KR20070121639A

KR20070121639A - 계란유래의 뼈 강화 조성물

Info

Publication number: KR20070121639A
Application number: KR1020077017967A
Authority: KR
Inventors: 야스유키 오오이; 지민영; 신스케 미나모토; 김무조; 김혜경; 임강현; 조상우
Original assignee: 가부시키 가이샤 파마푸즈; 임강현; 김혜경; 주식회사 두산
Priority date: 2005-01-11
Filing date: 2006-01-06
Publication date: 2007-12-27
Also published as: CN101188949B; JPWO2006075558A1; KR20060082015A; WO2006075558A1; JP5213332B2; CN101188949A; KR101156703B1

Abstract

본 발명의 뼈 강화 조성물은 난황 단백질 가수분해물로서, 겔여과 크로마토그래피에 의한 분자량 분포 분석에 있어서, 단백질ㆍ펩티드ㆍ아미노산의 합계에 의한 면적비에 대해, 분자량 500이상 20,000이하 부분의 면적비가 50%이상 차지하는 것을 유효성분으로 한다. 이 조성물은 조골세포의 증식촉진, 뼈 성장 및 뼈 강화작용을 가지는 것으로, 골다공증을 비롯한 각종 뼈 질환의 예방 및 치료에 유효하며고, 식품, 의약품 또는 사료에 폭넓게 이용하는 것이 가능하며, 일상적으로 지속적인 섭취가 가능한 안전 또는 저렴한 제품으로서 유용하다. 난황 단백질 가수분해물은 난황을 유기용매로 탈지한 후, 수득된 분말을 단백질 가수분해 효소로 가수분해한 것이 바람직하다.

Description

계란유래의 뼈 강화 조성물{EGG-DERIVED BONE-STRENGTHENING COMPOSITION}

본 발명은 뼈 성장 및 뼈 강화 작용을 나타내는 난황 단백질 가수분해 물질을 함유하는 조성물에 관한다. 또한 본 발명은 이 난황 단백질 가수분해 조성물을 배합한 식품, 의약품, 또는 사료에 관한다. 본 발명의 난황 단백질 가수분해 물질은 조골세포를 증식시키고, 뼈의 성장판에 있는 연골세포의 증식도 촉진 시키는 작용을 갖기 때문에 뼈 대사의 밸런스가 무너져서 생기는 뼈 질환의 예방과 치료, 그리고 어린이들과 젊은 층에 있어서의 성장기 뼈 강화에 유용하다.

최근 골다공증의 증가와 젊은층의 골절율의 증가 등 각종 뼈 질환이 사회 문제화 되고 있다. 골다공증 환자는 전국에 약 1000만 명 정도로 추정되고 있고 고령화가 진행됨에 따라 2010년에는 1600만 명에 이를 것이라는 예측도 있다. 골다공증은 주로 폐경 후의 여성에게 있어서 여성호르몬의 감소로 인해 뼈 형성과 뼈 흡수의 밸런스가 무너짐으로 인해 일어난다고 주목되어 왔으나, 남성에 있어서도 고령화에 따른 뼈의 염량의 감소가 보여졌다. 현재에도 50세 이상의 약 200만 명의 골다공증 환자가 있다. 또한 최근 20년 동안 초중고생의 골절율은 2배 이상 증가하였고 골다공증을 예방하기 위해서라도 성장기에 최대 골량을 더욱 높이는 것이 중요하다. 이처럼 지금은 뼈의 건강을 유지하기 위해서는 성별과 연령에 관계없이 사회 적으로 관심을 기울여야 한다.

종래의 뼈 질환을 예방 또는 치료하는 방법으로서 식이요법에 의한 칼슘보급, 가벼운 운동, 일광욕, 약 물치료 등이 이루어져 왔다. 식이요법에 의한 칼슘보급은 탄산칼슘, 인산칼슘 등의 칼슘염과 우골분, 난각, 어골분 등의 천연 칼슘제가 사용되어 왔으나 용해성이나 흡수성 그리고 정미성의 점에 있어서 반드시 경구섭취에 적합한 소재라고는 말할 수 는 없다. 적당한 운동은 골량을 증가시켜 뼈를 강화시키기 때문에 산보나 워킹은 뼈 건강에 도움이 되지만, 몸이 약한 사람의 경우는 가벼운 운동도 무리가 갈수 있고 또 누워서 병치레를 하는 노인의 경우는 거의 운동이 불가능하다. 일광욕은 활성비타민 D3를 보급해 준다는 점에서는 도움이 되지만, 이것만으로는 불충분하다. 약물투여는 비스포스포네이트와 칼시토닌 제제 등이 사용되고 있으며, 골다공증의 치료에도 효과가 있다고 알려져 있다. 그러나 이들 물질은 의약품 그 자체이며 복용에 있어서도 특별한 주의가 필요하다. 이명(귀울림), 두통, 식욕부진 등 부작용의 위험성도 있어, 계속적인 식품소재로서의 사용은 불가능하다.

