CN108697116A - 用于测定谷物、面粉、植物和复合食品中的谷物淀粉酶胰蛋白酶抑制剂的生物活性、量、除去或失活的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及从加工和未加工的食品中提取淀粉酶胰蛋白酶抑制剂(ATI)、测定ATI的生物活性、对食品中的ATI的量进行定量以及降低食品中的ATI的含量的方法。
Description
背景
摄入小麦、大麦或黑麦引发乳糜泻患者的小肠炎症。具体地说，这些谷物(麸质)的贮藏蛋白在携带HLA-DQ2或HLA-DQ8作为主要遗传易感性的个体中引发适应性Th1介导的免疫应答。适应性免疫的这种明确定义的作用与乳糜泻中先天免疫的不确定组成部分形成对比。已经鉴定了小麦和相关谷物中的α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂(ATI)CM3和0.19虫性分子作为单核细胞、巨噬细胞和树突细胞中先天免疫应答的强活化剂。ATI接合TLR4-MD2-CD14复合物并导致成熟标志物的上调。然后ATI引发从乳糜泻和非乳糜泻患者中的细胞释放促炎性细胞因子。在用ATI口服激发后，TLR4或TLR4信号传导缺陷的小鼠被保护免受肠道和全身免疫应答。这些发现将谷物ATI定义为乳糜泻的贡促成因素。此外且重要的是，ATI是加剧并因此可在其他肠道和非肠道免疫病症中激化炎症和不良免疫反应的强营养候选物。在这种血管中，ATI是非乳糜泻非过敏性小麦敏感性(目前专家手中的排除诊断)的最可能的引发剂，其中患者患有与消耗含麸质的食物紧密相关的肠道和/或肠道疾病。这种病状可影响达约10％的全球大多数小麦消费群体。因此，非常需要能够从食物中除去ATI和/或允许生产维持含麸质食物的所需性质、但ATI含量和生物活性低的食物的新颖技术和方法。此类技术的发展与分析方法密切相关，以对在加工以用于消费之前和之后食品中的ATI含量和生物活性进行定量。
发明概述
本发明涉及从加工和未加工的食品中提取ATI、测定ATI的生物活性、对食品中的ATI的量进行定量、降低食品中的ATI的含量以及支持生产具有降低的ATI含量的食品的方法。
在第一方面，本发明涉及一种降低食品的ATI含量的方法，其中所述方法包括将所述食品在提取缓冲液中孵育足以使所述食品的ATI含量降低至少50％的持续时间，随后从所述食品中除去所述提取缓冲液。
在一些实施方案中，所述提取缓冲液是中性、近中性或碱性溶剂或缓冲液。在一些实施方案中，所述提取缓冲液选自由以下各项组成的组：PBS、Tris缓冲液、水和碳酸氢铵或碳酸氢钠。在一些实施方案中，所述提取缓冲液含有盐(例如，0.1-1M NaCl)。
在一些实施方案中，所述提取缓冲液还包含洗涤剂或洗涤剂混合物。在一些实施方案中，所述洗涤剂或洗涤剂混合物选自由以下各项组成的组：十二烷基硫酸钠、TritonX-100、Tween-20和脱氧胆酸钠。
在一些实施方案中，所述提取缓冲液还包含还原剂。在一些实施方案中，所述还原剂选自由以下各项组成的组：巯基乙醇、二硫赤藓糖醇(DTT)、半胱氨酸、用氧化型谷胱甘肽(GSSG)平衡的谷胱甘肽(GSH)、亚硫酸盐和硫氧还蛋白。
在一些实施方案中，所述提取缓冲液还包含至少一种蛋白酶和/或工程化为还原和/或降解ATI的合成酶。本文进一步详细描述了工程化为还原和/或降解ATI的合成酶的实例。在一些实施方案中，所述蛋白酶是胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、真菌蛋白酶、酵母蛋白酶或细菌蛋白酶。在一些实施方案中，所述碱性蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。
在一些实施方案中，所述提取缓冲液还包含烷化剂。在一些实施方案中，所述烷化剂是碘乙酰胺，并且通过添加过量还原剂将所述烷化剂进一步淬灭。
对于食品技术，如ATI去富集的面粉的大量制备等，可在分离含有提取的ATI的上清液后直接使用提取的食品(例如，面团)。例如，湿面团经常被冷冻并直接运送至面包店。
在一些实施方案中，使所述食品在孵育之前机械分离。在一些实施方案中，使所述机械分离的食品在孵育之前干燥。
在一些实施方案中，所述干燥是空气干燥或冷冻干燥。在一些实施方案中，在所述干燥之前，使所述机械分离的食品与水性溶剂或沸点低于水的有机溶剂接触。在一些实施方案中，所述有机溶剂选自由丙酮和乙醇组成的组。
在第二方面，本发明的特征是一种从食品中提取淀粉酶胰蛋白酶抑制剂(ATI)的方法，其中所述方法包括：A)将所述食品与提取缓冲液一起在混合物中孵育；B)对所述混合物进行离心以形成沉淀和上清液；C)对所述上清液进行干燥；以及D)在重构缓冲液中重构所述干燥的上清液，其中提取的ATI存在于所述重构缓冲液中。
在一些实施方案中，所述食品在提取之前未被加工。在一些实施方案中，所述食品是加工食品。在一些实施方案中，所述食品是麸质。
在一些实施方案中，在步骤A之前，将所述食品研磨。在一些实施方案中，在步骤A之前，将所述食品脱脂。在一些实施方案中，所述脱脂通过将所述食品与甲醇/二乙醚一起孵育来进行。在一些实施方案中，所述甲醇/二乙醚以1:1比率存在。在一些实施方案中，所述提取缓冲液是碳酸氢铵或碳酸氢钠、氯仿/甲醇或酸。在一些实施方案中，所述酸是乙酸。
在一些实施方案中，所述提取缓冲液的浓度介于5mM至100mM之间。
在一些实施方案中，所述干燥是冷冻干燥或在气体例如空气流下干燥。
在一些实施方案中，在步骤D之前重复步骤A至C。在一些实施方案中，步骤A至C中的提取缓冲液是第一氯仿/甲醇，并且当重复步骤A至C时所述提取缓冲液是碳酸氢铵或碳酸氢钠，或其中在两次提取中所述提取缓冲液是碳酸氢铵或碳酸氢钠。
在一些实施方案中，在步骤A之前，用至少一种蛋白酶和/或工程化为还原和/或降解ATI的合成酶将所述食品消化。在一些实施方案中，所述蛋白酶是胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、真菌蛋白酶、酵母蛋白酶或细菌蛋白酶。在一些实施方案中，所述碱性蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。
在一些实施方案中，将所述食品首先用胃蛋白酶消化，随后用胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶消化。
在一些实施方案中，在用蛋白酶消化所述食品后，将所述食品离心以形成上清液，并将所述上清液与步骤A的所述提取缓冲液一起孵育。在一些实施方案中，所述孵育作为透析孵育进行，省略了步骤B，并且在透析后将所述上清液在步骤C中干燥。
在第三方面，本发明涉及一种测定样品中的ATI的生物活性的方法，其中所述方法包括将ATI-反应性细胞与疑似包含ATI的提取物一起孵育，并测定所述ATI-反应性细胞中的ATI-应答，由此测定样品中所述ATI的生物活性。
在一些实施方案中，通过本发明的第一方面和第二方面中描述的方法来制备所述疑似包含ATI的提取物。
在一些实施方案中，所述ATI-反应性细胞表达TLR4、TLR4-MD2或TLR4-MD2-CD14信号传导复合物。在一些实施方案中，所述ATI-反应性细胞选自由以下各项组成的组：单核细胞/巨噬细胞、树突细胞以及用TLR4、TLR4-MD2或TLR4-MD2-CD14低聚信号传导复合物转染的细胞。
在一些实施方案中，所述细胞是稳定细胞系，例如THP-1和U937细胞。在一些实施方案中，所述细胞是用TLR4-信号传导复合物转染的细胞(例如，HeLa或HEK293细胞)。
在一些实施方案中，所述ATI-应答测定包括对由所述细胞释放的一种或多种细胞因子进行定量。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子选自由以下各项组成的组：例如，IL-8、IL-15、TNFα、CCL2(MCP-1)以及CCL5(RANTES)。
在一些实施方案中，释放的趋化因子和/或细胞因子或相关因子的定量是通过ELISA进行。
在一些实施方案中，所述细胞包含处于TLR4(ATI)-应答启动子控制下的报道基因，并且所述ATI应答测定包括检测所述报道基因的表达。在一些实施方案中，所述ATI-应答启动子是IL-8启动子。在一些实施方案中，所述报道基因编码发光或荧光蛋白。
在一些实施方案中，所述ATI-应答测定包括测量所述细胞中与ATI-应答相关的一种或多种RNA的水平。在一些实施方案中，所述一种或多种RNA对应于趋化因子、细胞因子、Hsp27、Hsp70和/或Hsp90的那些。
在一些实施方案中，所述ATI-应答测定包括检测所述细胞上或所述细胞中的一种或多种活化标志物。在一些实施方案中，所述一种或多种活化标志物选自由以下各项组成的组：CD80、CD86、MHC II类、IL-12、IL-23和干扰素γ(释放或细胞内染色)。
在一些实施方案中，所述检测包括流式细胞术。
在一些实施方案中，所述ATI-应答测定包括检测与ATI应答相关的信号传导途径中的改变。在一些实施方案中，基于检测IRF-3、NFkB(p65)或NFkB核易位来检测信号传导途径中的所述改变。
在一些实施方案中，所述ATI-应答测定包括在所述疑似含有ATI的样品存在下接触卵白蛋白或麸质特异性T细胞，以及在ATI-反应性抗原呈递细胞存在下测量所述细胞的增殖。
