CN102770147A - 从大豆工艺流中分离的纯化的库尼兹胰蛋白酶抑制剂蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明公开了从工艺流中回收并具有至少约95重量％的总KTI蛋白浓度的新型库尼兹胰蛋白酶抑制剂(KTI)亚型，以及从工艺流中回收和分离纯化的KTI亚型的方法。

Description

从大豆工艺流中分离的纯化的库尼兹胰蛋白酶抑制剂蛋白

相关申请的交叉引用

本专利申请要求提交于2009年12月30日的美国临时申请序列61/291,312的优先权，该临时申请全文以引用方式并入本文。

发明领域

本公开提供了从大豆工艺流中分离和回收并具有至少约95重量％的总KTI蛋白浓度的新型库尼兹(Kunitz)胰蛋白酶抑制剂(KTI)亚型。

发明背景

抑制蛋白分解酶类的蛋白经常以高浓度存在于很多种子和其它的植物贮藏器官中。抑制剂蛋白还存在于几乎全部的动物组织和体液中。由于这些蛋白结合并抑制来自动物和微生物的蛋白分解酶类的能力，多年来它们已成为大量研究的对象。在医学和生物学中，抑制剂已成为蛋白水解研究的有用工具。由于蛋白酶抑制剂在控制涉及一些疾病如胰腺炎、休克和肺气肿的蛋白酶方面，以及作为用于调节哺乳动物受精作用的剂方面的治疗潜力，它们是尤其受关注的。

包含显著量的蛋白酶抑制剂的大豆工艺流。蛋白酶抑制剂已知至少抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶以及可能抑制调控一些关键代谢功能的多种其它关键跨膜蛋白酶。蛋白酶的局部给药对于例如特应性皮炎的病症是有用的，特应性皮炎是皮肤炎症的一种普通形式，其可以局限于少数区块或者涉及身体的大部分。蛋白酶抑制剂的褪色活性和它们防止紫外线导致的色素沉着的能力在体外和体内均已被证明(参见，例如，Paine等人，J.Invest.Dermatol.，116：587-595[2001])。蛋白酶抑制剂还被报道有利于创伤愈合。例如，分泌性白细胞蛋白酶抑制剂被证明当被局部施用时逆转了组织的破坏并加速了创伤愈合过程。此外，丝氨酸蛋白酶抑制剂还能够有助于在红斑狼疮病人中降低疼痛(参见，例如，美国专利6,537,968)。

天然存在的蛋白酶抑制剂可见于多种食物中，例如粮谷类(燕麦、大麦和玉米)、芽甘蓝、洋葱、甜菜根、小麦、龙爪稷和花生。所关注的一个来源是大豆。

从大豆和其它豆类中已鉴定了两大类的蛋白酶抑制剂超家族，每一类具有多种同工抑制剂。库尼兹胰蛋白酶抑制剂(KTI)是第一类的重要成员，第一类的成员具有大约170-200个氨基酸、介于20-25kDa之间的分子量，并且主要针对胰蛋白酶。库尼兹胰蛋白酶抑制剂通常是具有以两个二硫键连接的4个半胱氨酸、并且具有一个位于由二硫键限定的环中的反应性位点的单链多肽。第二类的抑制剂包含60-85个氨基酸，具有6-10kDa范围的分子量，相对地热稳定，并且在独立的结合位点抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。Bowman-Birk抑制剂(BBI)是这一类的一个实例。大豆中存在的蛋白酶抑制剂的平均水平，对于KTI和BBI最重要的蛋白酶抑制剂而言分别是约1.4％和0.6％。要注意的是，这些低水平使得分离天然的蛋白酶抑制剂用于临床用途是不现实的。

现有技术尚未描述从大豆蛋白来源获得的、不使用酸或醇萃取或者丙酮沉淀的、具有高纯度水平的KTI产品。本领域公开的用于分离KTI产品的方法已被描述于下列的特定参考文献中，但没有导致高纯度KTI产品的分离。J.Agric.Food Chem.39(5)：862-866(1991)；Protein Expressionand Purification 30：167-170(2003)；J.Agric.Food Chem.57(15)：7022-7029(2009)；FEBS Letters 294(1，2)：141-143(1991)；Journal ofFood Science，54(3)：606-617(1989)；Journal of Agriculture and FoodChemistry，49(3)：1069-1086(2001)；Journal of Agriculture and FoodChemistry，35(2)：205-209(1987)；Yamamoto，M.和Ikenaka，T.，Studies on Soybean Trypsin Inhibitors.I.Purification and Characterization of TwoSoybean Trypsin Inhibitors.J.Biochem.(Tokyo)，62(2)，141-149(1967)；Birk，Y.，The Bowman-Birk inhibitor：trypsin-and chymotrypsin-inhibitor from soybeans，Int.J.Peptide Protein Res.，25(2).113-131(1985)；Hwang，D.，Davis Lin，K.T.，Yang，W.，Foard，D.，Purification，Partial Characterization，and Immunological Relationships ofMultiple Low Molecular Weight Protease Inhibitors of Soybean，Biochimica etBiophysica Acta，495，369-382(1977)；Frattali，V.，Soybean Inhibitors-III.Properties of a low molecular weight soybean proteinase inhibitor，Journal ofBiological Chemistry，244(2)，274-280(1969)；Kassell，B.，Trypsinand Chymotrypsin Inhibitors from Soybean，Methods in Enzymology，66(c)，853(1970)；Birk，Y.，Proteinase Inhibitors from Legume Seeds，Methods in Enzymology，57，697；和Birk，Y.，Trypsin and ChymotrypsinInhibitors from Soybeans，Methods in Enzymology，58，700。因此，存在对适用于高纯度蛋白酶抑制剂和变体(具体而言，KTI)的生产的方法和组合物的需求。

相应地，本发明描述了通过本文所公开的方法以高纯度形式被回收的KTI蛋白的新型亚型。

发明概述

本发明一般而言提供了从大豆工艺流(包括大豆乳清流和大豆糖浆流)中分离和回收并表现出某些所期望的特性的新型库尼兹胰蛋白酶抑制剂(KTI)产品。更具体地讲，本发明涉及KTI蛋白的新型亚型，其具有以总KTI蛋白浓度表示的至少约95重量％纯度。所述方法涉及通过一系列的顺序分离操作浓缩大豆工艺流，以从大豆乳清中移除其它组分，产生适合作为基料用于回收KTI蛋白的纯化的部分。如本文其它地方所详述的，本发明描述的方法包括被设计用于回收水性大豆乳清的多种组分的一种或多种膜分离(过滤)操作或层析分离操作。大豆工艺流的多种组分的移除通常包括在其组分的移除之前和/或过程中浓缩所述大豆工艺流。

通常纯化的部分通过从大豆工艺流中移除一种或多种杂质(例如，微生物或矿物)、一种或多种大豆贮藏蛋白(例如，大豆球蛋白和β-伴球蛋白)、一种或多种大豆乳清蛋白、和/或一种或多种糖类制备。通过稀释除去使纯度降低的所述工艺流的其它主要组分(例如，贮藏蛋白、矿物、脂质、微生物和糖类)，同时同样地通过纯化蛋白馏分提高总KTI蛋白浓度，改进了高纯度的KTI蛋白的回收，其中所述纯化蛋白馏分通过除去作为所述蛋白的拮抗物和/或具有有害效应的组分(例如，内毒素)进行。具体而言，本公开提供了导致KTI产品的分离和移除的方法，所述KTI产品具有以总KTI蛋白浓度表示的至少约95重量％纯度。

本发明的方法包括首先将大豆工艺流引入过滤进料区域，与分离膜的一侧接触；使流体通过上述膜，以在过滤进料区域产生包含至少一种大豆贮藏蛋白和至少一种大豆乳清蛋白的第一保留物，以及在透过区域产生包含一种或多种糖类和一种或多种矿物的第一透过物；将所述第一保留物或其部分引入第二过滤进料区域，与第二分离膜的一侧接触；使流体通过所述第二膜，以在第二过滤进料区域产生包含一种或多种大豆贮藏蛋白的第二保留物，以及在第二透过区域产生包含水、一种或多种大豆乳清蛋白和糖类的第二透过物；将蛋白浓缩的大豆工艺流引入在其中包含离子交换树脂的离子交换单元；分离大豆乳清流以提供用于离子交换的多种进料部分；将上述多种进料部分引入离子交换区域；使上述多种进料部分的每一种与离子交换树脂接触，以通过与离子交换树脂的亲和移除KTI产品；以及，使离子交换树脂与洗脱介质接触，以从离子交换树脂移出KTI产品，从而形成洗脱的KTI蛋白馏分。

所得本发明的纯化的KTI产品由具有与SEQ ID NO：1至少90％相同的氨基酸序列的多肽组成；并且进一步地，其具有以总KTI蛋白浓度表示的至少约95重量％的KTI纯度。以总KTI蛋白浓度表示的至少约95重量％的KTI纯度意指本发明的KTI产品由至少约95重量％的KTI蛋白组成，而本发明的KTI产品的其余10重量％由杂质组成。杂质可以包括其它蛋白(例如贮藏蛋白或酸可溶的蛋白，依赖于大豆乳清蛋白的来源)、脂质、微生物、矿物和糖类。此外，纯化的KTI产品还表现出(i)基于干重，至少约95％的总蛋白浓度；(ii)至少约1500胰蛋白酶抑制单位/克蛋白的胰蛋白酶抑制剂活性；和/或，(iii)不超过约0.5内毒素单位(EU)/克蛋白的总内毒素含量。通过本发明的方法分离的KTI产品的量可以是低至克级(实验室规模的分离)或可以是若干公吨(工业或大规模分离)。

在另一方面，包含本发明的KTI蛋白的KTI产品导致一种或多种内毒素，其中总内毒素含量是约0.1EU/克蛋白至约5.0EU/克蛋白、约0.1EU/克蛋白至约2.5EU/克蛋白、约0.1EU/克蛋白至约1.5EU/克蛋白、约0.1EU/克蛋白至约1.0EU/克蛋白、或约0.1EU/克蛋白至约0.5EU/克蛋白。

本公开涉及此前未达到的纯度水平的KTI产品，所述产品是从大豆工艺流中回收的。这些分离的蛋白最终适合用于多种药物用途和个人护理产品。因此，除高于常规的KTI分离和纯化的经济有益效果之外，本公开的方法还基于通过本方法提供的KTI产品的性质表现出在本领域中的改进。尽管本文所公开的步骤的顺序提供了本发明的一个特定实施方案，应当指出的是，本文所公开的步骤可以任何顺序被实行。

附图简述

图1A是描述用于从工艺流中回收纯化的大豆乳清蛋白的方法中的步骤0至4的流程示意图。

图1B是描述用于从工艺流中回收纯化的大豆乳清蛋白的方法中的步骤5、6、14、15、16和17的流程示意图。

图1C是描述用于从工艺流中回收纯化的大豆乳清蛋白的方法中的步骤7至13的流程示意图。

图1D是描述用于从含水的大豆乳清流中回收富集的KTI产品的方法的流程示意图。

图2描述对KTI的Poros HS50离子交换馏分的十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。