그래서, 천연소재를 사용한 뼈 강화제로서 비타민류를 보강한 계란(특허문헌 1)과 아연을 강화한 굴 엑기스(특허문헌 2)를 사용한 것, 우유 유래의 염기성 단백질을 사용한 것(특허문헌 3, 4) 등이 개발되어 있다.

(특허문헌 1)　일본공개특허 H10-56978호 공보

(특허문헌 2)　일본공개특허 2002-80380호 공보

(특허문헌 3)　일본특허 제2974604호 공보

(특허문헌 4)　일본특허 제3112637호 공보

본 발명에는 일상적으로 계속해서 섭취 가능한 뼈 강화제로서 뼈 강화작용이 있고, 안전, 저렴하여 음식품 등에 폭넓게 사용이 가능한 신규한 식품소재를 제공하는 것을 과제로 한다.

계란은 37℃에서 3주간 따뜻하게 하면 병아리가 되는 현상이 나타나는 것처럼 생명체를 만드는 모든 재료를 포함하며 다음 세대를 이어가는 바이오 캡슐이며, 또 아직 발견되지 않은 생리활성도 많은 것으로 여겨진다. 계란은 고대부터 내려온 식경험이 있는 식품으로, 그 자체의 영양가치도 높고 안전하여 식품소재로서의 이용가치는 매우 높다.

그래서, 본 발명자들은 계란의 여러 가지 분획에 대해서 중에서 뼈 성장, 뼈 강화를 촉진하는 성분을 탐색한 결과, 난황 단백질 가수분해물에 조골세포 증식 및 석회화 촉진활성이 있는 것을 최초로 발견하였고, 또 이 성분을 경구섭취하는 것에 의해 뼈 성장을 촉진, 뼈 대사를 개선시킬 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 뼈 강화 조성물은 난황 단백질 가수분해물로서, 겔여과 크로마토그래피에 의한 분자량 분포 분석에 있어서, 단백질ㆍ펩티드ㆍ아미노산의 합계에 의한 면적비에 대해서, 분자량 500 이상 20,000 이하 부분의 면적비가 50% 이상 차지하는 것을 유효성분으로 하여 이루어지는 것을 특징으로 한다.

또, 단 본발명에 사용하는 난황 단백질 가수분해물은 탈지처리한 난황을 단백질 분해효소로 가수분해 한 것이 바람직하다.

난황의 탈지처리는 난황에 식품가공에 사용하는 유기용매 (예를 들어 에탄올, 이소프로파놀, 헥산등) 중 적어도 1종을 작용시켜서 수행하는 것이 바람직하다. 또 난황단백질가수분해 효소로서는 펩신, 트립신, 레닌, 레닌을 포함한 치즈용도의 렌넷, 카르복시펩티다아제A, 바실러스속 세균유래의 프로테아제 및 아스퍼질러스속 곰팡이균 유래의 프로테아제 등 어느 하나, 또는 그 조합을 사용하는 것이 바람직하다.

이러한 본 발명의 뼈 강화 조성물은 천연물을 사용한 안전한 것이므로 일상적으로 섭취 가능한 뼈 강화소재, 음식품, 의약품 또는 사료로서 폭넓은 사용이 가능하다.

본 발명에 사용하는 난황 단백질 가수분해물은 겔여과 크로마토그래피에 의한 분자량 분포 분석에 있어서 단백질ㆍ펩티드ㆍ아미노산의 합계에 의한 면적비에 대해서, 분자량 500 이상 20,000 이하 부분의 면적비가 50% 이상 차지하는 것이라면 좋지만, 면적비가 55%를 차지하는 것이 있으면 더욱 좋고, 65% 이상을 차지하는 것이 특히 좋다. 이 같은 난황 단백질 가수분해물은, 1) 조골세포증식 촉진(뼈를 만들어내는 세포의 증식을 촉진), 2)조골세포의 분화 촉진(뼈를 만들어내는 세포의 기능을 높여 콜라겐 생성 촉진, 석회화 촉진), 3)파골세포의 분화 증식 억제 (뼈를 녹여서 대사시키는 세포의 기능과 증식을 억제), 4)뼈 성장촉진이라는 효과를 가지는 것으로, 연골세포의 증식을 촉진시켜 뼈의 성장을 촉진시키는 활성도 가지고 있다.

