BR112019016250A2 - peptídeos isolados, uso do peptídeo isolado, método para prevenção ou tratamento de um distúrbio ósseo, método para melhorar a formação óssea, método para inibir a reabsorção óssea, método para induzir a deposição óssea, método para induzir a maturação óssea, método de expandir células tronco ex vivo e composição farmacêutica - Google Patents

peptídeos isolados, uso do peptídeo isolado, método para prevenção ou tratamento de um distúrbio ósseo, método para melhorar a formação óssea, método para inibir a reabsorção óssea, método para induzir a deposição óssea, método para induzir a maturação óssea, método de expandir células tronco ex vivo e composição farmacêutica Download PDF

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Abstract

a presente tecnologia refere-se de um modo geral a peptídeos de igfbp-2 que podem ser utilizados para melhorar distúrbios ósseos. a presente tecnologia também se refere de um modo geral a uso desses peptídeos em métodos para prevenir ou tratar distúrbios ósseos e a composições para tais usos.

Description

PEPTÍDEOS ISOLADOS, USO DO PEPTÍDEO ISOLADO, MÉTODO PARA PREVENÇÃO OU TRATAMENTO DE UM DISTÚRBIO ÓSSEO, MÉTODO PARA MELHORAR A FORMAÇÃO ÓSSEA, MÉTODO PARA INIBIR A REABSORÇÃO ÓSSEA, MÉTODO PARA INDUZIR A DEPOSIÇÃO ÓSSEA, MÉTODO PARA INDUZIR A MATURAÇÃO ÓSSEA, MÉTODO DE EXPANDIR CÉLULAS TRONCO EX VIVO E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA Referência cruzada ao pedido relacionado [01] O presente pedido reivindica prioridade e se beneficia do Pedido de Patente Provisório US 62/455,124, depositado em 6 de fevereiro de 2017, cuja divulgação é aqui incorporada por referência em sua totalidade.
Campo da tecnologia [02] A presente tecnologia refere-se de um modo geral a compostos, em particular peptídeos que podem ser utilizados para melhorar os distúrbios ósseos. A presente tecnologia também se refere de um modo geral a uso de tais compostos em métodos para prevenir e/ ou tratar distúrbios ósseos e à composições para tais uso. Antecedentes da invenção [03] A proteína 2 de ligação do fator de crescimento semelhante à insulina (IGFBP-2) é uma proteína de 36.000 Dalton que é um membro da família IGFBP. Existem seis (6) formas de proteínas de ligação a IGF de alta afinidade. Além de ligar os fatores de crescimento tipo insulina I e II e agir como proteínas de transporte, essas proteínas mostraram ter algumas ações que são independentes de sua capacidade de se ligar a IGFs.
[04] A IGFBP-2 é a segunda proteína de ligação mais abundante no soro. Ela circula em concentrações em humanos que variam entre 100-600 ng/ ml. As concentrações de proteína são altas durante a vida fetal e no nascimento e caem progressivamente durante a infância e adolescência. Há um ligeiro aumento, um aumento de aproximadamente 25% que ocorre entre os 60-80 anos de idade. As concentrações séricas de IGFBP-2 são reguladas por hormônios e nutrientes. O jejum provoca um aumento significativo na IGFBP-2 e a alimentação (particularmente a proteína da alimentação) restaura as concentrações ao normal. As concentrações
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2/64 também são suprimidas pela administração de insulina ou hormônio do crescimento, e são aumentadas pelo fator de crescimento semelhante à insulina-I. Isso se deve em parte à supressão do hormônio do crescimento e da insulina, os quais são suprimidos pela administração do IGF-I.
[05] Além de seu papel como proteína transportadora para fatores de crescimento semelhantes à insulina, a IGFBP-2 controla a massa óssea e o metabolismo da gordura. Camundongos knockout para IGFBP-2 (IGFBP-2 -/ -) têm massa óssea reduzida e aumentaram a massa gorda (DeMambro, Endocrinology, 2008). Em contraste, a superexpressão de IGFBP-2 em camundongos levou à redução da suscetibilidade à obesidade induzida por dieta e melhorou a sensibilidade à insulina (Wheatcroft, Diabetes, 2007; Hedbacker, Cell Metab, 2010). In vitro, a IGFBP-2 estimula diretamente a diferenciação de osteoblastos murinos e humanos (Xi, JBMR, 2014) e, ao contrário, inibe a diferenciação de pré-adipócitos (Wheatcroft, Diabetes, 2007).
[06] Como outras IGFBPs, a região N terminal da IGFBP-2 contém um sítio de ligação ao IGF-I, enquanto a região C-terminal facilita a ligação do IGF-I e explica a capacidade de se ligar à matriz extracelular. A IGFBP-2 também compreende dois domínios de ligação a heparina (HBD) que conferem funções independentes de ligação a IGF. O HBD1 é um HBD único que está localizado na região de ligação, enquanto o HBD2 está localizado na região C terminal. Enquanto HBD1 e HBD2 são responsáveis pela capacidade da IGFBP-2 de inibir a adipogênese (Xi, Endocrinology, 2013), apenas o HBD1 medeia propriedades na aquisição de massa óssea e diferenciação de osteoblastos (Kawai, JBC, 2011; Xi, JBMR, 2014).
[07] Estudos anteriores revelaram peptídeos incluindo HBD. Por exemplo, WO 2005/014635, o qual é aqui incorporado por referência, divulga Polipeptídeos Plasmáticos de desordem cardiovascular (CPPs) compartilhando similaridades de sequência de aminoácidos com HBD1. O documento WO 2005/014635 sugere uma função de diagnóstico potencial para tais CPPs. A Pat.US No. 9.220.746, que é também incorporada aqui por referência, divulga determinados Peptídeos HBD1 que conservam a atividade de osteoblastogênese de IGFBP-2. A Pat.
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US No. 9.220.746, propõe um papel para estes peptídeos no tratamento de condições relacionadas com os ossos.
[08] O tamanho de um peptídeo influencia a sua eficiência como um agente terapêutico. Os peptídeos mais longos são habitualmente rapidamente degradados após a administração e a sua eficácia in vivo é frequentemente fraca após administração intravenosa, subcutânea ou intramuscular em bolus. Além disso, a fabricação de peptídeos longos é um processo extenso e caro, seja fabricado por síntese de peptídeos em fase sólida ou por tecnologia recombinante. Finalmente, o tratamento crônico de pacientes com um peptídeo longo pode representar riscos de segurança para os pacientes na forma de imunogenicidade. Aumentar os anticorpos neutralizantes contra um peptídeo natural é um risco potencial para a saúde dos pacientes. Como tal, é altamente desejável obter fragmentos mais curtos que retenham a atividade do peptídeo inteiro e evitar os inconvenientes de peptídeos mais longos.
[09] Em vista do acima mostrado, seria altamente desejável identificar ainda os peptídeos de tamanho menores de HBD1 que possuem uma atividade biológica comparável à do comprimento inteiro de HBD1 mas que seria mais fácil e menos dispendioso de fabricar.
Descrição resumida da invenção [010] A presente tecnologia propõe fragmentos de IGFBP-2, em particular fragmentos de HBD1, que retêm a atividade do HBD1 inteiro e que podem ser úteis na prevenção ou tratamento de distúrbios ósseos.
[011] De acordo com vários aspectos, a presente tecnologia refere-se a um peptídeo isolado compreendendo um fragmento de domínio de ligação a heparina (HBD) conforme mostrado na SEQ ID NO: 1, o referido fragmento tendo 6 a 9 aminoácidos de comprimento e compreendendo uma sequência de aminoácidos GLEEPK como mostrado na SEQ ID NO: 14 ou um análogo do mesmo.
[012] De acordo com vários aspectos, a presente tecnologia refere-se a um peptídeo isolado compreendendo um fragmento do domínio de ligação à heparina (HBD), em que o HBD possui a sequência de aminoácidos KHHLGLEEPKKLR (SEQ ID NO: 1), o referido fragmento tendo 6 a 9 aminoácidos em comprimento e
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4/64 compreendendo uma sequência de aminoácidos GLEEPK (SEQ ID NO: 14) ou um análogo do mesmo.
[013] De acordo com vários aspectos, a presente tecnologia refere-se a um peptídeo isolado consistindo em um fragmento do domínio de ligação à heparina (HBD) conforme apresentado na SEQ ID NO: 1, o referido fragmento tendo 6 a 9 aminoácidos de comprimento e compreendendo uma sequência de aminoácidos GLEEPK conforme mostrado na SEQ ID NO: 14 ou um análogo do mesmo.
[014] De acordo com vários aspectos, a presente tecnologia refere-se a um peptídeo isolado consistindo em um fragmento do domínio de ligação à heparina (HBD) conforme mostrado na SEQ ID NO: 1, o referido fragmento tendo 6 a 10 aminoácidos de comprimento e compreendendo uma sequência de aminoácidos GLEEPK conforme mostrado na SEQ ID NO: 14 ou um análogo do mesmo para utilização na prevenção ou tratamento de um distúrbio ósseo.
[015] De acordo com vários aspectos, a presente tecnologia refere-se ao uso de peptídeos isolados como definidos aqui para a prevenção e/ ou tratamento de um distúrbio ósseo em um sujeito em necessidade do mesmo.