图3描述对富集的KTI馏分的SDS-PAGE分析。

图4描述对HiTrap DEAE FF离子交换馏分的SDS-PAGE分析。

图5描述提交给LC-MS/MS分析的KTI条带。

图6描述对Mimo6HE馏分的SDS-PAGE分析。

优选方面的详述

本文描述了从大豆工艺流中分离的新型KTI亚型，该亚型被发现表现出所期望的特性，包括此前未达到的水平的纯度。本文进一步描述了用于从在大豆蛋白分离物的制造中产生的多种豆科植物工艺流(包括大豆乳清流和大豆糖浆流)回收所述新型KTI亚型和其它产品的新型方法。例如，本公开的方法包括一种或多种被选择或设计用于提供所述KTI蛋白的回收的分离技术或方法(即，层析分离或膜分离)。KTI蛋白和大豆乳清流的一种或多种其它组分(例如，多种糖类，包括低聚糖)的分离可以利用多种分离技术(例如，膜、层析、沉淀、离心、或过滤)。具体的分离技术将取决于有待通过将其与所述工艺流的其它组分分离而被回收的所期望的组分。

例如，纯化的KTI馏分通常通过下列步骤制备：首先移除一种或多种杂质(例如，微生物或矿物)，然后移除包括一种或多种大豆贮藏蛋白(即，大豆球蛋白和β-伴球蛋白)的附加的杂质，然后移除一种或多种大豆乳清蛋白(包括，例如，BBI和其它非KTI的蛋白或钛)，和/或然后从大豆乳清中移除包括糖类的一种或多种附加的杂质。通过稀释除去使纯度降低的所述乳清流的其它主要组分(例如，贮藏蛋白、矿物和糖类)，同时同样地通过纯化蛋白馏分提高纯度，改进了高纯度形式的KTI蛋白的回收，其中所述纯化蛋白馏分通过除去作为所述蛋白的拮抗物和/或具有有害效应的组分(例如，内毒素)进行。大豆乳清的多种组分的移除通常包括在所述大豆乳清的组分的移除之前和/或过程中对所述大豆乳清的纯化。本文所公开的方法还将降低从大量含水废物的处理产生的污染。

贮藏蛋白、糖类、矿物和其它杂志的移除产生富集了所期望的KTI蛋白，并且不含可能是拮抗剂或毒素或者可能在其它方面具有有毒效应的杂质的馏分。例如，大豆贮藏蛋白富集的馏分通常可以与富集了一种或多种大豆乳清蛋白的馏分一起被回收。富集了一种或多种糖类(例如，低聚糖和/或多糖)的馏分也通常被制备。因此，本方法提供适合作为用于回收KTI蛋白的基料的馏分，并且还提供能够被用于从含水的大豆乳清中回收其它有用产品的其它馏分。例如，糖类和/或矿物从大豆乳清流中的移除产生了有用的馏分，糖类能够从其中被进一步分离，从而产生附加的有用的馏分：浓缩的糖和矿物馏分(可以包括柠檬酸)，以及可以最低限度的处理(如果存在的话)被处置或作为工艺用水被回收的相对纯的含水馏分。如此产生的工艺用水在本方法的实施中可以是尤其有用的。因此，本方法的进一步的优点可以是与常规的分离制备方法相比降低的工艺用水需求。

本公开的方法以至少两种方式提供了高于制造大豆蛋白分离物和浓缩物的常规方法的优点。如所指出的，制造大豆蛋白材料的常规方法通常处理大豆乳清流(例如，含水的大豆乳清或大豆糖浆)。因此，通过本公开的方法回收的产品代表了附加的产品和目前在与常规的大豆蛋白分离物和大豆蛋白浓缩物制造的关联中未实现的收益来源。此外，对大豆乳清流或大豆糖浆进行的用于回收可出售的产品的处理，可取地降低了与对大豆乳清流或大豆糖浆的处理或处置相关的成本。例如，如本文中其它地方所详述的，本发明的多种方法提供了相对纯的工艺流，所述工艺流可以在多种其它方法中被容易地利用或者以最低限度的处理(如果存在的话)被处置，从而降低所述方法对环境的影响。某些成本与本公开的方法相关联地存在，但所分离的附加的产品和废物处理的最小化的益处据信弥补了任何增加的成本。

A.酸可溶的蛋白

大豆蛋白分离物通常在大豆贮藏蛋白的等电点(例如，约4.5的pH)从脱脂大豆粕或大豆粉的水提物中沉淀。因此，大豆蛋白分离物一般包括在酸性液体介质中不可溶的蛋白。类似地，大豆蛋白浓缩物(第二精纯的大豆蛋白材料)的蛋白同样在酸性液体介质中是不可溶的。然而，通过本公开的方法回收的大豆乳清蛋白一般是酸可溶的，意味着它们在酸性液体介质中是可溶的。

例如，本公开提供了来源于含水大豆乳清，并且在环境条件(例如，约25℃的温度)下表现出跨越相对宽范围pH的含水(通常为酸性的)介质(例如，具有约2至约10、约2至约7、或约2至约6的pH的含水介质)中的优越溶解度的大豆蛋白组合物。通常所述大豆蛋白组合物的溶解度为至少约10克每升(g/L)，更典型至少约15g/L，以及更典型至少约20g/L。应当了解，提及跨越pH范围的溶解度时(包括在所附权利要求中)是指所指定的溶解度是在落在所指定的pH范围内的任何和全部的pH值达到的。例如，提及在约2至约10的pH范围至少约10g/L的溶解度表示所指定的溶解度是在3、4、5、6等pH达到的。

通过本公开的方法回收的酸可溶的大豆蛋白代表着本领域中的显著改进。如本文所指出的，所述酸可溶的蛋白是从通常被丢弃的大豆乳清流中回收的。

B.库尼兹胰蛋白酶抑制剂

如本文所论及的，大豆工艺流(包括，例如，大豆乳清流和大豆糖浆流)包含库尼兹胰蛋白酶抑制剂(KTI)蛋白。这种蛋白酶抑制剂已知至少抑制胰蛋白酶，并且可能抑制调节一些关键代谢功能的多种其它关键蛋白酶。

根据本发明的实施方案分离的KTI蛋白可以包含多肽，所述多肽具有与SEQ ID NO：1至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、或甚至100％相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述KTI蛋白可以包含与SEQ ID NO：1至少70％相同、更优选与SEQ ID NO：1至少80％相同、甚至更优选与SEQ ID NO：1至少90％相同、最优选与SEQID NO：1至少95％相同的氨基酸序列。

在本实施方案的另一方面，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：1至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、或甚至100％相同。

在本发明的某些方面，两种氨基酸序列之间的序列同一性通过比较所述氨基酸序列确定。在本发明的其它方面，序列同一性能够通过比较氨基酸序列与其保守的氨基酸取代物而确定。在本发明的某些方面，本发明的蛋白能够具有一个或多个保守取代。在本发明的其它方面，本发明的蛋白能够具有一个或多个非保守取代。

天然存在的氨基酸包括，例如，丙氨酸(A)、精氨酸(R)、天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C)、谷氨酸(E)、谷氨酰胺(Q)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、赖氨酸(K)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)和缬氨酸(V)。

保守的和非保守的氨基酸取代是本领域的普通技术人员已知的，例如，酸性氨基酸对另一种酸性氨基酸的取代可以被认为是保守取代而碱性氨基酸对酸性氨基酸的取代可以被认为是非保守取代；类似地，极性氨基酸对另一种极性氨基酸的取代可以被认为是保守取代而非极性氨基酸对极性氨基酸的取代可以被认为是非保守取代。氨基酸一般被分为下列类别(这能够被用作指导，用于确定取代是保守的还是非保守的)：(1)极性的/亲水性的：N、Q、S、T、K、R、H、D、E、C和Y；(2)非极性的/疏水性的：G、A、L、V、I、P、F、W和M；(3)酸性的：D、E和C；(4)碱性的：K、R和H；(5)芳香族的：F、W、Y和H；和(6)脂族的：G、A、L、V、I和P。

在本发明的某些方面，其中一种或多种氨基酸序列与SEQ ID NO：1不相同，这样的一种或多种氨基酸序列也具有KTI蛋白的功能，KTI蛋白已知抑制胰蛋白酶活性。用于确定这些功能的方法描述于本文中，并且是本领域的普通技术人员已知的。

在本发明的其它方面，其中组合物包含与SEQ ID NO：1不相同的一种或多种氨基酸序列，这样的一种或多种氨基酸序列也具有KTI蛋白的功能，KTI蛋白已知抑制胰蛋白酶。用于确定这些功能的方法描述于本文中，并且是本领域的普通技术人员已知的。

KTI蛋白由170个至200个氨基酸残基和大约两个二硫键组成。KTI蛋白的一级结构自1973年起即是已知的(参见Koide，T.和Ikenaka，T.，Studies on Soybean Trypsin Inhibitors.3.Amino-Acid Sequence of the Carboxyl-Terminal Region and the Complete Amino-Acid Sequence of Soybean TrypsinInhibitor，Eur.J.Biochem.32，417，1973)。

本公开的KTI产品的纯度代表着与其它KTI产品相比此前尚未达到的纯度水平。KTI馏分的纯度是总KTI蛋白浓度、比活性(如以胰蛋白酶抑制剂单位/克蛋白测量的)和具有KTI拮抗剂功能的组分、毒素、或在单纯的对每单位数量的KTI的功效的稀释之外还具有有毒效应的其它组分的不存在的函数。一般而言，本公开的KTI产品的总KTI蛋白浓度是至少约70重量％，或至少约80重量％。通常，本公开的KTI产品的总KTI蛋白浓度是至少约90重量％，优选至少约95重量％，更优选至少约99重量％。

“纯的”单体蛋白在单向或双向SDS-PAGE凝胶上电泳之后将产生单一条带，将作为单独的对称吸收峰从凝胶过滤、高效液相色谱(HPLC)、或离子交换柱上洗脱，将产生单独的一组质谱、核磁共振(NMR)、或W吸收光谱信号，并且在适当的情况下将没有对酶活性的污染。由于绝对的纯度不能被确定，简单的纯度标准被常规地使用，即，在SDS-PAGE之后不能检测到多于一个的蛋白条带。(参见Mohan，Determination of purity andyield.Methods in Molecular Biology，11，307-323(1992))。图3描述了单向凝胶电泳之后的本发明的KTI蛋白。如图3所示，本发明的KTI蛋白显示为对应于21kDa分子量标准的单一条带并且具有不同的等电点。

KTI馏分的纯度是总KTI蛋白浓度、比活性(如以胰蛋白酶抑制剂单位/克蛋白测量的)和具有KTI拮抗剂功能的组分、毒素、或在单纯的对每单位数量的KTI的功效的稀释之外还具有有毒效应的其它组分的不存在的函数。一般而言，本公开的KTI产品的总KTI蛋白浓度是至少约70重量％，或至少约80重量％。通常，本公开的KTI产品的总KTI蛋白浓度是至少约90重量％，优选至少约95重量％，更优选至少约99重量％。

除KTI纯度之外，本公开的KTI产品的总蛋白含量也是有利的和/或代表了本领域的改进。本公开的产品的KTI蛋白含量可以通过本领域已知的常规方法测定，包括，例如，描述于Ohnishi，S.T.和Barr，J.K.，Asimplified method of quantitating proteins using the biuret and phenol reagents.Anal.Biochem.，86，193(1978)中的Lowry方法。一般而言，本公开的KTI产品的总蛋白含量为至少约60重量％(基于干重)、至少约70重量％，至少约80重量％，或至少约85重量％。通常，本公开的KTI产品的总蛋白含量是至少约95重量％，优选至少约98重量％，更优选至少约99重量％。

