JP2013516429A - ボーマン・バークインヒビタープロテインを大豆加工ストリームから回収する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、参照によってその内容全体を本明細書に援用する、2009年12月30日に出願された米国仮特許出願第61/291,312号明細書の優先権を主張する。
(a)大豆タンパク質および不純物を含んでなる大豆加工ストリームに少なくとも1つの分離技術を施して、大豆タンパク質を含んでなる第1の透過液と、不純物を含んでなる第1の残余分を形成するステップと;(b)第1の透過液に少なくとも1つの分離技術を施して、不純物を含んでなる第2の透過液と、大量のタンパク質留分を含んでなる第2の残余分を形成するステップと;(c)少なくとも1つのクロマトグラフ分離に通過させるために、第2の残余分をキャリアストリームと合わせて、加工ストリーム中の他のタンパク質からBBIタンパク質ストリームを単離するステップと;(d)BBIタンパク質ストリームを液体沈殿媒体と合わせ、それに少なくとも1つの分離技術を施して、沈殿BBIタンパク質画分を形成するステップと;(e)沈殿BBIタンパク質画分を液体洗浄媒体と合わせて、可溶化BBIタンパク質画分を形成するステップと;(f)可溶化タンパク質画分に少なくとも1つの分離技術を施して、精製可溶化BBIタンパク質画分を形成するステップと;(g)精製可溶化タンパク質画分に少なくとも1つの分離操作を施して、精製BBI生成物を形成するステップとを含む。
大豆タンパク質単離物は、典型的には、大豆貯蔵タンパク質の等電点(例えばpH約4.5)において、脱脂大豆フレークまたは大豆粉の水性抽出物から沈殿する。したがって大豆タンパク質単離物は、一般に、酸性液体媒質中で可溶性でないタンパク質を含む。同様に、2番目に最も精製された大豆タンパク質材料である、大豆タンパク質濃縮物のタンパク質は、同じく酸性液体媒質中で一般に可溶性でない。しかし本開示の方法によって回収される大豆ホエータンパク質は、一般に酸可溶性であり、すなわちそれらは酸性液体媒質中で可溶性である。
本明細書で考察されるように、例えば大豆ホエーストリームおよび大豆糖蜜ストリームをはじめとする大豆加工ストリームは、相当量のボーマン・バークプロテアーゼインヒビター(BBI)を含有する。このプロテアーゼインヒビターは、少なくともトリプシン、キモトリプシンを阻害し、そして一連の重要な代謝機能を制御する、カテプシンG、エラスターゼ、およびキマーゼなどの多様な他の重要プロテアーゼを潜在的に阻害することが知られている。
分離は決して100%でないため、各ストリーム中に残留構成要素があり得ることが分離技術当業者によって理解される。さらに当業者は、分離技術が出発原料次第で異なり得ることを理解する。
大豆加工ストリームの一種である水性ホエーストリームおよび糖蜜ストリームは、ホールマメ科植物または油糧種子の精製過程から発生する。ホールマメ科植物または油糧種子は、多様な適切な植物に由来してもよい。非限定的例として、適切な植物としては、例えば大豆、トウモロコシ、エンドウマメ、カノーラ、ヒマワリ、ソルガム、米、アマランス、ジャガイモ、タピオカ、葛、カンナ、ルピナス、セイヨウアブラナ、小麦,オート麦、ライ麦、大麦、落花生、タチナタマメ、ハトムギ、マメ科植物、トンカマメ、フジマメ、ランスポッド(lancepods)(例えば、アップルリーフシード(apple leaf seed))、アルファルファ、スメイルメディックシード(snail medic seeds)、ライマメ、サンドマメ、インゲンマメ、ツルナシインゲンマメ、サトウキビ、キビ、材木用樹木、ホウレンソウ、チャプル(chapule)、繊毛虫類、デザートバナナ、レンズマメ、ふすま、ソラマメ、緑豆、小豆、ササゲ、ジャトロフィア(jatrophia)、緑藻類、およびそれらの混合物をはじめとするマメ科または非マメ科植物が挙げられる。一実施形態では、マメ科植物は大豆であり、大豆精製過程から発生する水性ホエーストリームは、水性大豆ホエーストリームである。
本明細書に記載される方法は、ホールマメ科植物または油糧種子の精製過程から発生する水性ホエーストリーム中に存在する、精製BBIタンパク質の回収および単離を対象とする。上で考察したように、ホールマメ科植物または油糧種子は、多様な適切な植物に由来してもよい。非限定的例として、適切な植物としては、例えば大豆、トウモロコシ、エンドウマメ、カノーラ、ヒマワリ、ソルガム、米、アマランス、ジャガイモ、タピオカ、葛、カンナ、ルピナス、セイヨウアブラナ、小麦,オート麦、ライ麦、大麦、落花生、タチナタマメ、ハトムギ、マメ科植物、トンカマメ、フジマメ、ランスポッド(lancepods)(例えば、アップルリーフシード(apple leaf seed))、アルファルファ、スメイルメディックシード(snail medic seeds)、ライマメ、サンドマメ、インゲンマメ、ツルナシインゲンマメ、サトウキビ、キビ、材木用樹木、ホウレンソウ、チャプル(chapule)、繊毛虫類、デザートバナナ、レンズマメ、ふすま、ソラマメ、緑豆、小豆、ササゲ、ジャトロフィア(jatrophia)、緑藻類、およびそれらの混合物をはじめとする、マメ科または非マメ科植物挙げられる。一実施形態では、マメ科植物は大豆であり、大豆の精製過程から発生する水性ホエーストリームは、水性大豆ホエーストリームである。