在第四方面，本发明涉及一种测定样品中的ATI的生物活性的方法，其中所述方法包括A)将固定的TLR4、TLR4-MD2或TLR4-MD2-CD14与疑似包含ATI的提取物一起孵育，其中所述固定的TLR4、TLR4-MD2或TLR4-MD2-CD14被固定至固相并结合至标记的ATI，B)除去所述提取物，以及C)测定所述提取物中或与固定至所述固相的所述固定的TLR4、TLR4-MD2或TLR4-MD2-CD14结合的标记的ATI的量。
在一些实施方案中，所述标记的ATI用荧光团标记。在一些实施方案中，所述标记的ATI用酶(例如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)标记。
在第五方面，本发明的特征是一种测定样品中的ATI的生物活性的方法，所述方法包括A)将固定的TLR4、TLR4-MD2或TLR4-MD2-CD14与疑似包含ATI的提取物一起孵育，B)除去所述疑似包含ATI的提取物，以及C)在ELISA中使用抗体测定与所述固定的TLR4结合的ATI的量。
在一些实施方案中，所述抗体识别并结合至至少一种选自由以下各项组成的组的ATI：CM3、CM2、0.19、0.28以及0.53。
在第六方面，本发明的特征是一种对食品中的ATI的量进行定量的方法，其中所述方法包括：A)将所述食品在提取缓冲液中孵育，从而形成提取物；B)任选地将所述提取物与烷化剂一起孵育；C)任选地将所述ATI与所述提取物分离；以及D)对所述ATI进行定量。
在一些实施方案中，所述提取缓冲液是中性、近中性或碱性溶剂或缓冲液。在一些实施方案中，所述提取缓冲液选自由以下各项组成的组：PBS、Tris缓冲液和碳酸氢铵或碳酸氢钠。
在一些实施方案中，所述提取缓冲液还包含洗涤剂或洗涤剂混合物。在一些实施方案中，所述洗涤剂或洗涤剂混合物选自由以下各项组成的组：十二烷基硫酸钠、TritonX-100、Tween-20和脱氧胆酸钠。
在一些实施方案中，所述提取缓冲液还包含还原剂。在一些实施方案中，所述还原剂选自由以下各项组成的组：巯基乙醇、二硫赤藓糖醇(DTT)、半胱氨酸、用氧化型谷胱甘肽(GSSG)平衡的谷胱甘肽(GSH)、亚硫酸盐和硫氧还蛋白。
在一些实施方案中，所述提取缓冲液还包含烷化剂。在一些实施方案中，所述烷化剂是碘乙酰胺，并且通过添加过量还原剂将所述烷化剂进一步淬灭。
在一些实施方案中，所述方法还包括将至少一种蛋白酶和/或工程化为还原和/或降解ATI的合成酶添加至所述提取物。本文进一步详细描述了工程化为还原和/或降解ATI的合成酶的实例。在一些实施方案中，所述蛋白酶是胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、真菌蛋白酶、酵母蛋白酶或细菌蛋白酶。在一些实施方案中，所述蛋白酶是胃蛋白酶。
在一些实施方案中，通过质谱法、定量蛋白质印迹或ELISA来对所述ATI进行定量。
在一些实施方案中，涉及固定的TLR4(例如，TLR4-MD2、TLR4-CD14或TLR4-MD2-CD14)和标记的ATI的测定可用于对食品中的ATI的量进行定量和/或测定食品中的ATI的生物活性的方法中。在此测定中，将TLR4固定在固体载体(即，96孔板的孔或珠粒)上。然后将标记的ATI(即，荧光团标记的ATI)添加至96孔板的孔中的固定的TLR4(例如TLR4-MD2，TLR4-CD14或TLR4-MD2-CD14)以形成TLR4(例如，TLR4-MD2、TLR4-CD14或TLR4-MD2-CD14)/标记的ATI的复合物。此外，将含有来自食品的提取的ATI的样品在之前、同时或之后添加至96孔板的含有TLR4(例如，TLR4-MD2、TLR4-CD14或TLR4-MD2-CD14)/标记的ATI复合物的孔。样品中的提取的ATI与标记的ATI竞争结合至固定的TLR4(例如，TLR4-MD2、TLR4-CD14或TLR4-MD2-CD14)。在将含有提取的ATI的样品与TLR4(例如，TLR4-MD2、TLR4-CD14或TLR4-MD2-CD14)/标记的ATI复合物一起孵育后，洗涤平板以除去未结合的标记的ATI。样品中提取的ATI越多，更多标记的ATI被TLR4(例如，TLR4-MD2、TLR4-CD14或TLR4-MD2-CD14)/标记的ATI复合物竞争置换并保持未结合。如果标记的ATI附接至特定荧光团，则保持与固体载体结合的荧光(发光)信号的量或洗涤物中的荧光信号(发光)的量可用作样品中提取的ATI的量的指示。在其他实施方案中，所述标记的ATI可通过与酶(即辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)或荧光或发光蛋白质偶联的第二试剂(即抗体)来检测，所述酶或蛋白质在与其特异性底物反应时产生光谱测定信号。在一些实施方案中，所述抗体识别并结合至至少一种选自由以下各项组成的组的ATI：例如，CM3、CM2、0.19、0.28以及0.53。
在一些实施方案中，所述ATI生物活性的测量可通过经由常规ELISA(例如夹心ELISA)或相关测定确定提取的ATI的量来代替。虽然这是目前技术水平，但证明，一旦确定了关键或主要天然ATI或某些ATI片段的选择，其总量与所测量的生物活性良好关联。在一些实施方案中，此类ELISA或相关技术识别并结合至至少一种选自由以下各项组成的组的ATI：例如，CM3、CM2、0.19、0.28以及0.53。
用于测量ATI-生物活性/量的分析方法与选择和制备含有ATI或ATI-去富集的食品集中联系。这些用于测量ATI-生物活性/量的分析测定有助于产生所需量的食品。据估据估计，通过将0.5-1.0克的基于小麦(例如，大麦、黑麦)的饮食中的平均ATI消耗降低大约90％来消除ATI的疾病促进作用(参见例如，Catassi等人,Nutrients 7:4966-4977,2015；Fasano等人,Gastroenterology 148:1195-1204,2015；Schuppan等人,Best Practice&Research:Clinical Gastroenterology 29:469-76,2015)。
在第七方面，本发明的特征是一种生产具有降低的ATI含量或不含ATI的食品的方法，所述方法包括：A)测定所述食品中的ATI的生物活性，和/或B)对所述食品中的ATI的量进行定量，以及C)通过使用一种或多种还原剂、蛋白酶和/或工程化为还原和/或降解所述食品中的ATI的合成酶提取和降解ATI来降低所述食品中的ATI的量。
在第七方面，本发明的特征是一种降低食品的反应性的方法，其中所述方法包括将谷物与氧化型谷胱甘肽(GSSG)和/或蛋白质结合的氧化型谷胱甘肽(PSSG)一起培养。在一些实施方案中，还将所述谷物与平衡量的还原型谷胱甘肽(GSH)一起培养。
在第八方面，本发明涉及一种降低食品的ATI/TLR4反应性的方法，其中所述方法包括将谷物与富含硫或贫硫的肥料一起培养。
在第九方面，本发明涉及一种降低食品的ATI含量的方法，其中所述方法包括用具有高二硫化物还原和/或蛋白水解能力的细菌使所述食品发酵。在一些实施方案中，所述细菌选自由以下各项组成的组：旧金山乳酸杆菌和罗伊氏乳酸杆菌LTH2584。
附图描述
图1示出与单独PBS或1mg的于200μl PBS中的粗Sigma麦醇溶蛋白(含有约15％wt/wt的ATI)相比，在口服管饲200μg的于200μl PBS中的纯化小麦ATI后12小时健康C57BL6小鼠的肠中的低度先天炎症的诱导。使用标准化至作为管家基因的GAPDH mRNA的定量RT-PCR从收获的肠中确定炎症基因。ATI也引起转谷氨酰胺酶2(TG2)mRNA的适度上调，其是对乳糜泻发病机制来说重要的。(A)：在向保持无麸质饮食的C57BL/6小鼠饲喂单剂量的ATI或含ATI的麦醇溶蛋白(来自Sigma的商业产品，具有约15％wt/wtATI)后，肠中炎症标志物(MCP-1＝CCL2和KC＝IL-8)和TG2的转录水平上调。n＝5只/组；*p<0.05。在一次口服ATI对比比BSA激发后血清IL-6的动力学，以及从由20％作为蛋白质来源的酪蛋白与限定的碳水化合物和脂肪组成的无麸质饮食改变为其中1％wt/wt的酪蛋白被ATI替代的饮食(GF到ATI)或其中25％的蛋白质被含有约5％w/w ATI的麸质替代的饮食(GF到G25)的小鼠对比继续GF饮食(GF到GF)的小鼠持续7天中的血清IL-8水平。(B)：在用ATI或含ATI的麦醇溶蛋白激发的组中，F4-80阳性细胞(巨噬细胞，x200)较高。巨噬细胞显示深色(过氧化物酶染色)。计数每个样品4个高倍视野中的阳性细胞的定量评定。n＝5只/组。
图2示出含有ATI的饮食加剧炎症性肠病。通过在维持无麸质饮食(GFD，基于纯酪蛋白的蛋白质源)或含25％的麸质(具有约15％w/w为ATI)/75％作为蛋白质来源的酪蛋白的“正常”食物的雌性C57BL/6小鼠的饮用水中添加低剂量的1.5％DSS(w/v)来诱导葡聚糖硫酸钠(DSS)结肠炎(Lauroui等人,PLoS One 7:e32084,2012；Wirtz等人Nat.Protoc.2:541-546,2007)。每两天记录小鼠体重变化，所述体重变化是结肠炎的严重程度的有力指标(数据由Ps组中的G.Pickert博士提供)。从第12天开始变化显著(不含ATI对比含ATI的食物，p<0.05)。
