CN114106083A - 一种小米蛋白和小米蛋白水解物的制备方法及小米蛋白水解物的应用 - Google Patents

一种小米蛋白和小米蛋白水解物的制备方法及小米蛋白水解物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种小米蛋白的制备方法，还公开了使用这种小米蛋白通过水解制备小米蛋白水解物的方法，及小米蛋白水解物用于制备治疗或改善结肠炎症的药物。本发明的有益效果是：小米为药食同源谷物食品，提取的小米蛋白水解物用于制备治疗或改善结肠炎症和肠屏障功能受损的药物，可有效抑制肠道促炎细胞因子表达，增强肠上皮细胞屏障功能，效果显著，且没有毒性，长期服用没有副作用。

Description

一种小米蛋白和小米蛋白水解物的制备方法及小米蛋白水解 物的应用
技术领域
本发明属于植物提取物用于制备药物技术领域，尤其是一种小米蛋白水解物的制备方法及其用于制备治疗或改善结肠炎症的药物。
背景技术
炎症性肠病(IBD)是一种以腹泻、腹痛和便血为特征的慢性胃肠道疾病，严重影响患者的生活质量。IBD包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)两个亚型。流行病学研究表明，随着患病率逐年增加，IBD已成为西方世界乃至亚洲、非洲和南美洲的主要胃肠道疾病之一。迄今为止，虽然尚未完全了解IBD发病的确切机制，但异常免疫反应和肠道屏障功能的破坏被认为是IBD的主要原因。肠道屏障功能由紧密连接蛋白维持。在IBD中观察到紧密连接蛋白水平的下调，这导致肠道通透性增加。此外，效应T淋巴细胞分化增加和炎症小体异常激活与IBD的发病机制有关。过去几十年IBD的治疗方法主要包括非靶向治疗(如氨基水杨酸盐、糖皮质激素和免疫调节剂)和靶向生物治疗(如抗TNF抗体、抗IL-23抗体和JAK抑制剂)。然而，这些药物在临床环境中的副作用和高昂的价格方面仍然存在局限性。通过饮食干预策略来预防和治疗IBD具有重要意义。
小米，禾本科植物，它耐干旱耐盐碱，生命力顽强，主要分布于干旱地区和半干旱地区，是中国的传统农作物之一。研究表明，摄入富含粟的饮食可以预防结肠炎和结直肠癌的进展。然而其功能性成分仍有待探索。蛋白质是小米的主要成分，占总重量的11％-18％。据报道，小米蛋白的蛋白酶水解物具有抗高血压和抗糖尿病活性。小米蛋白的生物活性肽已被证实证明具有抗氧化和抗真菌活性，并且可以在体外抑制RAW264.7细胞中促炎细胞因子的分泌。然而，小米蛋白水解物的摄入是否可以预防和治疗IBD的进展仍然未知。之前有研究表明常食用小米等谷物粥对肠炎有辅助疗效，并没有对其作为药物方面的应用进行研究。
发明内容
为了研究小米蛋白水解物在制备治疗或改善结肠炎症的药物方面的应用，本发明提供了一种小米蛋白制备方法，包括如下步骤：
首先对小米进行研磨和脱脂处理
(1)使用超微粉碎机研磨小米，将所得小米粉过60目筛，称取100g小米粉与正己烷按料液比1:8-1:12(w/v)混合，超声萃取20min-2h，500-8000g离心，弃上清，并对剩下的残渣重复上述操作一次，将收集的残渣放置于通风橱中自然风干，得到脱脂小米粉；
(2)称取(1)所述方法得到的脱脂小米粉与超纯水按料液比1:4-1:8(w/v)混合并充分搅拌，用1mol/LNaOH调至pH＝7.0，加入30U/g的α-淀粉酶，50°C水浴酶解0.5-4h，期间持续搅拌使体系均匀，反应结束后沸水浴20min灭酶，自然冷却至室温，500-8000g离心去除上清，用纯净水冲洗并重复离心2-4次，将收集的固体沉淀冷冻干燥，得到的提取物A；
