JP2012505652A

JP2012505652A - 修飾変異ボウマンブリックプロテアーゼインヒビター

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Publication number: JP2012505652A
Application number: JP2011532052A
Authority: JP
Inventors: アミン、ネーラム・エス; コリアー、キャサリーン・ディー; エスタブルック、メロディー; エステル、デビッド・エー; フォックス、ブライアン; パワー、スコット・ディー; シュミット、ブライアン・エフ; フォーグテンタンツ、グドルン
Original assignee: ダニスコ・ユーエス・インク
Priority date: 2008-10-15
Filing date: 2008-10-15
Publication date: 2012-03-08
Anticipated expiration: 2028-10-15
Also published as: AU2008362898B2; RU2509776C2; CA2740197A1; BRPI0823193A2; WO2010044786A1; CN102245635A; EP2344531B1; RU2011119481A; AU2008362898A1; JP5740308B2; MX2011003803A; CN102245635B; EP2344531A1

Abstract

本発明は、標的タンパク質に結合ペプチドを含み、より高いプロテアーゼ抑制活性を有するように及び／又は未修飾ＢＢＰＩよりも高い生産性を有するように更に修飾された、ボウマンブリックプロテアーゼインヒビタータンパク質（ＢＢＰＩ）に関する。本発明はこの修飾変異ＢＢＰＩをコードするポリヌクレオチド配列を含ポリヌクレオチド構築体及び／又は発現ベクター、前記修飾変異ＢＢＰＩを発現し生産する形質転換された宿主細胞、修飾変異ＢＢＰＩタンパク質、修飾変異ＢＢＰＩを含む組成物、及び修飾変異ＢＢＰＩを生産及びパーソナルケア組成物に用いる方法を含む。
【選択図】
図９

Description

本発明は標的タンパク質に結合するペプチドを含む、修飾変異ボウマンクロックプロテアーゼインヒビタータンパク質（ＢＢＰＩ）に関する。更に、本発明はより高いプロテアーゼ抑制活性を有するように修飾され、及び／又は未修飾ＢＢＰＩよりも生産性の高い、修飾変異ボウマンクロックプロテアーゼインヒビタータンパク質（ＢＢＰＩ）に関する。本発明はポリヌクレオチド構築体及び修された変異ＢＢＰＩをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター、修飾変異ＢＢＰＩを発現及び生成する形質転換された宿主細胞、修飾変異ＢＢＰＩタンパク質、修飾変異ＢＢＰＩを含む組成物生物、パーソナルケアにおいて、修飾変異ＢＢＰＩを生成し、使用する方法も含む。

タンパク質は幅広い生物学的過程に含まれている。プロテアーゼとプロテアーゼインヒビターとの間のバランスの崩壊はしばしは病理組織の崩壊と関係している。

組織損傷におけるプロテアーゼの役割に多くの研究が注目している。そして、プロテアーゼとプロテアーゼインヒビターとの間のバランスが組織の完全な状態を維持するための主用な決定要因であると考えられている。炎症細胞からのセリンプロテアーゼは好中球を含み、肺気腫、関節炎、アトピー性皮膚炎、及び乾癬等の炎症性疾患に関係している。これらの及び他の炎症状態はしばしばサイトカインの無調節のレベルに関する。

プロテアーゼは血管基底膜を分解し、細胞外基質の再構成して、細胞の移動及び浸潤を促進して、腫瘍の血管形成を促進する。プロテアーゼは血管形成成長因子を放出する。該成長因子は細胞外基質に結合し、細胞外基質化合物由来の遊走活性フラグメントを生成する。このフラグメントは順々に遊走性及び移動性を発揮して、内皮細胞、平滑筋細胞、及び繊維芽細胞上の活性を調節して、血管生成プロセスに関与する。生体内において血管生成活性のあるタンパク質因子のリストは線維芽細胞成長因子、アンギオゲニン（Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）、アンギオポイエチン（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）−１、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＮＰＹ、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ−アルファ、ＴＧＦ−ベータ、ＰＤ−ＥＣＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ、ＩＬ８、及び成長ホルモンを含む。近年のサイトカイン阻害剤に関するリスクは深刻な感染、アナフィラキシー、及びループス様症状を含む。更に、薬剤の使用を停止した後に、臨床的利益が損なわれることが観察され、患者の一部がこの生物学的因子（生物製剤）に対する抗体を生産する。この事は、繰返し使用すると効果が限定されるという危険性がある。

生体内及び生体外において、合成及び天然のプロテアーゼインヒビターは腫瘍形成を抑制することが証明されている。従来の研究調査は、セリンプロテアーゼインヒビター又はＳＥＲＰＩＮＳとして分類されている、構造的に関連のあるファミリーに属する特定のプロテアーゼインヒビターが好中球エラスターゼだけでなく、トリプシン、カセプシンＧ（ｃａｔｈｅｐｓｉｎＧ）、トロンビン、組織カリクレインを含む幾つかのプロテアーゼを抑制することが知られている。このＳＥＲＰＩＮＳは生体外の腫瘍誘発性形質転換及び動物モデルにおける腫瘍形成の回避／抑制非常に効果的である。精製されたプロテアーゼインヒビターの全身系の供給は関節炎並びに軟骨及び骨破壊を減少させる。

プロテアーゼインヒビターの局所的投与は、数箇所に存在する又は全身の大部分にあるアトピー性皮膚炎及び通常の皮膚炎のような症状に用いられている。プロテアーゼインヒビターの脱色活性及びそれらの紫外線誘発色素沈着の阻害能力は生体外及び生体内で研究されている。Ｐａｉｎｅｅｔａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅＤｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ１１６：５８７−５９５［２００１］参照。プロテアーゼインヒビターは外傷治癒に有効であることも発見されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｄａｉｌｙ．ｃｏｍ／ｒｅｌｅａｓｅｓ／２０００／１０／００１００２０７１７１８．ｈｔｍ）。分泌白血球プロテアーゼインヒビターは局所的に用いた場合組織崩壊を回復し、治癒プロセスを促進することが証明された。更に、セリンプロテアーゼインヒビターは紅斑性狼瘡患者の痛みを軽減することができる（ＵＳＰａｔｅｎｔＮｏ．６５３７９６８参照）。

天然のプロテアーゼインヒビターは穀粒穀物（オーツ、オオムギ、及びマイズ）、芽キャベツ、タマネギ、カブ、コムギ、シコクビエ、及びピーナツ等の各種食品に存在する。興味深い源の１つにダイズがある。ダイズにおける平均レベルは、最も重要なプロテアーゼインヒビターであるクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）及びボウマンブリックについて、それぞれ約１．４パーセント及び約０．６パーセントである。このように天然のプロテアーゼインヒビターは存在レベルが低いので、医薬品に用いるために単離することが実際的ではない。

従って、タンパク質治療にふさわしい性質を有するプロテアーゼインヒビターを大量に生産する方法及び使用可能な形態でプロテアーゼインヒビターを効果的に供給することができる組成物に対する必要性が存在する。

本発明の組成物及び方法は前述の必要性を満たし、特に病原性及び非病原性を含むサイトカインの活性を特に標的とするプロテアーゼインヒビターを提供することにおいて、有利である。

本発明は修飾変異ボウマン・ブリック・プロテアーゼインヒビタータンパク質（ＢＢＰＩ）に関する。このタンパク質は標的タンパク質に結合するペプチドを含み、未修飾ＢＢＰＩよりも大きなプロテアーゼインヒビター活性を有し及び／又はより多く生産される。本発明はこの修飾変異体ＢＢＰＩをコードするポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド構築体及び発現ベクター、修飾変異ＢＢＰＩを発現及び生成する形質転換宿主細胞、修飾変異ＢＢＰＩタンパク質、修飾変異ＢＢＰＩタンパク質を含む組成物、修飾変異ＢＢＰＩタンパク質を製造する方法及びパーソナルケアにおいて用いる方法を含む。

１つの態様において、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７で示す変異ＢＢＰＩの１、４、５、１１、１３、１８、２５、２７、２９、３１、３８、４０、５０、５２、５５、及び６５の位置に等しい位置から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置での置換アミノ酸を含む。このＢＢＰＩ骨格の第二プロテアーゼ抑制ループは結合ペプチドである。１つの態様において、ＢＢＰＩ骨格は骨格ＢＢＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）、ＢＢＩｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８５）、ＢＢＩ−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８６）、ＢＢＩｔ−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７）、ＢＢＩｔ−ＶＥＧＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４０）、ＢＢＩｔ−ＶＥＧＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４１）、ＢＢＩｔ−ＶＥＧＫＤ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４２）、ＢＢｄｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４４９）、ＢＢｓｂ３（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５０）、ＢＢｔｃ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５１）、ＢＢｄｂ−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５２）、ＢＢｓｂ３−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５３）及びＢＢｔｃ−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５４）から選択される。他の態様において、この結合ペプチドはＶＥＧＦ結合ペプチド、ＦＧＦ−５結合ペプチド、ＴＧＦβ結合ペプチド、及びＴＮＦ結合ペプチドから選択される。ＶＥＧＦ結合ペプチドはＡＣＹＮＬＹＧＷＴＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：９）、ＫＹＹＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５８）、ＴＬＷＫＳＹＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５９）、ＤＬＹＷＷ、（ＳＥＱＩＤＮＯ：４６０）、ＳＫＨＳＱＩＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４６８）、ＫＴＮＰＳＧＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４６９）、ＲＰＴＧＨＳＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４７０）、ＫＨＳＡＫＡＥ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４７１）、ＫＰＳＳＡＳＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４７２）、ＰＶＴＫＲＶＨ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４７３）、ＴＬＨＷＷＶＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９２）、ＰＹＫＡＳＦＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９３）、ＰＬＲＴＳＨＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９４）、ＥＡＴＰＲＯＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９５）、ＮＰＬＨＴＬＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９６）、ＫＨＥＲＩＷＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９７）、ＡＴＮＰＰＰＭ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９８）、ＳＴＴＳＰＮＭ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９９）、ＡＤＲＳＦＲＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５００）、ＰＫＡＤＳＫＱ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０１）、ＰＮＱＳＨＬＨ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０２）、ＳＧＳＥＴＷＭ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０３）、ＡＬＳＡＰＹＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０４）、ＫＭＰＴＳＫＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０５）、ＩＴＰＫＲＰＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０６）、ＫＷＩＶＳＥＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０７）、ＰＮＡＮＡＰＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０８）、ＮＶＱＳＬＰＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０９）、ＴＬＷＰＴＦＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１０）、ＮＬＷＰＨＦＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１１）、ＳＬＷＰＡＦＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１２）、ＳＬＷＰＨＦＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１３）、ＡＰＷＮＳＨＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１４）、ＡＰＷＮＬＨＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１５）、ＬＰＳＷＨＬＲ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１６）、ＰＴＩＬＥＷＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１７）、ＴＬＹＰＱＦＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１８）、ＨＬＡＰＳＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１９）、ＫＹＹＬＳＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２０）、ＷＹＴＬＹＫＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２１）、ＴＹＲＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２２）、ＲＹＳＬＹＹＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２３）、ＹＹＬＹＹＷＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２４）、ＮＹＱＬＹＧＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２５）、ＴＫＷＰＳＹＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２２６）、ＴＬＷＫＳＹＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２７）、ＰＬＷＰＳＹＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２８）、ＲＬＷＰＳＹＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２９）、ＴＬＷＰＫＹＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３０）、ＫＹＤＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ；５３１）、ＲＹＤＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３２）、ＤＹＲＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３３）、ＤＹＫＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３４）、ＥＹＫＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３５）、及びＲＹＰＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３６）から選択される。ＦＧＦ−５−結合ペプチドはＣＡＣＲＴＱＰＹＰＬＣＦ（ＭＭ００７；ＳＥＱＩＤＮＯ：４３０）、ＣＩＣＴＷＩＤＳＴＰＣ（ＰＳ２；ＳＥＱＩＤＮＯ：４３１）、ＣＹＧＬＰＦＴＲＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３７）、ＣＥＥＩＷＴＭＬＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３８）、ＣＷＡＬＴＶＫＴＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３９）、ＣＬＴＶＬＷＴＴＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４０）、ＣＴＬＷＮＲＳＰＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４１）、ＣＨＹＬＬＴＮＹＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４２）、ＣＲＩＨＬＡＨＫＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４３）、ＴＮＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４４）、ＨＬＱＴＴＥＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４５）、ＳＬＮＮＬＴＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４６）、ＴＮＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４７）、ＴＮＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４８）、ＬＲＩＬＡＮＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４９）、ＬＬＴＰＴＬＮ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５０）、ＡＬＰＴＨＳＮ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５１）、ＴＮＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５２）、ＬＣＲＲＦＥＮ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５３）、ＴＮＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５４）、ＴＮＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５５）、ＨＬＱＴＴＥＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５６）、ＰＬＧＬＣＰＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５７）、ＧＹＦＩＰＳＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５８）、ＴＫＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５９）、ＨＬＱＴＴＥＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６０）、ＷＮＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６１）、ＴＷＩＤＷＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６２）、ＲＴＱＰＹＰＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６７０）、及びＴＷＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６７１）から選択される。ＴＧＦβ結合ペプチドはＣＬＣＰＥＮＩＮＶＬＰＣＮ（ＰＥＮ３；ＳＥＱＩＤＮＯ：４３６）、ＣＩＣＫＨＮＶＤＷＬＣＦ（ＭＭＯ２１Ｗ；ＳＥＱＩＤＮＯ：４３７）、ＣＩＣＷＴＱＨＩＨＮＣＦ（ＷＴＱ；ＳＥＱＩＤＮＯ：４３８）、ＣＶＴＴＤＷＩＥＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６３）、ＣＹＹＳＱＦＨＱＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６４）、ＣＰＴＬＷＴＨＭＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６５）、ＱＳＡＣＩＶＹＹＶＧＲＫＰＫＶＥＣＡＳＳＤ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６６）、ＱＳＡＣＩＬＹＹＩＧＫＴＰＫＩＥＣＡＳＳＤ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６７）、ＱＳＡＣＩＬＹＹＶＧＲＴＰＫＶＥＣＡＳＳＤ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６８）、ａｃｅｔｙｌ−ＬＣＰＥＮＤＮＶＳＰＣＹ−ｃｏｈｎ２（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６９）、ＫＨＮＶＲＬＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７０）、ＮＤＴＰＳＹＦ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７１）、ＡＫＬＹＡＧＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７２）、ＲＧＰＡＨＳＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７３）、ＮＳＬＡＥＲＲ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７４）、ＨＰＬＡＳＰＨ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７５）、ＱＰＷＮＫＬＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７６）、ＡＷＬｒ／Ｍｉｐｙ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７７）、ＰＴＫＰＡＱＱ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７８）、ＰＳＬＮＲＰＱ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７９）、ＨＨＡＲＱＥＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８０）、ＲＨＨＴＰＧＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８１）、ＡＳＡＩＮＰＨ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８２）、ＣＨＧＹＤＲＡＰＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４４）、ＣＦＡＰＡＤＱＡＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４５）、ＣＩＰＳＲＦＩＴＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４６）、ＣＨＧＨＴＫＬＡＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４７）、ＣＮＧＫＳＫＬＡＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４８）、ＰＥＮＩＮＶＬＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ；６７２）、ＫＨＮＶＤＷＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６７３）及びＷＴＱＨＩＨＮＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６７４）から選択される。ＴＮＦα結合ペプチドはＲＹＷＱＤＩＰ（Ｔ１；ＳＥＱＩＤＮＯ：４７４）、ＡＰＥＰＩＬＡ（Ｔ２；ＳＥＱＩＤＮＯ：４７５）、ＤＭＩＭＶＳＩ（Ｔ３；ＳＥＱＩＤＮＯ：４７６）、ＷＴＰＫＰＴＱ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８３）、ＡＴＦＰＮＱＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８４）、ＡＳＴＶＧＧＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８５）、ＴＭＬＰＹＲＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８６）、ＡＷＨＳＰＳＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８７）、ＴＱＳＦＳＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８８）、ＴＨＫＮＴＬＲ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８９）、ＧＱＴＨＦＨＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５９０）、ＬＰＩＬＴＱＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５９１）、ＳＩＬＰＶＳＨ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５９２）、ＳＱＰＩＰＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５９３）、及びＱＰＬＲＫＬＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５９４）から選択される。

１つの態様において、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の変異ＢＢＰＩの１、４、５、１１、１３、１８、２５、２７、２９、３１、３８、４０、５０、５２、５５、及び６５に等しい位置から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置での置換アミノ酸を含む修飾変異ボウマンブリックプロテアーゼインヒビター（ＢＢＰＩ）を提供する。このＢＢＰＩの第二プロテアーゼ抑制ループは結合ペプチドである。幾つかの態様において、１位で置換されたアミノ酸は１Ａ及び１Ｃから選択される。他の態様において、４位で置換されたアミノ酸は４Ｖである。他の態様において、５位で置換されたアミノ酸はＰ及びＡから選択される。他の態様において、１３位で置換されたアミノ酸は１３Ｙ、１３Ｉ、１３Ｆ、１３Ｍ、１３Ｌ、１３Ｖ、１３Ｋ，及び１３Ｒから選択される。他の態様において、１８位で置換されたアミノ酸は１８Ｉ、１８Ｖ、及び１８Ｌから選択される。他の態様において、２５位で置換されたアミノ酸は２５Ｋ、２５Ｎ、２５Ｗ、２５Ｉ、２５Ａ、及び２５Ｒから選択される。他の態様において、２７位で置換されたアミノ酸は２７Ｈ、２７Ｋ、２７Ｖ、２７Ａ、及び２７Ｑから選択される。他の態様において、２９位で置換されたアミノ酸は２９Ｒ、２９Ｋ、及び２９Ｐから選択される。他の態様において、３１位で置換されたアミノ酸は３１Ｑ、３１Ｈ、３１Ｅ、３１Ａ、３１Ｒ、３１Ｗ、３１Ｋ及び３１Ｔから選択される。他の態様において、３８位で置換されたアミノ酸は３８Ｎ、３８Ｋ、及び３８Ｒから選択される。他の態様において、４０位で置換されたアミノ酸は４０Ｈ、４０Ｋ、４０Ｑ、４０Ｒ、及び４０Ｙから選択される。他の態様において、５０位で置換されたアミノ酸は５０Ｑ、５０Ｋ、５０Ｔ、５０Ｖ、５０Ｍ、及び５０Ｓから選択される。他の態様において、５２位で置換されたアミノ酸は５２Ｋ、５２Ｔ、５２Ｒ、５２Ｑ、５２Ｌ、５２Ｈ、５２Ａ、５２Ｍ、５２Ｓ、及び５２Ｅから選択される。他の態様において、５５位で置換されたアミノ酸は５５Ｍである。他の態様において、６５位で置換されたアミノ酸は６５Ｅ、６５Ｑ、及び６５Ｄから選択される。

他の態様において、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：３８９の挿入並びにＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の変異ＢＢＰＩの１、４、５、１１、１３、１８、２５、２７、２９、３１、３８、４０、５０、５２、５５、及び６５に等しい位置から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置での置換アミノ酸を含む、単離された修飾変異ボウマンブリックプロテアーゼインヒビター（ＢＢＰＩ）を提供する。このＢＢＰＩ骨格の第二プロテアーゼ抑制ループは結合ペプチドである。

幾つかの態様において、前述の修飾変異ＢＢＰＩのいずれか１つはセルラーゼ、クチナーゼ、及びジスルフィドイソメラーゼから選択される触媒ドメインを含む、融合タンパク質として発現される。代替的な態様において、この修飾変異ＢＢＰＩはＳＥＱＩＤＮＯ：１９５の融合タンパク質をして発現される。

幾つかの態様において、本発明の修飾変異ＢＢＰＩは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の変異ＢＢＰＩの１、４、５、１１、１３、１８、２５、２７、２９、３１、３８、４０、５０、５２、５５、及び６５に等しい位置から選択されるアミノ酸置換を、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、及び少なくとも８つ含む。幾つかの態様において、この修飾変異ＢＢＰＩはＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の５０及び５２位に等しいアミノ酸位置において少なくとも２つのアミノ酸置換の組み合わせを含む。５０及び５２位での２つのアミノ酸置換の組み合わせを含む修飾変異ＢＢＰＩの例としては、ＳＥＱＩＤＮＯ：５９５の修飾変異ＢＢＰＩがある。他の態様において、この修飾変異ＢＢＰＩはＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の２５、２９、４０、５０、及び５２位に等しい位置において少なくとも２つのアミノ酸置換の組み合わせを含む。幾つかの態様において、少なくとも３つのアミノ酸の組み合わせは２５Ｌ−５０Ｔ−５２Ａ、２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａから選択される。２５、２９、４０、５０、及び５２位から選択される３つのアミノ酸置換を含む修飾変異ＢＢＰＩの例としては、ＳＥＱＩＤＮＯＳ：６０３、６０７、及び６０９の修飾変異ＢＢＰＩがある。他の態様において、少なくとも４つのアミノ酸置換の組み合わせを含む修飾変異ＢＢＰＩはＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１３、２９、５０、及び５２に等しい位置で置換されたアミノ酸から選択される。幾つかの態様において、少なくとも４つのアミノ酸の組み合わせは１３Ｉ−２５Ｌ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−Ａ０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、２５Ｌ−２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、２５Ｌ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、及び２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａから選択される。４つのアミノ酸置換の組み合わせを含む修飾変異ＢＢＰＩの例としては、ＳＥＱＩＤＮＯＳ：５９６、６００、６０２、６０４、６０６、６０８、及び６４の修飾変異ＢＢＰＩがある。他の態様において、少なくとも５つのアミノ酸置換の組み合わせを含む修飾変異ＢＢＰＩはＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１３、２５、２９、４０、５０、及び５２に等しい位置におけるアミノ酸置換から選択される。幾つかの態様において、少なくとも５つの組み合わせは１３Ｉ−２５Ｌ−２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｌ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、Ａ１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、２５Ｌ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｋ−５２Ａ，及び１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ｔから選択される。１３、２５、２９、４０、５０、及び５２位から選択される５つのアミノ酸置換の組み合わせを含む修飾変異ＢＢＰＩの例としては、ＳＥＱＩＤＮＯＳ：４３２、４３４、４４３、４４５、４４６、５９７、５９９、６０１、６０５、６１５、６２０、６２４、及び６２５の修飾変異ＢＢＰＩがある。他の態様において、この修飾変異ＢＢＰＩはＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１、４、５、１１、１３、２５、２９、４０、５０、及び５２位に等しい位置におけるアミノ酸置換から選択される少なくとも６つのアミノ酸置換の組み合わせを含む。幾つかの態様において、少なくとも６つのアミノ酸置換の組み合わせは１３Ｉ−２５Ｌ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１Ｃ−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、４Ｖ−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、５Ｐ−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１１Ｇ−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｒ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２７Ｒ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−３１Ａ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−３１Ｒ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−３８Ｎ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、及び１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ−６５Ｅから選択される。１、４、５、１１、１３、２５、２９、４０、５０、及び５２位から選択される６つのアミノ酸置換の組み合わせを含む修飾変異ＢＢＰＩの例としては、ＳＥＱＩＤＮＯＳ：５９８、６１１、６１２、６１３、６１４、６１６、６１９、６２１、６２２、６２３、及び６２６の修飾変異ＢＢＰＩがある。他の態様において、修飾変異ＢＢＰＩはＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１３、２５、２９、３１、４０、５０、及び５２位に等しい位置から選択されるアミノ酸において少なくとも７つのアミノ酸置換を含む。幾つかの態様において、少なくとも７つのアミノ酸の組み合わせは１３Ｌ−２５Ｒ−２９Ｐ−３１Ａ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｌ−２５Ｒ−２９Ｐ−３１Ｒ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、及び１３Ｉ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔから選択される。１３、２５、２９、３１、４０、５０、及び５２位から選択される７つのアミノ酸置換の組み合わせを含む修飾変異ＢＢＰＩの例としては、ＳＥＱＩＤＮＯＳ：４９１、６１７、６１８、及び６３２−６３９の修飾変異ＢＢＰＩがある。更なる態様において、８つのアミノ酸置換の組み合わせを含む修飾変異ＢＢＰＩはＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１３、２５、２７、３１、４０、５０、及び５２位に等しい位置でのアミノ酸置換から選択される。幾つかの態様において、８つのアミノ酸の組み合わせは３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ａ−２９Ｒ−３１Ｅ−４０Ｋ−５０Ｑ−５２Ｑ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ｒ−２９Ｅ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｒ−５２Ｋ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ａ−２９Ｒ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｒ−５２Ｌ、及び１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ｑ−２９Ｐ−３１Ｅ−４０Ｈ−５０Ｒ−５２Ｑから選択される。１３、２５、２７、２９、３１、４０、５０、及び５２位から選択される８つのアミノ酸置換の組み合わせを含む修飾変異ＢＢＰＩの例としては、ＳＥＱＩＤＮＯＳ：６２７−６３１の修飾変異ＢＢＰＩがある。

幾つかの態様において、本発明はＶＥＧＦ（ＶＥＧＦ−ＢＢＰＩ）に結合する単離及び修飾変異ボウマンブリックプロテアーゼインヒビター（ＢＢＰＩ）を提供する。ＶＥＧＦ−ＢＢＰＩはＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の変異ＢＢＰＩの１、４、５、１１、１３、１８、２５、２７、２９、３１、３８、４０、５０、５２、５５、及び６５に等しい位置から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置でのアミノ酸置換を含み、第二プロテアーゼ抑制ループを置き換えるＶＥＧＦ−結合ペプチドを含む。幾つかの態様において、このＶＥＧＦ−結合ペプチドはＳＥＱＤＩＮＯＳ：９、４５８、４５９、６０、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、及び４７３から選択される。幾つかの態様において、このＶＥＧＦ−ＢＢＰＩはＳＥＱＤＩＮＯＳ：６０１、６０２、６２７、６２８、６３０、６３１、６４３、４９１、６３２、６３３、６３４、６３５、及び６３６から選択されるポリペプチド配列を有する。

幾つかの態様において、本発明の単離された修飾変異ＢＢＰＩは対応している未修飾の前駆体変異ＢＢＰＩよりもより高いトリプシン抑制活性を有する。他の態様において、この単離及び修飾変異ＢＢＰＩは対応している未修飾の前駆体変異ＢＢＰＩよりもより高いトリプシン抑制活性及び生産性を有する。

幾つかの態様において、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の単離された修飾変異ボウマンブリックプロテアーゼインヒビター（ＢｏｗｍａｎＢｉｒｋＰｒｏｔｅａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ）（ＢＢＰＩ）を提供し、前記ＢＢＰＩは更にＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１３、２５、２７、２９、３１、４０、５０、及び５２に等しい位置から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置においてアミノ酸置換を含む。このＶＥＧＦ−結合ペプチドはＦＧＦ−５、ＴＧＦβ、及びＴＮＦαから選択される標的タンパク質に結合する変異ペプチドで置き換えられる。

幾つかの態様において、ＶＥＧＦ−結合ペプチドはＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の変異ＢＢＰＩに含まれており、ＳＥＱＤＩＮＯＳ：４３０、４３１、６７０、及び６７１から選択される配列を有するＦＧＦ−結合ペプチドで置き換えられる。他の態様において、このＶＥＧＦ−結合ペプチドはＳＥＱＤＩＮＯＳ：４３６、４３７、４３８、６７２、６７３、及び６７４から選択されるＴＧＦβ結合ペプチドで置き換えられる。更なる態様において、ＶＥＧＦ−結合ペプチドはＳＥＱＤＩＮＯＳ：４７４、４７５、及び４７６から選択されるＴＮＦα結合ペプチドで置換される。

本発明は対応する未修飾前駆体ＢＢＰＩよりも高いトリプシン抑制活性及び生産性を有するＶＥＧＦ−、ＦＧＦ５−、ＴＧＦβ−、又はＴＮＦα−結合ペプチドを含む修飾変異ＢＢＰＩを含む。幾つかの態様において、この修飾変異ＢＢＰＩはＧＦ５−、ＴＧＦβ−、又はＴＮＦα−結合ペプチドを含み、ＳＥＱＩＤＮＯＳ：４３２、４３４、４４３、４４５、４４７、６３７、６３８、又は６３９の修飾変異ＢＢＰＩから選択される。

他の態様において、本発明はＢＢＰＩ融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。このＢＢＰＩ融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチドは酵素の触媒単位をコードしている第一ポリヌクレオチド配列並びに修飾変異ＢＢＰＩ、例えば、ＶＥＧＦ結合ＢＢＰＩ（ＶＥＧＦ−ＢＢＰＩ）、ＦＧＦ結合ＢＢＰＩ（ＦＧＦ−ＢＢＰＩ）、ＴＧＦ結合ＢＢＰＩ（ＴＧＦ−ＢＢＰＩ）、又はＴＮＦ結合ＢＢＰＩ（ＴＮＦ−ＢＢＰＩ）をコードしている第二ポリヌクレオチド配列を含む。他の態様において、この第一ポリヌヌクレオチド配列はセルラーゼの触媒単位をコードしている。

他の態様において、本発明はバクテリア細胞内で修飾変異ＢＢＰＩに関する方法を提供する。該方法は変異ＢＢＰＩをコードしているポリヌクレオチドを変異させて、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の変異ＢＢＰＩの１、４、５、１１、１３、１８、２５、２７、２９、３１、３８、４０、５０、５２、５５、及び６５に等しい位置から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む修飾変異ＢＢＰＩをコードするポリヌクレオチド構築体を生成する工程、バクテリア宿主細胞に前記ポリヌクレオチド構築体を導入する工程、前記バクテリア細胞を好適な条件下で培養して、異種ＤＮＡ配列を発現させる工程、及び対応する未修飾変異ＢＢＰＩよりも高いトリプシン抑制活性を有する修飾変異ＢＢＰＩを生成する工程を含む。幾つかの態様において、本発明の方法は発現された修飾変異ＢＢＰＩを回収する工程を更に含む。他の態様において、本発明の方法はこの修飾変異ＢＢＰＩを活性化する工程も含む。

幾つかの態様において、修飾変異ＢＢＰＩは対応する未修飾前駆体変異ＢＢＰＩよりも高いトリプシン抑制活性及び生産性を有する。未修飾前駆体変異ＢＢＰＩはＢＢＩ−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８６）、ＢＢＩｔ−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７）、ＢＢｄｂ−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５２）、ＢＢｓｂ３（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５３）、及びＢＢｔｃ−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５４）から選択される。幾つかの態様において、修飾変異ＢＢＰＩの第二プロテアーゼ抑制ループはＶＥＧＦ−結合ペプチド、ＦＧＦ−５結合ペプチド、ＴＧＦβ結合ペプチド、及びＴＮＦα結合ペプチドから選択される標的タンパク質結合ペプチドである。

本発明の方法により生成された修飾変異ＢＢＰＩは３つの置換の組み合わせ、例えば、２５Ｌ−５０Ｔ−５２Ａ、２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、４つの置換の組み合わせ、例えば、１３Ｉ−２５Ｌ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−Ａ０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、２５Ｌ−２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、２５Ｌ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、５つの置換の組み合わせ、例えば、１３Ｉ−２５Ｌ−２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｌ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、２５Ｌ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｌ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｋ−５２Ａ、及び１３Ｌ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ｔ、６つの置換の組み合わせ、例えば、１３Ｉ−２５Ｌ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１Ｃ−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、４Ｖ−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、５Ｐ−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１１Ｇ−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｒ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２７Ｒ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−３１Ａ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−３１Ｒ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−３８Ｎ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ−６５Ｅ、７つの置換の組み合わせ、例えば、１３Ｌ−２５Ｒ−２９Ｐ−３１Ａ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｌ−２５Ｒ−２９Ｐ−３１Ｒ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、並びに８つの置換の組み合わせ、例えば、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ａ−２９Ｒ−３１Ｅ−４０Ｋ−５０Ｑ−５２Ｑ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ｒ−２９Ｅ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｒ−５２Ｋ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ａ−２９Ｒ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｒ−５２Ｌ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ｑ−２９Ｐ−３１Ｅ−４０Ｈ−５０Ｒ−５２Ｑから選択される、アミノ酸置換の組み合わせを含む。

他の態様において、本発明は本発明の修飾変異ＢＢＰＩをコードしているポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する。前述のように、修飾変異ＢＢＰＩは、ボウマンブリックプロテアーゼインヒビターであり、該インヒビターの第二プロテアーゼ抑制ループは標的タンパク質に結合するペプチドで置き換えられ、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の変異ＢＢＰＩの１、４、５、１１、１３、１８、２５、２７、２９、３１、３８、４０、５０、５２、５５、及び６５位に等しい位置から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む。幾つかの態様において、本発明の修飾変異ＢＢＰＩの第二プロテアーゼ抑制ループはＶＥＧＦ−結合ペプチド、ＦＧＦ５−結合ペプチド、ＴＧＦβ−結合ペプチド、及びＴＮＦα−結合ペプチドから選択される標的タンパク質結合ペプチドである。幾つかの態様において、この変異ＢＢＰＩはＳＥＱＩＤＮＯ：１９５のポリに少なくとも８０％同一であるタンパク質として発現される。

他の態様において、本発明は本明細書で説明する、本発明のベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。幾つかの態様において、この宿主細胞は、バクテリア細胞、例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種の宿主細胞である。

１つの態様において、本発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の変異ＢＢＰＩの１、４、５、１１、１３、１８、２５、２７、２９、３１、３８、４０、５０、５２、５５、及び６５に等しい位置から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含み、このＢＢＰＩ骨格の第二プロテアーゼ抑制ループが血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）結合ペプチド、繊維芽細胞成長因子５（ＦＧＦ５）結合ペプチド、トランスフォーミンググロウスファクターβ（ＴＧＦβ）結合ペプチド、及び腫瘍エ壊死因子α（ＴＮＦα）変異ペプチドから選択される結合ペプチドである、修飾変異ボウマンブリックプロテアーゼインヒビター（ＢＢＰＩ）を含むパーソナルケア組成物を提供する。幾つかの態様において、このＢＢＰＩ骨格はＢＢＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）、ＢＢＩｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８５）、ＢＢＩ−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８６）、ＢＢＩｔ−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７）、ＢＢＩｔ−ＶＥＧＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４０）、ＢＢＩｔ−ＶＥＧＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４１）、ＢＢＩｔ−ＶＥＧＫＤ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４２）、ＢＢｄｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４４９）、ＢＢｓｂ３（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５０）、ＢＢｔｃ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５１）、ＢＢｄｂ−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５２）、ＢＢｓｂ３−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５３）、及びＢＢｔｃ−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５４）から選択される。

他の態様において、本発明の修飾変異ＢＢＰＩは以下の組み合わせから選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含む：５０Ｔ−５２Ａ、２５Ｌ−５０Ｔ−５２Ａ、２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｌ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、２５Ｌ−２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、２５Ｌ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｋ−２９Ｐ−５２Ｋ、１３Ｉ−２５Ｌ−２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｌ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、２５Ｌ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｌ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｋ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｋ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｌ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、Ｄ１Ｃ−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、Ｓ４Ｖ−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、Ｓ５Ｐ−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１１Ｇ−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｒ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２７Ｒ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−３１Ａ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−３１Ｒ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−３８Ｎ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ−６５Ｅ、１３Ｌ−２５Ｒ−２９Ｐ−３１Ａ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｌ−２５Ｒ−２９Ｐ−３１Ｒ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ａ−２９Ｒ−３１Ｅ−４０Ｋ−５０Ｑ−５２Ｑ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ｒ−２９Ｅ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｒ−５２Ｋ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ａ−２９Ｒ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｒ−５２Ｌ、及び１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ｑ−２９Ｐ−３１Ｅ−４０Ｈ−５０Ｒ−５２Ｑ。

他の態様において、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の変異ＢＢＰＩの１、４、５、１１、１３、１８、２５、２７、２９、３１、３８、４０、５０、５２、５５、及び６５に等しい位置から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含み、このＢＢＰＩの骨格の第二プロテアーゼ抑制ループが、ＡＣＹＮＬＹＧＷＴＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：９）、ＫＹＹＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５８）、ＴＬＷＫＳＹＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５９）、ＤＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４６０）、ＳＫＨＳＱＩＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４６８）、ＫＴＮＰＳＧＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４６９）、ＲＰＴＧＨＳＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４７０）、ＫＨＳＡＫＡＥ、（ＳＥＱＩＤＮＯ：４７１）、ＫＰＳＳＡＳＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４７２）、ＰＶＴＫＲＶＨ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４７３）、ＴＬＨＷＷＶＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９２）、ＰＹＫＡＳＦＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９３）、ＰＬＲＴＳＨＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９４）、ＥＡＴＰＲＯＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９５）、ＮＰＬＨＴＬＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９６）、ＫＨＥＲＩＷＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９７）、ＡＴＮＰＰＰＭ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９８）、ＳＴＴＳＰＮＭ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９９）、ＡＤＲＳＦＲＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５００）、ＰＫＡＤＳＫＱ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０１）、ＰＮＱＳＨＬＨ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０２）、ＳＧＳＥＴＷＭ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０３）、ＡＬＳＡＰＹＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０４）、ＫＭＰＴＳＫＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０５）、ＩＴＰＫＲＰＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０６）、ＫＷＩＶＳＥＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０７）、ＰＮＡＮＡＰＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０８）、ＮＶＱＳＬＰＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０９）、ＴＬＷＰＴＦＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１０）、ＮＬＷＰＨＦＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１１）、ＳＬＷＰＡＦＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１２）、ＳＬＷＰＨＦＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１３）、ＡＰＷＮＳＨＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１４）、ＡＰＷＮＬＨＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１５）、ＬＰＳＷＨＬＲ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１６）、ＰＴＩＬＥＷＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１７）、ＴＬＹＰＱＦＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１８）、ＨＬＡＰＳＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１９）、ＫＹＹＬＳＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２０）、ＷＹＴＬＹＫＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２１）、ＴＹＲＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２２）、ＲＹＳＬＹＹＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２３）、ＹＹＬＹＹＷＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２４）、ＮＹＱＬＹＧＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２５）、ＴＫＷＰＳＹＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２２６）、ＴＬＷＫＳＹＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２７）、ＰＬＷＰＳＹＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２８）、ＲＬＷＰＳＹＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２９）、ＴＬＷＰＫＹＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３０）、ＫＹＤＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ；５３１）、ＲＹＤＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３２）、ＤＹＲＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３３）、ＤＹＫＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３４）、ＥＹＫＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３５）、及びＲＹＰＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３６）から選択されるＶＥＧＦ−結合ペプチドである、修飾変異ボウマンブリックプロテアーゼインヒビター（ＢＢＰＩ）を含むパーソナルケア組成物を提供する。

他の態様において、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の変異ＢＢＰＩの１、４、５、１１、１３、１８、２５、２７、２９、３１、３８、４０、５０、５２、５５、及び６５に等しい位置から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含み、このＢＢＰＩの骨格の第二プロテアーゼ抑制ループが、ＣＡＣＲＴＱＰＹＰＬＣＦ（ＭＭ００７；ＳＥＱＩＤＮＯ：４３０）、ＣＩＣＴＷＩＤＳＴＰＣ（ＰＳ２；ＳＥＱＩＤＮＯ：４３１）、ＣＹＧＬＰＦＴＲＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３７）、ＣＥＥＩＷＴＭＬＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３８）、ＣＷＡＬＴＶＫＴＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３９）、ＣＬＴＶＬＷＴＴＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４０）、ＣＴＬＷＮＲＳＰＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４１）、ＣＨＹＬＬＴＮＹＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４２）、ＣＲＩＨＬＡＨＫＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４３）、ＴＮＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４４）、ＨＬＱＴＴＥＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４５）、ＳＬＮＮＬＴＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４６）、ＴＮＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４７）、ＴＮＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４８）、ＬＲＩＬＡＮＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４９）、ＬＬＴＰＴＬＮ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５０）、ＡＬＰＴＨＳＮ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５１）、ＴＮＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５２）、ＬＣＲＲＦＥＮ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５３）、ＴＮＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５４）、ＴＮＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５５）、ＨＬＱＴＴＥＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５６）、ＰＬＧＬＣＰＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５７）、ＧＹＦＩＰＳＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５８）、ＴＫＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５９）、ＨＬＱＴＴＥＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６０）、ＷＮＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６１）、ＴＷＩＤＷＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６２）、ＲＴＱＰＹＰＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６７０）、及びＴＷＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６７１）から選択されるＦＧＦ−結合ペプチドである、修飾変異ボウマンブリックプロテアーゼインヒビター（ＢＢＰＩ）を含むパーソナルケア組成物を提供する。

他の態様において、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の変異ＢＢＰＩの１、４、５、１１、１３、１８、２５、２７、２９、３１、３８、４０、５０、５２、５５、及び６５に等しい位置から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含み、このＢＢＰＩの骨格の第二プロテアーゼ抑制ループが、ＣＬＣＰＥＮＩＮＶＬＰＣＮ（ＰＥＮ３；ＳＥＱＩＤＮＯ：４３６）、ＣＩＣＫＨＮＶＤＷＬＣＦ（ＭＭＯ２１Ｗ；ＳＥＱＩＤＮＯ：４３７）、ＣＩＣＷＴＱＨＩＨＮＣＦ（ＷＴＱ；ＳＥＱＩＤＮＯ：４３８）、ＣＶＴＴＤＷＩＥＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６３）、ＣＹＹＳＱＦＨＱＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６４）、ＣＰＴＬＷＴＨＭＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６５）、ＱＳＡＣＩＶＹＹＶＧＲＫＰＫＶＥＣＡＳＳＤ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６６）、ＱＳＡＣＩＬＹＹＩＧＫＴＰＫＩＥＣＡＳＳＤ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６７）、ＱＳＡＣＩＬＹＹＶＧＲＴＰＫＶＥＣＡＳＳＤ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６８）、ａｃｅｔｙｌ−ＬＣＰＥＮＤＮＶＳＰＣＹ−ｃｏｈｎ２（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６９）、ＫＨＮＶＲＬＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７０）、ＮＤＴＰＳＹＦ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７１）、ＡＫＬＹＡＧＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７２）、ＲＧＰＡＨＳＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７３）、ＮＳＬＡＥＲＲ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７４）、ＨＰＬＡＳＰＨ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７５）、ＱＰＷＮＫＬＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７６）、ＡＷＬｒ／Ｍｉｐｙ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７７）、ＰＴＫＰＡＱＱ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７８）、ＰＳＬＮＲＰＱ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７９）、ＨＨＡＲＱＥＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８０）、ＲＨＨＴＰＧＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８１）、ＡＳＡＩＮＰＨ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８２）、ＣＨＧＹＤＲＡＰＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４４）、ＣＦＡＰＡＤＱＡＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４５）、ＣＩＰＳＲＦＩＴＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４６）、ＣＨＧＨＴＫＬＡＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４７）、ＣＮＧＫＳＫＬＡＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４８）、ＰＥＮＩＮＶＬＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ；６７２）、ＫＨＮＶＤＷＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６７３）、及びＷＴＱＨＩＨＮＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６７４）から選択されるＴＧＦ−結合ペプチドである、修飾変異ボウマンブリックプロテアーゼインヒビター（ＢＢＰＩ）を含むパーソナルケア組成物を提供する。

他の態様において、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の変異ＢＢＰＩの１、４、５、１１、１３、１８、２５、２７、２９、３１、３８、４０、５０、５２、５５、及び６５に等しい位置から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含み、このＢＢＰＩの骨格の第二プロテアーゼ抑制ループが、ＲＹＷＱＤＩＰ（Ｔ１；ＳＥＱＩＤＮＯ：４７４）、ＡＰＥＰＩＬＡ（Ｔ２；ＳＥＱＩＤＮＯ：４７５）、ＤＭＩＭＶＳＩ（Ｔ３；ＳＥＱＩＤＮＯ：４７６）、ＷＴＰＫＰＴＱ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８３）、ＡＴＦＰＮＱＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８４）、ＡＳＴＶＧＧＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８５）、ＴＭＬＰＹＲＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８６）、ＡＷＨＳＰＳＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８７）、ＴＱＳＦＳＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８８）、ＴＨＫＮＴＬＲ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８９）、ＧＱＴＨＦＨＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５９０）、ＬＰＩＬＴＱＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５９１）、ＳＩＬＰＶＳＨ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５９２）、ＳＱＰＩＰＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５９３）、及びＱＰＬＲＫＬＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５９４）から選択されるＴＮＦ−結合ペプチドである、修飾変異ボウマンブリックプロテアーゼインヒビター（ＢＢＰＩ）を含むパーソナルケア組成物を提供する。

他の態様において、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の変異ＢＢＰＩの１、４、５、１１、１３、１８、２５、２７、２９、３１、３８、４０、５０、５２、５５、及び６５に等しい位置から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含み、このＢＢＰＩの骨格の第二プロテアーゼ抑制ループが、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）結合ペプチド、繊維芽細胞成長因子５（ＦＧＦ５）結合ペプチド、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）結合ペプチド、及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）変異ペプチドから選択され、組成物の重量に基づいて約０．０００１％乃至約５％の範囲で存在する、修飾変異ボウマンブリックプロテアーゼインヒビター（ＢＢＰＩ）を含むパーソナルケア組成物を提供する。幾つかの態様において、本発明のパーソナルケア組成物に含まれる修飾変異体ＢＢＰＩはこのＢＢＰＩの対応する未修飾前駆体変異体よりも高いトリプシン抑制活性を有し、生産性も高い。

他の態様において、他の態様において、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の変異ＢＢＰＩの１、４、５、１１、１３、１８、２５、２７、２９、３１、３８、４０、５０、５２、５５、及び６５に等しい位置から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含み、このＢＢＰＩの骨格の第二プロテアーゼ抑制ループが、ＳＥＱＩＤＮＯＳ：９、４５８、４５９、４６０、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、及び４７３から選択されるＶＥＧＦ−結合ペプチドである、修飾変異ボウマンブリックプロテアーゼインヒビター（ＢＢＰＩ）を含むパーソナルケア組成物を提供する。幾つかの態様において、幾つかの態様において、修飾変異ＢＢＰＩの骨格はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７のＢＢＩｔ−ＡＶである。他の態様において、本発明のパーソナルケア組成物に含まれる修飾変異ＢＢＰＩは３Ｉ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｋ−２９Ｐ−５２Ｋ、１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ａ−２９Ｒ−３１Ｅ−４０Ｋ−５０Ｑ−５２Ｑ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ａ−２９Ｒ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｒ−５２Ｌから選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含む。幾つかの態様において、このパーソナルケア組成物はＳＥＱＩＤＮＯＳ：６０１、６０２、６２７、６２８、６３０、６３１、６４３、４９１、６３２、６３３、６３４、６３５、及び６３６から選択されるＶＥＧＦ−結合ＢＢＰＩ（ＶＥＧＦ−ＢＢＰＩ）を含む。幾つかの態様において、このパーソナルケア組成物は、スキンクリーム、ローション、スプレー、乳液、コロイド懸濁液、泡、エアロゾル、液体、ゲル、セラ、及び固形物から選択されるスキンケア組成物である。他の態様において、このスキンケア組成物は、保湿性ボディーウォッシュ、ボディーウォッシュ、抗菌性洗剤、スキン保護クリーム、ボディーローション、顔用クリーム、保湿クリーム、顔用クレンジング乳液、顔用ゲル、顔用美容液、界面活性剤ベース洗顔剤、顔用ピーリングゲル、抗ニキビトリートメント、顔用化粧水、ピーリングクリーム、顔用マスク、アフターシェービングローション、プレシェーブローション、日焼け用組成物、サンスクリーン、脱毛剤、発毛抑制剤、及び放射線保護剤を含む。通常、放射線保護剤は水耐性のないサンスクリーン、水耐性の高いサンスクリーン、及びシリコン中水サンスクリーンから選択されるサンスクリーンである。このスキンケア組成物は任意で局所的に適用する市販組成物、抗菌治療、抗ニキビ処理、皮膚保護剤、サンスクリーン、デオドラント、及び発汗抑制剤を任意で含む。幾つかの態様において、本発明の化粧組成物は少なくとも１つの顔料を含む。そのような化粧組成物は圧縮された粉末製剤及びファンデーションを含む。化粧下地組成物は油中水ファンデーション、シリコン中水ファンデーション、水中オイルファンデーション、無水メイクアップスティック、及びクリーム乃至粉末ファンデーションから選択することができる。

他の態様において、本発明は血管形成性皮膚病を治療するためのスキンケア組成物を提供する。このスキンケア組成物はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の変異ＢＢＩの１、４、５、１１、１３、１８、２５、２７、２９、３１、３８、４０、５０、５２、５５、及び６５に等しい位置から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含むボウマンブリックプロテアーゼインヒビター（ＢＢＰＩ）を含み、このＢＢＰＩの骨格の第二プロテアーゼ抑制ループはＳＥＱＩＤＮＯＳ：９、４５８、４５９、４６０、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、及び４７３から選択されるＶＥＧＦ−結合ペプチドである。

他の態様において、このパーソナルケア組成物は、乾癬、強皮症、静脈性潰瘍、にきび、酒さ、いぼ、湿疹、血管腫、およびリンパ管形成を患っている患者の皮膚の外観及び／又は状態を改善するために用いられる。

他の態様において、本発明は血管形成をする皮膚病を治療するためのスキンケア組成物のために提供される。このスキンケア組成物はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の変異ＢＢＩの１、４、５、１１、１３、１８、２５、２７、２９、３１、３８、４０、５０、５２、５５、及び６５に等しい位置から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置において、アミノ酸置換を有するボウマンブリックプロテアーゼインヒビター（ＢＢＰＩ）を含み、このＢＢＰＩの骨格の第二プロテアーゼ抑制ループがＥＱＩＤＮＯＳ：９、４５８、４５９、４６０、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、及び４７３から選択されるＶＥＧＦ−結合ペプチドである。このヘアケア組成物はシャンプー、ヘアスタイリング組成物、ヘアカラー、パーマネントウェーブ製剤、クリーム、ゲル、ムース、スプレー、乳液、コロイド懸濁液、液体、発泡体、及び固形から選択することができる。幾つかの態様において、ヘアケア組成物は放射線保護剤も含む。放射線保護剤の例とては、非水耐性サンスクリーン、高水耐性サンスクリーン、及びシリコン中水サンスクリーンから選択されるサンスクリーンを含む。このヘアケア組成物は発毛を抑制するために用いることができる。

他の態様において、本発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１、４、５、１１、１３、１８、２５、２７、２９、３１、３８、４０、５０、５２、５５、及び６５に等しい位置から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含むＢＢＰＩ含むパーソナルケア組成物を提供し、この組成物を発毛を抑制すべき領域に適用することにより、育毛を抑制するための方法を提供する。前記ＢＢＰＩ骨格の第二プロテアーゼ抑制ループはＳＥＱＩＤＮＯＳ：９、４５８、４５９、４６０、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、及び４７３から選択されるＶＥＧＦ結合ペプチドである。例えば、この組成物は顔の毛、腋毛、脚の毛、胴体の毛、腕の毛、及び頭の毛の成長を抑制するために用いることができる。幾つかの態様において、この方法はＳＥＱＩＤＮＯＳ：６０１、６０２、６２７、６２８、６３０、６３１、６４３、４９１、６３２、６３３、６３４、６３５、及び６３６から選択されるＶＥＧＦ−ＢＢＰＩを含むパーソナルケア組成物を用いる。

他の態様において、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の変異ＢＢＩの１、４、５、１１、１３、１８、２５、２７、２９、３１、３８、４０、５０、５２、５５、６５に等しい位置から選択される少なくとも１つのアミノ酸の位置においてアミノ酸置換を有する変異ＢＢＰＩを含む組成物を提供し、この組成物を患者の皮膚に適用する工程を含む、血管形成性の皮膚病を患っている患者の皮膚の概観及び状況を改善するための方法を提供する。このＢＢＰＩの骨格の第二プロテアーゼ抑制ループはＳＥＱＩＤＮＯＳ：９、４５８、４５９、４６０、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、及び４７３から選択されるＶＥＧＦ−結合ペプチドである。この血管形成性皮膚病は乾癬、硬皮症、静脈性潰瘍、ニキビ、酒さ、イボ、湿疹、血管腫、及びリンパ管形成から選択される。幾つかの態様において、この方法はＳＥＱＩＤＮＯＳ６０１、６０２、６２７、６２８、６３０、６３１、６４３、４９１、６３２、６３３、６３４、６３５、及び６３６から選択されるＶＥＧＦ−ＢＢＰＩを含むパーソナルケア組成物を用いる。

他の態様において、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の変異ＢＢＩの１、４、５、１１、１３、１８、２５、２７、２９、３１、３８、４０、５０、５２、５５、及び６５に等しい位置から選択される少なくとも１つのアミノ酸の位置においてアミノ酸置換を有するボウマンブリックプロテアーゼインヒビター（ＢＢＰＩ）を含むパーソナルケア組成物を提供する。このＢＢＰＩ骨格の第二プロテアーゼ抑制ループはＳＥＱＩＤＮＯＳ：４３０、及び４３１から選択される。幾つかの態様において、このＢＢＰＩ骨格はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７のＢＢＩｔ−ＡＶである。他の態様において、パーソナルケア組成物中に含まれる修飾変異ＢＢＰＩは１３Ｉ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｋ−２９Ｐ−５２Ｋ、１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ａ−２９Ｒ−３１Ｅ−４０Ｋ−５０Ｑ−５２Ｑ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ａ−２９Ｒ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｒ−５２Ｌから選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含む。幾つかの態様において、このパーソナルケア組成物はＳＥＱＩＤＮＯＳ：４３２及び４３４から選択されるＦＧＦ結合ＢＢＰＩ（ＦＧＦ−ＢＢＰＩ）である修飾変異ＢＢＰＩを含む。

幾つかの態様において、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の変異ＢＢＩの１、４、５、１１、１３、１８、２５、２７、２９、３１、３８、４０、５０、５２、５５、及び６５に等しい位置から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を有するボウマンブリックプロテアーゼインヒビター（ＢＢＰＩ）を含むヘアケア組成物を提供する。このＢＢＰＩ骨格の第二プロテアーゼ抑制ループはＳＥＱＩＤＮＯＳ：４３０及び４３１から選択されるＦＧＦ−結合ペプチドである。このヘアケア組成物は、シャンプー、コンディショナー、ヘアスタイリング組成物、ヘアカラー、パーマネントウェーブ製剤、クリーム、ゲル、ムース、スプレー、乳液、コロイド懸濁液、液体、発泡体、及び固形から選択される形態でよい。幾つかの態様において、このヘアケア組成物は放射線保護剤も含む。放射線保護剤の例としては、水耐性ではない酸サンスクリーン、強水耐性サンスクリーン、及びシリコン中水サンスクリーンから選択されるサンスクリーンを含む。このヘアケア組成物は育毛を促進するために用いることができる。

他の態様において、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の変異ＢＢＩの１、４、５、１１、１３、１８、２５、２７、２９、３１、３８、４０、５０、５２、５５、及び６５に等しい位置から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を有するボウマンブリックプロテアーゼインヒビター（ＢＢＰＩ）を含むパーソナルケア組成物を提供する工程及びこの組成物を育毛を望む固体の領域に適用する工程を含む育毛を促進する方法を提供する。このＢＢＰＩ骨格の第二プロテアーゼ抑制ループはＳＥＱＩＤＮＯＳ：４３０及び４３１から選択されるＦＧＦ−結合ペプチドである。例えば、この組成物は顔の毛、脇の毛、脚の毛、胴体の毛、腕の毛、及び毛髪の育毛を促進する。幾つかの態様において、この育毛パーソナルケア組成物は脱毛を含む状態を処置するために用いることができる。例えば、脱毛を含み、本願発明のヘアケア組成物を用いて処置できる状態は、炎症性脱毛症、萎縮性脱毛症、強皮症、ダニ咬傷、扁平苔癬、乾癬、狼瘡、脂漏性皮膚炎、脱毛症、血色素症、男性ホルモン性脱毛症、及び円形脱毛症を含む。幾つかの態様において、育毛を促進するのに用いることができるパーソナルケア組成物はＳＥＱＩＤＮＯＳ：４３２及び４３４から選択されるＦＧＦ結合ＢＢＰＩ（ＦＧＦ−ＢＢＰＩ）を含む。

他の態様において、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の変異ＢＢＩの変異ＢＢＩの１、４、５、１１、１３、１８、２５、２７、２９、３１、３８、４０、５０、５２、５５、及び６５に等しい位置から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を有する修飾変異ボウマンブリックプロテアーゼインヒビター（ＢＢＰＩ）を含むパーソナルケア組成物を提供する。このＢＢＰＩ骨格の第二プロテアーゼ抑制ループはＳＥＱＤＩＮＯＳ：４３６、４３７、４３８、６７２、６７３、及び６７４から選択されるＴＧＦ結合ペプチドである。幾つかの態様において、このＢＢＰＩ骨格はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７のＢＢＩｔ−ＡＶである。他の態様において、本発明のパーソナルケア組成物に含まれる修飾変異ＢＢＰＩは１３Ｉ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｋ−２９Ｐ−５２Ｋ、１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ａ−２９Ｒ−３１Ｅ−４０Ｋ−５０Ｑ−５２Ｑ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ａ−２９Ｒ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｒ−５２Ｌから選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含む。幾つかの態様において、このパーソナルケア組成物はＳＥＱＩＤＮＯＳ：４４３、４４５、及び４４７から選択されるＴＧＦ結合ＢＢＰＩ（ＴＧＦ−ＢＢＰＩ）である修飾変異ＢＢＰＩを含む。

他の態様において、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の変異ＢＢＩの１、４、５、１１、１３、１８、２５、２７、２９、３１、３８、４０、５０、５２、５５、及び６５に等しい位置から選択される少なくとも１つの位置においてアミノ酸置換を含む修飾変異ＢＢＰＩを含むパーソナルケア組成物を提供する。このＢＢＰＩ骨格の第二プロテアーゼ抑制ループはＳＥＱＤＩＮＯＳ：４３６、４３７、４３８、６７２、６７３、及び６７４から選択されるＴＧＦ結合ペプチドである。このヘアケア又はスキンケア組成物は、シャンプー、コンディショナー、ヘアスタイリング組成物、ヘアカラー、パーマネントウェーブ製剤、クリーム、ゲル、ムース、スプレー、乳液、コロイド懸濁液、液体、発泡体、及び固形物から選択される形態でよい。幾つかの態様において、組成物はスキンケア組成物である場合、保湿性ボディーウォッシュ、ボディーウォッシュ、抗菌クレンザー、スキンプロテクトクリーム、ボディーローション、顔用クリーム、保湿性クリーム、保湿性クレンジング乳液、顔用ゲル、顔用乳液、界面活性剤ベース顔用クレンザー、顔用ピーリングゲル、抗ニキビ剤、顔用トナー、ピーリングクリーム、顔用マスク、アフターシェーブローション、プレシェーブバーム、日焼け用組成物、サンスクリーン及び放射線保護剤を含む。このスキンケア組成物は任意で、局所的に適用する市販の薬剤、抗菌剤、抗ニキビ剤、スキンプロテクト、サンスクリーン、デオドラント剤、及び制汗剤を含む。このスキン又はヘアケア組成物に含まれる放射線保護剤は水に耐性のないサンスクリーン、強水耐性サンスクリーン、及びシリコン中水サンスクリーンを含む。

他の態様において、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の変異ＢＢＩの１、４、５、１１、１３、１８、２５、２７、２９、３１、３８、４０、５０、５２、５５、及び６５に等しい位置から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む修飾変異ボウマンブリックプロテアーゼインヒビター（ＢＢＰＩ）を含む化粧組成物を提供する。このＢＢＰＩ骨格の第二プロテアーゼ抑制ループはＳＥＱＤＩＮＯＳ：４３６、４３７、４３８、６７２、６７３、及び６７４から選択されるＴＧＦ−結合ペプチドである。化粧組成物の例としては、マスカラ、アイライン、固形パウダー製剤、及びファンデーションを含む。

他の態様において、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の変異ＢＢＩの１、４、５、１１、１３、１８、２５、２７、２９、３１、３８、４０、５０、５２、５５、及び６５に等しい位置から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む修飾変異ボウマンブリックプロテアーゼインヒビター（ＢＢＰＩ）を含むヘアケア組成物を提供する。このＢＢＰＩ骨格の第二プロテアーゼ抑制ループはＳＥＱＤＩＮＯＳ：４３６、４３７、４３８、６７２、６７３、及び６７４から選択されるＴＧＦ−結合ペプチドである。この組成物は更に放射線保護剤を含む。ヘアケア組成物に含まれる放射線保護剤は、強水耐性サンスクリーン、及びシリコン中水サンスクリーン等のサンスクリーンである。このヘアケア組成物は育毛を促進することができる。

他の態様において、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１、４、５、１１、１３、１８、２５、２７、２９、３１、３８、４０、５０、５２、５５、及び６５から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む修飾変異ボウマンブリックプロテアーゼインヒビター（ＢＢＰＩ）を含むパーソナルケア組成物を提供する工程及びこの組成物を育毛を望む固体の領域に適用する工程を含む、育毛を促進する方法を提供する。このＢＢＰＩ骨格の第二プロテアーゼ抑制ループはＳＥＱＤＩＮＯＳ：４３６、４３７、４３８、６７２、６７３、及び６７４から選択されるＴＧＦ−結合ペプチドである。例えば、この組成物は顔の毛、脇の毛、脚の毛、胴体の毛、腕の毛、及び毛髪の育毛を促進するために適用される。幾つかの態様において、この育毛促進パーソナルケア組成物は脱毛を含む状態を処理するために用いられる。例えば、脱毛を含み、本発明ヘアケア組成物を用いて処理することができる状態は、炎症性脱毛症、萎縮性脱毛症、強皮症、ダニ咬傷、扁平苔癬、乾癬、狼瘡、脂漏性皮膚炎、脱毛症、血色素症、男性ホルモン性脱毛症、及び円形脱毛症を含む。幾つかの態様において、この育毛を促進するパーソナルケア組成物はＳＥＱＩＤＮＯＳ：４４３、４４５、及び４４７から選択される修飾変異ＴＧＦ−ＢＢＰＩを含む。

他の態様において、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１、４、５、１１、１３、１８、２５、２７、２９、３１、３８、４０、５０、５２、５５、及び６５から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む修飾変異ボウマンブリックプロテアーゼインヒビター（ＢＢＰＩ）を含むパーソナルケア組成物を提供する工程及びこの組成物を固体に適用する工程を含む、皮膚病を患っている個体の皮膚の概観を状態を改善する方法を提供する。このＢＢＰＩ骨格の第二プロテアーゼ抑制ループはＳＥＱＤＩＮＯＳ：４３６、４３７、４３８、６７２、６７３、及び６７４から選択されるＴＧＦ−結合ペプチドである。幾つかの態様において、この組成物で処理できる皮膚病は乾癬、強皮症、及び皮膚癌を含む。幾つかの態様において、このパーソナルケア組成物はＳＥＱＩＤＮＯＳ：４４３、４４５、及び４４７から選択される修飾変異ＴＧＦ−ＢＢＰＩから選択されるＴＧＦ−ＢＰＩを含む。

他の態様において、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の変異ＢＢＩの１、４、５、１１、１３、１８、２５、２７、２９、３１、３８、４０、５０、５２、５５、及び６５に等しい位置から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含むボウマンブリックプロテアーゼインヒビター（ＢＢＰＩ）を含むパーソナルケア組成物を提供する。このＢＢＰＩ骨格の第二プロテアーゼ抑制ループはＳＥＱＩＤＮＯＳ：４７４、４７５、及び４７６から選択されるＴＮＦ−結合ペプチドである。幾つかの態様において、このＢＢＰＩ骨格はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７のＢＢＩｔ−ＡＶである。他の態様において、本発明のパーソナルケア組成物中に含まれる修飾変異ＢＢＰＩは１３Ｉ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｋ−２９Ｐ−５２Ｋ、１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ａ−２９Ｒ−３１Ｅ−４０Ｋ−５０Ｑ−５２Ｑ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ａ−２９Ｒ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｒ−５２Ｌから選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含む。幾つかの態様において、このパーソナルケア組成物はＳＥＱＩＤＮＯＳ：６３７、６３８、及び６３９から選択されるＴＮＦ−ＢＢＰＩである修飾変異ＢＢＰＩを含む。このパーソナルケア組成物は育毛を促進する。

他の態様において、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の変異ＢＢＩの１、４、５、１１、１３、１８、２５、２７、２９、３１、３８、４０、５０、５２、５５、及び６５から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む修飾変異ボウマンブリックプロテアーゼインヒビター（ＢＢＰＩ）を含むヘアケア組成物を提供する。このＢＢＰＩ骨格の第二プロテアーゼ抑制ループはＳＥＱＩＤＮＯＳ：４７４、４７５、及び４７６から選択されるＴＮＦ−結合ペプチドである。幾つかの態様において、このヘアケア組成物は乾癬を患っている固体における育毛を促進することができる。このヘアケア組成物はシャンプー、コンディショナー、ヘアスタイリング組成物、ヘアカラー、パーネントウェーブ製剤、クリーム、ゲル、ムース、スプレー、乳液、コロイド懸濁液、液体、発泡体、及び固形物から選択される形態でよい。幾つかの態様において、このヘアケア組成物は更に放射線保護剤を含む。放射線保護剤の例としては、水耐性ではないサンスクリーン、強水耐性サンスクリーン、及びシリコン中水サンスクリーン等のサンスクリーンを含む。幾つかの態様において、このヘアケア組成物は育毛を促進することができる。

他の態様において、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の変異ＢＢＩの１、４、５、１１、１３、１８、２５、２７、２９、３１、３８、４０、５０、５２、５５、及び６５に等しい位置から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置においてアミノ酸置換を含む修飾変異ボウマンブリックプロテアーゼインヒビター（ＢＢＰＩ）を含むスキンケア組成物を提供する。このＢＢＰＩ骨格の第二プロテアーゼ抑制ループはＳＥＱＩＤＮＯＳ：４７４、４７５、及び４７６から選択されるＴＮＦ−結合ペプチドである。このスキンケア組成物は乾癬又は強皮症を患っている固体の皮膚の概観及び／又は状態を改善するために用いることができる。幾つかの態様において、このスキンケア組成物は、クリーム、ローション、スプレー、乳液、コロイド懸濁液、発泡体、エアロゾル、液体、ゲル、美容液、及び固形物の形態でよい。代替的に、このスキンケア組成物は、保湿性ボディーウォッシュ、ボディーウォッシュ、抗菌クレンザー、スキンプロテクトクリーム、顔用ゲル、顔用美容液、界面活性剤ベース顔用クレンザー、顔用ピーリングゲル、抗ニキビ剤、顔用トナー、ピーリングクリーム、顔用マスク、アフターシェーブローション、プレシェーブローション、日焼け用組成物、スキンライトニング組成物、皮膚用赤み低減組成物、サンスクリーン、脱毛剤、及び放射線保護剤の形態である。任意で、このスキンケア組成物は更に局所的に適用される市販の薬剤、抗菌製剤、抗ニキビ製剤、皮膚保護剤、サンスクリーン、デオドラント剤、及び制汗剤を更に含む。

他の態様において、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の変異ＢＢＩの１、４、５、１１、１３、１８、２５、２７、２９、３１、３８、４０、５０、５２、５５、及び６５に等しい位置から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む修飾変異ボウマンブリックプロテアーゼインヒビター（ＢＢＰＩ）を含む化粧組成物を提供する。このＢＢＰＩの第二プロテアーゼ抑制ループはＳＥＱＩＤＮＯＳ：４７４、４７５、及び４７６から選択されるＴＮＦ−結合ペプチドである。この化粧組成物はマスカラ、アイライン、固形パウダー製剤、及びファンデーションから選択される。幾つかの態様において、この化粧組成物は少なくとも１つの顔料を含む化粧組成物である。少なくとも１つの顔料を含む化粧組成物はマスカラであり、このマスカラは水耐性ではないマスカラ、ウォータープルーフマスカラ、ボリュームを増やすマスカラ、長さを増やすマスカラ、カールをつけるマスカラ、無水ウォータープルーフマスカラ、水ベースマスカラ、及びアイラッシュ又はアイブロウトリートメントから選択される。他の態様において、この化粧組成物はルースパウダー、頬紅、アイシャドー、及び日焼け用パウダーから選択される固形パウダー製剤から選択される化粧組成物である。

更なる態様において、この化粧組成物はオイル中水ファンデーション、シリコン中水ファンデーション、水中オイルファンデーション、無水メイクアップスティック、及び／又はクリーム乃至粉末製剤から選択される化粧組成物である。

他の態様において、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の変異ＢＢＩの１、４、５、１１、１３、１８、２５、２７、２９、３１、３８、４０、５０、５２、５５、及び６５に等しい位置から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置においてアミノ酸置換を有する修飾変異ボウマンブリックプロテアーゼインヒビター（ＢＢＰＩ）を含むパーソナルケア組成物を提供する工程、及びこの組成物を育毛の促進を望む固体の領域に適用する工程を含む、乾癬を患っている固体の育毛を促進するための方法を提供する。このＢＢＰＩ骨格の第二プロテアーゼ抑制ループはＳＥＱＩＤＮＯＳ：４７４、４７５、及び４７６から選択されるＴＮＦ−結合ペプチドである。例えば、この組成物は顔の毛、脇の毛、脚の毛、胴体の毛、腕の毛、及び毛髪の育毛を促進するために用いられる。幾つかの態様において、育毛を促進するために用いるパーソナルケア組成物はＳＥＱＩＤＮＯＳ：６３７、６３８、及び６３９から選択される修飾ＴＮＦ−ＢＢＰＩを含む。

他の態様において、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の変異ＢＢＩの１、４、５、１１、１３、１８、２５、２７、２９、３１、３８、４０、５０、５２、５５、及び６５に等しい位置から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置においてアミノ酸置換を有する修飾変異ボウマンブリックプロテアーゼインヒビター（ＢＢＰＩ）を含むパーソナルケア組成物を提供する工程、及びこの組成物を固体に適用する工程を含む、乾癬を患っている固体の皮膚の概観及び／又は状態を改善するための方法を提供する。このＢＢＰＩ骨格の第二プロテアーゼ抑制ループはＳＥＱＩＤＮＯＳ：４７４、４７５、及び４７６から選択されるＴＮＦ−結合ペプチドである。幾つかの態様において、この方法はＥＱＩＤＮＯＳ：６３７、６３８、及び６３９から選択される修飾ＴＮＦ−ＢＢＰＩを含むパーソナルケア組成物を提供する工程を含む。

図１Ａ−ＤはｐＪＭ１０３インテグレーションベクターにクローンされたａｐｒＥ−ＢＣＥ１０３−ＢＢＩ−Ｈｉｓｔａｇ発現カセット（ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ）のＤＮＡ及びアミノ酸配列を提供する（ＳＥＱＩＤＮＯＳ：１及び２）。

図２はｐＪＭ１０３ＢＢＩｈｉｓ発現ベクターのスキームマップを提供する。

図３はＢＣＥ１０３融合部位（ＢａｍＨＩの位置）から遺伝子末端へのＤＮＡ及びアミノ酸配列を提供する（ＳＥＱＩＤＮＯＳ：３及び４）。ＣＫ３７２８１ペプチド配列（ＡＣＹＮＬＹＧＷＴＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：９）はトリプシン及びキモトリプシン抑制ループへ挿入される。

図４は培養の間の所与の条件において添加された各種チオール還元遺伝子で失活させた２ＢＢｌｃｋ８１に対する活性の力価を示すグラフである。バーの白い部分は活性２ＢＢＩｃｋ８１の量（トリプシン抑制により決定される）を示し、バーの黒い部分は不活性２ＢＢＩｃｋ８１の量（ＢＣＥ１０３活性から決定され、ＢＣＥ１０３及び２ＢＢｌｃｋ８１は１：１の割合で生産されると仮定する）。この活性２ＢＢｌｃｋ８１の分画はバーの上に示した。この図において、３７Ｃは添加物なし、ＢＭＥは２−メルカプトエタノール、Ｃｙｓはシステイン、Ｇｌｕは還元されたグルタチオン、ＣＴＴはジチオスレイトールを示す。

図５はイオン交換クロマトグラフィーによるＢＣＥ−ｌｎｋ２−２ＢＢｃｋ８１融合タンパク質の部分的な精製の後、２−メルカプトエタノールを用いた２ＢＢｌｃｋ８１の活性を示すグラフを提供する。活性アッセイにより測定されたＢＣＥ（ブラックバー）及び２ＢＢｌｃｋ８１（ホワイトバー）の濃度（μＭ）は３ｍＭの２−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）で処理した前と後で示した。

図６はＢｉｏＶｅｒｉｓアッセイにおけるＶｅｇＦへ結合している２ＢＢｌｃｋ８１対抗ＶｅｇＦの競合解析からの結果を示す。ＣＫ３７２８１ペプチドを用いた結合競合は比較のために示しており、野生型ＢＢＩへの結合はネガティブコントロールとして含む。

図７Ａ−Ｃはバチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＢＩ発現ベクター（ＢｓｓＨＩＩ及びＳａｃＩ部位を使用）へ挿入されたフミコーラインソレンス（Ｈ．ｉｎｓｏｌ及びＰＤＩ（ｈｉＰＤＩ）を運んでいる合成ＤＮＡフラグメントの配列並びにアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯＳ：５及び６）を提供する。

図８Ａ−Ｃはｐ２ＪＭ１０３−ｌｎｋ２−２ＢＢＩｃｋ８１のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位へ組み込まれたａｐｒＥ−クチナーゼ発現カセットのＤＮＡ及びアミノ酸配列を提供する（ＳＥＱＩＤＮＯＳ：７及び８）。

図９は未修飾ＢＢＩｔ−ＡＶタンパク質（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７）のアミノ酸配列を提供する。部位飽和ライブラリーを全ての番号付けがされらアミノ酸において構築した。トリプシン抑制ループ及びＶＥＧＦ結合ペプチドループ（イタリック）を示し、ジスルフィド結合は結合線で示した。下方において、ＶＥＧＦ結合ペプチドの配列を置き換えるｓＢＢＩのおけるキモトリプシン抑制ループと比較した。下向き矢印はキモトリプシン反応部位のＰ_１及びＰ_１’残基の間の可能な切断部位を示す。

図１０は２９位でなされた各アミノ酸置換のＢＢＩ：ＢＣＥの相対的活性割合を示す。この割合は２−メルカプトエタノール無添加（ホワイトバー）又は添加（ブラックバー）において、マイクロタイタープレートにおける４つ組の培養育成から平均化された。ｓＢＢＩに対する活性割合は陽性対象との比較を含む。この割合はＢＢＩｔ−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７）における野生型アミノ酸を決定するための値に規格化され（水平ラインで示す）、ロイシン、２―メルカプトエタノールの無添加（水平バー）又は添加（斜線のバー）でしめされる。

図１１Ａ及びＢは５０位（Ａ）及び３７位（Ｂ）でなされたアミノ酸置換についてのＢＢＩ：ＢＣＥ相対活性割合を提供する（ホワイトバー）。この割合は２−メルカプトエタノールの存在下での４つ組み培養からの平均値である。ｓＢＢＩに対する活性割合は比較のための陽性対象として含まれる（ブラックバー）。この割合はＢＢＩｔ−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７）における野生型アミノ酸のために決定された値（水平ラインで示す）で規格化され、斜線のバーで示す。

図１２はトリプシン抑制ループ中のＰ_２’位（図９における残基１８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７）におけるアミノ酸置換のためのＢＢＩ：ＢＣＥ相対割合を提供する。この割合は２−メルカプトエタノール（個別のデーター位置を示す）の存在において４つ組みで決定された。ｓＢＢＩ（ＢＢＩ；ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）、ＢＢＩｔ−ＡＶ（ＣＴ；ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７）、及びＢＢＩｔ−ＡＶ−Ｆ５０Ｔ（Ｆ５０Ｔ）の活性割合は水平ラインの右側に示し、比較のために追加された。この割合はＢＢＩｔ−ＡＶ（ＣＴ）を決定するための値で規格化された（水平ラインで示す）。

図１３は８つのアミノ酸置換の組み合わせを含む３つの変異体、即ち、８部位変異体、ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｋ−Ｍ２７Ａ−Ｌ２９Ｒ−Ｓ３１Ａ−Ａ４０Ｈ−Ｆ５０Ｒ−Ｖ５２Ｌ（ＲＬ８；ＳＥＱＩＤＮＯ：６３０）、ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｋ−Ｍ２７Ａ−Ｌ２９Ｒ−Ｓ３１Ｅ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｑ−Ｖ５２Ｑ（ＱＱ８；ＳＥＱＩＤＮＯ：６２８）、及びＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｒ−Ｍ２７Ａ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ａ−Ａ４０Ｈ−Ｆ５０Ｋ−Ｖ５２Ｔ（ＫＴ８；ＳＥＱＩＤＮＯ：６２７）の生成の比較を提供する。活性ＢＢＩ種の量は、育成後（◆）、２−メルカプトエタノールでの処理後（■）、及び酸／熱処理後（▲）のトリプシン抑制により決定された。ＢＢＩｔ−ＡＶ、５部位変異体ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ（ＴＡ５；ＳＥＱＩＤＮＯ：６０１）及びｓＢＢＩは比較のために含まれている。

図１４は前駆体変異ＢＢＰＩ骨格（親（ＰＴ）と示す）対修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ骨格（Ｑ；ＳＥＱＩＤＮＯ：６００）における好ましくはとなる結合ペプチド（３つのＴＧＦβ及び２つのＦＧＦ５バインダー）の、育成後（ブラックバー）、２−メルカプトエタノール処理後（斜線バー９、及び酸熱処理後（ホワイトバー）の活性ＢＢＩ種の比較（トリプシン抑制による）を提供する。全ての骨格において、結合ペプチドはキモトリプシン抑制ループを置き換える。ＰＥＮ３（ＳＥＱＩＤＮＯ：４３６）、ＷＴＱ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４３８）、及びＭＭ０２１Ｗ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４３７）はＴＧＦβ結合ペプチドであり、ＭＭ００７（ＳＥＱＩＤＮＯ：４３０）、及びＦＧＦｐｓ２（ＳＥＱＩＤＮＯ：４３１）はＦＧＦ５結合ペプチドである。

図１５はドリコスビフロラス（Ｄｏｌｉｃｈｏｓｂｉｆｌｏｒｕｓ）（ＢＢｄｂ−ＡＶ、ＳＥＱＩＤＮＯ：４５２）からの変異ボウマンブリック抑制ループ、グリシンマックス（Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ）（ダイズ）からの変異プロテアーゼインヒビターＩＶ又はＤ−ＩＩ（ＢＢｓｂ３−ＡＶ、ＳＥＱＩＤＮＯ：４５３）、及びキモトリプシンループがＶＥＧＦ−結合ペプチドであるトレセアセアレンシス（Ｔｏｒｒｅｓｅａ（Ａｍｂｕｒａｎａ）ｃｅａｒｅｎｓｉｓ）（ＢＢｔｃ−ＡＶ、ＳＥＱＩＤＮＯ：４５４）変異ボウマンブリック抑制ループのアミノ酸配列を提供する。これらのアミノ酸配列は変異ＢＢＩ、ＢＢＩｔ−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７）の配列に整列される。ＢＢＩｔ−ＡＶ配列とＣ９及びＣ５８の間の違いは太字で示す。全ての骨格において、ＣＫ３７８１結合ペプチド（ＡＣＹＮＬＹＧＷＴ；ＳＥＱＩＤＮＯ：９）は第二プロテアーゼ抑制ループを置き換える。

図１６は２−メルカプトエタノールで活性化した後（ホワイトバー）及び酸／熱処理後（ブラックバー）のＢＢＩｔ−ＡＶ、ＢＢｄｂ−ＡＶ、及びＢＢｔｃ−ＡＶの（トリプシン抑制による）活性ＢＢＩ濃度の比較を提供する。

図１７は未修飾ＢＢＩｔ−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７）、ＢＢｄｂ−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５２）、ＢＢｓｂ３−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５３）、及びＢＢｔｃ−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５４）及び対応する未修飾前駆体ＢＢＩｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７）、ＢＢｓｂ３（ＳＥＱＩＤＮＯ：４４９）、ＢＢｔｃ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５０）、及びＢＢｄｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５１）ＢＢＰＩのアラインメントを提供する。星印（＊）はＣ残基を維持している変異体ではないものを示す。番号付けされた残基は本発明の修飾変異ＢＢＰＩを生成するための置換されたアミノ酸を同定する。

図１８は野生型ＢＢＩにおけるＴ細胞エピトープを同定する。（Ａ）全７１ドナーの刺激指数（ＳＩ）値を平均化し、標準偏差をエラーバーで示した。（Ｂ）２０ｗｔＢＢＩエピトープセットにおける各エピトープに対する反応体の割合を示した。

発明の詳細な説明

本発明は標的タンパク質に結合するペプチドを含み、より大きなプロテアーゼ抑制活性を有するように修飾され、及び／又は未修飾ＢＢＰＩよりもより大きな生産性で生産さされる、修飾変異ボウマンブリックプロテアーゼインヒビタータンパク質（ＢＢＰＩ）に関する。この発明は修飾変異ＢＢＰＩをコードするポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド構築体及び発現ベクター、修飾変異ＢＢＰＩを発現及び生成する形質転換された宿主細胞、修飾変異ＢＢＰＩタンパク質、修飾変異ＢＢＰＩを含む組成物、及び修飾変異ＢＢＰＩを生成するための、及び／又はパーソナルケア組成物中に用いる方法を含む。

別に定義しない限り、本発明の実施は、分子生物学、微生物学、タンパク質精製、タンパク質工学、タンパク質及びＤＮＡ配列決定、及び組み替えＤＮＡ分野において、当業者の知識の範囲内である、従来技術を含む。そのような技術は当業者に知られており、多くの標準的な教科書、及び参考文献に記載されている。本明細書で言及している全ての特許、特許出願、文献及び刊行物はそっくりそのままに、参照により本明細書に援用される。

別に定義しない限り、本明細書で用いる全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する分野における当業者が理解しているのと同じ意味を有する。本明細書に含まれる用語を含む各種科学的辞書は当業者によく知られており、利用可能である。本明細書に記載されているものと類似又は等しい方法及び物質は本発明の実施に又は試験に用いることができるけれども、幾つかの好適な方法及び物質が記載されている。即ち、以下で定義される用語は本明細書全体を参照することにより完全に説明される。本発明は特定の方法論、手順、及び記載の試薬に限定されず、文脈により当業者が用いるこれらのものは変えられることは理解されている。

本明細書において、単数の用語、１つの及びこの（「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」）は別途定義しない限り複数も含むものとする。別に定義しない限り、核酸は左から右に向かって、５’から３’方向に記載する。アミノ酸配列は左から右に向かって、アミノ末端からカルボキシ末端に記載する。

本明細書で参照される全ての特許、特許出願、及び他の刊行物、これらの引用文献内に開示されている全ての配列は明示的に参照により、各文献、特許、又は特許出願が具体的に及び個別に参照により援用されているのと同様に、参照により本明細書に援用される。引用されている全てのドキュメントは、関係する部分において、参照により本明細書に援用される。しかしながら、いずれの文献の引用は本発明に関係する従来技術であるとして解釈されない。

数値範囲は範囲を定義している数を含む。そのようなより低い下限値は本明細書に開示されているならば、本明細書を通じて提供されているそれぞれの数値の上限はそれぞれのより低い数値限定を含む。本明細書を通じて提供されている各下限値は、もしより高い数値限定が本明細書に記載されているならば、それぞれのより高い数値限定を含む。

本明細書で提供される標題は本明細書全体により参照される本発明の各種側面又は態様を限定するものではない。従って、前述のように、以下で定義される用語は本明細書全体を参照することによりより完全に定義される。
５．１定義

本明細書において、「単離された」及び「精製された」の語は、本来関係している少なくとも１つの成分から除去された核酸又はアミノ酸（又は他の成分）を意味する。

本明細書において、「修飾」の語は、例えば、ボウマンブリックプロテアーゼインヒビター（ＢＢＰＩ）のようなプロテアーゼインヒビター（ＰＩ）に用いる場合、修飾「前駆体」又は「親」ＢＢＰＩ例えば、のアミノ酸配列由来のアミノ酸配列を有するＢＢＰＩを意味する。修飾前駆体ＢＢＰＩは自然発生又は野生型タンパク質でよく、又は変異ＢＢＰＩである。修飾タンパク質のアミノ酸配列は、前駆体アミノ酸配列領域の１つ異郷のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入により前駆体タンパク質アミノ酸配列由来である。幾つかの態様において、少なくとも１つのアミノ酸を置換して修飾プロテアーゼインヒビターを生成する。幾つかの態様において、この親プロテアーゼ幾つかのは変異ＢＢＰＩであり、変異配列で置換されたトリプシン及び／又はキモトリプシンループを含む。変異前駆体ＢＢＰＩの少なくとも１つのアミノ酸の置換は修飾さされた変異ＢＢＰＩプロテアーゼインヒビターを生成する。幾つかの態様において、この修飾偏にＰＩはＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１、４、５、１１、１３、１８、２５、２７、２９、３１、３８、４０、５０、５２、及び６５の位置に等しい少なくとも１つの位置におけるアミノ酸置換を含む（ＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＡＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＳＤＭＲＬＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＡＣＹＮＬＹＧＷＴＣＦＣＶＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ：ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７）。他の態様において、修飾変異ＰＩは本明細書で定義される組み合わせ置換を含む。他の態様において、この修された変異ＰＩは挿入を含む。そのような修飾はプロテアーゼインヒビター自体を操作というよりはむしろ、前駆体プロテアーゼインヒビターのアミノ酸配列をコードしている前駆体ＤＮＡ配列の修飾である。本明細書の修飾プロテアーゼインヒビターは反応性ループ、例えば、トリプシン及び／又はキモトリプシンループのほかの領域におけるアミノ酸残基のいずれか１つにおいて、１９の自然発生アミノ酸の置換を包含する。修飾配列をコードしているポリヌクレオチドは「修飾ポリヌクレオチド」といわれ、前駆体プロテアーゼインヒビターをコードしているポリヌクレオチドは「前駆体ポリヌクレオチド」といわれる。

本明細書において、「プロテアーゼインヒビター（ＰＩ）」の語は、ボウマンブリックプロテアーゼインヒビター（ＢＢＰＩ）を意味し、及びこの語と互換的に使用される。ＢＢＰＩは、例えば、Ｐｒａｋａｓｈｅｔａｌ．［Ｊ．ｍｏｌＥｖｏｌ４２：５６０−５６９（１９９６）］に記載のようなシステイン抗含有プロテアーゼインヒビターである。

本明細書において「骨格」の語は変異体配列が導入される、ＢＢＰＩタンパク質配列を意味する。幾つかの態様において、この骨格は変異体骨格であり、第一プロテアーゼ抑制ループ、例えば、トリプシンループ、及び／又は結合ペプチド配列で置換される、第二プロテアーゼインヒビターループ、例えば、キモトリプシンのいずれかを有する。他の態様において、この骨格は野生型ＢＢＰＩ骨格である。用語「修飾変異骨格」の語は、例えば、ＢＢＰＩ骨格の主鎖におけるアミノ酸置換又は挿入のような、修飾を含む変異骨格を意味する。

本明細書において、「主鎖」の語は第一及び／又は第二プロテアーゼ抑制ループ、即ち、トリプシン及び／又はキモトリプシンループを置き換えるために導入された結合ペプチドの外である変異ＢＢＰＩの部分を意味する。例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の変異ＢＢＰＩの主鎖はアミノ酸１−４０及び５０−６６、即ち、アミノ酸のＮ末端及び末端を意味し、アミノ酸位置４１乃至４９の変異システイン残基は、野生型ＢＢＰＩに見られるキモトリプシンループ、即ち、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３のＢＢＩを置きかえるために導入されたＶＥＧＦ結合配列を一まとめにする（ＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＡＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＳＤＭＲＬＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＩＣＡＬＳＹＰＡＱＣＦＣＶＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥＤＤＫＥＮ；ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）。幾つかの態様において、この骨格はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７のＢＢＩｔの骨格に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である。

本明細書において「結合ペプチド」、「結合配列」、「変異配列」、及び「変異ペプチド」の語は互換的に使用され、例えば、ボウマンブリックインヒビター等の第一及び／又は第二プロテアーゼインヒビターを置き換える短いペプチド配列を意味する。結合ペプチドは骨格中で置換されるプロテアーゼ抑制ループと同じ長さである必要はなく、少なくとも２つのアミノ酸のより野生型ＢＢＰＩのプロテアーゼ抑制ループと異なっている必要もない。幾つかの態様において、前駆体プロテアーゼインヒビターのトリプシン及び／又はキモトリプシン等の第一及び／又は第二プロテアーゼ抑制ループを置換することは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３等の野生型又はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の変異ＢＢＰＩのアミノ酸１５乃至２１にかかるトリプシンループ及び／又はアミノ酸４２乃至４８にかかるキモトリプシンループに等しい配列を変更する。この結合ペプチド配列はプロテアーゼインヒビターの結合ペプチド配列に対して異種のものである。結合ペプチドは標的タンパク質に結合する。

「ＶＥＧＦ結合ペプチド」、「ＦＧＦ結合ペプチド」、「ＴＧＦ結合ペプチド」、及び「ＴＮＦ結合ペプチド」は、本明細書においてそれぞれＶＥＧＦ、ＦＧＦ５、ＴＧＦβ、及びＴＮＦαに結合するペプチド配列を意味する。

「ＶＥＧＦ組成物」、「ＦＧＦ組成物」、「ＴＧＦ組成物」、及び「ＴＮＦ組成物」は、本明細書において、それぞれＶＥＧＦ−ＢＢＰＩ、ＦＧＦ−ＢＢＰＩ、ＴＧＦ−ＢＢＰＩ、及びＴＧＦ−ＢＢＰＩを含むパーソナルケア組成物のような組成物を意味する。

本明細書において製剤を意味するときに用いる「化合物」の語は修飾変異ＢＢＰＩ、例えば、ＶＥＧＦ−ＢＢＰＩ、ＦＧＦ−ＢＢＰＩ、ＴＧＦ−ＢＢＰＩ、又はＴＮＦ−ＢＢＰＩを意味する。製剤は修飾変異ＢＢＰＩの１つ以上を含む。即ち、製剤はＶＥＧＦ−ＢＢＰＩ及びＴＮＦ−ＢＢＰＩを含むか、又は本明細書に記載の他の４つのタイプのＢＢＰＩの他の組み合わせを含む。

パーソナルケア組成物中に含まれる修飾変異ＢＢＰＩを意味するときに用いる「１つの（ａ）」の語は修飾変異ＢＢＰＩが特定の配列を有していることを意味する。この文脈上において、「１つの（ａ）」はパーソナルケア組成物中に必要とされている修飾変異ＢＢＰい分子の数を限定するものではない。

「キモトリプシンループ」及び「第二プロテアーゼ抑制ループ」は本明細書において互換的に使用され、ボウマンブリックファミリーのプロテアーゼインヒビターの第二反応性ループに対応するアミノ酸配列に架かっているアミノ酸配列を意味する。例えば、Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ由来野生型ＢＢＰＩインヒビター、即ち、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３のＢＢＩの、第二プロテアーゼ抑制ループはシステイン１０及びシステイン１１により包含される第二反応性ループに架かるペプチド配列である（上記Ｐｒａｋａｓｈｅｔａｌ．参照）。

Ｃ１０及びＣ１１はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の変異ＢＢＩｔ−ＡＶにおけるアミノ酸４２乃至アミノ酸４８の間に等しいアミノ酸配列を含む（図９参照）。変異ＢＢＰＩ、例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７のＢＢＩｔ−ＡＶの第二プロテアーゼ抑制ループ又はキモトリプシンループは４１及び４９位におけるシステインにより包含されるアミノ酸４２乃至４８に架かるアミノ酸配列に対応する。４１位４９位はＰｒａｋａｓｈｅｔａｌ．によるＣ１０及びＣ１１に等しいシステイン残基である。ＳＥＱＩＤＮＯ：１３の野生型ＢＢＩの第二プロテアーゼ抑制ループのアミノ酸配列はキモトリプシン抑制ペプチドであるが、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の変異ＢＢＩｔ−ＡＶの第二プロテアーゼ抑制ループはＶＥＧＦ−結合ペプチドである。従って、用語「キモトリプシンループ」又は「第二プロテアーゼ抑制ループ」の語は本明細書において、ループの位置を意味し、Ｃ１０及びＣ１１の間の配列が変異ＢＢＰＩのプロテアーゼ抑制活性を付与することを意味しているのではない。同様に、「トリプシンループ」及び「第一抑制ループ」の語は、互換的に使用され、ボウマンブリックファミリーのプロテアーゼ抑制の反応性部位ループに対応するアミノ酸配列に架かるアミノ酸の配列を意味している。例えば、グリシンマックス（Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ）由来の野生型ＢＢＰＩインヒビター、即ち、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３はの第二プロテアーゼ抑制ループはシステイン４及びシステイン５により包含される第二反応性部位ループに架かるペプチド配列である（上記Ｐｒａｋａｓｈｅｔａｌ．参照）。Ｃ４及びＣ５はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の変異ＢＢＩｔ−ＡＶにおけるアミノ酸１５及びアミノ酸２１に架かるものに等しいアミノ酸配列を包含している（図９）。

本明細書において、「標的タンパク質」の語は変異ペプチドの結合により作用がブロックされるタンパク質（例えば、酵素、ホルモン等）を意味する。幾つかの態様において、この変異ペプチドはＢＢＰＩのトリプシン及び／又はキモトリプシンループを置き換えるときに、標的タンパク質に結合する。

本明細書において、「置換された」及び「置換」の語は親配列中のアミノ酸残基又は核酸塩基の置き換えを意味する。幾つかの態様において、置換は自然発生残基又は延期の置き換えを含む。幾つかの態様において、２つ以上のアミノ酸が置換されてアミノ酸置換の組み合わせを含む修飾ＢＢＰＩを生成する。幾つかの態様において、置換の組み合わせは置換がなされた位置におけるアミノ酸により示される。例えば、２５−５０−５２により表される組み合わせはアミノ酸の２５位、５０位、及び５２位における３つのアミノ酸が置換されていることを意味する。他の態様において、置換の組み合わせはアミノ酸位置及び置換から得られたアミノ酸により表される。例えば、１３Ｉ−２５Ｌ−５０Ｔ−５２Ａの組み合わせ置換を含む修飾ＢＢＰＩは１３位のアミノ酸がイソロイシンに置換され、２５位のアミノ酸がロイシンに置換され、５０位のアミノ酸がスレオニンに置換され、５２位のアミノ酸がアラニンで置換された、修飾ＢＢＰＩを示す。アミノ酸位置はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７のＢＢＰＩにおける番号付けされた位置に等しい。幾つかの態様において、置換の組み合わせは置換がなされた骨格の意味で用いられる。例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：６０１の修飾変異ＢＢＰＩはＢＢＩｔ−ＡＶ−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａともいわれる。これは１３、２９、４０、５０、及び５２のアミノ酸における置換を含むＢＢＩｔ−ＡＶ骨格（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７）の意味でもある。幾つかの態様において、このオリジナル及び置換されたアミノ酸が示される。例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：６０１の変異ＢＢＰＩはＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａと表すことができる。

本明細書において、「修飾」及び「修飾する」の語は、欠失、挿入、阻害、及び置換を含むがこれらに限定されないアミノ酸又はかっくさん配列の任意の変更を意味する。幾つかの態様において、修飾は天然の残基又は塩基の置き換えも含む。他の態様において、修飾は少なくとも１つのアミノ酸置換の組み合わせを含む。更なる態様において、この修飾は少なくとも１つのアミノ酸置換を組み合わせた挿入を有する又は有さない挿入を含む。

本明細書において、「等しい」の語は、ＢＢＰＩのアミノ酸残基又はアミノ酸の位置について用いるときは、未修飾前駆体ＢＢＰＩの一次配列中の位置に対応する修飾ＢＢＰＩ中のアミノ酸残基の位置を意味する。ＢＢＰＩ中の等しいアミノ酸位置を確立するために、修飾ＢＢＰＩアミノ酸配列が直接ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７のＢＢＰＩと比較され、特にボウマンブリックファミリーのプロテアーゼインヒビター中で変らないと知られている（Ｐｒａｋａｓｈｅｔａｌ．上記）システイン残基と比較する。保存された栄ループシステイン残基に整列させた後、アラインメントを維持させるために、挿入及び欠失を行い（即ち、任意の欠失又は挿入を通じて保存されたシステイン残渣を排除しないようにする。）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７のＢＢＰＩの配列のおける特定のアミノ酸位置に等しい位置における残基が定義される。保存システイン残基のアラインメントは好ましくはそのような残基の１００％保存されているべきである。例えば、図１７において変異体及び野生型ＢＢＰＩのアミノ酸配列が整列され、この２つのアミノ酸配列の間の同一性の最大量を提供する。これらの配列の比較は不変システイン残基が保存されていることを示している。一次配列は本発明のＢＢＰＩにおける等しいアミノ酸の位置を決定するために好適な構造であるが、等しい残基はＢＢＰＩタンパク質の三次構造のレベルで、同一性を決定するとこもできる。

等しいアミノ酸位置は等しい成熟残基を有するタンパク質の特定のアミノ酸残基の主鎖原子の２つ以上の原子配置にようなもので決定され、アラインメントの後の所望のタンパク質（Ｎ上のＮ、ＣＡ上のＣＡ、Ｃ上のＣ、及びＯ上のＯ）は０．１３ｎｍ以内、好ましくは０．１ｎｍ以内の位置にある。アラインメントはベストモデルが伸長され、解析されるタンパク質のタンパク質原子の非水素原子の原子配置の最大重複が与えるように位置あわせされた後に、達成される。好適なモデルは結晶学及びタンパク質特徴付け解析の分野の当業者に既知の方法を用いて決定される、最も高い利用可能な解法において実験回折データのための最も低いＲファクターを与えている結晶回折モデルである。ダイズ由来のボウマンブリックインヒビターの結晶構造は決定されており（Ｈｗａｎｇｅｔａｌ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．１０；２５２（３）：１０９９−１０１［１９７７］，Ｗｅｉｅｔａｌ．，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．１０；２５４（１１）：４８９２−４［１９７９］，Ｖｏｓｓｅｔａｌ．ＥｕｒＪＢｉｏｃｈｅｍ．１５；２４２（１）：１２２−３１［１９９６］）、三次構造のレベルにおいて等しいアミノ酸位置を決定するためのアウトラインとして用いられている。本明細書において、「融合ポリペプチド」、「融合タンパク質」、及び「融合アナロガス」は宿主細胞内で、宿主細胞から分泌されたポリペプチド又は普通に分泌されたそれらのタンパク質、切断可能なリンカーポリペプチド、及び所望のポリペプチドにおいて分泌配列として機能するシグナルポリペプチドのアミラーゼ末端からコードする。幾つかの態様において、この融合ポリペプチドは分泌配列及び分泌されたポリペプチドの間に位置するスペーサーペプチドを含む。幾つかの態様において、この融合タンパク質は宿主細胞酵素で処理され（例えば、プロテアーゼ）、融合タンパク質における他のタンパク質配列のない所望のタンパク質を生産する。本明細書において用いるように、「融合アナログ」、「融合ポリペプチド」、及び「融合タンパク質」の語は互換的に使用される。

本明細書において、「活性」の語はプロテアーゼに関係している酵素活性のような、特定のタンパク質に関する活性を意味する。幾つかの態様において、この活性は生物学的活性である。更なる態様において、この活性は測定可能な下流効果（例えば、その同類のレセプターに結合しているＶＦＧＦ）となるレセプターに対するタンパク質の結合を包含する。「生物学的活性」の語は当業者によりタンパク質に貢献している任意の活性を意味する。

本明細書において、「プロテアーゼ抑制活性」はプロテアーゼのタンパク質分解活性を抑制することにおけるＢＢＰＩの活性を意味する。即ち、ペプチド又はペプチド結合を有する基質を加水分解する能力を抑制すること。

本明細書において、「発現」後は遺伝子の核酸配列基づいて生成されたポリマーペプチドによるプロセスを意味する。このプロセスは転写及び翻訳の両方を含む。

ＢＢＰＩに関して用いる「生成」の語は、１タンパク質分泌の間に起こると知られているシグナルペプチドの除去及び２．ＢＢＰＩの活性成熟形態を生成し成熟プロセスにおいて起こると知られているプロ領域の除去を含む完全長プロテアーゼの２つの処理工程を包含する（Ｗａｎｇｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３７：３１６５−３１７１（１９９８）；Ｐｏｗｅｒｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ８３：３０９６−３１００（１９８６））。

本明細書において、「生産性」の語は未修飾及び／又は修飾変異プロテアーゼインヒビター、例えば、変異ＢＢＰＩが生成されるときのレベルを意味する。生産性が高くなれば、より多量のプロテアーゼインヒビターが生産される。

本明細書において、「効果的な生産」の語はタンパク質、例えば、修飾変異ＢＢＰＩの生産を意味し、このタンパク質が未修飾又は前駆体変異ＢＢＰＩよりも高いレベル生産されることを意味している。

本明細書において、「実質的に精製された」の語は、本発明のタンパク質又はタンパク質フラグメントにおいて用いる場合、タンパク質が必ず、意図する使用において、実際的で好適な範囲に他の基質を含まないことを意味する。特に、タンパク質は十分に精製されており、例えば、タンパク質配列決定及び／又は薬剤の製造のような使用の場面において、宿主細胞由来の他の生物学的成分を実質的に含んでいない。

本明細書において、「実質的に含まない」の語は他のタンパク質（即ち、コンタミプロテイン）を約加えて２０％未満、約１０％未満、約５％未満、又は約１％未満有数所望のタンパク質の調製物を包含する。

本明細書において、「ポリヌクレオチド」、「核酸分子」、及び「核酸配列」の語は核酸の任意の形態の配列を含み、ＲＮＡ、ＤＮＡ，及びｃＤＮＡ分子を含むがこれらに限定されない。遺伝子コードの退縮により、所与のタンパク質をコードしている複数のかっくさん配列が生成することは理解されている。

本明細書において、「ＤＮＡ構築体」、「ポリヌクレオチド構築体」、及び「形質転換ＤＮＡ」の語は互換的に使用され、宿主細胞又は有機体に配列を導入するために用いるＤＮＡを意味する。このＤＮＡはＰＣＲ又は当業者に知られている任意の好適な技術によりインビトロで生成される。幾つかの態様において、このＤＮＡ構築体は所望の配列（例えば、修飾配列）を包含する。幾つかの態様において、この配列は制御エレメント（例えば、プロモーター等）に作動可能に結合している。幾つかの態様において、このＤＮＡ構築体は宿主細胞染色体に相同な配列を含む。他の態様において、このＤＮＡ構築体は非相同配列を含む。一旦ＤＮＡ構築体がインビトロで構築されると、宿主細胞染色体の領域を変異するために用いられる（即ち、異種配列で内性配列を置き換える）。

本明細書において、「異種ＤＮＡ配列」の語は宿主細胞中に自然発生しないＤＮＡ配列を意味する。幾つかの態様において、この異種ＤＮＡ配列は調節エレメントを含む異なる遺伝子の部分からなるキメラＤＮＡ配列である。

本明細書において、「異種タンパク質」の語は宿主細胞において自然発生しない、即ち、異種配列によりコードされるタンパク質又はポリペプチドを意味する。

本明細書において「相同タンパク質」の語は野生型の又は細胞内で自然発生するタンパク質又はポリペプチドを意味する。

本明細書において、「ベクター」の語は１つ以上の細胞タイプへ核酸を導入するために設計されたポリヌクレオチド構築体を意味する。ベクターはクローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、及びプラスミドを含む。幾つかの態様において、このポリヌクレオチド構築体は修飾変異ＢＢＰＩをコードしているＤＮＡ配列を含む。

本明細書において、「発現ベクター」の語は外来細胞において異種ＤＮＡフラグメントを取り込み及び発現する能力のあるベクターを意味する。多くの真核及び原核発現ベクターが市場で入手可能である。好適な発現ベクターの選択は当業者の知識の範囲内である。

本明細書において、「プラスミド」の語はクローニングベクターとして用いられる環状二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ構築体を意味する。これは幾つかの原核又は真核細胞において染色体外自己複製遺伝エレメントを形成し、又は宿主染色体に組み込まれる。

本明細書において、細胞へ核酸配列を導入する場合に用いる、「導入された」の語は細胞へ核酸配列を輸送するために適した任意の方法を意味する。そのような導入方法はタンパク質融合、トランスフェクション、トランスフォーメーション、コンジュゲーション、及びトランスダクションを含むがこれらに限定されない（例えば、Ｆｅｒｒａｒｉｅｔａｌ．、“Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，”ｉｎＨａｒｄｗｏｏｄｅｔａｌ，（ｅｄｓ．），Ｂａｃｉｌｌｕｓ，ＰｌｅｎｕｍＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｒｐ．，ｐａｇｅｓ５７−７２，［１９８９］参照）。

