 것으로 밝혀졌으나 (He et al., Science 310:1022-1025 [2005]), 추가의 의료적 발달은 보고되지 않았다.
건선은 인구의 약 2.8% 에 영향을 미치는 흔한 피부 장애이다 (Linden and Weinstein Am. J. Med. 107:595-605 [1999]). 미국에서 450 만명의 사람이 건선을 겪고, 150 만명이 중등도 내지 중증 판상 건선을 앓는 것으로 추정된다. 이 질환은 피부의 만성 염증이 특징이다. 이러한 염증은 종종 고통스럽고 외양을 흉하게 만드는 붉은색, 가려운 피부 판의 형성을 유도한다. TNF-α 는 염증 유발자인 IL-1 및 IL-8 의 합성을 유도하기 때문에 피부 판의 형성 및 지속적 존재에서 중요한 역할을 한다. TNF-α 농도는 건선 환자의 영향받지 않은 피부에서보다 건선 병변에서 더 높고, 효과적 치료 이후 병변의 소멸과 함께 감소하는 경향이 있다 (Mussi et al., J. Biol. Regul. Homeost. Agents 11:115-118 [1997]). TNF-α 는 또한 각질세포 증식 및 혈관신생을 촉진하므로 (Asadullah et al., Drugs today 35:913-924 [1999]), 이 사이토카인의 저해는 여러 단계에서 질환을 정지시킬 것이다.
전통적으로, 중등도 건선의 제 1 선 치료는 국소적 물질로 이루어지는데 이는 그들이 신부전 또는 간부전과 같은 대부분의 심각한 부작용의 낮은 발생률과 함께 전신 요법보다 흔히 덜 침습적이기 때문이다 (Kincaid (2005) Drug discovery today 10:884). 일부 물질 예컨대 항갑상선 티오우레일렌, 프로필티오우라실 및 메티마졸이 건선 환자의 치료에 효과적이고, 상당한 수의 환자가 여러 주의 치료 이후 병변의 소멸 또는 대부분의 소멸을 나타냈다. 신규한 항-TNFα 생물제제, 엔브렐 (Enbrel), 레미케이드 (Remicade) 및 휴미라 (Humira) 에 의한 전신 치료가 중등도 내지 중증 만선 판상 건선에 대해 승인되었다. 상기 물질로 치료받은 환자는 매우 흔히 질환의 현저한 개선을 보였고 몇몇 경우에는 대부분 소멸했다 (Chaudhari et al., Lancet 357:1842-1847 [2001]; Leonardi et al., N. Engl. J. Med. 349:2014-2022 [2003]). 그러나 현재의 질환 요법은 특별히 만족스럽지 않고, 현재 사용되는 많은 요법은 상당한 누적적 독성과 연관된다 (Gottlieb et al., J Am Acad Dermatol. 48:829-835 [2003]). TNFα 차단 물질과 연관된 위험은 심각한 감염, 암, 과민증, B 형 간염 재활성화, 탈수초병, 혈구감소증, 심부전 및 루푸스-유사 증후군을 포함한다. 또한, 약물을 중단한 이후 임상적 이익의 소실이 관찰되었고, 적은 비율의 환자가 반복 사용시 생물학적 물질의 효능을 제한할 수 있는 생물학적 물질에 대한 항체를 발달시킨다.
크기가 너무 작아서 훨씬 덜 면역원성일 것으로 추정되는 조작된 개질 변이체 BBPI 와 같은 단백질은 환자에서 중화 항체의 발달에 관한 염려를 상당히 감소시킬 것이다. 항체 또는 단백질 융합에 비해 감소된 분자량으로 인해 BBPI 분자는 국소적 경로를 통한, 또는 피하 주사 또는 무바늘 전달 방법과 같은 덜 침습적 전신 투여를 통한 전달에 더욱 적합할 것이다.
본 발명은 개질 변이체 TNF-BBPI 를 포함하는 피부 및/또는 헤어 케어용 개인 케어 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, TNF-BBPI 를 포함하는 개인 케어 조성물은 피부 염증성 장애를 겪는 대상의 헤어 성장의 촉진 및/또는 피부 상태의 향상용이다. 일부 구현예에서, 염증성 피부 장애는 피부염, 습진, 건선, 여드름, 주사코 및 두드러기로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 피부과 염증성 장애는 건선이다. 따라서, 본 발명은 개인 피부 케어 및/또는 헤어 케어 조성물을 제공한다. 본 발명의 개인 케어 조성물 내에 포함된 TNF-BBPI 는 그 안에서 TNF-5-BBPI 의 전구체 스캐폴드의 동등한 키모트립신 루프가 TNF 변이체 펩티드에 의해 대체되고, 섹션 5.4.1 및 5.4.2 에서 기술된 바와 같이 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하는 개질 변이체 BBPI 이다. 본 발명에서, TNFα 에 대한 개질 변이체 TNF-BBPI 의 결합은 TNFα 가 그의 동족 수용체와 상호작용하는 것을 방지하고, 두피의 TNFα-유도된 염증을 저해하고 헤어 손실을 방지한다. 일부 구현예에서, TNFα 에 대한 개질 변이체 TNF-BBPI 의 결합은 본원에서 언급된 피부 염증성 장애 예를 들어 건선을 겪는 대상에서 피부의 염증을 감소시키고 피부의 상태를 향상시킨다. 그러나, 본 발명은 임의의 특정 메카니즘에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, TNF-BBPI 조성물 내에 포함된 TNF 변이체 펩티드는 RYWQDIP (T1; SEQ ID NO:474), APEPILA (T2; SEQ ID NO:475), DMIMVSI (T3; SEQ ID NO:476), WTPKPTQ (SEQ ID NO:583), ATFPNQS (SEQ ID NO:584), ASTVGGL (SEQ ID NO:585), TMLPYRP (SEQ ID NO:586), AWHSPSV (SEQ ID NO:587), TQSFSS (SEQ ID NO:588), THKNTLR (SEQ ID NO:589), GQTHFHV (SEQ ID NO:590), LPILTQT (SEQ ID NO:591), SILPVSH (SEQ ID NO:592), SQPIPI (SEQ ID NO:593) 및 QPLRKLP (SEQ ID NO:594) 로부터 선택된다. 다른 구현예에서, TNF 변이체 펩티드는 SEQ ID NO:483, 484 및 485 로부터 선택된다.
그 안에 변이체 TNF 펩티드가 도입되어 동등한 키모트립신 루프를 대체하는 스캐폴드는 글리신 맥스로부터의 콩 저해제의 스캐폴드 (BBI; SEQ ID NO:13) 또는 그의 성숙 및 절단된 형태 (SEQ ID NO:185), 돌리코스 비플로루스로부터의 저해제 (BBdb; SEQ ID NO:449), 글리신 맥스로부터의 콩 저해제 D-II (BBsb3; SEQ ID NO:450), 토레세아 (암부라나) 세아렌시스로부터의 저해제 (BBtc; SEQ ID NO:451), (SEQ ID NO:186) 의 BBI-AV 스캐폴드, (SEQ ID NO:187) 의 BBIt-AV 스캐폴드, (SEQ ID NO:452) 의 BBdb-AV 스캐폴드, (SEQ ID NO:453) 의 BBsb3-AV 스캐폴드, (SEQ ID NO:454) 의 BBtc-AV 스캐폴드, (SEQ ID NO:640) 의 BBIt-VEGK 스캐폴드, (SEQ ID NO:641) 의 BBIt-VEGT 스캐폴드 및 (SEQ ID NO:642) 의 BBIt-VEGKD 스캐폴드로부터 선택된다. 또한, 임의의 야생형 BBPI 전구체 스캐폴드, 예컨대 Prakash et al. (상기 참조) 에 의해 개시된 것들이 변이체 BBPI 스캐폴드를 생성하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, VEGF-BBPI 의 스캐폴드는 SEQ ID NO:187 의 것이다. 일부 구현예에서, 개질 변이체 TNF-BBPI 의 골격은 섹션 5.4.1 에서 언급된 바와 같이 SEQ ID NO:187 의 변이체 BBI 의 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 및 65 와 동등한 위치로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 다른 구현예에서, 개질 변이체 TNF-BBPI 의 골격은 섹션 5.4.2 에서 언급된 바와 같이 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 개의 아미노산 치환의 조합으로부터 선택되는 아미노산 치환의 조합을 포함한다.
다른 구현예에서, 개질 변이체 TNF-BBPI 의 골격은 SEQ ID NO:187 내 동등한 위치에서 13I-29P-50T-52A, 13I-40K-50T-52A, 13I-25K-29P-52K, 13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T, 13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q, 13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L 로부터 선택되는 아미노산 치환의 조합으로부터 선택되는 아미노산 치환의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 개인 케어 조성물은 그 안에서 전구체 스캐폴드의 동등한 키모트립신 루프가 SEQ ID NO:474, 475 및 476 으로부터 선택되는 TNF 변이체 펩티드로 대체되고 (여기서 스캐폴드는 SEQ ID NO:187 의 것임), 아미노산 치환의 조합 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T 를 포함하는 BBPI 를 포함한다.
일부 구현예에서, 개인 케어 조성물은 SEQ ID NO:647, 648 및 649 의 TNF-BBPI 로부터 선택되는 TNF-BBPI 를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 TNF 에 결합하는 TNF-BBPI 를 포함하는 개인 케어 조성물을 제공한다. 대안적 구현예에서, TNF 에 대한 TNF-BBPI 의 결합은 TNF 의 하류 활성을 차단한다. 일부 구현예에서, 조성물은 염증을 조정할 수 있다.
일부 구현예에서, 개질 변이체 BBPI-TNF 를 포함하는 개인 케어 조성물은 피부 케어용이다. 일부 구현예에서, 피부 케어 조성물은 피부 장애를 겪는 대상에서 피부 외양 및/또는 상태의 향상용이다. 따라서, 일부 구현예에서, 피부 케어용 개인 케어 조성물은 미용 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 피부 장애는 염증성 피부 장애이다. 일부 구현예에서, 염증성 피부 장애는 건선이다.
한 구현예에서, TNF-BBPI 를 포함하는 개인 케어 조성물은 피부 크림, 로션, 스프레이, 에멀젼, 콜로이드성 현탁액, 거품, 에어로졸, 액체, 겔, 세럼 및 고체로부터 선택되는 피부 케어 조성물이다. 또 다른 구현예에서, 개인 케어 조성물은 보습 바디 워시, 바디 워시, 살균 세정제, 피부 보호 크림, 바디 로션, 얼굴 크림, 보습 크림, 얼굴 세정 에멀젼, 얼굴 겔, 얼굴 세럼, 계면활성제계 얼굴 세정제, 얼굴 박리 겔, 여드름 방지 처리제, 얼굴 토너, 박리 크림, 얼굴 마스크, 애프터 쉐이브 밤, 프리-쉐이브 밤, 태닝 조성물, 피부 미백 조성물, 피부 발진 감소 조성물, 선스크린, 제모제, 헤어 성장 저해제 및 방사선 보호제로부터 선택되는 피부 케어 조성물이다. 방사선 보호제는 비-내수성 선스크린, 지속 내수성 선스크린 및 W/S 선스크린으로부터 선택된다.
한 구현예에서, TNF-BBPI 를 포함하는 개인 케어 조성물은 국소적으로 적용되는 비처방전 조성물, 진균 방지 처리제, 여드름 방지 처리제, 피부 보호제, 선스크린, 데오도란트 및 발한 억제제를 포함하는 피부 케어 조성물이다. 다른 구현예에서, 피부 케어 조성물은 피부 톤을 밝히고, 발진을 감소시키고, 피부 톤을 어둡게하는 것을 방지하고 또는 색 발달을 방지할 수 있다.
본 발명은 또한 미용 조성물인 개인 케어 조성물을 제공한다. 일부 바람직한 구현예에서, 미용 조성물은 마스카라, 압축 파우더 제형 및 파운데이션으로부터 선택된다. 일부 바람직한 구현예에서, 메이크업 조성물은 하나 이상의 안료를 포함한다.
일부 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 안료를 포함하는 메이크업 조성물은 비-방수 마스카라, 방수 마스카라, 부피 증대 마스카라, 길이 연장 마스카라, 컬링 마스카라, 무수 방수 마스카라, 수-기반 마스카라 및 속눈썹 또는 눈썹 처리제로부터 선택되는 마스카라이다.
또 추가의 구현예에서, 메이크업 조성물은 루스 파우더, 블러쉬, 아이 섀도우 및 브론징 파우더로부터 선택되는 압축 파우더 제형이다. 또 추가의 구현예에서, 메이크업 조성물은 유중수 파운데이션, W/S 파운데이션, 수중유 파운데이션, 무수메이크업 스틱 및 크림-투-파우더 파운데이션으로부터 선택되는 파운데이션이다.
일부 구현예에서, 개인 피부 케어 조성물은 본원에서 제시된 바와 같은 개질 변이체 TNF-BBPI, 및 생리적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 바람직하게는, TNF-BBPI 는 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.0001 중량% 내지 약 5 중량% 의 양으로 존재한다. 또한 바람직하게는, TNF-BBPI 는 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.001 중량% 내지 약 0.5 중량% 의 양으로 존재한다. 조성물은 에멀젼화 비히클, 예컨대 영양 크림 또는 로션, 안정화된 겔 또는 분산 시스템, 처리제 세럼, 리포솜 전달 시스템, 국소적 팩 또는 마스크, 계면활성제계 세정 시스템 예컨대 샴푸 또는 바디 워시, 에어로졸화된 또는 분무된 분산 또는 에멀젼, 헤어 또는 피부 컨디셔너, 스타일링 보조제, 또는 색조 제품 예컨대 메이크업, 뿐만 아니라 다른 적합한 메이크업 및 미용 제제의 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, 담체는 바람직하게는 물, 프로필렌 글리콜, 에탄올, 프로판올, 글리세롤, 부틸렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 것이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 TNF 변이체 펩티드 (TNF-BBPI) 를 포함하는 개질 변이체 BBPI 를 포함하는 헤어 케어용 개인 케어 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 헤어 케어 조성물은 건선을 겪는 환자에서 두피 피부 외양 및/또는 상태의 향상에 사용된다.
한 구현예에서, 헤어 케어 조성물은 샴푸, 컨디셔너, 헤어 스타일링 조성물, 헤어 색소, 퍼머넌트 웨이브 제형, 크림, 겔, 무스, 스프레이, 에멀젼, 콜로이드성 현탁액, 액체, 거품 및 고체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 헤어 케어 조성물은 방사선 보호제를 추가로 포함한다. 개인 피부 케어 조성물에 대해 기술된 바와 같이 방사선 보호제는 비-내수성 선스크린, 지속 내수성 선스크린 및 W/S 선스크린으로부터 선택되는 선스크린이다. 다른 구현예에서, 방사선 보호제는 비-내수성 선스크린, 지속 내수성 선스크린 및 W/S 선스크린으로부터 선택되는 선스크린이다.
일부 구현예에서, 개인 헤어 케어 조성물은 본원에서 제시된 바와 같은 개질 변이체 VEGF-BBPI, 및 생리적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 바람직하게는, VEGF-BBPI 는 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.0001 중량% 내지 약 5 중량% 의 양으로 존재한다. 또한 바람직하게는, VEGF-BBPI 는 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.001 중량% 내지 약 0.5 중량% 의 양으로 존재한다. 조성물은 에멀젼화 비히클, 예컨대 영양 크림 또는 로션, 안정화된 겔 또는 분산 시스템, 처리제 세럼, 리포솜 전달 시스템, 국소적 팩 또는 마스크, 계면활성제계 세정 시스템 예컨대 샴푸 또는 바디 워시, 에어로졸화된 또는 분무된 분산 또는 에멀젼, 헤어 또는 피부 컨디셔너, 스타일링 보조제, 또는 색조 제품 예컨대 메이크업, 뿐만 아니라 다른 적합한 메이크업 및 미용 제제의 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, 담체는 바람직하게는 물, 프로필렌 글리콜, 에탄올, 프로판올, 글리세롤, 부틸렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 것이다.
6.1.1 제형
추가적 바람직한 구현예에서, 본 발명은 본원에 설명된 바와 같은 하나 이상의 개질 변이체 BBPI 및 생리학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 미용 및/또는 약학 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 화합물은 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.0001 중량% 내지 약 5 중량% 의 양으로 존재한다. 또한 바람직하게는, 화합물은 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.001 중량% 내지 약 0.5 중량% 의 양으로 존재한다. 조성물은 에멀젼화된 비히클의 형태, 예컨대 영양 크림 또는 로션, 안정화된 겔 또는 분산계, 트리트먼트 세럼, 리포솜 전달계, 국부적 팩 또는 마스크, 계면활성제계 세정계, 예컨대 샴푸 또는 바디 워시, 에어로졸화 또는 스프레이화 분산액 또는 에멀젼, 헤어 또는 피부 컨디셔너, 스타일링 보조제 또는 유색 제품, 예컨대 메이크업일 수 있다. 바람직하게는, 담체는 물, 프로필렌 글리콜, 에탄올, 프로판올, 글리세롤, 부틸렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물이다.
본 발명이 다수의 개인 케어 조성물에서 사용될 것이라고 고려된다. 본 발명이 임의의 특정 포맷 또는 유형의 조성물에 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 하기 설명은 하기 발명을 포함하는 예시적인 비제한적 조성물을 제공한다.
에멀젼은 종래의 통상-사용되는 화장품 중 하나의 군을 포함한다. 용어 "에멀젼" 은 일반적으로 비혼화성이거나 서로 한정된 정도로만 혼화성인 두 액체의 불균질계에 대해 사용되고, 이는 통상 "상" 으로서 지칭된다. 하나의 상은 전형적으로 액적의 형태 (즉, "분산된", "불연속" 또는 "내부" 상) 인 반면, 다른 액체는 연속 (즉, "일관된" 또는 "외부") 상을 형성한다. 적용의 보다 적은 통상적인 형태는 복합 에멀젼 (즉, 분산된 (또는 불연속) 상의 액적이 추가의 분산상의 일부 액적을 포함하는 것, 예컨대 수/유/수 [W/O/W] 에멀젼 및 유/수/유 [O/W/O] 에멀젼) 을 포함한다.
유상이 수상에 미세하게 분포되어 있는 경우, 이는 수중유 에멀젼 (O/W 에멀젼; 예를 들어 밀크) 이다. O/W 에멀젼의 기본 특징은 물에 의해 결정된다. 이러한 에멀젼은 일반적으로 피부에 대해 기름기가 적고, 오히려 매트하며, W/O (유중수) 에멀젼보다 피부에 신속하게 흡수된다.
당업자는 크림 및 연고 (이들은 실온 내지 피부 온도의 범위에서 확산가능함) 뿐만 아니라 로션 및 밀크 (이들은 상기 온도 범위에서 더욱 유동성임) 를 포함하는, 미용 및/또는 피부과 용도를 위한 안정한 W/O 제제의 제형화에 대한 다수의 선택을 잘 알고 있다.
에멀젼의 안정성은 이의 점도, 특히 외부상의 점도에 따라 다르다. 에멀젼은 미세하게 분산된 입자가 함께 수집되어 비교적 큰 응집물을 형성하고, 접촉하는 액적이 합쳐지는 경우 불안정하게 된다. 이러한 과정을 "합체" 라고 지칭한다. 에멀젼의 외부상이 더욱 점성일수록, 합체의 과정은 더욱 느려진다. "액체" (= 유동성) 농도의 에멀젼은 다양한 화장품 (예를 들어, 피부 케어 로션, 세정 로션, 얼굴 로션, 핸드 로션 등) 에 사용된다. 이러한 조성물은 일반적으로 점도가 약 2000 mPa·s 내지 약 10,000 mPa·s 이다. 유동성 에멀젼의 안정성은 특정한 관심을 받을만한데, 입자의 상당히 큰 이동성이 더욱 신속한 합체를 촉진시키기 때문이다.
현재 통상 사용되는 액체 에멀젼이 일반적으로 증점제를 포함하고, 비교적 높은 전해질 농도에 대해 안정하지 않다는 것이 알려져 있다. 이는 조성물의 상분리에서 분명해진다. 그러나, 일부 구현예에서, 특정 전해질 (예를 들어, 수용성 UV 필터) 을 사용하여 다른 물리적, 화학적 또는 생리적 특성을 이용할 수 있는 것이 바람직하다. 다수의 경우 에멀젼화제계의 적절한 선택이 어느 정도로 해결책을 제공할 수 있으나, 다른 단점이 종종 발생한다.
예를 들어, 에멀젼화제가 궁극적으로 임의의 화학 물질과 같이 사용자의 과민감성 (즉, 과민성) 에 대한 반응 또는 알레르기 반응을 촉발시킬 수 있기 때문에, 일부 단점이 발생한다. 일부 개인에 대해 "저자극성" 조성물이 필요하고/하거나 바람직하더라도, 종래의 미용 에멀젼화제의 사용은 일반적으로 전부 위험없이 존재한다. 실제로, 일부 특히 민감한 개인에 있어서, 특정 피부병이 특정 에멀젼화제에 대한 노출 및 햇빛에 대한 동시 노출에 의해 촉발된다. 따라서, 당업자에게 알려져 있는 바와 같이, 일부 조성물에서, 특정 에멀젼화제가 덜 바람직하고/하거나 이것이 회피된다.
에멀젼화제가 없는 제제를 제조하는 것이 가능하다. 예를 들어, 일부 제제는 분산된 물 액적을 함유하는 유상 (즉, W/O 에멀젼과 유사함) 을 가진다. 이러한 계는 종종 분산상 및 연속상에 따라 "수분산액" 또는 "인조분산액" 이라고 불린다.
그러나, 미용 기술을 위해, 특히 약한 에멀젼화제의 특정 선택이 존재하기 때문에, 전적으로 에멀젼화제로 분산시키는 것이 필요하지 않고 가능하지 않다.
일부 리포솜 구현예에서, 리포솜은 물, 및 하나 이상의 기능성 또는 활성 성분(들)을 유지할 수 있는 지질 이중층 소낭을 형성할 수 있는 하나 이상의 성분을 포함한다. 지질 이중층 소낭을 형성할 수 있는 성분의 비제한적 예는 인지질, 수소화 포스파티딜콜린, 레시틴, 콜레스테롤 및 스핑고지질을 포함한다. 바람직한 리포솜은 제한없이 a) 리포이드 리포솜 0003 (물 및 레시틴 및 글리세린으로 구성됨); b) 리포이드 리포솜 0300 (물 및 포스파티딜콜린으로 구성됨); c) 리포이드 리포솜 0111 (물, 은행잎 추출물, 변성 알코올, 수소화 레시틴 및 콜레스테롤로 구성됨); d) 항자극성 리포솜 (물, 콜라나무 씨 추출물, 비사볼올 및 인지질로 구성됨); e) 비타민 C 및 E 리포솜 (물, 인지질, 토코페릴 아세테이트 및 아스코르빌 팔미테이트로 구성됨); f) 퍼밍 (firming) 리포솜 (물, 부틸렌 글리콜, 파이루스 말루스 (사과) 추출물, 인지질, 토코페릴 아세테이트 및 카보머로 구성됨); 및 g) 보습 리포솜 (물, 나트륨 PCA, 토코페릴 아세테이트, 잔탄검, 아르기닌, 리신, 글리신 및 프롤린으로 구성됨) 을 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 개인 케어 조성물은 본원에서 제공되는 스캐폴드에 더해 하나 이상의 활성 성분을 추가로 포함한다. 본 발명의 개인 케어 조성물에서 사용되는, 당업자에게 알려진 다수의 활성 성분이 존재한다. 실제로, 임의의 적합한 활성 성분 또는 적합한 활성 성분의 조합이 본 발명에서 사용될 것이라고 고려된다 (예를 들어, McCutcheon's Functional Materials, North American and International Editions, MC Publishing Co. [2003] 출판 참조). 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원의 개인 케어 조성물은 조성물의 약 0.0001 중량% 내지 약 20 중량% 의 수준으로 피부 케어 활성 성분을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 개인 케어 조성물은 조성물의 약 0.001 중량% 내지 약 0.5 중량% 의 피부 케어 활성 성분을 포함한다. 또한 다른 구현예에서, 개인 케어 조성물은 조성물의 약 0.01 중량% 내지 약 2 중량% 의 피부 케어 활성 성분을 포함한다.
리포솜을 통해 전달될 수 있는 기능성 또는 활성 성분의 비제한적 예는 비타민 및 이의 유도체, 항산화제, 단백질 및 펩티드, 각질 용해제, 바이오플라비노이드, 테르페노이드, 피토케미칼, 및 식물, 해양 또는 발효 기원의 추출물을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 조성물은 추가로 피부 케어 또는 헤어 케어 활성물을 포함한다. 활성 성분은 당업계에 알려진 것과 같은 임의의 광범위한 성분을 포함할 수 있다 (예를 들어, McCutcheon's Functional Materials, North American and International Editions, (2003), MC Publishing Co. 출판 참조). 바람직하게는, 이러한 활성물은 제한없이, 본원에 제공되고/되거나 당업계에 알려져 있는 바와 같은, 항산화제, 예컨대 토코페릴 및 아스코르빌 유도체, 바이오플라비노이드, 테르페노이드, 합성물 등, 비타민 및 비타민 유도체, 히드록실- 및 폴리히드록시산 및 이의 유도체, 예컨대 AHA 및 BHA 및 이들의 반응 생성물, 펩티드 및 폴리펩티드 및 이들의 유도체, 예컨대 글리코펩티드 및 친유화 펩티드, 열충격 단백질 및 사이토카인, 효소 및 효소 저해제 및 이들의 유도체, 예컨대 프로테아제, MMP 저해제, 카탈라아제, 글루코오스 옥시다제 및 과산화물 제거효소, 아미노산 및 이의 유도체, 버섯, 조류 및 해초 및 이들의 유도체를 비롯한 세균, 진균 및 효모 발효 생성물 및 이들의 유도체, 피토스테롤 및 식물 및 식물 부분 추출물 및 이들의 유도체 및 인지질 및 이의 유도체, 비듬 방지제, 예컨대 아연 피리티온 및 이들을 함유하는 전달계를 포함한다.
일부 바람직한 구현예에서, 피부 케어 활성물은 비타민 B3 성분, 판테놀, 비타민 E, 비타민 E 아세테이트, 레티놀, 레티닐 프로피오네이트, 레티닐 팔미테이트, 레티노산, 비타민 C, 테오브로민, 알파-히드록시산, 파르네솔, 피트란트리올, 살리실산, 팔미틸 펩타펩티드-3 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 바람직한 구현예에서, 비타민 B3 성분은 니아신아미드이다. 일부 구현예에서, 본원에서 제공되는 조성물은 약 0.0001 중량% 내지 약 20 중량%, 바람직하게는 약 0.001 중량% 내지 약 0.5 중량%, 더욱 바람직하게는 약 0.01 중량% 내지 약 1 중량% 의 수준으로 피부 케어 활성물을 포함한다.
상기 비타민 B3 화합물의 예시적인 유도체는 니코틴산의 비-혈관이완성 에스테르를 비롯한 니코틴산 에스테르, 니코티닐 아미노산, 카르복실산의 니코티닐 알코올 에스테르, 니코틴산 N-옥시드 및 니아신아미드 N-옥시드를 포함한다. 적합한 니코틴산의 에스테르는 C1-C22, 바람직하게는 C1-C16, 더욱 바람직하게는 C1-C6 알코올의 니코틴산 에스테르를 포함한다. 이러한 구현예에서, 알코올은 적합하게는 직쇄 또는 분지쇄, 시클릭 또는 비시클릭, 포화 또는 불포화 (방향족 포함), 및 치환 또는 비치환된다. 에스테르는 바람직하게는 비-혈관이완성이다.
니코틴산의 비-혈관이완성 에스테르는 토코페롤 니코티네이트 및 이노시톨 헥사니코티네이트를 포함하고; 토코페롤 니코티네이트가 바람직하다. 비타민 B3 화합물의 더욱 완벽한 설명은 WO 98/22085 에 제공되어 있다. 바람직한 비타민 B3 화합물은 니아신아미드 및 토코페롤 니코티네이트를 포함한다.
추가적 구현예에서, 피부 케어 활성물은 하나 이상의 레티노이드를 포함한다. 레티노이드는 바람직하게는 레티놀, 레티놀 에스테르 (예를 들어, 레티닐 팔미테이트, 레티닐 아세테이트, 레티닐 프로피오네이트를 비롯한 레티놀의 C2 - C22 알킬 에스테르), 레티날, 및/또는 레티노산 (올-트랜스 레티노산 및/또는 13-시스-레티노산 포함) 이고, 더욱 바람직하게는 레티노산 이외의 레티노이드이다. 이러한 화합물은 당업계에 잘 알려져 있고, 다수의 공급원 (예를 들어, Sigma 및 Boehringer Mannheim) 으로부터 시판된다. 바람직한 레티노이드는 레티놀, 레티닐 팔미테이트, 레티닐 아세테이트, 레티닐 프로피오네이트, 레티날, 레티노산 및 이들의 조합을 포함한다. 레티놀, 레티노산 프로피오네이트, 레티노산 및 레티닐 팔미테이트가 더욱 바람직하다. 일부 구현예에서, 레티노이드는 실질적으로 순수한 물질로서 포함되는 반면, 다른 구현예에서, 이는 천연 (예를 들어, 식물) 원천으로부터의 적합한 물리적 및/또는 화학적 단리에 의해 수득되는 추출물로서 제공된다. 레티노이드가 본원의 조성물에 포함되는 경우, 바람직하게는 약 0.005% 내지 약 2%, 바람직하게는 약 0.01% 내지 약 1% 레티노이드를 포함한다. 레티놀은 바람직하게는 약 0.01% 내지 약 0.15% 의 양으로 사용되고; 레티놀 에스테르는 바람직하게는 약 0.01% 내지 약 2% (예를 들어, 약 1%) 의 양으로 사용된다.
본 발명의 또한 추가의 구현예에서, 항산화제는 개인 케어 조성물에 혼입된다. 임의의 적합한 항산화제가 본 발명의 개인 케어 조성물에서 사용될 것이라고 고려된다. 적합한 항산화제는, 제한없이, 아미노산 (예를 들어, 글리신, 히스티딘, 티로신 및 트립토판) 및 이의 유도체, 이미다졸 (예를 들어 우로칸산) 및 이의 유도체, 펩티드 (예를 들어, D,L-카르노신, D-카르노신 및 L-카르노신) 및 이의 유도체 (예를 들어, 안세린), 카로테노이드, 카로틴 (예를 들어, α-카로틴, β-카로틴 및 γ-리코펜) 및 이의 유도체, 클로로겐산 및 이의 유도체, 아우로티오글루코오스, 프로필티오우라실 및 기타 티올 (예를 들어, 티오레독신, 글루타티온, 시스테인, 시스틴, 시스타민 및 글리코실, 이들의 N-아세틸, 메틸, 에틸, 프로필, 아밀, 부틸 및 라우릴, 팔미토일, 올레일, g-리놀레일, 콜레스테릴 및 글리세릴 에스테르) 및 이들의 염, 디라우릴 티오디프로피오네이트, 디스테아릴 티오디프로피오네이트, 티오디프로피온산 및 이의 유도체 (예를 들어, 에스테르, 에테르, 펩티드, 지질, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드 및 염), 및 아주 적은 용인 용량 (예를 들어, 국부적으로 pmol 내지 mmol/㎏) 의 술폭시민 화합물 (예를 들어 부티오닌 술폭시민, 호모시스테인 술폭시민, 부티오닌 술폰, 펜타-, 헥사- 및 헵타티오닌 술폭시민), 킬레이트제 (예를 들어, α-히드록시 지방산, 팔미트산, 피트산 및 락토페린), α-히드록시산 (예를 들어 시트르산, 락트산 및 말산), 부식산, 담즙산, 담즙 추출물, 빌리루빈, 빌리베르딘, EDTA, EGTA 및 이의 유도체, 불포화 지방산 및 이의 유도체 (예를 들어, 리놀렌산, 리놀레산, 올레산), 엽산 및 이의 유도체, 푸르푸릴리덴소르비톨 및 이의 유도체, 유비퀴논 및 유비퀴놀 및 이의 유도체, 비타민 C 및 이의 유도체 (예를 들어, 나트륨 아스코르빌 포스페이트, 아스코르빌 팔미테이트, Mg 아스코르빌 포스페이트 및 아스코르빌 아세테이트), 토코페롤 및 유도체 (예를 들어, 비타민 E 아세테이트), 벤조인 수지의 코니페릴 벤조에이트, 페룰산, 푸르푸릴리덴글루시톨, 카르노신, 부틸히드록시톨루엔, 부틸히드록시아니솔, 노르디히드로구아이악산, 노르디히드로구아이아레트산, 트리히드록시부티로페논, 요산 및 이의 유도체, 만노오스 및 이의 유도체, 아연 및 이의 유도체 (예를 들어, ZnO, ZnSO4), 셀레늄 및 이의 유도체 (예를 들어, 셀레노메티오닌), 스틸벤 및 이의 유도체 (예를 들어, 스틸벤 옥시드, 트랜스-스틸벤 옥시드) 및 본 발명의 특정 구현예(들)의 사용 의도에 적합한 상기 활성 성분의 유도체 (예를 들어, 염, 에스테르, 에테르, 당, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 펩티드 및 지질) 를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 중 하나 이상의 항산화제의 농도는 제제의 총 중량을 기준으로 바람직하게는 약 0.001 내지 약 30 중량%, 특히 바람직하게는 약 0.05 내지 약 20 중량%, 더욱 바람직하게는 약 1 내지 약 10 중량% 이다. 비타민 E 및/또는 이의 유도체가 항산화제(들)로서 사용되는 추가적 구현예에서, 바람직한 범위는 제형의 총 중량을 기준으로 약 0.001 내지 약 10 중량% 이다. 그러나, 다양한 농도가 본 발명의 다양한 구현예에서 사용될 것인 것과 같이, 본 발명이 임의의 특정 항산화제 농도(들)에 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
또한 일부 추가적 구현예에서, 활성 성분(들)은 카테킨, 카테킨의 담즙 에스테르 및/또는 카테킨 또는 카테킨의 담즙 에스테르의 함유물을 갖는 식물 또는 식물 섹션 (예를 들어, 차나무과 잎, 특히 차나무 [녹차] 종의 잎) 으로부터의 수성 또는 유기 추출물이다. 이의 전형적인 성분 (예를 들어, 폴리페놀 또는 카테킨, 카페인, 비타민, 당, 미네랄, 아미노산, 지질) 이 본 발명의 일부 구현예에서 특히 사용된다.
일부 구현예에서, 카테킨은 본 발명에서 사용된다. 카테킨은 수소화 플라본 또는 안토시아니딘으로서 간주되는 화합물의 군이고, "카테킨" 의 유도체이다 (카테콜, 3,3',4',5,7-플라반펜톨, 2-(3,4-디히드록시페닐)크로만-3,5,7-트리올). 에피카테킨 ((2R,3R)-3,3',4',5,7-플라반펜톨) 은 또한 본 발명의 일부 구현예에서 사용되는 활성 성분이다.
또한 추가의 구현예에서, 카테킨의 함유물을 갖는 식물 추출물, 특히 녹차의 추출물 (예를 들어, 동맥나무 족의 식물의 잎으로부터의 추출물, 특히 차에 사용되는 것들, 예컨대 C. 시네니스 (C. sinenis), C. 아사미카 (C. assamica), C. 탈리엔시스 (C. taliensis) 및 C. 이라와디엔시스 (C. irrawadiensis) 및 이러한 종과 다른 종의 잡종, 예컨대 C. 자포니카 (C. japonica)) 이 본 발명의 일부 개인 케어 조성물에서 사용된다.
일부 추가적 구현예에서, 바람직한 활성 성분은 (-)-카테킨, (+)-카테킨, (-)-카테킨 갈레이트, (-)-갈로카테킨 갈레이트, (+)-에피카테킨, (-)-에피카테킨, (-)-에피카테킨 갈레이트, (-)-에피갈로카테킨 및 (-)-에피갈로카테킨 갈레이트의 군으로부터의 카테킨 및 폴리페놀을 포함한다.
본 발명의 조성물의 일부 추가적 구현예에서, 플라본 및 이의 유도체 (또한 종종 "플라본" 으로 총괄하여 칭함) 가 사용된다. 이러한 화합물은 하기 기본 구조를 가진다 (치환 위치를 나타냄):
Figure pct00020
.
본 발명의 일부 개인 케어 조성물에서 사용되는 더욱 중요한 플라본 일부를 하기에 제공한다. 그러나, 본 발명이 임의의 특정 플라본에 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
Figure pct00021
천연에서, 플라본은 통상 글리코실화 형태로 존재한다.
일부 추가의 구현예에서, 본 발명의 개인 케어 조성물은 하기 일반 구조식을 갖는 하나 이상의 플라보노이드를 포함한다:
Figure pct00022
(식 중, Z1 내지 Z7 은, 서로 독립적으로, H, OH, 알콕시 및 히드록시알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 알콕시 및 히드록시알콕시기는 분지형 또는 비분지형일 수 있고, 탄소수가 1 내지 18 이며, 상기 Gly 는 모노- 및 올리고글리코시드 라디칼의 군으로부터 선택됨).
일부 대안적인 구현예에서, 본 발명의 개인 케어 조성물은 하기 일반 구조식을 갖는 하나 이상의 플라보노이드를 포함한다:
Figure pct00023
(식 중, Z1 내지 Z6 은, 서로 독립적으로, H, OH, 알콕시 및 히드록시알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 알콕시 및 히드록시알콕시기는 분지형 또는 비분지형일 수 있고, 탄소수가 1 내지 18 이며, 상기 Gly 는 모노 및 올리고글리코시드 라디칼의 군으로부터 선택됨).
일부 바람직한 구현예에서, 조성물은 하기 일반 구조식을 가진다:
Figure pct00024
(식 중, Gly1, Gly2 및 Gly3 은, 서로 독립적으로, 모노글리코시드 라디칼이고, Gly2 및 Gly3 은 또한, 개별적으로 또는 함께, 수소 원자에 의한 포화를 나타낼 수 있음). 일부 바람직한 구현예에서, Gly1, Gly2 및 Gly3 은, 서로 독립적으로, 헥소실 라디칼, 특히 람노실 라디칼 및 글루코실 라디칼의 군으로부터 선택된다. 그러나, 헥소실 라디칼, 예를 들어 알로실, 알트로실, 갈락토실, 굴로실, 이도실, 만노실 및 탈로실은, 또한 본 발명의 일부 구현예에서 사용된다. 또한 추가적 구현예에서, 펜토실 라디칼은 본 발명의 일부 개인 케어 조성물에서 사용된다.
일부 구현예에서, Z1 내지 Z5 은, 서로 독립적으로, 유리하게는 H, OH, 메톡시, 에톡시 및 2-히드록시에톡시로 이루어진 군으로부터 선택되고, 플라본 글리코시드는 하기 구조를 가진다:
Figure pct00025
.
일부 구현예에서, 본 발명의 일부 개인 케어 조성물에 제공되는 플라본 글리코시드는 하기 구조를 가진다:
Figure pct00026
(식 중, Gly1, Gly2 및 Gly3 은, 서로 독립적으로, 모노글리코시드 라디칼임). Gly2 및 Gly3 은 또한, 개별적으로 또는 함께, 수소 원자에 의한 포화를 나타낼 수 있다. 대안적 구현예에서, Gly1, Gly2 및 Gly3 은, 서로 독립적으로, 헥소실 라디칼, 특히 람노실 라디칼 및 글루코실 라디칼의 군으로부터 선택된다. 그러나, 다른 헥소실 라디칼, 예를 들어 알로실, 알트로실, 갈락토실, 굴로실, 이도실, 만노실 및 탈로실은 본 발명의 일부 구현예에서 사용된다. 또한, 일부 구현예에서, 펜토실 라디칼은 본 발명에서 사용된다. 일부 바람직한 구현예에서, 본 발명의 개인 케어 조성물은 a-글루코실루틴, a-글루코실미리세틴, a-글루코실이소쿼시트린, a-글루코실이소쿼세틴 및 a-글루코실쿼시트린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 플라본 글루코시드를 포함한다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, 플라본 글루코시드는 a-글루코실루틴이다.
또한 일부 추가적 구현예에서, 본 발명의 개인 케어 조성물은 하나 이상의 나린긴 (예를 들어, 아우란틴, 나린게닌-7-람노-글루코시드), 헤스페리딘 3',5,7-트리히드록시-4'-메톡시플라바논-7-루티노시드, 헤스페리도시드, 헤스페레틴-7-O-루티노시드), 루틴 (3,3',4',5,7-펜타히드록시플라본-3-루티노시드, 쿼세틴-3-루티노시드, 소포린, 비루탄, 루타비온, 타우루틴, 피토멜린, 멜린), 트록세루틴 (3,5-디히드록시-3',4',7-트리스(2-히드록시에톡시)플라본-3-(6-O-(6-데옥시-a-L-만노피라노실)-b-D-글루코피라노시드)), 모녹세루틴 (3,3',4',5-테트라히드록시-7-(2-히드록시에톡시)플라본-3-(6-O-(6-데옥시-a-L-만노피라노실)-b-D-글루코피라노시드)), 디히드로로비네틴 (3,3',4',5',7-펜타히드록시플라바논), 탁시폴린 (3,3',4',5,7-펜타히드록시플라바논), 에리오딕티올-7-글루코시드 (3',4',5,7-테트라히드록시플라바논-7 글루코시드), 플라바노마레인 (3',4',7,8-테트라히드록시플라바논-7 글루코시드), 및/또는 이소쿼세틴 (3,3',4',5,7-펜타히드록시플라바논-3-(b-D-글루코피라노시드) 을 포함한다. 또한 일부 추가적 구현예에서, 활성 성분은 유비퀴논 및 플라스토퀴논으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 유비퀴논은 하기 구조식을 특징으로 한다:
Figure pct00027
.
유비퀴논은 가장 광범위하고 가장 많이 연구된 바이오퀴논이다. 유비퀴논은, 측쇄에 연결된 이소프렌 단위체의 수에 따라, Q-1, Q-2, Q-3 등으로서, 또는 탄소 원자의 수에 따라, U-5, U-10, U-15 등으로서 지칭된다. 이들은 바람직하게는 특정 사슬 길이로 (예를 들어 일부 미생물 및 효모에서는 n = 6) 발생한다. 인간을 비롯한 대부분의 포유동물에서, Q10 이 지배적이다. 조효소 Q10 은 본 발명의 일부 구현예에서 특히 사용된다. 이의 구조식은 다음과 같다:
Figure pct00028
.
플라스토퀴논은 하기 일반 구조식을 가진다:
Figure pct00029
.
플라스토퀴논은 이소프렌 라디칼의 수 n 이 다르고, 이에 따라 지칭된다 (예를 들어, PQ-9 [n = 9]). 또한, 퀴논 고리 상의 치환기가 변하는 다른 플라스토퀴논은 일부 구현예에 존재한다.
또한 추가적 구현예에서, 본 발명은 데오드란트 및/또는 발한 억제제로서 사용하기에 적합한 제제를 제공한다. 통상 이러한 제제에서 사용되는 임의의 활성 성분이 본 발명의 다양한 구현예에서 또한 사용될 것이라고 고려된다. 통상 이러한 제제에서 사용되는 추가 성분은 또한 본 발명의 다양한 구현예에서 사용된다. 이러한 활성물 및 비활성 화합물의 예는, 제한없이, 악취 차폐제 (예를 들어, 향료), 악취 흡수제 (예를 들어, DE-P 40 09 347 에 기재되어 있는 필로실리케이트); 및 몬트모릴로나이트, 카올리나이트, 일라이트, 베이델라이트, 논트로나이트, 사포나이트, 헥토라이트, 벤토나이트, 스멕타이트, 및 리시놀레산의 아연염을 포함한다. 본 발명의 일부 구현예에서, 이러한 제제 중 활성 성분 (즉, 하나 이상의 화합물) 의 범위는 제제의 총 중량을 기준으로 바람직하게는 약 0.001 내지 약 30 중량%; 더욱 바람직하게는 약 0.05 내지 약 20 중량%; 가장 특히 약 1 내지 약 10 중량% 의 범위이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은, 필수 물질 및 임의적 다른 물질을 혼입시켜 필수 물질 및 임의적 성분이 적절한 농도로 피부 또는 헤어에 전달될 수 있게 하는, 피부 또는 헤어에 국부 적용에 적합한 안전 및 유효량의 피부과적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 담체는 필수 성분을 위한 희석제, 분산제, 용매 등으로서 작용하여, 필수 성분이 적절한 농도로 선택된 표적에 대해 고르게 적용되고 분포될 수 있도록 보장한다.
추가의 구현예에서, 본원에 기재되어 있는 유효량의 하나 이상의 화합물은, 또한 제한없이 헤어 스프레이 조성물, 헤어 스타일링 조성물, 헤어 샴푸 및/또는 컨디셔닝 조성물, 헤어 성장 조절의 목적에 적용되는 조성물 및 지루, 피부염 및/또는 비듬을 치료하기 위한 헤어 및 두피에 적용되는 조성물로서 유용한 것들을 포함하는, 손톱 및 헤어와 같은 케라틴성 물질에 적용되는 조성물에 포함된다.
또한 추가적 구현예에서, 본원에 기재되어 있는 유효량의 하나 이상의 화합물은 피부 또는 헤어에 국부 적용하기 적합한 조성물에 포함된다. 이러한 조성물은 제한없이 크림, 로션, 겔, 현탁 분산액, 마이크로에멀젼, 나노분산액, 마이크로스피어, 히드로겔, 에멀젼 (예를 들어, 수중유 및 유중수뿐만 아니라 복합 에멀젼) 및 다중적층 겔 등을 포함하는 임의의 적합한 형태로 제공된다 (예를 들어, Schlossman et al., The Chemistry and Manufacture of Cosmetics, [1998] 참조, 상기 특허는 본원에 참고로 포함됨). 일부 구현예에서, 조성물은 수성 또는 실리콘 조성물로서 제형화되는 반면, 다른 구현예에서는, 수성 연속상 중 하나 이상의 유상 (또는 유상 중 수상) 의 에멀젼으로서 제형화된다.
본 발명에 사용되는 담체의 유형은 조성물의 원하는 제품 형태의 유형에 따라 다르다. 담체는 고체, 반고체 또는 액체일 수 있다. 적합한 담체는 액체, 반고체 (예를 들어, 크림, 로션, 겔, 스틱, 연고 및 페이스트), 스프레이 및 무스를 포함한다. 바람직하게는 담체는 로션, 크림 또는 겔의 형태, 더욱 바람직하게는 입자가 침전되는 것을 방지하기 위한 충분한 증점 및 항복점을 갖는 것이다. 일부 구현예에서, 담체는 비활성인 반면, 다른 구현예에서는, 피부과적 이익을 제공한다. 일부 구현예에서, 담체는 피부 및/또는 헤어에 직접 적용되는 반면, 다른 구현예에서는, 직조 또는 부직조 수건 또는 천을 통해 적용된다. 또한 다른 구현예에서는, 패치, 마스크 또는 랩의 형태이다. 또한 추가의 구현예에서, 피부 및/또는 헤어에 에어로졸화되거나 달리 스프레이 또는 펌핑된다. 선택되는 담체는 본원에 기재되어 있는 필수 성분과 물리적 및 화학적으로 혼화성이고, 본 발명의 조성물과 연관되는 안정성, 효능 또는 다른 사용 이익을 과도하게 악화시키지 않아야 한다.
바람직한 담체는 피부과적으로 허용가능하고, 친수성인 희석제를 함유한다. 적합한 친수성 희석제는 물, 유기 친수성 희석제, 예컨대 C2 - C10, 바람직하게는 C2 - C6, 바람직하게는, C3 - C6 1가 알코올 및 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 폴리프로필렌 글리콜, 글리세롤, 부틸렌 글리콜, 1,2,4-부탄트리올, 소르비톨 에스테르, 1,2,6-헥사메트리올, 펜틸렌 글리콜, 헥실렌 글리콜, 소르비톨 에스테르, 에톡실화 에테르, 프로폭실화 에테르 및 이들의 조합을 포함하는 저분자량 글리콜 및 폴리올을 포함한다. 희석제는 바람직하게는 액체이다. 물은 바람직한 희석제이다. 조성물은 바람직하게는 약 20% 이상의 친수성 희석제를 포함한다.
일부 구현예에서, 적합한 담체는 또한 친수성상, 특히 수상 및 소수성 상 (예를 들어, 지질, 오일 또는 유성 물질) 을 포함하는 에멀젼을 포함한다. 당업자에게 잘 알려져 있는 바와 같이, 친수성 상은 소수성 상에 분산되어 있거나 또는 그 반대로 존재하여, 성분의 조성에 따라 각각 친수성 또는 소수성 분산 및 연속상을 형성한다. 용어 "분산상" 은 연속상에 현탁되고 이에 둘러쌓인 작은 입자 또는 액적으로 존재하는 상에 대해 사용되는, 에멀젼 기술의 숙련자에게 잘 알려져 있는 용어이다. 분산상은 또한 내부 또는 불연속상으로서 알려져 있다. 에멀젼은 실리콘중수 에멀젼과 같은 수중유 에멀젼 또는 유중수 에멀젼일 수 있거나 이를 포함할 수 있다 (예를 들어, 삼중 또는 다른 다중상 에멀젼). 수중유 에멀젼은 통상 약 1% 내지 약 60% (바람직하게는 약 1% 내지 약 30%) 의 분산 소수성 상 및 약 1% 내지 약 99% (바람직하게는 약 10% 내지 약 90%) 의 연속 친수성 상을 포함하는 반면, 유중수 에멀젼은 통상 약 1% 내지 약 98% (바람직하게는 약 40% 내지 약 90%) 의 분산 친수성 상 및 약 1% 내지 약 50% (바람직하게는 약 1% 내지 약 30%) 의 연속 소수성 상을 포함한다.
추가의 구현예에서, 담체는 또한 낮은 레벨의 피부에 상부 각질층 배리어를 통한 침투를 용이하게 하는 하나 이상의 성분을 포함한다. 침투 증강제의 예는 제한없이 프로필렌 글리콜, 아존, 에톡시디글리콜, 디메틸 이소소르비드, 우레아, 에탄올 및 디메틸 술폭시드뿐 아니라 마이크로에멀젼, 리포솜 및 나노에멀젼을 포함한다.
일부 추가적 구현예에서, 본 발명의 조성물은 바람직하게는 약 0.01% 내지 약 20%, 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 15%, 바람직하게는 약 0.5% 내지 약 10% 의 수준으로 존재하는 습윤성제를 포함한다. 바람직한 습윤성제는, 제한없이, 다가 알코올, 소르비톨, 글리세롤, 우레아, 베타인, D-판텐올, DL-판텐올, 칼슘 판토테네이트, 로얄 젤리, 판테틴, 판토테인, 판테닐 에틸 에테르, 판감산, 피리독신, 판토일 락토오스 비타민 B 복합체, 나트륨 피롤리돈 카르복실산, 헥산 - 1,2,6, - 트리올, 구아니딘 또는 이의 유도체 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 화합물을 포함한다.
본원에 사용하기 적합한 다가 알코올은, 제한없이, 폴리알킬렌 글리콜, 바람직하게는 프로필렌 글리콜, 디프로필렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 유도체, 소르비톨, 히드록시프로필 소르비톨, 에리트리톨, 트레이톨, 펜타에리트리톨, 자일리톨, 글루시톨, 만니톨, 펜틸렌 글리콜, 헥실렌 글리콜, 부틸렌 글리콜 (예를 들어, 1,3-부틸렌 글리콜), 헥산 트리올 (예를 들어, 1,2,6-헥산트리올), 트리메틸올 프로판, 네오펜틸 글리콜, 글리세린, 에톡실화 글리세린, 프로판-1,3 디올, 프로폭실화 글리세린 및 이들의 혼합물을 포함하는 알킬렌 폴리올 및 이들의 유도체를 포함한다. 상기 다가 알코올 중 임의의 것의 알콕실화 유도체는 또한 본원에 사용하기 적합하다. 본 발명의 바람직한 다가 알코올은 글리세린, 부틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 펜틸렌 글리콜, 헥실렌 글리콜, 디프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 헥산 트리올, 에톡실화 글리세린 및 프로폭실화 글리세린 및 이들의 혼합물로부터 선택된다.
본원에서 유용한 적합한 습윤성제는 나트륨 2-피롤리돈-5-카르복실레이트 (NaPCA), 구아니딘; 글리콜산 및 글리콜레이트 염 (예를 들어, 암모늄 및 4 차 알킬 암모늄); 락트산 및 락테이트 염 (예를 들어, 암모늄 및 4 차 알킬 암모늄); 다양한 형태 중 임의의 알로에 베라 (예를 들어, 알로에 베라 겔); 히알루론산 및 이의 유도체 (예를 들어, 나트륨 히알루로네이트와 같은 염 유도체); 락트아미드 모노에탄올아민; 아세트아미드 모노에탄올아민; 우레아; 베타인, 판텐올 및 이의 유도체; 및 이들의 혼합물이다.
일부 구현예에서, 일부 이상 (조성물의 약 5 중량% 이하) 의 습윤성제는 그 자체가 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 10% 의 양으로 존재하는 입자성 가교된 소수성 아크릴레이트 및 메타크릴레이트 공중합체와의 혼합물 형태로 본 발명의 조성물에 혼입되고, 이는 수성 또는 분산상에 첨가될 수 있다. 이러한 공중합체는 효과적인 보습 이익을 제공하는데 도움을 주면서 광택을 감소시키고 오일을 조절하는데 특히 가치가 있고, WO96/03964 에 더 상세히 기재되어 있으며, 상기 특허는 본원에 참고로서 포함된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 수중유 및 유중수 조성물은 약 0.05% 내지 약 20%, 바람직하게는 약 1% 내지 약 15%, 바람직하게는 약 2% 내지 약 10%, 바람직하게는 약 2% 내지 약 5% 의 피부과적으로 허용가능한 진정제를 포함한다. 진정제는 피부를 윤활시키고, 피부의 부드러움 및 유연성을 증가시키고, 피부 건조를 방지 또는 완화시키고/시키거나 피부를 보호하는 경향이 있다. 진정제는 통상 수-비혼화성, 유성 또는 왁스성 물질이고, 진정제는 국부 조성물에 심미적 특성을 부여할 수 있다. 다양한 적합한 진정제가 알려져 있고 (예를 들어, Sagarin, Cosmetics, Science and Technology, 2nd Edition, Vol. 1, pp. 32-43 [1972]; 및 WO 00/24372 참조), 본원에서 사용되며, 진정제로서 적합한 물질의 다수의 예를 포함한다. 추가적인 진정제는, 제한없이, 하기를 포함한다:
i) 탄소수 약 7 내지 약 40 의 직쇄 및 분지쇄 탄화수소, 예컨대 미네랄 오일, 도데칸, 스쿠알렌, 콜레스테롤, 수소화 폴리이소부틸렌, 이소헥산데칸, 이소에이코산, 이소옥타헥사콘탄, 이소헥사펜타콘타헥탄, 및 C7-C40 분지형 탄화수소인 C7-C40 이소파라핀. 본원에 사용하기 적합한 분지쇄 탄화수소는 이소펜타콘타옥탁탄, 페트롤레이텀 및 이들의 혼합물로부터 선택된다;
ii) C1-C30 카르복실산, C12 -15 알킬 벤조에이트 및 C2-C30 디카르복실산의 C1-C30 지방산 에스테르, 예를 들어 이소노닐 이소노나노에이트, 이소스테아릴 네오펜타노에이트, 이소데실 옥타노에이트, 이소데실 이소노나노에이트, 트리데실 이소노나노에이트, 미리스틸 옥타노에이트, 옥틸 펠라르고네이트, 옥틸 이소노나노에이트, 미리스틸 미리스테이트, 미리스틸 네오펜타노에이트, 미리스틸 옥타노에이트, 이소프로필 미리스테이트, 미리스틸 프로피오네이트, 이소프로필 스테아레이트, 이소프로필 이소스테아레이트, 메틸 이소스테아레이트, 베헤닐 베헤네이트, 디옥틸 말레에이트, 디이소프로필 아디페이트, 및 디이소프로필 디리놀레에이트 및 이들의 혼합물이 본 발명에서 또한 사용된다;
iii) 당 및 관련 물질의 C1-C30 모노- 및 폴리-에스테르. 이러한 에스테르는 당 또는 폴리올 부분 및 하나 이상의 카르복실산 부분으로부터 유래된다. 구성 산 및 당에 따라, 이러한 에스테르는 실온에서 액체 또는 고체 형태일 수 있다. 예는 글루코오스 테트라올레에이트, 올레산의 갈락토오스 테트라에스테르, 소르비톨 테트라올레에이트, 수크로오스 테트라올레에이트, 수크로오스 펜타올레에이트, 수크로오스 헥사올레에이트, 수크로오스 헵타올레에이트, 수크로오스 옥타올레에이트, 소르비톨 헥사에스테르를 포함한다. 다른 물질은 수크로오스의 면실유 또는 대두유 지방산 에스테르를 포함한다. 이러한 물질의 다른 예는 WO 96/16636 에 기재되어 있고, 상기 특허는 본원에 참고로서 포함된다;
iv) 식물성유 및 수소화 식물성유. 식물성유 및 수소화 식물성유의 예는 홍화유, 포도씨유, 코코넛유, 면실유, 멘헤이든유, 팜핵유, 팜유, 땅콩유, 대두유, 유채씨유, 아마인유, 미강유, 파인유, 견과유, 참기름, 해바라기씨유, 상기 원천으로부터의 부분 및 완전 수소화 오일 및 이들의 혼합물을 포함한다;
v) 가용성 또는 콜로이드-가용성 보습제. 예는 히알루론산 및 콘드로이틴 술페이트를 포함한다.
용어 "지질" 은 종종 지방, 오일, 왁스 등을 지칭하는 총칭으로서 사용된다. 또한, 용어 "유상" 및 "지질상" 은 또한 동의어로 사용된다. 그러나, 오일 및 지방은 정의와 다르게 이들의 극성에 있어서 서로 다르다. 오일 또는 유상의 극성 지수의 측정치로서 물에 대한 계면 장력을 채택하는 것이 제안되어 왔다. 따라서, 계면 장력이 주어진 오일 성분의 극성의 적합한 측정치로서 간주되는 것으로 고려된다. "계면 장력" 은 두 상 사이의 계면의 1 미터 길이의 가상선에 작용하는 힘이다. 이 측정에서, 유상 및 물 사이의 계면 장력이 낮을수록, 분석되는 유상의 극성이 크다. 이러한 계면 장력의 물리적인 단위는 통상 힘/길이 관계로부터 계산되고, 통상적으로 mN/m (밀리뉴턴/미터) 로 표현된다. 계면 감소를 시도하는 경우 + 부호를 가진다. 그 반대의 경우, - 부호를 가진다. 본원에 사용되는 바와 같이, 지질은, 물에 대한 계면 장력이 30 mN/m 미만인 경우, "극성" 으로서 간주된다.
"극성 오일" 은 레시틴 및 지방산 트리글리세리드의 군으로부터의 것, 즉 탄소 원자의 사슬 길이가 8 내지 24, 특히 12 내지 18 인 포화 및/또는 불포화, 분지형 및/또는 비분지형 알칸 카르복실산의 트리글리세롤 에스테르를 포함한다. 일부 구현예에서, 지방산 트리글리세리드는 합성, 반합성 및 천연 오일 (예를 들어, 올리브유, 해바라기유, 콩유, 땅콩유, 유채씨유, 아몬드유, 팜유, 코코넛유, 피마자유, 밀맥아유, 포도씨유, 엉겅퀴유, 달맞이꽃 종자유, 마카다미아 너트유 등) 로 이루어진 군으로부터 선택된다. 그러나, 본 발명이 특정 극성 오일을 함유하는 조성물에 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 본 발명에서 사용되는 극성 오일의 추가 예는 탄소 원자의 사슬 길이가 3 내지 30 인 포화 및/또는 불포화, 분지형 및/또는 비분지형 알칸 카르복실산과 탄소 원자의 사슬 길이가 3 내지 30 인 포화 및/또는 불포화, 분지형 및/또는 비분지형 알코올의 에스테르의 군, 방향족 카르복실산과 탄소 원자의 사슬 길이가 3 내지 30 인 포화 및/또는 불포화, 분지형 및/또는 비분지형 알코올의 에스테르의 군을 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 에스테르 오일은 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 이소프로필 스테아레이트, 이소프로필 올레에이트, n-부틸 스테아레이트, n-헥실 라우레이트, n-데실 올레에이트, 이소옥틸 스테아레이트, 이소노닐 스테아레이트, 이소노닐 이소노나노에이트, 2-에틸헥실 팔미테이트, 2-에틸헥실 라우레이트, 2-헥실데실 스테아레이트, 2-옥틸도데실 팔미테이트, 올레일 올레에이트, 올레일 에루케이트, 에루실 올레에이트, 에루실 에루케이트 및 이러한 에스테르의 합성, 반합성 및 천연 혼합물 (예를 들어, 호호바 오일) 로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또한, 일부 구현예에서, 유상은 디알킬 에테르, 및 포화 또는 불포화 및 분지형 또는 비분지형 알코올로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, 바람직한 구현예의 조성물의 유상은 또한 C12-15-알킬 벤조에이트를 함유하나, 대안적 구현예에서는, 바람직한 구현예는 후자만을 함유한다. 또한 추가적 구현예에서, 유상은 게르베 (Guerbet) 알코올의 군 (즉, 이의 제조를 최초로 기재한 Marcel Guerbet 에서 명칭을 딴 알코올의 군) 으로부터 선택된다. 이러한 알코올은 하기 식에 따라:
Figure pct00030
알코올의 알데히드로의 산화, 알데히드의 알돌 축합, 알돌로부터의 물의 제거 및 알킬 알데히드의 수소화에 의해 형성된다. 게르베 알코올은 저온에서도 액체이고, 피부 자극이 거의 없다. 따라서, 이는 피부 케어 및 헤어 케어 조성물에서 패팅 (fatting), 수퍼패팅 (superfatting) 및 또한 리패팅 (refatting) 성분으로서 사용된다. 실제로, 게르베 알코올의 용도는 미용 업계에서 알려져 있다. 이러한 용도에서, 이러한 종은 일반적으로 하기 구조를 갖는 것을 특징으로 한다:
Figure pct00031
.
이 구조에서, R1 및 R2 는 통상 비분지형 알킬 라디칼이다. 본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, R1 이 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸 또는 옥틸이고/이거나 R2 가 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 운데실, 도데실, 트리데실 또는 테트라데실인 하기 게르베 알코올이 본 발명에서 사용된다. 추가적인 구현예에서, 바람직한 게르베 알코올은 하기 화학 구조를 갖는, 시판되는, 예를 들어 상품명 ISOFOL® 12 (Condea Chemie GmbH) 으로 시판되는 2-부틸옥탄올:
Figure pct00032
, 및
하기 화학 구조를 갖는, 시판되는, 예를 들어 상품명 ISOFOL® 16 (Condea Chemie GmbH) 로 시판되는 2-헥실데칸올을 포함한다:
Figure pct00033
.