如果将得到的脱脂小米粉A与80％丙酮水溶液按照按照1:20-1:30(w/v)混合，超声10min，5000g离心5min，重复提取2次；离心后上清液45℃旋蒸浓缩，冷冻干燥后得到提取物B；
如果离心后获取沉淀，按1:8-12(w/v)的比例加入4M NaOH，水解1h，用浓盐酸调节至pH＝2，按照1:8-12(w/v)的比例加入乙酸乙酯，超声5min，重复3次，收集上清，旋转蒸发后冷冻干燥，得到提取物C；提取物B和提取物C的多酚含量分别为79.4％和86.3％。
小米蛋白水解物的制备包括如下步骤：
(1)称取先前制备的提取物A与超纯水按料液比1:50(w/v)混合，用1mol/L HCL调至pH＝2.0；
(2)按酶/底物＝1:25-1:100加入活力500U/mg的胃蛋白酶；
(3)37℃水浴酶解0.5-4h；
(4)沸水浴20min灭酶活，自然冷却至室温；
(5)用1mol/LNaOH调至pH＝7.5，按酶/底物＝1:5-1:20加入4×USP胰蛋白酶，37℃水浴酶解0.5-4h；
(7)沸水浴20min使酶失活，自然冷却至室温；
(8)水解样品8000g离心20min，收集上清液；
(9)冷冻干燥，获得小米蛋白水解物D，即小米蛋白水解物粉末。
一种小米蛋白水解物的制备方法制备得到小米蛋白水解物粉末FMPH。
所述小米蛋白水解物粉末的水解度为15.6％-31.4％。
本发明的另一个目的所述小米蛋白水解物粉末FMPH用于制备治疗或改善结肠炎症的药物。
本发明的有益效果是：小米为药食同源谷物食品，提取的小米蛋白水解物用于制备治疗或改善结肠炎症和肠屏障功能受损的药物，可有效抑制肠道促炎细胞因子表达，增强肠上皮细胞屏障功能，效果显著，且没有毒性，长期服用没有副作用。
附图说明
图1小米蛋白水解物对DSS诱导小鼠结肠炎症状的影响
图2小米蛋白水解物对结肠炎小鼠肠屏障相关基因的影响
图3小米蛋白水解物对结肠炎小鼠炎症相关基因的影响
图4小米蛋白水解物对结肠炎小鼠炎症相关基因的影响。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1
1.小米蛋白的制备
首先对小米进行研磨和脱脂处理。
(1)使用超微粉碎机研磨小米，将所得小米粉过60目筛，称取100g小米粉与正己烷按料液比1:10(w/v)混合，超声萃取1h，2000g离心，弃上清，并对剩下的残渣重复上述操作一次，将收集的残渣放置于通风橱中自然风干，得到脱脂小米粉。
(2)称取(1)所述方法得到的脱脂小米粉与超纯水按料液比1:6(w/v)混合并充分搅拌，用1mol/LNaOH调至pH＝7.0，加入30U/g的α-淀粉酶，50℃水浴酶解2h，期间持续搅拌使体系均匀。反应结束后沸水浴20min灭酶，自然冷却至室温，2000g离心去除上清，用纯净水冲洗并重复离心2-4次，将收集的固体沉淀冷冻干燥，得到的提取物A。
如果将(1)所述方法得到的脱脂小米粉与80％丙酮水溶液按照按照1:25(w/v)混合，超声10min，5000g离心5min，重复提取2次。离心后上清液45℃旋蒸浓缩，冷冻干燥后得到提取物B。
如果将离心后获取沉淀，按1:10(w/v)的比例加入4M NaOH，水解1h，用浓盐酸调节至pH＝2。依据(3)离心获取的沉淀质量，按照1:10(w/v)的比例加入乙酸乙酯，超声5min，重复3次。收集上清，旋转蒸发后冷冻干燥，得到提取物C。
2.蛋白纯度的测定