本明細書において、「型質転換された」又は「安定な形質転換」の語は、少なくとも２世代に渡り維持されている、そのゲノムへ組み込まれた非天然（異種）ポリヌクレオチド配列を有する細胞、又は少なくとも２世代に渡り維持されているエピソーマルプラスミドを意味する。

本明細書において、「パーセント同一性（％）」又は「パーセント相同性」の語は、ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列が本明細書に開示されている配列のヌクレオチド又はアミノ酸残基に同一である候補配列中のヌクレオチド又はアミノ酸配列のパーセンテージであると定義される。ポリヌクレオチド又はポリペプチドにより占められるパーセント同一性は整列させた配列により分子間の配列情報を直接比較して、当業者に既知の方法により決定される。幾つかの態様において、このアラインメントは整列させる配列におけるギャップの導入を含む。更に、候補ポリヌクレオチド又はアミノ酸よりも多い又は少ない配列について、パーセント同一性は核酸又はアミノ酸の総数に基づいて同一な核酸又はアミノ酸の数に基づいて決定される。従って、例えば、本明細書で同定された配列よりも短い配列の相同性はより短い配列のおける核酸又はアミノ酸の数を用いて決定される。この同一性は当業者に知られている標準的な技術を用いて決定される（例えば、ＳｍｉｔｈａｎｄＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２［１９８１］；ＮｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３［１９７０］；ＰｅａｒｓｏｎａｎｄＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４［１９８８］；ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓＳｏｆｔｗａｒｅＰａｃｋａｇｅのＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，及びＴＦＡＳＴＡ等のプログラム（ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）；ａｎｄＤｅｖｅｒｅｕｘｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄＲｅｓ．，１２：３８７−３９５［１９８４］参照）。

本明細書において、「アナロガス配列」はプロテアーゼインヒビターのボウマンブリックファミリーのためのものと必ず同じタンパク質の機能を有するものを意味する。更に、アナロガスタンパク質はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の変異ＢＢＰＩの配列に少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を含む。アナロガス配列は配列アラインメントの既知の方法により決定する。通常用いられるアラインメント方法はＢＡＬＳＴである。前述又は以下に述べるように、アラインメント配列において他の方法も用いることができる。

有用なアルゴリズムの１つとしては、ＰＩＬＥＵＰがある。ＰＩＬＥＵＰは累積的な一対アラインメントを用いて関連する配列のグループから複数の配列アラインメントを生成する。アラインメントを生成するために用いるクラスタリング関係を示している系統樹をプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰはＦｅｎｇ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅのプログレッシブアラインメント方法の簡略方法を使用する（（ＦｅｎｇａｎｄＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．，３５：３５１−３６０［１９８７］）．この方法はＨｉｇｇｉｎｓａｎｄＳｈａｒｐ（ＨｉｇｇｉｎｓａｎｄＳｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ５：１５１−１５３［１９８９］に記載の方法に類似している。）有用なＰＩＬＥＵＰパラメーターは３．００のデフォルトギャップウェイト、０．１０のデフォルトギャップレングスウェイト、及びウエイトエンドギャップを含む。

有用なアルゴリズムの他の例としてはＢＬＡＳＴアルゴリズムがあり、Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，（Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３−４１０，［１９９０］；ａｎｄＫａｒｌｉｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３−５７８７［１９９３］により説明されている。部分的に有用なＢＬＡＳＴプログラムはＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２６６：４６０−４８０［１９９６］参照）。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は幾つかのサーチパラメータを用いる。大部分のデフォルト値は設定されている。調節可能なパラメーターは以下の値である：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワードスレッシュホールド（Ｔ）＝１．１。ＨＳＰＳ及びＨＳＰＳ２パラメーターは動的値であり、特定の配列の組成及び所望の配列をサーチする、特定のデータベースの組成に依存してプログラム自体により確立される。しかしながら、この値は感受性を高めるために調節してもよい。Ａ％のアミノ酸配列同一性の値は整列された領域における最も実際的な残渣を有するものである「ロンガー」配列の残基の総数により、一致した残基の数を割って決定される。この「ロンガー」配列は整列された領域における最も実際的な残基有するものである（アラインメントスコアを最大化すために導入されたＷＵ−Ｂｌａｓｔ−２によるギャップは無視する。）好適な方法は、オーバーラップスパン及びオーバーラップフラクションがそれぞれ１及び０．１２５であるデフォルトパラメーターを設定したＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２のＢＬＡＳＴＮモジュールを用いる。

「宿主細胞」は本発明のＤＮＡを含む発現ベクターのための宿主細胞として提供する細胞由来の好適な細胞を意味する。好適な宿主細胞は天然の又は野生型細胞であり、又は変性された細胞でもよい。１つ以上の態様において、この宿主細胞はグラム陽性微生物である。幾つかの好適な態様において、この用語はバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種の細胞でよい。

本明細書において、「バチルス株」の語は、バチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルスリケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルスレンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、バチルスブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、バチルスステアロセレモフィリス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスアルカロフィリス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスアミロリケフェシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルスコラウシ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルスハロヂュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、バチルスメガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルスコアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルスサーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルスレンタス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、及びバチルスツリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）を含むがこれらに限定されない、当業者にバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属であると認識されている全ての種を含む。バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属は系統的な再編成がなされ続けていることは理解されている。従って、現在ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）と呼ばれているバチルスステアロデレモフィリス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のような有機体に、再分類された種も含む。酸素の存在において耐性のある内性胞子の生成はバチルス属の決定的な特徴をであるが、この特徴は、近年アリシクロバチルス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アンフォバチルス（Ａｍｐｈｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アネウリンバチルス（Ａｎｅｕｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アノキシバチルス（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、フィロバチルス（Ｆｉｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、グラシリバチルス（Ｇｒａｃｉｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、ハロバチルス（Ｈａｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、サリバチルス（Ｓａｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、セルモバチルス（Ｔｈｅｒｍｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ウレイバチルス（Ｕｒｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、及びビルギバチルス（Ｖｉｒｇｉｂａｃｉｌｌｕｓ）と呼ばれている属にも当てはまる。

本明細書において、「プロモーター配列」の語は発現目的のためのバクテリア宿主により認識されるＤＮＡ配列を意味する。好適な態様において、プロモーター配列は融合タンパク質をコードしているＤＮＡ配列に作動可能結合している。そのような結合は風用ＤＮＡ配列をコードしているＤＮＡ配列の翻訳開始コドンに関するプロモーターの位置決めを含む。特に好適な態様において、このプロモーター配列は融合ＤＮＡ配列の発現を仲介する転写及び翻訳制御配列を含む。

本明細書において、核酸配列は、他の核酸配列と機能的な位置関係に置き換えられた場合、「作動可能に結合している」という。例えば、分泌リーダーをコードしているＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与しているプレタンパク質として発現されている場合、このポリペプチドに対するＤＮＡに作動可能に結合している、プロモーター又はエンハンサーは配列の転写の影響する場合、コード配列に作動可能に結合している、あるいはリボゾーム結合部位は翻訳を促進するような位置にある場合、コード配列に作動可能に結合しているという。作動可能に結合しているＤＮＡ配列は通常連続的であり、分泌リーダーの場合、連続的でリーディングフェーズ中にある。しかしながら、エンハンサーは連続的である必要はない。結合は利用可能な制限部位において結合されることにより達成される。もしそのような部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが従来技術に従って用いられる。

本明細書において、「組換え体」は、異種核酸配列の導入により修飾細胞ベクター又はそのように修飾細胞由来の細胞を意味する。従って、例えば、組換え細胞は、意図的な人為的介入の結果として、発現できる又は全く発現できない状況下で、細胞の天然形態（非組み換え体）内で形成されたものとは違う遺伝を発現するか、又は他の過剰発現された天然遺伝組を発現する。

本明細書において、「パーソナルケア組成物」の用語は皮膚、ヘア、ネイル、歯に適用し、これらの表面及び膜を改善、洗浄、美化、処理、及び／又はケアする目的で用いられる。幾つかの態様において、このパーソナルケア組成物は栄養クリーム又はローション等の懸濁水、スキントナー、栄養乳液、栄養クリーム、マッサージクリーム、トリートメントクリーム、リポソームデリバリーシステム、局所的フェイスパック又はマスク等の安定化ゲル又は分散システム、シャンプー又はボディーウォッシュ、エアロゾル又はスプレー式ディスペンジョン又は乳液、ヘア又はスキンコンデョショナー、スタイリングエイ等の界面活性剤ベース洗浄システム、あるいは液体、クリーム、固形無水又はペンシル形態のマスカラ等の顔料製品の形態である。しかしながら、本発明において各種形態を用いることができるから、本発明は特定の形態に限定することを意図しない。

パーソナルケア組成物は、化粧品、パーソナルケア製品において用いる市場製品（ＯＴＣ）として分類することができる（例えば、化粧品、スキンケア、オーラルケア、ヘアケア、ネイルケア）。幾つかの態様において、修飾変異ＢＢＰＩはヘアケア組成物、スキンケア組成物、ネイルケア組成物、化粧組成物、又はこれらの任意の組み合わせ等のパーソナルケアに適用される。

本明細書において、「スキンケア組成物」の語はしわの最小化、しわ除去、脱色、着色、皮膚柔軟化、皮膚の潤滑化、脱毛、洗浄等を含むがこれらに限定されない有利な性質を提供するために皮膚に適用される。幾つかの好適な態様において、本発明はスキントーンを改善するスキンケア組成物を提供する。これらの態様において、改善はしわの減少、スムージング、スキンテクスチャー、皮膚の色味の変更、及び他の化粧的利点を含む。更なる態様において、このスキンケア組成物はボディーウォッシュ、保湿性ボディーウォッシュ、デオドラントボディーウォッシュ、抗菌洗浄剤、スキン保護クリーム、ボディーローション、顔用クリーム、保湿クリーム、顔用洗浄乳液、界面活性剤ベース顔用洗浄剤、顔用ピーリングゲル、顔用トナー、ピーリングクリーム、顔用マスク、アフターシェーブローション、バーム、及び／又は放射線保護組成物（例えば、サンスクリーン）からなる群より選択される。

本明細書において、「化粧組成物」は化粧に用いる組成物を意味する。連邦食品医薬品化粧品法（ＦＤ＆ＣＡｃｔ）の定義が本明細書に用いられる。従って、化粧品はそれらの意図する使用により定義され、洗浄、美化、魅力を促進する、又は外観を変えるためにこすり付ける、注ぐ、振り掛ける、又はスプレーする、又はたの手段で人体に適用される。ここれらの組成物は治療的効果なく、医薬品として調製されない。しかしながら、幾つかの場面において、化粧組成物は、化粧組成物のカラーリング又は他の利点のための化粧組成物の利用だけでなく、化粧品の利点を提供するために医薬品に含まれることがある。化粧組成物は本明細書ではメイクアップ組成物を含むと定義する。本発明はヒト意外の動物への化粧品の使用も包含する。

本明細書において、「医薬品組成物」及び「治療用組成物」の語は化粧的利益よりもむしろ医療的利益を提供する医薬品のような組成物を意味する。米国では、医薬品組成物及び治療用組成物は食品医薬品局により特定の条件の治療及び予防について承認されている。

本明細書において、「薬品」の語は連邦食品医薬品化粧品法（ＦＤ＆ＣＡｃｔ）の定義によるものである。従って、薬品は病気の診断、治療、緩和、治療、及び予防に用いるために意図された製品、及びヒト又はたの動物の体の構造又は任意の機能に影響を与える（食品以外の）製品であると定義される。

本明細書において、「リーブオン（ｌｅａｖｅ−ｏｎ）」の語は、固体に適用され、組成物に曝される領域が洗浄される前に通常数時間（例えば、４乃至１２時間）の間除去（例えば、洗浄、すすぎ等による除去）がなされない組成物を意味する。

本明細書において、「リンスオフ（ｒｉｎｓｅ−ｏｆｆ）」組成物は適用され、適用してすぐに（通常約適用の３０分以内）に（洗浄、すすぎ等により）洗浄される組成物を意味する。幾つかの好適な態様において、リンスオフ組成物は処理される領域に機能するのに効果的な量が付着するように製剤化されている。

本明細書において、「化粧的利益」の語はパーソナルケア組成物の投与からえら得た所望の化粧的変化を意味する。化粧的利益は、皮膚、ヘア、ネイル、及び歯の状態を含むがこれらに限定されない利益を含む。好適な態様において、少なくとも１つの化粧的利益は本発明のスキンケア、ヘアケア、ネイルケア、及びメイクアップ組成物により提供される。

本明細書において、「化粧組成物に利用可能な」の語は、合理的な利益／リスク比のつりあいの取れた、毒性、不相溶性、不安定性、炎症、アレルギー反応等を伴わずに、ヒト及び／又はたの動物の組織に接触させるのに好適な物質を意味する。

本明細書において、「顔料」、「カラーピグメント」、及び「ダイ」の語は組成物に色を提供する又は組成物を適用する表面（例えば、スキン及び／又はヘア）に色を付与する、本願発明の組成物に含まれる任意の化合物を意味する。

「放射能保護」の語はＵＶ放射をブロック又はフィルタリングすることができる物質を意味し、サンスクリーン及びサンブロックがある。

本明細書において、「皮膚の外観及び／又は状態の改善」の語は本発明のパーソナルケア組成物の使用により達成される利益を意味する。利益の例とては、皮膚の着色部分及び／又は皮膚の色素沈着を明るくすることを含むスキンカラーにおける汚れ及び／又は傷跡を減らすこと、乾燥の緩和、きめの粗さ及び乾燥部位の排除、水分を保持すること及び／又は環境ストレスから保護する能力を改善すること、細かいライン及びしわの外観を減らすこと、外観及びスキントナーの改善、皮膚の硬度及び／又は柔軟性の増加、皮膚のたるみの減少、皮膚の輝き及び透明度の増加、皮膚の再生プロセスの増加、及び／又は産毛の除去を含むがこれらに限定されない。幾つかの態様において、皮膚の外観及び／又は状態の改善は本発明のパーソナルケア組成物で皮膚の病気を治療することにより改善する。

「血管形成」の語は血管の発達となる、及び／又は有機体の組織の血管形成が高まる、生物学的プロセスを意味する。

「血管形成性疾患」、「血管形成性疾病」、及び「血管形成性皮膚疾患」の語は一般的に皮膚病、又は組織において連続的な血管形成又は血管形成の結果として生じる関連する疾患を意味する。しばしば、血管形成疾病の原因はしられていない。しかしながら、血管形成が疾病状態の実際的な原因であるか又は単なる疾病の状態であるかは、重要ではない。しかし、疾病の状態又はコンディションを処理又は改善することにおいて血管形成を抑制することは本発明の重要な側面である。従って、本発明は活性の特定のメカニズムに限定されない。本発明の化合物を用いて処理するのに好適な血管形成性の皮膚病の例としては、乾癬、ニキビ、酒さ、湿疹、血管種及びリンパ管形成、スタージ・ウェーバー症候群、神経線維腫症、結節硬化症、慢性炎症性浸潤症、及び関節炎を含むがこれらに限定されない。一次的又は二次的特徴として、脈管化を有する皮膚病は本明細書における血管形成性皮膚病であると考えられる。従って、本発明により提供されるＶＥＧＦ結合ＢＢＰＩ（ＶＥＧＦ−ＢＢＰＩｓ）を含むパーソナルケア組成物は幅広い血管形成性皮膚病及び／又はコンディションの処理に用いることができる。

「酒さ」の語は通常鼻及び頬の連続的な部分を含む、血管形成及び濾胞拡張によち特徴付けられるニキビ、酒さ、又は紅斑に用いられる。酒さは、非常にマイルドではあるが頑固な紅斑から根深い丘疹及び吹出物を有する脂線の広範囲にわたる過形成まで変化し、影響された紅斑部位における毛細血管拡張により生じる。このコンディションはコンディションの感受性に依存して「肥大性酒さ」又は「鼻瘤」とも言われる。この用語はコンディションの全形態を含む。

「乾癬」の語は、限局性の、不連続及び融合性の、赤みを帯びた、銀色の鱗屑を伴うことにより特徴づけられる発疹を意味する。本発明を特定の身体部位に限定することは意図しないけれども、乾癬病巣は通常ひじ、ひざ、頭皮、及び胴体に発生する。微視的に、これらの領域は特徴的な錯角化及び乳頭間隆起の延伸を示す。

「ニキビ」の語は、脂肪質的か外観を含む炎症性小胞、丘疹及び膿胞の発生により特徴付けられる皮膚の状態について用いる。数多くのニキビの形態があるけれども、最も一般的な形態は顔、背中上部、及び胸に発生することにより特徴づけられる、炎症性の基底部上のニキビ、嚢胞、丘疹、吹出物からなる、ニキビとして知られているものである。このコンディションは主に、ホルモンの活性により影響を受けると信じられている脂肪腺の過活動に依存する、成熟期及び思春期の間に発生する。

「湿疹」の語は、急性又は慢性の皮膚の炎症状態、典型的な紅斑、水腫状、丘疹、水疱、及び／又は痂皮形成を説明するために用いる。これらの状態はしばしば苔蘚化、鱗化に続き、時折、紅斑、頻度が低いが、色素沈着過度に次いで起こる。湿疹はしばしば引っかき及び焼けどした場所に発生する。湿疹小嚢は表皮内の海面状態に依存して形成する。湿疹は「皮疹」、「乾燥皮疹」、及び「鱗状皮疹」として口頭表現的に言われている。数多くの湿疹のサブカテゴリーがあるが、それらの全ては本発明の化合物の１つ以上により治療できる。

「血管腫」の語は、内皮細胞（血管の内側を覆う細胞）の自己退縮腫瘍を意味する。血管腫は循環システムと結合しており、血液で満たされている。外観は位置に依存している。もし血管腫が皮膚の表面にあるなら、熟したイチゴのように見える、もし皮膚の下にあるなら、青みがかったコブにみえる。ときどき、血管腫は肝臓又は喉頭のような内部器官内で成長する。約８０％は顔及び首に存在する、次いで最も多く存在するのが肝臓である。本発明のパーソナルケア組成物は皮膚を血管腫、即ち、皮膚表面の血管腫及び皮膚の直下の血管腫の治療を意図している。

「強皮症」の語は、皮膚又は他の器官におけるコラーゲンの広範囲にわたる沈着により特徴付けられる慢性的な病気である。強皮症は皮膚に影響を与え、より深刻なケースでは、血管及び内部器官に影響を与える。最も証拠的な症状は、皮膚の硬化であり、瘢痕化に関係している。この皮膚は硬く、赤く、鱗状の外観をしている。血管もより見えやすくなる。このプロセスにおいて有意なプレーヤーは、形質転換因子（ＴＧＦβ）である。強皮症の皮膚変化の局所的なトリートメントは疾病経過を変えることはできないが、痛み及び潰瘍形成を改善する。

本明細書において、「ヘアケア組成物」の語は濃厚化、間伐、着色、脱色、クレンジング、コンディショニング、柔軟化、形態維持等の利益的性質を提供を髪に提供するために適用される組成物を意味する。幾つかの態様において、このヘアケア組成物は、シャンプー、コンディショナー、抗ふけトリートメント、スタイリング剤、スタイリングコンディショナー、ヘアリペア又はトリートメント美容液、ローション、クリーム、ポマード、及び化学的トリートメントからなる群より選択される。他の態様において、このスタイリング剤はスプレー、ムース、リンス、ゲル、泡、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される。更なる態様において、ケミカルトリートメントは、パーマネントウェーブ、弛緩剤、及びパーマネント、セミパーマネント、テンポラリーカラートリートメント、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される。

本明細書において、「育毛抑制」及び「育毛の抑制」の語は毛の長さ及び／又は厚みが減少されることが観察されることを意味する。従って、幾つかの好適な態様において、本発明のパーソナルケア組成物の適用は、本発明のパーソナルケア組成物が適用されていない領域と比較すると毛の長さ及び／又は濃さを少なくすることに有利である。幾つかの態様において、毛の育成及び／又は濃さの観察された低減は、未処理領域と比較して１％未満乃至９９％以上であり、他の態様において、観察された減少は約１００％乃至約９０％、約加えて９０％乃至約８０％、約８０％乃至約７０％、約７０％乃至約６０％、約６０％乃至約５０％、約５０％乃至約４０％、約４０％乃至約３０％、約３０％乃至約２０％、約２０％乃至約１０％、約１０％乃至約１％である。即ち、目視（即ち、目により）又は他の方法で減少が観察される限り、低減のパーセンテージを限定することは意図しない。この語は、前述のように、任意の程度の「育毛を抑制」することを包含する。この語は完全な育毛の抑制（即ち、毛の育成が観察されない）に限定することは意図していない。

「皮膚の炎症性疾病」又は「炎症性皮膚病」の語は皮膚の炎症に関する皮膚コンディションを意味する。幾つかの態様において、この皮膚の炎症性疾患は、例えば、ＴＮＦαのような炎症性サイトカインのレベルが高くなることに関連して生じる疾患である。

本明細書において、幾つかの態様において、「化合物」の語は本発明のパーソナルケア組成物に含まれるＢＢＰＩを意味する。

「有効量」の語は、本発明の化合物の濃度又は量について、本明細書を通じて用いられ、疾病又は処理する状態が好ましく変化するための濃度又は量を意味する。例えば、この変化は育毛、育毛の抑制、疾病により生じた又は関係する状態の改善である。本明細書で用いるように、「安全で効果的な量」の語は、この物質が適用される領域において陽性変化を有意に誘発し、深刻な副作用が生じない、物質の有意量を意味する（合理的リスク／利益比）。この物質の安全で効果的な量は処理される特定の皮膚又は他の身体部位、処理される個体の年齢、処置される状態の重症度、処理の機関、連続する治療の性性質、用いらる物質、用いられるキャリアの性質等により変化する。当業者は組成物の所望の適用のための本明細書で提供されるパーソナルケア組成物の濃度を調節できる。

本明細書において「活性成分」の語は処置を受ける固体に利益を付与する組成物を意味する。例えば、幾つかの態様において、本発明は修飾ＢＢＰＩ、例えば、修飾ＶＥＧＦ−ＢＢＰＩ、適用する領域に利益を提供する「主要な活性成分」、を含むパーソナルケア組成物を提供する。従って、幾つかの態様において、修飾変異ＶＥＧＦ−ＢＢＰＩはスキンケア組成物中に存在し、血管形成性皮膚疾患を患っている固体の皮膚へ用いられる。利益を付与する本発明のパーソナルケア組成物中に追加的な成分があることから、この語をＶＥＧＦ−ＢＢＰＩに限定することは意図しない。幾つかの態様において、これらの追加的な成分は「第二活性成分」と表される。一次及び第二活性成分はまとめて本明細書において「活性成分」と言われる。本発明により提供される他の「一次活性成分」はＦＧＦ−ＢＢＰＩ、ＴＧＦ−ＢＢＰＩ、及びＴＮＦ−ＢＢＰＩを含む。

本明細書において、「ビタミンＢ３化合物」の語は以下の式を有する化合物を意味する。

式中、Ｒは−ＣＯＮＨ_２（即ち、ナイアシンアミド）、−ＣＯＯＨ（即ち、ニコチン酸）、又は−ＣＨ_２ＯＨ（ニコチニルアルコール）、又はこれらの誘導体、及びこれらの任意の塩である。

本明細書において、「非血管拡張性の」の語はエステルが個体の皮膚への適用の後視認できる赤味反応を通常生じないことを意味する。そのような化合物は裸眼では視認できない血管拡張引き起こすけれども、一般的な集団の大部分は視認可能な赤味反応を経験していないことを意図する。

本明細書において、「レチノイド」の語はビタミンＡの天然及び／又は合成アナログ及び／又は皮膚にビタミンＡの生物学的活性を与えるレチノール様化合物、並びにこれらの化合物の異性体及び立体異性体を含む。しかしながら、この語をこれらの化合物に限定することを意図しない。この語はビタミンＡアルコール（レチノール）及びビタミンＡアルデヒド（レチナール）、ビタニンＡアシド（レチノイン酸）、及びビタミンＡエステル（例えば、レニチニルアセテート、レチニルプロピオネート、レチニルパルミテート）等を含む。更に、この語は全てのトランス酸及び１３−シス−レチオノイン酸を含むことを更に意図する。この語は、各種使用形態だけでなく、カプセル化された組成物も包含することも意図する。「レチノール」及び「レチナール」の語は好ましくは全てのトランス化合物を包含する。本発明の製剤に好適に用いるレチノイドは全てのトランスレチノールであり、一般的に「レチノール」といわれているものである。

本明細書において、「カロテノイド」の語はβ−カロチン、リコピン、ルテイン、アスタキサンチン、ゼアキサンチン、クリプトキサンチン、シトラナキサンチン、カンタキサンチン、ビキシン、β−アポ−４−カロテナール、β−アポ−８−カロテナール、β−アポ−８−カロチノイドエステル、単独及びこれらの組合せを意味する。好適に用いられるカロテノイドはβ−カロテン、リコピン、ルテイン、アスタキサンチン、ゼアキサンチン、ソチラナキサンチン、及びカテナキサンチンである。幾つかの態様において、カロテノイドは結晶形態、及び乾燥粉末を含むがこれらに限定されない製剤の形態で用いられる（例えば、乾燥粉末についてＥＰ００６５１９３参照。本文献を参照により本明細書に援用する）。幾つかの態様において、リコピン、アスタキサンチン、ゼアキサンチ、及びソチラナキサンチンンの場合に好適に用いられるものは、リコピン、アスタキサンチン、及びカンタキサンチン含有乾燥粉末であり、例えば、ＬＹＣＯＶＩＴ^（商標）、ＬＵＣＡＮＴＩＮ^（商標）、ＰｉｎｋａｎｄＬＵＣＡＮＴＩＮ^（商標）Ｒｅｄ（ＢＡＳＦＡＧ、Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙより入手可能なリコピン、アスタキサンチン、及びカンタキサンチンの１０％乾燥粉末）がある。

本明細書において、「分散相」の語は乳液工業分野の当業者により、連続相中に懸濁されている、及び連続相に囲まれている小さな粒子及び液滴として存在する相として用いられている。分散相は「内部」又は「不連続」相としても知られている。

本明細書において、「浸透促進剤」の語は、上部の角質層バリアを通って皮膚の深層部への浸透を促進する組成物を意味する。浸透促進剤の例としては、プロピレングリコール、ａｚｏｎｅ、エトキシジグリコール、ジメチルイソソルビトール、尿素、エタノール、ジメチルスルホキシド、ミクロエマルジョン、リポソーム、及びナノエマルジョンを含むがこれらに限定されない。

本明細書において、「乳化剤」及び「界面活性剤」の語は物質の連続相内で分散剤を分散及び懸濁する化合物を意味する。界面活性剤は皮膚及び／又は毛髪洗浄を意図する目的において特に用いられている。特定の態様において、「界面活性剤」の語は表面活性剤を意味し、この表面活性剤は乳化剤として、又は皮膚の洗浄のような、他の界面活性目的で用いられる。

各種態様において、本発明はＵＶ吸収剤（例えば、オクチルメトキシシナメート、ベンゾフェノン−３、二酸化チタン、及びオクチルザリシレート）のような「保護剤」、フィルム形成剤（例えば、ＶＰ／エイコセンコオリマー）、化粧料（例えば、ペプチド及びタンパク質、アルファヒドロキシ酸、及びレチノール及びレチノン酸及びこれらの誘導体）、抗酸化剤（例えば、トコフェロール及びこれらの誘導体、及びアスコルビン酸及びこれらの誘導体）、ビタミン（例えば、Ｂ、Ｄ、Ｋ及びこれらの誘導体）、制汗剤（例えば、水酸化アルミニウム及び水酸化ジルコニウム）、脱毛剤（チオグリコール塩）、抗にきび剤（例えば、サリチル酸及び過酸化ベンゾイル）、接着剤及び剥離剤（例えば、シリケート、パミス、及びポリエチレン）、並びに植物、フルーツ、野菜、及び／又は海洋性源の抽出物も含む。

本明細書において、「生物学的活性」の語は組成物及び生体システムの間に起こる及び影響を与える関係を意味する。従って、この語はバイオテクノロジー及び生物学の当業者により、分子成分と生きている生物（例えば、組織、細胞等）の間の原因と影響の関係を説明する用語として用いられている。

本明細書において、「生物学的活性成分」の名詞は、生物（例えば、組織、細胞等）へ投与したときに生物学的活性を引き起こす組成物を意味する。この用語は「生物学的活性化合物」と同じ意味で用いる。

本明細書において、「シリコンゴム」の語は約２００，０００を超える、好ましくは約２００，０００乃至４，０００，０００の間の平均分子量を有する高分子量シリコンを意味する。この定義は非揮発性ポリアルキル及びポリアリルシロキサンゴムを含む。

本明細書において、修飾変異ＢＢＰＩを含む組成物」は、広義には所与の修飾変異ＢＢＰＩを含む任意の組成物を意味する。この組成物は任意の形態でよく、特に投与に好適な形態である。

本明細書において、化合物が任意の所望のルート（例えば、局所的、経口等）によりヒト又は他の動物に投与されたときに、「投与に好適な形態で」あるという。

本明細書において、「安全及び効果的な量」は物質を適用したときに陽性変化を有意に誘発し、深刻な副作用を起こさない十分量を意味する（合理的リスク／利益比）。この物質の安全かつ効果的な量は、処置される特定の皮膚及び他の身体部分、処置される個体の年齢、処置される状態の重症度、治療の期間、連続する治療の性質、用いられる特定の物質、用いられる特定の担体等により変化する。当業者は組成物の所望の適用のための本明細書で提供されるパーソナルケア組成物の濃度を調節することができる。
５．２ボウマンブリックプロテアーゼインヒビター骨格

ボウマンブリックプロテアーゼインヒビター（ＢＢＰＩ）は小タンパク質（６０乃至９０残基）の動態的及び構造的に良く特徴づけされたファミリーであり、植物の任意の他の部位において、発見されていない（例えば、Ｂｉｒｋ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．ＰｒｏｔｅｉｎＲｅｓ．，２５：１１３−１３１［１９８５］参照）。多くの野生型ＢＢＰＩ骨格の配列は単子類及び双子葉類の両方の種子から同定されており、解析されている（Ｐｒａｋａｓｈｅｔａｌ．，ＪｍｏｌＥｖｏｌ４２：５６０−５６９［１９９６］）。これらは通常、独立した結合ドメインをそれぞれ含む２つの三環系ドメインの対称構造を有するが、１つのドメインを有するもの、２つより多いドメインを有するものもある。ダイズから単離された主要な８ｋＤａまでのボウマンブリックインヒビター（ＢＢＰＩ）は２つの分離した反応部位ループを有し、ループ１はトリプシン様特異性を有するプロテアーゼを抑制し、ループＩＩはキモトリプシン様特異性を有するプロテアーゼを抑制する（例えば、Ｃｈｅｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：１９９０−１９９４［１９９２］；ＷｅｒｎｅｒａｎｄＷｅｍｍｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３１：９９９−１０１０［１９９２］；Ｌｉｎｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１２：５４９−５５５［１９９３］；Ｖｏｓｓｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２４２：１２２−１３１［１９９６］；及びＢｉｌｌｉｎｇｓｅｔａｌ．，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８９：３１２０−３１２４［１９９２］参照）。これらの結合領域はそれぞれ「標準ループ」構造を含む。これは、各種セリンプロテアーゼインヒビターにおいて見られるモチーフである（ＢｏｄｅａｎｄＨｕｂｅｒ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０４：４３３−４５１［１９９２］）。幾つかの態様において、野生型ＢＢＰＩ骨格は変異体及び修飾変異ＢＢＰＩ骨格の野生型前駆体ＢＢＰＩとしての役割がある。

幾つかの態様において、本発明は、トリプシン（ループＩ）及び／又はキモトリプシン（ループＩＩ）が変異ペプチドで置換された変異ＢＢＰＩ骨格を提供する。幾つかの態様において、このトリプシンループは変異ペプチドで置換され、キモトリプシン抑制活性（ＣＩＡ）を保持している変異ＢＢＰＩとなる。他の態様において、キモトリプシンループが変異ペプチドで置換され、トリプシン抑制活性（ＴＩＡ）を保持している変異ＢＢＰＩを生成する。更なる態様において、ＢＢＰＩのトリプシン及びキモトリプシンループはそれぞれ変異ペプチドで置換される。トリプシン及び／又はキモトリプシンループが変異ペプチド配列で置換されているＢＢＰＩ骨格の非限定的な例は野生型及び未修飾変異骨格を含む。野生型前駆体骨格はグリシンマックス（Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ）（ＢＢＩ；ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）由来ダイズインヒビターの骨格又はそれらの成熟又は切断形態等のＰｒａｋａｓｈ（上記）により開示された骨格（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８５；ＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＡＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＳＤＭＲＬＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＩＣＡＬＳＹＰＡＱＣＦＣＶＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ）、ドリコスビフロラス（Ｄｏｌｉｃｈｏｓｂｉｆｌｏｒｕｓ）（ＢＢｄｂ；ＳＥＱＩＤＮＯ：４４９；ＰＳＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＡＣＴＫＳＩＰＰＱＣＲＣＴＤＶＲＬＮＳＣＨＳＡＣＳＳＣＶＣＴＦＳＩＰＡＱＣＶＣＶＤＭＫＤＦＣＹＥＰＣＫ）由来インヒビター、グリシンマックス（Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ）（ＢＢｓｂ３；ＳＥＱＩＤＮＯ：４５０；ＤＤＥＹＳＫＰＣＣＤＬＣＭＣＴＲＳＭＰＰＱＣＳＣＥＤＩＲＬＮＳＣＨＳＤＣＫＳＣＭＣＴＲＳＱＰＧＱＣＲＣＬＤＴＮＤＦＣＹＫＰＣＫＳＲＤＤ）由来Ｄ−ＩＩダイズインヒビター、及びトレセアセアレンシス（Ｔｏｒｒｅｓｅａ（Ａｍｂｕｒａｎａ）ｃｅａｒｅｎｓｉｓ）（ＢＢｔｃ；ＳＥＱＩＤＮＯ：４５１；ＳＳＫＷＥＡＣＣＤＲＣＡＣＴＫＳＩＰＰＱＣＨＣＡＤＩＲＬＮＳＣＨＳＡＣＥＳＣＡＣＴＨＳＩＰＡＱＣＲＣＦＤＩＴＤＦＣＹＫＰＣＳＧ）由来インヒビターがある。

未修飾変異前駆体骨格の例は、キモトリプシンループがＶＥＧＦ結合変異配列で置換されているものを含むがこれらに限定されない。具体的には、ＢＢＩ−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８６；ＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＡＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＳＤＭＲＬＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＡＣＹＮＬＹＧＷＴＣＦＣＶＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥＤＤＫＥＮ）、
ＢＢＩｔ−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７；ＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＡＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＳＤＭＲＬＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＡＣＹＮＬＹＧＷＴＣＦＣＶＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ）、
ＢＢｄｂ−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５２；ＤＰＳＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＡＣＴＫＳＩＰＰＱＣＲＣＴＤＶＲＬＮＳＣＨＳＡＣＳＳＣＡＣＹＮＬＹＧＷＴＣＶＣＶＤＭＫＤＦＣＹＥＰＣＫ）、
ＢＢｓｂ３−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５３；ＤＰＤＤＥＹＳＫＰＣＣＤＬＣＭＣＴＲＳＭＰＰＱＣＳＣＥＤＩＲＬＮＳＣＨＳＤＣＫＳＣＡＣＹＮＬＹＧＷＴＣＲＣＬＤＴＮＤＦＣＹＫＰＣＫＳＲＤＤ）、及び
ＢＢｔｃ−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５４；ＤＰＳＳＫＷＥＡＣＣＤＲＣＡＣＴＫＳＩＰＰＱＣＨＣＡＤＩＲＬＮＳＣＨＳＡＣＥＳＣＡＣＹＮＬＹＧＷＴＣＲＣＦＤＩＴＤＦＣＹＫＰＣＳＧ）、
ＢＢＩｔ−ＶＥＧＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４０；ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＲＤＡＲＰＮＡＣＨＳＡＣＫＳＣＡＣＫＹＹＬＹＷＷＣＫＣＴＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ）、
ＢＢＩｔ−ＶＥＧＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４１；ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＲＤＡＲＰＮＡＣＨＳＡＣＫＳＣＡＣＴＬＷＫＳＹＷＣＫＣＴＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ）、及び
ＢＢＩｔ−ＶＥＧＫＤ（ＳＥＩＤＮＯ：６４２；ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＲＤＡＲＰＮＡＣＨＳＡＣＫＳＣＡＣＫＹＤＬＹＷＷＣＫＣＴＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ）を含む。幾つかの態様において、未修飾変異前駆骨格は野生型ＢＢＰＩのキモトリプシンループを変異ペプチドが置換し、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７のＢＢＰＩの４０位に等しい位置においてアミノ酸置換の置換が導入されている変異骨格である。例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７（ＢＢＩｔ−ＡＶ）の未修飾変異ＢＢＰＩ骨格は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８５の野生型前駆体骨格においてＳＥＱＩＤＮＯ：１８５のキモトリプシンループをＳＥＱＩＤＮＯ：９のＶＥＧＦ変異エペプチドで置換したもの由来である。キモトリプシンループの置換のほかに１４０Ａのアミノ酸置換も導入されている。ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の未修飾変異ＢＢＰＩは修飾変異ＢＢＰＩを生成するために修飾される。ここにおいてキモトリプシンループの置換に加えて以下で説明するような即ち、１つのアミノ酸置換が導入されている。

ＢＢＩの多くの異性体が特徴付けられているけれども、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３は約７１アミノ酸残基を含む幾つかの態様において用いた野生型ＢＢＰＩ骨格のアミノ酸配列の例である（実施例１参照）。幾つかの態様において、本発明は、ＢＢＰＩ骨格、例えば、ＳＥＩＤＮＯ：１１を提供する。ＳＥＱＩＤＮＯ：１１はプロ領域を含む。他の態様では、本発明はプロペプチドが除去されているＢＢｉを提供する。例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８５。更なる態様において、本発明はＮ末端又はＣ末端から１０このアミノ酸が除去されたＢＢＩ骨格を提供する。幾つかの態様において、本発明は５まで（アミノ酸置換を含む？）のＢＢＩ骨格、例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７を提供する。ＢＢＩ骨格の切断はＢＢＩの標的タンパク質への結合能力を阻害しないことが評価されるであろう。

ダイズにおいて、ＢＢＰＩ、例えば、ＢＢＩが１９アミノ酸長さのＮ末端プロペプチドを有するプロタンパク質として生成される。従って、幾つかの態様において、ＢＢＩはプロタンパク質の全て又は少なくとも一部で生成される。幾つかの態様において、ＢＢＩは切断され、Ｎ末端又はＣ末端のいずれかから１０アミノ酸残基程度が切断される。例えば、種子の発生において、幾つかのＢＢＰＩ分子が切断されたＣ末端９又は１０アミノ酸を有している。従って、タンパク質分解は一般的に初期のジスルフィド及び最終のジススルフィド結合、標的タンパク質に結合に通常邪魔をしない配列に依存している。しかしながら、ＢＢＰＩの異性体又は切断形態のいずれか１つが本発明の各態様に用いることは理解されている。幾つかの態様において、本発明に用いることができるＢＢＰＩの切断形態はキモトリプシンループが前述の変異配列で置換されている変異ＢＢｌｔである。
５．３変異ＢＢＰＩ

前述のように、ＢＢＰＩはプロテアーゼを抑制するループ（即ち、トリプシン及びキモトリプシンループ）を有する。本発明は野生型又は１つ以上の反応部位において未修飾変異ＢＢＰＩ前駆体骨格由来の変異ＢＢＰＩ（例えば、ＢＢＰＩのループＩ（トリプシン）及び／又はループＩＩ（キモトリプシン）が標的タンパク質に結合する変異タンパク質で置換されている）を提供する。本発明のＢＢＰＩに含まれる変異タンパク質が結合する標的タンパク質の非限定的な例としては、各種サイトカインがあり、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーのサイトカイン、特にＴＮＦ−α；形質転換成長因子ファミリーのサイトカイン、特に、ＴＧＦ−β；繊維芽細胞成長因子ファミリー（ＦＧＦ）のサイトカイン、特にＦＧＦ−５、及び血管内皮成長因子（ＶＦＧＦ）ファミリーのサイトカイン、特にＶＥＧＦ−Ａを含む。更に、本発明のＢＢＰＩの１つ又は両方のループを置換する変異ペプチドは、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、又はＣ５インヒビター、コンプスタチン（Ｃｏｍｐｓｔａｔｉｎ）、及びタンパク質の所望のタンパク質等の補体経路の抑制に影響するペプチドを含む。即ち、本発明をこれらのループのいずれに置換する特定の配列に限定することは意図していない。任意の好適な配列を本発明に用いることができる。

幾つかの態様において、ＢＢＰＩ前駆体骨格のトリプシン及び／又はキモトリプシンループをＶＥＧＦに結合する変異配列で置換して、変異ＶＥＧＦ−ＢＢＰＩタンパク質を生成する。幾つかの態様において、この変異ＢＢＰＩは野生型、あるいはグリシンマックス（Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ）（ＢＢＩ；ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）由来大豆インヒビターの骨格又はこの切断形態（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８５）、ドリコスビフロラス（Ｄｏｌｉｃｈｏｓｂｉｆｌｏｒｕｓ）（ＢＢｄｂ；ＳＥＱＩＤＮＯ：４４９）由来インヒビター、グリシンマックス（Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ）（ＢＢｓｂ３；ＳＥＱＩＤＮＯ：４５０）由来大豆インヒビターＤ−ＩＩ、トレセアセアレンシス（Ｔｏｒｒｅｓｅａ（Ａｍｂｕｒａｎａ）ｃｅａｒｅｎｓｉｓ）（ＢＢｔｃ；ＳＥＱＩＤＮＯ：４５１）由来インヒビター、（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８６）のＢＢＩ−ＡＧＶ骨格、（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７）のＢＢＩｔ−ＡＶ骨格、（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５２）のＢＢｄｂ−ＡＶ骨格、（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５３）のＢＢｓｂ３−ＡＶ骨格、（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５４）のＢＢｔｃ−ＡＶ骨格、（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４０）のＢＢＩｔ−ＶＥＧＫ骨格、（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４１）のＢＢＩｔ−ＶＥＧＴ骨格、及び（ＳＥＩＤＮＯ：６４２）のＢＢＩｔ−ＶＥＧＫＤ骨格から選択される。更に、Ｐｒａｋａｓｈら上記に記載のような野生型ＢＢＰＩ前駆体骨格も変異ＢＢＰＩ骨格を用いるために生成される。

幾つかの態様において、変異ＶＥＧＦ変異配列はＵ．Ｓ．ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓＳｅｒｉａｌＮｏｓ．０９／８３２，７２３及び１０／９８４，２７０に記載のＶＥＧＦ−結合ペプチドを含むがこれらに限定されない。具体的には、ＡＣＹＮＬＹＧＷＴＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：９）、ＫＹＹＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５８）、ＴＬＷＫＳＹＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５９）、ＤＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４６０）、ＳＫＨＳＱＩＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４６８）、ＫＴＮＰＳＧＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４６９）ＲＰＴＧＨＳＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４７０）、ＫＨＳＡＫＡＥ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４７１）、ＫＰＳＳＡＳＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４７２）、ＰＶＴＫＲＶＨ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４７３）、ＴＬＨＷＷＶＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９２）、ＰＹＫＡＳＦＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９３）、ＰＬＲＴＳＨＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９４）、ＥＡＴＰＲＯＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９５）、ＮＰＬＨＴＬＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９６）、ＫＨＥＲＩＷＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９７）、ＡＴＮＰＰＰＭ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９８）、ＳＴＴＳＰＮＭ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９９）、ＡＤＲＳＦＲＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５００）、ＰＫＡＤＳＫＱ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０１）、ＰＮＱＳＨＬＨ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０２）、ＳＧＳＥＴＷＭ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０３）、ＡＬＳＡＰＹＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０４）、ＫＭＰＴＳＫＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０５）、ＩＴＰＫＲＰＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０６）、ＫＷＩＶＳＥＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０７）、ＰＮＡＮＡＰＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０８）、ＮＶＱＳＬＰＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０９）、ＴＬＷＰＴＦＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１０）、ＮＬＷＰＨＦＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１１）、ＳＬＷＰＡＦＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１２）、ＳＬＷＰＨＦＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１３）、ＡＰＷＮＳＨＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１４）、ＡＰＷＮＬＨＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１５）、ＬＰＳＷＨＬＲ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１６）、ＰＴＩＬＥＷＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１７）、ＴＬＹＰＱＦＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１８）、ＨＬＡＰＳＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１９）の配列を含む。幾つかの他の態様において、ＶＥＧＦ変異配列はＵ．Ｓ．ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＳｅｒｉａｌＮｏ．１１／９１９，７１７に記載のＶＥＧＦ結合ペプチドを含むがこれらに限定されない。具体的には、ＫＹＹＬＳＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２０）、ＷＹＴＬＹＫＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２１）、ＴＹＲＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２２）、ＲＹＳＬＹＹＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２３）、ＹＹＬＹＹＷＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２４）、ＮＹＱＬＹＧＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２５）、ＴＫＷＰＳＹＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２２６）、ＴＬＷＫＳＹＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２７）、ＰＬＷＰＳＹＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２８）、ＲＬＷＰＳＹＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２９）、ＴＬＷＰＫＹＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３０）、ＫＹＤＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ；５３１）、ＲＹＤＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３２）、ＤＹＲＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３３）、ＤＹＫＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３４）、ＥＹＫＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３５）、及びＲＹＰＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３６）のペプチドを含む。

幾つかの態様において、ＢＢＰＩ前駆体骨格のトリプシン及び／又はキモトリプシンループはＦＧＦ５と影響しあう変異配列で置換して、変異ＢＢＰＩタンパク質を生成する。幾つかの態様において、この変異ＢＢＰＩは野生型又はグリシンマックス（Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ）（ＢＢＩ；ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）由来の大豆インヒビターの骨格又はこれらの成熟又は切断形態（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８５）、ドリコスビフロラス（Ｄｏｌｉｃｈｏｓｂｉｆｌｏｒｕｓ）（ＢＢｄｂ；ＳＥＱＩＤＮＯ：４４９）由来インヒビター、グリシンマックス（Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ）（ＢＢｓｂ３；ＳＥＱＩＤＮＯ：４５０）由来大豆インヒビターＤ−ＩＩ、トレセアセアレンシス（Ｔｏｒｒｅｓｅａ（Ａｍｂｕｒａｎａ）ｃｅａｒｅｎｓｉｓ）（ＢＢｔｃ；ＳＥＱＩＤＮＯ：４５１）由来インヒビター、（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８６）のＢＢＩ−ＡＶ骨格、（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７）のＢＢＩｔ−ＡＶ骨格、（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５２）のＢＢｄｂ−ＡＶ骨格、（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５３）のＢＢｓｂ３−ＡＶ骨格、（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５４）のＢＢｔｃ−ＡＶ骨格、（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４０）のＢＢＩｔ−ＶＥＧＫ骨格、（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４１）のＢＢＩｔ−ＶＥＧＴ骨格、及び（ＳＥＩＤＮＯ：６４２）のＢＢＩｔ−ＶＥＧＫＤ骨格から選択される未修飾変異ＢＢＰＩ前駆体骨格由来である。

幾つかの態様において、このＢＢＰＩ前駆体骨格のトリプシン及び／又はキモトリプシンループはＦＧＦ５と相互作用する変異配列で置換される。幾つかの態様において、このＦＧＦ５変異配列はＵ．Ｓ．ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＳｅｒｉａｌＮｏｓ．１０／９８４，４１０及び１２／０３３，８４８に記載のＦＧＦ５結合ペプチドを含むがこれらに限定されない。具体的には、ＣＡＣＲＴＱＰＹＰＬＣＦ（ＭＭ００７；ＳＥＱＩＤＮＯ：４３０）、ＣＩＣＴＷＩＤＳＴＰＣ（ＰＳ２；ＳＥＱＩＤＮＯ：４３１）、ＣＹＧＬＰＦＴＲＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３７）、ＣＥＥＩＷＴＭＬＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３８）、ＣＷＡＬＴＶＫＴＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３９）、ＣＬＴＶＬＷＴＴＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４０）、ＣＴＬＷＮＲＳＰＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４１）、ＣＨＹＬＬＴＮＹＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４２）、ＣＲＩＨＬＡＨＫＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４３）、ＴＮＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４４）、ＨＬＱＴＴＥＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４５）、ＳＬＮＮＬＴＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４６）、ＴＮＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４７）、ＴＮＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４８）、ＬＲＩＬＡＮＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４９）、ＬＬＴＰＴＬＮ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５０）、ＡＬＰＴＨＳＮ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５１）、ＴＮＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５２）、ＬＣＲＲＦＥＮ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５３）、ＴＮＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５４）、ＴＮＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５５）、ＨＬＱＴＴＥＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５６）、ＰＬＧＬＣＰＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５７）、ＧＹＦＩＰＳＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５８）、ＴＫＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５９）、ＨＬＱＴＴＥＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６０）、ＷＮＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６１）、ＴＷＩＤＷＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６２）、ＲＴＱＰＹＰＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６７０）及びＴＷＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６７１）ペプチドを含む。

幾つかの態様において、このＢＢＰＩ前駆体骨格のトリプシン及び／又はキモトリプシンループをＴＧＦβで置換して、変異ＴＧＦ−ＢＢＰＩを生成する。幾つかの態様において、この変異ＢＢＰＩは野生型又はグリシンマックス（Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ）（ＢＢＩ；ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）由来の大豆インヒビターの骨格又はこれらの成熟又は切断形態（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８５）、ドリコスビフロス（Ｄｏｌｉｃｈｏｓｂｉｆｌｏｒｕｓ）（ＢＢｄｂ；ＳＥＱＩＤＮＯ：４４９）由来インヒビター、グリシンマックス（Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ）（ＢＢｓｂ３；ＳＥＱＩＤＮＯ：４５０）由来大豆インヒビターＤ−ＩＩ、トレアセアセアレンシス（Ｔｏｒｒｅｓｅａ（Ａｍｂｕｒａｎａ）ｃｅａｒｅｎｓｉｓ）（ＢＢｔｃ；ＳＥＱＩＤＮＯ：４５１）由来インヒビター、（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８６）のＢＢＩ−ＡＶ骨格、（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７）のＢＢＩｔ−ＡＶ骨格、（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５２）のＢＢｄｂ−ＡＶ骨格、（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５３）のＢＢｓｂ３−ＡＶ骨格、（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５４）のＢＢｔｃ−ＡＶ骨格、（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４０）のＢＢＩｔ−ＶＥＧＫ骨格、（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４１）のＢＢＩｔ−ＶＥＧＴ骨格、及び（ＳＥＩＤＮＯ：６４２）のＢＢＩｔ−ＶＥＧＫＤ骨格から選択される。更に、任意のＰｒａｋａｓｈｅｔａｌ．上記に記載の野生型ＢＢＰＩ前駆体骨格も変異ＢＢＰＩ骨格に用いることができる。

幾つかの態様において、ＢＢＰＩ前駆体骨格のトリプシン及び／又はキモトリプシンループはＴＧＦβと影響しあう変異配列で置換される。幾つかの態様において、このＴＧＦβ変異配列はＵ．Ｓ．ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＳｅｒｉａｌＮｏ．１０／５８１，１４２に記載の結合ペプチドを含むがこれらに限定されない。具体的には、ＣＬＣＰＥＮＩＮＶＬＰＣＮ（ＰＥＮ３；ＳＥＱＩＤＮＯ：４３６）、ＣＩＣＫＨＮＶＤＷＬＣＦ（ＭＭＯ２１Ｗ；ＳＥＱＩＤＮＯ：４３７）、ＣＩＣＷＴＱＨＩＨＮＣＦ（ＷＴＱ；ＳＥＱＩＤＮＯ：４３８）、ＣＶＴＴＤＷＩＥＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６３）、ＣＹＹＳＱＦＨＱＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６４）、ＣＰＴＬＷＴＨＭＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６５）、ＱＳＡＣＩＶＹＹＶＧＲＫＰＫＶＥＣＡＳＳＤ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６６）、ＱＳＡＣＩＬＹＹＩＧＫＴＰＫＩＥＣＡＳＳＤ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６７）、ＱＳＡＣＩＬＹＹＶＧＲＴＰＫＶＥＣＡＳＳＤ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６８）、ａｃｅｔｙｌ−ＬＣＰＥＮＤＮＶＳＰＣＹ−ｃｏｈｎ２（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６９）、ＫＨＮＶＲＬＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７０）、ＮＤＴＰＳＹＦ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７１）、ＡＫＬＹＡＧＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７２）、ＲＧＰＡＨＳＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７３）、ＮＳＬＡＥＲＲ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７４）、ＨＰＬＡＳＰＨ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７５）、ＱＰＷＮＫＬＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７６）、ＡＷＬｒ／Ｍｉｐｙ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７７）、ＰＴＫＰＡＱＱ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７８）、ＰＳＬＮＲＰＱ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７９）、ＨＨＡＲＱＥＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８０）、ＲＨＨＴＰＧＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８１）、ＡＳＡＩＮＰＨ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８２）、ＣＨＧＹＤＲＡＰＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４４）、ＣＦＡＰＡＤＱＡＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４５）、ＣＩＰＳＲＦＩＴＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４６）、ＣＨＧＨＴＫＬＡＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４７）、ＣＮＧＫＳＫＬＡＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４８）、ＰＥＮＩＮＶＬＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ；６７２）、ＫＨＮＶＤＷＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６７３）及びＷＴＱＨＩＨＮＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６７４）のペプチドを含む。

幾つかの態様において、ＢＢＰＩ前駆体のトリプシン及び／又はキモトリプシンループはＴＮＦαと影響しあう変異配列で置換されて、変異ＴＮＦ−ＢＢＰＩを生成する。幾つかの態様において、この変異ＢＢＰＩは野生型又はグリシンマックス（Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ）（ＢＢＩ；ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）由来の大豆インヒビターの骨格又はこれらの成熟又は切断形態（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８５）、ドリコスビフロス（Ｄｏｌｉｃｈｏｓｂｉｆｌｏｒｕｓ）ＢＢｄｂ；ＳＥＱＩＤＮＯ：４４９）由来インヒビター、グリシンマックス（Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ）（ＢＢｓｂ３；ＳＥＱＩＤＮＯ：４５０）由来大豆インヒビターＤ−ＩＩ、トレセアセアレンシス（Ｔｏｒｒｅｓｅａ（Ａｍｂｕｒａｎａ）ｃｅａｒｅｎｓｉｓ）（ＢＢｔｃ；ＳＥＱＩＤＮＯ：４５１）由来インヒビター、（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８６）のＢＢＩ−ＡＶ骨格、（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７）のＢＢＩｔ−ＡＶ骨格、（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５２）のＢＢｄｂ−ＡＶ骨格、（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５３）のＢＢｓｂ３−ＡＶ骨格、（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５４）のＢＢｔｃ−ＡＶ骨格、（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４０）のＢＢＩｔ−ＶＥＧＫ骨格、（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４１）のＢＢＩｔ−ＶＥＧＴ骨格、及び（ＳＥＩＤＮＯ：６４２）のＢＢＩｔ−ＶＥＧＫＤ骨格から選択される。更に、任意のＰｒａｋａｓｈｅｔａｌ．上記に記載の野生型ＢＢＰＩ前駆体骨格も変異ＢＢＰＩ骨格に用いることができる。

幾つかの態様において、このＢＢＰＩ前駆体骨格のトリプシン及び／又はキモトリプシンループはＴＮＦαに結合する変異配列で置換される。幾つかの態様において、ＴＮＦα結合配列はＵ．Ｓ．ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＳｅｒｉａｌＮｏ．１０／９６８，７３２に記載の結合ペプチドを含むがこれらに限定されない。具体的には、ＲＹＷＱＤＩＰ（Ｔ１；ＳＥＱＩＤＮＯ：４７４）、ＡＰＥＰＩＬＡ（Ｔ２；ＳＥＱＩＤＮＯ：４７５）、ＤＭＩＭＶＳＩ（Ｔ３；ＳＥＱＩＤＮＯ：４７６）、ＷＴＰＫＰＴＱ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８３）、ＡＴＦＰＮＱＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８４）、ＡＳＴＶＧＧＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８５）、ＴＭＬＰＹＲＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８６）、ＡＷＨＳＰＳＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８７）、ＴＱＳＦＳＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８８）、ＴＨＫＮＴＬＲ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８９）、ＧＱＴＨＦＨＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５９０）、ＬＰＩＬＴＱＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５９１）、ＳＩＬＰＶＳＨ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５９２）、ＳＱＰＩＰＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５９３）、及びＱＰＬＲＫＬＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５９４）ペプチドを含む。

幾つかの態様において、この変異ＢＢＰＩは修飾変異ＢＢＰＩのＮ末端に位置するペプチド挿入を更に含む。幾つかの態様において、このペプチド挿入は１乃至１５アミノ酸の配列を含む。他の態様において、このペプチド挿入は５乃至１０アミノ酸の配列を含む。幾つかの態様において、このペプチド挿入はＳＥＱＩＤＮＯ：３８９（ＤＤＥＰＳＫＰＣＣＤＰＤＰ；ＳＥＱＩＤＮＯ：３８９のペプチドを含む。ＳＥＱＩＤＮＯ：３８９のペプチド挿入を含む修飾変異ＢＢＰＩの例としては、（ＤＤＥＰＳＫＰＣＣＤＰＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＡＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＳＤＭＲＬＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＡＣＹＮＬＹＧＷＴＣＦＣＶＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：３９０）の修飾変異４Ｄ１３ＢＢＩｔ−ＡＶ及びＳＥＱＩＤＮＯ：４１３（ＤＰＤＤＥＰＳＫＰＣＣＤＰＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＳＤＭＲＰＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＫＣＹＮＬＹＧＷＴＣＴＣＡＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：４１３）修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−４Ｄ１３−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａがある。

幾つかの態様において、変異配列は、ファージディスプレイ法及び他の好適なスクリーニング法を含むがこれらに限定されない、当業者に知られた各種方法で選択される。例えば、ランダムペプチド遺伝子ライブラリーをファージＰＩＩＩに融合させて、このファージの表面にペプチドライブラリーが提示されようにする。次いで、このファージディスプレイライブラリーを標的タンパク質に曝し、緩衝液で洗浄して、秘匿的結合を除去する（このプロセスはときどきパニングと呼ばれる）。最後に、結合しているファージとこのペプチドに対するＰＣＲの（で得られた）ＤＮＡが単離される。

大部分の態様において、ループの１つは、大部分において３乃至１４アミノ酸の長さ、好ましくは５乃至１０アミノ酸長さの、変異配列で置換されて変異ＢＢＰＩを生成する。所望の結合及び／又は抑制を提供する限り、より長い配列が本発明目に用いられる。更に、結合ループの置換に用いるのに好適なペプチドは、制約ループ（即ち、２つのシステイン残基の間のジスルフィド結合の存在により形成されたループ）内に含まれる場合、機能的な構造を導入する。幾つかの特定の態様において、このペプチドは７乃至９アミノ酸長である。他の態様において、変異配列は１０アミノ酸長のペプチドである。
５．４修飾変異ＢＢＰＩタンパク質
５．４．１修飾変異ＢＢＰＩ：シグナルアミノ酸置換

幾つかの態様において、本発明はＢＢＰＩの骨格に少なくとも１つのアミノ酸置換を更に含む変異ＢＢＰＩである、修飾変異ＢＢＰＩを提供する。従って、幾つかの態様において、修飾変異ＢＢＰＩは標的配列に結合する変異配列により置換されたトリプシン及び／又はキモトリプシンループを含み、更に置換されたループに、Ｃ末端及び／又はＮ末端で少なくとも１つのアミノ酸置換を含むことにより変性された、変異ＢＢＰＩである。従って、幾つかの態様において、修飾変異ＢＢＰＩは、セクション５．４で説明されている、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１、４、５、１１、１３、１８、２５、２７、２９、３１、３８、４０、５０、５２、５５、及び６５に等しい位置から選択される少なくとも１つの位置においてアミノ酸置換を含むものよりもむしろ、トリプシン及び／又はキモトリプシンループが変異ペプチドにより置換されている、セクション５．４で説明する変異ＢＢＰＩである。

修飾変異ＢＢＰＩのアミノ酸残基は、もしそれが特定の残基に相同であるなら（即ち、一次構造における位置に対応している）前駆体ＢＢＰＩの残基位置に等しい。一次構造の相同性を確立するために、前駆体ＢＢＰＩのアミノ酸配列が一次アミノ酸配列を直接比較し、特に配列が知られているＢＢＰＩにおいて保存されていると知られているシステイン残基のセットと比較される。図１７は野生型と本明細書で開示する変異前駆体ＢＢＰＩの間で保存されたシステイン残基を示している。本発明の修飾変異体にＢＢＰＩにおいて置換された等しい残基が番号付けされている。

前駆ＢＢＰＩは自然発生ＢＢＰＩ又は変異ＢＢＰＩである。特に、そのように修飾変異ＢＢＰＩは天然には見られないアミノ酸配列を有し、このアミノ酸配列は前駆体ＢＢＰＩのトリプシン及び／又はキモトリプシンループの置換により、及び別のアミノ酸で前駆体ＢＢＰＩの少なくとも１つのアミノ酸残基の置換することにより、提供される。幾つかの態様において、少なくとも１つのアミノ酸の置換は未修飾変異前駆体ＢＢＰＩよりもプロテアーゼ抑制活性が高い修飾変異ＢＢＰＩを生成する。他の態様において、少なくとも１つのアミノ酸の置換は未修飾変異前駆体ＢＢＰＩよりもプロテアーゼ抑制活性が高く、且つ生産性の高い修飾変異ＢＢＰＩを生成する。

従って、修飾変異体にＢＢＰＩは本明細書に記載の任意の１つの変異ＢＢＰＩ骨格の主鎖において少なくとも１つのアミノ酸置換により提供される。幾つかの態様において、単離された修飾変異ボウマンブリックプロテアーゼインヒビター（ＢＢＰＩ）はＢＢＰＩ骨格のキモトリプシンループを置換する変異ペプチドを含み、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の変異ＢＢＩの１、４、５、１１、１３、１８、２５、２７、２９、３１、３８、４０、５０、５２、５５、及び６５に等しい位置から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置において置換されたアミノ酸を更に含む。他の態様において、単離され修飾変異体にボウマンブリックプロテアーゼインヒビター（ＢＢＰＩ）はＢＢＰＩ骨格のトリプシンループを置換する変異ペプチドを含み、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１、４、５、１１、１３、１８、２５、２７、２９、３１、３８、４０、５０、５２、５５、及び５に等しい位置から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置においてアミノ酸置換を更に含む。他の態様において、単離され修飾変異ボウマンブリックプロテアーゼインヒビター（ＢＢＰＩ）はＢＢＰＩ骨格のトリプシン及びキモトリプシンループを置換する変異ペプチド及びＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の変異ＢＢＩの１、４、５、１１、１３、１８、２５、２７、２９、３１、３８、４０、５０、５２、５５、及び６５に等しい位置から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置においてアミノ酸置換を含む。幾つかの態様において、ＢＢＰＩ骨格はグリシンマックス（Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ）（ＢＢＩ；ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）由来の大豆インヒビターの骨格又はこれらの成熟又は切断形態（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８５）、ドリコスビフロス（Ｄｏｌｉｃｈｏｓｂｉｆｌｏｒｕｓ）（ＢＢｄｂ；ＳＥＱＩＤＮＯ：４４９）由来インヒビター、グリシンマックス（Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ）（ＢＢｓｂ３；ＳＥＱＩＤＮＯ：４５０）由来大豆インヒビターＤ−ＩＩ、トレセアセアレンシス（Ｔｏｒｒｅｓｅａ（Ａｍｂｕｒａｎａ）ｃｅａｒｅｎｓｉｓ）（ＢＢｔｃ；ＳＥＱＩＤＮＯ：４５１）由来インヒビター、（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８６）のＢＢＩ−ＡＶ骨格、（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７）のＢＢＩｔ−ＡＶ骨格、（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５２）のＢＢｄｂ−ＡＶ骨格、（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５３）のＢＢｓｂ３−ＡＶ骨格、（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５４）のＢＢｔｃ−ＡＶ骨格、（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４０）のＢＢＩｔ−ＶＥＧＫ骨格、（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４１）のＢＢＩｔ−ＶＥＧＴ骨格、及び（ＳＥＩＤＮＯ：６４２）のＢＢＩｔ−ＶＥＧＫＤ骨格から選択される。幾つかの態様において、修飾変異ＢＢＰＩに含まれる変異ペプチドはＶＥＧＦ結合ペプチド、ＦＧＦ−５結合ペプチド、ＴＧＦベータ結合ペプチド、ＴＮＦα結合ペプチドから選択される。幾つかの態様において、ＶＥＧＦ結合配列はＵ．Ｓ．ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓＳｅｒｉａｌＮｏｓ．０９／８３２，７２３及び１０／９８４，２７０に記載のＶＥＧＦ結合ペプチドを含むがこれらに限定されない。具体的にはＡＣＹＮＬＹＧＷＴＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：９）、ＫＹＹＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５８）、ＴＬＷＫＳＹＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５９）、ＤＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４６０）、ＳＫＨＳＱＩＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４６８）、ＫＴＮＰＳＧＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４６９）、ＲＰＴＧＨＳＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４７０）、ＫＨＳＡＫＡＥ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４７１）、ＫＰＳＳＡＳＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４７２）、ＰＶＴＫＲＶＨ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４７３）、ＴＬＨＷＷＶＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９２）、ＰＹＫＡＳＦＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９３）、ＰＬＲＴＳＨＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９４）、ＥＡＴＰＲＯＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９５）、ＮＰＬＨＴＬＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９６）、ＫＨＥＲＩＷＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９７）、ＡＴＮＰＰＰＭ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９８）、ＳＴＴＳＰＮＭ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９９）、ＡＤＲＳＦＲＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５００）、ＰＫＡＤＳＫＱ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０１）、ＰＮＱＳＨＬＨ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０２）、ＳＧＳＥＴＷＭ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０３）、ＡＬＳＡＰＹＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０４）、ＫＭＰＴＳＫＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０５）、ＩＴＰＫＲＰＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０６）、ＫＷＩＶＳＥＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０７）、ＰＮＡＮＡＰＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０８）、ＮＶＱＳＬＰＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０９）、ＴＬＷＰＴＦＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１０）、ＮＬＷＰＨＦＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１１）、ＳＬＷＰＡＦＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１２）、ＳＬＷＰＨＦＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１３）、ＡＰＷＮＳＨＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１４）、ＡＰＷＮＬＨＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１５）、ＬＰＳＷＨＬＲ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１６）、ＰＴＩＬＥＷＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１７）、ＴＬＹＰＱＦＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１８）、及びＨＬＡＰＳＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１９）ペプチドを含む。幾つかの態様において、このＶＥＧＦ変異配列はＵ．Ｓ．ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＳｅｒｉａｌＮｏ．１１／９１９，７１７に記載のＶＥＧＦ結合ペプチドを含むがこれらに限定されない。具体的にはＫＹＹＬＳＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２０）、ＷＹＴＬＹＫＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２１）、ＴＹＲＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２２）、ＲＹＳＬＹＹＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２３）、ＹＹＬＹＹＷＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２４）、ＮＹＱＬＹＧＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２５）、ＴＫＷＰＳＹＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２２６）、ＴＬＷＫＳＹＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２７）、ＰＬＷＰＳＹＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２８）、ＲＬＷＰＳＹＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２９）、ＴＬＷＰＫＹＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３０）、ＫＹＤＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ；５３１）、ＲＹＤＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３２）、ＤＹＲＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３３）、ＤＹＫＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３４）、ＥＹＫＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３５）、及びＲＹＰＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３６）ペプチドを含む。

他の態様において、ＦＧＦ−５結合配列はＵ．Ｓ．ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＳｅｒｉａｌＮｏ．１０／９８４，４１０及び１２／０３３，８４８に記載のＦＧＦ−５結合ペプチドを含むがこれらに限定されない。具体的にはＣＡＣＲＴＱＰＹＰＬＣＦ（ＭＭ００７；ＳＥＱＩＤＮＯ：４３０）、ＣＩＣＴＷＩＤＳＴＰＣ（ＰＳ２；ＳＥＱＩＤＮＯ：４３１）、ＣＹＧＬＰＦＴＲＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３７）、ＣＥＥＩＷＴＭＬＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３８）、ＣＷＡＬＴＶＫＴＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３９）、ＣＬＴＶＬＷＴＴＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４０）、ＣＴＬＷＮＲＳＰＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４１）、ＣＨＹＬＬＴＮＹＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４２）、ＣＲＩＨＬＡＨＫＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４３）、ＴＮＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４４）、ＨＬＱＴＴＥＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４５）、ＳＬＮＮＬＴＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４６）、ＴＮＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４７）、ＴＮＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４８）、ＬＲＩＬＡＮＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４９）、ＬＬＴＰＴＬＮ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５０）、ＡＬＰＴＨＳＮ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５１）、ＴＮＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５２）、ＬＣＲＲＦＥＮ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５３）、ＴＮＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５４）、ＴＮＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５５）、ＨＬＱＴＴＥＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５６）、ＰＬＧＬＣＰＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５７）、ＧＹＦＩＰＳＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５８）、ＴＫＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５９）、ＨＬＱＴＴＥＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６０）、ＷＮＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６１）、ＴＷＩＤＷＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６２）、ＲＴＱＰＹＰＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６７０）、及びＴＷＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６７１）ペプチドを含む。

他の態様において、変異ペプチドはＴＧＦβ結合ペプチドであり、Ｕ．Ｓ．ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＳｅｒｉａｌＮｏ．１０／５８１，１４２に記載のＴＧＦβを含むがこれらに限定されないＴＧＦβ結合配列から選択される。具体的には、ＣＬＣＰＥＮＩＮＶＬＰＣＮ（ＰＥＮ３；ＳＥＱＩＤＮＯ：４３６）、ＣＩＣＫＨＮＶＤＷＬＣＦ（ＭＭＯ２１Ｗ；ＳＥＱＩＤＮＯ：４３７）、ＣＩＣＷＴＱＨＩＨＮＣＦ（ＷＴＱ；ＳＥＱＩＤＮＯ：４３８）、ＣＶＴＴＤＷＩＥＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６３）、ＣＹＹＳＱＦＨＱＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６４）、ＣＰＴＬＷＴＨＭＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６５）、ＱＳＡＣＩＶＹＹＶＧＲＫＰＫＶＥＣＡＳＳＤ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６６）、ＱＳＡＣＩＬＹＹＩＧＫＴＰＫＩＥＣＡＳＳＤ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６７）、ＱＳＡＣＩＬＹＹＶＧＲＴＰＫＶＥＣＡＳＳＤ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６８）、ａｃｅｔｙｌ−ＬＣＰＥＮＤＮＶＳＰＣＹ−ｃｏｈｎ２（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６９）、ＫＨＮＶＲＬＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７０）、ＮＤＴＰＳＹＦ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７１）、ＡＫＬＹＡＧＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７２）、ＲＧＰＡＨＳＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７３）、ＮＳＬＡＥＲＲ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７４）、ＨＰＬＡＳＰＨ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７５）、ＱＰＷＮＫＬＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７６）、ＡＷＬｒ／Ｍｉｐｙ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７７）、ＰＴＫＰＡＱＱ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７８）、ＰＳＬＮＲＰＱ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７９）、ＨＨＡＲＱＥＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８０）、ＲＨＨＴＰＧＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８１）、ＡＳＡＩＮＰＨ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８２）、ＣＨＧＹＤＲＡＰＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４４）、ＣＦＡＰＡＤＱＡＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４５）、ＣＩＰＳＲＦＩＴＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４６）、ＣＨＧＨＴＫＬＡＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４７）、ＣＮＧＫＳＫＬＡＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４８）、ＰＥＮＩＮＶＬＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ；６７２）、ＫＨＮＶＤＷＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６７３）、及びＷＴＱＨＩＨＮＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６７４）ペプチドを含む。

更なる態様において、変異ペプチドはＵ．Ｓ．ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＳｅｒｉａｌＮｏ．１０／９６８，７３２に記載のＴＮＦ結合ペプチドを含むがこれらに限定されないＴＮＦα結合配列から選択されるＴＮＦα結合ペプチドである。具体的には、ＲＹＷＱＤＩＰ（Ｔ１；ＳＥＱＩＤＮＯ：４７４）、ＡＰＥＰＩＬＡ（Ｔ２；ＳＥＱＩＤＮＯ：４７５）、ＤＭＩＭＶＳＩ（Ｔ３；ＳＥＱＩＤＮＯ：４７６）、ＷＴＰＫＰＴＱ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８３）、ＡＴＦＰＮＱＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８４）、ＡＳＴＶＧＧＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８５）、ＴＭＬＰＹＲＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８６）、ＡＷＨＳＰＳＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８７）、ＴＱＳＦＳＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８８）、ＴＨＫＮＴＬＲ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８９）、ＧＱＴＨＦＨＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５９０）、ＬＰＩＬＴＱＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５９１）、ＳＩＬＰＶＳＨ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５９２）、ＳＱＰＩＰＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５９３）、及びＱＰＬＲＫＬＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５９４）ペプチドを含む。

幾つかの態様において、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１、４、５、１１、１３、１８、２５、２７、２９、３１、３８、４０、５０、５２、５５、及び６５に等しい位置から選択される少なくとも１つの等しい位置における少なくとも１つのアミノ酸置換は以下のアミノ酸置換となる。１つの態様において、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１位に等しいアミノ酸位置におけるアミノ酸置換はＡ及びＣから選択される。他の態様において、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の４位に等しいアミノ酸位置の置ける置換されたアミノ酸はＶである。他の態様において、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の５位に等しいアミノ酸位置で置換されたアミノ酸はＰ及びＡから選択される。他の態様において、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１１位に等しいアミノ酸位置で置換されたアミノ酸はＧである。他の態様において、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１３位に等しい位置でのアミノ酸位置における置換されたアミノ酸はＹ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｌ、Ｖ、Ｋ、及びＲから選択される。他の態様において、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１８位に等しいアミノ酸位置で置換されたアミノ酸はＩ、Ｖ、及びＬを含む。他の態様において、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の２５位に等しい位置のアミノ酸位置で置換されたアミノ酸はＫ、Ｎ、Ｗ、Ｉ、Ａ、及びＲから選択される。他の態様において、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の２７位に等しい位置のアミノ酸位置で置換されたアミノ酸はＲ、Ｋ、Ｖ、Ａ、及びＱを含む。他の態様において、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の２９位に等しい位置のアミノ酸位置で置換されたアミノ酸はＲ、Ｋ、及びＰから選択される。他の態様において、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の３１位に等しい位置のアミノ酸位置で置換されたアミノ酸はＱ、Ｈ、Ｅ、Ａ、Ｒ、Ｗ、Ｋ、及びＴから選択される。他の態様において、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の３８位に等しい位置のアミノ酸位置で置換されたアミノ酸はＮ、Ｋ、及びＲから選択される。他の態様において、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の４０位に等しい位置のアミノ酸位置で置換されたアミノ酸はＨ、Ｋ、Ｑ、Ｒ、及びＹから選択される。他の態様において、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の５０位に等しい位置のアミノ酸位置で置換されたアミノ酸はＲ、Ｑ、Ｋ、Ｔ、Ｖ、Ｍ、及びＳから選択される。他の態様において、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の５２位に等しい位置のアミノ酸位置で置換されたアミノ酸はＫ、Ｔ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、Ｈ、Ａ、Ｍ、Ｓ、及びＥから選択される。他の態様において、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の５５位に等しい位置のアミノ酸位置で置換されたアミノ酸はＭである。他の態様において、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の６５位に等しい位置のアミノ酸位置で置換されたアミノ酸はＥ、Ｑ、及びＤから選択される。幾つかの態様において、変異ＢＢＰＩにおいて１つのアミノ酸置換がなされ、前駆体未修飾変異ＢＢＰＩよりも高いプロテアーゼ抑制活性を有する修飾変異ＢＢＰＩとなる。幾つかの態様において、１つのアミノ酸置換は未修飾前駆体ＢＢＰＩよりも高いトリプシン抑制活性（ＴＩＡ）を有する修飾変異ＢＢＰＩを生成する。他の態様では、未修飾前駆体ＢＢＰＩよりも高いキモトリプシン抑制活性（ＣＩＡ）を有する修飾変異ＢＢＰＩを生成する。

１つの態様において、修飾変異ＢＢＰＩはＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の変異ＢＢＩであり（ＢＢＩｔ−ＡＶ；図９）、これはキモトリプシンループの変わりにＶＥＧＦ変異ペプチドを含み、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１、４、５、１１、１３、１８、２５、２７、２９、３１、３８、４０、５０、５２、５５、及び６５から選択される少なくとも１つの位置においてアミノ酸置換を含む修飾を更に含んで、修飾変異ＢＢＩを生成する。前述の１つのアミノ酸置換及びＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の変異ＢＢＩｔ−ＡＶＢＢＰＩにおいてなされたアミノ酸置換は未修飾前駆体変異ＢＢＩｔ−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７；実施例１０参照）よりも高いトリプシン抑制活性を有する修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶを生成する。

５．４．２修飾変異ＢＢＰＩ：アミノ酸置換の組み合わせ
本発明は少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、少なくとも６つの、少なくとも７つの、少なくとも８つの、少なくとも９つの、少なくとも１０この、少なくとも１１この、少なくとも１２この、少なくとも１３個の、少なくとも１４この、少なくとも１５個の、及び少なくとも１６個のアミノ酸置換を含む修飾変異ＢＢＰＩを含む。幾つかの態様において、少なくとも２つの、少なくとも３つの少なくとも４つの、少なくとも５つの、少なくとも６つの、少なくとも７つの、少なくとも８つの、少なくとも９つの、少なくとも１０個の、少なくとも１１個の、少なくとも１２個の、少なくとも１３個の、少なくとも１４個の、少なくとも１５個の、及び少なくとも１６個のアミノ酸置換は未修飾前駆体変異ＢＢＰＩよりも高いＴＩＡを有する修飾変異ＢＢＰＩを生成する。他の態様において、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つのアミノ酸置換は未修飾変異体ＢＢＰＩよりも高いＴＩＡ及び生産性を有する修飾変異ＢＢＰＩを生成する。

幾つかの態様において、修飾変異ＢＢＰＩはＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の５０位及び５２位に等しい位置での２つのアミノ酸置換の組み合わせを含む。幾つかの態様において、２つのアミノ酸置換の組み合わせは５０Ｔ−５２Ａである。本発明はセクション５．３に記載の変異ＢＢＰＩ骨格のいずれか１つと更にセクション５．４に記載の２つのアミノ酸置換の組み合わせ、５０Ｔ−５２Ａ、を更に含む変異ＢＢＰＩを提供する。１つの態様において、変異骨格のキモトリプシンループは、ＶＧＦ変異ペプチド、例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：９であり、変異骨格はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１３、５０、及び５２位に等しい位置での３つのアミノ酸置換の組み合わせを更に含む変異骨格で、修飾変異ＢＢＰＩ骨格を生成する。他の態様において、２つのアミノ酸置換の組み合わせを含む、修飾変異ＢＢＰＩは修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２ＡはＳＥＱＩＤＮＯ：５９５（ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＡＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＳＤＭＲＬＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＡＣＹＮＬＹＧＷＴＣＴＣＡＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：５９５）である。

幾つかの態様において、修飾変異ＢＢＰＩはＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１３、５０、及び５２位に等しい位置における３つのアミノ酸置換の組み合わせを含む。幾つかの態様において、３つのアミノ酸置換間の組み合わせは２５−５０−５２、２９−５０−５２、４０−５０−５２、及び１３−５０−５２における置換の組み合わせから選択される。幾つかの態様において、３つのアミノ酸置換の組み合わせは２５Ｌ−５０Ｔ−５２Ａ、２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、及び１３Ｉ−５０Ｔ−５２Ａから選択される。本発明はセクション５．３で説明され、更にセクション５．４で説明するような２５Ｌ−５０Ｔ−５２Ａ、２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、及び１３Ｉ−５０Ｔ−５２Ａから選択される３つのアミノ酸置換の組み合わせを含む、変異ＢＢＰＩ骨格の任意の１つを提供する。１つの態様において、変異骨格のキモトリプシンループはＶＲＧＦ変異ペプチド、例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：９であり、変異骨格はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１３、５０、及び５２位に等しい位置での３つのアミノ酸置換の組み合わせを含み、修飾変異ＢＢＰＩ骨格を生成する。１つの態様において、３つのアミノ酸置換の組み合わせを含む修飾変異ＢＢＰＩは、ＳＥＱＩＤＮＯ：６０３（ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＡＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＬＤＭＲＬＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＡＣＹＮＬＹＧＷＴＣＴＣＡＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：６０３）の修飾変異ＢＢＩｔ−Ａｖ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６０７（ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＡＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＳＤＭＲＰＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＡＣＹＮＬＹＧＷＴＣＴＣＡＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：６０７）の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ｌ２９Ｐ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、及びＳＥＱＩＤＮＯ：６０９（ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＡＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＳＤＭＲＬＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＫＣＹＮＬＹＧＷＴＣＴＣＡＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：６０９）の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａから選択される。

幾つかの態様において、修飾変異ＢＢＰＩはＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１３、２９、５０、及び５２位に等しい位置で４つのアミノ酸置換の組み合わせを含む。幾つかの態様において、この４つのアミノ酸置換の組み合わせは３−２５−５０−５２、１３−２９−５０−５２、２５−２９−５０−５２、１３−４０−５０−５２、２５−４０−５０−５２、及び２９−４０−５０−５２における置換の組み合わせから選択される。幾つかの態様において、４つのアミノ酸置換の組み合わせは３Ｉ−２５Ｌ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、２５Ｌ−２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、２５Ｌ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、及び２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａから選択される。本発明はセクション５．３に記載され、更にセクション５．４に記載のような１３Ｉ−２５Ｌ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、２５Ｌ−２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、２５Ｌ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、及び２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａから選択される４つのアミノ酸置換の組み合わせを含む変異ＢＢＰＩのいずれか１つを提供する。１つの態様において、変異骨格のキモトリプシンループはＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１３、２９、５０、及び５２位に等しい位置における４つのアミノ酸置換の組み合わせを含み、修飾変異ＢＢＰＩ骨格を生成する。１つの態様において、４つのアミノ酸置換の組み合わせを含む修飾変異ＢＢＰＩはＳＥＱＩＤＮＯ：５９６（ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＬＤＭＲＬＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＡＣＹＮＬＹＧＷＴＣＴＣＡＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：５９６）の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｌ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６００（ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＳＤＭＲＰＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＡＣＹＮＬＹＧＷＴＣＴＣＡＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：６００）の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６０２（ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＳＤＭＲＬＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＫＣＹＮＬＹＧＷＴＣＴＣＡＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：６０２）の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６０４（ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＡＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＬＤＭＲＰＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＡＣＹＮＬＹＧＷＴＣＴＣＡＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：６０４）の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ｓ２５Ｌ−Ｌ２９Ｐ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６０６（ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＡＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＬＤＭＲＬＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＫＣＹＮＬＹＧＷＴＣＴＣＡＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：６０６）の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ｓ２５Ｌ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６０８（ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＡＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＳＤＭＲＰＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＫＣＹＮＬＹＧＷＴＣＴＣＡＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：６０８）の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、及びＳＥＱＩＤＮＯ：６４３（ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＫＤＭＲＰＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＩＣＫＹＤＬＹＷＷＣＦＣＫＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：６４３）の修飾変異ＢＢＩｔ−ＶＥＧＫＤ−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｋ−Ｌ２９Ｐ−Ｖ５２Ｋから選択される。他の態様において、変異骨格のキモトリプシンループはＳＥＱＤＩＮＯＳ：４３０及び４３１から選択されるＦＧＦ５変異ペプチドであり、変異骨格はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１３、２９、５０、及び５２に等しい位置における４つのアミノ酸置換の組み合わせを更に含むように修飾して、修飾変異ＢＢＰＩ骨格を生成する。１つの態様において、４つのアミノ酸置換の組み合わせを含む修飾変異ＢＢＰＩはＳＥＱＩＤＮＯ：４３２の修飾変異ＢＢＩｔ−ＭＭ００７−Ｑ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ及びＳＥＱＩＤＮＯ：４３４の修飾変異ＢＢＩｔ−ＦＧＦｐｓ２−Ｑ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２から選択される。他の態様において、変異骨格のキモトリプシンループはＳＥＱＩＤＮＯＳ：４３６、４３７、４３８、６７２、６７３、及び６７４から選択されるＴＧＦβ変異ペプチドであり、変異骨格はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１３、２９、５０、及び５２に等しい位置における４つのアミノ酸置換の組み合わせを更に含むように修飾され、修飾変異ＢＢＰＩ骨格を生成する。１つの態様において、４つのアミノ酸置換の組み合わせを含む修飾へＢＢＰＩはＳＥＱＩＤＮＯ：４４３の修飾変異ＢＢＩｔ−ＰＥＮ３−Ｑ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４５の修飾変異ＢＢＩｔ−ＭＭ０２１Ｗ−Ｑ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、及びＳＥＱＩＤＮＯ：４４７の修飾変異ＢＢＩｔ−ＷＴＱ−Ｑ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａから選択される。

幾つかの態様において、修飾変異ＢＢＰＩはＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１３、２９、４０、５０、及び５２位に等しい入りにおいて５つのアミノ酸置換の組み合わせを含む。幾つかの態様において、５つのアミノ酸置換の組み合わせは１３−２５−２９−５０−５２、１３−２９−４０−５０−５２、１３−２５−４０−５０−５２、２５−２９−４０−５０−５２、及び１３−２９−４０−５０−５２の位置における置換の組み合わせから選択される。幾つかの態様において、５つのアミノ酸置換の組み合わせは１３Ｉ−２５Ｌ−２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｌ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、２５Ｌ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｌ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｋ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｋ−５２Ａ、及び１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ｔから選択される。本発明はセクション５．３に記載され、更にセクション５．４に記載の１３Ｉ−２５Ｌ−２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｌ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｌ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｋ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｋ−５２Ａ、及び１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ｔから選択される５つのアミノ酸置換の組み合わせを含む変異ＢＢＰＩの任意の１つを提供する。１つの態様において、変異骨格のキモトリプシンループはＳＥＱＩＤＮＯ：９のＶＥＧＦ変異ペプチドであり、変異骨格はＳＥＱＩＤＮＯ：１８の１３、２９、４０、５０、及び５２位に等しい位置における５つのアミノ酸置換の組み合わせを更に含むように修飾されて、修飾変異ＢＢＰＩ骨格を生成する。１つの態様において、５つのアミノ酸置換の組み合わせを含む修飾へＢＢＰＩはＳＥＱＩＤＮＯ：５９７（ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＬＤＭＲＰＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＡＣＹＮＬＹＧＷＴＣＴＣＡＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：５９７）の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｌ−Ｌ２９Ｐ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：５９９（ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＬＤＭＲＬＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＫＣＹＮＬＹＧＷＴＣＴＣＡＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：５９９）の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６０１（ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＳＤＭＲＰＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＫＣＹＮＬＹＧＷＴＣＴＣＡＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：６０１）の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｌ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６０５（ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＡＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＬＤＭＲＰＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＫＣＹＮＬＹＧＷＴＣＴＣＡＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：６０５）の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ｓ２５Ｌ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６１５（ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＬＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＳＤＭＲＰＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＫＣＹＮＬＹＧＷＴＣＴＣＡＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：６１５）の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｌ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２０（ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＳＤＭＲＫＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＫＣＹＮＬＹＧＷＴＣＴＣＡＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：６２０）の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｋ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２４（ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＳＤＭＲＰＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＫＣＹＮＬＹＧＷＴＣＫＣＡＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：６２４）の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｋ−Ｖ５２Ａ、及びＳＥＱＩＤＮＯ：６２５（ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＳＤＭＲＰＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＫＣＹＮＬＹＧＷＴＣＴＣＴＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：６２５）の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ｔから選択される。

幾つかの態様において、修飾変異ＢＢＰＩはＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１３、２５、２９、４０、５０、及び５２位に等しい位置において６つのアミノ酸置換の組み合わせを含む。幾つかの態様において、この６つのアミノ酸置換の組み合わせは１３−２５−２９−４０−５０−５２、１−１３−２９−４０−５０−５２、４−１３−２９−４０−５０−５２、５−１３−２９−４０−５０−５２、１１−１３−２９−４０−５０−５２、１３−２５−２９−４０−５０−５２、１３−２７−２９−４０−５０−５２、１３−２９−３１−４０−５０−５２、１３−２９−３１−４０−５０−５２、１３−２９−３８−４０−５０−５２、及び１３−２９−３８−４０−５０−５２の位置の置換の組み合わせから選択される。幾つかの態様において、６つのアミノ酸置換の組み合わせは１３Ｉ−２５Ｌ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１Ｃ−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、４Ｖ−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、５Ｐ−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１１Ｇ−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｒ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２７Ｒ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−３１Ａ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−３１Ｒ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−３８Ｎ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、及び１３Ｉ−２９Ｐ−３８Ｎ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａから選択される。本発明はセクション５．３に記載されており、更にセクション５．４で説明する１３Ｉ−２５Ｌ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１Ｃ−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、４Ｖ−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、５Ｐ−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１１Ｇ−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｒ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２７Ｒ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−３１Ａ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−３１Ｒ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−３８Ｎ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、及び１３Ｉ−２９Ｐ−３８Ｎ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａから選択される６つのアミノ酸置換の組み合わせを含む変異ＢＢＰＩのいずれか１つを提供する。１つの態様において、変異骨格のキモトリプシンループはＳＥＱＩＤＮＯ：９のＶＥＧＦ変異ペプチドであり、この変異骨格はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１３、２５、２９、４０、５０、及び５２位に等しい位置において６つのアミノ酸置換の組み合わせを更に含むように修飾され、修飾変異ＢＢＰＩ骨格を生成する。１つの態様において、６つのアミノ酸置換の組み合わせを含む修飾変異ＢＢＰＩはＳＥＱＩＤＮＯ：５９８（ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＬＤＭＲＰＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＫＣＹＮＬＹＧＷＴＣＴＣＡＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：５９８）の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｌ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６１１（ＤＰＤＤＥＶＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＳＤＭＲＰＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＫＣＹＮＬＹＧＷＴＣＴＣＡＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：６１１）の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ｄ１Ｃ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６１２（ＤＰＤＤＥＶＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＳＤＭＲＰＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＫＣＹＮＬＹＧＷＴＣＴＣＡＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：６１２）の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ｓ４Ｖ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６１３（ＤＰＤＤＥＳＰＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＳＤＭＲＰＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＫＣＹＮＬＹＧＷＴＣＴＣＡＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：６１３）の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ｓ５Ｐ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６１４（ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＧＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＳＤＭＲＰＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＫＣＹＮＬＹＧＷＴＣＴＣＡＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：６１４）の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ｑ１１Ｇ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６１６（ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＲＤＭＲＰＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＫＣＹＮＬＹＧＷＴＣＴＣＡＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：６１６）の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｒ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６１９（ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＳＤＲＲＰＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＫＣＹＮＬＹＧＷＴＣＴＣＡＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：６１９）の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｍ２７Ｒ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２１（ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＳＤＭＲＰＮＡＣＨＳＡＣＫＳＣＫＣＹＮＬＹＧＷＴＣＴＣＡＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：６２１）の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ａ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２２（ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＳＤＭＲＰＮＲＣＨＳＡＣＫＳＣＫＣＹＮＬＹＧＷＴＣＴＣＡＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：６２２）の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ｒ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２３（ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＳＤＭＲＰＮＳＣＨＳＡＣＫＮＣＫＣＹＮＬＹＧＷＴＣＴＣＡＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：６２３）の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３８Ｎ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、及びＳＥＱＩＤＮＯ：６２６（ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＳＤＭＲＰＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＫＣＹＮＬＹＧＷＴＣＴＣＡＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＥＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：６２６）の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３８Ｎ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａから選択される。

幾つかの態様において、修飾変異ＢＢＰＩはＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１３、２５、９、３１、４０、５０、及び５２位に等しいアミノ酸位置において７つのアミノ酸置換の組み合わせを含む。幾つかの態様において、７つのアミノ酸置換の組み合わせは１３−２５−２９−３１−４０−５０−５２、１３−２５−２９−３１−４０−５０−５２、１３−２５−２７−２９−３１−５０−５２、１３−２５−２７−２９−３１−５０−５２、１３−２５−２７−２９−３１−５０−５２、１３−２５−２７−２９−３１−５０−５２、１３−２５−２７−２９−３１−５０−５２、１３−２５−２７−２９−３１−５０−５２、１３−２５−２７−２９−３１−５０−５２、１３−２５−２７−２９−３１−５０−５２、及び１３−２５−２７−２９−３１−５０−５２から選択される。幾つかの態様において、７つのアミノ酸置換の組み合わせは１３Ｌ−２５Ｒ−２９Ｐ−３１Ａ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｌ−２５Ｒ−２９Ｐ−３１Ｒ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、及び１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔから選択される。本発明はセクション５．３に記載され、更にセクション５．４に記載の１３Ｌ−２５Ｒ−２９Ｐ−３１Ａ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｌ−２５Ｒ−２９Ｐ−３１Ｒ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、及び１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔから選択される７つのアミノ酸置換の組み合わせを含む変異ＢＢＰＩのいずれか１つを提供する。１つの態様において、変異骨格のキモトリプシンループはＳＥＱＩＤＮＯ：９のＶＥＧＦゲオバチルスペプチドであり、この変異骨格をＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１３、２５、２９、３１、４０、５０、及び５２位に等しい位置において７つのアミノ酸置換の組み合わせを含むように修飾して、修飾変異ＢＢＰＩ骨格を生成する。１つの態様において、７つのアミノ酸置換の組み合わせを含む修飾変異ＢＢＰＩはＳＥＱＩＤＮＯ：６１７（ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＲＤＭＲＰＮＡＣＨＳＡＣＫＳＣＫＣＹＮＬＹＧＷＴＣＴＣＡＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：６１７）の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｒ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ａ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６１８（ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＲＤＭＲＰＮＲＣＨＳＡＣＫＳＣＫＣＹＮＬＹＧＷＴＣＴＣＡＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：６１８）の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｒ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ｒ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：４９１（ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＲＤＡＲＰＮＡＣＨＳＡＣＫＳＣＡＣＳＫＨＳＱＩＴＣＫＣＴＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：４９１）の修飾変異ＢＢＩｔ−ＶＥＧＦ−Ｖ１−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｒ−Ｍ２７Ａ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ａ−Ｆ５０Ｋ−Ｖ５２Ｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６３２（ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＲＤＡＲＰＮＡＣＨＳＡＣＫＳＣＡＣＫＴＮＰＳＧＳＣＫＣＴＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ：ＳＥＱＩＤＮＯ：６３２）の修飾変異ＢＢＩｔ−ＶＥＧＦ−Ｖ２−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｒ−Ｍ２７Ａ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ａ−Ｆ５０Ｋ−Ｖ５２Ｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６３３（ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＲＤＡＲＰＮＡＣＨＳＡＣＫＳＣＡＣＲＰＴＧＨＳＬＣＫＣＴＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：６３３）の修飾変異ＢＢＩｔ−ＶＥＧＦ−Ｖ３−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｒ−Ｍ２７Ａ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ａ−Ｆ５０Ｋ−Ｖ５２Ｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６３４（ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＲＤＡＲＰＮＡＣＨＳＡＣＫＳＣＡＣＫＨＳＡＫＡＥＣＫＣＴＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：６３４）の修飾変異ＢＢＩｔ−ＶＥＧＦ−Ｖ４−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｒ−Ｍ２７Ａ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ａ−Ｆ５０Ｋ−Ｖ５２Ｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６３５（ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＲＤＡＲＰＮＡＣＨＳＡＣＫＳＣＡＣＫＰＳＳＡＳＳＣＫＣＴＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：６３５）の修飾変異ＢＢＩｔ−ＶＥＧＦ−Ｖ５−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｒ−Ｍ２７Ａ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ａ−Ｆ５０Ｋ−Ｖ５２Ｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６３６（ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＲＤＡＲＰＮＡＣＨＳＡＣＫＳＣＡＣＰＶＴＫＲＶＨＣＫＣＴＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：６３６）の修飾変異ＢＢＩｔ−ＶＥＧＦ−Ｖ６−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｒ−Ｍ２７Ａ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ａ−Ｆ５０Ｋ−Ｖ５２Ｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６３７（ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＲＤＡＲＰＮＡＣＨＳＡＣＫＳＣＡＣＲＹＷＱＤＩＰＣＫＣＴＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：６３７）の修飾変異ＢＢＩｔ−ＴＮＦα−Ｔ１−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｒ−Ｍ２７Ａ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ａ−Ｆ５０Ｋ−Ｖ５２Ｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６３８（ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＲＤＡＲＰＮＡＣＨＳＡＣＫＳＣＡＣＡＰＥＰＩＬＡＣＫＣＴＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：６３８）の修飾変異ＢＢＩｔ−ＴＮＦα−Ｔ２−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｒ−Ｍ２７Ａ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ａ−Ｆ５０Ｋ−Ｖ５２Ｔ、及びＳＥＱＩＤＮＯ：６３９（ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＫＤＱＲＰＮＥＣＨＳＡＣＫＳＣＨＣＹＮＬＹＧＷＴＣＲＣＱＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：６３９）の修飾変異ＢＢＩｔ−ＴＮＦα−Ｔ３−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｒ−Ｍ２７Ａ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ａ−Ｆ５０Ｋ−Ｖ５２Ｔから選択される。

幾つかの態様において、修飾変異ＢＢＰＩはＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の３、２５、２７、２９、３１、４０、５０、及び５２位に等しい位置で８つのアミノ酸置換の組み合わせを含む。幾つかの態様において、８つのアミノ酸置換の組み合わせは１３−２５−２７−２９−３１−４０−５０−５２、１３−２５−２７−２９−３１−４０−５０−５２、１３−２５−２７−２９−３１−４０−５０−５２、１３−２５−２７−２９−３１−４０−５０−５２、及び１３−２５−２７−２９−３１−４０−５０−５２の位置の置換の組み合わせを含む。幾つかの態様において、８つのアミノ酸置換の組み合わせは１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ａ−２９Ｒ−３１Ｅ−４０Ｋ−５０Ｑ−５２Ｑ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ｒ−２９Ｅ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｒ−５２Ｋ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ａ−２９Ｒ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｒ−５２Ｌ、及び１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ｑ−２９Ｐ−３１Ｅ−４０Ｈ−５０Ｒ−５２Ｑから選択される。本発明はセクション５．３に記載され、更にセクション５．４に記載の３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ａ−２９Ｒ−３１Ｅ−４０Ｋ−５０Ｑ−５２Ｑ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ｒ−２９Ｅ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｒ−５２Ｋ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ａ−２９Ｒ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｒ−５２Ｌ、及び１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ｑ−２９Ｐ−３１Ｅ−４０Ｈ−５０Ｒ−５２Ｑの組み合わせから選択される８つのアミノ酸置換の組み合わせを含む変異ＢＢＰＩのいずれか１つを提供する。１つの態様において、変異骨格のキモトリプシンループはＳＥＱＩＤＮＯ：９のＶＥＧＦ変異ペプチドであり、変異骨格をＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１３、２５、２７、２９、３１、４０、５０、及び５２位に等しい位置で８つのアミノ酸置換の組み合わせを含むように修飾して、修飾変異ＢＢＰＩ骨格を生成する。１つの態様において、８つのアミノ酸置換の組み合わせを含む修飾変異ＢＢＰＩは、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２７（ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＲＤＡＲＰＮＡＣＨＳＡＣＫＳＣＨＣＹＮＬＹＧＷＴＣＫＣＴＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：６２７；ＫＴ８）の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｒ−Ｍ２７Ａ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ａ−Ａ４０Ｈ−Ｆ５０Ｋ−Ｖ５２Ｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２８（ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＫＤＡＲＲＮＥＣＨＳＡＣＫＳＣＫＣＹＮＬＹＧＷＴＣＱＣＱＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：６２８；ＱＱ８）の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｋ−Ｍ２７Ａ−Ｌ２９Ｒ−Ｓ３１Ｅ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｑ−Ｖ５２Ｑ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２９の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｋ−Ｍ２７Ｒ−Ｌ２９Ｅ−Ｓ３１Ａ−Ａ４０Ｈ−Ｆ５０Ｒ−Ｖ５２Ｋ（ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＫＤＲＲＥＮＡＣＨＳＡＣＫＳＣＨＣＹＮＬＹＧＷＴＣＲＣＫＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：６２９；ＲＫ８）の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｋ−Ｍ２７Ｒ−Ｌ２９Ｅ−Ｓ３１Ａ−Ａ４０Ｈ−Ｆ５０Ｒ−Ｖ５２Ｋ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６３０（ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＫＤＡＲＲＮＡＣＨＳＡＣＫＳＣＨＣＹＮＬＹＧＷＴＣＲＣＬＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：６３０；ＲＬ８）の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｋ−Ｍ２７Ａ−Ｌ２９Ｒ−Ｓ３１Ａ−Ａ４０Ｈ−Ｆ５０Ｒ−Ｖ５２Ｌ、及びＳＥＱＩＤＮＯ：６３１（ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＫＤＱＲＰＮＥＣＨＳＡＣＫＳＣＨＣＹＮＬＹＧＷＴＣＲＣＱＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：６３１；ＲＱ８）の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｋ−Ｍ２７Ｑ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ｅ−Ａ４０Ｈ−Ｆ５０Ｒ−Ｖ５２Ｑから選択される。

本発明は前述のアミノ酸置換の組み合わせのいずれかを含み、未修飾前駆体ＢＢＰＩよりもプロテアーゼ抑制活性が高い修飾変異ＢＢＰＩを更に提供する。幾つかの態様において、対応する前駆体未修飾ＢＢＰＩのキモトリプシンループの代わりに変異体ペプチドを含む修飾変異ＢＢＰＩは前駆体未修飾ＢＢＰＩ骨格よりも高いトリプシン抑制活性（ＴＩＡ）を有する。他の態様において、対応する前駆体未修飾ＢＢＰＩのキモトリプシンループの代わりに変異体ペプチドを含む修飾変異ＢＢＰＩは前駆体未修飾ＢＢＰＩ骨格よりも高いトリプシン抑制活性（ＴＩＡ）を有する。

実施例で示すように、変異ＢＢＰＩの主鎖における少なくとも１つのアミノ酸の置換は未修飾変異ＢＢＰＩよりも高い生産性を有する修飾変異ＢＢＰＩを生成する。幾つかの態様において、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、又は８つのアミノ酸置換の組み合わせを含むＢＢＰＩは未修飾前駆体ＢＢＰＩよりも高い生産性を有する。従って、本発明は前述のいずれかのアミノ酸置換の組み合わせを含み、未修飾前駆体ＢＢＰＩよりも高い生産性（ＰＹ）を有する修飾変異ＢＢＰＩを提供する。更なる他の態様において、本発明は前述のいずれかのアミノ酸置換の組み合わせを含み、未修飾前駆体ＢＢＰＩのトリプシン抑制活性及び生産性よりも高いＴＩＡ及びＰＹを有する修飾変異ＢＢＰＩを提供する。

幾つかの態様において、この修飾変異ＢＢＰＩは更に修飾変異ＢＢＰＩのＮ末端に位置するペプチド挿入を含む。幾つかの態様において、ペプチド挿入は更に１乃至１５アミノ酸の間の配列を含む。他の態様において、このペプチド挿入は５乃至１０アミノ酸の間の配列を含む。幾つかの態様において、このペプチド挿入はＳＥＱＩＤＮＯ：３８９（ＤＤＥＰＳＫＰＣＣＤＰＤＰ；ＳＥＱＩＤＮＯ：３８９）のペプチドを含む。ＳＥＱＩＤＮＯ：３８９のペプチド挿入を含む修飾変異ＢＢＰＩの例は（ＤＤＥＰＳＫＰＣＣＤＰＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＡＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＳＤＭＲＬＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＡＣＹＮＬＹＧＷＴＣＦＣＶＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：３９０）及びＳＥＱＩＤＮＯ：４１３の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−４Ｄ１３−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ（ＤＰＤＤＥＰＳＫＰＣＣＤＰＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＳＤＭＲＰＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＫＣＹＮＬＹＧＷＴＣＴＣＡＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：４１３）の修飾変異４Ｄ１３ＢＢＩｔ−ＡＶである。
５．４．３ＢＢＰＩ融合タンパク質

