JP5791066B2 - 上皮細胞の増殖促進方法、及び上皮細胞の増殖促進剤 - Google Patents
上皮細胞の増殖促進方法、及び上皮細胞の増殖促進剤 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5791066B2 JP5791066B2 JP2010240973A JP2010240973A JP5791066B2 JP 5791066 B2 JP5791066 B2 JP 5791066B2 JP 2010240973 A JP2010240973 A JP 2010240973A JP 2010240973 A JP2010240973 A JP 2010240973A JP 5791066 B2 JP5791066 B2 JP 5791066B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- peptide
- cell growth
- growth promoting
- epithelial cell
- culture solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
本発明は、上皮細胞の増殖促進活性を有するペプチドを用いた上皮細胞の増殖促進方法、及び当該ペプチドを有効成分とする上皮細胞の増殖促進剤に関する。
ローヤルゼリーは、働き蜂が下咽頭腺と大腮腺から分泌する乳白色ゼリー状の栄養物質である。ローヤルゼリーは女王蜂幼虫の唯一の食糧であり、様々なビタミン類、ミネラル、糖質、アミノ酸、タンパク質成分を含み、非常に栄養価が高い。また、科学的に立証されてはいないものの、昔から、疲労回復作用、抗アレルギー作用、抗癌作用、免疫増強作用等の多くの薬理作用を有すると考えられている。このため、栄養補助食品や医薬品原料として広く用いられている。
近年、ローヤルゼリーの乾燥重量の約４０％を占めるタンパク質が、ローヤルゼリーの主要な生理活性物質として、注目されてきている。例えば、特許文献１及び２には、ローヤルゼリー中に含まれている分子量約５７ｋＤａの糖タンパク質が、肝細胞の増殖促進活性を有することが記載されている。
ローヤルゼリーは、粘性が高い上に水に不溶性の成分も含まれており、食品や医薬品の原料としての取り扱い性が難しい場合も多い。ローヤルゼリーをタンパク質分解酵素等によって分解することにより、粘性を低下させ、水溶性や安定性を向上させることができる。さらに、分解により、ローヤルゼリーが有する生理活性が増強されることもある。例えば、特許文献３では、ローヤルゼリー中のタンパク質をプロテアーゼによって分解して得られる分子量３，０００以下のペプチドを有効成分として含有する感染防御機能増強剤に係る発明が報告されている。また、ローヤルゼリー分解物が、分解処理前のローヤルゼリーには観察されなかった生理活性を有する場合もある。例えば、特許文献４では、ローヤルゼリーを、ペプシン並びにトリプシン及び／又はキモトリプシンにより処理して得られるローヤルゼリー分解物が、未分解のローヤルゼリーには観察されなかったアンギオテンシンＩ変換酵素に対する阻害活性を有することが報告されている。
現在用いられている方法の多くは、ローヤルゼリータンパク質を汎用されているプロテアーゼ等を用いて適当に分解しているにすぎない。汎用されている酵素は、ローヤルゼリーを本来の基質としているものではないため、不適当な箇所における分解により、本来有用であるペプチドの機能を失活させているおそれや、適当な箇所で分解されないことにより、生理活性を有するペプチドの産生効率が低くなるおそれがある。このため、ローヤルゼリーから、機能性ペプチド等の生理活性の高い分解物を効率よく得るためには、いずれの分解酵素を用いるかが重要である。実際に、特許文献４では、ペプシンにより処理して得られるローヤルゼリー分解物は、ペプシン並びにトリプシン及び／又はキモトリプシンにより処理して得られるローヤルゼリー分解物よりも阻害活性が顕著に低くなっている。
これに対して、ローヤルゼリーを主食とし、かつ、ローヤルゼリーの摂食により女王蜂への分化が制御されている女王蜂幼虫は、先天的にローヤルゼリーの分解に最適な分解酵素を有していると考えられる。つまり、女王蜂幼虫由来の分解酵素を用いることにより、ローヤルゼリーに含有されている機能性ペプチド等が有する生理活性を損なうおそれなく、ローヤルゼリーを分解することが期待できる。女王蜂幼虫由来の分解酵素については、特許文献５に、女王蜂幼虫中に内在する分解酵素を含有する組成物は、西洋ミツバチ(Ａｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａ) の２〜３日齢の女王蜂幼虫から遠心分離処理法を利用することによって調製できることが記載されている。さらに、特許文献５には、女王蜂幼虫由来の分解酵素を用いた分解処理により得られたローヤルゼリー分解物は、小腸由来の培養細胞に対して細胞増殖促進活性を有することも記載されている。
特許文献５に記載されているローヤルゼリー分解酵素含有物は、ローヤルゼリーの分解に最適な酵素であり、当該ローヤルゼリー分解酵素含有物により得られたローヤルゼリー分解物は、細胞増殖促進活性を備えるペプチドを豊富に含んでいると考えられる。
しかしながら、ローヤルゼリー分解物中には、様々な成分が含まれており、細胞増殖促進活性を備えるペプチドはその一部でしかないため、所望の細胞増殖促進効果を得るためには、多量のローヤルゼリー分解物を摂取しなくてはならないこともあり、摂取効率が良くない。
しかしながら、ローヤルゼリー分解物中には、様々な成分が含まれており、細胞増殖促進活性を備えるペプチドはその一部でしかないため、所望の細胞増殖促進効果を得るためには、多量のローヤルゼリー分解物を摂取しなくてはならないこともあり、摂取効率が良くない。
本発明は、細胞増殖促進活性を有するペプチドを用いた上皮細胞の増殖促進方法、及び当該ペプチドを有効成分とする上皮細胞の増殖促進剤を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、西洋ミツバチの女王蜂幼虫由来の分解酵素によって分解されたローヤルゼリー分解物中に含まれている細胞増殖促進活性を有するペプチドを同定し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、
（１） 配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分とすることを特徴とする、上皮細胞の増殖促進剤、
（２） 腸管感染症及び潰瘍性大腸炎からなる群より選択される１種以上の疾患の治療又は予防のために用いられることを特徴とする、前記（１）に記載の上皮細胞の増殖促進剤、
（３） 前記（１）又は（２）に記載の上皮細胞の増殖促進剤を、上皮細胞に接触させること（但し、ヒトに接触させることを除く。）を特徴とする、上皮細胞の増殖促進方法、
を提供するものである。
（１） 配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分とすることを特徴とする、上皮細胞の増殖促進剤、
（２） 腸管感染症及び潰瘍性大腸炎からなる群より選択される１種以上の疾患の治療又は予防のために用いられることを特徴とする、前記（１）に記載の上皮細胞の増殖促進剤、
（３） 前記（１）又は（２）に記載の上皮細胞の増殖促進剤を、上皮細胞に接触させること（但し、ヒトに接触させることを除く。）を特徴とする、上皮細胞の増殖促進方法、
を提供するものである。
本発明の上皮細胞の増殖促進方法及び上皮細胞の増殖促進剤により、上皮細胞の増殖を促進することができる。したがって、本発明の上皮細胞の増殖促進方法は、上皮細胞の損傷の修復を促進したり、腸管等の上皮細胞により形成される器官の形成が未発達である場合の器官形成を促進したりする効果が期待される。
本発明の上皮細胞の増殖促進剤は、下記に示すペプチドからなる群より選択される１種以上のペプチドを有効成分とすることを特徴とする。
配列番号１（Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（ペプチドＰ１）と、
配列番号１で表されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上皮細胞に対する増殖促進活性を有するペプチドと、
配列番号２（Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｌａ）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（ペプチドＰ２（非酸化型））と、
配列番号２で表されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上皮細胞に対する増殖促進活性を有するペプチドと、