图3示出含有ATI的饮食加剧实验性多发性硬化症。(A-D)：在维持无麸质饮食(GFD，酪蛋白作为蛋白质来源)的雌性C57BL/6小鼠中通过用髓磷脂少突胶质细胞蛋白免疫(在免疫的第一天和2天后在完全弗氏佐剂和百日咳毒素中乳化的MOG35–55)来诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)(一种合适的多发性硬化症模型)。将动物分成继续维持GFD的组1和改变为含有25％麸质(具有约15％w/w作为ATI)/75％作为蛋白质来源的酪蛋白的饮食的组2。使用提取的脑组织的FACS分析来计算浸润CNS的总T细胞(A)、CD4+(B)和CD8+(C)T细胞数目(示出三个独立实验的代表性实验，其中n＝4只小鼠/组)。在诱导后(诱导后天数，DPI)每天观察小鼠并针对EAE的临床征象评分(D)。数据代表三个独立实验(n＝10只/组，最大临床评分3.75)。*将两组进行比较，p<0.05。(E)：如图3A中，维持无麸质饮食(GFD)的雌性C57BL/6小鼠中的EAE诱导。将动物分成四组：组1继续GFD(GF到GF)，组2改变为含有纯化的ATI的饮食(GF到ATI；含1％纯化ATI的基于酪蛋白的蛋白质源)，组3改变为含有25％麸质的饮食(约15％w/w作为ATI)(GF到G)，并且组4改变为通过提取含有25％麸质与部分去富集ATI的饮食(ATI含量降低约70％(GF到G-ATI)。在诱导后(诱导后天数，DPI)每天观察小鼠并针对EAE的临床征象评分(D)。数据代表一个独立实验(n＝10只/组，最大临床评分：2.5：初期后腿麻痹，参见下文)。*对于GF/GF对比GF/ATI，从基线至疾病峰值的曲线下面积，p<0.05。临床EAE评分：0，无疾病；1，尾张力降低；2，异常步态(共济失调)和/或翻正反射受损(后肢无力或部分麻痹)；3，部分后肢麻痹；4，完全后肢麻痹；5，后肢麻痹伴随部分前肢麻痹；6，濒死或死亡。
图4示出含有ATI的饮食加剧过敏性哮喘。(A-F)：在维持无麸质饮食(GFD，酪蛋白作为蛋白质来源)或含有25％麸质(具有约15％w/w为ATI)/75％作为蛋白质来源的酪蛋白的“正常”食物的雌性C57BL/6小鼠中通过卵白蛋白(OVA)致敏和激发来诱导鼠哮喘模型。在致敏后分析血清IgG1(A)。在用PBS或OVA三次激发后杀死动物。使用支气管肺泡灌洗液(BALF)来制备细胞离心涂片器并计数细胞群体(B)。BALF也用于测量IL-13和IL-5分泌(C和D)。在H&E和PAS染色后对组织学肺切片进行评分(E和F)。(G-I)：如在图4A中所详述，在维持无麸质饮食(GFD)的雌性C57BL/6小鼠中通过OVA致敏和激发诱导鼠哮喘模型。将动物分成5组：组1继续使用GFD并用PBS致敏，组2继续使用GFD并用OVA致敏，组3改变为含有25％麸质(具有约15％w/w为ATI)/75％作为蛋白质来源的酪蛋白)的饮食，组4改变为含有ATI(具有1％纯化ATI的基于酪蛋白的蛋白质来源)的饮食，并且组5改变为含有25％麸质与低水平ATI的饮食(ATI去富集约70％)。所有组都用OVA激发，且然后杀死。从各组分离脾细胞并用3μg/mL的OVA刺激以进行增殖测定(A)。针对细胞因子IL-13和IL-5分析上清液(B和C)。**p<0.01，***p<0.005。
图5示出从小麦(黑麦、大麦)面粉、其相关产品和其他植物粉末中提取ATI以测定生物活性的简单方法。使用水提取是不完全的，但是使用含有低-中等浓度盐(优选NaCl)的缓冲溶液可改善和再现。实例是磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4或5-50mM碳酸氢铵(Abic)。也可使用其他浓度的在溶剂中的这些化学品或具有缓冲性质的相关或不相关的化学品，如EDTA、EGTA、碳酸氢钠、碳酸钠和各种磷酸盐缓冲液。可针对水、Abic溶液或乙酸(AA)进行提取物的透析。与AA相比，Abic透析在细胞读出系统中产生更高的ATI生物活性。在例如1小时的两次连续提取(第1次和第2次提取)后，可在不进行脱脂的情况下直接测定生物活性。类似地，用后者或类似的简化方法可进行用于大量ATI-去富集食品的制剂的提取。
图6示出来自小麦粉中的ATI的提取和生物活性测定。(A和B)：从来自现代小麦和更古老的小麦变种(伊朗，卡姆)的10g面粉依次提取总蛋白质AA：0.05％乙酸；Abic；50mM碳酸氢铵缓冲液。使用人单核-巨噬细胞系THP-1和标准化的冻干提取物(代表>90％的总ATI非人组合的第1和第2提取物)的生物活性测定。(C，D和E)：用碳酸氢铵(ABic)依次提取(3次提取)商业小麦粉和两种更古老的六倍体小麦变种(伊朗和卡姆)。使用不同时间点(从0.5到24小时)、不同浓度的Abic进行顺序提取，并测定每种提取物的ATI生物活性。
图7示出来自面粉和食品的ATI的提取和生物活性测定。(A，B，C，D和E)：含麸质谷物、无麸质主食/植物、用小麦、不同小麦品种(全部现代六倍体(德国霍恩海姆大学的F.Longin博士的馈赠))制造的产品以及商业啤酒的生物活性。在这些生物测定中，1μg的IL-8释放等同于约2mg的ATI。
图8示出(A)来自小麦的纯化的ATI对用胃蛋白酶、胰蛋白酶或胃蛋白酶和胰蛋白酶的序列消化2小时的抗性(在37℃下酶:底物比率1:100；在这些消化后生物活性仅降低约30％；BSA充当阴性对照。(B和C)相较于无麸质面包和烹饪意大利面，来自不同商业麸质以及来自含麸质面包对比面粉的ATI的提取和生物活性测定(全部在胃蛋白酶.胰蛋白酶消化、随后两次连续组合的碳酸氢铵提取后进行)。(D)：在升高的温度下通过还原和烷基化完成ATI灭活；在所使用的THP1细胞生物测定中，LPS用作阳性对照。
图9示出用于提取的ATI的生物活性定量的其他高灵敏度生物测定。将用Abic的ATI提取物冻干并标准化为蛋白质含量。(A)鼠骨髓来源的树突细胞(BM DC)和(B)TLR4/MD-2/CD14/IL-8 Prom/LUCPoterTM细胞系中的剂量依赖性刺激性应答。与图6中使用的THP-1细胞相比，这些读出细胞对ATI-生物活性显示更高的灵敏度(浓度高于约50和约100μg的ATI/ml下的上限效应)。
图10示出来自面粉和烘焙食物的总结ATI生物活性测定结果。大多数无麸质食物中ATI含量通常较低。根据生物活性ATI的量(如通过生物测定之一确定的先天刺激活性)对谷物和食物进行分类。高：典型的含麸质谷物和产品，中等：介于约5％-20％之间，以及低：低于典型含麸质谷物或食物的的5％。
图11示出SDS PAGE凝胶(4％-20％梯度)上来自小麦粉的提取物中的ATI。(A)：用乙酸(AA)提取并使用不同浓度的氯化钠(NaCl)盐析的春小麦。ATI代表运行在10-15kD范围内的大部分条带。用或不用还原剂(二硫苏糖醇，dtt)处理上清液(s)和沉淀(p)。值得注意的是，在酸性范围内，ATI在0.2M NaCl之间显著沉淀，而在0.5M NaCl，麸质将沉淀(25kD范围以上的条带)。(B)：在有或无还原剂的情况下用碳酸氢铵(Abic)提取的三种不同的小麦样品。Abic主要提取ATI(分子量约15kDa的显著条带)，仅少量麸质和其他蛋白质。
图12示出(A)：使用质谱法测定不同小麦提取物中的总ATI-量和ATI-物种，以及(B)：不同提取物的主要ATI以及其他ATI的相对量，所述其他ATI包括胰凝乳蛋白酶抑制剂WCI、内源性α-淀粉酶/枯草杆菌蛋白酶抑制剂和CMX1/CMX3。
图13示出使用质谱法，不同小麦提取物中ATI-物种的相对量。(A)：Abic提取物，(B)：氯仿/甲醇(CM)提取物，(C)：商业提取物(1520)，以及(D)：商业提取物(3535)。将冻干的ATI提取物(Abic和氯仿-甲醇)还原/烷基化，用胰蛋白酶消化并进行质谱分析。“其他”包括胰凝乳蛋白酶抑制剂WCI、内源性α-淀粉酶/枯草杆菌蛋白酶抑制剂和稀有ATI CMX1/CMX3)。
图14示出使用质谱法和蛋白质印迹法，不同小麦提取物中的主要ATI-物种CM3和0.19的相对量。(A和B)：使用质谱法测定，商业提取物1520和3535中CM3和0.19相对于总蛋白质的百分比的测定。(C)：分别使用对CM3和0.19具有特异性的兔肽抗体的还原SDS PAGE凝胶(4％-20％梯度)和蛋白质印迹。
图15示出发酵的小麦面团的ATI生物活性。(A)：用10％黑麦麦芽发酵的90％小麦面团中的ATI生物活性。将样品用Abic提取，冻干并重构。将标准化提取物与人单核细胞系THP-1一起培养并通过ELISA测量分泌的细胞因子(IL-8、MCP-1和TNF-α)。条形代表用不同菌株(旧金山乳酸杆菌(突变体)、清酒乳酸杆菌、罗伊氏乳酸杆菌和旧金山乳酸杆菌)发酵的样品。其他条形代表未发酵的黑麦麦芽的对照样品。结果来自3至5个样品，并使用单向ANOVA分析其显著性，并使用杜奈特氏检验与未发酵样品(对照)进行比较。显著性水平(p<0.05)用星号表示。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005。(B)：用100％全麦制备的发酵面团的ATI生物活性。用Abic提取样品并如上所述进行分析。
图16示出使用天然TLR4拮抗剂LPS-RS对ATI-生物活性的抑制。将来自类球红细菌的TLR4抑制性脂多糖(LPS-RS，1.5μg/mL)与THP-1细胞一起预孵育30分钟，然后添加富含CM3和0.19(37.5μg/mL)的ATI并培养过夜。还将大肠杆菌LPS(12.5ng/mL)与用LPS-RS(250ng/mL)预孵育(30分钟)的THP-1细胞一起培养过夜。大肠杆菌LPS(12.5ng/mL)、LPS-RS(1.5μg/mL)或单独缓冲液充当对照。