幾つかの態様において、それぞれの修飾変異ＢＢＰＩは触媒℃メイン、切断部位、及びＢＢＰＩ骨格を含む融合タンパク質として発現される。この触媒ドメインはセルラーゼ、クチナーゼ、及びジスルフィドイソメラーゼから選択される。幾つかの態様において、ＢＢＰＩ融合タンパク質に含まれる触媒ドメインはＳＥＱＩＤＮＯ：６６９
ＤＤＹＳＶＶＥＥＨＧＱＬＳＩＳＮＧＥＬＶＮＥＲＧＥＱＶＱＬＫＧＭＳＳＨＧＬＱＷＹＧＱＦＶＮＹＥＳＭＫＷＬＲＤＤＷＧＩＴＶＦＲＡＡＭＹＴＳＳＧＧＹＩＤＤＰＳＶＫＥＫＶＫＥＴＶＥＡＡＩＤＬＧＩＹＶＩＩＤＷＨＩＬＳＤＮＤＰＮＩＹＫＥＥＡＫＤＦＦＤＥＭＳＥＬＹＧＤＹＰＮＶＩＹＥＩＡＮＥＰＮＧＳＤＶＴＷＤＮＱＩＫＰＹＡＥＥＶＩＰＶＩＲＤＮＤＰＮＮＩＶＩＶＧＴＧＴＷＳＱＤＶＨＨＡＡＤＮＱＬＡＤＰＮＶＭＹＡＦＨＦＹＡＧＴＨＧＱＮＬＲＤＱＶＤＹＡＬＤＱＧＡＡＩＦＶＳＥＷＧＴＳＡＡＴＧＤＧＧＶＦＬＤＥＡＱＶＷＩＤＦＭＤＥＲＮＬＳＷＡＮＷＳＬＴＨＫＤＥＳＳＡＡＬＭＰＧＡＮＰＴＧＧＷＴＥＡＥＬＳＰＳＧＴＦＶＲＥＫＩＲＥＳＡＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６６９）のセルラーゼ触媒ドメインである。

この融合タンパク質はプロテアーゼ又は酸／熱により処理されて、修飾変異ＢＢＰＩを有利する。幾つかの態様において、この融合タンパク質は更に少なくとも１つのリンカー配列を含む。幾つかの態様において、このリンカー配列はＳＥＱＩＤＮＯＳ：１４１−１４３からなる群より選択される。融合タンパク質を切断して修飾変異ＢＢＰＩを放出することはしばしば有効であるが、必須ではない。融合タンパク質として発現され及び分泌された修飾変異ＢＢＰＩは、驚くべきことにそれらの機能を維持している。

修飾変異ＢＢＰＩ融合タンパク質は融合ポリヌクレオチド配列から宿主バクテリア細胞によりそれぞれ発現される。そのような融合ポリヌクレオチド配列は５’末端から３’末端への適したリーディングフレームにおいて、第一、第二、第三、及び第四ポリヌクレオチド配列の順に構築される。そのように構築されると、このポリヌクレオチド配列は、そのアミノ末端から、１．バクテリア種における分泌配列機能するシグナルペプチド、２．分泌されたポリペプチド又はバクテリア種から通常分泌されるタンパク質、例えば、セルラーゼ又はそのタンパク質、３．切断可能なリンカーペプチド、及び４．所望のポリペプチド（例えば、修飾変異ＢＢＰＩ）をコードする「融合ポリペプチド」をコードする。幾つかの態様において、前述の融合ポリヌクレオチド配列は更に、融合タンパク質の第一及び第二配列の間に、スペーサーとして機能するプロペプチドのタンパク質をコードしているポリヌクレオチドを含む。スペーサーの機能は第一及び第二ポリペプチドの間の距離を大きくすることである。幾つかの態様において、スペーサー配列は１乃至１０アミノ酸長である。他の態様において、前述の融合ポリヌクレオチド配列は更にリンカーペプチド及び修飾変異ＢＢＰＩの間にペプチド挿入コードするポリヌクレオチドを含む。幾つかの態様において、このペプチド挿入は１乃至１５アミノ酸の配列を含む。他の態様において、このペプチド挿入は５乃至１０アミノ酸の間の配列を含む。幾つかの態様において、このペプチド挿入はＳＥＱＩＤＮＯ：３８９のペプチドを含む。

融合タンパク質の生産のための各種方法は当業者に知られている。（例えば、ＵＳＰａｔｅｎｔｓ５，４１１，８７３、５，４２９，９５０、及び５，６７９，５４３参照。これらの文献を参照により本明細書に援用する。）従って、任意の好適な方法が本発明に用いられる。

５．５ボウマンブリックプロテアーゼインヒビターポリヌクレオチド
本発明発明は融合タンパク質の生成に依存しているので、遺伝子組み換えの分野の一般的な技術を依存している。本発明において用いる一般的な方法を開示している基本的なテキストはＳａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（（２ｎｄｅｄ．）［１９８９］）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（１９９０）；及びＡｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，（ｅｄｓ．），ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（１９９４）を含む。

本発明は修飾変異ＢＢＰＩの発現を可能にする、ポリヌクレオチド構築体、ベクター、及び宿主細胞を含む挿入を提供する。本発明のポリヌクレオチド構築体はプロモーター配列及び修飾変異ＢＢＰＩを含む融合タンパク質をコードする融合ポリマーヌクレオチド配列を含む。前述のように、融合ポリヌクレオチド配列は触媒ドメイン、切断部位、及びＢＢＰＩ骨格を含む。ＢＢＰＩをコードしている天然又は合成ポリヌクレオチドフラグメントがこのポリヌクレオチド構築体に取り込まれる。変異ＢＢＰＩへ導入される即ち、１つのアミノ酸置換は少なくとも１つのコドンにおける部位変異誘発のより生成される。他の態様において、少なくとも１つのアミノ酸置換はコード配列を含み、アニールされプロテアーゼ抑ＤＮＡ配列に結合される、コード配列を含むＤＮＡオリグヌクレオチドによりコードされる。所望のＤＮＡ配列がその後単離され本発明の方法に用いられる。

幾つかの態様において、本発明のポリヌクレオチド構築体は未修飾前駆体変異ＢＢＰＩのアミノ酸配列に対して、少なくとも６５％のアミノ酸配列同一性、少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性、少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９２％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９７％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、未修飾前駆体変異ＢＢＰＩよりも高いプロテアーゼ抑制活性を有する。本発明発明は更に、前述のアミノ酸置換の任意の１つの組み合わせを含み、より高いプロテアーゼ抑制活性、例えば、トリプシン抑制活性を有する修飾変異ＢＢＰＩをコードしているポリヌクレオチドを提供し、そして、修飾前駆体変異ＢＢＰＩを提供する。

幾つかの態様において、本発明のポリヌクレオチド構築体は用いる宿主細胞において修飾変異ＢＢＰＩの発現を最適化するコドンである、ポリヌクレオチド配列を含む。多くの細胞において各コドンの使用を列挙しているコドン使用テーブルは当業者に知られており（例えば、Ｎａｋａｍｕｒａｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２８：２９２［２０００］参照）、容易に利用可能であるので、発現されるべきタンパク質のアミノ酸配列を用いて、そのような核酸配列は容易に設計することができる。

本発明は構造的及び／又は機能的類似性により関連づけられる修飾変異ＢＢＰＩタンパク質をコードしているコード配列を含むポリヌクレオチド構築体も含む。幾つかの態様において、修飾変異ＢＢＰＩは異なる属及び／又は種に属する自然発生ＢＢＰＩ由来である。幾つかの態様において、関連するタンパク質は同じ種由来である。即ち、本発明を特定の源由来の関連タンパク質に限定することは意図していない。更に、「関連タンパク質」の語は、三次構造類事体及び一時構造類事態を包含する。例えば、本発明はＰｒａｋａｓｈｅｔａｌ．（ＪｍｏｌＥｖｏｌ４２：５６０−５６９［１９９６］）に記載のようなＢＢＰＩタンパク質の類似体を含むがこれらに限定されない類自体を包含する。

幾つかの態様において、本発明のポリヌクレオチド構築体に含まれるプロモーター配列はＢＢＰＩコーディングポリヌクレオチドに作動可能に結合している。例示的なプロモーター構成的プロモーター及び誘発プロモーターの両方を含む。そのようなプロモーターは当業者に知られている。天然プロモーターの１つ以上のヌクレオチドを置き換え、置換、追加、又は排除して、機能を失わずに欠失できることを理解している。本発明の実施はプロモーターのそのような変更を包含し、そのような変更により影響を受けない。遺伝子構築体に用いるプロモーターの選択はこの分野の当業者の知識の範囲内である。

幾つかの態様において、プロモーター配列はバクテリア源から得られる。幾つかの態様において、プロモーター配列はバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（例えば、バチルスアルガロフィリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルスブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ）、バチルスサーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルスクラウジ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｌａｕｓｉｉ）、バチルスコアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルスファームス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｆｉｒｍｕｓ）、バチルスレンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌａｕｔｕｓ）、バチルスリケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルスメガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルスプミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルスステアロセレモフィリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルススブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）、又はバチルスツリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ））；又はストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属（例えば、ストレプトマイセスリビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓ）又はすストレプトマイセスミュリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｍｕｒｉｎｕｓ））等のグラム陽性バクテリア、又はグラム陰性バクテリア（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ又はシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．））から選択される。

プロモーターは選択された宿主細胞において転写活性を有するＤＮＡ配列でよく、宿主細胞の相同体又は異性体である遺伝子由来でもよい。バクテリア宿主細胞中で修飾変異ＢＢＰＩの発現に用いることができる好適なプロモーターの例はＥ．ｃｏｌｉのｌａｃオペロンプロモーター、ステアロセレモフィリスコエリコラ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）アガラーゼ遺伝子、ｄａｇＡプロモーター、バチルスリケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）αアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）のプロモーター、バチルススブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）のａｐｒＥプロモーター、バチルスステアロセレモフィリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）マルトジェニックアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）のプロモーター、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）αアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）のプロモーター、バチルススブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｘｙｌＡ及びｘｙｌＢ遺伝子のプロモーター、及びＰｌ７０プロモーターを含むラクトコッカス種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）由来プロモーターを含むがこれらに限定されない。遺伝子をコードしている化合物がＥ．ｃｏｌｉのようなバクテリア種中で発現される場合、例えば、Ｔ７プロモーター及びファージラムダプロモーターを含むバクテリオファージプロモーターのような、好適なプロモーターが選択される。糸状菌における転写のための、有用なプロモーターの例は、アスペルギルスオリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコールミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルスニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）中性αアミラーゼ、アスペルギルスニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）酸安定αアミラーゼ、アスペルギルスニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、リゾムコールミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ、アスペルギルスオリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）アルカリプロテアーゼ、アスペルギルスオリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）リン酸トリオースイソメラーゼ（ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅｉｓｏｍｅｒａｓｅ、及びアスペルギルスニヂュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼをコードしている遺伝子由来のものである。酵母中での発現に好適なプロモーターの例は、サッカロマイセスセレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＧａｌ１及びＧａｌ１０、及びピチアパストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１又はＡＯＸ２プロモーターである。

本発明は対応する野生型プロモーターの活性と比較したときに高いプロモーターの活性を示すように修飾され、修飾変異ＢＢＰＩタンパク質の発現するプロモーター配列も含む。従って、バチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡｐｒＥプロモーターを定義する配列の変異体が本発明構築体に用いられることが理解される。バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）中でプロモーター配列変異体を生成する方法は当業者に知られている（例えば、Ｈｅｌｍａｎｎｅｔａｌ．，２００２．ＲＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅａｎｄｓｉｇｍａｆａｃｔｏｒｓ，ｐｐ２８９−３１２ＩｎＡ．Ｌ．Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ，Ｊ．Ａ．ＨｏｃｈａｎｄＲ．Ｌｏｓｉｃｋ（ｅｄ），Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓａｎｄｉｔｓｃｌｏｓｅｓｔｒｅｌａｔｉｖｅｓ：ｆｒｏｍｇｅｎｅｓｔｏｃｅｌｌｓ．ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．参照）。当業者に知られている任意の好適なプロモーターを本発明に用いることができるので、本発明を特定のプロモーターに限定することは意図しない。

幾つかの態様において、プロモーター配列に加えて、ポリヌクレオチド構築体も構造遺伝子の転写停止領域下流も含み、効果的な転写を提供する。幾つかの態様において、この停止領域はプロモーター配列と同じ遺伝子から得られる。他の態様では、他の遺伝子から得られる。好適な転写停止シグナルの選択は当業者に知られている。

５．６ボウマンブリックプロテアーゼインヒビターベクター
本発明は本発明のポリヌクレオチド構築体を含むベクターを提供する。このベクターを宿主細胞へ導入して本発明の修飾変異ＢＢＰＩタンパク質を発現する。導入された宿主細胞中で複成され視認される限り、任意のベクターを用いることができる。数多くの好適なベクター及びプロモーターが当業者に知られおり、市場で入手可能である。好適なクローニング及び発現ベクターは当業者に知られている各種文献にも記載されている。（例えば、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．（上記）及びＡｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ参照。これらの文献を参照により本明細書に援用する。）好適なＢＢＰＩコードＤＮＡ配列をプラスミド又はベクター（便宜的にこれらをまとめて「ベクター」と言う）に、任意の好適な手段で導入する。一般的に、ＤＮＡ配列はこの分野の当業者に知られている標準的な手順により好適な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。

好適なベクターは核酸配列、挿入部位、及び停止領域等の好適な制御エレメントをコードしている選択可能マーカーを通常含む。幾つかの態様において、このベクターは例えば、コード配列に作動可能に結合し、宿主細胞中のコード配列の発現を効果的にするため（及び／又はベクター又は宿主細胞環境中で、修飾可溶化タンパク質コード配列が通常発現されないため）の制御エレメント、（即ち、プロモーター及びターミネーターエレメント又は５’及び／又は３’未翻訳領域）を含む調節配列を含む。数多くの好適なベクター及びプロモーターが当業者に知られており、多くのものは市場で入手可能である。選択可能マーカーの選択は宿主細胞に依存する。異なる宿主細胞に対する公的なマーカーは当業者に知られている。典型的な選択可能マーカー遺伝子は、（ａ）抗生物質又は他の毒性（例えば、アンピシリン、メトトレキサート、テトラサイクリン、ネオマイシン、ミコフェノール酸、ピューロマイシン、ゼオマイシン、又はハイグロマイシン）に対する耐性を付与し、又は（ｂ）宿主細胞中の栄養要求性変異又は天然の栄養結合を補うタンパク質をコードする。

幾つかの態様において、融合ＢＢＰＩポリペプチドの発現は、宿主細胞中に導入されたマルチコピー／置換プラスミド上に存在しているポリヌクレオチドをコードしている対応する融合ポリペプチドの１つ以上のコピーの発現に起因している。幾つかの態様において、ベクターは宿主細胞中の融合ＢＢＰＩタンパク質を発現している染色体外自己複製遺伝エレメントを形成するマルチコピー／複成プラスミドベクターである。通常、このベクターはプラスミドを含む宿主細胞の選択を容易ならしめるための、選択マーカー遺伝子を運ぶ、プラスミドベクターである。宿主細胞中で自律的複成するベクターはバチルス細胞中でベクターを自律的に複成させることができる複製の起源を含むベクターを含む。複製のバクテリア起源の例としては、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて複成させることができるプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、及びｐＡＣＹＣ１８４の複成の起源、及びバチルス中で複成できるｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４、ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０、及びｐＡＭβ１がある。複成の起源はバチルス細胞中で機能温度感受性を付与する変異を有するものである（例えば、Ｅｈｒｌｉｃｈ，ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓＵＳＡ７５：１４３３［１９７８］参照）。本発明に用いることができる追加的なバクテリア発現ベクターはバクテリオファージλ及びＭ１３、並びにＭＢＰ、ＧＳＴ、及びＬａＺとして融合発現システムを含む。更なる態様において、エピトープタグは組換えタンパク質に加えて、単離の従来技術を提供する（例えば、ｃ−ｍｙｃ）。

幾つかの態様において、ＢＢＰＩ融合タンパク質の発現は宿主細胞のゲノムへ組み込まれたＢＢＰＩ融合コードポリヌクレオチドの即ち、１つのコピーの発現に起因する。従って、幾つかの態様において、本発明はインテグレーティングベクターに取り込まれるポリヌクレオチド構築体をコードしているＢＢＰＩを提供する。従って、ベクターが宿主細胞へくみこまれた場合、これはゲノムへ取り込まれ、統合されるゲノムと一緒に複成される。ＢＢＰＩ遺伝子の複数のコピーが宿主細胞のゲノムの複数の位置で組み込まれる。代替的に、ＢＢＰＩ融合タンパク質及び選択マーカー（例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードしている遺伝子等の抗生物質耐性マーカー）をコードしている配列を運ぶ増幅可能な発現カセットは一部位交叉イベントを介してゲノム中に取り込むことができ、その後好適な抗生物質（例えば、クロラムフェニコール）の濃度を高めて形質転換された宿主細胞に適用する。

５．７ボウマンブリックプロテアーゼインヒビター宿主細胞
１つの態様において、本発明は修飾変異ＢＢＰＩをコードしているポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。発現ベクターが宿主細胞に導入された後、形質転換された宿主細胞を所望のＢＢＰＩ融合タンパク質をコードしている遺伝子の発現に適した条件下で培養する。形質転換された細胞の大量バッチは前述のように培養することができる。最終的に、生成物は当業者に既知の技術を用いて培地から単離される。

プラスミド構築体を含む細胞をバチルス細胞へＤＮＡを導入し、バクテリア宿主細胞へプラスミドを形質転換する方法は良く知られている。幾つかの態様において、このプラスミドは次いで大腸菌から単離され、バチルスへ形質転換される。しかしながら、Ｅ．ｃｏｌｉのような介在微生物を用いることは必須ではない。幾つかの態様において、ＤＮＡ構築体又はベクターはバチルス宿主細胞に直接導入される。当業者はバチルス細胞へポリヌクレオチド配列を導入する方法を良く知っている。（例えば、Ｆｅｒｒａｒｉｅｔａｌ．、“Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，”ｉｎＨａｒｗｏｏｄｅｔａｌ．（ｅｄ．）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、ＰｌｅｎｕｍＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｒｐ．［１９８９］，ｐａｇｅｓ５７−７２；Ｓａｕｎｄｅｒｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５７：７１８−７２６［１９８４］；Ｈｏｃｈｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，９３：１９２５−１９３７［１９６７］；Ｍａｎｎｅｔａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３：１３１−１３５［１９８６］；及びＨｏｌｕｂｏｖａ、ＦｏｌｉａＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３０：９７［１９８５］；Ｃｈａｎｇｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８：１１−１１５［１９７９］；Ｖｏｒｏｂｊｅｖａｅｔａｌ．，ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，７：２６１−２６３［１９８０］；Ｓｍｉｔｈｅｔａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５１：６３４［１９８６］；Ｆｉｓｈｅｒｅｔａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３９：２１３−２１７［１９８１］；及びＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３０：２０３［１９８４］参照。）即ち、プロトプラスト形質転換及びコングレッション、形質感染、及びプロトプラスト融合を含む形質転換としてそのような方法は知られており、本発明に適している。形質転換の方法は、宿主細胞へ本発明により提供されるＤＮＡ構築体を導入するのに特に好ましい。

一般的に用いられている方法に加えて、幾つかの態様において、宿主細胞は直接形質転換される（即ち、ＤＮＡ構築体を宿主細胞へ導入する前に、介在細胞を用いて、増幅又は他の処理をしない）。宿主細胞へのＤＮＡ構築体の導入はプラスミド又はベクターへ挿入しないで、宿主細胞へＤＮＡを導入するために当業者に知られている物理的及び化学的方法を含む。そのような方法はエレクトロポレーション、ネイキッドＤＮＡ又はリポソームの挿入等を含むがこれらに限定されない。追加的な態様において、プラスミドへの挿入をしないで、ＤＮＡ構築体はプラスミドで共形質転換をされる。更なる態様において、選択マーカーは既知の方法で変性されたバチルス株から欠失される。（Ｓｔａｈｌｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５８：４１１−４１８［１９８４］；及びＰａｌｍｅｒｏｓｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ２４７：２５５−２６４［２０００］参照。）

バチルスを形質転換するために知られている方法は、部分的に相同なレジデントプラスミドを運ぶ適合細胞によるドナープラスミドの取り込むを含む、プラスミドマーカーレスキュー形質転換のような方法を含む（Ｃｏｎｔｅｎｔｅｅｔａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ２：５５５−５７１［１９７９］；Ｈａｉｍａｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２２３：１８５−１９１［１９９０］；Ｗｅｉｎｒａｕｃｈｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５４：１０７７−１０８７［１９８３］；及びＷｅｉｎｒａｕｃｈｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９：１２０５−１２１１［１９８７］）。この方法において、外来ドナープラスミドは染色体形質転換に似たプロセスにおいてレジデント「ヘルパー」プラスミドの相同領域で組み換える。

プロとプラスト形質転換による形質転換に含まれる他の方法は当業者に知られている。（例えば、ＣｈａｎｇａｎｄＣｏｈｅｎ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８：１１１−１１５［１９７９］；Ｖｏｒｏｂｊｅｖａｅｔａｌ．，ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，７：２６１−２６３［１９８０］；Ｓｍｉｔｈｅｔａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５１：６３４［１９８６］；Ｆｉｓｈｅｒｅｔａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３９：２１３−２１７［１９８１］；ＭｃＤｏｎａｌｄ［１９８４］Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３０：２０３［１９８４］；ａｎｄＢａｋｈｉｅｔｅｔａｌ．，４９：５７７［１９８５］参照）。更に、Ｍａｎｎｅｔａｌ．，（Ｍａｎｎｅｔａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３：１３１−１３５［１９８６］）はバチルスプロトプラストの形質転換を開示し、Ｈｏｌｕｂｏｖａ（Ｈｏｌｕｂｏｖａ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３０：９７［１９８５］）はＤＮＡ含有リポソームを用いてプロトプラストへＤＮＡを導入するための方法を開示する。幾つかの態様において、マーカー遺伝子は所望の遺伝子が宿主細胞中に存在するかしないかの指標として用いられる。幾つかの態様において、本発明のベクター中に含まれるＢＢＰＩ融合ポリマーヌクレオチド配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１９５のＢＢＰＩ融合タンパク質をコードする。これら方法に加えて、他の態様において、宿主細胞を直接形質転換する。「直接的形質転換」において、宿主細胞（即ち、バチルス細胞）に導入する前に修飾ポリヌクレオチドを増幅又は他の処理をするために、介在細胞を用いない。宿主細胞への修飾ポリヌクレオチドの導入はプラスミドマスカラベクターへの挿入をしないで、宿主細胞へ修飾ポリヌクレオチドを導入するために本分野で知られている物理的及び化学的方法を含む。そのような方法はコンピテント細胞の使用のほかに、塩化カルシウム沈降、エレクトロポレーション等のＤＮＡを細胞へ導入するための「人工的手段」の使用を含むがこれらに限定されない。従って、本発明はネイキッドＤＮＡ及びリポソーム等を用いることもできる。好適な宿主細胞有機体の例としては、バチラセアエ（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）（例えば、バチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルスリケニフォルｓミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルスレンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、バチルスブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、バチルスステアロセレモフィリス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスアルカロフィリス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルスクラウシ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルスハロヂュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、バチルスコアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルスサーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルスレンタス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、バチルスメガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、及びバチルスツリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ））、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属（例えば、ストレプトマイセス（Ｓ．ｍｕｒｉｎｕｓ）、及びストレプトマイセスリビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ））、酪酸バクテリア（例えば、ラクトコッカスラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ）等のラクトコッカス株（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｓｐｐ．）；ラクトバチルスレウテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｒｅｕｔｅｒｉ）を含むラクトバチルス株Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｐ．）；レウコノストック株（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｓｐｐ．）；ペディオコッカス株（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓｓｐｐ．）；及びストプレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓｐｐ）のバチルス株のメンバーを含むがこれらに限定されない。代替的に、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）又はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）に属するグラム陰性株も本発明に用いることができる。

幾つかの態様において、好適な宿主細胞微生物はピチア属（Ｐｉｃｈｉａｓｐ．）、ハンヌセラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａｓｐ）又はクリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉｎｉａ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）（例えば、サッカロマイセスセレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、スキゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ）（例えば、スキゾサッカロマイセスポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ））を含むがこれらに限定されないバイオテクノロジーの分野で有用な酵母種から選択される。幾つかの態様において、メチロトローフ酵母種の株であるピチアパストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）が宿主細胞として用いられ、他の態様において、宿主細胞微生物はハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａｓｐｅｃｉｅｓ）である。糸状菌の中で好適な宿主細胞微生物はアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種（例えば、アスペルギルスニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルスオリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルスツリンギエンシス（Ａ．ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ）、アスペルギルスアワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）、及びアスペルギルスニヂュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ））を含む。代替的に、フサリイウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐｅｃｉｅｓ）（例えば、フサリウムオキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ））の株及びリゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）（例えば、リゾムコールミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉ））の株が宿主細胞微生物として用いられる。追加的な好適な株はセルモマイセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）及びムコール（Ｍｕｃｏｒ）属を含むがこれらに限定されない。分泌されたタンパク質の折りたたみを促進して活性形態にする利益があるために、チオールジスルフィドオキシリダクターゼ又はシャペロン等のアクセサリータンパク質も幾つかの態様において、用いることができる。チオールジスルフィドオキシリダクターゼ及びタンパク質ジスルフィドイソメラーゼはタンパク質中の正しい蒸留残渣氏ルフィド結合の形成を促進する。バチスルスブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるｄｂｄＤＣオペロンの過剰発現はジスルフィド結合を有するタンパク質の生成に有利であることが報告されている（例えば、Ｍｅｉｍａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７：６９９４−７００１，［２００２］参照）。シャペロンは折り畳まれていない状態で曝されている疎水領域へ結合して、プロリン残基の隣のペプチド鎖の正しい形態の形成を補助し、好ましくない折り畳みを排除し、プロピル−ペプチジルシス−トランスイソメライブラリーゼによる、折り畳みを促進する。

本発明の幾つかの態様において、宿主細胞は即ち、１つのチオールジスルフィドオキシリダクターゼ又はシャペロンにおいてコードしている発現ベクターで形質転換される。当業者に知られている任意の好適なチオール−ジスルフィドオキシドリダクターゼ又はシャペロンを本発明に用いることができるので、本発明を特定のチオール−ジスルフィドオキシドリダクターゼ又はシャペロンに限定することを意図しない。

本発明の幾つかの態様において、そして以下で説明するように、適正に折り畳まれた分泌タンパク質のフラクションは、ジスルフィド結合を酸化／還元し及び／又は通常の酸化還元電位を変更する化学物質及び／又は溶媒の性質を変更してタンパク質の形態及び凝集を変更する化学物質を育成培地に添加して高めることができる。特定の好適な態様において、２−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）等のジスルフィド結合を還元する試薬は正しく折り畳まれたタンパク質の分画を高めるのに都合がよい。しかしながら、他の態様において及び用いる培地によっては、他のジスルフィド還元又は酸化剤（例えば、ＤＴＴ、ＴＣＥＰ、酸化還元グルタチオン、システイン、シスチン、システアミン、チオグルコネート、Ｓ_２Ｏ_３ ^２−、Ｓ_２Ｏ_４ ^２−、Ｓ_２Ｏ_５ ^２−、ＳＯ_３ ^２−、Ｓ_２Ｏ_７ ^２−、Ｃｕ＋等）を単独又は組み合わせて本発明に用いることができる。溶媒の性質を変更する他のアジュバンド（例えば、尿素、ＤＭＳＯ、ＴＷＥＥＮ（商標）−８０等）も単独で育成培地に添加して、又はＢＭＥ等のジスルフィド還元／酸化剤と一緒に用いて、正確に折り畳まれた分泌タンパク質の分画を高めるためることができ、本発明の各種態様に用いることができることは理解されている。幾つかの態様において、このＢＭＥは０．５乃至４ｍＭの範囲の濃度で、他の態様では０．１ｍＭ乃至１０ｍＭの濃度で用いられる。即ち、当業者は追加的なチオール還元／酸化剤の影響を最適化するための最も良い培地及び育成条件、及び／又は他のアジュバンド、並びにチオール還元／酸化剤及び／又は他のアジュバンドの用いる濃度をどのように選択すべきかを知っている。本発明を特定のジスルフィド還元／酸化剤に限定することは意図しない。当業者に知られている任意の好適な試薬を本発明に用いることができる。

５．７．１発酵パラメーター
本発明はバクテリア種を培養するための発酵方法に依存している。バクテリア種により異種タンパク質の生成のための発酵方法は当業者に知られている。培養は水性ミネラル塩培地、有機育成因子、炭素及びエネルギー源物質、酸素分子（好気性及び通性嫌気性バクテリアについて）、及び、もちろん用いられる１つ以上の特定の微生物の開始接種を含む育成培地中で行われる。

炭素及びエネルギー源、酸素、同化窒素、及び微生物の接種に加えて、適正な微生物成長を行い、微生物の転換プロセスにおける細胞により炭素及びエネルギー源の同化を最適化し、及び形質転換培地中で最大細胞濃度を有する最大細胞生産を達成するために、ミネラル栄養素の好適な量を供給することが必要である。

当業者に知られているように、各種培養培地を本発明に用いることができる。しかしながら、標準的な培地を本発明に用いる。幾つかの好適な培地製剤において、この培地は窒素のほかに、好適な量のリン酸、マグネシウム、カルシウム、カリウム、硫黄、及びナトリウムを、好適な可溶同化イオン及びこれらの組み合わせ形態で含み、好ましくは銅、マンガン、モリブデン、亜鉛、鉄、ホウ素、及び要素、の微量元素及び当業者に知られている全ての可溶性同化形態のものを含む。

幾つかの態様において、発酵反応は、空気、酸素抗含有空気、又は実質的に精製された酸素分子等の酸素含有気体の供給を必要とし、発酵管の内容物を維持して微生物の成長を維持するのに効果的な酸素分圧を有する、好気性プロセスである。実際には、酸素付加された炭化水素基質を使用することにより、微生物の育成のために必要な酸素が減少する。従って、好気性及びある程度の通気性嫌気性微生物の育成のために酸素分子を供給しなければならない。

通気速度は考えられる範囲を超えて変更することができるが、通気は、通常、ファーメンターの容量１リットル当たり、１分間に、０．５乃至１０容量、好ましくは０．５乃至７容量（所与の圧力及び２５℃）の範囲の速度で行われる。この量は反応器に供給されるべき通常の酸素含量の空気に基づいており、精製された酸素に換算すると、ファーメンターの容量１リットル当たり、１分間に、約０．１乃至１．７又は好ましくは約０．１乃至１．３容量（所与の圧力及び２５℃）になる。

微生物転換プロセスのために用いる圧力は幅広く変化させることができる。圧力は通常約０．５乃至５０ｐｓｉｇ、好ましくは約０乃至３０ｐｓｉｇ、より好ましくは大気圧よりわずかに高い圧力の範囲内であり、装置及び操作コストと酸素の溶存性とのバランスで決定される。大気圧より大きな圧力は、水性発酵漕において、溶存酸素濃度を高める傾向にあり、細胞成長速度を高めることができるので、有利である。同時に、このことは高い気圧が装置及び操業コストを減らすという事実とも整合性がある。

発酵温度は幾分変化させることができるが、大部分のバクテリア種について用いる温度を本発明で用いる。この温度は通常、約２０℃乃至４０℃の範囲であり、一般的には約２８℃乃至３７℃の範囲で、当業者に知られているように、選択される微生物の株に依存している。

この微生物は窒素同化の源も必要とする。窒素同化の源は任意の窒素含有化合物又は微生物による代謝利用のために好適な形態で窒素を放出することができる化合物である。タンパク質加水分解酵素等の各種有機窒素源化合物を用いることができるが、通常、アンモニア、水酸化アンモニウム、尿素、及びリン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、ピロリン酸アンモニウム、塩化アンモニウム又は他のアンモニウム化合物のような安価な窒素含有化合物が用いられる。アンモニアガス自体は大規模操業のために便利であり、好適な量で水性発酵槽（発酵培地）に通気して用いることができる。同時に、そのようなアンモニアはｐＨ調製にも用いることができる。

水性微生物発酵（発酵混合物）におけるｐＨの範囲は約２．０乃至８．０の例示的な範囲内である。しかしながら、特定の微生物のための至適ｐＨ範囲は、用いる培地にある程度依存しており、また用いる微生物にも依存している。従って、培地に関する幾分かの変更は当業者の知識の範囲内である。

発酵槽における発酵混合物の平均保持時間は、当業者に知られているように、用いる発酵温度及び培地に一部依存して、変更することが可能である。

幾つかの態様において、発酵槽は好ましくは、炭素含有基質が限定因子として制御することができ、それゆえ炭素含有基質の細胞への良好な転化が行われ、転化されない基質の相当量が細胞を汚染しないような、方法で行われることが好ましい。任意の残りの微量元素が容易に除去できることから、後者は水溶性基質では問題とはならない。しかしながら、非水溶性基質の場合ではこのことが問題となり、好適な洗浄工程等の追加的な製造処理が必要とされる。限定的基質レベルに到達するのに必要な時間は重要ではなく、特定の微生物及び実施される発酵方法に伴い変化する。しかしながら、発酵培地中の炭素源濃度をどのように決定し、炭素源の所望のレベルに達したかどうかは、本分野でよく知られている。

幾つかの態様において、発酵はバッチ又は連続操作として行われるが、フェドバッチ操作が通常、操作のしやすさ、生成物の均一な品質、及び全ての設備の経済性が最も好ましいことから、一般的に好まれている。

もし必要な場合には、全ての炭素及びエネルギー源の全部又は一部及び／又はアンモニア等の同化窒素源の一部が発酵槽へ水性ミネラル培地を供給する前に、水性ミネラル培地に転化される。即ち、反応器に導入される流れのそれぞれは予め決められた速度に制御され、又は発酵槽からのオフガス中の炭素及びエチレンエネルギー基質、ｐＨ、溶存酸素、酸素又は二酸化炭素、光透過性により測定される光密度等の濃度のモニタリングにより決定される。炭素及びエネルギー源の効率的な利用と合わせて、できるだけ細胞成長速度を速くし、基質変化に対して微生物細胞の生産性をできるだけ高くするように、各種物質の供給速度を変化させることができるが、より重要なことは容量単位で所望のタンパク質を最も多く得ることである。

各バッチ又は好適なフェドバッチ操作において、全ての装置、反応器、又は発酵手段、反応管又はコンテナ、パイプ、付帯循環装置又は冷却装置等は、通常約１２０℃で少なくとも１５分間蒸気を用いて、初めに殺菌される。殺菌された反応器をその後、酸素及び炭素含有基質を含むすべての必要とされる栄養素の存在下で選択された微生物の培地を接種する。用いる発酵槽のタイプは重要ではないが、幾つかの態様において、１５Ｌのバイオラフィート（Ｂｉｏｌａｆｉｔｔｅ）（Ｓａｉｎｔ−Ｇｅｒｍａｉｎ−ｅｎ−Ｌａｙｅ、フランス）が好ましい。

５．８タンパク質分離
幾つかの態様において、修飾プロテアーゼをコードしているポリヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は発現に好適な条件下で培養され、細胞培地からコードされたタンパク質を回収する。本発明の融合ＢＢＰＩを含む組み換え宿主細胞により生成されたタンパク質は培養培地に分泌される。幾つかの態様において、分泌された融合ＢＢＰＩは回収される。

幾つかの態様において、本発明は所望のタンパク質をその融合アナログから分離する方法を提供する。本明細書で説明する方法は融合アナログから修飾変異ＢＢＰＩの分離において用いることができる。

発酵ブロスから所望の融合ＢＢＰＩタンパク質の収集及び生成は当業者に知られている方法を用いて達成することもできる。発酵ブロスは一般的に、既知の方法により発酵ブロスから好適に除去される所望のタンパク質生成物のほかに、細胞、各種懸濁固形物、及び他のバイオマス不純物を含む細胞性崩壊物を含む。そのような除去の好適な方法は細胞のないろ過物を生成するための、固形―液体分離技術（例えば、遠心分離、ろ過、透析、ミクロろ過、回転真空ろ過、又は他の既知の方法）を含む。幾つかの態様において、ウルトラフィルトレーション、エバポレーション、及び／又は沈殿等の技術を用いる生成及び／又は結晶化の前に発酵ブロス又は無細胞ろ過物等を更に濃縮しておくことが好ましい。

上清中のタンパク質性成分の沈殿又はろ過は塩（例えば、塩酸アンモニウム）又は低ｐＨ（通常３未満）により達成でき、次いで各種クロマトグラフ法（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、親和クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、疎水電荷誘発クロマトグラフィー等）又は同様の方法により精製が行われる。本発明を特定の分離技術に限定することは意図しない。任意の方法を本発明に用いることができる。

特定の好適な態様において、発現された所望のポリペプチドはバクテリア細胞から選択される場合、このポリペプチドは育成培地から精製される。好適な態様において、発現宿主細胞が、ポリペプチドの精製（例えば、遠心分離）の前に培地から除去される。

発現された所望の組換えポリペプチドが宿主細胞から分泌されない場合、好適には、この細胞を崩壊させてポリペプチドを水性基質に抽出する。この工程が精製の第一工程となる。好ましくは発現宿主細胞は細胞を崩壊させる前に培地から収集される（例えば、遠心分離により）。細胞破壊は、リゾチーム又はベータグルカン消化により、又は細胞に高圧をかけることにより、既知の好適な方法を用いて行うことができる。（例えば、Ｓｃｏｂｅｓ、ＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｓｅｃｏｎｄｅｄｉｔｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ参照）。

幾つかの態様において、他の組換え構築体は可用性タンパク質の精製を促進する修飾へＢＢＰＩポリペプチドドメインをコードしている核酸配列に精製促進ドメインの添加することを含む（ＫｒｏｌｌＤＪｅｔａｌ（１９９３）ＤＮＡＣｅｌｌＢｉｏｌ１２：４４１−５３）。幾つかの態様において、修飾変異ＢＢＰＩのＣ末端へ６つのヒスチジン残基（即ち、ヒスタグ）を添加することは、所望のタンパク質及びその融合アナログの精製における補助工程として用いられる。精製補助剤としてのＨｉｓタグの使用は本分野において知られている（例えば、Ｈｅｎｇｅｎ，ＴＩＢＳ２０：２８５−２８６［１９９５］参照）。６つのＨｉｓタグを付加されたタンパク質は本分野で知られているＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄＭｅｔａｌｉｏｎＡｆｆｉｎｉｔｙＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＩＭＡＣ）を用いて用にに精製される。他の精製促進ドメインは固定化メタル上で精製することができるヒスチジン−トリプトファンモジュール等のメタルキレーティングペプチド（ＰｏｒａｔｈＪ（１９９２）ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒＰｕｒｉｆ３：２６３−２８１）、固定化されたイムノグロブリン上で精製することができるプロテインＡドメイン、及びＦＬＡＧＡ伸長／親和精製システムにおいて用いるドメイン（ＩｍｍｕｎｅｘＣｏｒｐ，ＳｅａｔｔｌｅＷＡ）を含むがこれらに限定されない。

精製ドメインと異種タンパク質との間のＦａｃｔｏｒＸＡ又はエンテロキナーゼ等の切断されたリンカー配列の包含も精製を促進するために用いることができる。

従って、本発明の融合ＢＢＰＩのための任意の好適な方法が本発明に用いることができる。即ち、本発明を特定の精製方法に限定することは意図しない。

幾つかの適用のために、本発明を用いて生成されたプロテアーゼインヒビターは高度に精製されていることが重要である（例えば、９９％より高い精製度）。このことは、所望のタンパク質を治療に用いる場合には真実であるが、他の適用にも必要なことである。本明細書で説明する方法は実質的に精製された所望のタンパク質を精製する方法を提供する。本明細書における所望のタンパク質は医薬品及びパーソナルケア組成物に好適である。しかしながら、本発明の方法を用いて各種精製レベルのタンパク質を製造することができ、本発明を用いて生成されたタンパク質を特定の精製レベルに限定することは意図しない。

５．８．１精製の間のＢＢＰＩの活性：プロテアーゼ抑制活性
本発明の幾つかの態様において、育成の後の精製工程の間に、ジスルフィド結合を還元／酸化し及び／又は通常の還元電位を変更する化合物及び／又は溶媒性質を変更してタンパク質の構造及び凝集に影響を与える化合物を添加してタンパク質の活性、即ち、プロテアーゼ抑制活性を高める。幾つかの好適な態様において、２−メルカプトエタノール等のジスルフィド結合を還元する試薬を添加して、タンパク質の活性を高くする。しかしながら、当業者が理解しているように、精製度及び緩衝液の組成に依存して、他の酸化又は還元剤（例えば、ＤＴＴ、ＴＣＥＰ、還元された又は酸化されたグルタチオンシステイン、シスチン、システアミン、トリグルコネート、Ｓ_２Ｏ_３ ^２−、Ｓ_２Ｏ_４ ^２−、Ｓ_２Ｏ_５ ^２−、ＳＯ_３ ^２−、Ｓ_２Ｏ_７ ^２−、Ｃｕ＋、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、タンパクチオール−ジスルフィド酸化還元酵素等）を単独又は組み合わせて本発明に用いることができる。溶媒性質を変更する他のアジュバンド（例えば、エタノールアミン、ＤＭＳＯ、ＴＷＥＥＮ（商標）―８０．アルギニン、尿素等）も単独又はＢＭＥ等のジスルフィド還元／酸化剤と組み合わせて、精製工程の間に、添加して、タンパク質の活性を高めることにより本発明に用いることができる。特定の好適な態様において、部分的に精製されたタンパク質は緩衝液（幾つかの特定に好ましい態様において、塩基性ｐＨにおいてＴＷＥＥＮ（商標）―８０を含む両性イオン緩衝液）希釈され及びＢＭＥとジスルフィド酸化剤（代替的な好まし痛いようにおいて、酸化グルタチオン又は硫酸ナトリウム）で活性化される。

更に、必要に応じて、ＢＢＰＩタンパク質の至適活性を決定するために条件をスクリーニングすることも意図する。例えば、各種ＢＭＥ濃度（０．１乃至１０ｍＭ）、酸化剤濃度（０乃至１／２０乃至２０倍のＢＭＥ濃度）、ｐＨ（７．５乃至９．５）、温度（１５乃至４０℃、希釈剤（１乃至２０倍）、インキュベーション時間（１２乃至７２時間）、通気（不活性ガス下でのインキュベーション乃至酸素含有ガスの存在下での激しい混合）、緩衝液タイプ（トリス、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳ、トリシン、ＴＡＰＳ、他の両性イオン緩衝液等）、緩衝液濃度（０．１乃至１Ｍ）、及び溶媒の性質を変更してタンパク質の構造及び凝集を変更すると知られている他の各種アジュバンドの添加（例えば、エタノールアミン、ＤＭＳＯ、ＴＷＥＥＮ（商標）８０、アルギニン、尿素等）を用いる発現システムのための至適条件を決定するために試験する。本発明を特定のジスルフィド還元／酸化剤、希釈剤、温度、ｐＨ、緩衝液タイプ又は組成物、又はアジュバンドに限定することは意図しない。当業者に知られている任意の好適な試薬を本発明に用いることができる。

チオール還元剤及び酸化剤によるＢＢＰＩの至適活性化は未修飾変異ＢＢＰＩのプロテアーゼ抑制活性の上昇を測定することによりモニタリングできる。トリプシン抑制活性は変異ペプチドで置換されたキモトリプシン抑制ループを有する変異体ＢＢＰＩにおけるプロテアーゼ抑制活性である。一方、キモトリプシン抑制活性は変異タンパク質で置換されたトリプシンループを含む変異ＢＢＰＩで測定されたプロテアーゼ抑制活性である。幾つかの態様において、修飾ＢＢＰＩのトリプシン抑制活性上の少なくとも１つのアミノ酸置換の影響は測定することができ、未修飾前駆体ＢＢＰＩのトリプシン抑制活性を比較することができる。

幾つかの態様において、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む修飾変異ＢＢＰＩは未修飾前駆体ＢＢＰＩのトリプシン抑制活性よりも高い活性を有する。幾つかの態様において、未修飾前駆体よりも高いＴＩＡを有する修飾変異体ＢＢＰＩを生成する１つのアミノ酸置換は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１、４、５、１１、１３、１８、２５、２７、２９、３１、３８、４０、５０、５２、５５、及び６５位に等しい位置から選択され、以下のアミノ酸置換を生じる。１つの態様において、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１に等しい位置でアミノ酸位置におけるアミノ酸置換はＡ及びＣから選択される。他の態様において、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の４位に等しいアミノ酸位置で置換されたアミノ酸はＶである。他の態様においてＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の５位に等しいアミノ酸位置で置換されたアミノ酸はＰ及びＡから選択される。他の態様において、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１１位に等しいアミノ酸位置で置換されたアミノ酸はＧである。他の態様において、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１３位に等しいアミノ酸位置で置換されたアミノ酸はＹ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｌ、Ｖ、Ｋ、及びＲから選択される。他の態様において、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１８位に等しいアミノ酸位置で置換されたアミノ酸はＩ、Ｖ、及びＬを含む。他の態様において、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の２５位に等しいアミノ酸位置で置換されたアミノ酸はＫ、Ｎ、Ｗ、Ｉ、Ａ、及びＲから選択される。他の態様において、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の２７位に等しいアミノ酸位置で置換されたアミノ酸はＲ、Ｋ、Ｖ、Ａ、及びＱを含む。他の態様において、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の２９位に等しいアミノ酸位置で置換されたアミノ酸はＲ、Ｋ、及びＰから選択される。他の態様において、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の３１位に等しいアミノ酸位置で置換されたアミノ酸はＱ、Ｈ、Ｅ、Ａ、Ｒ、Ｗ、Ｋ、及びＴから選択される。他の態様において、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の３８位に等しいアミノ酸位置で置換されたアミノ酸はＮ、Ｋ、及びＲから選択される。他の態様において、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の４０位に等しいアミノ酸位置で置換されたアミノ酸はＨ、Ｋ、Ｑ、Ｒ、及びＹから選択される。他の態様において、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の５０位に等しいアミノ酸位置で置換されたアミノ酸はＲ、Ｑ、Ｋ、Ｔ、Ｖ、Ｍ、及びＳから選択される。他の態様において、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の５２位に等しいアミノ酸位置で置換されたアミノ酸はＫ、Ｔ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、、Ｈ、Ａ、Ｍ、Ｓ、及びＥから選択される。他の態様において、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の５５位に等しいアミノ酸位置で置換されたアミノ酸はＭである。他の態様において、ＥＱＩＤＮＯ：１８７の６５位に等しいアミノ酸位置で置換されたアミノ酸はＥ、Ｑ、及びＤから選択される。

幾つかの態様において、対応する未修飾ＢＢＰＩよりも高いＴＩＡ及びＲＹを有する修飾変異ＢＢＰＩはそれぞれＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の５０位及び５２位に等しいアミノ酸位置で置換された２つのアミノ酸の組み合わせを含む。幾つかの態様において、２つのアミノ酸置換の組み合わせは５０Ｔ−５２Ａである。本発明はセクション５．３に記載され、セクション５．４に記載のような２つのアミノ酸置換の組み合わせ５０Ｔ−５２Ａを更に含む、任意の変異ＢＢＰＩ骨格を提供する。１つの態様において、変異骨格のキモトリプシンループはＶＥＧＦ変異ペプチド、例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：９であり、この変異骨格はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１３、５０、及び５２位に等しい位置における３つのアミノ酸置換の組み合わせを含むように修飾されて、修飾変異体ＢＢＰＩ骨格を生成する。１つの態様において、２つのアミノ酸置換の組み合わせを含む修飾変異ＢＢＰＩはＳＥＱＩＤＮＯ：５９５の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａである。

幾つかの態様において、対応する未修飾ＢＢＰＩよりも高いＴＩＡ及びＰＹを有する修飾変異体ＢＢＰＩはそれぞれ、ＥＱＩＤＮＯ：１８７の１３、５０、及び５２位に等しい位置において３つのアミノ酸置換の組み合わせを含む。幾つかの態様において、３つのアミノ酸置換の組み合わせは２５−５０−５２、２９−５０−５２、４０−５０−５２、及び１３−５０−５２の位置の組み合わせから選択される。幾つかの態様において、３つのアミノ酸置換の組み合わせは５Ｌ−５０Ｔ−５２Ａ、２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、及び１３Ｉ−５０Ｔ−５２Ａから選択される。本発明は５．３に記載され、セクション５．４に記載の２５Ｌ−５０Ｔ−５２Ａ、２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、及び１３Ｉ−５０Ｔ−５２Ａから選択される３つのアミノ酸置換の組み合わせを更に含む変異ＢＢＰＩのいずれか１つを提供する。１つの態様において、変異骨格のキモトリプシンループは、例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：９のＶＥＧＦ変異ペプチドであり、変異骨格はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１３、５０、及び５２に等しい位置における３つのアミノ酸置換の組み合わせを更に含むように修飾されて、修飾変異ＢＢＰＩ骨格を提供する。１つの態様において、３つのアミノ酸置換を含むように修飾変異ＢＢＰＩはＳＥＱＩＤＮＯ：６０３の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ｓ２５Ｌ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６０７の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ｌ２９Ｐ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、及びＳＥＱＩＤＮＯ：６０９の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａから選択される。

幾つかの態様において、対応する未修飾前駆体ＢＰＩよりも高いＴＩＡを有する修飾変異ＢＢＰＩはＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１３、２９、５０、及び５２位に等しい位置において４つのアミノ酸の組み合わせを含む。幾つかの態様において、４つのアミノ酸置換の組み合わせは１３−２５−５０−５２、１３−２９−５０−５２、２５−２９−５０−５２、１３−４０−５０−５２、２５−４０−５０−５２、及び２９−４０−５０−５２の位置の組み合わせから選択される。幾つかの態様において、４つのアミノ酸置換の組み合わせは１３Ｉ−２５Ｌ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、２５Ｌ−２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、２５Ｌ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、及び２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａから選択される。本発明はセクション５．３に記載され、セクション５．４に記載の３Ｉ−２５Ｌ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、２５Ｌ−２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、２５Ｌ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、及び２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａから選択される４つのアミノ酸置換の組み合わせを更に含む、変異ＢＢＰＩ骨格のいずれか１つを提供する。１つの態様において、変異骨格のキモトリプシンループはＳＥＱＩＤＮＯ：９及び４６０から選択されるＶＥＧＦ変異ペプチドであり、変異骨格はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１３、２９、５０、及び５２位に等しい位置における４つのアミノ酸置換の組み合わせを含んで、修飾変異ＢＢＰＩ骨格を提供する。１つの態様において、４つのアミノ酸置換の組み合わせを含む修飾変異ＢＢＰＩはＳＥＱＩＤＮＯ：５９６の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｌ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６００の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６０２の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６０４の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ｓ２５Ｌ−Ｌ２９Ｐ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６０６の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ｓ２５Ｌ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、及びＳＥＱＩＤＮＯ：６４３の修飾変異ＢＢＩｔ−ＶＥＧＫＤ−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｋ−Ｌ２９Ｐ−Ｖ５２Ｋから選択される。他の態様において、変異骨格のキモトリプシンループはＳＥＱＤＩＮＯＳ：４３３及び４３４のＦＧＦ５変異ペプチドから選択され、変異骨格はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１３、２９、５０、及び５２位に等しい位置におけるアミノ酸置換の組み合わせを含むように修飾され、修飾変異ＢＢＰＩ骨格を生成する。１つの態様において、この修飾変異ＢＢＰＩはＳＥＱＩＤＮＯ：４３２の修飾変異ＢＢＩｔ−ＭＭ００７−Ｑ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、及びＳＥＱＩＤＮＯ：４３４の修飾変異ＢＢＩｔ−ＦＧＦｐｓ２−Ｑ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａから選択される。他の態様において、変異骨格のキモトリプシンループはＳＥＱＩＤＮＯＳ：４３６、４３７、及び４３８のＴＧＥβ変異ペプチドから選択され、変異骨格はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１３、２９、５０、及び５２位に等しい位置における４つのアミノ酸置換の組み合わせを含むように修飾され、修飾変異骨格を生成する。１つの態様において、４つのアミノ酸置換の組み合わせを含む修飾変異ＢＢＰＩはＳＥＱＩＤＮＯ：４４３の修飾変異ＢＢＩｔ−ＰＥＮ３−Ｑ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４５の修飾変異ＢＢＩｔ−ＭＭ０２１Ｗ−Ｑ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、及びＳＥＱＩＤＮＯ：４４７の修飾変異ＢＢＩｔ−ＷＴＱ−Ｑ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａから選択される。

幾つかの態様において、対応する前駆体未修飾ＢＢＰＩよりも高いＴＩＡを有する修飾変異ＢＢＰＩはＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１３、２９、４０、５０、及び５２位に等しい位置において５つのアミノ酸置換の組み合わせをそれぞれ含む。幾つかの態様において、５つのアミノ酸置換の組み合わせは１３−２５−２９−５０−５２、１３−２９−４０−５０−５２、１３−２５−４０−５０−５２、２５−２９−４０−５０−５２、１３−２９−４０−５０−５２、１３−２９−４０−５０−５２、１３−２９−４０−５０−５２、及び１３−２９−４０−５０−５２の位置の組み合わせから選択される。幾つかの態様において、５つのアミノ酸置換の組み合わせは１３Ｉ−２５Ｌ−２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｌ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、２５Ｌ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｌ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｋ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｋ−５２Ａ、及び１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ｔから選択される。本発明はセクション５．３に記載され、セクション５．４に記載の１３Ｉ−２５Ｌ−２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｌ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、２５Ｌ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｌ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｋ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｋ−５２Ａ、及び１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ｔから選択される５つのアミノ酸置換の組み合わせを更に含む変異体ＢＢＰＩのいずれか１つを提供する。１つの態様において、変異骨格のキモトリプシンループはＳＥＱＩＤＮＯ：９のＶＥＧＦ変異ペプチドであり、変異骨格はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１３、２９、４０、５０、及び５２位に等しい位置において５つのアミノ酸置換の組み合わせを含むように修飾されて、修飾変異ＢＢＰＩ骨格を生成する。他の態様において、５つのアミノ酸置換の組み合わせを含む修飾変異ＢＢＰＩはＳＥＱＩＤＮＯ：５９７の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｌ−Ｌ２９Ｐ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：５９９の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６０１の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｌ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６０５の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ｓ２５Ｌ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６１５の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｌ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２０の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｋ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２４の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｋ−Ｖ５２Ａ、及びＳＥＱＩＤＮＯ：６２５の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ｔから選択される。

幾つかの態様において、対応する修飾前駆体ＢＢＰＩよりも高いＴＩＡを有する修飾変異ＢＢＰＩはそれぞれＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１３、２５、２９、４０、５０、及び５２位に等しい位置における６つのアミノ酸置換の組み合わせを含む。幾つかの態様において、６つのアミノ酸置換の組み合わせは１３−２５−２９−４０−５０−５２、１−１３−２９−４０−５０−５２、４−１３−２９−４０−５０−５２、５−１３−２９−４０−５０−５２、１１−１３−２９−４０−５０−５２、１３−２５−２９−４０−５０−５２、１３−２７−２９−４０−５０−５２、１３−２９−３１−４０−５０−５２、１３−２９−３１−４０−５０−５２、１３−２９−３８−４０−５０−５２、及び１３−２９−３８−４０−５０−５２の位置の組み合わせから選択される。幾つかの態様において、６つのアミノ酸置換の組み合わせは１３Ｉ−２５Ｌ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１Ｃ−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、４Ｖ−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、５Ｐ−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１１Ｇ−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｒ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２７Ｒ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−３１Ａ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−３１Ｒ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−３８Ｎ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、及び１３Ｉ−２９Ｐ−３８Ｎ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａから選択される。本発明はセクション５．３に記載され、セクション５．４に記載のような１３Ｉ−２５Ｌ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１Ｃ−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、４Ｖ−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、５Ｐ−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１１Ｇ−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｒ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２７Ｒ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−３１Ａ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−３１Ｒ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−３８Ｎ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、及び１３Ｉ−２９Ｐ−３８Ｎ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａから選択される６つのアミノ酸置換の組み合わせ更に含む変異ＢＢＰＩ骨格のいずれか１つを提供する。幾つかの態様において、変異骨格のキモトリプシンループはＳＥＱＩＤＮＯ：９のＶＥＧＦ変異ペプチドであり、変異骨格はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１３、２５、２９、４０、５０、及び５２位に等しい位置における６つのアミノ酸置換の組み合わせを含むように修飾され、修飾変異ＢＢＰＩ骨格を生成する。１つの態様において、６つのアミノ酸置換の組み合わせを含む修飾変異ＢＢＰＩはＳＥＱＩＤＮＯ：５９８の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｌ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６１１，の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ｄ１Ｃ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６１２の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ｓ４Ｖ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６１３の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ｓ５Ｐ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６１４の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ｑ１１Ｇ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６１６の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｒ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６１９の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｍ２７Ｒ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２１の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ａ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２２の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ｒ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２３の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３８Ｎ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、及びＳＥＱＩＤＮＯ：６２６の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３８Ｎ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａから選択される。

幾つかの態様において、対応する修飾前駆体ＢＢＰＩよりも高いＴＩＡを有する修飾変異ＢＢＰＩはそれぞれ３、２５、２９、３１、４０、５０、及び５２位に等しい位置における７つのアミノ酸置換の組み合わせを含む。幾つかの態様において、７つのアミノ酸置換の組み合わせは１３−２５−２９−３１−４０−５０−５２、１３−２５−２９−３１−４０−５０−５２、１３−２５−２７−２９−３１−５０−５２、１３−２５−２７−２９−３１−５０−５２、１３−２５−２７−２９−３１−５０−５２、１３−２５−２７−２９−３１−５０−５２、１３−２５−２７−２９−３１−５０−５２、１３−２５−２７−２９−３１−５０−５２、１３−２５−２７−２９−３１−５０−５２、１３−２５−２７−２９−３１−５０−５２、及び１３−２５−２７−２９−３１−５０−５２の位置の組み合わせから選択される。幾つかの態様において、７つのアミノ酸置換の組み合わせは１３Ｌ−２５Ｒ−２９Ｐ−３１Ａ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｌ−２５Ｒ−２９Ｐ−３１Ｒ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、及び１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔから選択される。本発明はセクション５．３に記載され、セクション５．４に記載のような１３Ｌ−２５Ｒ−２９Ｐ−３１Ａ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｌ−２５Ｒ−２９Ｐ−３１Ｒ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、及び１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔから選択される７つのアミノ酸置換の組み合わせ更に含む変異ＢＢＰＩ骨格のいずれか１つを提供する。幾つかの態様において、変異骨格のキモトリプシンループはＳＥＱＩＤＮＯ：９のＶＥＧＦ変異ペプチドであり、変異骨格はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１３、２５、２９、３１、４０、５０、及び５２位に等しい位置における６つのアミノ酸置換の組み合わせを含むように修飾され、修飾変異ＢＢＰＩ骨格を生成する。１つの態様において、７つのアミノ酸置換の組み合わせを含む修飾変異ＢＢＰＩは、ＳＥＱＩＤＮＯ：６１７の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｒ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ａ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６１８の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｒ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ｒ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：４９１の修飾変異ＢＢＩｔ−ＶＥＧＦ−Ｖ１−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｒ−Ｍ２７Ａ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ａ−Ｆ５０Ｋ−Ｖ５２、ＳＥＱＩＤＮＯ：６３２の修飾変異ＢＢＩｔ−ＶＥＧＦ−Ｖ２−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｒ−Ｍ２７Ａ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ａ−Ｆ５０Ｋ−Ｖ５２Ｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６３３の修飾変異ＢＢＩｔ−ＶＥＧＦ−Ｖ３− Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｒ−Ｍ２７Ａ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ａ−Ｆ５０Ｋ−Ｖ５２Ｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６３４の修飾変異ＢＢＩｔ−ＶＥＧＦ−Ｖ４−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｒ−Ｍ２７Ａ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ａ−Ｆ５０Ｋ−Ｖ５２Ｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６３５の修飾変異ＢＢＩｔ−ＶＥＧＦ−Ｖ５−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｒ−Ｍ２７Ａ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ａ−Ｆ５０Ｋ−Ｖ５２Ｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６３６の修飾変異ＢＢＩｔ−ＶＥＧＦ−Ｖ６−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｒ−Ｍ２７Ａ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ａ−Ｆ５０Ｋ−Ｖ５２Ｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６３７の修飾変異ＢＢＩｔ−ＴＮＦａ−Ｔ１−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｒ−Ｍ２７Ａ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ａ−Ｆ５０Ｋ−Ｖ５２Ｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６３８の修飾変異ＢＢＩｔ−ＴＮＦα−Ｔ２−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｒ−Ｍ２７Ａ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ａ−Ｆ５０Ｋ−Ｖ５２Ｔ、及びＳＥＱＩＤＮＯ：６３９の修飾変異ＢＢＩｔ−ＴＮＦα−Ｔ３−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｒ−Ｍ２７Ａ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ａ−Ｆ５０Ｋ−Ｖ５２Ｔから選択される。

幾つかの態様において、対応する前駆体未修飾ＢＢＰＩよりも態様において、ＴＩＡを有する修飾へＢＢＰＩは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１３、２５、２７、２９、３１、４０、５０、及び５２位に等しい位置における８つのアミノ酸置換の組み合わせをそれぞれ含む。幾つかの態様において、８つのアミノ酸置換の組み合わせは１３−２５−２７−２９−３１−４０−５０−５２、１３−２５−２７−２９−３１−４０−５０−５２、１３−２５−２７−２９−３１−４０−５０−５２、１３−２５−２７−２９−３１−４０−５０−５２、及び１３−２５−２７−２９−３１−４０−５０−５２位の位置の組み合わせから選択される。幾つかの態様において、８つのアミノ酸置換の組み合わせは１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ａ−２９Ｒ−３１Ｅ−４０Ｋ−５０Ｑ−５２Ｑ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ｒ−２９Ｅ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｒ−５２Ｋ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ａ−２９Ｒ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｒ−５２Ｌ、及び１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ｑ−２９Ｐ−３１Ｅ−４０Ｈ−５０Ｒ−５２Ｑの組み合わせから選択される。本発明はセクション５．３に記載され、セクション５．４に記載のような１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ａ−２９Ｒ−３１Ｅ−４０Ｋ−５０Ｑ−５２Ｑ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ｒ−２９Ｅ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｒ−５２Ｋ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ａ−２９Ｒ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｒ−５２Ｌ、及び１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ｑ−２９Ｐ−３１Ｅ−４０Ｈ−５０Ｒ−５２Ｑの組み合わせから選択される８つのアミノ酸置換の組み合わせを更に含む変異体ＢＢＰＩ骨格のいずれか１つを提供する。１つの態様において、変異骨格のキモトリプシンループはＳＥＱＩＤＮＯ：９のＶＥＧＦ変異ペプチドであり、変異骨格はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１３、２５、２７、２９、３１、４０、５０、及び５２位に等しい位置のおける８つのアミノ酸置換の組み合わせを含むように修飾され、修飾変異ＢＢＰＩ骨格を生成する。１つの態様において、８つのアミノ酸置換の組み合わせを含む修飾変異ＢＢＰＩはＳＥＱＩＤＮＯ：６２７の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｒ−Ｍ２７Ａ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ａ−Ａ４０Ｈ−Ｆ５０Ｋ−Ｖ５２Ｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２８の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｋ−Ｍ２７Ａ−Ｌ２９Ｒ−Ｓ３１Ｅ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｑ−Ｖ５２Ｑ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２９の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｋ−Ｍ２７Ｒ−Ｌ２９Ｅ−Ｓ３１Ａ−Ａ４０Ｈ−Ｆ５０Ｒ−Ｖ５２Ｋ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６３０の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｋ−Ｍ２７Ａ−Ｌ２９Ｒ−Ｓ３１Ａ−Ａ４０Ｈ−Ｆ５０Ｒ−Ｖ５２Ｌ、及びＳＥＱＩＤＮＯ：６３１の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ− Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｋ−Ｍ２７Ｑ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ｅ−Ａ４０Ｈ−Ｆ５０Ｒ−Ｖ５２Ｑから選択される。

幾つかの態様において、対応する未修飾前駆体ＢＢＰＩよりも大きなＴＩＡを有する修飾変異ＢＢＰＩは修飾ＢＢＰＩのＮ末端においてペプチド挿入をさらに含む。幾つかの態様において、このペプチド挿入は１乃至１５アミノ酸の間の配列を含む。他の態様において、このペプチド挿入は５乃至１０の間の配列を含む。幾つかの態様において、このペプチド挿入はＳＥＱＩＤＮＯ：３８９（ＤＤＥＰＳＫＰＣＣＤＰＤＰ；ＳＥＱＩＤＮＯ：３８９）のペプチドを含む。ＳＥＱＩＤＮＯ：３８９のペプチド挿入を有する修飾変異ＢＢＰＩの例としては、ＳＥＱＩＤＮＯ：３９０（ＤＤＥＰＳＫＰＣＣＤＰＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＡＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＳＤＭＲＬＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＡＣＹＮＬＹＧＷＴＣＦＣＶＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：３９０）の修飾変異４Ｄ１３ＢＢＩｔ−ＡＶ及びＳＥＱＩＤＮＯ：４１３の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−４Ｄ１３−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａを含む。

トリプシン及び／又はキモトリプシン抑制活性の向上の測定は酵素活性比、即ち、未修飾変異体ＢＢＰＩと比較したし変異ＢＢＰＩにおけるＢＣＥ：ＢＢＰＩ、における増加分として決定することができる。ＢＣＥ：ＢＢＰＩ酵素活性比は、ＢＣＥ、即ち、セルラーゼ酵素活性、に対するＢＢＰＩプロテアーゼ抑制活性、例えば、トリプシン抑制活性の比である。未修飾変異ＢＢＰＩの比は、修飾変異ＢＢＰＩが未修飾変異体ＢＢＰＩよりも高いプロテアーゼ抑制活性、例えば、トリプシン抑制活性を有することを示す、修飾変異ＢＢＰＩに対して１以上の比の値が割り当てられる。幾つかの態様において、修飾変異ＢＢＰＩの活性比は少なくとも１、少なくとも約１．０５、少なくとも約１．１、少なくとも約１．０５、少なくとも約１．１、少なくとも約１．２、少なくとも約１．３、少なくとも約１．４、少なくとも約１．５、少なくとも約１．６、少なくとも約１．７、少なくとも約１．８、少なくとも約１．９、及び少なくとも約２である。他の態様において、この活性比は少なくとも約２．１、少なくとも約２．２、少なくとも約２．３、少なくとも約２．４、少なくとも約２．５、少なくとも約２．６、少なくとも約２．７、少なくとも約２．８、少なくとも約２．９、及び少なくとも約３である、更なる態様において、この活性比は少なくとも約３．５、少なくとも約４．０、及び少なくとも約５である。従って、幾つかの態様において、プロテアーゼ抑制活性、例えば、修飾変異ＢＢＰＩのプロテアーゼ抑制活性は、対応する未修飾前駆ＢＢＰＩよりも、少なくとも約０．５％、約１．０％、約１．５％、約２．０％、約２．５％、約３．０％、約４．０％、約５．０％、約８．０％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％以上高い。他の態様において、プロテアーゼ抑制活性、例えば、修飾変異ＢＢＰＩのプロテアーゼ抑制活性は、対応する未修飾前駆体ＢＢＰＩよりも少なくとも約１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％から少なくとも約２００％まで、高い。

他の態様において、アミノ酸置換の組み合わせを含む変異ＢＢＰＩは未修飾前駆ＢＢＰＩよりも高いトリプシン抑制活性を有する。幾つかの態様において、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、及び少なくとも８つの置換が未修飾前駆ＢＢＰＩよりも高いＴＩＡを有する修飾変異ＢＢＰＩを生成する。セクション５．４で説明するアミノ酸置換の組み合わせを含む全ての修飾変異ＢＢＰＩは対応する未修飾前駆体ＢＢＰＩよりも高いトリプシン抑制活性を有する。
５．８．２ＢＢＰＩ生産性

幾つかの態様において、前駆体変異ＢＢＰＩにおいてなされたアミノ酸トリプシンは得られた修飾変異ＢＢＰＩに未修飾前駆体ＢＢＰＩが生産するよりも高い生産性を有するような能力を付与する。即ち、修飾変異ＢＢＰＩは未修飾前駆体ＢＢＰＩが生産されるよりも高いレベルで生産される。幾つかの態様において、本発明は対応する未修飾前駆体ＢＢＰＩよりも高いプロテアーゼ抑制活性、例えば、トリプシン抑制活性及び高い生産性を有するセクション５．４に記載のようなアミノ酸置換の組み合わせを含む修飾変異ＢＢＰＩを提供する。

対応する未修飾ＢＢＰＩよりも高いＴＩＡ及びＰＹを有する修飾変異ＢＢＰＩは即ち、２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、少なくとも６つの、少なくとも７つの、及び少なくとも８つのアミノ酸置換を含む（実施例１２、１３、１４、及び１５参照）。

幾つかの態様において、対応する修飾変異ＢＢＰＩよりも高いＴＩＡ及びＰＹを有する修飾変異ＢＢＰＩはＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の５０及び５２位に等しい位置のおいて２つのアミノ酸置換の組み合わせをそれぞれ含む。幾つかの態様において、２つのアミノ酸置換の組み合わせは５０Ｔ−５２Ａである。本発明はセクション５．３に記載され、選択される５．４に記載のような５０Ｔ−５２Ａの２つのアミノ酸置換の組み合わせを更に含む変異体ＢＢＰＩを提供する。１つの態様において、変異骨格のキモトリプシンループはＶＥＧＦ変異ペプチド、例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：９であり、変異骨格はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の３、５０、及び５２位に等しい位置における３つのアミノ酸置換の組み合わせを更に含むように修飾され、修飾変異ＢＢＰＩを生成する。１つの態様において、２つのアミノ酸置換の組み合わせを含む修飾変異ＢＢＰＩはＳＥＱＩＤＮＯ：６５９５の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａである。

幾つかの態様において、対応する未修飾前駆体ＢＢＰＩよりも高いＴＩＡ及びＰＹを有する修飾変異ＢＢＰＩはＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１３、５０、及び５２位に等しい位置において３つのアミノ酸置換の組み合わせを含む。幾つかの態様において、３つのアミノ酸置換の組み合わせは２５−５０−５２、２９−５０−５２、４０−５０−５２、１３−５０−５２の位置の組み合わせから選択される。幾つかの態様において、３つのアミノ酸置換の組み合わせは２５Ｌ−５０Ｔ−５２Ａ、２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、及び１３Ｉ−５０Ｔ−５２Ａから選択される。本発明はセクション５．３に記載され、セクション５．４に記載のような２５Ｌ−５０Ｔ−５２Ａ、２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、及び１３Ｉ−５０Ｔ−５２Ａから選択される３つのアミノ酸置換の組み合わせを更に含む変異ＢＢＰＩのいずれか１つを提供する。１つの態様において、変異骨格のキモトリプシンループはＳＥＱＩＤＮＯ：９のＶＥＧＦ変異ペプチドであり、変異骨格はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１３、５０、及び５２に等しい位置における３つのアミノ酸置換の組み合わせを更に含むように修飾され、修飾変異ＢＢＰＩ骨格を生成する。１つの態様において、アミノ酸置換の組み合わせを含む修飾変異ＢＢＰＩはＳＥＱＩＤＮＯ：６０３の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ｓ２５Ｌ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６０７の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ｌ２９Ｐ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６０９の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａから選択される。

幾つかの態様において、対応する前駆未修飾ＢＢＰＩよりも高いＴＡＩ及びＰＹを有する修飾変異ＢＢＰＩはＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１３、２９、５０、及び５２位に等しい位置において４つのアミノ酸置換の組み合わせをそれぞれ含む。幾つかの態様において、４つのアミノ酸置換の組み組み合わせは１３−２５−５０−５２、１３−２９−５０−５２、２５−２９−５０−５２、１３−４０−５０−５２、２５−４０−５０−５２、及び２９−４０−５０−５２の位置の組み合わせから選択される。幾つかの態様において、４つのアミノ酸置換の組み合わせは１３Ｉ−２５Ｌ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、２５Ｌ−２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、２５Ｌ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、及び２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａから選択される。本発明はセクション５．３に記載され、セクション５．４に記載のような１３Ｉ−２５Ｌ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、２５Ｌ−２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、２５Ｌ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、及び２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａから選択される４つのアミノ酸置換の組み合わせを更に含む、変異ＢＢＰＩのいずれか１つを提供する。１つの態様において、変異骨格のキモトリプシンループはＳＥＱＩＤＮＯ：９及び４６０から選択されるＶＥＧＦ変異ペプチドであり、変異骨格をＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１３、２９、５０、及び５２位に等しい位置における４つのアミノ酸置換の組み合わせを含むように修飾して、修飾変異ＢＢＰＩを提供する。１つの態様において、４つのアミノ酸置換の組み合わせを含む修飾変異ＢＢＰＩはＳＥＱＩＤＮＯ：５９６の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｌ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６００の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６０２の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６０４，の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ｓ２５Ｌ−Ｌ２９Ｐ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６０６の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ｓ２５Ｌ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６０８の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、及びＳＥＱＩＤＮＯ：６４３の修飾変異ＢＢＩｔ−ＶＥＧＫＤ−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｋ−Ｌ２９Ｐ−Ｖ５２Ｋから選択される。他の態様において、変異骨格のキモトリプシンループはＳＥＱＤＩＮＯＳ：４３０及び４３１から選択されるＦＧＦ５結合ペプチドであり、修変異骨格は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１３、２９、５０、及び５２位に等しい位置における４つのアミノ酸置換を含むように修飾され、修飾変異ＢＢＰＩ骨格を生成する。１つの態様において、４つのアミノ酸置換の組み合わせを含む修飾変異ＢＢＰＩはＳＥＱＩＤＮＯ：４３２の修飾変異ＢＢＩｔ−ＭＭ００７−Ｑ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ及びＳＥＱＩＤＮＯ：４３４の修飾変異ＢＢＩｔ−ＦＧＦｐｓ２−Ｑ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａから選択される。他の態様において、変異骨格のキモトリプシンループはＳＥＱＩＤＮＯＳ：４３６、４３７、及び４３８から選択されるＴＧＦβ変異ペプチドであり、変異骨格はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１３、２９、５０、及び５２位に等しい位置において４つのアミノ酸置換の組み合わせを含むように修飾され、修飾変異ＢＢＰＩ骨格を生成する。１つの態様において、４つのアミノ酸置換の組み合わせを含む修飾ＢＢＰＩはＳＥＱＩＤＮＯ：４４３の修飾変異ＢＢＩｔ−ＰＥＮ３−Ｑ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４５の修飾変異ＢＢＩｔ−ＭＭ０２１Ｗ−Ｑ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４７の修飾変異ＢＢＩｔ−ＷＴＱ−Ｑ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａから選択される。

幾つかの態様において、対応する未修飾前駆体ＢＢＰＩよりも高いＴＩＡ及びＰＹを有する修飾変異ＢＢＰＩはＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１３、２９、４０、５０、及び５２位に等しい位置において５つのアミノ酸置換の組み合わせをそれぞれ含む。幾つかの態様において、５つのアミノ酸置換の組み合わせは１３−２５−２９−５０−５２、１３−２９−４０−５０−５２、１３−２５−４０−５０−５２、２５−２９−４０−５０−５２、１３−２９−４０−５０−５２、１３−２９−４０−５０−５２、１３−２９−４０−５０−５２、及び１３−２９−４０−５０−５２の位置の組み合わせから選択される。幾つかの態様において、５つのアミノ酸置換の組み合わせは１３Ｉ−２５Ｌ−２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｌ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、２５Ｌ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｌ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｋ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｋ−５２Ａ、及び１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ｔから選択される。本発明はセクション５．３に記載され、セクション５．４に記載のような１３Ｉ−２５Ｌ−２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｌ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、２５Ｌ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｌ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｋ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｋ−５２Ａ、及び１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ｔから選択される５つのアミノ酸置換の組み合わせを更に含む、変異ＢＢＰＩのいずれか１つを提供する。１つの態様において、変異骨格のキモトリプシンループはＳＥＱＩＤＮＯ：９から選択されるＶＥＧＦ変異ペプチドであり、変異骨格をＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の３、２９、４０、５０、及び５２位に等しい位置における５つのアミノ酸置換の組み合わせを含むように修飾して、修飾変異ＢＢＰＩを提供する。１つの態様において、５つのアミノ酸置換の組み合わせを含む修飾変異ＢＢＰＩはＳＥＱＩＤＮＯ：５９７の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｌ−Ｌ２９Ｐ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：５９９の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６０１の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｌ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６０５の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ｓ２５Ｌ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６１５の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｌ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２０の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｋ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２４の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｋ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２５の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ｔから選択される。

幾つかの態様において、対応する前駆体未修飾ＢＢＰＩよりも高いＴＩＡ及びＰＹを有する修飾変異ＢＢＰＩは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の３、２５、２９、４０、５０、及び５２位に等しい位置において６つのアミノ酸置換の組み合わせをそれぞれ含む。幾つかの態様において、６つのアミノ酸置換の組み合わせは１３−２５−２９−４０−５０−５２、１−１３−２９−４０−５０−５２、４−１３−２９−４０−５０−５２、５−１３−２９−４０−５０−５２、１１−１３−２９−４０−５０−５２、１３−２５−２９−４０−５０−５２、１３−２７−２９−４０−５０−５２、１３−２９−３１−４０−５０−５２、１３−２９−３１−４０−５０−５２、１３−２９−３８−４０−５０−５２、及び１３−２９−３８−４０−５０−５２の位置の組み合わせから選択される。幾つかの態様において、６つのアミノ酸置換の組み合わせは１３Ｉ−２５Ｌ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１Ｃ−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、４Ｖ−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、５Ｐ−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１１Ｇ−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｒ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２７Ｒ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−３１Ａ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−３１Ｒ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−３８Ｎ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、及び１３Ｉ−２９Ｐ−３８Ｎ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａから選択される。本発明はセクション５．３に記載され、セクション５．４に記載のような１３Ｉ−２５Ｌ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１Ｃ−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、４Ｖ−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、５Ｐ−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１１Ｇ−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｒ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２７Ｒ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−３１Ａ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−３１Ｒ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−３８Ｎ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、及び１３Ｉ−２９Ｐ−３８Ｎ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａから選択される６つのアミノ酸置換の組み合わせを更に含む変異ＢＢＰＩを提供する。１つの態様において、変異ののキモトリプシンループはＳＥＱＩＤＮＯ：９のＶＥＧＦ変異ペプチドであり、変異骨格はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１３、２５、２９、４０、５０、及び５２に等しい位置における６つのアミノ酸置換を更に含むように修飾され、修飾変異ＢＢＰＩを生成する。１つの態様において、６つのアミノ酸置換の組み合わせを含む修飾変異ＢＢＰＩはＳＥＱＩＤＮＯ：５９８の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｌ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６１１の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ｄ１Ｃ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６１２の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ｓ４Ｖ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６１３の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ｓ５Ｐ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６１４の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ｑ１１Ｇ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６１６の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｒ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６１９の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｍ２７Ｒ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２１の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ａ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２２の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ｒ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２３の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３８Ｎ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、及びＳＥＱＩＤＮＯ：６２６の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３８Ｎ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａから選択される。

幾つかの態様において、対応する未修飾前駆体ＢＢＰＩよりも高いＴＩＡ及びＰＹを有する、修飾変異ＢＢＰＩはＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の３、２５、２９、３１、４０、５０、及び５２位に等しい位置において７つのアミノ酸置換の組み合わせをそれぞれ含む。幾つかの態様において、７つのアミノ酸置換の組み合わせは１３−２５−２９−３１−４０−５０−５２、１３−２５−２９−３１−４０−５０−５２、１３−２５−２７−２９−３１−５０−５２、１３−２５−２７−２９−３１−５０−５２、１３−２５−２７−２９−３１−５０−５２、１３−２５−２７−２９−３１−５０−５２、１３−２５−２７−２９−３１−５０−５２、１３−２５−２７−２９−３１−５０−５２、１３−２５−２７−２９−３１−５０−５２、１３−２５−２７−２９−３１−５０−５２、及び１３−２５−２７−２９−３１−５０−５２から選択される。幾つかの態様において、７つのアミノ酸置換の組み合わせは１３Ｌ−２５Ｒ−２９Ｐ−３１Ａ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｌ−２５Ｒ−２９Ｐ−３１Ｒ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、及び１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔから選択される。本発明はセクション５．３に記載され、セクション５．４で説明するように、１３Ｌ−２５Ｒ−２９Ｐ−３１Ａ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｌ−２５Ｒ−２９Ｐ−３１Ｒ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、及び１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔからセクション７つのアミノ酸置換の組み合わせを更に含む変異ＢＢＰＩを提供する。１つの態様において、変異骨格のキモトリプシンループはＳＥＱＩＤＮＯ：９のＶＥＧＦ変異ペプチドであり、変異骨格はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１３、２５、２９、３１、４０、５０、及び５２位に等しい位置における７つのアミノ酸置換の組み合わせを含むように修飾され、修飾変異ＢＢＰＩ骨格を生成する。１つの態様において、７つのアミノ酸リパーゼの組み合わせを含む修飾変異ＢＢＰＩはＳＥＱＩＤＮＯ：６１７の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｒ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ａ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６１８の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｒ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ｒ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ、ＳＥＱＩＤＮＯ：４９１のＢＢＩｔ−ＶＥＧＦ−Ｖ１−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｒ−Ｍ２７Ａ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ａ−Ｆ５０Ｋ−Ｖ５２Ｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６３２の変異ＢＢＩｔ−ＶＥＧＦ−Ｖ２−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｒ−Ｍ２７Ａ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ａ−Ｆ５０Ｋ−Ｖ５２Ｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６３３の修飾変異ＢＢＩｔ−ＶＥＧＦ−Ｖ３−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｒ−Ｍ２７Ａ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ａ−Ｆ５０Ｋ−Ｖ５２Ｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６３４の修飾変異ＢＢＩｔ−ＶＥＧＦ−Ｖ４−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｒ−Ｍ２７Ａ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ａ−Ｆ５０Ｋ−Ｖ５２Ｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６３５の修飾変異ＢＢＩｔ−ＶＥＧＦ−Ｖ５−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｒ−Ｍ２７Ａ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ａ−Ｆ５０Ｋ−Ｖ５２Ｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６３６の修飾変異ＢＢＩｔ−ＶＥＧＦ−Ｖ６−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｒ−Ｍ２７Ａ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ａ−Ｆ５０Ｋ−Ｖ５２Ｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６３７の修飾変異ＢＢＩｔ−ＴＮＦ−Ｔ１−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｒ−Ｍ２７Ａ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ａ−Ｆ５０Ｋ−Ｖ５２Ｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６３８の修飾変異ＢＢＩｔ―ＴＮＦ−Ｔ２−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｒ−Ｍ２７Ａ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ａ−Ｆ５０Ｋ−Ｖ５２Ｔ、及びＳＥＱＩＤＮＯ：６３９の修飾変異ＢＢＩｔ−ＴＮＦ−Ｔ３−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｒ−Ｍ２７Ａ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ａ−Ｆ５０Ｋ−Ｖ５２Ｔから選択される。

幾つかの態様において、対応する修飾変異ＢＢＰＩよりも高いＴＩＡ及びＰＹを有数する修飾変異ＢＢＰＩは、それぞれＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１３、２５、２７、２９、３１、４０、５０、及び５２に等しい位置において８つのアミノ酸置換の組み合わせを含む。幾つかの態様において、８つのアミノ酸置換の組み合わせは１３−２５−２７−２９−３１−４０−５０−５２、１３−２５−２７−２９−３１−４０−５０−５２、１３−２５−２７−２９−３１−４０−５０−５２、１３−２５−２７−２９−３１−４０−５０−５２、及び１３−２５−２７−２９−３１−４０−５０−５２から選択される。幾つかの態様において、８つのアミノ酸置換の組み合わせは１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ａ−２９Ｒ−３１Ｅ−４０Ｋ−５０Ｑ−５２Ｑ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ｒ−２９Ｅ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｒ−５２Ｋ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ａ−２９Ｒ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｒ−５２Ｌ、及び１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ｑ−２９Ｐ−３１Ｅ−４０Ｈ−５０Ｒ−５２Ｑから選択される。本発明はセクション５．３に記載され、セクション５．４に記載のように１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ａ−２９Ｒ−３１Ｅ−４０Ｋ−５０Ｑ−５２Ｑ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ｒ−２９Ｅ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｒ−５２Ｋ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ａ−２９Ｒ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｒ−５２Ｌ、及び１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ｑ−２９Ｐ−３１Ｅ−４０Ｈ−５０Ｒ−５２Ｑから選択される８つのアミノ酸置換の組み合わせを更に含む変異ＢＢＰＩのいずれか１つを提供する。１つの態様において、変異骨格のキモトリプシンループはＳＥＱＩＤＮＯ：９のＶＥＧＦへペプチドであり、変異骨格をＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１３、２５、２７、２９、３１、４０、５０、及び５２位に等しい位置における８つのアミノ酸置換の組み合わせを更に含むように修飾して、修飾変異ＢＢＰＩを生成する。１つの態様において、８つのアミノ酸置換の組み合わせを含む修飾変異ＢＢＰＩはＳＥＱＩＤＮＯ：６２７の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｒ−Ｍ２７Ａ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ａ−Ａ４０Ｈ−Ｆ５０Ｋ−Ｖ５２Ｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２８の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｋ−Ｍ２７Ａ−Ｌ２９Ｒ−Ｓ３１Ｅ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｑ−Ｖ５２Ｑ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２９の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｋ−Ｍ２７Ｒ−Ｌ２９Ｅ−Ｓ３１Ａ−Ａ４０Ｈ−Ｆ５０Ｒ−Ｖ５２Ｋ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６３０の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｋ−Ｍ２７Ａ−Ｌ２９Ｒ−Ｓ３１Ａ−Ａ４０Ｈ−Ｆ５０Ｒ−Ｖ５２Ｌ、及びＳＥＱＩＤＮＯ：６３１の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｋ−Ｍ２７Ｑ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ｅ−Ａ４０Ｈ−Ｆ５０Ｒ−Ｖ５２Ｑから選択される。

１つの態様において、修飾変異ＢＢＰＩは修飾変異ＢＢＰＩのＮ末端においてペプチド挿入を更に含む。幾つかの態様において、このペプチド挿入は１乃至５アミノ酸の間の配列である。他の態様において、このペプチド挿入は５乃至１０アミノ酸の長さである。幾つかの態様において、ペプチド挿入はＳＥＱＩＤＮＯ：３８９のペプチドを含む。ＳＥＱＩＤＮＯ：３８９のペプチド挿入を含む修飾変異ＢＢＰＩの例としては、ＳＥＱＩＤＮＯ：３９０の修飾変異４Ｄ１３ＢＢＩｔ−ＡＶ及びＳＥＱＩＤＮＯ：４１３．の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−４Ｄ１３−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａがある。

本発明は対応する修飾前駆ＢＢＰＩよりも高いＴＩＡ及びＰＹを有する修飾変異ＢＢＰＩを更に提供する。この修飾変異ＢＢＰＩのそれぞれは前述のアミノ酸置換の組み合わせの任意の１つを含み、未修飾前駆変異ＢＢＰＩよりも高いプロテアーゼ抑制活性を有する。幾つかの態様において、対応する未修飾前駆体ＢＢＰＩにキモトリプシンループのかわりに変異ペプチドを含む修飾変異ＢＢＰＩは未修飾前駆体ＢＢＰＩよりも高いキモトリプシン抑制活性（ＴＩＡ）を有する。他の態様において、対応する未修飾前駆体ＢＢＰＩのトリプシンループの代わりに変異ペプチドを含む修飾変異ＢＢＰＩ骨格は飾前駆体ＢＢＰＩよりも高いキモトリプシン抑制活性を有する。

実施例に示すように、変異ＢＢＰＩの主鎖における少なくとも１つのアミノ酸の置換は未修飾変異体ＢＢＰＩよりも高い生産性を有する修飾変異ＢＢＰＩを生成する。幾つかの態様において、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、又は８つのアミノ酸置換の組み合わせを含むＢＢＰＩは未修飾前駆体ＢＢＰＩよりも高い生産性を有する。従って、本発明は前述のアミノ酸置換の組み合わせの任意の１つを含み、未修飾前駆体変異ＢＢＰＩよりも高い生産性（ＰＹ）を有する、修飾変異ＢＢＰＩを提供する。更なる態様において、本発明は前述のアミノ酸置換の組み合わせの任意の１つを含み、未修飾前駆変異ＢＢＰＩよりも高いＴＩＡ及びＰＹ及び生産性を有する、修飾変異ＢＢＰＩを提供する。

幾つかの態様において、未修飾前駆体ＢＢＰＩよりも高いＴＩＡ及びＰＹを有する修飾変異ＢＢＰＩはそれぞれ修飾変異ＢＢＰＩのＮ末端において、ペプチド組成物をさらに含む。幾つかの態様において、このペプチド挿入は１乃至１５アミノ酸の配列を含む。他の態様において、このペプチド挿入は５乃至１０アミノ酸の配列を含む。幾つかの態様において、このペプチド挿入はＳＥＱＩＤＮＯ：３８９のペプチドを含む。修飾変異ＢＢＰＩの例としては、ＳＥＱＩＤＮＯ：３８９の修飾変異４Ｄ１３ＢＢＩｔ−ＡＶ及びＳＥＱＩＤＮＯ：４１３の修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−４Ｄ１３−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａを含む。

生産性の向上は、ＢＣＥコアのＣ末端からのＢＢＰＩの切断による遊離ＢＢＰＩのレベルを測定して決定することができる。前述のように、幾つかの態様において、ＢＢＰＩ融合タンパク質はプロテアーゼを用いて、又は化学的手段より、ＢＢＰＩ融合タンパク質は切断することができる。他の態様において、ＢＣＥからＢＢＰＩへ結合するＣＢＤリンカーに存在するＡ−Ｐ結合を切断するＢＢＰＩは酸／熱処理により処理することができる。更なる態様において、このＢＢＰＩ融合タンパク質はバチルスリケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来グルタミルエンドペプチダーゼＩを用いて切断することができる。幾つかの態様において、修飾変異ＢＢＰＩの生産性の向上は、ＢＢＰＩ融合タンパク質の活性化及びＢＢＰＩ融合タンパク質の酸熱処理に続く遊離された変異ＢＢＰＩのレベル上昇を、同じ処理をした未修飾前駆体ＢＢＰＩのレベルと比較して、測定される。他の態様において、修飾変異ＢＢＰＩの生産性における向上は、融合タンパク質の活性をおこなわずに、酸／熱処理して生じた遊離ＢＢＰＩのレベルの増加分を同じ処理をした対応する未修飾前駆体ＢＢＰＩのレベルと比較して、測定する。幾つかの態様において、この遊離修飾変異ＢＢＰＩは対応する前駆ＢＢＰＩよりも高い生産及びＴＩＡを有する。

幾つかの態様において、修飾変異ＢＢＰＩは対応する未修飾前駆体ＢＢＰＩよりも、少なくとも約０．５％、約１．０％、約１．５％、約２．０％、約２．５％、約３．０％、約４．０％、約５．０％、約８．０％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％以上高い生産性を有する。他の態様において、修飾変異ＢＢＰＩの生産性は、対応する未修飾前駆ＢＢＰＩよりも少なくとも約１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、及び少なくとも約２００％まで高い。

６．パーソナルケア組成物
６．０．１修飾変異ＢＢＰＩを含むパーソナルケア組成物
本発明は医薬品又は非医薬品用途としての、少なくとも１つの修飾変異ＢＢＰＩを含むパーソナルケア組成物を提供する。幾つかの態様において、本発明はパーソナルケア組成物及びそれらの使用法を提供する。幾つかの態様において、本発明はスキンケアに用いるパーソナルケア組成物を提供する。幾つかの態様において、このパーソナルケア組成物はヘアケアに用いる。他の態様において、このパーソナルケア組成物は化粧組成物を含むスキンケアに用いる。幾つかの態様において、他の態様において、本発明のパーソナルケア組成物は各種疾患の治療に用いる。

本明細書において詳細に説明するように、本発明はヘアケア、スキンケア、及び化粧（例えばメイクアップ）を含むがこれらに限定されないパーソナルケアの数おおくの側面に用いることができる。例えば、本発明のパーソナルケア、スキンケア、サンケア（例えば、サンスクリーン、及びタンナー）、ヘアケア（例えば、シャンプー、エイーブオン及び／又はリンスオフコンディショナー、ヘアトニック、ヘアスプレー、ゲル、フォーム、ムース、セット製品、ヘアカラー、パーマネント製剤、他のスタイリング及びクレンジング製品等）、スキン、ヘア、リップのアフターサンケア、オーラルケア（例えば、歯磨き粉及びゲル、マウスウォッシュ、リンス等）、バス製品（例えば、洗浄剤、シャワーソープ、バスソープ、バスソルト、パール等）、スキンライトニング、スキンコンディションのための洗浄処理（例えば、吹出物、ニキビ、スキントナー等）、脱毛剤、ウェットワイプ、デオドラント、制汗剤、顔用マスク、髭剃り（例えば、シェービングクリーム）、アフターシェーブローション、スキンピーリング（例えば、剥離剤）、女性用製品（例えば、生理用品）、パーソナルフレッシュナー、及びフットケアに用いられる組成物を提供する。本発明は化粧料（例えば、ファンデーション、マスカラ、アイシャドー、アイライン、リップスティック、リップグロス、チーク等）に用いる組成物も提供する。更に、本発明は疾患に関連する毛の状態を改善するために用いるパーソナルケア組成物を提供する。他の態様において、このパーソナルケア組成物は疾患に関連する皮膚の状態を改善するために用いるパーソナルケア組成物を提供する。本発明の組成物は、固体、液体、コロイド、乳液、オイル、ゲル、アエロゾル、発泡体、粉末、ポンプスプレー等を含むがこれらに限定されない各種形態で用いることができ、並びにウェットワイプ等のアイテムと併せて用いることもできる。即ち、本発明は意図する使用に対して好適な形態で用いることを意図する。

幾つかの態様において、パーソナルケア組成物は前述のセクション５．４に記載のような、変異ペプチド及び少なくとも１つのアミノ酸置換を含む修飾変異ＢＢＰＩを提供する。他の態様において、このパーソナルケア組成物は前述のセクション５．４．２において説明されているような変異ペプチド及びアミノ酸置換の組み合わせを含む修飾変異ＢＢＰＩを含むパーソナルケア組成物を提供する。幾つかの態様において、パーソナルケア組成物は等しいキモトリプシンループがＶＥＧＦ結合ペプチドであるし変異ＢＢＰＩを含む。他の態様において、このパーソナルケア組成物は等しいキモトリプシンループがＦＧＦ５結合ペプチドである修飾変異ＢＢＰＩを含むパーソナルケア組成物を提供する。他の態様において、このパーソナルケア組成物は等しいキモトリプシンループがＴＧＦβ結合ペプチドである、修飾変異ＢＢＰＩを含む。

更なる態様において、このパーソナルケア組成物は等しいキモトリプシンループがＴＮＦα結合ペプチドである修飾変異ＢＢＰＩを含む組成物を提供する。幾つかの態様において、修飾変異ＢＢＰＩはパーソナルケア組成物中に約０．０００１重量パーセント乃至約５重量パーセント含まれる。代替的な態様において、修飾変異ＢＢＰＩはパーソナルケア組成物中に約０．００１重量パーセント乃至約０．５重量パーセント含まれる。更なる態様において、この修飾変異ＢＢＰＩはパーソナルケア組成物中に約０．０１重量パーセント乃至約１重量パーセント含まれる。

６．０．２修飾変異ＢＢＰＩを含むパーソナルケア組成物
ＶＥＧＦは細胞生存、分化、及び酸化窒素及びポリスタサイクリンの生成を含む細胞の各種機能に影響するだけでなく、血管形成において中心的な役割を担っている（Ｚａｃｈａｒｙｅｔａｌ．，ＣａｒｄｉｏｖａｓｃＲｅｓ，４９：５６８−８１［２００１］）。病原性状態における血管形成の一次刺激として、ＶＥＧＦを認識することは、ＶＥＧＦ活性をブロックするための試みを導いてきた。抗ＶＥＧＦレセプター抗体、可溶性レセプター構築体、アンチセンスストラテジー、ＲＮＡアプタマー因子ＶＥＧＦ、及び低分子量ＶＥＧＦチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）インヒビターは、ＶＥＧＦシグナリングを妨げるのに用いるために研究されてきた（Ｓｉｅｍｅｉｓｔｅｒｅｔａｌ．，［１９９８］参照）。実際には、モノクローナル抗体因子ＶＥＧＦがヒトの腫瘍の外来移植の成長を抑制し、マウスにおいて腹水の形成を抑制した（Ｋｉｍｅｔａｌ．，［１９９３］；Ａｓａｎｏｅｔａｌ．，［１９９８］；Ｍｅｓｉａｎｏｅｔａｌ．，［１９９８］；Ｌｕｏｅｔａｌ．，［１９９８ａ］及び［１９９８ｂ］；並びにＢｏｒｇｓｔｒｏｍｅｔａｌ．，［１９９６］及び［１９９８］）。

ＶＥＧＦ及びＲＴＫを含む血管形成は、腫瘍の成長だけでなく、血管形成に依存している異なる生体システムに影響をしている他の多くの疾病又は状態も含み、関節炎、アテローム斑（骨及び靭帯）、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、黄斑変症、眼ヘルペス、トラコーマ及び角膜移植血管新生、及び血管繊維腫を含む。ＶＥＧＦ発現は乾癬患者の表皮過形成において、及び強皮症、酒さ、血管腫、接触性皮膚炎、及び皮膚の引っかき傷の異常肥大を含む高められた血管形成ににより特徴付けられる、他の皮膚疾患において、上向き調節を行う（ＤｅｔｍａｒａｎｄＹｅｏｅｔａｌ．［１９９５］）。トランスジェニックマウスの表皮におけるＶＥＧＦの標的発現は数多くの腫瘍と脆弱な血管形成を伴う、皮膚における血管形成の増加を生じると報告されている（Ｂｒｏｗｎｅｔａｌ．，［１９９８］参照）。マウスの皮膚における慢性的にＶＥＧＦの合成はＶＥＧＦに特異的な結合因子により元に戻すことができるヒトの乾癬の組織学的に等しいマウスモデルを提供する（Ｘｉａｅｔａｌ．，［２００３］）。更に、紫外線放射はケラチノサイトにおけるＶＥＧＦ生成を含み、皮膚の血管形成を高める（Ｋｉｍｅｔａｌ．，Ｓｏｃ．ＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅＤｅｒｍａｔｏｌ．１２６：２６９７［２００６］；Ｂｌａｕｄｓｈｕｎｅｔａｌ．，ＦＥＢＳＬｅｔ．４７４：１９５−２００［２０００］；Ｋｏｓｍａｄａｋｉｅｔａｌ．，ＦＡＳＥＢＪ．１７：４４６−８［２００３］）。

更に、げっ歯類の毛胞の外毛根鞘におけるＶＥＧＦの発現は毛髪の成長期における毛細血管の増殖に時間的及び空間的に関連していることが発見された。外毛根鞘におけるＶＥＧＦの遺伝子組み換え的過剰発現は毛胞周囲の血管形成を高め、育毛組成物それに次ぐ脱毛を促進し、より大きな毛髪の成長も促進した（Ｙａｎｏｅｔａｌ．ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ１０７：４０９−１７［２００１］）。

従って、ＶＥＧＦは疾病及び非疾病に関する各県形成に含まれる。

本発明は修飾変異ＶＥＧＦ−ＢＢＰＩを含むパーソナルスキンケア及びパーソナルヘアケア組成物を提供する。本発明のパーソナルケア組成物に含まれるＶＥＧＦ−ＢＢＰＩは、ＶＥＧＦ−ＢＢＰＩの前駆体骨格中のキモトリプシンループに等しい位置がＶＥＧＦ変異ペプチドで置換されており、更にセクション５．４．２及び６．４．２に記載されている少なくとも１つのアミノ酸置換を更に含む、修飾変異体ＢＢＰＩである。本発明の幾つかの態様において、ＶＥＧＦへの修飾変異ＶＥＧＦ−ＢＧＬ７の結合は毛胞周辺の血管形成の上昇を抑制し、ＶＥＧＦが育毛を促進することを阻害する。他の態様において、ＶＥＧＦへの修飾変異ＶＥＧＦ−ＢＧＬ７の結合は、例えば、血管腫及び扁平苔癬等の血管形成性皮膚疾患を患っている患者の皮膚における血管形成の上昇を抑制する。更なる態様において、ＶＥＧＦへの修飾変異ＶＥＧＦ−ＢＧＬ７の結合は、乾癬、強皮症、静脈腫、ニキビ、酒さ、イボ、湿疹、及びリンパ管形成を含む炎症性皮膚疾患に関する調節不可能な血管形成の促進を阻害する。しかしながら、本発明を特定のメカニズムに限定することは意図しない。

幾つかの態様において、パーソナルケア組成物はキモトリプシンループがＵ．Ｓ．ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓＳｅｒｉａｌＮｏｓ．０９／８３２，７２３及び１０／９８４，２７０に記載のＶＥＧＦ結合ペプチドである、ＶＥＧＦ−ＢＢＰＩを含む。具体的には、このペプチドは、ＡＣＹＮＬＹＧＷＴＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：９）、ＫＹＹＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５８）、ＴＬＷＫＳＹＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５９）、ＤＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４６０）、ＳＫＨＳＱＩＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４６８）、ＫＴＮＰＳＧＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４６９）、ＲＰＴＧＨＳＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４７０）、ＫＨＳＡＫＡＥ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４７１）、ＫＰＳＳＡＳＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４７２）、ＰＶＴＫＲＶＨ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４７３）、ＴＬＨＷＷＶＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９２）、ＰＹＫＡＳＦＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９３）、ＰＬＲＴＳＨＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９４）、ＥＡＴＰＲＯＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９５）、ＮＰＬＨＴＬＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９６）、ＫＨＥＲＩＷＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９７）、ＡＴＮＰＰＰＭ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９８）、ＳＴＴＳＰＮＭ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９９）、ＡＤＲＳＦＲＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５００）、ＰＫＡＤＳＫＱ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０１）、ＰＮＱＳＨＬＨ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０２）、ＳＧＳＥＴＷＭ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０３）、ＡＬＳＡＰＹＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０４）、ＫＭＰＴＳＫＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０５）、ＩＴＰＫＲＰＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０６）、ＫＷＩＶＳＥＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０７）、ＰＮＡＮＡＰＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０８）、ＮＶＱＳＬＰＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０９）、ＴＬＷＰＴＦＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１０）、ＮＬＷＰＨＦＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１１）、ＳＬＷＰＡＦＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１２）、ＳＬＷＰＨＦＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１３）、ＡＰＷＮＳＨＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１４）、ＡＰＷＮＬＨＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１５）、ＬＰＳＷＨＬＲ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１６）、ＰＴＩＬＥＷＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１７）、ＴＬＹＰＱＦＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１８）、及びＨＬＡＰＳＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１９）を含む。幾つかの態様において、ＶＥＧＦ変異配列はＵ．Ｓ．ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＳｅｒｉａｌＮｏ．１１／９１９，７１７に記載のＶＥＧＦ結合ペプチドを含むがこれらに限定されない。具体的にはこのペプチドは、ＫＹＹＬＳＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２０）、ＷＹＴＬＹＫＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２１）、ＴＹＲＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２２）、ＲＹＳＬＹＹＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２３）、ＹＹＬＹＹＷＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２４）、ＮＹＱＬＹＧＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２５）、ＴＫＷＰＳＹＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２２６）、ＴＬＷＫＳＹＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２７）、ＰＬＷＰＳＹＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２８）、ＲＬＷＰＳＹＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２９）、ＴＬＷＰＫＹＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３０）、ＫＹＤＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ；５３１）、ＲＹＤＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３２）、ＤＹＲＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３３）、ＤＹＫＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３４）、ＥＹＫＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３５）、及びＲＹＰＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３６）を含む。他の態様において、このＶＥＧＦ結合ペプチドはＳＥＱＩＤＮＯＳ：９、４５８、４５９、４６０、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、及び４７３から選択される。