配列番号２で表されるアミノ酸配列中の４番目のトリプトファン（Ｔｒｐ）が酸化型であるアミノ酸配列からなるペプチド（ペプチドＰ２（酸化型））と、
配列番号２で表されるアミノ酸配列中の４番目のＴｒｐが酸化型であるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上皮細胞に対する増殖促進活性を有するペプチドと、
配列番号３（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（ペプチドＰ３）と、
配列番号３で表されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上皮細胞に対する増殖促進活性を有するペプチド。
以下、これらのペプチドを、「細胞増殖促進活性ペプチド」と総称することがある。
配列番号１（Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（ペプチドＰ１）と、
配列番号１で表されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上皮細胞に対する増殖促進活性を有するペプチドと、
配列番号２（Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｌａ）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（ペプチドＰ２（非酸化型））と、
配列番号２で表されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上皮細胞に対する増殖促進活性を有するペプチドと、
配列番号２で表されるアミノ酸配列中の４番目のトリプトファン（Ｔｒｐ）が酸化型であるアミノ酸配列からなるペプチド（ペプチドＰ２（酸化型））と、
配列番号２で表されるアミノ酸配列中の４番目のＴｒｐが酸化型であるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上皮細胞に対する増殖促進活性を有するペプチドと、
配列番号３（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（ペプチドＰ３）と、
配列番号３で表されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上皮細胞に対する増殖促進活性を有するペプチド。
以下、これらのペプチドを、「細胞増殖促進活性ペプチド」と総称することがある。
本発明及び本願明細書において、ペプチド中のトリプトファンが酸化型であるとは、当該アミノ酸残基が、トリプトファン残基が酸化されて酸素原子が付加していることを意味する。
また、以下、ペプチドＰ２（非酸化型）とペプチドＰ２（酸化型）とを合わせて、ペプチドＰ２という。
また、以下、ペプチドＰ２（非酸化型）とペプチドＰ２（酸化型）とを合わせて、ペプチドＰ２という。
後記実施例に示すようにペプチドＰ１、ペプチドＰ２、及びペプチドＰ３は、ローヤルゼリー（以下、ＲＪ）を西洋ミツバチの女王蜂幼虫由来の分解酵素によって分解することによって得られるＲＪ分解物中に含まれているペプチドであり、上皮細胞に対する増殖促進活性を有する。より詳細には、これらのペプチドは、女王蜂幼虫由来の分解酵素によってＲＪをｐＨ９で４時間以上酵素処理することにより得られたＲＪ分解物から、本発明者らによって新たに単離・同定された。
女王蜂幼虫由来の分解酵素は、女王蜂幼虫の体組織懸濁物から、酵素を含む組成物として得ることができる。具体的には、西洋ミツバチの２〜３日齢の女王蜂幼虫の体組織懸濁物を３層（白色固形の上層、黄白色に濁った溶液の中層、白色からやや褐色の沈殿の下層）に遠心分離し、黄白色に濁った溶液の中層を、ＲＪ分解酵素含有物として回収することができる。
一般的に何らかの生理活性を有する機能性ペプチドは、そのＮ末端やＣ末端に数個のアミノ酸が付加された場合でも、当該ペプチドの機能性が失われない場合が多い。同様に、ペプチドＰ１、ペプチドＰ２、及びペプチドＰ３も、上皮細胞に対する増殖促進活性を損なうことなく、それらのＮ末端やＣ末端、さらにはその両方に、１〜数個のアミノ酸を付加することができる。
本発明においては、配列番号１〜３で表されるアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端の少なくともいずれか一方に付加されるアミノ酸の数は、アミノ酸付加後のペプチドが上皮細胞に対する増殖促進活性を有している限り、特に限定されるものではない。例えば、Ｎ末端又はＣ末端にそれぞれ、１〜５個、好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することができる。
よって、ペプチドＰ１、ペプチドＰ２、又はペプチドＰ３のＮ末端及びＣ末端の少なくともいずれか一方に１〜数個のアミノ酸が付加されており、かつ上皮細胞に対する増殖促進活性を有するペプチドも、ペプチドＰ１、ペプチドＰ２、及びペプチドＰ３と同様に、本発明の上皮細胞の増殖促進剤の有効成分とすることができる。
さらに、本発明においては、ペプチドＰ１、ペプチドＰ２、又はペプチドＰ３が有する上皮細胞の増殖促進活性を損なわない限り、ペプチドＰ１、ペプチドＰ２、又はペプチドＰ３中の１〜数個のアミノ酸を欠失、置換若しくは付加させてもよい。具体的には、配列番号１で表されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上皮細胞に対する増殖促進活性を有するペプチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上皮細胞に対する増殖促進活性を有するペプチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列中の４番目のＴｒｐが酸化型であるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上皮細胞に対する増殖促進活性を有するペプチド、及び配列番号３で表されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上皮細胞に対する増殖促進活性を有するペプチドからなる群より選択される１種以上のペプチドも、本発明の上皮細胞の増殖促進剤の有効成分とすることができる。
本発明の上皮細胞の増殖促進剤の有効成分である細胞増殖促進活性ペプチドは、ペプチド合成により得られた合成品であってもよく、ＲＪ分解物から精製されたものであってもよい。例えば、ＲＪ分解物をカラムクロマトグラフィーによって分画し、細胞増殖促進活性ペプチドを含有する画分を回収する。この回収された画分を、本発明の上皮細胞の増殖促進剤の有効成分とすることができる。
本発明の上皮細胞の増殖促進剤は、医薬品やサプリメント等の飲食品として単独で摂取されてもよく、他の飲食用組成物や医薬用組成物と同様に、飲食品や医薬品への添加剤として用いることもできる。
本発明の上皮細胞の増殖促進剤の剤型は、特に限定されるものではない。例えば、ソフトカプセル剤、ハードカプセル剤、錠剤、顆粒剤、散剤、液剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤等であってもよい。培養細胞等へ用いられる場合には、乾燥粉末や、水や緩衝液等の適当な溶液に溶解させた液剤であることが好ましい。一方、生物個体へ用いられる場合には、経口投与に適した剤型であることが好ましく、腸溶剤であることがより好ましい。その他、増殖を促進させたい上皮細胞が外用剤を直接塗布することが可能な部位にある場合には、軟膏剤やクリーム剤、液剤、ゲル剤であることも好ましい。
本発明の上皮細胞の増殖促進剤に含まれる細胞増殖促進活性ペプチドは、１種類のみであってもよく、２種類以上を組み合わせてもよい。また、これらの増殖促進剤に含まれる細胞増殖促進活性ペプチドの量は、該細胞増殖促進活性ペプチドの細胞増殖促進活性の作用効果が発揮され得る量であれば、特に限定されるものではなく、細胞増殖促進活性ペプチドの種類や、剤型等を考慮して、適宜決定することができる。
本発明の上皮細胞の増殖促進剤は、細胞増殖促進活性ペプチドのみからなるものであってもよく、その他の成分を含有するものであってもよい。その他の成分としては、細胞増殖促進活性ペプチドの活性を損なわない限り、どのような成分であってもよく、例えば、細胞増殖促進活性ペプチド以外のＲＪ由来の成分を含有していてもよく、抗菌性や抗酸化性等の機能性ペプチドを含有していてもよい。その他にも、本発明の上皮細胞の増殖促進剤は、例えば、賦型剤、結合剤、界面活性剤、酸化防止剤、ｐＨ調整剤、崩壊剤、滑沢剤、防腐剤、殺菌剤、着色剤、矯味矯臭剤等の、医薬品や飲食品に添加される成分を含有することができる。