发明详述
淀粉酶胰蛋白酶抑制剂(ATI)
淀粉酶胰蛋白酶抑制剂(ATI)(作为用于所有结构上且特别是功能上相关的分子的术语)是存在于植物中的分子，所述分子充当先天免疫活化的引发剂。ATI不仅影响乳糜泻活动，而且影响其他炎性病状。如本文所用，ATI是指在食品中具有TLR4刺激活性的分子。在一些实施方案中，ATI通过模拟由两个TLR4分子和两个MD2分子组成的四聚体TLR4-信号传导复合物的MD2蛋白组分来刺激反应性细胞。
ATI作为TLR4的营养活化剂的新发现的活性不同于麸质在乳糜泻中和小麦(黑麦、大麦)蛋白在过敏症中的活性。ATI也可用作吸入性过敏原(Schuppan等人,Gastroenterology 2009；Batais等人,EurAnn Allergy Clinic 2008；Catassi等人,Nutrients 2013；Uvackova等人,J Proteome Res 2013)。值得注意的是，在小麦、大麦或黑麦(含麸质谷物)以及在一些含非麸质主食情况下摄入的ATI的致病效力不限于胃肠道，但也可能牵涉到影响其他肠外疾病(Catassi等人,Nutrients 7:4966-4977,2015；Fasano等人,Gastroenterology 148:1195-1204,2015；Schuppan等人,Best Practice&Research:Clinical Gastroenterology 29:469-76,2015)。已经积累了广泛的证据表明，营养性ATI在小肠、结肠和周围肠系膜淋巴结中诱导低度但显著的炎症。值得注意的是，营养性ATI通常加重炎性疾病，如在炎性肠病、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、非酒精性脂肪性肝炎和过敏性哮喘的小鼠模型中所说明。图1至4在所提及的体内情况和疾病中证明了这种“佐剂效应”。
除了含麸质食品如小麦、大麦和黑麦外，还检测到由ATI在一些无麸质食品如粟、大豆和藜麦中引起的显著TLR4刺激活性。还观察到，在低海拔和/或广泛受精情况下栽培的食物倾向于含有高水平的ATI，而在高海拔和/或未受精情况下栽培的食物通常含有较低水平的ATI或甚至不含ATI。这可通过小麦、黑麦和大麦(含麸质谷物)中ATI的结构相似性来解释，例如小麦中的主要CM3、CM2、0.19、0.28和0.53变体及其在大麦和黑麦中的同系物。这些ATI中的一些在无麸质主食中发现。本发明的方法可在疑似含有ATI的各种食品中进行，包括含麸质食品和无麸质食品以及已经例如通过烹饪或烘焙加工的食品，所述加工仅稍微降低ATI含量和生物活性。本发明的方法允许通过测量ATI含量和/或生物活性来选择表达低水平ATI的小麦变种。通过测量ATI含量和/或生物活性鉴定表达低水平ATI的小麦变种允许使用本文所述的ATI-还原/提取方法将这些小麦变种随后ATI去富集。
在消费前需要除去ATI以便产生较少促炎性食品的食品的一些实例示于图10中。
ATI还原剂和降解酶
ATI对通过许多已知蛋白酶降解具有抗性，包括人胃肠道的消化酶，如胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。这种抗性大部分是由于在ATI中存在若干(即，通常五个)分子内二硫键，所述二硫键产生紧凑的二级结构。一旦ATI中的二硫键被还原剂还原并且ATI暴露于适度升高的温度例如60℃(取决于缓冲系统)，则ATI活性丧失。然而，ATI可在较低温度下重折叠并恢复生物活性。因此，用于消除食品中的ATI生物活性的一种策略是使用酶进一步降解ATI，从而防止ATI重折叠。
可用于还原ATI中的二硫键的还原剂包括但不限于巯基乙醇、二硫赤藓糖醇(DTT)、半胱氨酸、谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、蛋白质结合的谷胱甘肽(PSSG)、亚硫酸盐以及硫氧还蛋白。在一些实施方案中，还原剂可通过例如还原型谷胱甘肽(GSH)平衡。在一些实施方案中，具有高二硫化物还原能力的细菌(例如，旧金山乳酸杆菌和罗伊氏乳酸杆菌LTH2584)可用作还原剂。在一些实施方案中，可用具有高二硫化物还原能力的细菌(例如，旧金山乳酸杆菌和罗伊氏乳酸杆菌LTH2584)培养和/或发酵食品。在一些实施方案中，可将一种或多种还原剂添加用于孵育食品的提取缓冲液中。在一些实施方案中，一种或多种还原剂可用于在酶降解之前还原ATI中的二硫键。在一些实施方案中，一种或多种还原剂可与酶组合(即，同时)使用以还原和降解ATI。
酶如蛋白酶可用于降解ATI。可用于降解ATI的蛋白酶包括但不限于胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、真菌蛋白酶、酵母蛋白酶以及细菌蛋白酶。碱性、中性和酸性蛋白酶是分别在碱性(即，在约8至约14的pH)、中性(即，在约7的pH)和酸性pH(即，在约1至约6的pH)条件下活性最高且最佳作用的蛋白酶。可用于降解ATI的碱性蛋白酶的实例包括但不限于丝氨酸蛋白酶、内肽酶、蛋白酶K、(Novozymes)、(Novozymes)、(Genencor)、(Henkel)、(KaoCorporation)以及本领域中已知的其他碱性蛋白酶，例如在Anwar等人,Biores.Tech.64:175-183,1998中描述的碱性蛋白酶，所述文献以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，取决于提取缓冲液的pH，可选择一种或多种适当的蛋白酶(即碱性、中性和/或酸性蛋白酶)以添加提取缓冲液中来降解ATI。例如，可将碱性蛋白酶(例如丝氨酸蛋白酶)添加碱性提取缓冲液中。
在一些实施方案中，酶可进行特异性工程化或进化以降解ATI(即合成酶)。可用于将酶工程化或进化以具有新颖能力的技术是本领域中已知的，即如美国专利号6,171,820和6,579,258中描述的随机诱变、蛋白酶文库筛选、突变体筛选、基因重组、基因位点饱和诱变(GSSM)以及美国专利号6,537,776中描述的可调基因组装(TGR)，所述专利各自以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，用于降解ATI的酶可被工程化为具有二硫键还原剂和蛋白酶的功能。在一些实施方案中，特异性地工程化或进化以降解ATI的酶可与一种或多种蛋白酶组合使用，所述蛋白酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、真菌蛋白酶、酵母蛋白酶以及细菌蛋白酶。
实施例
实施例1-用于测定未加工食品和加工食品中由于ATI所致的(促炎性)生物活性的方法
1.1.ATI的定量提取和ATI的蛋白水解消化
从不同的谷物、谷粒和食物中定量ATI提取以测定生物活性
缓冲液/溶剂提取方法(适用于大多数未加工食物，参见图5中的草图)：
1.将干燥材料研磨并筛分
2.将20g用200ml甲醇/二乙醚1:1在4℃-8℃下脱脂2小时(搅拌)
3.在5.000至10.000rpm下离心10至30分钟
步骤2.-3也可省略，而无显著生物活性损失
4.在4℃(搅拌)下将沉淀用200ml的50mM碳酸氢铵(Abic)提取过夜
5.在5.000至10.000rpm下离心10至30分钟
6.将上清液冷冻干燥
7.如上第二次(第三次)提取
8.将合并的上清液冷冻干燥
9.将冷冻干燥的材料在例如2ml的PBS或细胞培养相容性缓冲液或介质中重构
也可使用其他溶剂如氯仿/甲醇(CM)，但它们主要提取疏水性更强的CM-类ATI，而基本上不提取其他ATI物质。使用CM和上述溶剂/缓冲液或反之亦然的顺序提取是可能的。
缓冲液的组成可有所不同。因此，碳酸氢铵也可以更低(例如5mM)或更高(例如100mM)浓度使用，可使用其他中性或弱碱性缓冲液。甚至酸性提取也是可能的，例如通过使用50mM乙酸。然而酸性缓冲液共同提取大量其他蛋白质，如麸质(下文进一步详细描述)。
值得注意的是，ATI生物活性和ATI量可用上述缓冲液从两种完全提取物中测定，例如，含有盐的碱性缓冲液(例如，达1.0M的NaCl)通常提取总ATI的80％至90％(图6C至6E)。在此，两种提取物可组合以直接或稀释用于生物测定或ELISA。
在其他情况下，例如在液体食物如啤酒中，ATI生物活性和ATI量可直接从这些液体中测定而无需提取(对于啤酒参见图7E)。
从进一步加工，例如烹饪或烘焙食物如面包、饼干、意大利面或披萨中定量ATI提取
1.将干燥材料研磨并筛分
2.将20g用200ml甲醇/二乙醚1:1在4℃-8℃下脱脂2小时(搅拌)
3.在5.000至10.000rpm下离心10至30分钟
步骤2.-3也可省略，而无显著生物活性损失
4.将沉淀用不会显著降解高度二硫化物连接的ATI的(胃肠)蛋白酶如胃蛋白酶、随后胰蛋白酶消化，以更好地从食物基质中提取ATI。
ATI的蛋白水解消化
蛋白水解消化(胃蛋白酶-胰蛋白酶消化方案)的实例可在Frazer等人,Lancet1959中找到。以下描述简单的实例。
1.将1g悬浮样品在37℃用胃蛋白酶(10mg于0.5mL的0.1M HCL中，pH 1.8)消化4小时。
2.将样品以4,500rpm离心10分钟，并丢弃沉淀。
3.用NaOH将上清液的pH从1.8调节至7.8，且然后添加胰蛋白酶(Sigma T9201,10mg于在0.5mL中性缓冲液如PBS中)并在37℃孵育4小时。