추가적인 구현예에서, 게르베 알코올의 혼합물은 본 발명의 조성물에서 사용된다. 예를 들어, 2-부틸옥탄올과 2-헥실데칸올의 혼합물은 일부 구현예에서 사용된다. 최종 미용 또는 피부과적 제제 중 게르베 알코올의 총량은 제제의 총 중량을 기준으로 약 25.0 중량% 이하, 바람직하게는 약 0.5 내지 약 15.0 중량% 의 범위로 선택된다. 그러나, 당업자가 원하는 조성물 및 이의 용도(들)에 대해 적합한 농도를 갖는 조성물을 제조하는 방법을 알고 있는 것과 같이, 본 발명이 임의의 특정 농도 또는 농도 범위에 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 또한, 오일 및/또는 왁스 성분의 임의의 혼합물은 본 발명에서 사용될 것이라고 고려된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 왁스 (예를 들어, 세틸 팔미테이트) 는 유상의 다나독 지질 성분으로서 사용된다. 추가적인 구현예에서, 비극성 오일 (예를 들어, 분지형 및 비분지형 탄화수소 및 탄화수소 왁스, 특히 VASELINE® [즉, 페트롤레이텀], 파라핀 오일, 스쿠알란 및 스쿠알렌, 폴리올레핀 및 수소화 폴리이소부텐으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것) 이 본 발명에서 사용된다. 폴리올레핀을 함유하는 일부 구현예에서, 폴리데센은 바람직한 물질이다.
본 발명의 구현예에서 사용되는 지방 및/또는 왁스 성분은 제한없이 식물성 왁스, 동물성 왁스, 미네랄 왁스 및 석유화학 왁스를 포함한다. 특히 바람지한 왁스의 예는 칸델리라 왁스, 카나우바 왁스, 목랍, 에스파르토 그래스 왁스, 코르크 왁스, 구아루마 왁스, 쌀 배아 오일 왁스, 사탕수수 왁스, 베리 왁스, 오우리커리 왁스, 몬탄 왁스, 호호바 왁스, 쉐어 버터, 밀랍, 셸락 왁스, 경랍, 라놀린 (울 왁스), 꼬리융기 그리스, 세레신, 오조케라이트 (지랍), 파라핀 왁스 및 미세결정질 왁스를 포함한다.
본 발명에서 사용되는 추가적인 지방 및/또는 왁스 성분은 화학적 개질 왁스 및/또는 합성 왁스 (예를 들어, 상품명 SYNCROWAX® HRC [글리세릴 트리베헤네이트] 및 SYNSCROWAX® AW 1C [C18 -C36 지방산] 로 시판되는 것, CRODA GmbH 사제), 및 몬탄 에스테르 왁스, 사솔 왁스, 수소화 호호바 왁스, 합성 또는 개질된 밀랍 (예를 들어, 디메티콘 코폴리올 밀랍 및/또는 C30 -50 알킬 밀랍), 폴리알킬렌 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 왁스뿐만 아니라 화학적 개질된 지방 (예를 들어, 수소화 피마자유 및/또는 수소화 코코넛 지방 글리세리드와 같은 수소화 식물성 오일), 트리글리세리드 (예를 들어, 트리히드록시스테아린, 지방산, 지방산 에스테르 및 글리콜 에스테르, 예컨대 C20 -C40-알킬 스테아레이트, C20-C40-알킬히드록시스테아로일 스테아레이트 및/또는 글리콜 몬타네이트) 를 포함한다. 추가의 구현예에서, 본 발명은 특정 유기실리콘 화합물을 포함하고, 이는 특정 지방 및/또는 왁스 성분 (예를 들어, 스테아록시트리메틸실란) 과 유사한 특성을 갖는다. 추가적인 구현예에서, 지방 및/또는 왁스 성분은 개별적으로 제공되는 반면, 또한 추가의 구현예에서는, 이들은 혼합물로서 제공된다. 실제로, 이러한 오일 및/또는 왁스 성분의 임의의 원하는 혼합물이 본 발명의 다양한 구현예에서 사용될 것이라고 의도된다.
일부 구현예에서, 유상은 2-에틸헥실 이소스테아레이트, 옥틸도데칸올, 이소트리데실 이소노나노에이트, 이소에이코산, 2-에틸헥실 코코에이트, C12 -C15-알킬 벤조에이트, 카프릴/카프르산 트리글리세리드 및 디카프릴릴 에테르로 이루어진 군으로부터 선택된다. 대안적 구현예에서, 제한없이 하나 이상의 옥틸도데칸올, 카프릴/카프르산 트리글리세리드, 디카프릴릴 에테르, C12-C15-알킬 벤조에이트, 2-에틸헥실 이소스테아레이트, 이소트리데실 이소노나노에이트를 포함하는 혼합물을 포함하는 다양한 유상의 혼합물이 제공된다. 하기 표는 본 발명의 다양한 구현예에서 다른 지질과 조합되거나 단독으로 사용되는 지질의 목록을 제공한다. 물에 대한 상응하는 계면 장력은 마지막 행에 제시되어 있다. 그러나, 더욱 크거나 작은 극성 성분 등의 혼합물을 비롯한 다른 성분이 본 발명의 다양한 구현예에서 사용되므로, 본 발명은 이러한 특정 성분에 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
Figure pct00034
일부 구현예에서, 제제의 유상 일부 또는 전부는 종종 "실리콘 오일" 로도 칭하는 시클릭 및/또는 선형 실리콘으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 이러한 실리콘 또는 실리콘 오일은 일반적으로 다음과 같은 구조 요소를 특징으로 하는 단량체로서 존재한다:
Figure pct00035
.
본 발명의 일부 구현예에서 사용되는 2 이상의 실록실 단위를 갖는 실리콘은 일반적으로 다음과 같은 구조 요소를 특징으로 한다:
Figure pct00036
(식 중, 규소 원자는 동일 또는 상이한 알킬 라디칼 및/또는 아릴 라디칼로 치환될 수 있고, 상기 라디칼은 라디칼 R1 내지 R4 로 일반적으로 표시되고, 상이한 라디칼의 수는 반드시 4 에 제한되지 않으며, 2 내지 200,000 의 값을 추정할 수 있음).
본 발명에 따라 유리하게 사용되는 시클릭 실리콘은 일반적으로 다음과 같은 구조 요소를 특징으로 한다:
Figure pct00037
(식 중, 규소 원자는 동일 또는 상이한 알킬 라디칼 및/또는 아릴 라디칼로 치환될 수 있고, 상기 라디칼은 라디칼 R1 내지 R4 로 일반적으로 표시되고, 상이한 라디칼의 수는 반드시 4 에 제한되지 않는다. n 은 3/2 내지 10 의 값을 추정할 수 있다. "n" 에 대한 분수값은 홀수의 실록실기가 사이클에 존재할 수 있음을 고려함).
일부 구현예에서, 페닐트리메티콘은 실리콘 오일로서 선택된다. 본 발명의 다양한 구현예에 사용하기 적합한 다른 실리콘 오일은, 제한없이, 디메티콘, 페닐디메티콘, 시클로메티콘 (옥타메틸시클로테트라실록산), 헥사메틸시클로트리실록산, 폴리디메틸실록산, 폴리(메틸페닐실록산), 세틸디메티콘 및 베헤녹시디메티콘을 포함한다. 대안적 구현예에서, 제한없이 시클로메티콘과 이소트리데실 이소노나노에이트의 혼합물 및 시클로메티콘과 2-에틸헥실 이소스테아레이트의 혼합물을 포함하는 상기 화합물의 혼합물이 본 발명에서 사용된다. 또한 추가적 구현예에서, 유기 측쇄가 유도체화된 (예를 들어, 폴리에톡실화 및/또는 폴리프로필실화) 상기 언급된 화합물과 같은 유사한 구조의 실리콘 오일이 본 발명에서 사용된다. 이는 제한없이 세틸디메티콘 코폴리올과 같은 폴리실록산-폴리알킬-폴리에테르 공중합체 (즉, 세틸디메티콘 코폴리올 (및) 폴리글리세릴-4 이소스테아레이트 (및) 헥실 라우레이트) 와 같은 이러한 화합물을 포함한다. 실제로, 본 발명의 다양한 구현에에서 다양한 오일이 사용되는 것과 같이, 본 발명은 임의의 특정 실리콘 오일 및 실리콘 오일의 혼합물에 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
추가적인 구현예에서, 유중수 (W/O) 에멀젼은 본 발명에서 사용된다. 일부 구현예에서, W/O 에멀젼화제는 추가적인 공-에멀젼화제와 또는 공-에멀젼화제 없이 사용된다. 또한 추가의 구현예에서, 본 발명의 W/O 에멀젼은 제한없이 하나 이상의 하기 화합물을 포함하는 하나 이상의 에멀젼화제를 포함한다: 레시틴, 라놀린, 파라핀 오일 (파라피늄 리퀴둠) 과의 혼합물의 미세결정질 왁스 (세라 미세결정질), 오조케라이트, 수소화 피마자유, 폴리글리세릴-3 올레에이트, 울 왁스 산 혼합물, 울 왁스 알코올 혼합물, 펜타에리트리틸 이소스테아레이트, 폴리글리세릴-3 디이소스테아레이트, 밀랍 (Cera alba) 및 스테아르산, 이소프로필 히드록시세틸 에테르와의 혼합물의 나트륨 디히드록시세틸포스페이트, 메틸글루코오스 디올레에이트, 히드록시스테아레이트와 밀랍과의 혼합물의 메틸글루코오스 디올레에이트, 페트롤레이텀 및 오조케라이트 및 글리세릴 올레에이트 및 라놀린 알코올과의 혼합물의 미네랄 오일, 오조케라이트 및 수소화 피마자유 및 글리세릴 이소스테아레이트 및 폴리글리세릴-3 올레에이트와의 혼합물의 페트롤레이텀, PEG-7 수소화 피마자유, 오조케라이트 및 수소화 피마자유, 폴리글리세릴-4 이소스테아레이트, 세틸디메티콘 코폴리올 및 헥실 라우레이트와의 혼합물의 폴리글리세릴-4 이소스테아레이트, 라우릴메티콘 코폴리올, 세틸디메티콘 코폴리올, 아크릴레이트/C10-C30-알킬 아크릴레이트 가교중합체 (crosspolymer), Poloxamer 101, 폴리글리세릴-2 디폴리히드록시스테아레이트, 폴리글리세릴-3 디이소스테아레이트, 폴리글리세릴-4 디폴리히드록시스테아레이트, PEG-30 디폴리히드록시스테아레이트, 디이소스테아로일 폴리글리세릴-3 디이소스테아레이트, 폴리글리세릴-2 디폴리히드록시스테아레이트, 폴리글리세릴-3 디폴리히드록시스테아레이트, 폴리글리세릴-4 디폴리히드록시스테아레이트, 폴리글리세릴-3 디올레에이트.
본 발명의 또한 추가적인 구현예에서, 본 발명의 W/O 에멀젼은 제한없이 하기를 포함하는 하나 이상의 공동에멀젼화제를 포함한다:
세테아레트-20 과의 혼합물의 글리세릴 스테아레이트, 세테아레트-25, 스테아릴 알코올과의 혼합물의 세테아레트-6, PEG-40 피마자유 및 나트륨 세틸스테아릴 술페이트와의 혼합물의 세틸스테아릴 알코올, 트리세테아레트-4 포스페이트, 나트륨 세틸스테아릴 술페이트, 레시틴 트리라우레트-4 포스페이트, 라우레트-4 포스페이트, 스테아르산, 프로필렌 글리콜 스테아레이트 SE, PEG-25 수소화 피마자유, PEG-54 수소화 피마자유, PEG-6 카프릴/카프르산 글리세리드, 프로필렌 글리콜과의 혼합물의 글리세릴 올레에이트, 세테트-2, 세테트-20, 폴리소르베이트 60, PEG-100 스테아레이트와의 혼합물의 글리세릴 스테아레이트, 라우레트-4, 세테아레트-3, 이소스테아릴 글리세릴 에테르, 나트륨 세틸스테아릴 술페이트와의 혼합물의 세틸스테아릴 알코올, 라우레트-23, 스테아레트-2, PEG-30 스테아레이트와의 혼합물의 글리세릴 스테아레이트, PEG-40 스테아레이트, 글리콜 디스테아레이트, PEG-22 도데실 글리콜 공중합체, 폴리글리세릴-2 PEG-4 스테아레이트, 세테아레트-20, 메틸글루코오스 세스퀴스테아레이트, 스테아레트-10, PEG-20 스테아레이트, PEG-8 디스테아레이트와의 혼합물의 스테아레트-2, 스테아레트-21, 스테아레트-20, 이소스테아레트-20, PEG-45/도데실 글리콜 공중합체, 메톡시-PEG-22/도데실 글리콜 공중합체, PEG-20 글리세릴 스테아레이트, PEG-8 밀랍, 폴리글리세릴-2 라우레이트, 이소스테아릴 디글리세릴 숙시네이트, 스테아르아미도프로필 PG 디모늄 클로라이드 포스페이트, 글리세릴 스테아레이트 SE, 세테트-20, 트리에틸 시트레이트, PEG-20 메틸글루코오스 세스퀴스테아레이트, 세테아레트-12, 글리세릴 스테아레이트 시트레이트, 세틸 포스페이트, 트리세테아레트-4 포스페이트, 트리라우레트-4 포스페이트, 폴리글리세릴 메틸글루코오스 디스테아레이트, 칼륨 세틸 포스페이트, 이소스테아레트-10, 폴리글리세릴-2 세스퀴이소스테아레이트, 세테트-10, 올레트-20, 이소세테트-20, 세테아레트-20, 세테아레트-12, 세틸스테아릴 알코올 및 세틸 팔미테이트와의 혼합물의 글리세릴 스테아레이트, PEG-20 스테아레이트, PEG-30 스테아레이트, PEG-40 스테아레이트 및 PEG-100 스테아레이트와의 혼합물의 세틸스테아릴 알코올.
제제의 유상이 적어도 부분적으로 실리콘 오일로 이루어진 또한 추가적인 구현예에서, 실리콘 에멀젼화제가 사용된다. 일부 구현예에서, 실리콘 에멀젼화제는 계면활성 물질, 알킬메티콘 코폴리올 및/또는 알킬 디메티콘 코폴리올로 이루어진 군으로부터, 특히 하기 화학 구조를 특징으로 하는 화합물의 군으로부터 선택된다:
Figure pct00038
(식 중, X 및 Y 는, 서로 독립적으로, H 및 탄소수 1 내지 24 의 분지형 및 비분지형 알킬기, 아실기 및 알콕시기의 군으로부터 선택되고, p 는 0 내지 200 의 수이고, q 는 1 내지 40 의 수이며, r 은 1 내지 100 의 수임). 본 발명에서 사용되는 실리콘 에멀젼화제의 일부 예는, 제한없이, 디메티콘 코폴리올 (예를 들어, ABIL®B 8842, ABIL®B 8843, ABIL®B 8847, ABIL®B 8851, ABIL®B 8852, ABIL®B 8863, ABIL®B 8873 및 ABIL®B 88183, 모두 Th. Goldschmidt AG 사제) 을 포함한다. 본 발명에서 사용되는 계면활성 물질의 추가적인 예는 세틸디메티콘 코폴리올 (ABIL®EM 90) 및 시클로메티콘디메티콘 코폴리올 (ABIL®EM 97) 을 포함하고, 이는 모두 Th. Goldschmidt AG 사제이다. 본 발명에서 사용되는 다양한 조성물에 유용하다고 증명되어 온 추가적인 에멀젼화제는 Dow Corning Ltd 사제 라우릴메티콘 코폴리올 (Dow Corning® 5200 Formulation Aid) 이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 개인 케어 조성물 (예를 들어, 미용 또는 피부 케어 제제) 에 사용되는 에멀젼화제의 총량은 제제의 총 중량을 기준으로 약 0.1 내지 약 10.0 중량%, 바람직하게는 약 0.5 내지 약 5.0 중량% 의 범위로 존재한다. 그러나, 본 발명의 다양한 구현예가 바람직한 농도 및/또는 농도 범위가 상이한 것과 같이, 본 발명이 에멀젼화제 및/또는 공동에멀젼화제의 임의의 특정 농도에 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
일부 구현예에서, 본 발명은 피부 보호 크림, 피부 로션, 미용 밀크, 선스크린 크림 및 자외선 차단 (sun protection) 밀크를 포함하는 다양한 형태의 에멀젼을 제공한다. 일부 바람직한 구현예에서, 상기 조성물은 지방, 오일, 왁스 및/또는 다른 지방성 물질뿐 아니라 물을 포함하고, 하나 이상의 에멀젼화제는 이러한 유형의 제형에 통상 사용된다.
본 발명의 미용 세정 로션 및/또는 세정 크림의 액체 및 다소 더 고체인 에멀젼에 더해, 본 발명은 또한 스프레이성 세정 제제 ("세정 스프레이") 를 제공하고, 이는 예를 들어 메이크업을 제거하기 위해 또는 마일드 워싱 로션으로서 사용된다. 또한, 이러한 세정 스프레이는 흉터 있는 피부의 치료 용도에 사용된다. 이러한 세정 제제는 또한 "린스-오프 제제" (즉, 적용 후 피부를 씻어내는 제품) 로서 사용된다.
상기 성분에 더해, 본 발명의 다양한 구현예는 제한없이 보형제 (bodying agent), 충전재, 향료, 염료, 에멀젼화제, 추가 활성 성분 (예를 들어, 비타민 및 단백질), 광보호제, 안정화제, 방충제, 알코올, 자가-태닝 물질, 물, 염, 살균제, 프로테아제 및/또는 케라티나아제 등을 포함하는 보조제 및 첨가제와 같은 추가 성분을 포함한다. 실제로, 스캐폴드 및 펩티드를 포함하는 활성 성분이 포함되는 한, 본 발명이 임의의 특정 성분에 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 본 발명이 다수의 다양한 약용 제제에 사용될 것이라고 또한 고려된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 에멀젼화제 및/또는 계면활성제를 함유하여, 일반적으로 연속 수상에 분산상을 분산시키고 현탁시키는 것을 돕는다. 계면활성제는 또한 제품이 피부 또는 헤어 세정을 의도하는 경우 유용할 수 있다. 이후 편의상, "에멀젼화제" 는 용어 "계면활성제" 에 포함된다. 따라서, 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "계면활성제(들)" 는, 피부 세정과 같은 다른 계면활성제 목적을 위해 또는 에멀젼화제로서 사용되는지에 상관없이, 표면 활성제를 지칭한다. 종래의 계면활성제를 포함하는 알려져 있는 계면활성제는, 선택되는 작용제가 조성물의 필수 성분과 화학적 및 물리적으로 혼화성이고 원하는 특징으로 제공한다면, 본 발명에 사용된다 (예를 들어, WO 00/24372 참조). 적합한 계면활성제는 비-실리콘 유래 물질, 실리콘-유래 물질 및 이들의 혼합물을 포함한다.
추가의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 바람직하게는 약 0.05% 내지 약 30%, 더욱 바람직하게는 약 0.5% 내지 15%, 가장 바람직하게는 약 1% 내지 10% 의 계면활성제 또는 계면활성제의 혼합물을 포함한다. 선택되는 정확한 계면활성제 또는 계면활성제 혼합물은 조성물의 pH, 존재하는 다른 성분 및 원하는 최종 제품 미학에 따라 다르다.
비이온성 계면활성제 중에서, 당 또는 전분 중합체 (예를 들어, 글리코시드) 와 장쇄 알코올 (예를 들어, C8 -30 알코올) 의 축합 생성물로서 광범위하게 정의될 수 있는 것이 본원에서 유용하다. 다른 유용한 비이온성 계면활성제는 지방산과 알킬렌 옥시드의 축합 생성물 (즉, 지방산의 알킬렌 옥시드 에스테르) 을 포함한다. 이러한 물질은 일반식 RCO(X)nOH (식 중, R 은 C10 -30 알킬기이고, X 는 -OCH2CH2- (즉, 에틸렌 글리콜 또는 옥시드 유래) 또는 -OCH2CHCH3- (즉, 프로필렌 글리콜 또는 옥시드 유래) 이며, n 은 약 6 내지 약 200 의 정수임) 를 가진다. 다른 비이온성 계면활성제는 2 몰의 지방산과 알킬렌 옥시드의 축합 생성물 (즉, 지방산의 알킬렌 옥시드 디에스테르) 이다. 이러한 물질은 일반식 RCO(X)nOOCR (식 중, R 은 C10 -30 알킬기이고, X 는 -OCH2CH2- (즉, 에틸렌 글리콜 또는 옥시드 유래) 또는 -OCH2CHCH3- (즉, 프로필렌 글리콜 또는 옥시드 유래) 이며, n 은 약 6 내지 약 100 의 정수임) 를 가진다. 일부 구현예에서, 본원에 사용되는 에멀젼화제는 바람직하게는 소르비탄 지방산 에스테르와 수크로오스 지방산 에스테르의 혼합물 기재의 지방산 에스테르 배합물, 특히 소르비탄 스테아레이트와 수크로오스 코코에이트의 배합물이다. 추가의 적합한 예는 세테아릴 알코올과 세테아릴 글루코시드의 혼합물을 포함한다. 그러나, 다양한 적합한 에멀젼화제가 당업계에 알려져 있는 것과 같이, 본 발명이 임의의 특정 에멀젼화제에 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
추가적인 구현예에서, 본원에 유용한 친수성 계면활성제는 대안적으로 또는 추가적으로 광범위한 양이온성, 음이온성, 쯔비터이온성 및 양쪽성 계면활성제, 예컨대 당업계에 공지되어 있는 계면활성제 중 임의의 것을 포함한다 (예를 들어, McCutcheon's, Emulsifiers and Detergents, North American and International Editions, MC Publishing Co. [2003]; 미국 특허 번호 5,011,681; 미국 특허 번호 4,421,769; 및 미국 특허 번호 3,755,560 참조).
일부 추가적인 구현예에서, 제한없이 양이온성 에멀젼화제 (예를 들어, 4 차 계면활성제) 를 포함하는 계면- 및/또는 표면-활성제는 본 발명의 일부 개인 케어 조성물에 포함된다.
하나 이상의 N 원자를 함유하는 4 차 계면활성제는 4 개의 알킬 또는 아릴기에 공유 결합된다. 이는, pH 에 관계없이, 양전하를 이끈다. 알킬베타인, 알킬아미도프로필베타인 및 알킬아미도프로필히드록시술타인은 본 발명의 일부 구현예에서 사용되는 4 차 계면활성제의 예이다.
본 발명의 일부 구현예에서 제공되는 양이온성 계면활성제는 또한 제한없이 4 차 암모늄 화합물, 특히 벤질트리알킬암모늄 클로라이드 또는 브로마이드 (예를 들어, 벤질디메틸스테아릴암모늄 클로라이드), 알킬트리알킬암모늄 염 (예를 들어, 세틸트리메틸암모늄 클로라이드 또는 브로마이드), 알킬디메틸히드록시에틸암모늄 클로라이드 또는 브로마이드, 디알킬디메틸암모늄 클로라이드 또는 브로마이드, 알킬아미도에틸트리메틸암모늄 에테르 술페이트, 알킬피리디늄 염 (예를 들어, 라우릴- 또는 세틸피리미디늄 클로라이드), 이미다졸린 유도체, 및 양이온성을 갖는 화합물, 예컨대 아민 옥시드 (예를 들어, 알킬디메틸아민 옥시드 또는 알킬아미노에틸디메틸아민 옥시드) 를 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 세틸트리메틸암모늄은 본 발명의 일부 개인 케어 조성물에 사용된다.
또한 추가적인 구현예에서, 양이온성 중합체 (예를 들어, JAGUAR®C 162 [히드록시프로필 구아 히드록시프로필트리모늄 클로라이드]), 개질된 마그네슘 알루미늄 실리케이트 (예를 들어, 시판되는 쿼터늄-18-헥토라이트 (예를 들어, BENTONE®38; Rheox), 및/또는 시판되는 스테아르알코늄 헥토라이트 (예를 들어, SOFTISAN®겔; Huels AG) 는 본 발명의 일부 개인 케어 조성물에서 사용된다. 그러나, 본 발명이 임의의 특정 양이온성 중합체에 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
또한 일부 추가의 구현예에서, 본 발명의 일부 조성물은 에멀젼의 촉각 특성을 향상시키기 위해 오일 증점제를 포함한다. 바람직한 오일 증점제는, 제한없이, 기타 고체 (예를 들어, Degussa AG 사제 AEROSIL®유형의 소수성 산화규소) 를 포함한다. 유리한 AEROSIL® 옥시드 등급의 예는 AEROSIL®OX50, AEROSIL®130, AEROSIL®150, AEROSIL®200, AEROSIL®300, AEROSIL®380, AEROSIL®MOX 80, AEROSIL® MOX 170, AEROSIL® COK 84, AEROSIL® R　202, AEROSIL® R 805, AEROSIL® R 812, AEROSIL® R 972, AEROSIL® R 974 및 AEROSIL® R976 을 포함한다.
일부 추가적인 구현예에서, 본 발명의 일부 개인 케어 조성물은 하나 이상의 "금속 비누" (즉, 알칼리 금속염을 제외하고 고급 지방산의 염) 를 포함하고, 상기 금속 비누는 오일 증점제로서 기능한다. 이러한 금속 비누의 예는 제한없이 알루미늄 스테아레이트, 아연 스테아레이트 및/또는 마그네슘 스테아레이트를 포함한다.
다양한 음이온성 계면활성제는 또한 본원에서 유용하다 (예를 들어, 미국 특허 번호 3,929,678 참조). 예시적인 음이온성 계면활성제는, 제한없이, 알코일 이세티오네이트 (예를 들어, C12 - C30), 알킬 및 알킬 에테르 술페이트 및 이들의 염, 알킬 및 알킬 에테르 포스페이트 및 이들의 염, 알킬 메틸 타우레이트 (예를 들어, C12 - C30), 및 지방산의 비누 (예를 들어, 치환 알킬아민 및 알칼리 금속염, 예를 들어, 나트륨 또는 칼륨염) 를 포함한다.
양쪽성 및 쯔비터이온성 계면활성제는 또한 본원에서 유용하다. 본 발명의 조성물에서 사용되는 바람직한 양쪽성 및 쯔비터이온성 계면활성제의 예는 지방족 라디칼이 직쇄 또는 분지쇄일 수 있는 지방족 2 차 및 3 차 아민의 유도체로서 널리 기재되어 있는 것들이고, 상기 지방족 치환기 중 하나는 약 8 내지 약 22 개의 탄소 원자 (바람직하게는 C8 - C18) 를 함유하고, 하나는 음이온성 수용성 기 (예를 들어, 카르복시, 술포네이트, 술페이트, 포스페이트 또는 포스포네이트) 를 함유한다. 예는 제한없이 알킬 이미노 아세테이트 및 이미노디알카노에이트 및 아미노알카노에이트, 이미다졸리늄 및 암모늄 유도체를 포함한다. 다른 적합한 양쪽성 및 쯔비터이온성 계면활성제는 베타인, 술타인, 히드록시술타인 및 분지형 및 비분지형 알카노일 사르코시네이트 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다.
일부 추가의 구현예에서, 일부 개인 케어 조성물은 하나 이상의 양쪽성 및/또는 쯔비터이온성 계면활성제 (예를 들어, 코카미도프로필베타인) 및/또는 보습제 (예를 들어 베타인) 를 포함한다. 본 발명의 이러한 구현예에서 사용되는 양쪽성 계면활성제의 예는 제한없이 아실/디알킬에틸렌디아민 (예를 들어, 나트륨 아실암포아세테이트), 디나트륨 아실암포디프로피오네이트, 디나트륨 알킬암포디아세테이트, 나트륨 아실암포히드록시프로필술포네이트, 디나트륨 아실암포디아세테이트, 나트륨 아실암포프로피오네이트, N-알킬아미노산, 예를 들어 아미노프로필알킬글루타미드, 알킬아미노프로피온산, 나트륨 알킬이미도디프로피오네이트 및 라우로암포카르복시글리시네이트를 포함한다.
일부 구현예에서, 제제 중 표면- 또는 계면-활성 물질 (하나 이상의 화합물) 의 양은 제제의 총 중량을 기준으로 바람직하게는 약 0.001 내지 약 30 중량%, 더욱 바람직하게는 약 0.05 내지 약 20 중량%, 가장 바람직하게는 약 1 내지 약 10 중량% 이다.
또한 일부 추가적인 구현예에서, 활성 성분 (하나 이상의 화합물) 은 하나 이상의 친유성 활성 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 친유성 활성 성분은 아세틸살리실산, 아트로핀, 아줄렌, 히드로코르티손 및 이의 유도체 (예를 들어, 히드로코르티손-17-발레레이트), B 비타민, D 비타민, 비타민 B1, 비타민 B12, 비타민 D1, 레티노이드, 비사볼롤, 불포화 지방산 (예를 들어, 종종 "비타민 F" 로도 지칭되는 필수 지방산), γ-리놀렌산, 올레산, 에이코사펜텐산, 도코사헥센산 및 이의 유도체, 클로람페니콜, 카페인, 프로스타글란딘, 티몰, 캠퍼 (캄포르 (camphor)), 식물성 및 동물성 기원의 추출물 또는 다른 생성물 (예를 들어 달맞이꽃 종자유, 보리지 오일 또는 커런트씨유, 어유, 대구 간유) 및 세라미드 및 세라미드-형 화합물 등으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 활성 성분(들)은 리패팅 물질이다 (예를 들어, 퍼셀린 오일, EUCERIT® 및/또는 NEROCERIT®).
추가의 구현예에서, 본 발명의 일부 에멀젼은 에멀젼화제 또는 계면활성제를 함유하는 실리콘을 포함한다. 다양한 실리콘 에멀젼화제는 본원에서 사용된다. 이러한 실리콘 에멀젼화제는 통상적으로는 실리콘 계면활성제로도 당업자에게 알려져 있는 유기 개질된 유기폴리실록산이다. 유용한 실리콘 에멀젼화제는, 제한없이, 디메티콘 코폴리올을 포함한다. 이러한 물질은 개질된 폴리디메틸 실록산이고, 이는 폴리에틸렌 옥시드 사슬, 폴리프로필렌 옥시드 사슬, 이러한 사슬들의 혼합물 및 에틸렌 옥시드와 프로필렌 옥시드 유래의 부분을 함유하는 폴리에테르 사슬과 같은 폴리에테르 측쇄를 포함한다. 다른 예는 알킬-개질 디메티콘 코폴리올 (즉, C2-C30 펜던트 측쇄를 함유하는 화합물) 을 포함한다. 또한 다른 유용한 디메티콘 코폴리올은 다양한 양이온성, 음이온성, 양쪽성 및 쯔비터이온성 펜던트 부분을 갖는 물질을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 중합체성 증점제를 포함한다. 본원에서 유용한 중합체성 증점제는 바람직하게는 수평균 분자량이 약 20,000 초과, 더욱 바람직하게는 약 50,000 초과, 가장 바람직하게는 약 100,000 초과이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 조성물의 약 0.01% 내지 약 10%, 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 8%, 더욱 바람직하게는 약 0.2% 내지 약 5 중량% 의 중합체성 증점제 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
본원에 사용하기 바람직한 중합체 증점제는, 제한없이, 비이온성 증점제 및 음이온성 증점제 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 적합한 비이온성 증점제는, 제한없이, 폴리아크릴아미드 중합체, 가교 폴리(N-비닐피롤리돈), 다당류, 천연 또는 합성 검, 폴리비닐피롤리돈 및 폴리비닐알코올을 포함한다. 적합한 음이온성 증점제는, 제한없이, 아크릴산/에틸 아크릴레이트 공중합체, 카르복시비닐 중합체 및 알킬 비닐 에테르와 말레산 무수물의 가교 공중합체를 포함한다. 시판되는 증점제 (예를 들어, 카보폴; Noveon) 는 본 발명의 일부 구현예에서 사용된다. 적합한 카보폴 수지는 소수성으로 개질될 수 있고, 다른 적합한 수지 또는 이들의 혼합물을 WO98/22085 에 기재되어 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 수상은 겔 특징을 갖고, 유효 함량의 화합물 및 용매 (적절한 경우) 에 더해 바람직하게는 물, 추가로 유기 및/또는 무기 증점제, 및/또는 히드로콜로이드를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 무기 증점제는 개질, 비개질, 자연 발생적 및 합성 필로실리케이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일반적으로 순수한 성분을 사용하는 것이 바람직하나, 일부 구현예에서, 상이한 개질 및/또는 비개질된 필로실리케이트의 혼합물이 본 발명의 다양한 조성물에서 사용된다. 일반적으로 당업계에 알려져 있는 바와 같이, 필로실리케이트는 실리케이트 또는 알루미네이트 단위체가 3 개의 Si-O- 또는 Al-O- 결합을 통해 함께 연결되고 웨이브 시트 또는 층 구조를 형성하는 알루모실리케이트 및 실리케이트이다. 4 번째 Si-O- 또는 Al-O- 원자가는 양이온에 의해 포화된다. 비교적 약한 정전기 상호작용 (예를 들어 수소 다리 결합) 은 개별적인 층 사이에 존재한다. 층 구조는 대체로 강한 공유 결합에 의해 정의된다. 시트 실리케이트의 화학양론은 순수한 실리케이트 구조에 대해 (Si2O5 2 -) 이고, 알루모실리케이트에 대해 (AlmSi2 - mO5 (2+m)-) (식 중, "m" 은 0 초과 및 2 미만의 수임) 이다. 순수한 실리케이트의 부재 하에 알루모실리케이트가 존재하는 일부 구현예에서, Al3 + 로 대체된 각각의 Si4 + 기는 전하를 중화시키기 위해 또다른 약간의 전하된 양이온을 필요로 한다. 전하 균형은 바람직하게는 H+, 알칼리 금속 이온 또는 알칼리 토금속 이온에 의해 안정된다. 대안적 구현예에서, 알루미늄은 반대이온으로서 사용된다. 알루모실리케이트와 대조적으로, 이러한 화합물은 "알루미늄 실리케이트" 로 지칭된다. 알루미늄이 모든 실리케이트 네트워크에 반대이온으로서 존재하는 "알루미늄 알루모실리케이트" 는 본 발명의 일부 구현예에서 사용된다.
필로실리케이트는 당업계에 잘 알려져 있다 (예를 들어, Hollemann et al., Lehrbuch der Anorganischen Chemie [Textbook of Inorganic Chemistry], 91st-100th Ed., Walter de Gruyter - Verlag [1985]; Remy, Lehrbuch der Anorganischen Chemie, 12th Ed., Akademische Verlagsgesellschaft, Leipzig [1965] 참조). 몬트모릴로나이트의 층 구조도 알려져 있다 (Roempps Chemie-Lexikon, Franckh'sche Verlagshandlung, W. Keller & Co., Stuttgart, 8th Ed., [1985], p.　2668　f 참조). 필로실리케이트의 예는 하기를 포함한다 (몬트모릴로나이트는 자연 발생적 벤토나이트를 포함하는 주요 미네랄임):
몬트모릴로나이트 Na0 .33((Al1 .67Mg0 .33)(OH)2(Si4O10))
종종 간소화됨: Al2O3*4SiO2*H2O*nH2O 또는
Al2[(OH)2/Si4O10]·nH2O
카올리나이트 Al2(OH)4(Si2O5)
일라이트 (K,H3O)y(Mg3(OH)2(Si4 - yAlyO10)) 또는
(K,H3O)y(Al2(OH)2(Si4 - yAlyO10))
(식 중, y = 0.7 - 0.9)
베이델라이트 (Ca,Na)0.3(Al2(OH)2(Al0.5Si3 .5O10))
논트로나이트 Na0 .33(Fe2(OH)2(Al0.33Si3 .67O10))
사포나이트 (Ca,Na)0.33((Mg,Fe)3(OH)2(Al0.33Si3 .67O10))
헥토라이트 Na0 .33((Mg,Li)3(OH,F)2(Si4O10)).
일부 바람직한 구현예에서, 제한없이 알루미늄 실리케이트, 예컨대 몬트모릴로나이트 (벤토나이트, 헥토라이트 및 이의 유도체, 예컨대 쿼터늄-18 벤토나이트, 쿼터늄-18 헥토라이트, 스테아르알코늄 벤토나이트 및 스테아르알코늄 헥토라이트), 및 또한 마그네슘-알루미늄 실리케이트 (VEEGUM® 등급) 및 나트륨-마그네슘 실리케이트 (LAPONITE® 등급) 를 포함하는 무기 겔 형성제가 본 발명에서 사용된다.
몬트모릴로나이트는 이중팔면체 스멕타이트의 유형인 점토 미네랄을 나타내고, 물에서 팽창하나 플라스틱이 되지 않는 덩어리이다. 몬트모릴로나이트의 3층 구조 중 층 패킷은 물 (2 내지 7 배량) 및 다른 물질, 예를 들어, 알코올, 글리콜, 피리딘, 피콜린, 암모늄 화합물, 히드록시-알루미노실리케이트 이온 등의 역혼입의 결과로서 팽창할 수 있다. 상기 제시된 화학식은 단지 대략적인 화학식을 제공하는데, 몬트모릴로나이트가 이온 교환에 대한 용량이 크기 때문이다. 예를 들어, Al 은 Mg, Fe2 +, Fe3 +, Zn, Pb (예를 들어, 폐수 중 유해한 물질로부터), Cr, Cu 및 다른 원소로 대체될 수 있다. 팔면체 층의 생성된 음전하는 간층 위치에서 양이온, 특히 Na+ (즉, 나트륨 몬트모릴로나이트) 및 Ca2 + (즉, 칼슘 몬트모릴로나이트, 매우 작은 정도로만 팽창될 수 있는 화합물) 의 존재 하에 보상된다.
대안적 구현예에서, 제한없이 OPTIGEL® (Sued-Chemie) 로서 시판되는 화합물을 포함하는 합성 마그네슘 실리케이트 및/또는 벤토나이트는 본 발명에서 사용된다. 상기 지시된 바와 같이, 일부 구현예에서, 시판되는 VEEGUM® (R.T. Vanderbilt Comp., Inc) 과 같은 알루미늄 실리케이트는 본 발명에서 사용된다. 본 발명의 다양한 구현예에서 사용되는 다양한 VEEGUM® 등급은 하기에 제시된다.
Figure pct00039
상기 제품은 물에서 팽창하여 점성 겔을 형성하고, 이는 알칼리성 반응을 가진다. 몬트모릴로나이트 또는 벤토나이트의 친유기성 (organophilization) (4 차 알킬암모늄 이온에 대한 간층 양이온의 교환) 은 바람직하게는 유기 용매 및 오일, 지방, 연고, 잉크, 표면 코팅 및 세제에서 분산액에 사용되는 제품 (벤톤) 을 생성한다.
BENTONE® 은 장쇄 유기 암모늄 및 특정 유형의 몬트모릴로나이트로부터 구축되는 다양한 중성이고 화학적으로 비활성인 겔화제에 대한 상품명이다. BENTONE® 겔화제는 유기 매질에서 팽창하고, 이는 매질을 또한 팽창시킨다. 겔은 희석된 산 및 알칼리에 내성이 있으나, 강산 및 강알칼리와 연장 접촉시 겔화 특성을 부분적으로 상실한다. 이들의 친유기성으로 인해, BENTONE® 겔화제는 단지 겨우 물에 의해 적셔질 수 있다. Kronos Titan 사제: BENTONE® 27, 유기 개질된 몬트모릴로나이트; BENTONE® 34 (디메틸디옥틸암모늄 벤토나이트; 미국 특허 번호 2,531,427 에 따라 제조되고, 이 특허는 본원에 참고로서 포함되며, 친유성기로 인해 물보다 친유성 배지에서 용이하게 팽창함); BENTONE® 38, 유기 개질된 몬트모릴로나이트, 크림색 내지 백색의 파우더로서 시판됨; BENTONE® LT, 정제된 점토 미네랄; BENTONE® Gel MIO, 미네랄 오일 중 매우 미세한 현탁액으로서 공급되는 유기 개질된 몬트모릴로나이트 (SUS-71) (10% 벤토나이트, 86.7% 미네랄 오일 및 3.3% 습윤제); BENTONE® Gel IPM, 이소프로필 미리스테이트에 현탁되어 있는 유기 개질된 벤토나이트 (10% 벤토나이트, 86.7% 이소프로필미리스테이트, 3.3% 습윤제); BENTONE® Gel CAO, 피마자유에서 취해진 유기 개질된 몬트모릴로나이트 (10% 벤토나이트, 86.7% 피마자유 및 3.3% 습윤제); BENTONE® Gel Lantrol, 페이스트 형태의, 추가 가공, 특히 미용 조성물의 제조에 추가 가공에 의도되는 유기 개질된 몬트모릴로나이트; 10% 벤토나이트, 64.9 LANTROL® (울 왁스 오일), 22.0 이소프로필 미리스테이트, 3.0 습윤제 및 0.1 프로필 p-히드록시벤조에이트; BENTONE® Gel Lan I, 울 왁스 USP 와 이소프로필 팔미테이트의 혼합물에서의 10% 강도 BENTONE® 27 페이스트; BENTONE® Gel Lan II, 순수한 액체 울 왁스 중 벤토나이트 페이스트; BENTONE® Gel NV, 디부틸 프탈레이트 중 15% 강도 BENTONE® 27 페이스트; BENTONE® Gel OMS, Shellso T. 중 벤토나이트 페이스트; BENTONE® Gel OMS 25, 이소파라핀계 탄화수소 중 벤토나이트 페이스트 (IDOPAR® H); 및 BENTONE® Gel IPP, 이소프로필 팔미테이트 중 벤토나이트를 비롯한 시판되는 다양한 BENTONE® 겔화제 등급이 존재한다.
"히드로콜로이드" 는 더욱 정확한 명칭 "친수성 콜로이드" 에 대한 전문 약어이다. 히드로콜로이드는 거의 선형인 구조 및 개별적인 분자 간의 2 차 및 1 차 원자가 결합을 허용하는 상호작용의 분자간 힘을 가져 망상 구조 (recticular strcture) 를 형성하는 거대분자이다. 일부 히드로콜로이드는 수성계에서 겔 또는 점성 용액을 형성하는 수용성의 천연 또는 합성 중합체이다. 이러한 화합물은 물의 이동성을 제한하면서 물 분자를 결합하거나 (수화) 또는 교착된 거대분자에 물을 흡착하고 캡슐화시켜 물의 점도를 증가시킨다. 이러한 수용성 중합체는 화학적으로 매우 상이하나 물 또는 수성 매질에서 이들의 가용성에 있어서 통상적인 특성을 공유하는 다수의 천연 및 합성 중합체 군을 나타낸다. 이를 위한 전제 조건은 이러한 중합체가 물 중 가용성에 충분한 다수의 친수성 기를 갖고 너무 크게 가교되지 않는 것이다. 이러한 친수성 기는 예를 들어 다음과 같이, 자연에서 비이온성, 음이온성 또는 양이온성일 수 있다:
Figure pct00040
.
일부 바람직한 구현예에서, 화장용으로 그리고 피부과적으로 적절한 히드로콜로이드의 군은 하기 군으로 나뉜다: 유기, 천연 화합물 (예를 들어, 한천, 카라긴, 트래거캔스, 아라비아 검, 알기네이트, 펙틴, 폴리오스, 구아 가루, 캐롭 콩 가루, 전분, 덱스트린, 젤라틴 및 카세인); 유기, 개질된 천연 물질 (예를 들어, 카르복시메틸셀룰로오스 및 다른 셀룰로오스 에테르, 히드록시에틸셀룰로오스 및 히드록시프로필셀룰로오스 및 미세결정질 셀룰로오스); 유기, 완전 합성 화합물 (예를 들어, 폴리아크릴 및 폴리메타크릴 화합물, 비닐 중합체, 폴리카르복실산, 폴리에테르, 폴리이민, 폴리아미드 및 폴리우레탄); 및 무기 화합물 (예를 들어, 폴리규산, 점토 미네랄, 예컨대 몬트모릴로나이트, 제올라이트 및 실리카).
대안적 구현예에서, 에틸셀룰로오스는 본 발명의 조성물에서 안정화제로서 사용된다. 에틸셀룰로오스는 하기 구조를 특징으로 한다. 이 구조에서, R 은 에틸기 또는 수소 원자이다.
Figure pct00041
일부 바람직한 구현예에서, 에틸셀룰로오스의 에틸화도는 약 40 내지 약 55% 에 해당하는 약 2.0 내지 약 3.0, 더욱 바람직하게는 약 48.0 내지 약 49.5% 에틸화이다. 평균 분자량은 바람직하게는 80 부의 톨루엔과 20 부의 에탄올의 혼합물 중 약 5% 강도 용액의 점도가 25℃ 에서 3 내지 110 mPas, 더욱 바람직하게는 9 내지 11 mPas 이도록 선택된다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, 평균 분자량은 약 100,000 내지 약 400,000 g/mol 이다. 일부 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물 중 에틸셀룰로오스 농도는 제제의 총 중량을 기준으로 약 0.1 내지 약 10 중량%의 범위이다. 제한없이 시판되는 에틸셀룰로오스 (예를 들어, ETHOCEL® Standard 10 Premium; Dow Chemicals) 를 포함하는 다양한 에틸셀룰로오스가 본 발명에서 사용된다.
또한 추가적인 구현예에서, 미세결정질 셀룰로오스가 본 발명의 조성물에서 히드로콜로이드로서 사용된다. 제한없이 시판되는 미세결정질 셀룰로오스 제제 (예를 들어, AVICEL®, 예컨대 AVICEL® RC-591, 및 AVICEL® RC/CL; AVICEL® CE-15; 및 AVICEL® 500; FMC Corporation Food and Pharmaceutical Products) 를 포함하는 다양한 미세결정질 셀룰로오스 제제가 본 발명에서 사용된다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, AVICEL® RC-591 (89% 미세결정질 셀루로오스 및 11% 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스로 구성되는 개질된 미세결정질 셀룰로오스) 이 본 발명에서 사용된다.
본 발명에서 사용되는 추가적인 히드로콜로이드는 메틸셀룰로오스 (즉, 셀룰로오스의 메틸에스테르) 를 포함한다. 이러한 화합물은 하기 구조식을 특징으로 한다:
Figure pct00042
(식 중, R 은 수소 또는 메틸기일 수 있음).
셀룰로오스 혼합 에테르 (일반적으로 메틸셀룰로오스로 칭하고, 이는 우세한 함량의 메틸기에 더해 또한 2-히드록시에틸, 2-히드록시프로필 또는 2-히드록시부틸기를 함유함) 는 또한 본 발명의 일부 구현예에서 사용된다. 일부 바람직한 구현예에서, 히드록시프로필)메틸-셀룰로오스 (예를 들어, METHOCEL® E4M; Dow Chemical Co.) 가 본 발명에서 사용된다.
또한 추가의 구현예에서, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스 (즉, 셀룰로오스의 글리콜 에테르의 나트륨염, 이에 대해 상기 구조식 중 R 은 수소 및/또는 CH2-COONa 일 수 있음) 가 본 발명에서 사용된다. 일부 바람직한 구현예에서, 종종 "셀룰로오스 검" 으로도 칭하는 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스 (예를 들어, NATROSOL® Plus 330 CS; Aqualon) 가 본 발명에서 사용된다.
추가적인 구현예에서, 일반적으로 옥수수당으로부터 발효에 의해 형성되고 칼륨염으로서 단리되는 음이온성 헤테로 다당류인 잔탄 (CAS 번호 11138-66-2) (즉, 잔탄검) 이 본 발명에서 사용된다. 이는 잔토모나스 캄페스트리스 (Xanthomonas campestris) 및 일부 다른 종에 의해 혐기성 조건 하에서 생성되고, 분자량이 2x106 내지 24x106 이다. 잔탄은 측쇄를 갖는 셀룰로오스를 갖는 사슬로부터 형성된다. 하위군의 구조는 글루코오스, 만노오스, 글루쿠론산, 아세테이트 및 피루베이트로 이루어진다. 피루베이트 단위체의 수는 잔탄의 점도를 결정한다.
또한 추가의 구현예에서, 카라긴은 본 발명의 조성물에서 겔 형성제로서 사용된다. 이 화합물은 한천의 구조와 유사한 구조를 갖는 북대서양 홍조류 (진정 홍조류 (Florideae); 콘드루스 크리스푸스 (Chondrus crispus) 및 기가르티나 스텔라타 (Gigartina stellata)) 로부터의 추출물이다. 용어 "카라긴" 은 흔히 건조된 한천 생성물에 대해 사용되고, "카라기난" 은 이의 추출물에 대해 사용된다. 조류의 온수 추출물로부터 침전되는 카라긴은 분자량이 약 100,000 내지 약 800,000 이고 술페이트 함량이 약 25% 인 무색 내지 모래색 파우더이다. 온수에 매우 용이하게 용해되는 카라긴은 물 함량이 95-98% 인 경우에도 냉각시 틱소성 (thixotropic) 겔을 형성한다. 겔의 강성은 카라긴의 이중 나선 구조에 의해 달성된다.
카라기난의 경우, 3 개의 주요 성분이 구별된다. 겔-형성 "κ분획" 은 D-갈락토오스 4-술페이트 및 3,6-안히드로-α-D-갈락토오스로 이루어지고, 이는 1,3- 및 1,4-위치에서 교대적 글리코시드 결합을 가진다 (대조적으로, 한천은 3,6-안히드로-α-L-갈락토오스를 함유함). 비겔화 "λ 분획" 은 1,3-글리코시드 연결된 D-갈락토오스 2-술페이트 및 1,4-결합된 D-갈락토오스-2,6-디술페이트 라디칼로 구성되고, 냉수에서 용이하게 용해된다. 마지막으로, "ι-카라기난" 은 1,3 결합의 D-갈락토오스 4-술페이트 및 1,4 결합의 3,6-안히드로-α-D-갈락토오스 2-술페이트로 구성되고, 수용성이고 또한 겔을 형성한다. 존재하는 임의의 양이온 (K+, NH4 +, Na+, Mg2 +, Ca2 +) 의 특성은 또한 카라긴의 가용성에 영향을 미친다.
또한 추가적인 구현예에서, 키토산 (즉, 부분 탈아실화된 키틴) 은 본 발명의 다양한 조성물에서 사용된다. 키토산은 필름-형성 특성을 갖고, 피부에 비단같은 느낌을 갖는 것을 특징으로 한다. 일부 용도에 대한 하나의 단점은 적용 동안 일시적으로 (통상) 발생하는 피부에 대한 심한 점착성이다. 이러한 점착성으로 인해, 일부 제제는 소비자에게 허용되지 않는다. 그러나, 키토산은 헤어 케어 조성물을 포함하는 일부 제제에서 사용되는데, 이는 증점 및 안정화뿐만 아니라 중합체성 필름의 접착 및 내수성의 향상에 있어서 키틴보다 양호하기 때문이다. 키토산의 용도는 개인 케어 업계의 숙련자에게 잘 알려져 있다 (예를 들어, Fiedler, Lexikon der Hilfsstoffe fuer Pharmazie , Kosmetik und angrenzende Gebiete, [Lexikon of auxiliaries for pharmacy, Comsmetics and related fields], 3rd edition, Editio Cantor, Aulendorf, [1989], p. 293 참조). 키토산은 하기 구조식을 특징으로 한다:
Figure pct00043
(식 중, n 은 약 10,000 이하의 값으로 추정되고, X 는 아세틸 라디칼 또는 수소임). 키토산은 키틴의 탈아세틸화 및 부분 탈중합 (가수분해) 에 의해 형성되고, 이는 하기 구조식을 특징으로 한다:
Figure pct00044
.
키틴은 절지동물 (예를 들어 곤충, 게, 및 거미) 외골격의 필수 성분이고, 또한 다른 생물 (예를 들어 연체동물, 조류 및 균류) 의 연결 및/또는 지지 조직에서 발견된다. 약 pH < 6 의 영역에서, 키토산은 양전하이고, 이 범위에서 또한 수성계에 가용성이다. 음이온성 재료와 비혼화성이다. 이러한 이유로, 키토산-함유 수중유 에멀젼을 제조하기 위해, 비이온성 에멀젼화제의 사용이 적절하다 (예를 들어, EP 776 657). 일부 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 적어도 약 25% 초과, 더욱 바람직하게는 약 55 초과 내지 약 99% 의 탈아세틸화도를 갖는 하나 이상의 키토산을 함유한다 (1H-NMR 로 측정됨). 일부 구현예에서, 분자량이 약 10,000 내지 약 1,000,00, 특히 분자량이 100,000 내지 1,000,000 인 (겔 침투 크로마토그래피로 측정됨) 키토산이 본 발명에서 사용된다.
또한 추가의 구현예에서, 폴리아크릴레이트는 본 발명의 일부 조성물에서 겔화제로서 사용된다. 적합한 폴리아크릴레이트는 제한없이 아크릴레이트-알킬 아크릴레이트 공중합체, 특히 카보머 또는 CARBOPOL® 공중합체 (B. F. Goodrich Co.) 의 군으로부터 선택되는 것을 포함한다. 특히, 본 발명의 일부 구현예에서 사용되는 아크릴레이트-알킬 아크릴레이트 공중합체는 하기 구조를 가진다:
Figure pct00045
(식 중, R' 는 장쇄 알킬 라디칼이고, x 및 y 는 각 공단량체의 각각의 화학양론적 비율을 상징하는 수를 나타냄).
일부 구현예에서, 아크릴레이트 공중합체 및/또는 아크릴레이트-알킬 아크릴레이트 공중합체는, 제한없이, 시판되는 것 (예를 들어, CARBOPOL® 1382, CARBOPOL® 981 및 CARBOPOL® 5984; B. F. Goodrich Co., 특히, CARBOPOL 등급 980, 981, 1382, 2984, 5984 및 Carbomer 2001 의 군으로부터의 폴리아크릴레이트) 을 포함한다. 추가적인 구현예에서, C10-30-알킬 아크릴레이트와 하나 이상의 아크릴산, 메타크릴산 또는 이들의 에스테르 (이는 수크로오스의 알릴 에테르 또는 펜타에리트리토의 알릴 에테르와 가교됨) 단량체의 공중합체는 본 발명의 일부 구현예에서 사용된다.
INCI 명칭 "아크릴레이트/C10 -30 알킬 아크릴레이트 가교중합체" 를 갖는 화합물이 또한 본 발명의 일부 구현예에서 사용된다. 일부 구현예에서, 시판되는 중합체 (예를 들어, PEMULEN® TR1 및 PEMULEN® TR2; B. F. Goodrich Co.) 가 본 발명의 일부 구현예에서 사용되나, 본 발명이 임의의 특정 아크릴레이트-함유 조성물에 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
또한 추가적인 구현예에서, INCI 명칭 "암모늄 아크릴로일디메틸타우레이트/비닐피롤리돈 공중합체" 를 갖는 화합물이 본 발명에서 사용된다. 이러한 암모늄 아크릴로일디메틸타우레이트/비닐피롤리돈 공중합체는 하기 구조에 상응하는 실험식 [C7H16N2SO4]n [C6H9NO]m 를 가진다:
Figure pct00046
.
이러한 화합물의 바람직한 종은 등록 번호 58374-69-9, 13162-05-5 및 88-12-0 으로 화학 초록에 열거되어 있고, 시판된다 (예를 들어, ARISTOFLEX®; Clariant GmbH). 그러나, 본 발명이 임의의 특정 종에 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 본 발명의 또한 추가적인 구현예에서, 아크릴로일디메틸 타우레이트를 포함하는 공중합체/가교중합체 (예를 들어, SIMUGEL® EG 및 SIMUGEL® EG; Seppic S.A.) 는 본 발명의 일부 조성물에서 사용된다.
본 발명에서 사용되는 추가적인 완전 합성 히드로콜로이드는, 제한없이, 물에 가용성 또는 분산성이고 유리하게는 하기로부터 수득될 수 있는 음이온성 폴리우레탄을 포함한다:
Aa) 하나의 분자 당 2 이상의 활성 수소 원자를 함유하는 하나 이상의 화합물,
Ab) 산 또는 염 기를 함유하는 하나 이상의 디올, 및
Ac) 하나 이상의 디이소시아네이트.
일부 바람직한 구현예에서, 성분 Aa) 는, 특히, 각 경우의 수평균 분자량이 3000 이하인 디올, 아미노알코올, 디아민, 폴리스테롤, 폴리에테롤 또는 이들의 혼합물이고, 상기 화합물의 3 몰% 이하는 트리올 또는 트리아민으로 대체될 수 있다. 디올 및 폴리에스테르디올이 바람직하다. 특히, 성분 Aa) 는 성분 Aa) 의 총 중량을 기준으로 50 중량% 이상의 폴리에스테르디올을 포함한다. 적합한 폴리에스테르디올은 모두 폴리우레탄의 제조에 통상 사용되는 것들 모두, 특히 프탈산과 디에틸렌 글리콜, 이소프탈산과 1,4-부탄디올, 이소프탈산/아디프산과 1,6-헥산디올, 및 아디프산과 에틸렌 글리콜 또는 5-NaSO3-이소프탈산, 프탈산, 아디프산과 1,6-헥산디올의 반응 생성물이다.
본 발명의 일부 구현예에서 사용되는 디올의 예는, 제한없이, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 부틸렌 글리콜, 네오펜틸 글리콜, 폴리에테롤 (예를 들어, 분자량이 3000 이하인 폴리에틸렌 글리콜), 수평균 분자량이 3000 이하인 에틸렌 옥시드와 프로필렌 옥시드의 블록 공중합체, 및 랜덤 분포 방식으로 또는 블록 형태로 공중합된 알킬렌 옥시드 단위체를 함유하는 에틸렌 옥시드, 프로필렌 옥시드와 부틸렌 옥시드의 블록 공중합체를 포함한다. 에틸렌 글리콜, 네오펜틸 글리콜, 디-, 트리-, 테트라-, 펜타- 또는 헥사에틸렌 글리콜이 바람직하다. 사용되는 다른 디올은 폴리(α-히드록시카르복실산)디올을 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에서 사용되는 적합한 아미노알코올은 제한없이 2-아미노에탄올, 2-(N-메틸아미노)에탄올, 3-아미노프로판올 및 4-아미노부탄올을 포함한다.
일부 구현예에서, 암모니아를 이용한 폴리알킬렌 옥시드의 아민화에 의해 제조될 수 있는, 에틸렌디아민, 프로필렌디아민, 1,4-디아미노부탄, 1,6-디아미노헥산 및 α,ω-디아민과 같은 디아민은 본 발명의 일부 조성물에서 사용된다.
성분 Ab) 는, 특히, 하기 화학식을 갖는 화합물 또는 디메틸올프로판산이다:
Figure pct00047
및
Figure pct00048
(식 중, RR 은 각 경우에 C2-C18-알킬렌기이고, Me 은 Na 또는 K 임).
성분 Ac) 는, 특히, 헥사메틸렌 디이소시아네이트, 이소포론 디이소시아네이트, 메틸디페닐 이소시아네이트 (MDI) 및/또는 톨릴렌 디이소시아네이트이다.
일부 구현예에서, 폴리우레탄은 70 내지 130℃ 의 온도에서 비활성 용매에서 비활성-기체 분위기 하에 Aa) 및 Ab) 군의 화합물과 Ac) 군의 화합물을 반응시켜 수득된다. 이러한 반응은 비교적 높은 분자량을 갖는 폴리우레탄을 제조하기 위해 적절한 경우 사슬 확장제의 존재 하에 수행될 수 있다. 폴리우레탄의 제조에 있어서 통상적인 바와 같이, 성분 [(Aa)+(Ab)]:Ac 는 유리하게는 0.8 내지 1.1:1 의 몰비로 사용된다. 폴리우레탄의 산가는 성분 (Aa) 와 (Ab) 의 혼합물 중 성분 (Ab) 의 화합물의 농도 및 조성에 의해 결정된다.
일부 구현예에서, 폴리우레탄은 H. Fikentscher 에 따라 약 15 내지 약 100, 바람직하게는 약 25 내지 약 50 의 K 값을 가진다 (25℃ 및 pH 7 에서 N-메틸피롤리돈 중 0.1 중량% 강도 용액에서 측정됨). K 값 (즉, "고유 점도") 은 중합체 용액의 점도 측정에 의해 측정되는 것이 용이한 매개변수이고, 따라서 중합체를 특징짓는 공업적 분야에서 종종 사용된다. 본 발명의 일부 구현예에서 사용되는 산기를 함유하는 폴리우레탄은, 제한없이, 부분 또는 완전 중화 후 에멀젼화제의 도움없이 수용성 또는 분산성인 폴리우레탄을 포함한다. 폴리우레탄의 염은 일반적으로 중화되지 않은 폴리우레탄보다 수중 가용성 또는 분산성이 양호하다. 폴리우레탄의 중화에 사용되는 염기는 알칼리 금속 염기 (예를 들어, 수산화나트륨 용액, 수산화칼륨 용액, 소다, 탄산수소나트륨, 탄산칼륨 또는 탄산수소칼륨) 및 알칼리 토금속 염기 (예를 들어, 수산화칼슘, 산화칼슘, 수산화마그네슘 또는 탄산마그네슘, 및 암모니아 및 아민) 를 포함한다. 일부 구현예에서, 2-아미노-2-메틸프로판올, 디에틸아미노프로필아민 및 트리이소프로판올아민은 산기를 함유하는 폴리우레탄의 중화에 특히 사용된다. 또한 추가적인 구현예에서, 산기를 함유하는 폴리우레탄의 중화는 2 이상의 염기의 혼합물 (예를 들어 수산화나트륨 용액과 트리이소프로판올아민의 혼합물) 을 사용하여 수행된다. 사용 의도에 따라, 중화는 부분적 (예를 들어 약 20 내지 약 40%) 이거나 완전하다 (즉, 100%). 이러한 중합체 및 이의 제조는 DE-A-42 25 045 에 더욱 상세히 기술되어 있고, 상기 특허는 본원에 참고로서 포함된다.
B. 하기의 수용성 또는 수분산성 양이온성 폴리우레탄 및 폴리우레아:
Ba) 하나의 분자 당 2 이상의 활성 수소 원자를 함유하는 하나 이상의 화합물과 이미 반응하였을 수 있는 하나 이상의 디이소시아네이트, 및
Bb) 하나 이상의 3 차, 4 차 또는 양성자화 3 차 아미노 질소 원자를 갖는 하나 이상의 1 차 또는 2 차 트리아민, 1 차 또는 2 차 디아민, 1 차 또는 2 차 아미노 알코올, 또는 디올.
바람직한 디이소시아네이트는 상기 A) 에 제시되어 있는 것과 같다. 2 이상의 활성 수소 원자를 갖는 화합물은 디올, 아미노알코올, 디아민, 폴리에스테롤, 폴리아미드디아민 및 폴리에테롤이다. 이러한 유형의 적합한 화합물은 상기 A) 에 제시되어 있는 것과 같다.
폴리우레탄은 상기 A) 에 기재된 바와 같이 제조된다. 대전된 양이온성 기는 양성자화 (예를 들어, 락트산과 같은 카르복실산로) 또는 4 차화 (예를 들어 C1 내지 C4-알킬 할라이드와 같은 알킬화제로) 에 의해 존재하는 3 차 아미노 질소 원자로부터 폴리우레아 또는 술페이트에서 제조될 수 있다. 이러한 알킬화제의 예는, 제한없이, 에틸 클로라이드, 에틸 브로마이드, 메틸 클로라이드, 메틸 브로마이드, 디메틸 술페이트 및 디에틸 술페이트를 포함한다. 이러한 중합체 및 이의 제조는 DE-A-42 41 118 에 더욱 상세히 기재되어 있고, 상기 특허는 본원에 참고로서 포함된다.