本発明の上皮細胞の増殖促進剤の製造方法は、含有される細胞増殖促進活性ペプチドの増殖促進活性を損なわない方法であれば特に限定されるものではなく、通常、機能性ペプチドを含有する飲食用組成物又は医薬用組成物を製造する場合に使用される方法を用いて製造することができる。
本発明の上皮細胞の増殖促進剤の投与量は、細胞増殖促進活性ペプチドの細胞増殖促進活性が発揮され得る量であれば、特に限定されるものではなく、細胞増殖促進活性ペプチドの種類、対象とする細胞の種類や状態、剤形、投与方法等を考慮して適宜決定することができる。例えば、培養細胞等の生物個体外の細胞へ用いる場合には、本発明の上皮細胞の増殖促進剤を、培養液中の細胞増殖促進活性ペプチドの含有量が０．１μｇ〜５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１μｇ〜１ｍｇ／ｍＬとなるように培養液へ添加することができる。
生物個体に摂取させる場合には、本発明の上皮細胞の増殖促進剤の摂取量は、該細胞増殖促進活性ペプチドの細胞増殖促進活性が発揮され得る量であれば、特に限定されるものではなく、摂取する人や動物の体重、年齢、性別、剤型等により適宜決定することができる。例えば、細胞増殖促進活性ペプチドの一日当たりの摂取量が１μｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１μｇ〜１ｍｇ／ｋｇとなるように、１度に又は数回に分けて摂取させることが好ましい。
何らかの原因によって小腸上皮組織に損傷を受けた場合には、損傷部位近傍の正常な細胞が増殖することによって、損傷部位が修復される。したがって、本発明の上皮細胞の増殖促進剤は、腸管上皮組織の損傷を伴う疾患の治療や予防のために好適に用いることができる。腸管上皮組織の損傷を伴う疾患としては、例えば、腸管感染症、潰瘍性大腸炎等が挙げられる。また、未熟児では腸管形成が不十分であり、壊死が起こりやすい等の問題が生じる場合があるが、本発明の上皮細胞の増殖促進剤によって腸管形成が促進される効果も期待することができる。
本発明の上皮細胞の増殖促進剤は、腸管上皮細胞以外の上皮細胞、例えば皮膚由来上皮細胞に対しても増殖促進活性を有する。このため、本発明の上皮細胞の増殖促進剤は、火傷等の皮膚上皮組織の損傷に対する治療剤として機能することが期待できる。
例えば特許文献１や２に記載されている肝細胞の増殖促進活性を有するタンパク質は、経口投与された場合に、摂取された生体内の酵素によって消化を受けるため、増殖促進活性が大幅に低下してしまう可能性がある。これに対して、本発明の上皮細胞の増殖促進剤の有効成分はペプチドであり、タンパク質に比べて摂取された生物の体内消化酵素やｐＨの変化等による影響を受けにくいため、効率よく増殖促進作用を発揮し得る。
細胞増殖促進活性ペプチドにより上皮細胞の増殖が促進される作用機序は未だ明らかではないが、後記実施例４〜６の結果から、ペプチドＰ１の細胞増殖促進作用は、ＳｒｃファミリーからＭＥＫ５−ＥＲＫ５経路、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路にシグナルが伝達されている可能性が示唆される。一方で、Ｓｒｃファミリーを下流のシグナル伝達経として含み、細胞表面の受容体の一つとして働くことが報告されている分子として、インテグリンが挙げられる。インテグリンについては、これまでに、アポトーシスにおいてペプチドと相互作用をすることや、ＡｋｔやＳＴＡＴとの関連が報告されている（Ehattacharya, et al.: Biochem J, (2006) vol.397, p437-447）。また、インテグリンとＳｒｃの間には、ＦＡＫを介してシグナルが伝達されているという報告もある（Guan: Matrix Biology (1997), vol.16, p195-200）。これらの知見から、ペプチドＰ１は、インテグリンとの相互作用により、ＦＡＫを介してＳｒｃを活性化し、この結果、ＭＥＫ５−ＥＲＫ５経路、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路にシグナルが伝達されることによって細胞増殖が促進されている可能性がある。
本発明の上皮細胞の増殖促進方法は、少なくとも１種類の細胞増殖促進活性ペプチドを上皮細胞に接触させることを特徴とする。ペプチドＰ１、ペプチドＰ２、ペプチドＰ３等の細胞増殖促進活性ペプチドを接触させて増殖を促進させる上皮細胞は、生物個体の腸管や皮膚等の上皮組織に存在する細胞であってもよく、培養細胞等の生物個体外の細胞であってもよい。具体的には、生物個体外の細胞へは、当該細胞の培養液等に細胞増殖促進活性ペプチドを添加することによって、また、生物個体中の細胞へは、細胞増殖促進活性ペプチドを経口投与や上皮組織表面へ直接塗布又は噴霧することによって、細胞増殖促進活性ペプチドを上皮細胞に接触させることができる。
本発明において増殖を促進させる生物個体外の細胞は、ヒト由来の上皮細胞であってもよく、ヒト以外の動物由来の上皮細胞であってもよい。また、生物個体中の細胞増殖を促進させるために、細胞増殖促進活性ペプチドを投与する生物としては、ヒトであってもよく、ヒト以外の動物であってもよい。
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［参考例１］ ＲＪ分解酵素含有物の調製
約１５ｇの３日齢の西洋ミツバチの女王蜂幼虫を、採取した後、氷冷した生理食塩水で洗浄した。その後、ポリエステル製の平均１００メッシュの布（「テトロン」、東レ社製）を用いて女王蜂幼虫を裏ごしすることで、幼虫の表皮を破り、体液及び内臓を搾り出した。これにより、乳白色の幼虫懸濁物を調製した。
当該幼虫懸濁物を、ｐＨ７の５０ｍＭリン酸緩衝液を用いて２倍希釈した後、１０，０００×ｇ、５℃で１０分間遠心した。該遠心処理により、白色固形の上層、黄白色に濁った溶液の中層、白色からやや褐色の沈殿による下層の３層に分離された。該上層は脂質分、該下層は不溶性の体組織等と推定される。該中層を回収した後、さらに１０，０００×ｇ、５℃で１０分間遠心して３層に分離し、中層をＲＪ分解酵素含有物として回収した。該ＲＪ分解酵素含有物を、除去しきれなかった不溶性の組織片を除去し、かつ滅菌するために、０．２μｍのセルロースアセテート系フィルター（ＤＩＳＭＩＣ−２５ＣＳ、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）を用いて濾過した。これにより、黄色透明なＲＪ分解酵素含有物を得た。
該ＲＪ分解酵素含有物のタンパク質濃度を、ＢＳＡを標準物質としてＬｏｗｒｙ法を用いて測定し、ｐＨ７の５０ｍＭリン酸緩衝液を用いて、３ｍｇ／ｍＬのＲＪ分解酵素溶液を調製した。
約１５ｇの３日齢の西洋ミツバチの女王蜂幼虫を、採取した後、氷冷した生理食塩水で洗浄した。その後、ポリエステル製の平均１００メッシュの布（「テトロン」、東レ社製）を用いて女王蜂幼虫を裏ごしすることで、幼虫の表皮を破り、体液及び内臓を搾り出した。これにより、乳白色の幼虫懸濁物を調製した。
当該幼虫懸濁物を、ｐＨ７の５０ｍＭリン酸緩衝液を用いて２倍希釈した後、１０，０００×ｇ、５℃で１０分間遠心した。該遠心処理により、白色固形の上層、黄白色に濁った溶液の中層、白色からやや褐色の沈殿による下層の３層に分離された。該上層は脂質分、該下層は不溶性の体組織等と推定される。該中層を回収した後、さらに１０，０００×ｇ、５℃で１０分間遠心して３層に分離し、中層をＲＪ分解酵素含有物として回収した。該ＲＪ分解酵素含有物を、除去しきれなかった不溶性の組織片を除去し、かつ滅菌するために、０．２μｍのセルロースアセテート系フィルター（ＤＩＳＭＩＣ−２５ＣＳ、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）を用いて濾過した。これにより、黄色透明なＲＪ分解酵素含有物を得た。
該ＲＪ分解酵素含有物のタンパク質濃度を、ＢＳＡを標準物質としてＬｏｗｒｙ法を用いて測定し、ｐＨ７の５０ｍＭリン酸緩衝液を用いて、３ｍｇ／ｍＬのＲＪ分解酵素溶液を調製した。
［参考例２］ＲＪタンパク質溶液の調製
ＲＪ（中国産）１０ｍＬに、ｐＨ７．０の５０ｍＭリン酸緩衝液２０ｍＬを加えて混合して、ＲＪ希釈溶液を調製した。該ＲＪ希釈溶液を、２５，０００×ｇ、５℃で２０分間遠心した後、不溶性成分を除去し、上清を回収した。その後、該上清を、ｐＨ７．０の５０ｍＭリン酸緩衝液を用いて希釈し、３０ｍｇ／ｍＬのＲＪタンパク質溶液を調製した。
ＲＪ（中国産）１０ｍＬに、ｐＨ７．０の５０ｍＭリン酸緩衝液２０ｍＬを加えて混合して、ＲＪ希釈溶液を調製した。該ＲＪ希釈溶液を、２５，０００×ｇ、５℃で２０分間遠心した後、不溶性成分を除去し、上清を回収した。その後、該上清を、ｐＨ７．０の５０ｍＭリン酸緩衝液を用いて希釈し、３０ｍｇ／ｍＬのＲＪタンパク質溶液を調製した。
［実施例１］