4.用HCl将pH调节至4.5并添加N-甲苯磺酰基-氯甲基-酮(TLCK，10mg于0.5mLDMSO中)以阻断胰蛋白酶。
5.通过在4,500rpm下离心10分钟来除去沉淀物。
6.丢弃沉淀，并在4℃将上清液在10mM碳酸氢铵(Ph 7.8)(4L，2次变化)中透析(分子量排阻例如1000D)。
7.将样品无菌过滤并冷冻干燥。
8.可通过使用二辛可宁酸蛋白质测定(Pierce)来测定蛋白质浓度。
9.将冷冻干燥的材料在例如2ml的PBS或细胞培养相容性缓冲液或介质中重构。
可使用其他缓冲液以及缓冲液和酶浓度，只要保持酶活性即可。在一些例如几乎不烘焙的食物中，可能适用更苛刻的条件。此外，其他酶如胰凝乳蛋白酶或嗜热菌蛋白酶可单独使用(作为中性蛋白酶)或与胰蛋白酶组合使用，因为这些可使ATI基本上完整，同时降解其他主要(谷类)蛋白质，如麸质(Camus和Laporte,Reprod Nutr Dev 1980；Gessendorfer等人,Anal Bioanal Chem 2009；Jos等人,Scand J Gastroenterol 1975；Rombouts等人,Sci Rep 2013)。
由于它们对胃肠蛋白酶的抗性，在这些蛋白水解提取程序之后ATI基本保持完整并维持生物活性。体外研究表明，即使使用纯化的ATI，上述消化程序也使生物活性降低最多40％。此外，1g小麦粉在烘烤(在150℃-180℃下10-20分钟)前的提取生物活性在烘烤后降低最多50％(参见图7C、8A和8D中的实施例)。
1.2生物活性测定
生物活性测定的实例在图6至10中示出。
细胞培养
将如实施例1中所描述并在细胞培养相容性缓冲液中重构的ATI提取物(冷冻干燥或离心/浓缩)添加至ATI-反应性(携带TLR4的)细胞，优选单核细胞/巨噬细胞、树突细胞或用TLR4-MD2-CD14低聚信号传导复合物转染的细胞。还优选使用稳定细胞系，如人THP-1、U937或TLR4-MD2-CD14转染的HEK-293细胞(可从例如美国典型培养物保藏中心获得)。除了人细胞外，还可使用其他物种如小鼠或大鼠的细胞。培养物优选在37℃、5％CO2气氛下在补充有100IU/ml青霉素/100μg/ml链霉素和10％胎牛血清的完全RPMI或DMEM中。细胞应该是无支原体的以获得可重现的结果。通常将1至100μL在实施例1中描述的重构提取物添加至指示细胞的培养物中(优选在24孔培养板中以在0.2-1mL培养基中25,000-200,000个细胞的密度接种)。优选在添加待测试的提取物后12-24小时收获培养上清液和/或细胞。
细胞因子/趋化因子测定。
可定量由于向上述细胞中添加ATI/ATI提取物所致的若干趋化因子和/或细胞因子释放到细胞培养基中以充当刺激性ATI活性的定量测量。实例是IL-8、IL-15、TNFα、CCL2(MCP-1)、CCL5(RANTES)。这可根据制造商的方案使用商业验证的ELISA(例如IL-8和TNFa[BD]；MCP-1、IL-15、RANTES[R&D Systems])来完成。除了TLR4依赖性细胞因子和趋化因子之外，还可测量在TLR4活化下游的其他分泌的或细胞可提取的蛋白质/肽，包括热休克蛋白(如Hsp27、Hsp70、Hsp90)活化或文献中已知的。
用TLR4-MD2-CD14和指示基因转染的细胞的使用
TLR4、MD-2和CD14的脂多糖(LPS)受体复合物已被鉴定为ATI-感测受体复合物(Junker等人,J Exp Med 2012)。由于IL-8是由TLR4诱导的主要细胞因子，所以开发了在IL-8启动子的转录控制下稳定表达TLR4、MD-2和CD14蛋白以及海肾荧光素酶报导基因的报导细胞系并且可商购获得(R&D Systems,San Diego,CA；Lee等人2013)。使用这种细胞系来测试ATI活性，并将值与在来自ATI-刺激的THP-1细胞的IL-8、MCP-1和TNF-α释放情况下所获得的值进行比较(图9)。也可使用例如产生荧光产物或释放如实施例1中所述可在细胞上清液中定量的可溶性产物或含有通过TLR4-MD2-CD14活化驱动的其他启动子的其他指示系统。这些系统特别适合刺激TLR4复合物的ATI-活性的高通量或高定量测量。
用于测定ATI生物活性的其他测定
RNA分离和定量RT-PCR
使用例如TRIzol(Invitrogen)从细胞中分离总RNA。定量RT-PCR优选使用外显子-外显子边界跨越引物序列和例如由Junker等人(2012)针对一组细胞因子所描述的SYBR绿或Taqman方法进行。除了TLR4依赖性细胞因子和趋化因子外，还可测量TLR4活化下游的其他转录物，包括热休克蛋白(如Hsp27、Hsp70、Hsp90)，以及文献中已知的其他转录活化基因。
流式细胞术
在用提取的ATI刺激后，还可使用定量活化标志物的流式细胞术对上述细胞进行分析。活化标志物是例如CD80、CD86、MHC II类、IL-12、IL-23、干扰素γ(细胞内染色)和从常见文献中已知的许多其他标志物。将细胞在4℃用FcR封闭试剂(Miltenyi Biotec)预孵育15分钟，然后在4℃优选用荧光标记的单克隆抗体在预定浓度下针对这些活化标志物染色30分钟。然后用染色缓冲液(例如PBS和1％BSA)洗涤细胞，通过DAPI排除(0.1μg/ml；Roche)评估细胞活力，并且仅通过流式细胞术分析活细胞，使用例如所描述的四激光LSRII和FlowJo软件(Tree Star)(Junker等人,J Exp Med2012)。
改变的信号转导
可用于测量样品中的ATI活性的其他定量读数是基于响应细胞中信号传导途径的活化(或抑制)。实例是某些激酶底物如IRF-3或NFkB(p65)的磷酸化或NFkB核易位。
淋巴细胞增殖测定
这种方法利用TLR4-复合物刺激的抗原呈递细胞(如单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或B细胞)在抗原存在下允许抗原特异性T细胞增殖或活化的能力。一个实例是卵白蛋白或麸质特异性T细胞系或T细胞克隆，以及分别负载有卵白蛋白(卵肽)或麸质(麸质肽)的HLA-相容性抗原呈递细胞或细胞系的孵育。向这些培养物中添加(未知量)的ATI将以剂量依赖性方式刺激T细胞增殖，这可在标准T细胞增殖测定中使用例如3H-胸苷或BrdU掺入来进行测量。这种测定的简化型式是向含有外周人或非人(例如啮齿类动物)的白细胞、血液或例如啮齿动物脾细胞的经典混合淋巴细胞反应中添加含ATI的溶液。
实施例2-用于测定未加工的食物和加工的食物中的ATI的化学量的方法。
2.2从食物中定量提取ATI
这些方法允许尤其来自加工的(例如烘焙)食物的高度蛋白水解抗性ATI(这种抗性主要归因于通常5个分子内二硫桥键的存在)的另一种、甚至更彻底地提取。在还原提取后的化学定量是定量性的，但由于蛋白质的解折叠而导致生物活性的丧失。但是，这不会影响蛋白质定量。提取优选使用含有或不含洗涤剂的还原方法，并且可进行或不进行额外的蛋白水解消化。
这些方法允许对给定谷物或人造短纤维变种中的所有ATI-物种进行定量。因此，全麦基因组测序揭示，现代六倍体小麦含有达16种不同的ATI-物种，并且这些中的约一半已被表征为蛋白质。此外，ATI占小麦总蛋白的2％至4％(其中80％至90％是麸质蛋白)。重要的是，古老的(二倍体、四倍体和早期六倍体)小麦通常含有较少的ATI基因和蛋白质(Altenbach等人,BMC Res Notes 2011；Dupont等人,Proteome Sci 2011)(图7A至7D和图10)。最后，第二个受精周期(开花后受精)增加总蛋白质含量(主要是麸质)，但降低ATI含量(Altenbach等人,Proteome Sci 2011)。这反映在图7D中所示的生物活性测定中，其证明了每克面粉的ATI含量(生物活性)对谷物的遗传背景、生长位置和受精程度的依赖性。还表明，各种ATI-变体(如小麦中的主要CM3和0.19物种)显示在摩尔基础上相似的TLR4刺激生物活性(参见下文)。
重要的是，其他主要含麸质谷物(大麦和黑麦)表达与小麦ATI具有高度序列同源性(Pekkarinen等人,J Agricult Food Chem 2003；Junker等人,J Exp Med 2012)并且具有相似的总体TLR4刺激生物活性的各种淀粉酶/胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶/枯草杆菌蛋白酶抑制剂(图7A和10)。
重要的是，一些无麸质谷粒和主食包含相关的ATI生物活性，这可通过结构类似于小麦ATI的ATI-物种解释。在一些实施方案中，一些无麸质谷粒中的ATI生物活性达到现代六倍体小麦中的生物活性的约20％(图7B)，
实施例：ATI的还原性提取。
将待分析的1克(干燥的)食物在优选含有洗涤剂或洗涤剂混合物(例如十二烷基硫酸钠、TritonX-100、Tween-20、脱氧胆酸钠)和还原剂(如2-巯基乙醇、二硫赤藓糖醇(DTT))的中性、近中性或碱性溶剂/缓冲液如PBS、Tris-缓冲液、碳酸氢铵中例如在5-200mM和37℃下提取30分钟至4小时。为了稳定游离硫醇基，应将样品烷基化，例如在20-500mM的最终浓度下在黑暗中用碘乙酰胺处理10至60分钟。碘乙酰胺将被过量的还原剂例如200mMDTT淬灭。澄清的上清液可例如通过透析或超滤与小分子量污染物分离。对于质谱法，可将悬浮液(澄清的上清液)例如用胰蛋白酶进一步消化。