이러한 난황 단백질 가수분해물을 주성분으로 하는 뼈 강화 조성물은 경구 섭취가 가능하기 때문에, 치즈, 버터, 발효유 등의 유제품, 음료유, 드링크 요구르트, 커피음료, 과즙 등의 음료, 제리, 푸딩, 쿠키, 비스켓, 웨하스 등의 과자, 냉동식품 등의 각종 형태의 음식품에 첨가하여 뼈 강화 작용을 가지는 음식품으로 할 수 있다. 더욱이 캅셀, 정제 등의 형태로된 서플리먼트로도 가능하여 골다공증의 예방, 증상 개선을 목적으로 한 음식품, 의약품 또는 사료의 소재로서 유용하다.

도 1은 실시예 １에서 얻은 난황 단백질 가수분해물의 겔여과 크로마토그래피에서의 분자량 분석 결과를 나타낸 도이며, 사선부는 분자량 500 이상 20,000 이하의 부분을 나타낸다.

도 2는 실시예 １의 난황 단백질 가수분해물과 Ｂ에서 얻은 난황 수용성 분획의 SDS 폴리아크릴아미드 전기영동에서의 분석결과를 나타낸 도이며, Ｍ레인은 도 왼편에 표시된 분자량 마커, １레인은 난황 단백질 가수분해, ２레인은 Ｂ에서 얻은 난황 수용성 분획의 전기영동 결과이다.

도 3은 래트의 실시예 １의 난황 단백질 가수분해물을 경구투여한 경우와 투여하지 않은 경우에 있어서의 경골 골단의 성장을 비교한 도이다.

도 4는 실시예 ２에서 얻은 난황 단백질 가수분해물의 겔여과 크로마토그래피에서의 분자량 분석 결과를 나타낸 도이며, 사선부는 분자량 500 이상 20,000 이하의 부분을 나타낸다.

도 5는 실시예 ２에서 얻은 난황 단백질 가수분해물을 사용해서 뼈 성장 촉 진효과를 측정한 결과를 나타낸 도이다.

도 6은 실시예 ２에서 얻은 난황 단백질 가수분해물을 사용하여 석회화 촉진 효과를 측정한 결과를 나타낸 도이다.

도 7은 다른 효소를 사용하여 얻은 난황 단백질 가수분해물을 사용하여 조골세포의 증식촉진 활성을 측정한 결과를 나타낸 도이다.

본 발명에 사용되는 난황은 닭, 오리, 메추리등의 난의 난황으로부터 얻어질 수 있으나 생산성 측면에서 계란의 난황이 바람직이게 사용된다. 또 계란을 사용하는 경우에는 난황액, 난황분말, 또는 탈지 난황분말을 사용하는 것이 가능하며, 그 중에서도 난황분말 또는 탈지 난황분말이 바람직하게 사용된다.

본 발명의 뼈 강화 조성물은 난황분말로부터 식품가공에 있어서 사용되는 유기용매를 사용하여, 탈지하여 얻어진 분말을 단백질 가수분해 효소로 가수분해하여 얻을 수 있다. 탈지에 사용되는 유기 용매로서는 에탄올, 이소프로파놀, 헥산 등 식품가공에 일반적으로 사용되는 유기용매가 사용 가능하지만, 간편성이나 안전성 측면에서 에탄올이 바람직하게 사용된다.

또, 난황으로부터 난황유, 난황레시틴을 제조할때 부산물로서 생기는 탈지 난황을 가수분해의 원료로 사용하는 것도 가능하다.

본 발명에 사용되는 상기의 단백질 가수분해 효소로서는 프로테아제활성 또는 카르복시펩티다아제 활성을 가진 식품제조에 사용가능한 펩신(EC.3.4.23.1), 트립신(EC.3.4.21.4), 레닌(EC.3.4.23.15), 레닌을 포함한 치즈 용도의 렌넷, 카르복 시 펩티다아제 A(EC.3.4.17.1), 바실러스속 세균 유래의 프로테아제 (상품명 「알카라아제」노보자임사 제조, 상품명「오리엔타아제 22BF」에이치비아이주식회사 제조, 상품명「누크레이신」에이치비아이주식회사 제조, 상품명 프로테아제 S『아마노』G」아마노엔자임 주식회사제품, 상품명「서모아제PC10」 다이와카세이주식회사 제품 등), 아스퍼질러스속 곰팡이균 유래의 프로테아제(상품명「오리엔타제 ONS」 에이치비아이주식회사 제조상품명「오리엔타제 20A」에이치비아이주식회사 제조, 상품명「프로테아제P『아마노』3G」아마노엔자임 주식회사제품, 상품명 「플레버자임」노보자임사 제품 등)등 어느 하나 또는 그것들의 조합을 하여 사용할 수 있다. 본 발명에 있어서는 상기 효소 중에서도 바실러스속 유래의 프로테아제 및/또는 펩신등이 바람직하다.