変異体ＶＥＧＦペプチドが導入されキモトリプシンループと置換される骨格はグリシンマックス（Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ）（ＢＢＩ；ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）由来ダイズインヒビター又はそれあらの成熟切断形態（（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８５）の骨格、ドリコスビフロラス（Ｄｏｌｉｃｈｏｓｂｉｆｌｏｒｕｓ）（ＢＢｄｂ；ＳＥＱＩＤＮＯ：４４９）由来インヒビター、グリシンマックス（Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ）（ＢＢｓｂ３；ＳＥＱＩＤＮＯ：４５０）由来ダイズインヒビターＤ−ＩＩ、トレセアセアレンシス（Ｔｏｒｒｅｓｅａ（Ａｍｂｕｒａｎａ）ｃｅａｒｅｎｓｉｓ）（ＢＢｔｃ；ＳＥＱＩＤＮＯ：４５１）インヒビター、（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８６）のＢＢＰＩ−ＡＶ骨格、（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７）のＢＢＰＩ−ＡＶ骨格、（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５２）のＢＢＰｄｂ−ＡＶ骨格、（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５３）のＢＢｓｂ３−ＡＶ骨格、（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５４のＢＢｔｃ−ＡＶ骨格、（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４０）のＢＢＩｔ−ＶＥＧＫ骨格、（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４１）のＢＢＩｔ−ＶＥＧＴ骨格、（ＳＥＩＤＮＯ：６４２）のＢＢＩｔ−ＶＥＧＫＤ骨格から選択される。更に、Ｐｒａｋａｓｈｅｔａｌ．（上記）に記載の任意の野生型ＢＢＰＩが変異ＢＢＰＩ骨格を生成するために用いられる。幾つかの態様において、この骨格はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７のＶＥＧＦ−ＢＢＰＩである。

幾つかの態様において、修飾変異ＶＥＧＦ−ＢＢＰＩはセクション５．４．１に記載のようにＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の変異ＢＢＰＩの１、４、５、１１、１３、１８、２５、２７、２９、３１、３８、４０、５０、５２、５５、及び６５に等しい位置から選択される少なくとも１つのアミノ酸配位置において少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。他の態様において、修飾変異ＶＥＧＦ−ＢＧＬ７はセクション５．４．２に記載のような２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、又は８つの組み合わせから選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含む。他の態様において、修飾変異ＶＥＧＦ−ＢＧＬ７はの骨格は１３Ｉ−２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｋ−２９Ｐ−５２Ｋ、１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ａ−２９Ｒ−３１Ｅ−４０Ｋ−５０Ｑ−５２Ｑ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ａ−２９Ｒ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｒ−５２Ｌから選択されるアミノ酸置換の組み合わせから選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含む。

幾つかの態様において、本発明のパーソナルケア組成物はＳＥＱＩＤＮＯＳ：９、４５８、４５９、４６０、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、及び４７３から選択されるＶＥＧＦ変異ペプチドで置換された前駆骨格のキモトリプシンループに等しい位置で、変異ＢＢＰＩを含む。ここでこの骨格はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７であり、１３Ｉ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｋ−２９Ｐ−５２Ｋ、１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ａ−２９Ｒ−３１Ｅ−４０Ｋ−５０Ｑ−５２Ｑ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ａ−２９Ｒ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｒ−５２Ｌから選択されるアミノ置換の組み合わせを含む。幾つかの態様において、パーソナルケア組成物はＳＥＱＩＤＮＯＳ：６０１、６０２、６２７、６２８、６２９、６３０、６３１、６４３、４９１、６３２、６３３、６３４、６３５、及び６３６のＶＥＧＦ−ＢＢＰＩから選択されるＶＥＧＦ−ＢＢＰＩを含む。

幾つかの態様において、本発明はＶＥＧＦに結合するＶＥＧＦ−ＢＢＰＩの結合ペプチドを含む。代替的な態様において、ＶＥＧＦへのＶＥＧＦ−ＢＧＬ７の結合はＶＥＧＦの加硫活性をブロックする。幾つかの態様において、この組成物は血管形成を調節することができる。

幾つかの態様において、このパーソナルケ組成物は修飾変異体ＶＥＧＦ−ＢＢＰＩをふくみ、スキンケアに用いられる。幾つかの態様において、このスキンケア組成物は皮膚の外観を改善するために用いる化粧品に用いる。他の態様において、このスキンケア組成物は皮膚疾患を患っている患者の皮膚の外観を改善する治療に用いる。幾つかの態様において、この皮膚疾患は血管形成性皮膚疾患である。追加的な態様において、この皮膚疾患は乾癬、強皮症、静脈腫、ニキビ、酒さ、イボ、湿疹、血管腫、及びリンパ管形成、から選択される。幾つかの態様において、この皮膚疾患は酒さ、である。他の態様において、この皮膚疾患は乾癬である。

１つの態様において、ＶＥＧＦ−ＢＢＰＩを含むパーソナルスキンケア組成物はスキンクリーム、ローション、スプレー、乳液、コロイド懸濁液、泡、エアロゾル、液体、ゲル、美容液、及び固形物から選択される。他の態様において、このパーソナルケア組成物は保湿ボディーウォッシュ、ボディーウォッシュ、抗菌洗浄剤、皮膚保護クリーム、ボディーローション、顔用クリーム、保湿クリーム、顔用洗浄乳液、顔用ゲル、顔用美容液、界面活性剤ベース顔用洗浄剤、顔用ピーリングゲル、抗ニキビトリートメント、顔用トナー、ピーリングクリーム、顔用マスク、アフターシェーブバーム、プレシェーブバーム、タンニング組成物、スキンライトニング組成物、皮膚の赤味を低減する組成物、サンスクリーン、脱毛剤、育毛抑制剤、及び放射線保護剤から選択される。放射線保護剤は水耐性でないサンスクリーン、高水耐性サンスクリーン、及びシリコン中水サンスクリーンから選択される。

１つの態様において、ＶＥＧＦ−ＢＢＰＩを含むパーソナルケア組成物は局所的に適用される店頭市場製品、抗菌トリートメント、抗ニキビトリートメント、皮膚保護剤、サンスクリーン、デオドラント剤、及び制汗剤を含む、スキンケア組成物である。他の態様において、この少なくとも組成物はスキントーンを明るくし、赤味を軽減し、スキントーンが暗くなるのを防ぎ、又は色の昂進を阻害する。

本発明は化粧組成物であるパーソナルケア組成物も提供する。幾つかの態様において、ＶＥＧＦ−ＢＢＰＩを含む化粧組成物は圧縮粉末製剤及びファンデーションから選択される。幾つかの好適な態様において、この化粧組成物は少なくとも１つの顔料を含む。

更なる態様において、このメイクアップ組成物はルースパウダー頬紅、及びブロンジングパウダーから選択される。更なる態様において、このメイクアップ組成物はオイル中水製剤、シリコン中水製剤、水中オイル製剤、無水メイクアップスティック、及びクリーム乃至粉末製剤から選択される。

幾つかの態様において、このパーソナルケア組成物は本明細書で定義される修飾変異ＶＥＧＦ−ＢＢＰＩ、及び物理的に利用可能なキャリア又は添加剤を含む。好ましくは、ＶＥＧＦ−ＢＢＰＩは組成物の総重量に基づいて、約０．０００１乃至約５％の量で存在する。このＶＥＧＦ−ＢＢＰＩは組成物の総重量に基づいて、約０．００１％乃至約０．５％の量で存在することが好ましい。この組成物は栄養クリーム又はローション、安定化ゲル又は分散システム、トリートメント美容液、リポソームデリバリーシステム、局所的パック又はマスク等の乳液形態、シャンプー、あるいはボディーウォッシュ等の界面活性剤ベースクレンジングシステム、エアロゾル化された又はスプレーの分散系又は乳液、ヘア又はスキンコンディショナー、スタイリング剤又はメイクアップ等の着色製品、並びに他の好適なメイクアップ及び化粧製品の形態でよい。幾つかの態様において、キャリアは水、プロピレングリコール、エタノール、プロパノール、グリセロール、ブチレングリコール、及びポリエチレングリコールからなる群より選択される。

幾つかの他の態様において、本発明はヘアケアに用いる修飾変異ＶＥＧＦ−ＢＢＰＩを含むパーソナルケア組成物を提供する。

幾つかの態様において、このヘアケア組成物は育毛の抑制に用いることができる。他の態様において、育毛の抑制は育毛が少ないことが好ましい少なくとも１つの疾病又は状態のちりょうのための毛の除去を含む。幾つかの態様において、抑制及び／又は除去は脱毛も含む。幾つかの態様において、毛は顔の毛、脚の毛、腕の毛、及び胴体の毛から選択される。

他の態様において、このヘアケア組成物は、シャンプー、コンディショナー、ヘアスタイリング組成物、ヘアカラー、パーマネントウェーブ製剤、クリーム、ゲル、ムース、スプレー、乳液、コロイド懸濁液、液体、泡、及び固形物から選択される。幾つかの態様において、このヘアケア組成物は更に放射線保護剤を含む。パーソナルスキンケア組成物において説明したように、この放射線保護剤は水耐性でないサンスクリーン、高水耐性サンスクリーン、及びシリコン中水サンスクリーンから選択される。他の態様において、放射線保護剤は水耐性でないサンスクリーン、高水耐性サンスクリーン、及びシリコン中水サンスクリーンから選択される。

幾つかの態様において、パーソナルケア組成物は本明細書で定義された修飾変異体ＶＥＧＦ−ＢＢＰＩ及び物理的利用可能な担体又は添加剤を含む。好ましくはこのＶＥＧＦ−ＢＢＰＩは組成物の総重量に基づいて約０．０００１％乃至約５％の量で存在する。ＶＥＧＦ−ＢＢＰＩは組成物の総重量に基づいて、約０．００１％乃至約１％の量で存在することも好ましい。この組成物は栄養クリーム又はローションの乳化された形態、安定化ゲル又は分散システム、トリートメント美容液、リポソームデリバリーシステム、局所的パック又はマスク、シャンプー又はボディーウォッシュ等の界面活性剤ベースクレンジングシステム、エアロゾル化された、又はスプレーの分散系、又は乳液、ヘア又はスキンコンディショナー、スタイリング剤、又はメイクアップ等の着色製品、並びに他の好適なメイクアップ及び化粧製品の形態でよい。幾つかの態様において、このキャリアは水、プロピレングリコール、エタノール、プロパノール、グリセロール、ブチレングリコール、及びポリエチレングリコールからなる群より選択される。

他の態様において、本発明のこのパーソナルケア組成物はＶＥＧＦの高いレベルに関係する血管疾病の治療に用いられる。

本発明は固体の育毛を抑制する方法も提供し、この方法は本発明のパーソナルケアＶＥＧＦヘアケア組成物を提供する工程、治療されるべき固体を提供する工程、育毛の抑制が好まれる固体の領域にこの組成物を提供する工程を含む。幾つかの態様において、育毛の抑制は固体の毛の育成を抑制することも含む。ここにおいて、抑制される毛は顔の毛、脇の毛、足の毛、動態の毛、腕の毛、及び頭の毛からなる群より選択される。追加的な態様において、本は発明のＶＥＧＦヘアケア組成物育毛の抑制のための方法はＳＥＱＩＤＮＯＳ：６０１、６０２、６２７、６２８、６２９、６３０、６３１、６４３、４９１、６３２、６３３、６３４、６３５、及び６３６から選択されるアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−ＢＢＰＩを含むパーソナルケアＣＢＨＩ変異体を含む。

他の態様において、本発明は皮膚疾患を患っている固体の皮膚の外観及び／又は状態を改善するための方法を提供する、この方法は本発明のパーソナルケア組成物を提供するこうてい、処理される個体を提供するこうてい、及びこの固体の皮膚に組成物を適用する工程を含む。幾つかの態様において、皮膚疾患は乾癬、静脈腫、ニキビ、酒さ、イボ、湿疹、血管腫、皮膚の扁平苔癬、及びリンパ管形成等から選択される。

幾つかの特定の好適な態様において、この皮膚疾患は酒さである。他の態様において、この皮膚疾患は乾癬である。追加的な態様において、皮膚疾患を患っている固体における皮膚の外観及び／又は状態を改善する、本発明のＶＥＧＦスキンケア組成物を用いる方法はＳＥＱＩＤＮＯＳ：６０１、６０２、６２７、６２８、６２９、６３０、６３１、６４３、４９１、６３２、６３３、６３４、６３５、及び６３６から選択されるアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−ＢＢＰＩを含むパーソナルケア組成物を含む。

６．０．３修飾変異体ＦＧＦ−５−ＢＢＰＩを含むパーソナルケア組成物
繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーは少なくとも２３メンバーを含む成長因子のスーパーファミリーである。この多くは細胞増殖、細胞分化、及び細胞機能の調節をしている。全てのＦＧＦは保存されたあ１２０アミノ酸コアを有する。このファミリーのメンバーは保存されたシステイン残基及びアミノ酸レベルで３０乃至５０％の配列同一性を有している。ＦＧＦの分子量はＦＧＦ−１について７０ｋＤａ乃至ＦＧＦ−５について３８０ｋＤａである。タンパク質の長さはＦＧＦ−１スプライス変異において６０アミノ酸で、ＦＧＦ−２について２８８アミノ酸である。ヘパリンへの結合はＦＧＦ因子が細胞表面レセプターと相互作用しあうのに必須な工程である。ＦＧＦ−５は２６８アミノ酸の分泌されたシグナルタンパク質であり、１７アミノ酸のシグナル配列に２１５アミノ酸の成熟ペプチドからなる。ヒト遺伝子も１８ｋＤａのサイズで１２３０アミノ酸長のグリコシル化された代替的なスプライス形態レベルが高い。ＦＧＦ−５のげっ歯類相同体はクローンされ、アミノ酸配列レベルでヒトタンパク質に８４％の相同性があることが発見された。ヒトＦＧＦ−５は３つのエキソンとからなり、染色体４ｑ２１に位置しており、げっ歯類ＦＧＦ−５とクロスリアクションする。

毛胞の形成は複合的な工程を含み、成長（発育相）、退行（中間期）、休止（テロゲン）、及び脱落期（エキソゲン）を含む。ＦＧＦ−５は毛のサイクルにおいて発育相から中間期の移行の主要な調節因子の１つであることが示唆されている。ＦＧＦ−５の発現は野生型マウスから毛包において検出されており、発育相の間の外毛根鞘に位置している。ＦＧＦ−５の予測されるヌル対立遺伝子、ｆｇｆ５ｎｅｏ、は異常な長髪となる（Ｈｅｂｅｒｔｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ７８：１０１７−２５［１９９４］）参照。）。この表現型はアンゴラ自然突然変異（ｇｏ）と同型のマウスのものと同じようである。近年、レセプターへの結合においてＦＧＦ−５と競合すると考えれている、部分的なＦＧＦ−５配列、ＦＧＦ−５Ｓが同定された（Ｉｔｏｅｔａｌ．，Ｊ．ＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ．，１９７：２７２−８３［２００３］参照）。

本発明は発毛の促進及び／又は毛の損失を阻害するために用いる、少なくとも１つの修飾変異ＦＧＦ−ＢＢＰＩを含むパーソナルケアを提供する。１つの態様において、本発明は、パーソナルスキンケアのためのＦＧＦ−ＢＢＰＩ組成物を提供する。１つの態様において、本発明はヘアケアのためのＦＧＦ−ＢＢＰＩ組成物を提供する。本発明のパーソナルケア組成物に含まれるＦＧＦ−ＢＢＰＩはＦＧＦ−５ＢＢＰＩの前駆体骨格の等しいキモトリプシンループがＦＧＦ−５変異ペプチドで置換されており、更にセクション５．４．１及び５．４．２に記載の少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。本発明において、修飾変異ＦＧＦ−ＢＢＰＩ又はＦＧＦ−５−ＢＢＰＩの結合はＦＧＦ−５と同属のレセプターとの相互作用を起こらないようにして、発育相から中間期への移行を抑制し、育毛を促進して、毛の損失を少なくする。しかしながら、本発明を任意の特定のメカニズムに限定することは意図しない。

幾つかの態様において、パーソナルケア組成物は少なくとも１つのＦＧＦ−ＢＢＰＩを含み、このＦＧＦ−ＢＢＰＩのキモトリプシンループはＣＡＣＲＴＱＰＹＰＬＣＦ（ＭＭ００７；ＳＥＱＩＤＮＯ：４３０）、ＣＩＣＴＷＩＤＳＴＰＣ（ＰＳ２；ＳＥＱＩＤＮＯ：４３１）、ＣＹＧＬＰＦＴＲＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３７）、ＣＥＥＩＷＴＭＬＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３８）、ＣＷＡＬＴＶＫＴＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３９）、ＣＬＴＶＬＷＴＴＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４０）、ＣＴＬＷＮＲＳＰＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４１）、ＣＨＹＬＬＴＮＹＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４２）、ＣＲＩＨＬＡＨＫＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４３）、ＴＮＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４４）、ＨＬＱＴＴＥＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４５）、ＳＬＮＮＬＴＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４６）、ＴＮＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４７）、ＴＮＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４８）、ＬＲＩＬＡＮＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４９）、ＬＬＴＰＴＬＮ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５０）、ＡＬＰＴＨＳＮ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５１）、ＴＮＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５２）、ＬＣＲＲＦＥＮ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５３）、ＴＮＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５４）、ＴＮＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５５）、ＨＬＱＴＴＥＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５６）、ＰＬＧＬＣＰＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５７）、ＧＹＦＩＰＳＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５８）、ＴＫＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５９）、ＨＬＱＴＴＥＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６０）、ＷＮＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６１）、ＴＷＩＤＷＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６２）、ＲＴＱＰＹＰＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６７０）、及びＴＷＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６７１）から選択される変異ペプチドである。他の態様において、このＦＧＦ変異ペプチドはＳＥＱＩＤＮＯＳ：４３０、４３１、６７０、及び６７１から選択される。

変異ＦＧＦペプチドが導入されてキモトリプシンループを置換する骨格はＧｌｙｃｉｎｅｍａｘ（ＢＢＩ；ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）由来ダイズインヒビター又はこれらに成熟及び切断形態（（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８５）、グリシンマックス（Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ）（ＢＢｓｂ３；ＳＥＱＩＤＮＯ：４５０）由来ダイズインヒビターＤ−ＩＩ、トレセアセアレンシス（Ｔｏｒｒｅｓｅａ（Ａｍｂｕｒａｎａ）ｃｅａｒｅｎｓｉｓ）（ＢＢｔｃ；ＳＥＱＩＤＮＯ：４５１）由来インヒビター、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８６のＢＢＩ−ＡＶｓｃａｆｆｏｌｄ、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７のＢＢＩｔ−ＡＶ骨格ＳＥＱＩＤＮＯ：４５２のＢＢｄｂ−ＡＶ骨格、ＳＥＱＩＤＮＯ：４５３のＢＢｓｂ３−ＡＶ骨格、ＳＥＱＩＤＮＯ：４５４のＢＢｔｃ−ＡＶ骨格、ＳＥＱＩＤＮＯ：６４０のＢＢＩｔ−ＶＥＧＫ骨格、ＳＥＱＩＤＮＯ：６４１のＢＢＩｔ−ＶＥＧＴ骨格、及びＳＥＩＤＮＯ：６４２のＢＢＩｔ−ＶＥＧＫＤ骨格から選択される。更に、Ｐｒａｋａｓｈｅｔａｌ．（上記）に記載のような、野生型ＢＢＰＩ前駆体骨格も変異ＢＢＰＩ骨格の生成に用いられる。幾つかの態様において、このＶＥＧＦ−ＢＢＰＩの骨格はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７である。

幾つかの態様において、修飾変異ＦＧＦ−ＢＢＰＩの主鎖はセクション５．４．１に記載のように、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の変異ＢＢＰＩの１、４、５、１１、１３、１８、２５、２７、２９、３１、３８、４０、５０、５２、５５、及び６５に等しい位置の少なくとも１つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む。他の態様において、修飾変異ＦＧＦ−ＢＢＰＩの主鎖は、セクション５．４．２に記載のように、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、又は８つのアミノ酸置換の組み合わせを含む。他の態様において、修飾変異ＦＧＦ−ＢＢＰＩの主鎖は１３Ｉ−２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｋ−２９Ｐ−５２Ｋ、１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ａ−２９Ｒ−３１Ｅ−４０Ｋ−５０Ｑ−５２Ｑ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ａ−２９Ｒ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｒ−５２Ｌから選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含む。幾つかの態様において、この置換の組み合わせは１３Ｉ−２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａである。

幾つかの態様において、本発明のパーソナルケア組成物は前駆体骨格のキモトリプシンループに等しい部分がＳＥＱＩＤＮＯＳ：４３３及び４３４から選択されるＦＧＦへペプチドで置換されている。この骨格はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７であり、アミノ酸置換１３Ｉ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａを含む。従って、幾つかの態様において、このパーソナルケア組成物はＳＥＱＩＤＮＯＳ：４３９及び４４１のＦＧＦ−ＢＢＰＩから選択されるＦＧＦ−ＢＢＰＩを含む。

幾つかの態様において、本発明はＦＧＦへ結合するＦＧＦ−ＢＢＰＩを含むパーソナルケア組成物を提供する。代替的な態様において、ＦＧＦへのＦＧＦ−ＢＢＰＩの結合はＦＧＦの下流活性をブロックする。幾つかの態様において、この組成物は育毛を促進する。

幾つかの態様において、修飾変異ＢＢＰＩ−ＦＧＦはスキンケアに用いる。幾つかの態様において、このスキンケア組成物は育毛を促進するために用いるスキンケア組成物である。幾つかの態様において、このスキンケア組成物は疾病を患っている患者又は毛の損失状態における育毛の促進に用いる。これらの態様の幾つかにおいて、この疾病又は状況は炎症性脱毛症、萎縮性脱毛症、強皮症、ダニ咬傷、扁平苔癬、乾癬、狼瘡、脂漏性皮膚炎、脱毛症、血色素症、男性ホルモン性脱毛症、及び円形脱毛症、癌、不完全な毛髪繊維形成、及び毛の生成に影響を与える環境因子からなる群より選択される。好適な態様において、ＦＧＦ―ＢＢＰＩを含むパーソナルケア組成物はスキンケアクリーム、ローション、スプレー、乳液、コロイド懸濁液、泡、エアロゾル、液体、ゲル、美容液、及び固形から選択される。他の態様において、このパーソナルケア組成物は保湿性ボディーウォッシュ、ボディーウォッシュ、抗菌クレンザー、スキンプロテクトクリーム、ボディーローション、顔用クリーム、保湿クリーム、顔用クレンジング乳液、顔用ゲル、顔用美容液、界面活性剤ベース顔用クレンザー、顔用マスク、アフターシェーブバーム、プレシェーブバーム、タンニング組成物、スキンラントニング組成物、赤み抑制組成物、サンスクリーン、脱毛剤、育毛抑制剤、及び放射線保護剤から選択されるスキンケア組成物である。放射線保護剤は非水耐性サンスクリーン、高水耐性サンスクリーン、及びシリコン中水サンスクリーンから選択される。

１つの態様において、ＦＧＦ−ＢＢＰＩを含むこのパーソナルスキンケア組成物は局所的に適用される店頭市場製品、抗菌トリートメント、抗ニキビトリートメント、皮膚保護剤、サンスクリーン、デオドラント剤、及び制汗剤を含むを含むスキンケア組成物である。

幾つかの態様において、このパーソナルスキンケア組成物は本明細書で定義された変異ＶＥＧＦ−ＢＢＰＩ及び物理的に許容可能な担体又は添加剤を含む。このＶＥＧＦ―ＢＢＰＩは組成物の総重量により、約０．００１％乃至約０．５％の量で存在する。この組成物は栄養クリーム又はローション、安定化ゲル又は分散システム、トリートメント美容液、リポソームデリバリーシステム、局所的パック又はマスク等の乳液形態、シャンプー又はボディーウォッシュ等の界面活性剤ベースクレンジングシステム、エアロゾル化された又はスプレーの分散系又は乳液、ヘア又はスキンコンディショナー、スタイリング剤又はメイクアップ等の着色製品、並びに他の好適なメイクアップ及び化粧製品の形態でよい。幾つかの態様において、この担体は水、プロピレングリコール、エタノール、プロパノール、グリセロール、ブチレングリコール、及びポリエチレングリコールからなる群より選択される。

他の態様において、本発明は、ヘアケアに用いる、修飾変異ＦＧＦ−ＢＢＰを含むパーソナルケア組成物を提供する。

幾つかの態様において、このヘアケア組成物は育毛の促進に用いる。他の態様において、調節は疾病を患っている患者又は毛の損失を含む状態における育毛の促進を含む。これらの幾つかにおいて、疾病又は状態は、炎症性脱毛症、萎縮性脱毛症、強皮症、ダニ咬傷、扁平苔癬、乾癬、狼瘡、脂漏性皮膚炎、脱毛症、血色素症、男性ホルモン性脱毛症、及び円形脱毛症、癌、不完全な毛髪繊維形成、及び毛の生成に影響を与える環境因子からなる群より選択される。好適な態様において、この疾病はアンドロゲン性脱毛症又は円形脱毛（症）である。１つの態様において、このヘアケア組成物はシャンプー、コンディショナー、ヘアスタイリング組成物、ヘアカラー、パーマネントウェーブ製剤、クリーム、ゲル、ムース、スプレー、乳液、コロイド懸濁液、液体、泡、及び固形物から選択される。幾つかの態様において、このヘアケア組成物は更に放射性保護剤を含む。スキンケア組成物のところで説明したように、この放射線保護剤は非水耐性サンスクリーン、高水耐性サンスクリーン、及びシリコン中水サンスクリーンから選択されるサンスクリーンを含む。

幾つかの態様において、このパーソナルケア組成物は本明細書で定義される修飾変異ＦＧＦ−ＢＢＰＩ及び物理的に許容可能な担体又は添加剤を含む。好ましくは、このＦＧＦ−ＢＢＰＩは組成物の総重量に基づいて約０．０００１％乃至約５％の量で存在する。このＦＧＦ−ＢＢＰＩは組成物の総重量に基づいて約０．００１％乃至約０．５％の量で存在しても好ましい。この組成物は、栄養クリーム又はローション、安定化ゲル又は分散システム、トリートメント美容液、リポソームデリバリーシステム、局所的パック又はマスク等の乳液形態、シャンプー又はボディーウォッシュ等の界面活性剤ベースクレンジングシステム、エアロゾル化された又はスプレーの分散系又は乳液、ヘア又はスキンコンディショナー、スタイリング剤又はメイクアップ等の着色製品、並びに他の好適なメイクアップ及び化粧製品の形態でよい。幾つかの態様において、この担体は水、プロピレングリコール、エタノール、プロパノール、グリセロール、ブチレングリコール、及びポリエチレングリコールからなる群より選択される。

他の態様において、本発明のパーソナルケアＦＧＦ−ＢＢＰＩ組成物はＦＧＦが高レベルになる各種疾患の治療に用いることができる。

本発明は患者の育毛を促進するための方法も提供する。この方法は、本発明のパーソナルケアＦＧＦ組成物を提供する工程、治療する患者を提供する工程、この患者の育毛を促進したい場所にこの組成物を適用する工程を含む。幾つかの態様において、このＦＧＦ組成物はスキンケア組成物である。他の態様において、このＦＧＦ組成物はヘアケア組成物である。幾つかの態様において、、育毛の促進は、固体のヘアの育毛の促進を含み、顔の毛、脇の毛、脚の毛、胴体の毛、及び腕の毛から選択される育毛を促進すべき領域の育毛の促進を含む。追加的な態様において、本発明のＦＧＦヘアヘア組成物を用いて育毛を促進する方法はＳＥＱＩＤＮＯＳ：４３９及び４４１から選択されるアミノ酸配列を有するＦＧＦ−ＢＢＰＩを含むパーソナルケア組成物を適用する工程を含む。

６．０．４修飾変異ＴＧＦβ―ＢＢＰＩを含むパーソナルケア組成物
形質転換成長因子―β（ＴＧＦβ）ファミリーはほとんど全ての細胞により合成されている。このＴＧＦβは安定な多機能ポリペプチド成長因子のグループであり、他の中でも特に、細胞の増殖の抑制及び刺激、細胞外マトリックスの制御、胚形成の間の間葉−上皮細胞相互作用の制御、傷に反応する細胞及び組織間の仲介、腫瘍形成、及び免疫反応の調節を活性化する。ＴＧＦβ―１はほとんど全ての細胞（幾つかの例外を除く）で合成される。ＴＧＦβはヒト血小板及び哺乳類の骨に高濃度で存在する。ＴＧＦβは細胞増殖の抑制、細胞外マトリックス沈着の促進、及び身体的免疫抑制を含む多くの機能を有する。ＴＧＦβは毛包の発育において生物学的に活性であることが発見見出された。ヒトＴＧＦβは１サブユニット当り約１１２アミノ酸を含むサブユニットを有する２５．０ｋＤａのタンパク質である。２つの異なるレセプタータンパク質がＴＧＦβ―１の結合及び／又はシグナリングに含まれており、これらはＴＧＦ−ＲβＩＩ及びＴＧＦ−ＲβＩである。ＴＧＦβ―２はケラチノサイト、繊維芽細胞、破骨細胞、胸腺上皮細胞、骨格筋細胞、前立腺上皮細胞、気管支上皮細胞、ニューロン及び星状細胞、内臓平滑筋細胞、マクロファージ、及び各種他の細胞を含む各種細胞で発現される。ＴＧＦβ−２はマスト細胞の成長抑制因子、細胞外マトリックスの蓄積のエンハンサー、及び免疫抑制をしての機能を含む多くの基本的な活性を有している。この成熟領域は、ＴＧＦβ―１に対して７１％、ＴＧＦβ―３に対して８０％、及び同じアミノ酸のマウス相同体に対して９７％の、アミノ酸レベルでの同一性を有する。ＴＧＦβ―２は「プロ」領域の間のジスルフィド結合と成熟領域の間のジスルフィド結合の形成により、二量体になる。ＴＧＦβ―２は１９アミノ酸シグナル配列、２８３プロ領域、及び１１２成熟アミノ酸セグメントを有するプレプロサイトカインとして合成される。ＴＧＦβ―２に対するレセプターは２つのタイプＩシグナルトランスダクションレセプターと２つのタイプＩＩリガンド結合レセプターの四量複合体を形成する。

毛包の形成は、複合的な工程を含み、成長（発育相）、退行（中間期）、休止（テロゲン）、及び脱落期（エキソゲン）を含む。（ＳｔｅｎｎａｎｄＰａｕｓ、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ，Ｅｘｐ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，８：２２９−２３３［１９９９］参照。）ＴＧＦβはヘアサイクルにおける発育相から中間期への移行の主要なドライバーの１つであることが示唆された（例えば、Ｆｏｉｔｚｉｋｅｔａｌ、ＦＡＳＥＢＪ．，５：７５２−７６０［２０００］；及びＳｏｍａｅｔａｌ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、１１８：９９３−９９９７［２００２］参照）。ＴＧＦβ２はげっ歯類の毛包の形態形成の必要誘導物質であり、十分誘導物質である。（Ｆｏｉｔｚｉｋｅｔａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｂｉｏｌ．，２１２：２７８−２８９［１９９９］参照。）トランスジェニックマウスにおける条件付きのＴＧＦβ―１の発現は可逆性の脱毛症を誘発することができる（Ｌｉｕｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９８：９１３９−９１４４［２００１］）。更に、ＴＧＦβ―１変異体はマウスにおいて中間期の開始を遅らせることに関係している（Ｆｏｉｔｚｉｋｅｔａｌ、［２０００］、上記）。近年、カタゲンはＴＧＦβ―２抗体の使用を通じて遅らせることが示された。（Ｓｏｍａｅｔａｌ．，［２００２］上記）最終的に、はげかかった頭皮乳頭細胞におけるＴＧＦβ―１生成は上皮細胞の成長を抑制する（Ｉｎｕｉｅｔａｌ．，ＦＡＳＥＢＪ．，１４：１９６７−１９６９［２００２］）。

ＴＧＦβは結合組織の蓄積を刺激することができ、このことは強皮症の発症及び他の線維性の疾病を示している（Ｂｌｏｂｅｅｔａｌ．，ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ３４２：１３５０−１３５８［２０００］）。強皮症は、初期の炎症及び血管の傷害、次いで皮膚及び他の器官における線維症が進行することを特徴とする慢性的な自己免疫疾患である（ＫｉｓｓｉｎａｎｄＫｏｒｎ、ＲｈｅｕｍＤｉｓＣｌｉｎＮｏｒｔｈＡｍ２９：３５１−３６９［２００３］）。最も目立つ症状は皮膚が硬化することであり、それにより引っかき傷が多くなる。

ＴＧＦβは皮膚の腫瘍の形成にも影響を与えることが示唆されている（Ｌｉｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ４５：３８９−３９６［２００６］）。ＴＧＦβシグナリング経路は上皮細胞のホメオスタシスの維持において最も重要な機構の１つである。この経路を抑制又は高めるかのいずれかの変更は腫瘍の成長に影響する。ＴＧＦβは星状な上皮細胞を育成と抑制するが、多くの上皮細胞において、逆説的ではあるが、過剰発現する。ＴＧＦβは腫瘍形成の初期の段階で腫瘍抑制因子として働くが、腫瘍形成の後期ではＴＧＦβが過剰発現すると腫瘍の浸潤及び転移の重要な因子となる。

本発明は修飾変異ＴＧＦ−ＢＢＰＩを含むパーソナルケア組成物を提供する。本発明のパーソナルケア組成物に含まれるＴＧＦβ―ＢＢＰＩはＴＧＦ−ＢＢＰＩの前駆体骨格のキモトリプシンループがＴＧＦβ変異ペプチドで置換されており、セクション５．４．１及び５．４．２セクション５．４．１及び５．４．２に記載の少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。幾つかの態様において、ＴＧＦβ１及び／又はＴＧＦβ２への修飾変異ＴＧＦ−ＢＢＰＩの結合はＴＧＦβ１及び／又はＴＧＦβ２が同属のレセプターに結合するのを阻害して、発育相から中間期への移行を阻害して、育毛を促進して、ヘアロスを阻害する。他の態様において、ＴＧＦβ１及び／又はＴＧＦβ２への修飾変異ＴＧＦ−ＢＢＰＩの結合はＴＧＦβ及び／又はＴＧＦβ２が像族のレセプターに結合するのを阻害して、強皮症の特徴である皮膚の線維質形成を阻害する。他の態様において、ＴＧＦβ１及び／又はＴＧＦβ２への修飾変異ＴＧＦ−ＢＢＰＩの結合は、同属のレセプターにＴＧＦβ１及び／又はＴＧＦβ２が結合するのを防いで、病理的な皮膚の傷の進行を阻害する。しかしながら、本発明を特定のメカニズムに限定することは意図しない。

幾つかの態様において、ＴＧＦβ―ＢＢＰＩに含まれるＴＧＦβ変異ペプチドはＣＬＣＰＥＮＩＮＶＬＰＣＮ（ＰＥＮ３；ＳＥＱＩＤＮＯ：４３６）、ＣＩＣＫＨＮＶＤＷＬＣＦ（ＭＭＯ２１Ｗ；ＳＥＱＩＤＮＯ：４３７）、ＣＩＣＷＴＱＨＩＨＮＣＦ（ＷＴＱ；ＳＥＱＩＤＮＯ：４３８）、ＣＶＴＴＤＷＩＥＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６３）、ＣＹＹＳＱＦＨＱＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６４）、ＣＰＴＬＷＴＨＭＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６５）、ＱＳＡＣＩＶＹＹＶＧＲＫＰＫＶＥＣＡＳＳＤ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６６）、ＱＳＡＣＩＬＹＹＩＧＫＴＰＫＩＥＣＡＳＳＤ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６７）、ＱＳＡＣＩＬＹＹＶＧＲＴＰＫＶＥＣＡＳＳＤ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６８）、ａｃｅｔｙｌ−ＬＣＰＥＮＤＮＶＳＰＣＹ−ｃｏｈｎ２（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６９）、ＫＨＮＶＲＬＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７０）、ＮＤＴＰＳＹＦ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７１）、ＡＫＬＹＡＧＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７２）、ＲＧＰＡＨＳＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７３）、ＮＳＬＡＥＲＲ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７４）、ＨＰＬＡＳＰＨ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７５）、ＱＰＷＮＫＬＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７６）、ＡＷＬｒ／Ｍｉｐｙ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７７）、ＰＴＫＰＡＱＱ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７８）、ＰＳＬＮＲＰＱ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７９）、ＨＨＡＲＱＥＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８０）、ＲＨＨＴＰＧＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８１）、ＡＳＡＩＮＰＨ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８２）、ＣＨＧＹＤＲＡＰＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４４）、ＣＦＡＰＡＤＱＡＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４５）、ＣＩＰＳＲＦＩＴＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４６）、ＣＨＧＨＴＫＬＡＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４７）、ＣＮＧＫＳＫＬＡＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４８）、ＰＥＮＩＮＶＬＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ；６７２）、ＫＨＮＶＤＷＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６７３）、及びＷＴＱＨＩＨＮＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６７４）から選択される。ＳＥＱＩＤＮＯＳ：６４４−６４８はＴＧＦβ１結合ペプチドである。ＳＥＱＩＤＮＯＳ：４６３、４３７、４３８、５６３−５８２はＴＧＦβ２結合ペプチドである。

他の態様において、このＴＧＦβ変異ペプチドはＳＥＱＩＤＮＯＳ：４３６、４３７及び４３８から選択される。

変異ＴＧＦβペプチドを導入して等しいキモトリプシンループを置換する骨格は、グリシンマックス（Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ）（ＢＢＩ；ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）由来の大豆インヒビターの骨格又はこれらの成熟又は切断形態（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８５）、ドリコスビフロラス（Ｄｏｌｉｃｈｏｓｂｉｆｌｏｒｕｓ）（ＢＢｄｂ；ＳＥＱＩＤＮＯ：４４９）由来インヒビター、グリシンマックス（Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ）（ＢＢｓｂ３；ＳＥＱＩＤＮＯ：４５０）由来大豆インヒビターＤ−ＩＩ、トレセアセアレンシス（Ｔｏｒｒｅｓｅａ（Ａｍｂｕｒａｎａ）ｃｅａｒｅｎｓｉｓ）（ＢＢｔｃ；ＳＥＱＩＤＮＯ：４５１）由来インヒビター、（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８６）のＢＢＩ−ＡＶ骨格、（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７）のＢＢＩｔ−ＡＶ骨格、（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５２）のＢＢｄｂ−ＡＶ骨格、（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５３）のＢＢｓｂ３−ＡＶ骨格、（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５４）のＢＢｔｃ−ＡＶ骨格、（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４０）のＢＢＩｔ−ＶＥＧＫ骨格、（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４１）のＢＢＩｔ−ＶＥＧＴ骨格、及び（ＳＥＩＤＮＯ：６４２）のＢＢＩｔ−ＶＥＧＫＤ骨格から選択される。更に、Ｐｒａｋａｓｈｅｔａｌ．（上記）に記載されているような野生型ＢＢＰＩ前駆体骨格も変異ＢＢＰＩ骨格を形成するのに用いる。幾つかの態様において、このＶＥＦＧ―ＢＢＰＩの骨格はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７である。

幾つかの態様において、修飾変異ＴＧＦβ―ＢＢＰＩの骨格はセクション５．４．１に記載のようなＳＥＱＩＤＮＯ：１８７，の変異ＢＢＰＩの１、４、５、１１、１３、１８、２５、２７、２９、３１、３８、４０、５０、５２、５５、及び６５に等しい位置における少なくとも１つのアミノ酸位置における少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。他の態様において、この修飾変異ＴＧＦβ―ＢＢＰＩの骨格はセクション５．４．２に記載のような２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、又は８つのアミノ酸置換の組み合わせを含む。他の態様において、この修飾変異ＴＧＦβ−ＢＢＰＩの主鎖は１３Ｉ−２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｋ−２９Ｐ−５２Ｋ、１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ａ−２９Ｒ−３１Ｅ−４０Ｋ−５０Ｑ−５２Ｑ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ａ−２９Ｒ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｒ−５２Ｌから選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含む。幾つかの態様において、この置換の組み合わせは１３Ｉ−２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａである。幾つかの態様において、本発明のパーソナルケア組成物は前駆体骨格の等しいキモトリプシンループがＳＥＱＩＤＮＯＳ：４３６、４３７、４３８、６７２、６７３、及び６７４から選択されるＴＧＦβ変異ペプチドで置換されており、骨格がＳＥＱＩＤＮＯ：１８７であり、アミノ酸置換の組み合わせ１３Ｉ−２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａを含むＢＢＰＩを含む。幾つかの態様において、このパーソナルケア組成物はＳＥＱＩＤＮＯＳ：４４３、４４５、及び４４７から選択されるＴＧＦβ―ＢＢＰＩを含む。

幾つかの態様において、本発明はＴＧＦβ１及び／又はＴＧＦβ２に結合するＴＧＦβ―ＢＢＰＩを含むパーソナルケア組成物を提供する。代替的な態様において、このＴＧＦβ−ＢＢＰＩのＴＧＦβへの結合はＴＧＦβの下流活性をブロックする。幾つかの態様において、この組成物は育毛を促進する。

幾つかの態様において、修飾変異ＴＧＦ−ＢＢＰＩを含むパーソナルケア促進するはスキンケアに用いられる。幾つかの態様において、このスキンケア組成物は、育毛を促進するために用いるスキンケア組成物である。

幾つかの態様において、このスキンケア組成物は疾病を患っている患者又は毛の損失状態における育毛の促進に用いる。これらの態様の幾つかにおいて、この疾病又は状況は炎症性脱毛症、萎縮性脱毛症、強皮症、ダニ咬傷、扁平苔癬、乾癬、狼瘡、脂漏性皮膚炎、脱毛症、血色素症、男性ホルモン性脱毛症、及び円形脱毛症、癌、不完全な毛髪繊維形成、及び毛の生成に影響を与える環境因子からなる群より選択される。好適な態様において、この疾病はアンドロゲン性脱毛症又は円形脱毛症である。

他の態様において、修飾変異ＴＧＦ−ＢＢＰＩを含むパーソナルケア組成物は強皮症を患っている患者の皮膚の外観及び／又は状態を改善するために用いる。更なる態様において、修飾変異ＴＧＦ−ＢＢＰＩを含む組成物は皮膚癌を患っている患者の皮膚外観及び／又は状態を改善する。

１つの態様において、ＴＧＦβ―ＢＢＰＩを含むパーソナルケア組成物はスキンクリーム、ローション、スプレー、乳液、コロイド懸濁液、泡、エアロゾル、液体、ゲル、美容液、及び固形から選択される。他の態様において、このパーソナルケア組成物は保湿性ボディーウォッシュ、ボディーウォッシュ、抗菌クレンザー、スキンプロテクトクリーム、ボディーローション、顔用クリーム、保湿クリーム、顔用クレンジング乳液、顔用ゲル、顔用美容液、界面活性剤ベース顔用クレンザー、顔用マスク、アフターシェーブバーム、プレシェーブバーム、タンニング組成物、スキンラントニング組成物、赤み抑制組成物、サンスクリーン、脱毛剤、育毛抑制剤、及び放射線保護剤から選択されるスキンケア組成物である。放射線保護剤は非水耐性サンスクリーン、高水耐性サンスクリーン、及びシリコン中水サンスクリーンから選択される。放射線保護剤は非水耐性サンスクリーン、高水耐性サンスクリーン、及びシリコン中水サンスクリーンから選択される。

幾つかの態様において、ＴＧＦβ―ＢＢＰＩを含むパーソナルケア組成物は局所的に適用される店頭市場製品、抗菌トリートメント、抗ニキビトリートメント、皮膚保護剤、サンスクリーン、デオドラント剤、及び制汗剤を含むスキンケア組成物である。

本発明は化粧組成物であるパーソナルケア組成物も提供する。幾つかの好適な態様において、この化粧組成物はマスカラ、圧縮パウダー製剤、及びファンデーションから選択される。幾つかの好適な態様において、このメイクアップ組成物は少なくとも１つの顔料を含む。

幾つかの態様において、少なくとも１つの原顔料を含むメイクアップ組成物は非ウォータープルーフますから。ウォータープルーフマスカラ、ボリュームを上げるマスカラ、長さを長くするマスカラ、カールを強くするマスカラ、無水ウォータープルーフマスカラ、水ベースマスカラ、及びアイラッシュ、マスカラアイブロウトリートメントから選択される。

更なる追加的な態様において、このメイクアップ組成物は圧縮されたパウダーファンでションであり、ルースパウダー、頬紅、アイシャドー、及びブロンジングパウダーから選択される。更なる態様において、このメイクアップ組成物はオイル中水ファンデーション、シリコン中水ファンデーション、水中オイルファンデーション、無水メイクアップスティック、及びクリームファンデーション乃至パウダーファンデーションから選択される。

幾つかの態様において、パーソナルケア組成物は本明細書で定義される修飾変異ＴＧＦ−ＢＢＰＩ、物理的に許容可能な担体又は添加剤を含む。好ましくは、ＴＧＦ−ＢＢＰＩは組成物の総重量に基づいて約０．０００１％乃至約５％の量で存在する。ＴＧＦ−ＢＢＰＩが組成物の総重量に基づいて、約０．００１％乃至約０．５％の量で存在することも好ましい。この組成物は栄養クリーム又はローション等の乳液媒体、安定化ゲル又は分散システム、トリートメント美容液、リポソームデリバリーシステム、局所的パック又はマスク等の乳液形態、シャンプー又はボディーウォッシュ等の界面活性剤ベースクレンジングシステム、エアロゾル化された又はスプレーの分散系又は乳液、ヘア又はスキンコンディショナー、スタイリング剤又はメイクアップ等の着色製品、並びに他の好適なメイクアップ及び化粧製品の形態でよい。幾つかの態様において、この担体は水、プロピレングリコール、エタノール、プロパノール、グリセロール、ブチレングリコール、及びポリエチレングリコールからなる群より選択される。

他の態様において、本発明は、ヘアケアに用いる、修飾変異ＴＧＦ−ＢＢＰを含むパーソナルケア組成物を提供する。幾つかの態様において、このヘアケア組成物は育毛の促進に用いる。

幾つかの態様において、このヘアケア組成物は育毛の促進に用いる。他の態様において、調節は疾病を患っている患者又は毛の損失を含む状態における育毛の促進を含む。これらの幾つかにおいて、疾病又は状態は、炎症性脱毛症、萎縮性脱毛症、強皮症、ダニ咬傷、扁平苔癬、乾癬、狼瘡、脂漏性皮膚炎、脱毛症、血色素症、男性ホルモン性脱毛症、及び円形脱毛症、癌、不完全な毛髪繊維形成、及び毛の生成に影響を与える環境因子からなる群より選択される。好適な態様において、この疾病はアンドロゲン性脱毛症又は円形脱毛症である。

１つの態様において、このヘアケア組成物はシャンプー、コンディショナー、ヘアスタイリング組成物、ヘアカラー、パーマネントウェーブ製剤、クリーム、ゲル、ムース、スプレー、乳液、コロイド懸濁液、液体、泡、及び固形物から選択される。幾つかの態様において、このヘアケア組成物は更に放射性保護剤を含む。スキンケア組成物のところで説明したように、この放射線保護剤は非水耐性サンスクリーン、高水耐性サンスクリーン、及びシリコン中水サンスクリーンから選択されるサンスクリーンを含む。他の態様において、この放射線保護剤は非水耐性サンスクリーン、高水耐性サンスクリーン、及びシリコン中水サンスクリーンから選択されるサンスクリーンである。

幾つかの態様において、このパーソナルケア組成物は本明細書で定義される修飾変異ＴＧＦβ−ＢＢＰＩ及び物理的に許容可能な担体又は添加剤を含む。好ましくは、このＴＧＦβ−ＢＢＰＩは組成物の総重量に基づいて約０．０００１％乃至約５％の量で存在する。このＴＧＦβ−ＢＢＰＩは組成物の総重量に基づいて約０．００１％乃至約０．５％の量で存在しても好ましい。この組成物は、栄養クリーム又はローション等の乳液媒体、安定化ゲル又は分散システム、トリートメント美容液、リポソームデリバリーシステム、局所的パック又はマスク等の乳液形態、シャンプー又はボディーウォッシュ等の界面活性剤ベースクレンジングシステム、エアロゾル化された又はスプレーの分散系又は乳液、ヘア又はスキンコンディショナー、スタイリング剤又はメイクアップ等の着色製品、並びに他の好適なメイクアップ及び化粧製品の形態でよい。幾つかの態様において、このキャリアは水、プロピレングリコール、エタノール、プロパノール、グリコール、ブチレングリコール、及びポリエチレングリコールからなる群より選択される少なくとも１つである。

他の態様において、本発明のパーソナルケアＴＧＦ−ＢＢＰＩ組成物はＴＧＦβ１及び／又はＴＧＦβ２が高レベルになる各種疾患の治療に用いることができる。

本発明は患者の育毛を促進するための方法も提供する。この方法は、本発明のパーソナルケアＴＧＦ組成物を提供する工程、治療する患者を提供する工程、この患者の育毛を促進したい場所にこの組成物を適用する工程を含む。幾つかの態様において、このＴＧＦ組成物はスキンケア組成物である。他の態様において、このＴＧＦ組成物はヘアケア組成物である。幾つかの態様において、育毛の促進は、固体のヘアの育毛の促進を含み、顔の毛、脇の毛、脚の毛、胴体の毛、及び腕の毛から選択される育毛を促進すべき領域の育毛の促進を含む。追加的な態様において、本発明のＴＧＦヘアケア組成物を用いて育毛を促進する方法はＳＥＱＩＤＮＯＳ：４４３、４４５、及び４４７から選択されるアミノ酸配列を有するＴＧＦ−ＢＢＰＩを含むパーソナルケア組成物を適用する工程を含む。

他の態様において、本発明は、皮膚疾患を患っている患者の皮膚の外観及び／又は状態を改善する方法を提供する。この方法は本発明のパーソナルケア組成物を提供する工程、治療される患者を提供する工程、及び患者の皮膚に組成物を適用する工程を含む。幾つかの態様において、この皮膚疾患は、乾癬、強皮症、及び皮膚癌から選択される。他の態様において、本発明のＴＧＦスキンケア組成物を用いる皮膚疾患を患っている患者の皮膚の外観及び／又は状態を改善するための方法はＳＥＱＩＤＮＯＳ：４４３、４４５、及び４４７から選択されるアミノ酸配列を含むＴＧＦ−ＢＢＰＩを含むパーソナルケア組成物を含む。

６．０．５修飾変異ＴＮＦα―ＢＢＰＩを含むパーソナルケア組成物
組織壊死因子（ＴＮＦ）のタンパク質ファミリーは大きなサイトカインファミリーである。組織壊死因子アルファ（ＴＮＦα）はＴＮＦファミリーのリガンドの原型のメンバーである。各種免疫細胞により生成され、免疫仲介炎症性疾患において重要な役割を果たす。

ＴＮＦαはＴ−胸腺細胞、Ｂ細胞、滑膜細胞、線維芽細胞、及びマクロファージにより２６ｋＤタンパク質をとして合成される。後に、ＴＮＦα転換酵素（メタロプロテイナーゼ、ＡＤＳＭＳ１７）により切断されて、１７−ｋＤ単体分子になる。これらの分子の３つが生理的な条件下で、２つの異性体に存在している膜結合レセプターにクロスリンクする、非保存的結合の１形態のホモトリマーを形成する。ＴＮＦレセプターＩ（ＴＮＦ−Ｒ１）及びＴＮＦレセプターＩＩ（ＴＮＦ−ＲＩＩ）。このもともとの機能は、数多くの細胞タイプの表面の対応するＴＮＦレセプターに結合することにより、好中球及び単球を刺激して完成の部位及びこれあの細胞を活性化して、微生物を殺すことである。これは、血管内皮膚を局所的に活性化して、血管拡張を引き起こし、浸透圧を上げる。血管内皮膚付着分子（ＩＣＡＭ−１，ＶＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチン）及びＭＨＣクラスＩＩは上方調節されて、前炎症性細胞を誘発し、イムノグロブリン及び補体を生成する。血小板は活性化されて、粘着性が高くなり、小さな血管閉塞が起こり、感染の汚染が起こる。更に、これはマクロファージ及び内皮細胞を誘発して、サイトカインを分泌して、標的細胞のアポトーシスを促進する。ＴＮＦαはタンパク質のパラクリン機能を有しており、ＩＬ−１、ＩＬ−６，及びＧＭ−ＣＳＦ等のプロ炎症性サイトカインの分泌を含む。ＴＮＦαはＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、及びＭＩＰ−１αを含む各種サイトカインの生成も刺激する。最終的に、ＴＮＦαはリウマチ滑膜の成長及び増殖に重要な、血管形成において役割を果たす。

免疫仲介炎症性疾患（ＩＭＩＤ）はＴＮＦαを含む、プロ炎症性サイトカインの異常な生産により開始される。これらの疾患は、リウマチ性関節炎（ＲＡ）、クローン病等の炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、慢性尋常性乾癬、乾癬性関節炎、血管炎、及び硬直性脊髄炎を含む。

免疫仲介炎症性疾患の治療における新たな発展は、このカテゴリにおいて幾つかの疾患の病態生理学における２つの重要なプレーヤーを同定したサイトカインの発現及びシグナリングにおける基礎研究から生じている。それは、ＴＮＦαとインターロイキン−１（ＩＬ−１）である。例えば、両サイトカインはＲＡを用いて患者の血清、滑膜、及び滑液中に高濃度で県シィ津されている。更に、ＴＮＦα及びＩＬ−１は関節炎の実験動物モデルにおいて、関節のダメージを誘発及び増大させることができる。そのような発見がこれらの影響をブロック／中和する作戦を発展させ、生物学的因子による特異標的が近年確立された。この生成物の第一世代はモノクローナル抗体（ｍＡｂ）及び可溶性融合タンパク質を含み、これら全てはサイトカインの結合のためのレセプターと競合する。

今日、米国ＦＤＡは、乾癬及び乾癬性関節炎を含む、各種ＩＭＩＤの治療における臨床使用について、３つのＴＮＦαインヒビター／ブロッカーを承認した。これらは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ成分に結合するＴＮＦレセプターＩＩの完全ヒトケミカルタンパク質であるＥｔａｎｅｒｃｅｐｔ（Ｅｎｂｒｅｌ^（商標）、Ａｍｇｅｎ−Ｗｙｅｔｈ）、ケミカルモノクローナル抗体であるＩｎｆｌｉｘｉｍａｂ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ^（商標）、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）、及び完全長ヒトＩｇＧ１抗ＴＮＦαモノクローナル抗体であるＡｄａｌｉｍｕｍａｂ（Ｈｕｍｉｒａ^（商標）、Ａｂｂｏｔｔ）である。このタンパク質の初期の効果及びこれらの因子の安全プロファイルは、経時的に効果が減少すること、これらの生物医薬因子が高コストであること、及びこれらの因子の適用ルートが限定されていることに問題があると評価された。

Ｂｏｙｍａｎ及びかれの共同研究者により研究された動物モデル（Ｂｏｙｍａｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９：７３１−７３６［２００４］）は乾癬の潜在的な進行において内在するＴ細胞及びＴＮＦαの必須な役割を示した。このモデルにおいて、病状を示さない前乾癬のヒトの皮膚の領域をトランスジェニックＡＧＲ１２９マウスに移植した。このモデルは中和する抗ヒトＮＦαモノクローナル抗体の適用（インフリキシマブ、ｉ．ｖ．）又はＴＮＦレセプター融合タンパク質（Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ，ｓ．ｃ．）は乾癬表現型を劇的に抑制した。これらの結果はＴＮＦαアンタゴニストはＩＭＤＩ疾患の進行に直接影響するという説を支持した。

不幸なことに、認められたＩＭＤＩのいずれかを患っている患者の三分の一以上が抗ＴＮＦ治療から臨床的な利益を得ることができなかった（Ｗｏｎｇｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２６：１２１−１３６［２００８］）。この医療分野を研究するための新規な治療の開発における努力が続けられている。臨床試験において、近年数多くの「スマート」なＴＮＦαアンタゴニストがある、これは、各種抗ＴＮＦモノクローナル抗体、フラグメント化された又は切断されたＴＮＦレセプター分子のペグ抗体を含む。更に、三量体サイトカインのＴＮＦαサブユニットの分解を促進する小分子は生体外の実験結果では良好であったが（Ｈｅｅｔａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ３１０：１０２２−１０２５［２００５］）、臨床への開発は報告されていない。

乾癬は人口の約２．８パーセントが罹患する一般的な皮膚病である（ＬｉｎｄｅｎａｎｄＷｅｉｎｓｔｅｉｎＡｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．１０７：５９５−６０５［１９９９］）おそらく米国において４５０万人が乾癬を患い、１５０万人が中程度から深刻な鱗状乾癬に罹患している。この病気は皮膚の完成炎症であると特徴付けられている。この炎症は、後々痛くて醜いやけどが残る赤くかゆみを伴う皮膚垢の形成を促進する。ＴＮＦαはこれらの形成に重要な役割を担い、炎症のトリガーであるＩＬ−１、ＩＬ−８の合成を誘発するので連続的に存在する。ＴＮＦαの濃度は乾癬患者の影響されていない皮膚よりも乾癬領域において高く、効果的な治療でこの領域の洗浄をすると減少する傾向にある（Ｍｕｓｓｉｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｇｕｌ．Ｈｏｍｅｏｓｔ．Ａｇｅｎｔｓ１１：１１５−１１８［１９９７］）。ＴＮＦαはサイトカイン増殖と血管形成も促進し（Ａｓａｄｕｌｌａｈｅｔａｌ．，Ｄｒｕｇｓｔｏｄａｙ３５：９１３−９２４［１９９９］）、従って、このサイトカインを抑制すると複数ステージにおいて、この病気を中断させることになる。

伝統的に、それらはしばしば全身治療よりも、侵襲の少なく、腎臓又は肝臓不全等の大部分のシリアスな副作用の発生も少なくいので、軽度乾癬の第一線の治療は局所的因子からなる。抗甲状腺薬チオウレイレネス（ｔｈｉｏｕｒｅｙｌｅｎｅｓ）、プロピルチオウラシル、及びメチマゾール等の試薬は、数週間の治療の後に、乾癬患者の多くにおいて、かれらの病状を完治又は完治に近い治療効果を示した。新たな抗ＴＮＦα生物学的製剤である、エンブレル（Ｅｎｂｒｅｌ）、レミケード（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）、及びフミラ（Ｈｕｍｉｒａ）を用いる全身系の治療は軽度から深刻な慢性鱗状乾癬について承認された。このような薬剤で治療された患者は高頻度で大幅な改善が見られ、幾つかの症例では、ほぼ完治している（Ｃｈａｕｄｈａｒｉｅｔａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ３５７：１８４２−１８４７［２００１］；Ｌｅｏｎａｒｄｉｅｔａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４９：２０１４−２０２２［２００３］）。しかし、今日、この疾病の治療は著しく満足されていないし、今日用いられている治療の大部分は、毒性が蓄積することに大いに関係する（Ｇｏｔｔｌｉｅｂｅｔａｌ．，ＪＡｍＡｃａｄＤｅｒｍａｔｏｌ．４８：８２９−８３５［２００３］）。ＴＮＦαブロック剤に関連するリスクは深刻な感染症、悪性化、過敏症、Ｂ型肝炎反応性、脱髄疾患、血球減少症、心不全、及び狼瘡様症候群を含む。更に、治療薬を停止した後に臨床的利益が減少し、患者の少数ではこの生物学的薬品に対する抗体を生成してしまうでの、繰り返ししようしているうちに硬化が限定されるようである。

サイズを小さくして、免疫原性がより小さくなったと推測される遺伝的に改変された修飾変異ＢＢＰＩ等のタンパク質は患者における中和抗体の生成に関する懸念を有意に減らす。抗体又は融合タンパク質と比較して分子量が低いことから、ＢＢＰＩ分子は局所的ルートを介しての輸送がしやすく、又は腹膜注射又は注射以外の輸送方法のような侵襲的な全身系投与を少なくすることができる。

本発明はスキン及び／又はヘアケアに用いる、修飾変異ＢＢＰＩを含むパーソナルケア組成物を提供する。幾つかの態様において、ＴＮＦ−ＢＢＰＩを含むパーソナルケア組成物は育毛を促進し及び／又は皮膚の炎症性疾患を患っている固体の皮膚の状況を改善する。幾つかの態様において、この炎症性皮膚疾患は皮膚炎、湿疹、乾癬、にきび、酒さ、及び蕁麻疹から選択される。幾つかの態様において、皮膚の炎症性疾患は乾癬である。従って、本発明はスキンケア及び／又はヘアケア組成物を提供する。本発明のパーソナルケア組成物に含まれるＴＮＦ−ＢＢＰＩはＴＮＦ−５−ＢＢＰＩの前駆体骨格の等しいキモトリプシンループがＴＮＦ変異ペプチドで置換されており、更にセクション５．４．１及び５．４．２に記載のような少なくとも１つのアミノ酸置換を更に含む修飾変異ＢＢＰＩである。本発明において、修飾変異ＴＮＦ−ＢＢＰＩのＴＮＦαへ結合すると、同属レセプターとの相互作用を回避して、頭皮のＴＮＦα誘発性炎症を抑制して、毛の損失を避けることができる。幾つかの態様において、ＴＮＦαへの修飾変異ＴＮＦ―ＢＢＰＩの結合は皮膚の炎症を少なくして、例えば、乾癬のような本明細書に記載の皮膚の炎症性疾患を患っている患者の皮膚の状態を改善する。しかしながら、本発明を特定のメカニズムに限定することは意図しない。

幾つかの態様において、ＴＮＦ−ＢＢＰＩ組成物に含まれるＴＮＦ変異ペプチドはＲＹＷＱＤＩＰ（Ｔ１；ＳＥＱＩＤＮＯ：４７４）、ＡＰＥＰＩＬＡ（Ｔ２；ＳＥＱＩＤＮＯ：４７５）、ＤＭＩＭＶＳＩ（Ｔ３；ＳＥＱＩＤＮＯ：４７６）、ＷＴＰＫＰＴＱ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８３）、ＡＴＦＰＮＱＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８４）、ＡＳＴＶＧＧＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８５）、ＴＭＬＰＹＲＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８６）、ＡＷＨＳＰＳＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８７）、ＴＱＳＦＳＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８８）、ＴＨＫＮＴＬＲ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８９）、ＧＱＴＨＦＨＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５９０）、ＬＰＩＬＴＱＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５９１）、ＳＩＬＰＶＳＨ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５９２）、ＳＱＰＩＰＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５９３）、及びＱＰＬＲＫＬＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５９４）から選択される。他の態様において、このＴＮＦ変異ペプチドはＳＥＱＩＤＮＯＳ：４８３、４８４、及び４８５から選択される。

変異ＴＮＦペプチドが導入されて等しいキモトリプシンループを置換する、骨格はグリシンマックス（Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ）（ＢＢＩ；ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）由来の大豆インヒビターの骨格又はこれらの成熟又は切断形態（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８５）、ドリコスビフロラス（Ｄｏｌｉｃｈｏｓｂｉｆｌｏｒｕｓ）（ＢＢｄｂ；ＳＥＱＩＤＮＯ：４４９）由来インヒビター、グリシンマックス（Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ）（ＢＢｓｂ３；ＳＥＱＩＤＮＯ：４５０）由来大豆インヒビターＤ−ＩＩ、トレセアセアレンシス（Ｔｏｒｒｅｓｅａ（Ａｍｂｕｒａｎａ）ｃｅａｒｅｎｓｉｓ）（ＢＢｔｃ；ＳＥＱＩＤＮＯ：４５１）由来インヒビター、（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８６）のＢＢＩ−ＡＶ骨格、（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７）のＢＢＩｔ−ＡＶ骨格、（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５２）のＢＢｄｂ−ＡＶ骨格、（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５３）のＢＢｓｂ３−ＡＶ骨格、（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５４）のＢＢｔｃ−ＡＶ骨格、（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４０）のＢＢＩｔ−ＶＥＧＫ骨格、（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４１）のＢＢＩｔ−ＶＥＧＴ骨格、及び（ＳＥＩＤＮＯ：６４２）のＢＢＩｔ−ＶＥＧＫＤ骨格から選択される。更に、任意のＰｒａｋａｓｈｅｔａｌ．上記に記載の野生型ＢＢＰＩ前駆体骨格も変異ＢＢＰＩ骨格に用いることができる。幾つかの態様において、このＶＥＧＦ−ＢＢＰＩの骨格はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７である。幾つかの態様において、修飾変異ＴＮＦ−ＢＢＰＩの主鎖はセクション５．４．１に記載のように、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の変異ＢＢＰＩの１、４、５、１１、１３、１８、２５、２７、２９、３１、３８、４０、５０、５２、５５、及び６５に等しい位置の少なくとも１つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む。他の態様において、修飾変異ＴＮＦ−ＢＢＰＩの主鎖は、セクション５．４．２に記載のように、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、又は８つのアミノ酸置換の組み合わせを含む。

他の態様において、修飾変異ＦＧＦ−ＢＢＰＩの主鎖はＳＥＱＩＤＮＯ：１８７．の等しい位置における１３Ｉ−２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｋ−２９Ｐ−５２Ｋ、１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ａ−２９Ｒ−３１Ｅ−４０Ｋ−５０Ｑ−５２Ｑ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ａ−２９Ｒ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｒ−５２Ｌから選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含む。

幾つかの態様において、本発明のパーソナルケア組成物は等しいキモトリプシンループがＳＥＱＩＤＮＯＳ：４７４、４７５、及び４７６から選択されるＴＮＦ変異ペプチドで置換されており、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の骨格を有するＢＢＰＩを含む。このＢＢＰＩはこの置換の組み合わせは１３Ｉ−２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａである。

幾つかの態様において、このパーソナルケア組成物はＳＥＱＩＤＮＯＳ：６４７、６４８、及び６４９のＴＮＦ−ＢＢＰＩから選択されるＴＮＦ−ＢＢＰＩを含む。

幾つかの態様において、本発明はＴＮＦに結合するＴＮＦ−ＢＢＰＩを含むパーソナルケア組成物を提供する。代替的な態様において、ＴＮＦへのＴＮＦ−ＢＢＰＩの結合はＴＮＦの下流活性をブロックする。幾つかの態様において、この組成物は炎症を調節する。

幾つかの態様において、修飾変異ＢＢＰＩ―ＴＮＦを含むこのパーソナルケア組成物はスキンケアに用いられる。幾つかの態様において、このスキンケア組成物は皮膚疾患を患っている患者の皮膚の外観及び／又は状態を改善するために用いる。従って、幾つかの態様において、スキンケアに用いるパーソナルケア組成物は化粧組成物を含む。幾つかの態様において、この皮膚疾患は炎症性皮膚疾患である、幾つかの態様において、この炎症性皮膚疾患は乾癬である。

幾つかの態様において、ＴＮＦ−ＢＢＰＩを含むこのパーソナルケア組成物はスキンクリーム、ローション、スプレー、乳液、コロイド懸濁液、泡、エアロゾル、液体、ゲル、セラ、及び固形物から選択されるスキンケア組成物である。他の態様において、このスキンケア組成物は、保湿性ボディーウォッシュ、ボディーウォッシュ、抗菌性洗剤、スキン保護クリーム、ボディーローション、顔用クリーム、保湿クリーム、顔用クレンジング乳液、顔用ゲル、顔用美容液、界面活性剤ベース洗顔剤、顔用ピーリングゲル、抗ニキビトリートメント、顔用化粧水、ピーリングクリーム、顔用マスク、アフターシェービングローション、プレシェーブローション、日焼け用組成物、サンスクリーン、脱毛剤、発毛抑制剤、及び放射線保護剤を含む。放射線保護剤は水耐性のないサンスクリーン、水耐性の高いサンスクリーン、及びシリコン中水サンスクリーンから選択されるサンスクリーンである。

ＴＮＦ−ＢＢＰＩを含むスキンケア組成物は任意で局所的に適用する市販組成物、抗菌治療、抗ニキビ処理、皮膚保護剤、サンスクリーン、デオドラント、及び発汗抑制剤を任意で含む。他の態様において、このスキンケアケア組成物はライトニングスキンケアノート、赤みの減少、皮膚のトーンが暗くなる又は着色が進むのを避けることができる。

本発明は化粧組成物であるパーソナルケア組成物も提供する。幾つかの好適な態様において、この化粧組成物はマスカラ、圧縮粉末ファンデーション、及びファンデーションから選択される。幾つかの好適な態様において、このメイクアップ組成物はスキンケア１つの顔料を含む。

幾つかの好適な態様において、少なくとも１つの顔料を含むこのメイクアップ組成物は非ウォータープルーフマスカラ、ウォータープルーフマスカラ、ボリュームミングマスカラ、長さを増すマスカラ、カールを増すマスカラ、無水ウォータープルーフマスカラ、水ベースマスカラから選択されるマスカラ、及びアイラッシュ又はアイブロウトリートメントである。

更なる態様において、このメイクアップ組成物はルースパウダー、頬紅、アイシャドー、及びブロンンジングパウダーから選択される圧縮パウダーファンデーションである。更なる態様において、このメイクアップ組成物オイル中水ファンデーション、シリコン中水ファンデーション、水中オイルファンデーション、無水メイクアップスティック、及びクリーム乃至粉末ファンデーションから選択されるファンデーションである。

幾つかの態様において、このパーソナルスキンケア組成物は本明細書で定義された修飾変異ＴＮＦ−ＢＢＰＩ及び物理的に許容可能な担体又は添加物を含む。好ましくは、ＴＮＦ−ＢＢＰＩは組成物の総重量に基づいて約０．０００１％乃至約５％の量で存在する。ＴＮＦ−ＢＢＰＩは組成物の総重量に基づいて、約０００１％乃至約０．５％の量で存在することも好ましい。この組成物は栄養クリーム又はローション等の乳液媒体、安定化ゲル又は分散システム。トリートメント美容液、脂質輸送システム、局所的パック又はマスク、シャンプー又はボディーウォッシュ等の界面活性剤ベースクレンジングシステム、エアロゾル又はスプレー式分散体又は乳液、ヘア又はスキンコンディショナー、スタイリング剤、又は顔料を含むメイクアップ等の製品、他の好適なメイクアップ及び化粧製品の形態でよい。幾つかの態様において、この担体は好ましくは、水、プロピレングリコール、エタノール、プロパノール、グリセロール、ブチレングコール、及びポリエチレングリコールからなる群より選択される少なくとも１種である。

他の態様において、本発明はヘアケアに用いる、ＴＮＦ変異ペプチドを含む修飾変異ＢＢＰＩを含むパーソナルケア組成物を提供する。

幾つかの態様において、このヘアケア組成物は乾癬を患っている患者における頭皮の外観及び／又は状態を改善するために用いることができる。

１つの態様において、このヘアケア組成物はシャンプー、コンディショナー、ヘアスタイリング組成物、ヘアカラー、パーマネントウェーブ製剤、クリーム、ゲル、ムース、スプレー、乳液、コロイド懸濁液、液体、泡、及び固形物から選択される。

幾つかの態様において、このヘアケア組成物は更に放射性保護剤も含む。パーソナルスキンケア組成物において説明したように、この放射線保護剤は非水耐性サンスクリーン、高水耐性サンスクリーン、及びシリコン中水サンスクリーンから選択されるサンスクリーンである。他の態様において、この放射線保護剤は非水耐性サンスクリーン、高水耐性サンスクリーン、及びシリコン中水サンスクリーンから選択されるサンスクリーンである。

幾つかの態様において、このパーソナルケアヘアケア組成物は本明細書で定義される修飾変異ＶＥＧＦ−ＢＢＰＩ及び物理的に許容可能な担体又は添加剤を含む。好ましくは、このＶＥＧＦ−ＢＢＰＩは組成物の重量に基づいて約０．０００１％乃至約５％の量で存在する。このＶＥＧＦ―ＢＢＰＩは組成物の重量に基づいて約０．００１％乃至約０．５％の量で存在することも好ましい。この組成物は栄養クリーム又はローション等の乳化媒体、安定化ゲル又は分散システム、トリートメント乳液、脂質輸送システム、局所的パック又はマスク、シャンプー又はボディーウォッシュのような界面活性剤ベースクレンジングシステム、エアロゾル又はスプレー式分散媒体又は乳液、ヘア又はスキンコンディショナー、スタイリング剤、又はメイクアップ等の顔料含有製品、並びに他の好適なメイクアップ及び化粧製品の形態でよい。幾つかの態様において、この担体は好ましくは、水、プロピレングリコース、エタノール、プロパノール、グリセロール、及びプロピレングリコールからなる群より選択される少なくとも１つである。

６．１．１製剤
追加的な好適な態様において、本発明は本明細書で定義された少なくとも１つの修飾変異ＢＢＰＩ及び物理的に許容可能な担体及び添加剤を含む化粧及び／又はパーソナルケア組成物を提供する。好ましくは、この組成物は組成物の総重量に基づき約０．０００１％乃至約５％の量で存在する。この組成物は組成物の重量に基づいて、約０．００１％乃至約０．５％の量で存在することも好ましい。この組成物は栄養クリーム又はローション等の乳化媒体、安定化ゲル又は分散システム、トリートメント美容液、脂質輸送システム、局所的パック又はマスク、シャンプー又はボディーウォッシュ等の界面活性剤ベースクレンジングシステム、エアロゾル又はスプレー分散媒体又は乳液、ヘア又はスキンコンディショナー、スタイリング剤又はメイクアップ等の顔料含有製品の形態でよい。好ましくは、この担体は水、プロピレングリコース、エタノール、プロパノール、グリセロール、ブチレングリコール、及びポリエチレングリコールから選択される担体である。

本発明は数多くのパーソナルケア組成物に用いることを意図する。本発明発明を特定の形態又はタイプの組成物に限定することは意図しない。以下の説明は例示的なものであり、以下の発明を含む組成物を限定するものではない。

乳液は習慣的に、一般的な化粧品の１つのグループである。用語、「乳液」はお互いが限定的な限度でのみ不相溶又は相溶である２つの異種の液体システムを本明細書では意味する。通常これらは「相」と言われる。１つのフェーズは通常液滴である（即ち、「分散された」、「不連続」、又は「内部」相）であり、他の液体形態は連続（即ち、「密着性」又は「外部」）相である。製品のあまり一般的でない形態は多相乳液（即ち、分散（又は不連続）相が更なる分散相の液滴部分からなる、水／オイル／水（Ｗ／Ｏ／Ｗ）及びオイル／水／オイル（Ｏ／Ｗ／Ｏ）乳液）を含む。

もし、オイル相が最終的に水相中に分散されるなら、これは水中オイル乳液（Ｏ／Ｗ乳液、例えば、ミルク）である。Ｏ／Ｗ乳液の特徴は水により決定される。これらの乳液は皮膚上でつやを消すというよりも、油っぽくなり、Ｗ／Ｏ（オイル中水）乳液よりも急速に吸収される。

当業者は化粧及び／又は皮膚科で用いる安定なＷ／Ｏ製剤の調製の数多くのオプションに精通している。そのような製剤は室温乃至皮膚温度の範囲で塗りやすくなるクリーム及び軟膏、並びにこの温度範囲でより流安くなるローション及びミルクを含む。

乳液のタン訂正はその粘度、特に外相の粘度に依存している。乳液は、最終的に分散された液滴が凝集して相対的に大きな凝集体を形成し、及び液滴が接触して融合することから不安定になる。この工程は「凝集」と呼ばれている。「液体」（＝流動可能）の乳液は各種化粧品も用いられている（例えば、スキンケアローション、クレンジングローション、フェイスローション、ハンドローション等）。これらの組成物は通常約２０００ｍＰａ乃至約１０，０００ｍＰａの粘度を有している。液滴の考えられるより大きな移動性がより早い凝集を促進することから、流動可能乳液の安定性は特に大切である。

現在一般的に用いられている液体は濃縮剤を含み、相対的に高い電解質濃度のために不安定である。このことは、組成物の相分離において明らかにされている。しかしながら、幾つかの態様において、他の物理的、化学的、又は生理的それらの性質を利用するために、特定の電解質（例えば、水可溶性ＵＶフィルム）を用いることが好ましい。多くのケースにおいて、好適な乳液システムの選択がある程度改善されるが、しばしば他の不都合も生じる。

例えば、幾つかの不都合は、乳化剤、結局のところ、化学物質が、アレルギー反応又は使用者の過敏症（即ち、過感受性）に基づくアレルギーのきっかけとなるという事実に基づく結果となる。習慣的に化粧乳液は通常全くリスクがないが、何人かの使用者に対しては「低刺激性」の組成物であることが必要及び／又は好ましい。即ち、何人かの特に感受性の高い固体には、特定の皮膚病が特定の乳液及び同時に太陽光に曝されることによって引き起こされる。従って、当業者に知られているように、幾つかの組成物において、特定の乳化剤があまり好ましくなく及び／又は避けられるべきである。

乳化剤無添加製剤を調製することは可能である。例えば、いくつかの製剤は分散された水滴を含むオイル相（即ち、これはＷ／Ｏに近い乳液）を有する。そのようなシステムは時々水分散系（ｈｙｄｒｏｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎｓ）または脂質分散系（ｌｉｐｏｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎｓ）と呼ばれ、かなり長い間消費者に使用されてきた。

化粧製剤技術において、特定のマイルドな乳化剤を選択していることから、乳化剤を全く用いないことは必要なことではないし、可能なことでもない。

幾つかのリポソーム態様において、リポソームは水及び１つ以上の機能又は活性成分を維持することができる脂質二重層媒体を形成することができる１つ以上の成分を含む。そのような脂質二重層を形成することができる成分の非限定的な例としては、リン脂質、水素化ホスファチジルコリン、レセクチン、コレステロール、及びスフィンゴ脂質を含む。好適なリポソームの例としては、ａ）リポイドリポソーム０００３（水及びレクチン及びグリセリンからなる）、ｂ）リポイドリポソーム０３００（水及びホスファチジルコリンからなる）、ｃ）リポイドリポソーム０１１１（水、イチョウの葉の抽出物、変性アルコール、水酸化レクチン、及びコレステロールからなる）、ｄ）抗刺激性リポソーム（水、コーラの木の抽出物、ビサボロール、及びリン脂質からなる）、ｅ）ビタミンＣ及びＥリポソーム（水、リン脂質、酢酸トコフェロール、及びパルミチン酸アスコルビルからなる）、ｆ）安定リポソーム（水、ブチレングリコール、ピルビン酸塩、（リンゴ）抽出物、リン脂質、酢酸トコフェロール、及びカルボマーからなる）、及びｇ）保湿性リポソーム（水、ＰＣＡナトリウム、酢酸トコフェロール、キサンタンゴム、アルギニン、リジン、グリシン、及びプロリンからなる）があるがこれらに限定されない。

他の態様において、本発明のパーソナルケア組成物は本明細書で提供される骨格に加えて少なくとも１つの活性成分を含む。本発明のパーソナルケア組成物用いられる数多くの活性成分は当業者に知られている。即ち、任意の好適な活性成分又は好適な活性成分の組み合わせが本発明に用いられることを意図する（例えば、ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＭａｔｅｒｉａｌｓ、ＮｏｒｔｈＡｍｅｒｉｃａｎ及びＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＥｄｉｔｉｏｎｓ、ｐｕｂｌｉｓｈｅｄｂｙＭＣＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．［２００３］参照）。例えば、幾つかの態様において、本明細書におけるパーソナルケア組成物は組成物の重合に基づき約０．０００１％乃至約２０％のスキンケア活性成分を含む。他の態様において、このパーソナルケア組成物は組成物の重合に基づき約０．００１％乃至約０．５％のスキンケア活性成分を含む。更なる態様において、このパーソナルケア組成物は組成物の重合に基づき約０．０１％乃至約２％のスキンケア活性成分を含む。

リポソームを介して提供することができる機能又は活性成分の非限定的な例としては、当業者に知られている、ビタミン及びそれらの誘導体、抗酸化剤、タンパク質及びペプチド、角質溶解剤、バイオフラボノイド、テルペノイド、フィトケミカル及び植物の抽出物、海又は発酵させたものを含む。好適な態様において、この組成物は皮膚癌又はヘアケアのための活性成分を更に含む。活性成分は当業者に知られているような幅広い各種成分を含むことができる（例えば、ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＭａｔｅｒｉａｌｓ、ＮｏｒｔｈＡｍｅｒｉｃａｎ及びＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＥｄｉｔｉｏｎｓ、（２００３）、ｐｕｂｌｉｓｈｅｄｂｙＭＣＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ参照）。好ましくは、そのような活性剤はトコフェロール及びアスコルビン酸誘導体等の抗酸化剤、バイオフラボノイド、テルペノイド、合成等をしたもの、ビタミン及びビタミン誘導体、ＡＨＡｓ及びＢＨＡｓ及びそれらの反応生成物等のヒドロキシ及びプロヒドロキシ酸及びそれらの誘導体、ペプチド及びポリペプチド及びグリコペプチド及び脂質添加されたペプチド等のそれらの誘導体、ヒートショックプロテイン及びケラチノサイト、プロテアーゼ、ＭＭＰインヒビター、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、及びスーパオキシド・ジスムターゼ等の酵素及び酵素インヒビター及びそれらの誘導体、アミノ酸及びそれらの誘導体、キノコ等のバクテリア、糸状菌、及び酵母発酵生成物及びそれらの生成物、藻類及び海草及びそれらの生成物、フィトステロール及び植物及び植物の部分的抽出物及びそれらの誘導体及びリン脂質及びそれらの誘導体、亜鉛ピリチオン等の抗フケ成分及びそれらを含む輸送システムを含むがこれらに限定されない。

幾つかの好適な態様において、このスキンケア活性剤はビタミンＢ３成分、パンテノール、ビタミンＥ，ビタミンＥアセテート、レチノール、レチニールプロピオネート、レチニールパルミテート、レチノイド酸、ビタミンＣ、テオブロミン、アルファヒドロキシ酸、ファルネソール、フィトラントル（オールｐｈｙｔｒａｎｔｒｉｏｌ）、サリチル酸、パルミチルからなる群より選択される。幾つかの好適な態様において、このビタミンＢ３成分はナイアシンアミドである。幾つかの態様において、本明細書で提供される組成物は重量に基づいて、スキンケア活性成分を、約０．０００１％乃至約２０％、好ましくは約０．００１％乃至約０．５％、より好ましくは約０．０１％乃至約１％含む。

前述のビタミンＢ３化合物の例示的な誘導体、ニコチン酸の非血管拡張性エステル、ニコチニルアミノ酸、カルボン酸のコチニルアルコールエステル、ニコチン酸窒素酸化物、及びニコチンアミドの窒素酸化物を含むニコチン酸エステルを含む。好適なニコチン酸はＣ１乃至Ｃ２２のニコチン酸エステル、より好ましくはＣ１乃至Ｃ６アルコールのニコチン酸エステルを含む。これらの態様において、このアルコールは好ましくは直鎖、又は分岐鎖でよく、環状でも非環式でもよく、飽和でも不飽和でよく（芳香族を含む）、置換されていてもされていなくてもよい。このエステルは好ましくは非血管拡張性である。

ニコチン酸の非血管拡張性エステルはニコチン酸トコフェロール及びイノシトールヘキサニコチネートを含み。ニコチン酸トコフェロールが好ましい。ビタミンＢ３化合物のより完璧な説明はＷＯ９８／２２０８５に記載されている。好適なビタミンＢ３化合物はナイアシンアミド及びトコフェロールニコチネートを含む。

追加的な態様において、このスキンケア活性化合物は少なくとも１つのレチノイドを含む。このレチノイドは好ましくは、レチノール、レチノールエステル（レチニルパルミテート、レチニルアセテート、レチニルプトパネートを含むレチノールのＣ２乃至Ｃ２２アルキルエステル）、レチナール及び／又は（全てのトランスレチノイン酸及び／又は１３−ｃｉｓレチノイン酸を含む）レチノイン酸、より好ましくはレチノイン酸以外のレチノイドを含む。これらの化合物は当業者に知られており、数多くの製造元から市場で入手可能である（例えば、Ｓｉｇｍａ及びＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）、好適なレチノイドは、レチノール、レチニルパルミテート、レチニルアセテート、レチニルプロピオネート、レチナール、レチノイン酸、及びこれらの組み合わせを含む。幾つかの態様において、このレチノイドは実質的に精製された物質として含まれている。他の態様では、天然資源（例えば、植物）から好適な物理的手段及び／又は化学的に単離され、抽出物として得られる。レチノイドが本明細書における組成物に含まれる場合、約０．００５％乃至約２％、好ましくは約０．０１％乃至約１％、含まれる、レチノールが約０．０１％乃至約０．１５％含まれる。レチノールエステルは約０．０１％乃至約２％の量で含まれる（例えば、約１％）。

本発明の更なる態様において、抗酸化剤が本発明の組成物に含まれる。本発明の更なる態様において、抗酸化剤がパーソナルケア組成物に取り込まれる。あらゆる適した抗酸化剤は本発明の発明のパーソナルケア組成物に用いることができる。適した抗酸化剤はアミノ酸（例えば、グリシン、ヒスチジン、トリプシン又はトリプトファン）、及びそれらの誘導体、イミダゾール（例えば、ウロカニン酸）及びそれらの誘導体、ペプチド（例えば、Ｄ，Ｌ−カルノシン、Ｄ−カルノシン、及びＬ−カルノシン）及びそれらの誘導体（例えば、アンセリン）、カロテノイド、カロテン類（例えば、α−カロテン、β−カロテン、及びγ−リコペン）及びそれらの誘導体、クロゲン酸及びそれらの誘導体、アウロチオグルコース、プロピルチオウラシル及び他のチオール（例えば、チオオレドキシン、グルタチオン、システイン、シスチン、シスタミン、及びグリコシル、Ｎ−アセチル、メチル、エチル、プロピル、アミル、ブチル、及びラウリル、パルミトイル、オレイル、ｇ−リノレイル、コレステイル及びこれらのグリセリルエーテル）及びそれらの塩、ジラウリルチオジプロピオネート、ジステアリルチオジプロピオネート、チオジプロピオン酸及びそれらの誘導体（例えば、エステル、エーテル、ペプチド、脂質、ヌクレオチド、ヌクレオシド、及び塩）及びスルホキシイミン化合物（例えば、ブチオニンスルホキシイミン、ホモシステインスルホキシイミン、ブチオニンスルホン、ペンタ−、ヘキサ−、及びヘプタチオニンスルホキシイミン）、僅かな耐量（例えば、通常、ｐｍｏｌ乃至ｍｍｏｌ／ｋｇ）、ケラチン化因子（例えば、α−ヒドロキシ脂肪酸、パルミチン酸、フィチン酸、及びラクトフェリン）、α−ヒドロキシ酸（例えば、クエン酸、酪酸、マレイン酸）、それのフミン酸、胆汁酸、胆液抽出物、ビリルビン、ビリベルジン、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、及びそれらの誘導体、不飽和脂肪酸及びそれらの誘導体（例えばリノレン酸、リノール酸の酸の油酸）、葉酸及びそれらの誘導体、ｆｕｒｆｕｒｙｌｉｄｅｎｅｓｏｒｂｉｔｏｌ及びそれらの誘導体、ユビキノンとユビキノールとそれらの誘導体、ビタミンＣ及びそれらの誘導体（例えばナトリウムアスコルビン酸リン酸、アスコルビン酸パルミテート、Ｍｇアスコルビン酸リン酸、及びアスコルビン酸酢酸）、トコフェロールと誘導体（例えばビタミンＥ酢酸塩）、ベンゾイン樹脂のｃｏｎｉｆｅｒｙｌ安息香酸エステル、フェルラ酸、ｆｕｒｆｕｒｙｌｉｄｅｎｅｇｌｕｃｉｔｏｌ、カルノシン、ブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、ｎｏｒｄｉｈｙｄｒｏｇｕａｉａｃｉｃ酸、ノルジヒドログアヤレト酸、トリヒドロキシブチロフェノン、尿酸及び誘導体、マンノース及びその誘導体、亜鉛及びそれらの誘導体（例えば、ＺｎＯ、ＺｎＳＯ４）、セレニウム及びその誘導体（例えば、セレレノモチオニン）、スチルベン及びその誘導体（例えば、酸化スチルベン、トランス酸化スチルベン）、及びそれらの誘導体（例えば、塩、エステル、エーテル、糖、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ペプチド、及び脂質）である。

幾つかの態様において、本発明の組成物中の１つ以上の抗酸化剤は製品の総重量に基づいて、約０．０１％乃至約３０％、好ましくは約０．０５％乃至約２０％、より好ましくは約１乃至約１０％の範囲で含まれる。追加的な態様において、ビタミンＥ及び／又はその誘導体は抗酸化剤として用いられる。好適な含量の範囲は、製剤の総重量に基づいて約０．００１乃至約１０％である。しかしながら、様々な濃度が本発明の組成物に用いることができるので、本発明を特定の抗酸化剤の濃度に限定することは意図しない。

更なる幾つかの追加的な態様において、前記有効成分は、さらに有利には、カテキン類及びカテキン類の胆汁酸エステル類ツバキ科植物の葉、特にＣａｍｅｌｌｉａｓｉｎｅｎｓｉｓ種（緑茶）の葉などのカテキン類またはカテキン類の胆汁酸エステルを含有する植物または植物の部分からの水抽出物もしくは有機抽出物を含む群から選択される。それらの代表的な成分（例えば、ポリフェノール類もしくはカテキン類、カフェイン、ビタミン類、糖類、ミネラル類、アミノ酸類、脂質類）を含む。

幾つかの態様において、カテキンは水素化フラボン類またはアントシアニジン類と見なされ、「カテキン」の誘導体（カテコール、３，３′，４′，５，７−フラバンペントール、２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）クロマン−３，５，７−トリオール）である化合物群である。エピカテキン（（２Ｒ，３Ｒ）−３，３′，４′，５，７−フラバンペントール）も、本発明に関して有利なカテキン類である。

追加的な態様において、カテキンを含有する植物抽出物、特には例えばカメリア種の植物の葉などの緑茶の抽出物、特に詳細には茶であるＣａｍｅｌｌｉａｓｉｎｅｎｉｓ、Ｃ．ａｓｓａｍｉｃａ、Ｃ．ｔａｌｉｅｎｓｉｓ及びＣ．ｉｒｒａｗａｄｉｅｎｓｉｓならびに例えばＣａｍｅｌｌｉａｊａｐｏｎｉｃａとこれらの交配種からの抽出物も有利である。

更なる態様において、好ましい有効成分には、ポリフェノール類及び（−）−カテキン、（＋）−カテキン、没食子酸（−）−カテキン、没食子酸（−）−ガロカテキン、（＋）−エピカテキン、（−）−エピカテキン、没食子酸（−）−エピカテキン、（−）−エピガロカテキン、没食子酸（−）−エピガロカテキンの群からのカテキン類もある。

幾つかの好適な態様において、幾つかの追加的な態様において、フラボン及びそれの誘導体（総称して「フラボン類」と称することも多い）も、本発明に関して有利な有効成分である。それは、下記の基本構造を特徴とする（置換位置を示してある）。

本発明によるパーソナルケア組成物において好ましく使用可能な比較的重要なフラボン類の一部を下記の表に示す。しかしながら、本発明をこれらの特定のフラボノイドに限定することは意図しない。

実際にはフラボン類は、グリコシル化型であるのが普通である。

幾つかの態様において、本発明のパーソナルケア組成物は、少なくとも１つの下記一般構造式を有するフラボノイドを含む。

式中、Ｚ_１〜Ｚ_７は互いに独立に、Ｈ、ＯＨ、アルコキシ及びヒドロキシアルコキシからなる群から選択され、そのアルコキシ及びヒドロキシアルコキシ基は分岐または未分岐であることができ、炭素原子１〜１８個を有し；Ｇｌｙはモノ及びオリゴグリコシド基の群から選択される。

幾つかの代替的な態様において、本発明のパーソナルケア組成物は、少なくとも１つの下記一般構造式を有するフラボノイドを含む。

式中、Ｚ_１〜Ｚ_６は互いに独立に、Ｈ、ＯＨ、アルコキシ及びヒドロキシアルコキシからなる群から選択され、そのアルコキシ及びヒドロキシアルコキシ基は分岐または未分岐であることができ、炭素原子１〜１８個を有し；Ｇｌｙはモノ及びオリゴグリコシド基の群から選択される。

幾つかの態様において、本発明のパーソナルケア組成物の幾つかに用いられるフラボノイドグリコシドは以下の構造式を有する：

式中、Ｇｌｙ_１、Ｇｌｙ_２及びＧｌｙ_３は互いに独立に、モノグリコシド基である。Ｇｌｙ_２及びＧｌｙ_３はさらに、個別または一体となって、水素原子による飽和を表すこともできる。好ましくは、Ｇｌｙ_１、Ｇｌｙ_２及びＧｌｙ_３は互いに独立に、ヘキソシル基、特にはラムノシル基及びグルコシル基の群から選択される。しかしながら、他のヘキソシル基、例えばアロシル、アルトロシル、ガラクトシル、グロシル、イドシル、マンノシル及びタロシルも、状況によっては有利に使用可能なこともある。ペントシル基を用いることが本発明により有利である場合もある。本発明に関して、α−グルコシルルチン、α−グルコシルミリセチン、α−グルコシルイソケルシトリン、α−グルコシルイソケルセチン及びα−グルコシルケルシトリンからなる群からのフラボングリコシドを選択することが特に有利である。特に好ましいものは、α−グルコシルルチンである。

更なる幾つかの追加的な態様において、本発明のパーソナルケア組成物は、少なくとも１つのナリンギン（アウランチン（ａｕｒａｎｔｉｎ）、ナリンゲニン−７−ラムノ−グルコシド）、ヘスペリジン３′，５，７−トリヒドロキシ−４′−メトキシフラバノン−７−ルチノシド、ヘスペリドシド、ヘスペレチン−７−Ｏ−ルチノシド）、ルチン（３，３′，４′，５，７−ペンタヒドロキシフラボン−３−ルチノシド、ケルセチン−３−ルチノシド、ソフォリン（ｓｏｐｈｏｒｉｎ）、ビルタン（ｂｉｒｕｔａｎ）、ルタビオン（ｒｕｔａｂｉｏｎ）、タウルチン、フィトメリン（ｐｈｙｔｏｍｅｌｉｎ）、メリン）、トロキセルチン（３，５−ジヒドロキシ−３′，４′，７−トリス（２−ヒドロキシエトキシ）フラボン−３−（６−Ｏ−（６−デオキシ−α−Ｌ−マンノピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシド））、モノオキセルチン（３、３′，４′，５−テトラヒドロキシ−７−（２−ヒドロキシエトキシ）フラボン−３−（６−Ｏ−（６−デオキシ−α−Ｌ−マンノピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシド））、ジヒドロロビネチン（ｄｉｈｙｄｒｏｒｏｂｉｎｅｔｉｎ）（３，３′，４′，５′，７−ペンタヒドロキシフラバノン）、タキシフォリン（ｔａｘｉｆｏｌｉｎ）（３，３′，４′，５′，７−ペンタヒドロキシフラバノン）、エリオジクチオール−７−グルコシド（３′，４′，５，７−テトラヒドロキシフラバノン−７−グルコシド）、フラバノマレイン（ｆｌａｖａｎｏｍａｒｅｉｎ）（３′，４′，７，８−テトラヒドロキシフラバノン−７−グルコシド）及びイソケルセチン（３，３′，４′，５，７−ペンタヒドロキシフラバノン−３−（β−Ｄ−グルコピラノシド）を含む。ユビキノン類及びプラストキノン類から有効成分を選択することも有利である。ユビキノン類は、下記構造式により特徴付けられる。

ユビキノン類は、非常に広く分布することから、最も研究の行われている生体キノン類である。ユビキノン類は、Ｑ−１、Ｑ−２、Ｑ−３などのように側鎖に連結したイソプレン単位数に応じて呼ばれたり、あるいはＵ−５、Ｕ−１０、Ｕ−１５のように炭素原子数に応じて呼ばれる。それらは好ましくは、一定の鎖長で生じるものであり、例えば一部の微生物及び酵母ではｎ＝６である。ヒトを含むほとんどの哺乳動物では、Ｑ１０が支配的である補酵素Ｑ１０が特に有利であり、それは下記構造式を特徴とする。

プラストキノン類は下記一般構造式を有する。

プラストキノン類は、イソプレン基の数ｎにおいて異なり、それに従って例えばＰＱ−９（ｎ＝９）と称する。さらに、キノン環上の置換基が異なる他のプラストキノン類が存在する。

更なる態様において、本発明は体臭防止剤（デオドラント）及び／又は制汗剤として用いるのに適した製剤を提供する。これらの製剤において従来使用されている任意の活性成分も本発明の各種態様に用いることができる。そのような製剤において従来使用されている追加的な成分も本発明の各種態様に用いることができる。そのような活性成分及び不活性成分の例は、臭気遮へい物（例えば、香料）、臭気吸着剤（例えば、ＤＥ−Ｐ４００９３４７に記載のフィロシリケート並びにモントモリロナイト、カオリナイト、イライト、ベイデライト、ノントロナイト、サポナイト、ヘクトライト、ベントナイト、スメクタイト、及びリシノール酸の亜鉛塩）を含むがこれらに限定されない。本発明の幾つかの態様において、そのような製剤における活性成分（即ち、１つ以上の成分）は重量に基づいて約０．００１％乃至約３０％、より好ましくは約０．０５％乃至約２０％、最も具体的な範囲は製剤の総重量に基づいて約１％乃至約１０％である。

いくつかの態様において、本発明の組成物は、必要な物質及び／又は追加的他の物質の公的な量を皮膚又はヘアに適用することを可能にするための、局所適用に好適な皮膚用医薬品として使用可能な担体を安全且つ有効量含む。従って、幾つかの態様において、前記キャリアは希釈、分散、溶媒又はこれらの化合物が選択された標的に好適な濃度で適用又は分散することを確実にさせるために必要な成分として作用する。

更なる態様において、本明細書で述べる１つ以上の有効量の化合物も爪及びヘア等の角質物質に適用するために組成物中に含まれる。前記組成物はヘアスプレー組成物、ヘアスタイリング組成物、ヘアシャンプー及び／又はコンディショニング組成物、ヘア成長を調節するために提供される組成物、及び脂漏症、皮膚炎、及び／またはふけを治療する目的で適用される組成物を含むがこれらに限定されない。

更なる追加的な態様において、本明細書で述べる１つ以上の化合物の有効量は皮膚又はヘアへの局所適用に好適な量で組成物中に含まれる。これらの組成物は任意の好適な形態で提供される。クリーム、ローション、ゲル、懸濁分散体、ミクロエマルジョン、ナノ分散体、ミクロスフィア、ハイドロゲル、エマルジョン（例えば、多相乳液のほか水中油型及び油中水型乳液）、及び多層ゲル及び同種のもの（例えば、参照により本明細書に援用される、Ｓｃｈｌｏｓｓｍａｎｅｔａｌ．、ＴｈｅＣｈｅｍｉｓｔｒｙ及びＭａｎｕｆａｃｔｕｒｅｏｆＣｏｓｍｅｔｉｃｓ、［１９９８］）。幾つかの態様において、前記組成物は水溶液又はシリコン化合物として製剤化される、他の態様において、それらは水性の連続相中に１つ以上の油相を含む乳液（又は油相中に水相を含む乳液）として製剤化される。

本発明に用いられるキャリアのタイプは、組成物の製品形態に依存する。キャリアは個体、準個体、又は液体でよい。好適なキャリアは、液体、準固形（例えば、乳液、ローション、ゲル、スティック、軟膏、及びペースト）、スプレー、及びムースを含む。好適なキャリアは、ローション、クリーム、又はゲルであり、より好ましいものは、十分な密度を有し粒子の沈殿を起こさないようにするものである。幾つかの態様において、前記キャリアは不活性物質である。他の態様において、それは皮膚用医薬品としての利点を有する。幾つかの態様において、前記キャリアは直接皮膚及び／又はヘアに適用される。他の態様において、前記キャリアは織布及び不織布を介して適用される。更なる他の態様において、前記キャリアはパッチ、マスク、又はラップの形態を有する。更なる態様において、前記キャリアはエアロゾル形態であるか、又の他の形態で皮膚及び／又はヘアにスプレーされるか、投入される。選択されたキャリアは本明細書で述べる必須の化合物と物理的及び化学的に相溶性を有し、安定性、効果、又は本発明の組成物を用いることによる他の利益を過度に与えないものである。

好適なキャリアは皮膚用医薬品として使用可能な、親水性の希釈剤である。好適な親水性希釈剤は、水、Ｃ２−Ｃ１０、好ましくはＣ２−Ｃ６、好ましくはＣ３−Ｃ６の１水酸基を有するアルコール等の有機親水性希釈剤、及びプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、グリセロール、ブチレングリコール、１，２，４−ブタネトリオール、ソルビトールエステル、１，２，６−ヘキサノール、ペンチレングリコール、ヘキシレングリコール、ソルビトールエステル、エトキシル化エーテル、プロポキシル化エーテル等の低分子量のグリコール及びポリオール、並びにこれらの混合物を含む。前記希釈剤は好ましくは脂質である。水は好ましい希釈剤である。前記組成物は好ましくは少なくとも２０％の親水性希釈剤を含む。

幾つかの態様において、好適なキャリアは、疎水性相、特に水相と疎水相（例えば、脂質、油、又は油性物質）を含む乳液も含む。当業者に知られているように、前記疎水相は親水相中に分散されているか、逆に疎水相中に親水相が分散して、組成物の成分に応じて、疎水性又は親水性の分散相と連続相を形成している。「分散相」の語は、乳液技術の分野の当業者によく知られており、本明細書において、連続相により形成されている環境中に懸濁されている小さな粒子又は液滴を有する相を意味する。前記分散相は、内部相又は不連続相としても知られている。前記乳液は水中油型乳液又はシリコン中水型乳液等の油中水型乳液であるか、これらを（例えば、三相又は他の多相乳液中に）含む。水中油型乳液は通常、１％乃至６０％（好ましくは１％乃至３０％）の分散された疎水相と１％乃至９９％（好ましくは１０％乃至９０％）の連続する親水相からなる。他の態様において、油中水型乳液は、１％乃至９８％（好ましくは４０％乃至９０％）の分散された親水相と１％乃至５０％（好ましくは１％乃至３０％）の連続する疎水相を有する。

幾つかの態様において、前記キャリアは皮膚の角質層を通って基底部への浸透を促進する１つ以上の成分を含む。浸透促進剤の例は、マイクロエマルジョン、リポソーム、及びナノエマルジョンの他に、プロピレングリコール、アゾン、エトキシジグリコール、ジメチルイソソルビトール、尿素、及びジメチルスルホキシドを含むがこれらに限定されない。

幾つかの態様において、本発明の組成物は保湿剤を０．０１％乃至１０％、好ましくは０．１％乃至１５％、好ましくは０．５％乃至１０％のレベルで含む。好適な保湿剤はポリヒドリックアルコール、ソルビトール、グリセロール、尿素、ベタイン、Ｄ−パンテノール、ＤＬ−パンテノール、パントテン酸、カルシウム、ロイヤルゼリー、パンセチン、パントセイン、パンテニルエチルエーテル、パンガミン酸、ピリドキシン、パントイルラクテート、ビタミンＢ複合体、ナトリウムピロリドン、アルボン酸、ヘキサン−１，２，６−トリオール、グアニジン及びその誘導体、及びこれらの混合物を含むがこれらに限定されない。

本発明に好適なポリヒドリックアルコールは、プロピレングリコール、ヘキシレングリコール、ブチレングリコール、（例えば、１，３−ブチレングリコール）、ヘキサントリオール（例えば、１，２，６−ヘキセンチオール）、トリメチロールプロパン、ネオペンチルグリコール、グリセリン、エトキシル化グリセリン、プロパン−１，３−ジオール、プロポキシル化グリセリン、及びこれらの誘導体等のポリアルキレングリコール及び好ましくはアルキレンポリオール及びこれらの誘導体を含むがこれらに限定されない。上記ポリフヒドリックアルコールの任意の誘導体、アルコキシル化誘導体も本発明に好適である。本発明に好適なポリヒドリックアルコールは、グリセリン、ブチレングリコール、プロピレングリコール、ペンチルグリコール、ヘキシルグリコール、ジプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ヘキサントリオール、エトキシグリセリン、及びプロポキシル化グリセリン及びこれらの混合物から選択される。

本明細書における工程な保湿剤は、ナトリウム２−ピロリドンー５−カルボキシレート（ＮａＰＣＡ）、グアニジン、グリセロール酸、及びグリコレートエステル（例えば、アンモニウムと４級アルキルアンモニウム）、酢酸及び酪酸塩（例えば、アンモニウムと４級アルキルアンモニウム）、各種形態のアロエベラ（例えば、アロエベラゲル）、ヒアルロン酸及びそれらの誘導体（例えば、ヒアロルロン酸ナトリウム等の塩誘導体）、ラクタミドモノエタノールアミド、アセトアミドモノエタノールアミド、尿素、ベタイン、パンテノール、及びそれらの誘導体、並びにそれらの混合物である。

幾つかの態様において、保湿剤の少なくとも１部（組成物の重量に基づいて５％まで）は粒子状の架橋された親水性アクリレート又はメタクリレートコポリマーの混合物の形態で本発明の組成物に提供される。前記保湿剤の一部は０．１％乃至１０％の量で存在し、水相又は分散相に添加することができる。前記コポリマーは光沢を消し、油をコントロールしする一方で、効果的な保湿作用を提供する。前記コポリマーは参照により本発明に援用されるＷＯ９６／０３９６４に記載されている。

幾つかの態様において本発明の水中油型組成物及び油中水型組成物は、０．０５％乃至２０％、好ましくは１乃至１５％、好ましくは２％乃至１５％の量で皮膚用医薬品として使用しうる乳液を含む。乳液は皮膚を潤滑にし、滑らかさ及び柔軟性を高め、及び皮膚を乾燥するのを防ぎ、及び／又は皮膚を保護する。乳液は通常、水に混和しない油性又はワックス性物質であり、局所的に審美的効果を与える。乳液として多くの好適な物質の例を含む多くの好適な乳液が知られており（例えば、Ｓａｇａｒｉｎ、Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ、ＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ、Ｖｏｌ．１、ｐｐ．３２−４３［１９７２］；及びＷＯ００／２４３７２参照）本明細書においても説明されている。追加的な乳液は以下のものを含むがこれらに限定されない。
ｉ）ミネラルオイル、ドデセン、スクアラン、コレステロール、水素添加ポリイソブチレン、イソヘキサデセン、イソエイコサン、イソオクタヘキサコネート、及び分岐鎖Ｃ７−Ｃ４０イソパラフィン等の７乃至４０の炭素数を有する直鎖及び分岐鎖炭化水素。本発明に用いる好適な分岐鎖はｉｓｏｐｅｎｔａｃｏｎｔａｏｃｔａｃｔａｎｅ、ペテロラクタム及びこれらの混合物から選択される。
ｉｉ）Ｃ１−Ｃ３０カルボン酸のＣ１−Ｃ３０脂肪酸エステル、Ｃ１２−１５アルキルベンソエート、及びＣ２−Ｃ３０カルボン酸のＣ１２−１５アルキルベンソエート、例えば、イソノニルイソノナノエート、イソステアリルネオペンタノエート、イソデシルオクタノエート、イソデシルイソノナノエート、トリデシルイソノナノエート、ミリスチルオクタノエート、オクチルペラルゴネート、オクチルイソノナノエート。ミリスチルミリステエート、ミリスチルネオペンタノエート、ミリスチルオクタノエート、イソプロピルミリスチレート、ミリスチルプロピオネート、イソプロピルステアレート、イソプロピルイソステアレート、メチルイソステアレート、ベヘニルベヘネート、ジオクチルマレエート、ジイソプロピルアジペート、及びジイソプロピルジリノレート、及びこれらの混合物の本発明に用いることができる。
ｉｉｉ）糖及び関連物質のＣ１−Ｃ３０モノ及びポリエステル。これらはのエステルは、糖又はポリオール及び１つ以上のカルボン酸部分由来である。酸及び糖の成分に依存して、これらのエステルは室温で液体又は固体形態になる。例としては、グルコーステトラオレエート、オレイン酸のガラクトーステトラエステル、ソルビトールテトラオレエート、スクローステトラオテエート、スクロースペンタオレエート、スクロースヘキサオレエート、スクロースヘプタオレエート、スクロースオクタオレエート、ソルビトールヘキサエステルを含む。他の物質はスクロースのコットンシードオイル脂肪酸又は大豆オイル脂肪酸のエステルである。このような物質の他の例は、参照により本明細書に援用されるＷＯ９６／１６６３６に記載されている。
ｉｖ）ベジタブルオイル又は水素添加ベジタブルオイル。ベジタブルオイル及び水素添加ベジタブルの例は、サフラワーオイル、ゲレープシードオイル、ココナッツオイル、コットンシードオイル、メンハーデンオイル、パーム核油、ポーナッツオイル、ダイズオイル、菜種油、リン種油、ライスオイル、パインオイル、ナッツオイル、ゴマ油、ひまわり種子油、これらの一部又は全部を水素添加したもの、及びこれらの混合物を含む。
ｖ）溶解性又はコロイド溶解性保湿剤。例としてはヒアルロン酸及び硫酸コンドロイチンを含む。

「脂質」の語は、脂肪、オイル、ワックス等を意味する一般的な語として用いられる。更に、「オイル相」及び「脂質相」の語も互換的に使用される。しかしながら、オイルと脂肪は極性においてお互いに異なるこのであり、それらは定義しずらい。水への界面張力をオイルのまたは油性の相の極性インデックスの測定に採用することが提案されている。従って、界面張力は所与のオイル組成物の極性の測定に適していると思われる。「界面張力」は、２つの相の間の界面の中の長さにおいて想像線に１メートル作用する力である。この計測において油性の相と水の間の界面張力がより低いほど分析されている油性相の極性はより大きい。この界面張力のための物理単位は力／長さの関係から慣例的に計算することができ、ｍＮ／ｍ（計器によって分割されたミリニュートン）と通常表現される。それが、界面を減らすことに作用するならば、それは陽性である。逆の場合に、それは陰性である。本明細書においては、水への界面張力が３０ｍＮ／ｍより少ないならば、脂質は「極性」とみなされている。

「極性オイル」はレシチン及び脂肪酸トリグリセリド、即ち、８乃至２４、特に１２乃至１８炭素原子の鎖長を有する、分岐及び／又は非分岐、飽和及び／又は不飽和のトリグリセリドエステルの群からのいずれかを含む。いくつかの態様において、前記脂肪酸トリグリセリドは合成、準合成、及び天然オイル（即ち、オリーブオイル、サンフラワーオイル、大豆オイル、菜種オイル、アーモンドオイル、ヤシ油、ココナツオイル、ヒマシ油、コムギオイル、グレープシードオイル、アザミオイル、オオマツヨイグサオイル、マカデミアナッツオイル等）からなる群より選択される。しかしながら、本発明の発明の特定の極性を含む組成物に限定することは意図しない。本発明に用いることができる極性オイルの追加的な例は、３乃至３０炭素原子の鎖長を有する、飽和及び／又は不飽和、分岐及び／又は非分岐アルコールのエステルからなる群、並びに芳香族カルボン酸及び３乃至３０炭素原子の鎖長を有する、飽和及び／又は不飽和、分岐及び／又は非分岐のアルコールのエステルからなる群より選択される。いくつかの態様において、そのようなエステルオイルは、イソプロピルミリスチレート、イソプロピルパルミチテート、イソプロピルステアレート、イソプロピルオレエート、ｎ−ブチルステアレート、ｎ−ヘキシルラウリレート、ｎ−デシルオレエート、イソオクチルステアレート、イソノニルステアレート、イソノニルイソノナネート、２−エチルヘキシルパルミチエート、２−エチルヘキシルラウリレート、２−ヘキシルデシルステアレート、２−オクチルドデシルパルミテート、オレイルオレエート、オレイルエルケート、エルキルオレエート、エルキルエルケート、及びこれらのエステルの合成、準合成及び天然物の混合物（例えば、ホホバ油）からなる群から選択される。

更に、幾つかの態様にいて、前記オイル相は飽和又は不飽和、分岐又は非分岐アルコールのほかにジアルキルエステルからなる群より選択される。幾つかの特に好適な態様において、組成物の前記オイル相は、Ｃ_{１２−１５}アルキルベンゾエートも含む。他の態様において、好適な態様は後者のみを含む。更なる態様において、前記オイル相はＧｕｅｒｂｅｔアルコール（即ち、か最初にそれらの調製を説明したマルセルＧｕｅｒｂｅｔにちなんで名付けられたアルコールのグループ）らなる群より選択される。これらのアルコールは、以下の式により特徴付けられる：

式１

アルコールからアルデヒドへの酸化により、アルデヒドのアルドール濃縮により、アルドールから水が排除され、アリルアルデヒドの水素付加が起こる。Ｇｕｅｒｂｅｔアルコールは低温においても液状であり、皮膚に対して炎症を生じない。従って、これらはスキンケア及びヘアケア組成物においてｆａｔｔｉｎｇ、及びｓｕｐｅｒｆａｔｔｉｎｇ、及びｒｅｆａｔｔｉｎｇ成分として用いることができる。即ち、Ｇｕｅｒｂｅｔアルコールの使用は、当業者に知られている。これらの適用において、これらの物質は以下の構造式を有することにより特徴付けられる：

式中、Ｒ１及びＲ２は通常、非分岐アルキルラジカルである。本発明の幾つかの好適な態様において、Ｒ１がプロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、又はオクチルであり、及び／又はＲ２がヘキシル、フェニル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、又はテトラデシルであるＧｕｅｒｂｅｔアルコールを本発明に用いることができる。更なる態様において、好適なＧｕｅｒｂｅｔアルコールは例えば、ＩＳＯＦＯＬ（商標）１２（ＣｏｎｄｅａＣｈｅｍｉｅＧｍｂＨ）の名称で販売されている、以下の構造式を有する２−ブチルオクタノール：

及び、ＩＳＯＦＯＬ（商標）１６（ＣｏｎｄｅａＣｈｅｍｉｅＧｍｂＨ）の名称で販売されている、以下の構造式を有する２−ヘキシルデカノールを有する。

追加的な態様において、例えば、Ｇｕｅｒｂｅｔアルコールの混合物も本発明の組成物に用いることができる。例えば、２−ブチルオクタノール及び２−ヘキシルデカノールの混合物は幾つかの態様に用いることができる。最終化粧品又は皮膚科用製剤中のＧｕｅｒｂｅｔアルコールの総量は最終製品の重量に対して約０．２５％まで、好ましくは約０．５乃至１５．０％の範囲から選択される。しかしながら、当業者は所望の組成物及びそれらの用途により、好適な濃度を有する組成物を調製する方法を知っていることから、本発明を特定の濃度及び濃度の範囲に限定することは意図しない。更に、オイル及び／又はワックス化合物の任意の組合せを本発明に用いることができる。例えば、幾つかの態様において、ワッスク（例えば、セチルパルミテート）はオイル相の固形脂質化合物として用いることができる。更なる態様において、非極性オイル（例えば、分岐及び非分岐炭化水素、及び炭化水素ワックスから選択されるもの）、特にＶＡＳＥＬＩＮＥ（商標）（即ち、ホワイト油）、パラフィンオイル、スクアランとスクアレン、ポリオレフィン、及び水素処理したポリイソブテンは本発明に用いることができる。ポリオレフィンを含むいくつかの態様において、ポリデセンが好ましい。

本発明の態様に用いることができる脂肪及び／又はワックス化合物はベジタブルワックス、アニマルワックス、ミネラルワックス、及び鉱物ワックスを含むがこれらに限定されない。特に好適なワックスの例は、カンデリラワッスク、カルナウバワックス、うるしワックス、アフリカハネガヤワックス、コルクワックス、グアルマワックス、イネ胚芽オイルワックス、糖きびワックス、ベリーワックス、オウリキュリーワックス、モンタンワッスク、ホホバワックス、シアバター、蜜蝋、シェラックワックス、鯨蝋、ラノリン（羊毛脂）、尾羽グリース、セレシン、オゾケライト（地蝋）、パラフィンワックス、及びミクロ結晶ワックスを含む。

本発明の態様に用いることができる追加的な脂肪及び／又はワックス化合物は化学的に修飾ワックス及び／又は合成ワックス（例えば、ＣＲＯＤＡＧｍｂＨより販売されているＳＹＮＣＲＯＷＡＸ（商標）ＨＲＣ［グリセリルトリベヘネート］及びＳＹＮＳＣＲＯＷＡＸ（商標）ＡＷ１Ｃ［Ｃ_１８−Ｃ_３６脂肪酸］）、及びモンタンエステルワッスク、Ｓａｓｏｌワックス、水素化ホホバワックス、合成又は修飾蜜蝋（例えば、ジメチコーンコポリオールワックス及び／又はＣ_{３０−５０}アルキル蜜蝋）、ポリアルキレンワックス、ポリエチレングリコールワックス、並びに化学修飾された脂肪（例えば、水素化ヒマシ油及び／又は水素化ココナッツ脂肪グリセリド等の水素化ベジタブルオイル）、トリグリセリド（例えば、トリヒドロキシステアリン、脂肪酸、脂肪酸エステル、及びＣ_{２０−４０}アルキルステアレート、Ｃ_{２０−４０}アルキルヒドロキシステアロイルステアレート、及び／又はグリコールモンタネート等のグリコールエステル）を含む。更なる態様において、本発明は特定の脂肪及び／又はワックス化合物と同様の物理的性質を有する特定の有機シリコン化合物を含む（例えば、ステアロキシトリメチルシラン）。追加的な態様において、前記脂肪及び／又はワックス化合物は別々に提供される。他の態様においては、これらは混合物として提供される。すなわち、そのようなオイル／ワックス化合物のあらゆる所望の混合物が本発明の各種態様に用いることができる。

幾つかの態様において、前記オイル相は２−エチルヘキシルイソステアレート、オクチルドデカノール、イソトリデシルイソノナノエート、イソエイコサン、２−エチルヘキシルココエート、Ｃ１２−１５−アルキルベンゾエート、パプリイック／カプリックトリグリセリド、及びジカプリルイルエーテルからなる群より選択される。代替的な態様において、オクチルドデカノール、パプリイック／カプリックトリグリセリド、ジカプリルイルエーテル、Ｃ１２−１５アルキルベンゾエート、２−エチルヘキシルイソステアレート、イソトリデシルイソノナエートの１つ以上を含む混合物を含むがこれらに限定されない、各種オイル相の混合物が提供される。以下の表は本発明の各種態様に、単独で又は他の資質と組み合わせて用いることができる脂質のリストを提供する。対応する水への界面張力は最後のカラム中に記載している。より高い又は低い極性を有する化合物の混合物を含む他の化合物も本発明の各種態様に用いることができることから、本発明をこれらの列挙された化合物に限定することは意図しない。

幾つかの態様において、製剤のオイル相の幾つか又は全部は、しばしは「シリコンオイル」とも言われる環状及び／又は直鎖シリコンからなる群より選択される。幾つかの態様において、これらのシリコン又はシリコンイエロー折るは以下の構造エレメントにより特徴付けられるモノマーとして存在している：

本発明の幾つかの態様に用いられる２つ以上のシロキシル単位を有するシリコンは通常、以下の構造エレメントにより特徴付けられる：

式中、シリコン分子は、Ｒ１乃至Ｒ４で示す同一の又は異なるアルキルラジカル及び／又はアリルラジカルにより置換されていてもよい。異なるラジカルの数は４である必要はなく、２乃至２００，０００の値である。

本発明に有利に用いることができる環状シリコンは以下の構造エレメントにより特徴付けられる：

式中、シリコン分子は、Ｒ１乃至Ｒ４で示す同一の又は異なるアルキルラジカル及び／又はアリルラジカルにより置換されていてもよい。異なるラジカルの数は４である必要はなく、ｎは３／２乃至２０である。「ｎ」についての分数の値は、奇数のシロキシル基が環の中に存在する場合を考慮したものである。

幾つかの態様において、フェニルトリメチコーンがシリコンオイルとして選択される。本発明の各種態様に用いるのに適した他のシリコンオイルは、ジメチコーン、フェニルジメチコーン、シクロメチコーン（オクタメチルシクロテトラシロキサン）、ヘキサメチルシクロトリシロキサン、ポリジメチルシロキサン、ポリ（メチルフェニルシロキサン）、セチルジメチコーン、及びベヘノキシジメチコーンを含むがこれらに限定されない。代替的な態様において、シクロメチコーン及びイソトリデシルイソノナノエートの混合物、並びにシクロメチコーン及び２−エチルヘキシルイソステアレートの混合物を含むがこれらに限定されない、これらの化合物の混合物も本発明に用いることができる。更なる追加的な態様において、前記化合物の有機側鎖が誘導体化された化合物（例えば、ポリエトキシ化及び／又はポリプロポキシル化）等の類似の化合物のシリコンオイルも本発明に用いることができる。これらは、セチルジメチコーンコポリオール（即ち、スェチルジメチコーンコポリオール（及び）ポリグリセリル−４−イソステアレート（及び）ヘキシルラウレート）等のポリシロキサン−ポリアルキル−ポリエーテル−コポリマー等の化合物を含むがこれらに限定されない。即ち、本発明の各種態様には各種オイルを用いることができることから、本発明を特定のシリコンオイル又はシリコンオイルの混合物に限定することを意図しない。

追加的な態様において、油中水（Ｗ／Ｏ）型乳液は本発明に用いることができる。幾つかの態様において、Ｗ／Ｏ乳液は追加的な共乳化剤と一緒に又はこれを用いずに使用することができる。更なる態様において、Ｗ／Ｏ乳液は更に、レシチン、ラノリン、パラフィン油（Ｐａｒａｆｆｉｎｕｍｌｉｑｕｉｄｕｍ）を含む混合物の中のミクロ結晶ワックス（ミクロ結晶蜜蝋）オゾケライト、水素化ヒマシ油、ポリグリセリル−３オレエート、ウールワックス酸混合物、ウールワックスアルコール混合物、ペンタエリトリチルイソステアレート、ポリグリセリル−３ジイソステアレート、蜜蝋（Ｃｅｒａａｌｂａ）及びステアリン酸、イソプロピルヒドロキシエーテルを含む混合物中のとソディウムジヒドロキシセチルフォフェート、メチルグルコースジオレエート、ヒドロキシステアレート及び蜜蝋を含む混合物中のメチルグルコースジオレエート、ワセリンとオゾケライトとグリセリルオレエートとラノリンアルコールを含む混合物中のミネラルオイル、オゾケライトと水素化ヒマシ油とグリセリルイソステアレートとポリグリセリル−３オレエートを含む混合物中のワセリン、ＰＥＧ−７水素化ヒマシ油、オゾケライト及び水素化ヒマシ油、ポリグリセリル−４イソステアレート、セチルジメチコーンコポリオール及びヘキシルラウレートを含む混合物中のポリグリセリル−４イソステアレート、ラウリルメチコーンコポリオール、セチルジメチコーンコポリオール、アクリレート／Ｃ_１０−Ｃ_３０−アルキルアクリレートクロスポリマー、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ１０１、ポリグリセリル−２ジポリヒドロキシステアレート、ポリグリセリル−３ジイソステアレート、ポリグリセリル−４ジポリヒドロキシステアレート、ＰＥＧ−３０ジポリヒドロキシステアレート、ジイソステアロイル−３ジイソステアレート、ポリグリセリル−２ジポリヒドロキシステアレート、ポリグリセリル−３ジポリヒドロキシステアレート、ポリグリセリル−４ジポリヒドロキシステアレート、ポリグリセリル−３ジオレートの中の１つ以上の化合物を含むがこれらに限定されない、１つ以上の乳化剤を含む。

本発明の更なる態様において、本発明のＷ／Ｏ乳液は、セテアレス−２０を有する混合物中のグリセリルステアレート、セテアレスー２５、ステアリルアルコールを含む混合物中のセテアレス−６、ＰＥＧ−４０ヒマシ油とソディウムセチルステアリルスルフェートを含む混合物中のセチルステアリルアルコール、トリセテアレス−４フォスフェート、ソディウムセチルステアリルスルフェート、レシチントリラウレス−４フォスフェート、ラウレス−４フォスフェート、ステアリン酸、プロピレングリコールステアレートＳＥ、ＰＥＧ−２５水素化ヒマシ油、ＰＥＧ−５４水素化ヒマシ油、ＰＥＧ−６カプリイック／カプリックグリセリド、プロピレングリコールを含む混合物中のグリセロールオレエート、セテス−２、セテス−２０、ポリソルベート６０、ＰＥＧ−１００ステアレートを含む混合物中のグリセリルステアレート、ラウレス−４、セテアレス−３、イソステアリルグリセリルエーテル、ソディウムセチルステアリルスルフェートを含む混合物中のセチルステアリルアルコール、ラウレス−２３、ステアレス−２、ＰＥＧ−３０ステアレートを含む混合物中のグリセリルステアレート、ＰＥＧ−４０ステアレート、グリコールジステアレート、ＰＥＧ−２２ドデシルグリコールコポリマー、ポリグリセリル−２ＰＥＧ−４ステアレート、セテアレス−２０、メチルグルコースセスクイステアレート、ステアレス−１０、ＰＥＧ−２ステアレート、ＰＥＧ−８ジステアレートを含む混合物中のステアレス−２、ステアレス−２１、ステアレス−２０、イソステアレス−２０、ＰＥＧ−４５／ドデシルグリコールコポリマー、メトキシ−ＰＥＧ−２２／ドデシルグリコールコポリマー、ＰＥＧ−２０グリセリルステアレート、ＰＥＧ−８蜜蝋、ポリグリセリル−２ラウレート、イソステアリルジグリセリルスクシネート、ステアラミドプロピルＰＧジモニウムクロライドフォスフェート、グリセリルステアレートＳＥ、セテス−２０、トリエチルシトレート、ＰＥＧ−２０メチルグルコースセクイステアレート、セテアレス−１２、グリセリルステアレートシトレート、セチルフォスフェート、トリセテアレス−４フォスフェート、トリラウレス−４フォスフェート、ポリグリセリルメチルグルコースジステアレート、ポタシウムセチルフォスフェート、イソステアレス−１０、ポリグリセリル−２セクイイソステアレート、セテス−１０、オレス−２０、イソセテス−２０、セテアレス−２０を含む混合物中のグリセリルステアレート、セテアレス−１２、セチルステアリルアルコール及びセチルパルミテート、ＰＥＧ−２０ステアレートを含む混合物中のセチルステアリルアルコール、ＰＥＧ−３０ステアレート、ＰＥＧ−４０ステアレート、及びＰＥＧ１００ステアレート、を含むがこれらに限定されない１つ以上の共乳化剤を含む。

更なる態様において、シリコンオイルを少なくとも一部に含む製剤のオイル相において、シリコン乳化剤を用いることができる。幾つかの態様において、このシリコン乳化剤は、アルキルメチコーンコポリオール、及び／又はアルキルジメチコーンコポリオールの界面活性作用を有する群から選択される。特に、以下の構造式により特徴付けられる化合物の群より選択される。

式中、Ｘ及びＹは、それぞれ独立して、Ｈ基、並びに１乃至２４炭素原子を有する分岐及び非分岐アルキル基、アシル基、及びアルコキシ基から選択され、ｐは０乃至２００の数であり、ｑは１乃至４０の数であり、ｒは１乃至１００の数である。本発明に用いることができるシリコン乳化剤の幾つかの例は、ジメチコーンポリオール（例えば、ＡＢＩＬ（商標）Ｂ８８４２、ＡＢＩＬ（商標）Ｂ８８４３、ＡＢＩＬ（商標）Ｂ８８４７、ＡＢＩＬ（商標）Ｂ８８５１、ＡＢＩＬ（商標）Ｂ８８５２、ＡＢＥＬ（商標）Ｂ８８６３、ＡＢＩＬ（商標）Ｂ８８７３、及びＡＢＩＬ（商標）Ｂ８８１８３：これらはＴｈ．ＧｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔＡＧより入手可能である）。本発明に用いることができる追加的な界面活性作用のある物質の例はセチルジメチコーンコポリオール（ＡＢＩＬ（商標）ＥＭ９０）並びにシクロメチコーンジメチコーンコポリオール（ＡＢＩＬ（商標）ＥＭ９７）を含む。両者は、Ｔｈ．ＧｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔＡＧより入手可能である。本発明の乳化剤の用いることができることが証明されている化合物は、ＤｏｗＣｏｒｎｉｎｇＬｔｄ．より販売されているラウレスメチコーンコポリマー（ＤｏｗＣｏｒｎｉｎｇ（商標）５２００ＦｏｒｍｕｌａｔｉｏｎＡｉｄ）である。

本発明の好適な態様において、パーソナルケア組成物中（例えば、化粧品又は皮膚用製剤）に用いられる乳化剤の量は製剤の総重量に基づいて、約０．１乃至約１０．０％、好ましくは約０．５乃至約５．０％である。しかしながら、本発明の各種態様は異なる好適な濃度及び／又は濃度範囲を有することから、本発明を特定の乳化剤及び／又は共乳化剤の濃度に限定することは意図しない。

幾つかの態様において、本発明は皮膚保護クリーム、スキンローション、化粧乳液、日焼け止めクリーム、及び日焼け止め乳液を含む各種形態で、乳液を提供する。幾つかの好適な態様において、これらの組成物は、脂肪、オイル、ワックス、及び／又は他の脂肪基質、並びに水を含み、慣習的にもちいられる場合には、１つ以上の乳化剤を含も含む。

本発明の化粧用クレンジングローション及び／又はクレンジングクリームの液体及び幾分固形状の乳液に加えて、本発明はメイクアップを除去するため又はマイルドなクレンジングローションとして使われる、吹付けることができるクレンジング用製剤（「クレンジングスプレー」）も提供する。更に、これらのクレンジングスプレーは、傷［染み・汚れ・欠点・汚点・欠陥］のある皮膚の治療に用いることができる。これらのクレンジング製剤は「リンスオフ（洗い流すタイプの）製剤」（即ち、適用した後に皮膚から洗い流される）と定義される。

上記化粧品に加えて、本発明の各種態様は、賦形剤（ｂｏｄｙｉｎｇａｇｅｎｔ）、充填剤、香料、ダイ、乳化剤、追加的な成分（例えば、ビタミン及びタンパク質）、光保護剤、安定化剤、防虫剤、アルコール、セルフタンニング基質、水、塩、抗生物質、プロテアーゼ、及び／又はケラチン等を含むがこれらに限定されない、助剤と添加剤等の追加的な成分を含む。即ち、スキャフォールド及びペプチドを含む活性化合物が含まれている限り、本発明を特定の成分に限定することは意図しない。更に、本発明は数多くの様々な医療用製剤に用いられる。

幾つかの態様において、本発明の組成物は、分散相を連続相である水相に分散及び懸濁しやすくするための乳化剤及び／又は界面活性剤を含む。界面活性剤は製品が皮膚又はヘアの洗浄用組成物である場合にも有用である。本明細書においては、「乳化剤」の語は「界面活性剤」の語に包含される。従って、本明細書で用いるように、「界面活性剤」の語は、皮膚の洗浄等の目的に対しての面活性剤のほかに、乳化剤として、表面活性作用を有するものも意味する。従来の界面活性剤を含む既知の界面活性剤も本発明に用いることができる。化学的又は物理的に組成物の必須成分と適合しており、所望の性質を提供するように界面活性剤は選択される（例えば、ＷＯ００／２４３７２参照）。好適な界面活性剤は非シリコン誘導体物質、シリコン誘導体物質、及び／又はこれらの混合物から選択される。

更なる態様において、本発明の前記組成物は好ましくは０．０５％乃至３０％、より好ましくは０．５％乃至１５％、及び／又は最も好ましくは１％乃至１０％の界面活性剤又は界面活性剤の混合物を含む。界面活性剤及び／又は界面活性剤の混合物は、正確には、組成物のｐＨ、存在する他の成分、及び最終製品の所望の審美性により選択される。

好適な界面活性剤又は界面活性剤混合物は組成物のｐＨ、存在する他の成分、及び所望の最終製品の審美性に基づいて選択される。

非イオン性界面活性剤の中で本発明に有用なものは、広義には、糖又はデンプンポリマー（例えば、グリコシド）を有する長鎖アルコール（例えば、Ｃ８−３０アルコール）の濃縮生成物であると定義される。他の有用な非イオン界面活性剤は脂肪酸を有するアルキレンオキシド（即ち、脂肪酸のアルキレンオキシドエステル）の濃縮生成物を含む。これらの物質は、一般式、ＲＣＯ（Ｘ）ｎＯＨを有する。式中、ＲはＣ_{１０−３０}アルキル基、Ｘは−ＯＣＨ_２ＣＨ_２−（即ち、エチレングリコール又はオキサイド）又は−ＯＣＨ_２ＣＨＣＨ_３−（即ち、プロピレングリコール又はオキシドの誘導体）及びｎは６乃至２００の整数である。他の非イオン界面活性剤は２モル脂肪酸を有するアルキレンオキシドの濃縮生成物である。これらの物質は一般式、ＲＣＯ（Ｘ）ｎＯＯＣＲを有する。式中、ＲはＣ_{１０−３０ア}ルキル基、Ｘは−ＯＣＨ_２ＣＨ_２−（即ち、エチレングリコール又はオキシドの誘導体）又は−ＯＣＨ_２−ＣＨＣＨ_３−（即ち、プロピレングリコール又はオキシドの誘導体）及びｎは１乃至１００の整数である。幾つかの態様において、本明細書における乳化剤は好ましくはソルビタン脂肪酸エステル及びスクロール脂肪酸脂肪酸エステル、特にソルビタンステアレート及び／又はスクロースココエートに基づく脂肪酸エステルの混合物である。更に好適な例は、セテアリルアルコール及び／又はセテアリルグリコールの混合物を含む。しかしながら、各種好適な乳化剤は本分野において知られていることこから、本発明を特定の乳化剤に限定することは意図しない。

追加的な態様において、本発明に有用な親水性界面活性剤は代替的に又は追加的に、等分やにおいて知られいてるカチオン、アニオン、両イオン性及び／又は両性界面活性剤を含む（例えば、ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ‘ｓ．ＥｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓａｎｄＤｅｔｅｒｇｅｎｔｓ、ＮｏｒｔｈＡｍｅｒｉｃａｎａｎｄＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＥｄｉｔｉｏｎｓ、ＭＣＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．［２００３］；Ｕ．Ｓ．ＰａｔｅｎｔＮｏ．５，０１１，６８１、Ｕ．Ｓ．ＰａｔｅｎｔＮｏ．４，４２１，７６９、及びＵ．Ｓ．ＰａｔｅｎｔＮｏ．３，７５５，５６０参照）。

追加的な態様において、本発明のパーソナルケア組成物にカチオン乳化剤（例えば、４級
界面活性剤）を含むがこれらに限定されない界面−及び／又は表面活性剤が含まれる。

４級界面活性剤は、４個のアルキル基もしくはアリール基に共有結合した少なくとも１個のＮ原子を有する。それによって、ｐＨとは無関係に正電荷が生じる。アルキルベタイン、アルキルアミドプロピルベタイン及びアルキルアミドプロピルヒドロキシサルタイン（ｓｕｌｔａｉｎｅ）が本発明の幾つかの態様に用いることができる４級界面活性剤である。

４級界面活性剤は、４個のアルキル基もしくはアリール基に共有結合した少なくとも１個のＮ原子を有する。それによって、ｐＨとは無関係に正電荷が生じる。アルキルベタイン、アルキルアミドプロピルベタイン及びアルキルアミドプロピルヒドロキシサルタイン（ｓｕｌｔａｉｎｅ）が本発明の幾つかの態様に用いることができる４級界面活性剤である。
カチオン系界面活性剤も好ましくは、４級アンモニウム化合物の群から選択することができ、特には例えばベンジルジメチルステアリルアンモニウムクロライドなどのベンジルトリアルキルアンモニウムクロライドもしくはブロマイド類、そして例えばセチルトリメチルアンモニウムクロライドもしくはブロマイドなどのアルキルトリアルキルアンモニウム塩類、アルキルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロライドもしくはブロマイド類、ジアルキルジメチルアンモニウムクロライドもしくはブロマイド類、アルキルアミドエチルトリメチルアンモニウムエーテルサルフェート類、塩化ラウリル−もしくはセチルピリミジニウムなどのアルキルピリジニウム塩類、イミダゾリン誘導体、ならびにアルキルジメチルアミンオキサイド類もしくはアルキルアミノエチルジメチルアミンオキサイド類のようなアミンオキサイドなどのカチオン性を有する化合物がある。特には、セチルトリメチルアンモニウム塩類を含むがこれらに限定されない界面活性剤を用いることができる。

追加的な態様において、カチオン性ポリマー類（例：ジャグアー（商標）Ｃ１６２［ヒドロキシプロピルグアーヒドロキシプロピルトリモニウムクロライド］または修飾マグネシウムアルミニウムシリケート類（例えばレオックス（Ｒｈｅｏｘ）から商品名ベントン（Ｂｅｎｔｏｎｅ；商標）３８で入手可能なクオタニウム（ｑｕａｔｅｒｎｉｕｍ）−１８−ヘクトライトまたは例えばヒュルス社（ＨｕｌｓＡＧ）から商品名ソフチザン（Ｓｏｆｔｉｓａｎ；商標）ゲルで入手可能なステアラルコニウムヘクトライト）も本発明のいくつかのパーソナルケア組成物に用いることができる。しかしながら、本発明をこれらの特定のカチオンポリマー又はに限定することは意図しない。

本発明による製剤には有利には、オイル系増粘剤を含有させて、エマルションの感触特性を改善することもできる。本発明に関して有利なオイル系増粘剤は、例えばデグッサ社から入手可能なエアロジル（商標）類の疎水性酸化ケイ素類などの他の固体がある。有利なエアロジル（商標）類の例としては、例えばエアロジル（商標）ＯＸ５０、エアロジル（商標）１３０、エアロジル（商標）１５０、エアロジル（商標）２００、エアロジル（商標）３００、エアロジル（商標）３８０、エアロジル（商標）ＭＯＸ８０、エアロジル（商標）ＭＯＸ１７０、エアロジル（商標）ＣＯＫ８４、エアロジル（商標）Ｒ２０２、エアロジル（商標）Ｒ８０５、エアロジル（商標）Ｒ８１２、エアロジル（商標）Ｒ９７２、エアロジル（商標）Ｒ９７４及び／またはエアロジル（商標）Ｒ９７６がある。

幾つかの追加的な態様において、本発明の幾つかのパーソナルケア組成物は、「金属石鹸」（すなわち、アルカリ金属塩を除く高級脂肪酸の塩）も、オイル系増粘剤として用いることができる。例としては、ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸亜鉛及び／またはステアリン酸マグネシウムなどがある。

各種アニオン界面活性剤は本発明に有用である（例えば、Ｕ．Ｓ．ＰａｔｅｎｔＮｏ．３，９２９，６７８参照）。典型的なアニオン界面活性剤はアルコキシイソチオネート（例えば、Ｃ２１−Ｃ３０）、アルキル及びアルキルエーテルサルフェート及びそれらの塩、アルキル及び／又はアルキルエーテルフォスフェート及びそれらの塩、アルキルメチルタウレート（例えば、Ｃ１２−Ｃ３０）及び／又は脂肪酸の石鹸（例えば、置換アルキルアミン及びアルカリ金属塩、例えば、ナトリウム又はカリウム塩）を含むがこれらに限定されない。

両イオン性及び両性界面活性剤の本発明に用いることができる。本発明の組成物に用いることができる好適な両イオン性及び両性界面活性剤の例は、広義には、脂肪鎖が直鎖又は分岐鎖であり、１つの脂肪置換基が８乃至２２（好ましくはＣ_８−Ｃ_１８）炭素原子を含み、１つの脂肪置換基が陰性の水に可溶な基（例えば、カルボキシ基、スルネート基、フォスフェート基、又はフォスファノエート基）を含む脂肪族二級又は三級アミンの誘導体と定義される。例としては、アルキルイミノアセテート、及び／又はイミノジアルカノエート、及び／又はアミノアルカノエート、イミダゾリニウム及び／又はアンモニウム誘導体を含むがこれらに限定されない。他の好適な両イオン性及び両性界面活性剤はベタイン、スルタイン（ｓｕｌｔａｉｎｅ）、ヒドロキシスルタイン（ｓｕｌｔａｉｎｅ）及び分岐又は非分岐アルカノイルザルコシネート、及びこれらの混合物からなる群より選択される。

幾つかの更なる態様において、本発明のパーソナルケア組成物は少なくとも１つの両性または両性イオン性界面活性剤（例：コカミドプロピルベタイン）及び保湿剤（例：ベタイン）を含む。有利に使用される両性界面活性剤の例としては、アシルアンフォ酢酸ナトリウム、アシルアンフォジプロピオン酸ジナトリウム、アルキルアンフォジ酢酸ジナトリウム、アシルアンフォヒドロキシプロピルスルホン酸ナトリウム、アシルアンフォ酢酸ジナトリウム及びアシルアンフォプロピオン酸ナトリウムなどのアシル／ジアルキルエチレンジアミン；例えばアミノプロピルアルキルグルタミド、アルキルアミノプロピオン酸、アルキルイミドジプロピオン酸ナトリウム及びラウロアンフォカルボキシグリシネートなどのＮ−アルキルアミノ酸類がある。

本発明の組成物における表面活性物質または界面活性物質（１以上の化合物）の量は、製剤の総重量基準で、好ましくは０．００１〜３０重量％、特に好ましくは０．０５〜２０重量％、特には１〜１０重量％である。

幾つかの更なる態様において、前記有効成分（１以上の化合物）は少なくとも１つの親水性有効成分を含む。幾つかの態様において、前記親水性有効成分はアセチルサリチル酸、アトロピン、アズレン、ハイドロコルチゾン及びハイドロコルチゾン−１７−バレレートなどのそれの誘導体、Ｂ群及びＤ群などのビタミン類、非常に好ましくはビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＤ１、そしてビサボロール、不飽和脂肪酸類、すなわち必須脂肪酸（ビタミンＦと称される場合も多い）、特にはγ−リノレン酸、オレイン酸、エイコサペンテン酸、ドコサヘキセン酸及びそれの誘導体、クロラムフェニコール、カフェイン、プロスタグランジン類、チモール、カンファー、植物及び動物起源の抽出物その他の産生物、例えばオオマツヨイグサオイル、ボレッジ（ｂｏｒｒａｇｅ）オイルまたはスグリ種子オイル、魚オイル類、タラ肝油、そしてセラミド類及びセラミド様化合物等から選択される。幾つかの態様において、前記有効成分は、再脂肪化（ｒｅｆａｔｔｉｎｇ）物質である（例えばプルセリン（ｐｕｒｃｅｌｌｉｎ）オイル、ユーセリット（商標）及びネオセリット（商標）等）。

更なる態様において、本発明のいくつかの乳液は乳化剤又は界面活性剤を含むシリコンを含む。各種シリコン乳化剤は本発明に用いることができる。これらのシリコン乳化剤は通常有機的に修飾された有機ポリシロキサンであり、シリコン界面活性剤として当業者に知られている。有用な乳化剤はジメチコーンシロキサンを含むがこれらに限定されない。これらの物質はポリエチレンオキシド鎖、ポリプロピレンオキシド鎖、これらの混合物等のポリエーテル側鎖、並びにエチレンオキシド及び／又はプロピレンオキシドの両方の由来部分含むポリエーテル鎖を含むように修飾されたポリジメチルシロキサンである。他の例は、アルキル修飾ジメチコーン（即ち、Ｃ_２−Ｃ_３０ペンダント側鎖を含む化合物）を含む。更なるジメチコーンコポリマーは各種カチオン、アニオン、両イオン性、及び両性のペンダント部分を含むものである。

幾つかの態様において、本発明の組成物は、少なくとも１つのポリマー性濃厚剤を含む。ポリマー性濃厚剤は２０，０００より大きい、より好ましくは５０，０００より大きい、及び最も好ましくは１００，０００より大きい数平均分子量を有する。幾つかの態様において、本発明の組成物は組成物の重量に基づいて０．０１％乃至１０％、好ましくは０．１％乃至８％、より好ましくは０．２％乃至５％のポリマー性の濃厚剤を含む。

本発明に用いる好適なポリマー性濃厚剤は非イオン濃厚剤及び／又はアニオン濃厚剤又はこれらの混合物を含むがこれらに限定されない。好適な非イオン性濃厚剤はポリアクリルアミドポリマー、架橋されたポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリサッカライド、天然又は合成ガム、ポリビニルピロリドン及び／又はポリビニルアルコールを含むがこれらに限定されない。好適なアニオン性濃厚剤はアクリル酸／エチルアクリレートコポリマー、カルボキシビニルポリマー、及びアルキルビニルエーテル及び／又は無水マレイン酸の架橋コポリマーを含むがこれらに限定されない。市販の濃厚剤（例えば、Ｃａｒｂｏｐｏｌ；Ｎｏｖｅｏｎ）はも本発明の幾つかの態様に用いることができる。好適なＣａｒｂｏｐｏｌは疎水的に修飾されており、他の好適なレジンはＷＯ９８／２２０８５に記載されている。これらの混合物も用いることができる。

本発明の幾つかの態様において、この水相はゲル性質を有する。ここにおいて、化合物及び溶媒（好適なものとして）に加えて、好ましくは水を含み、更に、有機及び／又は無機濃厚剤及び／又はハイドロコロイドを含む。

本発明の幾つかの態様において、有効量の化合物及び溶媒に添加されるゲル相を有する水相は、好ましくは、水、有機及び／又は無機増粘剤及び／又はハイドロコロイドを含む。
幾つかの態様において、無機増粘剤は、修飾、未就職、自然発生、及び合成フィロシリケートの群から選択される。一般的に純粋な物質を使用することが好ましいとされているが、幾つかの態様において、異なる修飾及び／又は未修飾フィロシリケートの混合物も本発明の各種組成物に用いることができる。本分野において知られているように、フィロシリケートは３つのＳｉ−Ｏ−又はＡｌ−Ｏ−結合を介してお互いに結合しているシリケート又はアルミネート単位を有する、シリケート及びアルミネートであり、波状シート又は層状構造を有する。４番目のＳｉ−Ｏ−またはＡｌ−Ｏ−の価数はカチオンにより飽和される、各層の間には比較的弱い荷電状態の相互作用が存在する。この層の構造は広義には（強い）共有結合であると定義されている。この層状シリケートについては（Ｓｉ２Ｏ_５ ^２−）、アルミノシリケートについては（Ａｌ_ｍＳｉ^２− _ｍＯ_５ ^{（２＋ｍ）−}）である。式中、「ｍ」はゼロより大きく２より小さい。純粋なシリケートの不存在下におけるアルミノシリケートが存在する幾つかの態様において、Ａｌ３＋に置換されるＳｉ４−は電のバランスをとるために１＋カチオンを必要とする。このチャージバランスは好ましくはＨ＋、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオンにより達成することが好ましい。代替的な態様において、アルミニウムは対イオンとして使用される。アルミシリケートとは対照的に、これらの化合物は「アルミニウムシリケート」と言われる。アルミニウムがシリケートネットワーク上に存在し、対イオンとしても存在する「アルミニウムアルミノシリケート」も本発明の幾つかの態様に用いることができる。

フィロシリケートは当分野においてよく知られている（例えば、Ｈｏｌｌｅｍａｎｎｅｔａｌ．、ＬｅｈｒｂｕｃｈｄｅｒＡｎｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎＣｈｅｍｉｅ［ＴｅｘｔｂｏｏｋｏｆＩｎｏｒｇａｎｉｃＣｈｅｍｉｓｔｒｙ］、９１ｓｔ−１００ｔｈＥｄ．、ＷａｌｔｅｒｄｅＧｒｕｙｔｅｒ − Ｖｅｒｌａｇ［１９８５］；Ｒｅｍｙ、ＬｅｈｒｂｕｃｈｄｅｒＡｎｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎＣｈｅｍｉｅ、１２^ｔｈＥｄ．、ＡｋａｄｅｍｉｓｃｈｅＶｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ、Ｌｅｉｐｚｉｇ［１９６５］参照）。モントモリロナイトの層状構造も知られている（ＲδｍｐｐｓＣｈｅｍｉｅ−Ｌｅｘｉｋｏｎ、Ｆｒａｎｃｋｈ’ｓｃｈｅＶｅｒｌａｇｓｈａｎｄｌｕｎｇ、Ｗ．Ｋｅｌｌｅｒ＆Ｃｏ．、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、８ｔｈＥｄ．、［１９８５］、ｐ．２６６８ｆ参照）。フィロシリケートの例は以下を含む（モントモリロナイトは天然のベントナイトを含む主要鉱物である）；
モントモリロナイト：Ｎａ_０．３３（（Ａｌ_１．６７Ｍｇ_０．３３）（ＯＨ）_２（Ｓｉ_４Ｏ_１０））
しばしば簡略化される：Ａｌ_２Ｏ_３＊４ＳｉＯ_２＊Ｈ_２Ｏ＊ｎＨ_２Ｏ又はＡｌ_２［（ＯＨ）_２／Ｓｉ_４Ｏｉ_０］・ｎＨ_２Ｏ
カオリナイト：Ａｌ_２（ＯＨ）_４（Ｓｉ_２Ｏ_５）
イライト：（Ｋ，Ｈ_３Ｏ）_ｙ（Ｍｇ_３（ＯＨ）_２（Ｓｉ_４．_ｙＡＬＯ_１０））又は（Ｋ，Ｈ_３Ｏ）_ｙ（Ａｌ_２（ＯＨ）_２（Ｓｉ_４．_ｙＡｌ_ｙＯ_１０））：式中ｙ＝０．７−０．９
ベリデライト：（Ｃａ_５Ｎａ）_０．３（Ａｌ_２（ＯＨ）_２（ＡＩ_０．５Ｓｉ_３．５Ｏ_１０））
ノントロナイト：Ｎａ_０．３３（Ｆｅ_２（ＯＨ）_２（Ａｌ_０．３３Ｓｉ_３．６７Ｏ_１０））
サポナイト：（Ｃａ，Ｎａ）_０．３３（（Ｍｇ，Ｆｅ）_３（ＯＨ）_２（Ａｌ_０．３３Ｓｉ_３．６７Ｏ_１０））
ヘクトライト：Ｎａ_０．３３（ＫＭｇ_１Ｌｉ）_３（ＯＨ_，Ｆ）_２（Ｓｉ_４Ｏ_１０）。

幾つかの好適な態様において、無機ゲル形態はモントモリロナイト（ベントナイト、ヘクトライト、並びにクアテリウム−１８ベントナイト、ステアラルコニウムベントナイト、及びステアラルコニウムヘクトライト等のこれらの誘導体）等のアルミニウムシリケートを含むがこれらに限定されない。マグネシウム−アルミニウムシリケート（ＶＥＥＧＵＭ（商標）グレード）、及びナトリウム−マグネシウムシリケート（ＬＡＰＯＮＩＴＥ（商標））も本発明に用いることができる。

モンモリロナイトは、複八面体スメクタイトのタイプで、水の中で質量が膨張する粘土鉱物であるが、可塑性を有してはいない。モントモリロナイトの３層層状構造における層パケットは水（２乃至７倍量）、及び例えば、アルコール、ピリジン、ピコリン、アンモニウム化合物、ヒドロキシアルミノシリケートイオン等の他の物質の取り込みの結果、膨潤さえることができる。モントモリロナイトは大容量のイオン交換能を有しているので。前記化学式は単に近時的なものをあらわしている。例えば、ＡｌはＭｇ、Ｆｅ^２＋、Ｆｅ^３＋、Ｚｎ、Ｐｂ（例えば、下水中の有害物質）、Ｃｒ、Ｃｕ、及び他の元素に置き換えることができる。中間膜位置における特定のＮａ＋（すなわちナトリウムモンモリロナイト）とＣａ２＋（即ち、、カルシウムモンモリロナイト、膨潤性が非常に小さい化合物）において、八面体層の結果として生じている陰電荷は正イオンの存在によって補われる。

代替的な態様において、ＯＰＴＩＧＥＬ（商標）（Ｓｕｄ−Ｃｈｅｍ）として販売されているがこれらに限定されない、合成マグネシウムシリケート及び／又はベントナイトも本発明に用いることができる。上で示したように、幾つかの態様において、ＶＥＥＧＵＭ（商標）（Ｒ．Ｔ．ＶａｎｄｅｒｂｉｌｔＣｏｍｐ．、Ｉｎｃ）として販売されているアルミノシリケートも本発明に用いることができる。各種グレードのＶＥＥＧＵＭ（商標）も本発明に用いることができる。本発明の各種態様に用いることができる各種ＶＥＥＧＵＭ（商標）グレードは以下で提供される。

上記生成物は、水で膨潤してアルカリ反応を有する粘性のゲルになる。これらの製品は、水中でアルカリ性反応を生起し、膨潤して粘性のゲルを形成する。モンモリロナイト又はベントナイトの有機親和性化（ｏｒｇａｎｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）（中間層カチオンの４級アンモニウムイオンとの交換）により、有機溶媒及び油、脂肪、軟膏、インク、表面塗装中の分散液として、また、界面活性剤中の分散液として使用するのに好ましい生成物（ベントン）を生成する。

Ｂｅｎｔｏｎｅ（商標）は、長鎖有機アンモニウム塩と特定の型のモンモリロナイトから成る種々の中性の化学的に不活性なゲル化剤の商品名である。ベントンは、有機媒体中で膨潤することで有機媒体を膨張させる。得られたゲルは希酸及び希アルカリに対して耐性を有するが、強酸及び強アルカリと長時間接触するとゲル化特性を部分的に消失する。ベントンは有機親和性を有するので、水に対してはかろうじて湿るのみである。以下に示すＢｅｎｔｏｎｅ（商標）グレードが、例えば、ＫｒｏｎｏｓＴｉｔａｎにより販売されている。Ｂｅｎｔｏｎｅ（商標）２７（有機的に変性されたモンモリロナイト）、Ｂｅｎｔｏｎｅ（商標）３４（ジメチルジオクチルアンモニウムベントナイト；これは、米国特許第２５３１４２７号に従って製造されたものであり、親油性基を有するため水よりも親油性媒体中で容易に膨潤する）、Ｂｅｎｔｏｎｅ（商標）３８（有機的に変性されたモンモリロナイト；淡黄色から白色の粉末）、Ｂｅｎｔｏｎｅ（商標）ＬＴ（精製した粘度鉱物）、Ｂｅｎｔｏｎｅ（商標）ＧｅｌＭＩＯ（有機的に変性されたモンモリロナイトであり、鉱油中の微細分散液（ＳＵＳ−７１）（１０％ベントナイト、８６．７％鉱油、及び３．３％湿潤剤）として供給される）、Ｂｅｎｔｏｎｅ（商標）ＧｅｌＩＰＭ（有機的に変性されたベントナイトであり、これはミリスチン酸イソプロピル中に懸濁している（１０％ベントナイト、８６．７％ミリスチン酸イソプロピル、３．３％湿潤剤））、Ｂｅｎｔｏｎｅ（商標）ＧｅｌＣＡＯ（有機的に変性されたモンモリロナイトであり、これはひまし油中に含まれている（１０％ベントナイト、８６．７％ひまし油、及び３．３％湿潤剤）、Ｂｅｎｔｏｎｅ（商標）ＧｅｌＬａｎｔｒｏｌ（有機的に変性されたモンモリロナイトであり、これはさらなる加工、特に化粧品組成物の製造のために意図されたペースト形態である；１０％ベントナイト、６４．９％Ｌａｎｔｒｏｌ（羊毛脂油）、２２．０％ミリスチン酸イソプロピル、３．０％湿潤剤、及び０．１％ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル）、Ｂｅｎｔｏｎｅ（商標）ＧｅｌＬａｎＩ（羊毛脂ＵＳＰとパルミチン酸イソプロピルの混合物中の１０％濃度のＢｅｎｔｏｎｅ（商標）２７ペースト）、Ｂｅｎｔｏｎｅ（商標）ＧｅｌＬａｎＩＩ（純粋な液状羊毛脂中のベントナイトペースト）、Ｂｅｎｔｏｎｅ（商標）ＧｅｌＮＶ（フタル酸ジブチル中の１５％濃度のＢｅｎｔｏｎｅ（商標）２７のペースト）、Ｂｅｎｔｏｎｅ（商標）ＧｅｌＯＭＳ（ＳｈｅｌｌｓｏｌＴ．中のベントナイトペースト）、Ｂｅｎｔｏｎｅ（商標）ＧｅｌＯＭＳ２５（イソパラフィン系炭化水素（Ｉｄｏｐａｒ（商標）Ｈ）中のベントナイトペースト）、Ｂｅｎｔｏｎｅ（商標）ＧｅｌＩＰＰ（パルミチン酸イソプロピル中のベントナイトペースト）。

「ヒドロコロイド（ｈｙｄｒｏｃｏｌｌｏｉｄ）」は、より正確な名称「親水コロイド（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｃｏｌｌｏｉｄ）」の技術的略語である。ヒドロコロイドは概ね直鎖構造を有する巨大分子であって、個々の分子間の側原子価結合及び主原子価結合を可能にし、それによって網状構造（ｒｅｃｔｉｃｕｌａｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）の形成を可能にする分子間力の相互作用を有する。幾つかの種類のヒドロコロイドは、水性系中でゲル又は高粘性溶液を形成する水溶性の天然高分子又は合成高分子である。ヒドロコロイドは、水分子と結合（水和）するか、あるいは織り込まれた巨大分子の中に水分子を吸収して包み込み、同時に水分子の運動を制限することで、水の粘性を増大させる。上記の様な水溶性高分子は、水又は水性媒体に溶解し得るという共通の性質を有する、化学的に極めて多種多様な天然高分子及び合成高分子の大きな群を表す。水溶性であるためには、これらの高分子は、水に可溶性となるのに充分な数の親水性基を有すると共に架橋の程度がそれほど大きくないことが要求される。当該親水性基は、実際、例えば以下に示す様な、非イオン性、アニオン性又はカチオン性の基であり得る。

幾つかの好適な態様において、化粧品用として又は皮膚科学的に適切なヒドロコロイドの群は、以下に示す様に分類される；有機天然化合物、例えば、寒天、カラギーン、トラガカントゴム、アラビアゴム、アルギネート類、ペクチン類、ポリオース類（ｐｏｌｙｏｓｅｓ）、グアー粉、イナゴマメ粉、デンプン、デキストリン類、ゼラチン、及びカゼイン等；有機変性天然物質、例えば、カルボキシメチルセルロース及びその他のセルロースエーテル類、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、及び微結晶性セルロース等；有機完全合成化合物、例えば、ポリアクリル酸化合物、ポリメタクリル酸化合物、ビニルポリマー類、ポリカルボン酸類、ポリエーテル類、ポリイミン類、ポリアミド類、及びポリウレタン類等；無機化合物、例えば、ポリケイ酸類、及び粘土鉱物（例えば、モンモリロナイト、ゼオライト及びシリカ）等。

代替的な態様において、代替的な態様において、有利な安定剤はエチルセルロースである。エチルセルロースは、下記構造により特徴づけられる。上記式中、Ｒはエチル基又は水素原子のいずれかであり得る。

幾つかの好適な態様において、上記エチルセルロース中のエチル化の程度は、有利には２．０〜３．０であり、これは４０〜５５％に相当する。エチル化の程度は、好ましくは、４８．０〜４９．５％である。平均分子質量は、好ましくは、２５℃で測定したトルエン８０部とエタノール２０部から成る混合物中の５％濃度の溶液の粘度が３〜１１０ｍＰａｓ、好ましくは、９〜１１ｍＰａｓとなるように選択される。特に有利には、平均分子質量は１００，０００〜４００，０００ｇ／ｍｏｌである。本発明の調製物中のエチルセルロースの含有量は、調製物の総重量を基準にして０．１〜１０重量％であるのが好ましい。その様な製品は、例えば、ＥＴＨＯＣＥＬ（商標）Ｓｔａｎｄａｒｄ１０Ｐｒｅｍｉｕｍ（ＤｏｗＣｈｅｍｉｃａｌｓ）の商品名のものが入手可能である。

更なる追加的な態様において、微結晶性セルロースは本発明の目的において有利なヒドロコロイドである。例えば、ＡＶＩＣＥＬ（商標）、ＡＶＩＣＥＬ（商標）ＲＣ−５９１、ＡＶＩＣＥＬ（商標）ＲＣ／ＣＬ、ＡＶＩＣＥＬ（商標）ＣＥ−１、及ＡＶＩＣＥＬ（商標）５００；ＦＭＣ（ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎＦｏｏｄａｎｄＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＰｒｏｄｕｃｔｓ）を含むがこれらに限定されない各種微結晶性セルロースを本発明に用いることができる。本発明の目的において特に有利な製品は、グレードＡｖｉｃｅｌ（商標）ＲＣ−５９１であり、これは、８９％の微結晶性セルロースと１１％のナトリウムカルボキシメチルセルロースから成る変性微結晶性セルロースである。

有利に使用される別のヒドロコロイドは、例えば、メチルセルロースである。メチルセルロースは、セルロースのメチルエーテル類の呼称である。メチルセルロースは、下記構造のより特徴付けられる：

式中、Ｒは水素原子又はメチル基であり得る。

本発明の目的において特に有利なものは、一般に同じ様にメチルセルロースと称されるセルロースの混合エーテルである。これは、最も多いメチル基に加えて、２−ヒドロキシエチル基、２−ヒドロキシプロピル基、又は２−ヒドロキシブチル基を有する。特に好ましいのは、（ヒドロキシプロピル）メチルセルロースであり、例えば、ＤｏｗＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐ．からＭｅｔｈｏｃｅｌ（商標）Ｅ４Ｍの商品名のものが入手可能である。

更なる態様において、ナトリウムカルボキシメチルセルロースもまた、本発明において有利である。ナトリウムカルボキシメチルセルロースはセルロースのグリコール酸エーテルのナトリウム塩であって、上記構造式中のＲが水素及び／又はＣＨ２‐ＣＯＯＮａである。特に好ましいナトリウムカルボキシメチルセルロースは、Ｎａｔｒｏｓｏｌ（商標）Ｐｌｕｓ３３０ＣＳの商品名でＡｑｕａｌｏｎから入手可能で、別名セルロースガムとも呼ばれるものである。

本発明の目的において好ましい別のものは、キサンタンガムとも称されるキサンタン（ＣＡＳＮｏ．１１１３８−６６−２）である。キサンタンは、一般にトウモロコシ糖の発酵により形成され、そしてカリウム塩として単離されるアニオン性のヘテロ多糖である。キサンタンは、キサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）及び別の幾つかの種により好気的条件下において生成され、２×１０^６〜２４×１０^６の分子量を有する。キサンタンは、側鎖をもつβ−１，４結合グルコース（セルロース）を有する鎖から形成される。キサンタンのサブグループの構造は、グルコース、マンノース、グルクロン酸、アセテート及びピルベートから成る。キサンタンの粘度は、ピルベート単位の数により決まる。

更なる態様において、カラギーンもまた本発明の目的においてさらに有利なゲル形成因子である。カラギーンは、真正紅藻類（Ｆｌｏｒｉｄｅａｅ）に属する北大西洋紅藻類（ＮｏｒｔｈＡｔｌａｎｔｉｃｒｅｄａｌｇａｅ）（コンドルス・クリスプス（Ｃｈｏｎｄｒｕｓｃｒｉｓｐｕｓ）及びギカルティナ・ステラータ（Ｇｉｇａｒｔｉｎａｓｔｅｌｌａｔａ））のゲル形成抽出物であって、寒天に似た構造を有する。用語「カラギーン（ｃａｒｒａｇｅｅｎ）」は、しばしば、藻類の乾燥生成物に対して使用され、「カラギーナン（ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ）」はその抽出物に対して使用される。藻類の熱水抽出物から沈殿したカラギーンは、１００，０００〜８００，０００の分子量を有し、スルフェート含有量約２５％の、無色から砂色の粉末である。カラギーンは温水に極めて容易に溶解し、たとえ含水量が９５〜９８％であっても、冷却するとチキソトロピーゲルを形成する。その様なゲルの堅さは、カラギーンの二重螺旋構造によりもたらされる。

カラギーナンの場合は、本質的な３種の構成要素が区別される。ゲル形成性κ画分は、Ｄ−ガラクトース４−硫酸と３，６−アンヒドロ−α−Ｄ−ガラクトースから成り、１，３−位及び１，４−位に交互グリコシド結合を有する（それに対して、寒天は３，６−アンヒドロ−α−Ｌ−ガラクトースを含有する）。非ゲル化λ画分は、１，３−グリコシド結合Ｄ−ガラクトース２−硫酸基と１，４−結合Ｄ−ガラクトース−２，６−二硫酸基から構成され、冷水に容易に溶解する。τ−カラギーナンは、１，３結合のＤ−ガラクトース４−硫酸と１，４結合の３，６−アンヒドロ−α−Ｄ−ガラクトース２−硫酸から構成され、水溶性であると同時にゲル形成性でもある。存在するカチオンの種類（Ｋ＋，ＮＨ４＋，Ｎａ＋，Ｍｇ２＋，Ｃａ２＋）もカラギーンの溶解性に影響する。

更なる態様において、キトサン（即ち、部分的に脱アシル化されたキチン）を本発明に用いることができる。部分的に化粧用製剤でのキトサンの使用はそれ自体公知である。この生体ポリマーは、特に薄膜形成性を有し、皮膚でのシルク的感触を特徴とする。しかしながら欠点として、特に使用時に、一時的ではあるが生じる皮膚での強い粘着性がある。個々の場合において、消費者にとって許容できないものであったり、ないしは良くない評価を受けることから、相当する製剤は市販できるものではない。周知のように、キトサンは例えばヘアケアで使用される。それは、元になるキチンと比べて、増粘剤や安定剤としては好適度が高く、ポリマー薄膜の接着性及び耐水性が改善される。先行技術に関する非常に多くの文献の代表的なものには、フィードラーの著作がある（Ｈ．Ｐ．Ｆｉｅｄｌｅｒ，”ＬｅｘｉｋｏｎｄｅｒＨｉｌｆｓｓｔｏｆｆｅｆｕｒＰｈａｒｍａｚｉｅ、ＫｏｓｍｅｔｉｋｕｎｄａｎｇｒｅｎｚｅｎｄｅＧｅｂｉｅｔｅ”［薬学、化粧品及び関連分野用補助剤のレキシコン（Ｌｅｘｉｋｏｎ）］、ｔｈｉｒｄｅｄｉｔｉｏｎ１９８９、ＥｄｉｔｉｏＣａｎｔｏｒ、Ａｕｌｅｎｄｏｒｆ、ｐ．２９３）。キトサンは、下記の構造式を特徴とする。

上記式において、ｎは約１００００以下の値を取り；Ｘはアセチル基または水素である。キトサンは、下記の構造式を特徴とするキチンの脱アセチル化及び部分脱重合（加水分解）によって生成する。

キチンは、節足動物（例：昆虫、カニ、クモ）の外骨格の必須構成要素であり、他の生物（例：軟体類、藻類、真菌）の支持組織でも認められる。約ｐＨ＜６の領域では、キトサンは正電荷を有し、その範囲では水系に可溶でもある。それはアニオン性原料とは不適合である。そのため、キトサン含有水中油型エマルションを得るためには、ノニオン系乳化剤を使用することが適切である（ＥＰ−Ａ７７６６５７参照）。幾つかの好適な態様において、本発明に用いる組成物は、少なくとも１つの、脱アセチル化度＞２５％、より好ましくは＞５５〜９９％の範囲の［１Ｈ−ＮＭＲによって決定］、脱アシル化されたキトサン類が好ましい。幾つかの態様において、分子量１０，０００〜１，０００，０００のキトサン、特には分子量１００，０００〜１，０００，０００のもの［ゲル透過クロマトグラフィーによって測定］も本発明に用いることができる。

ポリアクリレート類も同様に、本発明に関して好ましく使用されるゲル化剤である。本発明により有利なポリアクリレート類は、アクリレート−アルキルアクリレートコポリマー類、特にはカルボマー類またはカルボポール類（ｃａｒｂｏｐｏｌｓ）の群（カルボポール（商標）は実際には、グッドリッチ社（Ｂ．Ｆ．ＧｏｏｄｒｉｃｈＣｏｍｐａｎｙ）の商標である）から選択されるものである。特に、本発明により有利なアクリレート−アルキルアクリレートコポリマーは下記の構造を特徴とする。

式中、Ｒ′は長鎖アルキル基であり；ｘ及びｙは、各コモノマーの個々の化学量論的割合を記号化した数字を表す。

幾つかの態様において、グッドリッチ社から商品名カルボポール（商標）１３８２、カルボポール（商標）９８１及びカルボポール（商標）５９８４で入手可能なアクリレートコポリマー類及び／またはアクリレート−アルキルアクリレートコポリマー類も本発明の幾つかの組成物に用いることができる。非常に好ましいものは、カルボポール類９８０、９８１、１３８２、２９８４、５９８４及びカルボマー２００１の群からのポリアクリレート類である。アクリル酸Ｃ_{１０−３０}アルキル及び１以上のアクリル酸モノマー類のコポリマー、ショ糖のアリルエーテルまたはペンタエリスリトールのアリルエーテルと架橋したメタクリル酸またはそれのエステル類のコポリマーも有利である。

ＩＮＣＩ名「Ａｃｒｙｌａｔｅｓ／Ｃｉｏ−３０ＡｌｋｙｌＡｃｒｙｌａｔｅＣｒｏｓｓｐｏｌｙｍｅｒ」を有する化合物も本発明の幾つかの組成物に用いることができる。特に有利なものは、グッドリッチ社から商品名ペムレン（Ｐｅｍｕｌｅｎ；商標）ＴＲ１及びペムレン（商標）ＴＲ２で入手可能なポリマー類である。しかしながら、本発明を特定のアクリレート化合物に限定することは意図しない。

更なる態様において、ＩＮＣＩ名「ａｍｍｏｎｉｕｍａｃｒｙｌｏｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｔａｕｒａｔｅｓ／ｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ」有する化合物を本発明に用いることができる。これらのアクリロイルジメチルタウリン酸アンモニウム／ビニルピロリジンコポリマー（ａｍｍｏｎｉｕｍａｃｒｙｌｏｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｔａｕｒａｔｅｓ／ｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ）類は、経験式［Ｃ_７Ｈ_１６Ｎ_２ＳＯ_４］_ｎ［Ｃ_６Ｈ_９ＮＯ］_ｍを有し、それは下記の構造に相当する。

本発明に関して好ましい化学種は、ケミカル・アブストラクツに列挙されている登録番号５８３７４−６９−９、１３１６２−０５−５及び８８−１２−０であり、クラリアント社（ＣｌａｒｉａｎｔＧｍｂＨ）から商品名アリストフレックス（商標）で入手可能である。しかしながら、本発明をこれらの種に限定することを意図しない。例えばセピック社（ＳｅｐｐｉｃＳ．Ａ．）からのシムゲル（Ｓｉｍｕｇｅｌ；商標）ＥＧまたはシムゲル（商標）ＥＧなどのアクリロイルジメチルタウレート（Ｔａｕｒａｔｅ）を含むコポリマー類／橋かけポリマー類も本発明の幾つかの組成物に用いることができる。

本発明によって使用されるさらに別の完全に合成のヒドロコロイド類は水に可溶または分散可能であって、有利には下記のものから得ることができるアニオン系ポリウレタン類を含むがこれらに限定されない。
Ａａ）１分子当たり２個以上の活性水素原子を有する少なくとも１種類の化合物；
Ａｂ）酸または塩の基を有する少なくとも１種類のジオール；及び
Ａｃ）少なくとも１種類のジイソシアネート。

幾つかの態様において、成分Ａａ）は特には、各場合で数平均分子量が３０００以下であるジオール、アミノアルコール、ジアミン、ポリエステロール、ポリエーテロールまたはそれらの混合物であり、その化合物の３モル％以下がトリオール類またはトリアミン類で置き換わっていても良い。好ましいものは、ジオール類及びポリエステルジオール類である。特に、成分Ａａ）は、成分Ａａ）の総重量基準で少なくとも５０重量％のポリエステルジオールを有する。好適なポリエステルジオール類は、ポリウレタン類の製造に通常使用されるもの全てであり、詳細には、フタル酸とジエチレングリコール、イソフタル酸と１，４−ブタンジオール、イソフタル酸／アジピン酸と１，６−ヘキサンジオール、ならびにアジピン酸とエチレングリコールまたは５−ＮａＳＯ_３−イソフタル酸、フタル酸、アジピン酸と１，６−ヘキサンジオールの反応生成物である。

使用可能なジオール類の例としては、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、ネオペンチルグリコール、ポリエーテロール類があり、例えば分子量３０００以下のポリエチレングリコール類、数平均分子量３０００以下のエチレンオキサイドとプロピレンオキサイドのブロックコポリマー類、あるいはランダムに分散した、あるいはブロックの形でのコポリマー化アルキレンオキサイド単位を有するエチレンオキサイド、プロピレンオキサイド及びブチレンオキサイドのブロックコポリマー類がある。好ましいものは、エチレングリコール、ネオペンチルグリコール、ジ−、トリ−、テトラ−、ペンタ−またはヘキサエチレングリコールである。使用可能な他のジオール類は、ポリ（α−ヒドロキシカルボン酸）ジオール類である。

好適なアミノアルコール類は、例えば２−アミノエタノール、２−（Ｎ−メチルアミノ）エタノール、３−アミノプロパノールまたは４−アミノブタノールである。

好適なジアミン類の例は、エチレンジアミン、プロピレンジアミン、１，４−ジアミノブタン及び１，６−ジアミノヘキサン、ならびにポリアルキレンオキサイド類のアンモニアによるアミノ化によって製造可能なα，ω−ジアミン類である。

成分Ａｂ）は特には、ジメチロールプロパン酸または下記式の化合物である。

式中、ＲＲは各場合において、Ｃ_２〜Ｃ_１８アルキレン基であり、ＭｅはＮａまたはＫである。

成分Ａｃ）は特には、ヘキサメチレンジイソシアネート、イソホロンジイソシアネート、メチルジフェニルイソシアネート（ＭＤＩ）及び／またはトリレンジイソシアネートである。

幾つかの態様において、上記ポリウレタン類は、群Ａａ）及びＡｂ）の化合物を、７０〜１３０℃の温度で不活性溶媒中、不活性ガス雰囲気下にて、群Ａｃ）の化合物と反応させることで得ることができる。この反応は適宜に、鎖延長剤存在下に実施して、比較的高い分子量のポリウレタン類を製造することができる。ポリウレタン類の製造で通常行われるように、成分［（Ａａ）＋（Ａｂ）］：Ａｃは有利には、０．８〜１．１：１のモル比で用いられる。上記ポリウレタン類の酸価は、組成及び成分（Ａａ）及び（Ａｂ）混合物中の成分（Ａｂ）の化合物の濃度によって決まる。

幾つかの態様において、上記ポリウレタン類は、フィケンチャー（Ｈ．Ｆｉｋｅｎｔｓｃｈｅｒ）によるＫ値（２５℃及びｐＨ７でのＮ−メチルピロリドン中、濃度０．１重量％で測定）として１５〜１００、好ましくは２５〜５０を有する。固有粘度とも称されるＫ値は、ポリマー溶液の粘度測定によって測定することが容易なパラメータであることから、ポリマーの特性決定用に工業的に非常に多くの場合で使用される。酸基を有するポリウレタン類は、中和（部分的または完全）後に、水溶性であるか、乳化剤を用いなくとも分散可能である。そのポリウレタンの塩類は通常、未中和ポリウレタン類と比較して、水での溶解度や分散性が高い。上記ポリウレタン類の中和に使用可能な塩基は、水酸化ナトリウム溶液、水酸化カリウム溶液、ソーダ、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウムまたは炭酸水素カリウムなどのアルカリ金属塩基、及び水酸化カルシウム、酸化カルシウム、水酸化マグネシウムまたは炭酸マグネシウムなどのアルカリ土類金属塩基、ならびにアンモニア及びアミン類である。２−アミノ−２−メチルプロパノール、ジエチルアミノプロピルアミン及びトリイソプロパノールアミンは、酸基を有するポリウレタン類の中和に特に有用であることが明らかになっている。酸基を有するポリウレタン類の中和は、２種類以上の塩基の混合物、例えば水酸化ナトリウムとトリイソプロパノールアミンの混合物を用いて行うこともできる。所期の用途に応じて、中和は例えば２０〜４０％という部分的なものとすることができるか、完全なもの、すなわち１００％とすることができる。これらのポリマー類及びそれの製造については、ＤＥ−Ａ−４２２５０４５（これにより、全範囲を参照したものとする）に、より詳細に記載されている。

Ｂ．下記の水溶性または水分散性カチオン系ポリウレタン類及びポリ尿素類。
Ｂａ）予め１分子当たり２個以上の活性水素原子を有する１以上の化合物と反応させておくことができる少なくとも１種類のジイソシアネート；及び
Ｂｂ）少なくとも１種類のジオール、１級もしくは２級アミノアルコール、１級もしくは２級ジアミン、あるいは１以上の３級、４級またはプロトン化３級アミノ窒素原子を有する１級もしくは２級トリアミン。

好ましいジイソシアネート類は、Ａ）で前述したものである。２個以上の活性水素原子を有する化合物は、ジオール類、アミノアルコール類、ジアミン類、ポリエステロール類、ポリアミドジアミン類及びポリエーテロール類である。この種の好適な化合物は、Ａ）で前述したものである。

ポリウレタン類は、Ａ）で前述した方法に従って製造される。例えば乳酸などのカルボン酸を用いたプロトン化、あるいは例えばハロゲン化もしくは硫酸Ｃ_１〜Ｃ_４アルキルなどのアルキル化剤を用いた４級化によって、存在する３級アミノ窒素原子から、ポリ尿素において、電荷を有するカチオン性基を得ることができる。そのようなアルキル化剤の例としては、塩化エチル、臭化エチル、塩化メチル、臭化メチル、硫酸ジメチル及び硫酸ジエチルがある。これらのポリマー類及びそれの製造については、ＤＥ−Ａ−４２４１１１８（参照により本明細書に援用する）に、より詳細に記載されている。
Ｃ．下記のカルボキシレート基を有する直鎖ポルウレタン類

Ｃａ）下記式の２，２−ヒドロキシメチル−置換カルボン酸：

上記式中、ＲＲ′は水素原子またはＣ_１〜Ｃ_２０アルキル基であり、それはポリウレタン１ｇ当たりカルボキシル基が０．３５〜２．２５ミリ当量でポリウレタン中に存在するという条件を満足する量で使用される。

Ｃｂ）ポリウレタン重量に基づいて１０〜９０重量％の２個以下の活性水素原子を有する１種類以上の有機化合物；ならびに、
Ｃｃ）１種類以上の有機ジイソシアネート。

ポリウレタンに存在するカルボキシル基は最終的には、少なくとも部分的に好適な塩基によって中和される。これらのポリマー類及びそれの製造については、ＥＰ−Ａ−６１９１１１（参照により本明細書に援用する）に記載されている。

Ｄ．トリ−もしくはテトラカルボン酸類の無水物とジオール類、ジアミン類もしくはアミノアルコール類のカルボキシル含有重縮合生成物（ポリエステル類、ポリアミド類またはポリエステルアミド類）。これらのポリマー類及びそれの製造については、ＤＥ−Ａ−４２２４７６１（参照により本明細書に援用する）に、より詳細に記載されている。

Ｅ．参照により本明細書に援用するＤＥ−Ａ−４３１４３０５、３６２７９７０及び２９−１７−５０４に記載のポリアクリレート類及びポリメタクリレート類。

本発明により使用されるポリマーは好ましくは、１５〜１００、好ましくは２５〜５０のＫ値を有する。そのポリマーは、本発明による組成物中、組成物の総重量基準で、０．２〜２０重量％の範囲の量で存在する。塩は、ポリマーの交換性を高める上で有効な量で使用する。塩は通常は、組成物の総重量基準で、０．０２〜１０重量％、好ましくは０．０５〜５重量％、特には０．１〜３重量％の量で使用する。

最終の化粧用製剤または皮膚用製剤中での１以上のヒドロコロイドの総量は、製剤の総重量基準で、有利には５重量％未満、好ましくは０．０５〜３．０重量％、特に好ましくは０．１〜１．０重量％となるように選択される。

幾つかの好適な態様において、本発明は少なくとも１つのシリコンオイル相を含む。シリコンオイル相は、通常、組成物の０．１％乃至２０％ｍコポリマー０．５％乃至１０％、より好ましくは０．５％乃至５％である。前記シリコンオイル相は好ましくは、１つ以上のシリコン化合物を含む。

幾つかの態様において、シリコン化合物は直鎖、分岐鎖、及び環状シリコンを含む、流体である。本発明に有用なシリコン流体はポリアルキルシロキサン流体、ポリアリルシロキサン流体、環状及び／又は直鎖ポリアルキルシロキサン、ポリアルコキシル化シリコン、アミノ及び／又は４級アンモニウム修飾シリコン、ポリアルキルアリルシロキサン、又はポリエーテルシロキサンコポリマー、及びこれらの混合物を含むシリコンを含む。揮発性又は不揮発性のシリコン流体も本発明に用いることができる。シリコン流体は、通常、２００，０００未満の数平均分子量を有する。好適な態様において、好適なシリコン流体は１００，０００以下、好ましくは５０００以下、及びより好ましくは１０，０００以下の分子量を有する。好ましくは、前記シリコン流体は１００乃至５０，０００及び好ましくは２００乃至４０，０００の範囲の重量平均分子量を有するシリコン流体から選択される。通常、シリコン流体は２５℃において、０．６５乃至６００，０００ｍｍ２Ｓ−１、好ましくは０．６５乃至１０，０００ｍｍ２Ｓ−１の粘度を有する。前記粘度は１９７０年７月２９日発行のＤｏｗＣｏｒｎｉｎｇＣｏｒｐｏｒａｔｅＴｅｓｔＭｅｔｈｏｄＣＴＭ０００４に定義されているガラスキャピラリー粘度計により測定することができる。本発明に用いることができる好適なポリジメチルシロキサンは、市場で入手可能な化合物を含む（例えば、ＧｅｎｅｒａｌＥｌｅｃｔｒｉｃＣｏｍｐａｎｙ及びＤｏｗＣｏｒｎｉｎｇ）。非揮発性のポリアルキルアリルシロキサン、例えば、２５℃において０．６５乃至３０，０００ｍｍ２ｓ−１の粘度を有するポリメチルフェニルシロキサン（ＧｅｎｅｒａｌＥｌｅｃｔｒｉｃＣｏｍｐａｎｙ及びＤｏｗＣｏｒｎｉｎｇ）も有用である。本発明に有用な環状ポリジメチルシロキサンは３−７（ＣＨ_３）_２ＳｉＯ部分、好ましくは５以上の部分を取り込んでいる環状構造を有するものである。

追加的な態様において、シリコンガムの本発明に用いることができる。幾つかの好適な態様において、シリコンオイル相はシリコンガム又はシリコンガムを含むシリコンの混合物を含む。通常、シリコンガムは２５℃において、１，０００，０００ｍｍ２ｓ−１の粘度を有する。前記シリコンガムは当業者に知られているジメチコーンを含む（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，１５２，４１６；及びＮｏｌｌ、ＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＳｉｌｉｃｏｎｅｓ、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ［１９６８］参照）。ＧｅｎｅｒａｌＥｌｅｃｔｒｉｃＳｉｌｉｃｏｎｅＲｕｂｂｅｒＰｒｏｄｕｃｔＤａｔａＳｈｅｅｔｓＳＥ３０、ＳＥ３３、ＳＥ５４及びＳＥ７６に記載されているシリコンガムも本発明に用いることができる。シリコンガムの特定の例は、ポリジメチルシロキサン、（ポリジメチルシロキサン）（メチルビニルシロキサン）コポリマー、ポリ（ジメチルシロキサン）（ジフェニル）（メチルビニルシロキサンコポリマー及び／又はこれらの混合物を含む。本発明に用いることができる好適なシリコンガムは２００，０００乃至４，０００，０００の分子量を結うｓリポソーム、ジメチコーン、ジメチコーンコポリマー、ジメチコーン及びこれらの混合物から選択される。

幾つかの態様において、シリコン相はシリコンガム流体ブレンドの一部として組成物に取り込まれる。前記シリコンガムがシリコンガム流体ブレンドの一部として取り込まれる場合、前記シリコンガムは前記シリコンガム流体ブレンドの重量により５％乃至４０％、特に１０％乃至２０％含まれる。好適なシリコンガム流体ブレンドは、
ｉ）分子量２００，０００乃至４，０００，０００を有し、ジメチコノル、フルオロシリコン、及びジメチコーン及びこれらの混合物から選択されるシリコン及び
ｉｉ）０．６５ｍｍ２ｓ−１乃至１００ｍｍ２ｓ−１の粘度を有するシリコン流体であるキャリア、
よりなる。ｉ）及びｉｉ）の割合は１０：９０乃至２０：８０である。前記シリコンガムベース組成物は最終粘度が、１００ｍｍ２ｓ−１乃至１００，０００ｍｍ２ｓ−１であり、好ましくは５００ｍｍ２ｓ−１乃至１０，０００ｍｍ２ｓ−１である。

本発明のシリコンオイル相に有用な更なるシリコン組成物は、任意で流体キャリア中に分散されている架橋ポリオルガノシロキサンポリマーを含む。通常、キャリアと一緒の架橋ポリオルガノシロキサンポリマーは０．１％乃至２０％、好ましくは０．５％乃至１０％、より好ましくは０．５％乃至５％、組成物に含まれる。そのようなポリマーは、架橋剤により架橋されたポリオルガノシロキサンポリマーを含む。好適なポリオルガノシロキサンポリマーはメチルビニルジメチコーン、メチルビニルジフェニルジメチコーン、及びメチルビニルフェニルメチルジフェニルジメチコーンを含む。

本発明のシリコンオイル相に有用な更なるシリコン組成物は、少なくとも１つのポリジオルガノシロキサンセグメント及び少なくとも１つのポリオキシアルキレンセグメントを含むポリジオルガノシロキサン−ポリオキシアルキレンコポリマーを含む（例えば、ＷＯ９８／２２０８５参照）。好適なポリジオルガノシロキサン−ポリオキシアルキレンコポリマーはＷａｃｋｅｒ−ＣｈｅｍｉｅＧｍｂＨより販売されているＢＥＬＳＩＬ（商標）である。本発明に用いることができる特に好適なコポリマー流体はＣＴＦＡ指定のジメチコーン／ジメチコーンコポリマーを有するＤｏｗＣｏｒｎｉｎｇＤＣ３２２５Ｃを含む。

更なる態様において、本発明の組成物は有機サンスクリーンを含む。幾つかの態様において、好適なサンスクリーンは、ＵＶＡ吸収性質を有し、ＵＶＢ吸収性質を有するものもある。更にこれらの混合物を有するものもある。サンスクリーン有効成分の好適な量は、所望のＵＶ保護のほかに、組成物の太陽光線保護指数（ＳＰＦ）に依存する。ＰＳＦは同一固体において、保護されていない皮膚において最小の紅斑が生産されるのに必要とされる紫外線エネルギーと、保護された皮膚において同様の最小の紅斑が生成されるのに必要とされる紫外線エネルギーの割合である。用いるサンスクリーンの両は好ましくは２％乃至２０％、及びより好ましくは４％乃至４０％である。好適なサンスクリーンは、米国、日本、及びヨーロッパで用いられているものを含むがこれらに限定されない。本発明の組成物は２乃至３０、より好ましくは４乃至３０、より好ましくは４乃至１５のＳＰＦｗｐを有する。

幾つかの態様において、本発明の組成物は１つ以上のＵＶＡ（３２０ｎｍ乃至４００ｎｍ）吸収性日焼け止め有効成分を有する。好適なＵＶＡ吸収日焼け止め有効成分はジベンゾイルメタン（例えば、ＬｏｗｅａｎｄＳｈａａｔｈ（ｅｄｓ．）、Ｓｕｎｓｃｒｅｅｎｓ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ、ａｎｄＲｅｇｕｌａｔｏｒｙＡｓｐｅｃｔｓ、ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ参照）、その誘導体、メチルアントラニレート及びホモメチル１−Ｎ−アセチルアントラニレート等のアントラニル酸塩、及びそれらの混合物を含むがこれらに限定されない。前記ＵＶＡ吸収日焼け止め有効成分は好ましくは、単独で又は組成物中の他の成分と組み合わせて幅広い範囲のＵＶＡスペクトルを吸収するのに有効である範囲の量で組成物中に存在する。

好適なＵＶＡ吸収日焼け止め有効成分は、ベンゾイルメタン日焼け止め有効成分、及び／又はそれらの誘導体を含む。それらは、２−メチルジベンゾイルメタン、４−メチルジベンゾイルメタン、４−イソプロピルジベンゾイルメタン、４−タート−ブチルイルジベンゾイルメタン、２，４−ジメチルジベンゾイルメタン、２，５−ジメチルジベンゾイルメタン、４，４’−ジイソプロピルベンソイルメタン、４−（１，１−ジメチルエチル）−４’−メトキシジベンゾイルメタン、２−メチル−５−ジイソプロピル−４’−メトキシジベンゾイルメタン、２−メチル−５−ｔｅｒｔ‐ブチル−４’−メトキシ−ジベンゾイルメタン、２，４−ジメチル−４’−メトキシジベンゾイルメタン、２，６−ジメチル−４’−メトキシジベンゾイルメタン、及びこれらの混合物を含むがこれらに限定されない。好適なベンゾイル日焼け止め有効成分は４−（１，１−ジメチルエチル）−４’−メトキシジベンゾイルメタン、４−イソプロピルジベンゾイルメタン、及びこれらの混合物の中から選択される。好適な日焼け止め有効成分は４−（１，１−ジメチルエチル）−４’−メトキシジベンゾイルメタンである。

日焼け止め有効成分、４−（１，１−ジメチルエチル）−４’−メトキシジベンゾイルメタン、はブチルメトキシジベンゾイルメタン又は「アボベンゾン」として知られており、ＧｉｖａｕｄａｎＲｏｕｒｅ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）よりＰａｒｓｏｌ（商標）１７８９として、及びＭｅｒｃｋ＆Ｃｏ．、ＩｎｃよりＥｕｓｏｌｅｘ（商標）９０２０として販売されている。日焼け止め有効成分、４−イソプロピルジベンゾイルメタンもイソプロピルジベンゾイルメタンとして知られており、Ｅｕｓｏｌｅｘ（商標）８０２０として知られている。

幾つかの態様において、本発明の組成物は更に、２９０ｎｍ乃至３２０ｎｍの波長を有するＵＶ光線を吸収するＵＶＢ日焼け止め有効成分を１つ以上含む。前記ＵＶＢ吸収日焼け止め有効成分は好ましくは、単独で又は組成物中の他の成分と組み合わせて幅広い範囲のＵＶＢスペクトルを吸収するのに有効である範囲の量で組成物中に存在する。前記組成物は、ＵＶＢ吸収有機サンスクリーンの重量に基づいて０．１％乃至２０％、好ましくは０．１％乃至１２％、より好ましくは０．５％乃至８％含まれるか、又は関連する規定に記載されている量で含まれる。

各種ＵＶＢ日焼け止め有効成分が本発明に用いられる（例えば、Ｕ．Ｓ．ＰａｔＮｏ．５，０８７，３７２；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，０７３，３７１；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，０７３，３７２；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，９３７，３７０；及びＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，９９９，１８６参照）。好適なＵＶＢサンスクリーン有効成分は、２−エチルヘキシル−２−シアノ−３，２−エチルヘキシルＮ、Ｎ−ジメチル−ｐ−アミノベンゼン、ｐ−アミノベンゼン酸、オキシベンゾン、ホモメチルザリシレート、オクチルザリシレート、４，４’−メトキシ−ｔ−ブチルジベンゾメタン、４−イソプロピルジベンゾイルメタン、３−ベンジルジエンカンファー、３−（４−メチルベンジルジエン）カンファー、２−フェニル−ベンンジミダゾール−５−スルホン酸（ＰＢＳＡ）、桂皮酸エステル及び２−エチルヘキシル−ｐ−メトキシシナメート等のそれらの誘導体、ザリシレートエステル及びトリエタノールアミンザリシレート、エチルヘキシルザリシレート、オクチルジメチルパラ−アミノ安息香酸等のそれらの誘導体、カンファー誘導体及びそれらの誘導体、及びこれらの混合物から選択される。好適な有機日焼け止め有効成分は、２−メチルヘキシル−２−シアノ−３，３−ジフェニルアクリレート、２−フェニル−ベンジミダゾール−５−スルホン酸（ＰＢＳＡ）、オクチル−メトキシシナメート及びこれらの混合物を含む。酸性日焼け止めの塩及び酸中和形態も本発明に有効である。

従って、幾つかの態様において、本発明は以下を含むがこれらに限定されない任意の有機ＵＶ−Ａ及びＵＶ−Ｂフィルターを含む組成物を提供する。

幾つかの態様において、ＵＶ光線に曝すことにより分解する性質を有する成分を含む場合には、本発明に有用な組成物の一つに少なくとも１つの有効成分を添加して、ＵＶＡサンスクリーンを安定化して、ＵＶＡ保護能を維持させることができる。これらの安定化能を有する数多くの物質が報告されており、ＵＶＡサンスクリーン及び組成物全体の性能を補うように選択することができる（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ５，９７２，３１６；５，９６８，４８５；５，９３５，５５６；５，８２７，５０８；及びＷＯ００／０６１１０参照）。安定化剤の好適な例は、２−エチルヘキシル−２−シアノ−３，３−ジフェニルアクリレート、エチル−２−シアノ−３，３−−ジフェニルアクリレート、２−エチルヘキシル−３，３−ジフェニルアクリレート、エチル−３，３−ビス（４−メトキシフェニル）アクリレート、ジエチルヘキシル２，６−ナフタレート、及びこれらの混合物を含む（ＳｙｍｒｉｓｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ）。

幾つかの好適な態様において、本発明は、クレンジングミルク、サンスクリーンローション、栄養クリーム、デイクリーム、ナイトクリーム等として用いられるのに適した化粧品及び／又は皮膚用製剤を提供する。幾つかの態様において、本発明は、薬物（例えば、医薬品）組成物の化合物に用いられる。幾つかの態様において、本発明は装飾的化粧品（例えば、メイクアップ製剤）に用いられる。

幾つかの特に好適な態様において、本発明は化粧品及び／又は皮膚用製剤に有用な日焼け止めを提供する。本発明の態様に用いられる活性成分に加えて、幾つかの態様において、これらの製剤は好ましくは少なくとも１つの幅広い波長フィルター及び／又は少なくとも１つのＵＶＡフィルター基質及び／又は少なくとも１つのＵＶＢフィルター基質及び／又は少なくとも１つの無機顔料を追加的に含んでいる。

更なる態様において、本発明はＵＶ保護化合物を含むが、主に日焼け止めとしては用いられないパーソナルケア組成物を提供する。例えば、幾つかの態様において、ＵＶ−Ａ及び／又はＵＶ−Ｂフィルター基質はデイクリーム又はヘアクリーム組成物中に取り込まれる。

追加的な態様において、本発明のパーソナルケア組成物は慣習的に使用されている場合には、化粧品として有用な成分、助剤、及び／又は添加剤（例えば、抗酸化剤、保存料、抗酸化剤、防腐剤、殺菌剤、香水、消泡剤、色素、色づけ作用を有する色素、増粘剤、表面活性物質、乳化剤、皮膚軟化薬、加湿器、及び／または湿潤剤、脂肪、オイル、ワックス、またはアルコール、ポリオ−ル、重合体、泡安定剤、電解液、有機溶媒、またはシリコン誘導体などの化粧品又は皮膚科用製剤に通常使用されている成分）を含む。即ち、製品及び使用者に適している限り、各種成分が本発明の各種態様に用いられる。

幾つかの態様において、少なくとも１つの成分を本発明の組成物に添加して、前記組成物の皮膚における効果を改善する、特に前記組成物が皮膚に適用されたときに水による洗浄又はこすって皮膚から剥離することに対して耐性を付与することができる。そのような成分の例は、アクリレート／Ｃ１２−２２アルキルメタクリレートコポリマー、アクリレート／アクリレートコポリマー、ジメチオニン、ジメチコノール、グラフト−コポリル（ジメチルシロキサン／ｉ−ブチルメタクリレート）、ラウリルジメチコーン、ＰＶＰ／ヘキサデカンコポリマー、ＰＶＰ／エイコセンコポリマー、トリコンタニルＰＶＰ、及びトリメトキシシロキシシリケートを含むがこれらに限定されない。

有機サンスクリーンに加えて、幾つかの態様において、本発明の組成物は、無機物理的酸ブロックを含む（例えば、ＴＦＡＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｏｓｍｅｔｉｃＩｎｇｒｅｄｉｅｎｔＤｉｃｔｉｏｎａｒｙ、６^ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ、ｐｐ．１０２６−２８ａｎｄ１１０３［１９９５］；Ｓａｙｒｅｅｔａｌ、Ｊ．Ｓｏｃ．Ｃｏｓｍｅｔ．Ｃｈｅｍ．、４１：１０３−１０９［１９９０］；及びＬｏｗｅｅｔａｌ．、ｓｕｐｒａ）。好適な無機物理的サンブロックは酸化亜鉛、及び二酸化チタン、及びこれらの混合物を含む。

好適な態様を用いる場合、前記組成物が皮膚に適用されるときに、前記物理的サンブロックは、組成物中に、重量により０．５％乃至２０％、好ましくは０．５％乃至１０％、及びより好ましくは０．５％乃至５％含まれている。二酸化チタンを用いる場合、前記二酸化チタンはアナターゼ、ルチル、又は非結晶構造を含むことができる。

サンスクリーン用にミクロ化されたグレードの二酸化チタン及び酸化亜鉛の生産は、ＴａｙｃａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｕｎｉｑｅｍａ、ＳｈｉｎｅｔｓｕＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｋｅｒｒ−ＭｃＧｅｅ、Ｎａｎｏｐｈａｓｅ、Ｎａｎｏｓｏｕｒｃｅ、Ｓａｃｈｔｌｅｂｅｎ、Ｅｌｅｍｅｎｔｉｓ、ａｎｄＢＡＳＦＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ並びにこれらの会社の関連会社により行われているがこれらの会社に限定されない。物理的に太陽光線をブロックする粒子（例えば、酸化チタン及び二酸化亜鉛）は、アミノ酸、アルミナ、アルミニウムステアレート、アルミニウムラウレート等のアルミニウム化合物、カルボン酸及びそれらの塩（例えば、ステアリン酸及びその塩）、レクチン等のリン脂質、有機シリコン化合物、シリカシリケート及びそれらの混合物等の無機シリコン化合物を含むがこれらに限定されない。幾つかの好適な態様において、本発明の組成物は重量により、０，１％乃至１５％、好ましくは０．１％乃至７％、より好ましくは０．５％乃至５％、無機サンスクリーンを含む。

幾つかの乳化剤の有害な効果に加えて、他のファクターへの露出は、皮と毛を傷つけると知られている。例えば、皮膚における太陽光の紫外線部分の有害な影響は、一般的に知られている。２９０ｎｍ未満（即ち、ＵＶＣ領域）の波長を有する光線は大気中のオゾン層に吸収されるけれども、２９０ｎｍ乃至３２０ｎｍ（即ち、ＵＶＢ領域）の範囲の光線は紅斑、簡単な日焼け、または深刻さを変える火傷さえ起こす。日光の最大紅斑活性は約３０８ｎｍ付近の相対的に狭い範囲で起こる。

有害なＵＶＢ光線に対して保護を提供する多くの物質が知られている。最も一般的なものは、３−ｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅｃａｍｐｈｏｒの、４−アミノ安息香酸の、桂皮酸の、サルチル酸の、ベンゾフェノンの、そして２−フェニル−ベンズイミダゾールの誘導体である。

ＵＶＡもダメージを引き起こすことから、約３２０ｎｍ乃至約４００ｎｍの間のＵＶＡ領域の範囲の利用可能なフィルター基質を有することも重要である。長い間、３２０ｎｍと４００ｎｍの間の波長を持っている長波のＵＶ−Ａ光線が取るに足りない生物学の行動だけを有していて、それに応じて、ＵＶ−Ｂ光線がヒトの皮膚において最も光損傷を生じていることがに間違って仮定されていた。しかしながら、近年の数多くの研究がＵＶ−Ａ光線は、皮膚における、光学動態、特に光学毒性、反応及び染色体損傷のトリガーの観点からＵＶ−Ｂよりも有害であることを証明した。更に、ＵＶ−Ｂ光線の有害な影響はＵＶ−Ａ光線に曝すことにより増強される。

ＵＶ−Ａ光線自体による及び日常的な状況下でのＵＶ−Ａ光線は、支持体内における、皮膚の構造及び伸びに重要な成分であるコラーゲン及びエラスチン繊維に十分ダメージを与えることが示されている。このことは、皮膚において、時期早尚な「加齢」となる、慢性的な光誘発性の変化を誘発する。通常光より誘発される皮膚の加齢の臨床的態様は、しわ及び線の増加させ、引き続いて不規則なしわが生じる。更に、皮膚は光誘発性皮膚の加齢により影響を受け、不規則な色素沈着を引き起こす。場合によっては、ブラウン・パッチ、角化上皮、癌、または悪性黒色腫が生じる。毎日のＵＶ露出の結果による時期早尚な皮膚の加齢現象はランゲルハンス細胞の活動低下及びわずかではあるが慢性の炎症有することにより特徴付けられる。

地球に届く紫外線の約９０％はＵＶ−Ａである。地球に届くＵＶ−Ｂ光線の量は多くのファクターに依存している（例えば、年月日及び／又は緯度）が、地球に届くＵＶ−Ａ光線のレベルは日時及び地理的条件にかかわりなく毎日ほぼ一定している。更に、ＵＶ−Ａ光線の大部分は生物の表皮を突き抜けるのに対して、ＵＶ−Ｂ光線の約７０％は角質層に保持される。例えば、光保護フィルター基質を化粧品又は皮膚科の製剤に適用することによるＵＶ−Ａ光線を妨げる保護は基本的に重要である。

一般的に光を妨げる基質の光吸収性質は、良く知られており、記録されている。その大部分は、これらの物質を取り込んだ各製品に付随するドキュメントおける厳しい規格を与えあられていいながら、そのような物質の使用において、好適な事例を挙げている大部分の工業的国々において記録されている。最終製中の基質の濃度についてに、皮膚自身中または皮膚表面と物質との相互作用はしばしば、どれほどよく組成物が各個人に機能するかついてに影響を与えるかもしれない変数を示すので、吸光度値はガイドを提供する。しかし、均一に、厚く、フィルタ物質が皮膚の角質層中、及びその上で分散される態様において、このことを前もって評価することは通常難しい。

ＵＶ−Ａ保護性能を試験するために、通常当業者に知られているＩＰＤの方法（ＥＰＤ５ｉｍｍｅｄｉａｔｅｐｉｇｍｅｎｔｄａｒｋｅｎｉｎｇ）が利用される。この方法は日焼け防止指数の決意に類似していて、生じた色素沈着が無防備の皮膚のために生産されたそれと同じになる前に、どのくらい長波長のＵＶ−Ａ光線によって光をあてられることができるかを光線保護組成物による保護を利用して示す方法を提供する。

ヨーロッパを通じて確立された他の試験方法は、オーストラリア規格ＡＳ／ＮＺＳ２６０４：１９９７である。この方において、ＵＶ−Ａ領域における製剤の吸収が測定される。この条件を満たすために、製剤は３２０乃至３６０ｎｍの領域のＵＶ−Ａ光線を少なくとも９０％吸収しなければならない。

また、ＵＶ−Ａ領域で高いフィルタ作用を有する既知の光保護フィルタ物質の使用濃度は、しばしば、それらが、固体形態の他の物質と結合されるという現実の事実によって制限されることは日焼け止め組成物の製剤化において興味深い。従って、相対的に高いサンプロテクト効果とＵＶ−Ａプロテクション効果を達成することに関しての困難性が存在する。しかしながら、これらの困難性を克服し及び／又は埋め合わせるための手段を知っている。

光保護フィルター物質は通常、高価であり、幾つかの光保護フィルター物質は更に化粧品及び／又は皮膚科製品中に比較的高濃度で組み込むことが困難であるため、本発明のいくつかの態様は、従来のＵＶ−Ａ光線保護フィルター物質を低い濃度で含むにも関わらず、高いＵＶ−Ａ保護性能を達成することができる、単純でコスト効果のよい製剤を意図している。

しかしながら、当分野において知られているように、ＵＶ光線は皮膚の代謝を阻害する生成物を生産する光化学反応を誘導する。これらの光化学反応生成物は、主にフリーラジカル化合物（例えば、ヒドロキシラジカル）である。フリーラジカルに定義されていない皮膚の中で形成される光化学反応生成物は高い活性を有する制御不可能な二次反応を誘発する。しかしながら、短命なエポキシドと多くの他が生じるときに、一重項酸素（酸素分子の非自由基励起状態）がＵＶ照射の間に生じる。例えば、一重項酸素はその増大した反応性のため標準の三重項酸素（フリー・ラジカル基底状態）と異なる。しかしながら、励起した、活性のある「フリー・ラジカル」三重項状態はも存在する。従って、これらの反応を防止するために、抗酸化剤、及び／または自由ラジカルスカベンジャーは化粧品、及び／または皮膚科学的製剤において用いることができる。

光保護用の化粧品及び／又は皮膚科学的製剤に用いられる光保護剤としての化合物は、通常、光保護性能が良い。しかしながら、それらは、満足なやり方で意図する製剤中にそれらを取り込むことにおいて困難伴うという不利益も有する。

上で示したように、太陽光線保護指数（ＳＰＦ）は光保護組成物により保護されている皮膚が未処理の皮膚と同じ紅斑反応が生じる前にどれくらい長く光照射を受けられるかを示す（即ち、未保護皮膚を比較して１０倍長く光を当てることができる場合をＳＰＦ＝１０）。消費者は「ＳＰＦ」の意味をよく理解しており、製品上のＳＰＦの値に基づきスキンケア及び／又はヘアケア製品を選択する。消費者は、早期老化と同様に主として過剰な太陽照射と皮膚癌の間の関連の増大した一般の人々の認識による日焼け防止指数について製造業者から信頼できる情報を受け取ることを期待している。更に、世界の幾つかの部分では、オゾン層の破壊は主要な懸念事項である。皮膚タイプと予測される太陽照射に依存して、消費者は下のまたはより高いＳＰＦと製品を選ぶ。しかしながら、しかし、特に、子供と色白皮膚を持つヒトに適用される製品において、消費者は比較的高いＳＰＦ指数を選ぶ傾向があるように思われる。幾つかの態様において、本発明の発明は従来の光保護フィルター物質を相対的に低い濃度で含むが、消費者に許容されうる程度のＳＰＦ値を有する組成物を提供する。

幾つかの好適な態様において、本発明により提供される日焼け止め製剤の主要な成分は水又は水性液体；水性エタノール液体；天然オイル及び／又は天然オイルを化学修飾したオイル及び／又は合成オイル；脂肪、ワックス、及び他の天然及び合成脂肪基質、好ましくは脂肪酸と少ない炭素数を有するアルコール｛例えば、イソプロパノール、プロピレングリコール、又はグリセロール｝とのエステル、又は脂肪アルコールと少ない炭素数を有するアルカン酸又は脂肪酸とのエステル；アルコール；少ない炭素数のジオール又はポリオール及びそれらのエステル、好ましくはエタノール、イソプロパノール、プロピレングリコール、グリセロール、エチレングリコール、エチレングリコールモノエチル又はモノブチルエーテル、プロピレングリコールモノメチル、モノエチル又はモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチル又はモノエチルエーテル、及び類似体である。代替的な好適な態様において、これらの成分の２つ以上の混合物も本発明の発明に用いることができる。

幾つかの好適な態様において、本発明の組成物は保存料も含む。そのような保存料はペンチレングリコール、エチレングリコール、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びそれらの塩、クロロヘキシジン（及びその２酢酸、ジヒロドクロライド、ジグルコネート誘導体）、１，１，１−トリクロロ−２−メチル−２−プロパノール、パラクロロメタキシレノール、ポリヘキサメチレンビグアミドヒドロクロライド、デヒドロ酢酸、ジアソリジニル尿素、２，４−ジクロロベンジルアルコール、４，４−ジメチル−１，３−オキサゾリジン、ホルムアルデヒド（例えば、重合を防ぐために、１０−１５％のメタノールを含む３７％水溶液）、グルタラアルデヒド、ジメチルタントイン（ｄｉｍｅｔｈｙｌｉｄａｎｔｏｉｎ）、イミダゾール尿素、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、オルト−フェニルフェノール、４−ヒドロキシ安息香酸エステル（例えば、パラベン）及びそのメチル−、エチル−、イソプロピル−、ブチル−、及びイソブチルエステル、トリクロサン、２−フェノキシエタノール、フェニルメルクリック酢酸、ホウ酸、硝酸、クアテリウム−１５、ザリシレート、サリチル及びその塩、カルシウム、カルシウムソルベート、ソルビン酸、及びその塩、ヨードプロパニルブチルカルバニミエートジンクパイチオン（ｉｏｄｏｐｒｏｐａｎｙｌｂｕｔｙｌｃａｒｂａｍａｔｅｚｉｎｃｐｙｒｉｔｈｉｏｎｅ）、ベンジルアルコール、５−ブロモ−５−ニトロ−１，３−ジオキサン、２−ブロモ―２−ニトロプロパン−１，３−ジオール、安息香酸及びその塩、亜硫酸エステル、重亜硫酸塩、フェノキシエタノール、クロロキシレノール、ジアゾロジニイル尿素、メチルパラベン、プロピルパラベン、イソプロピルパラベン、イソブチルパラベン、ブチルパラベン、エチルパラベン、フェノキシエタノールＰＧ、及び塩化ベンザルコニウムを含むがこれらに限定されない。

更なる態様において、食品及び試料に用いる保存料は本発明の各種組成物に用いることができる。以下の表において、そのような化合物及びそれらのＥナンバーを列挙する。しかしながら、本発明の各種態様には追加的な保存料も用いることができることから、本発明をこれらの特定の保存料に限定することは意図しない。

各種態様に用いることができる追加的な保存料は、ジブロモシアノブタン（２−ブロモ−２−ブロモメチルグルタロジニトリル）、３−ヨード−２−プロピニルブチルカルバメート、２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１，３−ジオール、イミダゾールジニルウレア、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾール−３−オン、２−クロロアセトアミド、ベンズアルコニウムクロライド、ベンジルアルコール、及びホルムアルデヒド供与体を含むがこれらに限定されない。本発明の各種態様に用いることができる更なる保存料は、フェニルヒドロキシアリルエーテル、特に多くの微生物に対して抗バクテリア及び抗菌作用を示す「フェノキシエタノール」として知られているものを含む。

中和剤、香料及び香料安定剤、着色料等の任意の成分も本発明に用いることができる。追加的な成分は最終製品における皮膚の柔軟性／滑らかさを高めることが好ましい。更に、そのような組成物は製品の審美性を損ねないことも好ましい。

他の追加的な物質は、水溶性及び／又は非水溶性保存料のほかに、角質溶解剤を含む。前記角質溶解剤は０．１％乃至５％（例えば、Ｇｅｒｍａｌｌ１１５、ヒドロキシ安息抗酸化剤のメチル、エチル、プロピル、及び／又はブチルエステル、ベンジルアルコール、ＬｏｎｚａよりＧｌｙｄａｎｔＰｌｕｓの商標で販売されているＤＭＤＭヒダントインイドプロパニルブチルカルバネート、ＥＤＴＡ、ＥＵＸＹＬ（商標）Ｋ４００、ブロモポル（２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１，３−ジオール）及びフェノキシプロパノール）を含む。抗菌剤（例えば、ＩＲＧＡＳＡＮ（商標））、及びフェノキシエタノール（好ましくは０．１％乃至５％）、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、及びデンプン挿入ナトリウムポリアクリレート等の可溶性又はコロイド可溶性保湿剤（例えば、ＣｅｌａｎｅｓｅＳｕｐｅｒａｂｓｏｒｂｅｎｔＭａｔｅｒｉａｌｓ、Ｐｏｒｔｓｍｉｔｈ、ＶＡより販売されているＳＡＮＷＥＴ（商標）ＩＭ−ＩＯＯＯ、ＩＭ−１５００及びＩＭ−２５００；例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，０７６，６６３参照）、ビタミンＡ、ビタミンＢ、ビタミンＣ、ビタミンＥ及びこれらの誘導体及びフィタンチオール等のこれらの構成単位、及びビタミンＫ及び脂肪酸ドデカトリエノール等のこれらの構成成分、アルファ及びベータヒドロキシ酸、アロエベラ、スフィンゴシン及びフィトスフィンゴシン、コレステロール、皮膚白化剤、Ｎ−アセチルシステイン、顔料、トリクロサン及びトリクロロカーボンとして知られているＴＣＣ／ＴＣＳ等の抗菌剤、香料及び香料安定剤も追加的な成分として含まれる。アルファヒドロキシ酸の例は、グリコール酸、酪酸、マレイン酸、クエン酸であり、グリコール酸と共に使用されるのは、アンモニウムグリコレート、アルファ−ヒドロキシエタン酸、アルファ−ヒドロキシオクタン酸、アルファヒドロキシカプリル酸、ヒドロキシカプリル酸、混合フルーツ酸、トリ−アルファフルーツ酸、トリプルフルーツ酸、サトウキビ抽出物、アルファヒドロキシ及び植物、脂肪酸に架橋されている１−アルファヒドロキシ酸グリコマー（例えば、アルファニュートリアム）を含む。アルファヒドロキシ酸の好適な例は、グリコール酸及び酪酸である。アルファヒドロキシ酸のレベルは１０％までである。本発明に用いることができる添加剤化合物は天然又は合成物由来かに関わらず好適なものが用いられるので、本発明を特定の添加剤に限定することは意図しない。

他の好適な物質は水溶性又は水可溶性の保存料を含む。前記保存料は０．１％乃至５％（例えば、Ｇｅｒｍａｌｌ１１５、ヒドロキシ安息抗酸化剤のメチル、エチル、プロピル、及び／又はブチルエステル、ベンジルアルコール、ＬｏｎｚａよりＧｌｙｄａｎｔＰｌｕｓの商標で販売されているＤＭＤＭヒダントインイドプロパニルブチルカルバネート、ＥＤＴＡ、ＥＵＸＹＬ（商標）Ｋ４００、ブロモポル（２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１，３−ジオール）及びフェノキシプロパノール）を含む。抗菌剤（例えば、ＩＲＧＡＳＡＮ（商標））、及びフェノキシエタノール（好ましくは０．１％乃至５％）、０．１％乃至５％）含まれる。トリクロサン及びトリクロロカーボンとして知られているＴＣＣ／ＴＣＳ等の抗菌剤も追加的な成分として含まれる。

２，４，４’−トリクロロ−２’−ヒドロキシジフェニルエーテル（即ち、ＩＲＧＡＳＡＮ（商標））、１，６−ジ（４−クロロフェニルビグアニド）ヘキサン（即ち、ＣＨＬＯＲＨＥＸＩＤＩＮ）、３，４，４’−トリクロロカルバニリド、四級アンモニウム化合物、小球根のオイル、ミントオイル、タイムオイル、トリエチルシトレート、ＦＡＲＮＥＳＯＬ（商標）（３，７，１１−トリエチル− ２，６，１０−ドデカトリエン−ｌ−オール）、を含むがこれらに限定されない他の抗菌剤、並びに参照により本明細書に援用されるＤＥ−３７４０１８６、ＤＥ−３９３８１４０、ＤＥ−４２０４３２１、ＤＥ−４２２９７０７、ＤＥ−４３０９３７２、ＤＥ−４４１１６６４、ＤＥ−１９５４１９６７、ＤＥ−１９５４３６９５、ＤＥ−１９５４３６９６、ＤＥ−１９５４７１６０、ＤＥ−１９６０２１０８、ＤＥ−１９６０２１１０、ＤＥ−１９６０２１１１、ＤＥ−１９６３１００３、ＤＥ−１９６３１００４、ＤＥ−１９６３４０１９、ＤＥ−４２２９７３７、ＤＥ−４２３７０８１、ＤＥ−４３２４２１９、ＤＥ−４４２９４６７、ＤＥ−４４２３４１０、及びＤＥ−１９５１６７０５に記載の活性成分及び／又は活性成分の組合せも同様に本発明の各種態様に用いることができる。更なる態様において、ソディウムハイドロゲネートカーボンも本発明の幾つかの組成物に取り込まれる。しかしながら、同様の効果を有する各種化合物は本発明の各種態様に用いることができることから、本発明の特定の抗菌剤又は抗菌剤の組合せに限定することを意図しない。

本発明のパーソナルケア組成物の追加的な態様において、抗刺激及び／又は抗炎症作用を有する化合物が含まれる。幾つかの態様において、バチルアルコール（オクタデシルグリセリルエーテル）、セラキルアルコール（９−オクタデセニルグリセリルエーテル）、チミルアルコール（ヘキサデシルグリセリルエーテル）、ビサボロール及び／又はパンテノールが含まれる。しかしながら、本発明における製品において好適な抗刺激及び／又は抗炎症作用を有する各種化合物が本発明の発明に用いられることから、本発明を特定の抗刺激及び／又は抗炎症作用を有する化合物に限定することを意図しない。

親水性ゲル化剤を含む酸基の中和に用いるのに適した中和剤は水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、モネタロアミン（ｍｏｎｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎ）、ジエタノールアミン、アミノメチルプロパノール、トリス−緩衝及びトリエタノールアミンを含む。

本発明に用いることができる他の好適な物質は当業者に知られている他の多くの機能成分及び／又は活性成分を含む（例えば、ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＭａｔｅｒｉａｌｓ、ＮｏｒｔｈＡｍｅｒｉｃａｎａｎｄＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＥｄｉｔｉｏｎｓ、ＭＣＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．［２００３］参照）。上で説明したように、皮膚限定的な例は、角質層溶解剤；ヒアルロン酸及びコンドロイチン硫酸等の可溶性又はコロイド可溶性保湿剤；ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＫ等のビタミン及びそれらの誘導体及びそれらの構成単位；フィタントリオール；ドデカトリエノール等の脂肪族アルコール；アルファ及びベータヒドロキシ酸；アロエベラ；スフィンゴシン及びフィトスフィンゴシン；コレルテロース；皮膚白化剤；Ｎ−アセチルシステイン；顔料を含む。アルファヒドロキシ酸の例は、グリコール酸、酪酸、マレイン酸、クエン酸（合成又は天然由来のいずれでもよく、単独又は組み合わせて用いてもよい）、及びこれらのエステル又は緩衝された組み合わせでもよい。アルファヒドロキシ酸の他の例は、アルファヒドロキシエタン酸、アルファヒドロキシオクタン酸、アルファヒドロキシカプリル酸、及びヒドロキシカプリル酸を含む。好適なアルファヒドロキシ酸は、グリコール酸及び酪酸を含む。アルファヒドロキシ酸１０％までの量で組成物に含むことが好ましい。

任意の好適な物質は、油相に含まれる非水溶性の顔料を含む。本発明の組成物に用いるのに好適な顔料は有機物及び／又は無機物でよい。「顔料」の語は、マット仕上げ剤、光分散剤、及びマイカ、セラサイト、及びカルボネート塩等の製剤化補助剤等の、少ない色味又はすくない光沢を有する物質を含む。好適な顔料の更なる例は、二酸化チタン、酸化鉄、酸化鉄のグルタミン酸塩、酸化亜鉛、塩酸化ビスマス、ウルトラマリンブルー（分散前及び／又はコート前又はそれ以外のいずれでもよい）Ｄ＆Ｃダイ及びレーキ、ＦＤ＆Ｃ指定色、カルミン等の天然色素添加剤、及びこれらの混合物を含む。組成物のタイプに依存して、顔料の混合物も本発明の組成物に用いられる。保湿性、皮膚感覚、及び乳液との相溶性の観点から本発明に用いられる顔料が処方される。幾つかの態様において、前記顔料はアミノ酸、シリコン、レクチン、及びエステルオイルを含むがこれらに限定されない化合物と共に処方される。

更なる態様において、本発明は少なくとも１つの無機顔料を含む。幾つかの好適な態様において、これらの無機顔料は金属酸化物及び／又は水にわずかしか溶けない又は不溶性の金属化合物である。例としては、酸化亜鉛（ＺｎＯ）、チタニウム（ＴｉＯ_２）、鉄（例えば、Ｆｅ_２Ｏ_３）、ジルコニウム（ＺｒＯ_２）、シリカ（ＳｉＯ_２）、マンガン（例えば、ＭｎＯ）、アルミニウム（Ａｌ_２Ｏ_３）、ロウ（例えば、Ｃｅ_２Ｏ_３）、及びこれらの酸化物の混合物、並びにこれらのブレンドを含む。幾つかの態様において、金属酸化物はマイクロファイングレード（ｍｉｃｒｏｆｉｎｅｇｒａｄｅ）である。一方他の態様では、前記金属酸化物は顔料グレード（ｐｉｇｍｅｎｔｇｒａｄｅ）である。更なる態様において、これらの金属酸化物は、マイクロファイン及びピグメントグレードの混合物である。追加的な態様において、これらの無機顔料はコートされている（即ち、それらは表面処理されている）。幾つかの好適な態様において、その表面は薄い疎水性フィルムでコートされている。幾つかの他の好適な態様において、これらの表面は薄い疎水性フィルムでコートされている。

本明細書において、本発明の組成物中に用いられる「ピグメント」、「カラーピグメント」、及び「ダイ」の語は、色を組成物に提供する任意の化合物、及び／又は本発明の組成物が適用される表面（例えば、皮膚及び／又はヘア）に色を付与する任意の化合物を意味する。幾つかの態様において、前記ダイ及び顔料はＣｏｓｍｅｔｉｃｓＤｉｒｅｃｔｉｖｅ又はＥＣにより提供される化粧品色素のリストから選択される。大部分のケースにおいて、これらのダイ及び顔料は食品に適用される色素とは異なる。好適な顔料／ダイは、酸化チタン、マイカ、酸化鉄（例えば、Ｆｅ２Ｏ３、Ｆｅ３Ｏ４、ＦｅＯ（ＯＨ））及び／又は酸化スズを例として含む。有利な顔料／ダイは、カルミン、ベルリンフブルー、酸化クロムグリーン、ウルトラマリンブルー及び／又はマンガンバイオレットを例として含む。幾つかの好適な態様において、前記顔料／ダイは以下の表にあげるものを含むがこれらに限定されない。色指数（ＣｏｌｏｕｒＩｎｄｅｘＮｕｍｂｅｒｓ（ＣＩＮ））は当業者に知られている（ＳｏｃｉｅｔｙｏｆＤｙｅｒｓａｎｄＣｏｌｏｕｒｉｓｔｓ、ＲｏｗｅＣｏｌｏｕｒＩｎｄｅｘ、３ｒｄＥｄｉｔｉｏｎ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ、［１９７１］参照）。

更なる態様において、本発明の組成物は、更に以下のグループから選択される１つ以上の基質を含む；２，４−ジヒドロキシアゾベンゼン、１−（２’−クロロ−４’−ニトロ−１’−フェニルアゾ）−２−ヒドロキシナフタレン、セレスレッド（ＣｅｒｅｓＲｅｄ）、２−（４−スルホ−１−ナフチルアゾ）−１−ナフトール−４−スルホン酸、２−ヒドロキシ−１，２’−アゾナフタレン−１’−スルホン酸のカルシウム塩、１−（２−スルホ−４−メチル−１−フェニルアゾ）−２−ナフチルカルボン酸のカルシウム及びバリウム塩、１−（２−スルホ−１−ナフチルアゾ）−２−ヒドロキシナフタレン−３−カルボン酸のカルシウム塩、１−（４−スルホ−１−フェニルアゾ）−２−ナフトール−６−スルホン酸のアルミニウム塩、１−（４−スルホ−１−ナフチルアゾ）−２−ナフトール−３，６−ジスルホン酸のアルミニウム塩、１−（４−スルホ−１−ナフチルアゾ）−２−ナフトール−６，８−ジスルホン酸、４−（４−−１−ナフチルアゾ）−１−（４−スルホフェニル）−５−ヒドロキシピラゾロン−３−カルボン酸のアルミニウム塩、４，５−ジブロモフルオレセインのアルミニウム及びジルコニウム塩、２，４，５，７−テトラブロモフルオロセインのアルミニウム及びジルコニウム塩、３’，４’，５’，６’−テトラクロロ−２，４，５，７−テトラフルオロセインのアルミニウム及びジルコニウム塩、２，４，５，７、−テトラヨードフルオロセインのアルミニウム塩、キノフェタロンジスルホン酸のアルミニウム塩、インディゴジスルホン酸のアルミニウム塩、赤及び黒酸化鉄（ＣＩＮ：７７４９１（レッド）及び７７４９９（ブラック））、酸化鉄水和物（ＣＩＮ：７７４９２）、マンガンアンモニウムジフォスフェート及び二酸化チタンからなる群より選択される。

更なる態様において、パプリカ抽出物、βカロテン、又はコチニール等の油溶性天然ダイも本発明に用いることができる。

更なる追加的な態様において、本発明のゲルクリーム組成物は真珠光沢を有する顔料を含む。幾つかの好適な態様において、「天然真珠光沢顔料」（例えば、「パールエッセンス」［グアニジン／ハイポキサンチンを魚の骨由来の結晶と混合したもの］、「マザーオブパール」（ｍｏｔｈｅｒｏｆｐｅａｒｌ）［二枚貝を粉末にしたもの］、及び「単一結晶パールセントセグメント」（例えば、ビスマスオキシクロライド［ＢｉＯＣｌ］）、及び「層状基質顔料」（例えば、マイカ／酸化金属）様々な真珠光沢を有する顔料が本発明に用いられる。

パールセント顔料の基質は、粉末顔料、ビスマスオキシクロライド及び／又は二酸化チタンのカストロールオイル分散体、マイカ上のビスマスオキシクロライド及び／又は二酸化チタンを含むがこれらに限定されない。例えば、ＣＩＮ７７１６３に列挙されている光沢顔料も有効である。

本発明に用いるマイカ／酸化金属に基づくパールセント顔料の追加的なグループを以下に示す。

好適な態様において、Ｔｉｍｉｒｏｎ、Ｃｏｌｏｒｏｎａ、又はＤｉｃｈｒｏｎａの商標でＭｅｒｋから販売されているパールセント顔料も本発明に用いることができる。しかしながら、本発明を本明細書に開示されている特定の顔料に限定することは意図しない。即ち、本発明に用いるパールセント顔料は、多くの源から入手可能である。例えば、マイカとは違う基質にも例えば、シリカ等にも更なる金属酸化物をコートすることができる。例えば、ＴｉＯ_２及びＦｅ_２Ｏ_３（「ｒｏｎａｓｐｈｅｒｅｓ」）でコートされたＳｉＯ_２粒子はメルクから市販されており、本発明に用いられる細いラインを光学的に減退するのに有効である（しわを消すのによい）。追加的にｇｏｎｉｏｃｈｒｏｍａｔｉｃｅｆｆｅｃｔを有する顔料は例えば、ＢＡＳＦよりＳｉｃｏｐｅａｒｌＦａｎｔａｓｔｉｃｏの商標で販売されている。

代替的な態様において、この基質（例えば、マイカ）は含まれない。幾つかの好適な態様において、ＳｉＯ_２を用いて調製されたパールセント顔料を選択する。ゴニオクロマチック効果も有するそのような顔料はＢＡＳＦよりＳｉｃｏｐｅａｒｌＦａｎｔａｓｔｉｃｏの商標名で取引されている。

更なる態様において、二酸化チタンでコートしたカルシウムナトリウムホウケイ酸塩を基にしたＥｎｇｅｌｈａｒｄ／Ｍｅａｒｌから得られた顔料も用いることができる。これらはＲｅｆｌｅｃｋｓの商標で販売されている。４０ｎｍ乃至１８０ｎｍの粒子サイズのものは色に加えて、ツヤを出すことができる。

更なる態様において、ＦｌｏｒａＴｅｃｈより販売されているＭｅｔａｓｏｍｅｓＳｔａｎｄｅｒｓｄ／Ｇｌｉｔｔｅｒの各色（イエロー、レッド、グリーン、ブルー）も本発明に用いることができる。このグリッター粒子は各種補助剤及びダイとの混合されている（例えば、ＣＩＮ１９１４０、７７００７、７７２８９、７７４９１を有するダイとの混合物）。

幾つかの態様において、前記ダイ及び顔料は独立して、又は混合物として存在する。代替的な態様において、これらは異なる色彩効果を提供するために、異なる層厚でお互いにコートされていてもよい。幾つかの態様において、ダイ及び顔料の総量は各種濃度の範囲から選択される（例えば、約０．１重量％乃至約３０重量％、好ましくは約０．５重量％乃至約１５重量％、及び最も好ましくは約１．０乃至約１０重量％、重量％は製品の総重量に基づく）。

本発明の組成物のｐＨは３．５乃至１０、好ましくは４乃至８、より好ましくは５乃至７である。最終製品中のｐＨは酸、塩基、又は緩衝塩により、組成物生物の形態及び組成物に必要なｐＨに基づいて必要に応じて調製される。

本発明の組成物は当分野において知られている好適な技術により調製される。通常、水相及び／又は油相は、任意の順番で、仕切られているそれぞれの相に任意の順番で物質を添加することにより、別々に調整される。もし、最終製品が乳液であれば、２つの相は、内激しい撹拌、又は必要によりホモジナイズして内部相の液滴を小さくすることにより結合される。高い揮発性を有する、又は加水分解又は高温における分解しやすい任意の成分は、緩やかに撹拌しながら、製造工程の最後の方、可能であれば乳化後に添加される。調剤量及び添加量は、製品の性能を基準として決定される。

本発明の幾つかの態様において、ＶＥＧＦ活性を低くする方法が提供される。これらの態様において、この方法は、有機固体に必要に応じて本明細書で定義する組成物の有効量を適用する工程を含む。追加的な態様において、本発明はヒト及び他の動物を含む有機固体を必要に応じて処理する化合物を提供する。

幾つかの更なる態様において、本発明は少なくとも１つのクレアチン及び／またはクレアチン誘導体を含む。クレアチンは、下記の構造を特徴とする。

本発明のパーソナルケア組成物の幾つかの好適な態様において、リン酸クレアチン及び硫酸クレアチン、酢酸クレアチン、アスコルビン酸クレアチンならびに１価もしくは多価アルコールでカルボキシル基がエステル化された誘導体も用いることができる。

幾つかの追加的な態様において、本発明のパーソナルケア組成物はＬ−カルニチン［３−ヒドロキシ−４−（トリメチルアンモニオ）ブチロベタイン］を含む。アシルカルニチンは以下の構造式を有する。

式中、Ｒは炭素原子数１０以下の分岐及び未分岐アルキル基の群から選択される。幾つかの好適な態様において、ポリピオニルカルニチン及び／又はアセチルカルニチンが用いられる。Ｄ体及びＬ体のラセミ体などのエナンチオマー混合物、及び両方のエナンチオマー（Ｄ型及びＬ型）とも、本発明のパーソナルケア組成物に用いることができる。

さらに別の有利な有効成分は、セリコシド（ｓｅｒｉｃｏｓｉｄｅ）、ピリドキソール、ビタミンＫ及びビオチンならびに芳香物質である。当然のことながら、本発明による製剤で使用することができる前記有効成分及び有効成分の組み合わせのリストは限定的なものではない。有効成分は、個別にまたは互いとの組み合わせで用いることができる。本発明による製剤におけるそのような有効成分（１以上の化合物）の量は、製剤の総重量基準で、好ましくは０．００１〜３０重量％、特に好ましくは０．０５〜２０重量％、特には０．１〜１０重量％である。当業者は意図する組成物に応じて好適な有効成分の量を有する組成物を製剤化することができる。

更なる態様において、本発明は本発明の組成物を製造する方法を提供する。幾つかの態様において、これらの方法はオイル相及び水相の成分を別々に結合し及び過熱し、その後これらを一緒にして撹拌する工程を含む。幾つかの好適な態様において、これらの相はホモジナイズされる。幾つかの特に好適な態様において、前記組成物は中程度から高程度のエネルギーを用いて、有利には、回転数が１００００ｒｐｍ（好ましくは２５００乃至７７００ｒｐｍ）までのギアリム分散器を用いて撹拌される。

６．２実施例
本発明は以下の実施例において更に詳細に説明されるが、これらは特許請求の範囲を限定するものではない。添付の図は明細書の重要な部分と本発明発明の説明として考えられる。本明細書において引用している文献の全ては参照により本明細書に援用される。以下の実施例は例示的なものであり、特許請求の範囲を限定するものではない。

以下で説明する実施例において、以下の略語を用いる：ＰＩ（プロテアイナーゼインヒビター）、ＢＢＩ（Ｂｏｗｍａｎ−Ｂｒｉｋインヒビター）、ＳＴＩ（ダイズトリプシンインヒビター）、ｐｐｍ（１００万分の１）、ＶＥＧＦ及びＶｅｇＦ（血管内皮成長因子）、Ｍ（モルの）、ｍＭ（ミリモルの）、μＭ（マイクロモルの）、ｎＭ（ナノモルの）、ｍｏｌ（モル）、ｍｍｏｌ（ミリモル）、μｍｏｌ（マイクロモル）、ｎｍｏｌ（ナノモル）、ｇｍ（グラム）、ｍｇ（ミリグラム）、μｇ（マイクログラム）、ｐｇ（ピコグラム）、Ｌ（リットル）、ｍｌ及びｍＬ（ミリリットル）、μｌ及びμＬ（マイクロリットル）、ｃｍ（センチメートル）、ｍｍ（ミリメートル）、μｍ（マイクロメートル）、ｎｍ（ナノメートル）、Ｕ（単位）、Ｖ（ボルト）、ＭＷ（分子量）、ｓｅｃ（秒）、ｍｉｎ（ｓ）（分）、ｈ（ｓ）及びｈｒ（ｓ）（時間）、℃（摂氏）、ＱＳ（十分量）、ＮＤ（検出不能）、ＳＡ（視認可能）、ＮＡ（適用不能）、ｒｐｍ（１分間あたりの回転数）、Ｈ_２Ｏ（水）、ｄＨ_２Ｏ（脱イオン水）、ＨＣｌ（塩酸）、ａａ（アミノ酸）、ｂｐ（ベースペア）、ｋｂ（キロベースペア）、ｋＤ（キロダルトン）、ｃＤＮＡ（転写又は相補ＤＮＡ）、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）、ｓｓＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）、ｄｓＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）、ｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド三リン酸）、ＲＮＡ（リボ核酸）、ＭｇＣｌ_２（塩化マグネシウム）、ＮａＣｌ（塩化ナトリウム）、ｗ／ｖ（容量対重量）、ｖ／ｖ（重量対重量）、ｇ（比重）、ＯＤ（光学密度）、Ａ_４０５（４０５ｎｍにおける吸光度）、Ｖｍａｘ（酵素触媒反応における最大速度）、ＦＧＦｒＩ（ＩＩＩｃ）（ＦＧＦ−５レセプター）、ダルベッコリン酸緩衝溶液（ＤＰＢＳ）、ＳＯＣ（２％バクト−トリプトン、０．５％バクトイースト抽出物、１０ｍＭＮａＣｌ、２．５ｍＭＫＣｌ）、テリフィックブロス（ＴｅｒｒｉｆｉｃＢｒｏｔｈ）（ＴＢ；１２ｇ／ｌバクト−トリプトン、２４ｇ／ｌグリセロール、２．３１ｇ／ｌＫＨ_２ＰＯ_４、及び１２．５４ｇ／ｌＫ_２ＨＰＯ_４）、ＯＤ_２８０（２８０ｎｍにおける光学密度）、ＯＤ_６００（６００ｎｍにおける光学密度）、ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水［１５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．２］）、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．２５％ＴＷＥＥＮ（商標）２０）、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、ｂＭＥ、ＢＭＥ及びβＭＥ（ベータメルカプトエタノール又は２−メルカプトエタノール）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン−クロライド）、Ｔｒｉｃｉｎｅ（トリシン）（Ｎ−［トリス−（ヒドロキシメチル）−メチル］グリシン）、ＣＨＥＳ（２−（Ｎ−シクロ−ヘキシルアミノ）エタン−スルホン酸）、ＴＡＰＳ（３−｛［トリス−（ヒドロキシメチル）−メチル］−アミノ｝−プロパンスルホン酸）、ＣＡＰＳ（３−（シクロ−ヘキシルアミノ）−プロパンスルホン酸）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、ＤＴＴ（１，４−ジチオ−ＤＬ−トレイトール）、Ｇｌｕｔ及びＧＳＨ（還元グルタチオン）、ＧＳＳＧ（酸化グルタチオン）、ＴＣＥＰ（トリス［２−カルボキシメチル］ホスフィン）、Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ−［２−エタンスルホン酸］）、ＨＢＳ（ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水）、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、Ｃｉ（キューリ）、ｍＣｉ（ミリキューリ）、μＣｉ（マイクロキューリ）、ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）、Ｏ／Ｗ（水中油型乳液）、Ｗ／Ｏ（油中水型乳液）、Ｗ／Ｓ（シリコン中水型乳液）、ピケリング乳液（固形化合物で安定化させた乳液）、ヒドロ分散液（乳化剤を含まない製剤）、ＰＩＴ（特定の乳液を作るときに用いる相逆転技術）、スティック（口紅、制汗剤、デオドラントを含むがこれらに限定されない、棒状の形態を有する製剤）、Ｔｓ（トシル）、Ｂｎ（ベンジル）、Ｐｈ（フェニル）、Ｍｓ（メシル）、Ｅｔ（エチル）、Ｍｅ（メチル）、Ｋｌｅｎｏｗ（ＤＮＡポリメラーゼＩラージフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ（クレノウ））フラグメント）、ｒｐｍ（一分当たりの回転数）、ＥＧＴＡ（エチレングリコール−ビス（β−アミノメチルエーテル）Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−四酢酸）、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ｂｌａ（β−ラクタマーゼ又はアンピシリン耐性遺伝子）、ＰＤＳ（成長因子を除去するために透析された、プラズマ由来ウシ血清；繊維質を取り除いたウシ血清の透析は、ＤＭＥＭに対して４℃で６時間撹拌して行う。培地を交換し、透析を一晩続ける；透析されたＰＤＳを２４時間後に収集し、０．２μｍフィルターで２回処理して滅菌する）、ＦＣＳ及びＦＢＳ（ウシ胎児血清）、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ（ＧＥヘルスケア、チャルフォントストリート、ジャイルズ、ＵＫ）、ＤＮＡ２．０（ＤＮＡ２．０、メロンパーク、カリフォルニア）、ＯＸＯＩＤ（オキシドベージングストーク、ハンプシャー、ＵＫ）、Ｍｅｇａｚｙｍｅ（メガザイムインターナショナルアイルランド社、ブレービジネスパーク、ブレー、ウィックロー、アイルランド）、Ｃｏｍｉｎｇ（コーニングライフサイエンス、コーニング、ニューヨーク）、ＮＥＮ（ＮＥＮライフサイエンスプロダクツ、ボストン、マサチューセッツ）、ＰｈａｒｍａＡＳ（ファルマＡＳ、オスロ、ノルウェイ）、Ｄｙｎａｌ（ダイナル、オスロ、ノルウェイ）、Ｂｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（バイオ−シンセシス、ルイスビル、テキサス）、ＡＴＣＣ（アメリカンタイプカルチャーコレクション、ロックイビル、メリーランド）、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ（ギブコ／ＢＲＬ、グランドアイランド、ニューヨーク）、Ｓｉｇｍａ（シグマケミカル社、セントルイス、ミズリー）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（ファルマシア、ピスカタウェイ、ニュージャージー）、ＮＣＢＩ（全米バイオテクノロジー情報センター）、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（アプライドバイオシステム、フォスターシティー、カリフォルニア）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（クローンテックラボラトリーズ、パロアルト、カリフォルニア）、Ｄｉｆｃｏ（ディフコラボラトリーズ、デトロイト、ミシガン）、Ｏｘｏｉｄ（オキシド社、オグデンスブルグ、ニューヨーク）、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ（オージントンバイオケミカル社、フリーホールド、ニュージャージー）、ＧＩＢＣＯＢＲＬ又はＧｉｂｃｏＢＲＬ（ライフテクノロジー社、ゲーサーズバーグ、メリーランド）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（ミリポア、ビルリカ、マサチューセッツ）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（バイオラド、ハーリーキューズ、カリフォルニア）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（インビトロジェン社、サンディエゴ、カリフォルニア）、ＮＥＢ（ニューイングランドバイオラドズ、ベバリー、マサチューセッツ）、Ｃａｍｂｅｒｅｘ（カンベレックスバイオプロダクツ、ロックフィールド、イリノイ）、Ｓｉｇｍａ（シグマケミカル社、セントルイス、ミズリー）、Ｐｉｅｒｃｅ（ピアスバイオテクノロジー、ロックフォード、イリノイ）、Ｔａｋａｒａ（タカラ・バイオ社、大津、日本）、Ｒｏｃｈｅ（ホフマン−ラ・ロッシュ、バーゼル、スイス）、ＥＭＳｃｉｅｎｃｅ（エムイーサイエン、ギブスタウン、ニュージャージー）、Ｑｉａｇｅｎ（キアゲン社、バレンシア、カリフォルニア）、Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ（バイオデザイン社、ソーコ、メイン）、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ（バイオソース、インターナショナル、カマリロ、カリフォルニア）、Ａｐｔａｇｅｎ（アプタゲンインク、ヘルドン、バージニア）、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅ（モレキュラーデバイス、コーポレーション、サニービル、カリフォルニア）、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネアポリ、ミネソタ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ストラタジェンクローニングシステムズ、ラホーヤ、カリフォルニア）、Ｍａｒｓｈ（マーシュバイオサイエンス、ロチェスター、ニューヨーク）、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ（バイオテック社、ウィヌースキー、バーモント）、Ｂｉａｃｏｒｅ（ビアコア社、ピスカタウェイ、ニュージャージー）、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ（ペプロテック、ロッキーヒル、ニュージャージー）、ＳｙｎＰｅｐ（シンペップ、ダブリン、カリフォルニア）、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（ケミコン、テクニカ、カリフォルニア）、ＣｌｉｎｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（クリニカルリサーチラボラトリーズ、インク、ピスカタウェイ、ニュージャージー）、及びＭｉｃｒｏｓｏｆｔ（マイクロソフト社、レドモンド、ワシントン）。
実施例１：Ｂ．スブチリスにおけるＢＣＥ１０３−ビタミン融合タンパク質の生成

この実施例において、Ｂ．スブチリスにおけるＢＣＥ１０３−ＢＢＰＩ融合タンパク質の生成を説明する。これらの実施例において用いる。Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグを有するプロＢＢＰＩタンパク質をコードしている合成遺伝子（ＯｐｅｒｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のＤＮＡ配列を以下に示す
ＡＡＣＣＴＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＡＡＧＣＴＴＧＧＣＣＴＧＣＴＴＡＴＧＡＡＡＴＣＡＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＣＡＧＣＡＡＴＧＡＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣＴＣＴＡＡＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＧＡＴＣＡＡＴＧＣＧＣＡＴＧＴＡＣＧＡＡＡＴＣＡＡＡＴＣＣＴＣＣＡＣＡＧＴＧＴＣＧＧＴＧＴＴＣＣＧＡＴＡＴＧＣＧＴＣＴＧＡＡＴＡＧＣＴＧＴＣＡＴＡＧＴＧＣＡＴＧＣＡＡＡＡＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＧＣＣＣＴＧＡＧＴＴＡＴＣＣＡＧＣＴＣＡＡＴＧＴＴＴＴＴＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣＡＣＧＧＡＣＴＴＣＴＧＣＴＡＴＧＡＧＣＣＡＴＧＴＡＡＡＣＣＡＡＧＣＧＡＧＧＡＣＧＡＴＡＡＡＧＡＧＡＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０）

前記合成遺伝子によりコードされるＣ末端ヘキサヒスチジンタグを有するプロＢＢＰＩのタンパク質配列を以下に示す
ＮＬＲＬＳＫＬＧＬＬＭＫＳＤＨＱＨＳＮＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＡＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＳＤＭＲＬＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＩＣＡＬＳＹＰＡＱＣＦＣＶＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥＤＤＫＥＮＨＨＨＨＨＨ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１）

ＢＢＰＩの主要な成熟形態をコードする合成遺伝組成物のＤＮＡ配列のを以下に示す：
ＧＡＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣＴＣＴＡＡＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＧＡＴＣＡＡＴＧＣＧＣＡＴＧＴＡＣＧＡＡＡＴＣＡＡＡＴＣＣＴＣＣＡＣＡＧＴＧＴＣＧＧＴＧＴＴＣＣＧＡＴＡＴＧＣＧＴＣＴＧＡＡＴＡＧＣＴＧＴＣＡＴＡＧＴＧＣＡＴＧＣＡＡＡＡＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＧＣＣＣＴＧＡＧＴＴＡＴＣＣＡＧＣＴＣＡＡＴＧＴＴＴＴＴＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣＡＣＧＧＡＣＴＴＣＴＧＣＴＡＴＧＡＧＣＣＡＴＧＴＡＡＡＣＣＡＡＧＣＧＡＧＧＡＣＧＡＴＡＡＡＧＡＧＡＡＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２）

前記合成遺伝子によりコードされるＢＢＰＩの主要な成熟形態のタンパク質配列を以下に示す：
ＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＡＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＳＤＭＲＬＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＩＣＡＬＳＹＰＡＱＣＦＣＶＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥＤＤＫＥＮ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）

ｐＪ１０３ベクターにおけるＢＣＥ１０３セルラーゼ発現カセットに融合するＢＢＩ遺伝子を増幅するために用いるＰＣＲプライマーを以下に示す：
ＢＢＩｆｕｓｉｏｎ＿ＦＷ：５’ＣＡＧＣＡＣＧＧＡＴＣＣＡＧＡＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣＴＣＴＡＡＡＣＣＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）

ＢＢＩＨｉｎｄＩＩＩ＿ＲＶ：５’ＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＴＴＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＣＧＧＡＴＴＴＣＣＴＴＣＡ
ＧＧＡＡＡＴＣＣＧＴＣＣＴＣＴＧＴＴＡＡＣＴＴＴＴＡＧＴＴＣＴＣＴＴＴＡＴＣＧＴＣＣＴＣＧＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：１５）

ＢＢＩＨＩＳ−ＨｉｎｄＩＩＩ＿ＲＶ：５’ＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＴＴＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＣＧＧＡＴＴＴＣＣＴＴＣＡＧＧＡＡＡＴＣＣＧＴＣＣＴＣＴＧＴＴＡＡＣＴＴＴＴＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＧＴＴＣＴＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：１６）

ＰＪＭ１０３インテグレーションベクターへクローンされたａｐｒＥ−ＢＣＥ−１０３−ＢＢＩヒスタグ発現カセットの配列を図１に示す。ｐＪＭ１０３ＢＢＩＨｉｓ発現カセットの概略的プラスミドマップを図１に示す。

バチルススブチルス（Ｂ．ｓｕｂｕｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥプロモーター及びシグナル配列に融合されたアルカリセルラーゼ（ＢＣＥ１０３）遺伝子（ｖａｎＳｏｌｉｇｅｎ、米国特許６，０６３，６１１を参照のこと。この文献を参照により本明細書に援用する）は、ｐＵＣＡＰＲ１０３（Ｓｈａｗｅｔａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３２０：３０３−３０９［２００２］）をＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとして（すなわち、ＢＣＥ１０３触媒ドメイン及び第一セルロース結合ドメインリンカーのみのコード配列を運搬するフラグメント）ｐＪＭ１０３内でクローニングした（Ｐｅｒｅｇｏ、「ＩｎｔｅｇｒａｔｉｏｎａｌｖｅｃｔｏｒｓｆｏｒｇｅｎｅｔｉｃｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｉｎＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ」Ｉｎ、ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓａｎｄＯｔｈｅｒＧｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉａ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、ａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ、Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ、Ｈｏｃｈ、ａｎｄＬｏｓｉｃｋ（ｅｄｓ）、ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＤ．Ｃ．、ｐｐ．６１５−６２４［１９９３］）。Ｃ末端にヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）を有するダイズボウマン−ブリック（Ｂｏｕｍａｎ−Ｂｒｉｋ）プロテアーゼインヒビター（ＢＢＩ）（Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔＡｃｃｅｓｓｉｏｎ＃Ｐ０１０５５；ＯｄａｎｉａｎｄＩｋｅｎａｋａ、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、７１：８３９−８４８［１９７２］参照のこと）は、オペロンテクノロジー（ＯｐｅｒｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｓ）（上記ＤＮＡ配列を参照のこと）により合成された。３’ＨｉｎｄＩＩＩ部位を用いてＢＢＩ遺伝子をｐＪＭ１０３ベクター内でクローンさせた後に、ＢＣＥ１０３遺伝子を用いる正確なりーディングフレーム中に５’ＢａｍＨＩ部位及び３’末端に導入された強力な転写終了因子を生成するプライマーを用いてＢＢＩ遺伝子をＰＣＲにより増幅した（全プライマーはＭＷＧＢｉｏｔｅｃｈ、ＯｌｉｇｏｓＥｔｃ．又はＯｐｅｒｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより合成された）。

合成ＢＢＩ遺伝子をテンプレートとして用いて、ＢＢＩｆｕｓｉｏｎ＿ＦＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）及びＢＢＩＨＩＳＨｉｎｄＩＩＩ＿ＲＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１６）、又はＢＢＩｆｕｓｉｏｎ＿ＦＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）及びＢＢＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ＿ＲＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１５）のプライマーをそれぞれ用いてＣ末端にＨｉｓ−Ｔａｇを有する、又は有しないＰＣＲフラグメントを生成した。他の方法で示さない限り、製造会社の説明書に従いハイフェデリティープラチナＴａｑポリメラーゼ（ＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＰＣＲを３０サイクル行った（５５℃のアニーリング温度）。ａｐｒＥ−ＢＣＥ発現カセットを運ぶＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして、ＰＣＲフラグメントをｐＪＭ１０３内でクローニングした。正確な遺伝子配列をＤＮＡ配列決定により確認した。

従って、図１に示すように、ＣＢＥ１０３セルラーゼ遺伝子によりコードされる第一ＣＢＤ（セルロース結合ドメイン）リンカー配列のＣ末端コード領域に対するフレーム中にＢＢＩ遺伝子（Ｈｉｓ−Ｔａｇを有するもの又は有しないもの）の成熟コード領域のＮ末端を融合した。それゆえ、２のＢＣＥ１０３のＣＢＤ（Ｓｈａｗｅｔａｌ．，上記）は、最終的な発現カセットの中のＢＢＩにより置き換えられ、ｐＪＭ１０３ＢＢＩ又はｐＪＭ１０３ＢＢＩｈｉｓとなった（図２参照）。このａｐｒＥプロモーターはＢＣＥ１０３−ＢＢＩ遺伝子融合体の発現を制御する（Ｆｅｒｒａｒｉｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂａｃｔ．、１７０：２８９−２９５［１９８８］及びＨｅｎｎｅｒｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂａｃｔ．、１７０：２９６−３００［１９８８］参照のこと）。

有用なバチルススブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞、ＢＧ３９３４ｃｏｍＫ（ｄｅｇＵ^Ｈｙ３２、ｏｐｐＡ、ΔｓｐｏＩＩＥ３５０１、ΔａｐｒＥ、ΔｎｐｒＥ、Δｅｐｒ、ΔｉｓｐＡ、Δｂｐｒ、ａｍｙＥ：：ｘｙｌＲＰｘｙｌＡｃｏｍＫ−ｐｈｌｅｏ）を発現プラスミド、ｐＪＭ１０３ＢＢＩ又はｐＪＭ１０３ＢＢＩｈｉｓで形質転換した。バクテリアは、キシロース誘発プロモーター（Ｈａｌｍｅｔａｌ．、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２１：７６３−７７５［１９９６］）の存在下でｃｏｍＫ遺伝子により誘発させることにより有用にすることができる。形質転換体を、５ μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むウリアブロスアガー（ＬｕｒｉａＢｒｏｔｈａｇａｒ）（ＬＡ）プレート上で選択した。遺伝子増幅での発現を高めるために、コロニーが縞状になり、抗生物質を含む培地における成長率がクロラムフェニコールが欠失している培地における成長率と同じになるまで、２５ μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを用いて、ＬＡプレート上で育成した。ＢＣＥ−ＢＢＩ融合タンパク質は、ＴＳＢ培地（ＯＸＯＩＤより市販されているトリプトンダイズブロス（ＴｒｙｐｔｏｎｅＳｏｙａＢｒｏｔｈ）、３０ｇ／Ｌ）又はＭＯＰＳベース合成培地中であるＭＢＤ培地において、３７ ℃の振とうフラスコの中で育成することにより生成された。ＮＨ_４Ｃｌ_２、ＦｅＳＯ_４、及びＣａＣｌ_２を培地から除き、３ｍＭのＫ_２ＨＰＯ_４を用い、６０ｍＭの尿素、７５ｇ／Ｌのグルコース及び１％のソイトン（ｓｏｙｔｏｎｅ）を供給した以外は、（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１１９：７３６−７４７［１９７４］）に記載されたようにＭＢＤ培地を調製した。微量栄養素は、１００倍濃度の貯蔵溶液として調製された。この溶液は１リットル中４００ｍｇのＦｅＳＯ_４−７Ｈ_２Ｏ、１００ｍｇのＭｎＳＯ_４−Ｈ_２Ｏ、１００ｍｇのＺｎＳＯ_４−７Ｈ_２Ｏ、５０ｍｇのＣｕＣｌ_２−２Ｈ_２Ｏ、１００ｍｇのＣｏＣｌ_２−６Ｈ_２Ｏ、１００ｍｇのＮａＭｏＯ_４−２Ｈ_２Ｏ、１００ｍｇのＮａ_２Ｂ_４Ｏ_７−１ＯＨ_２Ｏ、１０ｍｌの１ＭＣａＣｌ_２、及び１０ｍｌの０．５Ｍクエン酸ナトリウムを含む。

ＢＣＥ１０３−ＢＢＩ融合タンパク質は、標準的なタンパク質染色方法（例えば、ゲルコードブルー染色試薬（ＧｅｌＣｏｄｅＢｌｕｅＳｔａｉｎＲｅａｇｅｎｔ）Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて４４ｋＤａ付近のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の主要なタンパク質バンドとして視認することができる（ＥＭＳ緩衝液中１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、製造会社の説明書に従い操作。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。ＢＣＥ１０３−ＢＢＩ融合タンパク質は製造会社の説明書に記載の手順を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの免役ブロットにより確認された（ＢＭ染色体ウエスタンブロットキット（ＢＭＣｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇＫｉｔ）、ＲｏｃｈｅＡｐｐｌｉｅｄＳｃｉｅｎｃｅ抗ヒスタグ抗体又は抗ＢＣＥ１０３セルラーゼポリクローナル抗体を検出に用いた）。

ＢＣＥ１０３活性を決定するために、既知の方法を用いて、セルラーゼ分解を（０．２％コンオレッドで染色された１％カルボキシメチルセルロース又はメガザイムのアゾＣＭセルロースを含む）ＬＡセルラーゼインジケータープレート上で定性的に、あるいは合成基質、４−ニトロフェニル□−Ｄ−セロビオシド（シグマ）をもちいた培養ブロスにおいて、アッセイ緩衝液中の直接アッセイにより定量的にした。（例えば、ｖａｎＴｉｌｂｅｕｒｇｈｅｔａｌ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１６０：４５−５９［１９８８］参照。）

ＢＢＩ活性を決定するのアッセイ緩衝液の中でトリプシン抑制アッセイを行った。特に、標準曲線は、２ μｇ／ｍｌの標準ＢＢＩ溶液を１：１の連続希釈（１００ μＬＢＢＩ＋１００ｍｌアッセイ緩衝液）することにより作製した。疎水性相互作用カラム（ＰＯＲＯＳＨＰ２、フェニルカラム、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、２０ｍＭＭＥＳｐＨ６．０中１ｍｇ／ｍｌトリプシン−キモトリプシンインヒビター（シグマカタログ＃Ｔ−９７７７）からこの標準ＢＢＩを精製した。このカラムを２０ｍＭＭＥＳｐＨ６．０で平衡化し、５ｍｇのインヒビターを負荷し、平衡化に用いた緩衝液で洗浄した、その後、ＢＢＩを水で溶出した。抑制アッセイで試験する未知のＢＢＩサンプルを、２以上のデータポイントが標準曲線の範囲内に入るように必要に応じて希釈した（通常、１：１０、１：１００、１：２００、１：１０００、１：２０００の希釈のサンプルの希釈率が試験され、必要に応じて希釈率を微調整した）。希釈した各標準ＢＢＩ及びサンプル２０μＬに、８０μＬの５ｎｇ／ｍｌのウシ脾臓トリプシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）（アッセイ緩衝液の中へ、１ｍｇ／ｍｌトリプシンストック溶液を希釈することにより作製された）。便宜上、この標準物質とサンプルを９６ウェルマイクロタイタープレート中に整列させた。混合及び２５℃１５分間のインキュベーションにより反応を行った。インキュベーションの後、０．５ｍｇ／ｍｌのトリプシン基質１００μＬ（ＤＭＳＯ中１００ｍｇ／ｍｌの溶液からアッセイ緩衝液の希釈により調整）、Ｓｕｃ−ＡＡＰＲ−ｐＮＡ（スクシニル−アラニン−アラインヒビター−プロリン−アルギニン−パラニトロアニリド、Ｂａｃｈｅｍ）を添加し、混合し、ＯＤ（Ａ_４０５）を１５分間モニターした。ペクトラマックス２５０（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ２５０）（ＭｏｌｅｃｕｌａｅｒＤｅｖｉｃｅｓ）を用いて少なくとも１２秒毎に一回記録をとった。記録されたデータのポイントは、各反応に対するＶｍａｘの決定に用いた。標準曲線は、ＢＢＩ濃度に対するＶｍａｘのプロットにより作製し、４の指標曲線に当てはめた。全てのデータのフィッティングは製造会社（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）が提供するソフトウェアを用いて行われた。未知サンプルのＢＢＩ濃度を標準曲線を用いて計算した。代替的に、ＢＢＩ活性は同じ手順を用いてウシ脾臓キモトリプシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）抑制を検出することにより測定された（キモトリプシンは、トリプシンと同じ濃度で用い、キモトリプシン活性は、１００μＬの０．４ｍｇ／ｍｌキモトリプシン基質、スクシニル−アラニン−アラニン−プロリン−パラニトロアニリド、（Ｂａｃｈｅｍ）の添加により測定された）。

振とうフラスコサンプル（２．８Ｌのフェルバッハ６バッフルフラスコ中５００ｍＭＭＢＤ培地、３７℃、２２５ｒｐｍ、６０時間後に収穫する）の力価が、通常、０．４乃至０．９ｍｇ／ｍｌＢＣＥ活性及び４０乃至１５０μｇ／ｍｌＢＢＩトリプシン抑制活性になるように培養が行われる。しかしながら、力価はバクテリア系統、培養培地及び育成条件（通気、温度、収穫時間等）の最適化により、更に改善することができる。

野生型ＢＢＩに対するＢＣＥ１０３融合に加えて、ＢＢＩに対する融合タンパク質変異体及びＢＣＥ１０３及びＢＢＩの間の各種リンカーを有する融合タンパク質は上で概説した方法を用いて、以下の実施例のように製造することができる。更に、融合タンパク質はＢＢＩを精製工程において第一ＣＢＤを用いることの助けとなる第二ＣＢＤリンカー（ＢＣＥ−ｃｂｄＤ−ＢＢＩ；実施例４を参照のこと）に結合させたときにも生成される。

実施例２
ＢＣＥ１０３−ＢＢＩ融合タンパク質としてのＢＢＩ反応部位ループのペプチド置換体の生成
この実施例では、ＢＣＥ１０３−ＢＢＩのようにＢＢＩ反応部位へ置換するペプチドを生成するための試験を説明する。これらの試験の各工程に用いるプライマー及び他の配列を以下に記載する。ＢＣＥ１０３融合部位（ＢａｍＩＩＩの位置）から遺伝子の終わりまでの１２ＢＢＩｃｋ８１配列を図３に示す。ＣＫ３７２８１ペプチド配列（ＡＣＹＮＬＹＧＷＴＣ（配列番号９））をトリプシン及びキモトリプシン抑制ループの両方に挿入した。

ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）部位直接変異誘発（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いたＢＢＩ遺伝子中にＥｃｏＲＩ部位を導入するために用いるプライマーは以下である。
ＢｏｗＢｅｃｏ−Ｆ
５’−ＧＡＴＡＴＧＣＧＴＣＴＧＡＡＴＴＣＣＴＧＴＣＡＴＡＧＴＧＣＡＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７）

ＢｏｗＢｅｃｏ−Ｒ
５’−ＡＴＧＣＡＣＴＡＴＧＡＣＡＧＧＡＡＴＴＣＡＧＡＣＧＣＡＴＡＴＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８）

ＶｅｇＦ結合ペプチドＣＫ３７２８１でトリプシン抑制部位を置換するためにアニールされ、ＢＢＩ遺伝子（ＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ）の中でクローニングされるＤＮＡオリゴヌクレオチド配列は以下である。
１ＢＢｃｋ８１＋
５’−ＣＴＡＡＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＧＡＴＣＡＡＴＧＣＧＣＡＴＧＴＴＡＴＡＡＴＴＴＧＴＡＴＧＧＧＴＧＧＡＣＴＴＧＴＣＧＣＴＧＣＡＧＣＧＡＴＡＴＧＣＧＴＣＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１９）

１ＢＢｃｋ８１−
５’− ＡＡＴＴＣＡＧＡＣＧＣＡＴＡＴＣＧＣＴＧＣＡＧＣＧＡＣＡＡＧＴＣＣＡＣＣＣＡＴＡＣＡＡＡＴＴＡＴＡＡＣＡＴＧＣＧＣＡＴＴＧＡＴＣＧＣＡＡＣＡＧＧＧＴＴＴＡＧＡＧＣＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２０）

ＶｅｇＦ結合ペプチドＣＫ３７２８１でキモトリプシン抑制部位を置換するためにアニールされ、ＢＢＩ遺伝子（ＥｃｏＲＩ−ＳａｃｌＩ）の中でクローニングされるＤＮＡオリゴヌクレオチド配列は以下である。
２ＢＢｃｋ８１＋
５’−ＡＡＴＴＣＣＴＧＴＣＡＴＡＧＴＧＣＣＴＧＣＡＡＡＡＧＣＴＧＣＧＣＡＴＧＴＴＡＴＡＡＣＣＴＧＴＡＣＧＧＧＴＧＧＡＣＣＴＧＴＴＴＴＴＧＣＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２１）

２ＢＢｃｋ８１−
５’−ＴＣＧＡＣＧＣＡＡＡＡＡＣＡＧＧＴＣＣＡＣＣＣＧＴＡＣＡＧＧＴＴＡＴＡＡＣＡＴＧＣＧＣＡＧＣＴＴＴＴＧＣＡＧＧＣＡＣＴＡＴＧＡＣＡＧＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２２）

合成ＢＢＩ遺伝子のトリプシン（ＳａｃＩ及びＥｃｏＲＩ制限部位）又はキモトリプシン（ＥｃｏＲＩ及びＳａＩＩ制限部位）反応部位ループに中にペプチドを導入するためのカセットを作るために用いるオリゴヌクレオチドペアのＤＮＡ配列を以下に記載する。これらのペプチドコード配列はｐ２ＪＭ１０３ＢＢＩ発現ベクター内にＳａｃＩ−ＳａｌＩフラグメントとして導入された。

Ｃｏｍｓｔａｔｉｎ（１^ｓｔループ）
ＣＴＡＡＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＧＡＴＣＡＡＴＧＣＧＣＡＴＧＴＧＴＴＧＴＴＣＡＧＧＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＣＣＡＣＣＧＴＴＧＴＣＧＣＴＧＣＡＧＣＧＡＴＡＴＧＣＧＴＣＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２３）
及び
ＡＡＴＴＣＡＧＡＣＧＣＡＴＡＴＣＧＣＴＧＣＡＧＣＧＡＣＡＡＣＧＧＴＧＧＴＧＡＣＣＣＣＡＧＴＣＣＴＧＡＡＣＡＡＣＡＣＡＴＧＣＧＣＡＴＴＧＡＴＣＧＣＡＡＣＡＧＧＧＴＴＴＡＧＡＧＣＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２４）

Ｃｏｍｓｔａｔｉｎ（２^ｎｄループ）
ＣＡＡＡＡＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＧＴＴＧＴＴＣＡＧＧＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＣＣＡＣＣＧＴＴＧＴＴＴＴＴＧＣＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２５）
及び
ＴＣＧＡＣＧＣＡＡＡＡＡＣＡＡＣＧＧＴＧＧＴＧＡＣＣＣＣＡＧＴＣＣＴＧＡＡＣＡＡＣＧＣＡＧＡＴＡＣＡＧＣＴＴＴＴＧＣＡＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２６）

Ｃ２ｃ（１^ｓｔループ）
ＣＴＡＡＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＧＡＴＣＡＡＴＧＣＡＧＣＴＧＴＧＧＴＣＧＴＡＡＡＡＴＣＣＣＧＡＴＣＣＡＧＴＧＴＣＧＣＴＧＣＡＧＣＧＡＴＡＴＧＣＧＴＣＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２７）
及び
ＡＡＴＴＣＡＧＡＣＧＣＡＴＡＴＣＧＣＴＧＣＡＧＣＧＡＣＡＣＴＧＧＡＴＣＧＧＧＡＴＴＴＴＡＣＧＡＣＣＡＣＡＧＣＴＧＣＡＴＴＧＡＴＣＧＣＡＡＣＡＧＧＧＴＴＴＡＧＡＧＣＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２８）

Ｃ３ｃ（１^ｓｔループ）
ＣＴＡＡＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＧＡＴＣＡＡＴＧＣＧＧＴＴＧＴＧＣＴＣＧＴＴＣＴＡＡＣＣＴＧＧＡＣＧＡＡＴＧＴＣＧＣＴＧＣＡＧＣＧＡＴＡＴＧＣＧＴＣＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２９）
及び
ＡＡＴＴＣＡＧＡＣＧＣＡＴＡＴＣＧＣＴＧＣＡＧＣＧＡＣＡＴＴＣＧＴＣＣＡＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＡＧＣＡＣＡＡＣＣＧＣＡＴＴＧＡＴＣＧＣＡＡＣＡＧＧＧＴＴＴＡＧＡＧＣＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３０）

Ｃ４ｃ（１^ｓｔループ）
ＣＴＡＡＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＧＡＴＣＡＡＴＧＣＧＧＴＴＧＴＣＡＧＣＧＴＧＣＴＣＴＧＣＣＧＡＴＣＣＴＧＴＧＴＣＧＣＴＧＣＡＧＣＧＡＴＡＴＧＣＧＴＣＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３１）
及び
ＡＡＴＴＣＡＧＡＣＧＣＡＴＡＴＣＧＣＴＧＣＡＧＣＧＡＣＡＣＡＧＧＡＴＣＧＧＣＡＧＡＧＣＡＣＧＣＴＧＡＣＡＡＣＣＧＣＡＴＴＧＡＴＣＧＣＡＡＣＡＧＧＧＴＴＴＡＧＡＧＣＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３２）

Ｃ５ｃ（１^ｓｔループ）
ＣＴＡＡＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＧＡＴＣＡＡＴＧＣＣＡＧＴＧＴＧＧＴＣＧＴＣＴＧＣＡＣＡＴＧＡＡＡＡＣＣＴＧＴＣＧＣＴＧＣＡＧＣＧＡＴＡＴＧＣＧＴＣＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３３）
及び
ＡＡＴＴＣＡＧＡＣＧＣＡＴＡＴＣＧＣＴＧＣＡＧＣＧＡＣＡＧＧＴＴＴＴＣＡＴＧＴＧＣＡＧＡＣＧＡＣＣＡＣＡＣＴＧＧＣＡＴＴＧＡＴＣＧＣＡＡＣＡＧＧＧＴＴＴＡＧＡＧＣＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３４）

Ｘａ１（２^ｎｄループ）
ＡＡＴＴＣＣＴＧＴＣＡＴＡＧＴＧＣＣＴＧＣＡＡＡＡＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＧＣＣＣＧＴＡＧＴＴＴＧＣＣＡＧＣＴＣＡＡＴＧＴＴＴＴＴＧＣＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３５）
及び
ＴＣＧＡＣＧＣＡＡＡＡＡＣＡＴＴＧＡＧＣＴＧＧＣＡＡＡＣＴＡＣＧＧＧＣＧＣＡＧＡＴＡＣＡＧＣＴＴＴＴＧＣＡＧＧＣＡＣＴＡＴＧＡＣＡＧＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３６）

ｈＳＣＣ１（１^ｓｔループ）
ＣＴＡＡＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＧＡＴＣＡＡＴＧＣＡＡＣＴＧＴＡＣＧＴＡＣＴＣＡＡＣＣＣＣＴＣＣＡＣＡＧＴＧＴＣＧＣＴＧＣＡＧＣＧＡＴＡＴＧＣＧＴＣＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３７）
及び
ＡＡＴＴＣＡＧＡＣＧＣＡＴＡＴＣＧＣＴＧＣＡＧＣＧＡＣＡＣＴＧＴＧＧＡＧＧＧＧＴＴＧＡＧＴＡＣＧＴＡＣＡＧＴＴＧＣＡＴＴＧＡＴＣＧＣＡＡＣＡＧＧＧＴＴＴＡＧＡＧＣＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３８）

ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（商標）ＩＩ−ＸＬ部位直接変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてトリプシン又はキモトリプシン反応部位へペプチド配列を導入するために用いるオリゴヌクレオチドプライマーペアのＤＮＡ配列を以下に記載する。製造会社の説明書及びこの実施例に記載の通りに反応を行った。６８ ℃で６分間の伸長を行い、９５ ℃で５０秒間の変性を行い、５５ ℃で５０秒間のアニーリングを２０サイクル行った。２０サイクル終了後、６８ ℃で２０分間の最終伸長を行った。
１Ａ（２^ｎｄループ）
ＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＣＧＣＴＣＡＡＡＡＴＣＴＣＧＴＧＧＣＴＧＴＴＴＴＴＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣＡＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３９）
及び
ＣＧＣＡＡＡＡＡＣＡＧＣＣＡＣＧＡＧＡＴＴＴＴＧＡＧＣＧＴＴＴＧＣＡＧＡＴＡＣＡＧＣＴＴＴＴＧＣＡＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４０）

２Ｂ（２^ｎｄループ）
ＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＴＧＧＴＡＴＡＡＴＣＡＡＡＴＧＡＣＡＡＣＡＴＧＴＴＴＴＴＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣＡＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４１）
及び
ＣＧＣＡＡＡＡＡＣＡＴＧＴＴＧＴＣＡＴＴＴＧＡＴＴＡＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＴＡＣＡＧＣＴＴＴＴＧＣＡＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４２）

４Ａ（２^ｎｄループ）
ＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＣＡＴＣＡＡＣＴＴＧＧＣＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＴＴＴＴＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣＡＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４３）
及び
ＣＧＣＡＡＡＡＡＣＡＴＧＡＡＴＴＣＧＧＧＣＣＡＡＧＴＴＧＡＴＧＧＣＡＧＡＴＡＣＡＧＣＴＴＴＴＧＣＡＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４４）

５Ａ（２^ｎｄループ）
ＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＣＡＴＣＣＧＴＧＧＧＣＡＣＣＧＴＡＴＴＣＴＴＧＴＴＴＴＴＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣＡＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５）
及び
ＣＧＣＡＡＡＡＡＣＡＡＧＡＡＴＡＣＧＧＴＧＣＣＣＡＣＧＧＡＴＧＧＣＡＧＡＴＡＣＡＧＣＴＴＴＴＧＣＡＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４６）

６−１Ａ（２^ｎｄループ）
ＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＴＣＴＴＣＡＴＴＡＴＣＴＴＣＡＡＣＡＧＴＧＴＴＴＴＴＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣＡＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４７）
及び
ＣＧＣＡＡＡＡＡＣＡＣＴＧＴＴＧＡＡＧＡＴＡＡＴＧＡＡＧＡＴＴＧＣＡＧＡＴＡＣＡＧＣＴＴＴＴＧＣＡＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４８）

７Ａ（２^ｎｄループ）
ＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＣＡＣＣＧＴＣＴＣＴＴＴＡＴＣＧＣＣＣＧＴＧＴＴＴＴＴＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣＡＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９）
及び
ＣＧＣＡＡＡＡＡＣＡＣＧＧＧＣＧＡＴＡＡＡＧＡＧＡＣＧＧＴＧＴＧＣＡＧＡＴＡＣＡＧＣＴＴＴＴＧＣＡＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０）

８Ｂ（２^ｎｄループ）
ＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＣＴＴＡＣＡＧＡＴＣＡＡＴＣＴＡＡＡＣＣＧＴＧＴＴＴＴＴＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣＡＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１）
及び
ＣＧＣＡＡＡＡＡＣＡＣＧＧＴＴＴＡＧＡＴＴＧＡＴＣＴＧＴＡＡＧＧＣＡＧＡＴＡＣＡＧＣＴＴＴＴＧＣＡＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２）

９Ａ（２^ｎｄループ）
ＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＧＴＴＡＣＡＡＣＡＴＣＡＡＴＧＧＧＣＡＴＧＴＧＴＴＴＴＴＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣＡＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３）
及び
ＣＧＣＡＡＡＡＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＴＧＴＡＡＣＧＣＡＧＡＴＡＣＡＧＣＴＴＴＴＧＣＡＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４）

１０Ｂ（２^ｎｄループ）
ＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＣＧＣＧＣＡＴＣＡＣＣＧＴＡＴＧＡＴＴＧＧＴＧＴＴＴＴＴＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣＡＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５）
及び
ＣＧＣＡＡＡＡＡＣＡＣＣＡＡＴＣＡＴＡＣＧＧＴＧＡＴＧＣＧＣＧＧＣＡＧＡＴＡＣＡＧＣＴＴＴＴＧＣＡＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６）

１１−１Ａ（２^ｎｄループ）
ＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＴＣＡＡＣＡＣＡＡＡＡＡＡＴＴＣＣＧＣＡＡＴＧＴＴＴＴＴＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣＡＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７）
及び
ＣＧＣＡＡＡＡＡＣＡＴＴＧＣＧＧＡＡＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＴＧＡＧＣＡＧＡＴＡＣＡＧＣＴＴＴＴＧＣＡＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８）

１２Ｂ（２^ｎｄループ）
ＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＣＡＣＡＡＴＴＴＣＧＣＴＣＴＧＣＡＡＣＡＴＧＴＴＴＴＴＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣＡＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５９）
及び
ＣＧＣＡＡＡＡＡＣＡＴＧＴＴＧＣＡＧＡＧＣＧＡＡＡＴＴＧＴＧＴＧＣＡＧＡＴＡＣＡＧＣＴＴＴＴＧＣＡＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６０）

１３Ａ（２^ｎｄループ）
ＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＣＣＧＧＡＴＣＡＴＧＴＴＣＣＧＣＡＴＣＴＴＴＧＴＴＴＴＴＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣＡＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６１）
及び
ＣＧＣＡＡＡＡＡＣＡＡＡＧＡＴＧＣＧＧＡＡＣＡＴＧＡＴＣＣＧＧＧＣＡＧＡＴＡＣＡＧＣＴＴＴＴＧＣＡＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６２）

１５−１Ａ（２^ｎｄループ）
ＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＴＣＡＧＧＣＴＴＴＣＣＧＣＴＴＴＣＴＡＣＡＴＧＴＴＴＴＴＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣＡＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６３）
及び
ＣＧＣＡＡＡＡＡＣＡＴＧＴＡＧＡＡＡＧＣＧＧＡＡＡＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＡＴＡＣＡＧＣＴＴＴＴＧＣＡＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４）

１Ａ６（１^ｓｔループ）
ＴＣＡＡＴＧＣＧＣＡＴＧＴＧＡＡＧＡＧＡＴＣＴＧＧＡＣＴＡＴＧＣＴＴＴＧＣＣＧＧＴＧＴＴＣＣＧＡＴＡＴＧＣＧＴＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６５）
及び
ＣＧＧＡＡＣＡＣＣＧＧＣＡＡＡＧＣＡＴＡＧＴＣＣＡＧＡＴＣＴＣＴＴＣＡＣＡＴＧＣＧＣＡＴＴＧＡＴＣＧＣＡＡＣＡＧＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６６）

１Ａ６（２^ｎｄループ）
ＣＡＡＡＡＧＣＴＧＴＧＣＴＴＧＴＧＡＡＧＡＧＡＴＣＴＧＧＡＣＴＡＴＧＣＴＴＴＧＣＴＴＴＴＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣＡＣＧＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６７）
及び
ＡＣＧＣＡＡＡＡＧＣＡＡＡＧＣＡＴＡＧＴＣＣＡＧＡＴＣＴＣＴＴＣＡＣＡＡＧＣＡＣＡＧＣＴＴＴＴＧＣＡＴＧＣＡＣＴＡＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６８）

１Ｃ２（１^ｓｔループ）
ＴＣＡＡＴＧＣＧＣＡＴＧＴＴＧＧＧＣＣＣＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡＡＡＣＡＴＧＣＣＧＧＴＧＴＴＣＣＧＡＴＡＴＧＣＧＴＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６９）
及び
ＣＧＧＡＡＣＡＣＣＧＧＣＡＴＧＴＴＴＴＧＡＣＡＧＴＡＡＧＧＧＣＣＣＡＡＣＡＴＧＣＧＣＡＴＴＧＡＴＣＧＣＡＡＣＡＧＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：７０）

１Ｃ２（２^ｎｄループ）
ＣＡＡＡＡＧＣＴＧＴＧＣＴＴＧＴＴＧＧＧＣＣＣＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡＡＡＣＡＴＧＣＴＴＴＴＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣＡＣＧＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：７１）
及び
ＡＣＧＣＡＡＡＡＧＣＡＴＧＴＴＴＴＧＡＣＡＧＴＡＡＧＧＧＣＣＣＡＡＣＡＡＧＣＡＣＡＧＣＴＴＴＴＧＣＡＴＧＣＡＣＴＡＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：７２）

２Ｅ２（１^ｓｔループ）
ＴＣＡＡＴＧＣＧＣＡＴＧＴＣＴＴＡＣＡＧＴＡＣＴＧＴＧＧＡＣＴＡＣＡＴＧＣＣＧＧＴＧＴＴＣＣＧＡＴＡＴＧＣＧＴＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：７３）
及び
ＣＧＧＡＡＣＡＣＣＧＧＣＡＴＧＴＡＧＴＣＣＡＣＡＧＴＡＣＴＧＴＡＡＧＡＣＡＴＧＣＧＣＡＴＴＧＡＴＣＧＣＡＡＣＡＧＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：７４）

２Ｅ２（２^ｎｄループ）
ＣＡＡＡＡＧＣＴＧＴＧＣＴＴＧＴＣＴＴＡＣＡＧＴＡＣＴＧＴＧＧＡＣＴＡＣＡＴＧＣＴＴＴＴＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣＡＣＧＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：７５）
及び
ＡＣＧＣＡＡＡＡＧＣＡＴＧＴＡＧＴＣＣＡＣＡＧＴＡＣＴＧＴＡＡＧＡＣＡＡＧＣＡＣＡＧＣＴＴＴＴＧＣＡＴＧＣＡＣＴＡＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：７６）

２Ｅ５（１^ｓｔループ）
ＴＣＡＡＴＧＣＧＣＡＴＧＴＡＣＴＣＴＴＴＧＧＡＡＣＡＧＡＴＣＴＣＣＴＴＧＣＣＧＧＴＧＴＴＣＣＧＡＴＡＴＧＣＧＴＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：７７）
及び
ＣＧＧＡＡＣＡＣＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＡＴＣＴＧＴＴＣＣＡＡＡＧＡＧＴＡＣＡＴＧＣＧＣＡＴＴＧＡＴＣＧＣＡＡＣＡＧＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：７８）

２Ｅ５（２^ｎｄループ）
ＣＡＡＡＡＧＣＴＧＴＧＣＴＴＧＴＡＣＴＣＴＴＴＧＧＡＡＴＣＧＡＴＣＴＣＣＴＴＧＣＴＴＴＴＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣＡＣＧＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：７９）
及び
ＡＣＧＣＡＡＡＡＧＣＡＡＧＧＡＧＡＴＣＧＡＴＴＣＣＡＡＡＧＡＧＴＡＣＡＡＧＣＡＣＡＧＣＴＴＴＴＧＣＡＴＧＣＡＣＴＡＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：８０）

ＦＧＦｎｓ（１^ｓｔループ）
ＴＣＡＡＴＧＣＧＣＡＴＧＴＡＣＡＡＡＣＡＴＣＧＡＴＴＣＴＡＣＴＣＣＴＴＧＣＣＧＧＴＧＴＴＣＣＧＡＴＡＴＧＣＧＴＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：８１）
及び
ＣＧＧＡＡＣＡＣＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＧＡＡＴＣＧＡＴＧＴＴＴＧＴＡＣＡＴＧＣＧＣＡＴＴＧＡＴＣＧＣＡＡＣＡＧＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：８２）

ＦＧＦｎｓ（２^ｎｄループ）
ＣＡＡＡＡＧＣＴＧＴＧＣＴＴＧＣＡＣＡＡＡＣＡＴＣＧＡＴＴＣＴＡＣＴＣＣＴＴＧＴＴＴＴＴＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣＡＣＧＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：８３）
及び
ＡＣＧＣＡＡＡＡＡＣＡＡＧＧＡＧＴＡＧＡＡＴＣＧＡＴＧＴＴＴＧＴＧＣＡＡＧＣＡＣＡＧＣＴＴＴＴＧＣＡＴＧＣＡＣＴＡＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：８４）

ＦＧＦｋｒ（１^ｓｔループ）
ＴＣＡＡＴＧＣＧＣＡＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＴＣＧＡＴＣＧＴＡＣＴＣＣＴＴＧＣＣＧＧＴＧＴＴＣＣＧＡＴＡＴＧＣＧＴＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：８５）
及び
ＣＧＧＡＡＣＡＣＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＴＣＧＡＴＴＴＴＴＧＴＡＣＡＴＧＣＧＣＡＴＴＧＡＴＣＧＣＡＡＣＡＧＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：８６）

ＦＧＦｋｒ（２^ｎｄループ）
ＣＡＡＡＡＧＣＴＧＴＧＣＴＴＧＣＡＣＡＡＡＡＡＴＣＧＡＴＣＧＴＡＣＴＣＣＴＴＧＴＴＴＴＴＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣＡＣＧＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：８７）
及び
ＡＣＧＣＡＡＡＡＡＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＴＣＧＡＴＴＴＴＴＧＴＧＣＡＡＧＣＡＣＡＧＣＴＴＴＴＧＣＡＴＧＣＡＣＴＡＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：８８）

ＦＧＦｈｌ（１^ｓｔループ）
ＴＣＡＡＴＧＣＧＣＡＴＧＴＣＡＣＣＴＧＣＡＧＡＣＡＡＣＴＧＡＡＡＣＡＴＧＣＣＧＧＴＧＴＴＣＣＧＡＴＡＴＧＣＧＴＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：８９）
及び
ＣＧＧＡＡＣＡＣＣＧＧＣＡＴＧＴＴＴＣＡＧＴＴＧＴＣＴＧＣＡＧＧＴＧＡＣＡＴＧＣＧＣＡＴＴＧＡＴＣＧＣＡＡＣＡＧＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：９０）

ＦＧＦｈｌ（２^ｎｄループ）
ＣＡＡＡＡＧＣＴＧＴＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＴＧＣＡＧＡＣＡＡＣＴＧＡＡＡＣＡＴＧＴＴＴＴＴＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣＡＣＧＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：９１）
及び
ＡＣＧＣＡＡＡＡＡＣＡＴＧＴＴＴＣＡＧＴＴＧＴＣＴＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＡＧＣＡＣＡＧＣＴＴＴＴＧＣＡＴＧＣＡＣＴＡＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：９２）

ＦＧＦｇｙ（１^ｓｔループ）
ＴＣＡＡＴＧＣＧＣＡＴＧＴＧＧＣＴＡＣＴＴＣＡＴＣＣＣＡＴＣＧＡＴＴＴＧＣＣＧＧＴＧＴＴＣＣＧＡＴＡＴＧＣＧＴＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：９３）
及び
ＣＧＧＡＡＣＡＣＣＧＧＣＡＡＡＴＣＧＡＴＧＧＧＡＴＧＡＡＧＴＡＧＣＣＡＣＡＴＧＣＧＣＡＴＴＧＡＴＣＧＣＡＡＣＡＧＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：９４）

ＦＧＦｇｙ（２^ｎｄループ）
ＣＡＡＡＡＧＣＴＧＴＧＣＴＴＧＣＧＧＣＴＡＣＴＴＣＡＴＣＣＣＡＴＣＧＡＴＴＴＧＴＴＴＴＴＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣＡＣＧＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：９５）
及び
ＡＣＧＣＡＡＡＡＡＣＡＡＡＴＣＧＡＴＧＧＧＡＴＧＡＡＧＴＡＧＣＣＧＣＡＡＧＣＡＣＡＧＣＴＴＴＴＧＣＡＴＧＣＡＣＴＡＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：９６）

ＭＭ００５（１^ｓｔループ）
ＴＣＡＡＴＧＣＧＣＡＴＧＴＴＴＡＣＧＴＡＴＣＣＴＴＧＣＴＡＡＣＡＡＡＴＧＣＣＧＧＴＧＴＴＣＣＧＡＴＡＴＧＣＧＴＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：９７）
及び
ＣＧＧＡＡＣＡＣＣＧＧＣＡＴＴＴＧＴＴＡＧＣＡＡＧＧＡＴＡＣＧＴＡＡＡＣＡＴＧＣＧＣＡＴＴＧＡＴＣＧＣＡＡＣＡＧＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：９８）

ＭＭ００５（２^ｎｄループ）
ＣＡＡＡＡＧＣＴＧＴＧＣＴＴＧＣＴＴＡＣＧＴＡＴＣＣＴＴＧＣＴＡＡＣＡＡＡＴＧＴＴＴＴＴＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣＡＣＧＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：９９）
及び
ＡＣＧＣＡＡＡＡＡＣＡＴＴＴＧＴＴＡＧＣＡＡＧＧＡＴＡＣＧＴＡＡＧＣＡＡＧＣＡＣＡＧＣＴＴＴＴＧＣＡＴＧＣＡＣＴＡＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１００）

ＭＭ００７（１^ｓｔループ）
ＧＣＧＡＴＣＡＡＴＧＣＧＣＣＴＧＣＡＧＡＡＣＴＣＡＡＣＣＡＴＡＴＣＣＴＴＴＡＴＧＴＣＧＧＴＧＴＴＣＣＧＡＴＡＴＧＣＧＴＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０１）
及び
ＧＧＡＡＣＡＣＣＧＡＣＡＴＡＡＡＧＧＡＴＡＴＧＧＴＴＧＡＧＴＴＣＴＧＣＡＧＧＣＧＣＡＴＴＧＡＴＣＧＣＡＡＣＡＧＧＧＴＴＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０２）

ＭＭ００７（２^ｎｄループ）
ＣＡＡＡＡＧＣＴＧＴＧＣＣＴＧＣＡＧＡＡＣＡＣＡＡＣＣＴＴＡＣＣＣＡＣＴＴＴＧＴＴＴＴＴＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣＡＣＧＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０３）
及び
ＡＣＧＣＡＡＡＡＡＣＡＡＡＧＴＧＧＧＴＡＡＧＧＴＴＧＴＧＴＴＣＴＧＣＡＧＧＣＡＣＡＧＣＴＴＴＴＧＣＡＴＧＣＡＣＴＡＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０４）

ＭＭ００９（２^ｎｄループ）
ＣＡＡＡＡＧＣＴＧＴＧＣＣＴＧＣＣＴＧＴＴＡＡＣＡＣＣＴＡＣＴＣＴＴＡＡＣＴＧＴＴＴＴＴＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣＡＣＧＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０５）
及び
ＡＣＧＣＡＡＡＡＡＣＡＧＴＴＡＡＧＡＧＴＡＧＧＴＧＴＴＡＡＣＡＧＧＣＡＧＧＣＡＣＡＧＣＴＴＴＴＧＣＡＴＧＣＡＣＴＡＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０６）

ＭＭ０１０（１^ｓｔループ）
ＴＣＡＡＴＧＣＧＣＡＴＧＣＧＣＴＣＴＴＣＣＡＡＣＴＣＡＴＴＣＴＡＡＣＴＧＴＣＧＧＴＧＴＴＣＣＧＡＴＡＴＧＣＧＴＣＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０７）
及び
ＣＧＧＡＡＣＡＣＣＧＡＣＡＧＴＴＡＧＡＡＴＧＡＧＴＴＧＧＡＡＧＡＧＣＧＣＡＴＧＣＧＣＡＴＴＧＡＴＣＧＣＡＡＣＡＧＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０８）

ＭＭ０１０（２^ｎｄループ）
ＣＡＡＡＡＧＣＴＧＴＧＣＣＴＧＣＧＣＧＣＴＴＣＣＴＡＣＡＣＡＣＴＣＴＡＡＣＴＧＴＴＴＴＴＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣＡＣＧＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０９）
及び
ＡＣＧＣＡＡＡＡＡＣＡＧＴＴＡＧＡＧＴＧＴＧＴＡＧＧＡＡＧＣＧＣＧＣＡＧＧＣＡＣＡＧＣＴＴＴＴＧＣＡＴＧＣＡＣＴＡＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１０）

ＭＭ０１７（２^ｎｄループ）
ＣＡＡＡＡＧＣＴＧＴＧＣＣＴＧＣＣＣＴＴＴＡＧＧＣＣＴＴＴＧＣＣＣＡＣＣＴＴＧＴＴＴＴＴＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣＡＣＧＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１１）
及び
ＡＣＧＣＡＡＡＡＡＣＡＡＧＧＴＧＧＧＣＡＡＡＧＧＣＣＴＡＡＡＧＧＧＣＡＧＧＣＡＣＡＧＣＴＴＴＴＧＣＡＴＧＣＡＣＴＡＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１２）

ＦＧＦｐｓ１（２^ｎｄループ）
ＡＡＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＴＧＧＡＡＣＡＴＣＧＡＴＴＣＴＡＣＡＣＣＴＴＧＴＴＴＴＴＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣＡＣＧＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１３）
及び
ＡＣＧＣＡＡＡＡＡＣＡＡＧＧＴＧＴＡＧＡＡＴＣＧＡＴＧＴＴＣＣＡＧＣＡＧＡＴＡＣＡＧＣＴＴＴＴＧＣＡＴＧＣＡＣＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１４）

ＦＧＦｐｓ２（１^ｓｔループ）
ＧＣＧＡＴＣＡＡＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＣＴＴＧＧＡＴＴＧＡＣＡＧＴＡＣＴＣＣＴＴＧＴＣＧＧＴＧＴＴＣＣＧＡＴＡＴＧＣＧＴＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１５）
及び
ＧＧＡＡＣＡＣＣＧＡＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＴＧＴＣＡＡＴＣＣＡＡＧＴＡＣＡＧＡＴＧＣＡＴＴＧＡＴＣＧＣＡＡＣＡＧＧＧＴＴＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１６）

ＦＧＦｐｓ２（２^ｎｄループ）
ＡＡＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＣＡＴＧＧＡＴＣＧＡＴＡＧＴＡＣＴＣＣＴＴＧＴＴＴＴＴＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣＡＣＧＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１７）
及び
ＡＣＧＣＡＡＡＡＡＣＡＡＧＧＴＧＴＡＧＡＡＴＣＧＡＴＣＣＡＴＧＴＧＣＡＧＡＴＡＣＡＧＣＴＴＴＴＧＣＡＴＧＣＡＣＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１８）

ＦＧＦｐｓＢ（２^ｎｄループ）
ＡＡＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＴＡＣＡＴＧＧＡＴＣＧＡＴＴＧＧＡＣＡＣＣＴＴＧＴＴＴＴＴＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣＡＣＧＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１９）
及び
ＡＣＧＣＡＡＡＡＡＣＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＡＴＣＧＡＴＣＣＡＴＧＴＡＣＡＧＡＴＡＣＡＧＣＴＴＴＴＧＣＡＴＧＣＡＣＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２０）

１Ａ８（２^ｎｄループ）
ＣＡＡＡＡＧＣＴＧＣＧＣＡＴＧＴＧＴＴＡＣＴＡＣＡＧＡＴＴＧＧＡＴＣＧＡＡＴＧＴＴＴＴＴＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣＡＣＧＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２１）
及び
ＡＣＧＣＡＡＡＡＡＣＡＴＴＣＧＡＴＣＣＡＡＴＣＴＧＴＡＧＴＡＡＣＡＣＡＴＧＣＧＣＡＧＣＴＴＴＴＧＣＡＴＧＣＡＣＴＡＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２２）

１Ａ１２（２^ｎｄループ）
ＣＡＡＡＡＧＣＴＧＴＧＣＣＴＧＣＣＣＡＡＣＡＣＴＴＴＧＧＡＣＴＣＡＴＡＴＧＴＧＴＴＴＴＴＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣＡＣＧＧＡＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２３）
及び
ＡＣＧＣＡＡＡＡＡＣＡＣＡＴＡＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＧＴＧＴＴＧＧＧＣＡＧＧＣＡＣＡＧＣＴＴＴＴＧＣＡＴＧＣＡＣＴＡＴＧＡＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２４）

１Ｅ１１（２^ｎｄループ）
ＣＡＡＡＡＧＣＴＧＣＧＣＡＴＧＴＴＡＣＴＡＣＴＣＴＣＡＡＴＴＣＣＡＣＣＡＡＴＧＴＴＴＴＴＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣＡＣＧＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２５）
及び
ＡＣＧＣＡＡＡＡＡＣＡＴＴＧＧＴＧＧＡＡＴＴＧＡＧＡＧＴＡＧＴＡＡＣＡＴＧＣＧＣＡＧＣＴＴＴＴＧＣＡＴＧＣＡＣＴＡＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２６）

ＴＧＦｐｓ１（２^ｎｄループ）
ＣＡＡＡＡＧＣＴＧＴＣＴＴＴＧＴＣＣＧＧＡＡＡＡＣＧＡＴＡＡＣＧＴＴＴＣＴＣＣＴＴＧＴＡＡＴＴＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣＡＣＧＧＡＣＴＴＣＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２７）
及び
ＴＧＴＣＧＡＣＧＣＡＡＴＴＡＣＡＡＧＧＡＧＡＡＡＣＧＴＴＡＴＣＧＴＴＴＴＣＣＧＧＡＣＡＡＡＧＡＣＡＧＣＴＴＴＴＧＣＡＴＧＣＡＣＴＡＴＧＡＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２８）

ｐ２ＪＭ１０３−ｌｎｋ２−ＢＢＩ発現ベクターのキモトリプシン反応部位ループへＭＭ０２１ペプチドを導入するためのカセットを作るために用いるオリゴヌクレオチドペアのＤＮＡ配列を以下に記載する。このカセットはベクター内のＳｐｈＩ及びＳａｌＩ制限部位へ結合された。
ＭＭ０２１（２^ｎｄループ）
ＣＡＡＡＡＧＣＴＧＴＧＣＴＴＧＴＡＡＡＣＡＣＡＡＣＧＴＡＣＧＴＣＴＴＴＴＡＴＧＴＴＴＴＴＧＣＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２９）
及び
ＴＣＧＡＣＧＣＡＡＡＡＡＣＡＴＡＡＡＡＧＡＣＧＴＡＣＧＴＴＧＴＧＴＴＴＡＣＡＡＧＣＡＣＡＧＣＴＴＴＴＧＣＡＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３０）

システインコンストレインドペプチド（ｃｙｓｔｅｉｎｅｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄｐｅｐｔｉｄｅｓ）からできているライブラリーは所望の基質に結合するペプチドの選択のための良く知られた試薬（例えば、市販のＰｈＤ−Ｃ７Ｃファージディスプレイライブラリーキット、ＮＥＢ）である。ＢＢＩはペプチド結合を選択するために用いられる各種方法で提示されるペプチドループに似た構造を有する２のシステインコンストレインド（ｃｙｓｔｅｉｎｅｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）反応部位ループを有する。従って、一旦システインコンストレインド（ｃｙｓｔｅｉｎｅｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）結合ペプチドが選択されると、ＢＢＩは結合反応におけるペプチドを提供するためのスキャッフォールドとして使用するのに適している。

ＤＮＡオリゴヌクレオチドカセットを用いて、ＣＫ３７２８１ペプチド配列（ＡＣＹＮＬＹＧＷＴＣ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：９）で、トリプシン、キモトリプシン、又は両方の活性部位ループを置換することによりＶｅｇＦ結合ペプチドＣＫ３７２８１（例えば、２００３年９月１３日に提出された米国継続出願６０／５２０，４０３、参照のこと。該出願を参照により本明細書に援用する。）をＢＢＩの中へ移植した。構築を促進させるために、上で示すＢｏｗＢｅｃｏ＿Ｆ及びＢｏｗＢｅｃｏ＿Ｒプライマーを用いたＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）部位直接変異誘発を用いて製造会社の説明書に記載従い、トリプシン及びキモトリプシン反応部位ループの間のＢＢＩ遺伝子（ＯｐｅｒｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの合成品；実施例１６を参照のこと）のコード領域にＥｃｏＲＩサイトを導入した（０．５ｐｍｏｌの各プライマーをＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）反応に用いた。９７℃で３分間の第一変性工程の後、６８ ℃で１２分間、９５℃で３０秒間及び５５℃で１分間のＰＣＲサイクルを１８回行い、その後に６８℃で１５分間の最終伸長を行った）。

トリプシン抑制ペプチドループの置換のために、２のＤＮＡオリゴヌクレオチド（１ＢＢＣＫ８１＋及び１ＢＢＣｋ８１−）をアニールし、ＳａｃＩ及びＥｃｏＲＩ反応部位に結合した。同様に、キモトリプシン抑制ループの置換のために、ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩサイトをオリゴヌクレオチド（２ＢＢｃｋ８１＋及び２ＢＢｃｋ８１−）のアニーリングにより作られたＤＮＡカセットの挿入に用いた。ＣＫ３７２８１ペプチドは、トリプシンループを初めにＣＫ３７２８１ペプチドで置換した後に、オリゴヌクレオチド（２ＢＢｃｋ８１＋及び２ＢＢｃｋ８１−）を用いてキモトリプシンループの中にＣＫ３７２８１を挿入することにより両ループの中に移植した。トリプシンループ（１ＢＢＩｃｋ８１）の中ＣＫ３７２８１を有するＢＢＩをＳａｃＩ−ＳｐｈＩフラグメントとしてｐＪＭ１０３ＢＢ発現カセット内に移動した。キモトリプシンループ（２ＢＢＩｃｋ８１）又は両者のループ（１２ＢＢＩｃｋ８１）の中のＣＫ３７２８１を有するＢＢＩを、ＳａｃＩ−ＳａｌＩフラグメントとしてｐＪＭ１０３ＢＢＩの中に挿入した。正確な配列はＤＮＡ配列決定を用いて確認した（１２ＢＢＩｃｋ８１遺伝子の配列は図１６に示す）。得られたベクター、ｐＪＫ１０３−１ＢＢＩｃｋ８１、ｐＪＫ１０３−２ＢＢＩｃｋ８１又はｐＪＫ１０３−１２ＢＢＩｃｋ８１をバチルススブチルス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＧ３９３４ｃｏｍＫの形質転換に用い、上の実施例１に示すように、ＢＣＥ融合タンパク質の生産を確認した。

無細胞ブロスに存在する主要タンパク質である４４ｋＤａ付近の融合タンパク質がＳＤＳ−ＰＡＧＥで検出された。幾つかのケースにおいて、ＢＣＥ触媒コアに対応する３４ｋＤａ付近の主要タンパク質バンドの存在により視認することができる有意なＢＢＩ部分の退縮（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）（５０％まで）（特にＭＢＤ倍地中で４８時間以上育成した場合）が見られた。このケースにおいて、ＢＣＥ１０３セルラーゼの力価は、野生型ＢＢＩ（実施例１６）に融合させて測定したものと同様であるが、ＢＢＩの活性は通常の半分以下であった。

育成の間のＢＢＩ変異体のタンパク質分解を減らすために（すなわち、融合タンパク質との比較においてＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に存在するＢＣＥ１０３セルラーぜ触媒コアの量を減らすために）、９のプロテアーゼ遺伝子（ｄｅｇＵ^ＨＹ３２、ｏｐｐＡ、△ｓｐｏＩＩＥ３５０１、△ａｐｒＥ、△ｎｐｆＥ、△ｅｐｒ、△ｉｓｐＡ、△ｂｐｒ、△ｖｐｒ、△ｗｐｒＡ、△ｍｐｒ−ｙｂｉＦ、△ｎｐｒＢ、ａｍｙＥ：：ｘｙｌＲＰｘｙｌＡｃｏｍＫ−ｐｈｌｅｏ）を欠失させたバチルススブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）系統を発現宿主細胞として用いた。育成温度（３５℃）及び通気量（２００ｒｐｍ）を減らした。これらの変更により、主要融合タンパク質バンド（〜４４ｋＤａ）はＢＣＥ触媒コア（〜３４ｋＤａ）と思われる分子量で存在するバンドと大差なく、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で観察された。

ＢＣＥ１０３セルラーゼのＣ末端に融合させたＢＢＩのトリプシン及び／又はキモトリプシン活性部位ループへの置換を行ったときに、ＣＫ３７２８１ペプチドに加えて、多くのシステインコンストレインドペプチド（ｃｙｓｔｅｉｎｅｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄｐｅｐｔｉｄｅｓ）が生産された。特定の例はを以下に示す。

（１）相補的な抑制因子として設計又は選択されたペプチド、第一又は第二反応部位ループへ導入されたコンプスタチン（ｃｏｍｐｓｔａｔｉｎ）（Ｓａｈｕｅｔａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５７：８８４−８９１、［１９９６］参照のこと）、Ｃ２ｃ（第一ループ）、Ｃ３ｃ（第一ループ）、Ｃ４ｃ（第一ループ）、及びＣ５ｃ（第一ループ）、又は１Ｂ、２Ｂ、４Ａ、５Ａ、６−１Ａ、７Ａ、８Ｂ、９Ａ、１０Ｂ、１１−１Ａ、１２Ｂ、１３Ａ、及び１５−１Ａ（全て第二ループ）へ結合する反応においてＦａｃｔｏｒＢにより選択されたペプチド
（２）プロテアーゼファクターＸａ、又は角質溶解キモトリプシンＸａｌ（第二ループ）又はｈＳＣＣ１（第一ループ）に結合するためのペプチド
（３）ＦＧＦ５結合反応により選択されたペプチド；１Ａ６（第一又は第二ループ）、１Ｃ２（第一又は第二ループ）、２Ｅ２（第一又は第二ループ）、２Ｅ５（第一、第二、又は両ループ）、ＦＧＦｎｓ（第一又は第二ループ）、ＦＧＦｋｒ（第一又は第二ループ）、ＦＧＦｈｌ（第一又は第二ループ）、ＦＧＦｇｙ（第一又は第二ループ）、ＭＭ００５（第一又は第二ループ）、ＭＭ００７（第一、第二、又は両ループ）、ＭＭ００９（第二ループ）、ＭＭ０１０（第一、第二、又は両ループ）、ＭＭ０１７（第二ループ）、ＦＧＦｐｓ１（第二ループ）、ＦＧＦｐｓ２（第一、第二、又は両ループ）、及びＦＧＦｐｓＢ（第二ループ）、及び
（４）ＴＧＦ−１結合反応により選択されたペプチド；１Ａ８（第二ループ）、ｌＡ１２（第二ループ）、ｌＥ１１（第二ループ）、ＴＧＦｐｓｌ（第二ループ）及びＭＭ０２１（第二ループ）。

これらのペプチドをトリプシン（第一ループ）又はキモトリプシン（第二ループ）活性部位ループのいずれかへ導入するために用いるオリゴヌクレオチド及びこれらのペプチドをＢＢＩに移植するために用いる方法は上に記載されている。全てのケースにおいて、生産された融合タンパク質をＤＳＤ−ＰＡＧＥゲルにより評価した。ＣＫ３７２８１置換ペプチドに対して説明したのと同様に、幾つかの置換ペプチドをもちいて、タンパク質分解を減少させることによりにより無傷の融合タンパク質の生成量が高められた。

実施例３
チオール還元／酸化試薬によるＢＢＩの活性化
育成の後の（トリプシン又はキモトリプシンの抑制による）ＢＢＩの活性は、（２の分子が融合タンパク質の中で１：１のモル比で存在する）無細胞上清中で測定されるＢＣＥ１０３セルラーゼの活性から予想されるものよりも通常５乃至２０倍低い。ＢＣＥ１０３−ＢＢＩ融合タンパク質中のＢＢＩ活性の増加（トリプシン又はキモトリプシン抑制により測定される）は、接種の後、１−４ｍＭの濃度のｂＭＥをＭＢＤ成長培地に添加した後１４時間育成することにより確実に得ることができる。融合タンパク質中のＢＢＩのトリプシン又はキモトリプシン抑制活性は、結合ペプチド（例えば、ＶｅｒｇＦ結合ペプチドＣＫ３７２８１）をキモトリプシン又はトリプシン反応部位ループにそれぞれ置換したときよりも低くなる。野生型ＢＢＩを用いて、ｂＭＥで処理することによって、抑制活性は増加させることができる。予想しないことに、これらの試験においてＢＢＩ育成の間の活性における他のチオール還元試薬（例えば、システイン、還元グルタチオン、ＤＬ−ジチオスレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）及びトリス［２−カルボキシメチル］フォスフィン）の影響は小さいか、無視できる程度であった。抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸又はＤＬ−α酢酸トコフェロール）、他のアジュバンド（例えば、イソロイシン、ダイズオイル、Ｔｗｅｅｎ（商標）−８０）を培地に添加すること、又は３０℃における育成も、ＢＣＥ１０３：ＢＢＩ活性の比を改善しなかった。

特に育成の間のＢＢＩ活性を決定するために、ｐ２ＪＭ１０３−Ｅ３−２ＢＢＩｃＫ８１（以下実施例４を参照のこと）で形質転換させたバチルススブチルス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＧ６００６を含む培地を、２５０ｍｌの振とうフラスコ内で３７℃、１３時間、４０ｍｌのＭＢＤ中で育成した。その後、図４で示すチオール還元試薬を添加し、６２時間の育成の後に細胞の上清を収穫した。２−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、システイン（Ｃｙｓ）、還元グルタチオン（Ｇｌｕｔ）及びＤＬ−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を図４に提供されているグラフで示す最終濃度になるように成長培地に添加した。５ｍＭ βＭＥの濃度はより良いＢＣＥ１０３：ＢＢＩ活性比となったが、通常は、試薬の添加がバクテリア成長を減少させることから、ＢＣＥ１０３及びＢＢＩ力価は全体的に減少した（図４参照のこと）。ＢＣＥ１０３及び２ＢＢＩｃｋ８１の力価は実施例１で説明したアッセイを用いて測定した。

ＢＢＩ活性化はＱセファロースイオン交換クロマトグラフィーにより融合タンパク質（例えば、ＢＣＥ−ｌｎｋ２−２ＢＢＩｃｋ８１、以下の実施例４参照）。

融合タンパク質を作動している振とうタンク又は発酵槽から得られた無細胞ブロスから精製した。このブロスを、ろ過し、５乃至１０倍の水で希釈し、ｐＨを７．５乃至８．０に調製した。希釈サンプルはＱセファロースレジン（ＧＨｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を充填したカラムに負荷した。このカラムを５０ｍＭトリスｐＨ７．５で洗浄し、３００ｍＭＮａＣｌを含む同じ緩衝液で再度洗浄した。融合タンパク質は、７００ｍＭのＮａＣｌで溶出した。

ＢＢＩを活性化させるために収集された融合タンパク質分画を１０倍のアッセイ緩衝液の中で溶出し、その後、２ｍＭのβＭＥ及び０．２ｍＭの酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）を添加し２４時間室温で、スターラープレート又はロックプラットフォーム上で攪拌を続けることにより処理した。ＢＢＩは、ＢＣＥ１０３セルラーゼで測定される濃度にもとづき予測されるトリプシン抑制活性の７０乃至１００％を達成した。上で概説した活性化方法は、通常最良の結果を出すけれども、幾つかのケースにおいて、所与のサンプルの活性を最大化するために９６ウェルプレートにおいて、スクリーニングを行った。最初にスクリーニングする典型的な条件は、アッセイ緩衝液による希釈倍率（例えば、２乃至５０倍の連続希釈）、βＭＥ濃度（例えば、連続する０．５乃至５ｍＭ）及び酸化グルタチオン濃度（例えば、０ｍＭ、１／２０乃至１／２βＭＥ濃度）である。

ＢＣＥ−ｌｎｋ２−２ＢＢＩｃｋ８１融合タンパク質の活性化を図５に示す。この特定の態様において、Ｑセファロース精製後の融合タンパク質を０．００５％のＴｗｅｅｎ（商標）−８０含むダルベッコＰＢＳ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）を用いて１：１０に希釈した。βメルカプトエタノールを３ｍＭの最終濃度で添加し、振とう機上で室温、一晩インキュベートした。このサンプルは、更に磁気攪拌プレート上で激しく攪拌しながら６０時間室温でインキュベートした。（βＭＥで処置する前後の）ＢＣＥ１０３及び２ＢＢＩｃｋ８１の力価を、それぞれ、セルラーゼアッセイ及びトリプシン抑制アッセイにより決定した。

幾つかの態様において、大容量発酵槽のからの無細胞ブロス中のＢＢＩ又はその変異体の活性化のような、活性化反応において、希釈及びβＭＥ濃度を減少させることが好ましい。このことは、高濃度緩衝液（５００ｍＭトリスｐＨ６．８）、又はＣＨＥＳ等（ＣＡＰＳ、トリシン、ＴＡＰＳ及び他の適切な両性イオン緩衝液）の両性イオン緩衝液に変更することにより達成できる。例えば、無細胞ブロス（又はイオン交換クロマトグラファイーにより精製された融合タンパク質分画）は３７５ｍＭのＣＨＥＳｐＨ６．８中、０．００５％のＴＷＥＥＮ（商標）−８０で希釈し、その後に、１ｍＭのβＭＥ及び１０ｍＭのＮａ_２ＳＯ_３で活性化し、攪拌しながら室温で２４時間インキュベーションする。ＢＣＥ１０３セルラーゼ融合変異体等のＢＢＩあるいはこの変異体の力価はこの方法により、（ＢＣＥ１０３セルラーゼ活性に基づく）予測値に対して７０乃至１００％まで活性化することができる。

実施例４
ＢＣＥ１０３−ＢＢＩ融合タンパク質の切断による遊離ＢＢＩ／変異体の放出
この実施例は、ＢＣＥ１０３−ＢＢＩ融合タンパク質を切断による遊離ＢＢＩ又はその変異体の放出について説明する。

培地育成の間にＢＣＥ１０３触媒ドメイン及びＢＢＩの間に切断可能部位を作り出すために、アニールされ、ｐＪＭ１０３のＢａｍＨＩ及びＳａｃＩサイトへ結合するＤＮＡオリゴヌクレオチドペアの配列を以下に示す。
ＢＣＥｓｕｂＢＢＩ（スブチリシンタイプ感受性ペプチド配列）
ＧＡＴＣＣＡＧＧＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＴＡＧＴＴＧＡＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３１）
及び
ＣＴＣＡＴＣＧＴＣＡＡＣＴＡＡＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＣＣＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３２）

ＢＣＥｃｂｄＬＢＢＩ（１^ｓｔＣＢＤの一部）
ＧＡＴＣＣＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＡＣＣＣＡＡＣＴＣＣＴＣＣＡＴＣＴＧＡＴＣＣＴＧＧＡＧＡＡＴＡＣＣＣＡＧＣＴＴＧＧＧＡＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３３）
及び
ＣＴＣＡＴＣＧＴＣＣＣＡＡＧＣＴＧＧＧＴＡＴＴＣＴＣＣＡＧＧＡＴＣＡＧＡＴＧＧＡＧＧＡＧＴＴＧＧＧＴＣＡＧＧＴＴＣＡＣＣＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３４）

ＢＣＥｐｒｏＢＢＩ（ＢＢＩの完全プロペプチド）
ＧＡＴＣＣＧＧＣＧＡＡＣＣＴＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＡＡＧＣＴＴＧＧＣＣＴＧＣＴＴＡＴＧＡＡＡＴＣＡＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＣＡＧＣＡＡＴＧＡＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３５）
及び
ＣＴＣＡＴＣＧＴＣＡＴＴＧＣＴＧＴＧＣＴＧＡＴＧＧＴＣＴＧＡＴＴＴＣＡＴＡＡＧＣＡＧＧＣＣＡＡＧＣＴＴＡＧＡＣＡＧＡＣＧＣＡＧＧＴＴＣＧＣＣＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３６）

ＢＣＥｓｈｏｒｔｐｒｏＢＢＩ（ＢＢＩのプロペプチドのＣ末端部分）
ＧＡＴＣＣＡＡＡＡＴＣＡＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＣＡＧＣＡＡＴＧＡＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３７）
及び
ＣＴＣＡＴＣＧＴＣＡＴＴＧＣＴＧＴＧＣＴＧＡＴＧＧＴＣＴＧＡＴＴＴＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３８）

ＢＣＥ１０３セルラーゼの第二ＣＢＤリンカーへＢＢＩを融合するために、へアニールされ、ｐ２ＪＭ１０３−ＢＢＩのＢａｍＨＩ及びＳａｃＩ部位へ結合されるＤＮＡオリゴヌクレオチドペアの配列を以下に示す。
ＢＣＥｃｂｄＤＢＢＩ
ＧＡＴＣＣＡＧＧＡＧＡＡＣＣＧＧＡＣＣＣＡＡＣＧＣＣＣＣＣＡＡＧＴＧＡＴＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＡＴＣＣＡＧＣＡＴＧＧＧＡＴＴＣＡＡＡＴＣＡＡＡＴＴＴＡＣＡＣＡＡＡＴＧＡＡＡＴＴＧＴＧＴＡＴＣＡＴＡＡＣＧＧＴＣＡＧＴＴＡＴＧＧＣＡＡＧＣＧＡＡＡＴＧＧＴＧＧＡＣＡＣＡＡＡＡＴＣＡＡＧＡＧＣＣＡＧＧＴＧＡＣＣＣＡＴＡＣＧＧＴＣＣＧＴＧＧＧＡＡＣＣＡＣＴＣＡＡＡＴＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＴＴＣＡＧＡＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３９）
及び
ＣＴＣＡＴＣＧＴＣＴＧＡＡＴＣＴＧＧＧＴＣＡＧＡＴＴＴＧＡＧＴＧＧＴＴＣＣＣＡＣＧＧＡＣＣＧＴＡＴＧＧＧＴＣＡＣＣＴＧＧＣＴＣＴＴＧＡＴＴＴＴＧＴＧＴＣＣＡＣＣＡＴＴＴＣＧＣＴＴＧＣＣＡＴＡＡＣＴＧＡＣＣＧＴＴＡＴＧＡＴＡＣＡＣＡＡＴＴＴＣＡＴＴＴＧＴＧＴＡＡＡＴＴＴＧＡＴＴＴＧＡＡＴＣＣＣＡＴＧＣＴＧＧＡＴＡＣＴＣＴＣＣＴＧＧＡＴＣＡＣＴＴＧＧＧＧＧＣＧＴＴＧＧＧＴＣＣＧＧＴＴＣＴＣＣＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４０）

アスパラギン酸及びプロリン残渣の間の酸切断をするのに適したペプチド配列を以下に示す。
リンカー１―ＷＧＤＰＨＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４１）（Ｌｉｄｅｌｌｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：１３９４４−５１［２００３］）

リンカー２−ＤＮＮＤＰＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４２）（Ｓｅｇａｌａｓｅｔａｌ．、ＦＥＢＳＬｅｔｔ．３７１：１７１−１７５［１９９５］）

リンカー３−ＶＶＡＤＰＮ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４３）（Ｋｅｍｐｅｒｍａｎｅｔａｌ．、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６９：１５８９−１５９７［２００３］）

ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）部位直接変異誘発によりＢｓｓＨＩＩ部位をｐＪＭ１０３ＢＢＩへ導入するために用いるオリゴヌクレオチドプライマーを以下に示す。
ＢＣＥｂｓｓ−Ｆ
５’−ＴＧＧＣＧＴＴＣＡＧＣＡＡＣＡＴＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＧＣＴＧＡＴＧＡＴＴＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４４）

ＢＣＥｂｓｓ−Ｒ
５’−ＴＡＡＴＣＡＴＣＡＧＣＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＡＴＧＴＴＧＣＴＧＡＡＣＧＣＣＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４５）

ＢＢＩの停止コドンの後にＨＩｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩ部位を導入し、ＬＡＴの後にＰａｃＩ部位を導入し、本来のＨｉｎｄＩＩＩ部位を除去するためのカセット（ＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ）としてアニールされるＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す。
ＢＣＥｔｅｒｍ＋
５’−ＧＡＣＡＴＣＡＣＧＧＡＣＴＴＣＴＧＣＴＡＴＧＡＧＣＣＡＴＧＴＡＡＡＣＣＡＡＧＣＧＡＧＧＡＣＧＡＴＡＡＡＧＡＧＡＡＣＴＡＡＡＡＧＣＴＴＡＡＣＴＣＧＡＧＧＴＴＡＡＣＡＧＡＧＧＡＣＧＧＡＴＴＴＣＣＴＧＡＡＧＧＡＡＡＴＣＣＧＴＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＡＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４６）

ＢＣＥｔｅｒｍ−
５’−ＡＧＣＴＣＴＴＡＡＴＴＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＣＧＧＡＴＴＴＣＣＴＴＣＡＧＧＡＡＡＴＣＣＧＴＣＣＴＣＴＧＴＴＡＡＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＧＣＴＴＴＴＡＧＴＴＣＴＣＴＴＴＡＴＣＧＴＣＣＴＣＧＣＴＴＧＧＴＴＴＡＣＡＴＧＧＣＴＣＡＴＡＧＣＡＧＡＡＧＴＣＣＧＴＧＡＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４７）

ＢＣＥ１０３触媒ドメイン及びＢＢＩの間に挿入される上で提供される酸ラベルリンカー（すなわち、リンカー１、リンカー２及びリンカー３）を生成するために用いるＰＣＲプライマーを以下に示す。
ＢＣＥ１０３ｃｏｒｅＢｓｓＨＩＩ＿ＦＷ
５’−ＣＡＧＣＡＡＣＡＴＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＧＣＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４８）

リンカーＷＧＤＰＨＹ＿ＲＶ
５’−ＡＴＣＧＴＣＴＧＧＡＴＣＣＧＧＡＴＡＧＴＧＧＧＧＧＴＣＴＣＣＣＣＡＡＧＡＴＧＣＴＧＡＴＴＣＴＣＴＴＡＴＴＴＴＴＴＣＣＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４９）

リンカーＤＮＮＤＰＩ＿ＲＶ
５’−ＡＴＣＧＴＣＴＧＧＡＴＣＣＧＧＴＡＴＧＧＧＡＴＣＡＴＴＧＴＴＧＴＣＡＧＡＴＧＣＴＧＡＴＴＣＴＣＴＴＡＴＴＴＴＴＴＣＣＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１５０）

リンカーＶＶＡＤＰＮ＿ＲＶ
５’−ＡＴＣＧＴＣＴＧＧＡＴＣＣＧＧＧＴＴＧＧＧＡＴＣＴＧＣＡＡＣＴＡＣＡＧＡＴＧＣＴＧＡＴＴＣＴＣＴＴＡＴＴＴＴＴＴＣＣＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１５１）

上で説明する第一ＣＢＤリンカーに挿入する酸ラベルリンカーを生成するために用いるＰＣＲプライマーを以下に示す。

ＢＣＥ１０３ｃｏｒｅＰｓｔＩ＿ＦＷ
ＧＣＡＴＡＡＧＧＡＴＧＡＧＴＣＡＴＣＴＧＣＡＧＣＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１５２）

ＬｐｌｕｓＷＧＤＰＨＹ＿ＲＶ
５’−ＡＴＣＧＴＣＴＧＧＡＴＣＣＧＧＡＴＡＧＴＧＧＧＧＧＴＣＴＣＣＣＣＡＣＧＧＴＴＣＴＣＣＴＧＧＡＴＣＡＧＡＴＧＧＣＧＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１５３）

ＬｐｌｕｓＤＮＮＤＰＩ＿ＲＶ
５’−ＡＴＣＧＴＣＴＧＧＡＴＣＣＧＧＴＡＴＧＧＧＡＴＣＡＴＴＧＴＴＧＴＣＣＧＧＴＴＣＴＣＣＴＧＧＡＴＣＡＧＡＴＧＧＣＧＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１５４）

ＬｐｌｕｓＶＶＡＤＰＮ＿ＲＶ
５’−ＡＴＣＧＴＣＴＧＧＡＴＣＣＧＧＧＴＴＧＧＧＡＴＣＴＧＣＡＡＣＴＡＣＣＧＧＴＴＣＴＣＣＴＧＧＡＴＣＡＧＡＴＧＧＣＧＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１５５）

ＢＢＩ及びＢＣＥ１０３触媒ドメインの間に挿入された酸ラベルリンカーのタンパク質配列を以下に示す。酸ラベルリンカーを太字で示し、第一ＣＢＤドメイン配列を下線で示す。
リンカー１
ＢＣＥ−ＷＧＤＰＨＹ−ＰＤＰ−ＢＢＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１５６）

リンカー２
ＢＣＥ−ＤＮＮＤＰＩ−ＰＤＰ−ＢＢＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１５７）

リンカー３
ＢＣＥ−ＶＶＡＤＰＮ−ＰＤＰ−ＢＢＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１５８）

リンカープラス１
ＢＣＥ−ＩＰＰＳＤＰＴＰＰＳＤＰＧＥＰ−ＷＧＤＰＨＹ−ＰＤＰ−ＢＢＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１５９）

リンカープラス２
ＢＣＥ−ＩＰＰＳＤＰＴＰＰＳＤＰＧＥＰ−ＤＮＮＤＰＩ−ＰＤＰ−ＢＢＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１６０）

リンカープラス３
ＢＣＥ−ＩＰＰＳＤＰＴＰＰＳＤＰＧＥＰ−ＶＶＡＤＰＮ−ＰＤＰ−ＢＢＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１６１）

精製工程の間にＢＢＩ及びＢＣＥ１０３触媒ドメインの間に切断可能部位を生成するために、アニールされ、ｐＪＭ１０３−ＢＢＩのＢａｍＨＩ及びＳａｃＩへ結合されるＤＮＡオリゴヌクレオチドペアの配列を以下に示す。
ＢＣＥｅｎｔＢＢＩ（エンテロペプチダーゼ切断部位）
ＧＡＴＣＣＡＧＧＴＧＧＡＧＡＣＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１６２）
及び
ＣＴＣＡＴＣＧＴＣＴＴＴＧＴＣＡＴＣＧＴＣＧＴＣＴＣＣＡＣＣＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１６３）

ＢＣＥｇｅｎｅｎ１ＢＢＩ（ゲネナーゼＩ切断部位）
ＧＡＴＣＣＡＧＧＴＧＣＴＧＣＴＣＡＴＴＡＣＧＡＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１６４）
及び
ＣＴＣＡＴＣＧＴＣＧＴＡＡＴＧＡＧＣＡＧＣＡＣＣＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１６５）

精製工程の間にＢＢＩ及びＢＣＥ１０３触媒ドメインの間に挿入される切断可能部位を生成するために、へアニールされ、ｐＪＭ１０３−ｌｎｋ２−１ＢＢＩｃｋ８１のＢａｍＨＩ及びＳａｃＩ結合されるＤＮＡオリゴヌクレオチドペアの配列を以下に示す。
ＢＣＥｆｕｒｉｎＢＢＩ（フリン／ブリステラーゼ切断部位）
ＧＡＴＣＣＡＣＧＴＧＣＴＡＡＡＡＧＡＧＡＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１６６）
及び
ＣＴＣＡＴＣＧＴＣＴＣＴＴＴＴＡＧＣＡＣＧＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１６７）

ＢＣＥｇｅｎｅｎ２ＢＢＩ（ゲネナーゼＩ切断部位）
ＧＡＴＣＣＡＧＧＣＧＣＴＧＣＡＣＡＣＴＡＣＡＡＣＧＡＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１６８）
及び
ＣＴＣＡＴＣＧＴＣＧＴＴＧＴＡＧＴＧＴＧＣＡＧＣＧＣＣＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１６９）

ＢＣＥｆｌｅＢＢＩ（Ｍｐｒ切断部位）
ＧＡＴＣＣＡＴＴＣＣＴＴＧＡＡＧＡＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７０）
及び
ＣＴＣＡＴＣＧＴＣＴＴＣＡＡＧＧＡＡＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７１）

ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位直接変異誘発（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ）を用いてリンカー２へＥ及びＥ３リンカーを導入するために用いるオリゴヌクレオチドプライマーペアの配列を以下に示す。
ＢＣＥ−Ｅｌｎｋ−ＢＢＩ（Ｍｐｒ切断部位）
ＣＣＣＡＴＡＣＣＧＧＡＧＣＣＡＧＡＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣＴＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７２）
及び
ＣＡＴＣＧＴＣＴＧＧＣＴＣＣＧＧＴＡＴＧＧＧＡＴＣＡＴＴＧＴＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７３）

ＢＣＥ１０３触媒ドメイン及びＢＢＩの間のＥ３リンカーのタンパク質配列はＤＮＮＤＰＩＰＥＰ［ＤＤＥＳＦＮＭＰＩＰＥＰ］（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７４）である。この配列において、Ｅリンカーを下線で示し、大腸菌における間違った組換えにより生成された配列を太字で示す。Ｍｐｒ（又はＶ８プロテアーゼ）による切断はＥ３リンカーの中にある３のグルタミン酸のいずれかの後に引き起こすことができる。従って、この構築体は、ＢＣＥ−（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７４）−ＢＢＩとなる。

ＢＢＩ及びＢＣＥ１０３触媒ドメインの間に挿入されるＧｅｎｅｎａｓｅＩ切断可能部位を生成するために、へアニールされ、ｐ２ＪＭ１０３−ｌｎｋ２−２ＢＢＩｃｋ８１のＢａｍＨＩ及びＳａｃＩへ結合されるＤＮＡオリゴヌクレオチドペアの配列を以下に示す。
ＢＣＥｇｅｎｅｎ３ＢＢＩ
ＧＡＴＣＣＡＧＧＣＧＣＴＧＣＡＣＡＣＴＡＣＡＡＡＴＣＡＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＣＡＧＣＡＡＴＧＡＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７５）
及び
ＣＴＣＡＴＣＧＴＣＡＴＴＧＣＴＧＴＧＣＴＧＡＴＧＧＴＣＴＧＡＴＴＴＧＴＡＧＴＧＴＧＣＡＧＣＧＣＣＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７６）

ＢＣＥｇｅｎｅｎ４ＢＢＩ
ＧＡＴＣＣＡＧＧＣＧＣＴＧＣＡＣＡＣＴＡＣＧＴＡＧＡＡＴＴＴＣＡＡＧＡＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７７）
及び
ＣＴＣＡＴＣＧＴＣＴＴＧＡＡＡＴＴＣＴＡＣＧＴＡＧＴＧＴＧＣＡＧＣＧＣＣＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７８）

ＢＤＥ１０３触媒ドメイン及びＢＢＩの間に挿入されるＧｅｎｅｎａｓｅＩ感受性切断部位（酸感受性及びＭｐｒ感受性でもある）のタンパク質配列は、ＤＮＮＤＰＩＰＤＰ［ＧＡＡＨＹＶＥＦＱ］（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７９）である。ＧｅｎｅａｓｅＩ部位（Ｇｅｎ４リンカーは太字（［］ので囲む配列）で（チロシン及びバリンの間に発生する切断）（ＮＥＢ）、リンカー２は下線で示。Ｍｐｒによる切断もＧｅｎ４リンカーの中のバリンの後のグルタミンの後に発生させることができる。本発明で用いられる配列はＢＣＥ−（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７９）−ＢＢＩである。

ＢＣＥ１０３−ｌｎｋ２−２ＢＢＩｃｋ８１融合タンパク質における切断部位を以下に示す。ＢＣＥ１０３触媒ドメイン（下線）のＣ末端のアミノ酸、リンカー２配列（太字）及び２ＢＢＩｃｋ８１配列を示す。酸／熱に不安定なＡｓｐ−Ｐｒｏ結合は塗りつぶし矢印、グルタミン酸の後のＭｐｒ感受性結合は線矢印で示した。

遊離ＢＢＩ又はその変異体を単離するために、ＢＣＥ１０３−ＢＢＩ融合タンパク質からＢＢＩ部分を切り離すことが必要になる。幾つかの態様において、バチルススブチルス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）により製造される固有のプロテアーゼを用いてこれは育成の間に行われる。幾つかの代替的な態様において、この切断は育成の後の精製工程（例えば、酸／熱又はタンパク質分解切断）ｄで行われる。リンカーは育成の間の切断に感受性を有する可能性のあるものが設計され（上記、ｓｕｂ、ｃｂｄｌ、ｐｒｏ、ｓｈｏｒｔｐｒｏ、及びｃｂｄＤ）、ＢａｍＨＩ−ＳａｃＩカセットとして、ｐＪＭ１０３ＢＢＩ又はｐ２ＪＭ１０３ＢＢＩ発現ベクター内でクローニングされる。融合タンパク質に対するＢＣＥ１０３触媒ドメインの生成は実施例１で説明されるＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で解析された。

ｐｒｏリンカーを除く、全てのリンカーにおいて、ＢＣＥ１０３触媒コアに対応する大きなバンドのほかに、ほぼ完全に切断されていると考えられる融合タンパク質の小さな切断が観察された。不幸なことに、育成の間に切断を行うと無細胞上清中で測定されるＢＢＩ活性は無視できるほどとなり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で同定するされるＢＢＩバンドを生じなかった。本発明を特定の方法又は理論に制限することは意図しないけれども、ＢＢＩはその不活性形態において、タンパク質分解に影響を受けやすいことが明らかでる。従って、活性化後の精製工程の間に切断することが通常好ましい。

幾つかの態様において、アスパラギン酸及びプロリン残渣の間の結合は、当該技術分野で知られている様に、酸性ｐＨにおける熱処理により切断される（Ｌａｎｄｏｎ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、４７：１４５−１４９［１９７７］）。ＢＣＥ１０３セルラーゼの中の第一ＣＢＤリンカーは酸／熱処理により切断される可能性のある３のＡｓｐ−Ｐｒｏペプチド配列を有する（図１を参照のこと）。しかしながら、これらの部位において、酸／熱処理による切断は効率が悪いことがわかった。特に酸／熱に不安定なタンパク質配列は文献に記載されている。そのような３の配列は、ＷＧＤＰＨＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４１）、ＤＮＮＤＰＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８４）、及びＷＡＤＰＮ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４３）（すなわち、リンカー１、２、及び３）である。

これらの酸に不安定なリンカーが、ＢＣＥ１０３−ＢＢＩ発現ベクター、ｐＪＭ１０３ＢＢＩ、へ導入される前に、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）ＸＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）変異誘発部位を用いて（８分間の伸長時間、及び１分間の変性工程を用いる以外は、製造会社の説明書に従い、実施例１７で述べた方法を用いて）、ＢＣＥｂｓｓ＿Ｆ及びＢＣＥｂｓｓ＿Ｒ（上記）のオリゴヌクレオチドを用いて、ａｐｒＥシグナル配列コード領域にａＢｓｓＨＩＩ部位を挿入した。その後、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩ部位をＬＡＴターミネーター（ＢＢＩ停止コドンの後の）の前に挿入し、ＳａｌＩ及び元のＨｉｎｄＩＩ部位へのオリゴヌクレオチドカセット（ＢＣＥｔｅｒｍ＋及びＢＣＥｔｅｒｍ−；上記）の挿入により、このターミネーター（ＬＡＴターミネーターの後のオリジナルＨｉｎｄＩＩＩ部位）の後にＰａｃＩ部位を付加した。この新しいベクターを「ｐ２ＪＭ１０３ＢＢＩ」と称した。

前方向プライマー、ＢＣＥ１０３ｃｏｒｅＢｓｓＨＩＩ＿Ｆｗ、リンカーＷＧＤＰＨＹ＿Ｒ、リンカーＤＮＮＤＰＩ＿ＲＶ又はリンカーＶＶＡＤＰＮ＿ＲＶ（配列は上記）の各リバースプライマーを用いて、及びｐＪＭ１０３ＢＢＩをテンプレートとして用いたＰＣＲにより、酸に不安定なリンカーフラグメントを製造した（ＰＣＲ手順については実施例１を参照のこと）。９７０ｂｐのＰＣＲフラグメントをＢａｎＨＩ及びＰｓｔＩで消化し、酸リンカーフラグメントをコードしている１５４ｂｐのフラグメントを電気泳動の後、アガロースから単離し、ＢａｎＨＩ及びＰｓｔＩで消化ししたｐＪＭ１０３ベクター内へ結合した。最終発現ベクターにおけるリンカー配列、ｐ２ＬＭ１０３ｌｎｋ−ＢＢＩ、ｐ２ＪＭ１０３ｌｎｋ２−ＢＢＩ及びｐ２ＪＭ１０３ｌｎｋ−ＢＢＩをＤＮＡ配列決定により確認した。

コンピテントバチルススブチルス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）系統、ＢＧ３９３４ｃｏｍＫ又はＢＧ６００６を、プラスミドを用いて形質転換し、コロニーを５ μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＡプレート上で選択し、実施例１で説明する様に、２５ μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを用いて増幅した。

同様に、第一ＣＢＤリンカーに挿入した。特に、ＰＣＲフラグメントは、前方向プライマー、ＢＣＥ１０３ｃｏｒｅＰｓｔＩ＿ＦＷ、ＬｐｌｕｓＤＮＮＤＰＩ＿ＲＶ又はＬｐｌｕｓＶＶＡＤＰＮ＿ＲＶのリバースプライマー（配列を上に記載）を用いて、テンプレートをｐ２ＪＭ１０３ＢＢＩとして酸に不安定なリンカーを生成した。１５０ｂｐのフラグメントを、ＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩを用いて消化し、精製し、ＢａｎＨＩ及びＰｓｔＩを用いて消化したｐ２ＪＭ１０３ＢＢＩに結合した。正確な配列をＤＮＡ配列決定法により確認し、上で述べたように、ｐ２ＪＭ１０３ｐｌｎｋ−ＢＢＩ、ｐ２ＪＭ１０３ｐｌｎｋ２−ＢＢＩ及びｐ２ＪＭ１０３ｐｌｌｎｋ３−ＢＢＩは、バチルススブチルス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の形質転換に用いた。

ＭＢＤ培地での育成の後、上で説明した（実施例２を参照のこと）イオン交換クロマトグラフィーにより融合タンパク質を精製した。融合タンパク質は１０％のギ酸中、５５℃、１６時間での処理することにより切断された。ＢＣＥ１０３触媒ドメインは、酸処理の間に沈殿し、遠心分離により分離された。上清中の遊離ＢＢＩをスピードバク（ＳｐｅｅｄＶａｃ）で一晩乾燥した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷する前に５０ｍＭトリスｐＨ８の中にサンプルを懸濁した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのタンパク質染色解析により、酸切断は、リンカー２がＢＣＥ１０３触媒ドメイン及びＢＢＩ（ＢＣＥ−ＤＮＮＤＰＩ−ＰＤＰ−ＢＢＩ）の間に挿入されている場合には、融合タンパク質において有効であることが観察された。このリンカーは、ｐＨ２、７５℃、２０ｍＭのグリシン中で数時間処理することで切断されることがわかった。

代替的な態様において、精製工程の間にプロテアーゼで処理することにより融合タンパク質を切断した。グルタミン酸特異プロテアーゼ（例えば、Ｍｐｒ又はＶ８プロテアーゼ）、フリン／ブリスターゼ、ＧｅｎｅｎａｓｅＩ及びエンテロペプチダーゼ（エンテロキナーゼ）に対する切断部位を用いてリンカーを消化した。リンカーは、ＢｅｎＨＩ及びＳａｃＩ部位を用いて、発現ベクター中のＢＣＥ１０３触媒コア及びＢＢＩの間にオリゴヌクレオチドカセットとして（配列は上に記載）導入された。オリジナルの発現ベクター（ｐＪＭ１０３ＢＢＩ）のコード領域において、第一ＣＢＤドメインの中及びＢＢＩの中の第三残渣にバチルススブチルス（Ｂ．ｓｕｂｕｔｉｌｉｓ）Ｍｐｒ又はＶ８プロテアーゼ等のグルタミン酸特異プロテアーゼにより切断されやすいと予測されるグルタミン酸残渣がある（図１）。しかしながら、ＢｓＭｐｒ又はＶ８プロテアーゼのいずれもがこれらの部位でＢＣＥ−ＢＢＩ融合タンパク質を切断することが困難であることがわかった。従って、これらのプロテアーゼにより切断されやすい他のリンカーを設計することが必要であった。

上で説明した６の不安定なリンカーの切断をＢｓＭｐｒにより試験した。これらの融合タンパク質は室温で、１６μｇのＢｓＭｐｒを用いて１６時間処理することにより切断された。切断の後、ＢＣＥ１０３触媒ドメインを１０％のギ酸を添加することにで乾燥させた。ＤＳＤ−ＰＡＧＥに負荷する前に５０ｍＭトリスｐＨ８にサンプルを懸濁した。酸切断と同様、ＢＣＥ−ＤＮＮＤＰＩ−ＰＤＰ−ＢＢＩ（リンカー２）融合タンパク質は、他のリンカーのどれよりもＢｓＭｐｒで効果的に切断された。それゆえ、ＢＢＩ及びその変異体は、酸／熱処理又はＢｓＭｐｒ等のグルタミン酸特異プロテアーゼを用いたタンパク質分解のいずれかによりＢＣＥ−ＤＮＮＤＰＤ−ＰＤＰ−ＢＢＩ融合タンパク質から、効果的に放出されていることがわかった。Ｍｐｒにより切断されるように設計された幾つかの他のリンカーも試験されたが、リンカー２よりも効果的なこのはなかった（Ｅ３リンカーは、Ｅリンカーを構築するために意図されたＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）部位切断変異誘発を用いた形質転換の後に大腸菌内の誤った組換えにより生成された）。上に示す様に、リンカー２の中に、酸／熱に不安定な切断部位と、Ｍｒｐにより切断されやすい３の部位がある。

フリン又はブリスターゼ（ＮＢＥ）（ＢＣＥｆｕｒｉｎＢＢＩ）又は、エンテロペプチダーゼ（エンテロキナーゼ、ＮＥＢ）（ＢＣＥｅｎｔＢＢＩ）による切断のために構築されたリンカーが試験されたが、これらのプロテアーゼより効果的に切断された配列はなかった。４のリンカー（ＢＣＥｇｅｎｅｎ１ＢＢＩ、ＢＣＥｇｅｎｅｎ２ＢＢＩ、ＢＣＥｇｅｎｅｎ３ＢＢＩ、及びＢＣＥｇｅｎｅｎ４ＢＢＩ）も消化され、ＧｅｎｅｎａｓｅＩ（ＮＥＢ）による切断について試験された。融合タンパク質の効果的な切断は、Ｇｅｎｅ４リンカー（ＢＣＥｇｅｎｅｎ４ＢＢＩ）を用いたときに観察された。ＢｓＭｐｒもまた、Ｇｅｎｅ４リンカーを効果的に切断した。

精製されたＢＣＥ−ｌｎｋ２−２ＢＢＩｃｋ８１融合タンパク質の活性化の後の、ＢｓＭｐｒによる切断はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上では観察されなかった。しかしながら、リンカー２（又はＧｅｎ４リンカー）を有するＢＣＥ−ＢＢＩ融合タンパク質の活性化の後の切断は、バチルスリケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｎａｉｓ）から単離されたＭｐｒプロテアーゼ（ＢＩＭｐｒ）を用いて成し遂げることができる。本発明を特定のメカニズムに限定することは意図しないけれども、成熟ＢＢＩの中の３番目のアミノ酸の切断はＢＩＭｐｒに対してより感受性があることが明らかである一方で、ＢＢＩのＣ末端から６番目のアミノ酸はＢｓＭｐｒ切断に対してより敏感である。

幾つかの態様において、切断の後、ＢＢＩは、上で述べるＢＣＥ１０３触媒ドメインの選択的酸沈殿（ｐＨ３以下）により、イオン交換クロマトグラフィー（実施例２０を参照のこと）、又は、５０ｍＭトリスｐＨ８．０を用いた無水トリプシンアガロースに負荷し、１５０ｍＭＮａＣｌで５０ｍＭトリスｐＨ８．０を洗浄し、その後、３００ｍＭＮａＣｌｄｅ，ｐＨ２．２５０ｍＭグリシンで結合ＢＢＩを溶出することにより、ＢＣＥ１０３触媒ドメインから単離精製された。

実施例５
ＢＢＩｃｋ８１のＶｅｇＦへの結合
本実施例は、ＢＢＩｃＫ８１のＶｅｇＦへの結合を評価するために行う試験について述べる。ＢＣＥ１０３−ｌｎｋ２−２ＢＢＩｃｋ８１融合タンパク質は実施例２で述べたように、バチルススブチルス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を用いて生成された。融合タンパク質を生成し、実施例３に記載されているように、βＭＥ及び酸化グルタチオンを用いた処理により、ＢＢＩトリプシン抑制活性が増加された。融合タンパク質はＢｓＭｐｒプロテアーゼ（実施例１９参照のこと）により切断され、Ｑセファロースカラムを用いたイオン交換クロマトグラフィーによりＢＣＥ１０３触媒ドメインから２ＢＢＩｃＫ８１を精製した。

すなわち、切断の後、切断されたサンプルのｐＨを５．５に調製し、このサンプルをその後、（ｐＨ５．５、２５ｍＭＭＥＳを用いて平衡化した）カラムに負荷した。

遊離２ＢＢＩｃｋ８１は、２５ｍＭ酢酸ナトリウムをカラムに通すことにより洗浄されるが、ＢＣＥ１０３触媒コアは樹脂に結合したままであった。２ＢＢＩｃＫ８１分画は精密ろ過により濃縮され、結合アッセイ（ＢｉｏＶｅｒｉｓ）に基づく、電気化学発光（ＥＣＬ）分析を用いて解析された。抗−ＶｅｇＦ抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）及びＶｅｇＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）は、製造会社（ＢｉｏＶｅｒｉｓ）の説明書に従って電気化学発光ダイ及びビオチンでそれぞれ標識した。全ての材料は０．１％Ｔｗｅｅｎ（商標）−８０を用いてダルベッコＰＢＳ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）中に溶解した。抗−ＶｅｇＦ抗体の一連の希釈物（１２５、２５０、及び５００ｎｇ／ｍｌ）及びＶｅｇＦの一連の希釈物（１００、１５０、２００及び２５０ｎｇ／ｍｌ）は、強固なＥＣＬシグナルを与える濃度を決定するためにアッセイされた。

２ＢＢＩｃｋ８１結合テストのために、５０μＬの５００ｎｇ／ｍｌＥＣＬ標識抗−ＶｅｒＦ抗体、５０μＬの２５０ｎｇ／ｍｌビオチン標識ＶｅｇＦ及び１００μＬ２ＢＢＩｃＬ８１（１２．５、１５、３１．２５、６２．５、１２５、２５０又は５００ｎｇ／ｍｌ）を振とうしながら、室温で２時間インキュベーションした。その後、５０μＬの０．２ｍｇ／ｍｌストレプトアビジンコートビーズを添加し、室温で３０分インキュベートした。ＥＣＬシグナルは、製造会社（ＢｉｏＶｅｒｉｓ）の説明書に従い、ＢｉｏＶｅｒｉｓＭ８／３８４解析を用いて測定した。図１９に示すように、ＥＣＬシグナルは２ＢＢＩｃｋ８１濃度が増加する毎に減少した。標識された抗−ＶｅｇＦ抗体のより多くが磁気ビースが付着しているＶｅｇＦに結合したことを示す。

従って、ＣＫ３７２８１ペプチドは、ＢＢＩキモトリプシン抑制ループ（２ＢＢＩｃＫ８１）上に移植されたときに、μモルの濃度で抗−ＶｅｒｇＦ抗体とＶｅｇＦの結合について競合することがわかった。実際には、２ＢＢＩｃｋ８１はＶｅｇＦ結合に対して、合成ＣＫ３７８１ペプチド自身よりも強固に競合することがわかった（図６参照のこと）。ＣＫ３７２８１ペプチドは、トリプシン抑制ループ、１ＢＢＩｃ８１内に挿入され、ＢｉｏＶｅｒｉｓアッセイにおいて、抗−ＶｅｇＦ抗体と競合した。従って、ＢＢＩは各種スクリーニング法により選択される本発明の活性結合ペプチドのスキャッフォールドとして有用である。

実施例６
２ＢＢＩｃｋ８１の生産に対する融合代替パートナーの使用
本実施例は、融合代替パートナーを評価するための試験を説明する。ｐＥＴ−４０（＋）由来のｄｓｂｃ遺伝子（大腸菌）を増殖させるのに用いるオリゴヌクレオチドプライマーのＤＮＡ配列を以下に示す。このプライマーはｐ２ＪＭ１０３−Ｇｅｎ４−２ＢＢＩｃｋ８１内へのクローニングのために５’末端にＢｓｓＨＩＩ部位を、３’末端にＢａｎＨＩ部位を生成する。
ＤｓｂＣＢＢＩ−Ｆ
ＡＡＣＡＴＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＧＣＴＧＡＴＧＡＣＧＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＡＣＡＡＡＣＧＴＴＡＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８１）

ＤｓｂＣＢＢＩ−Ｒ
ＴＣＧＴＣＴＧＧＡＴＣＣＧＧＴＡＴＧＧＧＡＴＣＡＴＴＧＴＴＧＴＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＴＡＧＴＴＧＡＴＣＣＴＴＴＡＣＣＧＣＴＧＧＴＣＡＴＴＴＴＴＴＧＧＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８２）

リンカー２を有するＢＢＩへ、シュードモナスメンドセラ（Ｐ．ｍｅｎｄｏｃｉｎａ）クチナーゼ遺伝子の融合のためのカセット（Ａｌｗ４４Ｉ−ＢａｎＨＩ）を作るために共にアニールされるオリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列を以下に示す。
ＣｕｔｉｎａｓｅＢＢＩ＋
ＴＧＣＡＣＴＴＣＴＣＴＧＣＴＴＴＧＧＴＣＴＧＴＴＧＡＡＣＧＣＡＧＡＧＧＴＣＴＴＧＡＣＡＡＣＡＡＴＧＡＴＣＣＴＡＴＴＣＣＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８３）

ＣｕｔｉｎａｓｅＢＢＩ−
ＧＡＴＣＣＧＧＡＡＴＡＧＧＡＴＣＡＴＴＧＴＴＧＴＣＡＡＧＡＣＣＴＣＴＧＣＧＴＴＣＡＡＣＡＧＡＣＣＡＡＡＧＣＡＧＡＧＡＡＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８４）

ＢＩ部分は７個のジスルフィド結合を有することから、ＢＣＥ１０３セルロース触媒ドメイン以外の融合タンパク質を用いて、活性ＢＢＩの高い力価が得られることが予測される。例えば、幾つかの態様において、チオールジスルフィド酸化還元酵素及び／又はタンパク質ジスルフィドイソメラーゼは正しく折りたたまれたＢＢＩを生産するための融合タンパク質として用いられる。この態様において、追加的な活性化ステップが大部分の環境下において必要とされない。追加的な態様において、バチルススブチルス（Ｂ．ｓｂｕｔｉｌｉｓ）の中で高い力価で製造される他のタンパク質も融合パートナーとして用いることができる。例えば、フミコーラインソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａｉｎｓｏｌｅｎｓ）由来の熱安定タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ｈｉＰＤＩ）は、バチスルスブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ）の中の免役グロブリンの軽鎖（２ジスルフィド）の融合パターンとして用いられている（Ｋａｊｉｎｏｅｔａｌ．、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６：６３８−６４２［２０００］）参照のこと。

ＢＢＩ生産に関して、ｈｉＰＤＩがＢＣＥ１０３よりも良い融合パートナーであるかどうかを決定するために、ｈｉＰＤＩ遺伝子を合成し（ＤＮＡ２．０）、発現ベクター、ｐ２ＪＭ１０３−ｌｎｋ２−２ＢＢＩｃｋ８１（実施例４を参照のこと）、の中で、ＢｓｓＨＩＩ−ＳａｃＩフラグメントとしてクローニングした。制限部位が導入された又は欠失されている場合を除き、高頻度で、高発現するバチルススブチルス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）遺伝子の発生コドンが合成遺伝子の設計のために選択された。最終濃度において、成熟ｈｉＰＤＩ遺伝子のＮ末端をＡｐｒＥシグナル配列に融合し、Ｃ末端はエンテロペプチダーゼ切断部位を有するリンカーに融合した（Ｋａｊｉｎｏｅｔａｌ．、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６６：６３８−６４２［２０００］）。それらを順番に、２ＢＢＩｃｋ８１（実施例１９参照のこと）に融合する。この発現ベクター、ｐ２ＪＭ−ＰＤＩ−ＥＫ−２ＢＢＩｃｋ８１はバチルススブチルス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＧ６００６を形質転換するために用いた。融合タンパク質の生成はＭＢＤ培地中で（実施例１６で説明したように）２ｍＭβＭＥを添加、あるいは無添加した状態で、接種後１４時間で評価に用いた。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより評価されるように、ＰＤＩ−２ＢＢＩｃｋ８１融合タンパク質の生産は、通常同じ条件で育成されたＢＣＥ−２ＢＢＩｃｋ８１によりわずかに少ない。ＰＤＩ−２ＢＢＩｃｋ８１細胞を含まない上清を用いて測定された（トリプシン抑制）ＢＢＩ力価も又、通常ＢＣＥ−２ＢＢＩｃｋ８１融合細胞よりもわずかに少なかった。ＢＣＥ１０３への融合と同様に、ＰＤＩへ融合させたときに測定されるＢＢＩ力価は、２ｍＭβＭＥ中で育成したときに高くなり、ＢＢＩ活性はβＭＥフリー培地中で育成したときの育成の後、細胞フリー上清にβＭＥを添加することにより高められた（実施例３に記載されているように）。したがって、ＰＤＩのチオールジスルフィド酸化還元活性は、融合タンパク質の中の活性か２ＢＢＩｃｋ８１の力価を有意に改善しなようであり、ＢＢＩ分子を活性化する必要を排除した。

育成の間のＢＢＩ力価を改善すると思われる融合タンパク質の還元電位を増加させるために、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）由来のＤｓｂＣが２ＢＢＩｃＫ８１に対する融合パートナーとして用いられた。ｄｓｂＣ遺伝子は、ＤｓｂＣＢＢＩ−Ｆ及びＤｓｂＣＢＢＩ−Ｒをプライマーとして用いて（配列は上に記載）、ｐＥＴ−４０（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）をテンプレートとして用いて、製造会社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ）の説明書に従い、ＨｅｒｃｕｌａｓｅＥｎｈａｎｃｅｄＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲにより増幅させた。単離されたＰＣＲフラグメントはベクターｐ２ＪＭ１０３−Ｇｅｎ４−２ＢＢＩｃｋ８１（実施例４を参照のこと）の中で、ＢｓｓＨＩＩ−ＢｓｍＨＩフラグメントとして用いてクローニングした。融合遺伝子の正確な配列はＤＮＡ配列決定により確認された。このケースにおいて、ＤＳｂＣ−２ＢＢＩｃｋ８１融合タンパク質の力価はＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で判断した時に、ＢＣＥ−２ＢＢＩｃｋ８１融合タンパク質よりも有意に低かった。トリプシン抑制により測定される活性２ＢＢＩｃｋ８１力価も又十分に低かった。

バチルススブチルス（Ｂ．ｓｕｂｕｔｉｌｉｓ）の中で高い力価を伴い生産される他のタンパク質は、ＢＢＩの生産に対する融合パートナーとして用いることができる。そのようなタンパク質の一つは、バチルススブチルス（Ｂ．ｓｕｂｕｔｉｌｉｓ）由来のａｐｒＥプロモーターを用いて高力価が発現されるシュードモナスメンドシナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｍｅｎｄｏｃｉｎａ）由来のクチナーゼである（参照により本発明の明細書に援用される米国特許５，４２９，９５０参照のこと）。ａｐｒ−Ｅクチナーゼ遺伝子融合（体）は、ＥｃｏＲ１−Ａｌｎ４４Ｉフラグメント（ｐＡＫ−１５由来）として、Ａｌｗ４４Ｉ−ＢａｍＨＩリンカーオリゴヌクレオチドカセット（配列は上記）を用いて、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩを用いて切断されたｐ２ＪＭ１０３−ｌｎｋ２−２ＢＢＩｃｋ８１（実施例４参照のこと）へ結合した。このクチナーゼ−リンカー２−２ＢＢＩｃＫ８１発現ベクターは、バチルススブチルスＢＧ６００６細胞の形質転換に用いて、融合タンパク質はＭＢＤ培地の中で他の融合タンパク質に対して記載したのと同様に生産された（実施例１参照のこと）。このケースにおいて、クチナーゼリンカ−２−２ＢＢＩｃｋ融合タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で見られる主要バンドではなく、測定されたリパーゼ力価（米国特許５，４２９、９５０に記載の方法を用いて測定された）及びＢＢＩの力価はＢＣＥ−２ＢＢＩｃｋ８１融合タンパク質で見られたものよりも大部低くなっていた（２０倍）。クチナーゼ融合タンパク質中のＢＢＩ力価は育成培地に、３ｍＭのβＭＥを添加したときにも改善されなかった。したがって、活性２ＢＢＩｃｋ８１の最高力価はＢＣＥ−２ＢＢＩｃｋ融合タンパク質の活性化により、確実に得られるのである。しかしながら、各種融合タンパク質も本発明に用いることができるだろう。

実施例７
切断されたＢＢＰＩ―ＡＶ（ＢＢＰＩ―ＡＶ；ＤＥＱＩＤＮＯ：１８７）
この実施例は２ＢＢｌｃｋ８１ＢＢＩタンパク質（ＢＢＩ−ＡＶ；ＳＥＱＩＤＮＯ：１８６）
ＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＡＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＳＤＭＲＬＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＡＣＹＮＬＹＧＷＴＣＦＣＶＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥＤＤＫＥＮ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８）の生成を改善を実施する。

前述の実験及びＶｏｇｔｅｎｔａｎｚｅｔａｌ．、２００７（ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒＰｕｒｉｆ５５：４０−５２［２００７］）の記事はＢＣＥ１０３セルラーゼ触媒ドメインメイン（ＢＣＥ）のＣ末端に融合したダイズボウマンブリックインヒビター（ＢＢＩ）を含む融合タンパク質を生成する方法を開示する。前述のように、このシステムはトリプシン及び／又はキモトリプシンループを置換する各種変異ペプチドを有するＢＢＩ分子を生成するために用いられてきた。例えば、野生型のキモトリプシンインヒビターループを置換するＶＥＧＦ結合ペプチド、ＣＫ３７２８１（ＡＣＹＮＬＹＧＷＴＣ；ＳＥＱＩＤＮＯ：９）、を含むＢＢＩ分子、ＢＢＩ−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８６）が生産され、精製され、及びＶＥＧＦに結合するモノクローナル抗体を用いた結合アッセイ（ＢｉｏＶｅｒｉｓ）に基づく電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬ）における競合を示す。しかしながら、変異ＢＢＩ−ＡＶの回収された産量は不正確なジスルフィド結合を有する分子の初期のパーセンテージの高いことに起因している野生型ＢＢＩ分子よりも生産性が低い。

ＳＥＱＩＤＮＯ：１８６のＢＢＩ−ＡＶ切断形態（即ち、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７のＢＢＩ−ＡＶ）はＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＡＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＳＤＭＲＬＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＡＣＹＮＬＹＧＷＴＣＦＣＶＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７）あり、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８６のＣ末端の５つのアミノ酸がなく、ＶＥＧＦを競合体としてラベルされたモノクローナル抗体を用いたＥＣＬ（ＢｉｏＶｅｒｉｓ）アッセイにおいて、完全長分子（即ち、切断された分子）よりもＶＥＧＦへの結合が良好であることが示された。ＢＢＩｔ−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７），と呼ばれるＢＢＩ−ＡＶのＣ末端切断形態はＢａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のＧｌｕＢＬプロテアーゼ（グルタミルエンドペプチダーゼＩ）でＣ末端をトリミングすることにより精製工程の間に製造できる。代替的に、ＢＢＩｔ−ＡＶは以下の改良されたオリグヌクレオチドカセットを用いて停止コドンを導入することにより得ることができる。以下のＢＢＩ−切断＋及びＢＢＩ切断−オリゴヌクレオチドをアニールしてオリグヌクレオチドアンモニウムｋセットを生成した。
ＢＢＩ−ｔｒｕｎｃ＋
５’−ＴＣＧＡＣＡＴＣＡＣＧＧＡＣＴＴＣＴＧＣＴＡＴＧＡＡＣＣＡＴＧＴＡＡＡＣＣＡＡＧＣＧＡＧＴＡＡＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８８）
及び
ＢＢＩ −ｔｒｕｎｃ−
５’−ＡＧＣＴＴＴＴＡＣＴＣＧＣＴＴＧＧＴＴＴＡＣＡＴＧＧＴＴＣＡＴＡＧＣＡＧＡＡＧＴＣＣＧＴＧＡＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８９）

このオリゴヌクレオチドカセットをその後Ｐ２ＪＭ１０３−ＬＮＫ２−２ＢＢＩＣＫ８１のＳａｌｌ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位に結合し、正確な配列を確認し、得えられた発現カセットをＰ２ＪＭ１０３−ＬＮＫ２−ＢＢＩＴ−ＡＶとした。

発現を改善するために、ＡＰＲＥＰＲＯ−ＰＥＰＴＩＤＥ、ＡＧＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１９１）（Ｕ．Ｓ．ＰＡＴＥＮＴＮＯ．５，４２９，９５０）の初めの３つのアミノ酸をコードしているポリヌクレオチド配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１９０ｇｃｔｇｇｔａａａ）をＡＰＲＥシグナル配列の最後と成熟ＢＣＥ１０３セルラーゼの間に、ＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（商標）部位指定変異誘発キット（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）を用いて挿入した。この部位指定変異誘発は以下のオリゴヌクレオチドプライマーをテンプレートとして、Ｐ２ＪＭ１０３−ＬＮＫ２−ＢＢＩＴ−ＡＶを用いた製造により説明されるように、必須である。
ＢＣＥ−ＡＧＫ−Ｆ：
５’−ＧＣＧＣＧＣＡＧＧＣＡＧＣＴＧＧＴＡＡＡＧＡＴＧＡＴＴＡＴＴＣＡＧＴＴＧＴＡＧＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１９２）
及び
ＢＣＥ−ＡＧＫ−Ｒ：
５’−ＡＡＴＡＡＴＣＡＴＣＴＴＴＡＣＣＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＡＴＧＴＴＧＣＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１９３）

正確な挿入がＤＮＡ配列決定により確認され、得られた発現ベクターをｐ２ＪＭａｇｋ１０３−ｌｎｋ２−ＢＢＩｔ−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１９４）とした。

ｐ２ＪＭａｇｋ１０３−ｌｎｋ２−ＢＢＩｔ−ＡＶ発現ベクターでバクテリア細胞を形質転換して、ＢＣＥタンパク質に融合するＢＢＩｔ−Ａｖを発現した。

実施例８
ＢＢＩｔ−ＡＶ部位飽和ライブラリー
この実施例は、図９に示すＢＢＩｔ−ＡＶ分子（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７）の３９アミノ酸のそれぞれに置換を含む部位飽和ライブラリーを構築することにより、未修飾ＢＢＩｔ−ＡＶ由来の修飾変異ＢＢＰＩを生成することを開示する。

ＢＢＩｔ−ＡＶ部位飽和ライブラリーは以下のようにＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ複数部位指定変異誘発キット（ＱＣＭＳ）の変更バージョンを用いて、Ａｍｉｎｅｔａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ３５：１１３４−１１４０、［２００３］）に記載のように、生成した。中央及び１７乃至２０フランキング塩基中のＮＮＳコドンを有するフォワード及びリバースプライマーの重複を各部位について設計した。ＢＢＩ−ＡＶ分子の置ける６６アミノ酸位置のそれぞれにおけるフォワード（Ｆ）及びリバース（Ｒ）プライマーの配列を表１に示す。

各変異反応物は、５０乃至１００ｎｇテンプレートプラスミド（ｐ２ＪＭａｇｋ１０３−ｌｎｋ２−ＢＢＩｔ−ＡＶ；ＳＥＱＩＤＮＯ：１９４）、０．５μＬの１０ＸＱＣＳＭ反応緩衝液、１８．５μＬの脱イオン水、及び１μＬの酵素ブレンド（ＱＣＭＳｋｉｔ）を含み、総量でで２５μＬになる。残基１０、１１、１３、及び２５におけるＢＢＩ―ＡＶライブラリーについてのみ１μＬのフォワードプライマー（２５μＭ）を用い、リバースプライマーを用いなかった。６、３７、３８、５０及び５３残基におけるライブラリーについて、変異反応は０．５μＬのフォワードプライマーとベクター中の配列に相補的な他のプライマー（５’−ＣＴＡＴＧＣＧＧＣＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡＴＴＧＴＡＣ；ＳＥＱＩＤＮＯ：３２８）と組み合わせて用いて行った。変異誘発反応について、用いた熱サイクルプログラムは９５℃２分を１サイクル、次いで９５℃３０秒、５５℃１分、及び６８℃１０分を２９サイクル行った（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）。テンプレートＤＮＡは０．５乃至１μＬＤｐｎｌ（ＱＣＭＳｋｉｔから）を添加して、３７℃で１乃至４時間インキュベートし、次いで新たに０．５乃至１μＬＤｐｎｌを添加して、３７℃で１乃至４時間インキュベートして消化した。このテンプレートＤＮＡはＤｐｎｌ消化の影響を受けやすくするために、ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）等のＥ．ｃｏｌｉｄａｍ^＋株から得られた。

バチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の効果的な形質転換のために、各変異誘発反応のおけるＤＮＡをアマシャムからのＴｅｍｐｌｉｐｈｉｋｉｔを用いて、ローリングサイクル増幅（ＲＣＡ）により増幅した。具体的には、１μＬの希釈していないＱＣＭＳ反応物をＴｅｍｐｌｉｐｈｉｋｉｔのサンプル緩衝液５μＬと混合する。この混合物を３分間９５℃で加熱してＤＮＡを変性させる。反応物を氷上に２分置く。その後、５μＬのサンプル緩衝液及び０．２μＬのｐｈｉ２９ポリメラーゼを反応物に添して、ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈサームサイクラー内で３０℃、５時間インキュベートする。最後に、反応物中のｐｈｉ２９酵素をＭＪＲｅｓｅａｒｃｈｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ中で６５℃１０分間インキュベートして、熱失活させる。増幅したＤＮＡを１０乃至１００倍に希釈して、１μＬをコンピテントバチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＧ６００６ｃｅｌｌｓ（Ｖｏｇｔｅｎｔａｎｚｅｔａｌ．、２００７）１００μＬの形質転換に用いる。形質転換混合物の２５μＬ又は７５μＬを５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを懸濁させて含むＬｕｒｉａアガープレート上で平板培養した。育成の後、個々の形質転換体を採取して、９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェル中の５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを懸濁して含むＬｕｒｉａブロス１００μＬ中に接種した。これを湿度の高い通気ボックス中、３７℃２７０ｒｐｍで育成し（Ｉｎｎｏｖａ４２３０ｉｎｃｕｂａｔｏｒ、ＮｅｗＢｒｕｎｓｗｉｃｋＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）た。育成の後、５０％グリセロール８０μＬを各ウェルに添加してよく混合した。各ウェルから１４０μＬの培地を採取して、新たなマイクロタイタープレートにおいて、２つのマイクロタイタープレートを作成た。両方のプレートを−８０℃で貯蔵した。１つのプレートをマスターとして保管し、他のプレートを個々の変異体のＤＮＡ配列決定（Ｃｏｇｅｎｉｃｓ、Ｈｕｓｔｏｎ、ＴＸ）に用いた。ＤＮＡ配列について、マイクロタイタープレートの各コロニーを一晩育成して、１０並びに４０倍に希釈し、このうちの２μＬをＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＲｅａｄｙ−ｔｏ−ｇｏＰＣＲビーズ及びプライマーＢＢＩ−ＰＣＲ−Ｆ及びＢＢＩ−ＰＣＲ−Ｒを用いて、ＰＣＲ反応に用いた。熱サイクル条件は、９５℃５分を１サイクル、次いで９５℃１分、５５℃１分、及び７２℃１分を３０サイクル行った。ＰＣＲ生成物をＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅＩ及びシュリンプアルカリフォスファターゼ（ＥＸＯＳＡＰ−ＩＴ、ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）又で処理するか、又はＭ１３リバースプライマーで配列決定する前にカラム精製を行った。

各マスタープレート中の培養物を解凍して、各ウェルに５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含む１５０μＬのＬｕｒｉａブロスを含む新しいマイクロタイタープレートにピンリプリケーターを用いて接種した。このプレートを前述のような湿度の高い通気ボックス中で１０時間まで育成した。対照として、２つのウェル中の培養物を同時に１５ｍｌ培養チューブ内（５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを服務５ｍｌのＬｕｒｉａブロス）で育成したＢＢＩ及びＢＢＩ−ＡＶ培地に置き換えた。培地を育成した後、このプレートを、ピンリプリケーターを用いて、各ウェルに５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＭＢＤ培地（Ｖｏｇｔｅｎｔａｎｚｅｔａｌ．、２００７）１５０μＬ含む２つの９６ウェルマイクロタイタープレートの接種に用いた。この２つのプレートを１４時間育成し（前述のように積まれたプレートの周りに空気を効率的に流すために、プラスチックスペーサーをおいた）、その後２−メルカプトエタノールを各ウェルに添加して、プレートの１つにおいて、最終濃度を２ｍＭにした。このプレートを更に４６時間育成した。培養ブロス（２−メルカプトエタノール添加又は無添加）を含む９６ウェルフルタープレートをＢＢＩ及びＢＣＥ活性のアッセイに用いた。

実施例９
ＢＢＩｔ−ＡＶ変異体の初期スクリーニング：最も高いＢＢＩｔ−ＡＶ：ＢＣＥ活性比を有する変異体を決定するためのＢＢＩ及びＢＣＡ活性
この実施例において、部位飽和変異誘発方法により精製された修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶへ導入されたアミノ酸置換の硬化を評価するための方法を提供する。前述のような部位飽和変異誘発方法により精製された修飾ＢＢｌｔ−ＡＶのトリプシン抑制活性を測定し、対照野生型ＢＢＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３；ＢＢＩ−ｗｔ又はｓＢＢＩ）及び対照未修飾ＢＢＩｔ−Ａｖ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７）と比較した。本発明を特定の方法に限定することは意図しない。他の好適な方法も用いることができる。

トリプシン抑制アッセイ：ＢＢＩ活性の決定
活性対照及び修飾ＢＢＩｔ−ＡＶの相対的濃度を前述のように精製されたＢＢＩを標準として用いてトリプシン抑制アッセイにより決定した。幾つかのサンプルについて、活性ＢＢＩ濃度をＦｌｅｃｋｅｒ（Ｆｌｅｃｋｅｒ、Ｐ．ＦＥＢＳＬｅｔｔ．２５２：１５３−１５７［１９８９］；Ｖｏｇｔｅｎｔａｎｚｅｔａｌ．上記）に記載の方法に従って残余トリプシン活性により測定した。

ライブラリーを９６ウェルプレート中で育成した培養物の希釈剤物を用いて回折した。典型的には、各ウェルからの培養ブロスアッセイ緩衝液（１００ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．６、０．００５％Ｔｗｅｅｎ８０）で希釈して（２００倍）第二のマイクロタイタープレート（ＣｏＳｔａｒ９０１７、Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｉｎｃ．、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）に移した。その後、２０μｌの希釈されたサンプルを第三のマイクロタイタープレートに移した。希釈したｓＢＢＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）対照培養物を２０、１０、５、マイクロタイタープレート２．５μＬ用いて、空のウェルに標準曲線を作成した。その後、８０μＬの５０ｎｇ／ｍｌトリプシン（ボバインパンクレアトリプシン、ＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｏｒｐ．、Ｌａｋｅｗｏｏｄ、ＮＪ）（１ｍｇ／ｍｌストック溶液をアッセイ緩衝液で希釈して調整）をこのプレートの各ウェルに添加した。反応物を混合し、１５分間室温に置いた。インキュベーションの後、ＤＭＳＯ中１００ｍｇ／ｍｌ溶液からアッセイ緩衝液で希釈剤された０．５ｍｇ／ｍｌトリプシン基質１００μＬ（ｓｕｃｃｉｎｙｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐａｒａ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ、ＢａｃｈｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｃ．、ＫｉｎｇｏｆＰｒｕｓｓｉａ、ＰＡ）を各ウェルに添加して、混合し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ２５０（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）を用いて各１２秒ごとに１回記録をして、１５分間４０５ｎｍにおける吸光度をモニターした。データポイントは各反応の速度を決定するために用いた。反応速度対ＢＢＩ容量をプロッティングして標準曲線を作成し、４つのパラメーター式に当てはめた。全てのデーターのフィッティングをソフトウェア（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓＣｏｒｐ．、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて行った。各ＢＢＩｔ−ＡＶ変異体の活性を標準曲線から計算した。したがって、修飾タンパク質全てのｓＢＢＩ対象培地（ＢＢＩ−ＷＴ）における活性にたいして決定した。もし、データの大部分が標準曲線のＩＣ５０に当てはまらない場合、新たな希釈剤プレートを作成しアッセイした。

セルラーゼ酵素活性アッセイ：ＢＣＥアッセイ
ＢＣＥの濃度を、前述及びＶｏｇｔｅｎｔａｎｚｅｔａｌ．２００７に記載のように精製したＢＣＥを標準として用いて、活性アッセイにより決定した。９６ウェルマイクロタイタープレート中で育成されたライブラリーの活性について、２０μＬの培地ブロスを新しいマイクロタイタープレートの各ウェルに移した。２０、１０、５、又は２．５μＬの希釈されたＢＢＩ−ＷＴ対照培地を空のウェルに添加して標準曲線を作成した。その後、１８０μＬのＢＣＥ基質（アッセイ緩衝液中０．２５μｇ／ｍｌ）、４−ニトロフェニルβ−Ｄ−セロビオシド（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）をこのプレートに添加した。このプレートを混合し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ２５０（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）を用いて各１２秒ごとに１回記録をして、１５分間４０５ｎｍにおける吸光度をモニターした。データポイントは各反応の速度を決定するために用いた。標準曲線を培養物容量対速度のプロッティングにより生成し、二次曲線にあてはめた。各変異体培養物中のＢＣＥ濃度は標準対象培養物に対して決定された。

酵素活性比：ＢＢＩｔＡＶ：ＢＣＥ比
マイクロタイタープレートの結果から、各ウェルのＢＢｌｔ−ＡＶ：ＢＣＥ活性は、相対的なＢＢＩｔ−ＡＶとｒプシン抑制活性値を相対的なＢＣＥ活性値で割って決定した。このデータはＢＢＩｔ−ＡＶ：ＢＣＥ活性比に基づいて並べた。最も高いＢＢＩｔ−ＡＶ：ＢＣＥ活性比を有する修飾変異体を選択し、以下の第二スクリーニングに供した。

ＢＢＩｔ−ＡＶ：ＢＣＥ酵素活性比の解析−変異体の第二スクリーニング
この実施例では、一次スクリーニングで決定したように、還元剤（２−メルカプトエタノール）の存在又は不存在下で育成したときに、対照未修飾ＢＢＩｔ−ＡＶに対して改善されたＢＢＩｔ−ＡＶ：ＢＣＥ活性比を有する修飾ＢＢＩｔ−ＡＶが整列させられ、２次アッセイにおいて４通りに評価された。最初に、２次スクリーニングにとえい決定されたように最も高いＢＢＩｔ−ＡＶ：ＢＣＥ比を有する修飾ＢＢＩｔ−ＡＶのそれぞれをコードしているポリヌクレオチドのみを配列決定した。次いで、全てのＢＢＩｔ−ＡＶクローンを配列決定した。

マイクロタイタープレートにおける４通りの試験―２次スクリーン
各プレートについて、一次スクリーンから選択された修飾ＢＢＩｔ−ＡＶを含む培養物の２２個のサンプル及びｓＢＢＩ及び未修飾ＢＢＩｔ−ＡＶを含む対象培養物の２つのサンプルを、１５ｍｌ培養チューブ内で５ｐｐｍクロラムフェニコールを含むＬｕｒｉａブロス５ｍｌで、１０時間育成した（３７℃、２５０ｒｐｍ）。その後、９６ウェルのマイクロタイタープレートに２４個の培地をそれぞれ１５０μＬずつ４つ組みに配列させた。この配置させたプレートをその後ピンレプリケターを用いて各ウェルごとに５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＭＢＤ培地１５０μｌを含む２つ組のフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＳＧＶ２２１０）への接種に用いた。平板培養した培地を（２−β―メルカプトエタノール（βＭＥ）の存在下又は不存在下）で育成し、ＢＢＩ−ＡＶ：ＢＣＥ比を前述のように決定及び解析した。

図１０は修飾変異ＢＢＩｔのトリプシン抑制活性におけるＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の２９位における１９アミノ酸置換全ての効果の例を示す。このデータはＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の２９位における１つのアミノ酸置換を有する修飾ＢＢＩ−ＡＶのＢＣＥ及びトリプシン活性の４つ組み測定から決定されたＢＢＩ及びＢＣＥ活性の比を示す。

実施例１０
既知のアミノ酸置換を有する改善され修飾ＢＢＩｔ−ＡＶの選択
この実施例では、未修飾親ＢＢＩ−ＡＶのトリプシン抑制活性と比較したときに、改善されトリプシン抑制活を有するＢＢＩｔ−ＡＶとなる、初期インキュベートのスクリーニングで同定された部位におけるアミノ酸置換の完全なセットを生成するために、部位飽和ライブラリーを生成する。更に、可能な１９アミノ酸全部で予め置換されていない部位におけるアミノ酸置換の完全なセットを部位指定変異誘発により生成した。合計３９個の部位飽和ライブラリーを生成して、ＢＢＩトリプシン抑制活性及びＢＣＥ活性の４つ組み活性測定を解析して対照ＢＢＩ分子、即ち、ｓＢＢＩ及び未修飾ＢＢＩｔ−Ａよりも大きなよりプシン抑制活性を有する修飾ＢＢＩｔ−ＡＶとなる一部位置換を決定した。未修飾ＢＢＩｔ−ＡＶにおいて置換されたアミノ酸の位置を図９に示す。

１８、３８、及び６１位における部位飽和ライブラリーの第二セットの構築
初めに、ライブラリー構築のために、合成遺伝子を合成して、２ＢＢＩｃｋ８１コード領域中のトリプシン抑制ループをコードしている領域とキモトリプシンループをコードしている領域との間のＳｐｌ部位を有するＥｃｏＲＩ部位を置換した。（ＥｃｏＲＩの位置は図３に示す）。この合成遺伝子配列は：
ＧＧＡＴＣＣＡＧＡＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣＴＣＴＡＡＡＣＣＴＴＧＴＴＧＣＧＡＴＣＡＡＴＧＣＧＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＴＣＡＡＡＣＣＣＴＣＣＡＣＡＡＴＧＴＣＧＴＴＧＴＴＣＴＧＡＴＡＴＧＣＧＴＴＴＡＡＡＴＡＧＣＴＧＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＴＧＣＡＡＡＴＣＡＴＧＴＧＣＴＴＧＣＴＡＴＡＡＣＣＴＴＴＡＣＧＧＴＴＧＧＡＣＡＴＧＴＴＴＣＴＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣＡＣＴＧＡＣＴＴＣＴＧＣＴＡＴＧＡＡＣＣＡＴＧＴＡＡＡＣＣＴＴＣＴＧＡＡＴＡＡＡＡＧＣＴＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３２９）。この合成遺伝子をＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとしてｐ２ＪＭａｇｋ１０３−ｌｎｋ２−ＢＢＩｔ−ＡＶへクローンして、得られたベクターをｐ２ＪＭａｇｋ１０３−ｌｎｋ２−ＢＢＩｔ−Ａｖｓｐｈとした。

部位飽和ライブラリーを１８、３７、及び６１位で、以下のオリグヌクレオチドカセットを用いて構築した。

１８位における部位飽和ライブラリーはオリグヌクレオチド：ＧＴＡＣＡＡＡＡＴＣＡＮＮＳＣＣＴＣＣＡＣＡＡＴＧＴＣＧＴＴＧＴＴＣＴＧＡＴＡＴＧＣＧＴＴＴＡＡＡＴＡＧＣＴＧＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３３０）、及び５’−ＣＡＧＡＡＴＧＡＣＡＧＣＴＡＴＴＴＡＡＡＣＧＣＡＴＡＴＣＡＧＡＡＣＡＡＣＧＡＣＡＴＴＧＴＧＧＡＧＧＳＮＮＴＧＡＴＴＴＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３３１）のアリーニング及び得られたカセットをｐ２ＪＭａｇｋ１０３−ｌｎｋ２−ＢＢＩ−ＡｖｓｐｈのＢｓｒＧＩ及びＳｐｈＩへ結合することにより構築した。

３７位における部位飽和ライブラリーは、オリグヌクレオチド５’−ＴＣＧＡＣＧＣＡＧＡＡＡＣＡＴＧＴＣＣＡＡＣＣＧＴＡＡＡＧＧＴＴＡＴＡＧＣＡＡＧＣＡＣＡＴＧＡＳＮＮＧＣＡＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３３２）及び５’−ＣＮＮＳＴＣＡＴＧＴＧＣＴＴＧＣＴＡＴＡＡＣＣＴＴＴＡＣＧＧＴＴＧＧＡＣＡＴＧＴＴＴＣＴＧＣＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３３３）のアニーリング及びｐ２ＪＭａｇｋ１０３−ｌｎｋ２−ＢＢＩ−ＡｖｓｐｈのＳａｌ及びＳｐｈＩ部位への得られたカセットの結合により構築した。

６１位における部位飽和ライブラリーはオリグヌクレオチド５’−ＴＣＧＡＣＡＴＣＡＣＴＧＡＣＴＴＣＴＧＣＴＡＴＧＡＡＮＮＳＴＧＴＡＡＡＣＣＴＴＣＴＧＡＡＴＡＡＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３３４）と２つのオリグヌクレオチド５’−ＴＴＣＡＴＡＧＣＡＧＡＡＧＴＣＡＧＴＧＡＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３３５）、及び５’−ＡＧＣＴＴＴＴＡＴＴＣＡＧＡＡＧＧＴＴＴＡＣＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３３６）とのアニーリング及びｐ２ＪＭａｇｋ１０３−ｌｎｋ２−ＢＢＩ−ＡｖｓｐｈのＳａｌ及びＳｐｈＩ部位への得られたカセットの結合により構築した。

リゲート混合物をＥ．ｃｏｌｉＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を型質転換するために用いた。９６個の形質転換体を選択して、ＤＮＡ配列決定により、各クローン中存在するアミノ酸置換を決定した。各一部位アミノ酸置換から単離されたプラスミドをその後バチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の形質転換に用いた。

部位指定変異誘発によるアミノ酸置換の生成
選択された部位のおけるアミノ酸置換を好適な制限部位を用いてｐ２ＪＭａｇｋ１０３−ｌｎｋ２−ＢＢＩ−ＡＶｓｐｈベクターのオリグヌクレオチド又はオリグヌクレオチドカセットに結合して構築した。置換、オリグヌクレオチド配列、及び制限部位を表２に示す。

個々のアミノ酸置換の二次スクリーニンング：マイクロタイタープレートにおける４つ組試験
各選択された部位について、個々のアミノ酸置換に対応してコロニーを選択した。５ｐｐｍクロラムフェニコールを含む５ｍｌのＬｕｒｉａブロス中で、ＢＢＩ−ＷＴ、ＢＢＩｔ−ＡＶ及びＢＢＩｔ−ＡＶ−Ｆ５０Ｔを対照として一緒に、これらのコロニーを育成した。各培地の１５０マイクロタイターアリコートを９６ウェルマイクロタイタープレートに配列させて、４ウェルを各アミノ酸置換及び各対照に用いた。配列させたプレート中で育成した各培地をその後ピンレプリケーターを用いて１ウェル当り５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む１５０μｌのＭＢＤ培地を含む２つ組みのフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＳＧＶ２２１０）への接種に用いた。このプレート中の培地を２−メルカプトエタノールの存在下及び含む存在下で育成し、前述のように解析した。ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ｆ５０Ｔは２−メルカプトエタノール等の還元剤で活性する前に未修飾ＢＢＩｔ−ＡＶ親株の初期ＢＢＩｔ−ＡＶ：ＢＣＥ活性比に匹敵する活性を有するが、還元後は未修飾ＢＢＩｔ−ＡＶよりも３倍以上のＢＢＩｔ−ＡＶ：ＢＣＥ活性比を有すると同定された修飾ＢＢＩｔ−ＡＶである。

各部位について、ＢＢＩ：ＢＣＥ活性比を各ウェルについて決定して、４つ組み測定の平均値を計算した。個々のアミノ酸置換についての活性比を未修飾親ＢＢＩｔ−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７），野生型ＢＢＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）、及びＢＢＩｔ−ＡＶ−Ｆ５０Ｔと称する修飾ＢＢＩｔ−ＡＶと比較した。

図１１Ａ及び１１Ｂは５０及び３７位におけるそれぞれの置換についてｓＢＢＩについて決定されたものに対する２−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）の存在下において決定されたＢＢＩ：ＢＣＥ比の４つ組み測定の平均値を示す。

全体的に、このデータは前駆体ＢＢＩｔ−ＡＶに等しいか又は大きいトリプシン抑制活性を有するＢＢＩｔ−ＡＶとなる親ＢＢＩｔ−ＡＶ分子の６６個の位置／部位の１６位においてなされたアミノ酸の一部位置換を示す（表３にデータをまとめる）。この一部位置換の全てについて、Ｆ５０Ｒは最もよいＢＢＩｔ−ＡＶ：ＢＣＥ活性比となり、一方５０位におけるいくつかの置換は前駆体未修飾ＢＢＩｔ−ＡＶ及び野生型トリプシンインヒビターよりも４倍より大きいＢＢＩｔ−ＡＶ：ＢＣＥ活性比を有する修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶを生成した（図１１Ａ及びＢ）。

これらのデータはＢＢＩ−ＡＶにおける一部位置換がＢＢＩ−ＡＶの活性に有意に効果的であることを示す。

実施例１１
改善された精製生産量を有する修飾変異体の選択
この実施例において、開示された方法をトリプシン抑制活性を有し、対応する未修飾前駆体ＢＢＩｔ−ＡＶよりも大きな生産量で生産される、アミノ酸置換を含む修飾ＢＢＩｔ−ＡＶを同定するために用いる。

４つ組みプレートスクリーニングにおいてより大きなＢＢＩｔ−ＡＶ：ＢＣＥ活性を有することに基づいて選択された修飾ＢＢＩ−ＡＶをＢＣＥ：ＢＢＩｔ−ＡＶ融合タンパク質からＢＢＩｔ−ＡＶを切断する精製工程の間に用いる酸／熱処理に類似するように設計された振とうフラスコにおいて更に試験した。従って、未修飾ＢＢＩｔ−ＡＶよりも大きなＢＢＩ：ＢＣＥ活性を有し、酸／熱処理された修飾ＢＢＩｔ−ＡＶを未修飾前駆体ＢＢＩｔ−ＡＶよりも大量に生産することができる修飾ＢＢＩｔ−ＡＶとした。

還元剤、例えば、２−メルカプトエタノール等での活性化のあと、より高いＢＢＩｔ−ＡＶ：ＢＣＥ活性比は、所与のアミノ酸置換が少なくとも正しく折り畳まれたトリプシン抑制ループを有する分子のフラクションが有意に高いことを示している。しかしながら、類似のＢＢＩｔＡＶ：ＢＣＥ活性比を有する２つの異なるアミノ酸置換が、精製後に幾分異なる総生産性となった。例えば、Ｖ５２Ｌ及びＭ２７Ａは同じ活性レベルであるが、Ｍ２７Ａは約４０％酸／熱処理後に好適な生産性を示した。従って、「好適な活性体」として一次スクリーニングで選択された変異体を更により良い予測精製生産性を研究するための第二の基準により評価した。

振とうフラスコスクリーニング：精製生産性の試験
発現を高めるために、選択コロニーの遺伝子コピーを、成長速度がクロラムフェニコールを含まないＬｕｒｉａアガープレート上での成長速度に同じにくらいになるまで、２５μｇ／ｍｌクロラクフェニコールを含むＬｕｒｉａアガープレート今日で連続的に振とうしてコロニーを増幅させた。選択された変異体及びコロニーの培地を１５ｍｌのチューブで１０時間まで、２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬｕｒｉａブロス３ｍｌ中で育成させた。これらの培地（３０μＬ）を２５０ｍｌのバッフルド振とうフラスコ中の３０ｍｌＭＢＤ培地に接種して。３７℃、２２５ｒｐｍで６０時間まで育成した。

最も良い生産性を示した変異体の選択について、培養ブロスを以下のように処理した。このブロスを０．２５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ９．３）２０ｍｌと混合し、ＮａＯＨでｐＨを９．０に調整した。その後、２−メルカプトエタノールを希釈した培地に添加して、最終濃度を２ｍＭにして、ゆるやかに振とうしながら室温で一晩インキュベーションした。ＢＢＩｔ−ＡＶ部分をその後融合タンパク質から酸／熱処理にとり切断した。この処理は第一に活性化されたブロスのｐＨをｐＨ１．９乃至２．０に硫酸で調整し、振とうしながら６０℃で１６時間インキュベートして達せいすることができる。ＢＢＩｔ−ＡＶ融合タンパク質及びＢＣＥ触媒ドメインメインはｐＨ２では可溶化しないが、遊離ＢＢＩ種は可溶化する。切断反応の後、不溶性物質を遠心分離（５分、３，０００ｒｐｍ）で除去し、上清を前述のようにトリプシン抑制活性を解析した。このＢＢＩ活性は開始物質についても決定し、活性跡のサンプルについても決定した。開始物質のＢＣＥ活性は前述のように決定した。ＢＢＩｔ−ＡＶ：ＢＣＥ活性比をその後各工程ごとに計算した。最も高収率で生成され酸／熱処理された修飾ＢＢＩｔ−ＡＶは更なる試験のために選択された。

酸／熱処理の後に有意に改善されたＢＢＩｔ−ＡＶ生産性を示したアミノ酸置換位置は１３、２５、２７、２９、３１、４０、５０、及び５２であった。酸／熱処理後に改善された生産性を示した他の置換はＤ１Ｃ（活性化しない場合）、Ｓ４Ｖ、Ｓ５Ｐ、Ｑ１１Ｇ、Ｓ３８Ｎ、及びＳ６５Ｅであった。プライマーの予期せぬ複成により生成された追加的な変異体（４位における部位飽和ライブラリーの生成に用いたＱｕｉｋＣｈａｎｇｅの反応の間）も酸／熱処理後により高いＢＢＩｔ−ＡＶ活性を有していた。この変異体において、アミノ酸配列、ＤＤＥＰＳＫＰＣＣＤＰＤＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３８９）（４Ｄ１３挿入と呼ぶ）をリンカーとＢＢＩｔ−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７）のＮ末端との間に挿入してＳＥＱＩＤＮＯ：３９１におけるリンカーに融合した修飾ＢＢＩｔ−ＡＶを生成した。

リンカーをイタリック体で示し、挿入を小文字で示し、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７に対応するＢＢＩｔ−ＡＶを太字で示した。４Ｄ１３修飾ＢＢＩｔ−ＡＶは：ＤＤＥＰＳＫＰＣＣＤＰＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＡＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＳＤＭＲＬＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＡＣＹＮＬＹＧＷＴＣＦＣＶＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３９０）。

ＳＥＱＩＤＮＯ：３９の４Ｄ１３−ＢＢＩｔ−ＡＶをコードしている合成遺伝子はＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＧＡＡＣＣＧＡＧＣＡＡＡＣＣＴＴＧＣＴＧＴＧＡＴＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＡＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣＴＣＴＡＡＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＧＡＴＣＡＡＴＧＣＡＴＴＴＧＴＡＣＧＡＡＡＴＣＡＡＡＴＣＣＴＣＣＡＣＡＧＴＧＴＣＧＧＴＧＴＴＣＣＧＡＴＡＴＧＣＧＴＣＣＧＡＡＴＴＣＣＴＧＴＣＡＴＡＧＴＧＣＣＴＧＣＡＡＡＡＧＣＴＧＣＡＡＧＴＧＴＴＡＴＡＡＣＣＴＧＴＡＣＧＧＧＴＧＧＡＣＣＴＧＴＡＣＡＴＧＣＧＣＣＧＡＣＡＴＣＡＣＧＧＡＣＴＴＣＴＧＣＴＡＴＧＡＡＣＣＡＴＧＴＡＡＡＣＣＡＡＧＣＧＡＧＴＡＡＡＡＧＣＴＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３９４）。

実施例１２
変異の組み合わせ
この実施例において、平板培養スクリーニング又は振とうフラスコスクリーニングにおいて改善されたＢＢＩ：ＢＣＥ活性比を有するＢＢＩｔ−ＡＶとなる一部位アミノ酸置換を組み合わせて一部位アミノ酸置換を有する修飾ＢＢＩｔ−ＡＶよりも多いなＢＢＩｔ−ＡＶ：ＢＣＥ活性比及び／又は生産性を有する修飾ＢＢＩｔ−ＡＶを生成した。

前述の実施例９及び１０で説明した一次二次スクリーニングに続いて、Ａ１３Ｉ、Ｆ５０Ｔ及びＶ５２Ａのアミノ酸置換をそれぞれ含む修飾ＢＢＩｔ−ＡＶを、対照に対して改善されたＢＢＩ：ＢＣＥ活性比を有するものとして同定した。これたの３つの置換の最も好適な組み合わせを選択するためにライブラリーを構築した。このライブラリーは反応混合物中以下のプライマーを等モル濃度用いる前述のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）変異誘発プロトコルにより行った。プライマー５’−ＣＴＧＴＴＧＣＧＡＴＣＡＡＴＧＣＡＴＴＴＧＴＡＣＧＡＡＡＴＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３９５）を用いてＡ１３１置換を生成した。プライマー５’−ＣＴＧＴＡＣＧＧＧＴＧＧＡＣＣＴＧＴＡＣＡＴＧＣＧＹＣＧＡＣＡＴＣＡＣＧＧＡＣＴＴＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３９６）を用いてＦ５０Ｔ及びＦ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ置換を生成した。プライマー５’−ＧＡＣＣＴＧＴＴＴＴＴＧＣＧＹＣＧＡＣＡＴＣＡＣＧＧＡＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３９７）を用いて反応混合物中のＶ５２Ａ置換を生成した。前述のように、マイクロタイタープレートにおいてコロニーを選択しスクリーニングした。

Ｆ５０Ｔ及びＶ５２Ａ置換を含む修飾二部位修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶ（ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ；ＳＥＱＩＤＮＯ：５９５）を得た。ポリヌクレオチド配列はＳＥＱＩＤＮＯ：３９８である：
ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ
ＧＧＡＴＣＣＡＧＡＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣＴＣＴＡＡＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＧＡＴＣＡＡＴＧＣＧＣＡＴＧＴＡＣＧＡＡＡＴＣＡＡＡＴＣＣＴＣＣＡＣＡＧＴＧＴＣＧＧＴＧＴＴＣＣＧＡＴＡＴＧＣＧＴＣＴＧＡＡＴＴＣＣＴＧＴＣＡＴＡＧＴＧＣＣＴＧＣＡＡＡＡＧＣＴＧＣＧＣＡＴＧＴＴＡＴＡＡＣＣＴＧＴＡＣＧＧＧＴＧＧＡＣＣＴＧＴＡＣＡＴＧＣＧＣＣＧＡＣＡＴＣＡＣＧＧＡＣＴＴＣＴＧＣＴＡＴＧＡＡＣＣＡＴＧＴＡＡＡＣＣＡＡＧＣＧＡＧＴＡＡＡＡＧＣＴＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３９８）

ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＡＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＳＤＭＲＬＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＡＣＹＮＬＹＧＷＴＣＴＣＡＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５９５）。

３つ、４つ、及び５つのアミノ酸置換を含む修飾ＢＢＩｔ−ＡＶの生成
前述の実施例９及び１０に記載のスクリーニングにおいて同定されたＡ１３Ｉ、Ｓ２５Ｌ、Ｌ２９Ｐ及びＡ４０Ｋ生成可能な置換の組み合わせをＢＢＩｔ−ＡＶ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ二部位変異体中に作成した。これらの置換はｐ２ＪＭａｇｋ１０３ｌｎｋ２ＢＢＩｔ−ＡＶベクターのＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位へクローンした合成遺伝子を用いて組み合わせた。これらの置換の組み合わせを含む修飾ＢＢＩｔ−ＡＶの対応するアミノ酸配列をコードしているポリヌクレオチド配列を以下に示す。

６つ及び７つのアミノ酸置換を含む修飾ＢＢＩｔ−ＡＶの生成
ＳＥＱＩＤＮＯ：４０４のポリヌクレオチドによりコードされる５部位変異体（ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ）中に４Ｄ１３挿入、一部位アミノ酸置換Ｄ１Ｃ、Ｓ４Ｖ、Ｓ５Ｐ、Ｑ１１Ｇ、Ｉ１３Ｌ、Ｓ２５Ｒ、Ｍ２７Ｒ、Ｐ２９Ｋ、Ｓ３１Ａ、Ｓ３１Ｒ、Ｓ３８Ｎ、Ｔ５０Ｋ、Ａ５２Ｔ、Ｓ６５Ｅ、及びＳ２５Ｒ−Ｓ３１Ｒ、及びＳ２５Ｒ−Ｓ３１の２つのアミノ酸置換を含む変異体を生成した。

以下のオリゴヌクレオチドを用いてＢａｍＨＩ及びＳａｃＩ制限部位を有するオリグヌクレオチドカセットで、ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４０４）の発現のために４Ｄ１３ペプチドをｐ２ＪＭ１０３ベースベクターに挿入した：
５’−ＧＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＧＡＡＣＣＧＡＧＣＡＡＡＣＣＴＴＧＣＴＧＴＧＡＴＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＡＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３９２）及び５’−ＣＴＣＡＴＣＧＴＣＡＧＧＧＴＣＴＧＧＡＴＣＡＣＡＧＣＡＡＧＧＴＴＴＧＣＴＣＧＧＴＴＣＧＴＣＡＴＣＴＧ
（ＳＥＱＩＤＮＯ：３９３）

ＢＢＩｔ−ＡＶ−４Ｄ１３挿入−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａのアミノ酸配列は：
ＤＰＤＤＥＰＳＫＰＣＣＤＰＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＳＤＭＲＰＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＫＣＹＮＬＹＧＷＴＣＴＣＡＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４１３）

他の変異体はｐ２ＪＭ１０３−ｌｎｋ２のＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位に合成遺伝子をクローニングして生成した。各合成遺伝子のポリヌクレオチド配列及び得られた修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶの修飾アミノ酸配列を表４に示す。

修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶのＢＢＩ：ＢＣＥ比は前述のように決定され、各修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶの生産性を計算した。修飾ＢＢＩｔ−ＡＶｓＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｒ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ｒ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６１８）、ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｒ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ａ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６１７）、ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｒ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６１６）、ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ｒ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６２２）は、５部位変異体ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６０１）よりも好適な生産性を示した。一方、ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｋ−Ｖ５２Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６２４）、ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｌ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６１５）及びＢＢＩｔ−ＡＶ−４Ｄ１３挿入−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４１３）はＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６０１）よりも好適な生産性を示した。修飾ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ−Ｓ６５Ｅ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６２６）、及びＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３８Ｎ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６２３）はＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２（ＳＥＱＩＤＮＯ：６２４）、ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｍ２７Ｒ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６１９）、ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ａ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６２１）、及びＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６２５）と同程度か幾分少ない生産性を示した。一方、ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ｓ４Ｖ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６１２）、ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ｑ１１Ｇ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６１４）、ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｋ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６２０）、及びＢＢＩｔ−ＡＶ−Ｓ５Ｐ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６１１）は全て酸／熱処理の後ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６０１）より有意に低い生産性を示した。活性化を行わないＢＢＩｔ−ＡＶ−Ｄ１Ｃ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６１１）の生産性はＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６０１）よりも大いに低かった。しかしながら、活性化しない場合の酸／熱処理後のＢＢＩｔ−ＡＶ−Ｄ１Ｃ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６１１）の生産性は活性化したＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６０１）の２倍より高かったが、活性化しないＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６０１）と同程度であった。従って、活性化しないで高い生産性を有する置換は存在しなかった。

８つのアミノ酸置換を含む修飾ＢＢＩｔ−ＡＶ（八部位変異体）の生成
５部位修飾ＢＢＩ−ＡＶの試験い続いて、８つの置換部位を含む追加的に修飾ＢＢＩ（８部位変異体）を生成した。８部位変異体の活性及び精製生産性を前述のように決定した。８部位変異体ＢＢＩｔ−ＡＶの構築は表５に示す合成遺伝子を用いて前述のように行った。

振とうフラスコスクリーニングで選択された最も好適な８部位変異体をかならず前述のように、しかし以下の変更を加えて精製工程において試験した。１）育成の後、培地をＣＨＥＳ緩衝液の代わりにグリシン緩衝液（１２５ｍＭ最終濃度及びｐＨを９．０に調整）を用いた。２）サンプルを２ｍＭ２−メルカプトエタノールのみで活性化した（硫酸ナトリウムを用いない）。３）酸で沈殿する融合タンパク質を１２５ｍＮグリシン１００ｍｌに懸濁させた（４０ｍＭグリシン３５０ｍｌのかわりに）。４）酸／熱処理後に収集されたペレットを１０ｍｌの水で洗浄し、ろ過した。即ち「洗浄ペレット」ろ過物をもとのろ過物と組み合わせた。最終的なろ過物を収集して、前述のようにＧｌｕ−ＢＬで処理した。

結果は、８部位変異ＢＢＩｔ−ＡＶ分子ＱＱ８（ＳＥＱＩＤＮＯ：６２８）及びＫＴ８（ＳＥＱＩＤＮＯ：６２７）が５部位変異ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ変異体（ＳＥＱＩＤＮＯ：６０１）よりも大きな精製生産性を示した。修飾８部位変異体ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｋ−Ｍ２７Ａ−Ｌ２９Ｒ−Ｓ３１Ａ−Ａ４０Ｈ−Ｆ５０Ｒ−Ｖ５２Ｌ（ＲＬ８；ＳＥＱＩＤＮＯ：６３０）、ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｋ−Ｍ２７Ａ−Ｌ２９Ｒ−Ｓ３１Ｅ−Ａ４０Ｋ−Ｆ５０Ｑ−Ｖ５２Ｑ（ＱＱ８；ＳＥＱＩＤＮＯ：６２８）及びＢＢＩｔ−ＡＶ−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｒ−Ｍ２７Ａ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ａ−Ａ４０Ｈ−Ｆ５０Ｋ−Ｖ５２Ｔ（ＫＴ８；ＳＥＱＩＤＮＯ：６２７）は野生型ｓＢＢＩ分子／タンパク質よりも好適な生産性を示した（図１３）。

実施例１３
ＦＧＦ５又はＴＧＦβ結合ペプチドを運ぶＢＢＩ骨格の改善された生産
この実施例において、改善されたトリプシン抑制活性及び／又は精製生産量を有する修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶとなる同じアミノ酸置換をキモトリプシンループをＦＧＦ−５μＴＧＦβ１結合ペプチドのいずれかで置換して変異ＢＢＩ骨格の改善されたトリプシン抑制活性及び／又は精製生産性について試験した。

変異体及び修飾ＢＢＩ−ＦＧＦ−５タンパク質の精製
Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ｆ５０Ｔ−Ｖ５２Ａ（全て４０位で位置合わせ）の置換の組み合わせ、及びキモトリプシンループ中に置換したＦＧＦ−５結合ペプチドＭＭ００７：ＲＴＱＰＹＰＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６７０）又はＦＧＦ−５結合ペプチドＦＧＦｐｓ２：ＴＷＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６７１）のいずれかを含む修飾変異ＢＢＩｔ−ＦＧＦ−５プロテアーゼインヒビターをベクターｐ２ＪＭａｇｋ１０３−ｌｎｋ２−ＢＢＩｔ−ＡＶのＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位へ合成遺伝子を結合することにより構築した。得られた修飾変異ＭＭ００７−Ｑ−ＢＢＩｔ−ＦＧＦ−５（ＳＥＱＩＤＮＯ：４３２；ＳＥＱＩＤＮＯ：４３３）、及び修飾変異ＦＧＦｐｓ２−Ｑ−ＢＢＩｔ−ＦＧＦ−５（ＳＥＱＩＤＮＯ：４３４ＳＥＱＩＤＮＯ：４３５）をコードする合成遺伝子のアミノ酸配列及びＤＮＡ配列を以下に示す：
ＭＭ００７−Ｑ−ＢＢＩｔ−ＦＧＦ−５合成遺伝子
ＧＧＡＴＣＣＡＧＡＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣＴＣＴＡＡＡＣＣＴＴＧＴＴＧＣＧＡＴＣＡＡＴＧＣＡＴＴＴＧＴＡＣＴＡＡＡＴＣＡＡＡＴＣＣＴＣＣＡＣＡＡＴＧＴＣＧＴＴＧＴＴＣＴＧＡＴＡＴＧＣＧＴＣＣＴＡＡＴＡＧＣＴＧＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＴＧＣＡＡＡＴＣＡＴＧＴＧＣＴＴＧＣＣＧＴＡＣＴＣＡＡＣＣＡＴＡＣＣＣＴＣＴＴＴＧＴＡＣＡＴＧＣＧＣＡＧＡＣＡＴＣＡＣＴＧＡＣＴＴＣＴＧＣＴＡＴＧＡＡＣＣＡＴＧＴＡＡＡＣＣＡＴＣＴＧＡＡＴＡＡＡＡＧＣＴＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４３３）

ＭＭ００７−Ｑ−ＢＢＩｔ−ＦＧＦ−５タンパク質
ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＳＤＭＲＰＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＡＣＲＴＱＰＹＰＬＣＴＣＡＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４３２）

ＦＧＦｐｓ２−Ｑ−ＢＢＩｔ−ＦＧＦ−５
ＧＧＡＴＣＣＡＧＡＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣＴＣＴＡＡＡＣＣＴＴＧＴＴＧＣＧＡＴＣＡＡＴＧＣＡＴＴＴＧＴＡＣＴＡＡＡＴＣＡＡＡＴＣＣＴＣＣＡＣＡＡＴＧＴＣＧＴＴＧＴＴＣＴＧＡＴＡＴＧＣＧＴＣＣＴＡＡＴＡＧＣＴＧＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＴＧＣＡＡＡＴＣＡＴＧＴＧＣＴＴＧＣＡＣＴＴＧＧＡＴＴＧＡＴＴＣＡＡＣＡＣＣＡＴＧＴＡＣＡＴＧＣＧＣＡＧＡＣＡＴＣＡＣＴＧＡＣＴＴＣＴＧＣＴＡＴＧＡＡＣＣＡＴＧＴＡＡＡＣＣＡＴＣＴＧＡＡＴＡＡＡＡＧＣＴＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４３５）

ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＳＤＭＲＰＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＡＣＴＷＩＤＳＴＰＣＴＣＡＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４３４）

変異体及び修飾ＢＢＩ−ＴＧＦβタンパク質の精製
ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７のＢＢＩｔ−ＡＶのキモトリプシンループを、ＴＧＦβ１結合ペプチドＰＥＮ３：ＣＬＣＰＥＮＩＮＶＬＰＣＮ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４３６）、ＴＧＦβ１結合ペプチドＭＭ０２１Ｗ：ＣＩＣＫＨＮＶＤＷＬＣＦ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４３７）、又はＴＧＦβ１結合ペプチドＷＴＱ：ＣＩＣＷＴＱＨＩＨＮＣＦ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４３８）に置換して、以下のように実施例２において説明した変異ＢＢＰＩを生成した。

オリグヌクレオチドペアを用いてカセットを作成し、ＴＧＦβ１結合ペプチド、ＰＥＮ３、ＭＭ０２１Ｗ又はＷＴＱでｐ２ＪＭ１０３−ｌｎｋ２−２ＢＢＩ−ＦＧＦｈｌ発現ベクターによりコードされるキモトリプシン反応部位ループ中のＦＧＦｈｌ結合ペプチドを置換した。ｐ２ＪＭ１０３−ｌｎｋ２−２ＢＢＩ−ＦＧＦｈｌをプライマー（ＳＥＱＩＤＮＯ：９１及びＳＥＱＩＤＮＯ：９２）と実施例２で説明したＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）法を用いて構築した。ＴＧＦβ結合カセットをベクターｐ２ＪＭ１０３ｌｎｋ２−２ＢＢＩ−ＦＧＦｈｌ中のＳｐｈＩ及びＳａｌＩ反応部位へ結合して、変異ＢＢＩ分子ＰＥＮ３−ＢＢＩｔ−ＴＧＦβ、ＭＭ０２１Ｗ−ＢＢＩｔ−ＴＧＦβ、及びＷＴＱ−ＢＢＩｔ−ＴＧＦβをそれぞれ構築した。カセットの構築に用いたオリグヌクレオチドのＤＮＡ配列を以下に示す：
ＰＥＮ３（２^ｎｄループ）
ＣＡＡＡＡＧＣＴＧＴＣＴＴＴＧＴＣＣＴＧＡＡＡＡＴＡＴＴＡＡＣＧＴＴＣＴＴＣＣＴＴＧＴＡＡＣＴＧＣＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４３９）
及び
ＴＣＧＡＣＧＣＡＧＴＴＡＣＡＡＧＧＡＡＧＡＡＣＧＴＴＡＡＴＡＴＴＴＴＣＡＧＧＡＣＡＡＡＧＡＣＡＧＣＴＴＴＴＧＣＡＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４４０）

ＭＭ０２１Ｗ（２^ｎｄループ）
ＣＡＡＡＴＣＡＴＧＣＡＴＴＴＧＴＡＡＡＣＡＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＴＧＧＴＴＡＴＧＴＴＴＴＴＧＣＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２９）
及び
ＴＣＧＡＣＧＣＡＡＡＡＡＣＡＴＡＡＣＣＡＡＴＣＴＡＣＧＴＴＧＴＧＴＴＴＡＣＡＡＡＴＧＣＡＴＧＡＴＴＴＧＣＡＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３０）

ＷＴＱ（２^ｎｄループ）
ＣＡＡＡＴＣＡＴＧＣＡＴＴＴＧＴＴＧＧＡＣＡＣＡＡＣＡＴＡＴＣＣＡＣＡＡＣＴＧＴＴＴＴＴＧＣＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４４１）
及び
ＴＣＧＡＣＧＣＡＡＡＡＡＣＡＧＴＴＧＴＧＧＡＴＡＴＧＴＴＧＴＧＴＣＣＡＡＣＡＡＡＴＧＣＡＴＧＡＴＴＴＧＣＡＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４４２）

更に、Ａ１３Ｉ−Ｌ２９Ｐ−Ｖ５２Ａの置換組合せ及びキモトリプシンループの代わりにＴＧＦβ１結合ペプチドＰＥＮ３−Ｑ：ＣＰＥＮＩＮＶＬＰＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６７２）、ＭＭ０２１Ｗ−Ｑ：ＣＫＨＮＶＤＷＬＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６７３）又はＷＴＱ−Ｑ：ＣＷＴＱＨＩＨＮＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６７４）を含むを含む修飾変異ＢＢＰＩ−ＴＧＦβ１変異体（全て４０位にアラニンを含み５０位にスレオニンを含む）はベクターｐ２ＪＭａｇｋ１０３−ｌｎｋ２−ＢＢＩｔ−ＡＶのＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位へ合成遺伝子を結合することにより構築された。得られた修飾変異ＰＥＮ３−Ｑ−ＢＢＩｔ−ＴＧＦβ１（ＳＥＱＩＤＮＯ：４４３；ＳＥＱＩＤＮＯ：４４４）、修飾変異ＭＭ０２１Ｗ−ＢＢＩ−ＴＧＦβ１（ＳＥＱＩＤＮＯ：４４５；ＳＥＱＩＤＮＯ：４４６）、及び修飾変異ＷＴＱ−ＢＢＩ−ＴＧＦβ１（ＳＥＱＩＤＮＯ：４４７；ＳＥＱＩＤＮＯ：４４８）をコードしている合成遺伝子のアミノ酸配列及びＤＮＡ配列を以下に示す：
ＰＥＮ３−Ｑ−ＢＢＩｔ−ＴＧＦβ１（ＳＥＱＩＤＮＯ：４４３）
ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＳＤＭＲＰＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＡＣＰＥＮＩＮＶＬＰＣＴＣＡＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ

ＰＥＮ３−Ｑ−ＢＢＩｔ−ＴＧＦβ１（ＳＥＱＩＤＮＯ：４４４）
ＧＧＡＴＣＣＡＧＡＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣＴＣＴＡＡＡＣＣＴＴＧＴＴＧＣＧＡＴＣＡＡＴＧＣＡＴＴＴＧＴＡＣＴＡＡＡＴＣＡＡＡＴＣＣＴＣＣＡＣＡＡＴＧＴＣＧＴＴＧＴＴＣＴＧＡＴＡＴＧＣＧＴＣＣＴＡＡＴＡＧＣＴＧＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＴＧＣＡＡＡＴＣＡＴＧＴＧＣＴＴＧＣＣＣＡＧＡＡＡＡＣＡＴＣＡＡＣＧＴＴＣＴＴＣＣＴＴＧＴＡＣＡＴＧＣＧＣＡＧＡＣＡＴＣＡＣＴＧＡＣＴＴＣＴＧＣＴＡＴＧＡＡＣＣＡＴＧＴＡＡＡＣＣＡＴＣＴＧＡＡＴＡＡＡＡＧＣＴＴ

ＭＭ０２１Ｗ−Ｑ−ＢＢＩｔ−ＴＧＦβ１（ＳＥＱＩＤＮＯ：４４５）
ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＳＤＭＲＰＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＡＣＫＨＮＶＤＷＬＣＴＣＡＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ

ＭＭ０２１Ｗ−Ｑ−ＢＢＩｔ−ＴＧＦβ１（ＳＥＱＩＤＮＯ：４４６）
ＧＧＡＴＣＣＡＧＡＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣＴＣＴＡＡＡＣＣＴＴＧＴＴＧＣＧＡＴＣＡＡＴＧＣＡＴＴＴＧＴＡＣＴＡＡＡＴＣＡＡＡＴＣＣＴＣＣＡＣＡＡＴＧＴＣＧＴＴＧＴＴＣＴＧＡＴＡＴＧＣＧＴＣＣＴＡＡＴＡＧＣＴＧＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＴＧＣＡＡＡＴＣＡＴＧＴＧＣＴＴＧＣＡＡＡＣＡＴＡＡＣＧＴＴＧＡＴＴＧＧＣＴＴＴＧＴＡＣＡＴＧＣＧＣＡＧＡＣＡＴＣＡＣＴＧＡＣＴＴＣＴＧＣＴＡＴＧＡＡＣＣＡＴＧＴＡＡＡＣＣＡＴＣＴＧＡＡＴＡＡＡＡＧＣＴＴ

ＷＴＱ−Ｑ−ＢＢＩｔ−ＴＧＦβ１（ＳＥＱＩＤＮＯ：４４７）
ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＳＤＭＲＰＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＡＣＫＨＮＶＤＷＬＣＴＣＡＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ

ＷＴＱ−Ｑ−ＢＢＩｔ−ＴＧＦβ１（ＳＥＱＩＤＮＯ：４４８）
ＧＧＡＴＣＣＡＧＡＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣＴＣＴＡＡＡＣＣＴＴＧＴＴＧＣＧＡＴＣＡＡＴＧＣＡＴＴＴＧＴＡＣＴＡＡＡＴＣＡＡＡＴＣＣＴＣＣＡＣＡＡＴＧＴＣＧＴＴＧＴＴＣＴＧＡＴＡＴＧＣＧＴＣＣＴＡＡＴＡＧＣＴＧＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＴＧＣＡＡＡＴＣＡＴＧＴＧＣＴＴＧＣＴＧＧＡＣＡＣＡＡＣＡＴＡＴＣＣＡＣＡＡＣＴＧＴＡＣＡＴＧＣＧＣＡＧＡＣＡＴＣＡＣＴＧＡＣＴＴＣＴＧＣＴＡＴＧＡＡＣＣＡＴＧＴＡＡＡＣＣＡＴＣＴＧＡＡＴＡＡＡＡＧＣＴＴ

ＦＧＦ−５又はＴＧＦβ結合ペプチドを含む変異体及び修飾変異ＢＢＩｓを含む１０個のベクターを用いてバチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＧ６００６宿主細胞を構築された。この形質転換体を育成し、宿主細胞びより生成された遺伝的に修飾ＢＢＩを前述のようにトリプシン抑制活性及び生産性について試験した。

図１４は育成後、２―メルカプトエタノールでの活性後、及び／又は酸熱処理後に測定された、未修飾変異親ＭＭ００７−ＰＴ−ＢＢＩｔ−ＦＧＦ−５（ＳＥＱＩＤＮＯ：６７８）：
（ＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＡＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＳＤＭＲＬＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＡＣＲＴＱＰＹＰＬＣＦＣＶＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：６７８）、未修飾変異親ＦＧＦｐｓ２−ＰＴ−ＢＢＩｔ−ＦＧＦ５（ＳＥＱＩＤＮＯ：６７９）：
（ＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＡＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＳＤＭＲＬＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＡＣＴＷＩＤＳＴＰＣＦＣＶＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：６７９）、未修飾変異親ＰＥＮ３−ＰＴ−ＢＢＩｔ−ＴＧＦβ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６８０）：
（ＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＡＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＳＤＭＲＬＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＡＣＰＥＮＩＮＶＬＰＣＦＣＶＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：６８０）、未修飾変異親ＷＴＱ−ＰＴ−ＴＧＦβ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６８１）：
（ＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＡＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＳＤＭＲＬＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＡＣＷＴＱＨＩＨＮＣＦＣＦＣＶＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：６８１）、未修飾変異親ＭＭ００２１Ｗ−ＰＴ−ＴＧＦβ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６８２）：
（ＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＡＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＳＤＭＲＬＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＡＣＫＨＮＶＤＷＬＣＦＣＶＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：６８２）（図１４におけるＰＴ）、修飾変異ＦＧＦｐｓ２−Ｑ−ＢＢＩｔ−ＦＧＦ５（ＳＥＱＩＤＮＯ：４３４），修飾変異ＰＥＮ３−Ｑ−ＢＢＩｔ−ＴＧＦβ１（ＳＥＱＩＤＮＯ：４４３），修飾変異ＷＴＱ−Ｑ−ＢＢＩｔ−ＴＧＦβ１（ＳＥＱＩＤＮＯ：４４５）、及び修飾変異ＭＭ００２１Ｗ−Ｑ−ＢＢＩｔ−ＴＧＦβ１（ＳＥＱＩＤＮＯ：４４７）タンパク質（図１４におけるＱ）のトリプシン抑制活性を示す。

このデータはＧＦ−５又はＴＧＦβ１結合ペプチドを運ぶＢＢＩｔ骨格が存在するときアミノ酸１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ａ−５０Ｔ−５２Ａの組合せが、この結合ペプチドを運ぶ対応する親ＢＢＩ骨格と比較して、育成及び活性後のトリプシン抑制活性を改善し、酸／熱処理後の生産性を改善したことを示している。

キモトリプシンループがＦＧＦ−５結合ペプチド及びＴＧＦβ１結合ペプチド等の他の結合ペプチドで置換されたキモトリプシンループを有する同じ置換体も改善されたトリプシン抑制活性を示していることから、このデータはキモトリプシンループをＶＥＧＦ結合ペプチドで修飾した変異ＢＢＩのトリプシン抑制活性及び／又は生産性の改善を示した置換がＢＢＩ−ＡＶに特異ではないことも示された。それ故、ＢＢＩｔ−ＡＶの生産性及び／又はトリプシン抑制活性を高めるＢＢＩ骨格においてなされたこのアミノ酸置換は他の結合ペプチドを運ぶＢＢＩ骨格に一般的に利用可能である。

実施例１４
ボウマンブリックインヒビター骨格の性能
この実施例において、変異ボウマンブリックインヒビター例えば、ＢＢＩｔ−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７）を、Ｄｏｌｉｃｈｏｓｂｉｆｌｏｒｕｓ（ＢＢｄｂ、Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＡＫ９７７６５；ＳＥＱＩＤＮＯ：４４９）
ＰＳＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＡＣＴＫＳＩＰＰＱＣＲＣＴＤＶＲＬＮＳＣＨＳＡＣＳＳＣＶＣＴＦＳＩＰＡＱＣＶＣＶＤＭＫＤＦＣＹＥＰＣＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４４９）、Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ（ｓｏｙｂｅａｎ）プロテアーゼインヒビターＩＶ又はＤ−ＩＩ（ＢＢｓｂ３、Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０１０６４；ＳＥＱＩＤＮＯ：４５０）
ＤＤＥＹＳＫＰＣＣＤＬＣＭＣＴＲＳＭＰＰＱＣＳＣＥＤＩＲＬＮＳＣＨＳＤＣＫＳＣＭＣＴＲＳＱＰＧＱＣＲＣＬＤＴＮＤＦＣＹＫＰＣＫＳＲＤＤ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５０）、及びトレセアセアレンシス（Ｔｏｒｒｅｓｅａ（Ａｍｂｕｒａｎａ）ｃｅａｒｅｎｓｉｓ）（ＢＢｔｃ、Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ８３２８３；ＳＥＱＩＤＮＯ：４５１）
ＳＳＫＷＥＡＣＣＤＲＣＡＣＴＫＳＩＰＰＱＣＨＣＡＤＩＲＬＮＳＣＨＳＡＣＥＳＣＡＣＴＨＳＩＰＡＱＣＲＣＦＤＩＴＤＦＣＹＫＰＣＳＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５１）由来のボウマンブリックインヒビター配列全域にわたって保存されていない配列をＢＢＩｔ−Ａ骨格へ置換することにより試験した。