[016] De acordo com vários aspectos, a presente tecnologia refere-se ao uso de peptídeos isolados como definidos aqui na fabricação de um medicamento para a prevenção e/ ou tratamento de um distúrbio ósseo em um sujeito em necessidade do mesmo.
[017] De acordo com vários aspectos, a presente tecnologia refere-se ao uso de peptídeos isolados como definidos aqui para melhorar a formação de osso em um indivíduo com necessidade do mesmo.
[018] De acordo com vários aspectos, a presente tecnologia refere-se ao uso de peptídeos isolados como definidos aqui na fabricação de um medicamento para melhorar a formação de osso em um indivíduo com necessidade do mesmo.
[019] De acordo com vários aspectos, a presente tecnologia refere-se ao uso de peptídeos isolados como definidos aqui para a inibição da reabsorção óssea em um sujeito em necessidade do mesmo.
[020] De acordo com vários aspectos, a presente tecnologia refere-se ao
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5/64 uso de peptídeos isolados como definidos aqui na fabricação de um medicamento para a inibição da reabsorção óssea em um sujeito em necessidade do mesmo.
[021] De acordo com vários aspectos, a presente tecnologia refere-se ao uso de peptídeos isolados como definidos aqui para induzir a deposição de osso em um indivíduo com necessidade do mesmo.
[022] De acordo com vários aspectos, a presente tecnologia refere-se ao uso de peptídeos isolados como definidos aqui na fabricação de um medicamento para induzir a deposição de osso em um indivíduo com necessidade do mesmo.
[023] De acordo com vários aspectos, a presente tecnologia refere-se ao uso de peptídeos isolados como definidos aqui para induzir a maturação de osso em um indivíduo com necessidade do mesmo.
[024] De acordo com vários aspectos, a presente tecnologia refere-se ao uso de peptídeos isolados como definidos aqui na fabricação de um medicamento para induzir a maturação de osso em um indivíduo com necessidade do mesmo.
[025] De acordo com vários aspectos, a presente tecnologia refere-se ao uso de peptídeos isolados como definidos aqui para estimular osteoblastogênese em um sujeito em necessidade do mesmo.
[026] De acordo com vários aspectos, a presente tecnologia refere-se a um método para prevenção e/ ou tratamento de um distúrbio ósseo em um indivíduo com necessidade do mesmo, o método compreendendo a administração de um peptídeo isolado como aqui definido a um indivíduo em uma quantidade eficaz para prevenir ou tratar o distúrbio ósseo no sujeito.
[027] De acordo com vários aspectos, a presente tecnologia refere-se a um método para melhorar a formação óssea em um sujeito com a necessidade do mesmo, o método compreendendo a administração de um peptídeo isolado como aqui definido ao sujeito em uma quantidade eficaz para prevenir ou melhorar a formação óssea no indivíduo.
[028] De acordo com vários aspectos, a presente tecnologia refere-se a um método para inibir a reabsorção óssea em um indivíduo com a necessidade do mesmo, o método compreendendo a administração de um peptídeo isolado como aqui
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6/64 definido ao sujeito em uma quantidade eficaz para inibir a reabsorção óssea no indivíduo.
[029] De acordo com vários aspectos, a presente tecnologia refere-se a um método para induzir a deposição óssea em um sujeito em necessidade do mesmo, o método compreendendo administrar um peptídeo isolado como aqui definido ao indivíduo em uma quantidade eficaz para induzir deposição óssea no indivíduo.
[030] De acordo com vários aspectos, a presente tecnologia refere-se a um método para induzir a maturação óssea em um sujeito em necessidade do mesmo, o método compreendendo administrar um peptídeo isolado como aqui definido ao indivíduo em uma quantidade eficaz para induzir a maturação óssea no indivíduo.
[031] De acordo com vários aspectos, a presente tecnologia refere-se a um método de expansão de células tronco in vitro ou ex vivo, compreendendo o contato de um peptídeo isolado como aqui definido com células tronco de um sujeito, em que as referidas células tronco são mantidas sob condições em que são reintroduzidas no sujeito.
[032] De acordo com vários aspectos, a presente tecnologia refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo um ou mais peptídeos isolados como aqui definidos em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável.
[033] De acordo com vários aspectos, a presente tecnologia refere-se ao uso de um peptídeo isolado, como aqui definido, para inibição da diferenciação de células adiposas no sujeito.
[034] De acordo com vários aspectos, a presente tecnologia refere-se ao uso de um peptídeo isolado como aqui definido na fabricação de um medicamento para inibição da diferenciação de células adiposas em um sujeito.
[035] De acordo com vários aspectos, a presente tecnologia refere-se ao uso de um peptídeo isolado, como aqui definido, para modulação da massa gorda em um sujeito.
[036] De acordo com vários aspectos, a presente tecnologia refere-se ao uso de um peptídeo isolado, tal como aqui definido, na fabricação de um medicamento para modulação da massa gorda em um sujeito.
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7/64 [037] Outros aspectos e características da presente tecnologia se tornarão evidentes para os técnicos no assunto após revisão da seguinte descrição de formas de realização específicas em conjunção com os desenhos anexos.
Breve descrição dos desenhos [038] Todas as características das formas de realização que são descritas nesta divulgação não são mutuamente exclusivas e podem ser combinadas umas com as outras. Por exemplo, elementos de uma forma de realização podem ser utilizados nas outras formas de realização sem mais menção. Uma descrição detalhada de formas de realização específicas é fornecida abaixo com referência aos desenhos em anexo, nos quais:
[039] A Figura 1 é um gráfico que mostra o perfil farmacocinético de peptídeos de acordo com algumas formas de realização da presente tecnologia em ratos Sprague Dawley do sexo masculino, após injeção intravenosa de HBD1 cíclico (3-11), HBD1 (3-11) com C16:0 no N terminal, HBD1 (3- 11) com C18:0 no N terminal;
[040] A Figura 2 é um gráfico que mostra o perfil farmacocinético de peptídeos de acordo com algumas formas de realização da presente tecnologia em ratos Sprague Dawley do sexo masculino, após injeção subcutânea de HBD1 cíclico (3-11), HBD1 (3-11) com C16:0 no N terminal, HBD1 (3-11) com C18:0 no N terminal;
[041] A Figura 3 é um gráfico que mostra o perfil farmacocinético de peptídeos de acordo com algumas formas de realização da presente tecnologia em ratos Sprague Dawley do sexo masculino, após injeção subcutânea de HBD1 (3-11) com C16:0 no N terminal, HBD1 (3-11) com C14:0 no N terminal, HBD1 (3-11) com C18:0 no N terminal e HBD1 (3-11) com C20:0 no N terminal;
[042] A Figura 4 é um gráfico que mostra o perfil farmacocinético de peptídeos de acordo com algumas formas de realização da presente tecnologia após injeção única intravenosa (iv) e subcutânea (sc) em miniporcos Gottingen HBD1 (3-11) com C 18:0 no N terminal. Valores individuais representam a média dos valores obtidos para três sujeitos diferentes;
[043] As Figuras 5A-5C são gráficos que mostram o efeito dos peptídeos de acordo com algumas formas de realização da presente tecnologia no osso
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8/64 em ratos ovariectomizados. Os gráficos mostram a porcentagem de aumento de veículo OVX em parâmetros pCT selecionados de metáfise tibial após HBD1 (3-11) de seis semanas com Cl8:0 no N terminal de tratamento em ratos OVX Sprague-Dawley. A Figura 5A mostra BV/ TV; a Figura 5B mostra Tb.N; a Figura 5C mostra cone. D (*: pvalor < 0,05, **: p-valor < 0,01, ***: p-valor < 0,001 vs veiculo OVX); e [044] As Figuras 6A-6B são gráficos que mostram o efeito dos peptídeos de acordo com algumas formas de realização da presente tecnologia nas propriedades biomecânicas do osso indicadas. Os gráficos mostram a porcentagem de aumento de veículo OVX em parâmetros biomecânicos selecionados a partir de vértebras lombares (Figura 6A) e do colo do fêmur (Figura 6B), após um tratamento de 6 semanas com HBD1 (3-11) com C18:0 no N terminal em ratos OVX Sprague-Dawley (*: p-valor < 0,05, vs veículo OVX).
Descrição detalhada da tecnologia [045] Esta presente descrição da tecnologia não pretende ser um catálogo detalhado de todas as diferentes formas em que a presente tecnologia pode ser implementada, ou todas as características que podem ser adicionadas à presente tecnologia. Por exemplo, as características ilustradas em relação a uma forma de realização podem ser incorporadas em outras formas de realização, e as características ilustradas em relação a uma forma de realização particular podem ser eliminadas dessa forma de realização. Além disso, numerosas variações e adições às várias formas de realização aqui sugeridas serão evidentes para os técnicos no assunto à luz da presente descrição que não se afasta da presente tecnologia. Assim, o seguinte relatório descritivo pretende ilustrar algumas formas de realização particulares da presente tecnologia, e não especificar exaustivamente todas as permutações, combinações e variações das mesmas. A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que o comumente entendido por um técnico no assunto à qual a presente tecnologia pertence.
[046] A presente divulgação decorre do trabalho realizado pelos presentes descobridores em fragmentos peptídicos de IGFBP-2, em particular em fragmentos peptídicos do domínio de ligação à heparina (HBD) de IGFBP-2, e no seu
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9/64 estudo de como estes fragmentos peptídicos podem ser utilizados em métodos para melhorar os ossos, tal como em métodos de prevenção e/ ou tratamento de distúrbios ósseos.