为了进一步分析，可将样品冷冻干燥、在溶液中浓缩(例如通过超速离心)，或者可将蛋白质吸附到固体载体上。对于质谱法，肽优选被吸附到固体载体上。
2.2提取的ATI的定量
面粉中ATI的化学定量的实例在图11至图14中示出。
质谱法
这优先在富含ATI的样品中进行(定量提取)，并在蛋白水解消化后进行，使用标准现有技术定量MS技术(Prandi B等人,Food Chem 2013)。4种不同ATI分离物的液相色谱-质谱定量在图12至图14中示出。
定量蛋白质印迹法
这在于适当缓冲液中重构后并通过使用针对总ATI或全部或主要ATI物种的多聚或单克隆抗体进行。这在无蛋白水解消化的情况下最佳作用。
已经针对从六倍体小麦中提取的ATI混合物并针对主要ATI如CM3、CM16、0.19或0.54的若干抗原表位产生了高滴度抗体。蛋白质印迹表征的实例在图14C中示出。
基于遗传分析，已经描述了达16种ATI物种。然而，ATI的亚群通常占所有ATI的>90％。这些是非共价连接的四聚体CM2、CM3、CM16、二聚体0.19、0.54以及例如0.19和0.54的单体(Altenbach等人,BMC Res Notes 2011；Dupont等人,Proteome Sci 2011)。数据表明，TLR4刺激能力对于二聚体和四聚体ATI最高并且对于单体ATI最低。在给定小麦、黑麦或大麦变种中对主要3至8种ATI物种的定量将近似于总ATI定量。如果需要，也可对次要物种进行定量。
ELISA或类似的定量测定
这些在没有和有(有限)蛋白水解消化的情况下最佳作用。它们是基于针对抗原(主要ATI的线性以及结构表位)产生的单克隆或多克隆抗体。在经典ELISA变型中，使一种抗体与固相结合，另一种与诸如生物素、碱性磷酸酶、过氧化物酶、荧光或发光指示剂的检测系统以及现有技术检测系统连接。这也包括基于抑制的测定，其需要例如包被的抗体和标记的ATI标准物以与未知样品中的ATI竞争。还可使用其他现有技术测定如放射免疫测定(例如，平衡或抑制形式)或珠粒测定，包括通过多重测定进行定量。
值得注意的是，观察到主要ATI物种(CM3、CM2、0.19、0.28和0.53/0.54)中的2至3种的ELISA定量与小麦和其他含生物活性ATI的谷物和食物的提取物中的总ATI生物活性良好相关(数据未示出)。
实施例3-在谷粒生长或灌浆期间防止ATI中正确分子内二硫化物形成的方法
氧化型谷胱甘肽(GSSG)与蛋白质结合的谷胱甘肽(PSSG)之间的平衡在谷粒灌浆期期间向PSSG移动，例如累积蛋白质(主要是麸质)(Bykova等人,Phytochem 2011；Ferreira等人,Plant Physiol Biochem 2012)可防止过早分子内和分子间二硫键键合。在这种氧化还原状态(以PSSG为特征)下固定生长中小麦植株也将防止ATI分子内的二硫键键合，并且因此使得ATI在进一步加工小麦粉之前或之后高度易于变性和蛋白水解降解。类似地，植物的早期发育硫氧还蛋白酶系统的过度和持续诱导(也与PSSG复合物形成的增强相结合)将使新生ATI分子保持非二硫键连接状态，从而使其易于蛋白水解消化(Wong等人,Phytochem 2004；Wong等人,Plant Cell Physiol 2004)。这些措施还将使小麦(黑麦、大麦)面粉更容易在人体内发生蛋白水解消化。
促进PSSG键形成的方法是用过量的GSH或GSSG培养，用降低植物的氧化还原电势如超氧化物歧化酶或过氧化氢酶活性的酶培养或诱导所述酶。替代策略是调节对生长中小麦(黑麦、大麦)的硫供应，例如经由也依次使用富含硫的对比不含硫的肥料。因此，在硫消耗下，包含ATI的所得面粉蛋白在它们的二硫化物结构方面更固定并且不易于被外部蛋白酶或胃肠道蛋白酶的蛋白水解降解(Reinbold等人,JAgricultFood Chem 2008)，但是ATI含量(稍微)下降。
实施例4-通过在引入食物链之前从例如小麦(黑麦、大麦或通过发酵及其祖先谷粒)中充分提取而从复杂食物中除去ATI或消除ATI生物活性的方法
ATI对通过许多已知蛋白酶降解相当具有抗性，包括人胃肠道的消化酶，如胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。这种抗性的大分是由于存在若干(通常5个)分子内二硫键，所述二硫键产生通常由上下排列的四个主要的α螺旋组成的紧凑二级结构，从而确保用于二聚化和四聚化的紧密结构和疏水相互作用表面(Oda等人,Biochemistry 1997)。因此，用于显著减少(>70％，优选80％和更多)例如面粉中的生物活性ATI的有效方法是基于1)使用优选基于水的缓冲液的极限提取，和2)二硫化物还原，其有助于解折叠、消除生物活性(即，活化TLR4复合物)并允许在摄入如此制备的食物之前或期间蛋白水解消化。还原的和解折叠的ATI的蛋白水解消化可用食品工业中常用的蛋白酶容易地实现，所述蛋白酶包括例如酸性pH下的胃蛋白酶，或例如在近中性或碱性pH下的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶。降解解折叠或变性的ATI的酶也在某些发酵过程中产生，如下所述，包括酵母面团发酵或还原发酵。这也包括产生特异性酶活性以裂解(解折叠的、变性的)ATI的发酵，包括已被工程化以为食品工业产生这种活性的细菌。
4.1化学方法(也参见图5、图6和图11)
ATI的溶剂提取
可使用上述方法(1.1.1和1.1.2)从面粉和甚至加工食物中提取ATI。由于低成本和缺乏残余溶剂的潜在毒性，用基于水的缓冲液提取是优选的。提取的面粉(食物)可例如通过沉降或离心机械分离，且然后冷冻干燥或(优选)在允许大量干燥的空气或其他(惰性)气体中干燥。在干燥颗粒之前，其他步骤，如用水和/或沸点低于水但结合残余水的(有机)溶剂(如用于食品工业的丙酮、乙醇或类似溶剂)洗涤可用于除去微量的盐或酸(来自提取缓冲液)和残余水。当提取的面粉被冷冻用于储存和运输或者直接用于进一步食物加工(如发酵或面团制备)时，也可保留残余水。
如实施例1中详述的，用1至2次提取可达到80％至90％生物活性ATI的除去。这种降低将极大地降低易感个体中在肠和肠外的ATI-诱导的炎症的风险，因为营养性ATI效应是剂量依赖性的。
ATI中的二硫化物的化学还原。
这些方法与针对ATI的分析(定量)提取详述的那些方法类似(如上所述)。然而，在此主要目的是生物活性ATI的还原性灭活，以便消除它们的TLR4刺激活性，而对消费者没有毒性。
实施例：ATI的还原性灭活。
将100g(干燥的)面粉或食物在pH调节的中性、近中性或碱性溶剂/缓冲液(如水或盐水)中或与用PBS和还原剂(如半胱氨酸或用氧化型谷胱甘肽(GSSG)平衡的谷胱甘肽(GSH))一起在温度范围介于4℃与100℃之间的温度下孵育范围可介于1秒与24小时之间的时间。也可使用其他在食品工业中已知的通常温和的还原剂。还原的ATI优选在高于50℃的温度下变性，并且可通过与例如半胱氨酸或GSH的二硫键联或经由错误折叠的新产生的分子内和分子间二硫键锁定在这种变性状态。也可使用在食品工业中使用的其他游离SH-基团封闭剂。
也可在通过添加维生素C或产生例如活化氧的其他促氧化系统进行面团混合期间固定ATI中的部分还原并因此切断的分子内二硫化物。这已针对麦谷蛋白中的二硫化物证明，(Koehler P等人,J Agricult Food Chem 2003a和b)，但在ATI中也是有效的。
4.2用于减少食物如面粉中的生物活性ATI的发酵策略
存在若干降低ATI生物活性的发酵方法，所述发酵方法主要基于非还原性或还原性发酵和/或(二硫化物还原的)ATI的蛋白水解消化。
用乳酸杆菌发酵小麦(黑麦、大麦)面团用于增强酸性条件下麸质蛋白的降解。选择具有活性硫醇(二硫化物还原)代谢的乳酸杆菌特别适合于还原并随后蛋白水解降解ATI。一个实例是罗伊氏乳酸杆菌和旧金山乳酸杆菌，其有效地灭活蛋白质，如小麦的高度二硫键连接的卵转铁蛋白以及ATI。蛋白水解活性主要由小麦天冬氨酸蛋白酶引起(Loponen等人,J Agricult Food Chem 2007；Loponen等人,J Agricult Food Chem2008)，但可添加食品工业中使用的其他蛋白水解酶。可进行小麦面粉和其他含ATI面粉的发酵，例如在面团中具有不同比例的黑麦麦芽，如5％-20％。在此，除了添加食品工业中使用的有益细菌以制备例如酵母面团(乳酸杆菌物种)外，黑麦麦芽也用作蛋白水解酶的来源，所述蛋白水解酶显示降解免疫原性麸质蛋白(Loponen等人,J AgricultFood Chem2007)。这种方法可与本文描述的任何其他ATI-还原方法组合。
通过含ATI面粉和面团的非还原性和还原性发酵降低ATI含量
面团可用全麦面粉且无添加剂制备。使用精制而不是粗制面粉或者添加用于食品工业以改善发酵或面团质量的常用试剂，优化是可能的。一个实例是在发酵之前、期间或之后添加还原剂，如半胱氨酸或谷胱甘肽。另一种替代方案是使用具有高二硫化物还原能力的发酵细菌。此类菌株已进行了描述并且包含例如旧金山乳酸杆菌和罗伊氏乳酸杆菌LTH2584。图15示出所进行的发酵实验(24小时)的结果。使用上述方法测定来自发酵且然后冷冻的面团的两次连续组合的碳酸氢铵提取物中的ATI活性。
以下发酵方案在37℃下应用24小时：
i)化学酸化的对照(面团中低SH(巯基)水平，不减少蛋白质中的二硫键)；
ii)清酒乳酸杆菌(低SH)；
iii)旧金山乳酸杆菌(由于谷胱甘肽还原酶活性，面团中SH水平高并且蛋白质中的二硫键减少)；