단백질 가수분해 효소의 농도는 사용하는 효소에 따라서 적절히 변하지만 효소와 탈지난황의 질량비가 1:20부터 1:1000이 바람직하다. 또 효소 반응온도와 반응시간도 효소에 따라 다르지만 25∼75℃에서 1∼24시간 가수분해를 수행하는 것이 바람직하다. 반응시간은 너무 길거나 너무 짧으면 수득되는 가수분해물에 대해서 조골세포의 증식촉진, 뼈 성장 및 뼈 강화작용을 만족하게 얻을 수 없다.

상기한 바와 같이 하여 수득된 난황 단백질 가수분해물은 적당한 탈염과정을 거쳐, 본 발명의 뼈 강화 조성물로서 사용이 가능하다. 또한 한외 여과막, 겔여과나 각종 크로마토그래피, 멤브레인 필터, 등전점을 이용한 방법 등으로 정제 및 분획하여 사용해도 좋다.

상기한 바와 같이 하여 수득된 난황 단백질 가수분해물은 겔여과 크로마토그 래피에 의한 분자량 분포 분석에 있어서, 단백질ㆍ펩티드ㆍ아미노산의 합계에 의한 면적비에 대해서 분자량 500 이상 20,000 이하 부분의 면적비가 50% 이상 차지하는 것이 중요하고, 상기 면적비가 55%를 차지하는 것이 더 바람직하고, 5% 이상을 차지하는 것이 특히 바람직하다. 분자량 분포가 상기의 범위 외에 있으면 효과의 저하나, 소실이 발생하거나, 가열에 의한 변성과 응집 등이 일어나기 쉽다. 단, 분포가 상기의 범위를 만족시키는 경우에는 미분해의 난황단백질이 10∼20 질량% 잔존해 있어도 괜찮다.

본 발명의 뼈 강화 조성물에 있어서의 난황 단백질 가수분해물은 조골세포의 증식 촉진 활성이 난황 단백질 가수분해물 무첨가의 대조에 대해서 1.2배 이상 높이는 것이 바람직하며, 추가로, 65℃∼90℃에서 3∼6분간 열처리를 해도 조골세포의 증식 촉진 활성이 상기 대조에 대해서 1.2배 이상 유지하고 있는 것이 바람직하다.

상기의 조골세포 증식촉진 활성의 측정에는 마우스 조골세포인 MC3T3-T1 세포나 인간 유래의 조골세포성 세포인 U2OS 세포를 사용한 정법으로 수행할 수 있었다.

본 발명의 뼈 강화 조성물에 있어서 난황 단백질 가수분해물의 함유량은 특별히 한정되어 있지는 않으나 난황 단백질 가수분해물을 0.05∼50 질량% 함유하는 것이 바람직하고, 0.1∼25 질량% 포함하는 것이 더 바람직하다.

난황 단백질 가수분해물의 함유량이 0.05 질량% 미만이 되면 본 뼈 강화 조성물을 식품에 고농도로 첨가할 수밖에 없기 때문에 바람직하지 않고, 50 질량% 이 상이 되면 용해성에 영향을 미치기 때문에 바람직하지 않다.

본 발명의 뼈 강화 조성물은 골다공증과 각종 뼈 질환의 예방 또는 개선에 적용되며, 그 유효 섭취량은 성인 1일 기준, 난황 단백질 가수분해물 환산으로 50 mg에서 5g이다.

단, 본 발명의 뼈 강화 조성물은 래트에 의한 급성독성은 인정되지 않았다.

이렇게 하여 조제된 뼈 강화 조성물은 통상 분말화하여 사용된다. 분말화는 동결건조 또는 분무건조를 수행하여도 좋고, 통상적으로 음시품에 경구적으로 투여된다.

본 발명의 뼈 강화 조성물은 상기 기술한 성분 외에도 부형제, 유화제, 안정제, 감미료, pH 조정제, 증점제, 단백질, 펩타이드, 아미노산, 지질, 다당류, 올리고당 등의 통상 식품에 사용되는 성분을 포함할 수 있다.

본 발명의 뼈 강화 조성물은 음식품에 첨가하는 것 이외에도 투여형태에 따라 여러가지 형태로 제조되며, 분말(또는 과립), 드링크제, 정제, 캅셀제 등으로 사용하는 것도 가능하다. 또 계란은 아주 오래전부터 식경험이 있는 안전한 소재이기 때문에 지속적으로 섭취하여도 부작용의 문제가 없는 소재로서 의약품 또는 사료 등에 이용하는 것도 가능하다.