本发明采用福林酚法测定提取物的蛋白纯度。甲液：A液：分别配制4％的Na2CO3溶液和0.2mol/L的NaOH溶液，使用前1:1混合；B液：分别配制1％的CuSO4·5H2O溶液和2％的酒石酸钾钠溶液，使用前1:1混合。将A液和B液按50:1混合得到甲液。乙液：福林酚试剂。
向200μl甲液中加入40μl提取物A溶液(提前稀释至适宜浓度)，混匀后在30℃条件下反应10min，再加入20μl乙液，混匀后在30℃条件下反应30min，以牛血清白蛋白(BSA)为标准品，测定500nm吸光度。通过福林酚法测得提取物A的蛋白含量为81.8％-94.6％，表明提取物A为富含小米蛋白的提取物。
3多酚纯度的测定
本发明采用福林酚法测定提取物的多酚纯度。将提取物B和提取物C溶解于超纯水，稀释至合适浓度，加入福林酚试剂以氧化提取物，加入7％Na2CO3溶液终止反应。以没食子酸为标准品，测定760nm吸光值。提取物B和提取物C的多酚含量分别为79.4％和86.3％，表明二者为富含小米多酚的提取物。
实施例2小米蛋白水解物的制备
(1)称取先前制备的小米蛋白A与超纯水按料液比1:50(w/v)混合，
(2)用1mol/LHCL将调至pH＝2.0。
(3)按酶/底物＝1:70加入胃蛋白酶(500U/mg)。
(4)37℃水浴酶解2h。
(5)沸水浴20min灭酶活，自然冷却至室温。
(6)用1mol/LNaOH调至pH＝7.5，按酶/底物＝1:10加入胰蛋白酶(4×USP)。
(7)37℃水浴酶解2h。
(8)沸水浴20min使酶失活，自然冷却至室温。
(9)水解样品8000g离心20min，收集上清液。
(10)冷冻干燥，获得小米蛋白水解物D，即小米蛋白水解物粉末(FMPH)。
多肽纯度的测定
本研究采用福林酚法测定小米蛋白水解物中多肽的纯度。
甲液：A液：分别配制4％的Na2CO3溶液和0.2mol/L的NaOH溶液，使用前1:1混合；B液：分别配制1％的CuSO4·5H2O溶液和2％的酒石酸钾钠溶液，使用前1:1混合。将A液和B液按50:1混合得到甲液。
乙液：福林酚试剂。
标准曲线的建立：配制浓度梯度为0，50，100，150，200，250，300μg/ml的BSA标准溶液，向200μl甲液中加入40μl样品溶液，混匀后在30℃条件下反应10min，再加入20μl乙液，混匀后在30℃条件下反应30min，在500nm处测定吸光度。每个浓度设置三个平行，以BSA浓度为纵轴，吸光度为横轴做标准曲线。
小米蛋白水解物中多肽纯度的测定：向200μl甲液中加入40μl小米蛋白水解物样品溶液(提前稀释至适宜浓度)，混匀后在30℃条件下反应10min，再加入20μl乙液，混匀后在30℃条件下反应30min，在500nm处测定吸光度。每个样品设置三个平行，将样品的吸光度代入到BSA标准曲线中计算。
小米蛋白水解物D水解度的测定
水解度(DH)是指是被水解的肽键数的百分比，本发明采用邻苯二甲醛(OPA)法测定小米蛋白的水解度。
OPA试剂：A液：将1.905g四硼酸钠和50mg十二烷基硫酸钠(SDS)溶解于40mlMilli-Q水中，超声处理1h。B液：将40mg邻苯二甲醛(OPA)溶解于1ml无水乙醇中，待完全溶解后全部转移至A液中。再向A液中加入44mg二硫苏糖醇(DTT)，最终用Milli-Q水定容至50ml。
向96孔板中分别加入32μl Milli-Q水，丝氨酸标准溶液和样品溶液，再加入240μlOPA溶液，混匀后于37℃条件下避光反应2min，在340nm处测定吸光度。
丝氨酸标准溶液：称取10mg丝氨酸溶解于Milli-Q水中，配置为0.9516mM丝氨酸标准溶液。
向96孔板中分别加入32μl Milli-Q水，丝氨酸标准溶液和样品溶液，再加入240μlOPA溶液，混匀后于37℃条件下避光反应2min，在340nm处测定吸光度，每个样设置三个平行。
水解度(DH)的计算
Figure BDA0003402465810000061
htot取决于原料的类型。对于大多数食物蛋白而言，氨基酸的平均分子量是125g/mol，则htot约为8，也即每g蛋白约含有8mmol的肽键。
h是丝氨酸氨基毫摩数的函数。
Figure BDA0003402465810000062
Figure BDA0003402465810000063
其中0.9516为标准样品丝氨酸的浓度，即0.9516mmol/L，C为样品的蛋白质量浓度(mg/ml)。
通过福林酚法测得小米蛋白水解物的蛋白纯度为83.8％±5.95％。通过OPA法测得小米蛋白的水解度为31.4％±1.44％。
小米蛋白A、提取物B、提取物C、小米蛋白水解物D对Caco-2细胞跨膜电阻、屏障蛋白和促炎细胞因子表达的影响
将Caco-2细胞接种于12孔板Transwell，细胞在37℃，5％CO2的条件下培养14-21天，直至细胞完全分化成人肠上皮细胞。将100μg/mL LPS加入Transwell基底侧，构建炎症和屏障功能受损细胞模型。同时加入200mg/mL小米蛋白A、提取物B、提取物C及小米蛋白水解物D(即小米蛋白水解物FMPH)，与细胞共孵育，处理24h后，测定各组跨膜电阻(TEER)值，ELISA法测定细胞培养上清中的细胞因子浓度，RT-qPCR法测定细胞培养物的mRNA表达。
TEER的测定结果表明(图4A)，LPS可显著增加Caco-2细胞通透性，小米蛋白、提取物B、提取物C对LPS引起的TEER降低无显著影响，但小米蛋白水解物D可显著逆转这一变化。与正常组相比，LPS处理可以显著增加Caco-2细胞分泌的促炎细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的浓度(图4B)，小米蛋白A、提取物B、提取物C对细胞因子的分泌没有显著影响，但小米蛋白水解物D可显著抑制上述促炎因子的分泌。RT-qPCR的结果表明，与NM组相比，LPS的处理可以显著降低紧密连接蛋白occludin、ZO-1和claudin-3以及黏蛋白MUC2的mRNA表达，这一变化仅在小米蛋白水解物D处理后出现回调(图4C)。这些结果表明，小米蛋白水解物D与其他小米提取物相比，具有增强肠细胞屏障功能的独特潜力。
实施例3小米蛋白水解物对结肠炎小鼠表观生理指标的影响
36只4周龄SPF级雄性BALB/c小鼠，饲养于南开大学动物饲养中心，饲养条件：25±2℃，相对湿度50±5％，12小时循环光照，自由取水取食，相关实验操作符合动物实验伦理学要求。普通饲料喂养1周适应环境，实验从第二周正式开始。
本实验采用3％DSS诱导小鼠结肠炎模型。一周适应期后，将36只小鼠随机分成正常组(NM)，模型组(DSS)，小米蛋白处理组(FMPH)，每组12只，每笼4只。适应一周后，FHPH组小鼠分别灌胃400mg/kg·day小米蛋白水解物溶液，正常组和对照组的小鼠则灌胃生理盐水，持续灌胃4周。第四周开始给予对照组和三个小米蛋白水解物干预组的小鼠含3％DSS的饮水，正常组饮用水中不含DSS，一周后处死小鼠。
利用疾病活动指数(DAI)来评估疾病状态，基于体重减轻程度：0(0％),1(1–5％),2(5–10％),3(10–20％),and4(>20％)；粪便软硬程度：0-正常，1-质软但成形，2-松散不成形，3-非常稀(腹泻)；便血程度：0-无症状，1-轻微出血，2-明显出血，3-大出血，三项评分加和后即为DAI。
利用HE染色观测结肠组织病理学变化，将远端结肠组织在10％福尔马林中固定24h后，对其进行石蜡包埋、切片并用苏木精和伊红(H&E)染色。每个结肠样本在100倍显微镜下随机选择拍摄3个视野。根据隐窝缺损和变性程度(0-3)，炎性浸润程度(0-4)和炎性活动范围(0-4)三项指标综合对结肠炎症的严重程度进行组织病理学评估，并且以上评估均是盲法进行的。
组外其他实验组均出现了体重降低的情况，DSS处理第七天时，模型(DSS)组的小鼠体重显著低于小米蛋白水解物(FMPH)组。病情活动指数(DAI)包含体重减轻，粪便形态，便血情况三项指标，常用于评估小鼠结肠炎病情的严重程度。如图1B所示，DSS处理后，小鼠出现体重减轻，腹泻，便血等症状，DSS组的DAI评分明显上升。在小米蛋白水解物干预作用下，FMPH组的DAI评分显著低于DSS组。结肠长度和脾脏重量也是与结肠炎症进展相关的指标，FMPH组于DSS组相比，小鼠结肠长度显著增加，脾脏重量显著降低(图1C-1E)。H&E染色结肠组织切片如图1F-1G所示，空白组的结肠组织病理学形态正常，无炎症损伤。DSS组小鼠结肠切片呈现出炎性浸润、组织缺损和隐窝扭曲变形的现象，而FMPH处理后这种变化显著改善。此外，髓过氧化物酶(MPO)是表征炎症水平的关键指标，FMPH组小鼠与DSS组小鼠相比，结肠MPO水平显著降低(图1H)。由上述结果可知，小米蛋白水解物D可以改善DSS诱导小鼠结肠炎症状。
实施例4小米蛋白水解物对小鼠结肠炎症水平的影响
结肠炎的发展与促炎细胞因子的表达增加有关，这些细胞因子在介导肠道炎症中起到重要作用。利用ELISA测定结肠组织细胞因子含量，利用Westernblot测定调控细胞因子表达的核转录因子NFκB p65的蛋白表达和磷酸化水平。如图2A所示，在DSS处理下，模型组小鼠的结肠炎症因子IL-6,TNF-α,IL-17,IL-1β的蛋白表达水平与NM组相比显著上调。在小米蛋白水解物的干预作用下，前述促炎细胞因子在结肠中的表达显著回调。NFκB是调控多种细胞因子表达的关键蛋白，其磷酸化水平的增加可增加促炎细胞因子的表达。Westernblot的结果表明，DSS组小鼠结肠NFκB磷酸化水平显著增加，而小米蛋白水解物可显著降低小鼠NFκB磷酸化水平(图2B)。以上结果表明，小米蛋白水解物能够通过调控肠道免疫信号通路、抑制结肠炎症因子表达进而改善结肠炎症。
实施例5小米蛋白水解物对小鼠肠屏障功能的影响
结肠炎的发展伴随着肠道上皮屏障功能的破坏，ZO-1,Occludin和Claudin-3是肠道紧密连接的重要组成部分。肠屏障功能受损会进而导致吸收进入血液循环的内毒素(LPS)水平的增加和系统性炎症反应，是导致结肠炎的重要诱因。利用ELISA测定血清LPS含量，利用Westernblot结肠屏障相关蛋白的表达水平。
如图3A所示，在DSS处理作用下，模型组小鼠血清LPS水平显著增加。与模型组小鼠相比，小米蛋白水解物干预可显著回调血清LPS水平，与正常组相比无显著差异。相应的，模型组小鼠结肠ZO-1,occludin和claudin-3蛋白表达水平与正常组相比显著降低(图3B-3C)。在小米蛋白水解物的干预作用下，ZO-1和Occludin的表达水平相较于模型组显著上调。以上结果表明，小米蛋白水解物能够缓解肠屏障功能受损，并进而改善结肠炎。

Claims (8)

1.一种小米蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)使用超微粉碎机研磨小米，将所得小米粉过60目筛，称取100 g小米粉与正己烷按料液比1:8-1:12(w/v)混合，超声萃取20 min-2 h，500-8000g离心，弃上清，并对剩下的残渣重复上述操作一次，将收集的残渣放置于通风橱中自然风干，得到脱脂小米粉；
(2)称取(1)所述方法得到的脱脂小米粉与超纯水按料液比1:4-1:8(w/v)混合并充分搅拌，用1mol/LNaOH调至pH＝7.0，加入30 U/g的α-淀粉酶，50℃水浴酶解0.5-4 h，期间持续搅拌使体系均匀，反应结束后沸水浴20 min灭酶，自然冷却至室温，500-8000g离心去除上清，用纯净水冲洗并重复离心2-4次，将收集的固体沉淀冷冻干燥，得到小米蛋白A。
2.根据权利要求1所述一种小米蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(1)使用超微粉碎机研磨小米，将所得小米粉过60目筛，称取100 g小米粉与正己烷按料液比1:10(w/v)混合，超声萃取1 h，2000g离心，弃上清，并对剩下的残渣重复上述操作一次，将收集的残渣放置于通风橱中自然风干，得到脱脂小米粉。
3.根据权利要求1所述一种小米蛋白的制备方法，其特征在于，称取步骤(1)所述方法得到的脱脂小米粉与超纯水按料液比1:6(w/v)混合并充分搅拌，用1mol/LNaOH调至pH＝7.0，加入30 U/g的α-淀粉酶，50℃水浴酶解2h，期间持续搅拌使体系均匀，反应结束后沸水浴20 min灭酶，自然冷却至室温，2000g离心去除上清，用纯净水冲洗并重复离心2-4次，将收集的固体沉淀冷冻干燥，得到得到小米蛋白A。
4.一种小米蛋白水解物的制备方法，其特征在于，使用权利要求1的小米蛋白水解制备，包括如下步骤：
(1)称取先前制备的提取物A与超纯水按料液比1:50(w/v)混合，用1mol/LHCL调至pH＝2.0；
(2)按酶/底物＝1:25-1:100加入活力500U/mg的胃蛋白酶；
(3)37℃水浴酶解0.5-4 h；
(4)沸水浴20 min灭酶活，自然冷却至室温；
(5)用1mol/LNaOH调至pH＝7.5，按酶/底物＝1:5-1:20加入1000 U/mg的胰蛋白酶，37℃水浴酶解0.5-4h；
(7)沸水浴20 min使酶失活，自然冷却至室温；
(8)水解样品8000g离心20 min，收集上清液；
(9)冷冻干燥，获得小米蛋白水解物D，即小米蛋白水解物粉末。
5.根据权利要求4所述一种小米蛋白水解物的制备方法，其特征在于，步骤(2)按酶/底物＝1:70加入活力500U/mg的胃蛋白酶，37℃水浴酶解2 h。
6.根据权利要求4所述一种小米蛋白水解物的制备方法，其特征在于，步骤(5)用1mol/L NaOH调至pH＝7.5，按酶/底物＝1:10加入1000 U/mg的胰蛋白酶，37℃水浴酶解2h。
7.根据权利要求4所述一种小米蛋白水解物的制备方法，其特征在于，所得小米蛋白水解物D水解度为15.6％-31.4％。
8.权利要求7所述方法制备的小米蛋白水解物D用于制备治疗或改善结肠炎症的药物。
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