iv)旧金山乳酸杆菌δgsrH(由于编码谷胱甘肽还原酶基因的基因被破坏，所以面团中SH水平低)；
v)罗伊氏乳酸杆菌LTH2584(由于胱硫醚γ裂合酶，高SH水平)；
vi)第二种化学酸化的对照以匹配罗伊氏乳酸杆菌的生长温度。
用于适当发酵的对照：关于pH、有机酸水平和SH-基团对面团进行分析，也对发酵细菌的数量进行分析。
数据表明，在添加或不添加黑麦麦芽的情况下，通常用乳酸杆菌发酵的酵母面团中的ATI-生物活性降低达约50％-60％。这表明显著蛋白水解消化并因此通常通过发酵灭活ATI，而无二硫化物还原菌株的更高降解活性。
值得注意的是，硫醇还原细菌(旧金山乳酸杆菌和罗伊氏乳酸杆菌)的优点是可能的。在初步实验中，发酵后加热面团至不使黑麦(大麦)麦芽或乳酸杆菌来源的蛋白水解酶灭活的高温(时间达2小时)可进一步将ATI生物活性降低至经受硫醇还原乳酸杆菌的面团中的20％对比非硫醇还原细菌中的30％，从而表明前一菌株的优点。使用对这些蛋白质具有特异性的多克隆抗体，在蛋白质印迹中这伴随着主要ATI-条带CM3和0.19的相当降低。总体而言，比常规发酵更多的还原发酵导致ATI的二硫化物还原，所述ATI随后变得易受食品工业中使用的酶(如由Lactobacillae生产的那些或存在于麦芽中的那些)的蛋白水解降解。
实施例5-可添加至含ATI食物的TLR4拮抗化合物
存在若干(弱到中等活性)口服TLR4拮抗剂，它们中的许多具有草药来源，长期用作香料或食品添加剂。这些是例如生物碱、芳香族化合物、多酚、肽或蛋白质(Rossignal和Lynn 2005；Lucas和Maes,Mol Neurobiol 2013)。实例包括但不限于五日热巴尔通体脂多糖(Popa等人,Infect Immunol 2007)；来自大青属的叶子提取物(Kouakou等人,BMCComplement Altern Med 2013)；肉桂提取物及其活性组分(Kanuri等,JNutr 2009)；eritoran模拟TLR4-MD2-CD14复合物的MD组分、被配制成抗胃或肠水解的爱尔妥朗(eritoran)(Shirey等人,Nature 2013)；来自例如绿茶的表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(Hong等人,J Immunol 2010；Bao等人,Mol Nutr Food Res 2013)；来自姜的6-姜酚和1-脱氢-10-姜二酮(1D10G)(Ahn等人,Mol Cless 2009；Park等人,Biochem Biophys ResCommunic 2012)；褪黑激素(Hu等人,Pinela Res 2013)；作为TLR4-NFkB途径抑制剂的小檗碱(Li等人,Acta Pharmacol Sin 2012)；来自光合细菌红细菌类球红细菌的脂多糖(LPS-RS)(Rallabhandi等人，Coats等人,J Immunol 2005)；以及来自牙龈卟啉单胞菌的脂多糖(Coats等人,J Immunol 2005；Curtis等人,InfectImmunol 2011)。
将这些具有证明的TLR4拮抗活性的化合物或化合物混合物添加至含ATI食物中将拮抗ATI的TLR4活化活性而无需先前提取或灭活。这应该与完全避免这些先前灭活或提取步骤或在这些步骤之后“中和”残余ATI活性有关。可通过使用来自光合细菌类球红细菌的天然TLR4拮抗剂(LPS-RS)证明这种中和ATI-诱导的先天免疫活化(Rallabhandi等人,JImmunol 2005)(图16)。
其他实施方案
以上说明书中提及的所有公布、专利和专利申请都特此以引用的方式并入，所述引用的程度就如同已特定地和个别地指示将各个别公布、专利或专利申请以引用的方式整体并入一般。本发明的所描述的装置和方法的各种修改和变化对于本领域技术人员是显而易知的，而不背离本发明的范围和精神。虽然已结合特定实施方案描述了本发明，但应理解，能够进行其他修改并且所要求保护的本发明不应不适当地限于此类特定实施方案。事实上，本领域技术人员显而易知的用于执行本发明的所描述模式的各种修改意图在本发明的范围内。本申请意图涵盖大体依照本发明的原理对本发明进行的任何变化、使用或者调整，并且包括本公开内容的此类偏离属于本发明所属领域中已知的惯用并且可适用于本文之前阐述的必要特征。
其他实施方案在以下权利要求内。
Claims (81)
1.一种降低食品的ATI含量的方法，所述方法包括将所述食品在提取缓冲液中孵育足以使所述食品的所述ATI含量降低至少50％的持续时间，随后从所述食品中除去所述提取缓冲液。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述提取缓冲液是中性、近中性或碱性溶剂或缓冲液。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述提取缓冲液选自由以下各项组成的组：PBS、Tris缓冲液、水和碳酸氢铵或碳酸氢钠。
4.如权利要求2或3所述的方法，其中所述提取缓冲液还包含洗涤剂或洗涤剂混合物。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述洗涤剂或洗涤剂混合物选自由以下各项组成的组：十二烷基硫酸钠、Triton X-100、Tween-20和脱氧胆酸钠。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述提取缓冲液还包含还原剂。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述还原剂选自由以下各项组成的组：巯基乙醇、二硫赤藓糖醇(DTT)、半胱氨酸、用氧化型谷胱甘肽(GSSG)平衡的谷胱甘肽(GSH)、亚硫酸盐和硫氧还蛋白。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述提取缓冲液还包含至少一种蛋白酶和/或工程化为还原和/或降解ATI的合成酶。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述蛋白酶是胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、真菌蛋白酶、酵母蛋白酶或细菌蛋白酶。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述碱性蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述提取缓冲液还包含烷化剂。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述烷化剂是碘乙酰胺，并且通过添加过量还原剂将所述烷化剂进一步淬灭。
13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中使所述食品在孵育之前机械分离。
14.如权利要求13所述的方法，其中使所述机械分离的食品在孵育之前干燥。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述干燥是空气干燥或冷冻干燥。
16.如权利要求14或15所述的方法，其中，在所述干燥之前，使所述机械分离的食品与水性溶剂或沸点低于水的有机溶剂接触。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述有机溶剂选自由丙酮和乙醇组成的组。
18.一种从食品中提取淀粉酶胰蛋白酶抑制剂(ATI)的方法，所述方法包括：
A)将所述食品与提取缓冲液一起在混合物中孵育；
B)对所述混合物进行离心以形成沉淀和上清液；
C)对所述上清液进行干燥；以及
D)在重构缓冲液中重构所述干燥的上清液，
其中提取的ATI存在于所述重构缓冲液中。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述食品在提取之前未被加工。
20.如权利要求18所述的方法，其中所述食品是加工食品。
21.如权利要求18所述的方法，其中所述食品是麸质。
22.如权利要求18至21中任一项所述的方法，其中，在步骤A之前，将所述食品研磨。
23.如权利要求18至22中任一项所述的方法，其中，在步骤A之前，将所述食品脱脂。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述脱脂通过将所述食品与甲醇/二乙醚一起孵育来进行。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述甲醇/二乙醚以1:1的比率存在。
26.如权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述提取缓冲液是碳酸氢铵或碳酸氢钠、氯仿/甲醇或酸。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述酸是乙酸。
28.如权利要求26或27所述的方法，其中所述提取缓冲液的浓度介于5mM至100mM之间。
29.如权利要求18至28中任一项所述的方法，其中所述干燥是冷冻干燥或在气体例如空气流下干燥。
30.如权利要求18至29中任一项所述的方法，其中在步骤D之前重复步骤A至C。