A. Compostos, peptídeos, fragmentos e análogos dos mesmos [047] Como aqui utilizado, a expressão e o termo “Domínio de ligação à heparina” e “HBD” referem-se ao domínio de ligação à heparina de IGFBP-2. O termo “HBD1” refere-se ao domínio de ligação à heparina 1 do IGFBP-2. O termo “HBD1” se destina a referir a um peptídeo tendo a sequência de amino ácido como definida na SEQ ID NO: 1, a saber: ^KHHLGLEEPKKLR-13, em que “1” refere-se ao resíduo de aminoácido na extremidade 5’ ou N terminal deste peptídeo HBD1 e “ ” refere-se ao resíduo de aminoácido na extremidade 3’ ou no C terminal deste peptídeo HBD1. Por conseguinte, os aminoácidos de HBD1 ocupam as seguintes posições:
‘kWlWeWWVr [048] Serão utilizadas abreviações bem conhecidas na técnica para descrever aminoácidos, incluindo aminoácidos levógiros (L-aminoácidos ou L ou na forma L) e aminoácidos dextrógiros (D-aminoácidos ou D ou na forma D), Alanina (Ala ou A), Arginina (Arg ou R), Asparagina (Asn ou N), Ácido Aspártico (Asp ou D), Cisteína (Cys ou C), Ácido Glutâmico (Glu ou E), Glutamina (Gin ou Q), glicina (Gly ou G), Histidina (His ou H), Isoleucina (He ou I), Leucina (Leu ou L), Lisina (Lys ou K), Metionina (Met ou M), Fenilalanina (Phe ou F), Prolina (Pro ou P), Serina (Ser ou S), Treonina (Thr ou T), Triptofano (Trp ou W), Tirosina (Tyr ou Y) e Valina (Vai ou V). Um resíduo de L-aminoácido dentro da sequência peptídica nativa pode ser alterado para qualquer um dos 20 L-aminoácidos comumente encontrados em proteínas ou qualquer um dos D-aminoácidos correspondentes, aminoácidos raros, tais como, mas não limitados a, 4-hidroxiprolina ou hidroxilisina, ou um aminoácido não proteico, tal como P-alanina ou homosserina. Salvo indicado ao contrário, um aminoácido aqui denominado refere-se à forma L.
[049] Variações de ocorrência natural dos peptídeos definidos aqui são aqueles que podem compreender substituições, adições ou deleções de um ou mais aminoácidos que resultam devido a alterações discretas na sequência de nucleotídeos do
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10/64 gene codificante ou alelos do mesmo ou que resultam devido ao splicing alternativo do RNA transcrito. Entende-se que as alterações não afetam substancialmente as propriedades, características farmacológicas e biológicas das variantes peptídicas.
[050] Os peptídeos da presente divulgação podem estar na forma de sais. Particularmente, as funções ácidas da molécula podem ser substituídas por um seu derivado salino tal como, mas não limitado a, um sal trifluoroacetato.
[051] Por “peptídeo”, “polipeptídeo” ou “proteína” significa qualquer cadeia de aminoácidos, independentemente do comprimento ou modificação póstranslacional (por exemplo, glicosilação ou fosforilação), ou modificação química, ou aqueles que contêm aminoácidos não naturais ou incomuns, como D-Tyr, ornitina, ácido amino-adípico.
[052] Em algumas formas de realização, o peptídeo da presente divulgação compreende um fragmento de HBD1. Em algumas formas de realização, o peptídeo tem 10 aminoácidos de comprimento. Em algumas formas de realização, o peptídeo tem 9 aminoácidos de comprimento. Em algumas outras formas de realização, o peptídeo tem 8 aminoácidos de comprimento. Em algumas outras formas de realização, o peptídeo tem 7 aminoácidos de comprimento. Em algumas outras formas de realização, o peptídeo tem 6 aminoácidos de comprimento. Em algumas formas de realização, o peptídeo tem 5 aminoácidos de comprimento.
[053] Como aqui utilizado, o termo e expressão “fragmento” ou “fragmento do mesmo” refere-se a um fragmento de aminoácido de um peptídeo tal como IGFBP-2 ou do HBD de IGFBP-2 ou do HBD1 de IGFBP-2. Fragmentos de HBD1 são mais curtos do que 13 resíduos de aminoácidos. Os fragmentos de HBD1 podem, portanto ter 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 ou 4 resíduos de aminoácidos de comprimento. Em algumas formas de realização, o fragmento de HBD1 tem 10 aminoácidos de comprimento. Em algumas formas de realização, o fragmento de HBD1 tem 9 aminoácidos de comprimento. Em algumas outras formas de realização, o fragmento de HBD1 tem 8 aminoácidos de comprimento. Em algumas outras formas de realização, o fragmento de HBD1 tem 7 aminoácidos de comprimento. Em algumas outras formas de realização, o fragmento de HBD1 tem 6 aminoácidos de comprimento.
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Em algumas outras formas de realização, o fragmento de HBD1 tem 5 aminoácidos de comprimento. Em algumas outras formas de realização, o fragmento de HBD1 tem 4 aminoácidos de comprimento.
[054] Em uma forma de realização, a presente divulgação fornece peptídeos tendo as sequências de aminoácidos descritas na Tabela 1. HBD1 (1-13) representa o comprimento total de HBD1. Os peptídeos restantes apresentados na Tabela 1 são fragmentos de HBD1 (1-13), em que os resíduos de aminoácidos no N terminal ou no C terminal ou em ambos o N terminal e o C terminal estão ausentes.
Tabela 1: Exemplos de fragmentos de HBD1
Nome do fragmento Sequência de Aminoácidos Número de resíduos de aminoácidos
SEQ ID NO: 1 HBD1 (1-13) ’- KHHLGLEEPKKLR-13 13
SEQ ID NO: 2 HBD1 (2-13) ’-HHLGLEEPKKLR-13 12
SEQ ID NO: 3 HBD1 (3-13) HLGLEEPKKLR-13 11
SEQ ID NO: 4 HBD1 (4-13) ’-LGLEEPKKLR-13 10
SEQ ID NO: 5 HBD1 (1-12) ’-KHHLGLEEPKKL.-13 12
SEQ ID NO: 6 HBD1 (1-11) ’-KHHLGLEEPKK. -13 11
SEQ ID NO: 7 HBD1 (3-10) HLGLEEPK-13 8
SEQ ID NO: 8 HBD1 (3-9) HLGLEEP-13 7
SEQ ID NO: 9 HBD1 (3-12) HLGLEEPKKL-13 10
SEQ ID NO: 10 HBD1 (3-11) 1 - -HLGLEEPKK 13 9
SEQ ID NO: 11 HBD1 (4-11) ’-LGLEEPKK -13 8
SEQ ID NO: 12 HBD1 (5-11) ’-GLEEPKK -13 7
SEQ ID NO: 13 HBD1 (4-10) ’-LGLEEPK-13 7
SEQ ID NO: 14 HBD1 (5-10) ’-GLEEPK-13 6
SEQ ID NO: 15 HBD1 (4-9) ’-LGLEEP-13 6
SEQ ID NO: 16 HBD1 (2-11) ’-HHLGLEEPKK. -13 10
SEQ ID NO: 77 HBD1 (3-11) cíclico cíciicoi _HLGLEEPKK-13ciclico 9
[055] Em algumas formas de realização, os peptídeos da presente
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12/64 divulgação são “purificados”, “isolados” ou “substancialmente puros”. Os peptídeos são “purificados”, “isolados” ou “substancialmente puros” quando são separados dos componentes que naturalmente os acompanham. Normalmente, um composto é substancialmente puro quando é pelo menos cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93 %, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, ou cerca de 99%, em peso, do material total em uma amostra. Técnicas para purificar ou isolar peptídeos são vulgarmente conhecidas e utilizadas na técnica e serão conhecidas pelos técnicos na técnica.
[056] Em algumas outras formas de realização, certos peptídeos de acordo com a presente divulgação também podem estar na forma ciclizada, de tal modo que os N ou C terminais estão ligados diretamente cabeça-a-cauda diretamente, ou através da inserção de uma porção de ligação, tal porção em si de um modo geral compreende um ou mais resíduos de aminoácidos, conforme requerido para se unir à cadeia principal de modo a evitar a alteração da estrutura tridimensional do peptídeo em relação à forma não ciclizada. Tais derivados peptídicos podem ter estabilidade e biodisponibilidade melhoradas em relação aos peptídeos não ciclizados.