C. 하기의 카르복실레이트기를 갖는 선형 폴리우레탄:
Ca) 하기 화학식의 2,2-히드록시메틸-치환 카르복실산:
Figure pct00049
(식 중, RR' 는 수소 원자 또는 C1-C20-알킬기임), 이는 폴리우레탄 1g 당 폴리우레탄에 존재하는 약 0.35 내지 약 2.25 밀리당량의 카르복실기에 충분한 양으로 사용됨,
Cb) 폴리우레탄의 중량에 대해 약 10 내지 약 90 중량% 의, 2 개 이하의 활성 수소 원자를 갖는 하나 이상의 유기 화합물 및
Cc) 하나 이상의 유기 디이소시아네이트.
일부 바람직한 구현예에서, 폴리우레탄에 존재하는 카르복실기를, 마지막으로, 적합한 염기로 적어도 부분적으로 중화시킨다. 이러한 중합체 및 이의 제조는 EP-A-619 111 에 기재되어 있고, 상기 특허는 본원에 참고로서 포함된다.
D. 트리- 또는 테트라카르복실산의 무수물과 디올, 디아민 또는 아미노알코올의 카르복실-함유 중축합 생성물 (폴리에스테르, 폴리아미드 또는 폴리에스테르 아미드). 이러한 중합체 및 이의 제조는 DE-A-42 24 761 에 더욱 상세히 기재되어 있고, 상기 특허는 본원에 참고로서 포함된다.
E. DE-A-43 14 305, 36 27 970 및 29　17　504 에 더욱 상세히 기재되어 있는 폴리아크릴레이트 및 폴리메타크릴레이트, 상기 특허들은 본원에 참고로서 포함된다.
본 발명의 일부 구현예에서 사용되는 중합체는 K 값이 약 15 내지 약 100, 더욱 바람직하게는 약 25 내지 약 50 이다. 중합체는 일반적으로 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.2 내지 약 20 중량% 범위의 양으로 조성물에 존재한다. 염은 중합체의 교환가능성을 향상시키기에 충분한 양으로 사용된다. 염은 일반적으로 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.02 내지 약 10 중량%, 더욱 바람직하게는 약 0.05 내지 약 5 중량%, 특히 약 0.1 내지 약 3 중량% 의 양으로 사용된다.
본 발명의 개인 케어 조성물의 일부 구현예에서 하나 이상의 히드로콜로이드의 총량은 제제의 총 중량을 기준으로 약 5 중량% 미만, 바람직하게는 약 0.05 내지 약 3.0 중량%, 더욱 바람직하게는 약 0.1 내지 약 1.0 중량% 이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 실리콘 오일상을 포함한다. 실리콘 오일상(들)은 일반적으로 조성물의 약 0.1% 내지 약 20%, 바람직하게는 약 0.5% 내지 약 10%, 더욱 바람직하게는 약 0.5% 내지 약 5% 를 포함한다. 실리콘 오일상은 바람직하게는 하나 이상의 실리콘 성분을 포함한다.
일부 구현예에서, 실리콘 성분은 유체이고, 직쇄, 분지형 및 시클릭 실리콘을 포함한다. 본원에서 유용한 적합한 실리콘 유체는 폴리알킬 실록산 유체, 폴리아릴 실록산 유체, 시클릭 및 선형 폴리알킬실록산을 포함하는 실리콘, 폴리알콕실화 실리콘, 아미노 및 4 차 암모늄 개질된 실리콘, 폴리알킬아릴 실록산 또는 폴리에테르 실록산 공중합체 및 이들의 혼합물을 포함한다. 휘발성 및 비휘발성 실리콘 유체가 본원에서 사용된다. 실리콘 유체는 일반적으로 평균 분자량이 약 200,000 미만이다. 바람직한 구현예에서, 적합한 실리콘 유체는 분자량이 약 100,000 이하, 바람직하게는 약 50,000 이하, 더욱 바람직하게는 약 10,000 이하이다. 바람직하게는 실리콘 유체는 중량평균 분자량이 약 100 내지 약 50,000 의 범위, 바람직하게는 약 200 내지 약 40,000 의 범위인 실리콘 유체로부터 선택된다. 통상적으로는, 실리콘 유체는 25℃ 에서 점도가 약 0.65 내지 약 600,000 ㎟·s- 1 의 범위, 바람직하게는 약 0.65 내지 약 10,000 ㎟·s- 1 의 범위이다. 점도를 Dow Corning Corporate Test Method CTM0004, July 29, 1970 에 설명된 바와 같이 유리 모세관 점도계로 측정할 수 있다. 본원에서 사용될 수 있는 적합한 폴리디메틸 실록산은 시판되는 화합물 (예를 들어, General Electric Company 및 Dow Corning 사제) 을 포함한다. 본질적으로 25℃ 에서 점도가 약 약 0.65 내지 30,000 ㎟·s- 1 인 비휘발성 폴리알킬아릴실록산, 예를 들어 폴리메틸페닐실록산 (General Electric Company 또는 Dow Corning 사제) 이 또한 유용하다. 본원에 사용하기 적합한 시클릭 폴리디메틸실록산은 약 3 내지 약 7 개, 바람직하게는 약 5 이상의 (CH3)2SiO 부분을 포함하는 고리 구조를 갖는 것이다.
추가적인 구현예에서, 실리콘 검이 본원에서 사용된다. 일부 바람직한 구현예에서, 실리콘 오일상은 실리콘 검 또는 실리콘 검을 포함하는 실리콘의 혼합물을 포함한다. 통상적으로는, 실리콘 검은 25℃ 에서 점도가 약 1,000,000 ㎟·s-1 초과이다. 실리콘 검은 당업계에 알려져 있는 디메티콘을 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,152,416; 및 Noll, Chemistry and Technology of Silicones, Academic Press, New York [1968] 참조). General Electric Silicone Rubber Product Data Sheets SE 30, SE 33, SE 54 및 SE 76 에 기재되어 있는 실리콘 검과 같은 실리콘 검은 또한 본 발명에서 사용된다. 실리콘 검의 특정예는 폴리디메틸실록산, (폴리디메틸실록산)(메틸비닐실록산) 공중합체, 폴리(디메틸실록산)(디페닐)(메틸비닐실록산) 공중합체 및 이들의 혼합물을 포함한다. 본원에 사용하기 바람직한 실리콘 검은 분자량이 약 200,000 내지 약 4,000,000 이고, 디메티콘올, 디메티콘 코폴리올, 디메티콘 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 실리콘 검이다.
일부 구현예에서, 실리콘 상은 본원에서 바람직하게는 실리콘 검-유체 배합물의 일부로서 조성물에 혼입된 실리콘 검을 포함한다. 실리콘 검이 실리콘 검-유체 배합물의 일부로서 혼입되는 경우, 실리콘 검은 바람직하게는 실리콘 검-유체 배합물의 약 5% 내지 약 40%, 특히 약 10% 내지 20 중량% 를 이룬다. 본원에서 적합한 실리콘 검-유체 배합물은 본질적으로 하기로 이루어진 혼합물이다:
(i) 분자량이 약 200,000 내지 약 4,000,000 이고 디메티콘올, 플루오로실리콘 및 디메티콘 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 실리콘; 및
(ii) 실리콘 유체이고, 점도가 약 0.65 ㎟·s-1 내지 약 100 ㎟·s- 1 인 담체,
상기 i) 대 ii) 의 비가 약 10:90 내지 약 20:80 이고, 상기 실리콘 검-기재의 성분이 약 100 ㎟·s-1 내지 약 100,000 ㎟·s-1, 바람직하게는 500 ㎟·s-1 내지 약 10,000 ㎟·s- 1 의 최종 점도를 가짐.
본원에서 실리콘 오일상에 사용하기 적합한 추가의 실리콘 성분은 임의로 유체 담체에 분산되어 있는 가교 폴리오르가노실록산 중합체를 포함한다. 일반적으로, 존재하는 경우, 가교 폴리오르가노실록산 중합체는 이의 담체 (존재하는 경우) 와 함께 조성물의 약 0.1% 내지 약 20%, 바람직하게는 약 0.5% 내지 약 10%, 더욱 바람직하게는 약 0.5% 내지 약 5% 를 포함한다. 이러한 중합체는 가교제에 의해 가교된 폴리오르가노실록산 중합체를 포함한다 (예를 들어, WO98/22085 참조). 본원에 사용하기 적합한 폴리오르가노실록산 중합체의 예는, 제한없이, 메틸 비닐 디메티콘, 메틸 비닐 디페닐 디메티콘 및 메틸 비닐 페닐 메틸 디페닐 디메티콘을 포함한다.
본원에서 실리콘 오일상에 사용하기 적합한 또 다른 부류의 실리콘 성분은 하나 이상의 폴리디오르가노실록산 분절 및 하나 이상의 폴리옥시알킬렌 분절을 함유하는 폴리디오르가노실록산-폴리옥시알킬렌 공중합체를 포함한다 (예를 들어, WO98/22085 참조). 적합한 폴리디오르가노실록산-폴리알킬렌 공중합체는 Wacker-Chemie GmbH 에서 상표명 BELSIL® 로 시판된다. 본원에서 사용하기 특히 바람직한 공중합체 유체 배합물은 CTFA 호칭 디메티콘/디메티콘 코폴리올을 갖는 Dow Corning DC3225C 를 포함한다.
추가의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 유기 선스크린을 포함한다. 일부 구현예에서, 적합한 선스크린은 UVA 흡수 특성을 갖는 반면, 다른 것들은 UVB 흡수 특성을 갖고, 또한 다른 것들은 이들의 혼합물을 포함한다. 정확한 양의 선스크린 활성물은, 조성물의 원하는 자외선 차단 지수 (즉, "SPF") 및 원하는 UV 보호 수준에 따라 변한다. SPF 는 통상 사용되는 홍반에 대한 선스크린의 광보호 측정치이다. SPF 는 동일한 개체에서 보호된 피부에 대한 최소의 홍반을 생성하는데 필요한 자외선 에너지 대 보호되지 않은 피부에 대한 동일한 최소의 홍반을 생성하는데 필요한 자외선 에너지의 비로서 정의된다. 선스크린의 사용량은 바람직하게는 약 2% 내지 약 20%, 더욱 바람직하게는 약 4% 내지 약 14% 이다. 적합한 선스크린은, 제한없이, 미국, 일본, 유럽 및 호주에서 사용 승인된 것들을 포함한다. 본 발명의 조성물은 바람직하게는 약 2 내지 약 30, 바람직하게는 약 4 내지 30, 더욱 바람직하게는 약 4 내지 약 15 의 SPF 를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 약 320㎚ 내지 약 400㎚ 의 파장을 갖는 UV 복사선을 흡수하는 하나 이상의 UVA 흡수 선스크린 활성물을 포함한다. 적합한 UVA 선스크린 활성물은, 제한없이, 디벤조일메탄 (예를 들어, Lowe and Shaath (eds.), Sunscreens : Development , Evaluation , and Regulatory Aspects, Marcel Dekker, Inc. 참조) 유도체, 안트라닐레이트 유도체, 예컨대 메틸안트라닐레이트 및 호모메틸, 1-N-아세틸안트라닐레이트 및 이들의 혼합물을 포함한다. UVA 흡수 선스크린 활성물은 바람직하게는 독립적으로 또는 조성물에 존재할 수 있는 다른 UV 보호 활성물과 조합되어 광범위한 스펙트럼 UVA 보호를 제공하기에 충분한 양으로 존재한다.
적합한 UVA 선스크린 활성물은 디벤조일메탄 선스크린 활성물 및 이들의 유도체를 포함한다. 이들은, 제한없이, 2-메틸디벤조일메탄, 4-메틸디벤조일메탄, 4-이소프로필디벤조일메탄, 4-tert-부틸디벤조일메탄, 2,4-디메틸디벤조일메탄, 2,5-디메틸디벤조일메탄, 4,4'-디이소프로필벤조일메탄, 4-(1,1-디메틸에틸)-4'-메톡시디벤조일메탄, 2-메틸-5-이소프로필-4'-메톡시디벤조일메탄, 2-메틸-5-tert-부틸-4'-메톡시-디벤조일메탄, 2,4-디메틸-4'-메톡시디벤조일메탄, 2,6-디메틸-4'-tert-부틸-4'-메톡시디벤조일메탄 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 것을 포함한다. 바람직한 디벤조일 선스크린 활성물은 4-(1,1-디메틸에틸)-4'-메톡시디벤조일메탄, 4-이소프로필디벤조일메탄 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 것을 포함한다. 바람직한 선스크린 활성물은 4-(1,1-디메틸에틸)-4'-메톡시디벤조일메탄이다.
부틸 메톡시디벤조일메탄 또는 "아보벤존" 이라고도 알려져 있는 선스크린 활성물 4-(1,1-디메틸에틸)-4'-메톡시디벤조일메탄은 Givaudan Roure (International) S. A. 에서 Parsol® 1789 및 Merck & Co., Inc. 에서 Eusolex® 9020 의 명칭으로 시판된다. 이소프로필디벤조일메탄으로도 알려져 있는 선스크린 4-이소프로필디벤조일메탄은 Merck 에서 Eusolex® 8020 의 명칭으로 시판된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 추가로 약 290㎚ 내지 약 320㎚ 의 파장을 갖는 UV 복사선을 흡수하는 하나 이상의 UVB 선스크린 활성물을 포함한다. 조성물은 독립적으로 또는 조성물에 존재할 수 있는 UV 보호 활성물과 조합되어 UVB 보호를 제공하는데 효과적이고 안전한 양의 UVB 선스크린 활성물을 포함한다. 조성물은 적절한 규제 권한(들)에 의해 제시된 바와 같은 또는 약 0.1 중량% 내지 약 20 중량%, 바람직하게는 약 0.1 중량% 내지 약 12 중량%, 더욱 바람직하게는 약 0.5 중량% 내지 약 8 중량%의 각각의 UVB 흡수 유기 선스크린을 포함한다.
다양한 UVB 선스크린 활성물은 본원에 사용하기 적합하다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,087,372; 미국 특허 번호 5,073,371; 미국 특허 번호 5,073,372; 미국 특허 번호 4,937,370; 및 미국 특허 번호 4,999,186). 바람직한 UVB 선스크린 활성물은 2-에틸헥실-2-시아노-3,2-에틸헥실 N,N-디메틸-p-아미노벤조에이트, p-아미노벤조산, 옥시벤존, 호모멘틸 살리실레이트, 옥틸 살리실레이트, 4,4'-메톡시-t-부틸디벤조일메탄, 4-이소프로필 디벤조일메탄, 3-벤질리덴 캠퍼, 3-(4-메틸벤질리덴) 캠퍼, 3-디페닐아크릴레이트, 2-페닐-벤즈이미다졸-5-술폰산 (PBSA), 신나메이트 에스테르 및 2-에틸헥실-p-메톡시신나메이트와 같은 이의 유도체, 살리실레이트 에스테르 및 트리에탄올아민 살리실레이트, 에틸헥실 살리실레이트와 같은 이의 유도체, 옥틸디메틸 파라-아미노벤조산, 캠퍼 유도체 및 이의 유도체, 및 이들의 혼합물로부터 선택된다. 바람직한 유기 선스크린 활성물은 2-에틸헥실-2-시아노-3,3-디페닐아크릴레이트, 2-페닐-벤즈이미다졸-5-술폰산 (PBSA), 옥틸-p-메톡시신나메이트, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 산성 선스크린의 염 및 산 중화 형태가 또한 본원에서 유용하다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 발명은 예를 들어 제한없이 하기를 포함하는 임의의 유기 UV-A 및 UV-B 필터를 포함하는 조성물을 제공한다:
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
일부 구현예에서, UVA 선스크린을 안정화시켜 이것이 UV 복사선에 대한 노출에 대해 광분해하는 것을 방지하여 UVA 보호 효능을 유지하기 위해, 하나 이상의 작용제를 본 발명에서 유용한 임의의 조성물에 첨가한다. 광범위한 화합물이 안정화 특성을 갖는다고 보고되어 있고, UVA 선스크린 및 조성물 모두를 전체적으로 보완하도록 선택되어야 한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,972,316; 5,968,485; 5,935,556; 5,827,508; 및 WO 00/06110 참조). 본 발명에 사용하기 위한 안정화제의 바람직한 예는 2-에틸헥실-2-시아노-3,3-디페닐아크릴레이트, 에틸-2-시아노-3,3-디페닐아크릴레이트, 2-에틸헥실-3,3-디페닐아크릴레이트, 에틸-3,3-비스(4-메톡시페닐)아크릴레이트, 디에틸헥실 2,6 나프탈레이트 및 이들의 혼합물 (Symrise Chemical Company) 을 포함한다.
일부 바람직한 구현예에서, 본 발명은 피부 보호 크림, 세정 밀크, 선 스크린 로션, 영양 크림, 데이 크림, 나이트 크림 등으로서 사용하기 적합한 미용 및/또는 국부 피부과적 제제를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 약물 (즉, 약학) 조성물의 성분을 사용한다. 추가적인 구현예에서, 본 발명은 장식용 화장품 (예를 들어, 메이크업 제형) 을 사용한다.
일부 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명은 미용 및/또는 피부 케어 제제에 유용한 선스크린을 제공한다. 본 발명의 구현예에 따라 사용되는 활성 성분에 더해, 일부 구현예에서, 이러한 제제는 바람직하게는 추가적으로 하나 이상의 광대역 필터 및/또는 하나 이상의 UVA 필터 물질 및/또는 하나 이상의 UVB 필터 물질 및/또는 하나 이상의 무기 안료를 포함한다.
또한 추가의 구현예에서, 본 발명은 UV 보호 성분을 가지나 주로 선스크린이 아닌 개인 케어 조성물을 제공한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, UV-A 및/또는 UV-B 필터 물질은 데이 크림 및/또는 헤어 케어 조성물에 혼입된다.
추가적인 구현예에서, 본 발명의 개인 케어 조성물은 이러한 제제에 통상 사용되는, 화장용으로 활성인 성분, 보조제 및/또는 첨가제를 포함한다 (예를 들어, 항산화제, 보존제, 살세균제, 향료, 거품 억제제, 염료, 착색 작용을 갖는 안료, 증점제, 표면-활성 물질, 에멀젼화제, 진정제, 보습제 및/또는 습윤성제, 지방, 오일, 왁스 또는 미용 또는 피부과적 제형의 다른 종래의 성분, 예컨대 알코올, 폴리올, 중합체, 거품 안정화제, 전해질, 유기 용매 또는 실리콘 유도체). 실제로, 다양한 화합물이 제품 및 사용자에게 적절한 경우 본 발명의 다양한 구현예에서 사용될 것이라고 고려된다.
일부 구현예에서, 이러한 조성물의 피부 지속성을 향상시키기 위해, 특히 물에 의해 세척되어지거나 벗겨지는 것에 대한 내성을 증강기키기 위해 하나 이상의 작용제를 본 발명에서 유용한 임의의 조성물에 첨가한다. 예는, 제한없이, 아크릴레이트/C12 -22 알킬메타크릴레이트 공중합체, 아크릴레이트/아크릴레이트 공중합체, 디메티콘, 디메티콘올, 그래프트-코폴리(디메틸실록산/i-부틸 메타크릴레이트), 라우릴 디메티콘, PVP/헥사데칸 공중합체, PVP/에이코센 공중합체, 트리콘타닐 PVP 및 트리메톡시실록실리케이트를 포함한다.
유기 선스크린에 더해, 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 추가적으로 무기의 물리적 선블록을 포함한다 (예를 들어, TFA International Cosmetic Ingredient Dictionary, 6th Edition, pp. 1026-28 및 1103 [1995]; Sayre et al., J. Soc. Cosmet. Chem., 41:103-109 [1990]; 및 상기의 Lowe et al. 참조). 바람직한 무기의 물리적 선블록은 산화아연 및 이산화티탄 및 이들의 혼합물을 포함한다.
바람직한 구현예에서 사용되는 경우, 물리적 선블록은 본 발명의 조성물이 피부에서 투명 (즉, 비-백화) 하도록 하는 양, 바람직하게는 약 0.5 중량% 내지 약 20 중량%, 바람직하게는 약 0.5 중량% 내지 약 10 중량%, 더욱 바람직하게는 약 0.5 중량% 내지 5 중량% 로 존재한다. 이산화티탄이 사용되는 경우, 아나타아제, 루틸 또는 비정질 구조를 가질 수 있다. 선스크린 용도용 미크론화된 등급 이산화티탄 및 산화아연의 제조사는, 제한없이, Tayca Corporation, Uniqema, Shinetsu Chemical Corporation, Kerr-McGee, Nanophase, Nanosource, Sachtleben, Elementis, 및 BASF Corporation 뿐만 아니라 이들의 유통 중개상 및 선스크린용 물질을 추가로 가공하는 회사를 포함한다. 물리적 선블록 입자 (예를 들어, 이산화티탄 및 산화아연) 는 제한없이 아미노산, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 알루미늄 라우레이트 등과 같은 알루미늄 화합물; 카르복실산 및 이의 염 (예를 들어, 스테아르산 및 이의 염); 레시틴과 같은 인지질; 유기 실리콘 화합물; 실리카 및 실리케이트와 같은 무기 실리콘 화합물 및 이들의 혼합물을 포함하는 다양한 물질로 코팅되거나 코팅되지 않을 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 약 0.1 중량% 내지 약 15 중량%, 바람직하게는 약 0.1 중량% 내지 약 7 중량%, 더욱 바람직하게는 약 0.5 중량% 내지 약 5 중량% 의 무기 선스크린을 포함한다.
일부 에멀젼화제의 유해한 효과에 더해, 다른 인자에 대한 노출은 피부 및 헤어에 해롭다는 것이 알려져 있다. 예를 들어, 피부에 대한 태양 복사 중 자외선 부분의 폐해는 일반적으로 알려져 있다. 파장이 290 ㎚ 미만인 복사선 (즉, UVC 영역) 이 지구 대기 중 오존층에 의해 흡수되는 반면, 290 ㎚ 내지 320 ㎚ 의 범위의 복사선 (즉, UVB 영역) 은 홍반, 단순 햇빛 화상 또는 심지어 다양한 중증도의 화상을 야기한다. 햇빛의 홍반 활성 최대는 약 308 ㎚ 의 비교적 좁은 영역으로서 제시된다.
다수의 화합물은 유해한 UVB 복사선에 대한 보호를 제공하는 것으로 알려져 있다. 대개, 이러한 화합물은 3-벤질레딘캠퍼, 4-아미노벤조산, 신남산, 살리실산, 벤조페논 및 2-페닐-벤즈이미다졸의 유도체이다.
약 320 ㎚ 내지 약 400 ㎚ 범위, UVA 영역에 대한 이용가능한 필터 물질을 갖는 것이 또한 중요한데, 이의 복사선이 또한 손상을 야기할 수 있기 때문이다. 320 ㎚ 내지 400 ㎚ 의 파장을 갖는 장파장 UV-A 복사선이 오직 극미한 생물학적 작용을 갖고, 따라서 UV-B 선이 인간 피부에 대한 대부분의 광분해에 대한 원인일 수 있다고 오랫동안 부정확하게 추정되어 왔다. 그러나, 다수의 최근 연구에서는 피부의 광역학, 특히 광독성, 반응 및 만성 변화의 촉발에 대해 UV-A 복사선이 UV-B 복사선보다 훨씬 더 유해하다고 나타났다. 또한, UV-B 복사선의 폐해는 UV-A 복사선에 대한 노출에 의해 더욱 심해질 수 있다.
그 자체 및 매우 정상적인 일상 조건 하에서 UV-A 복사선이 단기간 내에 피부의 구조 및 강도에 필수적으로 중요한 콜라겐 및 엘라스틴 섬유를 손상시키기에 충분하다는 것을 나타냈다. 이는 피부가 조기 "노화" 되도록 피부에서 만성 광-유도 변화를 일으킨다. 광에 의해 노화된 피부의 임상 외양은 주름 및 주름살 증가 및 불규칙적이고 깊은 주름의 선명함을 포함한다. 또한, 광-유도 피부 노화에 의해 영향을 받는 피부 영역은 종종 불규칙적인 색소침착을 보인다. 일부 경우에, 갈색 부분, 각질, 암종 또는 악성 흑색종을 발생시킨다. 일상의 UV 노출의 결과로서 조기 노화된 피부는 또한 랑게르한스 세포 활성 저하 및 경미한 만성 염증을 갖는 것을 특징으로 한다.
지구에 도달하는 자외선 복사선 중 약 90% 는 UV-A 선으로 이루어진다. 지구에 도달하는 UV-B 복사선의 양이 다수의 인자 (예를 들어, 햇수와 일수의 기간 및/또는 위도) 에 따라 광범위하게 변하나, 지구에 도달하는 UV-A 복사선 수준은 햇수와 일수의 기간 또는 지리학적 인자에 관계없이 일상 기준으로 비교적 일정하다. 추가로, UV-A 복사선 대다수는 살아있는 표피에 침투하는 반면, 약 70% 의 UV-B 선은 각질층에 의해 보유된다. 따라서, 예를 들어 피부에 대한 미용 또는 피부과적 제형의 형태의 광보호 필터 물질의 적용에 의한 UV-A 선에 대한 예방 보호가 근본적으로 중요하다.
일반적으로, 광보호 필터 물질의 흡수 거동은 매우 잘 알려져 있고, 기록되어 있는데, 가장 산업화된 국가가 이러한 물질의 사용에 대해, 주로 이러한 물질을 혼입하는 각 제품을 동반하는 기록에 대한 매우 엄격한 기준을 시행하는 포지티브 리스트를 가지기 때문이다. 최종 제형 중 물질의 농도에 있어서, 흡수값은 가이드를 제공하는데, 피부 또는 피부 자체 표면의 물질의 상호작용이 종종 조성물이 각 개인에 대한 수행에 영향을 줄 수 있는 변수를 나타내기 때문이다. 그러나, 통상적으로, 필터 물질이 피부의 각질층에 그리고 각질층 상에 얼마나 균일하고 두껍게 분포하는지를 사전에 추정하는 것이 곤란하다.
UV-A 보호 성능을 시험하기 위해, 당업계에 알려져 있는 IPD 방법 (IPD 5 즉각적인 안료 감광) 이 통상 사용된다. 이 방법은 자외선 차단 지수의 측정과 유사하고, 광보호 조성물로 보호된 피부가 보호되지 않은 피부에 대해 생성되는 것과 동일한 색소침착 발생 전에 UV-A 로 조사될 수 있는 기간을 나타내는 방법을 제공한다.
유럽에서 확립된 또다른 시험 방법은 호주 표준 AS/NZS 2604:1997 이다. 이 방법에서, UV-A 영역 내 제제의 흡수를 측정한다. 상기 표준을 충족시키기 위해, 제제는 320-360 ㎚ 영역의 UV-A 복사선의 90% 이상을 흡수해야 한다.
UV-A 영역에서 높은 필터 작용을 또한 나타내는 공지된 광보호 필터 물질의 사용 농도가 종종 고체 형태인 다른 물질과 조합된다는 사실 자체에 의해 제한되는 것이 선스크린 조성물의 제형에 중요하다. 따라서, 비교적 높은 자외선 차단 지수 및 UV-A 보호 성능을 달성하는데 관련있는 특정 제형이 곤란하다. 그러나, 당업자는 일반적으로 이러한 곤란을 극복하고/하거나 보완하기 위한 수단을 알고 있다.
광보호 필터 물질이 일반적으로 고비용이고 일부 광보호 필터 물질이 또한 비교적 높은 농도로 미용 및/또는 피부과적 제제에 혼입되기 곤란하기 때문에, 본 발명의 일부 구현예에서는, 특별히 저농도의 종래의 UV-A 광보호 필터 물질을 가짐에도 불구하고 허용가능하거나 심지어 높은 UV-A 보호 성능을 달성하는 단순하고 비용-효율적인 제제를 제공하는 것을 고안했다.
그러나, 당업계에 알려져 있는 바와 같이, UV 복사선은 또한 피부 대사에 개입하는 생성물을 생성하는 광화학 반응을 야기할 수 있다. 이러한 광화학 반응 생성물은 주로 자유-라디칼 화합물 (예를 들어, 히드록실 라디칼) 이다. 피부 자체에서 형성되는 한정되지 않는 자유-라디칼 광생성물은 또한 높은 반응성의 결과로 조절되지 않은 2 차 반응을 나타낼 수 있다. 그러나, 산소 분자의 비-자유-라디칼 여기된 상태인 일중항 산소는 또한 단명하는 에폭시드 등이 그랬을 수 있듯이 UV 조사 동안 발생할 수 있다. 일중항 산소는, 예를 들어, 이의 반응성 증가에 의해 정상적인 삼중항 산소 (자유-라디칼 기저 상태) 와 상이하다. 그러나, 산소 분자의 여기된 반응성 "자유-라디칼" 삼중항 상태도 존재한다. 따라서, 이러한 반응을 방지하기 위해, 항산화제 및/또는 자유-라디칼 제거제가 미용 및/또는 피부과적 제형에 사용된다.
미용 및/또는 피부과적 광보호 제형에서 광보호제로 통상 사용되는 화합물은 일반적으로 양호한 광보호를 제공하는 것을 특징으로 한다. 그러나, 이들은 종종 충족스러운 방식으로 원하는 제형에 혼입되기 곤란하다는 단점을 가진다.
상기 지시되는 바와 같이, 자외선 차단 지수 (SPF) 는 광보호 조성물로 보호된 피부가 보호되지 않은 피부에 대한 동일한 홍반 반응 발생 전에 조사될 수 있는 기간을 지시한다 (즉, SPF = 10 은 보호되지 않은 피부에 비해 10 배 지속됨). 소비자는 "SPF" 의미를 매우 잘 알고 있고, 제품에 지시되어 있는 SPF 값에 기초하여 피부 및/또는 헤어 케어 제품을 선택한다. 소비자들은 대체로 자외선 노출과 피부암뿐만 아니라 조기 노화 간의 연관성의 대중적 의식 증가로 인해, 자외선 차단 지수에 대한 제조사로부터의 신뢰있는 정보를 받기를 기대한다. 또한, 세계 일부에서, 오존층의 분해가 주요 관심사이다. 피부 유형 및 예상되는 자외선 노출에 따라, 소비자들은 낮거나 높은 SPF 를 갖는 제품을 선택한다. 그러나, 특히 어린이들 및 흰 살결을 갖는 사람들에 적용되는 제품에 대해 소비자들이 비교적 높은 SPF 지수를 선택하는 경향을 보인다. 일부 구현예에서, 본 발명은 비교적 낮은 농도의 종래의 광보호 필터 물질을 갖고, 또한 소비자에게 허용가능한 SPF 값을 갖는 조성물을 제공한다.
일부 바람직한 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 선스크린 제제의 기본 성분은 하기를 포함한다: 물 또는 수용액; 에탄올성 수용액; 천연 오일 및/또는 화학적 개질된 천연 오일 및/또는 합성 오일; 지방, 왁스 및 기타 천연 및 합성 지방 물질, 바람직하게는 저탄소수의 알코올 (예를 들어, 이소프로판올, 프로필렌 글리콜 또는 글리세롤) 과 지방산의 에스테르, 또는 저탄소수의 알칸산 또는 지방산과 지방 알코올의 에스테르; 저탄소수의 알코올, 디올 또는 폴리올, 및 이들의 에테르, 바람직하게는 에탄올, 이소프로판올, 프로필렌 글리콜, 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜 모노에틸 또는 모노부틸 에테르, 프로필렌 글리콜 모노메틸, 모노에틸 또는 모노부틸 에테르, 디에틸렌 글리콜 모노메틸 또는 모노에틸 에테르 및 유사 생성물. 대안적 바람직한 구현예에서, 상기 성분 중 2 종 이상의 혼합물이 본 발명에서 사용된다.
일부 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 또한 보존제를 포함한다. 이러한 보존제는, 제한없이, 펜틸렌 글리콜, 에틸렌 디아민 테트라 아세테이트 (EDTA) 및 이들의 염, 클로르헥시딘 (및 이의 디아세테이트, 디히드로클로라이드, 디글루코네이트 유도체), 1,1,1-트리클로로-2-메틸-2-프로판올, 파라클로로 메탁실레놀, 폴리헥사메틸렌비구아니드 히드로클로라이드, 데히드로아세트산, 디아졸리디닐 우레아, 2,4-디클로로벤질 알코올, 4,4-디메틸-1,3-옥사졸리딘, 포름알데히드 (예를 들어, 10-15% 메탄올을 가져 중합을 방지하는 37% 수용액), 글루타르알데히드, 디메틸리단토인, 이미다졸리디닐 우레아, 5-클로로-2-메틸-4-이소티아졸린-3-온, 오르토-페닐페놀, 4-히드록시벤조산 에스테르 (예를 들어, "파라벤") 및 이의 메틸-, 에틸-, 프로필-, 이소프로필-, 부틸- 및 이소부틸-에스테르, 트리클로산, 2-페녹시에탄올, 페닐수은 아세테이트, 보레이트, 니트레이트, 쿼터늄-15, 살리실레이트, 살리실산 및 이의 염, 칼슘, 칼슘 소르베이트, 소르브산 및 이의 염, 요오도프로파닐 부틸카르바메이트 아연 피리티온, 벤질 알코올, 5-브로모-5-니트로-1,3-디옥산, 2-브로모-2-니트로프로판-1,3-디올, 벤조산 및 이의 염, 술파이트, 바이술파이트, 페녹시에탄올, 클로르옥실에놀, 디아졸리디닐 우레아, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 이소프로필파라벤, 이소부틸파라벤, 부틸파라벤, 에틸파라벤, 페녹시에탄올 PG 및 벤즈알코늄 클로라이드를 포함한다.
또한 추가의 구현예에서, 보존제, 예컨대 식품 및 사료용에 사용되는 보존제가 본 발명의 다양한 조성물에 사용된다. 하기 표는 이러한 화합물 및 각 화합물에 대한 E 번호를 제공한다. 그러나, 추가적인 보존제가 본 발명의 다양한 구현예에서 사용될 것이라고 고려되므로, 본 발명이 이러한 특정 보존제에 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
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Figure pct00054
다양한 구현예에서 사용되는 추가적인 보존제는, 제한없이, 디브로모디시아노부탄 (2-브로모-2-브로모메틸글루타로디니트릴), 3-요오도-2-프로피닐부틸카르바메이트, 2-브로모-2-니트로프로판-1,3-디올, 이미다졸리디닐우레아, 5-클로로-2-메틸-4-이소티아졸린-3-온, 2-클로로아세트아미드, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤질 알코올 및 포름알데히드 공여체를 포함한다. 본 발명의 다양한 구현예에서 사용되는 추가의 보존제는 다수의 미생물에 대한 살세균 및 살진균 효과로 인해 페닐 히드록시알킬 에테르, 특히 "페녹시에탄올" 로 알려진 화합물을 포함한다.
중화제, 향료 및 향료 가용화제 및 착색제와 같은 다양한 임의적 성분은 또한 본원의 조성물 일부에 사용된다. 임의의 추가 성분이 제품의 피부 부드러움/매끄러움 이익을 증강시키는 것이 바람직하다. 또한, 임의의 이러한 성분이 제품의 심미적 특성에 부정적인 영향을 주지 않는 것이 바람직하다.
다른 임의적 물질은 각질 용해제, 및 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 5%의 수준의 수용성 및/또는 가용화성 보존제 (예를 들어, Germall 115, 히드록시벤조산의 메틸, 에틸, 프로필 및 부틸 에스테르, 벤질 알코올, Lonza 사제 상품명 Glydant Plus 으로 시판되는 DMDM 히단토인 요오도프로파닐 부틸카르바네이트; EDTA, EUXYL® K400, 브로모폴 (2-브로모-2-니트로프로판-1,3-디올) 및 페녹시프로판올); 항세균성물 (예를 들어, IRGASAN®) 및 페녹시에탄올 (바람직하게는 약 0.1% 내지 약 5%의 수준); 및 가용성 또는 콜로이드-가용성 보습제, 예컨대 히알루론산, 콘드로이틴 술페이트 및 전분-그래프트 나트륨 폴리아크릴레이트 (예를 들어, Celanese Superabsorbent Materials, Portsmith, VA 사제 SANWET® IM-1000, IM-1500 및 IM-2500, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,076,663 참조; 비타민, 예컨대 비타민 A, 비타민 C, 비타민 E 및 이들의 유도체 및 이들의 빌딩 블록, 예컨대 피탄트리올, 및 비타민 K 및 이들의 성분, 예컨대 지방 알코올 도데카트리에놀; 알파 및 베타 히드록시산; 알로에 베라; 스핑고신 및 피토스핑고신, 콜레스테롤; 피부 미백제; N-아세틸 시스테인; 착색제; 항세균제, 예컨대 트리클로산 및 트리클로로카본으로도 알려진 TCC/TCS; 향료 및 향료 가용화제를 포함한다. 알파 히드록시산의 예는 글리콜산, 락트산, 말산, 시트르산, 암모늄 글리콜레이트와의 글리콜산, 알파-히드록시 에탄산, 알파-히드록시옥탄산, 알파-히드록시카프릴산, 히드록시카프릴산, 혼합 과일산, 트리-알파 히드록시 과일산, 삼중 과일산, 사탕수수 추출물, 알파 히드록시 및 식물성 추출물, 1-알파 히드록시산 및 가교된 지방산의 글리코머 (예를 들어, 알파 뉴트륨) 를 포함한다. 알파 히드록시산의 바람직한 예는 글리콜산 및 락트산이다. 알파 히드록시산이 약 10% 이하의 수준으로 사용되는 것이 바람직하다. 천연 원천으로부터의 또는 실험실에서 합성에 의한 수득에 관계없이 임의의 적합한 첨가 화합물이 본 발명에서 사용되는 것과 같이, 본 발명이 임의의 특정 원천 유래의 임의의 특정 화합물에 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
다른 임의적 물질은 수용성 또는 가용화성 보존제, 예컨대 Germall 115, 히드록시벤조산의 메틸, 에틸, 프로필 및 부틸 에스테르, 벤질 알코올, Lonza 에서 상품명 Glydant Plus 로 시판되는 DMDM 히단토인 요오도프로파닐 부틸카르바네이트, EDTA, Euxyl (RTM) K400, 브로모폴 (2-브로모-2-니트로프로판-1,3-디올), 펜틸렌 글리콜 및 페녹시프로판올; 항세균성물, 예컨대 Irgasan (RTM) 및 페녹시에탄올 (바람직하게는 0.1% 내지 약 5%의 수준) 을 바람직하게는 각각 약 0.1% 내지 약 5%의 수준으로 포함한다. 트리클로산 및 트리클로로카본으로도 알려진 TCC/TCS 와 같은 항세균제는 또한 본 발명의 조성물에서 유용하다.
제한없이 2,4,4'-트리클로로-2'-히드록시디페닐 에테르 (즉, IRGASAN®), 1,6-디(4-클로로페닐바이구아니도)헥산 (즉, CHLORHEXIDIN), 3,4,4'-트리클로로카르바닐리드, 4 차 암모늄 화합물, 정향유, 박하유, 타임유, 트리에틸 시트레이트, FARNESOL® (3,7,11-트리메틸-2,6,10-도데카트리엔-1-올) 및 DE-37 40 186, DE-39 38 140, DE-42 04 321, DE-42 29 707, DE-43 09 372, DE-44 11 664, DE-195 41 967, DE-195 43 695, DE-195 43 696, DE-195 47 160, DE-196 02 108, DE-196 02 110, DE-196 02 111, DE-196 31 003, DE-196 31 004, DE-196 34 019, DE-42 29 737, DE-42 37 081, DE-43 24 219, DE-44 29 467, DE-44 23 410, 및 DE-195 16 705 (상기 특허들은 본원에 참고로서 포함됨) 에 기재되어 있는 활성 성분 및/또는 활성 성분 조합을 포함하는 다른 살균제는 또한 본 발명의 다양한 구현예에서 사용하기 적합하다. 또한 추가의 구현예에서, 탄산수소나트륨은 본 발명의 일부 조성물에 포함된다. 그러나, 이러한 효과를 갖는 다양한 화합물이 본 발명의 다양한 구현예에서 사용될 것과 같이, 본 발명이 임의의 특정 살균제 또는 임의의 살균제 조합에 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
본 발명의 개인 케어 조성물의 추가적인 구현예에서, 항-자극제 및/또는 항-염증 활성물과 같은 화합물이 포함된다. 일부 구현예에서, 바틸 알코올 (a-옥타데실 글리세릴 에테르), 셀라킬 알코올 (a-9-옥타데세닐 글리세릴 에테르), 키밀 알코올 (a-헥사데실 글리세릴 에테르), 비사볼롤 및/또는 판테놀이 포함된다. 그러나, 이러한 적용에 적합한 다양한 화합물이 본 발명에서 사용되는 것과 같이, 본 발명이 임의의 특정 항-자극제(들) 및/또는 항-염증제(들)의 혼입에 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
본원에서 산기 함유 친수성 겔화제를 중화시키는데 사용하기 적합한 중화제는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 모노에탄올아민, 디에탄올아민, 아미노 메틸 프로판올, 트리스-완충제 및 트리에탄올아민을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 다른 임의적 물질은 당업자에게 알려져 있는 다수의 기능성 및/또는 활성 성분 중 임의의 것을 포함한다 (예를 들어, McCutcheon's Functional Materials, North American and International Editions, MC Publishing Co. [2003] 참조). 상기 지시되는 바와 같이, 비제한 예는 각질 용해제; 가용성 또는 콜로이드-가용성 보습제, 예컨대 히알루론산 및 콘드로이틴 술페이트; 비타민, 예컨대 비타민 A, 비타민 C, 비타민 E, 비타민 K 및 이들의 유도체 및 이들의 빌딩 블록; 피탄트리올; 지방 알코올, 예컨대 도데카트리에놀; 알파 및 베타 히드록시산; 알로에 베라; 스핑고신 및 피토스핑고신, 콜레스테롤; 피부 미백제; N-아세틸 시스테인; 착색제를 포함하고; 알파 히드록시산의 예는 글리콜산, 락트산, 말산 및 시트르산 (합성 또는 천연 원천 유래에 관계없이 그리고 단독으로 또는 조합되어 사용되는지 관계없이) 및 이들의 에스테르 또는 적절한 완충 조합을 포함한다. 알파-히드록시산의 다른 예는 하기를 포함한다: 알파-히드록시 에탄산, 알파-히드록시옥탄산, 알파-히드록시카프릴산 및 히드록시카프릴산. 알파 히드록시산의 바람직한 예는 글리콜산 및 락트산을 포함한다. 알파 히드록시산이 약 10% 이하의 수준으로 사용되는 것이 바람직하다.
임의적 물질은, 수용성인 경우 유상 성분의 총 수준에 기여하고 포함되는 안료를 포함한다. 본 발명의 조성물에 사용하기 적합한 안료는 유기 및/또는 무기일 수 있다. 용어 "안료" 에는 낮은 색 또는 광택을 갖는 물질, 예컨대 매트 마감제, 광산란제 및 제형 보조제, 예컨대 운모 (마이카 (mica)), 세라사이트 및 카르보네이트 염이 또한 포함된다. 적합한 안료의 추가의 예는 이산화티탄 (티타늄 이산화물 (titanium dioxide)), 산화철 (철 산화물 (iron oxide)), 글루타메이트 산화철, 산화아연, 비스무트 옥시클로라이드, 울트라마린 블루 (이들 모두는 예비-분산 및/또는 예비-코팅될 수 있거나 아닐 수 있음) D&C 염료 및 레이크, FD&C 색, 천연색 첨가제, 예컨대 카민, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 조성물의 유형에 따라, 안료의 혼합물이 본 발명의 바람직한 구현예에서 통상 사용된다. 본원에 사용하기 바람직한 안료는 보습, 피부 감촉, 피부 외양 및 에멀젼 상용성의 관점으로부터 처리된 안료이다. 일부 구현예에서, 안료는 제한없이 아미노산, 실리콘, 레시틴 및 에스테르 오일을 포함하는 화합물로 처리된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 제한없이 금속산화물 기재의 무기 안료 및/또는 다소 수용성 또는 불용성인 금속 화합물, 예컨대 산화아연 (ZnO), 티탄 (TiO2), 철 (예를 들어, Fe2O3), 지르코늄 (ZrO2), 실리카 (SiO2), 망간 (예를 들어, MnO), 알루미늄 (Al2O3), 세륨 (예를 들어, Ce2O3), 및 이들 산화물의 혼합 조성물 및 이들의 배합물을 포함하는 안료를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 바람직한 구현예에서, 금속산화물은 초미립자인 반면, 대안적 바람직한 구현예에서, 금속산화물은 안료 등급이다. 또한 일부 추가적 구현예에서, 안료는 이들이 표면 처리되도록 "코팅"된다. 일부 바람직한 구현예에서, 코팅물은 얇고, 소수성인 필름층을 포함하는 반면, 다른 구현예에서는, 코팅물은 얇고, 친수성인 필름층을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 본 발명의 조성물에 대해 사용되는 용어 "안료", "착색 안료" 및 "염료" 는 조성물에 색을 제공하고/하거나 조성물이 적용되는 표면 (예를 들어, 피부 및/또는 헤어) 에 색을 부여하는 임의의 화합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 염료 및 안료는 Cosmetics Directive 또는 EC 에 의해 제공되는 미용 염색제의 목록으로부터 선택된다. 대다수 경우에, 이러한 염료 및 안료는 식품에 승인되는 염료와 동일하다. 바람직한 안료/염료는 예를 들어, 이산화티탄, 운모, 산화철 (예를 들어, Fe2O3, Fe3O4, FeO(OH)) 및/또는 산화주석을 포함한다. 유리한 안료/염료는 예를 들어 카민, 베를린 블루, 산화크롬 그린, 울트라마린 블루 및/또는 망간 바이올렛을 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 안료/염료는 제한없이 하기 표의 것들을 포함한다. 색 지수 번호 (Colour Index Number, CIN) 는 당업계에 알려져 있다 (Society of Dyers and Colourists, Rowe Colour Index, 3rd Edition, Bradford, England, [1971] 참조).
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Figure pct00057
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또한 추가의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 추가로 하기 군으로부터의 하나 이상의 물질을 포함한다: 2,4-디히드록시아조벤젠, 1-(2'-클로로-4'-니트로-1'-페닐아조)-2-히드록시나프탈렌, 세레스 레드, 2-(4-술포-1-나프틸아조)-1-나프톨-4-술폰산, 2-히드록시-1,2'-아조나프탈렌-1'-술폰산의 칼슘염, 1-(2-술포-4-메틸-1-페닐아조)-2-나프틸카르복실산의 칼슘 및 바륨염, 1-(2-술포-1-나프틸아조)-2-히드록시나프탈렌-3-카르복실산의 칼슘염, 1-(4-술포-1-페닐아조)-2-나프톨-6-술폰산의 알루미늄염, 1-(4-술포-1-나프틸아조)-2-나프톨-3,6-디술폰산의 알루미늄염, 1-(4-술포-1-나프틸아조)-2-나프톨-6,8-디술폰산, 4-(4-술포-1-페닐아조)-1-(4-술포페닐)-5-히드록시피라졸론-3-카르복실산의 알루미늄염, 4,5-디브로모플루오레세인의 알루미늄 및 지르코늄염, 2,4,5,7-테트라브로모플루오레세인의 알루미늄 및 지르코늄염, 3',4',5',6'-테트라클로로-2,4,5,7-테트라브로모플루오레세인 및 이의 알루미늄염, 2,4,5,7-테트라요오도플루오레세인의 알루미늄염, 퀴노프탈론 디술폰산의 알루미늄염, 인디고 디술폰산의 알루미늄염, 레드 및 블랙 산화철 (CIN: 77 491 (레드) 및 77 499 (블랙)), 산화철 수화물 (CIN: 77 492), 이인산암모늄망간 및 이산화티탄.
또한 추가의 구현예에서, 유용성 천연 염료, 예를 들어, 파프리카 추출물, β-카로틴 또는 양홍이 본 발명에서 사용된다.
또한 추가적인 구현예에서, 본 발명의 겔 크림 조성물은 진주 광택 안료를 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 제한없이 "천연 진주 광택 안료" (예를 들어, "진주정" [어류 비늘로부터의 구아닌/히포잔틴 혼합 결정], "진주층" [분쇄된 홍합 껍데기]), 및 "단결정질 진주 광택 안료" (예를 들어, 비스무트 옥시클로라이드 [BiOCl]); 및 "층 기질 안료" (예를 들어 운모/금속 산화물) 를 포함하는 다양한 진주 광택 안료는 본 발명에서 사용된다.
진주 광택 안료의 베이스는, 제한없이, 분말성 안료, 비스무트 옥시클로라이드 및/또는 이산화티탄의 피마자유 분산액, 운모 상의 비스무트 옥시클로라이드 및/또는 이산화티탄을 포함한다. CIN 77163 으로 열거된 광택 안료가 예를 들어 특히 유리하다.
운모/금속 산화물 기재의 진주 광택 안료의 추가 군은 본 발명에서 특히 사용되고, 하기에 제공된다.
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일부 바람직한 구현예에서, Merck 사에서 상품명 Timiron, Colorona 또는 Dichrona 로 시판되는 진주 광택 안료는 본 발명에서 사용된다. 그러나, 본 발명이 본원에서 열거된 특정 안료에 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 실제로, 본 발명에서 사용되는 진주 광택 안료는 다수의 공급원으로부터 입수가능하다. 예를 들어, 운모 이외의 다른 기질은 추가로 금속 산화물, 예를 들어, 실리카 등으로 코팅될 수 있다. 예를 들어, TiO2 및 Fe2O3 ("로나스피어 (ronaspheres") 로 코팅된 SiO2 입자 (Merck 에서 시판되고 미세 라인의 광학 축소에 특히 적합함) 가 본 발명에서 사용된다.
대안적 구현예에서, 기질 (예를 들어, 운모) 이 포함되지 않는다. 일부 바람직한 구현예에서, SiO2 를 사용하여 제조된 진주 광택 안료가 특히 바람직하다. 또한 추가적으로 고니오크로마틱 (goniochromatic) 효과를 가질 수 있는 이러한 안료는, 예를 들어, BASF 사제 상품명 Sicopearl Fantastico 으로 입수가능하다.
추가적인 구현예에서, 이산화티탄으로 코팅된, 칼슘 나트륨 보로실리케이트 기재의 Engelhard / Mearl 에서 입수되는 안료가 또한 사용된다. 이들은 명칭 Reflecks 로 입수가능하다. 색에 더해, 입자 크기가 40 ㎚ 내지 180 ㎚ 인 결과, 이들은 광휘 효과를 가진다.
또한 추가의 구현예에서, Flora Tech 사에서 다양한 색 (황색, 적색, 녹색, 청색) 의 상품명 Metasomes Standard/Glitter 으로 입수가능한 효과 안료가 본 발명의 조성물에서 사용된다. 광휘 입자는 다양한 보조제 및 염료 (예를 들어, 색 지수 (CI) 번호 19140, 77007, 77289, 77491 을 갖는 염료) 와의 혼합물로 본원에 존재한다.
일부 구현예에서, 염료 및 안료는 개별적으로 또는 혼합물로 존재한다. 대안적 구현예에서, 이들은 서로 공통으로 코팅되어, 상이한 코팅 두께가 일반적으로 상이한 색 효과를 생성한다. 일부 구현예에서, 염료와 색-부여 염료의 총량은 농도 범위 (예를 들어, 각 경우 제제의 총 중량을 기준으로 약 0.1 중량% 내지 약 30 중량%; 바람직하게는 약 0.5 내지 약 15 중량%; 가장 바람직하게는 약 1.0 내지 약 10 중량%) 로부터 선택된다.
바람직한 구현예에서, 본원의 조성물의 pH 는 약 3.5 내지 약 10, 바람직하게는 약 4 내지 약 8, 더욱 바람직하게는 약 5 내지 약 7 의 범위이고, 최종 조성물의 pH 는 조성물 형태 및 화합물의 pH-요건에 따라 필요시 산성, 염기성 또는 완충 염의 첨가로 조정된다.
본 발명의 조성물은 당업자에게 잘 알려진 표준 기술에 의해 제조된다. 일반적으로 수상 및/또는 유상은 개별적으로 제조되고, 유사한 상 분할 물질은 임의의 순서로 첨가된다. 최종 생성물이 에멀젼인 경우, 두 상을 필요시 격렬한 교반 및/또는 균질화로 수합하여, 내부상 액적의 크기를 감소시킨다. 휘발성이 높거나 고온에서 가수분해 또는 분해되기 쉬운 제형 중 임의의 성분은 적용가능한 경우 에멀젼화 후 공정 후기에 온화한 교반 하에 첨가된다. 투여 빈도 및 양은 원하는 성능 기준에 따라 다를 것이다.
본 발명의 일부 구현예에서, VEGF 활성 감소 방법이 제공된다. 이러한 구현예에서, 상기 방법은 본원에 설명된 화합물 중 어느 하나의 유효량을 이를 필요로 하는 생물에 적용하는 것을 포함한다. 추가적 바람직한 구현예에서, 본 발명은 인간 및 다른 동물을 포함하는, 치료를 필요로 하는 생물의 치료용 화합물을 제공한다.
또한 일부 추가의 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 크레아틴 및/또는 크레아틴 유도체를 포함한다. 크레아틴은 하기 구조를 가진다:
Figure pct00063
.
본 발명의 개인 케어 조성물의 일부 바람직한 구현예에서, 크레아틴 포스페이트, 크레아틴 술페이트, 크레아틴 아세테이트, 크레아틴 아스코르베이트 및/또는 일- 또는 다관능성 알코올와 카르복실기에서 에스테르화된 유도체가 사용된다.
일부 추가적 구현예에서, 본 발명의 개인 케어 조성물은 L-카르니틴 [3-히드록시-4-(트리메틸암모니오)부티로베타인] 을 함유한다. 아실카르니틴은 하기 일반 구조를 갖고:
Figure pct00064
(식 중, R 은 탄소수 10 이하의 분지형 및 비분지형 알킬 라디칼의 군으로부터 선택됨), 본 발명의 일부 구현예에서 사용된다. 일부 바람직한 구현예에서, 프로피오닐카르니틴 및/또는 아세틸카르니틴이 사용된다. 거울상이성질체 모두 (D 및 L 형태), 및 D- 및 L-형태의 혼합물 및 라세미체가 본 발명의 일부 개인 케어 조성물에서 사용된다.
일부 추가의 구현예에서, 본 발명의 활성 성분은, 제한없이, 세리코시드, 피리독솔, 비타민 K, 비오틴 및 아로마 물질을 포함한다. 또한, 본 발명의 개인 케어 조성물에 존재하는 활성 성분이 임의의 특정 성분 및/또는 활성물의 혼합물(들)에 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 실제로, 다양한 활성물 및 활성물의 혼합물이 본 발명의 다양한 구현예에서 사용되는 것으로 의도된다. 또한, 이러한 활성물의 농도(들)가 임의의 특정 수준에 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 일부 구현예에서, 농도는 제제의 총 중량을 기준으로 약 0.001 내지 약 30 중량% 인 반면, 다른 구현예에서는 약 0.05 내지 약 20 중량% 이고, 또한 추가의 구현예에서는, 약 0.1 내지 약 10 중량% 이다. 또한, 당업자가 조성물의 사용 의도에 적합한 활성물(들) 농도로 본 발명의 개인 케어 조성물을 제형화할 것이라고 고려된다.
또한 추가의 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 조성물의 제조 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은 유상 및/또는 수상의 성분을 개별적으로 수합하고 가열시킨 후 함께 교반 하에 수합하는 것을 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 상은 균질화된다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, 조성물은 중간 내지 높은 에너지 입력으로, 유리하게는 최대 10000 rpm (바람직하게는 약 2500 내지 약 7700 rpm 의 범위) 이하의 회전수로 기어 림 (gear rim) 분산기계를 사용하여 교반된다.
6.2 실험
본 발명은 하기 실시예에서 더욱 상세히 기술되고, 하기 실시예는 청구되는 본 발명의 범주를 어느 방식으로도 제한하지 않는다. 첨부되는 도면은 본 발명의 명세서 및 상세한 설명의 일부로서 고려된다. 언급되는 모든 참고문헌은 거기에 참고되어 있는 모든 것들이 본원에 참고로서 포함된다. 하기 실시예가 설명될 것이나, 청구되는 본 발명이 이에 제한되지 않는다.
하기 실험 개시내용에서, 하기 약어는 PI (프로테이나아제 저해제), BBI (글리신 맥스 Acc. No. P01055 로부터의 바우만-버크 저해제), BBI-AV (바우만-버크 저해제 항-VegF), STI (글리신 맥스로부터의 콩 트립신 저해제); VEGF 및 VegF (혈관 내피 성장 인자); BBdb (돌리코스 비플로루스 Acc. No. AAK97765 로부터의 바우만 버크 저해제), BBsb3 (글리신 맥스 (콩) 프로테아제 저해제 IV 또는 D-II 로부터의 바우만 버크 저해제), 및 BBtc (토레세아 세아렌시스로부터의 바우만 버크 저해제), FGF-5 (섬유모세포 성장 인자 5), TGFβ (형질전환 성장 인자 β), TNFα (종양 괴사 인자 α), ppm (백만분율); M (몰농도); mM (밀리몰농도); μM (마이크로몰농도); nM (나노몰농도); mol (몰); mmol (밀리몰); μmol (마이크로몰); nmol (나노몰); gm (그램); ㎎ (밀리그램); ㎍ (마이크로그램); pg (피코그램); L (리터); ㎖ 및 mL (밀리리터); ㎕ 및 μL (마이크로리터); ㎝ (센티미터); ㎜ (밀리미터); ㎛ (마이크로미터); ㎚ (나노미터); U (유닛); V (볼트); MW (분자량); sec (초); min(s) (분); h(s) 및 hr(s) (시간);℃ (섭씨도); QS (충분량); ND (수행하지 않음); NA (적용되지 않음); rpm (분당 회전 수); H2O (물); dH2O (탈이온수); HCl　(염산); aa (아미노산); bp (염기쌍); kb (킬로염기쌍); kD　(킬로달톤); cDNA (복사 또는 상보적 DNA); DNA (디옥시리보핵산); ssDNA (단일 가닥 DNA); dsDNA (이중 가닥 DNA); dNTP (디옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트); RNA (리보핵산); MgCl2 (염화마그네슘); NaCl (염화나트륨); w/v (부피에 대한 중량); v/v (부피에 대한 부피); g (중력); OD (광학 밀도); 둘베코 포스페이트 완충 용액 (DPBS); SOC (2% 박토-트립톤, 0.5% 박토 효모 추출물, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl); 테리픽 (Terrific) 브로쓰 (TB; 12 g/l 박토 트립톤, 24 g/l 글리세롤, 2.31 g/l KH2PO4, 및 12.54 g/l K2HPO4); OD280 (280 ㎚ 에서의 광학 밀도); OD600 (600 ㎚ 에서의 광학 밀도); A405 (405 ㎚ 에서의 흡광도); Vmax (효소 촉매화 반응의 최대 초기 속도); PAGE (폴리아크릴아미드 겔 전기영동); PBS (포스페이트 완충 염수 [150 mM NaCl, 10 mM 나트륨 포스페이트 완충제, pH 7.2]); PBST (PBS+0.25% TWEEN® 20); PEG (폴리에틸렌 글리콜); PCR (폴리머라아제 연쇄 반응); RT-PCR (역전사 PCR); SDS (나트륨 도데실 술페이트); Tris (트리스(히드록시메틸)아미노메탄); HEPES (N-[2-히드록시에틸]피페라진-N-[2-에탄술폰산]); HBS (HEPES 완충 염수); SDS (나트륨 도데실술페이트); bME, BME 및 βME (베타-머캅토에탄올 또는 2-머캅토에탄올); Tris-HCl (트리스[히드록시메틸]아미노메탄-히드로클로라이드); 트리신 (Tricine) (N-[트리스-(히드록시메틸)-메틸]-글리신); CHES (2-(N-시클로-헥실아미노)에탄-술폰산); TAPS (3-{[트리스-(히드록시메틸)-메틸]-아미노}-프로판술폰산); CAPS (3-(시클로-헥실아미노)-프로판-술폰산; DMSO (디메틸 술폭시드); DTT (1,4-디티오-DL-트레이톨); Glut 및 GSH (환원된 글루타티온); GSSG (산화된 글루타티온); TCEP (트리스[2-카르복시에틸]포스핀); Ci (큐리); mCi (밀리큐리); μCi (마이크로큐리); TLC (박막 크로마토그래피); Ts (토실); Bn (벤질); Ph (페닐); Ms (메실); Et (에틸), Me (메틸); Taq (써무스 아쿠아티쿠스 (Thermus aquaticus) DNA 폴리머라아제); Klenow (DNA 폴리머라아제 I 라지 (클레노) 절편); rpm (분당 회전 수); EGTA (에틸렌 글리콜-비스(β-아미노에틸 에테르) N,N,N', N'-테트라아세트산); EDTA (에틸렌디아민테트라세트산); bla (β-락타마아제 또는 암피실린-내성 유전자; GE Healthcare (GE Healthcare, Chalfont St. Giles, United Kingdom); DNA2.0 (DNA2.0, Menlo Park, CA); OXOID (Oxoid, Basingstoke, Hampshire, UK); Megazyme (Megazyme International Ireland Ltd., Bray Business Park, Bray, Co., Wicklow, Ireland); Corning (Corning Life Sciences, Corning, NY); (NEN (NEN Life Science Products, Boston, MA); Pharma AS (Pharma AS, Oslo, Norway); Dynal (Dynal, Oslo, Norway); Bio-Synthesis (Bio-Synthesis, Lewisville, TX); ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD); Gibco/BRL (Gibco/BRL, Grand Island, NY); Sigma (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO); Pharmacia (Pharmacia Biotech, Pisacataway, NJ); NCBI (National Center for Biotechnology Information); Applied Biosystems (Applied Biosystems, Foster City, CA); Clontech (CLONTECH Laboratories, Palo Alto, CA); Operon Technologies (Operon Technologies, Inc., Alameda, CA); MWG Biotech (MWG Biotech, High Point, NC); Oligos Etc (Oligos Etc. Inc, Wilsonville, OR); Bachem (Bachem Bioscience, Inc., King of Prussia, PA); Difco (Difco Laboratories, Detroit, MI); Mediatech (Mediatech, Herndon, VA; Santa Cruz (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA); BioVeris (BioVeris Corp., Gaithersburg, MD); Oxoid (Oxoid Inc., Ogdensburg, NY); Worthington (Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ); GIBCO BRL 또는 Gibco BRL (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD); Millipore (Millipore, Billerica, MA); Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA); Invitrogen (Invitrogen Corp., San Diego, CA); NEB (New England Biolabs, Beverly, MA); Sigma (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO); Pierce (Pierce Biotechnology, Rockford, IL); Takara (Takara Bio Inc. Otsu, Japan); Roche (Hoffmann-La Roche, Basel, Switzerland); EM Science (EM Science, Gibbstown, NJ); Qiagen (Qiagen, Inc., Valencia, CA); Biodesign (Biodesign Intl., Saco, Maine); Aptagen (Aptagen, Inc., Herndon, VA); Molecular Devices (Molecular Devices, Corp., Sunnyvale, CA); R&D Systems (R&D Systems, Minneapolis, MN); Stratagene (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA); Marsh (Marsh Biosciences, Rochester, NY); Bio-Tek (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT); (Biacore (Biacore, Inc., Piscataway, NJ); PeproTech (PeproTech, Rocky Hill, NJ); SynPep (SynPep, Dublin, CA); 및 Microsoft (Microsoft, Inc., Redmond, WA) 에 적용된다.