실시예

이하, 실시예를 들어서 본 발명을 보다 자세하게 설명을 한다. 그러나 본 발명은 이들 실시예의 실험에 한정되는 것은 아니다.

A. 탈지난황의 조제

난황분말 1㎏에 에탄올 5ℓ를 첨가하여 블렌더로 30분간 교반한 후, 고형물을 회수하였다. 이 조작을 3회 반복하여 난황으로부터 탈지를 수행하고, 풍건하여 568g의 탈지 난황을 얻었다.

B. 난황의 수용성 획분의 조제

A에서 얻는 탈지 난황 284g에 37℃의 온수 3ℓ를 첨가하고, 온도를 유지하면서 스틸러로 잘 교반한 후, 8,000 rpm, 30분간 원심분리를 수행한 후에 상층액을 얻었다. 그리고 동결건조로 분말화하여 13.4g의 난황 수용성 획분을 얻었다.

실시예 1 (난황 단백질 가수분해물의 제조)

A에서 얻은 탈지 난황분말 300g에 물 3ℓ를 첨가하고, 염산으로 pH3.5으로 맞추었다. 그 후 펩신(시그마 알드리치사제조) 3g을 첨가하고, 37℃에서 3시간 효소 반응을 수행하였다. 그 후 수산화 나트륨으로 pH 7로 중화시켜 효소를 실활시킨 후, 여과 보조제(셀라이트) 30g을 첨가한 후, 여과기(부후나 로토)로 여과, 여과액을 동결건조시켜 난황 단백질 가수분해물 44.8g을 얻었다.

실시예 1에서 수득된 난황 단백질 가수분해물은 이하 조건의 겔크로마토그래피로 분자량의 분석을 하였다.

칼럼：Diol 60(6.0×300㎜) (상품명, 와이엠씨사제품)　

용출액：0.2M인산칼륨 완충액, 0.2M NaCl(pH6.9)/아세트니트릴(70：30)　

유속：0.7㎖/분　

검출파장：280nm

그 결과를 도 1에 나타낸다. 도 1에서, 실시예 1의 난황 단백질 가수분해물은 단백질ㆍ펩타이드ㆍ아미노산의 합계를 나타낸 전체 면적에 대해서 분자량 500 이상 20,000 이하의 부분의 면적비(사선부)가 약 57%를 차지하는 것이 판명되었다.

다음으로 실시예 1의 난황 단백질 가수분해물과 B에서 얻은 난황 수용성 획분을 이용해서 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동을 통상적 방법에 의해 수행하였다. 결과를 도 2에 나타낸다. 도 2에서 판명된 것처럼 난황 수용성 획분보다도 작은 20,000 이하의 분자량을 나타내는 밴드는 많이 나타났다.

시험 1 (조골세포 증식촉진 활성의 측정)

실시예 1에서 얻은 난황 단백질 가수분해물의 조골세포 증식촉진 활성을 아래와 같이 측정하였다. 즉 마우스 조골세포 MC3T3－E1 세포를 10% FBS를 포함하는 α-MEM 배양액을 사용하여, 37℃, 5% CO₂-95%air의 조건하에서 콘플르엔트될때 까지 배양한 후, 트립신처리에 의해 세포를 회수하였다. 회수된 세포를 상기의 α-MEM배양액에 현탁하고, 세포 현탁액(1×10⁴개/㎖)을 조제하였다. 이 세포 현탁액을 24웰 플레이트에 0.5㎖씩 파종하고, 37℃, 5% CO₂-95%air의 조건하에서 배양하였다. 다음날 난황 단백질 가수분해물을 50(v/v)% DMSO에 용해시켜 난황 단백질 가수분해물이 100, 25, 12.5 ㎍/㎖가 되도록 세포에 첨가 (DMSO는 배양액의 1(v/v)%가 되도록 첨가), 또 석회화 촉진제인 α-글리세로인산염(2 mmol/ℓ)을 첨가하였다. 배양액은 1일마다 교환하며, 20일후에 MTT(3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5- diphenyltetrazolium Bromide)를 사용하여 통상적 방법에 따라 조골세포의 수를 측정하였다(MTT법).

난황 단백질 가수분해물(100 ㎍/㎖)의 ㎖조골세포 증식촉진 활성은 대조의 증식수를 100으로 하였을 때의 상대값을 나타내면 150±11이었다. 한편 상기 Ｂ에서 수득된 난황 수용성 획분의 조골세포 증식촉신 활성은 동일한 상태값으로 나타내면, 128±18이었다.

또, 실시예 1에서 수득된 난황 단백질 가수분해물을 80℃에서 5분간 열처리를 수행하고, 동일하게 조골세포의 증식촉진 활성을 측정하면, 대조의 증식수를 100으로 하였을 때의 상대값이 130±10이었다. 한편 상기 Ｂ에서 수득된 난황 수용성 획분으로 동일한 열처리를 수행한 경우, 조골세포의 증직촉진 활성은 동일한 상대값으로 나타내면 105±11이었다. 즉, 난황 단백질 가수분해물은 열처리에 대해서 약간 활성이 감소하고 있지만, 충분하게 조골세포의 증식촉진 활성을 유지하여 열 안정성을 나타내고 있음을 알 수 있다.

시험 2 (뼈 성장 촉진효과)

실시예 1에서 얻은 난황 단백질 가수분해물의 뼈 성장 촉진효과를 Sprague-Dawley계 래트를 사용하여 평가하였다. 구체적으로는 형광물질인 테트라사이클린을 투여하고, 테트라사이클린이 칼슘을 킬레이트하여 뼈에 침착되는 현상을 이용하여, 뼈에 형성되는 형광밴드를 관찰하는 것으로서 경골의 성장을 측정하였다.

즉, 시험기간 (1주일)중, 20 mg/㎖의 농도로 정제수에 용해된 시료를 래트에 위 존데를 이용하여 경구투여(100 mg/㎏체중/1일)하였다. 그리고, 시험기간 중 3일 째와 5일째에 테트라사이클린을 주사로 투여하였다. 또 시험기간 중에 있어서의 래트의 음료수와 사료(상품명「MF」, 오리엔탈효모사제품)은 자유 급식하였다.

7일째에 경골을 적출하여 테트라사이클린의 투여에 의해 경뼈 성장판 하부 (뼈 신생부)에 형성된 각 형광밴드의 간격(테트라사이클린을 투여한 3일째로에서 5일째까지 2일간에 걸친 경골 골단의 신장)을 형광 현미경하에 관찰하여 측정하였다.

난황 단백질 가수분해물을 투여하지 않은 경우(대조)의 뼈 신장률을 100%로 하여 난황 단백질 가수분해물을 투여한 경우의 뼈 신장률을 구한 결과를 도 3에 나타낸다. 도 3에서, 대조와 비교하여 난황 단백질 가수분해물을 투여한 경우 2개의 형광밴드의 간격이 31% 넓어져서 뼈 성장 촉진효과가 있음을 확인하였다.

실시예 2 (난황 단백질 가수분해물의 제조)

A와 동일한 방법으로 얻은 탈지 난황분말 500㎏에 물 2.5톤 및 노보자임사의 알카라아제(상품명, Bacillus licheniformis유래의 프로테아제)25㎏을 가하고, pH 7, 55℃에서 3시간 효소반응을 수행한 후, 80℃에서 15분간 열처리하여 효소를 실활시키고, 원심력 3000g으로 20분간, 원심분리하여 불용물을 제거하고, 여과 후, 여과액을 분무건조 하여 약 140㎏의 난황 단백질 가수분해물을 얻었다.

실시예 2에서 얻은 난황 단백질 가수분해물의 분자량분석을 실시예 1과 같은 방법으로 실시하였다. 그 결과를 도 4에 나타낸다. 도 4에서 수득된 난황 단백질 가수분해물은 단백질ㆍ펩타이드ㆍ아미노산의 합계를 나타낸 전체 면적에 대해서, 분자량 500 이상 20,000 이하의 부분의 면적비(사선부)가 약 85%를 차지하는 것이 판명되었다.

다음으로, 실시예 2의 난황 단백질 가수분해물에 대해서 아래와 같은 실험을 실시하였다. 각 시험에 있어서 컨트롤은 난황 단백질 가수분해물을 사용하지 않은 경우를 나타낸다.

시험 1(뼈 성장 촉진효과)

실시예 2에서 얻은 난황 단백질 가수분해물의 뼈 성장 촉진효과를 실시예 1의 시험2와 같은 방법으로 조사하였다. 즉, Sprague-Dawley계 래트에 정제수에 녹인 시료(농도20 mg/㎖)를 위 존데를 이용 경구투여 (매일, 체중 1㎏당 10mg, 20mg또는 50mg을 투여)하였다. 그리고 시험기간중 3일째와 5일째에 형광물질인 테트라사이클린 (10mg/㎏)을 주사로 투여하고, 7일째에 경골을 적출하여 형광 현미경 하에서 관찰되는 2개의 형광밴드의 간격(테트라사이클린을 투여한 3일째에서 5일째까지 2일간에 걸친 경골 골단의 신장)을 측정하였다. 그 결과를 도 5에 나타낸다. 도 5에서, 투여량 의존적으로 뼈 성장 촉진효과가 얻어지는 것을 확인하였다.

시험 2(석회화 촉진효과)

3.5cm 배양접시에 6×10⁵개의 MC3T3-E1 세포를 파종(α-MEM배지, 10%FCS, 2mmol/ℓ글리세로인산)하고, 실시예 2에서 얻은 난황 단백질 가수 분해물을 100㎍/m의 농도로 첨가하고, 2일마다 배지 교환을 하여 4주간 배양을 계속한 후, 세포를 PBS(인산완충용액)으로 세정하고, 5(v/v)%의 과염소산을 첨가 후 초음파 처리하여 세포에 침착되어 있는 칼슘을 용출시키고, 용출된 칼슘양을 「칼슘E테스트 와코」(상품명, 화광순약공업주식회사 제품)을 사용하여 석회화 활성을 측정하였다. 이 결과를 도 6에 나타낸다. 도6에서, 난황 단백질 가수분해물을 첨가하는 것에 의해 석회화 활성의 유의차가 (p<0.001)상승한 것임을 확인하였다.

시험 3(파골세포의 분화 및 증식억제 효과)

마우스의 골수로부터 골수세포를 분리하여 파골세포에로의 분화와 증식을 측정하였다. 우선 마우수의 대퇴골의 골수세포를 분화 유도 인자인 RANKL (receptor activator of NF-κB Ligand：NF-κB활성화 수용체 리간드) 함유의 α-MEM배지에서 3일간 배양하고, 샘플 처리후, 다시 4일간 배양하였다. 그 후 세포를 고정액으로 고정 후, TRAP염색키트(상품명 「387-A　Acid Phosphatase, Leukocyte」 시그마 알드리치 재팬사 제품)을 사용하여 TRAP염색을 수행하였다. 적색으로 염색된 파골세포의 수를 현미경으로 관찰하였다. 실시예 2의 난황 단백질 가수분해물을 50㎍/㎖ 첨가, 100 ㎍/㎖첨가 및 200 ㎍/㎖ 첨가로 배양 한 것과 무첨가로 배양한 것에 대해서 파골세포의 발생빈도를 측정한 것의 결과를 다음 표에 나타낸다.

난황 단백질 가수분해물　　　 파골세포(적색 염색된 세포)

첨가량(㎍/㎖)　　　　　　　 발생빈도(%)

0　　　　　　　　　　　　　22.5

50　　　　　　　　　　　　　 16

100 2.5

200　　　　　　　　　　　　　 0

상기의 표로부터 파골세포의 발생빈도가 난황 단백질 가수분해물의 농도 의존적으로 억제되고 있음을 확인하였다.

실시예 3( 난황 단백질 가수분해물 )

A에서 얻은 탈지난황분말 300g에 물 3ℓ를 가하고, 표1에 나타낸 효소조건으로 효소반응을 수행한 후, 비등 수욕상 80℃에 도달 후, 10분간 열처리하여 효소를 실활 시킨 후, 여과 보조제 (셀라이트)를 30g가하고, 여과기 (부후나 로토)로 여과하여 얻어진 여과액을 동결건조시켜 7종의 난황 단백질 가수분해물을 얻었다.

시험 1(조골세포 증식촉진 활성)

마우스 조골세포인 MC3T3-E1 세포를, 10% FBS를 포함하는α-MEM 배양액을 사용하여, 37℃, 5% CO₂-95%air의 조건하에서 콘플르엔트될때 까지 배양한 후, 트립신처리에 의해 세포를 회수하였다. 회수된 세포를 상기의 α-MEM 배양액에 현탁하여 세포 현탁액(2×10⁴개/㎖)을 조제하였다. 이 세포 현탁액을 96웰 플레이트에 0.1㎖씩 파종하고, 또 석회화 촉진제인 α-글리세로인산염 (2 mmol/ℓ)을 첨가하고, 37℃, 5% CO_２-95%air의 조건하에서 배양하였다. 24시간 후에 실시예 3에서 얻은 시료를 50(v/v)% DMSO에 용해시켜 시료가 100 ㎍/㎖이 되도록 세포에 첨가하였다(DMSO는 배양액의 1(v/v)%가 되도록 첨가). 그리고 배양 24시간 후에 실시예1과 동일한 방법으로 하여, MTT법에 의해 세포 증식 활성을 측정하였다.

각 난황 단백질 가수분해물(100 ㎍/㎖)의 조골세포 증식촉진 활성을, 컨트롤(난황 단백질 가수분해물 미첨가)의 증식수를 100으로 하였을 때의 상대값으로 나타낸 결과를 도 7에 나타낸다. 도 7에서, 바실러스속 유래의 프로테아제, 펩신, 아스퍼질러스속 곰팡이균 유래의 프로테아제를 사용하여 가수분해하여 수득된 난황 단백질 가수분해물은 높은 조골세포 증식 활성을 갖는 것임을 확인하였다(바실러스속 유래의 프로테아제 및 펩신을 사용하여 가수분해 해서 얻은 난황 단백질 가수분해물에 대해서 컨트롤에 대해 유의차 (p<0.005)있음).

이하의 실시예에 대해서 특별히 언급이 없는 한 「%」는 「질량%」를 나타낸다.

실시예 4 (청량음료수)

실시예 1에서 얻은 난황 단백질 가수분해물을 함유하는 청량음료수를 조제하였다. 즉, 조성이 혼합 이성화당 15.0%, 과즙 10%, 난황 단백질 가수분해물 2.0%, 향료 0.1%, 칼슘 0.1%, 물 72.8%인 원료를 혼합하고, 플레이트 살균기를 사용하여 90℃, 15초간 살균하여 뼈 강화작용이 있는 청량 음료수를 제조하였다.

실시예 5 (요구르트)

실시예 1에서 얻은 난황 단백질 가수분해물을 함유하는 요구르트를 조제하였다. 즉, 조성이 난황 단백질 가수분해물 3.0%, 슈크로오스 7%, 향료 0.1%, 요구르트 89.9%인 원료를 혼합하여 용기에 충진하고, 뼈 강화작용이 있는 요구르트를 제조하였다.

실시예 6 (치즈)

실시예 1에서 얻은 난황 단백질 가수분해물을 함유하는 치즈를 조제하였다. 즉, 고다 치즈 35%, 체다 치즈 35%, 파르메잔 치즈 20%, 난황 단백질 가수분해물 2.0%, 인산칼슘 1.0%, 물 7.0%을 포함하도록 각 원료를 혼합한 후, 유화온도 85℃에서 유화시켜 골강 화작용이 있는 프로세스 치즈를 제조하였다.

실시예 7 (캅셀제)

실시예 1에서 얻은 난황 단백질 가수분해물 60%, 콘스타치 30%, 유당 10%를 함유하는 각 원료를 배합하여, 젤라틴 캅셀에 충진(캅셀 1개당 200mg)시켜 뼈 강화 작용이 있는 캄셀을 제조하였다.

실시예 8 (정제)

실시예 1에서 얻은 난황 단백질 가수분해물 60%, 환원 맥아당 18%, 결정 셀룰로스 18%, 자당에스테르 4%를 함유하도록 각 원료를 배합한 후, 타정(1정당 300mg)하여 뼈 강화작용이 있는 정제를 제조하였다.

본 발명의 뼈 강화 조성물 및 그것을 함유하는 음식품은 안전하고, 저렴한 난황과 난황유를 제조할때 나오는 부산물인 탈지난황을 원료로 하고, 조골세포 증식 촉진, 뼈 성장 및 뼈 강화작용을 갖기 때문에 골다공증의 예방과 뼈의 성장 촉진 및 뼈의 강화를 위한 건강식품으로서 이용하는 것이 가능하다.

Claims

난황 단백질 가수분해물로서, 겔여과 크로마토그래피에 의한 분자량 분포 분석에 있어서, 단백질ㆍ펩티드ㆍ아미노산의 합계에 의한 면적비에 대해, 분자량 500 이상 20,000 이하 부분의 면적비가 50% 이상 차지하는 것을 유효성분으로 하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 뼈 강화 조성물.
제 1 항에 있어서, 난황 단백질 가수분해물이 난황을 식품가공할 때 사용되는 유기용매의 적어도 1종에 의해 탈지처리한 후, 단백질 가수분해 효소로 가수분해 한 것임을 특징으로 하는 뼈 강화 조성물
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 단백질 가수분해 효소가 펩신, 트립신, 레닌, 레닌을 포함하는 치즈 용도의 렌넷, 카르복시 펩티다아제A, 바실러스속 세균 유래의 프로테아제 및 아스퍼질러스속 곰팡이균 유래의 프로테아제로 이루어지는 그룹에서 선택되는 적어도 1종인 것을 특징으로 하는 뼈 강화 조성물.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 기재된 뼈 강화 조성물을 배합한 음식품, 의약 또는 사료.