ＲＪ分解物中の上皮細胞増殖促進活性を有するペプチドＰ１を同定した。
１．ＲＪタンパク質の分解
８ｍＬの５０ｍＭ Ｔｒｉ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９）に、１ｍＬの前記参考例２に記載する方法により調製したＲＪタンパク質溶液（３０ｍｇ／ｍＬ）と、前記実施例１に記載する方法により調製した１ｍＬのＲＪ分解酵素溶液（６ｍｇ／ｍＬ）を添加して混合した酵素反応液を調製した。該酵素反応液を３７℃で２４時間反応させた後、氷冷して反応を停止させ、ＲＪ分解物（ｐＨ９）を得た。
ＲＪ分解物中の上皮細胞増殖促進活性を有するペプチドＰ１を同定した。
１．ＲＪタンパク質の分解
８ｍＬの５０ｍＭ Ｔｒｉ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９）に、１ｍＬの前記参考例２に記載する方法により調製したＲＪタンパク質溶液（３０ｍｇ／ｍＬ）と、前記実施例１に記載する方法により調製した１ｍＬのＲＪ分解酵素溶液（６ｍｇ／ｍＬ）を添加して混合した酵素反応液を調製した。該酵素反応液を３７℃で２４時間反応させた後、氷冷して反応を停止させ、ＲＪ分解物（ｐＨ９）を得た。
２．ゲル濾過クロマトグラフィーによる分画
ＲＪ分解物（ｐＨ９）を、Ｈｉ Ｔｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いてサイズ分画を行った。吸光度（２８０ｎｍ）及び伝導率を測定して得られた溶出パターンに従って、比較的分子量の大きい脱塩した高分子量画分（以下、フラクションＤ１）と、比較的分子量が小さく塩を含む低分子量画分（以下、フラクションＤ２）の２つの画分を分取した。なお、低分子量画分は、分子量１０００〜１５００にピークを有する画分であった。
図１は、Ｈｉ Ｔｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラムを用いたカラムクロマトグラフィーによってＲＪ分解物（ｐＨ９）を分画し、吸光度（２８０ｎｍ）及び伝導率を測定した結果得られたチャート図である。実線がＲＪ分解物（ｐＨ９）の吸光度、点線がＲＪ分解物（ｐＨ９）の伝導率を、それぞれ示している。図中、「Ｄ１」がフラクションＤ１として分取した画分であり、「Ｄ２」がフラクションＤ２として分取した画分である。
ＲＪ分解物（ｐＨ９）を、Ｈｉ Ｔｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いてサイズ分画を行った。吸光度（２８０ｎｍ）及び伝導率を測定して得られた溶出パターンに従って、比較的分子量の大きい脱塩した高分子量画分（以下、フラクションＤ１）と、比較的分子量が小さく塩を含む低分子量画分（以下、フラクションＤ２）の２つの画分を分取した。なお、低分子量画分は、分子量１０００〜１５００にピークを有する画分であった。
図１は、Ｈｉ Ｔｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラムを用いたカラムクロマトグラフィーによってＲＪ分解物（ｐＨ９）を分画し、吸光度（２８０ｎｍ）及び伝導率を測定した結果得られたチャート図である。実線がＲＪ分解物（ｐＨ９）の吸光度、点線がＲＪ分解物（ｐＨ９）の伝導率を、それぞれ示している。図中、「Ｄ１」がフラクションＤ１として分取した画分であり、「Ｄ２」がフラクションＤ２として分取した画分である。
３．逆相クロマトグラフィーによる分画１
フラクションＤ２（ｐＨ９）を、ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ１２０−Ｔカラム（東ソー社製）を用いて分画を行った。吸着バッファーとして、０．０５％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）溶液を、溶出バッファーとして、０．０５％ＴＦＡ含有９０％アセトニトリル溶液を、それぞれ用いて、グラジエント溶出を行った。
図２は、ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ１２０−Ｔカラムを用いたカラムクロマトグラフィーによってフラクションＤ２（ｐＨ９）を分画し、吸光度（２１５ｎｍ）を測定した結果得られたチャート図である。図中、実線が吸光度を示し、点線がアセトニトリルの濃度を示す。図２に示すように、主に４つのピークが観察され、各ピークを含む４つの画分を、フラクションＤ２−１〜４としてそれぞれ分取した。各画分は、図２に示す。
フラクションＤ２（ｐＨ９）を、ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ１２０−Ｔカラム（東ソー社製）を用いて分画を行った。吸着バッファーとして、０．０５％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）溶液を、溶出バッファーとして、０．０５％ＴＦＡ含有９０％アセトニトリル溶液を、それぞれ用いて、グラジエント溶出を行った。
図２は、ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ１２０−Ｔカラムを用いたカラムクロマトグラフィーによってフラクションＤ２（ｐＨ９）を分画し、吸光度（２１５ｎｍ）を測定した結果得られたチャート図である。図中、実線が吸光度を示し、点線がアセトニトリルの濃度を示す。図２に示すように、主に４つのピークが観察され、各ピークを含む４つの画分を、フラクションＤ２−１〜４としてそれぞれ分取した。各画分は、図２に示す。
４．フラクションＤ２−１〜４の上皮細胞増殖促進活性の測定
フラクションＤ２−１〜４が有する細胞増殖活性を調べるため、ラットの小腸クリプト由来の培養細胞株ＩＥＣ−６細胞を用いてＷＳＴ−１法を行った。
具体的には、常法により培養されたＩＥＣ−６細胞の培養液を、ＦＣＳ等の増殖因子を含有しない培養液（対照培養液）にフラクションＤ２−１〜４のいずれかを含有させた培養液に交換して、さらに２４時間培養した。なお、各培養液には、フラクションＤ２−１〜４のいずれかを、フラクション由来のタンパク質濃度が１０〜２００μｇ／ｍＬとなるように添加した。その後、培養液中に、テトラゾリウム塩ＷＳＴ−１（和光純薬工業社製）を添加して２時間培養した後、細胞培養液の４５０ｎｍの吸光度を測定することにより、フォルマザン産物の産生量を測定した。各培養液を用いて培養した場合の細胞増殖量は、対照培養液を添加した場合に産生されたフォルマザン産物量に対する、各培養液を添加した場合に産生されたフォルマザン産物量の比率（％）で表した。ポジティブコントロールとして５％ＦＣＳ含有培養液を、ネガティブコントロールとして対照培養液を、それぞれ用いた。
フラクションＤ２−１〜４が有する細胞増殖活性を調べるため、ラットの小腸クリプト由来の培養細胞株ＩＥＣ−６細胞を用いてＷＳＴ−１法を行った。
具体的には、常法により培養されたＩＥＣ−６細胞の培養液を、ＦＣＳ等の増殖因子を含有しない培養液（対照培養液）にフラクションＤ２−１〜４のいずれかを含有させた培養液に交換して、さらに２４時間培養した。なお、各培養液には、フラクションＤ２−１〜４のいずれかを、フラクション由来のタンパク質濃度が１０〜２００μｇ／ｍＬとなるように添加した。その後、培養液中に、テトラゾリウム塩ＷＳＴ−１（和光純薬工業社製）を添加して２時間培養した後、細胞培養液の４５０ｎｍの吸光度を測定することにより、フォルマザン産物の産生量を測定した。各培養液を用いて培養した場合の細胞増殖量は、対照培養液を添加した場合に産生されたフォルマザン産物量に対する、各培養液を添加した場合に産生されたフォルマザン産物量の比率（％）で表した。ポジティブコントロールとして５％ＦＣＳ含有培養液を、ネガティブコントロールとして対照培養液を、それぞれ用いた。
この結果、フラクションＤ２−３又はＤ２−４を含有させた培養液で培養した場合には、対照培養液で培養した場合よりも細胞増殖量が増大しており、フラクションＤ２−３及びＤ２−４には、細胞増殖促進活性を有する成分が含まれていることが確認された。一方、フラクションＤ２−１又はＤ２−２を含有させた培養液で培養した場合には、いずれも、対照培養液で培養した場合と同様に細胞増殖量はほとんど変化せず、これらの画分には細胞増殖に著しい影響を与えることはないことが明らかになった。
５．逆相クロマトグラフィーによる分画２
フラクションＤ２−３（４０〜４５％アセトニトリル濃度によって溶出されるピークを有する画分）を、再度ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ１２０−Ｔカラム（東ソー社製）を用いて分画を行った。吸着バッファーとして、０．０５％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）溶液を、溶出バッファーとして、０．０５％ＴＦＡ含有９０％アセトニトリル溶液を、それぞれ用いて、グラジエント溶出を行った。