실시예 1
B. 서브틸리스에서의 BCE103 - BBI 융합 단백질의 생성
본 실시예에서, B. 서브틸리스에서의 BCE103-BBI 융합 단백질을 생성하기 위해 수행된 실험을 기술한다. 이 실험에서 사용된 C-말단 헥사-히스티딘 표지를 갖는 프로-BBI 단백질에 대해 코딩하는 합성 유전자 (Operon Technologies) 의 DNA 서열은 다음과 같다:
Figure pct00065
.
상기 합성 유전자에 의해 코딩된 C-말단 헥사-히스티딘 표지된 프로-BBI 의 단백질 서열은 다음과 같다:
Figure pct00066
.
BBI 의 주요 성숙 형태에 대해 코딩되는 합성 유전자의 DNA 서열의 부분은 다음과 같다:
Figure pct00067
.
상기 합성 유전자에 의해 코딩되는 BBI 의 주요 성숙 형태의 단백질 서열은 다음과 같다:
Figure pct00068
.
pJ103 벡터 내 BCE103 셀룰라아제 발현 카세트에 융합하기 위해 BBI 유전자를 증폭시키는데 사용되는 PCR 프라이머는 다음과 같았다:
Figure pct00069
Figure pct00070
Figure pct00071
.
pJM103 삽입 벡터에 클로닝된 aprE-BCE103-BBI-HisTag 발현 카세트 (EcoRI-HindIII) 의 서열을 도 1 에 제공한다. pJM103BBIHis 발현 벡터의 도식적인 플라스미드 지도를 도 2 에 제공한다.
B. 서브틸리스 aprE 프로모터 및 신호 서열에 융합된 알칼리성 셀룰라아제 (BCE103) 유전자 (van Soligen, 미국 특허 번호 6,063,611 참조, 이는 본원에 참고로서 포함됨) 를 pJM103 (Perego, "Integrational vectors for genetic manipulation in Bacillus subtilis" In, Bacillus subtilis and Other Gram-positive Bacteria: Biochemistry, Physiology, and Molecular Genetics, Sonenshein, Hoch, and Losick (eds), American Society for Microbiology, Washington D.C., pp. 615-624 [1993]) 에 EcoRI-BamHI 절편 (즉, BCE103 촉매 도메인 및 첫번째 셀룰로오스 결합 도메인 링커의 코딩 서열만을 갖는 절편) 으로서 pUCAPR103 (Shaw et al., J. Mol. Biol., 320:303-309 [2002]) 으로부터 클로닝하였다. C-말단 헥사-히스티딘 표지 (His-Tag) 를 갖는 콩 바우만-버크 프로테아제 저해제 (BBI) 를 인코딩하는 유전자 (Swiss-Prot Accession # P01055; See, Odani and Ikenaka, J. Biochem., 71: 839-848 [1972]) 를 Operon Technologies 에서 합성하였다 (상기 DNA 서열 참조). BCE103 유전자를 갖는 올바른 판독 프레임에서의 5' BamHI 위치를 생성하고 3' 말단에서 pJM103 벡터에 클로닝하기 위해 3'-HindIII 위치를 갖는 BBI 유전자의 말단 후에 강한 전사 터미네이터 (LAT, 바실러스 리체니포르미스 α-아밀라아제 유전자로부터) 를 도입한 프라이머 (모든 프라이머를 MWG Biotech, Oligos Etc., 또는 Operon Technologies 에서 합성하였음) 로 PCR 에 의해 BBI 유전자를 증폭시켰다.
합성 BBI 유전자를 주형으로서 사용하여 각각 프라이머 BBI융합_FW (SEQ ID NO:14) 및 BBIHISHindIII_RV (SEQ ID NO:16), 또는 BBI융합_FW (SEQ ID NO:14) 및 BBI-HindIII_RV (SEQ ID NO:15) 로 C-말단 His-Tag 를 갖거나 없는 PCR 절편을 생성하였다. 달리 지시되지 않는 한, 공급사의 지시에 따라 (55℃ 의 어닐링 온도) 고충실도 플래티늄 Taq 폴리머라아제 (Invitrogen) 로 30 사이클에 대해 써모사이클러에서 통상 PCR 반응을 수행하였다. aprE-BCE103 발현 카세트를 갖는 pJN103 에 BamHI-HindIII 절편으로서 PCR 절편을 클로닝하였다. 정확한 유전자 서열을 DNA 서열분석에 의해 확인하였다.
따라서, 도 1 에 나타내는 바와 같이, BBI 유전자의 성숙 코딩 부위의 N-말단 (His-Tag 를 갖거나 없음) 을 BCE103 셀룰라아제 유전자에 의해 코딩된 제 1 CBD (셀룰로오스 결합 도메인) 링커 서열의 C-말단 코팅 부위에 대해 프레임에서 융합하였다. 이로써, BCE103 의 두 CBD (상기의 Shaw et al.) 를 최종 발현 벡터인 pJM103BBI 또는 pJM103BBIhis 에서 BBI 로 대체하였다 (도 2 참조). aprE 프로모터는 BCE103-BBI 유전자 융합의 발현을 제어한다 (Ferrari et al., J. Bact., 170:289-295 [1988]; 및 Henner et al., J. Bact., 170: 296-300 [1988] 참조).
적격 바실러스 서브틸리스 세포인 BG3934comK (degUHy32, oppA, ΔspoIIE3501, ΔaprE, ΔnprE, Δepr, ΔispA, Δbpr, amyE::xylRPxylAcomK-phleo) 를 발현 플라스미드 pJM103BBI 또는 pJM103BBIhis 로 형질전환시켰다. 세균을 자일로오스 유도성 프로모터의 제어 하에 comK 유전자의 유도에 의해 적격화시켰다 (Hahn et al., Mol. Microbiol., 21:763-775 [1996]). 형질전환체를 5 ㎍/㎖ 클로람페니콜을 함유하는 Luria 브로쓰 한천 (LA) 플레이트에서 선별하였다. 유전자 증폭에 의해 발현을 증가시키기 위해, 항생제를 이용한 성장 속도가 클로람페니콜의 부재 하의 성장 속도와 유사할 때까지 25 ㎍/㎖ 클로람페니콜을 갖는 LA 플레이트에서 콜로니를 수회 스트리킹시키고 성장시켰다. BCE103-BBI 융합 단백질을 TSB 배지 (OXOID 사제 트립톤 소야 브로쓰, 30 g/L) 또는 MBD 배지인 MOPS 기재의 한정된 배지 중에 37℃ 에서 진탕 플라스크에서 성장에 의해 제조하였다. MBD 배지를, NH4Cl2, FeSO4 및 CaCl2 를 베이스 배지에서 배제하고, 3 mM K2HPO4 를 사용하며, 베이스 배지를 60 mM 우레아, 75 g/L 글루코오스 및 1 % 소이톤 (soytone) 으로 보충한 것을 제외하고, 기재된 바와 같이 (Neidhardt et al., J. Bacteriol., 119: 736-747 [1974]) 본질적으로 제조하였다. 또한, 미량영양소를, 1 리터에 400 ㎎ FeSO4·7H2O, 100 ㎎ MnSO4·H2O, 100 ㎎ ZnSO4·7H2O, 50 ㎎ CuCl2·2H2O, 100 ㎎ CoCl2·6H2O, 100 ㎎ NaMoO4·2H2O, 100 ㎎ Na2B4O7·10H2O, 10 ㎖ 의 1M CaCl2 및 10 ㎖ 의 0.5 M 나트륨 시트레이트를 함유하는 100 X 저장물로서 구성하였다.
표준 단백질 염색 (예를 들어 GelCode Blue Stain Reagent; Pierce) 을 사용하여 ~ 44 kDa 에서 작동하는 SDS-PAGE 겔 (MES 완충액 중 10 % NuPAGE, 제조사 Invitrogen 에 의해 기재된 바와 같이 작동함) 상에서 주요 단백질 밴드로서 세포가 없는 상청액 (TSB 배지에서 24 시간 성장 또는 MBD 배지에서 48 시간 성장 후) 으로부터의 샘플에서 BCE103-BBI 융합 단백질을 쉽게 예상할 수 있었다. BCE103-BBI 융합 단백질의 동일성을, 제조사에 의해 공급되는 프로토콜 (검출을 위한 항-HisTag 항체 또는 항-BCE103 셀룰라아제 다클론성 항체를 사용하는 BM Chromogenic Western Blotting Kit; Roche Applied Science) 을 사용하여 SDS-PAGE 겔의 면역블롯에 의해 확인하였다.
BCE103 활성을 측정하기 위해, 당업계에 알려진 방법 (예를 들어, van Tilbeurgh et al., Meth. Enzymol., 160:45-59 [1988] 참조) 을 사용하여, LA 셀룰라아제 지시 플레이트 (0.2 % 콩고 레드로 염색된 1% 카르복시메틸셀룰로오스, 또는 0.5 % 아조-CM-셀룰로오스, Megazyme 를 가짐) 상에서 정성으로, 또는 합성 기질인 4-니트로페닐 β-D-셀로비오시드 (Sigma) 를 사용하는 배양 브로쓰에서 검정 완충액 (100 mM Tris pH 8.6, 0.005 % Tween-80) 에서 직접 검정에 의해 정량적으로 셀룰라아제 분해를 평가하였다.
트립신 저해 검정을 검정 완충액에서 수행하여 BBI 활성을 측정하였다. 상세하게는, 2 ㎍/mL 표준 BBI 용액의 11 개의 1:1 연속 희석액 (100 μL BBI + 100 μL 검정 완충액) 을 제조함으로써 표준 곡선을 생성하였다. 소수성 상호작용 컬럼 (POROS HP2, 페닐 컬럼, Applied Biosystems) 을 사용하여 20 mM MES pH 6.0 중 1 ㎎/㎖ 트립신-키모트립신 저해제 (Sigma Cat. #T-9777) 용액으로부터 BBI 표준물을 정제하였다. 20 mM MES pH 6.0 으로 컬럼을 평형화시키고, 5 ㎎ 의 저해제로 로딩하고, 평형 완충액으로 세척한 후, BBI 를 물로 용리하였다. 저해 검정에서 시험되는 알려지지 않은 BBI 샘플을 필요에 따라 희석시켜, 2 개 이상의 측정점을 표준 곡선에 포함시켰다 (통상 1:10, 1:100, 1:200, 1:1000, 1:2000 샘플 희석액을 시험한 후, 필요한 경우 희석액을 미세 조정하였음). 각각의 희석된 BBI 표준 또는 샘플 20 μL 을 80 μL 의 50 ng/㎖ 소 췌장 트립신 (Worthington) (검정 완충액에 저장 1 ㎎/㎖ 트립신을 희석시켜 제조됨) 에 첨가하였다. 편의상, 표준 및 샘플을 96 웰 마이크로타이터 플레이트에 정렬하였다. 반응물을 혼합하고 15 분 동안 25℃ 에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 100 μL 의 0.5 ㎎/㎖ 트립신 기질 (DMSO 중 100 ㎎/㎖ 용액으로부터의 검정 완충액에서 희석됨) 인 Suc-AAPR-pNA (숙시닐-Ala-Ala-Pro-Arg-파라-니트로아닐리드, Bachem) 를 첨가하고, 혼합하며, OD (A405) 를 15 분 동안 모니터링하고, Spectra Max 250 (Molecular Devices) 를 사용하여 1 시점을 12 초마다 기록하였다. 각 반응에 대해 Vmax 를 측정하기 위해 측정점을 사용하였다. Vmax 대 BBI 농도를 표시하여 표준 곡선을 생성하고, 4 개의 매개변수 곡선에 피팅시켰다. 모든 데이터 피팅을 제조사 (Molecular Devices) 에 의해 공급된 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 알려지지 않은 샘플의 BBI 농도를 표준 곡선으로부터 계산하였다. 대안적으로, 동일한 프로토콜을 사용하나 소 췌장 키모트립신 (Worthington) 저해를 측정함으로써 BBI 활성을 측정하였다 (키모트립신을 트립신과 동일한 농도로 사용하였고, 100 ㎕ 의 0.4 ㎎/㎖ 키모트립신 기질인 숙시닐-Ala-Ala-Pro-Phe-파라-니트로아닐리드, Bachem 를 첨가하여 키모트립신 활성을 측정하였음).
진탕 플라스크로부터의 역가는 (2.8 ℓ Fernbach 6 개의 베플형 플라스크에서 37℃, 225 rpm, 성장 6 시간 후 채취, 500 ㎖ MBD 배지) 전형적으로 0.4 - 0.9 ㎎/㎖ BCE 활성 및 40 - 150 ㎍/㎖ BBI 트립신 저해 활성의 범위에서 작동하였다. 그러나, 역가는 세균 균주, 배양 배지 및 성장 조건 (통기, 온도, 채취 시간 등) 을 최적화함으로써 추가로 향상될 수 있는 것으로 여겨진다.
상기 서술된 방법을 사용하여, 하기 실시예에 기재되는 바와 같이, BCE103 이외에, 야생형 BBI 에 대한 융합, BBI 변이체에 대한 융합 단백질, 및 BCE103 과 BBI 사이의 여러 링커를 갖는 융합 단백질을 제조하였다. 또한, 정제 공정을 조력하기 위해 1st CBD 를 사용하는 것을 가능하게 하는 2nd CBD 링커 (BCE-cbdD-BBI; 실시예 4 참조) 에 대해 BBI 가 융합되는 경우에 융합 단백질을 또한 제조하였다.
실시예 2
BCE103 - BBI 융합 단백질로서 BBI 반응성 위치 루프로 치환되는 펩티드의 제조
본 실시예에서, BCE103-BBI 융합 단백질로서 BBI 반응성 위치 루프로 치환되는 펩티드를 제조하기 위해 수행하는 실험을 기재하였다. 본 실험의 여러 단계에 사용되는 프라이머뿐만 아니라, 기타 서열을 하기에 제공하였다. BCE103 융합 위치 (BamHI) 에서부터 유전자 말단까지의 12BBIck81 의 서열을 도 3 에 나타냈다. CK37281 펩티드 서열 (ACYNLYGWTC (SEQ ID NO:9) 을 트립신 및 키모트립신 저해 루프 둘 모두로 삽입하였다.
QuikChange
Figure pct00072
위치-지정 돌연변이유발 (Stratagene) 을 사용하여 BBI 유전자에서 EcoRI 위치를 도입하는데 사용되는 프라이머는 하기와 같다:
Figure pct00073
트립신 저해 루프를 VegF 결합 펩티드 CK37281 로 대체하기 위해 BBI 유전자 ( SacI - EcoRI ) 에서 어닐링되고 클로닝되는 DNA 올리고뉴클레오티드의 서열은 하기와 같다:
Figure pct00074
키모트립신 저해 루프를 VegF 결합 펩티드 CK37281 로 대체하기 위해 BBI 유전자 (EcoRI-SalI) 에서 어닐링되고 클로닝는 DNA 올리고뉴클레오티드의 서열은 하기와 같다:
Figure pct00075
합성 BBI 유전자의 트립신 (SacI 및 EcoRI 제한 위치) 또는 키모트립신 (EcoRI 및 SalI 제한 위치) 반응성 위치 루프로 펩티드를 도입하기 위한 카세트를 제조하는데 사용되는 올리고뉴클레오티드 쌍의 DNA 서열을 하기에 제공한다. 그리고 나서 이러한 펩티드 코딩 서열을 SacI-SalI 절편으로서 p2JM103BBI 발현 벡터로 이동시켰다.
Figure pct00076
Figure pct00077
Figure pct00078
QuikChange
Figure pct00079
II XL 위치-지정 돌연변이유발 키트 (Stratagene) 를 사용하여 트립신 또는 키모트립신 반응성 위치 루프로 펩티드 서열을 도입하는데 사용되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍의 DNA 서열을 하기에 제공한다. 제조사에 의해 서술되어 있고 본 실시예에 기술된 바와 같이 반응을 수행하였다. 68 ℃ 에서 6 분의 연장, 95℃ 에서 50 초의 변성, 및 55℃ 에서 50 초의 어닐링으로 20 사이클을 수행하였다. 사이클 후, 최종 연장을 68℃ 에서 20 분 동안 수행하였다.
Figure pct00080
Figure pct00081
Figure pct00082
Figure pct00083
Figure pct00084
Figure pct00085
Figure pct00086
Figure pct00087
Figure pct00088
Figure pct00089
p2JM103-lnk2-BBI 발현 벡터의 키모트립신 반응성 위치 루프로 MM021 펩티드를 도입하기 위한 카세트를 제조하는데 사용되는 올리고뉴클레오티드 쌍의 DNA 서열을 하기에 제공한다. 벡터에서 SphI 및 SalI 제한 위치로 카세트를 라이게이션하였다.
Figure pct00090
시스테인 구속 펩티드로 제조된 라이브러리는 관심의 기질에 결합하는 펩티드를 선택하기 위한 대중적인 시약 (예를 들어, 시판 PhD-C7C Phage Display Peptide Library Kit; NEB) 이다. BBI 는 펩티드 결합자를 선택하는데 사용되는 여러 방법에서 제시한 펩티드 루프와 구조적으로 유사한 두 개의 시스테인 구속 반응성 위치 루프를 갖는다. 그래서, 일단 시스테인 구속 결합 펩티드가 선택되면, BBI 는 결합 반응에서 펩티드를 나타내기 위해 스캐폴드로서 사용하는데 적합하다.
DNA 올리고뉴클레오티드 카세트를 사용하여, 트립신, 키모트립신, 또는 반응성 위치 루프 두 모두를, CK37281 펩티드 서열 (ACYNLYGWTC)(SEQ ID NO:9) 로 대체함으로써, VEGF 결합 펩티드 CK37281 (예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 2003 년 11 월 13 일 출원된 동시계속 미국 특허 가출원 일련 번호 제 60/520,403 호 참조) 을 BBI 에 그래프트하였다. 구조화를 용이하게 하기 위해서, 상기 나타낸 바와 같이 프라이머 BowBeco-F 및 BowBeco-R 을 사용하는 제조사 (Stratagene) 에 의해 기술된 방법을 사용하여, QuikChange
Figure pct00091
위치-지정 돌연변이유발에 의해 트립신 및 키모트립신 반응성 위치 루프 사이에서 BBI 유전자 (Operon Technologies 에 의해 주문합성됨; 실시예 1 참조) 의 코딩 부위에 EcoRI 위치를 도입시켰다 (0.5 pmol 의 각 프라이머를 QuikChange
Figure pct00092
반응에 사용하고; 3 분 동안 97℃ 의 초기 변성 단계, 12 분 동안 68℃, 30 초 동안 95℃ 및 1 분 동안 55℃ 의 18 PCR 사이클 후, 이어서 68℃ 에서 15 분 동안의 최종 연장 반응).
트립신 저해 펩티드 루프를 대체하기 위해, 두 개의 DNA 올리고뉴클레오티드 (1BBCK81+ 및 1BBCk81-) 를 어닐링하고 SacI 및 EcoRI 제한 위치로 라이게이션하였다. 마찬가지로, 키모트립신 저해 펩티드 루프를 대체하기 위해, 올리고뉴클레오티드 (2BBck81+ 및 2BBck81-) 를 어닐링하여 제조된 DNA 카세트의 삽입을 위해 EcoRI 및 SalI 위치를 사용하였다. 트립신 루프를 우선 CK37281 펩티드에 의해 대체시킨 후, 올리고뉴클레오티드 (2BBck81+ 및 2BBck81-) 를 사용하여 키모트립신 루프에 CK37281 펩티드를 삽입함으로써 루프 둘 모두에 CK37281 펩티드를 그래프트하였다. 트립신 루프 (1BBIck81) 에서 CK37281 펩티드를 갖는 BBI 를 SacI-SphI 절편으로서 pJM103BBI 발현 벡터로 이동시켰다. 키모트립신 루프 (2BBIck81), 또는 둘 모두의 루프 (12BBIck81) 에서 CK37281 을 갖는 BBI 를 SacI-SalI 절편으로서 pJM103BBI 로 이동시켰다. 정확한 서열을 DNA 서열분석에 의해 확인하였다 (12BBIck81 유전자의 서열을 도 3 에 나타냄). 그 결과 생성된 벡터, pJM103-1BBIck81, pJM103-2BBIck81, 또는 pJM103-12BBIck81 을 사용하여 B. 서브틸리스 BG3934comK 를 형질전환시키고, BCE 융합 단백질의 생성을 상기 실시예 1 에서와 같이 측정하였다.
무세포 브로쓰에 존재하는 주 단백질이 되는 ~ 44 kDa 에서 런닝하는 융합 단백질을 SDS-PAGE 에 의해 검출하였다. 일부 경우에서일지라도, BCE103 촉매 코어에 상응하는 ~ 34 kDa 에서 런닝하는 중요한 단백질 밴드의 존재에 의해 관찰되는 바와 같이 BBI 부분 (특히 MBD 배지에서의 48 시간 초과의 성장 후) 의 유의한 분해 (50% 이하) 가 있었다. 이러한 경우에서, BCE103 셀룰라아제의 역가는 야생형 BBI 에 대한 융합을 이용하여 측정된 것 (실시예 1) 과 유사하였지만, BBI (2BBIck81 을 갖는 트립신 저해, 또는 1BBIck81 을 갖는 키모트립신 저해) 의 활성은 일반적으로 약 2 배 적었다.
성장 동안 BBI 변이체의 단백질 분해를 감소 (즉, 융합 단백질에 비해 SDS-PAGE 겔에 존재하는 BCE103 셀룰라아제 코어의 양을 감소) 시키기 위해서, 결실된 9 개의 프로테아제 유전자를 갖는 바실러스 서브틸리스 균주, BG6006 (degUHy32, oppA, ΔspoIIE3501, ΔaprE, ΔnprE, Δepr, ΔispA, Δbpr, ΔvprΔwprA, Δmpr-ybjF, ΔnprB, amyE::xylRPxylAcomK-ermC) 를 발현 숙주로서 사용하였고, 성장 온도 (35℃) 및 통기 (200 rpm) 를 감소시켰다. 이러한 변화에 따라서, 주 융합 단백질 밴드 (~ 44 kDa) 를, BCE 촉매 코어 단백질 (~ 34 kDa) 에 대해 예상되는 분자량으로 존재하는 무의미한 밴드를 갖는 SDS-PAGE 겔에서 관찰하였다.
CK37281 펩티드 이외에, BCE103 셀룰라아제의 C-말단에 융합된 BBI 의 트립신 및/또는 키모트립신 반응성 위치 루프로 치환되는 경우, 다수의 기타 시스테인 구속 펩티드를 제조하였다. 특정 실시예는 하기를 포함하였다:
(1) 1st 또는 2nd 반응성 위치 루프 (Sahu et al., J. Immunol., 157: 884-891, [1996] 참조), C2c (1st 루프), C3c (1st 루프), C4c (1st 루프) 및 C5c (1st 루프) 에 도입된 콤프스타틴 (compstatin) 인 보체 길항제로서 설계되거나 선택되는 펩티드; 또는 인자 B 결합 반응 1B, 2B, 4A, 5A, 6-1A, 7A, 8B, 9A, 10B, 11-1A, 12B, 13A, 및 15-1A (모두 2nd 루프에 있음) 중에서 선택되는 펩티드;
(2) 프로테아제 인자 Xa 또는 각질층 키모트립신, Xa1 (2nd 루프) 또는 hSCC1 (1st 루프) 와 각각 결합하도록 설계된 펩티드;
(3) FGF5 결합 반응 1A6 (1st 또는 2nd 루프), 1C2 (1st 또는 2nd 루프), 2E2 (1st 또는 2nd 루프), 2E5 (1st, 2nd 또는 둘 모두의 루프), FGFns (1st 또는 2nd 루프), FGFkr (1st 또는 2nd 루프), FGFhl (1st 또는 2nd 루프), FGFgy (1st 또는 2nd 루프), MM005 (1st 또는 2nd 루프), MM007 (1st, 2nd 또는 둘 모두의 루프), MM009 (2nd 루프), MM010 (1st, 2nd 또는 둘 모두의 루프), MM017 (2nd 루프), FGFps1 (2nd 루프), FGFps2 (1st, 2nd 또는 둘 모두의 루프), 및 FGFpsB (2nd 루프) 중에서 선택되는 펩티드; 및
(4) TGFβ-1 결합 반응 1A8 (2nd 루프), 1A12 (2nd 루프), 1E11 (2nd 루프), TGFps1 (2nd 루프), 및 MM021 (2nd 루프) 중에서 선택되는 펩티드.
상기 펩티드를 트립신 (1st 루프) 또는 키모트립신 (2nd 루프) 반응성 위치 루프로 도입하는데 사용되는 올리고뉴클레오티드, 및 상기 펩티드를 BBI 로 그래프트하는데 사용되는 방법이 상기에 제공하였다. 모든 경우에 있어서, 융합 단백질을 SDS-PAGE 겔에 의해 측정된 바와 같이 제조하였다. 그러나, 일부 치환된 펩티드를 사용하여, CK37281 치환된 펩티드에 대해 상술된 바와 같은 단백질 분해를 감소시킴으로써 손상되지 않은 (intact) 융합 단백질의 양을 증가시켰다.
실시예 3
티올 환원/산화제에 의한 BBI 의 활성화
성장 후, (트리신 또는 키모트립신 저해에 의한) BBI 의 활성은 전형적으로 무세포 상청액 (두 개의 분자가 1:1 몰비로 융합 단백질 중에 존재해야함) 에서 측정된 BCE103 셀룰라아제의 활성으로부터 예상되는 것보다 약 5 ~ 20 배 낮다. BCE103-BBI 융합 단백질에서 (트립신 또는 키모트립신 저해에 의해 측정된) BBI 활성의 증가는 보통, 통상적으로 접종 약 14 시간 후 MBD 성장 배지에 첨가되는 1 - 4 mM 의 농도의 βME 를 첨가함으로써 수득될 수 있다. 융합 단백질에서 BBI 의 트립신 또는 키모트립신 저해 활성은 또한, 결합 펩티드 (예를 들어 VEGF 결합 펩티드 CK37281) 가 키모트립신 또는 트립신 반응성 위치 루프를 각각 대체하는 경우의 예상보다 낮았다. 야생형 BBI 를 사용하였기 때문에, 저해 활성은 βME 로 처리함으로써 증가될 수 있었다. 예상외로, 다른 티올 환원제 (예를 들어, 시스테인, 환원된 글루타티온, DL-디티오트레이톨 및 트리스[2-카르복시에틸] 포스핀) 은 이러한 실험에서 성장 동안 BBI 의 활성화에 미치는 작거나 극히 작은 효과를 갖는다. 또한 항산화제 (예를 들어, 아스코르브산 또는 DL-α-토코페롤 아세테이트) 또는 기타 보조제의 성장 배지 (예를 들어, 이소류신, 대두유, Tween-80) 로의 첨가, 또는 30℃ 에서의 성장은 BCE103:BBI 활성비를 유의하게 향상시키기 못했다.
특히, 성장 동안 BBI 활성화를 측정하기 위해서, p2JM103-E3-2BBIck81 (하기 실시예 4 참조) 을 사용하여 형질전환된 B. 서브틸리스 BG6006 을 37℃ 에서 13 시간 동안 250 ㎖ 진탕 플라스크에서 40 ㎖ MBD 배지 중에 성장시켰다. 그리고 나서, 도 4 의 그래프에 나타낸 티올 환원제를 첨가하고, 성장 62 시간 후 세포 상청액을 채취하였다. 시약인 2-머캅토에탄올 (BME), 시스테인 (Cys), 환원된 글루타티온 (Glut), 및 DL-디티오트레이톨 (DTT) 을 성장 배지에 첨가하고 최종 농도를 도 4 에 제공된 그래프에 나타내었다. 5 mM βME 의 농도는 양호한 BCE103:BBI 활성비를 야기할 수 있지만, 적어도 부분적으로는 첨가된 시약에 의해 초래된 세균 성장의 감소 때문에, 전형적으로 BCE103 및 BBI 역가를 전체적으로 증가시킬 수 있다 (도 4 참조). 실시예 1 에 기술된 검정을 사용하여 BCE103 및 2BBIck81 의 역가를 측정하였다.
또한, Q-세파로오스 이온 교환 크로마토그래피에 의한 융합 단백질 (예를 들어 BCE-lnk2-2BBIck81, 하기 실시예 4 참조) 의 부분 정제 후 BBI 활성화를 달성하였다.
진탕 플라스크 또는 발효기 런으로부터 수득된 무세포 브로쓰로부터, 융합 단백질을 정제하였다. 브로쓰를 여과하고, 수중에서 5 배 내지 10 배로 희석하여 pH 를 pH 7.5 - 8.0 로 조절하였다. Q-세파로오스 수지 (GE Healthcare) 로 패킹된 컬럼에 희석된 샘플을 로딩하였다. 컬럼을 50 mM Tris pH 7.5 로 세척한 후 300 mM NaCl 을 함유하는 동일한 완충액에서 다시 세척하였다. 700 mM NaCl 을 함유하는 동일한 완충액에서 융합 단백질을 용리하였다.
BBI 를 활성화시키기 위해서, 풀링한 융합 단백질 분획을 검정 완충액 중에 10 배 희석시킨 후, 실온에서 약 24 시간 동안 교반 플레이트 또는 라커 플랫폼에서 일정하게 혼합하면서 2 mM βME 및 0.2 mM 산환된 글루타티온 (GSSG) 으로 처리하였다. BBI 는 일반적으로 BCE103 셀룰라아제의 측정 농도에 근거한 예상되는 트립신 저해 활성의 약 70 - 100% 로 활성화될 수 있다. 상술된 활성화 방법은 일반적으로 최고의 결과를 산출하지만, 일부 경우에서, 제공된 샘플의 활성화를 최대화하기 위해서, 스크리닝을 96-웰 플레이트에서 수행하여 최적 조건을 결정하였다. 초기에, 스크리닝된 전형적인 상태를 검정 완충액 (예를 들어, 2-50 배 연속 희석), βME 농축액 (예를 들어, 0.5-5 mM 연속물) 및 산환된 글루타티온 농축액 (예를 들어, 0 mM 다음으로 1/20 내지 1/2 의 연속물 βME 농도) 에서 희석하였다.
융합 단백질 BCE-lnk2-2BBIck81 의 활성화를 도 5 에 나타냈다. 이러한 특정 실시예에서, Q-세파로오스 정제로부터의 융합 단백질을 1:10 으로, 0.005% TWEEN
Figure pct00093
-80 을 갖는 둘베코 PBS (Mediatech) 에서 희석하였다. 베타-머캅토에탄올을 최종 농도 3 mM 이 되도록 라커에서 밤새 실온에서 인큐베이션하였다. 샘플을 추가로, 자력 교반 플레이트에서 격렬히 교반하면서, 실온에서 약 60 시간 동안 인큐베이션하였다. (βME 처리 전후) BCE103 및 2BBIck81 의 역가를 셀룰라아제 검정 및 트립신 저해 검정으로 각각 측정하였다.
일부 구현예에서, 예컨대 대용량의 발효물로부터의 무세포 브로쓰에서 BBI 또는 이의 변이체를 활성화시키기 위해서, 희석 및 활성화 반응에서의 βME 농도를 감소시키는 것이 바람직하다. 이는 고농도의 완충액 (500 mM Tris pH 8.6) 을 사용하거나, CHES 와 같은 쯔비터 이온성 완충액 (또한 CAPS, 트리신, TAPS, 및 기타 적합한 쯔비터 이온성 완충액) 으로 변경함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 무세포 브로쓰 (또는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제된 융합 단백질 분획) 를 1:1 로 0.005% TWEEN
Figure pct00094
-80 을 갖는 375 mM CHES pH 8.6 에 희석시킨 후, 1 mM βME 및 10 mM Na2SO3 로 활성화시키고, 실온에서 약 24 시간 동안 교반하면서 인큐베이션하였다. BCE103 셀룰라아제 융합 단백질로서 BBI 또는 이의 변이체를 통상, (BCE103 셀룰라아제 활성에 기초하는) 예상 값이 70-100% 가 되도록 상기 방법으로 활성화시켰다.
실시예 4
BCE103 - BBI 융합 단백질의 절단에 의한 자유 BBI / 변이체의 방출
본 실시예는 BCE103-BBI 융합 단백질의 절단에 의해 자유 BBI 또는 이의 변이체를 방출시키기 위해 전개되는 실험을 기술한다.
BCE103 촉매 도메인 및 BBI 사이의 배양 성장 동안 잠재적 절단 위치를 생성하기 위해 pJM103-BBI 의 BamHI 및 SacI 위치로 어닐링되고 라이게이션된 DNA 올리고뉴클레오티드 쌍의 서열을 하기와 같이 제공하였다.
Figure pct00095
BCE103 셀룰라아제의 2nd CBD 링커에 BBI 를 융합시키기 위해 p2JM103-BBI의 BamHI 및 SacI 위치에 어닐링되고 라이게이션된 DNA 올리고뉴클레오티드 쌍의 서열을 하기에 제공하였다.
Figure pct00096
아스파르트산 및 프롤린 잔기 사이의 산 절단되기 쉬운 펩티드 서열을 하기에 제공하였다.
Figure pct00097
QuikChange
Figure pct00098
위치-지정 돌연변이유발에 의해 BssHII 위치를 pJM103BBI 에 도입하는데 사용되는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 하기에 제공하였다.
Figure pct00099
BBI 의 정지 코돈 후 HindIII 및 XhoI 위치를 도입시키고, LAT 후 PacI 위치를 도입시키고, 본래 HindIII 위치를 제거하기 위한 카세트 (SalI-HindIII) 로서 어닐링된 DNA 올리고뉴클레오티드의 서열을 하기에 제공하였다.
Figure pct00100
BCE103 촉매 도메인 및 BBI 사이에 삽입되는, 상기 제공되는 산에 불안정한 링커 (즉, 링커 1, 링커 2, 및 링커 3) 를 생성하기 위해 사용되는 PCR 프라이머를 하기에 제공하였다.
Figure pct00101
Figure pct00102
1st CBD 링커에 삽입되는, 상기 제공되는 산에 불안정한 링커 (즉, 링커 1, 링커 2, 및 링커 3) 를 생성하기 위해 사용되는 PCR 프라이머를 하기에 제공하였다.
Figure pct00103
BCE103 촉매 도메인 및 BBI 사이에 삽입되는 산에 불안정한 링커의 단백질 서열을 하기에 제공하였다. 산에 불안정한 링커를 볼드체로 나타냈고, 제 1 CBD 도메인으로부터의 서열에 밑줄그었다.
Figure pct00104
Figure pct00105
정제 공정 동안 BCE103 촉매 도메인 및 BBI 사이의 잠재적 절단 위치를 생성하기 위해 pJM103-BBI 의 BamHI 및 SacI 위치로 어닐링되고 라이게이션된 DNA 올리고뉴클레오티드 쌍의 서열을 하기에 제공하였다.
Figure pct00106
정제 공정 동안 BCE103 촉매 도메인 및 BBI 사이의 잠재적 절단 위치를 생성하기 위해 pJM103-lnk2-1BBIck81 의 BamHI 및 SacI 위치로 어닐링되고 라이게이션된 DNA 올리고뉴클레오티드 쌍의 서열을 하기에 제공하였다.
Figure pct00107
QuikChange 위치-지정 돌연변이유발 (Stratagene) 에 의해 링커 2 에 E 및 E3 링커를 도입하기 위해 사용되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍의 서열을 하기에 제공하였다.
Figure pct00108
BCE103 촉매 도메인과 BBI 사이의 E3 링커의 단백질 서열은 DNNDPIPEP DDESFNMPIPEP (SEQ ID NO:174) 였다. 상기 서열에서, E 링커는 밑줄그어져 있고, E. 콜리에서 결함적 유전자 재조합에 의해 생성되는 서열은 볼드체로 나타냈다. Mpr (또는 V8 프로테아제) 에 의한 절단은 E3 링커에 존재하는 3 개의 글루탐산 중 임의의 것 후 발생할 수 있다. 따라서, 구조는 BCE-(SEQ ID NO:174)-BBI 였다.
BCE103 촉매 도메인 및 BBI 사이의 잠재적 게네나아제 I 절단 위치를 생성하기 위해 p2JM103-lnk2-2BBIck81 의 BamHI 및 SacI 위치로 어닐링되고 라이게이션된 DNA 올리고뉴클레오티드 쌍의 서열을 하기에 제공하였다.
Figure pct00109
BCE103 촉매 도메인 및 BBI 사이에 삽입된 게네나아제 I 민감성 절단 위치 (또한 산 및 Mpr 민감성) 의 단백질 서열은 DNNDPIPDP GAAHYVEFQ (SEQ ID NO:179) 였다. 게네나아제 I 위치 (Gen4 링커) 는 볼드체 (절단은 티로신 및 발린 사이에서 발생함) (NEB) 로 나타냈고, 링커 2 에는 밑줄을 그었다. Mpr 에 의한 절단은 또한 Gen4 링커에서 발린의 뒤를 잇는 글루탐산 후 발생할 수 있다. 본원에 사용되는 서열은 BCE-SEQ ID NO:179)-BBI 였다.
BCE103-lnk2-2BBIck81 융합 단백질에서 절단 위치를 하기에 나타내었다. BCE103 촉매 도메인의 C-말단 7 개 아미노산 (밑줄), 링커 2 서열 (볼드체), 및 2BBIck81 서열을 제시하였다. 산/열에 불안정한 Asp-Pro 결합은 검은 삼각형 화살표로 나타냈고, 글루탐산 후 Mpr 민감성 결합은 선으로된 화살표로 나타냈다.
Figure pct00110
자유 BBI 또는 이의 변이체를 단리시키기 위해서, BBI 부분은 BCE103-BBI 융합 단백질로부터 절단될 필요가 있다. 일부 구현예에서, 이는 B. 서브틸리스에 의해 본질적으로 생성되는 프로테아제에 의해, 성장 동안 달성된다. 일부 대안적인 구현예에서, 상기 절단은 정제 공정 동안 성장 후 발생한다 (예를 들어 산/열 또는 단백질 분해적 절단에 의함). 성장 동안 잠재적으로 절단되기 쉬운 링커를 설계하고 (상기 sub, cbdL, pro, shortpro, 및 cbdD 참조), BamHI-SacI 카세트로서 pJM103BBI 또는 p2JM103BBI 발현 벡터로 클로닝하였다. 융합 단백질 대 BCE103 촉매 도메인의 생산량을 실시예 1 에 기술된 바와 같이 SDS-PAGE 겔에서 분석하였다.
융합 단백질의 작은 절단을 프로 링커를 제외한 모든 링커에 대해 관찰하였는데, BCE103 촉매 코어에 상응하는 넓은 밴드가 있었음에도 불구하고, 거의 완전히 절단되어 매우 작은 손상되지 않은 융합 단백질이 겔에서 관찰되었다. 불행하게도, 성장 동안 상기 절단은 무세포 상청액에서 측정되는 무시할만한 BBI 활성을 야기하고 BBI 밴드는 SDS-PAGE 겔에서 확인될 수 없었다. 본 발명은 임의의 특정 메카니즘 또는 이론에 한정되지 않은 것으로 의도되지만, BBI 가 특히 비활성 형태에서 단백질 분해에 대해 특히 민감할 수 있다. 따라서, 활성화 후 정제 공정 동안의 절단이 일반적으로 바람직하다.
일부 구현예에서, 아스파르트산 및 프롤린 잔기 사이에서의 결합은 당업계에 공지된 바와 같은 산성 pH 에서의 열처리에 의해 절단된다 (예를 들어, Landon, Meth. Enzymol., 47:145-149 [1977] 참조). BCE103 셀룰라아제에서 1st CBD 링커는 산/열처리에 의해 절단되는 잠재성을 갖는 세 개의 Asp-Pro 디펩티드 서열 (도 1 참조) 을 갖는다. 그러나, 상기 위치에서 산/열처리에 의한 절단은 비효율적인 것을 발견하였다. 특히 산/열에 불안정한 단백질 서열은 상기 문헌에 기술되어 있고, 상기 세개의 서열은 WGDPHY (SEQ ID NO:141), DNNDPI (SEQ ID NO:142), 및 VVADPN (SEQ ID NO:143) (즉, 링커 1, 2 및 3) 이다.
상기 산에 불안정한 링커를 BCE103-BBI 발현 벡터, pJM103BBI 에 도입하기 전에, 올리고뉴클레오티드 프라이머 BCEbss-F 및 BCEbss-R (상기 제공됨) 을 사용하여 aprE 신호 서열 코딩 부위에 QuikChange
Figure pct00111
XL (Stratagene) 돌연변이유발 (제조사의 방법을 사용하고; 8 분 연장 및 1 분 변성 단계를 제외하고는 상기 실시예 2 에 기재되어 있음) 에 의해 BssHII 위치를 도입하였다. 그 후, HindIII 및 XhoI 위치를 LAT 터미네이터의 앞 (BBI 정지 코돈 후) 에 삽입하고, 올리고뉴클레오티드 카세트 (BCEterm+ 및 BCEterm-; 상기 제공됨) 를 SalI 및 본래 HindIII 위치에 삽입함으로써, PacI 위치를 터미네이터 (LAT 터미네이터 후 본래 HindIII 위치를 제거하였음) 후에 추가하였다. 상기 신규 벡터를 "p2JM103BBI" 로 지칭하였다.
산에 불안정한 링커 절편을, 각 역방향 프라이머와 함께 정방향 프라이머 BCE103coreBssHII_FW, 링커 WGDPHY_R, 링커 DNNDPI_RV, 또는 링커VVADPN_RV (모두가 상기 제공된 서열) 및 p2JM103BBI 를 주형으로서 사용하여 PCR 에 의해 생성하였다 (PCR 프로토콜에 대한 실시예 1 참조). 970 bp 의 PCR 절편을 BamHI 및 PstI 를 이용하여 소화시키고, 산 링커 절편을 인코딩하는 154 bp 절편을 전기영동 후 아가로오스 겔로부터 단리시키고, 겔로부터 정제된 BamHI 및 PstI 를 이용하여 소화된 p2JM103 벡터로 라이게이션하였다. 최종 발현 벡터, p2JM103lnk1-BBI, p2JM103lnk2-BBI 및 p2JM103lnk3-BBI 에서의 링커 서열을 DNA 서열분석으로 확인하였다.
실시예 1 에 기술된 바와 같이, 적격 B. 서브틸리스 균주 BG3934comK 또는 BG6006 을, 플라스미드를 이용하여 형질전환시키고, 콜로니를 5 ㎍/㎖ 클로람페니콜 LA 플레이트에서 선택하여 25 ㎍/㎖ 클로람페니콜로 증폭시켰다.
유사하게, 산에 불안정한 링커를 제 1 CBD 링커에 삽입하였다. 특히, 주형으로서 p2JM103BBI 와 함께 역방향 프라이머 LplusWGDPHY_RV, LplusDNNDPI_RV, 또는 LplusVVADPN_RV (서열에 대한 상기 참조) 와 정방향 프라이머 BCE103corePstI_FW 를 사용하여 PCR 절편을 생성하였다. 약 150 bp 의 PCR 절편을, BamHI 및 PstI 를 사용하여 소화시키고, 정제하고, BamHI 및 PstI 를 사용하여 정제된 p2JM103BBI 벡터로 라이게이션하였다. 정확한 서열을 DNA 서열분석으로 확인하고, 플라스미드 p2JM103pllnk1-BBI, p2JM103pllnk2-BBI 및 p2JM103pllnk3-BBI 를 사용하여 상술된 바와 같이 B. 서브틸리스 균주를 형질전환시켰다.
MBD 배지에서 성장 후, 융합 단백질을 본질적으로 상술된 바와 같이 이온 교환 크로마토그래피로 정제하였다 (실시예 2 참조). 융합 단백질을 10% 포름산에서 55℃ 에서 16 시간 동안 처리함으로써 절단하였다. BCE103 촉매 도메인을 산처리 동안 침전시키고, 원심분리로 제거하였다. 상청액에서 자유 BBI 를 밤새 SpeedVac 에서 건조시켰다. 샘플을 SDS-PAGE 겔에 로딩하기 전에 50 mM Tris pH 8 에 현탁시켰다. 단백질 염색된 SDS-PAGE 겔의 분석에 의해, 링커 2 가 BCE103 촉매 도메인 및 BBI 사이에 삽입된 융합 단백질 (BCE-DNNDPI-PDP-BBI) 에서 산 절단이 더욱 효율적인 것을 관찰하였다. 20 mM 글리신 pH 2 에서 75℃ 에서 2 시간 가량 이내에 상기 링커가 절단되는 것을 발견하였다.
대안적인 구현예에서, 정제 공정 동안 프로테아제로 처리함으로써 융합 단백질을 절단하였다. 글루탐산 특이적 프로테아제 (예를 들어, Mpr 또는 V8 프로테아제), 퓨린/블리스터라아제, 게네나아제 I, 및 엔테로펩티다아제 (엔테로키나아제) 에 대한 절단 위치를 갖도록 링커를 설계하였다. BamHI 및 SacI 위치를 이용하여 발현 벡터에서 BCE103 촉매 코어 및 BBI 사이에 올리고뉴클레오티드 카세트 (서열에 대해 상기 참조) 로서 상기 링커를 삽입하였다 (도 1 참조). 본래 발현 벡터 (pJM103BBI) 의 코딩 부위에서, 1st CBD 도메인 내에 글루탐산 잔기가 존재하며 BBI 내에 제 3 잔기가 존재하는데, 이는 글루탐산 특이적 프로테아제, 예컨대 B. 서브틸리스 Mpr (BsMpr) 또는 V8 프로테아제에 의해 절단되기 쉬운 것으로 여겨진다 (도 1 참조). 그러나, 상기 위치에서 매우 효율적으로 BCE-BBI 융합 단백질을 절단하는 BsMpr 또는 V8 프로테아제를 발견하지 못했다. 따라서, 상기 프로테아제에 의해 절단되기 쉬운 기타 링커를 설계할 필요성이 있었다.
상술된 산에 불안정한 링커 6 개를 BsMpr 에 의한 절단에 대해 시험하였다. 이러한 융합 단백질을, 실온에서 16 ㎍ 의 BsMpr 로 16 시간 동안 처리함으로써 절단하였다. 절단 후, BCE103 촉매 도메인을, 10% 포름산을 첨가함으로써 침전시키고, 원심분리에 의해 제거하였다. 상청액에서 자유 BBI 를 SpeedVac 에서 밤새 건조시켰다. 샘플을 SDS-PAGE 에 로딩하기 전에 50 mM Tris pH 8 에 현탁시켰다. 산 절단과 유사하게, 임의의 기타 링커 보다 BsMpr 에 의해 매우 효율적으로 BCE-DNNDPI-PDP-BBI (링커 2) 융합 단백질을 절단하였다. 따라서, 글루탐산 특정 프로테아제, 예컨대 BsMpr 을 이용하는 단백질 분해 또는 산/열처리에 의해 BCE-DNNDPI-PDP-BBI 융합 단백질로부터 효율적으로 방출되는 BBI 및 이의 변이체를 발견하였다. Mpr (예를 들어, 상기 제공된 바와 같은 E, E3 링커, 및 플레) 에 의해 절단되도록 설계된 기타 여러 링커를 시험하였지만, 이들 중 어느 것도 링커 2 에 비해 어떠한 장점을 갖지 못했다 (E 링커를 구성하도록 설계된 QuikChange
Figure pct00112
위치-지정 돌연변이유발 반응을 이용하여 형질전환 후 E. 콜리에서 결함적 유전자 재조합에 의해 E3 링커를 생성하였다). 상기 제시한 바와 같이, 링커 2 에 산/열에 불안정한 절단 위치 2 개 및 Mpr 에 의해 절단되기 쉬운 위치 3 개가 있다.
퓨린 또는 블리스터라아제 (NEB) (BCEfurinBBI), 또는 엔테로펩티다아제 (엔테로키나아제, NEB) (BCEentBBI) 에 의해 절단되도록 설계된 링커를 시험하였지만, 이들 서열 중 어느 것도 적절한 프로테아제에 의해 효율적으로 절단되지 않았다. 4 개의 링커를 또한 설계하고 (BCEgenen1BBI, BCEgenen2BBI, BCEgenen3BBI, 및 BCEgenen4BBI), 게네나아제 I (NEB) 에 의한 절단에 대해 시험하였다. 융합 단백질의 효율적 절단은, 오로지 Gen4 링커 (BCEgenen4BBI) 를 사용했을 때만 관찰하였다. BsMpr 은 또한 Gen4 링커를 효율적으로 절단하기 위한 것임을 발견하였다.
정제된 BCE-lnk2-2BBIck81 융합 단백질의 활성화 후, BsMpr 에 의한 절단은 SDS-PAGE 겔에 의해 측정된 바와 같이 완료되지 않았다. 그러나, 링커 2 (또는 Gen4 링커) 를 갖는 BCE-BBI 융합 단백질의 활성화 후 완전한 절단이 바실러스 리체니포르미스로부터 단리된 Mpr 프로테아제 (BlMpr) 를 사용함으로써 달성될 수 있음을 발견하였다. 본 발명이 임의의 특정 메카니즘에 한정되는 것으로 의도되지 않지만, 성숙 BBI 에서 제 3 아미노산 후 절단은 BlMpr 에 보다 민감한 것으로 나타난 반면, BBI 의 C-말단으로부터의 제 6 아미노산 후 절단은 BsMpr 절단에 보다 민감하였다.
일부 구현예에서, 절단 후, 상술된 바와 같이 BCE103 촉매 도메인의 선택적 산 침전 (pH 3 이하), 이온 교환 크로마토그래피 (실시예 5 참조), 또는 50 mM Tris pH 8.0 에 로딩된 언히드로트립신-아가로오스 (Sigma) 컬럼에서 BBI 의 선택적 결합에 의해 BCE103 촉매 도메인으로부터 BBI 를 정제하고, 150 mM NaCl 을 갖는 50 mM Tris pH 8.0 로 세척한 후, 300 mM NaCl 를 갖는 50 mM 글리신 pH 2.2 를 사용하여 결합된 BBI 를 용리하였다.
실시예 5
BBIck81 과 VegF 의 결합
본 실시예에서는, BBIck81 과 VegF 의 결합을 평가하기 위해 수행된 실험을 기술한다. BCE103-lnk2-2BBIck81 융합 단백질을 실시예 2 에 기술된 바와 같이 B. 서브틸리스에서 제조하였다. 융합 단백질을 정제하고, 실시예 3 에 기술된 바와 같이 βME 및 산환된 글루타티온을 사용하여 처리함으로써 BBI 트립신 저해 활성을 증가시켰다. BsMpr 프로테아제 (실시예 4 참조) 에 의해 융합 단백질을 절단하고, Q-세파로오스 컬럼을 사용하는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 BCE103 촉매 도메인으로부터 자유 2BBIck81 을 정제하였다.
간략하게는, 절단 후, 절단된 샘플의 pH 를 5.5 로 조절한 후, 샘플을 컬럼 (25 mM MES pH 5.5 로 평형화됨) 에 로딩하였다. 25 mM 아세트산 나트륨 pH 5.0 를 사용하는 컬럼을 통해 자유 2BBIck81 을 세척하면서, BCE103 촉매 코어가 수지와 결합되어 잔존하였다. 2BBIck81 분획을 한외여과로 농축시키고, 전기화학발광 (ECL) 기재 결합 검정 (BioVeris) 을 사용하여 분석하였다. 제조사 (BioVeris) 에 의해 기술된 바와 같이, 항-VegF 항체 (Santa Cruz) 및 VegF (PeproTech) 를 전기화학발광 염색약 및 비오틴으로 각각 라벨링하였다. 모든 물질은 0.1% TWEEN
Figure pct00113
-80 이 보충된 둘베코 PBS (Mediatech) 에 있었다. 항-VegF 항체의 초기 희석 연속물 (125, 250 및 500 ng/㎖) 및 VegF (100, 150, 200 및 250 ng/㎖) 를 결합 검정으로 시험하여 강건한 (robust) ECL 신호를 제공하는 각각의 농도를 측정하였다.
2BBIck81 결합을 시험하기 위해, 50 ㎕ 의 500 ng/㎖ ECL 라벨링된 항-VegF 항체, 50 ㎕ 의 250 ng/㎖ 비오티닐화 VegF 및 100 ㎕ 2BBIck81 (12.5, 15, 31.25, 62.5, 125, 250 또는 500 ng/㎖ 의 연속물) 를 진탕시키면서 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 그리고 나서, 50 ㎕ 의 0.2 ㎎/㎖ 스트렙타아비딘 코팅된 비드를 첨가하고, 반응을 실온에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 제조사 (BioVeris) 의해 기술된 바와 같이 BioVeris M8/384 분석기를 사용하여 ECL 신호를 측정하였다. 도 6 에서 보이는 바와 같이, 2BBIck81 의 농도가 증가함에 따라 감소하는 ECL 신호는 자석 비드에 부착된 VegF 에 결합된 더 많은 라벨링된 항-VegF 항체를 대체하였다.
따라서, BBI (2BBIck81) 의 키모트립신 저해 루프에 그래프트되는 경우의 CK37281 펩티드는 마이크로몰 농도에서 VegF 에 결합하기 위해 항-VegF 항체와 경쟁하였다. 사실, 2BBIck81 는 합성된 CK37281 펩티드 자체보다 더 나은 VegF 결합을 위해 경쟁하였다 (도 6 참조). 트립신 저해 루프, 1BBIck81 로 삽입된 CK37281 펩티드가 또한 BioVeris 검정에서 항-VegF 항체와 경쟁하였다. 그리하여, BBI 는 다양한 스크리닝 방법에 의해 선택된 활성 결합 펩티드를 제공하는 스캐폴드로서 유용한 것으로 밝혀졌다.
실시예 6
2 BBIck81 의 생성을 위한 대안적인 융합 파트너의 사용
본 실시예에서, 대안적인 융합 파트너를 평가하기 위해 수행한 실험을 기술한다. pET-40b(+) 로부터 dsbC 유전자 (E. 콜리) 를 증폭하기 위해 사용되는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 DNA 서열을 하기에 제공하였다. 이러한 프라이머는 p2JM103-Gen4-2BBIck81 로 클로닝하기 위한 5' 말단에서의 BssHII 위치 및 3' 말단에서의 BamHI 를 생성하였다.
Figure pct00114
링커 2 를 갖는 BBI 에 P. 멘도시나 (P. mendocina) 큐티나아제 유전자를 융합시키기 위한 카세트 (Alw44I-BamHI) 를 제조하기 위해 함께 어닐링된 올리고뉴클레오티드의 DNA 서열을 하기에 제공하였다.
Figure pct00115
BBI 부분이 7 개의 디술피드 결합을 갖기 때문에, 활성 BBI 의 높은 역가가 BCE103 셀룰라아제 촉매 도메인 이외의 융합 단백질을 사용하여 수득될 것으로 예상된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 티올-디술피드 옥시도리덕타아제 및/또는 단백질 디술피드 이소머라아제와 같은 조성물은 정확하게 접힌 BBI 부분을 생성하도록 조력하는 융합 단백질로서 사용하였다. 이러한 구현예에서, 추가적인 활성화 단계는 대부분의 환경에서 필요하지 않았다. 추가적인 구현예에서, B. 서브틸리스에서 높은 역가에서 제조되는 기타 단백질이 또한 융합 파트너로서 사용하였다. 예를 들어, 진균 후미콜라 인솔렌스 (hiPDI) 로부터의 내열성 단백질 디술피드 이소머라아제가 바실러스 브레비스에서 면역글로불린 G (2 디술피드) 의 경쇄를 제조하기 위해 융합 파트너로서 사용된 바 있다 (Kajino et al., Appl. Env. Microbiol., 66:638-642 [2000] 참조).
hiPDI 가 BBI 의 제조를 위해 BCE103 보다 더 나은 융합 파트너일 수 있는지 측정하기 위해서, 상기 hiPDI 유전자를 분석하고 (DNA2.0), BssHII- SacI 절편으로서 발현 벡터, p2JM103-lnk2-2BBIck81 (실시예 4 참조) 으로 클로닝하였다. 합성 유전자를 설계하는데 있어서, 제한 위치가 도입되고 결실되는 경우를 제외하고는, 고도로 발현되는 B. 서브틸리스 유전자에서 매우 자주 발생하는 코돈을 선택하였다. 최종 구조에서, 성숙 hiPDI 유전자의 N-말단을 AprE 신호 서열에 융합시키고, C-말단을 엔테로펩티다아제 절단 위치를 갖는 링커에 융합시키고 (Kajino et al., Appl. Env. Microbiol., 66:638-642 [2000]), 그 다음으로 2BBIck81 (도 7 참조) 에 융합시켰다. 상기 발현 벡터, p2JM-PDI-EK-2BBIck81 을 사용하여 B. 서브틸리스 BG6006 을 형질전환시키고, 융합 단백질의 생성량을 접종 14 시간 후 2 mM BME 가 있거나 없는 MBD 배지 (실시예 1 에 기술된 바와 같음) 에서 측정하였다.
SDS-PAGE 겔에 의해 측정된 바와 같이, PDI-2BBIck81 융합 단백질의 생성량은 전형적으로 동일한 조건 하에서의 BCE-2BBck81 성장보다 다소 적다. PDI-2BBIck81 무세포 상청액으로부터 측정되는 BBI 역가 (트립신 저해) 는 전형적으로 BCE-2BBIck81 융합보다 적었다. BCE103 에 융합하기 때문에, PDI 에 융합된 경우의 BBI 의 측정된 활성은 2 mM BME 에서 성장하는 경우보다 높았고, 무-BME 배지 (실시예 3 에 기술된 바와 같음) 에서 성장하는 경우 성장 후 무세포 상청액에 BME 를 첨가함으로써 BBI 활성을 증가시켰다. 그리하여, PDI 의 티올-디술피드 옥시도리덕타아제 활성은 융합 단백질에서 활성 2BBIck81 의 역가를 유의하게 증가시키거나 BBI 분자의 활성화의 필요성을 배제하는 것으로 보이지 않았다.
성장 동안 BBI 역가를 향상시키는 것으로 예상되는 융합 단백질의 환원전위를 증가시키기 위해서, 대장균으로부터의 DsbC 를 2BBIck81 을 위한 융합 파트너로서 사용하였다. 프라이머로서 DsbCBBI-F 및 DsbCBBI-R (상기 나타낸 서열) 및 주형으로서 pET-40b(+) (Novagen) 을 사용하여 제조사 (Stratagene) 에 의해 기술된 바와 같이 Herculase Enhanced DNA 폴리머라아제를 사용하는 PCR 에 의해 dsbC 유전자를 증폭시켰다. 단리된 PCR 절편을 BssHII-BamHI 절편으로서 벡터 p2JM103-Gen4-2BBIck81 (실시예 4 참조) 로 클로닝하였다. 융합 유전자의 정확한 서열을 DNA 서열분석으로 확인하였다. 이러한 경우, DsbC-2BBIck81 융합 단백질의 역가는 SDS-PAGE 겔에서 측정된 BCE-2BBIck81 융합 단백질보다 유의하게 낮았고, 트립신 저해에 의해 측정된 활성 2BBIck81 의 역가가 또한 매우 낮았다.
B. 서브틸리스에서 높은 역가로 생성되는 기타 단백질은 BBI 의 생성을 위한 융합 파트너로서 사용하였다. 상기 하나의 단백질은 B. 서브틸리스로부터의 aprE 프로모터를 이용하는 높은 역가로 발현된 슈도모나스 멘도시나로부터의 큐티나아제이다 (예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제 5,429,950 호 참조). (pAK-15 로부터의) EcoRI-Alw44I 절편으로서 aprE-큐티나아제 유전자 융합을, EcoRI 및 BamHI 를 이용하여 절단된 p2JM103-lnk2-2BBIck81 (실시예 4 참조) 로 Alw44I-BamHI 링커 올리고뉴클레오티드 카세트 (상기 서열 참조) 를 이용하여 라이게이션하였다. 이러한 큐티나아제-링커2-2BBIck81 발현 벡터 (EcoRI-BamHI aprE-큐티나아제-링커2 서열을 위한 도 8 참조) 를 사용하여 B. 서브틸리스 BG6006 세포를 형질전환시키고, 기타 융합 단백질에 대해 앞서 기술된 바와 같이 MBD 배지에서 융합 단백질을 제조하였다 (실시예 1 참조). 이러한 경우, 큐티나아제-링커2-2BBIck81 융합 단백질은 SDS-PAGE 겔에서 관찰된 주 밴드가 아니었고, 측정된 리파아제 역가 (미국 특허 제 5,429,950 호에 제공되는 방법을 사용하여 측정됨) 및 BBI 역가는 BCE-2BBIck81 융합 단백질을 사용하여 발견된 것보다 훨씬 작았다 (약 20 배). 또한, 큐티나아제 융합 단백질에서 BBI 역가는 3 mM βME 가 성장 배지에 첨가되는 경우 유의하게 향상되지 않았다. 그리하여, 활성 2BBIck81 의 최고 역가는 BCE-2BBIck81 융합 단백질의 활성화에 의해 지속적으로 수득되었다. 그렇더라도, 여러 융합 파트너가 본 발명에서 사용될 것으로 예상된다.
실시예 7
절단된 BBI - AV ( BBIt - AV ; SEQ ID NO :187) 의 발현
본 실시예는 2BBIck81 BBI 단백질 (BBI-AV; SEQ ID NO:186) DDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCACYNLYGWTCFCVDITDFCYEPCKPSEDDKEN (SEQ ID NO:18) 의 생성을 향상시키기 위해 수행한 실험을 기술한다.
상기 실시예 및 {Vogtentanz et al., 2007 (Protein Expr Purif 55:40-52 [2007])} 의 저널 기사에는 BCE103 셀룰라아제 촉매 도메인 (BCE) 의 C-말단에 융합된 콩 바우만-버크 프로테아제 저해제 (BBI) 를 포함하는 융합 단백질의 제조 방법이 기술되어 있다. 상기 기술된 바와 같이, 상기 시스템은 트립신 및/또는 키모트립신 저해 루프를 대체하는 여러 변이 펩티드를 갖는 BBI 분자를 제조하기 위해 사용되어 왔다. 예를 들어, 음성 키모트립신 저해 루프 (ICALSYPAQC; SEQ ID NO:388) 을 대체하는 VEGF 결합 펩티드, CK37281 (ACYNLYGWTC; SEQ ID NO:9) 를 함유하는 BBI 분자, BBI-AV (SEQ ID NO:186) 를 제조하고, 정제하고 VEGF 에 결합하기 위한 단일클론 항체를 이용하여 전기화학발광 (ECL) 기재 결합 검정 (BioVeris) 에서 완료하였다. 그러나, 변이체 BBI-AV 의 회수율은 야생형 BBI 보다 낮았는데, 아마 부정확하게 형성된 디술피드 결합을 갖는 분자의 초기 높은 백분율로 인한 것으로 보인다.