[057] Os métodos para a ciclização de peptídeos são bem conhecidos na técnica. A ciclização pode ser conseguida por formação de ligações dissulfeto entre dois grupos funcionais de cadeia lateral, formação de ligação amida ou éster entre um grupo funcional de cadeia lateral e a função da a-amino ou carboxila da cadeia principal, formação de ligação amida ou éster entre grupos funcionais de cadeia lateral ou formação de ligação amida entre as funções da cadeia principal α-amino e carboxila. Estas reações de ciclização foram tradicionalmente realizadas a alta diluição em solução. A ciclização é de um modo geral realizada enquanto o peptídeo está ligado à resina. Uma das formas mais comuns de sintetizar peptídeos cíclicos em um suporte sólido é ligando a cadeia lateral de um aminoácido à resina. Usando estratégias de proteção apropriadas, os C e N terminais podem ser seletivamente desprotegidos e ciclizados na resina após a montagem da cadeia. Esta estratégia amplamente utilizada e compatível com os protocolos de terc-butiloxicarbonila (Boc) ou 9
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13/64 fluorenilmetoxicarbonila (Fmoc). No entanto, ele é restrito a peptídeos que contêm funcionalidade de cadeia lateral apropriada para anexar ao suporte sólido. Várias abordagens podem ser utilizadas para alcançar uma síntese eficiente de peptídeos cíclicos. Um procedimento para sintetizar peptídeos cíclicos baseia-se na ciclização com divagem simultânea da resina. Depois de uma sequência peptídica apropriada ser montada por síntese de fase sólida na resina ou uma sequência linear é anexada à resina, o grupo amino desprotegido pode reagir com a sua ligação ativa de ancoragem para produzir peptídeos cíclicos protegidos. Em geral, é necessário uma etapa final de desproteção para produzir o peptídeo cíclico alvo. Os procedimentos para sintetizar peptídeos cíclicos são bem conhecidos na técnica.
[058] Em outras formas de realização, a presente divulgação fornece análogos dos peptídeos aqui definidos. Como aqui utilizado, o termo “análogo” referese a um peptídeo que tem a atividade fisiológica do composto parental do mesmo, e que inclui um ou mais (por exemplo, dois, três, quatro, cinco ou seis ou mais) aminoácidos diferentes da sequência de aminoácidos de um peptídeo parental de ocorrência natural. Tal análogo tem de preferência pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95% da atividade fisiológica do peptídeo parental.
[059] Em algumas outras formas de realização, os análogos podem ser tão fisiologicamente ativos como o parental (ou seja, tem 100% de atividade fisiológica do peptídeo parental) ou podem ser mais do que cerca de 100%, mais do que cerca de 110%, mais do que cerca de 120%, mais de cerca de 130%, mais de cerca de 140%, mais de cerca de 150%, mais de cerca de 160%, mais de cerca de 170%, mais de cerca de 180%, mais de cerca de 190% ou mais de cerca de 200% fisicamente ativo do que o peptídeo parental.
[060] Tais aminoácidos diferentes podem ser adições, substituições, deleções ou combinações dos mesmos, incluindo a adição de grupos de cadeias laterais não naturais e ligações de cadeia principal. Modificações de peptídeos para produzir
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14/64 análogos dos mesmos são conhecidas. Veja-se, por exemplo, a Pat. No. US 7.323.543; veja também Pat. No. US 7.482.171; 7.459.152; e 7.393.919, que são todas aqui incorporadas por referência. Para exemplos, os análogos de peptídeos compreendendo HBD1 ou análogos de fragmentos de HBD1 referem-se a: i) análogos estruturais; ii) análogos funcionais; ou iii) análogos estruturais e funcionais de HBD1 que são, inter alia, capaz de substituir HBD1 em melhorar os distúrbios ósseos, tais como, por exemplo, na prevenção e/ ou tratamento de distúrbios ósseos.
[061] Análogos dos peptídeos da presente divulgação que têm pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos 99% de homologia de sequência com as sequências de aminoácidos descritas aqui ao longo de todo o seu comprimento, e compartilhando pelo menos um dos efeitos metabólicos ou atividade biológica de HBD1. Um técnico no assunto rapidamente identificaria uma sequência análoga de HBD1 ou uma sequência analógica de um fragmento de HBD1.
[062] Os análogos de HBD1 ou análogos de fragmento de HBD1 são, por exemplo, os análogos obtidos por varreduras de alanina ou por substituições de aminoácidos. Em alguns casos, os análogos de HBD1 ou os seus análogos de fragmentos do mesmo podem compreender um aminoácido codificado de forma não natural, em que o aminoácido codificador não natural refere-se a um aminoácido que não é um dos aminoácidos comuns ou pirrolisina ou selenocistea, ou um aminoácido que ocorre por modificação (por exemplo, modificação pós-tradução) de aminoácido naturalmente codificado (incluindo, mas não limitado a, 20 aminoácidos comuns ou pirrolisina e selenocisteína), mas eles próprios não são incorporados em uma cadeia polipeptídica em crescimento pelo complexo de tradução. Exemplos de tais aminoácidos de ocorrência não natural incluem, mas não estão limitados a, Nacetilglucosaminil-L-serina, N-acetilglucosaminil-L-treonina e O-fosfotirosina.
[063] A Tabela 2 apresenta exemplos de análogos de HBD1 (3-11) com
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15/64 substituições de alanina nas diferentes posições de aminoácido.
Tabela 2: Fragmento de HBD1 (3-11) com substituições de alanina em várias posições
Sequência de Aminoácidos
SEQ ID NO: 17 ALGLEEPKK
SEQ ID NO: 18 HAGLEEPKK
SEQ ID NO: 19 HLALEEPKK
SEQ ID NO: 20 HLGAEEPKK
SEQ ID NO: 21 HLGLAEPKK
SEQ ID NO: 22 HLGLEAPKK
SEQ ID NO: 23 HLGLEEAKK
SEQ ID NO: 24 HLGLEEPAK
SEQ ID NO: 25 HLGLEEPKA
[064] A Tabela 3 apresenta outros exemplos de análogos de fragmentos de HBD1 compreendendo as substituições de aminoácidos nas posições de aminoácidos diferentes de HBD1 (3-11).
Tabela 3: Análogos do fragmento de HBD1 (3-11) com substituições de aminoácidos em várias posições
SEQ ID NOs Sequência de Aminoácidos
SEQ ID NO: 26 HLGLERPKK
SEQ ID NO: 27 HLGLEFPKK
SEQ ID NO: 28 HLGLEIPKK
SEQ ID NO: 29 HLGLEPPKK
SEQ ID NO: 30 HLGLESPKK
SEQ ID NO: 31 HLGLEERKK
SEQ ID NO: 32 HLGLEEFKK
SEQ ID NO: 33 HLGLEELKK
SEQ ID NO: 34 HLGLEESKK
SEQ ID NO: 35 HLGLEEDKK
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16/64
SEQ ID NOs Sequência de Aminoácidos
SEQ ID NO: 36 HLGLEEPFK
SEQ ID NO: 37 HLGLEEPPK
SEQ ID NO: 38 HLGLEEPSK
SEQ ID NO: 39 HLGLEEPDK
SEQ ID NO: 40 HLGLEEPKF
SEQ ID NO: 41 HLGLEEPKI
SEQ ID NO: 42 HLGLEEPKP
SEQ ID NO: 43 HLGLEEPKS
SEQ ID NO: 44 HLGLEEPKD
SEQ ID NO: 45 HLGLEEPIK
SEQ ID NO: 46 HLGLEEPVK
SEQ ID NO: 47 HLGLEEPQK
SEQ ID NO: 48 HLGLEEPTK
SEQ ID NO: 49 HLGLEEPEK
SEQ ID NO: 50 HLGLEEPKH
SEQ ID NO: 51 HLGLEEPKR
SEQ ID NO: 52 HLGLEEPKL
SEQ ID NO: 53 HLGLEEPKM
SEQ ID NO: 54 HLGLEEPKW
SEQ ID NO: 55 HLGLEEPKV
SEQ ID NO: 56 HLGLEEPKQ
SEQ ID NO: 57 HLGLEEPKN
SEQ ID NO: 58 HLGLEEPKY
SEQ ID NO: 59 HLGLEEPKT
SEQ ID NO: 60 HLGLEEPKE
SEQ ID NO: 61 HLGLEEPSP
SEQ ID NO: 62 HLGLEEPSS
SEQ ID NO: 89 KLGLEEPKK
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17/64
SEQ ID NOs Sequência de Aminoácidos
SEQ ID NO: 90 HVGLEEPKK
SEQ ID NO: 91 HLPLEEPKK
SEQ ID NO: 92 HLG I EEPKK
SEQ ID NO: 93 NLGLEEPKK
SEQ ID NO: 94 HTGLEEPKK
SEQ ID NO: 95 HLKLEEPKK
SEQ ID NO: 96 HLGSEEPKK
SEQ ID NO: 97 HLGLEEPYK
SEQ ID NO: 98 HLGLEEPQK
SEQ ID NO: 99 HLGLEEPNK
SEQ ID NO: 100 HLGLEEPSF
SEQ ID NO: 101 HLGLEEPSV
SEQ ID NO: 102 HLGLEEPLM
SEQ ID NO: 103 HLGLEEPLY
SEQ ID NO: 104 HLGLEEPLN
SEQ ID NO: 105 HLGLEEPLQ
SEQ ID NO: 106 HLGLEEPFV
SEQ ID NO: 107 HLGLEEPFQ
SEQ ID NO: 108 HLGLEEPFN
SEQ ID NO: 109 HLGLEEPVM
SEQ ID NO: 110 HLGLEEPVN
SEQ ID NO: 111 HLGLEEPM K
[065] Em alguns casos, os análogos de HBD1 ou seus fragmentos podem diferir na sequência de HBD1 por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 substituições, deleções ou adições de aminoácidos, ou suas combinações.