特定の実施形態では、本発明のBBIタンパク質は、例えば組換え手段によって、または合成的に生成される。本発明のタンパク質の組換え生産は、当業者に知られている標準技術を使用して行われる。このような方法としては、例えば1つまたは複数のコード核酸配列を作成することが挙げられ、それは全長cDNA配列をテンプレートとして使用して、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)ベースの方法によって実施し得る。所望の核酸配列の生成に続いて、配列を(例えば大腸菌(Escherichia coli)pCAL−n発現プラスミドをはじめとする)発現プラスミドに挿入し、次にそれを微生物に形質移入する;次に(例えば抗生物質耐性選択マーカーまたは発光選択マーカーをはじめとする)選択マーカーを使用して、所望の配列を含有するプラスミドを含有するクローン選択を実施する;所望の配列を含有するプラスミドを含有するクローンの大量生産がそれに続く;所望のクローンからペプチドを精製する(例えばGorlatov et al.Biochemistry(2002)41,4107−4116に記載される方法;米国特許第4,980,456号明細書を参照されたい)。代案としては本発明のペプチドは、合成手段または半合成手段(例えば組換え生産と合成手段の組み合わせ)によって製造し得る。
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語を下で定義する。
およそ3.7質量%の総タンパク量含量と、22.5質量%(乾燥質量基準)の総固形分を有する水性大豆ホエー(145l)をBTS−25またはMMM0.45ミクロン精密濾過膜を含有するOPTISEP 7000濾過モジュール内に導入する。膜に水性大豆ホエーを通過させると、水性大豆ホエーを含有する透過液(3.2質量%の固形分を有する132L)と、大豆ホエーの最初の細菌含量の99%以上、および大豆ホエーのケイ素脱泡剤含量の90%以上を含有する残余分とが形成される。
86.2質量%(乾燥質量基準;窒素燃焼アッセイ、標準ケルダール法による測定)の総タンパク量含量を有する噴霧乾燥大豆ホエータンパク質(44gm)を脱イオン水中で最終濃度10%(w/v)に再懸濁し、室温で2時間撹拌した。次に懸濁液をBeckman JA−10ローター内で10分間、4000×Gで遠心分離して不溶性物質を除去した。上清を4体積のクエン酸ナトリウム緩衝液(10mM、pH3.0)で希釈して、濃塩酸で最終pH3.0にさらに調節した。pH調節された上清を遠心分離し、Jouan C60ローター内で室温で30分間、4000RPMで不溶性物質を除去し、上清をデカントしてカラム装入材料として使用した。
既知のBBIタンパク質構造と、本発明のBBIタンパク質の比較として、表3に、それぞれに見られるアミノ酸残基のモル百分率(mol%)を記載する。本発明のBBI生成物は、UC DavisのMolecular Structure Facilityによって、L−8800 Hitachi分析器を使用して分析された。分析器はイオン交換クロマトグラフィーを使用してアミノ酸を分離し、「ポストカラム」ニンヒドリン反応検出システムがそれに続いた。標準加水分解手順は、6N HClを110℃で24時間使用した。標準酸加水分解に先だって、システイン酸およびメチオニンスルホンの酸安定形態を生じる過ギ酸での酸化によって、システイン(およびシスチン)およびメチオニンを測定した。トリプトファンは、MES加水分解工程を使用して測定した。
先に考察したように、対象において特定の病的状態を治療するのに、本発明のBBIタンパク質が使用される。BBIタンパク質は、単一BBIタンパク質であり、または本明細書に記載されるBBIタンパク質のあらゆる混合物である。本発明のBBIタンパク質は、例えば本発明のBBIタンパク質と薬学的に許容できるキャリアとを含んでなる組成物として、または本発明のBBIタンパク質を含んでなる食品として、投与し得る。
本明細書で実証されるように、本発明のBBIタンパク質を含んでなる組成物による処置は、退行性筋疾患デュシェンヌ型筋ジストロフィーのマウスモデルにおける骨格筋機能を改善する。
Claims (22)
- 少なくとも約90質量%の総BBIタンパク質濃度を有するBBI生成物を精製する方法であって、
(a)大豆タンパク質および不純物を含んでなる大豆加工ストリームにクロマトグラフ分離を施すステップと;
(b)任意選択的に、大豆タンパク質および不純物を含んでなる大豆加工ストリームに1つまたは複数の分離技術を施すステップと、