31.如权利要求30所述的方法，其中步骤A至C中的所述提取缓冲液是第一氯仿/甲醇，并且当重复步骤A至C时所述提取缓冲液是碳酸氢铵或碳酸氢钠，或其中在两次提取中所述提取缓冲液是碳酸氢铵或碳酸氢钠。
32.如权利要求18至31中任一项所述的方法，其中，在步骤A之前，用至少一种蛋白酶和/或工程化为还原和/或降解ATI的合成酶将所述食品消化。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述蛋白酶是胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、真菌蛋白酶、酵母蛋白酶或细菌蛋白酶。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述碱性蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。
35.如权利要求33所述的方法，其中将所述食品首先用胃蛋白酶消化，随后用胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶消化。
36.如权利要求32至35中任一项所述的方法，其中，在用蛋白酶消化所述食品后，将所述食品离心以形成上清液，并将所述上清液与步骤A的所述提取缓冲液一起孵育。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述孵育作为渗析孵育进行，省略了步骤B，并且在渗析后将所述上清液在步骤C中干燥。
38.一种测定样品中的ATI的生物活性的方法，所述方法包括将ATI反应性细胞与疑似包含ATI的提取物一起孵育，并测定所述ATI反应性细胞中的ATI应答，由此测定样品中所述ATI的生物活性。
39.如权利要求38所述的方法，其中通过如权利要求1至37中任一项所述的方法来制备所述疑似包含ATI的提取物。
40.如权利要求38或39所述的方法，其中所述ATI反应性细胞表达TLR4、TLR4-MD2或TLR4-MD2-CD14信号传导复合物。
41.如权利要求38至40中任一项所述的方法，其中所述ATI反应性细胞选自由以下各项组成的组：单核细胞/巨噬细胞、树突细胞以及用TLR4、TLR4-MD2或TLR4-MD2-CD14低聚信号传导复合物转染的细胞。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述细胞是选自由THP-1和U937细胞组成的组的稳定细胞系。
43.如权利要求38至42中任一项所述的方法，其中所述ATI应答测定包括对由所述细胞释放的一种或多种细胞因子进行定量。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述一种或多种细胞因子选自由以下各项组成的组：IL-8、IL-15、TNFα、CCL2(MCP-1)以及CCL5(RANTES)。
45.如权利要求43或44所述的方法，其中通过ELISA进行所述定量。
46.如权利要求38至42中任一项所述的方法，其中所述细胞包含处于TLR4(ATI)应答启动子控制下的报导基因，并且所述ATI应答测定包括检测所述报导基因的表达。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述ATI应答启动子是IL-8启动子。
48.如权利要求46或47所述的方法，其中所述报导基因编码发光或荧光蛋白。
49.如权利要求38至42中任一项所述的方法，其中所述ATI应答测定包括测量所述细胞中与ATI应答相关的一种或多种RNA的水平。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述一种或多种RNA对应于Hsp27、Hsp70和/或Hsp90。
51.如权利要求38至42中任一项所述的方法，其中所述ATI应答测定包括检测所述细胞上或所述细胞中的一种或多种活化标志物。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述一种或多种活化标志物选自由以下各项组成的组：CD80、CD86、MHC II类、IL-12、IL-23和干扰素γ(释放或细胞内染色)。
53.如权利要求51或52所述的方法，其中所述检测包括流式细胞术。
54.如权利要求38至42中任一项所述的方法，其中所述ATI应答测定包括检测与ATI应答相关的信号传导途径中的改变。
55.如权利要求54所述的方法，其中基于检测IRF-3、NFkB(p65)或NFkB核易位来检测信号传导途径中的所述改变。
56.如权利要求38至42中任一项所述的方法，其中所述ATI应答测定包括在所述疑似含有ATI的样品存在下接触卵白蛋白或麸质特异性T细胞，以及在ATI反应性抗原呈递细胞存在下测量所述细胞的增殖。
57.一种测定样品中的ATI的生物活性的方法，所述方法包括
A)将固定的TLR4、TLR4-MD2或TLR4-MD2-CD14与疑似包含ATI的提取物一起孵育，其中所述固定的TLR4、TLR4-MD2或TLR4-MD2-CD14被固定至固相并结合至标记的ATI，
B)除去所述提取物，以及
C)测定所述提取物中或与固定至所述固相的所述固定的TLR4、TLR4-MD2或TLR4-MD2-CD14结合的标记的ATI的量。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述标记的ATI用荧光团标记。
59.如权利要求57所述的方法，其中所述标记的ATI用酶标记。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述酶是辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。
61.一种测定样品中的ATI的生物活性的方法，所述方法包括
A)将固定的TLR4、TLR4-MD2或TLR4-MD2-CD14与疑似包含ATI的提取物一起孵育，
B)除去所述疑似包含ATI的提取物，以及
C)在ELISA中使用抗体测定与所述固定的TLR4结合的ATI的量。
62.如权利要求61所述的方法，其中所述抗体识别并结合至至少一种选自由以下各项组成的组的ATI：CM3、CM2、0.19、0.28以及0.53/0.54。
63.一种对食品中的ATI的量进行定量的方法，所述方法包括：
A)将所述食品在提取缓冲液中孵育，从而形成提取物；
B)任选地将所述提取物与烷化剂一起孵育；
C)任选地将所述ATI与所述提取物分离；以及
D)对所述ATI进行定量。
64.如权利要求63所述的方法，其中所述提取缓冲液是中性、近中性或碱性溶剂或缓冲液。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述提取缓冲液选自由以下各项组成的组：PBS、Tris缓冲液和碳酸氢铵或碳酸氢钠。
66.如权利要求64或65所述的方法，其中所述提取缓冲液还包含洗涤剂或洗涤剂混合物。
67.如权利要求66所述的方法，其中所述洗涤剂或洗涤剂混合物选自由以下各项组成的组：十二烷基硫酸钠、Triton X-100、Tween-20和脱氧胆酸钠。
68.如权利要求63至67中任一项所述的方法，其中所述提取缓冲液还包含还原剂。
69.如权利要求68所述的方法，其中所述还原剂选自由以下各项组成的组：巯基乙醇、二硫赤藓糖醇(DTT)、半胱氨酸、用氧化型谷胱甘肽(GSSG)平衡的谷胱甘肽(GSH)、亚硫酸盐以及硫氧还蛋白。
70.如权利要求63至69中任一项所述的方法，其中所述提取缓冲液还包含烷化剂。
71.如权利要求70所述的方法，其中所述烷化剂是碘乙酰胺，并且所述烷化剂通过添加过量还原剂进一步淬灭。
72.如权利要求63至71中任一项所述的方法，其中所述方法还包括将至少一种蛋白酶和/或工程化为还原和/或降解ATI的合成酶添加至所述提取物中。
73.如权利要求72所述的方法，其中所述蛋白酶是胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、真菌蛋白酶、酵母蛋白酶或细菌蛋白酶。
74.如权利要求73所述的方法，其中所述蛋白酶是胃蛋白酶。
75.如权利要求63至74中任一项所述的方法，其中通过质谱法、定量蛋白质印迹或ELISA对所述ATI进行定量。
76.一种生产具有降低的ATI含量或不含ATI的食品的方法，所述方法包括：
A)测定所述食品中的ATI的生物活性，和/或
B)对所述食品中的ATI的量进行定量，以及
C)通过使用一种或多种还原剂、蛋白酶和/或工程化为还原和/或降解所述食品中的ATI的合成酶提取和降解ATI来降低所述食品中的ATI的量。
77.一种降低食品的反应性的方法，所述方法包括将谷物与氧化型谷胱甘肽(GSSG)和/或蛋白质结合的谷胱甘肽(PSSG)一起培养。
78.如权利要求77所述的方法，其还包括将所述谷物与平衡量的还原型谷胱甘肽(GSH)一起培养。
79.一种降低食品的ATI/TLR4反应性的方法，所述方法包括将谷物与富含硫或贫硫的肥料一起培养。
80.一种降低食品的ATI含量的方法，所述方法包括用具有高二硫化物还原和/或蛋白水解能力的细菌使所述食品发酵。
81.如权利要求80所述的方法，其中所述细菌选自由以下各项组成的组：旧金山乳酸杆菌和罗伊氏乳酸杆菌LTH2584。
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