[066] Em alguns casos, a substituição de aminoácidos é uma substituição conservadora de aminoácidos. Como aqui utilizado, a expressão “substituição conservativa de aminoácidos” refere-se a substituições que substituem um
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18/64 resíduo por outro de características semelhantes. Substituições de aminoácidos conservativas típicas incluem aquelas entre Gly (G), Ala (A), Vai (V), Leu (L) e He (I); aquelas entre Ser (S), Cys (C), Met (M) e Thr (T); aquelas entre os resíduos acídicos Asp (D) e Glu (E); aquelas entre Asn (N) e Gin (Q); aquelas entre os resíduos básicos His (H), Lys (K) e Arg (R); e aquelas entre os resíduos aromáticos Phe (F), Try (W) e Tyr(Y).
[067] Em algumas formas de realização, a presente tecnologia fornece um peptídeo isolado possuindo um fragmento de HBD1 como mostrado na SEQ ID NO: 1. Em alguns casos, o fragmento tem entre 6 a 10 aminoácidos de comprimento e compreende os resíduos 3 a 10 de HBD1, nomeadamente: HLGLEEPK como estabelecido na SEQ ID NO: 7 ou um análogo do mesmo. Exemplos de análogos de um peptídeo possuindo a sequência de aminoácidos HLGLEEPK incluem, mas não estão limitados aos peptídeos apresentados na Tabela 4.
Tabela 4: Análogos do fragmento HBD1 (3-10) com substituições de aminoácidos em várias posições
SEQ ID NO: Sequência de Aminoácidos
SEQ ID NO: 112 HLGLEEPR
SEQ ID NO: 113 HLGLEEPH
[068] Em algumas formas de realização, a presente tecnologia fornece um peptídeo isolado possuindo um fragmento de HBD1 como mostrado na SEQ ID NO: 1. Em alguns casos, o fragmento tem entre 6 a 10 aminoácidos de comprimento e compreende os resíduos 5 a 10 de HBD1, ou seja: GLEEPK conforme mostrado na SEQ ID NO: 14 ou um análogo do mesmo. Em algumas outras formas de realização, o fragmento tem entre 6 a 9 aminoácidos de comprimento e compreende os resíduos 5 a 10 de HBD1, nomeadamente: GLEEPK conforme mostrado na SEQ ID NO: 14 ou um análogo do mesmo. Exemplos de análogos de um peptídeo possuindo a sequência de aminoácidos GLEEPK incluem, mas não estão limitados aos peptídeos apresentados na Tabela 5.
Tabela 5: Análogos do fragmento de HBD1 (5-10) com substituições de aminoácidos em várias posições
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SEQ ID NO: Sequência de Aminoácidos
SEQ ID NO: 79 GLEEPL
SEQ ID NO: 80 GLEEPR
SEQ ID NO: 81 GLDEPK
SEQ ID NO: 82 GLEDPK
SEQ ID NO: 83 GGEEPK
SEQ ID NO: 84 GVEEPK
SEQ ID NO: 85 GIEEPK
SEQ ID NO: 86 VLEEPK
SEQ ID NO: 87 LLEEPK
SEQ ID NO: 88 ILEEPK
[069] Em algumas outras formas de realização, os peptídeos da presente invenção podem ser modificados. Como aqui utilizado o termo “modificado” quando utilizado para qualificar um peptídeo, refere-se a quaisquer alterações feitas em um peptídeo, tais como mudanças no comprimento do peptídeo, na sequência de aminoácidos, na estrutura química, na modificação de co-tradução ou na modificação pós-tradução de um peptídeo. Em alguns casos, os peptídeos da presente invenção compreendem um ou mais resíduos de aminoácidos que são modificados.
[070] Como aqui utilizado, a expressão “modificação pós-tradução” refere-se a qualquer modificação de um aminoácido natural ou não natural que ocorre a um tal aminoácido depois de ter sido incorporado em uma cadeia peptídica. O termo abrange, apenas a título de exemplo, modificações in vivo de co-tradução, modificações in vitro de co-tradução (tal como em um sistema de tradução sem células), modificações in vivo pós-tradução e modificações in vitro pós-tradução. Exemplos de modificações pós-tradução são, mas não estão limitados a, glicosilação, peguilação, acetilação, acilação, amidação, metilação, carboxilação, fosforilação, adição de sais, amidas ou ésteres, em particular ésteres C terminais e derivados N-acila dos peptídeos da presente invenção. Os tipos de modificações pós-tradução são bem conhecidos na técnica.
[071] Em algumas formas de realização, os peptídeos da presente invenção incluem uma ou mais porções de poli(etileno glicol) (ou “PEG”) de entre
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20/64 cerca de 10.000 e cerca de 40.000 de peso molecular acoplado a ambos o N ou C terminal do peptídeo. “Polialquileno glicol” significa polímeros de polialquileno glicol de cadeia linear ou ramificada incluindo, mas não limitados a, polietileno glicol (PEG), polipropileno glicol (PPG) e polibutileno glicol (PBG), bem como copolímeros de PEG, PPG e PBG em qualquer combinação e inclui o monoalquiléter do polialquileno glicol. Assim, em várias formas de realização da presente tecnologia, o polialquileno glicol nos peptídeos da presente invenção pode ser, mas não está limitado a, polietileno glicol, polipropileno glicol, polibutileno glicol e qualquer combinação dos mesmos. Em certas formas de realização, o polialquileno glicol é polietileno glicol ou “PEG”. O termo “subunidade de PEG” refere-se a uma única unidade de polietileno glicol, isto é, (CH2CH2O)-.
[072] Em algumas formas de realização, o polialquileno glicol (por exemplo, PEG) pode ser não polidisperso, monodisperso, substancialmente monodisperso, puramente monodisperso ou substancialmente puramente monodisperso. “Monodisperso” é usado para descrever uma mistura de compostos em que cerca de 100 por cento dos compostos na mistura têm o mesmo peso molecular. “Substancialmente monodisperso” é usado para descrever uma mistura de compostos em que pelo menos cerca de 95 por cento dos compostos na mistura têm o mesmo peso molecular. “Puramente monodisperso” é usado para descrever uma mistura de compostos em que cerca de 100 por cento dos compostos na mistura têm o mesmo peso molecular e têm a mesma estrutura molecular. Assim, uma mistura puramente monodispersa é uma mistura monodispersa, mas uma mistura monodispersa não é necessariamente uma mistura puramente monodispersa. “Substancialmente puramente monodispersa” é usado para descrever uma mistura de compostos em que pelo menos cerca de 95 por cento dos compostos na mistura têm o mesmo peso molecular e têm a mesma estrutura molecular. Assim, uma mistura substancialmente puramente monodispersa é uma mistura substancialmente monodispersa, mas uma mistura substancialmente monodispersa não é necessariamente uma mistura substancialmente monodispersa. A Tabela 6 apresenta exemplos de peptídeos da presente invenção que são modificados por peguilação.
Tabela 6: Fragmentos de HBD1 PEGuilado
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SEQ ID NOs Sequência de Aminoácidos
SEQ ID NO: 63 PEG20-C-KHHLGLEEPKKLR
SEQ ID NO: 64 KHHLGLEEPKKLR-C-PEG20
SEQ ID NO: 65 PEG20-C-HHLGLEEPKK
SEQ ID NO: 66 HHLGLEEPKK-C-PEG20
SEQ ID NO: 67 PEG20-C-HLGLEEPKK
[073] Em alguns outros casos, os peptídeos da presente invenção incluem um ou mais grupo(s) acila acoplado a qualquer aminoácido do peptídeo. Em alguns casos, o um ou mais grupo(s) acila está acoplado ao aminoácido N terminal ou ao C terminal ou a ambos. Em alguns casos, a acilação dos peptídeos da presente invenção é uma acilação graxa, pela qual é adicionado um ácido graxo a um ou mais aminoácido(s) particular(es) do peptídeo. Exemplos de acilação graxa incluem adição de: ácido láurico (C12:0), ácido tridecíclico (C13:0), ácido mirístico (C14:0), ácido pentadecíclico (C15:0), ácido palmítico (Cl6:0), ácido margárico (Cl7:0), ácido esteárico (C18:0), ácido nonadecíclico (C19:0), ácido araquidínico (C20:0), ácido heneicosílico (C21:0), ácido beênico (C22:0), ácido tricosílico (C23:0), ou ácido lignocérico (C24:0), ou uma mistura dos mesmos, com um ou mais aminoácidos dos peptídeos da presente invenção.
[074] Em algumas variantes, o ácido graxo a ser adicionado pode ser insaturado (por exemplo, monoinsaturado ou poliinsaturado). Exemplos de ácidos graxos insaturados incluem mas não se limitam a: i) ácido graxo mono-insaturado: ácido crotônico, miristoleico, ácido palmitoleico, ácido sapiênico, ácido oleico, ácido elaidico, ácido vaccênico, gadoleico, ácido eicosenoico, ácido erúcico, ácido nervônico; ii) ácido graxo di-insaturado: ácido linoleico, ácido eicosadienoico, ácido docosadienoico; iii) ácidos graxos tri-insaturados: ácido linolênico, ácido pinolênico, ácido eleoesteárico, ácido hidrogenado, ácido di-homo-y-linolênico, ácido eicosatrienoico; iv) ácido graxo tetra-insaturado: ácido estearidônico, ácido araquidônico, ácido eicosatetraenoico, ácido adrenico; v) ácidos graxos pentainsaturados: ácido bosseopentaenoico, ácido eicosapentaenoico, ácido ozubondo, ácido sardina, ácido tetracosanolpentaenoico; e vi) ácidos graxos hexa-insaturados: ácido
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22/64 docosahexaenoico e ácido de arenque.