KTI蛋白已知仅抑制胰蛋白酶，而包含蛋白的组合物的其它组分(例如BBI蛋白)已知既抑制胰蛋白酶又抑制胰凝乳蛋白酶。因此，在本公开的抑制胰蛋白酶的准备中，胰凝乳蛋白酶抑制剂活性的不存在指示了KTI蛋白的存在。

类似地，本公开的KTI产品的胰蛋白酶抑制剂活性(按照胰蛋白酶抑制剂单位/克蛋白，或TIU/克蛋白表达)可以通过本领域已知的常规方法测定，包括，例如，在其中一个TIU被定义为能够抑制1mg的胰蛋白酶的底物的量，而一个胰蛋白酶单位等于在pH 8.2和37℃以N-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯胺(BAPA硝基苯胺)作为底物每10分钟0.019的ΔA410。一般而言，本公开的KTI产品的胰蛋白酶抑制剂活性为至少约300TIU/克蛋白，典型为至少约500TIU/克蛋白，更典型为至少约950TIU/克蛋白，甚至更典型为至少约1500TIU/克蛋白。

KTI产品目前据信适合的多种应用要求相对低的内毒素含量。例如，多种治疗应用要求KTI产品满足药品等级材料适用的规章。因此，在多个优选的方面，所述KTI产品的总内毒素含量为优选不超过约1.5EU/克蛋白，更优选不超过约1EU/克蛋白，更优选不超过约0.5EU/克蛋白，以及甚至更优选不超过约0.25EU/克蛋白。例如，根据多个此类方面，所述KTI产品的总内毒素含量典型为约0.1EU/克蛋白至约1.5EU/克蛋白，更典型为约0.1EU/克蛋白至约1.0EU/克蛋白，和更典型为约0.1EU/克蛋白至约0.5EU/克蛋白(例如，约0.1EU/克蛋白至约0.25EU/克蛋白)。附加地或者作为另外一种选择，本公开的KTI产品的总内毒素含量为不超过约5.0内毒素单位每克蛋白(EU/克蛋白)，或不超过约2.5EU/克蛋白。例如，在多个方面，总内毒素含量为约0.1EU/克蛋白至约5.0EU/克蛋白，或约0.1EU/克蛋白至约2.5EU/克蛋白。

应当了解，本公开的KTI产品可以表现出以上指定的特征中的一种、组合、或全部。例如，本公开的KTI产品可以表现出所指定的KTI纯度和总蛋白含量。KTI产品也可以表现出所指定的KTI纯度、胰蛋白酶抑制剂活性和本文所公开的序列。以另一个实例的方式，所述KTI产品可以表现出所指定的KTI蛋白浓度和总内毒素含量。在这些以及另外的方面，本公开的KTI产品可以表现出所指定的总大豆蛋白浓度和胰蛋白酶抑制剂活性。以另一个实例的方式，本公开的KTI产品可以表现出所指定的总大豆蛋白浓度和总内毒素含量。所述KTI产品的特性的这些组合是示例性的，并且这一列举并不旨在是详尽的。也就是说，根据本公开，KTI产品可以任何以上所指定范围内的任何以上所指定的值，表现出以上提及的特性的任何组合。

本发明的KTI产品能够从任何来源或者允许从天然的基于植物的基质离析、分离、或纯化KTI的任何方法获得。以非限制性实例的方式，天然的基于植物的基质能够来源于豆科(包括如大豆)、玉米、豌豆、卡诺拉、向日葵、高粱、稻、苋属植物、马铃薯、木薯、竹芋、美人蕉、羽扇豆、油菜、小麦、燕麦、裸麦、大麦、花生、洋刀豆、薏苡、豌豆家族豆类、巴鲁、鹊豆、矛豆荚(例如，雨豆树种子)、苜蓿、蜗牛苜蓿种子、利马豆、牛油豆、芸豆、矮菜豆、甘蔗、小米、成材木、菠菜、chapule、纤毛虫、甜点香蕉、兵豆、麸、蚕豆或胡豆、绿豆、赤豆、豇豆、麻风树、绿藻、以及它们的组合。在本发明的特定方面，KTI是在多种工艺流中从大豆获得的。多种大豆工艺流包括，例如，含水的大豆提取物流(其是大豆流的蛋白组分在其中为可溶性形式的任何流。例如来自脱脂大豆材料)、含水的豆浆提取物流(其是大豆流的蛋白组分在其中为可溶性形式的来自全部或部分脱脂的大豆材料的任何流)、含水的大豆乳清流(其是由贮藏蛋白的沉淀或盐析得到的任何乳清流；沉淀方法能够包括高温以及化学方法)、含水的大豆糖浆流(其是通过从含水的大豆乳清流中移除水产生的任何流)、含水的大豆蛋白浓缩物大豆糖浆流(其是来自对来自大豆蛋白浓缩方法的可溶性糖的醇提取物的任何流)、含水的大豆透过流(其是由不同分子量的蛋白馏分的分离得到的任何流，所述分离中较小分子量的蛋白通过膜)和含水的豆腐乳清流(其包括来源于豆腐凝结过程的任何乳清流。通过本发明的方法分离的KTI产品的量可以是低至克级(实验室规模的分离)或可以是若干公吨(工业或大规模分离)。

C.含水的乳清流

含水的乳清流和糖浆流是大豆工艺流的类型，它们是从精炼完整豆类或油料种子的方法产生的。完整的豆类或油料种子可以来源于多种适合的植物。以非限制性实例的方式，适合的植物包括豆科植物(包括如大豆)、玉米、豌豆、卡诺拉、向日葵、高粱、稻、苋属植物、马铃薯、木薯、竹芋、美人蕉、羽扇豆、油菜、小麦、燕麦、裸麦、大麦、花生、洋刀豆、薏苡、豌豆家族豆类、巴鲁、鹊豆、矛豆荚(例如，雨豆树种子)、苜蓿、蜗牛苜蓿种子、利马豆、牛油豆、芸豆、矮菜豆、甘蔗、小米、成材木、菠菜、chapule、纤毛虫、甜点香蕉、兵豆、麸、蚕豆或胡豆、绿豆、赤豆、豇豆、麻风树、绿藻、以及它们的组合。在一个实施方案中，所述豆科植物是大豆，并且从精炼大豆的方法产生的含水的乳清流是含水的大豆乳清流。

在大豆蛋白分离物的制造中产生的含水的大豆乳清流一般是相对被稀释的并且通常作为废物被丢弃。更具体地讲，所述含水的大豆乳清流具有典型小于约10重量％，典型小于约7.5重量％，以及更典型小于约5重量％的总固体含量。例如，在多个方面，所述含水的大豆乳清流的固体含量为约0.5重量％至约10重量％，约1重量％至约4重量％，或约1重量％至约3重量％(例如，约2重量％)。因此，在商业化的大豆蛋白分离物生产过程中，产生了必须被处理或处置的显著体积的废水。

大豆乳清流通常包含大部分起始大豆材料的初始大豆蛋白含量。如本文所用，术语“大豆蛋白”一般是指来源于大豆的任何和全部的蛋白。天然存在的大豆蛋白一般是具有被亲水外壳围绕的疏水核心的球状蛋白。大量的大豆蛋白已被鉴定，包括，例如，贮藏蛋白如大豆球蛋白和β-伴球蛋白。大豆蛋白同样包括蛋白酶抑制剂，如以上提及的KTI蛋白。大豆蛋白也包括血球凝集素如凝集素、脂氧合酶、β-淀粉酶和露那辛。值得注意的是，大豆植物可以被转化，以产生通常不被大豆植物表达的其它蛋白。应当了解，本文提及“大豆蛋白”时同样设想了如此产生的蛋白。

基于干重，大豆蛋白占大豆乳清流的至少约10重量％，至少约15重量％，或至少约20重量％(基于干重)。通常，大豆蛋白占大豆乳清流的约10重量％至约40重量％，或约20重量％至约30重量％(基于干重)。大豆蛋白分离物通常包含大部分大豆的贮藏蛋白。然而，在分离物沉淀之后剩余的大豆乳清流同样包含一种或多种大豆贮藏蛋白。

除多种大豆蛋白之外，含水的大豆乳清流还同样包含一种或多种碳水化合物(即糖类)。一般而言，糖类按大豆乳清流的重量计(基于干重)占至少约25％，至少约35％，或至少约45％。通常，糖类按大豆乳清流的重量计(基于干重)占约25％至约75％，更典型占约35％至约65％，更典型占约40％至约60％。

大豆乳清流的糖类一般包括一种或多种单糖、和/或一种或多种低聚糖或多糖。例如，在多个方面，所述大豆乳清流包含选自葡萄糖、果糖、以及它们的组合的单糖。通常，单糖占大豆乳清流的约0.5％至约10重量％，更典型约1％至约5重量％(基于干重)。进一步根据这些以及多个其它方面，所述大豆乳清流包含选自蔗糖、棉子糖、水苏糖、以及它们的组合的低聚糖。通常，低聚糖按大豆乳清流的重量计(基于干重)占约30％至约60％，更典型约40％至约50％。

含水的大豆乳清流还通常包含包括多种组分的灰分，所述组分包括，例如，多种矿物、植酸、柠檬酸和维生素。通常存在于大豆乳清流中的矿物包括钠、钾、钙、磷、镁、氯、铁、锰、锌、铜、以及它们的组合。存在于大豆乳清流中的维生素包括，例如，硫胺素和核黄素。无论其确切的组成如何，灰分按重量计典型占大豆乳清流(基于干重)的约5％至约30％，更典型约10％至约25％。

含水的大豆乳清流还通常包含脂肪部分，脂肪部分按重量计一般占大豆乳清流(基于干重)的约0.1％至约5％。在本发明的某些方面，脂肪含量通过酸水解测量，并且按大豆乳清流的重量计(基于干重)为约3％。

除上述组分之外，含水的大豆乳清流通常还包含一种或多种微生物，包括，例如，多种细菌、霉菌和酵母。这些组分的比例通常为约100至约1×10⁹菌落形成单位数(CFU)每毫升不等。如本文中其它地方所详述的，在多个方面，在蛋白回收和/或分离之前，含水的大豆乳清流被处理，以移除这些组分。

如所指出的，大豆蛋白分离物的常规的生产通常包括处理大豆蛋白分离物的分离之后剩余的含水的大豆乳清流。根据本公开，一种或多种蛋白和多种其它组分(例如，糖类和矿物)的回收导致相对纯的含水的大豆乳清流。蛋白和一种或多种组分未被移除的常规的大豆乳清流一般要求在处置和/或再利用之前进行处理。根据本公开的多个方面，所述含水的乳清流可以最低限度的(如果存在的话)处理被处置或作为工艺用水被利用。例如，所述含水的乳清流可以在本公开的一个或多个过滤(例如，渗滤)操作中被使用。

除了从大豆蛋白分离物的制造中产生的含水的大豆乳清流回收KTI蛋白之外，应当了解，本文所述的方法还同样适合用于回收大豆蛋白分离物的制造中产生的大豆糖浆流的一种或多种组分，因为大豆糖浆流是附加类型的大豆工艺流。