図３は、ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ１２０−Ｔカラムを用いたカラムクロマトグラフィーによってフラクションＤ２−３を分画し、吸光度（２１５ｎｍ）を測定した結果得られたチャート図である。図中、実線が吸光度を示し、点線がアセトニトリルの濃度を示す。図３に示すように、主に２つのピークが観察され、第１のピークの前のフラクションＤ２−３ａ（図３中の「ａ」）、第１のピークを含むフラクションＤ２−３ｂ（図３中の「ｂ」）、第２のピークを含むフラクションＤ２−３ｃ（図３中の「ｃ」）、及び第２のピークの後のフラクションＤ２−３ｄ（図３中の「ｄ」）の４つの画分を分取した。
フラクションＤ２−３（４０〜４５％アセトニトリル濃度によって溶出されるピークを有する画分）を、再度ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ１２０−Ｔカラム（東ソー社製）を用いて分画を行った。吸着バッファーとして、０．０５％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）溶液を、溶出バッファーとして、０．０５％ＴＦＡ含有９０％アセトニトリル溶液を、それぞれ用いて、グラジエント溶出を行った。
図３は、ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ１２０−Ｔカラムを用いたカラムクロマトグラフィーによってフラクションＤ２−３を分画し、吸光度（２１５ｎｍ）を測定した結果得られたチャート図である。図中、実線が吸光度を示し、点線がアセトニトリルの濃度を示す。図３に示すように、主に２つのピークが観察され、第１のピークの前のフラクションＤ２−３ａ（図３中の「ａ」）、第１のピークを含むフラクションＤ２−３ｂ（図３中の「ｂ」）、第２のピークを含むフラクションＤ２−３ｃ（図３中の「ｃ」）、及び第２のピークの後のフラクションＤ２−３ｄ（図３中の「ｄ」）の４つの画分を分取した。
６．フラクションＤ２−３ａ〜ｄの上皮細胞増殖促進活性の測定
フラクションＤ２−３ａ〜ｄが有する細胞増殖活性を調べるため、ＩＥＣ−６細胞を用いてＷＳＴ−１法を行った。具体的には、前記４．でフラクションＤ２−１〜４が有する細胞増殖活性を調べた方法と同様にして行った。
この結果、フラクションＤ２−３ａを含有させた培養液で培養した場合には、対照培養液で培養した場合よりも細胞増殖量が増大しており、フラクションＤ２−３ａには、細胞増殖促進活性を有する成分が含まれていることが確認された。一方、フラクションＤ２−３ｂ、Ｄ２−３ｃ、及びＤ２−３ｄを含有させた培養液で培養した場合には、いずれも、対照培養液で培養した場合と同様に細胞増殖量はほとんど変化せず、これらの画分には細胞増殖に著しい影響を与えることはないことが明らかになった。
フラクションＤ２−３ａ〜ｄが有する細胞増殖活性を調べるため、ＩＥＣ−６細胞を用いてＷＳＴ−１法を行った。具体的には、前記４．でフラクションＤ２−１〜４が有する細胞増殖活性を調べた方法と同様にして行った。
この結果、フラクションＤ２−３ａを含有させた培養液で培養した場合には、対照培養液で培養した場合よりも細胞増殖量が増大しており、フラクションＤ２−３ａには、細胞増殖促進活性を有する成分が含まれていることが確認された。一方、フラクションＤ２−３ｂ、Ｄ２−３ｃ、及びＤ２−３ｄを含有させた培養液で培養した場合には、いずれも、対照培養液で培養した場合と同様に細胞増殖量はほとんど変化せず、これらの画分には細胞増殖に著しい影響を与えることはないことが明らかになった。
７．フラクションＤ２−３ａ中のペプチドのアミノ酸配列の同定
上皮細胞に対する増殖促進活性を示したフラクションＤ２−３ａに対して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析を行った。その結果、７つの分子イオンピーク（ｍ／ｚ：９０６．６３３、１０１９．７２８、１１３２．７２７、１１７７．６０５、１２３０．７５０、１２９５．８０８）が得られた。それらに対してさらにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ／ＭＳ分析を行い、Ｍａｓｃｏｔ検索を行った結果、ｍ／ｚ：１２９５．８０８の分子イオンピークがＭａｊｏｒ Ｒｏｙａｌ Ｊｅｌｌｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ １（ＭＰＪＰ１）の３７２〜３８１番目のＹＩＮＲＥＹＩＬＶＬ（Ｍｗ：１２９５．５３）（配列番号１）のアミノ酸配列からなるペプチドであると同定された。
上皮細胞に対する増殖促進活性を示したフラクションＤ２−３ａに対して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析を行った。その結果、７つの分子イオンピーク（ｍ／ｚ：９０６．６３３、１０１９．７２８、１１３２．７２７、１１７７．６０５、１２３０．７５０、１２９５．８０８）が得られた。それらに対してさらにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ／ＭＳ分析を行い、Ｍａｓｃｏｔ検索を行った結果、ｍ／ｚ：１２９５．８０８の分子イオンピークがＭａｊｏｒ Ｒｏｙａｌ Ｊｅｌｌｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ １（ＭＰＪＰ１）の３７２〜３８１番目のＹＩＮＲＥＹＩＬＶＬ（Ｍｗ：１２９５．５３）（配列番号１）のアミノ酸配列からなるペプチドであると同定された。
［実施例２］
ＲＪ分解物中の上皮細胞増殖促進活性を有するペプチドＰ２（酸化型）及びペプチドＰ３を同定した。
１．逆相クロマトグラフィーによる分画１
実施例１の「２．ゲル濾過クロマトグラフィーによる分画」により得られたフラクションＤ２（ｐＨ９）を、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ（登録商標） ５Ｃ１８−ＡＲカラム（ナカライテスク社製）を用いて分画を行った。吸着バッファーとして、０．０５％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）溶液を、溶出バッファーとして、０．０５％ＴＦＡ含有９０％アセトニトリル溶液を、それぞれ用いて、グラジエント溶出を行った。この結果、主に５つのピークが観察され、各ピークを含む５つの画分を、フラクションＤ２’−１〜５としてそれぞれ分取した。
フラクションＤ２’−１〜５が有する細胞増殖活性を調べるため、ＩＥＣ−６細胞を用いてＷＳＴ−１法を行った。具体的には、前記４．でフラクションＤ２−１〜４が有する細胞増殖活性を調べた方法と同様にして行った。この結果、フラクションＤ２’−５を含有させた培養液で培養した場合には、対照培養液で培養した場合よりも細胞増殖量が増大しており、フラクションＤ２’−５には、細胞増殖促進活性を有する成分が含まれていることが確認された。
ＲＪ分解物中の上皮細胞増殖促進活性を有するペプチドＰ２（酸化型）及びペプチドＰ３を同定した。
１．逆相クロマトグラフィーによる分画１
実施例１の「２．ゲル濾過クロマトグラフィーによる分画」により得られたフラクションＤ２（ｐＨ９）を、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ（登録商標） ５Ｃ１８−ＡＲカラム（ナカライテスク社製）を用いて分画を行った。吸着バッファーとして、０．０５％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）溶液を、溶出バッファーとして、０．０５％ＴＦＡ含有９０％アセトニトリル溶液を、それぞれ用いて、グラジエント溶出を行った。この結果、主に５つのピークが観察され、各ピークを含む５つの画分を、フラクションＤ２’−１〜５としてそれぞれ分取した。
フラクションＤ２’−１〜５が有する細胞増殖活性を調べるため、ＩＥＣ−６細胞を用いてＷＳＴ−１法を行った。具体的には、前記４．でフラクションＤ２−１〜４が有する細胞増殖活性を調べた方法と同様にして行った。この結果、フラクションＤ２’−５を含有させた培養液で培養した場合には、対照培養液で培養した場合よりも細胞増殖量が増大しており、フラクションＤ２’−５には、細胞増殖促進活性を有する成分が含まれていることが確認された。
２．逆相クロマトグラフィーによる分画２
フラクションＤ２’−５を再度Ｃｏｓｍｏｓｉｌ（登録商標） ５Ｃ１８−ＡＲカラム（ナカライテスク社製）を用いて、同様の条件で分画を行った。この結果、主に３つのピークが観察され、各ピークを含む５つの画分を、それぞれフラクションＤ２’−５ａ〜ｃとしてそれぞれ分取した。