[075] Em algumas formas de realização, os peptídeos da presente invenção podem ser acoplados a ácidos graxos que compreendem um ou mais grupos funcionais carboxílicos (-COOH).
[076] Os métodos para realizar acilação de peptídeos são bem conhecidos na técnica. A Tabela 7 apresenta exemplos de peptídeos da presente invenção que são modificados por acilação.
Tabela 7: Fragmentos de HBD1 (2-11) acilados
SEQ ID NOs Sequência de Aminoácidos
SEQ ID NO: 68 C16:0-HHLGLEEPKK
SEQ ID NO: 69 C18:0-HHLGLEEPKK
SEQ ID NO: 70 C20:0-HHLGLEEPKK
SEQ ID NO: 71 C14:0-HLGLEEPKK
SEQ ID NO: 72 C16:0-HLGLEEPKK
SEQ ID NO: 73 C18:0-HLGLEEPKK
SEQ ID NO: 74 C20:0-HLGLEEPKK
SEQ ID NO: 75 C16:0-diácido-HLGLEEPKK
SEQ ID NO: 76 HLGLEEPKK-C16:0
SEQ ID NO: 78 C16:0-KHHLGLEEPKKLR
[077] Em algumas formas de realização adicionais, os peptídeos da presente invenção podem ser acoplados a um ligante ou a um grupo de ligação (por exemplo, porção de ligação). Como aqui utilizado, a expressão “ligante” ou “ grupo de ligação” inclui grupos de ligação não aminoácidos tais como são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Patentes US Nos. 7,468,418; 7,402,652; e 7,351,797, que são todos aqui incorporados por referência) ou variações dos mesmos que serão evidentes para os técnicos no assunto.
[078] Em algumas formas de realização, os peptídeos da presente invenção podem incluir mais do que uma modificação (por exemplo, podem incluir um grupo PEG e um grupo acila).
[079] Em algumas outras formas de realização, os peptídeos da
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23/64 presente invenção podem ser acoplados a um grupo modificador que é ele próprio modificado. Por exemplo, os peptídeos da presente invenção podem ser acoplados a um ácido graxo que é ele próprio modificado. O ácido graxo modificado pode, por exemplo, ser acoplado a um ligante ou a um grupo de ligação e o ligante ou o grupo de ligação pode ele próprio ser acoplado a outro grupo modificador tal como um grupo PEG ou um ou mais grupos funcionais carboxílicos (-COOH). Várias combinações de modificações e os métodos para a sua concretização serão reconhecidas e apreciadas pelos técnicos no assunto.
[080] Certos aspectos da presente tecnologia utilizam polinucleotídeos. Estes polinucleotídeos incluem polinucleotídeos isolados que codificam os peptídeos, fragmentos e análogos de HBD1 aqui definidos.
[081] Como aqui utilizado, o termo “polinucleotídeo” refere-se a uma molécula compreendida de uma pluralidade de subunidades de desoxirribonucleotídeos ou nucleosídeos. A ligação entre as subunidades de nucleosídeos pode ser fornecida por fosfatos, fosfonatos, fosforamidatos, fosforotioatos ou semelhantes, ou por grupos não fosfatos como são conhecidos na técnica, tais como ligações tipo peptoides utilizadas em ácidos nucleicos peptídicos (PNA). Os grupos de ligação podem ser quirais ou aquirais. Os oligonucleotídeos ou polinucleotídeos podem variar em comprimento de 2 subunidades de nucleosídeos para centenas ou milhares de subunidades de nucleosídeos. Embora os oligonucleotídeos possuam preferencialmente 5 a 100 subunidades de comprimento e, de um modo mais preferido, 5 a 60 subunidades de comprimento, o comprimento dos polinucleotídeos pode ser muito maior (por exemplo, até 100). O polinucleotídeo pode ser qualquer um de DNA e RNA. O DNA pode estar em qualquer forma de DNA genômico, uma biblioteca de DNA genômico, cDNA derivado de uma célula ou tecido e DNA sintético. Além disso, a presente invenção pode, em certos aspectos, utilizar vectores que incluem bacteriófagos, plasmídeos, cosmídeos ou fagemídeos.
[082] Os polipeptídeos úteis na presente tecnologia podem ser preparados de qualquer modo adequado como conhecido na técnica. Esses polipeptídeos incluem polipeptídeos de ocorrência natural isolados, polipeptídeos produzidos de
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24/64 forma recombinante, polipeptídeos produzidos sinteticamente ou polipeptideos produzidos por uma combinação destes métodos. Meios e métodos para preparar tais polipeptídeos são bem conhecidos na técnica.
B. Ações terapêuticas [083] Como aqui utilizado, os termos “tratar”, “tratando” e “tratamento” como aqui utilizados, referem-se a qualquer tipo de tratamento que fornece um benefício a um sujeito afetado por uma doença, incluindo melhoria na condição do paciente (por exemplo, em um ou mais sintomas), atraso na progressão da doença ou semelhantes.
[084] Como usado aqui, os termos “sujeitos” e “paciente” de um modo geral se referem a sujeitos humanos e são usados de forma intercambiável. Os sujeitos podem ser do sexo masculino ou feminino e podem ser de qualquer raça ou etnia, incluindo, mas não limitados a, caucasianos, afro-americanos, africanos, asiáticos, hispânicos, indianos, etc. Os sujeitos podem ser de qualquer idade, incluindo recémnascidos, recém-nascido, criança, adolescente, adulto e geriátrico. Em algumas formas de realização, os sujeitos são afligidos por um distúrbio ósseo. Os sujeitos também podem incluir sujeitos animais, particularmente sujeitos mamíferos, tais como caninos, felinos, bovinos, caprinos, equinos, ovinos, porcinos, roedores (por exemplo, ratos e camundongos), lagomorfos, primatas (incluindo primatas não humanos), etc., para uso na medicina veterinária ou para fins de desenvolvimento de medicamentos farmacêuticos.
[085] Em algumas formas de realização, os peptídeos da presente invenção podem ser utilizados para aperfeiçoar e/ ou melhorar um distúrbio ósseo (ou utilizados em um método para aperfeiçoar e/ ou melhorar um distúrbio ósseo). Em alguns casos, os peptídeos da presente invenção podem ser utilizados para prevenir um distúrbio ósseo, em algum outro caso, os peptídeos da presente invenção podem ser utilizados para tratar um distúrbio ósseo, em alguns outros casos, os peptídeos da presente invenção podem ser usados para prevenir e tratar um distúrbio ósseo.
[086] Como aqui utilizado, a expressão “distúrbio ósseo” refere-se a qualquer uma de várias doenças que causam várias anormalidades ou deformidades de
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25/64 um ou mais ossos e/ ou células ósseas. Exemplos de distúrbios ósseos incluem: osteoporose, raquitismo, osteomalácia, osteogênese imperfeita, doença do osso de mármore (osteopetrose), displasia fibrosa, osteoporose pós-menopausa, osteoporose senil em homens e mulheres, osteoporose induzida por glicocorticoides, osteoporose induzida por imobilização, osteoporose induzida por ausência de peso, osteoporose póstransplante, osteoporose migratória, osteoporose idiopática, osteoporose juvenil, Doença de Paget, hiperparatiroidismo crônico, hipertiroidismo, artrite reumatoide, doença de Gorham-Stout, síndrome de McCune-Albright, metástases osteolíticas de vários cânceres ou mieloma múltiplo.
[087] Como usado aqui, a expressão “distúrbios ósseos” também inclui perda de massa óssea, fragilidade óssea geral, degeneração articular, fraturas não unidas, problemas ortopédicos e dentários causados por diabetes, periimplantite, respostas deficientes a enxertos ósseos/ implantes/ materiais substitutos ósseos, doenças periodontais, envelhecimento esquelético, ossos fraturado, defeitos ósseos, transplante ósseo, enxertos ósseos, câncer ósseo, substituições articulares, reparo articular, fusão, reparo de facetas, degeneração óssea, implantes e reparos dentários, déficits de medula óssea e outras condições associadas com osso e tecido ósseo. Os defeitos ósseos podem ser uma falha, deformação e/ ou uma fratura não consolidada em um osso. As distúrbios ósseos também incluem osteopatia em pacientes acromegálicos, doença óssea relacionada à fibrose cística, doença óssea adinâmica, osteodistrofia renal associada à doença renal crônica, doença óssea associada à cistinose e doença óssea associada à hiperoxalúria.
[088] A degeneração óssea pode ser devida a osteopenia ou osteoporose (por exemplo, o paciente sofre de osteoporose geriátrica ou senil, com osteoporose pósmenopausa, etc.) ou devido ao nanismo.
[089] As substituições articulares que podem ser tratadas incluem vertebral, joelho, quadril, tarso, falange, cotovelo, tornozelo e/ ou outras articulações articulares ou suas substituições. Os reparos articulares incluem, mas não se limitam a reparos nas articulações vertebrais, no joelho, no quadril, no tarso, na falange, no cotovelo, no tornozelo e na sacroilíaca.
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26/64 [090] Em algumas formas de realização, os peptídeos da presente invenção podem ser utilizados para melhorar a formação óssea (isto é, aumentando a quantidade de osso novo que é colocado ou utilizado em um método para melhorar a formação óssea).
[091] Em algumas outras formas de realização, os peptídeos da presente invenção podem ser utilizados para inibir a reabsorção óssea (isto é, para reduzir a quantidade de osso que é dissolvida) (ou utilizada em um método para inibir a reabsorção óssea) simultaneamente em um sujeito que dela necessite. Exemplos não limitativos de sujeitos para os quais tal tratamento estaria indicado e/ ou seriam benéficos incluem as mulheres (por exemplo, pós-menopáusicas; pré-menopausa) com osteoporose ou baixa massa óssea, homens com osteoporose ou baixa massa óssea, sujeitos com uma fratura de cura, sujeitos submetidos a imobilização prolongada, sujeitos que foram ou são imobilizados durante um período prolongado, sujeitos que provavelmente sofreriam ou experimentariam imobilização prolongada, sujeitos com deficiência de estrogênio, etc., como seria conhecido na técnica.
[092] Em algumas outras formas de realização, os peptídeos da presente invenção podem ser utilizados para indução da deposição e maturação óssea em um sujeito em necessidade do mesmo (por exemplo, um sujeito com um distúrbio ósseo) (ou utilizado em um método para indução de deposição e maturação óssea). Em alguns casos, o peptídeo da presente invenção pode ser utilizado em combinação com um inibidor de reabsorção óssea.
[093] Em alguns aspectos destas formas de realização, o distúrbio ósseo está em um local alvo do sujeito. O local alvo pode ser um espaço intervertebral, uma articulação facetária, um local de uma fratura óssea, ossos da boca, queixo e mandíbula, ou um local de implante.
[094] Demonstrou-se que o HBD1 modula a aquisição de massa óssea e a diferenciação de osteoblastos (Kawai, JBC, 2011; Xi, JBMR, 2014). Em vista disto, é razoável inferir que os fragmentos de HBD1 que retêm as atividades fisiológicas de HBD1 também pode modular a aquisição de massa óssea e a diferenciação dos osteoblastos. Como tal, em algumas formas de realização, os peptídeos da presente
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27/64 invenção podem ser utilizados para inibir a diferenciação de células adiposas (por exemplo, inibição da diferenciação de precursores de células adiposas em adipócitos maduros) no sujeito. Em algumas outras formas de realização, os peptídeos da presente invenção podem ser utilizados para modular a massa gorda em um sujeito.
[095] Em algumas formas de realização, os peptídeos da presente invenção podem ser empregues em métodos de expansão in vitro ou ex vivo de células tronco, realizadas de acordo com protocolos conhecidos na técnica. Assim, a presente invenção fornece um modo de expandir células tronco in vitro ou ex vivo, compreendendo o contato dos peptídeos da presente invenção com células tronco de um sujeito, em que as referidas células tronco são mantidas sob condições em que são reintroduzidas no sujeito. Por exemplo, em algumas formas de realização ex vivo, as células tronco são obtidas de um sujeito, por exemplo, um humano, por exemplo, de sangue periférico, sangue do cordão umbilical ou da medula óssea, e as células tronco são colocadas em contato com o composto da presente invenção fora do corpo do sujeito. As formas de realização ex vivo incluem a obtenção de células tronco de um sujeito e a cultura das células durante um período de tempo antes da utilização (por exemplo, para transplante). Em algumas formas de realização, após contato com os peptídeos da presente invenção, as células são entregues a um sujeito, por exemplo, o mesmo sujeito a partir do qual as células foram isoladas (doação autóloga) ou um sujeito diferente (não autólogo (por exemplo, doação singenética ou alogênica). Exemplos não limitativos de um sujeito para o qual estes métodos seriam indicados ou benéficos inclui um sujeito que tem ou que tenha passado por quimioterapia, um sujeito que esteja ou que tenha passado por radiação, um sujeito com anemia aplástica, um sujeito com mielodisplasia, e qualquer combinação dos mesmos.
[096] Em algumas formas de realização, os usos e métodos aqui definidos compreendem administrar a um sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de um peptídeo como aqui definido para alcançar os efeitos aqui discutidos (por exemplo, para prevenir e/ ou tratar um distúrbio ósseo).
[097] A posologia terapeuticamente eficaz de qualquer peptídeo específico da presente invenção variará de peptídeo para peptídeo, paciente para
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28/64 paciente, e sujeito a sujeito, e dependerá, entre outras coisas, do efeito ou resultado a ser alcançado, da condição do paciente e da rota de administração. Em algumas formas de realização, a dosagem é de cerca de 1 pg/ kg a cerca de 1 mg/ kg. Em algumas outras formas de realização, uma dosagem é de cerca de 1 mg/ kg a cerca de 50 mg/ kg.
[098] Em alguns casos, a dosagem é de cerca de 0,001 mg/ kg, cerca de 0,05 mg/ kg, cerca de 0,1 mg/ kg, cerca de 0,2 mg/ kg, cerca de 0,3 mg/ kg, cerca de 0,4 mg/ kg, cerca de 0,5 mg/ kg, cerca de 0,6 mg/ kg, cerca de 0,7 mg/ kg, cerca de 0,8 mg/ kg, cerca de 0,9 mg/ kg ou cerca de 1,0 mg/ kg, até cerca de 30 mg/ kg, ou cerca de 40 mg/ kg.
[099] Em alguns outros casos, a dosagem é de cerca de 1 mg/ kg, cerca de 2 mg/ kg, cerca de 3 mg/ kg, cerca de 4 mg/ kg, cerca de 5 mg/ kg, cerca de 6 mg/ kg, cerca de 7 mg/ kg, cerca de 8 mg/ kg, cerca de 9 mg/ kg, cerca de 10 mg/ kg, cerca de 11 mg/ kg, cerca de 12 mg/ kg, cerca de 13 mg/ kg, cerca de 14 mg/ kg, cerca de 15 mg/ kg, cerca de 16 mg/ kg, cerca de 17 mg/ kg, cerca de 18 mg/ kg, cerca de 19 mg/ kg, cerca de 20 mg/ kg, cerca de 21 mg/ kg, cerca de 22 mg/ kg, cerca de 23 mg/ kg, cerca de 24 mg/ kg, cerca de 25 mg/ kg, cerca de 26 mg/ kg, cerca de 27 mg/ kg, cerca de 28 mg/ kg, cerca de 29 mg/ kg, cerca de 30 mg/ kg, cerca de 31 mg/ kg, cerca de 32 mg/ kg, cerca de 33 mg/ kg, cerca de 34 mg/ kg, cerca de 35 mg/ kg, cerca de 36 mg/ kg, cerca de 37 mg/ kg, cerca de 38 mg/ kg, cerca de 39 mg/ kg, cerca de 40 mg/ kg, cerca de 41 mg/ kg, cerca de 42 mg/ kg, cerca de 43 mg/ kg, cerca de 44 mg/ kg, cerca de 45 mg/ kg, cerca de 46 mg/ kg, cerca de 47 mg/ kg, cerca de 48 mg/ kg, cerca de 49 mg/ kg, ou cerca de 50 mg/ kg ou mais podem ser utilizados.
[0100] Exemplos adicionais de dosagens terapeuticamente eficazes incluem: entre cerca de 1 e cerca de 50 mg/ kg/ 96h; entre cerca de 1 e cerca de 50 mg/ kg/ 48h; entre cerca de 1 e cerca de 50 mg/ kg/ 36h; entre cerca de 1 e cerca de 50 mg/ kg/ 24h; entre cerca de 1 e cerca de 50 mg/ kg/ 12h; entre cerca de 1 e cerca de 25 mg/ kg/ 96h; entre cerca de 1 e cerca de 25 mg/ kg/ 48h; entre cerca de 1 e cerca de 25 mg/ kg/ 36h; entre cerca de 1 e cerca de 25 mg/ kg/ 24h; entre cerca de 1 e cerca de 25 mg/ kg/ 12h; entre cerca de 1 e cerca de 10 mg/ kg/ 96h; entre cerca de 1 e cerca de 10 mg/ kg/ 48h; entre cerca de 1 e cerca de 10 mg/ kg/ 36h; entre cerca de 1 e cerca de 10 mg/
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29/64 kg/ 24h; entre cerca de 1 e cerca de 10 mg/ kg/ 12h; entre cerca de 1 e cerca de 5 mg/ kg/ 96h; entre cerca de 1 e cerca de 5 mg/ kg/ 48h; entre cerca de 1 e cerca de 5 mg/ kg/ 36h; entre cerca de 1 e cerca de 5 mg/ kg/ 24h; entre cerca de 1 e cerca de 5 mg/ kg/ 12h; entre cerca de 0,001 e cerca de 1 mg/ kg/ 96h; entre cerca de 0,001 e cerca de 1 mg/ kg/ 48h; entre cerca de 0,001 e cerca de 1 mg/ kg/ 36h; entre cerca de 0,001 e cerca de 1 mg/ kg/ 24h; e entre cerca de 0,001 e cerca de 1 mg/ kg/ 12h.
[0101] “Administrando concorrentemente” ou “administrar concorrentemente” como aqui utilizado significa que os dois ou mais peptídeos, compostos ou composições são administrados em tempo suficientemente próximo para produzir um efeito combinado (isto é, concorrentemente pode ser simultaneamente ou podem ser dois ou mais eventos que ocorrem dentro de um curto período de tempo antes ou depois de outros, por exemplo, sequencialmente). A administração concomitante simultânea pode ser realizada, por exemplo, misturando os compostos antes da administração, ou administrando os compostos no mesmo momento, mas em locais anatômicos diferentes e/ ou utilizando diferentes vias de administração.