D.KTI蛋白的回收

本文所述的方式涉及纯化的KTI蛋白的回收和分离，所述KTI蛋白存在于产生自完整的豆类或油料种子的精炼方法的含水的乳清流中。如上文所论及，所述完整的豆类或油料种子可以来源于多种适合的植物。以非限制性实例的方式，适合的植物包括豆科植物(包括如大豆)、玉米、豌豆、卡诺拉、向日葵、高粱、稻、苋属植物、马铃薯、木薯、竹芋、美人蕉、羽扇豆、油菜、小麦、燕麦、裸麦、大麦、花生、洋刀豆、薏苡、豌豆家族豆类、巴鲁、鹊豆、矛豆荚(例如，雨豆树种子)、苜蓿、蜗牛苜蓿种子、利马豆、牛油豆、芸豆、矮菜豆、甘蔗、小米、成材木、菠菜、chapule、纤毛虫、甜点香蕉、兵豆、麸、蚕豆或胡豆、绿豆、赤豆、豇豆、麻风树、绿藻、以及它们的组合。在一个实施方案中，所述豆科植物是大豆，并且从精炼大豆的方法产生的含水的乳清流是含水的大豆乳清流。

在多个方面，本公开提供了用于回收和分离KTI蛋白的方法，所述KTI蛋白存在于大豆蛋白分离物的生产过程中产生的含水的大豆乳清流中。应当指出的是，本发明的方法不限于大豆乳清或大豆糖浆流，并且可以被用于从很多种豆科植物工艺流中回收蛋白和多种其它组分。在多个方面，包含高比例的KTI蛋白的馏分被从大豆乳清流中回收。

通过本公开的方法处理的大豆乳清流一般是相对稀释的。为了有利于KTI蛋白的回收和/或分离，所述乳清流优选在所述方法的初始步骤中被浓缩。大豆乳清流的浓缩有助于从所述乳清流中回收和分离KTI蛋白。例如，在本公开的一个优选的实施方案中，在回收KTI蛋白之前，通过使含水的大豆乳清或其部分与分离膜接触，以形成包含含水的大豆乳清的保留物和包含水的透过物，从所述含水的大豆乳清中移除水。在本公开的其它实施方案中，水可以通过本领域已知的任何方法从所述大豆乳清中移除，例如通过蒸发。

随着KTI蛋白的回收，本公开的方法通常将蛋白自存在于大豆乳清流中的糖类分离。任选地，本公开的方法可以被配置和控制，以将大豆乳清流中的糖分离至一种或多种馏分(例如，单糖富集的馏分和/或低聚糖富集的馏分)。这可以在多个步骤中完成，以将不同的糖类从蛋白分离。因此，糖类从大豆乳清流中的回收提供了进一步的产品流。如所指出的，糖类的移除通常产生糖类能够被从其分离的馏分，所述分离产生浓缩的糖类馏分和可以最低限度的(如果存在的话)处理被处置或作为工艺用水被回收利用的相对纯的含水馏分。

在处理所述保留物以移除糖类之后，所述保留物被进一步处理以移除附加的组分。如所指出的，可以通过本公开被处理的多种大豆乳清流包括一种或多种矿物(例如，磷和钙)。已经被注意到，一种或多种矿物的存在，可以通过，例如，膜的污染和从所期望回收的组分(即，KTI蛋白)分离方面的困难，对下游的处理造成挑战。除了普遍地回收这些所期望的组分之外，从大豆乳清中移除矿物目前据信还有助于回收具有较高纯度的KTI产品。如本文中其它地方所详述的，从大豆乳清中移除矿物一般可以根据本领域中已知的方法进行，所述方法包括，例如，沉淀和离心。由于植酸通常存在于通过本发明的方法处理的含水的大豆乳清流中，矿物如钙和镁通常以植酸钙和植酸镁的形式被回收。其它被移除的矿物还可以包括，例如，钠、钾、锌、铁、锰和铜。

本公开包括多种适用于从在大豆蛋白分离物的生产中产生的含水的大豆乳清流回收KTI蛋白的方法。一般而言，本公开的方法包括一个或多个操作，所述操作被设计和配置为分离出含水的大豆乳清流的特定组分，从而浓缩所述乳清流并使得能够从其回收纯化的KTI蛋白。

一般而言，根据本公开，任何本领域中熟知的多种分离和纯化技术可以被用于移除存在于含水的大豆乳清中的多种干扰组分和从其分离纯化的KTI蛋白，所述技术包括，例如膜分离技术(例如，过滤，如超滤、微量过滤、纳滤、和/或反向渗透)、层析分离技术(例如，离子交换层析、膜层析、吸附层析、尺寸排阻层析、反相层析、凝胶过滤、亲和层析，其包括，例如，阴离子或阳离子交换层析、模拟移动床层析、膨胀床吸附层析、凝胶过滤、反相层析、和/或混合床离子交换)、电泳、透析、微粒过滤、沉淀、离心、结晶、以及它们的组合。上述多种组分的分离的主要原理是分子大小，尽管在过滤应用中，过滤介质的渗透性能够被样品的化学、分子或静电特性影响。如本文中其它地方所详述的(例如，下文提及图1A、1B、1C和1D时)，本公开的方法通常利用多于一种的取决于待移除的乳清流的特定组分的分离膜。例如，所述方法的一个步骤可以利用超滤分离膜，然后的一个或多个步骤利用纳滤分离膜。

在关于不溶性固体的移除的某些方面，微粒过滤、沉淀、离心、结晶、以及它们的组合可以被使用。通过这些方法移除的不溶性固体通常大于20μm。

微粒过滤是通过使用微粒过滤膜将固体颗粒从流体分离的方法。适合的微量过滤膜由本领域已知的适当材料构成，所述材料包括，例如，聚砜、改性聚砜、陶瓷和不锈钢。微量过滤膜通常具有约0.1微米(μm)至约20μm范围的孔径。在某些方面，微量过滤膜具有约0.2μm至约2μm范围的孔径。

超滤与微量过滤类似，但在分离膜的孔径方面不同。超滤膜通常被用于从具有较低分子量的分子分离具有较高分子量的分子(包括，例如，蛋白)。适合的超滤膜通常由本领域已知的适当材料构成，所述材料例如聚砜(PS)、聚醚砜(PES)、聚丙烯(PP)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、再生纤维素(RC)、陶瓷、不锈钢、或薄膜复合材料。超滤膜通常具有约1千道尔顿(kDa)至约300kDa或约5kDa至约50kDa的阻隔分子量。附加地或者作为另外一种选择，适合的超滤膜可以具有约0.002μm至约0.5μm的孔径。

纳滤被用于流体移除小分子。适合的纳滤膜通常由本领域已知的适当材料构成(例如聚醚砜、聚砜、陶瓷和聚酯上的聚酰胺型薄膜复合材料)并且通常具有约0.1kDa至约5kDa或约1kDa至约4kDa的MWCO。附加地或者作为另外一种选择，适合的纳滤膜可以具有约0.0009μm至约0.009μm的孔径。

反向渗透(或超过滤)通常被用于糖类的浓缩。适合的反向渗透膜包括本领域一般已知的那些(例如，具有小于0.5nm的孔径的膜)。

本发明的过滤步骤中利用的分离膜可以单独地或以组合方式根据本领域已知的一种或多种配置方式被布置。例如，膜可以平板的形式、或者以多层膜在其中被组合到一起(连同分离器筛网的任选的层)的盒模块的形式被配置。含水的大豆乳清通常在膜堆的一端被引入交替通道，而流体通过膜进入一个或多个滤液或透过物通道。分离膜也可以被布置在螺旋状的模块中，在其中交替的膜的层围绕着中空的中心核。含水的大豆乳清被引入所述模块的一个末端，而流体通过所述交替的膜的层，流向并进入所述模块的核心。以另一个实例的方式，分离膜可以被布置在中空纤维模块中，所述模块包括一束相对窄的膜管。含水的大豆乳清被引入所述模块中，而流体沿通过所述模块的大豆乳清的流的横向通过膜管束。适合的膜的布置描述于，例如，美国专利6,946,075中，其全文以引用方式并入本文。

本发明的过滤步骤可以采用直接(常规流)过滤或切向(错流)过滤。在直接或常规流过滤中，流体(即，含水的大豆乳清)被直接向着分离膜运送。作为另外一种选择，在切向或错流过滤中，流体(即，含水的大豆乳清)可以沿分离膜表面的切向被运送。切向或错流过滤的一个优点是，含水的大豆乳清的流切向施加在膜上的摩擦或扫刮力通常有助于维持流量。相应地，在多个方面，本公开的方法中的一个或多个步骤以及它们的组合按照错流过滤操作。适合的错流过滤器包括本领域中一般已知的那些，包括美国专利6,946,075中描述的那些。应当了解，流体的通过可以根据常规的和/或切向的(即，交错的)流适当地进行。还应当了解，流体穿越其它膜分离单元的通过可以根据这些机制中的一种或全部两种进行，所述其它膜分离单元详述于本文中与图1A、1B、1C和1D中描述的实施方案以及其它方面相关的其它地方。

本发明所描述的方法涉及选择适当的分离操作或操作的组合，以从大豆乳清流中顺序移除多种组分和回收或分离KTI产品，所述KTI产品包含本领域此前尚未达到的水平的纯度。一般而言，并且如本文中其它地方所详述的，用于回收KTI蛋白的方法利用膜分离和层析分离(例如，离子交换)操作的组合。

如本文中其它地方所指出的，通过本公开的方法处理的含水的大豆乳清流一般是相对稀释的。在多个方面，在回收作为靶标的个别的蛋白之前，含水的大豆乳清通过，例如，水的移除，以至少约2(例如，约3或约6)的浓缩系数被浓缩。

与用于回收KTI蛋白的其它方法相比，至少部分地由于其处理含水的大豆乳清的多个样品的能力，通过模拟移动床(SMB)层析回收KTI蛋白一般也可以提供低成本、通量、和/或灵活性的优势。

已经被注意到，大豆乳清流的一种或多种组分可以干扰KTI蛋白的回收。例如，在大豆蛋白分离物制造过程中，硅化合物(通常为硅氧烷)经常作为消泡剂被引入，通常是以包含硅的化合物的形式，例如可从HydriteChemical或Emerald Performance Materials商购获得的那些。无论确切的来源如何，有机硅化合物通常以按硅含量计至高约15份每一百万份(ppm)、至高约10ppm、或至高约5ppm的浓度存在于大豆乳清流中。有机硅化合物的存在一般是非期望的，因为它可以干扰大豆乳清流的KTI蛋白的回收。

相应地，在多个方面，在用于回收和分离KTI蛋白的操作之前，硅氧烷和/或其它有机硅化合物被从大豆乳清流中移除，如本文中其它地方所详述的。优选地，硅化合物被移除至使得大豆乳清包含不超过痕量级有机硅的程度，如本文中其它地方所详述的。附加地或者作为另外一种选择，含水的大豆乳清可以包含一种或多种微生物，所述微生物可以干扰所述含水的大豆乳清的所期望的组分的回收，和/或在所述方法的最终的回收的产品中是非期望的。

为了移除这些干扰组分，可以使用选择性保留硅消泡剂和/或一种或多种微生物的分离膜过滤所述大豆乳清流，以产生包含硅和/或一种或多种微生物的保留物和包含含水的大豆乳清的透过物。这一初始纯化中使用的特定的膜(包括，例如，微量过滤)是根据待移除的组分选择的。无论所选择的膜的类型和从大豆乳清流中移除的组分如何，优选所期望的KTI蛋白的至少主要部分，并且优选所期望的KTI蛋白的基本上全部存在于保留物中。此外，就这一点而言，应当注意的是，提及包含含水的大豆乳清的透过物时表示用于移除一种或多种杂质的对乳清流的处理对所述大豆乳清流的其它组分具有很小的(如果存在的话)影响。

在多个供选择的替代方面，所述乳清流中包含的细菌可以在蛋白的回收之前通过加热被杀死。加热大豆乳清流以杀灭细菌的方式是不严格的，并且一般可以根据本领域已知的常规方法进行。

分离技术领域的技术人员知道，由于分离不会是100％，在每一流中能够存在残余的组分。此外，本领域的技术人员了解，分离技术能够依赖于起始的原材料而变化。

步骤0(参见图1A)-乳清蛋白预处理能够从包括但不限于大豆分离蛋白(ISP)糖浆、ISP乳清、大豆蛋白浓缩物(SPC)糖浆、SPC乳清、功能性大豆蛋白浓缩物(FSPC)乳清、以及它们的组合的进料流开始。能够用于乳清蛋白预处理步骤中的加工助剂包括但不限于酸、碱、氢氧化钠、氢氧化钙、盐酸、水、蒸汽、以及它们的组合。在调节pH之后，步骤0的pH能够是介于约3.0和约6.0之间、或介于3.5和5.5之间或约5.3。温度能够是介于约70℃和约95℃之间或约85℃。温度保持时间能够在约0分钟至约20分钟之间或约10分钟变化。在保留时间之后，所述流通过一个离心分离步骤(通常在间歇放电圆盘式净化离心机中)，以从所述乳清流中分离沉淀。来自乳清蛋白预处理的产物包括但不限于流0a中的乳清流(预处理的大豆乳清)的水相中的可溶性组分(分子量等于或小于约50千道尔顿(kDa))和流0b中的不溶性大分子量蛋白(介于约300kDa和约50kDa之间)，例如预处理的大豆乳清、贮藏蛋白、以及它们的组合。

步骤1(参见图1A)-微生物的降低能够以上述乳清蛋白预处理步骤的产物开始，包括但不限于预处理的大豆乳清。本步骤涉及预处理的大豆乳清的微量过滤。在这一步骤中，方法的变量和供选择的替代方案包括但不限于离心、死端过滤、加热灭菌、紫外灭菌、微量过滤、错流膜过滤、以及它们的组合。错流膜过滤包括但不限于螺旋式、板框式、中空纤维、陶瓷、动态或旋转盘、纳米纤维、以及它们的组合。步骤1的pH能够是介于约2.0和约12.0之间、或介于约3.5和约5.5之间或约5.3。温度能够是介于约5℃和约90℃之间、或介于约25℃和75℃之间或约50℃。来自步骤1的产物包括但不限于流1a中的贮藏蛋白、微生物、硅、以及它们的组合和流1b中的纯化的预处理的大豆乳清。

步骤2(参见图1A)-水和矿物的移除能够以来自流1b或4a的纯化的预处理的大豆乳清、或来自流0b的预处理的大豆乳清开始。其包括用于水的移除和部分矿物的移除的纳滤步骤。在这一步骤中，方法的变量和供选择的替代方案包括但不限于错流膜过滤、反向渗透、蒸发、纳滤、以及它们的组合。错流膜过滤包括但不限于螺旋式、板框式、中空纤维、陶瓷、动态或旋转盘、纳米纤维、以及它们的组合。步骤2的pH能够是介于约2.0和约12.0之间、或介于约3.5和约5.5之间或约5.3。温度能够是介于约5℃和约90℃之间、或介于约25℃和75℃之间或约50℃。来自这一水移除步骤的产物包括但不限于流2a中的纯化的预处理的大豆乳清和流2b中的水、一些矿物、一价阳离子、以及它们的组合。

步骤3(参见图1A)-矿物沉淀步骤能够以来自流2a的纯化的预处理的大豆乳清或来自流0a或1b的预处理的大豆乳清开始。其包括通过pH和/或温度变化沉淀的步骤。在这一步骤中，方法的变量和供选择的替代方案包括但不限于搅拌的或再循环的反应槽。能够用于矿物沉淀步骤中的加工助剂包括但不限于酸、碱、氢氧化钠、氢氧化钙、盐酸、氯化钠、肌醇六磷酸酶、以及它们的组合。步骤3的pH能够是介于约2.0和约12.0之间、或介于约6.0和约9.0之间或约8.0。温度能够是介于约5℃和约90℃之间、或介于约25℃和75℃之间或约50℃。pH保持时间能够介于约0分钟至约60分钟之间、或介于约5分钟和约20分钟之间或约10分钟变化。流3的产物是纯化的预处理的大豆乳清和沉淀的矿物的悬液。

步骤4(参见图1A)-矿物移除步骤能够以来自流3的纯化的预处理的大豆乳清和沉淀的矿物的悬液开始。其包括离心步骤。在这一步骤中，方法的变量和供选择的替代方案包括但不限于离心、过滤、死端过滤、错流膜过滤、以及它们的组合。错流膜过滤包括但不限于螺旋式、板框式、中空纤维、陶瓷、动态或旋转盘、纳米纤维、以及它们的组合。来自矿物移除步骤的产物包括但不限于流4a中的去矿物化的预处理的乳清和流4b中的不溶性矿物与一些蛋白矿物复合物。

步骤5(参见图1B)-蛋白分离和浓缩步骤能够以来自流4a的纯化的预处理的乳清或来自流0a、1b、或2a的乳清开始。其包括超滤步骤。能够用于超滤步骤中的加工助剂包括但不限于酸、碱、氢氧化钙、氢氧化钠、盐酸、以及它们的组合。在这一步骤中，方法的变量和供选择的替代方案包括但不限于错流膜过滤、超滤、以及它们的组合。错流膜过滤包括但不限于螺旋式、板框式、中空纤维、陶瓷、动态或旋转盘、纳米纤维、以及它们的组合。步骤5的pH能够是介于约2.0和约12.0之间、或介于约6.0和约9.0之间或约8.0。温度能够是介于约5℃和约90℃之间、或介于约25℃和75℃之间或约50℃。来自流5a的产物包括但不限于大豆乳清蛋白、BBI、KTI、贮藏蛋白、其它蛋白、以及它们的组合。来自流5b的产物包括但不限于钛、大豆低聚糖、矿物、以及它们的组合。

步骤6(参见图1B)-蛋白洗涤和纯化步骤能够以来自流4a或5a的大豆乳清蛋白、BBI、KTI、贮藏蛋白、其它蛋白或纯化的预处理的乳清、或来自流0a、1b、或2a的乳清开始。其包括渗滤步骤。在这一步骤中，方法的变量和供选择的替代方案包括但不限于再浆化、错流膜过滤、超滤、水渗滤、缓冲液渗滤、以及它们的组合。错流膜过滤包括但不限于螺旋式、板框式、中空纤维、陶瓷、动态或旋转盘、纳米纤维、以及它们的组合。能够用于蛋白洗涤和纯化步骤中的加工助剂包括但不限于水、流、以及它们的组合。步骤6的pH能够是介于约2.0和约12.0之间、或介于约6.0和约9.0之间或约7.0。温度能够是介于约5℃和约90℃之间、介于约25℃和75℃之间或约50℃。来自流6a的产物包括但不限于大豆乳清蛋白、BBI、KTI、贮藏蛋白、其它蛋白、以及它们的组合。来自流6b的产物包括但不限于钛、大豆低聚糖、水、矿物、以及它们的组合。

步骤7(参见图1C)-水移除步骤能够以来自流5b和/或流6b的钛、大豆低聚糖、水、矿物、以及它们的组合开始。其包括纳滤步骤。在这一步骤中，方法的变量和供选择的替代方案包括但不限于反向渗透、蒸发、纳滤、水渗滤、缓冲液渗滤、以及它们的组合。步骤7的pH能够是介于约2.0和约12.0之间、或介于约6.0和约9.0之间或约7.0。温度能够是介于约5℃和约90℃之间、介于约25℃和75℃之间或约50℃。来自流7a的产物包括但不限于钛、大豆低聚糖、水、矿物、以及它们的组合。来自流7b的产物包括但不限于水、矿物、以及它们的组合。

步骤8(参见图1C)-矿物移除步骤能够以来自流5b、6b、7a、和/或12b的钛、大豆低聚糖、水、矿物、以及它们的组合开始。其包括电渗析膜步骤。在这一步骤中，方法的变量和供选择的替代方案包括但不限于离子交换柱、层析、以及它们的组合。能够用于这一矿物移除步骤中的加工助剂包括但不限于水、酶、以及它们的组合。酶包括但不限于蛋白酶、肌醇六磷酸酶、以及它们的组合。步骤8的pH能够是介于约2.0和约12.0之间、或介于约6.0和约9.0之间或约7.0。温度能够是介于约5℃和约90℃之间、介于约25℃和50℃之间或约40℃。来自流8a的产物包括但不限于具有介于约10毫西门子/厘米(mS/cm)和约0.5mS/cm之间或约2mS/cm的电导率的去矿物化的大豆低聚糖。来自流8b的产物包括但不限于水、矿物、以及它们的组合。

步骤9(参见图1C)-颜色移除步骤能够以来自流8a、5b、6b、12b、和/或7a的去矿物化的大豆低聚糖开始。其利用活性炭床。在这一步骤中，方法的变量和供选择的替代方案包括但不限于离子交换。能够用于这一颜色移除步骤中的加工助剂包括但不限于活性炭、离子交换树脂、以及它们的组合。温度能够是介于约5℃和约90℃之间或约40℃。来自流9a的产物包括但不限于颜色化合物。流9b为脱色的溶液。来自流9b的产物包括但不限于大豆低聚糖、以及它们的组合。

步骤10(参见图1C)-大豆低聚糖分馏步骤能够以来自流9b、5b、6b、7a、和/或8a的大豆低聚糖、以及它们的组合开始。其包括层析步骤。在这一步骤中，方法的变量和供选择的替代方案包括但不限于层析、纳滤、以及它们的组合。能够用于这一大豆低聚糖分馏步骤中的加工助剂包括但不限于酸或碱，以如本领域的技术人员所知地基于所使用的树脂调节pH。来自流10a的产物包括但不限于大豆低聚糖。来自流10b的产物包括但不限于大豆低聚糖。

步骤11(参见图1C)-水移除步骤能够以来自流9b、5b、6b、7a、8a和/或10b的大豆低聚糖开始。其包括蒸发步骤。在这一步骤中，方法的变量和供选择的替代方案包括但不限于反向渗透、蒸发、纳滤、以及它们的组合。能够用于这一水移除步骤中的加工助剂包括但不限于消泡剂、流、真空、以及它们的组合。温度能够是介于约5℃和约90℃之间或约60℃。来自流11a的产物包括但不限于水。来自流11b的产物包括但不限于大豆低聚糖。

步骤12(参见图1C)-附加的从大豆低聚糖分离蛋白的步骤能够以来自流7a、5b、和/或6b的钛、大豆低聚糖、水、矿物、以及它们的组合开始。其包括超滤步骤。在这一步骤中，方法的变量和供选择的替代方案包括但不限于错流膜过滤、孔径介于约50kDa和约1kDa之间的超滤、以及它们的组合。错流膜过滤包括但不限于螺旋式、板框式、中空纤维、陶瓷、动态或旋转盘、纳米纤维、以及它们的组合。能够用于这一从糖类分离蛋白的步骤的加工助剂包括但不限于酸、碱、蛋白酶、肌醇六磷酸酶、以及它们的组合。步骤12的pH能够是介于约2.0和约12.0之间、约7.0。温度能够是介于约5℃和约90℃之间、介于约25℃和75℃之间或约50℃。来自流12b的产物包括但不限于大豆低聚糖、水、矿物、以及它们的组合。来自流12a的产物包括但不限于肽、其它蛋白、以及它们的组合。

步骤13(参见图1C)-水移除步骤能够以来自流12a的肽和其它蛋白开始。其包括蒸发步骤。在这一步骤中，方法的变量和供选择的替代方案包括但不限于反向渗透、纳滤、喷雾干燥、以及它们的组合。来自流13a的产物包括但不限于水。来自流13b的产物包括但不限于肽、其它蛋白、以及它们的组合。

步骤14(参见图1B)-蛋白分馏步骤可以通过以来自流6a和/或5a的大豆乳清蛋白、BBI、KTI、贮藏蛋白、其它蛋白、以及它们的组合开始进行。其包括超滤(具有300kDa至10kDa的孔径)步骤。在这一步骤中，方法的变量和供选择的替代方案包括但不限于错流膜过滤、超滤、纳滤、以及它们的组合。错流膜过滤包括但不限于螺旋式、板框式、中空纤维、陶瓷、动态或旋转盘、纳米纤维、以及它们的组合。步骤14的pH能够是介于约2.0和约12.0之间、或介于约6.0和约9.0之间或约7.0。温度能够是介于约5℃和约90℃之间、介于约25℃和75℃之间或约50℃。来自流14a的产物包括但不限于贮藏蛋白。来自流14b的产物包括但不限于大豆乳清蛋白、BBI、KTI、其它蛋白、以及它们的组合。

步骤15(参见图1B)-水移除步骤能够以来自流6a、5a、和/或14b的大豆乳清蛋白、BBI、KTI和其它蛋白开始。其包括蒸发步骤。在这一步骤中，方法的变量和供选择的替代方案包括但不限于蒸发、纳滤、RO、以及它们的组合。来自流15a的产物包括但不限于水。流15b产物包括但不限于大豆乳清蛋白、BBI、KTI、其它蛋白、以及它们的组合。

步骤16(参见图1B)-热处理步骤和瞬间冷却步骤能够以来自流6a、5a、14b、和/或15b的大豆乳清蛋白、BBI、KTI和其它蛋白开始。其包括超高温步骤。在这一步骤中，方法的变量和供选择的替代方案包括但不限于加热灭菌、蒸发、以及它们的组合。能够用于这一热处理和瞬间冷却步骤中的加工助剂包括但不限于水、流、以及它们的组合。所述加热步骤的温度能够是介于约129℃和约160℃之间或约152℃。温度保持时间能够是介于约8秒和约15秒之间或约9秒。瞬间冷却后，温度能够是介于约50℃和约95℃之间或约82℃。来自流16的产物包括但不限于大豆乳清蛋白。

步骤17(参见图1B)-干燥步骤能够以来自流6a、5a、14b、15b、和/或16的大豆乳清蛋白、BBI、KTI和其它蛋白开始。其包括干燥步骤。液体进料温度能够是介于约50℃和约95℃之间或约82℃。入口温度能够是介于约175℃和约370℃之间或约290℃。排气温度能够是介于约65℃和约98℃之间或约88℃。来自流17a的产物包括但不限于水。来自流17b的产物包括但不限于大豆乳清蛋白，其包括BBI、KTI、贮藏蛋白、其它蛋白、以及它们的组合。

图1D描述了用于从在大豆蛋白分离物的生成中产生的大豆乳清流中回收一直或多种单独的蛋白的本公开的方法的实施方案。

尽管未描述于图1D中，乳清蛋白预处理能够从处理包括但不限于大豆分离蛋白(ISP)糖浆、ISP乳清、大豆蛋白浓缩物(SPC)糖浆、SPC乳清、功能性大豆蛋白浓缩物(FSPC)乳清、以及它们的组合的进料流开始。能够用于乳清蛋白预处理步骤中的加工助剂包括但不限于酸、碱、氢氧化钠、氢氧化钙、盐酸、水、蒸汽、以及它们的组合。所述预处理步骤的pH能够是介于约3.0和约6.0之间，并且优选4.5。温度能够是介于约70℃和约95℃之间，并且优选约85℃。温度保持时间能够介于约0分钟至约20分钟之间、并且优选约10分钟变化。来自乳清蛋白的预处理的产物包括但不限于保留物中的乳清流(预处理的大豆乳清)的水相中的可溶性组分(分子量等于或小于约50千道尔顿(kDa))和透过物中的不溶性大分子量蛋白(介于约300kDa和约50kDa之间)，例如预处理的大豆乳清、贮藏蛋白、以及它们的组合。

如图1D中所示，含水的大豆乳清1被引入包含第一过滤进料区域6的膜分离单元5中，所述第一过滤进料区域6以比分离膜7另一侧的第一透过区域8中的压力更高的压力与所述膜的一侧接触。优选地，膜分离单元5包含至少一种微量过滤膜。

跨越膜分离单元5中的分离膜7的跨膜压力一般是至少约1psi、至少约5psi、至少约10psi、至少约20psi、至少约30psi、至少约40psi、至少约50psi、或至少约75psi。流体通常以至少约1升流体/小时/每平方米、或约1升流体/小时/每平方米至约400升流体/小时/每平方米横截面膜区域(横向于流动方向)的体积流量或流量通过所述膜。流量可以被，例如，过滤的类型、膜的污染等影响。大豆乳清典型以约0℃至约100℃，更典型以约25℃至约75℃的温度被引入所述膜分离单元的过滤进料区域。通常，含水的大豆乳清1由于保留物的原因体积减少约5％。流体穿越分离膜的通过导致第一保留物9和第一透过区域8中的第一透过物13。所述第一保留物9将主要包含一种或多种微生物和不溶性材料，更具体地讲，所述第一保留物9通常相对于所述第一透过物13富集了微生物。优选地，所述第一保留物9包含所述含水的大豆乳清的微生物含量的主要部分(如果不是基本上全部)。甚至更优选地，所述第一保留物9还包含消泡剂(例如，存在于所述含水的大豆乳清中的有机硅的硅或包含脂质的化合物)的主要部分，更具体地讲，基于消泡剂含量，所述第一保留物9包含至少约70重量％，更优选至少约80重量％，甚至更优选至少约90重量％的所述含水的大豆乳清的消泡剂含量。所述第一透过物13将主要包含所述含水的大豆乳清流的全部的多种剩余组分，例如可溶性大豆贮藏蛋白、大豆乳清蛋白、多种糖类、水、矿物、异黄酮素和维生素。

再次就图1D而言，所述第一透过物13被引入包含第二过滤进料区域18的膜分离单元17中，所述第二过滤进料区域18以比第二透过区域20中的压力更高的压力与分离膜19的一侧接触。膜分离单元17优选包含至少一种超滤膜作为分离膜19。跨越膜分离单元17中的分离膜19的跨膜压力一般是至少约5psi、至少约10psi、至少约25psi、至少约50psi、至少约100psi、或至少约150psi。流体通常以至少约1升流体/小时/每平方米、或约1升流体/小时/每平方米至约150升流体/小时/每平方米横截面膜区域(横向于流动方向)的体积流量或流量通过所述膜。大豆乳清典型以约0℃至约100℃，更典型以约25℃至约75℃的温度被引入所述膜分离单元的过滤进料区域。通常，含水的大豆乳清1以至少约5、或约5至约75(例如，约25)的浓缩系数被浓缩。超滤步骤可以任选地包括渗滤。渗滤体积通常为约1直到约10份渗滤体积每份保留物范围。

流体穿越所述分离膜的通过导致第二保留物21和第二透过物25。所述第二保留物21包含所述含水的大豆乳清的蛋白含量的显著部分，并因此被进一步处理，以回收KTI蛋白。优选地，所述第二保留物21包含存在于被引入所述第一过滤进料区域6的含水的大豆乳清中的多种大豆乳清蛋白的至少约25重量％至至少约90重量％(例如，至少约50重量％)(基于干重)。

再次就图1D而言，所述第二透过物25一般包含没有被回收至第二保留物21中的任何蛋白和所述大豆乳清流的多种其它组分(例如，多种糖类、水、矿物、维生素和异黄酮素)。尽管未图示于图1D中，所述第二透过物25的组分可以按照适当的分离操作被进一步处理，以分离和/或移除来自所述含水的乳清流的单独的组分。在附加的分离步骤之后，将优选地形成相对纯的水流，其在被处置或使用之前需要最低限度的处理(如果存在的话)。因此，本文所述的发明还通过，例如，改善环境品质处理了环境有益效果。

将所述第二保留物21与载流23混合以形成进料24，通向包含至少一种离子交换树脂30的离子交换柱或单元29。所述载流的确切位置不被严格要求。通常，所述载流的pH是约1至约7，更典型是约2至约6，更典型是约2至约5，甚至更典型是约3至约4。在KTI蛋白的回收的多个方面，所述载流包括非挥发性的缓冲液，包括如柠檬酸钠，或挥发性的缓冲液，包括如甲酸铵。例如，在多个方面，所述载流包括在含水混合物中以约10毫摩尔每升至约30毫摩尔每升(例如，20mM)包含反离子的缓冲液。

所述第二保留物21和/或进料流24的pH影响大豆蛋白的溶解度，而沉淀的蛋白可以导致离子交换柱的污染。因此，可能期望将流向离子交换柱的进料的pH控制在某些范围内(例如，通过缓冲作用)。如果必要，可以通过，例如，稀释所述第二保留物、载流和/或通过所述保留物和载流的混合提供的进料，将所述进料的pH维持在所述范围内。稀释剂的组成没有严格要求，通常为可以由本领域的技术人员容易地选择的含水介质(例如，去离子水)。除了影响所述进料的pH外，稀释还通常降低所述进料的内在离子强度，这促进了蛋白与离子交换树脂的结合。附加地或者作为另外一种选择，所述进料的pH可以通过载流的选择来控制。

离子交换树脂被选择为适用于第二保留物21和进料24中存在的一种或多种蛋白的选择性保留和回收。在多个方面，所述离子交换树脂被选择用于KTI蛋白的选择性保留或非KTI蛋白的保留，使得KTI蛋白与非KTI蛋白分离。以下的讨论聚焦在从含水的大豆乳清(例如，第二保留物21)中回收和分离KTI蛋白上。然而，应当了解，下列的流程能够容易地适应其它靶蛋白(例如BBI蛋白)的回收以及含水的之外的其它类型的输入流(例如，从喷雾干燥的复原的)。

无论离子交换单元的确切配置如何，适用于KTI蛋白的回收的离子交换树脂包括多种阳离子和阴离子交换树脂。依赖于进入离子交换柱的进料，尽管阳离子交换树脂和阴离子交换树脂均适用于回收KTI蛋白，所述离子交换树脂在多个方面包括阳离子交换树脂。例如，暴露于低于其等电点(pI)的pH中的蛋白更可能具有带正电荷的区域，并因此更牢固地与阳离子交换树脂结合。所述进料流中的大多数蛋白(例如，大豆贮藏蛋白)具有比KIT的pI和所述进料通常的pH更高的pI。因此，这些蛋白通常更牢固地与所述树脂结合。包含KTI蛋白的馏分可以通过使树脂与适当的洗脱剂接触而被容易地从离子交换柱上洗脱。

作为另外一种选择，所述进料的pH可以被控制为低于KTI蛋白的pI，以通过离子交换树脂提供KTI蛋白的保留。其它蛋白(例如BBI蛋白)也与所述树脂结合。然而，所期望的馏分的回收可以通过使离子交换树脂与用于蛋白馏分的差别洗脱的适当的洗脱机接触进行。

适当的阳离子交换树脂包括本领域所熟知的多种树脂。在至少一个实施方案中，所述离子交换树脂包括Poros 20HS-由Applied Biosystems制造的交联的多聚(苯乙烯-二乙烯基苯)基质，其表面涂覆了用磺基丙基(例如，丙烷磺酸，(OH)₂S(O)-(CH₂)₃-)官能化的多羟基聚合物。

再次就图1D而言，在进料24通过了离子交换柱30之后，回收洗脱了KTI蛋白流33。为了进一步纯化KTI蛋白流33并达到95％或更高的纯度，可以通过使用亲和层析(未描述于图1D中)分离所述KTI蛋白流33。亲和层析是通常在单个步骤中提供＞95％纯度的纯化技术。它利用靶分子的天然的或添加的特异性性质来将其与样品中的全部杂质分离。为了纯化KTI蛋白流33，在之前的步骤中尚未被除去的剩余的杂质(主要是大豆凝集素)，能够容易地通过亲和层析被除去。任何预制的应用特异性树脂(即，具有连接至其表面的特异性针对待分离化合物的配体的树脂)能够被使用和平衡，例如，N-乙酰-D-半乳糖胺树脂(目录号A2787，Sigma ChemicalCo.，St.Louis，MO)。使用本领域已知的方法，将KTI蛋白流33调节至与所述树脂相同的缓冲液组成，并施加至亲和柱，杂质从而粘附至树脂，而穿流被收集作为纯化的KTI馏分。

图2示出了对如图1D所示的本发明的方法过程中分离的多种保留物和透过物的SDS-PAGE纯度分析，包括KTI蛋白流33。泳道1描述了分离之前的大豆乳清的组成并且显示了多重组分的存在。与此相对，泳道5描述了在图1D中所示的多个分离操作之后富集的KTI馏分(即，KTI蛋白流33)。两个条带的存在表明，在图1D的分离过程之后，KTI蛋白和一种其它杂质(基于所述KTI馏分的分子量推测其为大豆凝集素)已从大豆乳清中分离。剩余的杂质(即，大豆凝集素)的移除能够如实施例中所示通过亲和层析完成，以获得几乎不含附加的组分并具有高水平的纯度(＞95％)的KTI产品。

图1A、1B、1C和1D中所描述的方法设计不限于原料或以上所示的大豆乳清组分的分离和回收的顺序，并且可被用于制备与上文所论及的那些不同的工艺流，包括，例如，如所附权利要求中所示的。

E.制备KTI的方法

在某些实施方案中，本发明的KTI蛋白通过，例如，重组方法或合成产生。本发明的蛋白的重组制备使用本领域的普通技术人员已知的标准技术进行。此类方法包括，例如，制备一种或多种编码核酸序列，这能够通过基于聚合酶链反应(PCR)的方法用全长cDNA序列作为模板进行。在制备了所期望的核酸序列之后，该序列被插入表达载体(包括，例如，大肠杆菌(Escherichia coli)pCAL-n表达质粒)中，然后将其转入微生物；然后，使用选择标记(包括，例如，抗生素抗性选择标记或荧光选择标记)，进行对包含含有所期望序列的质粒的克隆的选择；然后大量制备包含含有所期望序列的质粒的克隆；并从所期望的克隆纯化肽(参加，例如，Gorlatov等人所述的方法，Biochemistry(2002)41，4107-4116；美国专利4,980,456)。作为另外一种选择，本发明的肽能够通过合成方法或半合成方法(例如，重组制备和合成方法的组合)制备。

合成制备能够通过，例如，应用根据Carpino L.A.和Han.G Y，J.(Amer.Chem.Soc.1981；37；3404-3409)的芴甲氧羰基保护基团策略或叔-丁氧羰基(t-Boc)-保护基团策略进行。肽使用多重肽合成仪合成，例如，通过根据Merrifield R.B.(J.Amer.Chem.Soc.1963；85，2149-2154)的固相肽合成方法。然后对粗制肽进行纯化。

用于本发明的蛋白的合成制备的示例性方法描述于下文中。100mgTentagel-S-RAM(Rapp-Polymere)以0.24mmol/g的载量被转入可商购获得的肽合成设备(PSMM(Shimadzu))中，其中肽序列根据碳二亚胺/HOBt方法被逐步构建。FMOC-氨基酸衍生物通过加入5倍克分子数相等的过量二异丙基碳二亚胺(DIC)、二异丙基乙胺(DIPEA)和羟基苯并三唑(HOBt)，然后转入反应容器，与树脂载体混合30分钟而被预激活。洗涤步骤通过，例如，添加DMF并彻底混合1分钟进行。裂解步骤通过，例如，在DMF中添加哌啶并彻底混合4分钟进行。单个反应的移除和洗涤溶液通过迫使溶液通过反应容器的底部玻璃料实现。使用了氨基酸衍生物FMOC-Ala、FMOC-Arg(Pbf)、FMOC-Asp、FMOC-Gly、FMOC-His(Trt)、FMOC-Ile、FMOC-Leu、FMOC-Lys(BOC)、FMOC-Pro、FMOC-Ser(tBu)和FMOC-Tyr(tBu)(Orpegen)。当合成完成时，干燥肽树脂。随后通过在室温用三氟乙酸/TIS/EDT/水(体积比95∶2∶2∶1)处理2小时裂解肽酰胺。通过过滤、浓缩所述溶液和通过加入冰冷的乙醚沉淀，获得固体形式的粗产物。在0.1％TFA中以5-60％梯度乙腈在40分钟内以12ml/min的流量通过RP-HPLC纯化肽，并通过UV检测器方法在215nm评估洗脱液。通过分析型RP-HPLC和质谱测定了单个馏分的纯度。

F.使用方法

在本发明的多个方面，本发明的KTI蛋白能够被用于促进皮肤健康。促进皮肤健康的实例包括皮肤变色或色素沉着的减少、炎症的减少、皱纹的最小化、皱纹的除去、脱色、着色、皮肤软化、皮肤平滑化、脱毛和清洁。与此相关的皮肤健康的其它实例和实验方法可见于美国专利申请公布20100093028、20100092409、20090111160、20080249029、美国专利6,555,143(亦参见Chen等人，Photochemistry and Photobiology，2008，84：1551-1559和Paine等人，J.Invest.Dermatol.2001Apr；116(4)：587-95)。

定义

为了更好的理解本发明，下文定义了几个术语。

如本文所用，术语“酸可溶的”是指物质在具有约2至约7的pH的含水介质中以10克每升(g/L)的浓度具有至少约80％的溶解度。

如本文所用，术语“大豆分离蛋白”或“分离大豆蛋白”是指按无水计具有至少约90％的大豆蛋白的蛋白含量的大豆材料。

如本文所用，术语“对象”是指需要对病理状态进行处理的哺乳动物(优选人类)、鸟、鱼、爬行动物、两栖动物，所述病理状态包括但不限于与肌肉相关的疾病、非受控的细胞生长、自体免疫疾病和癌症。

如本文所用，术语“工艺流”是指来源于精炼完整的豆类或油料种子的方法的次级或附带的产物，包括含水的或溶剂流，其包括，例如，含水的大豆提取物流、含水的豆浆提取物流、含水的大豆乳清流、含水的大豆糖浆流、含水的大豆蛋白浓缩物大豆糖浆流、含水的大豆透过物流和含水的豆腐乳清流，并且附加地包括例如液体和干粉形式的大豆乳清蛋白，其能够根据本文所公开的方法被回收作为中间产物。

如本文所用，术语“大豆乳清蛋白”是指在大豆贮藏蛋白通常不溶解的pH可溶的蛋白，包括但不限于BBI、KTI、露那辛、脂氧合酶、脱水蛋白、凝集素、肽、以及它们的组合，并且进一步涵盖贮藏蛋白。

本专利申请中各处提及的其它蛋白被定义为包括但不限于露那辛、凝集素、脱水蛋白、脂氧合酶、以及它们的组合。

大豆低聚糖被定义为包括但不限于糖。糖被定义为包括但不限于蔗糖、棉子糖、水苏糖、毛蕊花糖、单糖、以及它们的组合。

当介绍本发明或其优选实施方案的要素时，冠词“一个”和“所述”旨在表示有一个或多个要素。术语“包含”、“包括”和“具有”旨在表示包容性并且表示除列出要素外还可以有其它要素。

在不脱离本发明范围的条件下，可对以上化合物、产品和方法进行各种更改，这意味着可将上文描述和下文实施例中包含的所有内容理解为例证性的而非限定性的。

实施例

实施例1：从大豆乳清蛋白中回收KTI蛋白

具有大约3.7重量％的总固体含量和22.5重量％(基于干重)的总蛋白含量的含水的大豆乳清(1451)被引入包含BTS-25或MMM 0.45微米微量过滤膜的OPTISEP 7000过滤模块中。含水的大豆乳清穿越膜的通过形成了包含含水的大豆乳清的透过物(1321，具有3.2重量％的固体含量)以及包含大于99％的大豆乳清初始细菌含量和大于90％的大豆乳清硅消泡剂含量的保留物。

表1：实验中所使用的膜的描述

膜名称	膜类型	材料	孔径	制造商
					BTS-	微量过滤(MF)	聚砜(PS)	μm	Pall
MMM μm	微量过滤(MF)	改性聚砜(MPS)	μm	Pall
					RC kDa	超滤(UF)	再生纤维素(RC)	kDa	Microdyn-Nadir
PES kDa	超滤(UF)	聚醚砜(PES)	kDa	Microdyn-Nadir
					NF PES	纳滤(NF)	聚醚砜(PES)	％脱NaCl	Microdyn-Nadir
NF	纳滤(NF)	聚砜薄膜	％脱NaCl	Sepro
					SG	反向渗透(RO)	薄膜	％脱NaCl	GE

来自微量过滤模块的透过物(1321)被引入包含具有约100kDa的孔径的再生纤维素(RC)超滤膜的OPTISEP 7000过滤模块中。透过物穿越超滤膜的通过形成包含糖类、矿物和维生素的第二透过物以及具有大约25.4重量％的固体含量和大约83重量％(基于干重)的总大豆蛋白含量的第二保留物(大约21)。