フラクションＤ２’−５ａ〜ｃが有する細胞増殖活性を調べるため、ＩＥＣ−６細胞を用いてＷＳＴ−１法を行った。具体的には、前記４．でフラクションＤ２−１〜４が有する細胞増殖活性を調べた方法と同様にして行った。
この結果、フラクションＤ２’−５ａ又はフラクションＤ２’−５ｃを含有させた培養液で培養した場合には、対照培養液で培養した場合よりも細胞増殖量が増大しており、これらのフラクションには、細胞増殖促進活性を有する成分が含まれていることが確認された。
フラクションＤ２’−５を再度Ｃｏｓｍｏｓｉｌ（登録商標） ５Ｃ１８−ＡＲカラム（ナカライテスク社製）を用いて、同様の条件で分画を行った。この結果、主に３つのピークが観察され、各ピークを含む５つの画分を、それぞれフラクションＤ２’−５ａ〜ｃとしてそれぞれ分取した。
フラクションＤ２’−５ａ〜ｃが有する細胞増殖活性を調べるため、ＩＥＣ−６細胞を用いてＷＳＴ−１法を行った。具体的には、前記４．でフラクションＤ２−１〜４が有する細胞増殖活性を調べた方法と同様にして行った。
この結果、フラクションＤ２’−５ａ又はフラクションＤ２’−５ｃを含有させた培養液で培養した場合には、対照培養液で培養した場合よりも細胞増殖量が増大しており、これらのフラクションには、細胞増殖促進活性を有する成分が含まれていることが確認された。
３．フラクションＤ２’−５ａ中のペプチドのアミノ酸配列の同定
上皮細胞に対する増殖促進活性を示したフラクションＤ２’−５ａに対して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析を行った。その結果、１つの分子イオンピーク（ｍ／ｚ：９０１．３４０）が得られた。それらに対してさらにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ／ＭＳ分析を行い、Ｍａｓｃｏｔ検索を行った結果、ｍ／ｚ：９０１．３４０の分子イオンピークがＭＰＪＰ１の１０７〜１１３番目のＹＰＤＷＳＦＡ（Ｍｗ：９０１．９３）（配列番号２）のアミノ酸配列からなり、かつ４番目のトリプトファン残基が酸化型であるペプチドであると同定された。
上皮細胞に対する増殖促進活性を示したフラクションＤ２’−５ａに対して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析を行った。その結果、１つの分子イオンピーク（ｍ／ｚ：９０１．３４０）が得られた。それらに対してさらにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ／ＭＳ分析を行い、Ｍａｓｃｏｔ検索を行った結果、ｍ／ｚ：９０１．３４０の分子イオンピークがＭＰＪＰ１の１０７〜１１３番目のＹＰＤＷＳＦＡ（Ｍｗ：９０１．９３）（配列番号２）のアミノ酸配列からなり、かつ４番目のトリプトファン残基が酸化型であるペプチドであると同定された。
４．フラクションＤ２’−５ｃ中のペプチドのアミノ酸配列の同定
上皮細胞に対する増殖促進活性を示したフラクションＤ２’−５ｃに対して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析を行った。その結果、４つの分子イオンピーク（ｍ／ｚ：１０２２．６１７，１１８２．６７９，１２５６．７０５，１４５６．７４３）が得られた。それらに対してさらにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ／ＭＳ分析を行い、Ｍａｓｃｏｔ検索を行った結果、ｍ／ｚ：１０２２．６１７の分子イオンピークがＭＰＪＰ１の３６６〜３７３番目のＶＰＩＦＤＲＹＩ（Ｍｗ：１０２２．２０）（配列番号３）のアミノ酸配列からなるペプチドであると同定された。
上皮細胞に対する増殖促進活性を示したフラクションＤ２’−５ｃに対して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析を行った。その結果、４つの分子イオンピーク（ｍ／ｚ：１０２２．６１７，１１８２．６７９，１２５６．７０５，１４５６．７４３）が得られた。それらに対してさらにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ／ＭＳ分析を行い、Ｍａｓｃｏｔ検索を行った結果、ｍ／ｚ：１０２２．６１７の分子イオンピークがＭＰＪＰ１の３６６〜３７３番目のＶＰＩＦＤＲＹＩ（Ｍｗ：１０２２．２０）（配列番号３）のアミノ酸配列からなるペプチドであると同定された。
［実施例３］
ＩＥＣ−６細胞を用いたＷＳＴ−１法により、ペプチドＰ１、ペプチドＰ２（非酸化型）、及びペプチドＰ３が有する細胞増殖活性を比較した。ペプチドＰ１〜３は、常法により合成したものを用いた。
具体的には、常法により培養されたＩＥＣ−６細胞の培養液を、ＦＣＳ等の増殖因子を含有しない培養液（対照培養液）にペプチドＰ１、ペプチドＰ２（非酸化型）、及びペプチドＰ３のいずれかを１０〜５００μｇ／ｍＬになるように含有させた培養液に交換して、さらに２４時間培養した。その後、各培養液を用いて培養した場合の細胞増殖量を、実施例１と同様にして測定した。ポジティブコントロールとして５％ＦＣＳ含有培養液を、ネガティブコントロールとして対照培養液を、それぞれ用いた。
ＩＥＣ−６細胞を用いたＷＳＴ−１法により、ペプチドＰ１、ペプチドＰ２（非酸化型）、及びペプチドＰ３が有する細胞増殖活性を比較した。ペプチドＰ１〜３は、常法により合成したものを用いた。
具体的には、常法により培養されたＩＥＣ−６細胞の培養液を、ＦＣＳ等の増殖因子を含有しない培養液（対照培養液）にペプチドＰ１、ペプチドＰ２（非酸化型）、及びペプチドＰ３のいずれかを１０〜５００μｇ／ｍＬになるように含有させた培養液に交換して、さらに２４時間培養した。その後、各培養液を用いて培養した場合の細胞増殖量を、実施例１と同様にして測定した。ポジティブコントロールとして５％ＦＣＳ含有培養液を、ネガティブコントロールとして対照培養液を、それぞれ用いた。
各培養液を用いて培養した場合の細胞増殖量を図４に示す。（ａ）は、ペプチドＰ１を含有させた培養液を添加した場合の結果であり、（ｂ）は、ペプチドＰ２（非酸化型）を含有させた培養液を添加した場合の結果であり、（ｃ）は、ペプチドＰ３を含有させた培養液を添加した場合の結果である。図中、「０％ＦＣＳ」は対照培養液を、「５％ＦＣＳ」は５％ＦＣＳ含有培養液を、それぞれ示している。また、残るカラムの各濃度は、各培養液中のペプチド濃度を示している。
この結果、いずれのペプチドを添加した場合にも、細胞増殖は有意に促進されており、ペプチドＰ１、ペプチドＰ２（非酸化型）、及びペプチドＰ３の全てが小腸上皮細胞の増殖促進活性を有することが確認された。中でも、ペプチドＰ１が最も強い細胞増殖促進作用を示した。
この結果、いずれのペプチドを添加した場合にも、細胞増殖は有意に促進されており、ペプチドＰ１、ペプチドＰ２（非酸化型）、及びペプチドＰ３の全てが小腸上皮細胞の増殖促進活性を有することが確認された。中でも、ペプチドＰ１が最も強い細胞増殖促進作用を示した。
［実施例４］
ペプチドＰ１の上皮細胞増殖促進活性に関するシグナル伝達機構について、各種シグナル伝達阻害剤を用いて検討した。
シグナル伝達阻害剤としては、Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ、ＡＧ１４７８、及びＰＰ２を用いた。Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎは、細胞表面に存在する受容体型プロテインチロシンキナーゼ（ＰＴＫ）と、非受容体型ＰＴＫの両方を非特異的に阻害するものである。また、ＡＧ１４７８は、代表的な受容体型ＰＴＫである上皮成長因子（ＥＧＦ）のレセプターを特異的に阻害するものであり、ＰＰ２は、代表的な非受容体型ＰＴＫであるＳｒｃファミリーを特異的に阻害するものである。
ペプチドＰ１の上皮細胞増殖促進活性に関するシグナル伝達機構について、各種シグナル伝達阻害剤を用いて検討した。
シグナル伝達阻害剤としては、Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ、ＡＧ１４７８、及びＰＰ２を用いた。Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎは、細胞表面に存在する受容体型プロテインチロシンキナーゼ（ＰＴＫ）と、非受容体型ＰＴＫの両方を非特異的に阻害するものである。また、ＡＧ１４７８は、代表的な受容体型ＰＴＫである上皮成長因子（ＥＧＦ）のレセプターを特異的に阻害するものであり、ＰＰ２は、代表的な非受容体型ＰＴＫであるＳｒｃファミリーを特異的に阻害するものである。