を含み、少なくとも約90質量%の総BBIタンパク質濃度を有するBBI生成物が得られる方法。 - クロマトグラフ分離が、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、および親和性クロマトグラフィーからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- クロマトグラフ分離が、イオン交換カラムを含んでなるイオン交換クロマトグラフィーである、請求項2に記載の方法。
- イオン交換カラムが、アニオン交換樹脂、カチオン交換樹脂、またはその組み合わせを含んでなる、請求項3に記載の方法。
- イオン交換カラムが前記BBI生成物を保持する、請求項3に記載の方法。
- イオン交換カラムが前記BBI生成物を保持しない、請求項3に記載の方法。
- 1つまたは複数の分離技術が、膜分離、電気泳動、透析、微粒子濾過、沈殿、遠心分離、結晶化、重力分離、および任意のその組み合わせからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 1つまたは複数の分離技術が膜分離である、請求項7に記載の方法。
- 大豆加工ストリームが、少なくとも約1リットル流体/時間−m2の体積流量で膜を通過する、請求項8に記載の方法。
- 体積流量が、約1〜約400リットルの流体/時間−m2である、請求項9に記載の方法。
- 大豆加工ストリームが、約0℃〜約100℃の温度で膜を通過する、請求項8に記載の方法。
- 大豆加工ストリームが、約25℃〜約75℃の温度で膜を通過する、請求項8に記載の方法。
- 膜が、精密濾過膜、限外濾過膜、またはその組み合わせを含んでなる、請求項8に記載の方法。
- pHを調節してBBIタンパク質の等電点未満に保ち、前記イオン交換樹脂によるBBIタンパク質の保持を提供するステップをさらに含む、請求項3に記載の方法。
- BBIタンパク質が前記イオン交換樹脂によって保持されないように、pHを調節してBBIタンパク質の等電点よりも高く保つステップをさらに含む、請求項3に記載の方法。
- 1つまたは複数の分離技術が、前記クロマトグラフ分離に先だって実施される、請求項1に記載の方法。
- 1つまたは複数の分離技術が、前記クロマトグラフ分離の後に実施される、請求項1に記載の方法。
- 精製BBI生成物が、少なくとも約95質量%の総BBIタンパク質濃度を有する、請求項1に記載の方法。
- 精製BBI生成物が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、および任意のその組み合わせと少なくとも90%の同一性を有する、少なくとも1つのアミノ酸配列を含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 精製BBI生成物が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、および任意のその組み合わせと少なくとも95%の同一性を有する、少なくとも1つのアミノ酸配列を含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも約90質量%の総BBIタンパク質濃度を有するBBI生成物を精製する方法であって、
(a)大豆タンパク質および不純物を含んでなる大豆加工ストリームに1つまたは複数の分離技術を施すステップと;
(b)大豆タンパク質および不純物を含んでなる大豆加工ストリームにクロマトグラフ分離を施すステップと
を含み、少なくとも約90質量%の総BBIタンパク質濃度を有するBBI生成物が得られる、方法。 - 少なくとも約90質量%の総BBIタンパク質濃度を有するBBI生成物を精製する方法であって、
(a)大豆タンパク質および不純物を含んでなる大豆加工ストリームに少なくとも1つの分離技術を施して、前記大豆タンパク質を含んでなる第1の透過液と、前記不純物を含んでなる第1の残余分を形成するステップと;
(b)前記第1の透過液に少なくとも1つの分離技術を施して、不純物を含んでなる第2の透過液と、大量のタンパク質留分を含んでなる第2の残余分を形成するステップと;
(c)少なくとも1つのクロマトグラフ分離に通過させるために、前記第2の残余分をキャリアストリームと合わせて、前記加工ストリーム中の他のタンパク質からBBIタンパク質ストリームを単離するステップと;
(d)前記BBIタンパク質ストリームを液体沈殿媒体と合わせ、それに少なくとも1つの分離技術を施して、沈殿BBIタンパク質画分を形成するステップと;
(e)前記沈殿BBIタンパク質画分を液体洗浄剤と合わせて、可溶化BBIタンパク質画分を形成するステップと;
(f)前記可溶化タンパク質画分に少なくとも1つの分離技術を施して、精製可溶化BBIタンパク質画分を形成するステップと;
(g)前記精製可溶化タンパク質画分に少なくとも1つの分離操作を施して、精製BBI生成物を形成するステップと
を含み、少なくとも約90質量%の総BBIタンパク質濃度を有するBBI生成物が得られる、方法。
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