通过使用Virtis Freezemobile 25XL冻干，干燥了第二保留物。将干燥样品的等分试样(53mg)悬浮于水中至25％的最终固体浓度，然后在室温搅拌孵育10分钟以促进溶解。以2000×g离心10min移除不溶物，并且将上清液用pH 3.0的20mM柠檬酸钠进一步稀释5x。所得pH下降导致所述混合物的一些组分沉淀，随后以2000×g离心5min移除沉淀。

将7×25mm Poros 50HS柱(0.8ml床体积；Applied Biosystems)预平衡于pH 3.0的20mM柠檬酸钠缓冲液中。通过0.45微米注射器过滤器过滤样品，并将0.5ml以1ml/min流量应用于所述柱。用20倍柱体积的平衡缓冲液将未结合的蛋白洗出所述柱，并且使用40倍柱体积、1M氯化钠在pH 3.0的20mM柠檬酸钠缓冲液中0-100％线性梯度以1ml的馏分回收结合的部分。考马斯染色的SDS-PAGE凝胶被用于分析每一馏分。基于MW_app，KTI_app局限于馏分25-32中(参见图2)。馏分29和30被合并，并且使用改进的Lowry蛋白测定法(Sigma-Aldrich总蛋白试剂盒，Micro-Lowry，Onishi和Barr改进)就总蛋白进行了分析。使用Kakade等人的流程(Kakade，M.L.，Simons，N.和Liener，I.E.，1969，An Evaluation ofNatural vs.Synthetic Substrates for Measuring the Antitryptic Activity ofSoybeans，Cereal Chem，46：518)估算了KTI活性。合并的样品的蛋白浓度被发现为0.48mg/ml，并且比活性为708Ti单位/克蛋白。还就胰凝乳蛋白酶抑制活性对富集的KTI样品进行了分析(使用Schechter，N.，Sprows，J.，Schoenberger，O.，Lazarus，G.，Cooperman，B.和Rubin，H.，1989，Reaction of Human Skin Chymotrypsin-like Proteinase Chymase with PlasmaProteinase Inhibitors，J.Biol.Chem.264：21308-21315，Jameson，G.W.，Roberts，D.V.，Adams，R.W.，Kyle，W.S.A.和Elmore，D.T.，1973，Determination of the Operational Molarity of Solutions of Bovine α-Chymotrypsin，Trypsin，Thrombin and Factor X_α by SpectrofluorimetricTitration，Biochem.J.131：107-117)并且发现基本不含。因此，如本实施例中制备的KTI不含BBI活性污染。

在KTI纯化过程中制备的多种馏分的SDS-PAGE分析描述于图3中。使用亲和层析来除去泳道5中显示的剩余的杂质，能够获得具有＞95％纯度的KTI。因此，将N-乙酰基-D-半乳糖胺树脂(目录号A2787，SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)平衡于pH 7.4的20mM Tris，154mM NaCl中。使用本领域已知的方法，将富集的KTI馏分调节至此相同的缓冲液组成并应用于亲和柱。将杂质与树脂结合，并且收集柱的穿流作为纯化的KTI馏分。

实施例2：通过质谱确认KTI同一性

使用下列流程将KTI纯化至大约95％纯度(基于SDS-PAGE分析)。将1克大豆Bowman-Birk抑制剂浓缩物(BBIC，Central Soya Co.Lot#02176-2)重悬于20ml pH 6.8的20mM HEPES缓冲液中以得到5％(w/v)浆液。在搅拌台上使用磁力搅拌棒在烧杯中搅拌所述浆液20min以使所述材料完全水化，然后以10.000×g离心10min以除去不溶的材料。轻轻倒出所得上清液并通过0.2μm过滤器过滤，并且将1ml滤液用起始缓冲液(25mM Tris，pH 7.5)稀释至10ml。然后，稀释的样品被立即以1ml/min的流量应用于在起始缓冲液中平衡的1ml HiTrap DEAE FF柱(GEHealthcare目录号17-5055-01)。在洗出未结合的蛋白之后，用0-1M NaCl在pH 7.5的20mM Tris中40倍柱体积线性梯度洗脱所述柱。洗脱过程中收集1ml的馏分，并通过SDS-PAGE进行分析(参见图4)。在馏分8-15中鉴定到KTI_app。馏分A11包含大约95％纯的KTI，并且被选择用于质谱分析。因此，12.5μl的这一馏分在10-20％SDS-PAGE凝胶上被分离、考马斯染色、并被提交至质谱分析(参见图4)。

分析在Donald Danforth Plant Sciences Center(St.Louis，MO)进行。因此，胶内胰蛋白酶酶解过程被用于将KTI_app条带裂解为肽，然后使用QStar XL nanospray-QTOF设备(Applied Biosciences)对其进行LC-MS/MS分析。针对NCBInr和TIGR大豆数据库检索了质谱数据，以鉴定胰蛋白酶酶解的肽所来源的蛋白。条带1A被鉴定为来自大豆的胰蛋白酶抑制剂压型A，图5。鉴定到的特异性肽是来自KTI的NELDKGIGTIISSPYR(aa 73-88)、FIAEGHPLSLK(aa 91-101)、IGENKDAMDGWFR(aa 132-144)、VSDDEFNNYK(aa 148-157)和NKPLVVQFQK(aa 191-200)。

实施例3：使用膨胀床吸附(EBA)层析从大量大豆乳清蛋白中纯化 KTI

用氢氧化钠将200ml具有1.92％的总固体含量的含水的大豆乳清调节至pH 6.0，并且应用于在pH 6.0的10mM柠檬酸钠中平衡的1×25cmMimo6HE树脂柱(UpFront Chromatography，Copenhagen Denmark)。材料在20-25℃使用7.5cm/min的线性流量从下向上加载至柱上。每隔一定间隔收集柱的穿流样品用于后期的分析。用10倍柱体积的平衡缓冲液将未结合的材料洗出柱，然后通过用30mM氢氧化钠洗脱回收结合的材料。在4-12％聚丙烯酰胺凝胶上分离了大豆乳清粉末悬浮液的EBA层析过程中回收的每一馏分10μl，并且用考马斯亮蓝R250染料染色。柱的载样、穿流、洗涤和氢氧化钠洗脱样品的SDS-PAGE分析描述于图6中。如图6中所用，RM：原材料(柱的载样)；RT1-4：载样过程中以相等间隔收集的穿流材料(穿流)；总计：总穿流馏分；W：柱的洗涤液；E：柱的洗脱液。明显地看见大多数加载的蛋白洗脱于穿流中，而大多数的KTI蛋白依然结合在树脂上。在洗脱液中回收总共355mg的蛋白(其大部分为KTI)，收率为1.8mg/ml起始材料。在这些条件下，这种树脂的容量显示为17.8mg的KTI(加上微量杂质)每ml吸附剂。

为了实现95％或更高的纯度，所述材料将被冻干，然后重溶于最小体积的缓冲液(例如，包含100mM NaCl的pH 7.5的20mM Tris)中，并且应用于在相同缓冲液中平衡的Superose 6尺寸排阻层析柱。柱将以0.5ml每分钟的流量被使用，并且连续监测洗脱液的280nm波长吸光度。馏分的收集将在一个柱空体积的洗脱之后立即开始，使用SDS-PAGE将纯化的KTI定位在特定的馏分。包含KTI的馏分将被合并，并且就胰蛋白酶抑制进行检测以验证纯度。

本领域的技术人员将容易地了解，本文所述的方法和组合物代表示例性的实施方案，并且不旨在限制本发明的范围。对本领域的技术人员而言将显而易见的是，可以对本文所公开的本公开进行不同的替换和修改，而不会背离本发明的范围和精神。

本说明书中提及的全部专利和出版物指示本公开所属的领域的那些技术人员的水平。全部专利和出版物均以引用方式并入本文，其引用程度如同每一单独的公布被特定和个别地以引用方式并入。

本文适当地例证性地描述的本公开可以在未具体公开于本文中的任何元件或限制的不存在下实施。因此，例如，在本文的每一实例中，术语“包含/包括”、“基本上由......组成”和“由......组成”中的任何一个可以被其它两个术语之一替代。本文所用的术语和表述被用于描述而并非进行限制，使用此类术语和表述并无意排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同形式，但公认的是在受权利要求书保护的本公开的范围内可以使用各种修改形式。因此，应当理解，虽然通过优选实施方案和任选特征对本公开进行了具体描述，但是本领域的技术人员可借助本文所公开的概念的修改形式和变型形式，并且应当理解此类修改形式和变型形式在本发明的范围内。

Claims (15)

1.库尼兹胰蛋白酶抑制剂(KTI)产品，所述产品具有至少约95重量％的总KTI蛋白浓度。

2.权利要求1的KTI产品，其中所述KTI蛋白还包含与SEQ ID NO：1至少85％相同的氨基酸序列。

3.权利要求1的KTI产品，其中所述KTI蛋白还包含与SEQ ID NO：1至少90％相同的氨基酸序列。

4.权利要求1的KTI产品，其中所述KTI蛋白还包含与SEQ ID NO：1至少95％相同的氨基酸序列。

5.权利要求1的KTI产品，其中基于干重，所述KTI产品还包含至少约95％的总蛋白含量。

6.权利要求1的KTI产品，其中所述产品还表现出至少约1500胰蛋白酶抑制单位/克蛋白的胰蛋白酶抑制剂活性。

7.权利要求1的KTI产品，其中所述产品还包含不超过约0.5内毒素单位/克蛋白的总内毒素含量。

8.库尼兹胰蛋白酶抑制剂(KTI)产品，其中所述KTI蛋白包含至少一种与SEQ ID NO：1至少80％相同的氨基酸序列。

9.权利要求11的KTI产品，其中所述KTI蛋白包含与SEQ ID NO：1至少85％相同的氨基酸序列。

10.权利要求11的KTI产品，其中所述KTI蛋白包含与SEQ ID NO：1至少90％相同的氨基酸序列。

11.权利要求11的KTI产品，其中所述KTI蛋白包含与SEQ ID NO：1至少95％相同的氨基酸序列。

12.库尼兹胰蛋白酶抑制剂(KTI)产品，所述产品具有至少约70重量％的总KTI蛋白浓度，并且其中所述KTI蛋白包含与SEQ ID NO：1至少80％相同的氨基酸序列。

13.库尼兹胰蛋白酶抑制剂(KTI)产品，所述产品具有至少约95％的基于干重的总蛋白含量，至少约1500胰蛋白酶抑制单位/克蛋白的胰蛋白酶抑制剂活性。

14.权利要求16的KTI产品，还包含不超过约0.5内毒素单位/克蛋白的总内毒素含量。

15.库尼兹胰蛋白酶抑制剂(KTI)产品，所述产品具有至少约95重量％KTI蛋白的总KTI蛋白浓度，其中所述KTI蛋白包含与SEQ ID NO：1至少80％相同的氨基酸序列，并且进一步地，其中所述KTI产品表现出下列特性中的一种或多种：

(i)基于干重，至少约95％的总蛋白含量；

(ii)至少约1500胰蛋白酶抑制单位/克蛋白的胰蛋白酶抑制剂活性；和/或

(iii)不超过约0.5内毒素单位/克蛋白的总内毒素含量。

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