具体的には、常法により培養されたＩＥＣ−６細胞の培養液を、ＦＣＳ等の増殖因子を含有しない培養液（対照培養液）にペプチドＰ１を含有させた培養液、又はペプチドＰ１と各種阻害剤を含有させた培養液に交換して、さらに２４時間培養した。なお、ペプチドＰ１は１００μｇ／ｍＬになるように、Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎは１０μＭになるように、ＡＧ１４７８は２μＭになるように、ＰＰ２は１０μＭになるように、それぞれ培養液に添加した。その後、各培養液を用いて培養した場合の細胞増殖量を、実施例１と同様にして測定した。ポジティブコントロールとして５％ＦＣＳ含有培養液を、ネガティブコントロールとして対照培養液を、それぞれ用いた。
この結果、ペプチドＰ１及びＧｅｎｉｓｔｅｉｎを含有させた培養液と、ペプチドＰ１及びＰＰ２を含有させた培養液では、ペプチドＰ１のみを含有させた培養液よりも細胞増殖量が少なく、ペプチドＰ１による増殖促進活性は、ＧｅｎｉｓｔｅｉｎやＰＰ２によって阻害されることが分かった。特にＰＰ２を添加した場合には、ペプチドＰ１による増殖促進効果が完全に打ち消されていた。これらの結果から、ペプチドＰ１の増殖促進活性は、Ｓｒｃファミリーを経て種々の下流経路に伝達されることにより発揮される可能性が示唆された。
一方で、ペプチドＰ１及びＡＧ１４７８を含有させた培養液の細胞増殖量は、ペプチドＰ１のみを含有させた培養液と同程度であり、ペプチドＰ１による増殖促進活性は、ＡＧ１４７８によって阻害されないことが分かった。
一方で、ペプチドＰ１及びＡＧ１４７８を含有させた培養液の細胞増殖量は、ペプチドＰ１のみを含有させた培養液と同程度であり、ペプチドＰ１による増殖促進活性は、ＡＧ１４７８によって阻害されないことが分かった。
［実施例５］
ペプチドＰ１の上皮細胞増殖促進活性とＳｒｃファミリーの下流経路との関係を、各種シグナル伝達阻害剤を用いて検討した。
Ｓｒｃファミリーの下流には、ＭＡＰＫ ｃａｓｃａｄｅ、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路、及びＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路が存在すると報告されている。そこで、ＭＡＰＫ ｃａｓｃａｄｅのＭＥＫを阻害するＰＤ９８０５９、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路のＰＩ３Ｋを阻害するＷｏｒｔｍａｎｎｉｎ、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路のＪＡＫを阻害するＡＧ４９０を培養液に添加し、ペプチドＰ１による増殖促進効果に対する影響を観察した。
具体的には、ＰＤ９８０５９は４７μＭになるように、Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎは１０μＭになるように、ＡＧ４９０は５μＭになるように、それぞれ培養液に添加した以外は、実施例４と同様にしてＩＥＣ−６細胞の培養を行い、各培養液を用いて培養した場合の細胞増殖量を測定した。
この結果、３種類全ての阻害剤を添加した場合において、ペプチドＰ１による増殖促進活性は阻害された。これらの結果から、ＭＡＰＫ ｃａｓｃａｄｅ、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路、及びＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路は、いずれもペプチドＰ１の細胞増殖促進活性に関与している可能性が示唆された。
ペプチドＰ１の上皮細胞増殖促進活性とＳｒｃファミリーの下流経路との関係を、各種シグナル伝達阻害剤を用いて検討した。
Ｓｒｃファミリーの下流には、ＭＡＰＫ ｃａｓｃａｄｅ、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路、及びＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路が存在すると報告されている。そこで、ＭＡＰＫ ｃａｓｃａｄｅのＭＥＫを阻害するＰＤ９８０５９、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路のＰＩ３Ｋを阻害するＷｏｒｔｍａｎｎｉｎ、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路のＪＡＫを阻害するＡＧ４９０を培養液に添加し、ペプチドＰ１による増殖促進効果に対する影響を観察した。
具体的には、ＰＤ９８０５９は４７μＭになるように、Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎは１０μＭになるように、ＡＧ４９０は５μＭになるように、それぞれ培養液に添加した以外は、実施例４と同様にしてＩＥＣ−６細胞の培養を行い、各培養液を用いて培養した場合の細胞増殖量を測定した。
この結果、３種類全ての阻害剤を添加した場合において、ペプチドＰ１による増殖促進活性は阻害された。これらの結果から、ＭＡＰＫ ｃａｓｃａｄｅ、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路、及びＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路は、いずれもペプチドＰ１の細胞増殖促進活性に関与している可能性が示唆された。
［実施例６］
ＭＡＰＫ ｃａｓｃａｄｅには、細胞増殖に関わる経路として、ＭＥＫ１／２−ＥＲＫ１／２経路とＭＥＫ５−ＥＲＫ５経路が報告されている（例えば、Nishimoto, et al.: EMBO reports (2006), vol.7, p782-786）。そこで、ＥＲＫ１／２を特異的に阻害するＦＲ１８０２０４を用いて、ペプチドＰ１の上皮細胞増殖促進活性とＭＥＫ１／２−ＥＲＫ１／２経路との関係を検討した。
具体的には、ＦＲ１８０２０４を１０μＭになるように培養液に添加した以外は、実施例４と同様にしてＩＥＣ−６細胞の培養を行い、各培養液を用いて培養した場合の細胞増殖量を測定した。
この結果、ペプチドＰ１及びＦＲ１８０２０４を含有させた培養液の細胞増殖量は、ペプチドＰ１のみを含有させた培養液と同程度であり、ペプチドＰ１による増殖促進活性は、ＡＧ１４７８によって阻害されないことが分かった。これらの結果から、ＭＡＰＫ ｃａｓｃａｄｅのうち、ＭＥＫ５−ＥＲＫ５経路が、ペプチドＰ１の細胞増殖促進活性に関与している可能性が示唆された。
ＭＡＰＫ ｃａｓｃａｄｅには、細胞増殖に関わる経路として、ＭＥＫ１／２−ＥＲＫ１／２経路とＭＥＫ５−ＥＲＫ５経路が報告されている（例えば、Nishimoto, et al.: EMBO reports (2006), vol.7, p782-786）。そこで、ＥＲＫ１／２を特異的に阻害するＦＲ１８０２０４を用いて、ペプチドＰ１の上皮細胞増殖促進活性とＭＥＫ１／２−ＥＲＫ１／２経路との関係を検討した。
具体的には、ＦＲ１８０２０４を１０μＭになるように培養液に添加した以外は、実施例４と同様にしてＩＥＣ−６細胞の培養を行い、各培養液を用いて培養した場合の細胞増殖量を測定した。
この結果、ペプチドＰ１及びＦＲ１８０２０４を含有させた培養液の細胞増殖量は、ペプチドＰ１のみを含有させた培養液と同程度であり、ペプチドＰ１による増殖促進活性は、ＡＧ１４７８によって阻害されないことが分かった。これらの結果から、ＭＡＰＫ ｃａｓｃａｄｅのうち、ＭＥＫ５−ＥＲＫ５経路が、ペプチドＰ１の細胞増殖促進活性に関与している可能性が示唆された。
本発明の上皮細胞の増殖促進方法及び上皮細胞の増殖促進剤は、上皮細胞の損傷からの回復を促進し得ることから、腸管感染症や潰瘍性大腸炎等の腸管上皮細胞の損傷を伴う疾患の治療や予防のための医薬や機能性食品等の有効成分として利用が可能である。さらに、上皮細胞の増殖メカニズムの解明等の学術分野でも利用が可能である。
Claims (3)
- 配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分とすることを特徴とする、上皮細胞の増殖促進剤。
- 腸管感染症及び潰瘍性大腸炎からなる群より選択される１種以上の疾患の治療又は予防のために用いられることを特徴とする、請求項１に記載の上皮細胞の増殖促進剤。
- 請求項１又は２に記載の上皮細胞の増殖促進剤を、上皮細胞に接触させること（但し、ヒトに接触させることを除く。）を特徴とする、上皮細胞の増殖促進方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010240973A JP5791066B2 (ja) | 2010-10-27 | 2010-10-27 | 上皮細胞の増殖促進方法、及び上皮細胞の増殖促進剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010240973A JP5791066B2 (ja) | 2010-10-27 | 2010-10-27 | 上皮細胞の増殖促進方法、及び上皮細胞の増殖促進剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2012092046A JP2012092046A (ja) | 2012-05-17 |