SEQ ID NO : 186 의 5 C-말단 아미노산이 결여된 SEQ ID NO :186 (즉, SEQ ID NO:187 의 BBIt - AV ) DDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCACYNLYGWTCFCVDITDFCYEPCKPSE (SEQ ID NO:187) 의 BBI-AV 의 절단형은 경쟁자로서 VEGF 에 대한 라벨링된 단일클론 항체를 사용하는 ECL (BioVeris) 검정에서 VEGF 와 전체 길이 분자 (즉, 미절단 분자) 보다 양호하게 결합하는 것으로 나타났다. BBI-AV 의 C-절단형 (BBIt-AV 로 지칭됨) (SEQ ID NO:187) 을, GluBL 프로테아제 (바실러스 리체니포르미스로부터의 글루타밀 엔도펩티다아제 I ) 로 C-말단을 트리밍함으로써 정제 공정 동안에 제조할 수 있었다. 대안적으로, BBIt-AV 는, 하기와 같이 조작된 올리고뉴클레오티드 카세트를 사용하는 정지 코돈을 도입함으로써 수득할 수 있었다. 올리고뉴클레오티드 카세트를 생성하기 위해 하기 BBI-trunc+ 및 BBI-trunc- 올리고뉴클레오티드를 어닐링하였다.
Figure pct00116
올리고뉴클레오티드 카세트를 발현 벡터 p2JM103-lnk2-2BBIck81 의 SalI 및 HindIII 위치로 라이게이션하고, 정확한 서열을 확인하고, 생성되는 발현 벡터를 p2JM103-lnk2-BBIt-AV 로 지칭하였다.
발현을 향상시키기 위해서, AprE 프로-펩티드, AGK (SEQ ID NO:191) (미국 특허 제 5,429,950 호) 의 첫번째 3 개의 아미노산을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO:190 GCTGGTAAA) 을, QuikChange
Figure pct00117
위치-지정 돌연변이유발 키트 (Stratagene) 를 사용하여 AprE 신호 서열의 말단과 성숙 BCE103 셀룰라아제의 시작부 사이에 삽입하였다. 위치 지정 돌연변이유발을 본질적으로, 올리고뉴클레오티드 프라이머와 함께 주형으로서 p2JM103-lnk2-BBIt-AV 를 사용하여 제조사에 의해 기술된 바와 같이 수행하였다:
Figure pct00118
Figure pct00119
정확한 삽입을 DNA 서열분석으로 확인하고, 생성된 발현 벡터를 p2JMagk103-Ink2-BBIt-AV (SEQ ID NO:194) 로 지칭하였다.
Figure pct00120
Figure pct00121
Figure pct00122
Figure pct00123
p2JMagk103-lnk2-BBIt-AV 발현 벡터를 사용하여 BCE 단백질 (SEQ ID NO:195) 에 융합된 BBIt-AV 를 발현하는 세균 세포를 형질전환시켰다.
Figure pct00124
실시예 8
BBIt - AV 위치 포화 라이브러리
본 실시예는 도 9 에 나타낸 BBIt-AV 분자 (SEQ ID NO:187) 의 각 39 아미노산 위치에서 치환을 포함하는 위치 포화 라이브러리를 구축함으로써 비개질 BBIt-AV 로부터 유래된 개질 변이체 BBPI 를 생성하기 위해 수행한 실험을 기술한다.
하기와 같이 Stratagene (La Jolla, CA) 으로부터 QuikChange 다수 위치-지정 돌연변이유발 (QCMS) 키트의 개질된 형태를 사용하여, BBIt-AV 위치-포화 라이브러리를 Amin 등에 의한 (Biotechniques 35: 1134-1140, [2003]) 에 기재된 바와 같이 본질적으로서 제조하였다. 중간 및 17 - 20 측면위치 염기 (flanking base) 에서 NNS 코돈을 갖는 중복 정방향 및 역방향 프라이머를 각 선택된 위치에 대해 설계하였고, BBI-AV 분자에서 각각의 66 아미노산 위치에서 각 정방향 (F) 및 역방향 (R) 프라이머에 대한 서열을 하기 표 1 에 나타냈다. 각 돌연변이유발 반응물은 25 ㎕ 의 전체 부피에 대해 50 - 100 ng 주형 플라스미드 (p2JMagk103-lnk2-BBIt-AV; SEQ ID NO:194), 0.5 ㎕ 정방향 프라이머 (25 μM), 0.5 ㎕ 역방향 프라이머 (25 μM), 1 ㎕ dNTP's (QCMS 키트), 2.5 ㎕ 10x QCMS 반응 완충액, 18.5 ㎕ 탈이온수, 및 1 ㎕ 효소 배합물 (QCMS 키트) 을 함유하였다. 잔여물 10, 11, 13 및 25 에서의 BBI-AV 라이브러리의 경우, 오로지 1 ㎕ 의 정방향 프라이머 (25 βM) 만이 역방향 프라이머 없이 사용되었다. 잔기 6, 37, 38, 50 및 53 에서의 라이브러리의 경우, 벡터에서 서열과 상보성인 다른 프라이머 (5'-CTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTAC; SEQ ID NO:328) 와 조합된 0.5 ㎕ 의 정방향 돌연변이성 프라이머를 이용하여, 돌연변이유발 반응을 수행하였다. 돌연변이유발 반응의 경우, 사용된 써모사이클러 프로그램은 95℃ 에서 2 분 동안 1 사이클하고, 이어서 95℃ 에서 30 초 동안, 55℃ 에서 1 분 동안, 및 68℃ 에서 10 분 동안 29 사이클을 하였다 (MJ Research 써모사이클러). 0.5 - 1 ㎕ DpnI (QCMS 키트) 를 첨가하여 주형 DNA 를 소화시키고, 37℃ 에서 1 - 4 시간 동안 인큐베이션한 후, 추가로 0.5 - 1 ㎕ DpnI 를 첨가하고, 추가로 37℃ 에서 1-4 시간 동안 인큐베이션하였다. Dpn I 소화에 영향받기 쉽도록 확실히 하기 위해, 주형 DNA 를 TOP10 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 과 같은 E. 콜리 dam+ 균주로부터 수득하였다.
B. 서브틸리스의 효율적인 형질전환을 위해, Templiphi 키트를 사용하는 롤링 서클 증폭 (RCA) 에 의해 각 돌연변이유발 반응에서 DNA 를 증폭시켰다. 특히, 1 ㎕ 의 희석되지 않은 QCMS 반응물을 Templiphi 키트의 5 ㎕ 의 샘플 완충액과 혼합하였다. 혼합물을 3 분 동안 95℃ 에서 가열하여 DNA 를 변성시켰다. 반응물을 얼음에 놓고 2 분 동안 냉각시켰다. 그 후, 5 ㎕ 의 반응 완충액 및 0.2 ㎕ 의 phi29 폴리머라아제를 상기 반응물에 첨가하고, MJ Research 써모사이클러에서 5 시간 동안 30℃ 에서 인큐베이션하였다. 마지막으로, 반응물에서의 phi29 효소를 MJ Research 써모사이클러에서 10 분 동안 65℃ 에서 인큐베이션에 의해 가열 비활성화시켰다. 증폭된 DNA 를 10 -100 배 희석시키고, 1 ㎕ 를 사용하여 100 ㎕ 의 적격 B. 서브틸리스 BG6006 세포 (Vogtentanz et al., 2007) 를 형질전환시켰다. 25 ㎕ 또는 75 ㎕ 의 형질전환 혼합물 분취량을 5 ㎍/㎖ 클로람페니콜이 보충된 Luria 한천 플레이트에 위치시켰다. 성장 후, 각각의 형질전환체를 선별하여 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 5 ㎍/㎖ 클로람페니콜이 보충된 200 ㎕ 의 Luria 브로쓰를 접종시켰다. 배양물을 37℃ 에서 270 rpm 으로 가습 공기포화 박스 (Innova 4230 incubator, New Brunswick Scientific) 에서 성장시켰다. 성장 후, 80 ㎕ 의 50% 글리세롤를 각 웰에 첨가하고 혼합하였다. 각 웰에서 140 ㎕ 의 배양물을 제거하여 2 반복 플레이트를 제조하고, 새 마이크로타이터 플레이트에 위치시켰다. 두 개의 플레이트를 -80℃ 에서 보관하였다. 하나의 플레이트를 마스터로서 두고, 다른 하나는 각 돌연변이의 DNA 서열분석 (Cogenics, Huston, TX) 을 위해 제공하였다. DNA 서열분석을 위해, 마이크로타이터 플레이트에서 성장한 각 콜로니의 밤샘 배양물을 10 - 40 배 희석하고, Amersham Biosciences Ready-to-go PCR 비드 및 프라이머 BBI-PCR-F 및 BBI-PCR-R 을 사용하여, 2 ㎕ 를 PCR 반응에 사용하였다. 써모-사이클링 조건은 95℃ 에서 5 분 동안 1 사이클, 이어서 95℃ 에서 1 분 동안, 55 ℃ 에서 1 분 동안, 72 ℃ 에서 1 분 동안 30 사이클, 및 72℃ 에서 7 분 동안 최종 사이클이었다. PCR 생성물을 엑소뉴클리아제 I 및 새우 알칼리성 포스파타아제 (EXOSAP-IT, Amersham Biosciences) 로 처리하거나, M13 역방향 프라이머를 사용하는 서열분석 전에 컬럼 정제하였다.
[표 1]
Figure pct00125
Figure pct00126
Figure pct00127
Figure pct00128
각 마스터 플레이트에서의 배양물을 해동하고, 핀 리플리케이터를 사용하여 150 ㎕ 의 Luria 브로쓰를 함유하는 새 멸균 마이크로타이터 플레이트에 5 ㎍/㎖ 클로람페니콜를 각 웰에 접종하였다. 플레이트를 상술된 바와 같은 가습 공기포화 박스에서 ~ 10 시간 동안 성장시켰다. 대조군의 경우, 두 개의 웰의 배양물을, 15 ㎖ 배양 튜브 (5 ㎍/㎖ 클로람페니콜을 갖는 5 ㎖ 의 Luria 브로쓰) 에서 함께 성장된 BBI 및 BBI-AV 배양물로 대체하였다. 배양물을 성장시킨 후, 핀 리플리케이터를 사용함으로써, 플레이트를 사용하여 150 ㎕ 의 MBD 배지를 함유하는 2 개의 2 반복 96-웰 필터 플레이트 (Millipore, MSGV2210) 에 5 ㎍/㎖ 클로람페니콜을 각 웰에 접종하였다 (Vogtentanz et al., 2007). (상기와 같이, 플레이트 주변에 효율적인 공기 흐름을 위해 쌓인 플레이트 사이에 위치된 플라스틱 스페이서를 가진) 2 반복 플레이트를 ~ 14 시간 동안 성장시킨 후, 2-머캅토에탄올을 플레이트 중 하나의 각 웰에 최종 농도 2 mM 로 첨가하였다. 그리고 나서 플레이트를 추가 ~ 46 시간 동안 성장시켰다. 배양 브로쓰 (첨가된 2-머캅토에탄올이 있거나 없음) 를 함유하는 96-웰 필터 플레이트를 BBI 및 BCE 활성에 대해 검정하였다.
실시예 9
BBIt - AV 변이체의 1 차 스크리닝: 최고 BBIt - AV : BCE 활성비를 갖는 변이체를 측정하기 위한 BBI 및 BCE 활성 검정
본 실시예에서, 위치-포화 방법에 따라 생성된 개질 변이체 BBIt-AV 로 도입된 아미노산 치환의 효과를 평가하기 위한 방법을 제공한다. 상술된 위치-포화 방법에 의해 생성된 개질 BBIt-AV 의 트립신 저해 활성을 측정하고 대조군 야생형 BBI (SEQ ID NO:13; BBI-wt 또는 sBBI) 및 대조군 비개질 BBIt-AV (SEQ ID NO:187) 의 트립신 저해 활성과 비교하였다. 다른 적합한 방법을 사용할 수 있기 때문에, 상기 특정 방법에 본 발명을 한정하는 것으로 의도하지는 않는다.
트립신 저해 검정: BBI 활성 측정
활성 대조군 및 개질 BBIt-AV 의 상대 농도를, 상술된 바와 같이 기준으로서 정제된 sBBI 를 사용하여 트립신 저해 검정에 의해 측정하였다. 일부 샘플에 대해, 활성 BBI 농도를 Flecker (Flecker, P. FEBS Lett. 252:153-57 [1989]; Vogtentanz et al. (상기 참조)) 에 의해 기술된 방법에 따른 잔여 트립신 활성에 의해 측정하였다.
96-웰 플레이트에서 성장한 배양물의 희석액을 사용하여 라이브러리를 분석하였다. 전형적으로, 각 웰의 배양 브로쓰를 검정 완충액 (100 mM Tris pH 8.6, 0.005% Tween 80) 으로 (200 배) 희석하고, 제 2 마이크로타이터 플레이트 (CoStar 9017, Corning, Inc., Corning, NY) 로 옮겼다. 이후, 20 ㎕ 의 희석된 샘플을 제 3 마이크로타이터 플레이트로 옮겼다. 20, 10, 5 또는 2.5 ㎕ 의 희석된 sBBI (SEQ ID NO:13) 대조군 배양물을 비어있는 웰에 첨가하여 기준 곡선을 생성하였다. 그 후, 80 ㎕ 의 50 ng/㎖ 트립신 (소 췌장 트립신, Worthington Biochemical Corp., Lakewood, NJ) (검정 완충액에서 희석된 1 ㎎/㎖ 저장 용액으로부터 제조됨) 을 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 반응물을 혼합하고 15 분 실온에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, DMSO 중의 100 ㎎/㎖ 용액으로부터의 검정 완충액에 희석된 100 ㎕ 의 0.5 ㎎/㎖ 트립신 기질 (숙시닐-Ala-Ala-Pro-Arg-para-니트로아닐리드, Bachem Bioscience, Inc., King of Prussiㄴa, PA) 을 각 웰에 첨가하고, 혼합하고, 405 nm 에서의 흡광도를 Spectra Max 250 (Molecular Devices) 을 사용하여, 매 12 초마다 기록된 1 시점으로 하여 15 분 동안 관찰하였다. 데이터 지점을 사용하여 각 반응의 속도를 측정하였다. 반응 속도 대 BBI 부피를 플롯팅함으로써 기준 곡선을 생성하였고, 4-매개변수 방정식에 피팅하였다. 제조사 (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA) 에서 공급한 소프트웨어를 사용하여 모든 데이터 피팅을 수행하였다. 각 BBIt-AV 변이체의 활성을 기준 곡선으로부터 계산하였다. 그리하여, 모든 개질 변이체 단백질의 활성을 sBBI 대조군 (BBI-WT) 배양물에서의 활성에 대해 측정하였다. 과반수의 데이터가 기준 곡선의 IC50 에 가깝지 않으면 새 희석 플레이트를 제조하여 검정하였다.
셀룰라아제 효소 활성 검정: BCE 검정
상술된 바와 같이 기준으로서 정제된 BCE 를 사용하는 활성 검정 및 (Vogtentanz et al. 2007) 에 의해 BCE 의 농도를 측정하였다. 96-웰 마이크로타이터 플레이트에서 성장한 라이브러리의 분석을 위해, 20 ㎕ 의 배양 브로쓰를 새 마이크로타이터 플레이트의 각 웰로 옮겼다. 20, 10, 5 또는 2.5 ㎕ 의 희석된 BBI-WT 대조군 배양물을 상기 비어있는 웰에 첨가함으로써 기준 곡선을 만들었다. 그리고 나서, 180 ㎕ 의 BCE 기질 (검정 완충액에서의 0.25 ㎍/㎖ ), 4-니트로페닐 β-D-셀로비오시드 (Sigma, St. Louis, MO) 를 상기 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 혼합하고, 405 nm 에서의 흡광도를 Spectra Max 250 (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA) 을 사용하여, 12 초마다 기록된 1 시점으로 하여 15 분 동안 관찰하였다. 데이터 지점을 사용하여 각 반응 속도를 측정하였다. 기준 곡선을 플롯팅 속도 대 배양 부피에 의해 생성하고, 이차 곡선에 피팅하였다. 각 변이체 배양물에서의 BCE 농도를 기준 대조군 배양물에 대해 측정하였다.
효소 활성비 : BBIt - AV : BCE 비
마이크로타이터 플레이트 검정 결과로부터, 각 웰의 BBIt-AV:BCE 활성비는 상대적 BBIt-AV 트립신 저해 활성값을 상대적 BCE 활성값으로 나누어 측정하였다. BBIt-AV:BCE 활성비를 근거로 하여 데이터를 분류하였다. 최고 BBIt-AV:BCE 활성비를 갖는 개질 변이체를 선택하여 하술되는 2 차 스크리닝을 적용시켰다.
효소 활성비 BBIt - AV : BCE 의 분석 - 변이체의 2 차 스크리닝
본 실시예에서, 1 차 스크리닝에서 측정된 바와 같이, 환원제 (2-머캅토에탄올) 의 존재 또는 부재 하에 성장한 경우 대조군 비개질 BBIt-AV 에 비해 향상된 BBIt-AV:BCE 활성을 갖는 개질 BBIt-AV 를 정렬하고 2 차 스크리닝에서 4 반복으로 검정하였다. 초기에, 제 2 스크리닝에서 측정된 최고 BBIt-AV:BCE 비를 갖는 개질 BBIt-AV 의 각각을 인코딩한 폴리뉴클레오티드만을 서열분석하였다. 나중에, 모든 BBIt-AV 클론을 서열분석하였다.
마이크로타이터 플레이트에서 4 반복 시험 - 2 차 스크리닝
각 플레이트의 경우, 초기 스크리닝으로부터 선택된 개질 BBIt-AV 를 함유하는 배양물의 22 개의 샘플, 및 sBBI 및 비개질 BBIt-AV 를 함유하는 대조군 배양물의 2 개의 샘플을 15 ㎖ 배양 튜브에서 5 ppm 클로람페니콜 (37℃, 250 rpm) 을 갖는 5 ㎖ 의 Luria 브로쓰에서 ~ 10 시간 동안 성장시켰다. 그리고 나서, 24 개의 배양물 중 150 ㎕ 의 각각을 96-웰 마이크로타이터 플레이트에서 4 반복으로 정렬하였다. 상기 정렬된 플레이트를 사용하여, 핀 리플리케이터를 사용함으로써 150 ㎕ 의 MBD 배지를 함유하는 2 반복 필터 플레이트 (Millipore, MSGV2210) 에 웰 당 5 ㎍/㎖ 클로람페니콜을 접종하였다. 플레이팅된 배양물을 2-β-머캅토에탄올 (βME) 의 존재 및 부재 하에 성장시키고, BBI-AV:BCE 비를 상술된 바와 같이 측정하여 분석하였다.
도 10 은 개질 변이체 BBIt 의 트립신 저해 활성에 미치는, SEQ ID NO:187 의 위치 29 에서의 모든 가능한 19 개의 아미노산 치환의 효과에 대한 예를 나타낸다. 데이터는 SEQ ID NO:187 의 위치 29 에서 단일 아미노산 치환을 갖는 개질 BBI-AV 의 BCE 및 트립신 활성의 4 반복 측정으로부터 측정된 BBI 및 BCE 활성비를 나타낸다.
실시예 10
공지된 아미노산 치환을 갖는 향상된 개질 BBIt - AV 를 위한 선택
본 실시예에서, 비개질 모 BBI-AV 의 트립신 저해 활성에 비해 향상된 트립신 저해 활성을 갖는 BBIt-AVs 에서 야기되는 초기 스크리닝에서 확인된 위치에서의 아미노산 치환의 완전한 집합을 생성하기 위해 위치 포화 라이브러리를 구축하였다. 또한, 모든 가능한 19 개의 아미노산으로 미리 치환되지 않은 위치에서 아미노산 치환의 완전한 집합을 위치-지정 돌연변이유발에 의해 생성하였다. 전체 39 개의 위치 포화 라이브러리를 생성하고, BBI 트립신 저해 활성 및 BCE 활성의 4 반복 활성 측정을 분석하여 대조군 BBI 분자, 즉 sBBI 및 비개질 BBIt-AV 보다 더 높은 트립신 저해 활성을 갖는 개질 BBIt-AV 분자에서 야기되는 단일 치환을 측정하였다. 비개질 BBIt-AV 에서 치환된 아미노산의 위치를 도 9 에 나타내었다.
위치 18, 38 및 61 에서의 위치-포화 라이브러리의 제 2 집합의 구축
우선, 라이브러리 구축을 보조하기 위해, 합성 유전자를 합성하여, 2BBIck81 코딩 부위에서 트립신 저해 루프를 코딩하는 부위 및 키모트립신 저해 루프를 인코딩하는 부위 사이에서 EcoRI 위치를 SphI 위치로 대체하였다 (EcoRI 위치의 장소를 도 3 에 나타냈음). 합성 유전자 서열은 하기와 같다:
Figure pct00129
.
상기 합성 유전자를 BamHI-HindIII 절편으로서 p2JMagk103-lnk2-BBIt-AV 로 클로닝하고, 생성되는 벡터를 p2JMagk103-lnk2-BBIt-AVsph 로 지칭하였다.
위치-포화 라이브러리를 하기와 같이 올리고뉴클레오티드 카세트를 사용하여 위치 18, 37 및 61 에서 구축하였다.
위치 18 에서의 위치-포화 라이브러리는, 올리고뉴클레오티드
Figure pct00130
을 어닐링하고, 생성되는 카세트를 p2JMagk103-lnk2-BBI-AVsph 의 BsrGI 및 SphI 위치로 라이게이션함으로써 구축되었다.
위치 37 에서의 위치-포화 라이브러리는, 올리고뉴클레오티드
Figure pct00131
을 어닐링하고, 생성되는 카세트를 p2JMagk103-lnk2-BBI-AVsph 의 SalI 및 SphI 위치로 라이게이션함으로써 구축되었다.
위치 61 에서의 위치-포화 라이브러리는, 올리고뉴클레오티드 5'-TCGACATCACTGACTTCTGCTATGAANNSTGTAAACCTTCTGAATAAA (SEQ ID NO:334) 를 두 개의 올리고뉴클레오티드 5'-TTCATAGCAGAAGTCAGTGATG (SEQ ID NO:335) 및 5'-AGCTTTTATTCAGAAGGTTTACA (SEQ ID NO:336) 로 어닐링하고, p2JMagk103-lnk2-BBIt-AVsph 의 SalI 및 HindIII 위치로 상기 카세트를 라이게이션함으로써 제조되었다.
라이게이션 믹스를 사용하여 E. 콜리 TOP10 세포 (Invitrogen) 를 형질전환시켰다. 96 개의 형질전환체를 선택하여, 각 클론에 존재하는 아미노산 치환을 DNA 서열분석으로 측정하였다. 각 단일 아미노산 치환으로부터 단리된 플라스미드를 사용하여 B. 서브틸리스를 형질전환시켰다.
위치 지정 돌연변이유발에 의한 아미노산 치환의 생성
적절한 제한 위치를 사용하여, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 카세트를 p2JMagk103-lnk2-BBI-AVsph 벡터로 라이게이션함으로써, 선택된 위치에서의 아미노산 치환을 구축하였다. 사용된 치환, 올리고뉴클레오티드 서열 및 제한 위치를 표 2 에 나타냈다.
[표 2]
위치 지정 돌연변이유발을 위한 올리고뉴클레오티드
Figure pct00132
Figure pct00133
Figure pct00134
Figure pct00135
Figure pct00136
Figure pct00137
Figure pct00138
개별적 아미노산 치환의 2 차 스크리닝: 마이크로타이터 플레이트에서의 4 반복 시험
각 선택된 위치에 대해, 각각의 아미노산 치환에 상응하는 클론을 선택하였다. 이러한 클론을 대조군으로서 BBI-WT, BBIt-AV 및 BBIt-AV-F50T 의 배양물과 함께, 37℃ 에서 ~ 10 시간 동안 15 ㎖ 배양 튜브에서 5 ppm 클로람페니콜 (37℃, 250 rpm) 를 갖는 5 ㎖ 의 Luria 브로쓰에서 성장시켰다. 각 배양물의 150 ㎕ 분취량을 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 웰, 각 아미노산 치환 및 각 대조군에 대한 4 개의 웰에 정렬하였다. 그리고 나서 정렬된 플레이트에서 성장한 각 배양물을 사용하여, 150 ㎕ 의 MBD 배지를 함유하는 2 반복 필터 플레이트 (Millipore, MSGV2210) 에 핀 리플리케이터를 사용하여 웰 당 5 ㎍/㎖ 클로람페니콜을 접종하였다. 플레이트에서의 배양물을 2-머캅토에탄올의 존재 및 부재 하에서 성장시키고, 상술된 바와 같이 분석하였다. BBIt-AV-F50T 는 비개질 BBIt-AV 모와 비슷한 활성화 이전의 초기 BBIt-AV:BCE 활성비를 갖지만, 2-머캅토에탄올과 같은 환원제를 사용한 활성화 후 비개질 BBIt-AV 보다 3 배 높은 BBIt-AV:BCE 활성비를 갖는 것으로 확인된 개질 BBIt-AV 이다.
각 위치의 경우, 각 웰에 대한 BBI:BCE 활성비를 측정하고, 4 반복 측정에 대한 평균값을 계산하였다. 각각의 아미노산 치환에 대한 활성비를 비개질 모 BBIt-AV (SEQ ID NO:187), 야생형 BBI (SEQ ID NO:13) 및 개질 BBIt-AV (BBIt-AV-F50T 를 지칭함) 에 대해 계산된 비와 비교하였다.
도 11A 및 11B 는 위치 50 및 37 각각에서의 각 치환에 대한 sBBI 에 대해 측정된 것에 대해, 2-머캅토에탄올 (BME) 의 존재하에 측정된 BBI:BCE 비의 4 반복 측정의 평균을 보여준다.
대체로, 데이터는 전구체 BBIt-AV 이상의 트립신 저해 활성을 갖는 BBIt-AV 변이체에서 야기되는 모 BBIt-AV 분자에서의 66 위치/위치의 16 에서 제조된 단일 아미노산 치환을 나타낸다 (표 3 에 데이터가 요약됨). 모든 단일 위치 치환 중에서, F5OR 은 최고의 BBIt-AV:BCE- 활성비를 야기하는 반면, 위치 50 에서의 여러 치환은 전구체 비개질 BBIt-AV 보다 4 배 높은 BBIt-AV:BCE 활성비를 갖는 개질 변이체 BBIt-AV 를 생성하고, 야생형 저해제와 유사하다 (도 11A-B).
이러한 데이터는 BBI-AV 분자에서의 단일 치환이 BBI-AV 의 활성에 미치는 유의한 효과를 가질 수 있음을 나타낸다.
[표 3]
비개질 BBIt - AV 보다 높은 BBI : BCE 활성비를 갖는 개질 BBIt - AV 분자에서 야기되는 치환
Figure pct00139
* 4D13 삽입물은 하술되는 BBI 단백질의 N-말단에 첨가되는 13 개의 아미노산 서열이다.
실시예 11
향상된 정제 수율을 갖는 개질 변이체의 선택
본 실시예에서, 상술된 방법을 사용하여 트립신 저해 활성을 보유하면서 상응하는 비개질 전구체 BBIt-AV 보다 높은 수율로 생성되는 단일 아미노산 치환을 함유하는 개질 BBIt-AV 를 확인하였다.
4 반복 플레이트 스크리닝에서 최고 BBIt-AV:BCE 활성비를 갖도록 선택된 개질 BBI-AV 를 추가로, BCE:BBIt-AV 융합 단백질로부터 BBIt-AV 를 절단하기 위해 정제 공정 중에 사용되는 산/열처리를 모방하기 위해 설계된 진탕 플라스크 스크리닝에서 시험하였다. 그리하여, 산/열처리 후 비개질 BBI-AV 보다 높은 BBI:BCE 활성비를 보유한 개질 BBIt-AV 를, 비개질 전구체 BBIt-AV 보다 높은 수율로 생성되는 개질 BBIt-AV 로서 확인하였다.
환원제, 예를 들어 2-머캅토에탄올을 사용한 활성화 후, 높은 BBIt-AV:BCE 활성비는, 제공된 아미노산 치환이 적어도 정확히 접힌 트립신 저해 루프를 갖는 분자의 분획을 유의하게 증가시키는 것을 나타낸다. 그러나, 유사한 BBIt-AV:BCE 활성비를 갖는 두 개의 상이한 아미노산 치환은 정제 후 다소 상이한 전체 수율을 가질 수 있다. 예를 들어, V52L 및 M27A 는 유사한 수준으로 활성화시키지만, M27A 는 산/열처리 후 약 40% 높은 수율을 가졌다. 그리하여, "양호한 활성화제" 로서 제 1 스크리닝에서 선택된 변이체를, 정제 수율을 잘 예측하기 위해 개발된 제 2 척도에 의해 추가로 평가하였다.
진탕 플라스크 스크리닝: 정제 수율을 위한 시험
발현을 증가시키기 위해, 선택된 클론의 유전자 카피를, 성장 속도가 클로람페니콜이 없는 Luria 한천 플레이트에서의 성장과 유사해질 때까지 25 ㎍/㎖ 클로람페니콜을 갖는 Luria 한천 플레이트에서 콜로니를 순차적으로 스트리킹함으로써 증폭시켰다. 선택된 변이체의 배양물 및 대조군을 15 ㎖ 튜브에서 25 ㎍/㎖ 클로람페니콜을 갖는 3 ㎖ Luria 브로쓰에서 ~ 10 시간 동안 성장시켰다. 상기 배양물 (30 μ) 을 사용하여 250 ㎖ 배플형 진탕 플라스크에서 30 ㎖ 의 MBD 배지를 접종시키고, 37℃ 및 225 rpm 에서 ~ 60 시간 동안 성장시켰다.
최고의 수율을 갖는 변이체를 선택하기 위해서, 배양 브로쓰를 하기와 같이 가공하였다. 우선, 20 ㎖ 의 브로쓰를 20 ㎖ 의 0.25 M 글리신 완충액 (pH 9.3) 을 혼합함으로써 상기 브로쓰를 활성화시키고, 50% NaOH 를 사용하여 pH 를 9.0 로 조절하였다. 그리고 나서, 2-머캅토에탄올을 희석된 배양물에 첨가하여 최종 농도가 2 mM 이 되게 하고, 배양물을 밤새 실온에서 가볍게 진탕시키면서 인큐베이션하였다. 그리고 나서, BBIt-AV 부분을 융합 단백질로부터 산/열처리에 의해 절단하고, 이를 우선 활성화된 브로쓰의 pH 를 황산을 사용하여 pH 1.9 - 2.0 로 조절한 후 60℃ 에서 16 시간 동안 가볍게 진탕시키면서 인큐베이션하였다. BBIt-AV-BCE 융합 단백질 및 BCE 촉매 도메인은 pH 2 에서 불용성이지만, 자유 BBI 종은 가용성이다. 절단 반응 후, 불용성 물질을 원심분리 (3,000 rpm 으로 5 분) 로 제거하고, 상술된 바와 같이 상청액을 트립신 저해 활성에 대해 분석하였다. 출발 물질 및 활성화 후의 샘플에 대한 BBI 활성을 또한 측정하였다. 출발 물질에 대한 BCE 활성을 또한 상술된 바와 같이 측정하였다. BBIt-AV:BCE 활성비를 공정 중 각 단계에 대해 계산하였다. 산/열처리 후 최고 수율로 생성된 개질 BBIt-AV 를 추가 연구를 위해 선택하였다.
산/열처리 후 BBIt-AV 수율을 유의하게 향상시킨 위치 13, 25, 27, 29, 31, 40, 50 및 52 에서 아미노산 치환을 발견하였다. 산/열처리 후 향상된 수율을 갖는 기타 치환은 D1C (활성화되지 않은 경우임), S4V, S5P, Q11G, S38N 및 S65E 였다. (위치 4 에서 위치-포화 라이브러리를 제조하기 위해 사용되는 QuikChange 반응 동안) 프라이머의 뜻밖의 중복에 의해 제조된 추가의 변이체는 또한 산/열처리 후 높은 BBIt-AV:BCE 활성비를 가졌다. 상기 변이체에서, 아미노산 서열, DDEPSKPCCDPDP (SEQ ID NO:389) (4D13 삽입으로 지칭됨) 을 BBIt-AV (SEQ ID NO:187) 의 링커 및 N-말단 사이에 삽입하고, SEQ ID NO:391 에서 링커에 융합된 개질 BBIt-AV 를 생성하였다.
Figure pct00140
링커를 이탤릭체로 나타내었고, 삽입물은 소문자로 나타내었으며, SEQ ID NO:187 에 상응하는 BBIt-AV 는 볼드체로 나타내었다. 4D13 개질 BBtI-AV 의 서열은 하기와 같다:
Figure pct00141
SEQ ID NO:390 의 4D13-BBIt-AV 를 인코딩하는 합성 유전자는 하기와 같다:
Figure pct00142
실시예 12
돌연변이의 조합
본 실시예에서, 플레이트 스크리닝 또는 진탕 플라스크 스크리닝에서 향상된 BBI:BCE 활성비를 갖는 BBIt-AV 에서 야기되는 단일 아미노산 치환을 조합하여, 단일 아미노산 치환을 운반하는 개질 BBIt-AV 보다 높은 BBIt-AV:BCE 활성비 및/또는 생성 수율을 갖는 개질 BBIt-AV 를 생성하였다.
상기 실시예 9 및 10 에 기술된 1 차 및 2 차 스크리닝 후, 단일 아미노산 치환 A13I, F50T 및 V52A 를 각각 함유하는 세 개의 개질 BBIt-AV 각각을, 각각의 대조군에 비해 향상된 BBI:BCE 활성비를 갖는 것으로서 확인하였다. 상기 세 개의 치환의 최선의 조합을 위해 선택하도록 라이브러리를 구축하였다. 반응 혼합물에서 등몰 농도의 하기 프라이머를 사용하는 상술된 QuikChange
Figure pct00143
돌연변이유발 프로토콜에 의해 라이브러리를 제작하였다: 프라이머 5'-CTGTTGCGATCAATGCATTTGTACGAAATC (SEQ ID NO:395) 를 사용하여 A13I 치환을 생성하였고, 프라이머 5'-CTGTACGGGTGGACCTGTACATGCGYCGACATCACGGACTTC (SEQ ID NO:396) 를 사용하여 F50T 및 F50T-V52A 치환을 생성하였으며, 프라이머 5'-GACCTGTTTTTGCGYCGACATCACGGAC (SEQ ID NO:397) 를 사용하여 반응 혼합물에서 V52A 치환을 생성하였다. 클론을 선택하고, 마이크로타이터 플레이트에서 스크리닝하고 상술된 바와 같이 스크리닝하였다.
F50T 및 V52A 치환을 함유하는 개질 이중 변이체 BBIt-AV (BBIt-AV-F50T-V52A; SEQ ID NO:595) 를 수득하고, SEQ ID NO:398 의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖도록 결정하였다.
Figure pct00144
3, 4 및 5 개의 아미노산 치환을 함유하는 개질 BBIt - AV 의 생성
상기 실시예 9 및 10 에 기술된 스크리닝에서 확인된 4 개의 생산적인 치환, A13I, S25L, L29P 및 A40K 의 조합을 BBIt-AV-F50T-V52A 이중 변이체에서 제작하였다. p2JMagk103lnk2BBIt-AV 벡터의 BamHI 및 HindIII 위치로 클로닝된 합성 유전자를 사용함으로써 상기 치환을 조합하였다. 치환의 조합을 포함하는 개질 BBIt-AV 에 대해 상응하는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 하기에 제공하였다.
Figure pct00145
Figure pct00146
Figure pct00147
Figure pct00148
Figure pct00149
6 및 7 개의 아미노산 치환을 함유하는 개질 BBIt - AV 의 생성
4D13 삽입물, 단일 아미노산 치환 D1C, S4V, S5P, Q11G, I13L, S25R, M27R, P29K, S31A, S31R, S38N, T50K, A52T, S65E, 및 SEQ ID NO:404 의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 5 중 변이체 (BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A) 에 존재하는 치환을 갖는 S25R-S31R 및 S25R-S31 을 포함하는 이중 아미노산 치환을 포함하는 변이체를 포함하는 추가의 개질 BBIt-AV 를 생성하였다.
하기 올리고뉴클레오티드를 사용하여 말단에 BamHI 및 SacI 제한 위치를 갖는 올리고뉴클레오티드 카세트와 함께 BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A (SEQ ID NO:404) 의 발현을 위해 구축된 p2JM103 기재 벡터로 4D13 펩티드를 삽입하였다:
Figure pct00150
BBIt-AV-4D13 삽입-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A 의 아미노산 서열:
Figure pct00151
p2JM103-lnk2 의 BamHI 및 HindIII 위치로 합성 유전자를 클로닝함으로써 기타 변이체를 제작하였다. 각 합성 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열 및 생성되는 개질 변이체 BBIt-AV 의 개질 아미노산 서열을 하기 표 4 에 나타냈다.
[표 4]
BBIt - AV -A13I- L29P -A40K-F50T- V52A 변이체 ( SEQ ID NO :601) 에 기초한 치환/개질을 포함하는 BBIt - AV
Figure pct00152
Figure pct00153
Figure pct00154
Figure pct00155
개질 변이체 BBIt-AV 의 BBI:BCE 비를 상술된 바와 같이 측정하고, 개질 변이체 BBIt-AV 각각에 대한 수율을 계산하였다. 개질 BBIt-AV BBIt-AV-A13I-S25R-L29P-S31R-A40K-F50T-V52A (SEQ ID NO:618), BBIt-AV-A13I-S25R-L29P-S31A-A40K-F50T-V52A (SEQ ID NO:617), BBIt-AV-A13I-S25R-L29P-A40K-F50T-V52A (SEQ ID NO:616), BBIt-AV-A13I-L29P-S31R-A40K-F50T-V52A (SEQ ID NO:622) 는 5 중 BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A (SEQ ID NO:601) 보다 산/열처리 후 유의하게 높은 수율을 가진 반면, BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50K-V52A (SEQ ID NO:624), BBIt-AV-A13L-L29P-A40K-F50T-V52A (SEQ ID NO:615) 및 BBIt-AV-4D13 삽입-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A (SEQ ID NO:413) 은 BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A (SEQ ID NO:601) 보다 약간 높은 수율을 가졌다. 개질 BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A-S65E (SEQ ID NO:626) 및 BBIt-AV-A13I-L29P-S38N-A40K-F50T-V52A (SEQ ID NO:623) 는 다소 낮은 BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52 (SEQ ID NO:624), BBIt-AV-A13I-M27R-L29P-A40K-F50T-V52A (SEQ ID NO:619), BBIt-AV-A13I-L29P-S31A-A40K-F50T-V52A (SEQ ID NO:621) 및 BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52T (SEQ ID NO:625) 와 유사한 수율을 가진 반면, BBIt-AV-S4V-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A (SEQ ID NO:612), BBIt-AV-Q11G-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A (SEQ ID NO:614), BBIt-AV-A13I-L29K-A40K-F50T-V52A (SEQ ID NO:620) 및 BBIt-AV-S5P-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A (SEQ ID NO:611) 모두는 산-열처리 후 BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A (SEQ ID NO:601) 보다 유의하게 낮은 수율을 가졌다. 활성화의 부재 하에서의 BBIt-AV-D1C-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A (SEQ ID NO:611) 의 수율은 또한 BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A (SEQ ID NO:601) 보다 매우 낮았다. 그러나, 활성화되지 않은 경우의 BBIt-AV-D1C-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A (SEQ ID NO:611) 의 산/열처리 후 수율은 활성화된 경우의 BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A (SEQ ID NO:601) 보다 약 2 배 높았지만, 활성화되지 않은 경우의 BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A (SEQ ID NO:601) 와 유사했다. 그리하여, 활성화 없이 고수율을 생산할 수 있는 치환을 발견하지 못했다.
8 개의 아미노산 치환을 함유하는 개질 BBI - AV 의 생성: 8 중 변이체
5 중-기재 개질 BBI-AV 의 시험 후, 8 개의 아미노산 치환이 포함되도록 추가의 개질 변이체 BBI (8 중 변이체) 를 생성하였다. 8 중 변이체의 활성 및 정제 수율을 상술된 바와 같이 측정하였다. 표 5 에서 보이는 바와 같은 합성 유전자를 사용하여 상술된 바와 같이 8 중 개질 BBIt-AV 의 구조를 달성하였다.
[표 5]
8 중 개질 변이체 BBIt - AV
Figure pct00156
Figure pct00157
진탕 플라스크 스크리닝에서 선택된 최상의 8 중 변이체를 본질적으로 상술된 바와 같고, 하기 변화를 포함하는 정제 공정으로 시험하였다: 1) 성장 후, 배양물을 CHES 완충액 대신 글리신 완충액 (125 mM 최종 농도 및 9.0 으로 조절된 pH) 에서 2 배 희석하고; 2) 샘플을 2 mM 2-머캅토에탄올만 (황산나트륨을 첨가하지 않음) 을 이용하여 활성화시키고; 3) 산 침전된 융합 단백질을 100 ㎖ 의 125 mM 글리신 (350 ㎖ 의 40 mM 글리신 대신임) 에 재현탁시키고; 4) 산/열처리 후 수집된 펠렛을 10 ㎖ 물로 세척하고, 여과하고, 이러한 "세척된 펠렛" 여과물을 본래 여과물과 조합하였다. 최종 여과물을 농축시키고, 상술된 바와 같이 Glu-BL 로 트리밍하였다.
결과는 8 중 변이체 BBIt-AV 분자 QQ8 (SEQ ID NO:628) 및 KT8 (SEQ ID NO:627) 이 5 중 개질 변이체 BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A 변이체 (SEQ ID NO:601) 보다 높은 정제 수율을 야기하는 것을 나타냈다. 개질 8 중 변이체 BBIt-AV-A13I-S25K-M27A-L29R-S31A-A40H-F50R-V52L (RL8; SEQ ID NO:630), BBIt-AV-A13I-S25K-M27A-L29R-S31E-A40K-F50Q-V52Q (QQ8; SEQ ID NO:628) 및 BBIt-AV-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-A40H-F50K-V52T (KT8; SEQ ID NO:627) 는 야생형 sBBI 분자/단백질보다 양호한 수율을 야기했다 (도 13).
실시예 13
FGF5 또는 TGF β1 결합 펩티드를 운반하는 BBI 스캐폴드의 향상된 생성
본 실시예에서, 향상된 트립신 저해 활성 및/또는 정제 수율을 갖는 개질 변이체 BBIt-AV 를 야기하는 동일한 아미노산 치환 (실시예 7-13 참조) 을, 키모트립신 루프가 FGF-5 또는 TGFβ1 결합 펩티드로 대체된 변이체 BBI 스캐폴드의 정제 수율 및/또는 트립신 저해 활성을 향상시키는 것에 대해 시험하였다.
변이체 및 개질 변이체 BBI - FGF -5 단백질의 생성:
치환 A13I-L29P-F50T-V52A (모두 위치 40 에서 알라닌을 가짐) 및 FGF-5 결합 펩티드 MM007 : RTQPYPL (SEQ ID NO:670), 또는 FGF-5 결합 펩티드 FGFps2: TWIDSTP (SEQ ID NO:671) 의 조합을 키모트립신 루프 대신에 포함하는 개질 변이체 BBIt-FGF-5 프로테아제 저해제를, 합성 유전자를 벡터 p2JMagk103-lnk2-BBIt-AV 의 BamHI 및 HindIII 위치로 라이게이션함으로써 구축하였다. 생성된 개질 변이체 MM007-Q-BBIt-FGF-5 (SEQ ID NO:432; SEQ ID NO:433) 및 개질 변이체 FGFps2-Q-BBIt-FGF-5 (SEQ ID NO:434 SEQ ID NO:435) 를 인코딩하는 합성 유전자의 아미노산 서열 및 DNA 서열은 하기와 같다.
Figure pct00158
변이체 및 개질 변이체 BBI - TGF β 단백질의 생성:
BBIt-AV (SEQ ID NO:187) 의 키모트립신 저해 루프를, 하기와 같이, 실시예 2 에서 기술된 방법에 따른 변이체 BBPI 를 생성하는 TGFβ1 결합 펩티드 PEN3: CLCPENINVLPCN (SEQ ID NO:436), TGFβ1 결합 펩티드 MM021W: CICKHNVDWLCF (SEQ ID NO:437) 또는 TGFβ1 결합 펩티드 WTQ: CICWTQHIHNCF (SEQ ID NO:438) 로 대체하였다.
p2JM103-lnk2-2BBI-FGFhl 발현 벡터에 의해 인코딩되는 키모트립신 반응성 위치 루프에서 FGFhl 결합 펩티드를 TGFβ1 결합 펩티드, PEN3, MM021W 또는 WTQ 로 대체하기 위해, 올리고뉴클레오티드 쌍을 사용하여 카세트를 제작하였다. 실시예 2 에서 기술된 프라이머 (SEQ ID NO:91 및 SEQ ID NO:92) 및 QuikChange
Figure pct00159
방법을 사용하여 p2JM103-lnk2-2BBI-FGFhl 을 구축하였다. TGFβ1 결합 카세트를 변이체 BBI 분자 PEN3-BBIt-TGFβ1, MM021W-BBIt-TGFβ1 및 WTQ-BBIt-TGFβ1 을 각각 구축하기 위해 벡터 p2JM103lnk2-2BBI-FGFhl 에서 SphI 및 SalI 제한 위치로 라이게이션하였다. 카세트를 제작하기 위해 사용되는 올리고뉴클레오티드의 DNA 서열을 하기와 같이 나타내었다.
Figure pct00160
또한, 치환 A13I-L29P-V52A (또한 모두는 위치 40 에서 알라닌 및 위치 50 에서 트레오닌을 가짐) 및 TGFβ1 결합 펩티드 PEN3-Q: CPENINVLPC (SEQ ID NO:672), MM021W-Q: CKHNVDWLC (SEQ ID NO:673) 또는 WTQ-Q: CWTQHIHNC (SEQ ID NO:674) 의 조합을 키모트립신 루프 대신에 포함하는 개질 변이체 BBPI-TGFβ1 변이체를, 벡터 p2JMagk103-lnk2-BBIt-AV 의 BamHI 및 HindIII 위치로 합성 유전자를 라이게이션함으로써 구축하였다. 생성된 개질 변이체 PEN3-Q-BBIt-TGFβ1 (SEQ ID NO:443; SEQ ID NO:444), 개질 변이체 MM021W-BBI-TGFβ1 (SEQ ID NO:445; SEQ ID NO:446), 및 개질 변이체 WTQ-BBI-TGFβ1 (SEQ ID NO:447; SEQ ID NO:448) 를 인코딩하는 합성 유전자의 아미노산 서열 및 DNA 서열은 하기와 같다.
Figure pct00161
FGF-5 또는 TGFβ 결합 펩티드를 함유하는 변이체 및 개질 변이체 BBI 를 포함하는 10 개의 벡터를 사용하여 B. 서브틸리스 BG6006 숙주 세포를 형질전환시켰다. 형질전환체를 성장시키고, 숙주 세포에 의해 생성된 조작 BBI 를 상술된 바와 같이 트립신 저해 활성 및 생성 수율에 대해 시험하였다.
도 14 는 성장 후, 2-머캅토에탄올을 사용한 활성화 후 및 산/열처리 후 측정된 비개질 변이체 모 MM007-PT-BBIt-FGF-5 (SEQ ID NO:678):
(DDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCAC RTQPYPL CFCVDITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:678),
비개질 변이체 모 FGFps2-PT-BBIt-FGF5 (SEQ ID NO:679):
(DDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCAC TWIDSTP CFCVDITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:679),
비개질 변이체 모 PEN3-PT-BBIt-TGFβ1 (SEQ ID NO:680):
(DDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCAC PENINVLP CFCVDITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:680),
비개질 변이체 모 WTQ-PT-TGFβ1 (SEQ ID NO:681):
(DDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCAC WTQHIHNCF CFCVDITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:681),
및 비개질 변이체 모 MM0021W-PT-TGFβ1 (SEQ ID NO:682):
(DDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCAC KHNVDWL CFCVDITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:682), (도 14 에서 지정된 PT) 및 상응하는 개질 변이체 MM007-Q-BBIt-FGF-5 (SEQ ID NO:432), 개질 변이체 FGFps2-Q-BBIt-FGF5 (SEQ ID NO:434), 개질 변이체 PEN3-Q-BBIt-TGFβ1 (SEQ ID NO:443), 개질 변이체 WTQ-Q-BBIt-TGFβ1 (SEQ ID NO:445), 및 개질 변이체 MM0021W-Q-BBIt-TGFβ1 (SEQ ID NO:447) 단백질 (도 14 에서 지정된 Q) 의 트립신 저해 활성을 나타낸다. 데이터는 FGF-5 또는 TGFβ1 결합 펩티드를 운반하는 BBIt 스캐폴드에 존재하는 경우 아미노산 13I-29P-40A-50T-52A 의 조합이, 결합 펩티드를 운반하는 상응하는 모 BBI 스캐폴드에 비해 성장 및 활성화 후의 트립신 저해 활성 및 산/열처리 후의 생성 수율을 향상시키는 것을 보여준다.
데이터는 또한, 키모트립신 루프가 VEGF 결합 펩티드로 대체된 개질 변이체 BBI 의 트립신 저해 활성 및/또는 정제 수율을 향상시키는 것으로 보여진 치환이, 키모트립신 루프가 기타 결합 펩티드, 예를 들어 FGF-5 결합 펩티드 및 TGFβ1 결합 펩티드에 의해 대체된 BBI 의 트립신 저해 활성 및/또는 생성 수율을 향상시키는 동일한 치환으로서 BBI-AV 에 특이적이지 않다는 증거가 된다.
따라서, BBIt-AV 의 생성 수율 및/또는 트립신 활성을 증가시키는 BBI 스캐폴드에서 제조된 아미노산 치환은 일반적으로 기타 결합 펩티드를 운반하는 BBI 스캐폴드에 적용가능할 것으로 예상된다.
실시예 14
바우만 버크 저해제 스캐폴드의 성능
본 실시예에서, 변이체 바우만 버크 저해제, 예를 들어 BBIt-AV (SEQ ID NO:187) 의 트립신 활성 및/또는 생성 수율에 미치는 아미노산 치환의 효과를 예측하는 능력을, 돌리코스 비플로루스 (BBdb, Acc. No. AAK97765; SEQ ID NO:449) PSESSKPCCDQCACTKSIPPQCRCTDVRLNSCHSACSSCVCTFSIPAQCVCVDMKDFCYEPCK (SEQ ID NO:449), 글리신 맥스 (콩) 프로테아제 저해제 IV 또는 D-II (BBsb3, Acc. No. P01064; SEQ ID NO:450) DDEYSKPCCDLCMCTRSMPPQCSCEDIRLNSCHSDCKSCMCTRSQPGQCRCLDT NDFCYKPCKSRDD (SEQ ID NO:450), 및 토레세아 (암부라나) 세아렌시스 (BBtc, Acc. No. P83283; SEQ ID NO:451) SSKWEACCDRCACTKSIPPQCHCADIRLNSCHSACESCACTHSIPAQCRCFDITDFCYKPCSG (SEQ ID NO:451) 로부터의 바우만 버크 저해제 서열을 거쳐 보존되지 않는 아미노산을 BBIt-AV 스캐폴드로 치환함으로써 시험하였다.
돌리코스 비플로루스 (BBdb, Acc. No. AAK97765; SEQ ID NO:449) 로부터의 바우만 버크 저해제의 제 2 프로테아제 저해 루프, 글리신 맥스 (콩) 프로테아제 저해제 IV 또는 D-II (BBsb3, Acc. No. P01064; SEQ ID NO:450) 로부터의 바우만 버크 저해제의 제 2 프로테아제 저해 루프 및 토레세아 (암부라나) 세아렌시스 (BBtc, Acc. No. P83283; SEQ ID NO:451) 로부터의 바우만 버크 저해제의 제 2 프로테아제 저해 루프를 VEGF 결합 펩티드 CK37281 (ACYNLYGWTC; SEQ ID NO:9) 로 대체하여, 상응하는 변이체 BBdb-AV (SEQ ID NO:452), BBsb3-AV (SEQ ID NO:453), 및 BBtc-AV (SEQ ID NO:454) 를 생성함으로써 변이체 바우만 버크 저해제를 생성하였다.
서열을 도 15 에서 나타낸 바와 같이 일렬이 되게 하고, SEQ ID NO:187 (BBIt-AV) 의 BBPI 의 위치 11, 13, 18, 23, 25, 27, 35, 37, 52, 54 및 55 와 동등한 위치에서의 아미노산을 4 개의 저해제를 거쳐 보존되지 않는 것으로서 확인하고, 선택하여 BBIt-AV 스캐폴드를 개질하였다.
BBdb-AV (SEQ ID NO:455) 및 BBsb3-AV (SEQ ID NO:456) 를 인코딩하는 합성 유전자를 BamHI-HindIII 절편으로서 p2JMagk103-lnk2-BBIt-AV 로 라이게이션하였다. BBtc-AV 유전자를 클로닝하기 위해, 유전자를 우선 BfrI 를 사용하여 소화시키고, 돌출부를 T4 DNA 폴리머라아제 및 dNTP 로 채우고, DNA 를 정제한 후 BamHI 를 사용하여 소화시켰다. HindIII 를 사용하여 소화된 p2JMagk103-lnk2-BBIt-AV 벡터로 상기 절편을 라이게이션하고, 돌출부를 T4 DNA 폴리머라아제 및 dNTP 로 채우고, DNA 를 정제한 후 BamHI 를 사용하여 소화시켰다. 변이체 PI 의 DNA 서열 및 상응하는 아미노산 서열은 하기와 같다.
Figure pct00162
변이체 저해제 서열을 포함하는 세 개의 발현 벡터를 사용하여 B. 서브틸리스 숙주 세포 BG6006 을 형질전환시켰다.
전형적으로, 제 1 디술피드 결합 (C8-C62) 의 외부의 N-말단 및 C-말단 끝의 치환은 트립신 저해 활성 및/또는 정제 수율에 미치는 작은 효과를 갖는다. 그리하여, C8 및 C62 사이의 위치에서 아미노산의 치환만을 연구하였다. 본 연구의 표적의 치환을 도 15 (볼드체 및 밑줄침) 에 나타냈다.
BBIt-AV (SEQ ID NO:187) 에서 위치 11, 13, 18, 23, 25, 27, 35, 37, 50, 52, 54, 55, 및 60 에서 각각의 아미노산 치환을 실시예 8 및 10 에 기술된 바와 같이 구축하였다. 이러한 치환을 실시예 9 및 10 에 기술된 바와 같이 (환원제가 있거나 없는) 마이크로타이터 플레이트에서 스크리닝함으로써 분석하였다. 결과를 하기 표 6 에 요약하였다.
[표 6]
개질 변이체 BBIt - AV 의 트립신 활성에 대한, BBtc - AV , BBdb - AV 및 BBsb3 - AV 스캐폴드에 존재하는 단일 아미노산 치환의 효과
Figure pct00163
* wt 는 상기 위치에서의 아미노산이 BBIt-AV 스캐폴드 (SEQ ID NO:187) 에서와 동일한 것을 나타낸다.
** (+/-) 는 환원제의 존재 하에 상대적 BBI:BCE 활성비가 BBIt-AV 와 유의하게 상이하지 않다는 것을 나타낸다.
*** (+) 는 환원제의 존재 하의 상대적 BBI:BCE 활성비가 BBIt-AV 보다 크고; "+" 의 수가 클수록 차이가 크다는 것을 나타낸다.
**** (-) 는 환원제의 존재 하의 상대적 BBI:BCE 활성비가 BBIt-AV 보다 낮고; "-" 의 수가 클수록 차이가 크다는 것을 나타낸다.
아미노산 치환의 효과가 추가적이라 가정하면, 표 6 에 제공된 데이터에서는, 변이체 BBItc-AV 가 BBIt-AV 보다 유의하게 양호하게 수행하는 한편, BBIsb3-AV 가 BBIt-AV 보다 유의하게 불량하게 수행하는 것으로 예측되었다. 또한, BBIdb-AV 가 환원제를 이용한 활성화에 있어서 BBIt-AV 보다 다소 양호하게 수행하는 것을 예측할 수 있다.
이러한 예측을 시험하기 위해서, BBIdb-AV, BBIsb3-AV 및 BBItc-AV 의 트립신 활성 및 생성 수율을, 실시예 11 에 기술된 진탕 플라스크 스크리닝을 사용하여 시험하고, 이들의 활성을 비개질 변이체 BBIt-AV 와 비교하였다.
도 16 에서 나타낸 데이터는, 예측한 바와 같이, BBItc-AV 가 활성화 후 최고의 트립신 저해 활성을 갖고, BBIdb-AV 저해 활성이 또한 BBIt-AV 저해제보다 높지만 BBItc-AV 저해제보다 낮은 것을 나타냈다. 또한, 예측한 바와 같이, BBIsb3-AV 는 매우 낮은 트립신 저해 활성을 갖고, 환원제를 사용하여 활성화되지 않았다 (저해 활성이 너무 작아서 도 16 에 나타내지 못했음). 또한, BBItc-AV 및 BBIdb-AV 는 활성화 후 BBIt-AV 보다 높은 저해 활성을 가질 뿐만 아니라, 향상된 생성 수율을 나타내는 산/열처리 후 높은 저해 활성을 가졌다.
따라서 결과는, BBIt-AV 에서 단일 아미노산 치환을 시험하는 경우에 수득되는 활성 데이터가 제 2 프로테아제 저해 루프를 대체하는 결합 펩티드를 갖는 스캐폴드로서 사용되는 경우의 기타 바우만 버크 저해제의 성능을 예측하는데 사용될 수 있음을 나타낸다.
실시예 15
개질 변이체 BBI 와 표적 단백질의 결합
본 실시예에서, 상응하는 표적 단백질을 결합시키기 위한 능력을 보유하는 변이체 펩티드의 능력을, 변이체 펩티드가 키모트립신 루프를 대체하기 위해 개질 바우만 버크 저해제 스캐폴드로 그래프트되는 경우에서 시험하였다.
BBI 에 대한 발현 벡터의 구조는 실시예 1 에 기술되어 있고, VEGF-결합 펩티드 CK37281 (SEQ ID NO:9), FGF-5-결합 펩티드 MM007 (SEQ ID NO:430) 또는 FGF-5-결합 펩티드 FGF5ps2 (SEQ ID NO:431) 을 키모트립신 저해 서열 대신 함유하는 변이체 BBI 에 대한 벡터의 구조는 상기 실시예 13 에 기재되어 있다. 아미노산 치환의 다양한 조합을 갖는 개질 변이체 BBIt-AV 를 위해 인코딩한 발현 벡터의 구축의 방법은 실시예 12 에 기술되어 있고, FGF5 및 TGFβ-결합 BBI 를 구축하기 위한 방법은 실시예 13 에 기술되어 있다.
올리고뉴클레오티드 카세트를 p2JM103-lnk2-2BBIck81 의 SphI 및 SalI 위치로 라이게이션함으로써, VegK (KYYLYWW ; SEQ ID NO:458), VegT (TLWKSYW ; SEQ ID NO:459) 및 VegKD (KYDLYWW ;SEQ ID NO:460) 로 지칭되는 VEGF-결합 펩티드를 키모트립신 저해 루프로 도입하였다. 개질 변이체 VEGK 및 VEGT BBPI 를 생성하기 위해 사용되는 올리고뉴클레오티드의 서열을 하기에 나타냈다.
Figure pct00164
Figure pct00165
합성 유전자 (VegKD-Q) 를 p2JMagk103-lnk2-2BBIck81 의 BamHI 및 HindIII 위치로 라이게이션함으로써, VegKD 로 지칭되는 VEGF-결합 펩티드를 변이체 BBI-A13I-S25K-L29P-V52K 로 도입하였다. 합성 유전자의 서열 및 인코딩된 BBPI 를 하기에 나타냈다.
Figure pct00166
합성 유전자를 p2JMagk103-lnk2-2BBIck81 의 BamHI 및 HindIII 위치로 라이게이션함으로써, VEGF-결합 펩티드 V1 (SKHSQIT; SEQ ID NO:468), V2 (KTNPSGS; SEQ ID NO:469), V3 (RPTGHSL; SEQ ID NO:470), V4 (KHSAKAE; SEQ ID NO:471), V5 (KPSSASS; SEQ ID NO:472) 및 V6 (PVTKRVH;SEQ ID NO:473), 및 TNFβ-결합 펩티드 T1 (RYWQDIP; SEQ ID NO:474), T2 (APEPILA; SEQ ID NO:475) 및 T3 (DMIMVSI; SEQ ID NO:476) 를, 아미노산 치환 A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-I40A-F50K-V52T 를 함유하는 개질 BBIt 의 키모트립신 저해 루프로 도입하였다. 생성된 개질 BBI 를 인코딩하는 합성 유전자의 DNA 서열을 하기에 나타냈다.
Figure pct00167
Figure pct00168
Figure pct00169
생성되는 벡터를 사용하여 B. 서브틸리스 BG6006 숙주 세포를 형질전환시켰다. 배양물을 500 ㎖ 의 MBD 배지에서 성장시키고, BBI 종을 상술된 바 및 Vogtentanz et al., 2007 (Protein Expr Purif 55:40-52 [2007]) 에 의한 바와 같이 본질적으로 정제하였다. BioVeris 결합 검정을 실시예 5 및 제조사에 의해 서술된 바와 같이 본질적으로 수행하였다. 라벨링된 경쟁자의 존재 또는 부재 하에서 개질 변이체 BBI 와 이의 표적 단백질 (예를 들어 VEGF, FGF5, TGFβ 및 TNFα) 의 결합을 측정하는 경쟁 검정인 BioVeris
Figure pct00170
결합 검정을 사용하여 개질 변이체 BBI 와 이들의 각각의 표적 단백질의 결합을 측정하였다. 상기 경쟁자는 표적 단백질에 대해 상승된 라벨링된 단일클론 항체 또는 표적 단백질의 라벨링된 음성 수용체일 수 있다. 전기화학발광 결합 검정을 실시예 5 에서 기술된 바와 같이 본질적으로 수행하였다. BioVeris 신호를 반으로 감소시키는데 필요되는 BBI 종의 농도를 측정함으로써 결합 데이터로부터 명백한 IC50 를 측정하였다. 키모트립신 저해 루프에서 표적 결합 펩티드가 없는 BBI 스캐폴드를 음성 대조군으로서 사용하였다.
결과를 하기 표 7 에 요약하였다.
[표 7]
키모트립신 루프가 VEGF -, FGF -5-, TGF β- 또는 TNF α-결합 변이체 펩티드에 의해 대체된 개질 변이체 바우만 버크 저해제의 결합 활성
Figure pct00171
Figure pct00172
Figure pct00173
Figure pct00174
●BBIt 스캐폴드의 키모트립신 루프를 대체하기 사용된 결합 펩티드.
▲SEQ ID NO:187 의 BBIt 의 아미노산 42-48 을 대체하는 결합 펩티드의 아미노산 서열.
*(+++) 는 약 2 - 10 μM 의 IC50 값을 나타내고; (++) 는 약 10 - 50 μM 의 IC50 값을 나타내며; (+) 는 약 50 - 250 μM 의 IC50 값을 나타내고; (-) 는 약 250 μM 초과의 IC50 값을 나타낸다.
이러한 데이터는 키모트립신 루프가 상이한 VEGF 결합 펩티드에 의해 대체되고, 스캐폴드의 골격에서 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하는 개질 변이체 BBPI 가 특히 이들의 표적 단백질, 즉 VEGF 과 결합하는 것을 보여준다. 유사하게는, 키모트립신 루프가 기타 변이체 펩티드, 예를 들어 FGF-5, TGFβ 및 TNFα 에 의해 대체되는 개질 변이체 BBPI 가 또한, 특히 상응하는 표적 단백질, 즉 FGF, TGF 및 TNF 에 결합한다. 또한, 키모트립신 루프가 변이체 펩티드, 예를 들어 VEGF 변이체 펩티드에 의해 대체되는 기타 BBPI 스캐폴드, 즉 BBtc, BBsb3 및 BBdb 가 또한 VEGF 표적 단백질에 특이적으로 결합할 수 있다.
결론적으로, 이러한 데이터는, 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고, 키모트립신 루프 대신 상이한 변이체 펩티드를 운반하는 개질 변이체 BBPI 스캐폴드가 자유 (비그래프트화) 결합 펩티드에 의해 기초되는 표적 단백질에 결합하는 능력을 보유한다는 것을 나타낸다. 그리하여, 이러한 데이터는 상응하는 표적 단백질에 결합하는 것으로 앞서 나타낸 상이한 결합 펩티드 서열이 개질 BBI 단백질의 키모트립신 저해 루프를 대체하기 위해 사용되고, 유사한 표적 단백질에 결합하는 것으로 예상될 수 있음을 나타낸다.
실시예 16
wt BBI 에서의 펩티드 T-세포 에피토프의 확인
WO9953038A2 및 Stickler et al, 2000 (J. Immunotherapy, 23(6), 654-660, [2000]) 에 기술된 바와 같이, 야생형 BBI 에서 펩티드 T-세포 에피토프의 확인을 위해 미성숙한 인간 T-세포를 사용하여 i-mune
Figure pct00175
검정을 수행하였다. 검정에 사용되는 펩티드를 야생형 BBI 아미노산 서열 DDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCICALSYPAQCFCVDITDFCYEPCKPSEDDKEN (SEQ ID NO:13) 에 기초하여 제조하였다. BBI 의 전체 길이 아미노산 서열로부터, 15 mer 펩티드를 Mimotopes US West (San Diego, CA) 에 의해 합성적으로 제조하였다. 각 15 mer 펩티드 서열을, 세 개의 잔기를 제외하고는 전후 15 mer 와 중복되도록 설계하였다. 야생형 BBI 서열에 상응하는 T-세포 에피토프에 대한 스크리닝에 사용되는 20 개 펩티드는 하기와 같았다:
Figure pct00176
Figure pct00177
간략하게는, 도 Y 에서 나타낸 펩티드를 사용하여, 인간 CD4+ T 세포를 수지상 세포 및 손상되지 않은 펩티드 집합에 대한 펩티드와 함께 공동-배양하였다. 사이토카인 반응을 [Strickler et al, 2000] 에 기재된 바와 같이 각 실험에서 평균화시키고, 펩티드에 대한 반응을, 자극 지수 (SI) 가 2.95 (도 18A) 초과이면 양성으로서 하여 표로 만들었다. 각 공여자에 대한 SI 값을 각 펩티드 집합에 대해 집계하였고, 각 펩티드에 대해 응답하는 공여자의 백분율을 도 18B 에 나타내었다. 백분율 배경 반응, 2.89% 를 집합에서 펩티드 전체에 대한 평균 백분율 응답자로서 측정하였다. 이러한 데이터집합에 대한 표준 편차는 2.21% 였다. 주요 에피토프는 배경보다 3 배 이상인 백분율 응답을 갖는 것으로 정의된다. 도 18A 및 18B 에 나타낸 데이터에 기초하여, 펩티드 반응은, 낮은 배경 반응 속도를 갖는 뜻밖의 공여자 집단에 대한 통계적 방법에 유의하게 기초하였다.
따라서, 이러한 데이터는 야생형 BBI 분자가 인간에서 낮은 면역원성 잠재성을 갖는 것으로 고려될 수 있음을 나타낸다.
실시예 17
개인 케어 조성물
본 실시예에서, 본 발명의 개질 변이체 BBPI 화합물 중 임의의 것을 포함하는 다양한 개인 케어 조성물을 하기와 같이 제공하였다. 이러한 제형에서, 양은 달리 표시되지 않는 한 전체 조성물의 백분율로서 제공하였다. 또한, 하기 제형에서 달리 표시되지 않는 한, BBI-AV (하기 "화합물" 로서 지칭됨) 의 농도는 약 0.01% 내지 약 1.0% 의 범위이다. 일부 제형에서, 바람직한 농도는 약 0.1% 내지 약 0.2% 의 범위인 반면, 다른 제형에서, 바람직한 농도는 약 0.05% 내지 약 0.1% (예를 들어, 헤어 성장 저해 구현예의 경우임); 약 0.02 내지 0.1% (예를 들어, 일부 피부 미백 구현예의 경우임); 약 0.5% 내지 약 1.0% (예를 들어, 일부 피부 미백 구현예의 경우임) 의 농도; 또는 약 0.1% 초과의 농도 (예를 들어, 일부 주사코 처리 구현예의 경우임) 이다. 당업자는 각 제품에 대한 BBI-AV 의 적합한 (즉, 최적) 농도를 결정하는 방법을 인지하고 있다. 하기 제공되는 조성물 일부에 있어서, "화합물" 양은 "SA" 로서 나타냈다. 이는 제조자가 본원에서 상기 나타낸 바와 같이 또는 특정 제형에 적절하게 BBI-AV 의 적절한 농도를 사용해야 한다는 것을 나타낸다.
Figure pct00178
Figure pct00179
Figure pct00180
Figure pct00181
Figure pct00182
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Figure pct00260
더 추가적인 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 무기 안료를 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 이러한 무기 안료는 금속 산화물 및/또는 기타 소량 수용성 또는 비수용성 금속 화합물을 기반으로 하는데, 이는 제한 없이 아연 산화물 (ZnO), 티타늄 (TiO2), 철 (예를 들어, Fe2O3), 지르코늄 (ZrO2), 실리카 (SiO2), 망간 (예를 들어, MnO), 알루미늄 (Al2O3), 세륨 (예를 들어, Ce2O3), 및 이러한 산화물의 혼합 산화물, 및 이의 배합물과 같은 화합물을 포함한다. 일부 구현예에서는 금속 산화물이 초미립자 등급인 반면, 다른 구현예에서는 금속 산화물이 안료 등급니다. 추가적인 구현예에서, 금속 산화물은 초미립자 및 안료 등급의 혼합물이다.
추가적인 구현예에서, 무기 안료는 코팅된다 (즉, 이는 표면에 대해 처리됨). 일부 특히 바람직한 구현예에서, 표면은 얇은, 소수성 필름으로 코팅된다. 일부 기타 특히 바람직한 구현예에서, 표면은 얇은 친수성 필름으로 코팅된다. 더 추가적인 구현예에서, 본 발명은 다양한 메이크업물 및 메이크업 성분을 포함하는 조성물을 제공한다. 예를 들어, 일부 구현예에서 본 발명은 다양한 염료 및/또는 안료를 제공한다. 일부 구현예에서, 유용한 안료는 제한 없이 티타늄 이산화물, 운모, 철 산화물 (예를 들어, Fe2O3, Fe3O4, FeO(OH) 등) 및/또는 제 1 주석 산화물을 포함한다. 본 발명은 또한 제한 없이 양홍색, 청색, 크로모옥사이드, 군청색 및/또는 자색 망간을 포함하는 색조를 제공한다. 일부 가장 바람직한 구현예의 색조 및 안료는 당업자에게 공지되어 있고 이미 제공된다 (예를 들어, [Colour Index Nummern (CIN), Rowe Colour Index, 3rd ed., Society of　Dyers and Colourists, Bradford, England [1971]] 참조).
추가적인 구현예에서, 운모/금속 산화물 기재의 진주광택제 안료는 상기 기재된 바와 같이 사용되었다. 그러나, 또다른 진주광택제 안료가 본 발명의 다양한 구현예에서 사용되므로, 본 발명이 이러한 특정 안료에 제한되는 것은 의도되지 않는다.
하기 제형은 본 발명의 용도의 추가적인 예를 제공한다.
Figure pct00261
Figure pct00262
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Figure pct00264
Figure pct00265
Figure pct00266
Figure pct00267
Figure pct00268
Figure pct00269
하기 제형은 본 발명의 BBI-AV 를 포함하는 애프터-쉐이브 제품의 예를 제공한다.
애프터 쉐이브 로션
% 성분 INCI
A 10.0 루비톨 EHO 세테아릴 에틸헥사노에이트
5.0 비타민 E 아세테이트 토코페릴 아세테이트
1.0 비사볼롤 라세미 비사볼롤
0.1 향료
0.3 카르보폴 Ultrez 21 아크릴레이트/C10-30 알킬 아크릴레이트 가교중합체
B 15.0 에탄올 알코올
1.0 D-판테놀 USP 판테놀
3.0 글리세린 87% 글리세린
0.1 트리에탄올아민 케어 트리에탄올아민
SA 화합물
QS 탈염수 (water dem.) 탈염수 (aqua dem.)
제조: 상 A 의 성분을 칭량하고, 이를 혼합하였다. 상 B 를 용해시키고, 이를 상 A 중에 교반시키고, 잘 균질화시켰다.
측정값:
점도: 18,500 mPa s 브룩필드 (Brookfield) RVD II+
pH 값: 5.8
하기 제형은 본 발명의 BBI-AV 를 포함하는 애프터-쉐이브 제품의 예를 제공한다.
프리 쉐이브
% 성분 INCI
A 80 에탄올 알코올
3.0 비타민 E 아세테이트 토코페릴 아세테이트
1.0 비사볼롤 라세미 비사볼롤
0.2 향료
0.1 멘톨 멘톨
4.0 루비톨 EHO 세테아릴 에틸헥사노에이트
2.0 Eutanol G 옥틸도데칸올
2.0 미글리올 812 카프릴산/카프르산 트리글리세리드
2.0 D-판테놀 USP 판테놀
2.0 위치 헤이즐 증류물 하마멜리스 버지니아나 (위치 헤이즐) 증류물
2.0 호호바 오일 시몬드시아 차이넨시스 (Simmondsia Chinensis) (호호바) 씨 오일
SA 화합물
제조: 상 A 의 성분을 칭량하고, 이를 맑게 용해시켰다.
상기 제조된 애프터-쉐이브 및 프리-쉐이브 제형은 충분한 BBI-AV (화합물) 을 함유하여, 원하는 효과(들) 를 제공한다. 일부 구현예에서, BBI-AV 의 농도는 약 1,000 ppm 내지 약 10,000 ppm 의 범위이다. 하기 제형에서, 사용된 BBI-AV 의 전형적인 농도는 약 100 ppm 내지 약 1,000 ppm, 또는 약 1,000 ppm 내지 약 10,000 ppm 의 범위이다. 그러나, 다른 농도가 본 발명의 다른 구현예에서 사용될 수 있으므로, 본 발명은 이러한 특정 농도 범위에 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
하기 제형은 본 발명의 BBI-AV 를 포함하는 애프터-선 제품의 예를 제공한다.
애프터 선 로션
% 성분 INCI
A 0.4 Carbopol 1342 아크릴레이트/C10-30 알킬 아크릴레이트 가교중합체
15.0 Luvitol EHO 세테아릴 에틸헥사노에이트
0.2 비사볼롤 rac. 비사볼롤
1.0 비타민 E 아세테이트 토코페릴 아세테이트
q.s. 향료
B 1.0 D-판테놀 USP 판테놀
15.0 에탄올 96% 알코올
3.0 글리세린 87% 글리세린
SA 화합물
64.2 탈염수 (water dem.) 탈염수 (aqua dem.)
C 0.2 Triethanolamine Care 트리에탄올아민
제조: 상 A 의 성분을 혼합하였다. 상 B 를 용해시키고, 이를 균질화시키면서 상 A 중에 교반시켰다. 상 C 로 중화시키고, 또다시 균질화시켰다.
측정값:
점도: 7 500mPa s 하케 점도계 (Haake Viscotester) VT-02
pH 값: 6.0
하기 제형은 본 발명의 BBI-AV 를 포함하는 얼굴 세정제 제품의 예를 제공한다.
얼굴 세정제
% 성분 INCI
A 10.0 Luvitol EHO 세테아릴 에틸헥사노에이트
10.0 Miglyol 812 카프릴산/카프르산 트리글리세리드
1.5 Dow Corning 345 Fluid 시클로펜타실록산, 시클로헥사실록산
2.0 Cremophor CO 40 PEG-40 수소화 피마자유
B 3.5 Luvigel EM 카프릴산/카프르산 트리글리세리드, 나트륨 아크릴레이트
공중합체
C 1.0 비타민 E 아세테이트 토코페릴 아세테이트
0.2 비사볼롤 rac. 비사볼롤
QS 보존제
QS 향료
D 3.0 Luviquat Care 폴리쿼터늄-44
0.5 Luviquat Mono LS 코코트리모늄 메토술페이트
0.5 Cremophor A 25 세테아레스-25
0.2 D-판테놀 50 P 판테놀, 프로필렌 글리콜
4.0 1,2 Propylene Glycol Care 프로필렌 글리콜
0.1 Edeta BD 이나트륨 EDTA
SA 화합물
QS 탈염수 (water dem.) 탈염수 (aqua dem.)
제조: 상 A 를 용해시킨 후, 상 B 중에 교반시켰다. 상 C 중에 천천히 섞었다. 상 D 를 용해시키고, 이를 조합된 상 A+B+C 중에 교반시키고, 균질화 시키고, 15 분 동안 다시 교반시켰다.
측정값:
점도: 7,200 mPa s 브룩필드 (Brookfield) RVT
pH 값: 5.8
하기 제형은 본 발명의 BBI-AV 를 포함하는 SPF 8 을 갖는 일상 케어 바디 스프레이 제품의 예를 제공한다.
일상 케어 바디 스프레이-SPF 8
% 성분 INCI
A 3.0 Uvinul MC 80 에틸헥실 메톡시신나메이트
2.0 Uvinul A Plus™ 디에틸아미노 히드록시벤조일 헥실 벤조에이트
1.0 Luviquat UltraCare 폴리쿼터늄-44
3.0 1,2 Propylenglycol Care 프로필렌 글리콜
2.0 D-판테놀 50 P 판테놀, 프로필렌 글리콜
1.0 Dow Corning 345 Fluid 시클로펜타실록산, 시클로헥사실록산
10.0 Eutanol G 옥틸도데칸올
0.5 Luviskol K 30 PVP
10.0 Miglyol 812 카프릴산/카프르산 트리글리세리드
3.0 Finsolv TN C12-15 알킬 벤조에이트
3.0 글리세린 87% 글리세린
1.0 비타민 E 아세테이트 토코페릴 아세테이트
0.3 비사볼롤 rac. 비사볼롤
화합물
QS 에탄올 알코올
제조: 상 A 의 성분을 칭량하고, 이를 맑게 용해시켰다.
측정값:
SPF: 8 유럽화장품협회 태스크 포스 (Colipa Task Force) "자외선 차단 측정"
하기 제형은 본 발명의 BBI-AV 를 포함하는 SPF 27 을 갖는 일상 케어 선 케어 로션 제품의 예를 제공한다.
선 케어 로션 - SPF 27
% 성분 INCI
A 4.5 Uvinul MC 80 에틸헥실 메톡시신나메이트
2.0 Uvinul A Plus™ 디에틸아미노 히드록시벤조일 헥실 벤조에이트
3.0 Uvinul N 539 T 옥토크릴렌
2.5 Cosmacol EMI 디-C12-13 알킬 말레이트
0.5 비타민 E 아세테이트 토코페릴 아세테이트
4.0 Tego Care 450 폴리글리세릴-3 메틸 글루코스 디스테아레이트
B 3.5 Cetiol SN Deo 세테아릴 이소노나노에이트
1.0 Ganex V-220 VP/에이코센 공중합체
5.0 이소헥사데칸 이소헥사데칸
2.5 Cosmacol EMI 디-C12-13 알킬 말레이트
3.0 Uvinul TiO2 티타늄 이산화물, 트리메톡시카프릴릴실란
C 5.0 글리세린 87% 글리세린
1.0 Lanette E 나트륨 세테아릴 술페이트
0.5 Keltrol 잔탄 검
60.7 탈염수 (water dem.) 탈염수 (aqua dem.)
D SA 화합물
1.0 Phenonip 페녹시에탄올, 메틸파라벤, 에틸파라벤,
0.3 비사볼롤 rac. 비사볼롤
제조: 상 A 및 B 를 개별적으로 약 80℃ 로 가열하였다. 상 B 를 균질화시키면서 상 A 중에 교반시켰다. 상 C 를 약 80℃ 로 가열하고, 이를 균질화시키면서 조합된 상 A+B 중에 교반시켰다. 약 40℃ 로 냉각시키고, 상 D 를 첨가하고, 다시 균질화시켰다.
측정값:
점도: 3,200mPa s 브룩필드 RVD II+
pH 값: 6.0
SPF: 27 유럽화장품협회 태스크 포스 "자외선 차단 측정"
선 케어 로션-SPF 24
% 성분 INCI
A 2.0 Cremophor A 6 세테아레스-6, 스테아릴 알코올
2.0 Cremophor A 25 세테아레스-25
3.0 Syncrowax HRC 트리베헤닌
2.0 Lanette O 세테아릴 알코올
2.0 Luvitol EHO 세테아릴 에틸헥사노에이트
5.0 Uvinul MC 80 에틸헥실 메톡시신나메이트
1.0 Uvinul T 150 에틸헥실 트리아존
1.0 Ganex V-220 VP/에이코센 공중합체
7.0 이소프로필 미리스테이트 이소프로필미리스테이트
B 5.0 Z-Cote HP-1 아연 산화물, 트리에톡시카프릴릴실란
C 0.2 Keltrol 히드록시에틸 아크릴레이트/나트륨 아크릴로일디메틸
타우레이트 공중합체, 스쿠알렌, 폴리소르베이트 60
0.2 Edeta BD 이나트륨 EDTA
5.0 1,2 Propylene Glycol Care 프로필렌 글리콜
0.5 D-판테놀 USP 판테놀
61.9 탈염수 (water dem.) 탈염수 (aqua dem.)
D SA 화합물
0.5 Euxyl K 300 페녹시에탄올, 메틸파라벤, 부틸파라벤,
에틸파라벤, 프로필파라벤, 이소부틸파라벤
1.0 비타민 E 아세테이트 토코페릴 아세테이트
0.2 비사볼롤 rac. 비사볼롤
제조: 상 A 를 80℃ 로 가열하고, 상 B 를 첨가하고, 3 분 동안 균질화시켰다. 상 C 를 약 80℃ 로 가열하고, 이를 균질화시키면서 조합된 상 A+B 중에 교반시켰다. 약 40℃ 로 냉각시키고, 상 D 를 첨가하고, 균질화시켰다.
측정값:
점도: 5,000mPa s 브룩필드 RVD II+
pH 값: 7.5
SPF: 24 유럽화장품협회 태스크 포스 "자외선 차단 측정"
하기 제형은 본 발명의 BBI-AV 를 포함하는 SPF 28 의 선 스크린 에멀젼 제품의 예를 제공한다.
선 스크린 에멀젼-SPF 28
% 성분 INCI
A 3.5 Cremophor A 6 세테아레스-6, 스테아릴 알코올
1.5 Cremophor A 25 세테아레스-25
7.5 Uvinul MC 80 에틸헥실 메톡시신나메이트
2.0 Uvinul A Plus™ 디에틸아미노 히드록시벤조일 헥실 벤조에이트
2.0 Dow Corning 345 Fluid 시클로펜타실록산, 시클로헥사실록산
0.5 밀랍 3044 PH 밀랍
3.0 Lanette O 세테아릴 알코올
10.0 Miglyol 812 카프릴산/카프르산 트리글리세리드
B 5.0 T-Lite SF-S 티타늄 이산화물, 실리카, 메티콘, 알루미나
C 3.0 글리세린 87% 글리세린
0.2 Edeta BD 이나트륨 EDTA
0.3 Keltrol T 잔탄 검
1.0 Plantacare 2000 데실 글루코시드
2.0 D-판테놀 50 P 판테놀, 프로필렌 글리콜
57.3 탈염수 (water dem.) 탈염수 (aqua dem.)
D SA 화합물
1.0 비타민 E 아세테이트 토코페릴 아세테이트
0.2 비사볼롤 rac. 비사볼롤
QS 향료
QS 보존제
제조: 상 A 를 80℃ 로 가열하고, 상 B 를 첨가하고, 3 분 동안 균질화시켰다. 상 C 를 약 80℃ 로 가열하고, 이를 균질화시키면서 조합된 상 A+B 중에 교반시켰다. 약 40℃ 로 냉각시키고, 상 D 를 첨가하고, 균질화시켰다.
측정값:
점도: 7,500mPa s 브룩필드 RVD II+
pH 값: 6.6
SPF: 28 유럽화장품협회 태스크 포스 "자외선 차단 측정"
하기 제형은 본 발명의 BBI-AV 를 포함하는 풋 밤 제품의 예를 제공한다.
풋 밤
% 성분 INCI
A 2.0 Cremophor A 6 세테아레스-6, 스테아릴 알코올
2.0 Cremophor A 25 세테아레스-25
5.0 Luvitol EHO 세테아릴 에틸헥사노에이트
4.0 Lanette 16 세틸 알코올
4.0 Cutina Gms 글리세릴 스테아레이트
5.0 파라핀 오일 미네랄 오일
0.2 멘톨 멘톨
0.5 캄포르 캄포르
B 70.3 탈염수 (water dem.) 탈염수 (aqua dem.)
QS 보존제
C SA 화합물
1.0 비사볼롤 rac. 비사볼롤
1.0 비타민 E 아세테이트 토코페릴 아세테이트
D 5.0 위치 헤이즐 추출물 위치 헤이즐 추출물
제조: 상 A 및 B 를 개별적으로 약 80℃ 로 가열하였다. 상 B 를 균질화시키면서 상 A 중에 교반시켰다. 약 40℃ 로 냉각시키고, 상 C 및 D 를 첨가하고, 다시 균질화시켰다. 실온으로 냉각시켰다.
측정값:
점도: 20,500 mPa s 브룩필드 RVD II+
pH 값: 6.0
하기 제형은 본 발명의 BBI-AV 를 포함하는 리프레싱 풋 겔 제품의 예를 제공한다.
리프레싱 풋 겔
% 성분 INCI
A 0.6 Carbopol Ultrez 21 아크릴레이트/C10-30 알킬 아크릴레이트 가교중합체
45.9 탈염수 (water dem.) 탈염수 (aqua dem.)
B 1.0 비사볼롤 rac. 비사볼롤
0.5 파르네솔 파르네솔
q.s. 향료
4.5 Cremophor CO 40 PEG-40 수소화 피마자유
1.0 Neutrol TE 테트라히드록시프로필 에틸렌디아민
1.5 멘톨 멘톨
SA 화합물
45.0 에탄올 96% 알코올
QS FD&C 청색 제 1 호 C.I. 42 090, FD&C 청색 제 1 호
제조: 상 A: Carbopol 을 산재시키고, 비커 바닥에 가라앉혔다. 상 B 를 용해시키고, 이를 상 A 중에 교반시켰다.
측정값:
점도: 14,500mPa s 브룩필드 RVD II+
pH 값: 7.5
하기 제형은 본 발명의 BBI-AV 를 포함하는 스킨 컨디셔닝 겔 제품의 예를 제공한다.
스킨 컨디셔닝 겔
% 성분 INCI
A 3.6 Cremophor CO 40 PEG-40 수소화 피마자유
15.0 에탄올 알코올
0.1 비사볼롤 rac. 비사볼롤
0.5 비타민 E 아세테이트 토코페릴 아세테이트
QS 향료
B 3.0 D-판테놀 USP 판테놀
0.6 Carbopol 940 카보머
SA 화합물
76.4 탈염수 (water dem.) 탈염수 (aqua dem.)
C 0.8 Triethanolamine Care 트리에탄올아민
제조: 상 A 를 맑게 용해시켰다. 상 B 를 팽윤시키고, 상 C 로 중화시켰다. 상 A 를 중화 상 B 중에 교반시키고 균질화시켰다.
측정값:
점도: 57,600mPa s 브룩필드 RVD II+
pH 값: 7.7
하기 제형은 본 발명의 BBI-AV 를 포함하는 W/O 에멀젼의 실시예를 제공한다.
W/O 에멀젼
% 성분 INCI
A 6.0 Cremophor WO 7 PEG-7 수소화 피마자유
8.0 Luvitol EHO 세테아릴 에틸헥사노에이트
5.0 이소프로필 미리스테이트 이소프로필 미리스테이트
15.0 파라핀 오일 미네랄 오일
0.3 마그네슘 스테아레이트 마그네슘 스테아레이트
0.3 알루미늄 스테아레이트 알루미늄 스테아레이트
2.0 Elfacos ST9 PEG-45/도데실 글리콜 공중합체
B 5.0 글리세린 87% 글리세린
0.7 마그네슘 술페이트-7-히드레이트 마그네슘 술페이트
56.6 탈염수 (water dem.) 탈염수 (aqua dem.)
C SA 화합물
0.5 비타민 E 아세테이트 토코페릴 아세테이트
0.6 비사볼롤 rac. 비사볼롤
제조: 상 A 및 B 를 개별적으로 약 85℃ 로 가열하였다. 상 B 를 상 A 중에 교반시키고 균질화시켰다. 교반하면서 약 40℃ 로 냉각시키고, 상 C 를 첨가하고 다시 균질화시켰다. 실온으로 냉각시켰다.
측정값:
점도: 37,500mPa s 브룩필드 RVD II+
하기 제형은 본 발명의 BBI-AV 를 포함하는 O/W 에멀젼 제품의 예를 제공한다.
O/W 에멀젼
% 성분 INCI
A 1.7 Cremophor A 6 세테아레스-6, 스테아릴 알코올
0.7 Cremophor A 25 세테아레스-25
2.0 Uvinul A Plus™ 디에틸아미노 히드록시벤조일 헥실
벤조에이트
2.0 Abil B 8843 PEG-14 디메티콘
3.6 Lanette O 세테아릴 알코올
6.0 Uvinul MC 80 에틸헥실 메톡시신나메이트
2.0 Cetiol B 디부틸 아디페이트
B 5.0 글리세린 87% 글리세린
0.2 Edeta BD 이나트륨 EDTA
1.0 D-판테놀 75 W 판테놀
q.s. 보존제
68.8 탈염수 (water dem.) 탈염수 (aqua dem.)
C 4.0 Luvigel EM 카프릴산/카프르산 트리글리세리드, 나트륨
아크릴레이트 공중합체
D 0.2 나트륨 아스코르빌 포스페이트 나트륨 아스코르빌 포스페이트
1.0 비타민 E 아세테이트 토코페릴 아세테이트
0.2 비사볼롤 rac. 비사볼롤
E q.s. 수산화나트륨 10% aq. w/w 수산화나트륨
F 1.0 RetiSTAR 카프릴산/카프르산 트리글리세리드, 나트륨
아스코르베이트, 토코페롤, 레티놀
SA 화합물
제조: 상 A 및 B 를 개별적으로 약 80℃ 로 가열하였다. 상 B 를 상 A 중에 교반시키고, 균질화시켰다. 상 C 를 조합된 상 A+B 중에 교반시키고, 균질화시켰다. 약 40℃ 로 냉각시키고, 상 D 를 첨가한 후, 상 E 로 pH 값을 6.5 로 조절하였다. 상 F 를 첨가하고, 균질화시켰다. 실온으로 냉각시켰다.
측정값:
점도: 37,500mPa s 브룩필드 RVD II+
pH 값: 6.3
하기 제형은 본 발명의 BBI-AV 를 포함하는 보호 데이 크림 제품의 예를 제공한다.
보호 데이 크림
% 성분 INCI
A 1.7 Cremophor A 6 세테아레스-6, 스테아릴 알코올
0.7 Cremophor A 25 세테아레스-25
2.0 Uvinul A Plus™ 디에틸아미노 히드록시벤조일 헥실
벤조에이트
2.0 Abil B 8843 PEG-14 디메티콘
3.6 Lanette O 세테아릴 알코올
6.0 Uvinul MC 80 에틸헥실 메톡시신나메이트
2.0 Cetiol B 디부틸 아디페이트
B 5.0 글리세린 87% 글리세린
0.2 Edeta BD 이나트륨 EDTA
1.0 D-판테놀 75 W 판테놀
QS 보존제
69.6 탈염수 (water dem.) 탈염수 (aqua dem.)
C 4.0 Luvigel EM 카프릴산/카프르산 트리글리세리드, 나트륨
아크릴레이트 공중합체
D 1.0 나트륨 아스코르빌 포스페이트 나트륨 아스코르빌 포스페이트
1.0 비타민 E 아세테이트 토코페릴 아세테이트
SA 화합물
0.2 비사볼롤 rac. 비사볼롤
E QS 수산화나트륨 10% aq. w/w 수산화나트륨
제조: 상 A 및 B 를 개별적으로 약 80℃ 로 가열하였다. 상 B 를 상 A 중에 교반시키고 균질화시켰다. 상 C 를 조합된 상 A+B 중에 교반시키고, 균질화시켰다. 약 40℃ 로 냉각시키고, 상 D 를 첨가한 후, 상 E 로 pH 값을 6.5 로 조절하였다. 실온으로 냉각시켰다.
측정값:
점도: 24,000mPa s 브룩필드 RVD II+
pH 값: 6.4
하기 제형은 본 발명의 BBI-AV 를 포함하는 헤어 케어 제품의 예를 제공한다.
헤어 컨디셔너
% 성분 (INCI)
A 10.0 PVP/VA 공중합체
0.2 히드록시에틸 세틸디모늄 포스페이트
0.2 세테아레스-25
0.5 디메티콘 코폴리올
QS 향료
10.0 알코올
SA 화합물
68.1 탈염수
B 10.0 프로판/부탄
% 성분 (INCI)
A 10.0 PVP/VA 공중합체
0.2 히드록시에틸 세틸디모늄 포스페이트
0.2 세테아레스-25
0.5 디메티콘 코폴리올
QS 향료
10.0 알코올
SA 화합물
64.1 탈염수
B 10.0 프로판/부탄
제조: 모든 화합물을 상 A 에 첨가하고, 교반하여 균질화시켰다. 적절한 용기에 채우고, 상 B 로 충전하였다.
거품 컨디셔너
% 성분 (INCI)
A 1.0 폴리쿼터늄-4
0.5 히드록시에틸 세틸디모늄 포스페이트
화합물
QS 향료
QS 보존제
91.5 탈염수
B 6.0 프로판/부탄
% 성분 (INCI)
A 1.0 폴리쿼터늄-4
0.5 히드록시에틸 세틸디모늄 포스페이트
화합물
QS 향료
QS 보존제
87.5 탈염수
B 6.0 프로판/부탄
제조: 모든 화합물을 상 A 에 첨가하고 교반하여 균질화시켰다. 적절한 용기에 채우고, 상 B 로 충전시켰다.
거품 컨디셔너
% 성분 (INCI)
A 1.0 폴리쿼터늄-11
0.5 히드록시에틸 세틸디모늄 포스페이트
화합물
QS 향료
QS 보존제
91.5 탈염수
B 6.0 프로판/부탄
% 성분 (INCI)
A 1.0 폴리쿼터늄-11
0.5 히드록시에틸 세틸디모늄 포스페이트
SA 화합물
QS 향료
QS 보존제
87.5 탈염수
B 6.0 프로판/부탄
제조: 모든 화합물을 상 A 에 첨가하고 교반하여 균질화시켰다. 적절한 용기에 채우고, 상 B 로 충전하였다.
스타일링용 거품
% 성분 (INCI)
A 0.5 라우레스-4
QS 향료
B 77.3 탈염수
10.0 폴리쿼터늄-28
화합물
0.5 디메티콘 코폴리올
0.2 세테아레스-25
0.2 판테놀
0.1 PEG-25 PABA
0.2 히드록시에틸셀룰로오스
C 10.0 HFC 152 A
% 성분 (INCI)
A 0.5 라우레스-4
QS 향료
B 73.3 탈염수
10.0 폴리쿼터늄-28
SA 화합물
0.5 디메티콘 코폴리올
0.2 세테아레스-25
0.2 판테놀
0.1 PEG-25 PABA
0.2 히드록시에틸셀룰로오스
C 10.0 HFC 152 A
제조: 상 A 의 화합물을 칭량하고, 이를 혼합하였다. 상 B 를 용해시키고, 상 A 중에 교반시키고 균질화시켰다. 적절한 용기에 채우고 상 C 로 충전하였다.
% 성분 (INCI)
A 2.0 코코트리모늄 메토술페이트
QS 향료
B 78.5 탈염수
6.7 아크릴레이트 공중합체
0.6 AMP
SA 화합물
0.5 디메티콘 코폴리올
0.2 세테아레스-25
0.2 판테놀
0.1 PEG-25 PABA
0.2 히드록시에틸셀룰로오스
C 10.0 HFC 152 A
% 성분 (INCI)
A 2.0 코코트리모늄 메토술페이트
QS 향료
B 74.5 탈염수
6.7 아크릴레이트 공중합체
0.6 AMP
SA 화합물
0.5 디메티콘 코폴리올
0.2 세테아레스-25
0.2 판테놀
0.1 PEG-25 PABA
0.2 히드록시에틸셀룰로오스
C 10.0 HFC 152 A
제조: 상 A 의 화합물을 칭량하고, 이를 혼합하였다. 상 B 를 용해시키고, 상 A 중에 교반시키고 균질화시켰다. 적절한 용기에 채우고, 상 C 로 충전하였다.
스타일링용 거품
% 성분 (INCI)
A 2.0 코코트리모늄 메토술페이트
QS 향료
B 7.70 폴리쿼터늄-44
SA 화합물
QS 보존제
79.3 탈염수
C 10.0 프로판/부탄
제조: 상 A 의 화합물을 칭량하고 이를 혼합하였다. 상 B 를 용해시키고, 상 A 중에 교반시키고 균질화시켰다. pH 를 6-7 로 조절하였다. 적절한 용기에 채우고, 상 C 로 충전하였다.
스타일링용 거품
% 성분 (INCI)
A 2.00 코코트리모늄 메토술페이트
QS 향료
B 72.32 탈염수
2.00 VP/아크릴레이트/라우릴 메타크릴레이트 공중합체
0.53 AMP
SA 화합물
0.20 세테아레스-25
0.50 판테놀
0.05 벤조페논-4
0.20 아모디메티콘, 세트리모늄 클로라이드, 트리데세스-12
15.00 알코올
C 0.20 히드록시에틸셀룰로오스
D 6.00 프로판/부탄
% 성분 (INCI)
A 2.00 코코트리모늄 메토술페이트
QS 향료
B 68.32 탈염수
2.00 VP/아크릴레이트/라우릴 메타크릴레이트 공중합체
0.53 AMP
SA 화합물
0.20 세테아레스-25
0.50 판테놀
0.05 벤조페논-4
0.20 아모디메티콘, 세트리모늄 클로라이드, 트리데세스-12
15.00 알코올
C 0.20 히드록시에틸셀룰로오스
D 6.00 프로판/부탄
제조: 상 A 의 화합물을 칭량하고, 이를 혼합하였다. 상 B 를 용해시키고, 상 A 중에 교반시키고 균질화시켰다. 상 C 를 첨가하고 다시 균질화시켰다. pH 를 6-7 로 조절하였다. 적절한 용기에 채우고, 상 D 로 충전하였다.
스타일링용 거품
% 성분 (INCI)
A 2.00 세트리모늄 클로라이드
QS 향료
B 67.85 탈염수
7.00 폴리쿼터늄-46
SA 화합물
0.20 세테아레스-25
0.50 판테놀
0.05 벤조페논-4
0.20 아모디메티콘, 세트리모늄 클로라이드, 트리데세스-12
15.00 알코올
C 0.20 히드록시에틸셀룰로오스
D 6.00 프로판/부탄
% 성분 (INCI)
A 2.00 세트리모늄 클로라이드
QS 향료
B 63.85 탈염수
7.00 폴리쿼터늄-46
SA 화합물
0.20 세테아레스-25
0.50 판테놀
0.05 벤조페논-4
0.20 아모디메티콘, 세트리모늄 클로라이드, 트리데세스-12
15.00 알코올
C 0.20 히드록시에틸셀룰로오스
D 6.00 프로판/부탄
제조: 상 A 의 화합물을 칭량하고, 이를 혼합하였다. 상 B 를 용해시키고, 상 A 중에 교반시키고 균질화시켰다. 상 C 를 첨가하고, 다시 균질화시켰다. pH 를 6-7 로 조절하였다. 적절한 용기에 채우고, 상 D 로 충전하였다.
스타일링용 거품
% 성분 (INCI)
A QS PEG-40 수소화 피마자유
QS 향료
85.5 탈염수
B 7.0 나트륨 폴리스티렌 술포네이트
SA 화합물
0.5 세트리모늄 브로마이드
QS 보존제
C 6.0 프로판/부탄
% 성분 (INCI)
A QS PEG-40 수소화 피마자유
QS 향료
81.5 탈염수
B 7.0 나트륨 폴리스티렌 술포네이트
SA 화합물
0.5 세트리모늄 브로마이드
QS 보존제
C 6.0 프로판/부탄
제조: 상 A 의 화합물을 칭량하고 이를 혼합하였다. 상 B 를 용해시키고, 상 A 중에 교반시키고 균질화시켰다. pH 를 6-7 로 조절하였다. 적절한 용기에 채우고, 상 C 로 충전하였다.
스타일링용 거품
% 성분 (INCI)
A QS PEG-40 수소화 피마자유
QS 향료
92.0 탈염수
B 0.5 폴리쿼터늄-10
1.0 화합물
0.5 세트리모늄 브로마이드
QS 보존제
C 6.0 프로판/부탄
% 성분 (INCI)
A QS PEG-40 수소화 피마자유
QS 향료
88.0 탈염수
B 0.5 폴리쿼터늄-10
5.0 화합물
0.5 세트리모늄 브로마이드
QS 보존제
C 6.0 프로판/부탄
제조: 상 A 의 화합물을 칭량하고 이를 혼합하였다. 상 B 를 용해시키고, 상 A 중에 교반시키고 균질화시켰다. pH 를 6-7 로 조절하였다. 적절한 용기에 채우고, 상 C 로 충전하였다.
% 성분 (INCI)
A QS PEG-40 수소화 피마자유
QS 향료
82.5 탈염수
B 10.0 폴리쿼터늄-16
SA 화합물
0.5 히드록시에틸 세틸디모늄 포스페이트
QS 보존제
C 6.0 프로판/부탄
% 성분 (INCI)
A QS PEG-40 수소화 피마자유
QS 향료
78.5 탈염수
B 100 폴리쿼터늄-16
SA 화합물
0.5 히드록시에틸 세틸디모늄 포스페이트
QS 보존제
C 6.0 프로판/부탄
제조: 상 A 의 화합물을 칭량하고 이를 혼합하였다. 상 B 를 용해시키고, 상 A 중에 교반시키고 균질화시켰다. pH 를 6-7 로 조절하였다. 적절한 용기에 채우고, 상 C 로 충전하였다.
스타일링용 거품
% 성분 (INCI)
A 2.0 코코트리모늄 메토술페이트
QS 향료
B 84.0 탈염수
2.0 키토산
SA 화합물
0.5 디메티콘 코폴리올
0.2 세테아레스-25
0.2 판테놀
0.1 PEG-25 PABA
C 10.0 HFC 152 A
% 성분 (INCI)
A 2.0 코코트리모늄 메토술페이트
QS 향료
B 80.0 탈염수
2.0 키토산
SA 화합물
0.5 디메티콘 코폴리올
0.2 세테아레스-25
0.2 판테놀
0.1 PEG-25 PABA
C 10.0 HFC 152 A
제조: 상 A 의 화합물을 칭량하고 이를 혼합하였다. 상 B 를 용해시키고, 상 A 중에 교반시키고 균질화시켰다. pH 를 6-7 로 조절하였다. 적절한 용기에 채우고, 상 C 로 충전하였다.
샴푸
% 성분 (INCI)
A 30.0 나트륨 라우레스 술페이트
6.0 나트륨 코코암포아세테이트
6.0 코카미도프로필 베타인
3.0 나트륨 라우레스 술페이트, 글리콜 디스테아레이트, 코카미드 MEA, 라우레스-10
SA 화합물
7.7 폴리쿼터늄-44
2.0 아모디메티콘
QS 향료
QS 보존제
1.0 염화나트륨
43.3 탈염수
B QS 시트르산
% 성분 (INCI)
A 30.0 나트륨 라우레스 술페이트
6.0 나트륨 코코암포아세테이트
6.0 코카미도프로필 베타인
3.0 나트륨 라우레스 술페이트, 글리콜 디스테아레이트, 코카미드 MEA, 라우레스-10
화합물
7.7 폴리쿼터늄-44
2.0 아모디메티콘
QS 향료
QS 보존제
1.0 염화나트륨
39.3 탈염수
B QS 시트르산
제조: 상 A 의 화합물을 칭량하고, 이를 혼합하였다. 시트르산으로 pH 를 6-7 로 조절하였다.
샤워 겔
% 성분 (INCI)
A 40.0 나트륨 라우레스 술페이트
5.0 데실 글루코시드
5.0 코카미도프로필 베타인
SA 화합물
1.0 판테놀
QS 향료
QS 보존제
2.0 염화나트륨
46.0 탈염수
B QS 시트르산
% 성분 (INCI)
A 40.0 나트륨 라우레스 술페이트
5.0 데실 글루코시드
5.0 코카미도프로필 베타인
SA 화합물
1.0 판테놀
QS 향료
QS 보존제
2.0 염화나트륨
42.0 탈염수
B QS 시트르산
제조: 상 A 의 화합물을 칭량하고, 이를 혼합하였다. 시트르산으로 pH 를 6-7 로 조절하였다.
샴푸
% 성분 (INCI)
A 40.0 나트륨 라우레스 술페이트
5.0 나트륨 C12-15 파레스-15 술포네이트
5.0 데실 글루코시드
QS 향료
0.1 피탄트리올
44.6 탈염수
SA 화합물
0.3 폴리쿼터늄-10
1.0 판테놀
QS 보존제
1.0 라우레스-3
2.0 염화나트륨
% 성분 (INCI)
A 40.0 나트륨 라우레스 술페이트
5.0 나트륨 C12-15 파레스-15 술포네이트
5.0 데실 글루코시드
QS 향료
0.1 피탄트리올
40.6 탈염수
SA 화합물
0.3 폴리쿼터늄-10
1.0 판테놀
QS 보존제
1.0 라우레스-3
2.0 염화나트륨
제조: 상 A 의 화합물을 칭량하고, 이를 혼합하였다. 시트르산으로 pH 를 6-7 로 조절하였다.
샴푸
% 성분 (INCI)
A 15.00 코카미도프로필 베타인
10.00 이나트륨 코코암포디아세테이트
5.00 폴리소르베이트 20
5.00 데실 글루코시드
QS 향료
QS 보존제
SA 화합물
0.15 구아 히드록시프로필트리모늄 클로라이드
2.00 라우레스-3
58.00 탈염수
QS 시트르산
B 3.00 PEG-150 디스테아레이트
% 성분 (INCI)
A 15.00 코카미도프로필 베타인
10.00 이나트륨 코코암포디아세테이트
5.00 폴리소르베이트 20
5.00 데실 글루코시드
QS 향료
QS 보존제
화합물
0.15 구아 히드록시프로필트리모늄 클로라이드
2.00 라우레스-3
54.00 탈염수
QS 시트르산
B 3.00 PEG-150 디스테아레이트
제조: 상 A 의 화합물을 칭량하고, 이를 혼합하였다. pH 를 6-7 로 조절하였다. 상 B 를 첨가하고, 최대 40℃ 로 가열하였다.
바디 로션
% 성분 (INCI)
A 2.0 세테아레스-25
2.0 세테아레스-6, 스테아릴 알코올
3.0 세테아릴 에틸헥사노에이트
1.0 디메티콘
4.0 세테아릴 알코올
3.0 글리세릴 스테아레이트 SE
5.0 미네랄 오일
4.0 시몬드시아 차이넨시스 (호호바) 씨 오일
3.0 미네랄 오일, 라놀린 알코올
B 5.0 프로필렌 글리콜
SA 화합물
1.0 판테놀
0.5 마그네슘 알루미늄 실리케이트
QS 보존제
65.5 탈염수
C QS 향료
D QS 시트르산
% 성분 (INCI)
A 2.0 세테아레스-25
2.0 세테아레스-6, 스테아릴 알코올
3.0 세테아릴 에틸헥사노에이트
1.0 디메티콘
4.0 세테아릴 알코올
3.0 글리세릴 스테아레이트 SE
5.0 미네랄 오일
4.0 시몬드시아 차이넨시스 (호호바) 씨 오일
3.0 미네랄 오일, 라놀린 알코올
B 5.0 프로필렌 글리콜
SA 화합물
1.0 판테놀
0.5 마그네슘 알루미늄 실리케이트
QS 보존제
61.5 탈염수
C QS 향료
D QS 시트르산
제조: 상 A 및 B 를 개별적으로 약 40℃ 로 가열하였다. 상 B 를 상 A 에 첨가하고, 교반함으로써 균질화시켰다. 상 C 를 조합된 상 A 및 B 에 첨가하고, 다시 균질화시켰다. 상 D 로 pH 를 6-7 로 조절하였다. 교반함으로써 균질화시키고, 실온으로 냉각시켰다.
바디 로션
% 성분 (INCI)
A 6.0 PEG-7 수소화 피마자유
10.0 세테아릴 에틸헥사노에이트
5.0 이소프로필 미리스테이트
7.0 미네랄 오일
0.5 시어 버터 (부티로스퍼멈 파르키 (Butyrospermum Parkii))
0.5 알루미늄 스테아레이트
0.5 마그네슘 스테아레이트
0.2 비사볼롤
0.7 쿼터늄-18-헥토라이트
B 5.0 디프로필렌 글리콜
0.7 마그네슘 술페이트
QS 보존제
62.9 탈염수
C QS 향료
SA 화합물
% 성분 (INCI)
A 6.0 PEG-7 수소화 피마자유
10.0 세테아릴 에틸헥사노에이트
5.0 이소프로필 미리스테이트
7.0 미네랄 오일
0.5 시어 버터 (부티로스퍼멈 파르키)
0.5 알루미늄 스테아레이트
0.5 마그네슘 스테아레이트
0.2 비사볼롤
0.7 쿼터늄-18-헥토라이트
B 5.0 디프로필렌 글리콜
0.7 마그네슘 술페이트
QS 보존제
58.9 탈염수
C QS 향료
SA 화합물
제조: 상 A 및 B 를 개별적으로 약 80℃ 로 가열하였다. 상 B 를 상 A 에 첨가하고, 교반함으로써 균질화시켰다. 40℃ 로 냉각시키고 상 C 를 첨가하였다. 다시 균질화시키고, 실온으로 냉각시켰다.
헤어 컨디셔너
% 성분 (INCI)
A 10.0 PVP/VA 공중합체
0.2 히드록시에틸 세틸디모늄 포스페이트
0.2 세테아레스-25
0.5 디메티콘 코폴리올
QS 향료
10.0 알코올
SA 화합물
68.1 탈염수
B 10.0 프로판/부탄
% 성분 (INCI)
A 10.0 PVP/VA 공중합체
0.2 히드록시에틸 세틸디모늄 포스페이트
0.2 세테아레스-25
0.5 디메티콘 코폴리올
QS 향료
10.0 알코올
SA 화합물
64.1 탈염수
B 10.0 프로판/부탄
제조: 모든 화합물을 상 A 에 첨가하고, 교반하여 균질화시켰다. 적절한 용기에 채우고 상 B 로 충전하였다.
거품 컨디셔너
% 성분 (INCI)
A 1.0 폴리쿼터늄-4
0.5 히드록시에틸 세틸디모늄 포스페이트
SA 화합물
QS 향료
QS 보존제
91.5 탈염수
B 6.0 프로판/부탄
% 성분 (INCI)
A 1.0 폴리쿼터늄-4
0.5 히드록시에틸 세틸디모늄 포스페이트
SA 화합물
QS 향료
QS 보존제
87.5 탈염수
B 6.0 프로판/부탄
제조: 모든 화합물을 상 A 에 첨가하고, 교반하여 균질화시켰다. 적절한 용기에 채우고, 상 B 로 충전하였다.
거품 컨디셔너
% 성분 (INCI)
A 1.0 폴리쿼터늄-11
0.5 히드록시에틸 세틸디모늄 포스페이트
화합물
QS 향료
QS 보존제
91.5 탈염수
B 6.0 프로판/부탄
% 성분 (INCI)
A 1.0 폴리쿼터늄-11
0.5 히드록시에틸 세틸디모늄 포스페이트
SA 화합물
QS 향료
QS 보존제
87.5 탈염수
B 6.0 프로판/부탄
제조: 모든 화합물을 상 A 에 첨가하고, 교반하여 균질화시켰다. 적절한 용기에 채우고, 상 B 로 충전하였다.
스타일링용 거품
% 성분 (INCI)
A 0.5 라우레스-4
QS 향료
B 77.3 탈염수
10.0 폴리쿼터늄-28
SA 화합물
0.5 디메티콘 코폴리올
0.2 세테아레스-25
0.2 판테놀
0.1 PEG-25 PABA
0.2 히드록시에틸셀룰로오스
C 10.0 HFC 152 A
% 성분 (INCI)
A 0.5 라우레스-4
QS 향료
B 73.3 탈염수
10.0 폴리쿼터늄-28
SA 화합물
0.5 디메티콘 코폴리올
0.2 세테아레스-25
0.2 판테놀
0.1 PEG-25 PABA
0.2 히드록시에틸셀룰로오스
C 10.0 HFC 152 A
제조: 상 A 의 화합물을 칭량하고, 이를 혼합하였다. 상 B 를 용해시키고, 상 A 중에 교반시키고 균질화시켰다. 적절한 용기에 채우고, 상 C 로 충전하였다.
스타일링용 거품
% 성분 (INCI)
A 2.0 코코트리모늄 메토술페이트
QS 향료
B 78.5 탈염수
6.7 아크릴레이트 공중합체
0.6 AMP
SA 화합물
0.5 디메티콘 코폴리올
0.2 세테아레스-25
0.2 판테놀
0.1 PEG-25 PABA
0.2 히드록시에틸셀룰로오스
C 10.0 HFC 152 A
% 성분 (INCI)
A 2.0 코코트리모늄 메토술페이트
QS 향료
B 74.5 탈염수
6.7 아크릴레이트 공중합체
0.6 AMP
SA 화합물
0.5 디메티콘 코폴리올
0.2 세테아레스-25
0.2 판테놀
0.1 PEG-25 PABA
0.2 히드록시에틸셀룰로오스
C 10.0 HFC 152 A
제조: 상 A 의 화합물을 칭량하고, 이를 혼합하였다. 상 B 를 용해시키고, 상 A 중에 교반시키고 균질화시켰다. 적절한 용기에 채우고 상 C 로 충전하였다.
스타일링용 거품
% 성분 (INCI)
A 2.0 코코트리모늄 메토술페이트
QS 향료
B 7.70 폴리쿼터늄-44
SA 화합물
QS 보존제
79.3 탈염수
C 10.0 프로판/부탄
% 성분 (INCI)
A 2.0 코코트리모늄 메토술페이트
QS 향료
B 7.70 폴리쿼터늄-44
SA 화합물
QS 보존제
75.3 탈염수
C 10.0 프로판/부탄
제조: 상 A 의 화합물을 칭량하고, 이를 혼합하였다. 상 B 를 용해시키고, 상 A 중에 교반시키고 균질화시켰다. pH 를 6-7 로 조절하였다. 적절한 용기에 채우고, 상 C 로 충전하였다.
스타일링용 거품
% 성분 (INCI)
A 2.00 코코트리모늄 메토술페이트
QS 향료
B 72.32 탈염수
2.00 VP/아크릴레이트/라우릴 메타크릴레이트 공중합체
0.53 AMP
SA 화합물
0.20 세테아레스-25
0.50 판테놀
0.05 벤조페논-4
0.20 아모디메티콘, 세트리모늄 클로라이드, 트리데세스-12
15.00 알코올
C 0.20 히드록시에틸셀룰로오스
D 6.00 프로판/부탄
% 성분 (INCI)
A 2.00 코코트리모늄 메토술페이트
QS 향료
B 68.32 탈염수
2.00 VP/아크릴레이트/라우릴 메타크릴레이트 공중합체
0.53 AMP
SA 화합물
0.20 세테아레스-25
0.50 판테놀
0.05 벤조페논-4
0.20 아모디메티콘, 세트리모늄 클로라이드, 트리데세스-12
15.00 알코올
C 0.20 히드록시에틸셀룰로오스
D 6.00 프로판/부탄
제조: 상 A 의 화합물을 칭량하고, 이를 혼합하였다. 상 B 를 용해시키고, 상 A 중에 교반시키고 균질화시켰다. 상 C 를 첨가하고, 다시 균질화시켰다. pH 를 6-7 로 조절하였다. 적절한 용기에 채우고, 상 D 로 충전하였다.
스타일링용 거품
% 성분 (INCI)
A 2.00 세트리모늄 클로라이드
QS 향료
B 67.85 탈염수
7.00 폴리쿼터늄-46
SA 화합물
0.20 세테아레스-25
0.50 판테놀
0.05 벤조페논-4
0.20 아모디메티콘, 세트리모늄 클로라이드, 트리데세스-12
15.00 알코올
C 0.20 히드록시에틸 셀룰로오스
D 6.00 프로판/부탄
% 성분 (INCI)
A 2.00 세트리모늄 클로라이드
QS 향료
B 63.85 탈염수
7.00 폴리쿼터늄-46
SA 화합물
0.20 세테아레스-25
0.50 판테놀
0.05 벤조페논-4
0.20 아모디메티콘, 세트리모늄 클로라이드, 트리데세스-12
15.00 알코올
C 0.20 히드록시에틸셀룰로오스
D 6.00 프로판/부탄
제조: 상 A 의 화합물을 칭량하고, 이를 혼합하였다. 상 B 를 용해시키고, 상 A 중에 교반시키고 균질화시켰다. 상 C 를 첨가하고, 다시 균질화시켰다. pH 를 6-7 로 조절하였다. 적절한 용기에 채우고, 상 D 로 충전하였다.
스타일링용 거품
% 성분 (INCI)
A QS PEG-40 수소화 피마자유
QS 향료
85.5 탈염수
B 7.0 나트륨 폴리스티렌 술포네이트
SA 화합물
0.5 세트리모늄 브로마이드
QS 보존제
C 6.0 프로판/부탄
% 성분 (INCI)
A QS PEG-40 수소화 피마자유
QS 향료
81.5 탈염수
B 7.0 나트륨 폴리스티렌 술포네이트
SA 화합물
0.5 세트리모늄 브로마이드
QS 보존제
C 6.0 프로판/부탄
제조: 상 A 의 화합물을 칭량하고, 이를 혼합하였다. 상 B 를 용해시키고, 상 A 중에 교반시키고 균질화시켰다. pH 를6-7 로 조절하였다. 적절한 용기에 채우고, 상 C 로 충전하였다.
스타일링용 거품
% 성분 (INCI)
A QS PEG-40 수소화 피마자유
QS 향료
92.0 탈염수
B 0.5 폴리쿼터늄-10
1.0 화합물
0.5 세트리모늄 브로마이드
QS 보존제
C 6.0 프로판/부탄
% 성분 (INCI)
A QS PEG-40 수소화 피마자유
QS 향료
88.0 탈염수
B 0.5 폴리쿼터늄-10
5.0 화합물
0.5 세트리모늄 브로마이드
QS 보존제
C 6.0 프로판/부탄
제조: 상 A 의 화합물을 칭량하고, 이를 혼합하였다. 상 B 를 용해시키고, 상 A 중에 교반시키고 균질화시켰다. pH 를 6-7 로 조절하였다. 적절한 용기에 채우고, 상 C 로 충전하였다.
스타일링용 거품
% 성분 (INCI)
A QS PEG-40 수소화 피마자유
QS 향료
82.5 탈염수
B 10.0 폴리쿼터늄-16
SA 화합물
0.5 히드록시에틸 세틸디모늄 포스페이트
QS 보존제
C 6.0 프로판/부탄
% 성분 (INCI)
A QS PEG-40 수소화 피마자유
QS 향료
78.5 탈염수
B 10.0 폴리쿼터늄-16
SA 화합물
0.5 히드록시에틸 세틸디모늄 포스페이트
QS 보존제
C 6.0 프로판/부탄
제조: 상 A 의 화합물을 칭량하고, 이를 혼합하였다. 상 B 를 용해시키고, 상 A 중에 교반시키고 균질화시켰다. pH 를 6-7 로 조절하였다. 적절한 용기에 채우고 상 C 로 충전하였다.
스타일링용 거품
% 성분 (INCI)
A 2.0 코코트리모늄 메토술페이트
QS 향료
B 84.0 탈염수
2.0 키토산
SA 화합물
0.5 디메티콘 코폴리올
0.2 세테아레스-25
0.2 판테놀
0.1 PEG-25 PABA
C 10.0 HFC 152 A
% 성분 (INCI)
A 2.0 코코트리모늄 메토술페이트
QS 향료
B 80.0 탈염수
2.0 키토산
SA 화합물
0.5 디메티콘 코폴리올
0.2 세테아레스-25
0.2 판테놀
0.1 PEG-25 PABA
C 10.0 HFC 152 A
제조: 상 A 의 화합물을 칭량하고, 이를 혼합하였다. 상 B 를 용해시키고, 상 A 중에 교반시키고 균질화시켰다. pH 를 6-7 로 조절하였다. 적절한 용기에 채우고 상 C 로 충전하였다.
샴푸
% 성분 (INCI)
A 30.0 나트륨 라우레스 술페이트
6.0 나트륨 코코암포아세테이트
6.0 코카미도프로필 베타인
3.0 나트륨 라우레스 술페이트, 글리콜 디스테아레이트, 코카미드 MEA, 라우레스-10
SA 화합물
7.7 폴리쿼터늄-44
2.0 아모디메티콘
QS 향료
QS 보존제
1.0 염화나트륨
43.3 탈염수
B QS 시트르산
% 성분 (INCI)
A 30.0 나트륨 라우레스 술페이트
6.0 나트륨 코코암포아세테이트
6.0 코카미도프로필 베타인
3.0 나트륨 라우레스 술페이트, 글리콜 디스테아레이트, 코카미드 MEA, 라우레스-10
SA 화합물
7.7 폴리쿼터늄-44
2.0 아모디메티콘
SA 향료
SA 보존제
1.0 염화나트륨
39.3 탈염수
B QS 시트르산
제조: 상 A 의 화합물을 칭량하고, 이를 혼합하였다. 시트르산으로 pH 를 6-7 로 조절하였다.
샤워 겔
% 성분 (INCI)
A 40.0 나트륨 라우레스 술페이트
5.0 데실 글루코시드
5.0 코카미도프로필 베타인
SA 화합물
1.0 판테놀
QS 향료
QS 보존제
2.0 염화나트륨
46.0 탈염수
B QS 시트르산
% 성분 (INCI)
A 40.0 나트륨 라우레스 술페이트
5.0 데실 글루코시드
5.0 코카미도프로필 베타인
SA 화합물
1.0 판테놀
QS 향료
QS 보존제
2.0 염화나트륨
42.0 탈염수
B QS 시트르산
제조: 상 A 의 화합물을 칭량하고, 이를 혼합하였다. 시트르산으로 pH 를 6-7 로 조절하였다.
샴푸
% 성분 (INCI)
A 40.0 나트륨 라우레스 술페이트
5.0 나트륨 C12-15 파레스-15 술포네이트
5.0 데실 글루코시드
QS 향료
0.1 피탄트리올
44.6 탈염수
SA 화합물
0.3 폴리쿼터늄-10
1.0 판테놀
QS 보존제
1.0 라우레스-3
2.0 염화나트륨
% 성분 (INCI)
A 40.0 나트륨 라우레스 술페이트
5.0 나트륨 C12-15 파레스-15 술포네이트
5.0 데실 글루코시드
QS 향료
0.1 피탄트리올
40.6 탈염수
SA 화합물
0.3 폴리쿼터늄-10
1.0 판테놀
QS 보존제
1.0 라우레스-3
2.0 염화나트륨
제조: 상 A 의 화합물을 칭량하고, 이를 혼합하였다. 시트르산으로 pH 를 6-7 로 조절하였다.
샴푸
% 성분 (INCI)
A 15.00 코카미도프로필 베타인
10.00 이나트륨 코코암포디아세테이트
5.00 폴리소르베이트 20
5.00 데실 글루코시드
QS 향료
QS 보존제
SA 화합물
0.15 구아 히드록시프로필트리모늄 클로라이드
2.00 라우레스-3
58.00 탈염수
QS 시트르산
B 3.00 PEG-150 디스테아레이트
% 성분 (INCI)
A 15.00 코카미도프로필 베타인
10.00 이나트륨 코코암포디아세테이트
5.00 폴리소르베이트 20
5.00 데실 글루코시드
QS 향료
QS 보존제
SA 화합물
0.15 구아 히드록시프로필트리모늄 클로라이드
2.00 라우레스-3
54.00 탈염수
QS 시트르산
B 3.00 PEG-150 디스테아레이트
제조: 상 A 의 화합물을 칭량하고, 이를 혼합하였다. pH 를 6-7 로 조절하였다. 상 B 를 첨가하고 최대 40℃ 로 가열하였다.
바디 로션
% 성분 (INCI)
A 2.0 세테아레스-25
2.0 세테아레스-6, 스테아릴 알코올
3.0 세테아릴 에틸헥사노에이트
1.0 디메티콘
4.0 세테아릴 알코올
3.0 글리세릴 스테아레이트 SE
5.0 미네랄 오일
4.0 시몬드시아 차이넨시스 (호호바) 씨 오일
3.0 미네랄 오일, 라놀린 알코올
B 5.0 프로필렌 글리콜
SA 화합물
1.0 판테놀
0.5 마그네슘 알루미늄 실리케이트
QS 보존제
65.5 탈염수
C QS 향료
D QS 시트르산
% 성분 (INCI)
A 2.0 세테아레스-25
2.0 세테아레스-6, 스테아릴 알코올
3.0 세테아릴 에틸헥사노에이트
1.0 디메티콘
4.0 세테아릴 알코올
3.0 글리세릴 스테아레이트 SE
5.0 미네랄 오일
4.0 시몬드시아 차이넨시스 (호호바) 씨 오일
3.0 미네랄 오일, 라놀린 알코올
B 5.0 프로필렌 글리콜
SA 화합물
1.0 판테놀
0.5 마그네슘 알루미늄 실리케이트
QS 보존제
61.5 탈염수
C QS 향료
D QS 시트르산
제조:
상 A 및 B 를 개별적으로 약 40℃ 로 가열하였다. 상 B 를 상 A 에 첨가하고, 교반함으로써 균질화시켰다. 상 C 를 조합된 상 A 및 B 에 첨가하고, 다시 균질화시켰다. 상 D 로 pH 를 6-7 로 조절하였다. 교반함으로써 균질화시키고, 실온으로 냉각시켰다.
바디 로션
% 성분 (INCI)
A 6.0 PEG-7 수소화 피마자유
10.0 세테아릴 에틸헥사노에이트
5.0 이소프로필미리스테이트
7.0 미네랄 오일
0.5 시어 버터 (부티로스퍼멈 파르키)
0.5 알루미늄 스테아레이트
0.5 마그네슘 스테아레이트
0.2 비사볼롤
0.7 쿼터늄-18-헥토라이트
B 5.0 디프로필렌 글리콜
0.7 마그네슘 술페이트
QS 보존제
62.9 탈염수
C QS 향료
SA 화합물
% 성분 (INCI)
A 6.0 PEG-7 수소화 피마자유
10.0 세테아릴 에틸헥사노에이트
5.0 이소프로필미리스테이트
7.0 미네랄 오일
0.5 시어 버터 (부티로스퍼멈 파르키)
0.5 알루미늄 스테아레이트
0.5 마그네슘 스테아레이트
0.2 비사볼롤
0.7 쿼터늄-18-헥토라이트
B 5.0 디프로필렌 글리콜
0.7 마그네슘 술페이트
QS 보존제
58.9 탈염수
C QS 향료
SA 화합물
제조: 상 A 및 B 를 개별적으로 약 80℃ 로 가열하였다. 상 B 를 상 A 에 첨가하고, 교반함으로써 균질화시켰다. 40℃ 로 냉각시키고 상 C 를 첨가하였다. 다시 균질화시키고, 실온으로 냉각시켰다.
일상 스킨 케어 O/W
% 성분 (INCI)
A 1.7 세테아레스-6, 스테아릴 알코올
0.7 세테아레스-25
2.0 디에틸아미노 히드록시벤조일 헥실 벤조에이트
2.0 PEG-14 디메티콘
3.6 세테아릴 알코올
6.0 에틸헥실 메톡시신나메이트
2.0 디부틸 아디페이트
B 5.0 글리세린
0.2 이나트륨 EDTA
1.0 판테놀
QS 보존제
67.8 탈염수
C 4.0 카프릴산/카프르산 트리글리세리드, 나트륨 아크릴레이트 공중합체
D 0.2 나트륨 아스코르빌 포스페이트
1.0 토코페릴 아세테이트
0.2 비사볼롤
1.0 카프릴산/카프르산 트리글리세리드, 나트륨 아스코르베이트, 토코페롤, 레티놀
SA 화합물
E QS 수산화나트륨
% 성분 (INCI)
A 1.7 세테아레스-6, 스테아릴 알코올
0.7 세테아레스-25
2.0 디에틸아미노 히드록시벤조일 헥실 벤조에이트
2.0 PEG-14 디메티콘
3.6 세테아릴 알코올
6.0 에틸헥실 메톡시신나메이트
2.0 디부틸 아디페이트
B 5.0 글리세린
0.2 이나트륨 EDTA
1.0 판테놀
QS 보존제
63.8 탈염수
C 4.0 카프릴산/카프르산 트리글리세리드, 나트륨 아크릴레이트 공중합체
D 0.2 나트륨 아스코르빌 포스페이트
1.0 토코페릴 아세테이트
0.2 비사볼롤
1.0 카프릴산/카프르산 트리글리세리드, 나트륨 아스코르베이트, 토코페롤, 레티놀
SA 화합물
E QS 수산화나트륨
제조: 상 A 및 B 를 개별적으로 약 80℃ 로 가열하였다. 상 B 를 상 A 에 첨가하고, 교반함으로써 균질화시켰다. 상 C 를 조합된 상 A 및 B 에 첨가하고, 다시 균질화시켰다. 약 40℃ 로 냉각시키고, 상 D 를 첨가하였다. 상 E 로 pH 를 약 6.5 로 조절하였다. 교반함으로써 균질화시키고, 실온으로 냉각시켰다.
보호 데이 스킨 크림 O/W
% 성분 (INCI)
A 1.7 세테아레스-6, 스테아릴 알코올
0.7 세테아레스-25
2.0 디에틸아미노 히드록시벤조일 헥실 벤조에이트
2.0 PEG-14 디메티콘
3.6 세테아릴 알코올
6.0 에틸헥실 메톡시신나메이트
2.0 디부틸 아디페이트
B 5.0 글리세린
0.2 이나트륨 EDTA
1.0 판테놀
QS 보존제
68.6 탈염수
C 4.0 카프릴산/카프르산 트리글리세리드, 나트륨 아크릴레이트 공중합체
D 1.0 나트륨 아스코르빌 포스페이트
1.0 토코페릴 아세테이트
0.2 비사볼롤
SA 화합물
E QS 수산화나트륨
% 성분 (INCI)
A 1.7 세테아레스-6, 스테아릴 알코올
0.7 세테아레스-25
2.0 디에틸아미노 히드록시벤조일 헥실 벤조에이트
2.0 PEG-14 디메티콘
3.6 세테아릴 알코올
6.0 에틸헥실 메톡시신나메이트
2.0 디부틸 아디페이트
B 5.0 글리세린
0.2 이나트륨 EDTA
1.0 판테놀
QS 보존제
64.6 탈염수
C 4.0 카프릴산/카프르산 트리글리세리드, 나트륨 아크릴레이트 공중합체
D 1.0 나트륨 아스코르빌 포스페이트
1.0 토코페릴 아세테이트
0.2 비사볼롤
화합물
E QS 수산화나트륨
제조: 상 A 및 B 를 개별적으로 약 80℃ 로 가열하였다. 상 B 를 상 A 에 첨가하고, 교반함으로써 균질화시켰다. 상 C 를 조합된 상 A 및 B 에 첨가하고, 다시 균질화시켰다. 약 40℃ 로 냉각시키고, 상 D 를 첨가하였다. 상 E 로 pH 를 약 6.5 로 조절하였다. 교반함으로써 균질화시키고, 실온으로 냉각시켰다.
얼굴 세정제 O/W
% 성분 (INCI)
A 10.0 세테아릴 에틸헥사노에이트
10.0 카프릴산/카프르산 트리글리세리드
1.5 시클로펜타실록산, 시클로헥사실록산
2.0 PEG-40 수소화 피마자유
B 3.5 카프릴산/카프르산 트리글리세리드, 나트륨 아크릴레이트 공중합체
C 1.0 토코페릴 아세테이트
0.2 비사볼롤
QS 보존제
QS 향료
D 3.0 폴리쿼터늄-44
0.5 코코트리모늄 메토술페이트
0.5 세테아레스-25
2.0 판테놀, 프로필렌 글리콜
4.0 프로필렌 글리콜
0.1 이나트륨 EDTA
SA 화합물
60.7 탈염수
% 성분 (INCI)
A 10.0 세테아릴 에틸헥사노에이트
10.0 카프릴산/카프르산 트리글리세리드
1.5 시클로펜타실록산, 시클로헥사실록산
2.0 PEG-40 수소화 피마자유
B 3.5 카프릴산/카프르산 트리글리세리드, 나트륨 아크릴레이트 공중합체
C 1.0 토코페릴 아세테이트
0.2 비사볼롤
QS 보존제
QS 향료
D 3.0 폴리쿼터늄-44
0.5 코코트리모늄 메토술페이트
0.5 세테아레스-25
2.0 판테놀, 프로필렌 글리콜
4.0 프로필렌 글리콜
0.1 이나트륨 EDTA
SA 화합물
56.7 탈염수
제조: 상 A 를 용해시키고, 상 B 를 상 A 에 첨가하고, 교반함으로써 균질화시켰다. 조합된 상 A 및 B 에 상 C 를 첨가하고, 다시 균질화시켰다. 상 D 를 조합된 상 A, B 및 C 에 첨가하고, 다시 균질화시켰다. 상 D 를 용해시키고, 상 A, B 및 C 에 첨가하고, 다시 균질화시켰다. 15 분 동안 교반시켰다.
일상 케어 바디 스프레이
% 성분 (INCI)
A 3.0 에틸헥실 메톡시신나메이트
2.0 디에틸아미노 히드록시벤조일 헥실 벤조에이트
1.0 폴리쿼터늄-44
3.0 프로필렌 글리콜
2.0 판테놀, 프로필렌 글리콜
1.0 시클로펜타실록산, 시클로헥사실록산
10.0 옥틸도데칸올
0.5 PVP
10.0 카프릴산/카프르산 트리글리세리드
3.0 C12-15 알킬 벤조에이트
3.0 글리세린
1.0 토코페릴 아세테이트
0.3 비사볼롤
SA 화합물
59.2 알코올
% 성분 (INCI)
A 3.0 에틸헥실 메톡시신나메이트
2.0 디에틸아미노 히드록시벤조일 헥실 벤조에이트
1.0 폴리쿼터늄-44
3.0 프로필렌 글리콜
2.0 판테놀, 프로필렌 글리콜
1.0 시클로펜타실록산, 시클로헥사실록산
10.0 옥틸도데칸올
0.5 PVP
10.0 카프릴산/카프르산 트리글리세리드
3.0 C12-15 알킬 벤조에이트
3.0 글리세린
1.0 토코페릴 아세테이트
0.3 비사볼롤
SA 화합물
55.2 알코올
제조: 상 A 의 모든 성분을 칭량하고, 교반함으로써 완전히 용해시켰다.
스킨 케어 겔
% 성분 (INCI)
A 3.6 PEG-40 수소화 피마자유
15.0 알코올
0.1 비사볼롤
0.5 토코페릴 아세테이트
QS 향료
B 3.0 판테놀
0.6 카보머
SA 화합물
75.4 탈염수
C 0.8 트리에탄올아민
% 성분 (INCI)
A 3.6 PEG-40 수소화 피마자유
15.0 알코올
0.1 비사볼롤
0.5 토코페릴 아세테이트
QS 향료
B 3.0 판테놀
0.6 카보머
SA 화합물
71.4 탈염수
C 0.8 트리에탄올아민
제조: 상 A 를 용해시켰다. 상 B 를 팽윤시키고, 상 C 로 중화시켰다. 상 A 를 상 B 및 C 에 첨가하고, 교반함으로써 균질화시켰다.
애프터 쉐이브 로션
% 성분 (INCI)
A 10.0 세테아릴 에틸헥사노에이트
5.0 토코페릴 아세테이트
1.0 비사볼롤
0.1 향료
0.3 아크릴레이트/C10-30 알킬 아크릴레이트 가교중합체
B 15.0 알코올
1.0 판테놀
3.0 글리세린
SA 화합물
1.0 트리에탄올아민
63.5 탈염수
% 성분 (INCI)
A 10.0 세테아릴 에틸헥사노에이트
5.0 토코페릴 아세테이트
1.0 비사볼롤
0.1 향료
0.3 아크릴레이트/C10-30 알킬 아크릴레이트 가교중합체
B 15.0 알코올
1.0 판테놀
3.0 글리세린
SA 화합물
0.1 트리에탄올아민
59.5 탈염수
제조: 상 A 를 용해시켰다. 상 B 를 용해시키고, 상 A 에 첨가하였다. 교반함으로써 균질화시켰다.
애프터 선 로션
% 성분 (INCI)
A 0.4 아크릴레이트/C10-30 알킬 아크릴레이트 가교중합체
15.0 세테아릴 에틸헥사노에이트
0.2 비사볼롤
1.0 토코페릴 아세테이트
QS 향료
B 1.0 판테놀
15.0 알코올
3.0 글리세린
SA 화합물
63.2 물
C 0.2 트리에탄올아민
% 성분 (INCI)
A 0.4 아크릴레이트/C10-30 알킬 아크릴레이트 가교중합체
15.0 세테아릴 에틸헥사노에이트
0.2 비사볼롤
1.0 토코페릴 아세테이트
QS 향료
B 1.0 판테놀
15.0 알코올
3.0 글리세린
SA 화합물
59.2 탈염수
C 0.2 트리에탄올아민
제조: 상 A 를 용해시켰다. 상 B 를 용해시키고, 상 A 에 첨가하였다. 교반함으로써 균질화시켰다. 상 C 를 첨가함으로써 상 A 및 B 를 중화시키고, 다시 균질화시켰다.
선스크린 로션
% 성분 (INCI)
A 4.5 에틸헥실 메톡시신나메이트
2.0 디에틸아미노 히드록시벤조일 헥실 벤조에이트
3.0 옥토크릴렌
2.5 디-C12-13 알킬 말레이트
0.5 토코페릴 아세테이트
4.0 폴리글리세릴-3 메틸 글루코스 디스테아레이트
B 3.5 세테아릴 이소노나노에이트
1.0 VP/에이코센 공중합체
5.0 이소헥사데칸
2.5 디-C12-13 알킬 말레이트
3.0 티타늄 이산화물, 트리메톡시카프릴릴실란
C 5.0 글리세린
1.0 나트륨 세테아릴 술페이트
0.5 잔탄 검
59.7 탈염수
D SA 화합물
1.0 페녹시에탄올, 메틸파라벤, 에틸파라벤, 부틸파라벤, 프로필파라벤, 이소부틸파라벤
0.3 비사볼롤
% 성분 (INCI)
A 4.5 에틸헥실 메톡시신나메이트
2.0 디에틸아미노 히드록시벤조일 헥실 벤조에이트
3.0 옥토크릴렌
2.5 디-C12-13 알킬 말레이트
0.5 토코페릴 아세테이트
4.0 폴리글리세릴-3 메틸 글루코스 디스테아레이트
B 3.5 세테아릴 이소노나노에이트
1.0 VP/에이코센 공중합체
5.0 이소헥사데칸
2.5 디-C12-13 알킬 말레이트
3.0 티타늄 이산화물, 트리메톡시카프릴릴실란
C 5.0 글리세린
1.0 나트륨 세테아릴 술페이트
0.5 잔탄 검
55.7 탈염수
D SA 화합물
1.0 페녹시에탄올, 메틸파라벤, 에틸파라벤, 부틸파라벤, 프로필파라벤, 이소부틸파라벤
0.3 비사볼롤
제조: 상 A 및 B 를 개별적으로 약 80℃ 로 가열하였다. 상 B 를 상 A 에 첨가하고, 교반함으로써 균질화시켰다. 상 C 를 80℃ 로 가열하고 조합된 상 A 및 B 에 첨가하고, 다시 균질화시켰다. 약 40℃ 로 냉각시키고, 상 D 를 첨가하였다. 다시 균질화시켰다.
선스크린 로션 O/W
% 성분 (INCI)
A 2.0 세테아레스-6, 스테아릴 알코올
2.0 세테아레스-25
3.0 트리베헤닌
2.0 세테아릴 알코올
2.0 세테아릴 에틸헥사노에이트
5.0 에틸헥실 메톡시신나메이트
1.0 에틸헥실 트리아존
1.0 VP/에이코센 공중합체
7.0 이소프로필미리스테이트
B 5.0 아연 산화물, 트리에톡시카프릴릴실란
C 0.2 잔탄 검
0.5 히드록시에틸 아크릴레이트/나트륨 아크릴로일디메틸 타우레이트 공중합체, 스쿠알렌, 폴리소르베이트 60
0.2 이나트륨 EDTA
5.0 프로필렌 글리콜
0.5 판테놀
60.9 탈염수
D SA 화합물
0.5 페녹시에탄올, 메틸파라벤, 부틸파라벤, 에틸파라벤, 프로필파라벤, 이소프로필파라벤
1.0 토코페릴 아세테이트
0.2 비사볼롤
% 성분 (INCI)
A 2.0 세테아레스-6, 스테아릴 알코올
2.0 세테아레스-25
3.0 트리베헤닌
2.0 세테아릴 알코올
2.0 세테아릴 에틸헥사노에이트
5.0 에틸헥실 메톡시신나메이트
1.0 에틸헥실 트리아존
1.0 VP/에이코센 공중합체
7.0 이소프로필 미리스테이트
B 5.0 아연 산화물, 트리에톡시카프릴릴실란
C 0.2 잔탄 검
0.5 히드록시에틸 아크릴레이트/나트륨 아크릴로일디메틸 타우레이트 공중합체, 스쿠알렌, 폴리소르베이트 60
0.2 이나트륨 EDTA
5.0 프로필렌 글리콜
0.5 판테놀
56.9 탈염수
D SA 화합물
0.5 페녹시에탄올, 메틸파라벤, 부틸파라벤, 에틸파라벤, 프로필파라벤, 이소프로필파라벤
1.0 토코페릴 아세테이트
0.2 비사볼롤
제조: 상 A 및 B 를 개별적으로 약 80℃ 로 가열하였다. 상 B 를 상 A 에 첨가하고, 교반함으로써 균질화하였다. 상 C 를 80℃ 로 가열하고, 조합된 상 A 및 B 에 첨가하고, 다시 균질화시켰다. 약 40℃ 로 냉각시키고, 상 D 를 첨가하였다. 다시 균질화시켰다.
선스크린 로션 O/W
% 성분 (INCI)
A 3.5 세테아레스-6, 스테아릴 알코올
1.5 세테아레스-25
7.5 에틸헥실 메톡시신나메이트
2.0 디에틸아미노 히드록시벤조일 헥실 벤조에이트
2.0 시클로펜타실록산, 시클로헥사실록산
0.5 밀랍
3.0 세테아릴 알코올
10.0 카프릴산/카프르산 트리글리세리드
B 5.0 티타늄 이산화물, 실리카, 메티콘, 알루미나
C 3.0 글리세린
0.2 이나트륨 EDTA
0.3 잔탄 검
1.0 데실 글루코시드
2.0 판테놀, 프로필렌 글리콜
56.3 탈염수
D SA 화합물
1.0 토코페릴 아세테이트
0.2 비사볼롤
QS 향료
QS 보존제
% 성분 (INCI)
A 3.5 세테아레스-6, 스테아릴 알코올
1.5 세테아레스-25
7.5 에틸헥실 메톡시신나메이트
2.0 디에틸아미노 히드록시벤조일 헥실 벤조에이트
2.0 시클로펜타실록산, 시클로헥사실록산
0.5 밀랍
3.0 세테아릴 알코올
10.0 카프릴산/카프르산 트리글리세리드
B 5.0 티타늄 이산화물, 실리카, 메티콘, 알루미나
C 3.0 글리세린
0.2 이나트륨 EDTA
0.3 잔탄 검
1.0 데실 글루코시드
2.0 판테놀, 프로필렌 글리콜
52.3 탈염수
D SA 화합물
1.0 토코페릴 아세테이트
0.2 비사볼롤
QS 향료
QS 보존제
제조: 상 A 및 B 를 개별적으로 약 80℃ 로 가열하였다. 상 B 를 상 A 에 첨가하고, 교반함으로써 균질화시켰다. 상 C 를 80℃ 로 가열하고, 조합된 상 A 및 B 에 첨가하고, 다시 균질화시켰다. 약 40℃ 로 냉각시키고, 상 D 를 첨가하였다. 다시 균질화시켰다.
풋밤
% 성분 (INCI)
A 2.0 세테아레스-6, 스테아릴 알코올
2.0 세테아레스-25
5.0 세테아릴 에틸헥사노에이트
4.0 세틸 알코올
4.0 글리세릴 스테아레이트
5.0 미네랄 오일
0.2 멘톨
0.5 캄포르
B 69.3 탈염수
QS 보존제
C 1.0 비사볼롤
1.0 토코페릴 아세테이트
D SA 화합물
5.0 위치 헤이즐 추출물
% 성분 (INCI)
A 2.0 세테아레스-6, 스테아릴 알코올
2.0 세테아레스-25
5.0 세테아릴 에틸헥사노에이트
4.0 세틸 알코올
4.0 글리세릴 스테아레이트
5.0 미네랄 오일
0.2 멘톨
0.5 캄포르
B 65.3 탈염수
QS 보존제
C 1.0 비사볼롤
1.0 토코페릴 아세테이트
D SA 화합물
5.0 위치 헤이즐 추출물
제조: 상 A 및 B 를 개별적으로 약 80℃ 로 가열하였다. 상 B 를 상 A 에 첨가하고, 교반함으로써 균질화시켰다. 약 40℃ 로 냉각시키고, 상 C 및 D 를 첨가하였다. 교반함으로써 균질화시키고, 실온으로 냉각시켰다.
W/O
% 성분 (INCI)
A 6.0 PEG-7 수소화 피마자유
8.0 세테아릴 에틸헥사노에이트
5.0 이소프로필 미리스테이트
15.0 미네랄 오일
0.3 마그네슘 스테아레이트
0.3 알루미늄 스테아레이트
2.0 PEG-45/도데실 글리콜 공중합체
B 5.0 글리세린
0.7 마그네슘 술페이트
55.6 탈염수
C 1.0 화합물
0.5 토코페릴 아세테이트
0.6 비사볼롤
% 성분 (INCI)
A 6.0 PEG-7 수소화 피마자유
8.0 세테아릴 에틸헥사노에이트
5.0 이소프로필 미리스테이트
15.0 미네랄 오일
0.3 마그네슘 스테아레이트
0.3 알루미늄 스테아레이트
2.0 PEG-45/도데실 글리콜 공중합체
B 5.0 글리세린
0.7 마그네슘 술페이트
51.6 탈염수
C 5.0 화합물
0.5 토코페릴 아세테이트
제조: 상 A 및 B 를 개별적으로 약 85℃ 로 가열하였다. 상 B 를 상 A 에 첨가하고, 교반함으로써 균질화하였다. 약 40℃ 로 냉각시키고, 상 C 를 첨가하였다. 교반함으로써 균질화시키고, 실온으로 냉각시켰다.
액체 메이크업-유형 O/W
% 성분 (INCI)
A 2.0 세테아레스-6, 스테아릴 알코올
2.0 세테아레스-25
6.0 글리세릴 스테아레이트
1.0 세틸 알코올
8.0 미네랄 오일
7.0 세테아릴 에틸헥사노에이트
0.2 디메티콘
B 3.0 프로필렌 글리콜
1.0 판테놀
QS 보존제
61.9 탈염수
C 0.1 비사볼롤
SA 화합물
QS 향료
D 5.7 C. I. 77 891, 티타늄 이산화물
1.1 철 산화물
% 성분 (INCI)
A 2.0 세테아레스-6, 스테아릴 알코올
2.0 세테아레스-25
6.0 글리세릴 스테아레이트
1.0 세틸 알코올
8.0 미네랄 오일
7.0 세테아릴 에틸헥사노에이트
0.2 디메티콘
B 3.0 프로필렌 글리콜
1.0 판테놀
QS 보존제
57.9 탈염수
C 0.1 비사볼롤
SA 화합물
QS 향료
D 5.7 C. I. 77 891, 티타늄 이산화물
1.1 철 산화물
제조: 상 A 및 B 를 개별적으로 약 80℃ 로 가열하였다. 상 B 를 상 A 에 첨가하고, 교반함으로써 균질화시켰다. 40℃ 로 냉각시키고, 상 C 및 D 를 첨가하였다. 다시 균질화시키고, 실온으로 냉각시켰다.
파운데이션
Figure pct00270
안료 (AS 5811, 5131, 5146, 5126 및 50230; Color Techniques) 및 프로필파라벤을 Silcare 31 M50 SV (Clariant) 에 분산시키고, 습윤될 때까지 교반시켰다. 혼합물을 이후 입자 크기가 10 ㎛ 미만일 때까지 타이트 세팅의 3 롤 분쇄기에 통과시켰다. 이후, D9011 엘라스토머 배합물 (Dow Corning) 및 DC 245 유체를 완료 용기에서 조합하고, 균질화될 때까지 교반시켰다. 색 연마제를 저속 균질화기 교반하면서 첨가하였다. 물을 별도의 용기에서 칭량하고, 화합물을 프로펠러 교반하면서 첨가하였다. 용해될 때까지 교반하였다. 메틸파라벤 및 벤조산을 부틸렌 글리콜에 첨가하였다. 혼합물을 약하게 가온하고, 용해될 때까지 교반시켰다. 혼합물을 30℃ 로 냉각시키고, 화합물-함유 용액에 첨가하였다. 빠르게 교반하면서 수상을 유상에 천천히 첨가하였다. 첨가가 완료되었을 때, 제제를 5 분 동안 균질화시켰다. 이러한 제제는 피부에 적용하기 위한 메이크업 파운데이션으로서 유용하다.
마스카라 제형
대조군 제제 및 2% 를 함유하는 마스카라 모두의 성분은 하기와 같다:
Figure pct00271
마스카라 제형을 제조하기 위해, 왁스 상 8 을 조합하고, 프로펠러 혼합하면서 80-90℃ 로 가열하였다. 10% 화합물 용액을 물에 화합물을 프로펠러 혼합하면서 첨가함으로써 제조하였다. 상 1 물을 칭량한 스테인레스 스틸 비커에 첨가하였다 (약 50 g 의 과량을 첨가하여 손실을 보충함). 상 2 메틸 파라벤을 부틸렌 글리콜에 첨가하고, 스팀 배스의 상부에서 용해될 때까지 가온하면서 교반시킨 후, 저속 호모믹서 교반하면서 물에 첨가하였다. 이후, 교반을 유지하면서, 상 4 흑색 철 산화물을 첨가하였다. 이후, Natrosol 을 교반을 유지하면서 살포하였다. 10% KOH 를 첨가하고, 비커를 가능한 한 단단히 덮은채 85℃ 로의 가열을 시작하였다. Natrosol 이 용해되면, 온도 및 교반을 유지하면서 10% 시트르산을 적가하였다. 이후, Arlacel 165 를 천천히 첨가하고, 5 분 이상 동안 혼합하여, 확실히 용해시켰다. 85-90℃ 에서, 왁스상을 호모믹싱하면서 수상에 천천히 첨가하였다. 온도 및 교반을 10 분 동안 유지하였다. 배치를 스팀 배쓰로부터 제거하고, 가끔 비커 벽을 수작업으로 긁으면서 호모믹싱하며 냉각시켰다. 55℃ 에서, 배치를 칭량하여 물 손실을 확인하였다. 혼합을 다시 시작하고, 필요한 경우 물을 다시 첨가하였다. 45℃ 에서, 상 9 및 10 을 첨가하였다. 냉수를 사용하여 30℃ 로 냉각을 계속하였다. 이 시점에서, 비커 벽을 계속하여 수작업으로 긁는 것이 필요하다.
이러한 제제에서, 소량의 KOH (상 5 중) 를 사용하여 pH 를 상승시켜, 습윤을 지연시키고 응집을 방지하기 위해 글리옥살로 코팅된 Natrosol 을 분산시켰다. 상 7 에 시트르산을 천천히 첨가하여, 철 산화물의 등전점 미만인 ~5.5 로 pH 를 조절하였다. 상 7 및 8 에서, Arlacel 165 를 유상과 수상으로 분리하였는데, 이는 에멀젼화가 두 상에서 계면활성제와 달성하기 더 쉽기 때문이다. 상 9 에 탈이온수를 화합물 대신 대조군 배치에 첨가하였다. 화합물 용액이 에멀젼이 가공되는 동안 제조되므로, 이는 완전히 새로운 것이다. 이러한 제조는 마스카라로 사용하기에 적합한 제형을 제공한다.
실시예 18
헤어 성장 저해
이 실시예에서는, 헤어 성장 저해에 대한 본 발명의 조성물의 능력을 측정하는 실험이 기재된다. 특히, 이러한 실험은 면도에 의한 제모 또는 제모 크림의 사용 또는 왁싱 이후의 헤어 성장을 감소시키는데 대한 본 발명의 조성물의 능력을 평가하기 위해 수행된다.
모 BBPI 의 키모트립신 루프가 VEGF-결합 펩티드로 대체되는 개질된 변이체 BBPI 를 함유하며 헤어 성장을 저해하기 위한 로션을 하기 제형 (A) 에 따라 제조하였다:
Figure pct00272
조성물은 SEQ ID NOS: 601, 602, 627-631, 643, 491, 632-636 으로부터 선택되는 VEGF-BBPI 중 하나 이상의 유형을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 SEQ ID NOS:601, 602, 627-631, 643, 491, 632-636 로부터 선택되는 VEGF-BBPI 중 2 개 이상, 3 개 이상, 4 개 이상 또는 5 개 이상의 상이한 유형을 포함한다.
VEGF-BBPI 를 포함하는 제형은 하기와 같이 제조된다:
1) 60℃, 바람직하게는 70℃ 이상의 온도에서 지방 알코올 에멀젼화제 및 오일 겔화제를 함께 용융상으로 배합하고,
2) 용융상을 수상으로 에멀젼화시키는데, 이때 에멀젼화 이전의 수상의 온도는 50℃, 바람직하게는 60℃, 더 바람직하게는 70℃ 이상이며, 이에 따라 에멀젼이 형성되고,
3) 에멀젼을 35℃ 이하의 온도로 냉각시키고,
4) 에멀젼에 향료, 보존제, 시트르산 용액의 완충 용액을 분산시키고,
5) 동일한 방식으로 VEGF-BBPI 의 용액을 첨가하고, 약 5 분에 걸쳐 완충 용액으로 완료시키고,
6) 혼합물을 추가로 10 분 동안 교반시킴.
대조군 제형 (B) 를 제형 A 의 제조에 대해 기재된 방법에 따르지만, VEGF-BBPI 는 배제하고 제조하였다.
수염 실험
이 실험에서, 피츠패트릭의 피부 구분 II 를 갖는 남성 대상 군 (예를 들어 5) 을 시험하였다. 각 개인은 실험 시작에 앞서 국부 얼굴 처리제를 사용하지 않도록 요구되었다. 제 1 일에, 수염 성장을 시각적으로 평가하고, 촬영하였다. 이러한 평가 및 사진에 따라, 시험될 조성물(들) 및 비히클 대조군을 원하는 농도(들) 로 적용하였다. 제 2 일부터, 각 개인은 면도 직후 조성물(들) 을 적용하였다. 실험 기간 동안 다른 면도 전 또는 면도 후 처리제를 사용하지 않았다. 대부분의 경우, 실험을 30 내지 45 일의 기간 동안 지속하였다. 수염 성장을 시각적으로 평가하고, 실험 동안 매 3 일 마다 촬영하였다. 헤어의 수 뿐 아니라 모간 길이 및 폭을, 컴퓨터 영상 분석을 사용하여 측정하였다. 바람직한 구현예에서, 시험 화합물(들) 의 적용으로 인하여 헤어의 수, 헤어 두께 및/또는 헤어 길이의 감소가 있었다.
다리 털 실험
이 실험에서는, 피츠패트릭의 피부 구분 II 를 갖는 여성 대상 군 (예를 들어 5) 을 시험하였다. 각 개인은 실험 시작에 앞서 국부 다리 처리제를 사용하지 않도록 요구되었다. 제 1 일에, 각 개인의 양쪽 다리의 범위를 표시하고, 헤어 성장을 시각적으로 평가하고 촬영하였다. 이러한 평가 및 사진에 따라, 시험될 조성물(들) 을 원하는 농도(들) 로 적용하였다. 이러한 평가 및 사진에 따라, 시험될 조성물(들) (즉, 원하는 농도의 VEGF-BBP 를 포함하는 시험 화합물), 및 비히클 대조군을 원하는 농도(들) 로 적용하였다. 일부 방법에서, 각 개인에게 2 개의 튜브가 공급되었는데, 그 중 하나는 VEGF-BBPI 를 포함하고, 다른 하나는 비히클 대조군을 포함하였다. 이러한 튜브를 "좌" 및 "우" 로 표시하였다. 실험 동안 매일, 개인은 2 개의 튜브의 조성물을 각각의 다리에 적용하였다. 적용 7 일 후, 각 개인을 시각적으로 평가하고 사진을 찍었다. 양쪽 다리를 이후 면도하거나 제모제에 노출시키고, 시험 개인은 이전과 같이 조성물 적용을 지속하였다. 헤어 성장을, 이후 매 2 일 마다 다리의 적절한 범위를 시각적으로, 그리고 촬영에 의해 평가하였다. 10 일 후, 다리를 다시 면도하고, 시험 개인은 이전과 같이 조성물 적용을 지속하였다. 일부 방법에서, 실험을 3 사이클동안 수행하였고, 헤어 성장을 시각적으로 평가하고, 사진을 찍었다. 실험을 이후 추가로 8 일 동안 지속하였다. 바람직한 구현예에서, 표시된 범위(들) 내에 시험 화합물(들) 의 적용으로 인하여 헤어의 수, 헤어 두께 및/또는 헤어 길이의 감소가 있었다.
2 일부터, 개인은 면도 직후 조성물(들) 을 적용하였다. 실험 기간 동안 다른 면도 전 또는 면도 후 처리제는 사용하지 않았다. 대부분의 경우, 실험을 30 내지 45 일의 기간 동안 지속하였다. 수염 성장을 시각적으로 평가하고, 실험 동안 매 3 일 마다 시각적으로 평가하고 촬영하였다. 헤어의 수, 및 모간 길이 및 폭을 컴퓨터 영상 분석을 사용하여 측정하였다. 바람직한 구현예에서, 시험 화합물(들) 의 적용으로 인하여 헤어의 수, 헤어 두께 및/또는 헤어 길이의 감소가 있었다.
SEQUENCE LISTING <110> Danisco US Inc., Genencor Division Amin, Neelam S. Collier, Katherine D. Estabrook, Melodie Estell, David A. Fox, Bryan P. Power, Scott D. Schmidt, Brian F. Vogtentanz, Gudrun <120> PERSONAL CARE COMPOSITIONS COMPRISING OF MODIFIED VARIANT BOWMAN BIRK PROTEASE INHIBITORS <130> 31151WO <140> PCT/US08/79951 <141> 2008-10-15 <160> 686 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1900 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence encoding fusion peptide of SEQ ID NO:2 <400> 1 aattctccat tttcttctgc tatcaaaata acagactcgt gattttccaa acgagctttc 60 aaaaaagcct ctgccccttg caaatcggat gcctgtctat aaaattcccg atattggtta 120 aacagcggcg caatggcggc cgcatctgat gtctttgctt ggcgaatgtt catcttattt 180 cttcctccct ctcaataatt ttttcattct atcccttttc tgtaaagttt atttttcaga 240 atacttttat catcatgctt tgaaaaaata tcacgataat atccattgtt ctcacggaag 300 cacacgcagg tcatttgaac gaattttttc gacaggaatt tgccgggact caggagcatt 360 taacctaaaa aagcatgaca tttcagcata atgaacattt actcatgtct attttcgttc 420 ttttctgtat gaaaatagtt atttcgagtc tctacggaaa tagcgagaga tgatatacct 480 aaatagagat aaaatcatct caaaaaaatg ggtctactaa aatattattc catctattac 540 aataaattca gtaaagagtg agaagcaaaa aattgtggat cagcttgttg tttgcgttaa 600 cgttaatctt tacgatggcg ttcagcaaca tgtctgcgca ggctgatgat tattcagttg 660 tagaggaaca tgggcaacta agtattagta acggtgaatt agtcaatgaa cgaggcgaac 720 aagttcagtt aaaagggatg agttcccatg gtttgcaatg gtacggtcaa tttgtaaact 780 atgaaagcat gaaatggcta agagatgatt ggggaataac tgtattccga gcagcaatgt 840 atacctcttc aggaggatat attgacgatc catcagtaaa ggaaaaagta aaagagactg 900 ttgaggctgc gatagacctt ggcatatatg tgatcattga ttggcatatc ctttcagaca 960 atgacccgaa tatatataaa gaagaagcga aggatttctt tgatgaaatg tcagagttgt 1020 atggagacta tccgaatgtg atatacgaaa ttgcaaatga accgaatggt agtgatgtta 1080 cgtgggacaa tcaaataaaa ccgtatgcag aagaagtgat tccggttatt cgtgacaatg 1140 accctaataa cattgttatt gtaggtacag gtacatggag tcaggatgtc catcatgcag 1200 ccgataatca gcttgcagat cctaacgtca tgtatgcatt tcatttttat gcaggaacac 1260 atggacaaaa tttacgagac caagtagatt atgcattaga tcaaggagca gcgatatttg 1320 ttagtgaatg ggggacaagt gcagctacag gtgatggtgg tgtgttttta gatgaagcac 1380 aagtgtggat tgactttatg gatgaaagaa atttaagctg ggccaactgg tctctaacgc 1440 ataaggatga gtcatctgca gcgttaatgc caggtgcaaa tccaactggt ggttggacag 1500 aggctgaact atctccatct ggtacatttg tgagggaaaa aataagagaa tcagcatcta 1560 ttccgccaag cgatccaaca ccgccatctg atccaggaga accggatcca gacgatgaga 1620 gctctaaacc ctgttgcgat caatgcgcat gtacgaaatc aaatcctcca cagtgtcggt 1680 gttccgatat gcgtctgaat agctgtcata gtgcatgcaa aagctgtatc tgcgccctga 1740 gttatccagc tcaatgtttt tgcgtcgaca tcacggactt ctgctatgag ccatgtaaac 1800 caagcgagga cgataaagag aaccatcatc accatcacca ttaaaagtta acagaggacg 1860 gatttcctga aggaaatccg tttttttatt tttaagcttg 1900 <210> 2 <211> 428 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic fusion peptide <400> 2 Met Arg Ser Lys Lys Leu Trp Ile Ser Leu Leu Phe Ala Leu Thr Leu 1 5 10 15 Ile Phe Thr Met Ala Phe Ser Asn Met Ser Ala Gln Ala Asp Asp Tyr 20 25 30 Ser Val Val Glu Glu His Gly Gln Leu Ser Ile Ser Asn Gly Glu Leu 35 40 45 Val Asn Glu Arg Gly Glu Gln Val Gln Leu Lys Gly Met Ser Ser His 50 55 60 Gly Leu Gln Trp Tyr Gly Gln Phe Val 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Thr Ile Ala 195 200 205 Phe Pro Tyr Leu Asn Ala Gln Pro Val Tyr Arg Arg Ala Asn Val Pro 210 215 220 Val Phe Trp Gly Glu Arg Arg Tyr Val Ser His Phe Glu Pro Val Gly 225 230 235 240 Ser Gly Gly Ala Tyr Arg Gly Pro Ser Thr Ala Trp Phe Arg Phe Gln 245 250 255 Leu Met Asp Asp Gln Asp Ala Arg Ala Thr Phe Tyr Gly Ala Gln Cys 260 265 270 Ser Leu Cys Thr Ser Leu Leu Trp Ser Val Glu Arg Arg Gly Leu Asp 275 280 285 Asn Asn Asp Pro Ile Pro Asp 290 295 <210> 8 <211> 1495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence encoding fusion peptide of SEQ ID NO:7 <400> 8 gaattctcca ttttcttctg ctatcaaaat aacagactcg tgattttcca aacgagcttt 60 caaaaaagcc tctgcccctt gcaaatcgga tgcctgtcta taaaattccc gatattggtt 120 aaacagcggc gcaatggcgg ccgcatctga tgtctttgct tggcgaatgt tcatcttatt 180 tcttcctccc tctcaataat tttttcattc tatccctttt ctgtaaagtt tatttttcag 240 aatactttta tcatcatgct ttgaaaaaat atcacgataa tatccattgt tctcacggaa 300 gcacacgcag gtcatttgaa cgaatttttt cgacaggaat ttgccgggac tcaggagcat 360 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acgcaaaaac aaggagtacg atcgattttt gtgcaagcac agcttttgca tgcactatg 59 <210> 89 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 89 tcaatgcgca tgtcacctgc agacaactga aacatgccgg tgttccgata tgcgtc 56 <210> 90 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 90 cggaacaccg gcatgtttca gttgtctgca ggtgacatgc gcattgatcg caacagg 57 <210> 91 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 91 caaaagctgt gcttgccacc tgcagacaac tgaaacatgt ttttgcgtcg acatcacgg 59 <210> 92 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 92 acgcaaaaac atgtttcagt tgtctgcagg tggcaagcac agcttttgca tgcactatg 59 <210> 93 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 93 tcaatgcgca tgtggctact tcatcccatc gatttgccgg tgttccgata tgcgtc 56 <210> 94 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide 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synthetic oligonucleotide <400> 170 gatccattcc ttgaagacga tgagagct 28 <210> 171 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 171 ctcatcgtct tcaaggaatg 20 <210> 172 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 172 cccataccgg agccagacga tgagagctc 29 <210> 173 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 173 catcgtctgg ctccggtatg ggatcattgt tg 32 <210> 174 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic linker peptide <400> 174 Asp Asn Asn Asp Pro Ile Pro Glu Pro Asp Asp Glu Ser Phe Asn Met 1 5 10 15 Pro Ile Pro Glu Pro 20 <210> 175 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 175 gatccaggcg ctgcacacta caaatcagac catcagcaca gcaatgacga tgagagct 58 <210> 176 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 176 ctcatcgtca ttgctgtgct gatggtctga tttgtagtgt 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oligonucleotide <400> 188 tcgacatcac ggacttctgc tatgaaccat gtaaaccaag cgagtaaa 48 <210> 189 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 189 agcttttact cgcttggttt acatggttca tagcagaagt ccgtgatg 48 <210> 190 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 190 gctggtaaa 9 <210> 191 <211> 3 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 191 Ala Gly Lys 1 <210> 192 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 192 gcgcgcaggc agctggtaaa gatgattatt cagttgtaga 40 <210> 193 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 193 aataatcatc tttaccagct gcctgcgcgc tcatgttgct 40 <210> 194 <211> 5625 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic expression vector <400> 194 gaattctcca ttttcttctg ctatcaaaat aacagactcg tgattttcca aacgagcttt 60 caaaaaagcc tctgcccctt gcaaatcgga tgcctgtcta taaaattccc gatattggtt 120 aaacagcggc gcaatggcgg ccgcatctga tgtctttgct tggcgaatgt tcatcttatt 180 tcttcctccc tctcaataat tttttcattc tatccctttt ctgtaaagtt tatttttcag 240 aatactttta tcatcatgct ttgaaaaaat atcacgataa tatccattgt tctcacggaa 300 gcacacgcag gtcatttgaa cgaatttttt cgacaggaat ttgccgggac tcaggagcat 360 ttaacctaaa aaagcatgac atttcagcat aatgaacatt tactcatgtc tattttcgtt 420 cttttctgta tgaaaatagt tatttcgagt ctctacggaa atagcgagag atgatatacc 480 taaatagaga taaaatcatc tcaaaaaaat gggtctacta aaatattatt ccatctatta 540 caataaattc acagaatagt cttttaagta agtctactct gaattttttt aaaaggagag 600 ggtaaagagt gagaagcaaa aaattgtgga tcagcttgtt gtttgcgtta acgttaatct 660 ttacgatggc gttcagcaac atgagcgcgc aggcagctgg taaagatgat tattcagttg 720 tagaggaaca tgggcaacta agtattagta acggtgaatt agtcaatgaa cgaggcgaac 780 aagttcagtt aaaagggatg agttcccatg gtttgcaatg gtacggtcaa tttgtaaact 840 atgaaagcat gaaatggcta agagatgatt ggggaataac tgtattccga gcagcaatgt 900 atacctcttc aggaggatat attgacgatc catcagtaaa ggaaaaagta aaagagactg 960 ttgaggctgc gatagacctt ggcatatatg tgatcattga ttggcatatc ctttcagaca 1020 atgacccgaa tatatataaa gaagaagcga aggatttctt tgatgaaatg tcagagttgt 1080 atggagacta tccgaatgtg atatacgaaa ttgcaaatga accgaatggt agtgatgtta 1140 cgtgggacaa tcaaataaaa ccgtatgcag aagaagtgat tccggttatt cgtgacaatg 1200 accctaataa cattgttatt gtaggtacag gtacatggag tcaggatgtc catcatgcag 1260 ccgataatca gcttgcagat cctaacgtca tgtatgcatt tcatttttat gcaggaacac 1320 atggacaaaa tttacgagac caagtagatt atgcattaga tcaaggagca gcgatatttg 1380 ttagtgaatg ggggacaagt gcagctacag gtgatggtgg tgtgttttta gatgaagcac 1440 aagtgtggat tgactttatg gatgaaagaa atttaagctg ggccaactgg tctctaacgc 1500 ataaggatga gtcatctgca gcgttaatgc caggtgcaaa tccaactggt ggttggacag 1560 aggctgaact atctccatct ggtacatttg tgagggaaaa aataagagaa tcagcatctg 1620 acaacaatga tcccataccg gatccagacg atgagagctc taaaccctgt tgcgatcaat 1680 gcgcatgtac gaaatcaaat cctccacagt gtcggtgttc cgatatgcgt ctgaattcct 1740 gtcatagtgc ctgcaaaagc tgcgcatgtt ataacctgta cgggtggacc tgtttttgcg 1800 tcgacatcac ggacttctgc tatgaaccat gtaaaccaag cgagtaaaag cttaactcga 1860 ggttaacaga ggacggattt cctgaaggaa atccgttttt ttatttttaa ttaagagctt 1920 ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca 1980 caacatacga gccggaaata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca 2040 cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc 2100 attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt 2160 cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact 2220 caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag 2280 caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata 2340 ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc 2400 cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg 2460 ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc 2520 tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg 2580 gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc 2640 ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga 2700 ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg 2760 gctacactag aagaacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa 2820 aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg 2880 tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt 2940 ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat 3000 tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct 3060 aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta 3120 tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa 3180 ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac 3240 gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa 3300 gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag 3360 taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg 3420 tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag 3480 ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg 3540 tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc 3600 ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat 3660 tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata 3720 ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa 3780 aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca 3840 actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc 3900 aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc 3960 tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg 4020 aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac 4080 ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga 4140 ggccctttcg tctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc 4200 cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg 4260 cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggct ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg 4320 tactgagagt gcaccataga tctggagctg taatataaaa accttcttca actaacgggg 4380 caggttagtg acattagaaa accgactgta aaaagtacag tcggcattat ctcatattat 4440 aaaagccagt cattaggcct atctgacaat tcctgaatag agttcataaa caatcctgca 4500 tgataaccat cacaaacaga atgatgtacc tgtaaagata gcggtaaata tattgaatta 4560 cctttattaa tgaattttcc tgctgtaata atgggtagaa ggtaattact attattattg 4620 atatttaagt taaacccagt aaatgaagtc catggaataa tagaaagaga aaaagcattt 4680 tcaggtatag gtgttttggg aaacaatttc cccgaaccat tatatttctc tacatcagaa 4740 aggtataaat cataaaactc tttgaagtca ttctttacag gagtccaaat accagagaat 4800 gttttagata caccatcaaa aattgtataa agtggctcta acttatccca ataacctaac 4860 tctccgtcgc tattgtaacc agttctaaaa gctgtatttg agtttatcac ccttgtcact 4920 aagaaaataa atgcagggta aaatttatat ccttcttgtt ttatgtttcg gtataaaaca 4980 ctaatatcaa tttctgtggt tatactaaaa gtcgtttgtt ggttcaaata atgattaaat 5040 atctcttttc tcttccaatt gtctaaatca attttattaa agttcatttg atatgcctcc 5100 taaattttta tctaaagtga atttaggagg cttacttgtc tgctttcttc attagaatca 5160 atcctttttt aaaagtcaat attactgtaa cataaatata tattttaaaa atatcccact 5220 ttatccaatt ttcgtttgtt gaactaatgg gtgctttagt tgaagaataa aagaccacat 5280 taaaaaatgt ggtcttttgt gtttttttaa aggatttgag cgtagcgaaa aatccttttc 5340 tttcttatct tgataataag ggtaactatt gccggatcgt cctcaggagt aggcgacatc 5400 gctaaataat gatctatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc 5460 atcaggcgcc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc 5520 tcttcgctat tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta 5580 acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagt 5625 <210> 195 <211> 383 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic BBPI fusion protein <400> 195 Ala Gly Lys Asp Asp Tyr Ser Val Val Glu Glu His Gly Gln Leu Ser 1 5 10 15 Ile Ser Asn Gly Glu Leu Val Asn Glu Arg Gly Glu Gln Val Gln Leu 20 25 30 Lys Gly Met Ser Ser His Gly Leu Gln Trp Tyr Gly Gln Phe Val Asn 35 40 45 Tyr Glu Ser Met Lys Trp Leu Arg Asp Asp Trp Gly Ile Thr Val Phe 50 55 60 Arg Ala Ala Met Tyr Thr Ser Ser Gly Gly Tyr Ile Asp Asp Pro Ser 65 70 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Glu Ala Glu Leu Ser Pro Ser Gly Thr Phe Val Arg Glu Lys Ile Arg 290 295 300 Glu Ser Ala Ser Asp Asn Asn Asp Pro Ile Pro Asp Pro Asp Asp Glu 305 310 315 320 Ser Ser Lys Pro Cys Cys Asp Gln Cys Ala Cys Thr Lys Ser Asn Pro 325 330 335 Pro Gln Cys Arg Cys Ser Asp Met Arg Leu Asn Ser Cys His Ser Ala 340 345 350 Cys Lys Ser Cys Ala Cys Tyr Asn Leu Tyr Gly Trp Thr Cys Phe Cys 355 360 365 Val Asp Ile Thr Asp Phe Cys Tyr Glu Pro Cys Lys Pro Ser Glu 370 375 380 <210> 196 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 196 gatcccatac cggatccann sgatgagagc tctaaacc 38 <210> 197 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 197 ccataccgga tccagacnns gagagctcta aaccctg 37 <210> 198 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 198 cataccggat ccagacgatn nsagctctaa accctgttg 39 <210> 199 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 199 cggatccaga cgatgagnns tctaaaccct gttgcgatc 39 <210> 200 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 200 gatccagacg atgagagcnn saaaccctgt tgcgatcaat g 41 <210> 201 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 201 cagacgatga gagctctnns ccctgttgcg atcaatg 37 <210> 202 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 202 gacgatgaga gctctaaann stgttgcgat caatgcgc 38 <210> 203 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 203 gatgagagct ctaaacccnn stgcgatcaa tgcgcatg 38 <210> 204 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 204 gagagctcta aaccctgtnn sgatcaatgc gcatgtac 38 <210> 205 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 205 gctctaaacc ctgttgcnns caatgcgcat gtacgaaatc 40 <210> 206 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 206 ctaaaccctg ttgcgatnns tgcgcatgta cgaaatc 37 <210> 207 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> n is a, c, g, or t <400> 207 ctaaaccctg ttgcgatcaa nnsgcatgta cgaaatcaaa tc 42 <210> 208 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 208 cctgttgcga tcaatgcnns tgtacgaaat caaatcc 37 <210> 209 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 209 gttgcgatca atgcgcanns acgaaatcaa atcctcc 37 <210> 210 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 210 gcgatcaatg cgcatgtnns aaatcaaatc ctccacag 38 <210> 211 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 211 gatcaatgcg catgtacgnn stcaaatcct ccacagtg 38 <210> 212 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 212 caatgcgcat gtacgaaann saatcctcca cagtgtcg 38 <210> 213 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 213 gcgcatgtac gaaatcanns cctccacagt gtcggtg 37 <210> 214 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 214 catgtacgaa atcaaatnns ccacagtgtc ggtgttc 37 <210> 215 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 215 gtacgaaatc aaatcctnns cagtgtcggt gttccgatat 40 <210> 216 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 216 cgaaatcaaa tcctccanns tgtcggtgtt ccgatatg 38 <210> 217 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 217 gaaatcaaat cctccacagn nscggtgttc cgatatgcg 39 <210> 218 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 218 caaatcctcc acagtgtnns tgttccgata tgcgtctg 38 <210> 219 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> n is a, c, g, or t <400> 219 caaatcctcc acagtgtcgg nnstccgata tgcgtctgaa ttc 43 <210> 220 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 220 ctccacagtg tcggtgtnns gatatgcgtc tgaattc 37 <210> 221 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 221 cacagtgtcg gtgttccnns atgcgtctga attcctg 37 <210> 222 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 222 cagtgtcggt gttccgatnn scgtctgaat tcctgtcata g 41 <210> 223 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 223 gtcggtgttc cgatatgnns ctgaattcct gtcatag 37 <210> 224 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 224 ggtgttccga tatgcgtnns aattcctgtc atagtgc 37 <210> 225 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 225 gttccgatat gcgtctgnns tcctgtcata gtgcctg 37 <210> 226 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 226 ccgatatgcg tctgaatnns tgtcatagtg cctgcaaaag 40 <210> 227 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 227 gatatgcgtc tgaattccnn scatagtgcc tgcaaaag 38 <210> 228 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> n is a, c, g, or t <400> 228 atatgcgtct gaattcctgt nnsagtgcct gcaaaagctg 40 <210> 229 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 229 gtctgaattc ctgtcatnns gcctgcaaaa gctgcgc 37 <210> 230 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 230 ctgaattcct gtcatagtnn stgcaaaagc tgcgcatg 38 <210> 231 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 231 gaattcctgt catagtgccn nsaaaagctg cgcatgttat aa 42 <210> 232 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 232 cctgtcatag tgcctgcnns agctgcgcat gttataac 38 <210> 233 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 233 gtcatagtgc ctgcaaanns tgcgcatgtt ataacctg 38 <210> 234 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 234 catagtgcct gcaaaagcnn sgcatgttat aacctgtac 39 <210> 235 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 235 gtgcctgcaa aagctgcnns tgttataacc tgtacgg 37 <210> 236 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 236 cctgcaaaag ctgcgcanns tataacctgt acgggtg 37 <210> 237 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 237 gcaaaagctg cgcatgtnns aacctgtacg ggtggac 37 <210> 238 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 238 caaaagctgc gcatgttatn nsctgtacgg gtggacctg 39 <210> 239 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 239 gctgcgcatg ttataacnns tacgggtgga cctgtttttg 40 <210> 240 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 240 gcgcatgtta taacctgnns gggtggacct gtttttg 37 <210> 241 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 241 catgttataa cctgtacnns tggacctgtt tttgcgtc 38 <210> 242 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 242 gttataacct gtacgggnns acctgttttt gcgtcgac 38 <210> 243 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> n is a, c, g, or t <400> 243 gttataacct gtacgggtgg nnstgttttt gcgtcgacat c 41 <210> 244 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> n is a, c, g, or t <400> 244 ataacctgta cgggtggacc nnsttttgcg tcgacatcac 40 <210> 245 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 245 ctgtacgggt ggacctgtnn stgcgtcgac atcacggac 39 <210> 246 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 246 gtacgggtgg acctgttttn nsgtcgacat cacggacttc 40 <210> 247 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 247 ggtggacctg tttttgcnns gacatcacgg acttctg 37 <210> 248 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 248 ggacctgttt ttgcgtcnns atcacggact tctgctatg 39 <210> 249 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 249 cctgtttttg cgtcgacnns acggacttct gctatgaac 39 <210> 250 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 250 gtttttgcgt cgacatcnns gacttctgct atgaacc 37 <210> 251 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> n is a, c, g, or t <400> 251 gtttttgcgt cgacatcacg nnsttctgct atgaaccatg 40 <210> 252 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 252 gcgtcgacat cacggacnns tgctatgaac catgtaaac 39 <210> 253 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 253 gtcgacatca cggacttcnn statgaacca tgtaaacc 38 <210> 254 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 254 gacatcacgg acttctgcnn sgaaccatgt aaaccaag 38 <210> 255 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 255 catcacggac ttctgctatn nsccatgtaa accaagcgag 40 <210> 256 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 256 cggacttctg ctatgaanns tgtaaaccaa gcgagtaaaa 40 <210> 257 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 257 gacttctgct atgaaccann saaaccaagc gagtaaaag 39 <210> 258 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 258 cttctgctat gaaccatgtn nsccaagcga gtaaaagctt aa 42 <210> 259 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 259 gctatgaacc atgtaaanns agcgagtaaa agcttaac 38 <210> 260 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 260 ctatgaacca tgtaaaccan nsgagtaaaa gcttaactc 39 <210> 261 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 261 gaaccatgta aaccaagcnn staaaagctt aactcgag 38 <210> 262 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 262 ggtttagagc tctcatcsnn tggatccggt atgggatc 38 <210> 263 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 263 cagggtttag agctctcsnn gtctggatcc ggtatgg 37 <210> 264 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 264 caacagggtt tagagctsnn atcgtctgga tccggtatg 39 <210> 265 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> n is a, c, g, or t <400> 265 gatcgcaaca gggtttagas nnctcatcgt ctggatccg 39 <210> 266 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> n is a, c, g, or t <400> 266 cattgatcgc aacagggttt snngctctca tcgtctggat c 41 <210> 267 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 267 cattgatcgc aacagggsnn agagctctca tcgtctg 37 <210> 268 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 268 gcgcattgat cgcaacasnn tttagagctc tcatcgtc 38 <210> 269 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 269 catgcgcatt gatcgcasnn gggtttagag ctctcatc 38 <210> 270 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 270 gtacatgcgc attgatcsnn acagggttta gagctctc 38 <210> 271 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> n is a, c, g, or t <400> 271 gatttcgtac atgcgcattg snngcaacag ggtttagagc 40 <210> 272 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 272 gatttcgtac atgcgcasnn atcgcaacag ggtttag 37 <210> 273 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> n is a, c, g, or t <400> 273 gatttgattt cgtacatgcs nnttgatcgc aacagggttt ag 42 <210> 274 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 274 ggatttgatt tcgtacasnn gcattgatcg caacagg 37 <210> 275 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 275 ggaggatttg atttcgtsnn tgcgcattga tcgcaac 37 <210> 276 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 276 ctgtggagga tttgatttsn nacatgcgca ttgatcgc 38 <210> 277 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 277 cactgtggag gatttgasnn cgtacatgcg cattgatc 38 <210> 278 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 278 cgacactgtg gaggattsnn tttcgtacat gcgcattg 38 <210> 279 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 279 caccgacact gtggaggsnn tgatttcgta catgcgc 37 <210> 280 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 280 gaacaccgac actgtggsnn atttgatttc gtacatg 37 <210> 281 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> n is a, c, g, or t <400> 281 atatcggaac accgacactg snnaggattt gatttcgtac 40 <210> 282 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 282 catatcggaa caccgacasn ntggaggatt tgatttcg 38 <210> 283 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 283 cgcatatcgg aacaccgsnn ctgtggagga tttgatttc 39 <210> 284 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 284 cagacgcata tcggaacasn nacactgtgg aggatttg 38 <210> 285 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> n is a, c, g, or t <400> 285 gaattcagac gcatatcgga snnccgacac tgtggaggat ttg 43 <210> 286 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 286 gaattcagac gcatatcsnn acaccgacac tgtggag 37 <210> 287 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 287 caggaattca gacgcatsnn ggaacaccga cactgtg 37 <210> 288 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> n is a, c, g, or t <400> 288 ctatgacagg aattcagacg snnatcggaa caccgacact g 41 <210> 289 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 289 ctatgacagg aattcagsnn catatcggaa caccgac 37 <210> 290 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 290 gcactatgac aggaattsnn acgcatatcg gaacacc 37 <210> 291 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 291 caggcactat gacaggasnn cagacgcata tcggaac 37 <210> 292 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> n is a, c, g, or t <400> 292 cttttgcagg cactatgaca snnattcaga cgcatatcgg 40 <210> 293 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 293 cttttgcagg cactatgsnn ggaattcaga cgcatatc 38 <210> 294 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 294 cagcttttgc aggcactsnn acaggaattc agacgcatat 40 <210> 295 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 295 gcgcagcttt tgcaggcsnn atgacaggaa ttcagac 37 <210> 296 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 296 catgcgcagc ttttgcasnn actatgacag gaattcag 38 <210> 297 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> n is a, c, g, or t <400> 297 ttataacatg cgcagctttt snnggcacta tgacaggaat tc 42 <210> 298 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 298 gttataacat gcgcagctsn ngcaggcact atgacagg 38 <210> 299 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 299 caggttataa catgcgcasn ntttgcaggc actatgac 38 <210> 300 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 300 gtacaggtta taacatgcsn ngcttttgca ggcactatg 39 <210> 301 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 301 ccgtacaggt tataacasnn gcagcttttg caggcac 37 <210> 302 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 302 cacccgtaca ggttatasnn tgcgcagctt ttgcagg 37 <210> 303 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 303 gtccacccgt acaggttsnn acatgcgcag cttttgc 37 <210> 304 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 304 caggtccacc cgtacagsnn ataacatgcg cagcttttg 39 <210> 305 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> n is a, c, g, or t <400> 305 caaaaacagg tccacccgta snngttataa catgcgcagc 40 <210> 306 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 306 caaaaacagg tccacccsnn caggttataa catgcgc 37 <210> 307 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 307 gacgcaaaaa caggtccasn ngtacaggtt ataacatg 38 <210> 308 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 308 gtcgacgcaa aaacaggtsn ncccgtacag gttataac 38 <210> 309 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 309 gatgtcgacg caaaaacasn nccacccgta caggttataa c 41 <210> 310 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 310 gtgatgtcga cgcaaaasnn ggtccacccg tacaggttat 40 <210> 311 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 311 gtccgtgatg tcgacgcasn nacaggtcca cccgtacag 39 <210> 312 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 312 gaagtccgtg atgtcgacsn naaaacaggt ccacccgtac 40 <210> 313 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 313 cagaagtccg tgatgtcsnn gcaaaaacag gtccacc 37 <210> 314 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> n is a, c, g, or t <400> 314 catagcagaa gtccgtgats nngacgcaaa aacaggtcc 39 <210> 315 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> n is a, c, g, or t <400> 315 gttcatagca gaagtccgts nngtcgacgc aaaaacagg 39 <210> 316 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 316 ggttcatagc agaagtcsnn gatgtcgacg caaaaac 37 <210> 317 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 317 catggttcat agcagaasnn cgtgatgtcg acgcaaaaac 40 <210> 318 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> n is a, c, g, or t <400> 318 gtttacatgg ttcatagcas nngtccgtga tgtcgacgc 39 <210> 319 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 319 ggtttacatg gttcatasnn gaagtccgtg atgtcgac 38 <210> 320 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 320 cttggtttac atggttcsnn gcagaagtcc gtgatgtc 38 <210> 321 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 321 ctcgcttggt ttacatggsn natagcagaa gtccgtgatg 40 <210> 322 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> n is a, c, g, or t <400> 322 ttttactcgc ttggtttaca snnttcatag cagaagtccg 40 <210> 323 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 323 cttttactcg cttggtttsn ntggttcata gcagaagtc 39 <210> 324 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> n is a, c, g, or t <400> 324 ttaagctttt actcgcttgg snnacatggt tcatagcaga ag 42 <210> 325 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 325 gttaagcttt tactcgctsn ntttacatgg ttcatagc 38 <210> 326 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 326 gagttaagct tttactcsnn tggtttacat ggttcatag 39 <210> 327 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 327 ctcgagttaa gcttttasnn gcttggttta catggttc 38 <210> 328 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 328 ctatgcggca tcagagcaga ttgtac 26 <210> 329 <211> 214 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic gene sequence <400> 329 ggatccagac gatgagagct ctaaaccttg ttgcgatcaa tgcgcttgta caaaatcaaa 60 ccctccacaa tgtcgttgtt ctgatatgcg tttaaatagc tgtcattctg catgcaaatc 120 atgtgcttgc tataaccttt acggttggac atgtttctgc gtcgacatca ctgacttctg 180 ctatgaacca tgtaaacctt ctgaataaaa gctt 214 <210> 330 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (12)..(13) <223> n is a, c, g, or t <400> 330 gtacaaaatc annscctcca caatgtcgtt gttctgatat gcgtttaaat agctgtcatt 60 ctgcatg 67 <210> 331 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (51)..(52) <223> n is a, c, g, or t <400> 331 cagaatgaca gctatttaaa cgcatatcag aacaacgaca ttgtggaggs nntgatttt 59 <210> 332 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (49)..(50) <223> n is a, c, g, or t <400> 332 tcgacgcaga aacatgtcca accgtaaagg ttatagcaag cacatgasnn gcatg 55 <210> 333 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> n is a, c, g, or t <400> 333 cnnstcatgt gcttgctata acctttacgg ttggacatgt ttctgcg 47 <210> 334 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (27)..(28) <223> n is a, c, g, or t <400> 334 tcgacatcac tgacttctgc tatgaannst gtaaaccttc tgaataaa 48 <210> 335 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 335 ttcatagcag aagtcagtga tg 22 <210> 336 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 336 agcttttatt cagaaggttt aca 23 <210> 337 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 337 gtacagtagc attgatcgca acaaggttta gagct 35 <210> 338 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n is a, c, g, or t <400> 338 gtacaaaatc aaaccctcca caatgtgant gttctgatat gcgtttaaat agctgtcatt 60 ctgcatg 67 <210> 339 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n is a, c, g, or t <400> 339 cagaatgaca gctatttaaa cgcatatcag aacantcaca ttgtggaggg tttgatttt 59 <210> 340 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 340 gtacaaaatc aaaccctcca caatgtcgtt gtatggatat gcgtttaaat agctgtcatt 60 ctgcatg 67 <210> 341 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 341 cagaatgaca gctatttaaa cgcatatcca tacaacgaca ttgtggaggg tttgatttt 59 <210> 342 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 342 gtacaaaatc aaaccctcca caatgtcgtt gttgggatat gcgtttaaat agctgtcatt 60 ctgcatg 67 <210> 343 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 343 cagaatgaca gctatttaaa cgcatatccc aacaacgaca ttgtggaggg tttgatttt 59 <210> 344 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 344 gtacaaaatc aaaccctcca caatgtcgtt gtgbagatat gcgtttaaat agctgtcatt 60 ctgcatg 67 <210> 345 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 345 cagaatgaca gctatttaaa cgcatatctv cacaacgaca ttgtggaggg tttgatttt 59 <210> 346 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 346 gtacaaaatc aaaccctcca caatgtcgtt gtmawgatat gcgtttaaat agctgtcatt 60 ctgcatg 67 <210> 347 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 347 cagaatgaca gctatttaaa cgcatatcwt kacaacgaca ttgtggaggg tttgatttt 59 <210> 348 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 348 gtacaaaatc aaaccctcca caatgtcgtt gttctgattg gcgtttaaat agctgtcatt 60 ctgcatg 67 <210> 349 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 349 cagaatgaca gctatttaaa cgccaatcag aacaacgaca ttgtggaggg tttgatttt 59 <210> 350 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 350 gtacaaaatc aaaccctcca caatgtcgtt gttctgatca ccgtttaaat agctgtcatt 60 ctgcatg 67 <210> 351 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n is a, c, g, or t <400> 351 tctgatgntc gtttaaatag ctgtcattct gcatg 35 <210> 352 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> n is a, c, g, or t <400> 352 gtacaaaatc aaaccctcca caatgtcgtt gttctgatgn tcgtttaaat agctgtcatt 60 ctgcatg 67 <210> 353 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is a, c, g, or t <400> 353 cagaatgaca gctatttaaa cgancatcag aacaacgaca ttgtggaggg tttgatttt 59 <210> 354 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 354 gtacaaaatc aaaccctcca caatgtcgtt gttctgatwt tcgtttaaat agctgtcatt 60 ctgcatg 67 <210> 355 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 355 cagaatgaca gctatttaaa cgaawatcag aacaacgaca ttgtggaggg tttgatttt 59 <210> 356 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 356 gtacaaaatc aaaccctcca caatgtcgtt gttctgatat gcgtattaat agctgtcatt 60 ctgcatg 67 <210> 357 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 357 cagaatgaca gctattaata cgcatatcag aacaacgaca ttgtggaggg tttgatttt 59 <210> 358 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (47)..(47) <223> n is a, c, g, or t <400> 358 gtacaaaatc aaaccctcca caatgtcgtt gttctgatat gcgtganaat agctgtcatt 60 ctgcatg 67 <210> 359 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is a, c, g, or t <400> 359 cagaatgaca gctattntca cgcatatcag aacaacgaca ttgtggaggg tttgatttt 59 <210> 360 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 360 gtacaaaatc aaaccctcca caatgtcgtt gttctgatat gcgtttaaat atgtgtcatt 60 ctgcatg 67 <210> 361 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 361 cagaatgaca catatttaaa cgcatatcag aacaacgaca ttgtggaggg tttgatttt 59 <210> 362 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 362 gtacaaaatc aaaccctcca caatgtcgtt gttctgatat gcgtttaaat kawtgtcatt 60 ctgcatg 67 <210> 363 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 363 cagaatgaca wtmatttaaa cgcatatcag aacaacgaca ttgtggaggg tttgatttt 59 <210> 364 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (53)..(53) <223> n is a, c, g, or t <400> 364 gtacaaaatc aaaccctcca caatgtcgtt gttctgatat gcgtttaaat cantgtcatt 60 ctgcatg 67 <210> 365 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <400> 365 cagaatgaca ntgatttaaa cgcatatcag aacaacgaca ttgtggaggg tttgatttt 59 <210> 366 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 366 gtacaaaatc aaaccctcca caatgtcgtt gttctgatat gcgtttaaat agctgtcata 60 tcgcatg 67 <210> 367 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 367 cgatatgaca gctatttaaa cgcatatcag aacaacgaca ttgtggaggg tttgatttt 59 <210> 368 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 368 gtacaaaatc aaaccctcca caatgtcgtt gttctgatat gcgtttaaat agctgtcatt 60 gggcatg 67 <210> 369 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 369 cccaatgaca gctatttaaa cgcatatcag aacaacgaca ttgtggaggg tttgatttt 59 <210> 370 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 370 gtacaaaatc aaaccctcca caatgtcgtt gttctgatat gcgtttaaat agctgtcatc 60 ragcatg 67 <210> 371 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 371 ctygatgaca gctatttaaa cgcatatcag aacaacgaca ttgtggaggg tttgatttt 59 <210> 372 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (62)..(62) <223> n is a, c, g, or t <400> 372 gtacaaaatc aaaccctcca caatgtcgtt gttctgatat gcgtttaaat agctgtcatg 60 angcatg 67 <210> 373 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n is a, c, g, or t <400> 373 cntcatgaca gctatttaaa cgcatatcag aacaacgaca ttgtggaggg tttgatttt 59 <210> 374 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 374 tcgacgcaga aacatgtcca accgtaaagg ttatagcaaw cacatgattt gcatg 55 <210> 375 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 375 caaatcatgt gwttgctata acctttacgg ttggacatgt ttctgcg 47 <210> 376 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 376 tcgacgcaga aacatgtcca accgtaaagg ttatagcaak gacatgattt gcatg 55 <210> 377 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 377 caaatcatgt cmttgctata acctttacgg ttggacatgt ttctgcg 47 <210> 378 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 378 tcgacgcaga aacatgtcca accgtaaagg ttatagcamy aacatgattt gcatg 55 <210> 379 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 379 caaatcatgt trktgctata acctttacgg ttggacatgt ttctgcg 47 <210> 380 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 380 tcgacgcaat cacatgtcca accgtaaagg ttatagcaag cacatgattt gcatg 55 <210> 381 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 381 caaatcatgt gcttgctata acctttacgg ttggacatgt gattgcg 47 <210> 382 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 382 tcgacgcatk gacatgtcca accgtaaagg ttatagcaag cacatgattt gcatg 55 <210> 383 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 383 caaatcatgt gcttgctata acctttacgg ttggacatgt cmatgcg 47 <210> 384 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 384 tcgacgcakc tacatgtcca accgtaaagg ttatagcaag cacatgattt gcatg 55 <210> 385 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 385 caaatcatgt gcttgctata acctttacgg ttggacatgt agmtgcg 47 <210> 386 <211> 95 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 386 caaatcatgt gcttgctata acctttacgg ttggacatgt ttctgcgatg acatcactga 60 cttctgctat gaaccatgta aaccttctga ataaa 95 <210> 387 <211> 103 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 387 agcttttatt cagaaggttt acatggttca tagcagaagt cagtgatgtc atcgcagaaa 60 catgtccaac cgtaaaggtt atagcaagca catgatttgc atg 103 <210> 388 <211> 11 <212> PRT <213> Glycine max <400> 388 Cys Ile Cys Ala Leu Ser Tyr Pro Ala Gln Cys 1 5 10 <210> 389 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide insert <400> 389 Asp Asp Glu Pro Ser Lys Pro Cys Cys Asp Pro Asp Pro 1 5 10 <210> 390 <211> 79 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic BBI sequence <400> 390 Asp Asp Glu Pro Ser Lys Pro Cys Cys Asp Pro Asp Pro Asp Asp Glu 1 5 10 15 Ser Ser Lys Pro Cys Cys Asp Gln Cys Ala Cys Thr Lys Ser Asn Pro 20 25 30 Pro Gln Cys Arg Cys Ser Asp Met Arg Leu Asn Ser Cys His Ser Ala 35 40 45 Cys Lys Ser Cys Ala Cys Tyr Asn Leu Tyr Gly Trp Thr Cys Phe Cys 50 55 60 Val Asp Ile Thr Asp Phe Cys Tyr Glu Pro Cys Lys Pro Ser Glu 65 70 75 <210> 391 <211> 88 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic fusion BBI sequence <400> 391 Asp Asn Asn Asp Pro Ile Pro Asp Pro Asp Asp Glu Pro Ser Lys Pro 1 5 10 15 Cys Cys Asp Pro Asp Pro Asp Asp Glu Ser Ser Lys Pro Cys Cys Asp 20 25 30 Gln Cys Ala Cys Thr Lys Ser Asn Pro Pro Gln Cys Arg Cys Ser Asp 35 40 45 Met Arg Leu Asn Ser Cys His Ser Ala Cys Lys Ser Cys Ala Cys Tyr 50 55 60 Asn Leu Tyr Gly Trp Thr Cys Phe Cys Val Asp Ile Thr Asp Phe Cys 65 70 75 80 Tyr Glu Pro Cys Lys Pro Ser Glu 85 <210> 392 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 392 gatccagatg acgaaccgag caaaccttgc tgtgatccag accctgacga tgagagct 58 <210> 393 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 393 ctcatcgtca gggtctggat cacagcaagg tttgctcggt tcgtcatctg 50 <210> 394 <211> 253 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic gene <400> 394 ggatccagat gacgaaccga gcaaaccttg ctgtgatcca gaccctgacg atgagagctc 60 taaaccctgt tgcgatcaat gcatttgtac gaaatcaaat cctccacagt gtcggtgttc 120 cgatatgcgt ccgaattcct gtcatagtgc ctgcaaaagc tgcaagtgtt ataacctgta 180 cgggtggacc tgtacatgcg ccgacatcac ggacttctgc tatgaaccat gtaaaccaag 240 cgagtaaaag ctt 253 <210> 395 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 395 ctgttgcgat caatgcattt gtacgaaatc 30 <210> 396 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 396 ctgtacgggt ggacctgtac atgcgycgac atcacggact tc 42 <210> 397 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 397 gacctgtttt tgcgycgaca tcacggac 28 <210> 398 <211> 214 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic gene encoding BBPI variant <400> 398 ggatccagac gatgagagct ctaaaccctg ttgcgatcaa tgcgcatgta cgaaatcaaa 60 tcctccacag tgtcggtgtt ccgatatgcg tctgaattcc tgtcatagtg cctgcaaaag 120 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650 Ser Ser Lys Pro Cys Cys Asp Gln Cys Ala Cys Thr Lys Ser Asn 1 5 10 15 <210> 651 <211> 15 <212> PRT <213> Glycine max <400> 651 Pro Cys Cys Asp Gln Cys Ala Cys Thr Lys Ser Asn Pro Pro Gln 1 5 10 15 <210> 652 <211> 15 <212> PRT <213> Glycine max <400> 652 Asp Gln Cys Ala Cys Thr Lys Ser Asn Pro Pro Gln Cys Arg Cys 1 5 10 15 <210> 653 <211> 15 <212> PRT <213> Glycine max <400> 653 Ala Cys Thr Lys Ser Asn Pro Pro Gln Cys Arg Cys Ser Asp Met 1 5 10 15 <210> 654 <211> 15 <212> PRT <213> Glycine max <400> 654 Lys Ser Asn Pro Pro Gln Cys Arg Cys Ser Asp Met Arg Leu Asn 1 5 10 15 <210> 655 <211> 15 <212> PRT <213> Glycine max <400> 655 Pro Pro Gln Cys Arg Cys Ser Asp Met Arg Leu Asn Ser Cys His 1 5 10 15 <210> 656 <211> 15 <212> PRT <213> Glycine max <400> 656 Cys Arg Cys Ser Asp Met Arg Leu Asn Ser Cys His Ser Ala Cys 1 5 10 15 <210> 657 <211> 15 <212> PRT <213> Glycine max <400> 657 Ser Asp Met Arg Leu Asn Ser Cys His Ser Ala Cys Lys Ser Cys 1 5 10 15 <210> 658 <211> 15 <212> PRT <213> Glycine max <400> 658 Arg Leu Asn Ser Cys His Ser Ala Cys Lys Ser Cys Ile Cys Ala 1 5 10 15 <210> 659 <211> 15 <212> PRT <213> Glycine max <400> 659 Ser Cys His Ser Ala Cys Lys Ser Cys Ile Cys Ala Leu Ser Tyr 1 5 10 15 <210> 660 <211> 15 <212> PRT <213> Glycine max <400> 660 Ser Ala Cys Lys Ser Cys Ile Cys Ala Leu Ser Tyr Pro Ala Gln 1 5 10 15 <210> 661 <211> 15 <212> PRT <213> Glycine max <400> 661 Lys Ser Cys Ile Cys Ala Leu Ser Tyr Pro Ala Gln Cys Phe Cys 1 5 10 15 <210> 662 <211> 15 <212> PRT <213> Glycine max <400> 662 Ile Cys Ala Leu Ser Tyr Pro Ala Gln Cys Phe Cys Val Asp Ile 1 5 10 15 <210> 663 <211> 15 <212> PRT <213> Glycine max <400> 663 Leu Ser Tyr Pro Ala Gln Cys Phe Cys Val Asp Ile Thr Asp Phe 1 5 10 15 <210> 664 <211> 15 <212> PRT <213> Glycine max <400> 664 Pro Ala Gln Cys Phe Cys Val Asp Ile Thr Asp Phe Cys Tyr Glu 1 5 10 15 <210> 665 <211> 15 <212> PRT <213> Glycine max <400> 665 Cys Phe Cys Val Asp Ile Thr Asp Phe Cys Tyr Glu Pro Cys Lys 1 5 10 15 <210> 666 <211> 15 <212> PRT <213> Glycine max <400> 666 Val Asp Ile Thr Asp Phe Cys Tyr Glu Pro Cys Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 <210> 667 <211> 15 <212> PRT <213> Glycine max <400> 667 Thr Asp Phe Cys Tyr Glu Pro Cys Lys Pro Ser Glu Asp Asp Lys 1 5 10 15 <210> 668 <211> 15 <212> PRT <213> Glycine max <400> 668 Phe Cys Tyr Glu Pro Cys Lys Pro Ser Glu Asp Asp Lys Glu Asn 1 5 10 15 <210> 669 <211> 305 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 669 Asp Asp Tyr Ser Val Val Glu Glu His Gly Gln Leu Ser Ile Ser Asn 1 5 10 15 Gly Glu Leu Val Asn Glu Arg Gly Glu Gln Val Gln Leu Lys Gly Met 20 25 30 Ser Ser His Gly Leu Gln Trp Tyr Gly Gln Phe Val Asn Tyr Glu Ser 35 40 45 Met Lys Trp Leu Arg Asp Asp Trp Gly Ile Thr Val Phe Arg Ala Ala 50 55 60 Met Tyr Thr Ser Ser Gly Gly Tyr Ile Asp Asp Pro Ser Val Lys Glu 65 70 75 80 Lys Val Lys Glu Thr Val Glu Ala Ala Ile Asp Leu Gly Ile Tyr Val 85 90 95 Ile Ile Asp Trp His Ile Leu Ser Asp Asn Asp Pro Asn Ile Tyr Lys 100 105 110 Glu Glu Ala Lys Asp Phe Phe Asp Glu Met Ser Glu Leu Tyr Gly Asp 115 120 125 Tyr Pro Asn Val Ile Tyr Glu Ile Ala Asn Glu Pro Asn Gly Ser Asp 130 135 140 Val Thr Trp Asp Asn Gln Ile Lys Pro Tyr Ala Glu Glu Val Ile Pro 145 150 155 160 Val Ile Arg Asp Asn Asp Pro Asn Asn Ile Val Ile Val Gly Thr Gly 165 170 175 Thr Trp Ser Gln Asp Val His His Ala Ala Asp Asn Gln Leu Ala Asp 180 185 190 Pro Asn Val Met Tyr Ala Phe His Phe Tyr Ala Gly Thr His Gly Gln 195 200 205 Asn Leu Arg Asp Gln Val Asp Tyr Ala Leu Asp Gln Gly Ala Ala Ile 210 215 220 Phe Val Ser Glu Trp Gly Thr Ser Ala Ala Thr Gly Asp Gly Gly Val 225 230 235 240 Phe Leu Asp Glu Ala Gln Val Trp Ile Asp Phe Met Asp Glu Arg Asn 245 250 255 Leu Ser Trp Ala Asn Trp Ser Leu Thr His Lys Asp Glu Ser Ser Ala 260 265 270 Ala Leu Met Pro Gly Ala Asn Pro Thr Gly Gly Trp Thr Glu Ala Glu 275 280 285 Leu Ser Pro Ser Gly Thr Phe Val Arg Glu Lys Ile Arg Glu Ser Ala 290 295 300 Ser 305 <210> 670 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic FGF-binding peptide <400> 670 Arg Thr Gln Pro Tyr Pro Leu 1 5 <210> 671 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic FGF-binding peptide <400> 671 Thr Trp Ile Asp Ser Thr Pro 1 5 <210> 672 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic TGF-binding peptide <400> 672 Pro Glu Asn Ile Asn Val Leu Pro 1 5 <210> 673 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic TGF-binding peptide <400> 673 Lys His Asn Val Asp Trp Leu 1 5 <210> 674 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic TGF-binding peptide <400> 674 Trp Thr Gln His Ile His Asn Cys 1 5 <210> 675 <211> 7 <212> PRT <213> Glycine max <400> 675 Ala Leu Ser Tyr Pro Ala Gln 1 5 <210> 676 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic VEGF binding protein <400> 676 Tyr Asn Leu Tyr Gly Trp Thr 1 5 <210> 677 <211> 63 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic BBdb-AV sequence <400> 677 Pro Ser Glu Ser Ser Lys Pro Cys Cys Asp Gln Cys Ala Cys Thr Lys 1 5 10 15 Ser Ile Pro Pro Gln Cys Arg Cys Thr Asp Val Arg Leu Asn Ser Cys 20 25 30 His Ser Ala Cys Ser Ser Cys Ala Cys Tyr Asn Leu Tyr Gly Trp Thr 35 40 45 Cys Val Cys Val Asp Met Lys Asp Phe Cys Tyr Glu Pro Cys Lys 50 55 60 <210> 678 <211> 66 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic MM007-PT-BBIt-FGF-5 <400> 678 Asp Asp Glu Ser Ser Lys Pro Cys Cys Asp Gln Cys Ala Cys Thr Lys 1 5 10 15 Ser Asn Pro Pro Gln Cys Arg Cys Ser Asp Met Arg Leu Asn Ser Cys 20 25 30 His Ser Ala Cys Lys Ser Cys Ala Cys Arg Thr Gln Pro Tyr Pro Leu 35 40 45 Cys Phe Cys Val Asp Ile Thr Asp Phe Cys Tyr Glu Pro Cys Lys Pro 50 55 60 Ser Glu 65 <210> 679 <211> 66 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic FGFps2-PT-BBIt-FGF5 <400> 679 Asp Asp Glu Ser Ser Lys Pro Cys Cys Asp Gln Cys Ala Cys Thr Lys 1 5 10 15 Ser Asn Pro Pro Gln Cys Arg Cys Ser Asp Met Arg Leu Asn Ser Cys 20 25 30 His Ser Ala Cys Lys Ser Cys Ala Cys Thr Trp Ile Asp Ser Thr Pro 35 40 45 Cys Phe Cys Val Asp Ile Thr Asp Phe Cys Tyr Glu Pro Cys Lys Pro 50 55 60 Ser Glu 65 <210> 680 <211> 67 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic PEN3-PT-BBIt-TGFBI <400> 680 Asp Asp Glu Ser Ser Lys Pro Cys Cys Asp Gln Cys Ala Cys Thr Lys 1 5 10 15 Ser Asn Pro Pro Gln Cys Arg Cys Ser Asp Met Arg Leu Asn Ser Cys 20 25 30 His Ser Ala Cys Lys Ser Cys Ala Cys Pro Glu Asn Ile Asn Val Leu 35 40 45 Pro Cys Phe Cys Val Asp Ile Thr Asp Phe Cys Tyr Glu Pro Cys Lys 50 55 60 Pro Ser Glu 65 <210> 681 <211> 68 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic WTQ-PT-TGFBI <400> 681 Asp Asp Glu Ser Ser Lys Pro Cys Cys Asp Gln Cys Ala Cys Thr Lys 1 5 10 15 Ser Asn Pro Pro Gln Cys Arg Cys Ser Asp Met Arg Leu Asn Ser Cys 20 25 30 His Ser Ala Cys Lys Ser Cys Ala Cys Trp Thr Gln His Ile His Asn 35 40 45 Cys Phe Cys Phe Cys Val Asp Ile Thr Asp Phe Cys Tyr Glu Pro Cys 50 55 60 Lys Pro Ser Glu 65 <210> 682 <211> 66 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic MM0021W-PT-TGFBI <400> 682 Asp Asp Glu Ser Ser Lys Pro Cys Cys Asp Gln Cys Ala Cys Thr Lys 1 5 10 15 Ser Asn Pro Pro Gln Cys Arg Cys Ser Asp Met Arg Leu Asn Ser Cys 20 25 30 His Ser Ala Cys Lys Ser Cys Ala Cys Lys His Asn Val Asp Trp Leu 35 40 45 Cys Phe Cys Val Asp Ile Thr Asp Phe Cys Tyr Glu Pro Cys Lys Pro 50 55 60 Ser Glu 65 <210> 683 <211> 67 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic BBsb3-AV sequence <400> 683 Asp Asp Glu Tyr Ser Lys Pro Cys Cys Asp Leu Cys Met Cys Thr Arg 1 5 10 15 Ser Met Pro Pro Gln Cys Ser Cys Glu Asp Ile Arg Leu Asn Ser Cys 20 25 30 His Ser Asp Cys Lys Ser Cys Ala Cys Tyr Asn Leu Tyr Gly Trp Thr 35 40 45 Cys Arg Cys Leu Asp Thr Asn Asp Phe Cys Tyr Lys Pro Cys Lys Ser 50 55 60 Arg Asp Asp 65 <210> 684 <211> 63 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic BBtc-AV sequence <400> 684 Ser Ser Lys Trp Glu Ala Cys Cys Asp Arg Cys Ala Cys Thr Lys Ser 1 5 10 15 Ile Pro Pro Gln Cys His Cys Ala Asp Ile Arg Leu Asn Ser Cys His 20 25 30 Ser Ala Cys Glu Ser Cys Ala Cys Tyr Asn Leu Tyr Gly Trp Thr Cys 35 40 45 Arg Cys Phe Asp Ile Thr Asp Phe Cys Tyr Lys Pro Cys Ser Gly 50 55 60 <210> 685 <211> 10 <212> PRT <213> Glycine max <400> 685 Ile Cys Ala Leu Ser Tyr Pro Ala Gln Cys 1 5 10 <210> 686 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic VEGF binding peptide <400> 686 Lys Tyr Asp Leu Tyr Trp Trp 1 5

Claims (168)

  1. BBPI (바우만 버크 프로테아제 저해제) 스캐폴드의 제 2 프로테아제 저해 루프가 결합 펩티드이고, 개질 변이체 BBPI 가 SEQ ID NO:187 의 변이체 BBPI 의 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 및 65 와 동등한 위치에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서 치환된 아미노산을 추가로 포함하는, 단리된 개질 변이체 바우만 버크 프로테아제 저해제 (BBPI).
  2. 제 1 항에 있어서, BBPI 스캐폴드가 BBI (SEQ ID NO:13), BBIt (SEQ ID NO:185), BBI-AV (SEQ ID NO:186), BBIt-AV (SEQ ID NO:187), BBIt-VEGK (SEQ ID NO:640), BBIt-VEGT (SEQ ID NO:641), BBIt-VEGKD (SEQ ID NO:642), BBdb (SEQ ID NO:449), BBsb3 (SEQ ID NO:450), BBtc (SEQ ID NO:451), BBdb-AV (SEQ ID NO:452), BBsb3-AV (SEQ ID NO:453) 및 BBtc-AV (SEQ ID NO:454) 에서 선택되는 단리된 개질 변이체 BBPI.
  3. 제 1 항에 있어서, 결합 펩티드가 VEGF 결합 펩티드, FGF-5 결합 펩티드, TGF-β 결합 펩티드 및 TNF-α 결합 펩티드에서 선택되는 단리된 개질 변이체 BBPI.
  4. 제 1 항에 있어서, 결합 펩티드가 하기에서 선택되는 VEGF 결합 펩티드인 단리된 개질 변이체 BBPI:
    Figure pct00273
  5. 제 1 항에 있어서, 결합 펩티드가 하기에서 선택되는 FGF-5 결합 펩티드인, 단리된 개질 변이체 BBPI:
    Figure pct00274
  6. 제 1 항에 있어서, 결합 펩티드가 하기에서 선택되는 TGFβ 결합 펩티드인, 단리된 개질 변이체 BBPI:
    Figure pct00275
  7. 제 1 항에 있어서, 결합 펩티드가 하기에서 선택되는 TNFα 결합 펩티드인, 단리된 개질 변이체 BBPI:
    Figure pct00276
  8. 제 1 항에 있어서, 위치 1 에서의 치환된 아미노산이 A 및 C 에서 선택되는 단리된 개질 변이체 BBPI.
  9. 제 1 항에 있어서, 위치 4 에서의 하나 이상의 치환이 V 인 단리된 개질 변이체 BBPI.
  10. 제 1 항에 있어서, 위치 5 에서의 하나 이상의 치환이 P 및 A 에서 선택되는 단리된 개질 변이체 BBPI.
  11. 제 1 항에 있어서, 위치 11 에서의 하나 이상의 치환이 11G 인 단리된 개질 변이체 BBPI.
  12. 제 1 항에 있어서, 위치 13 에서의 하나 이상의 치환이 13Y, 13I, 13F, 13M, 13L, 13V, 13K 및 13R 에서 선택되는 단리된 개질 변이체 BBPI.
  13. 제 1 항에 있어서, 위치 18 에서의 하나 이상의 치환이 18I 및 18V 및 18L 에서 선택되는 단리된 개질 변이체 BBPI.
  14. 제 1 항에 있어서, 위치 25 에서의 하나 이상의 치환이 25K, 25N, 25W, 25I, 25A 및 25R 에서 선택되는 단리된 개질 변이체 BBPI.
  15. 제 1 항에 있어서, 위치 27 에서의 하나 이상의 치환이 27H, 27K, 27V, 27A 및 27Q 에서 선택되는 단리된 개질 변이체 BBPI.
  16. 제 1 항에 있어서, 위치 29 에서의 하나 이상의 치환이 29R, 29K 및 29P 에서 선택되는 단리된 개질 변이체 BBPI.
  17. 제 1 항에 있어서, 위치 31 에서의 하나 이상의 치환이 31Q, 31H, 31E, 31A, 31R, 31W, 31K 및 31T 에서 선택되는 단리된 개질 변이체 BBPI.
  18. 제 1 항에 있어서, 위치 38 에서의 하나 이상의 치환이 38N, 38K 및 38R 에서 선택되는 단리된 개질 변이체 BBPI.
  19. 제 1 항에 있어서, 위치 40 에서의 하나 이상의 치환이 40H, 40K, 40Q, 40R 및 40Y 에서 선택되는 단리된 개질 BBI.
  20. 제 1 항에 있어서, 위치 50 에서의 하나 이상의 치환이 50R, 50Q, 50K, 50T, 50V, 50M 및 50S 에서 선택되는 단리된 개질 변이체 BBPI.
  21. 제 1 항에 있어서, 위치 52 에서의 하나 이상의 치환이 52K, 52T, 52R, 52Q, 52L, 52H, 52A, 52M, 52S 및 52E 에서 선택되는 단리된 개질 변이체 BBPI.
  22. 제 1 항에 있어서, 위치 55 에서의 하나 이상의 치환이 55M 인 단리된 개질 변이체 BBPI.
  23. 제 1 항에 있어서, 위치 65 에서의 하나 이상의 치환이 65E, 65Q 및 65D 에서 선택되는 단리된 개질 변이체 BBPI.
  24. 제 1 항에 있어서, SEQ ID NO:389 의 삽입물을 추가로 포함하는 단리된 개질 변이체 BBPI.
  25. 제 1 항에 있어서, 셀룰라아제, 큐티나아제 및 디술피드 이소머라아제에서 선택되는 촉매적 도메인을 포함하는 융합 단백질로서 발현되는 단리된 개질 변이체 BBPI.
  26. 제 1 항에 있어서, SEQ ID NO:195 의 융합 단백질로서 발현되는 단리된 개질 변이체 BBPI.
  27. 제 1 항에 있어서, SEQ ID NO:187 의 위치 50 및 52 와 동등한 아미노산 위치에서의 2 개 아미노산 치환의 조합을 포함하는 단리된 개질 변이체 BBPI.
  28. 제 27 항에 있어서, SEQ ID NO:595 의 아미노산 서열을 갖는 단리된 개질 변이체 BBPI.
  29. 제 1 항에 있어서, SEQ ID NO:187 의 위치 25, 29, 40, 50 및 52 와 동등한 위치에서의 아미노산 치환에서 선택되는 3 개 아미노산 치환의 조합을 포함하는 단리된 개질 변이체 BBPI.
  30. 제 29 항에 있어서, 3 개 아미노산의 조합이 조합 25L-50T-52A, 29P-50T-52A, 40K-50T-52A 에서 선택되는 단리된 개질 변이체 BBPI.
  31. 제 29 항에 있어서, SEQ ID NO:603, 607 및 609 에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 단리된 개질 변이체 BBPI.
  32. 제 1 항에 있어서, SEQ ID NO:187 의 위치 13, 29, 50 및 52 와 동등한 위치에서의 아미노산 치환에서 선택되는 4 개 아미노산 치환의 조합을 포함하는 단리된 개질 변이체 BBPI.
  33. 제 32 항에 있어서, 4 개 아미노산의 조합이 조합 13I-25L-50T-52A, 13I-29P-50T-52A, 13I-A0K-50T-52A, 25L-29P-50T-52A, 25L-40K-50T-52A 및 29P-40K-50T-52A 에서 선택되는 단리된 개질 BBPI.
  34. 제 33 항에 있어서, SEQ ID NO:596, 600, 602, 604, 606, 608 및 643 에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 단리된 개질 변이체 BBPI.
  35. 제 1 항에 있어서, SEQ ID NO:187 의 위치 13, 25, 29, 40, 50 및 52 와 동등한 위치에서의 아미노산 치환에서 선택되는 5 개 아미노산 치환의 조합을 포함하는 단리된 개질 변이체 BBPI.
  36. 제 35 항에 있어서, 5 개 아미노산의 조합이 조합 13I-25L-29P-50T-52A, 13I-25L-40K-50T-52A, A13I-29P-40K-50T-52A, 25L-29P-40K-50T-52A, 13I-29P-40K-50K-52A 및 13I-29P-40K-50T-52T 에서 선택되는 단리된 개질 변이체 BBPI.
  37. 제 36 항에 있어서, SEQ ID NO:432, 434, 443, 445, 446, 597, 599, 601, 605, 615, 620, 624 및 625 에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 단리된 개질 변이체 BBPI.
  38. 제 1 항에 있어서, SEQ ID NO:187 의 위치 1, 4, 5, 11, 13, 25, 29, 40, 50 및 52 와 동등한 위치에서의 아미노산 치환에서 선택되는 6 개 아미노산 치환의 조합을 포함하는 단리된 개질 변이체 BBPI.
  39. 제 38 항에 있어서, 6 개 아미노산의 조합이 조합 13I-25L-29P-40K-50T-52A, 1C-13I-29P-40K-50T-52A, 4V-13I-29P-40K-50T-52A, 5P-13I-29P-40K-50T-52A, 11G-13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25R-29P-40K-50T-52A, 13I-27R-29P-40K-50T-52A, 13I-29P-31A-40K-50T-52A, 13I-29P-31R-40K-50T-52A, 13I-29P-38N-40K-50T-52A 및 13I-29P-40K-50T-52A-65E 에서 선택되는 단리된 개질 변이체 BBPI.
  40. 제 39 항에 있어서, SEQ ID NO:598, 611, 612, 613, 614, 616, 619, 621, 622, 623 및 626 에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 단리된 개질 변이체 BBPI.
  41. 제 1 항에 있어서, SEQ ID NO:187 의 위치 13, 25, 29, 31, 40, 50 및 52 와 동등한 위치에서의 아미노산 치환에서 선택되는 7 개 아미노산 치환의 조합을 포함하는 단리된 개질 변이체 BBPI.
  42. 제 41 항에 있어서, 7 개 아미노산의 조합이 조합 13L-25R-29P-31A-40K-50T-52A, 13L-25R-29P-31R-40K-50T-52A 및 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T 에서 선택되는 단리된 개질 변이체 BBPI.
  43. 제 41 항에 있어서, SEQ ID NO:491, 617, 618 및 632-639 에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 단리된 개질 변이체 BBPI.
  44. 제 1 항에 있어서, SEQ ID NO:187 의 위치 13, 25, 27, 29, 31, 40, 50 및 52 와 동등한 위치에서의 아미노산 치환에서 선택되는 8 개 아미노산 치환의 조합을 포함하는 단리된 개질 변이체 BBPI.
  45. 제 44 항에 있어서, 8 개 아미노산의 조합이 조합 13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T, 13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q, 13I-25K-27R-29E-31A-40H-50R-52K, 13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L 및 13I-25K-27Q-29P-31E-40H-50R-52Q 에서 선택되는 단리된 개질 BBPI.
  46. 제 44 항에 있어서, SEQ ID NO:627-631 에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 단리된 개질 변이체 BBPI.
  47. 제 1 항에 있어서, VEGF 에 결합하는 단리된 개질 변이체 BBPI.
  48. 제 1 항에 있어서, VEGF 결합 펩티드가 SEQ ID NO:9, 458, 459, 460, 468, 469, 470, 471, 472 및 473 에서 선택되는 단리된 개질 변이체 BBPI.
  49. 제 1 항에 있어서, SEQ ID NO:601, 602, 627, 628, 630, 631, 643, 491, 632, 633, 634, 635 및 636 에서 선택되는 VEGF-BBPI 인 단리된 개질 변이체 BBPI.
  50. 제 1 항에 있어서, 단리된 개질 변이체 저해제가 상응하는 비개질 전구체 변이체 BBPI 보다 더 큰 트립신 저해 활성을 갖는 단리된 개질 변이체 BBPI.
  51. 제 1 항에 있어서, 상응하는 비개질 전구체 변이체 BBPI 보다 더 큰 트립신 저해 활성 및 생성 수율을 갖는 단리된 개질 변이체 BBPI.
  52. 위치 13, 25, 27, 29, 31, 40, 50 및 52 와 동등한 위치에서의 아미노산 치환에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, BBPI 의 VEGF 변이체 펩티드가 변이체 펩티드에 의해 대체되어 FGF-5, TGFβ 및 TNFα 에서 선택되는 표적 단백질에 결합하는, SEQ ID NO:187 의 단리된 개질 변이체 BBPI.
  53. 제 52 항에 있어서, 변이체 펩티드가 SEQ ID NO:430, 431, 670 및 671 에서 선택되는 FGF5 결합 펩티드인 단리된 개질 변이체 BBPI.
  54. 제 52 항에 있어서, 결합 펩티드가 SEQ ID NO:436, 437, 438, 672, 673 및 674 에서 선택되는 TGFβ 결합 펩티드인 단리된 개질 변이체 BBPI.
  55. 제 52 항에 있어서, 결합 펩티드가 SEQ ID NO:474, 475 및 476 에서 선택되는 TNFα 결합 펩티드인 단리된 개질 변이체 BBPI.
  56. 제 52 항에 있어서, 상응하는 비개질 전구체 BBPI 보다 더 큰 트립신 저해 활성 및 생성 수율을 갖는 단리된 개질 변이체 BBPI.
  57. 제 52 항에 잇어서, 변이체 바우만 버크 저해제가 SEQ ID NO:432, 434, 443, 445, 447, 637, 638 및 639 에서 선택되는 단리된 개질 변이체 BBPI.
  58. 효소의 촉매 단위를 인코딩하는 제 1 폴리뉴클레오티드 서열, 및 VEGF-결합 BBPI (VEGF-BBPI), FGF-결합 BBPI (FGF-BBPI), TGF-결합 BBPI (TGF-BBPI) 및 TNF-결합 BBPI (TNF-BBPI) 에서 선택되는 개질 변이체 프로테아제 저해제를 인코딩하는 제 2 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, BBPI 융합 단백질을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  59. 제 58 항에 있어서, 제 1 서열이 셀룰라아제의 촉매 단위를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  60. 하기를 포함하는, 세균 세포에서 개질 변이체 BBPI 를 생성하는 방법:
    a) SEQ ID NO:187 의 변이체 BBPI 의 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 및 65 와 동등한 위치에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 포함하는 개질 변이체 BBPI 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 구성물이 생성되도록, 변이체 BBPI 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 돌연변이시키고;
    b) 상기 폴리뉴클레오티드 구성물을 세균 숙주 세포에 도입하고;
    c) 상기 세균 세포를 이종 DNA 서열이 발현되도록 하는 적합한 배양 조건 하에 배양하고;
    d) 상응하는 비개질 전구체 변이체 BBPI 보다 더 큰 트립신 저해 활성을 갖는 상기 개질 변이체 BBPI 를 생성함.
  61. 제 60 항에 있어서, 개질 변이체 BBPI 가 상응하는 비개질 전구체 변이체 BBPI 보다 더 큰 트립신 저해 활성 및 생성 수율을 갖는 방법.
  62. 제 60 항에 있어서, 비개질 전구체 변이체 BBPI 가 BBI-AV (SEQ ID NO:186), BBIt-AV (SEQ ID NO:187), BBdb-AV (SEQ ID NO:452), BBsb3 (SEQ ID NO:453) 및 BBtc-AV (SEQ ID NO:454) 에서 선택되는 방법.
  63. 제 60 항에 있어서, 개질 변이체 BBPI 의 제 2 프로테아제 저해 루프가 VEGF 결합 펩티드, FGF-5 결합 펩티드, TGFβ 결합 펩티드 및 TNFα 결합 펩티드에서 선택되는 표적 단백질 결합 펩티드인 방법.
  64. 제 60 항에 있어서, 개질 변이체 BBPI 를 회수하는 것을 추가적으로 포함하는 방법.
  65. 제 60 항에 있어서, 개질 변이체 BBPI 를 활성화시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  66. 제 60 항에 있어서, 개질 변이체 BBPI 가 하기 조합에서 선택되는 아미노산 치환의 조합을 포함하는 방법:
    Figure pct00277
  67. 제 1 항에 따른 개질 변이체 BBPI 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터.
  68. 제 67 항에 있어서, 개질 변이체 BBPI 가 SEQ ID NO:195 의 폴리펩티드와 80% 이상 동일성을 갖는 융합 단백질로서 발현되는 발현 벡터.
  69. 제 67 항에 있어서, 개질 BBPI 의 제 2 프로테아제 저해 루프가 VEGF 결합 펩티드, FGF5 결합 펩티드, TGFβ 결합 펩티드 및 TNFα 결합 펩티드에서 선택되는 결합 펩티드인 발현 벡터.
  70. 제 67 항에 따른 벡터로 형질전환되는 숙주 세포.
  71. 제 70 항에 있어서, 바실러스 (Bacillus) 종 숙주 세포인 숙주 세포.
  72. 개질 변이체 BBPI 의 스캐폴드의 제 2 프로테아제 저해 루프가 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 결합 펩티드, 섬유모세포 성장 인자-5 (FGF5) 결합 펩티드, 형질전환 성장 인자 β (TGFβ) 결합 펩티드 및 종양 괴사 인자 α (TNFα) 변이체 펩티드에서 선택되는 결합 펩티드이며, 상기 개질 변이체 BBPI 가 SEQ ID NO:187 의 변이체 BBI 의 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 및 65 와 동등한 위치에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 추가로 포함하는, 개질 변이체 BBPI 를 포함하는 개인 케어 조성물.
  73. 제 72 항에 있어서, 스캐폴드가 하기에서 선택되는 개인 케어 조성물:
    Figure pct00278
  74. 제 72 항 또는 제 73 항에 있어서, 개질 변이체 BBPI 가 하기에서 선택되는 아미노산 치환의 조합을 포함하는 개인 케어 조성물:
    Figure pct00279
  75. 제 72 항 내지 제 74 항 중 어느 한 항에 있어서, 개질 변이체 BBPI 가 VEGF, FGF5, TGFβ 및 TNFα 에서 선택되는 표적 단백질에 결합하는 개인 케어 조성물.
  76. 제 72 항 내지 제 75 항 중 어느 한 항에 있어서, VEGF 결합 펩티드가 하기에서 선택되는 개인 케어 조성물:
    Figure pct00280
  77. 제 72 항 내지 제 75 항 중 어느 한 항에 있어서, FGF 결합 펩티드가 하기에서 선택되는 개인 케어 조성물:
    Figure pct00281
  78. 제 72 항 내지 제 75 항 중 어느 한 항에 있어서, TGF 결합 펩티드가 하기에서 선택되는 개인 케어 조성물:
    Figure pct00282
  79. 제 72 항 내지 제 75 항 중 어느 한 항에 있어서, TNF 결합 펩티드가 하기에서 선택되는 개인 케어 조성물:
    Figure pct00283
  80. 제 72 항 내지 제 75 항 중 어느 한 항에 있어서, 개질 변이체 BBPI 가 약 0.0001 중량% 내지 약 5 중량% 의 개인 케어 조성물을 포함하는 개인 케어 조성물.
  81. 제 72 항 내지 제 75 항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 개질 변이체 저해제가 단리된 개질 변이체 BBPI 의 상응하는 비개질 전구체 변이체 저해제보다 더 큰 트립신 저해 활성 및 생성 수율을 갖는 단리된 개질 변이체 BBPI.
  82. 제 72 항 내지 제 75 항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 펩티드가 SEQ ID NO:9, 458, 459, 460, 468, 469, 470, 471, 472 및 473 에서 선택되는 VEGF-결합 펩티드인 개인 케어 조성물.
  83. 제 82 항에 있어서, 스캐폴드가 SEQ ID NO:187 의 BBIt-AV 인 개인 케어 조성물.
  84. 제 82 항 또는 제 83 항에 있어서, 개질 변이체 BBPI 가 13I-40K-50T-52A, 13I-25K-29P-52K, 13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T, 13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q, 13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L 에서 선택되는 아미노산 치환의 조합을 포함하는 개인 케어 조성물.
  85. 제 72 항, 제 80 항 또는 제 81 항 중 어느 한 항에 있어서, 개질 변이체 BBPI 가 SEQ ID NO:601, 602, 627, 628, 630, 631, 643, 491, 632, 633, 634, 635 및 636 에서 선택되는 VEGF-결합 BBPI (VEGF-BBPI) 인 개인 케어 조성물.
  86. 제 75 항 또는 제 80 항 내지 제 85 항 중 어느 한 항에 있어서, 피부 크림, 로션, 스프레이, 에멀젼, 콜로이드성 현탁액, 거품, 에어로졸, 액체, 겔, 세럼 및 고체로 이루어지는 군에서 선택되는 피부 케어 조성물인 개인 케어 조성물.
  87. 제 75 항 또는 제 80 항 내지 제 85 항 중 어느 한 항에 있어서, 보습 바디 워시, 바디 워시, 살균 세정제, 피부 보호 크림, 바디 로션, 얼굴 크림, 보습 크림, 얼굴 세정 에멀젼, 얼굴 겔, 얼굴 세럼, 계면활성제계 얼굴 세정제, 얼굴 박리 겔, 여드름 방지 처리제, 얼굴 토너, 박리 크림, 얼굴 마스크, 애프터 쉐이브 밤, 프리-쉐이브 밤, 태닝 조성물, 선스크린, 제모제, 헤어 성장 저해제 및 방사선 보호제에서 선택되는 피부 케어 조성물인 개인 케어 조성물.
  88. 제 87 항에 있어서, 피부 케어 조성물이 국소 적용된 비처방전 조성물, 진균 방지 처리제, 여드름 방지 처리제, 피부 보호제, 선스크린, 데오도란트 및 발한 억제제를 추가로 포함하는 조성물.
  89. 제 87 항에 있어서, 방사선 보호제가 비-내수성 선스크린, 지속 내수성 선스크린 및 W/S (water-in-silicone) 선스크린에서 선택되는 선스크린인 조성물.
  90. 제 86 항에 있어서, 개인 케어 조성물이 압축 파우더 제형 및 파운데이션에서 선택되는 미용 조성물인 조성물.
  91. 제 90 항에 있어서, 미용 조성물이 하나 이상의 안료를 포함하는 조성물.
  92. 제 90 항에 있어서, 미용 조성물이 루스 파우더, 블러쉬 및 브론징 파우더에서 선택되는 압축 파우더 제형인 조성물.
  93. 제 90 항에 있어서, 미용 조성물이 유중수 파운데이션, W/S 파운데이션, 수중유 파운데이션, 무수 메이크업 스틱 및 크림-투-파우더 파운데이션에서 선택되는 파운데이션인 조성물.
  94. 제 86 항에 있어서, 개인 케어 조성물이 혈관신생 피부 장애 치료용 피부 케어 조성물인 조성물.
  95. 제 86 항에 있어서, 건선, 경피증, 정맥 궤양, 여드름, 주사코, 사마귀, 습진, 혈관종 및 림프관신생에서 선택되는 피부 장애를 겪는 대상에서의 피부 외양 및/또는 상태를 향상시키기 위한 피부 케어 조성물인 개인 케어 조성물.
  96. 제 75 항 또는 제 80 항 내지 제 85 항 중 어느 한 항에 있어서, 헤어 케어 조성물인 개인 케어 조성물.
  97. 제 96 항에 있어서, 샴푸, 컨디셔너, 헤어 스타일링 조성물, 헤어 색소, 퍼머넌트 웨이브 제형, 크림, 겔, 무스, 스프레이, 에멀젼, 콜로이드성 현탁액, 액체, 거품 및 고체로 이루어지는 군에서 선택되는 헤어 케어 조성물.
  98. 제 97 항에 있어서, 방사선 보호제를 추가로 포함하는 헤어 케어 조성물.
  99. 제 98 항에 있어서, 방사선 보호제가 비-내수성 선스크린, 지속 내수성 선스크린 및 W/S 선스크린에서 선택되는 선스크린인 조성물.
  100. 제 96 항에 있어서, 개인 케어 조성물이 헤어 성장을 방지할 수 있는 조성물.
  101. 하기 단계를 포함하는, 대상의 헤어 성장을 저해하는 방법:
    a) 제 75 항 또는 제 80 내지 제 85 항 중 어느 한 항에 따른 개인 케어 조성물을 제공하는 단계;
    b) 처리할 대상을 제공하는 단계; 및
    c) 상기 조성물을 헤어 성장의 저해가 필요한 부위 내에서 상기 대상에게 적용하는 단계.
  102. 제 101 항에 있어서, 성장이 저해될 헤어가 수염, 겨드랑이 털, 다리 털, 몸통 털, 팔 털 및 머리 털에서 선택되는 방법.
  103. 제 101 항에 있어서, 개인 케어 조성물이 SEQ ID NO:601, 602, 627, 628, 630, 631, 643, 491, 632, 633, 634, 635 및 636 에서 선택되는 VEGF-BBPI 를 포함하는 방법.
  104. 하기 단계를 포함하는, 혈관신생 피부 장애를 겪는 대상의 피부 외양 및/또는 상태를 향상시키는 방법:
    a) 제 75 항 또는 제 80 항 내지 제 85 항 중 어느 한 항에 따른 개인 케어 조성물을 제공하는 단계;
    b) 상기 대상을 제공하는 단계; 및
    c) 상기 조성물을 상기 대상의 피부에 적용하는 단계.
  105. 제 104 항에 있어서, 혈관신생 피부 장애가 건선, 경피증, 정맥 궤양, 여드름, 주사코, 사마귀, 습진, 혈관종 및 림프관신생에서 선택되는 방법.
  106. 제 104 항에 있어서, 개인 케어 조성물이 SEQ ID NO:601, 602, 627, 628, 630, 631, 643, 491, 632, 633, 634, 635 및 636 에서 선택되는 VEGF-BBI 를 포함하는 방법.
  107. 제 72 항 내지 제 75 항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 펩티드가 SEQ ID NO:430 및 431 에서 선택되는 FGF 변이체 펩티드인 개인 케어 조성물.
  108. 제 107 항에 있어서, 스캐폴드가 SEQ ID NO:187 의 BBIt-AV 인 개인 케어 조성물.
  109. 제 107 항 또는 제 108 항에 있어서, 개질 변이체 BBPI 가 13I-40K-50T-52A, 13I-25K-29P-52K, 13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T, 13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q, 13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L 에서 선택되는 아미노산 치환의 조합을 포함하는 개인 케어 조성물.
  110. 제 72 항, 제 80 항 또는 제 81 항 중 어느 한 항에 있어서, 개질 변이체 BBPI 가 SEQ ID NO:432 및 434 에서 선택되는 FGF-결합 BBPI (FGF-BBPI) 인 개인 케어 조성물.
  111. 제 77 항 또는 제 107 항 내지 제 110 항 중 어느 한 항에 있어서, 개인 케어 조성물이 헤어 케어 조성물인 조성물.
  112. 제 111 항에 있어서, 샴푸, 컨디셔너, 헤어 스타일링 조성물, 헤어 색소, 퍼머넌트 웨이브 제형, 크림, 겔, 무스, 스프레이, 에멀젼, 콜로이드성 현탁액, 액체, 거품 및 고체로 이루어지는 군에서 선택되는 헤어 케어 조성물.
  113. 제 111 항 또는 제 112 항에 있어서, 방사선 보호제를 추가로 포함하는 헤어 케어 조성물.
  114. 제 113 항에 있어서, 방사선 보호제가 비-내수성 선스크린, 지속 내수성 선스크린 및 W/S 선스크린에서 선택되는 선스크린인 조성물.
  115. 제 111 항에 있어서, 개인 케어 조성물이 헤어 성장을 촉진할 수 있는 조성물.
  116. 하기 단계를 포함하는, 대상의 헤어 성장을 촉진하는 방법:
    a) 제 77 항 또는 제 107 항 내지 제 110 항 중 어느 한 항에 따른 개인 케어 조성물을 제공하는 단계;
    b) 처리할 대상을 제공하는 단계; 및
    c) 상기 조성물을 헤어 성장의 촉진이 필요한 부위 내에서 상기 대상에게 적용하는 단계.
  117. 제 116 항에 있어서, 성장이 촉진될 헤어가 수염, 겨드랑이 털, 다리 털, 몸통 털, 팔 털 및 머리 털에서 선택되는 방법.
  118. 제 116 항에 있어서, 대상이 헤어 손실을 포함하는 상태를 겪는 방법.
  119. 제 116 항에 있어서, 상태가 염증성 탈모, 반흔성 탈모, 경피증, 진드기 교상, 편평 태선, 건선, 루푸스, 지루성 피부염, 느슨한 헤어 증후군, 혈색소침착증, 남성형 탈모 및 원형 탈모에서 선택되는 방법.
  120. 제 116 항에 있어서, 개인 케어 조성물이 SEQ ID NO:432 및 434 에서 선택되는 FGF-결합 BBPI (FGF-BBPI) 를 포함하는 방법.
  121. 제 72 항 내지 제 75 항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 펩티드가 SEQ ID NO:436, 437, 438, 672, 673 및 674 에서 선택되는 TGF 변이체 펩티드인 개인 케어 조성물.
  122. 제 121 항에 있어서, 스캐폴드가 SEQ ID NO:187 의 BBIt-AV 인 개인 케어 조성물.
  123. 제 121 항 또는 제 122 항에 있어서, 개질 변이체 BBPI 가 13I-40K-50T-52A, 13I-25K-29P-52K, 13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T, 13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q, 13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L 에서 선택되는 아미노산 치환의 조합을 포함하는 개인 케어 조성물.
  124. 제 72 항, 제 80 항 또는 제 81 항 중 어느 한 항에 있어서, 개질 변이체 BBPI 가 SEQ ID NO:443, 445 및 447 에서 선택되는 TGF-결합 BBPI (TGF-BBPI) 인 개인 케어 조성물.
  125. 제 78 항, 제 80 항, 제 81 항 또는 제 121 항 내지 제 124 항 중 어느 한 항에 있어서, 헤어 케어 또는 피부 케어 조성물인 개인 케어 조성물.
  126. 제 125 항에 있어서, 헤어 케어 또는 피부 케어 조성물이 샴푸, 컨디셔너, 헤어 스타일링 조성물, 헤어 색소, 퍼머넌트 웨이브 제형, 크림, 겔, 무스, 스프레이, 에멀젼, 콜로이드성 현탁액, 액체, 거품 및 고체로 이루어지는 군에서 선택되는 개인 케어 조성물.
  127. 제 125 항에 있어서, 개인 케어 조성물이 보습 바디 워시, 바디 워시, 살균 세정제, 피부 보호 크림, 바디 로션, 얼굴 크림, 보습 크림, 얼굴 세정 에멀젼, 얼굴 겔, 얼굴 세럼, 계면활성제계 얼굴 세정제, 얼굴 박리 겔, 여드름 방지 처리제, 얼굴 토너, 박리 크림, 얼굴 마스크, 애프터 쉐이브 밤, 프리-쉐이브 밤, 태닝 조성물, 선스크린 및 방사선 보호제에서 선택되는 피부 케어 조성물인 조성물.
  128. 제 127 항에 있어서, 피부 케어 조성물이 국소 적용된 비처방전 조성물, 진균 방지 처리제, 여드름 방지 처리제, 피부 보호제, 선스크린, 데오도란트 및 발한 억제제를 추가로 포함하는 조성물.
  129. 제 127 항에 있어서, 방사선 보호제가 비-내수성 선스크린, 지속 내수성 선스크린 및 W/S 선스크린에서 선택되는 선스크린인 조성물.
  130. 제 121 항 내지 제 124 항 중 어느 한 항에 있어서, 개인 케어 조성물이 미용 조성물인 조성물.
  131. 제 130 항에 있어서, 미용 조성물이 마스카라, 아이라이너, 압축 파우더 제형 및 파운데이션에서 선택되는 조성물.
  132. 제 126 항에 있어서, 방사선 보호제를 추가로 포함하는 헤어 케어 조성물.
  133. 제 132 항에 있어서, 방사선 보호제가 비-내수성 선스크린, 지속 내수성 선스크린 및 W/S 선스크린에서 선택되는 선스크린인 개인 케어 조성물.
  134. 제 125 항에 있어서, 헤어 성장을 촉진할 수 있는 개인 케어 조성물.
  135. 하기 단계를 포함하는, 대상의 헤어 성장을 촉진하는 방법:
    a) 제 78 항, 제 80 항, 제 81 항 또는 제 121 항 내지 제 124 항 중 어느 한 항에 따른 개인 케어 조성물을 제공하는 단계;
    b) 처리할 대상을 제공하는 단계; 및
    c) 상기 조성물을 헤어 성장의 촉진이 필요한 부위 내에서 상기 대상에게 적용하는 단계.
  136. 제 135 항에 있어서, 성장이 촉진될 헤어가 수염, 겨드랑이 털, 다리 털, 몸통 털, 팔 털 및 머리 털에서 선택되는 방법.
  137. 제 77 항에 있어서, 대상이 헤어 손실을 포함하는 상태를 겪는 방법.
  138. 제 135 항에 있어서, 상태가 염증성 탈모, 반흔성 탈모, 경피증, 진드기 교상, 편평 태선, 건선, 루푸스, 지루성 피부염, 느슨한 모발 증후군, 혈색소침착증, 남성형 탈모 및 원형 탈모에서 선택되는 방법.
  139. 제 135 항에 있어서, 개인 케어 조성물이 SEQ ID NO:443, 445 및 447 에서 선택되는 개질 변이체 TGF-BBPI 를 포함하는 방법.
  140. 하기 단계를 포함하는, 피부 장애를 겪는 대상의 피부 외양 및/또는 상태를 향상시키는 방법:
    a) 제 78 항, 제 80 항, 제 81 항 또는 제 121 항 내지 제 124 항 중 어느 한 항에 따른 개인 케어 조성물을 제공하는 단계;
    b) 상기 대상을 제공하는 단계; 및
    c) 상기 조성물을 상기 대상의 피부에 적용하는 단계.
  141. 제 140 항에 있어서, 피부 장애가 건선, 경피증 및 피부암에서 선택되는 방법.
  142. 제 140 항에 있어서, 개인 케어 조성물이 SEQ ID NO:443, 445 및 447 에서 선택되는 개질 변이체 TGF-BBPI 에서 선택되는 TGF-BBPI 를 포함하는 방법.
  143. 제 72 항 내지 제 74 항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 펩티드가 SEQ ID NO:474, 475 및 476 에서 선택되는 TNF 변이체 펩티드인 개인 케어 조성물.
  144. 제 143 항에 있어서, 스캐폴드가 SEQ ID NO:187 의 BBIt-AV 인 개인 케어 조성물.
  145. 제 143 항 또는 제 144 항에 있어서, 개질 변이체 BBPI 가 13I-40K-50T-52A, 13I-25K-29P-52K, 13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T, 13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q, 13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L 에서 선택되는 아미노산 치환의 조합을 포함하는 개인 케어 조성물.
  146. 제 72 항, 제 80 항 또는 제 81 항 중 어느 한 항에 있어서, 개질 변이체 BBPI 가 SEQ ID NO:637, 638 및 639 에서 선택되는 TNF-BBPI 인 개인 케어 조성물.
  147. 제 79 항 내지 제 81 항 및 제 142 항 내지 제 146 항 중 어느 한 항에 있어서, 헤어 케어 조성물인 개인 케어 조성물.
  148. 제 147 항에 있어서, 헤어 케어 조성물이 건선을 겪는 대상에서의 헤어 성장을 촉진할 수 있는 조성물.
  149. 제 147 항에 있어서, 샴푸, 컨디셔너, 헤어 스타일링 조성물, 헤어 색소, 퍼머넌트 웨이브 제형, 크림, 겔, 무스, 스프레이, 에멀젼, 콜로이드성 현탁액, 액체, 거품 및 고체로 이루어지는 군에서 선택되는 헤어 케어 조성물.
  150. 제 149 항에 있어서, 방사선 보호제를 추가로 포함하는 헤어 케어 조성물.
  151. 제 150 항에 있어서, 방사선 보호제가 비-내수성 선스크린, 지속 내수성 선스크린 및 W/S 선스크린에서 선택되는 선스크린인 헤어 케어 조성물.
  152. 제 147 항에 있어서, 헤어 성장을 촉진할 수 있는 개인 케어 조성물.
  153. 제 79 항 내지 제 81 항 및 제 142 항 내지 제 146 항 중 어느 한 항에 있어서, 피부 케어 조성물인 개인 케어 조성물.
  154. 제 153 항에 있어서, 피부 케어 조성물이 건선 또는 경피증을 겪는 대상의 피부 외양 및/또는 상태를 향상시킬 수 있는 개인 케어 조성물.
  155. 제 153 항에 있어서, 피부 크림, 로션, 스프레이, 에멀젼, 콜로이드성 현탁액, 거품, 에어로졸, 액체, 겔, 세럼 및 고체로 이루어지는 군에서 선택되는 피부 케어 조성물인 개인 케어 조성물.
  156. 제 153 항에 있어서, 보습 바디 워시, 바디 워시, 살균 세정제, 피부 보호 크림, 바디 로션, 얼굴 크림, 보습 크림, 얼굴 세정 에멀젼, 얼굴 겔, 얼굴 세럼, 계면활성제계 얼굴 세정제, 얼굴 박리 겔, 여드름 방지 처리제, 얼굴 토너, 박리 크림, 얼굴 마스크, 애프터 쉐이브 밤, 프리-쉐이브 밤, 태닝 조성물, 피부 미백 조성물, 피부 발진 감소 조성물, 선스크린, 제모제 및 방사선 보호제에서 선택되는 피부 케어 조성물인 개인 케어 조성물.
  157. 제 155 항에 있어서, 피부 케어 조성물이 국소 적용된 비처방전 조성물, 진균 방지 처리제, 여드름 방지 처리제, 피부 보호제, 선스크린, 데오도란트 및 발한 억제제를 추가로 포함하는 조성물.
  158. 제 79 항 내지 제 81 항 및 제 142 항 내지 제 146 항 중 어느 한 항에 있어서, 개인 케어 조성물이 미용 조성물인 조성물.
  159. 제 158 항에 있어서, 미용 조성물이 마스카라, 아이라이너, 압축 파우더 제형 및 파운데이션에서 선택되는 조성물.
  160. 제 159 항에 있어서, 미용 조성물이 하나 이상의 안료를 포함하는 조성물.
  161. 제 158 항 또는 제 159 항에 있어서, 하나 이상의 안료를 포함하는 미용 조성물이 비-방수 마스카라, 방수 마스카라, 부피 증대 마스카라, 길이 연장 마스카라, 컬링 마스카라, 무수 방수 마스카라, 수-기반 마스카라 및 속눈썹 또는 눈썹 처리제에서 선택되는 마스카라인 조성물.
  162. 제 160 항에 있어서, 미용 조성물이 루스 파우더, 블러쉬, 아이 섀도우 및 브론징 파우더에서 선택되는 압축 파우더 제형인 조성물.
  163. 제 160 항에 있어서, 미용 조성물이 유중수 파운데이션, W/S 파운데이션, 수중유 파운데이션, 무수 메이크업 스틱 및 크림-투-파우더 파운데이션에서 선택되는 파운데이션인 조성물.
  164. 하기 단계를 포함하는, 건선을 겪는 대상의 헤어 성장을 촉진하는 방법:
    a) 제 79 항 내지 제 81 항 및 제 142 항 내지 제 146 항 중 어느 한 항에 따른 개인 케어 조성물을 제공하는 단계;
    b) 처리할 대상을 제공하는 단계; 및
    c) 상기 조성물을 헤어 성장의 촉진이 필요한 부위 내에서 상기 대상에게 적용하는 단계.
  165. 제 164 항에 있어서, 성장이 촉진될 헤어가 수염, 겨드랑이 털, 다리 털, 몸통 털, 팥 털 및 머리 털에서 선택되는 방법.
  166. 제 164 항에 있어서, 개인 케어 조성물이 SEQ ID NO:637, 638 및 639 에서 선택되는 개질 TNF-BBPI 를 포함하는 방법.
  167. 하기 단계를 포함하는, 건선을 겪는 대상의 피부 외양 및/또는 상태를 향상시키는 방법:
    a) 제 79 항 내지 제 81 항 및 제 142 항 내지 제 146 항 중 어느 한 항에 따른 개인 케어 조성물을 제공하는 단계;
    b) 상기 대상을 제공하는 단계; 및
    c) 상기 조성물을 상기 대상의 피부에 적용하는 단계.
  168. 제 167 항에 있어서, 개인 케어 조성물이 SEQ ID NO:637, 638 및 639 에서 선택되는 개질 TNF-BBPI 를 포함하는 방법.
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