変異ボウマンブリックインヒビターをＤｏｌｉｃｈｏｓｂｉｆｌｏｒｕｓ（ＢＢｄｂ、Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＡＫ９７７６５；ＳＥＱＩＤＮＯ：４４９）由来ボウマンブリックインヒビターの第二プロテアーゼ抑制ループ、Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ（ｓｏｙｂｅａｎ）プロテアーゼインヒビターＩＶ又はＤ−ＩＩ（ＢＢｓｂ３、Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０１０６４；ＳＥＱＩＤＮＯ：４５０）由来のボウマンブリックインヒビターの第二プロテアーゼ抑制ループ、及びＶＥＧＦ結合ペプチドＣＫ３７２８１（ＡＣＹＮＬＹＧＷＴＣ；ＳＥＱＩＤＮＯ：９）を有するＴｏｒｒｅｓｅａ（Ａｍｂｕｒａｎａ）ｃｅａｒｅｎｓｉｓ（ＢＢｔｃ、Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ８３２８３；ＳＥＱＩＤＮＯ：４５１）で置換して、対応する変異ＢＢｄｂ−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５２）、ＢＢｓｂ３−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５３）、及びＢＢｔｃ−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５４）を生成した。

この配列を図１５に示すように整列させ、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７（ＢＢＩｔ−ＡＶ）のＢＢＰＩの１１、１３、１８、２３、２５、２７、３５、３７、５２、５４、及び５５位に等しい位置のアミノ酸を４つのインヒビター全体に渡り保存されてないものとして同定し、ＢＢＩｔ−ＡＶ骨格の修飾のために選択した。

ＢＢｄｂ−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５５）及びＢＢｓｂ３−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５６）をコードしている合成遺伝子をｐ２ＪＭａｇｋ１０３−ｌｎｋ２−ＢＢＩｔ−ＡＶへＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして結合させた。ＢＢｔｃ−ＡＶ遺伝子のクローニングのために、この遺伝子を初めにＢｆｒＩで消化し、オーバーハングをＴ４ＤＮＡポリメーラーゼ及びｄＮＴＰ’で埋めて、ＤＮＡを精製し、ＢａｍＨＩで消化した。このフラグメントをＨｉｎｄＩＩで消化されたｐ２ＪＭａｇｋ１０３−ｌｎｋ２−ＢＢＩｔ−ＡＶベクター、Ｔ４ＤＮＡポリメーラーゼ及びｄＮＴＰで埋められたオーバーハングに結合して、ＤＮＡを精製して、ＢａｍＨＩで消化した。このＤＮＡ配列及び変異タンパク質幾つかのＰＩの対応するアミノ酸配列を以下に示す：
ＢＢｄｂ−ＡＶ
ＧＧＡＴＣＣＴＴＣＴＧＡＧＡＧＣＴＣＴＡＡＡＣＣＡＴＧＣＴＧＴＧＡＴＣＡＡＴＧＣＧＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＴＣＴＡＴＣＣＣＴＣＣＡＣＡＡＴＧＣＣＧＴＴＧＣＡＣＴＧＡＴＧＴＴＣＧＴＣＴＴＡＡＣＴＣＡＴＧＴＣＡＣＴＣＴＧＣＡＴＧＣＡＧＣＴＣＡＴＧＣＧＣＴＴＧＴＴＡＣＡＡＣＣＴＴＴＡＣＧＧＴＴＧＧＡＣＡＴＧＣＧＴＴＴＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＧＡＡＡＧＡＴＴＴＣＴＧＣＴＡＣＧＡＡＣＣＴＴＧＴＡＡＡＴＡＡＡＡＧＣＴＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５５）

ＢＢｄｂ−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５２）
ＤＰＳＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＡＣＴＫＳＩＰＰＱＣＲＣＴＤＶＲＬＮＳＣＨＳＡＣＳＳＣＡＣＹＮＬＹＧＷＴＣＶＣＶＤＭＫＤＦＣＹＥＰＣＫ

ＢＢｓｂ３−ＡＶ
ＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＧＡＡＴＡＣＴＣＴＡＡＡＣＣＴＴＧＣＴＧＴＧＡＴＣＴＴＴＧＣＡＴＧＴＧＴＡＣＡＣＧＴＴＣＴＡＴＧＣＣＡＣＣＴＣＡＡＴＧＣＴＣＡＴＧＴＧＡＡＧＡＣＡＴＣＣＧＣＣＴＴＡＡＣＴＣＴＴＧＣＣＡＣＴＣＡＧＡＴＴＧＣＡＡＡＡＧＣＴＧＣＧＣＴＴＧＴＴＡＣＡＡＣＣＴＴＴＡＣＧＧＴＴＧＧＡＣＡＴＧＣＣＧＴＴＧＴＴＴＡＧＡＴＡＣＴＡＡＣＧＡＴＴＴＣＴＧＣＴＡＣＡＡＡＣＣＴＴＧＣＡＡＡＴＣＴＣＧＴＧＡＴＧＡＴＴＡＡＡＡＧＣＴＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５６）

ＢＢｓｂ３−ＡＶＡＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５３）
ＤＰＤＤＥＹＳＫＰＣＣＤＬＣＭＣＴＲＳＭＰＰＱＣＳＣＥＤＩＲＬＮＳＣＨＳＤＣＫＳＣＡＣＹＮＬＹＧＷＴＣＲＣＬＤＴＮＤＦＣＹＫＰＣＫＳＲＤＤ

ＢＢｔｃ−ＡＶ
ＧＧＡＴＣＣＴＴＣＴＴＣＡＡＡＡＴＧＧＧＡＡＧＣＴＴＧＣＴＧＴＧＡＴＣＧＴＴＧＣＧＣＡＴＧＣＡＣＡＡＡＡＴＣＴＡＴＣＣＣＴＣＣＡＣＡＡＴＧＣＣＡＣＴＧＣＧＣＴＧＡＴＡＴＣＣＧＴＣＴＴＡＡＣＴＣＡＴＧＣＣＡＴＴＣＴＧＣＡＴＧＣＧＡＡＡＧＣＴＧＣＧＣＴＴＧＴＴＡＣＡＡＣＣＴＴＴＡＣＧＧＴＴＧＧＡＣＡＴＧＣＣＧＴＴＧＣＴＴＣＧＡＴＡＴＣＡＣＴＧＡＴＴＴＣＴＧＴＴＡＣＡＡＡＣＣＴＴＧＣＴＣＴＧＧＣＴＡＡＡＡＧＣＴＴＡＡＡＡＧＧＡＧＡＣＣＧＴＴＡＡＴＣＴＡＡＡＡＴＣＡＴＴＡＴＴＴＧＡＧＧＣＣＣＧＡＧＣＴＴＡＡＡＧＣＴＴＡＡＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５７）

ＢＢｔｃ−ＡＶＡＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５４）
ＤＰＳＳＫＷＥＡＣＣＤＲＣＡＣＴＫＳＩＰＰＱＣＨＣＡＤＩＲＬＮＳＣＨＳＡＣＥＳＣＡＣＹＮＬＹＧＷＴＣＲＣＦＤＩＴＤＦＣＹＫＰＣＳＧ

変異インヒビター配列を含むこれらの発現ベクターをＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ宿主細胞ＢＧ６００６の形質転換に用いた。

通常、第一ジスルフィド結合（Ｃ８乃至Ｃ６２）の外側のＮ末端及びＣ末端における置換はトリプシンインヒビター活性及び／又は精製生産性にあまり影響しない。したがって、Ｃ８及びＣ６２の間の位置を研究のターゲットとした。この実験においてターゲットとされた置換を図１５に示す（太字及び下線）。

実施例８及び１０に記載のようにＢＢＩｔ−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７）における１１、１３、１８、２３、２５、２７、３５、３７、５０、５２、５４、５５、及び６０の位置における個々のアミノ酸置換体を構築した。これらの置換を実施例９及び１０に記載のようにマイクロタイタープレートにおいてスクリーニングし、結果を以下の表６にまとめた。

アミノ酸置換の効果が追加されたと過程すると、表６において追加されたデータは変異ＢＢＩｔｃ−ＡＶはＢＢＩｔ−ＡＶよりも有意に機能し、ＢＢＩｓｂ３−ＡＶはＢＢＩｔ−ＡＶよりも悪い結果となることが予測できた。更に、当業者は還元剤での活性化の観点からＢＢＩｄｂ−ＡＶはＢＢＩｔ−ＡＶよりも幾分このまし事を予測できるだろう。

これらの予測試験のために、ＢＢＩｄｂ−ＡＶ、ＢＢＩｓｂ３−ＡＶ及びＢＢＩｔｃ−ＡＶのトリプシン活性及び精製生産性を実施例１１において説明した振とうフラスコスクリーニングを用いて試験し、それらの活性を未修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶと比較した。

図１６に示されたデーターは説明したように、ＢＢＩｔｃ−ＡＶは最も高いトリプシン抑制アミノ酸配列活性を活性後に有し、ＢＢＩｄｂ−ＡＶ抑制活性もＢＢＩｔ−ＡＶインヒビターより高かったが、ＢＢＩｔｃ−ＡＶインヒビターよりは低かった。更に、予測されたように、ＢＢＩｓｂ３−ＡＶは非常に低いトリプシン抑制活性をゆうし、還元剤で活性にならなかった（図１６に示すように抑制活性が非常に低い）。更に、ＢＢＩｔｃ−ＡＶ及びＢＢＩｄｂ−ＡＶが活性化後にＢＢＩｔ−ＡＶよりも給い抑制活性を有するだけでなく、酸／熱処理後にもより高い活性を有しており、このことは改善された精製生産性を有することを示している。

それ故、この結果はＢＢＩｔ−ＡＶにおける１つのアミノ酸置換を試験したときに得られた結果が第二プロテアーゼ抑制ループを置換する結合ペプチドを有する骨格そして用いたときの他のボウマンブリックインヒビターの性能を予測することに用いることができることを示している。

実施例１５
修飾変異ＢＢＩの標的タンパク質への結合
この実施例において、変異ペプチドを修飾ボウマンブリクインヒビターへグラフトしてキモトリプシンループを置換した、変異ポリペプチドの対応する標的タンパク質へ結合する能力を試験した。

ＢＢＩへの発現ベクターの構築は実施例１に記載しており、キモトリプシンループ配列の位置にＶＥＧＦ−結合ペプチドＣＫ３７２８１（ＳＥＱＩＤＮＯ：９）、ＦＧＦ−５−結合ペプチドＭＭ００７（ＳＥＱＩＤＮＯ：４３０）又はＦＧＦ−５−結合ペプチドＦＧＦ５ｐｓ２（ＳＥＱＩＤＮＯ：４３１）を含む変異ＢＢＩのためのベクターの構築は実施例１３に記載した。各種アミノ酸置換の組み合わせを有する修飾変異ＢＢＩｔ−ＡＶをコードしている発現ベクターの構築する方法は実施例１３に記載した。

ＶｅｇＫ（ＫＹＹＬＹＷＷ；ＳＥＱＩＤＮＯ：４５８）、ＶｅｇＴ（ＴＬＷＫＳＹＷ；ＳＥＱＩＤＮＯ：４５９）及びＶｅｇＫＤ（ＫＹＤＬＹＷＷ；ＳＥＱＩＤＮＯ：４６０）という名称のＶＥＧＦ−結合ペプチドをオリゴヌクレオチドカセットをｐ２ＪＭ１０３−ｌｎｋ２−２ＢＢＩｃｋ８１のＳｐｈＩ及びＳａｌＩ部位へ結合することにより、キモトリプシン抑制ループへ導入した。修飾変異ＶＥＧＫ及びＶＥＧＴＢＢＰＩの生成に用いたオリゴヌクレオチドを以下に示す：
ＶｅｇＫ：
ＣＡＡＡＴＣＴＴＧＣＧＣＡＴＧＴＡＡＡＴＡＴＴＡＣＣＴＴＴＡＣＴＧＧＴＧＧＴＧＴＴＴＴＴＧＣＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４６１）
及び
ＴＣＧＡＣＧＣＡＡＡＡＡＣＡＣＣＡＣＣＡＧＴＡＡＡＧＧＴＡＡＴＡＴＴＴＡＣＡＴＧＣＧＣＡＡＧＡＴＴＴＧＣＡＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４６２）

ＢＢＩＴ−ＶＥＧＫ
ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＲＤＡＲＰＮＡＣＨＳＡＣＫＳＣＡＣＫＹＹＬＹＷＷＣＫＣＴＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４０）

ＶｅｇＴ：
ＣＡＡＡＴＣＴＴＧＣＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＴＴＴＧＧＡＡＡＴＣＴＴＡＣＴＧＧＴＧＴＴＴＴＴＧＣＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４６３）
及び
ＴＣＧＡＣＧＣＡＡＡＡＡＣＡＣＣＡＧＴＡＡＧＡＴＴＴＣＣＡＡＡＧＴＧＴＧＣＡＣＧＣＧＣＡＡＧＡＴＴＴＧＣＡＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４６４）

ＢＢＩｔ−ＶＥＧＴ
ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＲＤＡＲＰＮＡＣＨＳＡＣＫＳＣＡＣＴＬＷＫＳＹＷＣＫＣＴＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４１）

ＶｅｇＫＤ：
ＣＡＡＡＴＣＴＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＡＡＴＡＴＧＡＴＣＴＴＴＡＣＴＧＧＴＧＧＴＧＴＴＴＴＴＧＣＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４６５）
及び
ＴＣＧＡＣＧＣＡＡＡＡＡＣＡＣＣＡＣＣＡＧＴＡＡＡＧＡＴＣＡＴＡＴＴＴＡＣＡＧＡＴＧＣＡＡＧＡＴＴＴＧＣＡＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４６６）

ＶｅｇＫＤの称されるＶＥＧＦ−結合ペプチドを合成遺伝子（ＶｅｇＫＤ−Ｑ）をｐ２ＪＭａｇｋ１０３−ｌｎｋ２−２ＢＢＩｃｋ８１のｔｈｅＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位へ結合して変異ＢＢＩ−Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｋ−Ｌ２９Ｐ−Ｖ５２Ｋへ導入した。合成遺伝子の配列及びコードされるＢＢＰＩを以下に示す：
ＶｅｇＫＤ−Ｑ：
ＧＧＡＴＣＣＡＧＡＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣＴＣＴＡＡＡＣＣＴＴＧＴＴＧＣＧＡＴＣＡＡＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＣＡＡＡＡＴＣＡＡＡＣＣＣＴＣＣＡＣＡＡＴＧＴＣＧＴＴＧＴＡＡＡＧＡＴＡＴＧＣＧＴＣＣＴＡＡＴＡＧＣＴＧＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＴＧＣＡＡＡＴＣＡＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＡＴＧＡＣＣＴＴＴＡＣＴＧＧＴＧＧＴＧＴＴＴＣＴＧＣＡＡＡＧＡＣＡＴＣＡＣＴＧＡＣＴＴＣＴＧＣＴＡＴＧＡＡＣＣＡＴＧＴＡＡＡＣＣＴＴＣＴＧＡＡＴＡＡＡＡＧＣＴＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４６７）

ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＲＤＡＲＰＮＡＣＨＳＡＣＫＳＣＡＣＫＹＤＬＹＷＷＣＫＣＴＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４２）

ＶＥＧＦ−結合ペプチドＶ１（ＳＫＨＳＱＩＴ；ＳＥＱＩＤＮＯ：４６８）、Ｖ２（ＫＴＮＰＳＧＳ；ＳＥＱＩＤＮＯ：４６９）、Ｖ３（ＲＰＴＧＨＳＬ；ＳＥＱＩＤＮＯ：４７０）、Ｖ４（ＫＨＳＡＫＡＥ；ＳＥＱＩＤＮＯ：４７１）、Ｖ５（ＫＰＳＳＡＳＳ；ＳＥＱＩＤＮＯ：４７２）及びＶ６（ＰＶＴＫＲＶＨ；ＳＥＱＩＤＮＯ：４７３），及びＴＧＦβ―ｋ都合ペプチドＴ１（ＲＹＷＱＤＩＰ；ＳＥＱＩＤＮＯ：４７４）、Ｔ２（ＡＰＥＰＩＬＡ；ＳＥＱＩＤＮＯ：４７５）及びＴ３（ＤＭＩＭＶＳＩ；ＳＥＱＩＤＮＯ：４７６）をｐ２ＪＭａｇｋ１０３−ｌｎｋ２−２ＢＢＩｃｋ８１のＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位へ合成遺伝子を結合することによりアミノ酸置換Ａ１３Ｉ−Ｓ２５Ｒ−Ｍ２７Ａ−Ｌ２９Ｐ−Ｓ３１Ａ−Ｉ４０Ａ−Ｆ５０Ｋ−Ｖ５２Ｔを含む修飾ＢＢＩｔのキモトリプシン抑制ループへ導入した。合成遺伝子のＤＮＡ配列及び得られた修飾ＢＢＩを以下に示す：
ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ｖ１：
ＧＧＡＴＣＣＡＧＡＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣＴＣＴＡＡＡＣＣＴＴＧＴＴＧＣＧＡＴＣＡＡＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＣＡＡＡＡＴＣＡＡＡＣＣＣＴＣＣＡＣＡＡＴＧＴＣＧＴＴＧＴＡＧＡＧＡＴＧＣＴＣＧＴＣＣＴＡＡＴＧＣＡＴＧＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＴＧＣＡＡＡＴＣＡＴＧＴＧＣＴＴＧＣＡＧＣＡＡＡＣＡＣＴＣＴＣＡＡＡＴＴＡＣＴＴＧＴＡＡＡＴＧＣＡＣＡＧＡＣＡＴＣＡＣＴＧＡＣＴＴＣＴＧＣＴＡＴＧＡＡＣＣＡＴＧＴＡＡＡＣＣＴＴＣＴＧＡＡＴＡＡＡＡＧＣＴＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４７７）

ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＲＤＡＲＰＮＡＣＨＳＡＣＫＳＣＡＣＳＫＨＳＱＩＴＣＫＣＴＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９１）

ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ｖ２：
ＧＧＡＴＣＣＡＧＡＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣＴＣＴＡＡＡＣＣＴＴＧＴＴＧＣＧＡＴＣＡＡＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＣＡＡＡＡＴＣＡＡＡＣＣＣＴＣＣＡＣＡＡＴＧＴＣＧＴＴＧＴＡＧＡＧＡＴＧＣＴＣＧＴＣＣＴＡＡＴＧＣＡＴＧＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＴＧＣＡＡＡＴＣＡＴＧＴＧＣＴＴＧＣＡＡＡＡＣＡＡＡＣＣＣＡＡＧＣＧＧＴＴＣＴＴＧＴＡＡＡＴＧＣＡＣＡＧＡＣＡＴＣＡＣＴＧＡＣＴＴＣＴＧＣＴＡＴＧＡＡＣＣＡＴＧＴＡＡＡＣＣＴＴＣＴＧＡＡＴＡＡＡＡＧＣＴＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４７８）

ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＲＤＡＲＰＮＡＣＨＳＡＣＫＳＣＡＣＫＴＮＰＳＧＳＣＫＣＴＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６３２）

ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ｖ３：
ＧＧＡＴＣＣＡＧＡＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣＴＣＴＡＡＡＣＣＴＴＧＴＴＧＣＧＡＴＣＡＡＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＣＡＡＡＡＴＣＡＡＡＣＣＣＴＣＣＡＣＡＡＴＧＴＣＧＴＴＧＴＡＧＡＧＡＴＧＣＴＣＧＴＣＣＴＡＡＴＧＣＡＴＧＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＴＧＣＡＡＡＴＣＡＴＧＴＧＣＴＴＧＣＡＧＡＣＣＡＡＣＴＧＧＴＣＡＣＡＧＣＣＴＴＴＧＴＡＡＡＴＧＣＡＣＡＧＡＣＡＴＣＡＣＴＧＡＣＴＴＣＴＧＣＴＡＴＧＡＡＣＣＡＴＧＴＡＡＡＣＣＴＴＣＴＧＡＡＴＡＡＡＡＧＣＴＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４７９）

ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＲＤＡＲＰＮＡＣＨＳＡＣＫＳＣＡＣＲＰＴＧＨＳＬＣＫＣＴＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６３３）

ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ｖ４：
ＧＧＡＴＣＣＡＧＡＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣＴＣＴＡＡＡＣＣＴＴＧＴＴＧＣＧＡＴＣＡＡＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＣＡＡＡＡＴＣＡＡＡＣＣＣＴＣＣＡＣＡＡＴＧＴＣＧＴＴＧＴＡＧＡＧＡＴＧＣＴＣＧＴＣＣＴＡＡＴＧＣＡＴＧＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＴＧＣＡＡＡＴＣＡＴＧＴＧＣＴＴＧＣＡＡＡＣＡＣＡＧＣＧＣＴＡＡＡＧＣＡＧＡＡＴＧＴＡＡＡＴＧＣＡＣＡＧＡＣＡＴＣＡＣＴＧＡＣＴＴＣＴＧＣＴＡＴＧＡＡＣＣＡＴＧＴＡＡＡＣＣＴＴＣＴＧＡＡＴＡＡＡＡＧＣＴＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４８０）

ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＲＤＡＲＰＮＡＣＨＳＡＣＫＳＣＡＣＫＨＳＡＫＡＥＣＫＣＴＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６３４）

ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ｖ５：
ＧＧＡＴＣＣＡＧＡＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣＴＣＴＡＡＡＣＣＴＴＧＴＴＧＣＧＡＴＣＡＡＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＣＡＡＡＡＴＣＡＡＡＣＣＣＴＣＣＡＣＡＡＴＧＴＣＧＴＴＧＴＡＧＡＧＡＴＧＣＴＣＧＴＣＣＴＡＡＴＧＣＡＴＧＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＴＧＣＡＡＡＴＣＡＴＧＴＧＣＴＴＧＣＡＡＡＣＣＡＡＧＣＴＣＴＧＣＴＴＣＡＴＣＴＴＧＴＡＡＡＴＧＣＡＣＡＧＡＣＡＴＣＡＣＴＧＡＣＴＴＣＴＧＣＴＡＴＧＡＡＣＣＡＴＧＴＡＡＡＣＣＴＴＣＴＧＡＡＴＡＡＡＡＧＣＴＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４８１）

ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＲＤＡＲＰＮＡＣＨＳＡＣＫＳＣＡＣＫＰＳＳＡＳＳＣＫＣＴＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６３５）

ＢＢＩｔ−ＡＶ−Ｖ６：
ＧＧＡＴＣＣＡＧＡＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣＴＣＴＡＡＡＣＣＴＴＧＴＴＧＣＧＡＴＣＡＡＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＣＡＡＡＡＴＣＡＡＡＣＣＣＴＣＣＡＣＡＡＴＧＴＣＧＴＴＧＴＡＧＡＧＡＴＧＣＴＣＧＴＣＣＴＡＡＴＧＣＡＴＧＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＴＧＣＡＡＡＴＣＡＴＧＴＧＣＴＴＧＣＣＣＡＧＴＴＡＣＴＡＡＡＡＧＡＧＴＡＣＡＣＴＧＴＡＡＡＴＧＣＡＣＡＧＡＣＡＴＣＡＣＴＧＡＣＴＴＣＴＧＣＴＡＴＧＡＡＣＣＡＴＧＴＡＡＡＣＣＴＴＣＴＧＡＡＴＡＡＡＡＧＣＴＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４８２）

ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＲＤＡＲＰＮＡＣＨＳＡＣＫＳＣＡＣＰＶＴＫＲＶＨＣＫＣＴＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６３６）

ＢＢＩｔ−ＴＮＦ−Ｔ１：
ＧＧＡＴＣＣＡＧＡＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣＴＣＴＡＡＡＣＣＴＴＧＴＴＧＣＧＡＴＣＡＡＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＣＡＡＡＡＴＣＡＡＡＣＣＣＴＣＣＡＣＡＡＴＧＴＣＧＴＴＧＴＡＧＡＧＡＴＧＣＴＣＧＴＣＣＴＡＡＴＧＣＡＴＧＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＴＧＣＡＡＡＴＣＡＴＧＴＧＣＴＴＧＣＡＧＡＴＡＣＴＧＧＣＡＡＧＡＴＡＴＴＣＣＡＴＧＴＡＡＡＴＧＣＡＣＡＧＡＣＡＴＣＡＣＴＧＡＣＴＴＣＴＧＣＴＡＴＧＡＡＣＣＡＴＧＴＡＡＡＣＣＴＴＣＴＧＡＡＴＡＡＡＡＧＣＴＴ（ＳＥＱＤＩＮＯ：４８３）

ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＲＤＡＲＰＮＡＣＨＳＡＣＫＳＣＡＣＲＹＷＱＤＩＰＣＫＣＴＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６３７）

ＢＢＩｔ−ＴＮＦ−Ｔ２：
ＧＧＡＴＣＣＡＧＡＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣＴＣＴＡＡＡＣＣＴＴＧＴＴＧＣＧＡＴＣＡＡＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＣＡＡＡＡＴＣＡＡＡＣＣＣＴＣＣＡＣＡＡＴＧＴＣＧＴＴＧＴＡＧＡＧＡＴＧＣＴＣＧＴＣＣＴＡＡＴＧＣＡＴＧＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＴＧＣＡＡＡＴＣＡＴＧＴＧＣＴＴＧＣＧＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＴＡＴＴＣＴＴＧＣＴＴＧＴＡＡＡＴＧＣＡＣＡＧＡＣＡＴＣＡＣＴＧＡＣＴＴＣＴＧＣＴＡＴＧＡＡＣＣＡＴＧＴＡＡＡＣＣＴＴＣＴＧＡＡＴＡＡＡＡＧＣＴＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４８４）

ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＲＤＡＲＰＮＡＣＨＳＡＣＫＳＣＡＣＡＰＥＰＩＬＡＣＫＣＴＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６３８）

ＢＢＩｔ−ＴＮＦ−Ｔ３：
ＧＧＡＴＣＣＡＧＡＣＧＡＴＧＡＧαＡＧＣＴＣＴＡＡＡＣＣＴＴＧＴＴＧＣＧＡＴＣＡＡＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＣＡＡＡＡＴＣＡＡＡＣＣＣＴＣＣＡＣＡＡＴＧＴＣＧＴＴＧＴＡＧＡＧＡＴＧＣＴＣＧＴＣＣＴＡＡＴＧＣＡＴＧＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＴＧＣＡＡＡＴＣＡＴＧＴＧＣＴＴＧＣＧＡＴＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＴＡＧＣＡＴＣＴＧＴＡＡＡＴＧＣＡＣＡＧＡＣＡＴＣＡＣＴＧＡＣＴＴＣＴＧＣＴＡＴＧＡＡＣＣＡＴＧＴＡＡＡＣＣＴＴＣＴＧＡＡＴＡＡＡＡＧＣＴＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４８５）

ＤＰＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＩＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＲＤＡＲＰＮＡＣＨＳＡＣＫＳＣＡＣＤＭＩＭＶＳＩＣＫＣＴＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６３９）

得られたベクターをＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＢＧ６００６宿主細胞の形質転換に用いた。培養物を５００ｍｌのＭＢＤ培地で育成し、ＢＢＩ種を前述及びＶｏｇｔｅｎｔａｎｚｅｔａｌ．、２００７（ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒＰｕｒｉｆ５５：４０−５２［２００７］）に記載のように精製した。ＢｉｏＶｅｒｉｓ結合アッセイを実施例５及び取り扱い説明書に従い行った。修飾変異ＢＢＩのそれぞれの標的タンパク質への結合をＢｉｏＶｅｒｉｓ（商標）結合アッセイを用いて測定した。この結合アッセイはラベルされた競合体の存在下、不存在下で修飾変異ＢＢＩのその標的タンパク質（例えば、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ５、ＴＧＦβ及びＴＮＦα）への結合を測定する競合アッセイである。この競合体は標的タンパク質に対しするモノクローナル抗体又は標的タンパク質のラベルされた天然レセプターで標識することができる。この電子化学蛍光結合アッセイは実施例５に記載のように行った。明らかなＩＣ５０を、ＢｉｏＶｅｒｉｓシグナルを１／２にまで減らすのに必要なＢＢＩ種の濃度を決定することにより結合データから決定した。キモトリプシンループ中に標的へ都合ペプチドを含まないＢＢＩ骨格を負の対照として用いた。結果を以下の表７に示す。

このデータは異なる結合ペプチドで置換されたキモトリプシンループを有し、更に少なくとも１つのアミノ酸置換を骨格に含む修飾変異ＢＢＰＩが、具体的にそれらの標的タンパク質、少なくともＶＥＧＦに結合することを示している。同様に、キモトリプシンループが例えば、ＦＧＦ−５、ＴＧＦβ及びＴＮＦα等の他の変異体で置換されている修飾変異ＢＢＰＩも具合的にそれらの対応する標的タンパク質、即ち、ＦＧＦ、ＴＧＦ及びＴＮＦに結合する。更に、キモトリプシンループが変異ペプチド、例えば、ＶＥＧＦ変異体で置換されている他のＢＢＰＩ骨格、即ち、ＢＢｔｃ、ＢＢｓｂ３、及びＢＢｄｂも具体的にＶＥＧＦ標的タンパク質に結合することができる。

結局、こえらのデータは少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、キモトリプシンループの位置に異なる変異ペプチドを有する修飾変異ＢＢＰＩ骨格は遊離（グラフトされていない）結合ペプチドにより結合される標的タンパク質への結合能力を有していることを示した。したがって、このデータは、対応する標的タンパク質に結合することが示された異なる結合ペプチド配列は修飾ＢＢＰＩのキモトリプシン抑制ループの置換に用いることができ、同属の標的タンパク質に結合可能であることを示した。

実施例１６
ＢＢＩ中のＴ−細胞エピトープの同定
ＷＯ９９５３０３８Ａ２ａｎｄＳｔｉｃｋｌｅｒｅｔａｌ、２０００（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、２３（６）、６５４−６６０、［２０００］）に記載のようにナイーブヒトＴｚａｉｂｏｕを用いて野生型ＢＢＰＩにおけるＴさいぼうエピトープの同定をｉ−ｍｕｎｅ（商標）アッセイで行った。このアッセイに用いたペプチドは野生型ＢＢＩアミノ酸配列ＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＡＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＳＤＭＲＬＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＩＣＡＬＳＹＰＡＱＣＦＣＶＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥＤＤＫＥＮ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）に基づいている。ＢＢＩの完全長アミノ酸配列あから１５ｍｅｒペプチドをＭｉｍｏｔｏｐｅｓＵＳＷｅｓｔ（ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）．により合成した。各１５ｍｅｒペプチド配列を３つの残基以外の前及び後の１５ｍｅｒと重複するように設計した。野生型配列に対応したＴ細胞エピトープのスクリーニングに用いた２０ペプチドを以下に示す：
Ｐ１ＤＤＥＳＳＫＰＣＣＤＱＣＡＣＴ（Ｐ１；ＳＥＱＩＤＮＯ：６４９）
Ｐ２ＳＳＫＰＣＣＤＱＣＡＣＴＫＳＮ（Ｐ２；ＳＥＱＩＤＮＯ：６５０）
Ｐ３ＰＣＣＤＱＣＡＣＴＫＳＮＰＰＱ（Ｐ３；ＳＥＱＩＤＮＯ：６５１）
Ｐ４ＤＱＣＡＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣ（Ｐ４；ＳＥＱＩＤＮＯ：６５２）
Ｐ５ＡＣＴＫＳＮＰＰＱＣＲＣＳＤＭ（Ｐ５；ＳＥＱＩＤＮＯ：６５３）
Ｐ６ＫＳＮＰＰＱＣＲＣＳＤＭＲＬＮ（Ｐ６；ＳＥＱＩＤＮＯ：６５４）
Ｐ７ＰＰＱＣＲＣＳＤＭＲＬＮＳＣＨ（Ｐ７；ＳＥＱＩＤＮＯ：６５５）
Ｐ８ＣＲＣＳＤＭＲＬＮＳＣＨＳＡＣ（Ｐ８；ＳＥＱＩＤＮＯ：６５６）
Ｐ９ＳＤＭＲＬＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣ（Ｐ９；ＳＥＱＩＤＮＯ：６５７）
Ｐ１０ＲＬＮＳＣＨＳＡＣＫＳＣＩＣＡ（Ｐ１０；ＳＥＱＩＤＮＯ：６５８）
Ｐ１１ＳＣＨＳＡＣＫＳＣＩＣＡＬＳＹ（Ｐ１１；ＳＥＱＩＤＮＯ：６５９）
Ｐ１２ＳＡＣＫＳＣＩＣＡＬＳＹＰＡＱ（Ｐ１２；ＳＥＱＩＤＮＯ：６６０）
Ｐ１３ＫＳＣＩＣＡＬＳＹＰＡＱＣＦＣ（Ｐ１３；ＳＥＱＩＤＮＯ：６６１）
Ｐ１４ＩＣＡＬＳＹＰＡＱＣＦＣＶＤＩ（Ｐ１４；ＳＥＱＩＤＮＯ：６６２）
Ｐ１５ＬＳＹＰＡＱＣＦＣＶＤＩＴＤＦ（Ｐ１５；ＳＥＱＩＤＮＯ：６６３）
Ｐ１６ＰＡＱＣＦＣＶＤＩＴＤＦＣＹＥ（Ｐ１６；ＳＥＱＩＤＮＯ：６６４）
Ｐ１７ＣＦＣＶＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫ（Ｐ１７；ＳＥＱＩＤＮＯ：６６５）
Ｐ１８ＶＤＩＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥ（Ｐ１８；ＳＥＱＩＤＮＯ：６６６）
Ｐ１９ＴＤＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥＤＤＫ（Ｐ１９；ＳＥＱＩＤＮＯ：６６７）
Ｐ２０ＦＣＹＥＰＣＫＰＳＥＤＤＫＥＮ（２０；ＳＥＱＩＤＮＯ：６６８）

簡単に説明すると、ＦｉｇｕｒｅＹに示すＣＤ４＋Ｔ細胞を樹状細胞及びインタクトペプチドセットのためのペプチドと一緒に培養した。サイトカイン反応をＳｔｒｉｃｋｌｅｒｅｔａｌ、２０００に記載のように各実験において平均化してペプチドに対する反応を、刺激指標（ＳＩ）が２．９５より高い場合は陽性として表にした（図１８）。各ドナーについてのＳＩ値は各ペプチドセットについて当てはめて、各ペプチドに対して反応するドナーのパーセンテージを図１８Ｂに示した。このパーゼントバックグラウンド反応は２．８９％であり、このセットにおける全てのペプチドに対しする平均パーセント反応性を決定した。このデータセットの標準偏差は２．２１％であった。バックグラウンドよりも３倍より高い反応性パーセンテージを有するものを主要なエピトープとした。図１８Ａ及び１８Ｂに示したデータに基づき、低いバックグラウンド反応速度を有する曝されてないドナー集団に対する統計的方法に基づいて、どのペプチド反応も有意な差をしめさなかった。

それ故、これらのデータは野生型ＢＢＩ分子はヒトにおいて免疫原性が低いと考えられる。

実施例１７
パーソナルケア組成物
この実施例において、本発明の修飾変異ＢＢＰＩのいずれかを含む各種パーソナルケア組成物を以下のように提供する。他に定義しない限り、含量のパーセンテージは組成物の総重量に基づいて提供される。以下の製剤において、他で定義しない限り、ＢＢＩ−ＡＶ（「本発明の化合物」と記載する）は、０．０１％乃至１．０％の範囲で含まれる。幾つかの製剤において、好適な濃度は０．１％乃至０．２％である。他の製剤において、好適な濃度は、０．０５％乃至０．１％である（例えば、いくつかのヘア成長抑制剤の態様において）；０．０２％乃至０．１％（スキンライトニンング組成物）；０．５％乃至１．０％（例えば、いくつかのスキンライトニング組成物）又は０．１％以上（例えば、酒さ治療用組成物）である。当業者は、各製品に好適なＢＢＩ−ＡＶの濃度を決定する方法を知っている。以下に提供するいくつかの組成物において、「本発明の化合物」の含量を「ＳＡ」と表示する。この表示は、上で説明したように、以下で示す製剤は好適な濃度のＢＢＩ−ＡＶを含んでいる、又は特定の製剤に好適濃度のＢＢＩ−ＡＶを含んでいるということを示すものである。

更なる態様において、本発明は少なくとも１つの無機顔料を含む。幾つかの好適な態様において、これらの無機顔料は金属酸化物及び／又は水にわずかしか溶けない又は不溶性の金属化合物である。例としては、酸化亜鉛（ＺｎＯ）、チタニウム（ＴｉＯ_２）、鉄（例えば、Ｆｅ２Ｏ_３）、ジルコニウム（ＺｒＯ_２）、シリカ（ＳｉＯ_２）、マンガン（例えば、ＭｎＯ）、アルミニウム（Ａｌ_２Ｏ_３）、ロウ（例えば、Ｃｅ_２Ｏ_３）、及びこれらの酸化物の混合物、並びにこれらのブレンドを含む。幾つかの態様において、金属酸化物はマイクロファイングレード（ｍｉｃｒｏｆｉｎｅｇｒａｄｅ）である。一方他の態様では、前記金属酸化物は顔料グレード（ｐｉｇｍｅｎｔｇｒａｄｅ）である。更なる態様において、これらの金属酸化物は、マイクロファイン及びピグメントグレードの混合物である。

追加的な態様において、これらの無機顔料はコートされている（即ち、それらは表面処理されている）。幾つかの好適な態様において、その表面は薄い疎水性フィルムでコートされている。幾つかの他の好適な態様において、これらの表面は薄い疎水性フィルムでコートされている。更なる態様において、本発明は各種メイクアップ組成物及びメイクアップ成分を提供する。例えば、幾つかの態様において、本発明は各種ダイ及び／又は顔料を提供する。幾つかの態様において、有用な顔料は二酸化チタン、マイカ、酸化鉄（例えば、Ｆｅ２Ｏ３、Ｆｅ３Ｏ４、ＦｅＯ（ＯＨ）等）及び／又は酸化ズスを含むがこれらに限定されない。着色剤及び顔料の最も好適な態様は当業者に知られている（例えば、ＣｏｌｏｕｒＩｎｄｅｘＮｕｍｍｅｒｎ（ＣＩＮ）、ＲｏｗｅＣｏｌｏｕｒＩｎｄｅｘ、３^ｒｄｅｄ．、ＳｏｃｉｅｔｙｏｆＤｙｅｒｓａｎｄＣｏｌｏｕｒｉｓｔｓ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ［１９７１］参照）。

追加的な態様において、マイカ／酸化金属に基づく真珠光沢を有する顔料も用いることができる。しかしながら、他の真珠光沢を有する顔料も本発明の各種態様に用いることができることから、本発明を特定の顔料に限定することは意図しない。

以下の製剤は本発明の追加的な態様を示す。

以下に示す製法は、本発明のＢＢＩ−ＡＶを含むアフターシェイブ製品の実施例である。

以下に示す製法は、本発明のＢＢＩ−ＡＶを含むプレシェイブ製品の実施例である。

上に示したアフターシェイブおよびプレシェイブ製品の製法には、目的の効果を得るのに十分な量のＢＢＩ−ＡＶ（本発明の化合物）が含まれている。ある実施態様では、ＢＢＩ−ＡＶの濃度は１，０００ｐｐｍから１０，０００ｐｐｍの間にある。次に示す製法では、ＢＢＩ−ＡＶの典型的な濃度は、１００ｐｐｍから１，０００ｐｐｍの間であるか、または、１，０００ｐｐｍから１０，０００ｐｐｍの間である。しかしながら、これは、本発明をこの特定の範囲の濃度に限定する趣旨ではなく、本発明の他の実施態様では他の濃度を用いることがでる。

以下に示す製法は、本発明のＢＢＩ−ＡＶを含むアフターサン製品の実施例を与える。

以下に示す製法は、本発明のＢＢＩ−ＡＶを含むフェイシャル・クレンザー製品の実施例を示す。

以下に示す製法は、本発明のＢＢＩ−ＡＶを含むＳＰＦ８のデイリー・ケア・ボディー・スプレー製品の実施例である。

以下に示す製法は、本発明のＢＢＩ−ＡＶを含むＳＰＦ２７のサン・スクリーン・エマルジョン製品の実施例である。

以下に示す製法は、本発明のＢＢＩ−ＡＶを含むＳＰＦ２８のサン・スクリーン・エマルジョン製品の実施例である。

以下に示す製法は、本発明のＢＢＩ−ＡＶを含むフット・バーム製品の実施例である。

以下に示す製法は、本発明のＢＢＩ−ＡＶを含むリフレッシング・フット・ジェル製品の実施例である。

以下に示す製法は、本発明のＢＢＩ−ＡＶを含むスキン・コンディショニング・ジェル製品の実施例である。

以下に示す製法は、本発明のＢＢＩ−ＡＶを含むＷ／Ｏ型エマルジョンの実施例である。

以下に示す製法は、本発明のＢＢＩ−ＡＶを含むＯ／Ｗ型エマルジョン製品の実施例である。

以下に示す製法は、本発明のＢＢＩ−ＡＶを含む保護用デイ・クリーム製品の実施例である。

以下に示す製法は、本発明のＢＢＩ−ＡＶを含むヘア・ケア製品の実施例である。

顔料（ＡＳ５８１１、５１３１、５１４６、５１２６、及び５０２３０；ＣｏｌｏｒＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）とプロピルパラベンをＳｉｌｃａｒｅ３１Ｍ５０ＳＶ（Ｃｌａｒｉａｎｔ）中に分散させ、湿り気を帯びるまでかき混ぜる。この混合物を粉砕して、粒子径を１０μｍ未満にする。その後、ＤＣ９０１１ＥｌａｓｔｏｍｅｒＢｌｅｎｄ（ＤｏｗＣｏｒｎｉｎｇ）およびＤＣ２４５Ｆｌｕｉｄを最終工程容器で混合し、かき混ぜて均質化する。均質化のためのかき混ぜ行程をゆっくりと行いながら、色素成分を加える。水を計量して別々の容器に入れ、本発明の化合物をプロペラによるかき混ぜを行いながら徐々に加え、溶解するまでかき混ぜる。メチルパラベンと安息香酸がブチレン・グリコールに加えられる。混合物は徐々に暖められ、溶解するまでかき混ぜられる。混合物は３０℃に冷却され、本発明の化合物を含む溶液に加えられる。素早くかき混ぜながら、水相を油相にゆっくりと加える。加え終わった後、調合液を５分間均質化する。この調合液は、皮膚に塗るメークアップ・ファンデーションとして有用である。

マスカラ製造方法
対照用調合液と２％含有マスカラの成分は以下の通りである。

マスカラ製剤を製造するために、ワックス相８を結合させ、８５−９０℃でプロペラ混合しながら加熱した。１０％化合物溶液をプロペラ混合しながら、水に本発明の化合物を添加することにより調製した。相１の水をステンレススチールビーカー（損失を埋め合わせるために５０ｇ超を添加する）。相２のメチルパラベンをブチレングリコールに添加し、溶解するまでラップでふたをして蒸気バスのトップにおいて撹拌した。その後、緩やかに撹拌しながら水を添加した。その後、相４のブラック酸化鉄を添加し、撹拌を続けた。その後、Ｎａｔｒｏｓｏｌをふりかけ、撹拌を続けた、１０％ＫＯＨを添加し、ビーカーをできるだけきつふたをして８５℃になるまで加熱した。その後、Ａｒｌａｃｅ１６５を添加し、確実に溶解させるために少なくとも５分間混合した。８５−８９℃において、撹拌しながらワックス相を緩やかに水相に添加した。この温度と撹拌を１０分間維持した。このバッチを蒸気バスから取り出し、ビーカー壁の剥離物を均一に混合する間、冷却した。５５℃において、水のロスを測定するためにビーカー重量を測定した。混合を再開し水を必要に応じて添加した。４５℃において、相９及び１０を添加した。冷却水を用いて３０℃まで冷却を続けた。この時点で、連続的なビーカー壁の剥離物が必要となる。

この調製において、少量のＫＯＨ（相５）を用いてｐＨをあげることにより、湿潤を遅延させ、凝集を防止するためにグリコキサールを用いてコートされたＮａｔｒｏｓｏｌを分散させる。相７において、クエン酸を緩やかに添加してｐＨを、酸化鉄の等電点以下の〜５．５に調整する。相７及び８において、乳化が、両方のフェーズの中の界面活性剤によってより遂行しやすいので製品１６５は油相及び水相に分割されている。相９において、脱イオン水を化合物の代わりに対照に添加した。乳液を調整している間にこの化合物溶液を調整するので、前記化合物溶液は新鮮である。このように調製することにより本発明に適したカスカラが製造される。

実施例１８
ヘア成長抑制
この試験において、本発明の組成物のヘア成長の抑制能力を評価するために行った。特に、これらの試験は、シェービング、又はクリーム又はワックスを用いての脱毛の後のヘア成長を抑制する能力を評価した。

ＶＥＧＦ結合ペプチドで親ＢＢＰＩのキモトリプシンループを置換した修飾変異ＢＢＰＩを含む育毛抑制のためのローションを以下のように調製した。

この組成物はＳＥＱＩＤＮＯＳ：６０１、６０２、６２７−６３１、６４３、４９１、６３２−６３６から選択される即ち、１つのＶＥＧＦ−ＢＢＰＩを含む。幾つかの態様において、この組成物はＳＥＱＩＤＮＯＳ：６０１、６０２、６２７−６３１、６４３、４９１、６３２−６３６から選択される少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、又は少なくとも５つの異なるタイプのＶＥＧＦ―ＢＢＰＩを含む。ＶＥＧＦ―ＢＢＰＩを含むこの組成物は以下のように調製した：
１）脂肪酸乳化剤とオイルゲル化剤とを６０℃、好ましくは７０℃以上の溶融相に混合する；
２）この溶融相を水相へ乳化して、乳液を形成する。乳化前の水相の温度は５０℃、好ましくは６０℃、より好ましくは７０℃以上である；
３）この乳液を３５℃以下に冷却する；
４）香料、保存料、クエン酸緩衝液を乳液中に分散させる；
５）同様にＶＥＧＦ−ＢＢＰＩの乳液を５分以上掛けて緩衝液と一緒に添加する；
６）更に１０分間この混合物を撹拌する。

対照製剤ＢはＶＥＧＦ―ＢＢＰＩを含まない以外は同様に調製した。

顔の毛についての試験
これらの試験において、フィツパトリック（Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ）スキン分類ＩＩを有するグループ（例えば、５人）の男性の個体について試験を行った。これらの個人は、実験に先立って、顔用のトリートメントを行っていない。１日目、顔の毛の成長を肉眼で評価して写真を撮った。これに続いて、試験される組成物及び／対照を所望の濃度で適用した。２日目のは初めに、シェービングの直後の個体に本発明の組成物を適用した。大部分の場合、この試験を３０乃至４５日間続けた。この間、３日ごとに顔の毛の成長を視覚的に評価し、写真に記録さした。

脚の毛についての試験
この試験において、フィツパトリック（Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ）スキン分類ＩＩを有するグループ（例えば、５人）の女性の個体について試験を行った。各個人の足をマークして、毛の成長を肉眼及び写真で記録した。れに続いて、試験される組成物（即ち、所望の濃度のＢＢＩ−ＡＶの濃度を含む化合物）及び／対照を所望の濃度で適用した。幾つかの方法において、各個人に２本のチューブを与えた（１つはＢＢＩ−ＡＶを含み、他方は対照）。これらのチューブを「左」と「右」にマークした。試験期間のそれぞれの日に、個体はそれぞれの足に２つのチューブに入っている組成物を適用し。適用７日後、各個人の脚を視覚的に評価し、写真を撮り、両足をシェーブ又の脱毛用品により脱毛し、これまでと同様に脚への組成物の適用を続けた。毛の成長は、２日毎に視覚的に評価され、写真に記録された。幾つかの方法において、実験を３サイクル続け、ヘア成長を肉眼的に評価し、写真を撮った。この実験はさらに８日間続けられた。この試験により、マークした部位における製剤の適用により毛の数、毛の密度、及び／又は毛の長さが減少していることが確認された。

２日目の初めに、個人はシェービングの直後に本発明の組成物を適用した。この試験の間、ほかのプレ又はプロトリートメントは行わなかった。幾つかのケースにおいて、この試験は３０乃至４５日間続けられた。顔の毛の成長は、この間３日毎に視覚的に評価され、写真に記録された。毛の数、及び毛幹の長さ及び幅をコンピュータイメージ解析により測定した。試験物質の適用により毛の数、密度及び／又は長さが減少していることが確認された。

Claims

単離された修飾された変異ボウマンブリックプロテアーゼインヒビター（ＢＢＰＩ）であって、ＢＢＰＩ骨格の第二プロテアーゼ抑制ループが結合ペプチドであり、前記修飾された変異ＢＢＰＩがＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の変異ＢＢＰＩの１、４、５、１１、１３、１８、２５、２７、２９、３１、３８、４０、５０、５２、５５、及び６５位に等しい位置から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置において置換されたアミノ酸を更に含む、単離された修飾された変異ボウマンブリックプロテアーゼインヒビター（ＢＢＰＩ）。
前記ＢＢＰＩ骨格がＢＢＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）、ＢＢＩｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８５）、ＢＢＩ−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８６）、ＢＢＩｔ−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７）、ＢＢＩｔ−ＶＥＧＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４０）、ＢＢＩｔ−ＶＥＧＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４１）、ＢＢＩｔ−ＶＥＧＫＤ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４２）、ＢＢｄｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４４９）、ＢＢｓｂ３（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５０）、ＢＢｔｃ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５１）、ＢＢｄｂ−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５２）、ＢＢｓｂ３−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５３）、及びＢＢｔｃ−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５４）から選択される、請求項１の単離された修飾された変異ＢＢＰＩ。
前記結合ペプチドがＶＥＧＦ結合ペプチド、ＦＧＦ−５結合ペプチド、ＴＧＦβ 結合ペプチド、及びＴＮＦα結合ペプチドから選択される、請求項１の単離された修飾された変異ＢＢＰＩ。
前記結合ペプチドがＡＣＹＮＬＹＧＷＴＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：９）、ＫＹＹＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５８）、ＴＬＷＫＳＹＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５９）、ＤＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４６０）、ＳＫＨＳＱＩＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４６８）ＫＴＮＰＳＧＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４６９）、ＲＰＴＧＨＳＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４７０）、ＫＨＳＡＫＡＥ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４７１）、ＫＰＳＳＡＳＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４７２）、ＰＶＴＫＲＶＨ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４７３）、ＴＬＨＷＷＶＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９２）、ＰＹＫＡＳＦＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９３）、ＰＬＲＴＳＨＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９４）、ＥＡＴＰＲＯＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９５）、ＮＰＬＨＴＬＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９６）、ＫＨＥＲＩＷＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９７）、ＡＴＮＰＰＰＭ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９８）、ＳＴＴＳＰＮＭ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９９）、ＡＤＲＳＦＲＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５００）、ＰＫＡＤＳＫＱ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０１）、ＰＮＱＳＨＬＨ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０２）、ＳＧＳＥＴＷＭ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０３）、ＡＬＳＡＰＹＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０４）、ＫＭＰＴＳＫＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０５）、ＩＴＰＫＲＰＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０６）、ＫＷＩＶＳＥＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０７）、ＰＮＡＮＡＰＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０８）、ＮＶＱＳＬＰＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０９）、ＴＬＷＰＴＦＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１０）、ＮＬＷＰＨＦＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１１）、ＳＬＷＰＡＦＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１２）、ＳＬＷＰＡＦＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１３）、ＡＰＷＮＳＨＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１４）、ＡＰＷＮＬＨＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１５）、ＬＰＳＷＨＬＲ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１６）、ＰＴＩＬＥＷＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１７）、ＴＬＹＰＱＦＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１８）、ＨＬＡＰＳＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１９）、ＫＹＹＬＳＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２０）、ＷＹＴＬＹＫＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２１）、ＴＹＲＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２２）、ＲＹＳＬＹＹＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２３）、ＹＹＬＹＹＷＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２４）、ＮＹＱＬＹＧＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２５）、ＴＫＷＰＳＹＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２２６）、ＴＬＷＫＳＹＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２７）、ＰＬＷＰＳＹＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２８）、ＲＬＷＰＳＹＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２９）、ＴＬＷＰＫＹＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３０）、ＫＹＤＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３１）、ＲＹＤＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３２）、ＤＹＲＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３３）、ＤＹＫＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３４）、ＥＹＫＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３５）、及びＲＹＰＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３６）から選択されるＶＥＧＦ結合ペプチドである、請求項１の単離された修飾された変異ＢＢＰＩ。
前記結合ペプチドがＣＡＣＲＴＱＰＹＰＬＣＦ（ＭＭ００７；ＳＥＱＩＤＮＯ：４３０）、ＣＩＣＴＷＩＤＳＴＰＣ（ＰＳ２；ＳＥＱＩＤＮＯ：４３１）、ＣＹＧＬＰＦＴＲＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３７）、ＣＥＥＩＷＴＭＬＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３８）、ＣＷＡＬＴＶＫＴＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３９）、ＣＬＴＶＬＷＴＴＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４０）、ＣＴＬＷＮＲＳＰＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４１）、ＣＨＹＬＬＴＮＹＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４２）、ＣＲＩＨＬＡＨＫＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４３）、ＴＮＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４４）、ＨＬＱＴＴＥＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４５）、ＳＬＮＮＬＴＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４６）、ＴＮＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４７）、ＴＮＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４８）、ＬＲＩＬＡＮＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４９）、ＬＬＴＰＴＬＮ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５０）、ＡＬＰＴＨＳＮ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５１）、ＴＮＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５２）、ＬＣＲＲＦＥＮ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５３）、ＴＮＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５４）、ＴＮＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５５）、ＨＬＱＴＴＥＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５６）、ＰＬＧＬＣＰＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５７）、ＧＹＦＩＰＳＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５８）、ＴＫＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５９）、ＨＬＱＴＴＥＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６０）、ＷＮＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６１）、ＴＷＩＤＷＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６２）、ＲＴＱＰＹＰＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６７０）、及びＴＷＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６７１）から選択されるＦＧＦ−５結合ペプチドである請求項１の単離され修飾された変異ＢＢＰＩ。
前記結合ペプチドがＣＬＣＰＥＮＩＮＶＬＰＣＮ（ＰＥＮ３；ＳＥＱＩＤＮＯ：４３６）、ＣＩＣＫＨＮＶＤＷＬＣＦ（ＭＭＯ２１Ｗ；ＳＥＱＩＤＮＯ：４３７）、ＣＩＣＷＴＱＨＩＨＮＣＦ（ＷＴＱ；ＳＥＱＩＤＮＯ：４３８）、ＣＶＴＴＤＷＩＥＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６３）、ＣＹＹＳＱＦＨＱＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６４）、ＣＰＴＬＷＴＨＭＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６５）、ＱＳＡＣＩＶＹＹＶＧＲＫＰＫＶＥＣＡＳＳＤ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６６）、ＱＳＡＣＩＬＹＹＩＧＫＴＰＫＩＥＣＡＳＳＤ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６７）、ＱＳＡＣＩＬＹＹＶＧＲＴＰＫＶＥＣＡＳＳＤ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６８）、ａｃｅｔｙｌ−ＬＣＰＥＮＤＮＶＳＰＣＹ−ｃｏｈｎ２（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６９）、ＫＨＮＶＲＬＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７０）、ＮＤＴＰＳＹＦ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７１）、ＡＫＬＹＡＧＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７２）、ＲＧＰＡＨＳＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７３）、ＮＳＬＡＥＲＲ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７４）、ＨＰＬＡＳＰＨ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７５）、ＱＰＷＮＫＬＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７６）、ＡＷＬｒ／Ｍｉｐｙ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７７）、ＰＴＫＰＡＱＱ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７８）、ＰＳＬＮＲＰＱ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７９）、ＨＨＡＲＱＥＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８０）、ＲＨＨＴＰＧＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８１）、ＡＳＡＩＮＰＨ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８２）、ＣＨＧＹＤＲＡＰＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４４）、ＣＦＡＰＡＤＱＡＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４５）、ＣＩＰＳＲＦＩＴＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４６）、ＣＨＧＨＴＫＬＡＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４７）、ＣＮＧＫＳＫＬＡＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４８）、ＰＥＮＩＮＶＬＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６７２）、ＫＨＮＶＤＷＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６７３）、及びＷＴＱＨＩＨＮＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６７４）から選択されるＴＧＦβ 結合ペプチドである請求項１の単離され修飾された変異ＢＢＰＩ。
前記結合ペプチドがＲＹＷＱＤＩＰ（Ｔ１；ＳＥＱＩＤＮＯ：４７４）、ＡＰＥＰＩＬＡ（Ｔ２；ＳＥＱＩＤＮＯ：４７５）、ＤＭＩＭＶＳＩ（Ｔ３；ＳＥＱＩＤＮＯ：４７６）、ＷＴＰＫＰＴＱ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８３）、ＡＴＦＰＮＱＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８４）、ＡＳＴＶＧＧＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８５）、ＴＭＬＰＹＲＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８６）、ＡＷＨＳＰＳＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８７）、ＴＱＳＦＳＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８８）、ＴＨＫＮＴＬＲ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８９）、ＧＱＴＨＦＨＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５９０）、ＬＰＩＬＴＱＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５９１）、ＳＩＬＰＶＳＨ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５９２）、ＳＱＰＩＰＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５９３）、及びＱＰＬＲＫＬＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５９４）から選択されるＴＮＦα結合ペプチドである、請求項１の単離され修飾された変異ＢＢＰＩ。
１位における置換されたアミノ酸がＡ及びＣから選択される、請求項１の単離され修飾された変異ＢＢＰＩ。
４位における少なくとも１つの置換がＶである、請求項１の単離され修飾された変異ＢＢＰＩ。
５位における少なくとも１つの置換がＰ及びＡから選択される、請求項１の単離され修飾された変異ＢＢＰＩ。
１１位における少なくとも１つの置換が１１Ｇである、請求項１の単離され修飾された変異ＢＢＰＩ。
１３位における少なくとも１つの置換が１３Ｙ、１３Ｉ、１３Ｆ、１３Ｍ、１３Ｌ、１３Ｖ、１３Ｋ、及び１３Ｒから選択される、請求項１の単離され修飾された変異ＢＢＰＩ。
１８位における少なくとも１つの置換が１８Ｉ、１８Ｖ、及び１８Ｌから選択される、請求項１の単離され修飾された変異ＢＢＰＩ。
２５位における少なくとも１つの置換が、２５Ｋ、２５Ｎ、２５Ｗ、２５Ｉ、２５Ａ、及び２５Ｒから選択される、請求項１の単離され修飾された変異ＢＢＰＩ。
２７位における少なくとも１つの置換が２７Ｈ、２７Ｋ、２７Ｖ、２７Ａ、及び２７Ｑから選択される、請求項１の単離され修飾された変異ＢＢＰＩ。
２９位における少なくとも１つの置換が２９Ｒ、２９Ｋ、及び２９Ｐから選択される、請求項１の単離され修飾された変異ＢＢＰＩ。
３１位における少なくとも１つの置換が３１Ｑ、３１Ｈ、３１Ｅ、３１Ａ、３１Ｒ、３１Ｗ、３１Ｋ、及び３１Ｔから選択される、請求項１の単離され修飾された変異ＢＢＰＩ。
３８位における少なくとも１つの置換が３８Ｎ、３８Ｋ、及び３８Ｒから選択される、請求項１の単離され修飾された変異ＢＢＰＩ。
４０位における少なくとも１つの置換が４０Ｈ、４０Ｋ、４０Ｑ、４０Ｒ、及び４０Ｙから選される、請求項１の単離され修飾された変異ＢＢＰＩ。
５０位における少なくとも１つの置換が５０Ｒ、５０Ｑ、５０Ｋ、５０Ｔ、５０Ｖ、５０Ｍ、及び５０Ｓから選択される、請求項１の単離され修飾された変異ＢＢＰＩ。
５２位における少なくとも１つの置換が５２Ｋ、５２Ｔ、５２Ｒ、５２Ｑ、５２Ｌ、５２Ｈ、５２Ａ、５２Ｍ、５２Ｓ、及び５２Ｅから選択される、請求項１の単離され修飾された変異ＢＢＰＩ。
５５位における少なくとも１つの置換が５５Ｍである、請求項１の単離され修飾された変異ＢＢＰＩ。
６５位における少なくとも１つの置換が、６５Ｅ、６５Ｑ、及び６５Ｄから選択される、請求項１の単離され修飾された変異ＢＢＰＩ。
ＳＥＱＩＤＮＯ：３８９の挿入を更に含む請求項１の単離され修飾された変異ＢＢＰＩ。
前記修飾された変異ＢＢＰＩがセルラーゼ、クチナーゼ、及びジスルフィドイソメラーゼから選択される酵素の触媒ドメインを含む融合タンパク質として発現される、請求項１の単離され修飾された変異ＢＢＰＩ。
前記修飾された変異ＢＢＰＩがＳＥＱＩＤＮＯ：１９５の融合タンパク質として発現される、請求項１の単離され修飾された変異ＢＢＰＩ。
前記修飾された変異ＢＢＰＩがＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の５０及び５２位に等しいアミノ酸位置において２つのアミノ酸置換の組み合わせを含む、請求項１の修飾された変異ＢＢＰＩ。
前記修飾された変異ＢＢＰＩがＳＥＱＩＤＮＯ：５９５のアミノ酸配列を有する、請求項２７の単離され修飾された変異ＢＢＰＩ。
前記修飾された変異ＢＢＰＩがＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の２５、２９、４０、５０、及び５２位に等しい位置における３つのアミノ酸置換の組み合わせを含む、請求項１の単離され修飾された変異ＢＢＰＩ。
３つのアミノ酸置換の組み合わせが２５Ｌ−５０Ｔ−５２Ａ、２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａの組み合わせから選択される、請求項２９の単離された修飾された変異ＢＢＰＩ。
前記修飾された変異ＢＢＰＩがＳＥＱＩＤＮＯＳ：６０３、６０７、及び６０９から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２９の単離され修飾された変異ＢＢＰＩ。
前記修飾された変異ＢＢＰＩがＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１３、２９、５０、及び５２位に等しい位置における４つのアミノ酸置換の組み合わせを含む修飾された変異ＢＢＰＩ。
前記４つのアミノ酸の置換の組み合わせが１３Ｉ−２５Ｌ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−Ａ０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、２５Ｌ−２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、２５Ｌ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、及び２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａから選択される、請求項３２の単離され修飾されたＢＢＰＩ。
前記修飾された変異ＢＢＰＩがＳＥＱＩＤＮＯＳ：５９６、６００、６０２、６０４、６０６、６０８、及び６４３から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３３の単離され修飾された変異ＢＢＰＩ。
前記修飾された変異ＢＢＰＩがＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１３、２５、２９、４０、５０、及び５２位に等しい位置におけるアミノ酸置換から選択される５つのアミノ酸置換の組み合わせを含む、請求項１の単離され修飾された変異ＢＢＰＩ。
前記５つのアミノ酸置換の組み合わせが１３Ｉ−２５Ｌ−２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｌ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、Ａ１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、２５Ｌ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｋ−５２Ａ、及び１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ｔから選択される、請求項３５の単離され修飾された変異ＢＢＰＩ。
前記修飾された変異ＢＢＰＩがＳＥＱＩＤＮＯＳ：４３２、４３４、４４３、４４５、４４６、５９７、５９９、６０１、６０５、６１５、６２０、６２４、及び６２５から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３６に記載の単離され修飾された変異ＢＢＰＩ。
前記修飾された変異ＢＢＰＩがＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１、４、５、１１、１３、２５、２９、４０、５０、及び５２に等しい位置から選択される６つのアミノ酸置換の組み合わせを含む、請求項１の単離され修飾された変異ＢＢＰＩ。
前記６つのアミノ酸置換の組み合わせが１３Ｉ−２５Ｌ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１Ｃ−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、４Ｖ−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、５Ｐ−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１１Ｇ−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｒ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２７Ｒ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−３１Ａ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−３１Ｒ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−３８Ｎー４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、及び１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ−６５Ｅから選択される、請求項３８の単離され修飾された変異ＢＢＰＩ。
前記修飾された変異ＢＢＰＩがＳＥＱＩＤＮＯＳ：５９８、６１１、６１２、６１３、６１４、６１６、６１９、６２１、６２２、６２３、及び６２６から選択されるアミノ酸配列を含む請求項３９の単離され修飾された変異ＢＢＰＩ。
前記修飾された変異ＢＢＰＩがＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１３、２５、２９、３１、４０、５０、及び５２位に等しい位置における７つのアミノ酸置換の組み合わせを含む、請求項１の単離され修飾された変異ＢＢＰＩ。
前記７つのアミノ酸置換の組み合わせが１３Ｌ−２５Ｒ−２９Ｐ−３１Ａ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｌ−２５Ｒ−２９Ｐ−３１Ｒ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、及び１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔから選択される、請求項４１の単離され修飾された変異ＢＢＰＩ。
前記修飾された変異ＢＢＰＩがＳＥＱＩＤＮＯＳ：４９１、６１７、６１８、及び６３２乃至６３９のアミノ酸配列を含む、請求項４１の単離され修飾された変異ＢＢＰＩ。
前記修飾された変異ＢＢＰＩがＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１３、２５、２７、２９、３１、４０、５０、及び５２位に等しい位置における８つのアミノ酸置換の組み合わせを含む、請求項１の単離され修飾された変異ＢＢＰＩ。
前記８つのアミノ酸置換の組み合わせが１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ａ−２９Ｒ−３１Ｅ−４０Ｋ−５０Ｑ−５２Ｑ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ｒ−２９Ｅ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｒ−５２Ｋ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ａ−２９Ｒ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｒ−５２Ｌ、及び１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ｑ−２９Ｐ−３１Ｅ−４０Ｈ−５０Ｒ−５２Ｑから選択される、請求項４４の単離され修飾された変異ＢＢＰＩ。
前記修飾された変異ＢＢＰＩがＳＥＱＩＤＮＯＳ：６２７乃至６３１から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項４４の単離され修飾された変異ＢＢＰＩ。
前記修飾された変異ＢＢＰＩがＶＥＧＦに結合する、請求項１の単離され修飾された変異ＢＢＰＩ。
ＶＥＧＦに結合しているペプチドがＳＥＱＤＩＮＯＳ：９、４５８、４５９、４６０、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、及び４７３から選択される、請求項１の単離され修飾された変異ＢＢＰＩ。
前記修飾された変異ＢＢＰＩがＳＥＱＤＩＮＯＳ：６０１、６０２、６２７、６２８、６３０、６３１、６４３、４９１、６３２、６３３、６３４、６３５、及び６３６から選択されるＶＥＧＦ−ＢＢＰＩである、請求項１の単離され修飾された変異ＢＢＰＩ。
前記単離され修飾された変異インヒビターが対応する未修飾前駆変異ＢＢＰＩよりも高いトリプシン抑制活性を示す、請求項１の単離され修飾された変異ＢＢＰＩ。
前記単離され修飾された変異ＢＢＰＩが対応する未修飾前駆変異ＢＢＰＩよりも高いトリプシン抑制活性及び生産性を示す、請求項１の単離され修飾された変異ＢＢＰＩ。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の１３、２５、２７、２９、３１、４０、５０、及び５２位の少なくとも１つの位置におけるアミノ酸置換を含み、ＶＥＧＦ変異ペプチドがＦＧＦ−５、ＴＧＦβ、及びＴＮＦαから選択される標的タンパク質に結合する変異ペプチドにより置換されている、単離され修飾された変異ＢＢＰＩ。
前記変異ペプチドがＳＥＱＤＩＮＯＳ：４３０、４３１、６７０、及び６７１から選択されるＦＧＦ５である、請求項５２の単離され修飾された変異ＢＢＰＩ。
前記結合ペプチドがＳＥＱＤＩＮＯＳ：４３６、４３７、４３８、６７２、６７３、及び６７４から選択される、請求項５２の単離され修飾された変異ＢＢＰＩ。
前記結合ペプチドがＳＥＱＤＩＮＯＳ：４７４、４７５、及び４７６から選択される、ＴＮＦα結合ペプチドである、請求項５２の単離され修飾された変異ＢＢＰＩ。
前記修飾された変異ＢＢＰＩが対応する未修飾前駆ＢＢＰＩよりも高いトリプシン抑制活性を有する、請求項５２の単離され修飾された変異ＢＢＰＩ。
前記変異ボウマンブリックインヒビターがＳＥＱＩＤＮＯ：４３２、４３４、４４３、４４５、４４７、６３７、６３８、及び６３９から選択される、請求項５２の単離され修飾された変異ＢＢＰＩ。
酵素の触媒単位をコードしている第一ポリヌクレオチド配列及びＶＥＧＦ結合ＢＢＰＩ（ＶＥＧＦ−ＢＢＰＩ）、ＦＧＦ結合ＢＢＰＩ（ＦＧＦ−ＢＢＰＩ）、ＴＧＦ結合ＢＢＰＩ（ＴＧＦ−ＢＢＰＩ）及びＴＮＦ結合ＢＢＰＩ（ＴＮＦ−ＢＢＰＩ）から選択される修飾された変異プロテアーゼインヒビターをコードしている第二ポリヌクレオチド配列を含む、ＢＢＰＩ融合タンパク質をコードしている単離されたポリヌクレオチド。
前記第一配列がセルラーゼの触媒単位をコードしている、請求項５８の単離されたポリヌクレオチド。
バクテリア細胞内で修飾された変異ＢＢＰＩを生成する方法であって、
ａ）変異ＢＢＰＩをコードしているポリヌクレオチドを変異させてＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の変異ＢＢＰＩの１、４、５、１１、１３、１８、２５、２７、２９、３１、３８、４０、５０、５２、５５、及び６５に等しい位置から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置においてアミノ酸置換を含む、修飾された変異ＢＢＰＩをコードしているポリヌクレオチド構築体を生成する工程、
ｂ）バクテリア宿主細胞へ前記ポリヌクレオチド構築体を導入する工程、
ｃ）前記バクテリア宿主細胞を好適な条件下で培養して、異種ＤＮＡを発現させる工程、
ｄ）対応する未修飾前駆変異ＢＢＰＩよりも高いトリプシン抑制活性を有する修飾されたへＢＢＰＩを生成する工程、を含む方法。
前記修飾された変異ＢＢＰＩが対応する前駆変異ＢＢＰＩよりも高いトリプシン抑制活性及び生産性を有する、請求項６０の方法。
前記未修飾前駆変異ＢＢＰＩがＢＢＩ−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８６）、ＢＢＩｔ−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７）、ＢＢｄｂ−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５２）、ＢＢｓｂ３（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５３）、及びＢＢｔｃ−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５４）から選択される、請求項６０の方法。
前記修飾された変異ＢＢＰＩの第二プロテアーゼ抑制ループがＶＥＧＦ結合ペプチドＦＧＦ−５結合ペプチド、ＴＧＦβ結合ペプチド、及びＴＮＦα結合ペプチドから選択される、請求項６０の方法。
前記修飾された変異ＢＢＰＩを回収する工程を更に含む、請求項６０の方法。
前記修飾された変異ＢＢＰＩを活性化する工程を更に含む、請求項６０の方法。
前記修飾された変異ＢＢＰＩが（３）２５Ｌ−５０Ｔ−５２Ａ、２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、（４）１３Ｉ−２５Ｌ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−Ａ０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、２５Ｌ−２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、２５Ｌ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、及び２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、（５）１３Ｉ−２５Ｌ−２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｌ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、２５Ｌ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｌ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｋ−５２Ａ、及び１３Ｌ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ｔ、（６）１３Ｉ−２５Ｌ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１Ｃ−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、４Ｖ−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、５Ｐ−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１１Ｇ−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｒ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２７Ｒ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−３１Ａ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−３１Ｒ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−３８Ｎ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ−６５Ｅ、（７）１３Ｌ−２５Ｒ−２９Ｐ−３１Ａ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｌ−２５Ｒ−２９Ｐ−３１Ｒ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、（８）１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ａ−２９Ｒ−３１Ｅ−４０Ｋ−５０Ｑ−５２Ｑ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ｒ−２９Ｅ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｒ−５２Ｋ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ａ−２９Ｒ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｒ−５２Ｌ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ｑ−２９Ｐ−３１Ｅ−４０Ｈ−５０Ｒ−５２Ｑから選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含む、請求項６０の方法。
請求項１の単離され修飾された変異ＢＢＰＩをコードしているポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
前記修飾された変異ＢＢＰＩがＳＥＱＩＤＮＯ：１９５のポリペプチドに少なくとも８０％の同一性を有する融合タンパク質として発現される、請求項６７の発現ベクター。
前記修飾されたＢＢＰＩの第二プロテアーゼ抑制ループがＶＥＧＦ結合ペプチド、ＦＧＦ５結合ペプチド、ＴＧＦβ 結合ペプチド、及びＴＮＦα 結合ペプチドから選択される、結合ペプチドである、請求項６７の発現ベクター。
請求項６７のＶＥＧＦで形質転換された宿主細胞。
前記宿主細胞がバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属宿主細胞である、請求項７０の宿主細胞。
前記ＢＢＰＩの骨格の第二プロテアーゼ抑制ループが血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）結合ペプチド、繊維芽細胞成長因子−５（ＦＧＦ５）結合ペプチド、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）結合ペプチド、及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）変異ペプチドから選択され、前記修飾された変異ＢＢＰＩがＳＥＱＩＤＮＯ：１８７の変異ＢＢＰＩの１、４、５、１１、１３、１８、２５、２７、２９、３１、３８、４０、５０、５２、５５、及び６５に等しい位置から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置においてアミノ酸置換を更に含む、修飾された変異ＢＢＰＩを含むパーソナルケア組成物。
骨格がＢＢＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）、ＢＢＩｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８５）、ＢＢＩ−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８６）、ＢＢＩｔ−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８７）、ＢＢＩｔ−ＶＥＧＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４０）、ＢＢＩｔ−ＶＥＧＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４１）、ＢＢＩｔ−ＶＥＧＫＤ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４２）、ＢＢｄｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４４９）、ＢＢｓｂ３（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５０）、ＢＢｔｃ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５１）、ＢＢｄｂ−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５２）、ＢＢｓｂ３−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５３）、及びＢＢｔｃ−ＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５４）から選択される、請求項７２のパーソナルケア組成物。
前記修飾された変異ＢＢＰＩが５０Ｔ−５２Ａ、２５Ｌ−５０Ｔ−５２Ａ、２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｌ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、２５Ｌ−２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、２５Ｌ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｋ−２９Ｐ−５２Ｋ、１３Ｉ−２５Ｌ−２９Ｐ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｌ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、２５Ｌ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｌ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｋ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｋ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｌ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、Ｄ１Ｃ−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、Ｓ４Ｖ−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、Ｓ５Ｐ−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１１Ｇ−１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｒ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２７Ｒ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−３１Ａ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−３１Ｒ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−３８Ｎ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ−６５Ｅ、１３Ｌ−２５Ｒ−２９Ｐ−３１Ａ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｌ−２５Ｒ−２９Ｐ−３１Ｒ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ａ−２９Ｒ−３１Ｅ−４０Ｋ−５０Ｑ−５２Ｑ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ｒ−２９Ｅ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｒ−５２Ｋ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ａ−２９Ｒ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｒ−５２Ｌ、及び１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ｑ−２９Ｐ−３１Ｅ−４０Ｈ−５０Ｒ−５２Ｑから選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含む、請求項７２又は７３に記載のパーソナルケア組成物。
前記修飾された変異ＢＢＰＩがＶＥＧＦ、ＦＧＦ５、ＴＧＦβ、及びＴＮＦαから選択される標的タンパク質に結合する、請求項７２、７３、及び７４のいずれか１項に記載のパーソナルケア組成物。
前記ＶＥＧＦ結合ペプチドがＡＣＹＮＬＹＧＷＴＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：９）、ＫＹＹＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５８）、ＴＬＷＫＳＹＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５９）、ＤＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４６０）、ＳＫＨＳＱＩＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４６８）、ＫＴＮＰＳＧＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４６９）、ＲＰＴＧＨＳＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４７０）、ＫＨＳＡＫＡＥ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４７１）、ＫＰＳＳＡＳＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４７２）、ＰＶＴＫＲＶＨ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４７３）、ＴＬＨＷＷＶＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９２）、ＰＹＫＡＳＦＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９３）、ＰＬＲＴＳＨＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９４）、ＥＡＴＰＲＯＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９５）、ＮＰＬＨＴＬＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９６）、ＫＨＥＲＩＷＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９７）、ＡＴＮＰＰＰＭ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９８）、ＳＴＴＳＰＮＭ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９９）、ＡＤＲＳＦＲＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５００）、ＰＫＡＤＳＫＱ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０１）、ＰＮＱＳＨＬＨ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０２）、ＳＧＳＥＴＷＭ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０３）、ＡＬＳＡＰＹＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０４）、ＫＭＰＴＳＫＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０５）、ＩＴＰＫＲＰＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０６）、ＫＷＩＶＳＥＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０７）、ＰＮＡＮＡＰＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０８）、ＮＶＱＳＬＰＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０９）、ＴＬＷＰＴＦＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１０）、ＮＬＷＰＨＦＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１１）、ＳＬＷＰＡＦＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１２）、ＳＬＷＰＡＦＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１３）、ＡＰＷＮＳＨＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１４）、ＡＰＷＮＬＨＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１５）、ＬＰＳＷＨＬＲ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１６）、ＰＴＩＬＥＷＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１７）、ＴＬＹＰＱＦＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１８）、ＨＬＡＰＳＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１９）、ＫＹＹＬＳＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２０）、ＷＹＴＬＹＫＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２１）、ＴＹＲＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２２）、ＲＹＳＬＹＹＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２３）、ＹＹＬＹＹＷＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２４）、ＮＹＱＬＹＧＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２５）、ＴＫＷＰＳＹＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２２６）、ＴＬＷＫＳＹＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２７）、ＰＬＷＰＳＹＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２８）、ＲＬＷＰＳＹＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２９）、ＴＬＷＰＫＹＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３０）、ＫＹＤＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ；５３１）、ＲＹＤＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３２）、ＤＹＲＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３３）、ＤＹＫＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３４）、ＥＹＫＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３５）、及びＲＹＰＬＹＷＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３６）から選択される、請求項７２乃至７５のいずれか１項に記載のパーソナルケア組成物。
前記ＦＧＦ結合ペプチドがＣＡＣＲＴＱＰＹＰＬＣＦ（ＭＭ００７；ＳＥＱＩＤＮＯ：４３０）、ＣＩＣＴＷＩＤＳＴＰＣ（ＰＳ２；ＳＥＱＩＤＮＯ：４３１）、ＣＹＧＬＰＦＴＲＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３７）、ＣＥＥＩＷＴＭＬＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３８）、ＣＷＡＬＴＶＫＴＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３９）、ＣＬＴＶＬＷＴＴＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４０）、ＣＴＬＷＮＲＳＰＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４１）、ＣＨＹＬＬＴＮＹＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４２）、ＣＲＩＨＬＡＨＫＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４３）、ＴＮＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４４）、ＨＬＱＴＴＥＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４５）、ＳＬＮＮＬＴＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４６）、ＴＮＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４７）、ＴＮＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４８）、ＬＲＩＬＡＮＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４９）、ＬＬＴＰＴＬＮ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５０）、ＡＬＰＴＨＳＮ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５１）、ＴＮＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５２）、ＬＣＲＲＦＥＮ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５３）、ＴＮＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５４）、ＴＮＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５５）、ＨＬＱＴＴＥＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５６）、ＰＬＧＬＣＰＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５７）、ＧＹＦＩＰＳＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５８）、ＴＫＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５９）、ＨＬＱＴＴＥＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６０）、ＷＮＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６１）、ＴＷＩＤＷＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６２）、ＲＴＱＰＹＰＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６７０）、及びＴＷＩＤＳＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６７１）から選択される、請求項７２乃至７５のいずれか１項に記載のパーソナルケア組成物。
前記ＴＧＦ結合ペプチドがＣＬＣＰＥＮＩＮＶＬＰＣＮ（ＰＥＮ３；ＳＥＱＩＤＮＯ：４３６）、ＣＩＣＫＨＮＶＤＷＬＣＦ（ＭＭＯ２１Ｗ；ＳＥＱＩＤＮＯ：４３７）、ＣＩＣＷＴＱＨＩＨＮＣＦ（ＷＴＱ；ＳＥＱＩＤＮＯ：４３８）、ＣＶＴＴＤＷＩＥＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６３）、ＣＹＹＳＱＦＨＱＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６４）、ＣＰＴＬＷＴＨＭＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６５）、ＱＳＡＣＩＶＹＹＶＧＲＫＰＫＶＥＣＡＳＳＤ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６６）、ＱＳＡＣＩＬＹＹＩＧＫＴＰＫＩＥＣＡＳＳＤ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６７）、ＱＳＡＣＩＬＹＹＶＧＲＴＰＫＶＥＣＡＳＳＤ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６８）、ａｃｅｔｙｌ−ＬＣＰＥＮＤＮＶＳＰＣＹ−ｃｏｈｎ２（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６９）、ＫＨＮＶＲＬＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７０）、ＮＤＴＰＳＹＦ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７１）、ＡＫＬＹＡＧＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７２）、ＲＧＰＡＨＳＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７３）、ＮＳＬＡＥＲＲ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７４）、ＨＰＬＡＳＰＨ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７５）、ＱＰＷＮＫＬＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７６）、ＡＷＬｒ／Ｍｉｐｙ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７７）、ＰＴＫＰＡＱＱ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７８）、ＰＳＬＮＲＰＱ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７９）、ＨＨＡＲＱＥＷ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８０）、ＲＨＨＴＰＧＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８１）、ＡＳＡＩＮＰＨ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８２）、ＣＨＧＹＤＲＡＰＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４４）、ＣＦＡＰＡＤＱＡＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４５）、ＣＩＰＳＲＦＩＴＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４６）、ＣＨＧＨＴＫＬＡＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４７）、ＣＮＧＫＳＫＬＡＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４８）、ＰＥＮＩＮＶＬＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ；６７２）、ＫＨＮＶＤＷＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６７３）、及びＷＴＱＨＩＨＮＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６７４）から選択される、請求項７２乃至７５のいずれか１項に記載のパーソナルケア組成物。
前記ＴＮＦ結合ペプチドがＲＹＷＱＤＩＰ（Ｔ１；ＳＥＱＩＤＮＯ：４７４）、ＡＰＥＰＩＬＡ（Ｔ２；ＳＥＱＩＤＮＯ：４７５）、ＤＭＩＭＶＳＩ（Ｔ３；ＳＥＱＩＤＮＯ：４７６）、ＷＴＰＫＰＴＱ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８３）、ＡＴＦＰＮＱＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８４）、ＡＳＴＶＧＧＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８５）、ＴＭＬＰＹＲＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８６）、ＡＷＨＳＰＳＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８７）、ＴＱＳＦＳＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８８）、ＴＨＫＮＴＬＲ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８９）、ＧＱＴＨＦＨＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５９０）、ＬＰＩＬＴＱＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５９１）、ＳＩＬＰＶＳＨ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５９２）、ＳＱＰＩＰＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５９３）、及びＱＰＬＲＫＬＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５９４）から選択される、請求項７２乃至７５のいずれか１項に記載のパーソナルケア組成物。
前記修飾された変異ＢＢＰＩが前記パーソナルケア組成物に約０．０００１乃至約５重量パーセント含まれる、請求項７２乃至７５のいずれか１項に記載のパーソナルケア組成物。
前記単離された修飾された変異ＢＢＰＩが前記ＢＢＰＩの対応する未修飾前駆変異インヒビターよりも高いトリプシン抑制活性及び生産性を有する、請求項７２乃至７５のいずれか１項に記載の単離され修飾された変異ＢＢＰＩ。
前記結合ペプチドがＳＥＱＩＤＮＯＳ：９、４５８、４５９、４６０、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、及び４７３から選択されるＶＥＧＦ結合ペプチドである、請求項７２乃至７５のいずれかに記載のパーソナルケア組成物。
前記骨格がＳＥＱＩＤＮＯ：１８７のＢＢＩｔ−ＡＶである、請求項８２のパーソナルケア組成物。
前記修飾された変異ＢＢＰＩが１３Ｉ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｋ−２９Ｐ−５２Ｋ、１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ａ−２９Ｒ−３１Ｅ−４０Ｋ−５０Ｑ−５２Ｑ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ａ−２９Ｒ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｒ−５２Ｌから選択される、アミノ酸置換の組み合わせを含む、請求項８２又は８３のパーソナルケア組成物。
前記修飾された変異ＢＢＰＩがＳＥＱＩＤＮＯＳ：６０１、６０２、６２７、６２８、６３０、６３１、６４３、４９１、６３２、６３３、６３４、６３５、及び６３６から選択される、ＶＥＧＦ結合ＢＢＰＩ（ＶＥＧＦ−ＢＢＰＩ）である、請求項７２、８０、及び８１のいずれかに記載のパーソナルケア組成物。
前記パーソナルケア組成物が、スキンクリーム、ローション、スプレー、乳液、コロイド懸濁液、泡、エアロゾル、液体、ゲル、美容液、及び固形物から選択されるスキンケア組成物である、請求項７５及び８０乃至８５のいずれかに記載のパーソナルケア組成物。
前記パーソナルケア組成物が保湿性ボディーウォッシュ、ボディーウォッシュ、抗菌クレンザー、スキンプロテクトクリーム、ボディーローション、顔用クリーム、保湿性クリーム、保湿性クレンジング乳液、顔用ゲル、顔用美容液、界面活性剤ベース顔用クレンザー、顔用ピーリングゲル、ニキビ予防トリートメント、顔用トナー、ピーリングクリーム、顔用マスク、アフターシェーブバーム、プレシェーブバーム、タンニング組成物、サンスクリーン、フケ予防剤、育毛抑制剤、及び放射線保護剤から選択されるスキンケア組成物である、請求項７５及び８０乃至８５のいずれかに記載のパーソナルケアケア組成物。
前記スキンケア組成物が局所的に適用される市販製剤、抗菌トリートメント、ニキビ予防トリートメント、スキン保護剤、サンスクリーン、デオドラント、及び抑汗剤を更に含む、請求項８７の組成物。
前記サンスクリーンが非水耐性サンスクリーン、高水耐性サンスクリーン、及びシリコン中水サンスクリーンから選択される、請求項８７の組成物。
前記パーソナルケア組成物が圧縮パウダー製剤及びファンデーションから選択される化粧組成物である、請求項８６の組成物。
前記組成物が少なくとも１つの顔料を含む、請求項９０の組成物。
前記化粧組成物がルースパウダー、頬紅、及びブロンジングパウダーから選択される圧縮パウダー製剤である、請求項９０の組成物。
前記化粧組成物が油中水ファンデーション、シリコン中水ファンデーション、水中油ファンデーション、無水メイクアップスティック、及びクリームトゥパウダーファンデーションから選択される、ファンデーションである、請求項９０の組成物。
前記パーソナルケア組成物が血管形成性の皮膚病を治療するためのスキンケア組成物である、請求項８６の組成物。
前記パーソナルケア組成物が、乾癬、強皮症、静脈性潰瘍、ニキビ、酒さ、イボ、湿疹、血管腫、及びリンパ管形成から選択される皮膚病を患っている固体における皮膚の外観及び／又は状態を改善するためのスキンケア組成物である、請求項８６のパーソナルケア組成物。
前記パーソナルケア組成物がヘアケア組成物である、請求項７５及び８０乃至８５のいずれか１項に記載のパーソナルケア組成物。
前記ヘアケア組成物がシャンプー、コンディショナー、ヘアスタイリング組成物、染毛剤、パーマネントウェーブ製剤、クリーム、ゲル、ムース、スプレー、乳液、コロイド懸濁液、液体、泡、及び固形物からなる群より選択される、請求項９６のヘアケア組成物。
前記ヘアケア組成物が更に放射線保護剤を含む、請求項９７のヘアケア組成物。
前記放射線保護剤が非水耐性サンスクリーン、高水耐性サンスクリーン、及びシリコン中水サンスクリーンから選択される、請求項９８の組成物。
前記パーソナルケア組成物が育毛を阻害する、請求項９６の組成物。
固体の育毛を抑制する方法であって、前記方法が、
ａ）請求項７５及び８０乃至８５のいずれか１項に記載のパーソナルケア組成物を提供する工程、
ｂ）処理される個体を提供する工程、及び
ｃ）育毛を抑制したい固体の領域に前記組成物を適用する工程を含む、方法。
前記育毛が抑制されるべき毛が、顔の毛、脇の毛、脚の毛、胴体の毛、腕の毛、及び頭の毛から選択される、請求項１０１の方法。
前記パーソナルケア組成物がＳＥＱＩＤＮＯＳ：６０１、６０２、６２７、６２８、６３０、６３１、６４３、４９１、６３２、６３３、６３４、６３５、及び６３６から選択されるＶＥＧＦ―ＢＢＰＩを含む、請求項１０１の方法。
血管形成性皮膚病を患っている固体の皮膚の外観及び／又は状態を改善する方法であって、
ａ）請求項７５及び８０乃至８５のいずれか１項に記載のパーソナルケア組成物を提供する工程、
ｂ）固体を提供する工程、及び
ｃ）前記固体の皮膚に前記組成物を適用する工程、を含む方法。
前記血管形成性皮膚病が、乾癬、強皮症、静脈性潰瘍、ニキビ、酒さ、イボ、湿疹、血管腫、及びリンパ管形成から選択される、請求項１０４の方法。
前記パーソナルケア組成物がＳＥＱＩＤＮＯＳ：６０１、６０２、６２７、６２８、６３０、６３１、６４３、４９１、６３２、６３３、６３４、６３５、及び６３６から選択される、ＶＥＧＦ―ＢＢＰＩを含む、請求項１０４の方法。
前記変異ペプチドがＳＥＱＩＤＮＯＳ：４３０及び４３１から選択されるＦＧＦ変異ペプチドである、請求項７２乃至７５のいずれか１項に記載のパーソナルケア組成物。
前記骨格がＳＥＱＩＤＮＯ：１８７のＢＢｌｔ−ＡＶである、請求項１０７のパーソナルケア組成物。
前記修飾された変異ＢＢＰＩが１３Ｉ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｋ−２９Ｐ−５２Ｋ、１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ａ−２９Ｒ−３１Ｅ−４０Ｋ−５０Ｑ−５２Ｑ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ａ−２９Ｒ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｒ−５２Ｌから選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含む、請求項１０７及び１０８のいずれか１項に記載のパーソナルケア組成物。
前記修飾された変異ＢＢＰＩがＳＥＱＩＤＮＯＳ：４３２及び４３４から選択されるＦＧＦ結合ＢＢＰＩ（ＦＧＦ―ＢＢＰＩ）である、請求項７２、８０、及び８１のいずれか１項に記載のパーソナルケア組成物。
前記パーソナルケア組成物がヘアケア組成物を含む、請求項７７及び１０７乃至１１０のいずれか１項に記載の組成物。
前記ヘアケア組成物がシャンプー、コンディショナー、ヘアスタイリング組成物、染毛剤、パーマネントウェーブ製剤、クリーム、ゲル、ムース、スプレー、乳液、コロイド懸濁液、液体、泡、及び固形物からなる群より選択される、請求項１１１のヘアケア組成物。
前記ヘアケア組成物が更に放射線保護剤を含む、請求項１１１又は１１２のいずれかに記載のヘアケア組成物。
前記放射線保護剤が、非水耐性サンスクリーン、高水耐性サンスクリーン、及びシリコン中水サンスクリーンから選択される、請求項１１３の組成物。
前記パーソナルケア組成物が育毛を促進する、請求項１１１の組成物。
固体の毛の育成を促進する方法であって、
ａ）請求項７７乃至１０７乃至１１０のいずれか１項に記載のパーソナルケア組成物を提供する工程、
ｂ）処理されるべき個体を提供する工程、及び
ｃ）育毛の促進が望まれる固体の領域に前記組成物を適用する工程を含む、方法。
促進されるべき育毛が顔の毛、脇の毛、胴体の毛、脚の毛、腕の毛、及び頭の毛から選択される、請求項１１６の方法。
前記固体が脱毛を含む症状を患っている、請求項１１６の方法。
前記症状が炎症性脱毛症、萎縮性脱毛症、刺咬部、扁平苔癬、乾癬、紅斑性狼瘡、脂漏性皮膚炎、脱毛症、血色素症、アンドロゲン性脱毛症、円形脱毛症から選択される、請求項１１６の方法。
前記パーソナルケア組成物がＳＥＱＩＤＮＯＳ：４３２及び４３４から選択されるＦＧＦ結合ＢＢＰＩ（ＦＧＦ−ＢＢＰＩ）を含む、請求項１１６の方法。
ＳＥＱＤＩＮＯＳ：４３６、４３７、４３８、６７２、６７３、及び６７４から請求項ＴＧＦ変異ペプチドである、請求項７２乃至７５のいずれか１項に記載のパーソナルケア組成物。
前記骨格がＳＥＱＩＤＮＯ：１８７のＢＢＩｔ−ＡＶである、請求項１２１のパーソナルケア組成物。
前記修飾された変異ＢＢＰＩが１３Ｉ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｋ−２９Ｐ−５２Ｋ、１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ａ−２９Ｒ−３１Ｅ−４０Ｋ−５０Ｑ−５２Ｑ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ａ−２９Ｒ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｒ−５２Ｌから選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含む、請求項１２１及び１２２のいずれか１項に記載のパーソナルケア組成物。
前記修飾された変異ＢＢＰＩがＳＥＱＩＤＮＯＳ：４４３、４４５、及び４４７から選択されるＴＧＦ結合ＢＢＰＩ（ＴＧＦ−ＢＢＰＩ）である、請求項７２、８０、及び８１のいずれか１項に記載のパーソナルケア組成物。
前記パーソナルケア組成物がヘアケア又はスキンケア組成物である、請求項７８、８０、８１、及び１２１乃至１２４のいずれか１項に記載のパーソナルケア組成物。
前記ヘアケア又はスキンケア組成物がシャンプー、コンディショナー、ヘアスタイリング組成物、染毛剤、パーマネントウェーブ製剤、クリーム、ゲル、ムース、スプレー、乳液、コロイド懸濁液、液体、泡、及び固形物からなる群より選択される、請求項１２５のパーソナルケア組成物。
前記パーソナルケア組成物が保湿性ボディーウォッシュ、ボディーウォッシュ、抗菌クレンザー、スキンプロテクトクリーム、ボディーローション、顔用クリーム、保湿性クリーム、顔用クレンジング乳液、フェイシャルゲル、保湿性美容液、界面活性剤ベース顔用クレンザー、顔用ピーリングゲル、ニキビ予防トリートメント、顔用トナー、ピーリングゲル、顔用マスク、アフターシェーブバーム、プレシェーブバーム、タンニング組成物、サンスクリーン、及び放射線保護剤から選択されるスキンケア組成物である、請求項１２５の組成物。
前記スキンケア組成物が局所的に適用される市販製剤、抗菌トリートメント、ニキビ予防トリートメント、スキン保護剤、サンスクリーン、デオドラント、及び抑汗剤を更に含む、請求項１２７の組成物。
前記放射線保護剤が非水耐性サンスクリーン、高水耐性サンスクリーン、及びシリコン中水サンスクリーンから選択される、請求項１２７の組成物。
前記パーソナルケア組成物が化粧組成物である、請求項１２１乃至１２４のいずれか１項に記載の組成物。
前記化粧組成物がマスカラ、アイライナー、圧縮パウダー製剤、及びファンデーションから選択される、請求項１３０の組成物。
前記ヘアケア組成物が更に放射線保護剤を含む、請求項１２６のヘアケア組成物。
前記放射線保護剤が非水耐性サンスクリーン、高水耐性サンスクリーン、及びシリコン中水サンスクリーンから選択される、請求項１３２のパーソナルケア組成物。
前記パーソナルケア組成物が育毛を促進する、請求項１２５のパーソナルケア組成物。
固体の育毛を促進する方法であって、
ａ）請求項７８、８０、８１、及び１２１乃至１２４のいずれか１項のパーソナルケア組成物を提供する工程、
ｂ）処理されるべき個体を提供する工程、及び
ｃ）育毛を望む固体の領域に前記組成物を適用する工程、を含む方法。
前記育毛が促進される毛が顔の毛、脇の毛、脚の毛、胴体の毛、腕の毛、及び頭の毛から選択される、請求項１３５の方法。
前記固体が脱毛を含む病気を患っている、請求項７７の方法。
前記症状が炎症性脱毛症、萎縮性脱毛症、刺咬部、扁平苔癬、乾癬、紅斑性狼瘡、脂漏性皮膚炎、脱毛症、血色素症、アンドロゲン性脱毛症、円形脱毛症から選択される、請求項１３５の方法。
前記パーソナルケア組成物がＳＥＱＩＤＮＯＳ：４４３、４４５、及び４４７から選択される修飾された変異ＴＧＦ−ＢＢＰＩを含む、請求項１３５の方法。
皮膚病を患っている固体の皮膚の外観及び／又は状態を改善する方法であって、
ａ）請求項７８、８０、８１、及び１２１乃至１２４のいずれか１項のパーソナルケア組成物を提供する工程、
ｂ）固体を提供する工程、及び
ｃ）固体の皮膚に前記組成物を提供する工程、を含む、方法。
前記皮膚病が乾癬、強皮症、及び皮膚癌から選択される、選択される１４０の方法。
前記パーソナルケア組成物がＳＥＱＩＤＮＯＳ：４４３、４４５、及び４４７から選択される修飾された変異ＴＧＦ−ＢＢＰＩから選択されるＴＧＦ−ＢＢＰＩを含む、選択される１４０の方法。
前記変異ペプチドがＳＥＱＩＤＮＯＳ：４７４、４７５、及び４７６から選択されるＴＮＦ変異ペプチドである、請求項７２乃至７４のパーソナルケア組成物。
前記骨格がＳＥＱＩＤＮＯ：１８７のＢＢＩｔ−ＡＶである、請求項１４３のパーソナルケア組成物。
前記修飾された変異ＢＢＰＩが１３Ｉ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｋ−２９Ｐ−５２Ｋ、１３Ｉ−２９Ｐ−４０Ｋ−５０Ｔ−５２Ａ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｒ−２７Ａ−２９Ｐ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｋ−５２Ｔ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ａ−２９Ｒ−３１Ｅ−４０Ｋ−５０Ｑ−５２Ｑ、１３Ｉ−２５Ｋ−２７Ａ−２９Ｒ−３１Ａ−４０Ｈ−５０Ｒ−５２Ｌから選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含む、請求項１４３又は１４４のいずれかに記載のパーソナルケア組成物。
前記修飾された変異ＢＢＰＩがＳＥＱＩＤＮＯＳ：６３７、６３８、及び６３９から選択されるＴＮＦ−ＢＢＰＩである、請求項７２、８０、及び８１のいずれか１項に記載のパーソナルケア組成物。
前記パーソナルケア組成物がヘアケア組成物である、請求項７９乃至８１及び１４２乃至１４６のいずれか１項に記載のパーソナルケア組成物。
前記パーソナルケア組成物が乾癬を患っている固体における育毛を促進する、請求項１４７の組成物。
前記ヘアケア組成物がシャンプー、コンディショナー、ヘアスタイリング組成物、染毛剤、パーマネントウェーブ製剤、クリーム、ゲル、ムース、スプレー、乳液、コロイド懸濁液、液体、泡、及び固形物からなる群より選択される、請求項１４７のヘアケア組成物。
前記ヘアケア組成物が放射線保護剤を更に含む、請求項１４９のヘアケア組成物。
前記放射線保護剤が非水耐性サンスクリーン、高水耐性サンスクリーン、及びシリコン中水サンスクリーンから選択される、請求項１５０のヘアケア組成物。
前記パーソナルケア組成物が育毛を促進することができる、請求項１４７のパーソナルケア組成物。
前記パーソナルケア組成物がスキンケア組成物である、請求項７９乃至８１及び１４２乃至１４６いずれか１項に記載のパーソナルケア組成物。
前記スキンケア組成物が乾癬又は強皮症を患っている固体の皮膚の外観及び／又は状態を改善することができる、請求項１５３のパーソナルケア組成物。
前記パーソナルケア組成物がスキンクリーム、ローション、スプレー、乳液、コロイド懸濁液、泡、エアロゾル、液体、ゲル、美容液、及び固形物から選択されるスキンケア組成物である、請求項１５３のパーソナルケア組成物。
前記パーソナルケア組成物が、保湿性ボディーウォッシュ、ボディーウォッシュ、抗菌クレンザー、スキンプロテクトクリーム、ボディーローション、顔用クリーム、保湿性クリーム、保湿性クレンジング乳液、フェイシャルゲル、保湿性美容液、界面活性剤ベース顔用クレンザー、顔用ピーリングゲル、ニキビ予防トリートメント、顔用トナー、ピーリングゲル、顔用マスク、アフターシェーブローション、プレシェーブローバーム、タンニング組成物、サンスクリーン、フケ予防剤、育毛抑制剤、及び放射線保護剤から選択される、スキンケア組成物である、請求項１５３のパーソナルケア組成物。
前記スキンケア組成物が局所的に適用される市販製剤、抗菌トリートメント、ニキビ予防トリートメント、スキン保護剤、サンスクリーン、デオドラント、及び抑汗剤を更に含む、請求項１５５の組成物。
前記パーソナルケア組成物が化粧組成物である、請求項７９乃至８１及び１４２乃至１４６の組成物。
前記化粧組成物がマスカラ、アイライナー、圧縮パウダー製剤、及びファンデーションから選択される、請求項１５８の組成物。
前記化粧組成物が少なくとも１つの顔料を含む、請求項１５９の組成物。
前記少なくとも１つの顔料を含む組成物が非ウォータープルーフマスカラ、ウォータープルーフマスカラ、ボリューミングマスカラ、レングシングマスカラ、カーリングマスカラ、無水ウォータープルーフマスカラ、水ベースマスカラ、及びアイラッシュ又はアイブロウトリートメントから選択されるマスカラである、請求項１５８又は１５９のいずれかに記載の組成物。
前記化粧組成物が、ルースパウダー、頬紅、アイシャドー、及びブロンジングパウダーから選択される、圧縮パウダー製剤である、請求項１６０の組成物。
前記化粧組成物が油中水ファンデーション、シリコン中水ファンデーション、水中油ファンデーション、無水メイクアップスティック、及びクリーム乃至パウダーファンデーションから選択されるファンデーションである、請求項１６０の組成物。
乾癬を患っている固体の育毛を促進する方法であって、
ａ）請求項７９乃至８１及び１４２乃至１４６のパーソナルケア組成物を提供する工程、
ｂ）処理されるべき個体を提供する工程、及び
ｃ）育毛が望まれる固体の領域に前記組成物を適用する工程を含む、方法。
育毛が促進される毛が、顔の毛、腋の下の毛、脚の毛、胴体の毛、腕の毛、及び頭の毛から選択される、選択される１６４の方法。
前記パーソナルケア組成物がＳＥＱＩＤＮＯＳ：６３７、６３８、及び６３９から選択される修飾されたＴＮＦ−ＢＢＰＩである、請求項１６４の方法。
乾癬を患っている固体の皮膚の外観及び／又は状態を改善する方法であって、
ａ）請求項７９乃至８１及び１４２乃至１４６のいずれか１項に記載のパーソナルケア組成物を提供する工程、
ｂ）固体を提供する工程、及び
ｃ）固体の皮膚に前記組成物を提供する工程を含む方法。
前記パーソナルケア組成物がＳＥＱＩＤＮＯＳ：６３７、６３８、及び６３９から選択される修飾されたＴＮＦ−ＢＢＰＩを含む、選択される１６７の方法。