| JP5791066B2 true JP5791066B2 (ja) | 2015-10-07 |
Family
ID=46385849
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2010240973A Active JP5791066B2 (ja) | 2010-10-27 | 2010-10-27 | 上皮細胞の増殖促進方法、及び上皮細胞の増殖促進剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP5791066B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2016052302A (ja) * | 2014-09-03 | 2016-04-14 | 株式会社秋田屋本店 | キモトリプシン様プロテアーゼ |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000166572A (ja) * | 1998-09-30 | 2000-06-20 | Eisai Co Ltd | 神経伝導抑制作用を有するペプチド |
| JP2000300275A (ja) * | 1999-04-26 | 2000-10-31 | Sumitomo Pharmaceut Co Ltd | 新規タンパク質ｈｓｇｌ及びその遺伝子 |
| JP2002355070A (ja) * | 2000-12-25 | 2002-12-10 | Mitsubishi Chemicals Corp | タウ−チューブリンキナーゼをコードするｄｎａ及びその利用 |
| WO2008099928A1 (ja) * | 2007-02-16 | 2008-08-21 | Jin-Pyo Lee | 蛋白質分解酵素活性を調節する作用を有する胎盤蛋白質及びその関連遺伝子 |
| JP5154964B2 (ja) * | 2007-02-23 | 2013-02-27 | 株式会社秋田屋本店 | ローヤルゼリー分解酵素含有物 |
-
2010
- 2010-10-27 JP JP2010240973A patent/JP5791066B2/ja active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2012092046A (ja) | 2012-05-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7759310B2 (en) | Mineral collagen chelates and methods of making and using same | |
| JP6075656B2 (ja) | コラーゲンペプチド組成物の製造方法 | |
| CN106243216B (zh) | Dpp-4抑制剂 | |
| Kumar et al. | In vitro anti-cancer, anti-diabetic, anti-inflammation and wound healing properties of collagen peptides derived from unicorn leatherjacket (Aluterus monoceros) at different hydrolysis | |
| JP6259209B2 (ja) | コラーゲン産生促進剤 | |
| JP2015042688A (ja) | 血管改善剤 | |
| WO2013129220A1 (ja) | ペプチドを含む医薬または食品 | |
| KR20070121639A (ko) | 계란유래의 뼈 강화 조성물 | |
| JP3802721B2 (ja) | 生体コラーゲン合成促進剤 | |
| CN106661087A (zh) | 用于改善哺乳动物血糖控制的肽及其组合物 | |
| CN104480176B (zh) | 鲢鱼dpp-iv抑制多肽及其应用 | |
| JP5791066B2 (ja) | 上皮細胞の増殖促進方法、及び上皮細胞の増殖促進剤 | |
| JP2011225495A (ja) | 血管内皮細胞保護剤ならびにこれを含む医薬組成物、食品および飼料 | |
| Kim et al. | Marine fisheries by-products as potential nutraceuticals: an overview | |
| JP2006056904A (ja) | 生体コラーゲン合成促進剤 | |
| KR20130006170A (ko) | ＣＨＰ(ｃｙｃｌｏ(Ｈｉｓ-Ｐｒｏ))를 고농도로 함유한 대두 가수분해물을 포함하는 혈당 조절용 조성물 | |
| RU2713935C1 (ru) | Пептиды морского происхождения и нуклеотиды рыб, композиции и их применение для снижения уровня глюкозы в крови | |
| JP2001514230A (ja) | ロビニア・シュードアカシア・レクチンとその使用 | |
| KR20080105073A (ko) | 동맥경화 예방제, 혈관 내막의 비후 억제제 및 혈관 내피 기능 개선제 | |
| CN104524544B (zh) | 一种多肽在治疗糖尿病中的应用 | |
| KR101491902B1 (ko) | 콜라게나제의 활성 저해 효과를 갖는 신규 펩타이드 및 그의 용도 | |
| US9365633B2 (en) | Peptide preparations and peptides with antitumour activity | |
| KR101322478B1 (ko) | Ｍｍｐ 활성 억제 효과를 갖는 전복 내장 위장관 소화가수분해물 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학 조성물 | |
| JP2001026753A (ja) | 高血圧症予防又は治療用組成物 | |
| KR20120021590A (ko) | 틸라피아 비늘의 효소적 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 고혈압의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20131024 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20131024 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20141219 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150216 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150414 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150604 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20150714 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20150729 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5791066 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313115 |
|
| R360 | Written notification for declining of transfer of rights |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313115 |
|
| R370 | Written measure of declining of transfer procedure |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R370 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |