CN109219443A - 成骨不全症等的预防和/或治疗药剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种成骨不全症、骨质疏松症和/或变形性关节症的预防和/或治疗药剂，其含有由(a)Val‑Asn‑Pro‑Glu‑Ser‑Glu‑Glu‑Glu(序列号1)或(b)Val‑Asn‑Pro‑Glu(序列号2)所表示的氨基酸序列组成的肽。本发明的药剂可经口摄取，且具有骨生成功能，具有骨折的预防和/或治愈促进效果，因此在成骨不全症、骨质疏松症和/或变形性关节症的预防和/或治疗上极其有用。

Description

成骨不全症等的预防和/或治疗药剂
技术领域
本发明涉及一种成骨不全症等的预防和/或治疗药剂。更详细而言，涉及一种成骨不全症、骨质疏松症和/或变形性关节症的预防和/或治疗药剂。
背景技术
成骨不全症是一种由于作为骨主要成分的胶原质的先天性异常而表现出骨脆弱性的疾病，其主要症状为易骨折性及进行性骨变形等。发生频率在大约2万人中有1人，被认定为疑难病。成骨不全症患者在婴儿期至幼儿期中，由于频繁的长管状骨骨折、持续性脊椎压迫骨折等多发骨折或高度的骨变形而导致无法行走等、在成人后有时也需要轮椅或看护(非专利文献1)。在日本，在内科治疗中功效及效果得到认可的唯一治疗药为具有骨吸收抑制作用的双膦酸盐制剂，其通过周期性静脉给药的骨折预防的效果得到了认可。已知该效果基于抑制破骨细胞的活动，抑制骨吸收。然而，由于在骨折治愈的修复期中，双膦酸盐制剂抑制在骨折治愈中起到重要作用的破骨细胞的活动，因此，在已经骨折时，该破骨细胞的功能的下降有可能使骨折的治愈延迟，因此受到禁用。此外，作为副作用，还存在引起低钙血症或呼吸困难等问题。因此，在成骨不全症的治疗中，希望开发一种效力与安全性优异的新型骨生成促进剂。
并且，实际上，对于成骨不全症，基于观察骨折治愈过程的报告可知，与不使用双膦酸盐制剂时相比，使用双膦酸盐制剂时骨折线的消失更耗费时间(非专利文献2)。此外，有报告称已知骨中发生细小的骨折，旧骨中积累细小的骨折，由于双膦酸盐制剂的给药而引发大理石状骨病，反而会增加骨折(非专利文献3)。进一步，虽已知双膦酸盐制剂不影响成长，但由于骨通过骨的更新而在保持其形状的同时变大，因此，若因双膦酸盐制剂而长期持续骨更新停止的状态，则存在引起骨的生成异常的可能(非专利文献4)。因此，对于成骨不全症的治疗药，希望一种不抑制破骨细胞的活动、通过新的作用机理促进骨生成、不仅只预防骨折还促进骨折治愈的新型骨生成促进剂。此外，大多成骨不全症患者为婴儿至幼儿的患者，因此，不对其成长带来异常、并为易摄取形态的可经口给药形态也是新型骨生成促进剂的理想的必要条件。
其中，在骨格的形成中，除了头盖骨与锁骨之外，几乎所有的骨都经过软骨内骨化的过程而形成。即，各骨作为软骨而形成。存在于该软骨骨干部中心的软骨细胞肥大化，陷入凋亡。此时通过从血管入侵的成骨细胞及破骨细胞置换为骨组织，从而形成骨(非专利文献5)。
同样地，在骨折治愈的修复过程中，也在修复期先进行基于膜性骨化的纤维性骨痂的形成，在骨折部附近以填充间隙的方式，由间充质干细胞分化的软骨细胞形成软骨。然后，软骨肥大化，受到血管入侵而钙化。然后，钙化软骨被破骨细胞吸收，被置换为由成骨细胞形成的骨组织(软骨内骨化)。骨折后，软骨均被置换为骨组织，经过纤维性骨痂置换为板层骨，直至骨愈合(非专利文献6)。如此，在骨生成及骨折治愈中的任一个过程中，间充质干细胞分化的软骨细胞、成骨细胞、破骨细胞等各种细胞群的作用也逐渐变得明确。
另一方面，已知特定的肽具有成骨前体细胞增殖促进活性(专利文献1)。然而，对于该肽对伴随成骨不全症等骨疾病的骨生成及骨折治愈带来的影响，不明确的点较多。此外，现在虽然存在针对骨质疏松症及变形性关节症的药剂，但并不能够令人满足。因此，本发明如以下详细描述，提供一种针对成骨不全症、骨质疏松症及变形性关节症的预防和/或治疗药剂。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2015/129726号
非专利文献
非专利文献1：骨形成不全症の診療ガイドライン(成骨不全症的诊疗指导方针)(日本幼儿内分泌学会药事委员会)日本幼儿科学会杂志2006；110:1467-1471.
非专利文献2：田中弘之(清野佳纪监修：改订版《骨の病気と付き合うには(与骨疾病打交道)》，Medical Review Co.,Ltd.:198-199,2010)
非专利文献3：Mashiba T,Hirano T,Turner CH,et al.:Suppressed boneturnover by bisphosphonates increases microdamage accumulation and reducessome biomechanical properties in dog rib(双膦酸盐抑制骨转换增加犬肋骨微损伤累积并降低某些生物力学性能).J Bone Miner Res 15:613-620,2000
非专利文献4：Whyte MP,Wenkert D,Clements KL,et al.:Bisphosphonate-induced osteopetrosis(双膦酸盐诱导的石骨症).N Engl J Med 349:457-463,2003
非专利文献5：妻木范行，《骨〃軟骨の再生(骨及软骨的再生)》，实验医学，Vol.32,No.7(增刊),177-184
非专利文献6：中岛新等，《骨折骨癒合研究の進歩(骨折骨愈合研究的进步)》，千叶医学，86:83-91,2010
发明内容
本发明要解决的技术问题
本发明的技术问题在于提供一种新型且优异的成骨不全症、骨质疏松症和/或变形性关节症的预防和/或治疗药剂。
解决技术问题的技术手段
本申请发明人进行了深入研究，结果明确了由序列号1或2所表示的氨基酸序列组成的肽同时具有软骨前体细胞增殖促进作用、成骨前体细胞增殖促进作用、以及IGF-1(胰岛素样生长因子)产生促进作用。此外明确了：与这些作用有关，在成长期大鼠中，由序列号1所表示的氨基酸序列组成的肽的经口给药依赖用量而促进骨生成，并促进肥大软骨层及成长软骨的增加。还明确了：在次级松质骨(secondary cancellous bone)中，促进成骨前体细胞增殖、钙化、骨量增加。并且还明确了：由序列号1所表示的氨基酸序列组成的肽的经口给药促进长轴骨的成长。在由序列号2所表示的氨基酸序列组成的肽中同样确认到了这些作用。
此外，本申请发明人还明确了以下情况。即，经口给药的由序列号1所表示的氨基酸序列组成的肽在胃液中难以被消化，在肠液中被代谢，变成由序列号2所表示的氨基酸序列组成的肽，由序列号2所表示的氨基酸序列组成的肽由肠管粘膜吸收。此外，经口给药的由序列号2所表示的氨基酸序列组成的肽在胃及肠中不会继续分解，由肠管粘膜吸收至体内。被吸收至体内的由序列号2所表示的氨基酸序列组成的肽，促进由间充质干细胞分化的软骨细胞的增殖，经过软骨内骨化，促进成骨细胞的增殖，由此促进骨生成及骨折治愈。此外，由序列号2所表示的氨基酸序列组成的肽通过经口给药在肝脏中促进IGF-1的产生，所产生的IGF-1不仅与由序列号2所表示的氨基酸序列组成的肽一起促进骨生成或骨折治愈，还促进骨的成长。因此，发现由序列号1或2所表示的氨基酸序列组成的肽的经口给药不像已有的双膦酸盐制剂那样抑制破骨细胞的活动，而是通过新的作用机理，作为有用的不仅预防成骨不全症中的骨折，还促进骨折治愈的新型药剂。特别是，本发明作为世界首例“同时具有骨折治愈促进作用及长轴骨成长作用的针对成骨不全症的经口制剂”，能够有效地对成骨不全症的治疗做出贡献。
如此，在所述专利文献1中，具体公开了作为优选形态的具有特定序列的五肽、七肽、八肽、十五肽，但本发明的由序列号1或2所表示的氨基酸序列组成的肽不仅对成骨不全症、还对骨折的治愈促进起到预料之外的显著效果，其中，由序列号2所表示的氨基酸序列组成的肽不仅未在所述专利文献1中被具体公开，还因结构简单而能够高效合成，并且起到吸收性也优异的这一优异效果。此外，由序列号2所表示的氨基酸序列组成的肽与由序列号1所表示的氨基酸序列组成的肽相比，每单位质量的效果高，还能够简便地进行给药尺寸的缩小化。
即，本发明包含以下的各发明。
[1]一种成骨不全症的预防和/或治疗药剂，其含有由(a)Val-Asn-Pro-Glu-Ser-Glu-Glu-Glu(序列号1)或(b)Val-Asn-Pro-Glu(序列号2)所表示的氨基酸序列组成的肽。
[2]一种骨质疏松症的预防和/或治疗药剂，其含有由(a)Val-Asn-Pro-Glu-Ser-Glu-Glu-Glu(序列号1)或(b)Val-Asn-Pro-Glu(序列号2)所表示的氨基酸序列组成的肽。
[3]一种变形性关节症的预防和/或治疗药剂，其含有由(a)Val-Asn-Pro-Glu-Ser-Glu-Glu-Glu(序列号1)或(b)Val-Asn-Pro-Glu(序列号2)所表示的氨基酸序列组成的肽。
[4]根据所述[1]～[3]中任一项所述的药剂，其为骨折的预防和/或治愈促进剂。
[5]根据所述[1]～[4]中任一项所述的药剂，其为经口给药用。
[6]一种成骨不全症、骨质疏松症和/或变形性关节症的预防和/或治疗用药品，其含有所述[1]～[5]中任一项所述的药剂。
[7]根据所述[1]～[6]中任一项所述的药剂，其特征在于，促进骨生成。
[8]一种所述[1]～[6]中任一项所述的药剂或药品与其他成骨不全症、骨质疏松症和/或变形性关节症的预防和/或治疗用药品的组合。
此外，本发明还包含以下形态。
[9]根据所述[1]～[3]中任一项所述的药剂，其将由(b)Val-Asn-Pro-Glu(序列号2)所表示的氨基酸序列组成的肽作为有效成分。
[10]根据所述[9]所述的药剂，其为骨折的预防和/或治愈促进用。
[11]一种成骨不全症、骨质疏松症和/或变形性关节症的预防和/或治疗用医药组合物，其特征在于，含有所述[1]～[3]所述的肽，同时或依次给药具有破骨细胞抑制作用的化合物或双膦酸盐制剂。
[12]一种患者用的医药组合物，其中，所述患者接受使用含有所述[1]～[3]中任一项所述的肽作为有效成分的、具有破骨细胞抑制作用的化合物或双膦酸盐制剂的治疗。
发明效果
根据本发明，能够提供一种新型的成骨不全症、骨质疏松症和/或变形性关节症的预防和/或治疗药剂。该药剂可经口摄取。该药剂具有骨生成功能。该药剂具有骨折的预防和/或治愈促进效果。该药剂在不抑制破骨细胞的活动、低钙血症等副作用少的方面等上特别优异。
附图说明
图1为表示合成肽(No.1)的分析结果的图表。
图2为表示合成肽(No.2)的分析结果的图表。
图3为表示测定合成肽(No.1)的成骨前体细胞增殖活性的结果的图。
图4为表示测定合成肽(No.2)的成骨前体细胞增殖活性的结果的图。
图5为表示测定合成肽(No.1)的软骨前体细胞增殖活性的结果的图。
图6为表示测定合成肽(No.2)的软骨前体细胞增殖活性的结果的图。
图7为表示实施例3的实验方案的图。
图8为表示测定合成肽(No.1)给药组的、每日的成长软骨伸长速度(长轴方向)的结果的图。
图9为表示测定合成肽(No.1)给药组的、大鼠的成长软骨中肥大软骨层的面积的结果的图。
图10为表示测定合成肽(No.1)给药组的、大鼠血清中胰岛素样生长因子(IGF-1)浓度的结果的图。
图11为表示实施例4的实验方案的图。
图12为表示使用荧光显微镜确认合成肽(No.1)给药组的大鼠初级海面骨的形成的结果的图。
图13为表示实施例5的实验方案的图。
图14为表示测定合成肽(No.1)给药组的、每日的成长软骨伸长速度(长轴方向)的结果的图。
图15为表示测定合成肽(No.1)给药组的、大鼠的次级松质骨中的骨量的结果的图。
图16为表示测定合成肽(No.1)给药组的、成骨细胞所局部存在的骨面相对于总骨面的面积比的结果的图。
图17为表示测定合成肽(No.1)给药组的、破骨细胞所局部存在的骨面相对于总骨面的面积比的结果的图。
图18为表示计算合成肽(No.1)给药组的、每日的大鼠次级松质骨钙化速度的结果的图。
图19为表示测定合成肽(No.1)给药组的、大鼠次级松质骨的骨量的结果的图。
图20为表示测定合成肽(No.1)给药组的、成骨细胞所局部存在的骨面相对于总骨面的面积比的结果的图。
图21为表示测定合成肽(No.1)给药组的、大鼠骨组织每单位面积的成骨细胞数的结果的图。
图22为表示测定合成肽(No.1)给药组的、破骨细胞所局部存在的骨面相对于总骨面的面积比的结果的图。
图23为表示测定合成肽(No.1)给药组的、大鼠骨组织每单位面积的破骨细胞数的结果的图。
图24为表示测定合成肽(No.1)给药组的、大鼠体重的经时变化的结果的图。
图25为表示实施例8的实验方案的图。
图26为表示经时测定合成肽(No.1)单次给药组的、大鼠血清中胰岛素样生长因子(IGF-1)浓度的结果的图。
图27为表示经时测定合成肽(No.2)单次给药组的、大鼠血清中胰岛素样生长因子(IGF-1)浓度的结果的图。
图28为表示测定合成肽(No.1)单次给药组的、大鼠血清中胰岛素样生长因子(IGF-1)浓度的结果的图。
图29为表示测定合成肽(No.1)单次给药组的、大鼠肝脏中胰岛素样生长因子(IGF-1)浓度的结果的图。
图30为表示测定合成肽(No.2)单次给药组的、大鼠血清中胰岛素样生长因子(IGF-1)浓度的结果的图。
图31为表示测定合成肽(No.2)单次给药组的、大鼠肝脏中胰岛素样生长因子(IGF-1)浓度的结果的图。
图32为表示测定合成肽(No.2)、合成肽(No.2)反向序列或合成肽(No.2)组成氨基酸单次给药组的、大鼠血清中胰岛素样生长因子(IGF-1)浓度的结果的图。
图33为表示测定合成肽(No.2)、合成肽(No.2)反向序列或合成肽(No.2)组成氨基酸单次给药组的、大鼠肝脏中胰岛素样生长因子(IGF-1)浓度的结果的图。
图34为表示经时测定合成肽(No.1)单次给药组的大鼠血浆甲状旁腺激素浓度(PTH)的结果的图。
图35为表示使用了合成肽(No.1)的人工胃液(0.2％NaCl、0.32％胃蛋白酶、2.4％稀盐酸、pH调节至3.0)进行消化试验的结果的图。
图36为表示使用了合成肽(No.1)的人工肠液(0.34％KH2PO4、0.36％Na2HPO4、1％胰酶、pH调节至6.8)进行消化试验的结果的图。
图37为表示测定使用荧光色素(Cy3)进行了标记的合成肽(No.1)单次给药组在小鼠活体内的吸收的结果的图。
具体实施方式
[肽]
本发明提供一种成骨不全症、骨质疏松症和/或变形性关节症的预防和/或治疗药剂，其含有由(a)Val-Asn-Pro-Glu-Ser-Glu-Glu-Glu(序列号1)或(b)Val-Asn-Pro-Glu(序列号2)所表示的氨基酸序列组成的肽作为有效成分。
本发明的肽为由(a)Val-Asn-Pro-Glu-Ser-Glu-Glu-Glu(序列号1)或(b)Val-Asn-Pro-Glu(序列号2)所表示的氨基酸序列组成的肽，包含其衍生物或其在药理学上允许的盐。在本说明书中，有时将由序列号1、2所表示的氨基酸序列组成的肽分别简称为合成肽(No.1)、合成肽(No.2)。
本发明的肽的衍生物中，特定的氨基酸序列所表示的肽的C末端可以为羧基(-COOH)、羧酸根(-COO-)、酰胺(-CONH2)或酯(-COOR)中的任一种。作为酯中的R，可列举出例如甲基、乙基、正丙基、异丙基或正丁基等C1-6链烷基；例如环戊基、环己基等C3-8环烷基；例如苯基、α-萘基等C6-12芳基；例如苄基、苯乙基等苯基-C1-2链烷基或α-萘基甲基等α-萘基-C1-2链烷基等C7-14芳烷基；除此之外还可列举出作为经口用酯而被广泛使用的新戊酰氧基甲基等。作为酰胺体，可列举出酰胺；被1个或2个C1-6链烷基取代的酰胺；被苯基取代的1个或2个C1-6链烷基取代的酰胺；2个取代基与它们所键合的氮原子一起、形成包含酰胺基的氮原子在内的吗啉基、哌啶基等五元环至七元环的氮杂环烷烃的酰胺等。
本发明的肽的衍生物中还包含：N末端的氨基被保护基团(例如，甲酰基、乙酰基等C2-6烷酰基等C1-6酰基等)保护的肽的衍生物；N末端侧在活体内被切断而生成的谷氨酰基被焦谷氨酸化的肽的衍生物；分子内的氨基酸的侧链上的取代基(例如、-OH、-SH、氨基、咪唑基、吲哚基、胍基等)被适当的保护基团(例如，甲酰基、乙酰基等C2-6烷酰基等C1-6酰基等)保护的肽的衍生物。
本发明中构成肽的衍生物的氨基酸的侧链可被任意的取代基修饰。取代基没有特别限定，例如可列举出氟原子、氯原子、氰基、羟基、硝基、链烷基、环烷基、烷氧基、氨基、磷酸根等。此外，侧链的取代基可被保护基团保护。在该技术领域中，取代基、保护基团等在以往已被充分确立，因此在本发明中可基于这些基团。
本发明中的肽可形成盐，作为该盐，优选生理学上允许的盐。作为生理学上允许的盐，例如可列举出与盐酸、硫酸、磷酸、乳酸、酒石酸、马来酸、富马酸、草酸、苹果酸、柠檬酸、油酸、棕榈酸等酸的盐；与钠、钾、钙等碱金属或碱土类金属的、或与铝的氢氧化物或碳酸盐的盐；与三乙胺、苄胺、二乙醇胺、叔丁胺、二环己胺、精氨酸等的盐等。
本发明的肽只要保持原来的肽的特性，则可含有D-氨基酸，也可含有非天然氨基酸。此外，本发明的肽或其衍生物只要保持原来的肽的特性，则可在肽上连接其他物质。作为可与肽连接的其他物质，例如可列举出其他肽、脂质、糖或糖链、乙酰基、天然或合成的聚合物等。此外，本发明的肽只要保持原来的肽的特性，则也可对肽进行糖链加成、侧链氧化、磷酸化等修饰。本发明的肽的丝氨酸也可被磷酸化。
即，本发明包含为序列号1及2的衍生物(或修饰体)的、表现出序列号1或2的生理活性(后文所述的骨生成作用或骨折治愈促进作用)的化合物。
本发明的肽可按照公知的一般的肽合成的方案，通过固相合成法(Fmoc法、Boc法)或液相合成法而容易地进行制备。此外，可使用导入了表达载体的转化子而进行制备，该表达载体含有编码本发明的肽、其衍生物或其盐的DNA。此外，可使用导入了表达载体的转化子而取得肽，并使用适当的蛋白酶或肽酶切断该肽从而进行制备，该表达载体含有编码一部分包含本发明的肽、其衍生物或其盐的肽的DNA。此外，可通过使用in vitro(胞外)转录及翻译类的方法进行制备。在以往已知有很多用于保持肽的生理活性的衍生物或修饰体，因此本发明也可基于这些物质。
此外，本发明的肽可由鸡蛋黄蛋白质的水解物提纯而取得。蛋黄蛋白质的水解物的制备方法、肽的提纯方法没有特别限定，可适当选用公知的方法。具体而言，例如可列举出：制备脱脂蛋黄粉末，使用蛋白酶等酶制备水解物，使用超滤、HPLC(高效液相色谱法)等各种色谱法对目标肽进行提纯的方法等。
[成骨不全症、骨质疏松症和/或变形性关节症的预防和/或治疗用途]
本发明的肽发挥成骨不全症、骨质疏松症和/或变形性关节症的预防和/或治疗效果。在本发明中，成骨不全症、骨质疏松症及变形性关节症的预防和/或治疗效果通过共通的机理而发挥作用。
成骨不全症、骨质疏松症和/或变形性关节症的预防和/或治疗效果可将有无骨生成作用及骨折治愈促进作用作为指标来进行确认。具体而言，例如，可将长轴骨的成长促进、肥大软骨层的面积、成长软骨等的增加、次级松质骨的钙化、骨量的增加、成骨前体细胞增殖促进、软骨前体细胞增殖促进、IGF-1产生促进等作为指标来进行确认(参照实施例)。在此，成长软骨是指例如位于骨骺的骨的伸长部位。次级松质骨是指例如成熟了的松质骨。本发明的肽特别是在同时具有长轴骨成长促进作用及骨折治愈促进作用的方面上优异。
应关注本发明的肽在不抑制破骨细胞的活动的方面、低钙血症等副作用少的方面上是优异的这一点。
确认到本发明的肽通过对哺乳动物的经口给药而发挥目标效果，因此含有这些肽的药剂可作为经口给药用的药剂而适宜地实施。此外，本发明的肽的安全性高，稳定地进行作用，可长期摄取或使用。
[药品]
本发明包含含有本发明的肽的药品。本发明的肽可用作成骨不全症、骨质疏松症和/或变形性关节症的预防和/或治疗用药品的有效成分。
本发明的药品以本发明的肽作为有效成分，可按照作为医药制剂制备法的公知方法(例如、日本药局方中记载的方法等)，适当掺合药学上允许的载体或添加剂而进行制剂化。具体而言，例如可列举出片剂(包括糖衣片、薄膜衣片、舌下片、口腔崩解片、含片等)、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂(包括软胶囊剂、微胶囊剂)、片剂、糖浆剂、液剂、乳剂、混悬剂、释放控制制剂(例如速放性制剂、缓释性制剂、缓释性微胶囊剂)、气雾剂、薄膜剂(例如口腔内崩解薄膜、口腔黏膜贴附薄膜)、注射剂(例如皮下注射剂、静脉内注射剂、肌肉内注射剂、腹腔内注射剂)、点滴剂、经皮肤吸收型制剂、软膏剂、洗剂、贴附剂、栓剂(例、肛门栓剂、阴道栓剂)、颗粒(pellet)、经鼻剂、经肺剂(吸入剂)、滴眼剂等经口剂或非经口剂。对于载体或添加剂的掺合比例，只要基于医药领域中通常采用的范围而适当设定即可。可掺合的载体或添加剂没有特别限制，例如可列举出水、生理盐水、其他水性溶剂、水性或油性基剂等各种载体、赋形剂、结合剂、pH调节剂、崩解剂、吸收促进剂、润滑剂、着色剂、矫味剂、香料等各种添加剂。
作为片剂、胶囊剂等中可含有的添加剂，例如可使用如明胶、玉米淀粉、黄蓍胶、阿拉伯树胶这样的结合剂；如结晶纤维素这样的赋形剂；如玉米淀粉、明胶、海藻酸等这样的膨化剂；如硬脂酸镁这样的润滑剂；如蔗糖、乳糖或糖精的甜味剂；如薄荷、白珠树油(akamono oil)或樱桃这样的香味剂等。当单位剂型(formulation unit form)为胶囊时，上述类型的材料可进一步含有如油脂这样的液状载体。用于注射的无菌组合物可按照通常的制剂业务(例如，使有效成分溶解或悬浮在注射用水、天然植物油等溶剂中等)进行制备。作为注射用的水性液，例如可使用含有生理盐水、含有葡萄糖及其他辅助药(例如、D-山梨醇、D-甘露醇、氯化钠等)的等渗液等，也可同时使用适当的溶解辅助剂，例如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子性表面活性剂(例如聚山梨酯80(注册商标)、HCO-50)等。作为油性液，例如可使用芝麻油、大豆油等，也可同时使用作为溶解辅助剂的苯甲酸苄酯、苄醇等。此外，也可与缓冲剂(例如磷酸盐缓冲液、乙酸钠缓冲液)、止痛剂(例如苯扎氯铵、盐酸普鲁卡因等)、稳定剂(例如人血清白蛋白、聚乙二醇等)、防腐剂(例如苄醇、苯酚等)、抗氧化剂等进行掺合。
通过上述方式得到的制剂安全且低毒性，因此可对例如人或其他哺乳动物(例如大鼠、小鼠、兔、羊、猪、牛、猫、狗、猴等)进行给药。给药对象可以是婴儿，也可以是幼儿，还可以是成人。
本发明的药品因剂型、给药方法、载体等而有所不同，相对于制剂总量，通常以0.01～100％(w/w)添加本发明的肽，优选以0.1～95％(w/w)的比例添加，由此可按照常规方法而制备。
给药量因给药对象、症状、给药途径等而存在差异，在经口给药时，通常对于体重约60kg的人而言，每日约0.01～1000mg，优选约0.1～500mg，更优选约0.5～100mg，进一步优选约5～80mg。每日的总给药量可以是单次给药量，也可以是分次给药量。
本发明的药品通过与其他药品组合使用，确认到相加或协同作用的提高。作为其他药品，例如可列举出成骨不全症药、骨质疏松症药、变形性关节症药。
作为其他药品，例如可列举出钙药、钙吸收促进药、人型抗RANKL单克隆抗体、女性激素制剂、选择性雌激素受体调节剂(SERM)、降钙素制剂、双膦酸盐制剂、人甲状旁腺激素(PTH)、PTHrP衍生物、维生素K2制剂、抗Siglec-15抗体、抗TNFα抗体、IL-1受体激动剂、抗IL-6受体、抗骨硬化蛋白抗体、组织蛋白酶K抑制剂、重组人类成纤维细胞生长因子(rhFGF-2)等。具体而言，作为钙药，例如可列举出乳酸钙、葡糖酸钙(商品名：CALCICOL注册商标)、L-天冬氨酸钙水合物(商品名：Aspara CA)等，并不特别限定。作为钙吸收促进药，例如可列举出α-骨化醇(商品名：Alfarol、Onealfa)、骨化三醇(商品名：Rocaltrol)、氟骨三醇(商品名：Fulstan)、艾地骨化醇(商品名：EDIROL)等，并不特别限定。作为人型抗RANKL单克隆抗体，例如可列举出地诺单抗(商品名：Pralia)，并不特别限定。作为女性激素制剂，例如可列举出雌三醇(商品名：HOLIN、ESTRIEL)、结合型雌激素(Premarin)、雌二醇(商品名：Estrana)等，并不特别限定。作为选择性雌激素受体调节剂(SERM)，例如可列举出雷洛昔芬盐酸盐(商品名：Evista)、巴多昔芬乙酸盐(商品名：Viviant)等，并不特别限定。作为降钙素制剂，例如可列举出依降钙素(商品名：Elcitonin)、鲑降钙素(商品名：CALCITORAN)等，并不特别限定。作为双膦酸盐制剂，例如可列举出依替膦酸二钠(商品名：Didronel)、阿仑膦酸钠(商品名：Bonalon、FOSAMAC)、利塞膦酸钠(商品名：BENET、Actonel)、米诺膦酸(商品名：Recalbon、Bonoteo)、伊班膦酸钠水合物(商品名：Bonviva注册商标)、伊班膦酸钠(商品名：Bonviva片)等，并不特别限定。作为人甲状旁腺激素(PTH)，例如可列举出特立帕肽(商品名：Teribone、Forteo)，并不特别限定。作为PTHrP衍生物，例如可列举出abaloparatide(阿巴帕肽)，并不特别限定。作为维生素K2制剂，例如可列举出四烯甲萘醌(商品名：K2、Glakay)，并不特别限定。作为抗骨硬化蛋白抗体，例如可列举出Romosozumab(商品名称)，并不特别限定。作为组织蛋白酶K抑制剂，例如可列举出Odanacatib(商品名称)，并不特别限定。
作为其他药品，可列举出双膦酸盐制剂。作为双膦酸盐制剂，例如可列举出帕米膦酸二钠水合物(商品名：Aredia)，并不特别限定。
作为其他药品，例如可列举出非类固醇类消炎镇痛剂(NSAID)、原肌球蛋白相关激酶(Trk)A抑制剂、腺苷A3受体激动剂、糖皮质激素受体激动剂、透明质酸、成纤维细胞生长因子18抑制剂、抗GM-CSF(颗粒球〃巨噬细胞集落刺激因子)抗体、抗NGF(神经生长因子)抗体等。作为非类固醇类消炎镇痛剂(NSAID)，例如可列举出(S)-氟比洛芬，并不特别限定。作为腺苷A3受体激动剂，例如可列举出piclidenoson(和厚朴酚)，并不特别限定。作为糖皮质激素受体激动剂，例如可列举出曲安奈德，并不特别限定。作为透明质酸，例如可列举出提纯透明质酸钠(商品名：ARTZ、SUVENYL)等，并不特别限定。作为成纤维细胞生长因子18抑制剂，例如可列举出sprifermin，并不特别限定。作为抗NGF(神经生长因子)抗体，例如可列举出fulranumab，并不特别限定。
此外，作为其他药品，可列举出具有破骨细胞抑制作用的化合物或双膦酸盐制剂。即使与这些药品组合使用，本发明的药剂或药品也不对破骨细胞造成影响，因此在成骨不全症、骨质疏松症和/或变形性关节症的预防和/或治疗中，可适用于该症状中的骨生成的促进、骨折的治愈促进等。
作为(A)本发明的药剂或药品与(B)其他成骨不全症、骨质疏松症和/或变形性关节症的预防和/或治疗用药品的组合的实施形态，可同时使用(A)与(B)，也可预先混合(A)与(B)。
本发明中，在同时使用(A)与(B)时，使用(A)与(B)的时机并不特别限定，可进行(A)的前给药、同时给药或后给药，且可以对任意进行组合。其中，进行(A)的“前给药”是指对未进行(B)的给药的状态的对象在一定时间内进行(A)的给药。此外，进行(A)的“同时给药”是指在从进行(B)的给药开始时至给药停止时持续进行(A)的给药，或在进行(B)的给药开始时至给药停止时之间的一定时间内对对象进行(A)的给药。进行(A)的“后给药”是指在停止进行(B)的给药后，在一定时间内对对象进行(A)的给药。另外，(A)及(B)的给药时间并不特别限定，例如可以为1～30分钟左右，也可以为1～12小时左右。
在本发明的药品中，预先混合(A)与(B)时，混合比(A)/(B)并不特别限定，例如可以是1/(0.001～1000)，也可以是1/(0.01～100)，也可以是1/(0.1～10)，还可以是1/(0.5～2)。
本发明包含本发明的药剂或药品，本发明的药剂或药品的特征在于促进骨生成。在此，促进骨生成是指例如：增殖成骨细胞、增殖软骨细胞、促进骨成长、增加骨钙化速度等，还指它们的两种以上的组合等。本发明中，作为骨，具体而言，例如可列举出初级海面骨、次级松质骨、骨髓、骨骺、干骺端、骨干、预钙化层、成长板、肥大软骨层、成长软骨、长轴骨、大腿骨、膝盖骨、腓骨、胫骨、皮质骨等，但并不限于此。
本发明还包含以下的各发明。
(a)一种成骨不全症、骨质疏松症和/或变形性关节症的预防和/或治疗方法，其特征在于，以本发明的药剂或该肽(由序列号1或2所表示的氨基酸序列组成的肽。其中，包括上述的盐、酯、衍生物、修饰体。以下相同)的有效量对哺乳动物进行给药。
(b)一种本发明的药剂或该肽，其用于成骨不全症、骨质疏松症和/或变形性关节症的预防和/或治疗。
(c)本发明的药剂或该肽在成骨不全症、骨质疏松症和/或变形性关节症的预防和/或治疗中的使用。
(d)本发明的药剂或该肽在成骨不全症、骨质疏松症和/或变形性关节症的预防和/或治疗用药品制备中的使用。
(e)一种骨折的预防和/或治愈促进方法，其特征在于，以本发明的药剂或该肽的有效量对哺乳动物进行给药。
(f)一种本发明的药剂或该肽，其用于骨折的预防和/或治愈促进。
(g)本发明的药剂或该肽在骨折的预防和/或治愈促进中的使用。
(h)本发明的药剂或该肽在骨折的预防和/或治愈促进用药品制备中的使用
(i)一种饮食品、食品添加物、饲料、饲料添加物、化妆品，其含有本发明的药剂或该肽。
[饮食品]
本发明的饮食品适合作为成骨不全症、骨质疏松症和/或变形性关节症的预防用饮食品、骨折预防和/或治愈促进用饮食品等。
饮食品中，包括含有本发明的药剂或该肽的健康食品、功能性食品、特定保健用食品、患者用食品、补剂。饮食品的形态并不特别限定，例如能够以片剂、颗粒剂、散剂、饮剂等形态而进行提供。作为本发明的饮食品，例如可列举出茶饮料、清凉饮料、碳酸饮料、营养饮料、果实饮料、乳酸饮料等饮料；荞麦面、乌冬面、中华面、方便面等面类；糖、糖果、口香糖、巧克力、零食点心、饼干、果冻、果酱、奶油、烘制点心、面包等点心及面包类；鱼糕、火腿、香肠等水产及畜产加工食品；加工乳、发酵乳等乳制品；色拉油、天妇罗油、人造黄油、蛋黄酱、起酥油、生奶油、酱汁等油脂及油脂加工食品；沙司、调料汁等调味料；咖喱、炖菜、盖饭、粥、菜粥等蒸煮袋食品；冰淇林、冰糕、刨冰等冰制食品等。.
[食品添加物、饲料、饲料添加物]
本发明的食品添加物适合作为成骨不全症、骨质疏松症和/或变形性关节症的预防用食品添加物、骨折预防和/或治愈促进用食品添加物等。本发明的食品添加物的形态并不特别限定，例如可列举出液状、膏状、粉末状、薄片状、颗粒状等。本发明的食品添加物可根据通常的食品添加物的制备方法进行制备。
进一步，也可作为含有本发明的肽的饲料或饲料添加物来进行实施。
[化妆品]
本发明的化妆品适合作为成骨不全症、骨质疏松症和/或变形性关节症的预防用化妆品、骨折预防和/或治愈促进用化妆品。化妆品包括所谓的药用化妆品(医药部外品)。作为化妆品，例如可列举出清洗剂、洗发香波、护发素、生发液、洗发液、须后水、身体乳液、化妆水、洁面膏、按摩霜、润肤霜、气雾产品、消臭剂、芳香剂、除臭剂或入浴剂等。除了本发明的肽以外，本发明的化妆品可根据目的而适当掺合化妆品中通常使用的成分，例如表面活性剂、保湿剂、来自动植物的油脂、硅酮类、高级醇、低级醇、来自动植物的提取物、紫外线吸收剂、消炎剂、金属螯合剂、维生素类、抗氧化剂、增粘剂、防腐剂、杀菌剂、pH调节剂、着色剂、各种香料等。
实施例
以下，通过实施例对本发明进行详细说明，但本发明并不受这些实施例限定。
[制备例：合成肽No.1及No.2的制备]
使用肽自动合成装置Syro II(Biotage Japan Ltd.制造)对合成肽No.1及No.2进行化学合成。图1或图2的图表中所示的单一峰表示目标合成肽No.1或No.2。
[实施例1：使用了合成肽的成骨前体细胞增殖促进活性的研究]
使用含有10％FBS的α-MEM培养液，在37℃、5％CO2-95％空气下将小鼠成骨细胞样细胞株MC3T3-E1Subclone-4(ATCC No.CRL-2593)培养至近汇合(subconfluent)后，通过胰蛋白酶处理收集细胞。将收集的细胞悬浮于上述α-MEM培养液，制备细胞悬浮液(5×104个/mL)。在96孔板上以每孔100μL播种该细胞悬浮液，在37℃、5％CO2-95％空气下进行前培养。第二天，交换为溶解有样本的含有0.1％FBS的α-MEM培养液，进一步培养24小时。成骨前体细胞的增殖活性通过BrdU摄取量进行评价。样本的成骨前体细胞的增殖促进活性以将未添加样本的增殖值设为100时的相对值进行表示。
将结果示于图3及4。合成肽No.1及No.2均促进了成骨前体细胞的增殖。此外，与合成肽No.1相比，合成肽No.2为高活性，在低浓度时也能够充分确认到其效果。
[实施例2：使用了合成肽的软骨前体细胞增殖促进活性的研究]
使用含有5％FBS、3×10-8M sodium selenite(亚硒酸钠)、5μg/mL humantransferrin(人转铁蛋白)的DMEM/F-12培养液，在37℃、5％CO2-95％空气下将小鼠软骨前体细胞株ATDC5(RCB0565)培养至近汇合后，通过胰蛋白酶处理收集细胞。将收集的细胞悬浮于上述DMEM/F12培养液，制备细胞悬浮液(5×104个/mL)。在96孔板上以每孔100μL播种该细胞悬浮液，在37℃、5％CO2-95％空气下进行前培养。第二天，交换为溶解有样本的含有3×10-8M sodium selenite,5μg/mL human transferrin的DMEM/F-12培养液，进一步培养24小时。软骨前体细胞的增殖活性通过BrdU摄取量进行评价。样本的软骨前体细胞的增殖促进活性以将未添加样本的增殖值设为100时的相对值进行表示。
将结果示于图5及6。合成肽No.1及No.2肽均促进了软骨前体细胞的增殖。
[实施例3：基于合成肽的成长期大鼠的骨成长促进作用的研究]
分别使用胃管，对4周龄的Crlj:WI雄性大鼠进行1天1次共7天的强制经口给药，对其给药合成肽(No.1)或注射水(对照)(各组：n＝10)。合成肽的用量设为1、10、100mg/kg/day。此外，作为阳性对照，将人成长激素(hGH；Norditropin，日本标准商品分类号872412)设为500μg/kg/day，进行1天1次共7天的皮下给药。作为骨生成部位的荧光标记，分别在第4天给药后进行四环素(20mg/kg)的皮下给药、在6天后进行钙黄绿素(10mg/kg)的皮下给药。在第7天对检体进行给药后，以绝食条件饲养大鼠。在24小时后在麻醉下对大鼠进行放血，使其安乐死，采取胫骨(参照图7)。然后，对胫骨近位部制作不脱钙样品(undecalcifiedspecimen)，使用荧光显微镜(OLYMPUS公司制造BX-53)取得图像，使用形态测量系统(Histometry RT digitizer，System Supply Co.,Ltd.)进行骨形态测量。在成长软骨的长轴方向的伸长率(Lo.G.R:Longitudinal Growth Rate(纵向生长率))的测量中，关于生长率，测量四环素及钙黄绿素的标记宽度，由这些荧光标记的给药间隔(2天)计算每日的成长宽度。
其结果，与对照组相比，hGH给药组及No.1给药组表现出有意义的骨成长促进作用，No.1的作用依赖浓度(图8)。此外，对肥大化软骨层的面积进行测定，其结果，与对照组相比，hGH给药组及No.1给药组(10mg/kg/day)为有意义的高值(图9)。
进一步，在对检体进行给药7天后，在绝食24小时后进行采血，制作血清，使用ELISA(R&D公司制造Mouse/Rat IGF-1Quantikine ELISA Kit(小鼠/大鼠IGF-1定量因子ELISA试剂盒)；Mg100)由该血清测定血清中胰岛素样生长因子(IGF-1)浓度，其结果，与对照相组相比，No.1给药组(1、10mg/kg/day)的血清IGF-1浓度表现出上升倾向(图10)。在成长期中，参与骨生成及肌肉发育的IGF-1的增加表示其为引起上述骨成长促进作用的一个原因。
由这些结果确认到通过经口给药本发明的肽，促进成长期中长轴方向的骨成长。
[实施例4：基于合成肽的初级海面骨的形成促进作用的研究]
分别使用胃管，对4周龄的Crlj:WI雄性大鼠进行1天1次共7天的强制经口给药，对其给药合成肽(No.1)或注射水(对照)(各组：n＝3)。合成肽的用量设为100mg/kg/day。此外，作为阳性对照，将人成长激素(hGH；Norditropin，日本标准商品分类号872412)设为500μg/kg/day，进行1天1次共7天的皮下给药。作为骨生成部位的荧光标记，分别在第4天给药后进行四环素(20mg/kg)的皮下给药、在6天后进行钙黄绿素(10mg/kg)的皮下给药。在第7天对检体进行给药后，以绝食条件饲养大鼠。在24小时后在麻醉下对大鼠进行放血，使其安乐死，采取胫骨(参照图11)。然后，制作胫骨近位部的不脱钙样品，使用荧光显微镜(OLYMPUS公司制造BX-53)取得图像，使用形态测量系统(Histometry RT digitizer，System Supply Co.,Ltd.)进行骨形态测量。
其结果，相对于对照组及hGH给药组，No.1给药组高频率地检测出了被摄取进入初级海面骨的荧光标记，确认到在早期诱导了成长期中的松质骨的形成(图12；白色部位)。
由以上明显可知，本发明的肽通过经口给药，促进了初级松质骨的形成。
[实施例5：基于合成肽的成长软骨及次级松质骨的骨生成促进作用的研究]
分别使用胃管，对4周龄的Crlj:WI雄性大鼠进行1天1次共21天的强制经口给药，对其给药合成肽(No.1)或注射水(对照)。合成肽的用量设为100mg/kg/day。此外，作为阳性对照，将人成长激素(hGH)设为500μg/kg/day，进行1天1次共21天的皮下给药。作为骨生成部位的荧光标记，分别在第18天给药后进行四环素(20mg/kg)的皮下给药、第20天进行钙黄绿素(10mg/kg)的皮下给药。在第21天对检体进行给药后，以绝食条件饲养大鼠。在24小时后在麻醉下对大鼠进行放血，使其安乐死，采取胫骨(参照图13)。然后，制作颈骨近位部的不脱钙样品，使用荧光显微镜(OLYMPUS公司制造BX-53)取得图像，使用形态测量系统(Histometry RT digitizer，System Supply Co.,Ltd.)及解析软件(CSS-840cancellousbone morphometry version(CSS-840松质骨形态计量学版)、System Supply Co.,Ltd.)进行骨形态测量。在测量骨骺软骨的长轴方向的生长率(Lo.G.R；Longitudinal GrowthRate)时，对于生长率，测量四环素及钙黄绿素的标记宽度，由这些荧光标记的给药间隔(2天)计算每日的成长宽度。
其结果，与对照组相比，hGH给药组及No.1给药组有意义地促进骨成长，No.1给药组相对于hGH给药组也表现出有意义的骨成长促进作用(图14)。由此，表示本发明的肽在更长期的经口给药条件下也促进长轴方向的骨成长。
进一步，通过上述的解析系统对次级松质骨的骨量(BV；Bone volume(骨体积)/TV；Tissue volume(骨组织体积))进行解析，其结果，相对于对照组及hGH给药组，No.1给药组为高值(图15)。此外，在No.1给药组中，相对于总骨面，成骨细胞所局部存在的骨面的比例(Ob.S；Osteoblast surface(成骨细胞表面)/BS；Bone surface(骨表面))为高值(图16)，破骨细胞所局部存在的骨面的比例(Oc.S；Osteoclast surface(破骨细胞表面)/BS；Bone surface)为低值(图17)。
由这些结果确认到，通过经口给药本发明的肽，诱导了生成占优势的骨代谢，从而增加了骨量。
[实施例6：基于合成肽的次级松质骨的骨钙化速度的增加作用的研究]
分别使用胃管，对4周龄的Crlj:WI雄性大鼠进行1天1次共7天的强制经口给药，对其给药合成肽(No.1)或注射水(对照)(各组：n＝10)。合成肽的用量设为1、10、100mg/kg/day。此外，作为阳性对照，将人成长激素(hGH；Norditropin，日本标准商品分类号872412)设为500μg/kg/day，进行1天1次共7天的皮下给药。作为骨生成部位的荧光标记，分别在第4天给药后进行四环素(20mg/kg)的皮下给药、6天后进行钙黄绿素(10mg/kg)的皮下给药。在第7天对检体进行给药后，以绝食条件饲养大鼠。在24小时后在麻醉下对大鼠进行放血，使其安乐死，采取胫骨(参照图7)。然后，制作胫骨近位部的不脱钙样品，使用荧光显微镜(OLYMPUS公司制造BX-53)取得图像，使用形态测量系统(Histometry RT digitizer，System Supply Co.,Ltd.)进行骨形态测量。测量次级松质骨的四环素及钙黄绿素的标记宽度，由这些荧光标记的给药间隔(2天)计算每日的钙化速度。
其结果，相对于对照组，hGH给药组及No.1给药组的钙化速度有意义地增加。进一步，No.1给药组中，在用量为10mg/kg/day以上时，相对于hGH给药组，其表现出有意义的钙化速度的增加(图18)。此外，对次级松质骨的骨量(BV；Bone volume/TV；Tissue volume)进行解析，其结果，与hGH给药组相比，No.1给药组(10mg/kg)呈有意义的高值(图19)。进一步可知，在No.1给药组中，相对于总骨面，成骨细胞所局部存在的骨面的比例(Ob.S；Osteoblast surface/BS；Bone surface)、骨组织每单位面积的成骨细胞数(N.Ob；Numberof osteoblast(成骨细胞数)/TV:Tissue volume)呈高值(图20、21)，但破骨细胞所局部存在的骨面的比例(Oc.S；Osteoclast surface/BS；Bone surface)、骨组织每单位面积的破骨细胞数(N.Oc；Number of osteoclast(破骨细胞数)/TV:Tissue volume)与对照组呈相同程度，不对破骨细胞造成影响(图22、23)。确认到No.1给药组中观察到的次级松质骨的钙化速度、骨量的增加是起因于那样的成骨细胞的增加。
这些结果表示，通过经口给药本发明的肽，促进了次级松质骨的钙化，骨生成速度增加。
[实施例7：基于合成肽的对体重的影响的研究]
分别使用胃管，对4周龄的Crlj:WI雄性大鼠进行1天1次共7天的强制经口给药，对其给药合成肽(No.1)或注射水(对照)(各组：n＝10)。合成肽的用量设为1、10、100mg/kg/day。此外，作为阳性对照，将人成长激素(hGH；Norditropin，日本标准商品分类号872412)设为500μg/kg/day，进行1天1次共7天的皮下给药。在给药的第1、3、5、7天测定体重。其结果，在给药期间，所有的组中均未确认到体重的有意义的变化(图24)。这些结果表示，即使连续7天经口摄取本发明的肽，也不对体重造成影响。
[实施例8：基于合成肽的胰岛素样生长因子(IGF-1)产生促进作用的研究]
分别使用胃管，对4周龄的Wistar雄性大鼠进行单次经口给药，对其给药合成肽(No.1或No.2)或注射水(对照)(各组：n＝6)。合成肽的用量的No.1及No.2均设为10mg/kg。在给药前、给药30、45、60、90分钟后从尾部采血，制作血清。在给药120分钟后，在麻醉下从腹部大静脉收集全血，使其安乐死(参照图25)。然后，使用ELISA(R&D公司制造Mouse/RatIGF-1Quantikine ELISA Kit；Mg100)测定血清中的IGF-1浓度。
其结果，与对照相比，合成肽No.1给药组在给药45、60、90分钟后，血清IGF-1浓度表现出有意义的高值，与对照相比，No.2给药组在给药45、60分钟后，血清IGF-1浓度表现出有意义的高值(图26、27)。
然后，对于各合成肽，研究浓度依赖性。首先，以1、5、10mg/kg单次经口给药合成肽No.1(各组：n＝6)，在60分钟后，在麻醉下使其安乐死后，取出肝脏，测定血清及肝脏中的IGF-1浓度。另外，对于血清IGF-1浓度，评价给药前与给药后的前后差(Δ值)。其结果，与对照组相比，No.1给药组的血清及肝脏中IGF-1浓度以浓度依赖性的方式有意义地上升(图28、29)。
然后，以0.1、1、10mg/kg对大鼠单次经口给药合成肽No.2(各组：n＝6)，在45分钟后，在麻醉下使其安乐死后，取出肝脏，测定血清及肝脏中的IGF-1浓度。另外，对于血清IGF-1浓度，评价给药前与给药后的前后差(Δ值)。其结果，与对照组相比，No.2给药组的血清及肝脏中IGF-1浓度以浓度依赖性的方式有意义地上升(图30、31)。
IGF-1于肝脏中产生，并参与骨的形成，因此明显可知，本发明的肽通过促进活体内的IGF-1的产生，从而促进了骨生成。
由上述结果确认到，通过经口给药本发明的肽No.1及No.2，促进了活体内的IGF-1的产生。
[实施例9：基于合成肽给药的IGF-1产生促进作用的研究]
分别使用胃管，对4周龄的Wistar雄性大鼠进行单次经口给药，对其给药合成肽(No.2)、与No.2为反向序列的肽(序列号3；在本申请说明书等中也表示为R-No.2)、合成肽No.2的组成氨基酸(在本申请说明书等中也表示为AA)、或注射水(对照)(各组：n＝6)。合成肽、反向序列肽及组成氨基酸的用量设为10mg/kg。在给药45分钟后，在麻醉下使其安乐死后，取出肝脏，使用ELISA(R&D公司制造Mouse/Rat IGF-1Quantikine ELISA Kit；Mg100)测定血清及肝脏中的IGF-1浓度。另外，对于血清IGF-1浓度，评价给药前与给药后的前后差(Δ值)。
其结果，只有合成肽No.2给药组的血清及肝脏中的IGF-1浓度表现出有意义的高值(图32、33)。由此确认到本发明的合成肽No.2的IGF-1产生促进作用为肽序列特异性。
[实施例10：基于合成肽给药的对甲状旁腺激素浓度的影响的研究]
分别使用胃管，对4周龄的Wistar雄性大鼠进行单次经口给药，对其给药合成肽(No.1)或注射水(对照)(各组：n＝6)。合成肽的用量设为10mg/kg。在给药前、给药30、45、60、90分钟后从尾部进行采血，制作血清。给药120分钟后，在麻醉下从腹部大静脉收集全血，使其安乐死。然后使用ELISA(Uscn Life Science Inc公司制造Enzyme-linkedImmunosorbent Assay Kit For Parathyroid Hormone(PTH)(甲状旁腺素酶联免疫分析试剂盒))测定血清中的甲状旁腺激素(parathyroid hormone：PTH)浓度。
其结果，在合成肽No.1给药组与对照组中，对于血清PTH浓度，未确认到有意义的变化(图34)。已知PTH参与骨代谢，在持续给药PTH时促进骨吸收，但在间歇给药时，促进骨生成。作为已有药的PTH制剂为利用了该特征的骨生成促进剂。由于本发明的合成肽不使血清中PTH浓度发生变化，因此暗示了其以与已有药不同的机理促进骨生成。
[实施例11：合成肽对消化液的耐性的研究]
对于合成肽No.1，进行人工胃液试验。将10mg的合成肽No.1溶解于1mL的人工胃液(0.2％NaCl、0.32％胃蛋白酶、2.4％稀盐酸，pH调节至3.0)，在37℃下使其振荡反应。在反应前、反应60、120分钟后回收样本，HPLC[色谱柱：(ODS柱，尺寸：Φ46mm×500mm，SHIMADZU)，流动相：(A)0.05％TFA，(B)90％Acetonitrile(乙腈)/0.05％TFA，B2％(0min)→20％(50min)→100％(50.1min)→100％(55min)Gradient(梯度)，检测：UV215nm]，研究合成肽No.1是否分解于胃液中(耐性)。其结果，合成肽No.1即使在人工胃液中反应60、120分钟，也不被分解，表现出高耐性(图35)。
然后，将10mg的合成肽No.1溶解于1mL的人工肠液(0.34％KH2PO4、0.36％Na2HPO4、1％胰酶，pH调节至6.8)，在37℃下使其振荡反应。分别在反应前、反应120分钟后、经过一整夜后回收进行了反应的样本，使用HPLC[色谱柱：(ODS柱，尺寸：Φ46mm×500mm、SHIMADZU)、流动相：(A)0.05％TFA，(B)90％Acetonitrile/0.05％TFA，B 2％(0min)→20％(50min)→100％(50.1min)→100％(55min)Gradient，检测：UV215nm]，研究合成肽No.1是否分解于肠液中(耐性)。其结果，合成肽No.1被人工肠液分解，在最终汇总为具有合成肽No.2的序列的肽(图36)。
由上述结果明显可知，若摄取本发明的合成肽No.1，则在消化管内能够被分解成合成肽No.2。
[实施例12：合成肽的体内吸收研究]
使用Cyanine 3(cy3)NHS ester(菁3(cy3)NHS酯)(Lumiprobe公司制造，Cat#:61020)标记合成肽No.1。将20mg的合成肽No.1溶解于9.2mL的0.1M NaHCO3(pH8.3)，将9mL的肽溶解液与1mL的利用二甲基亚砜进行了溶解的Cy3NHS ester(Cy3NHS酯)溶液(10mg/mL)混合。将混合溶液在室温、遮光下静置4小时后，使用G-10凝胶滤柱(GE HealthcareCo.Ltd.制造，Sephadex G-10)进行提纯。然后，通过冻结干燥去除溶剂，得到cy3标记合成肽No.1。对7周龄ddY雄性小鼠进行单次经口给药，对其给药得到的cy3标记合成肽No.1。将cy3标记合成肽No.1的用量设为100mg/kg。在给药15分后，在麻醉下从门静脉进行采血，使其安乐死后，取出胃、小肠、肝脏、肾脏、心脏、肺、脑、大腿骨。然后，对各组织进行均化，与由门静脉血制作的血清一同供于HPLC[色谱柱：(ODS柱，尺寸：Φ46mm×500mm、SHIMADZU)，流动相：(A)0.05％TFA、(B)90％Acetonitrile/0.05％TFA、B 2％(0min)→20％(50min)→100％(50.1min)→100％(55min)Gradient，检测：UV215nm]，对是否能在活体内检测出cy3标记合成肽No.1进行研究。
其结果，cy3标记合成肽No.1在小肠中被部分分解，检测到cy3标记合成肽No.1与cy3标记合成肽No.2，在门静脉血及肝脏中仅检测到cy3标记合成肽No.2(图37)。由上述结果确认到，本发明的合成肽No.1在小肠中被分解为具有合成肽No.2的序列的肽、并被吸收，经由血液转移至肝脏。由此暗示了：即使经口摄取合成肽No.1或合成肽No.2，合成肽No.1被代谢并变为合成肽No.2，且合成肽No.2以该形态全部到达至消化管，由于合成肽No.2分子量小，因此迅速地被消化管吸收，效率也高，因此即使均经口摄取，也能够更有效地取得这些肽所具有的效果。
另外，本发明不限于上述各实施方式及实施例，在权利要求所示的范围内可进行各种变更，适当组合分别在不同实施方式中公开的技术手段而得到的实施方式，也包含在本发明的技术范围内。此外，本说明书中记载的全部学术文献及专利文献在本说明书中作为参考而被援引。
序列表
<110> 富尔玛株式会社（PHARMA FOODS INTERNATIONAL CO., LTD.）
<120> 成骨不全症等的预防和/或治疗剂
<130> KHP182115924.3
<150> JP 2016-127102
<151> 2016-06-27
<160> 3
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> 合成肽
<400> 1
Val Asn Pro Glu Ser Glu Glu Glu
1 5
<210> 2
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> 合成肽
<400> 2
Val Asn Pro Glu
1
<210> 3
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> 合成肽
<400> 3
Glu Pro Asn Val
1

Claims (12)

1.一种成骨不全症的预防和/或治疗药剂，其含有由(a)Val-Asn-Pro-Glu-Ser-Glu-Glu-Glu(序列号1)或(b)Val-Asn-Pro-Glu(序列号2)所表示的氨基酸序列组成的肽。
2.一种骨质疏松症的预防和/或治疗药剂，其含有由(a)Val-Asn-Pro-Glu-Ser-Glu-Glu-Glu(序列号1)或(b)Val-Asn-Pro-Glu(序列号2)所表示的氨基酸序列组成的肽。
3.一种变形性关节症的预防和/或治疗药剂，其含有由(a)Val-Asn-Pro-Glu-Ser-Glu-Glu-Glu(序列号1)或(b)Val-Asn-Pro-Glu(序列号2)所表示的氨基酸序列组成的肽。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的药剂，其为骨折的预防和/或治愈促进剂。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的药剂，其为经口给药用。
6.一种成骨不全症、骨质疏松症和/或变形性关节症的预防和/或治疗用药品，其含有权利要求1～5中任一项所述的药剂。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的药剂或药品，其特征在于，促进骨生成。
8.一种权利要求1～6中任一项所述的药剂或药品与其他成骨不全症、骨质疏松症和/或变形性关节症的预防和/或治疗用药品的组合。
9.根据权利要求1～3中任一项所述的药剂，其将由(b)Val-Asn-Pro-Glu(序列号2)所表示的氨基酸序列组成的肽作为有效成分。
10.根据权利要求9所示的药剂，其为骨折的预防和/或治愈促进用。
11.一种成骨不全症、骨质疏松症和/或变形性关节症的预防和/或治疗用医药组合物，其特征在于，含有权利要求1～3中任一项所述的肽，同时或依次给药具有破骨细胞抑制作用的化合物或双膦酸盐制剂。
12.一种患者用的医药组合物，其中，所述患者接受使用含有权利要求1～3中任一项所述的肽作为有效成分的、具有破骨细胞抑制作用的化合物或双膦酸盐制剂的治疗。
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