C. Composições Farmacêuticas [0102] Como aqui utilizado, a expressão “agente ativo” refere-se a um peptídeo como aqui definido.
[0103] As expressões “terapeuticamente aceitável”, “terapeuticamente adequada”, “farmaceuticamente aceitável” e “farmaceuticamente adequado” são aqui utilizados indiferentemente e referem-se a um peptídeo, um composto, ou uma composição que é adequado(a) para administração a um sujeito para atingir os efeitos descritos aqui, tal como o tratamento aqui definido, sem efeitos colaterais indevidamente deletérios à luz da gravidade da doença e necessidade do tratamento.
[0104] Os peptídeos descritos acima podem ser formulados para administração em um veículo farmacêutico de acordo com técnicas conhecidas. Ver, por exemplo, Remington, The Science and Pratice of Pharmacy (9a Ed. 1995). Na fabricação de uma composição farmacêutica de acordo com a presente invenção, o peptídeo (incluindo os seus sais fisiologicamente aceitáveis) é tipicamente misturado com, inter alia, um veículo aceitável. O veículo deve, evidentemente, ser aceitável no
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30/64 sentido de ser compatível com quaisquer outros ingredientes na composição e não deve ser prejudicial para o paciente. O veículo pode ser um sólido ou líquido, ou ambos, e de preferência formulado com o peptídeo como uma formulação de dose unitária, por exemplo, um comprimido, que pode conter desde cerca de 0,01 ou cerca de 0,5% a cerca de 95% ou cerca de 99% em peso do peptídeo. Um ou mais compostos ativos podem ser incorporados nas composições da presente invenção, as quais podem ser preparadas por qualquer uma das técnicas bem conhecidas de farmácia compreendendo a mistura dos componentes, opcionalmente incluindo um ou mais ingredientes acessórios.
[0105] A composição da presente invenção inclui as adequadas para administração oral, retal, tópica, bucal (por exemplo, sublingual), vaginal, parentérica (por exemplo, subcutânea, intramuscular, intradérmica ou intravenosa), tópica (isto é, ambas as superfícies da pele e da mucosa, incluindo superfícies das vias aéreas) e administração transdérmica, embora a via mais adequada em qualquer caso particular dependa da natureza e gravidade da condição a ser tratada e da natureza do peptídeo particular que esta ser utilizado.
[0106] As composições adequadas para administração oral podem ser apresentadas em unidades discretas, tais como cápsulas, pílulas, pastilhas ou comprimidos, cada um contendo uma quantidade predeterminada do peptídeo; como um pó ou grânulos; como uma solução ou uma suspensão em um líquido aquoso ou não aquoso; ou como uma emulsão óleo-em-água ou água-em-óleo. Tais composições podem ser preparadas por qualquer método de farmácia adequado que inclua a etapa de associar o peptídeo e um veículo adequado (que pode conter um ou mais ingredientes acessórios como notado acima). Em geral, as composições da presente invenção são preparadas misturando uniformemente e intimamente o peptídeo com um veículo sólido finamente dividido ou líquido, ou ambos, e depois, se necessário, moldando a mistura resultante. Por exemplo, um comprimido pode ser preparado por compressão ou moldagem de um pó ou grânulos contendo o peptídeo, opcionalmente com um ou mais ingredientes acessórios. Os comprimidos prensados podem ser preparados por compressão, em uma máquina adequada, do composto em uma forma de fluxo livre, tal
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31/64 como um pó ou grânulos opcionalmente misturados com um aglutinante, lubrificante, diluente inerte e/ ou tensoativo/ agente(s) dispersante(s) de superfície.. Os comprimidos moldados podem ser feitos por moldagem, em uma máquina adequada, do composto em pó umedecido com um ligante líquido inerte.
[0107] As composições adequadas para administração bucal (sublingual) incluem pastilhas compreendendo o peptídeo em uma base aromatizada, de um modo geral sacarose e goma arábica ou tragacanto; e pastilhas compreendendo o peptídeo em uma base inerte tal como gelatina e glicerina ou sacarose e acácia.
[0108] As composições da presente invenção adequadas para administração parentérica compreendem soluções injetáveis aquosas e não aquosas estéreis do peptídeo, preparações essas que são preferencialmente isotônicas com o sangue do receptor pretendido. Estas preparações podem conter anti-oxidantes, tampões, bacteriostatos e solutos que tornam a composição isotônica com o sangue do receptor pretendido. Suspensões estéreis aquosas e não aquosas podem incluir agentes de suspensão e agentes espessantes. A composição pode ser apresentada em recipientes de dose unitária ou multidose, por exemplo ampolas e frascos selados, e pode ser armazenada em uma condição liofilizada (freeze-dried) requerendo apenas a adição do veículo líquido esterilizado, por exemplo, solução salina ou água-para-injeção imediatamente antes do uso. Soluções e suspensões para injeção extemporânea podem ser preparadas a partir de pós, grânulos e comprimidos estéreis do tipo anteriormente descrito. Por exemplo, em um aspecto da presente invenção, é fornecida uma composição estéril, estável e injetável compreendendo um peptídeo como aqui definido, ou um sal do mesmo, em uma forma de dosagem unitária em um recipiente selado. O peptídeo ou sal fornecido na forma de um liofilizado que é capaz de ser reconstituído com um veículo farmaceuticamente aceitável adequado para formar uma composição líquida adequada para a sua injeção em um sujeito. A forma de dosagem unitária compreende tipicamente de cerca de 10 mg a cerca de 10 gramas do peptídeo ou sal. Quando o peptídeo ou sal é substancialmente insolúvel em água, pode ser empregue uma quantidade suficiente de agente emulsionante que é fisiologicamente aceitável em quantidade suficiente para emulsionar o composto ou sal em um veículo aquoso. Um tal
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32/64 agente emulsionante útil é a fosfatidil colina.
[0109] As composições adequadas para administração retal são preferencialmente apresentadas como supositórios de dose unitária. Estes podem ser preparados misturando o peptídeo como aqui definido com um ou mais veículos sólidos convencionais, por exemplo manteiga de cacau, e depois modelando a mistura resultante.
[0110] As composições adequadas para aplicação tópica na pele tomam preferencialmente a forma de um unguento, creme, loção, pasta, gel, spray, aerossol ou óleo. Os veículos que podem ser utilizados incluem vaselina, lanolina, polietileno glicois, álcoois, potenciadores transdérmicos e combinações de dois ou mais dos mesmos.
[0111] Composições adequadas para administração transdérmica podem ser apresentadas como emplastos discretos adaptados para permanecerem em contato íntimo com a epiderme do receptor durante um período de tempo prolongado. As composições adequadas para administração transdérmica podem também ser administradas por iontoforese (ver, por exemplo, Pharmaceutical Research 3 (6): 318 (1986)) e tipicamente tomam a forma de uma solução aquosa opcionalmente tamponada do peptídeo como aqui definido. As composições adequadas compreendem tampão citrato ou bis\tris (pH 6) ou etanol/ água e contêm de 0,1 M a 0,2M de ingrediente ativo.
[0112] Além disso, a presente invenção fornece formulações lipossômicas do peptídeo aqui divulgado e sais dos mesmos. A tecnologia para formar suspensões lipossômicas é bem conhecida na técnica. Quando o peptídeo como aqui definido ou o sal do mesmo é um sal solúvel em água, utilizando tecnologia convencional de lipossomas, o mesmo pode ser incorporado em vesículas lipídicas. Em tal caso, devido à solubilidade em água do peptídeo ou sal, o peptídeo ou sal será substancialmente arrastado dentro do centro hidrofílico ou núcleo dos lipossomas. A camada lipídica utilizada pode ser de qualquer composição convencional e pode conter colesterol ou pode ser isenta de colesterol. Quando o peptídeo ou sal de interesse é insolúvel em água, empregando novamente a tecnologia convencional de formação de lipossomas, o sal pode ser substancialmente arrastado dentro da bicamada lipídica
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33/64 hidrofóbica que forma a estrutura do lipossoma. Em qualquer dos casos, os lipossomas que são produzidos podem ser reduzidos em tamanho, como através da utilização de técnicas padrão de sonicação e homogeneização.
[0113] As formulações lipossômicas contendo os agentes ativos aqui revelados ou os sais dos mesmos, podem ser liofilizadas para produzir um liofilizado que pode ser reconstituído de um veículo farmaceuticamente aceitável, tal como água, para regenerar uma suspensão lipossomal.
[0114] Outras composições farmacêuticas podem ser preparadas a partir do agente ativo insolúvel em água aqui descrito, ou sais dos mesmos, tais como emulsões de base aquosa. Em tal caso, a composição conterá uma quantidade suficiente de agente emulsionante farmaceuticamente aceitável para emulsionar a quantidade desejada do agente ativo ou sal do mesmo. Agentes emulsionantes particularmente úteis incluem fosfatidilcolinas e lecitina.
[0115] Em algumas formas de realização, os peptídeos da presente invenção podem ser administrados a um sujeito em necessidade do mesmo utilizando um dispositivo médico, em particular utilizando dispositivos médicos ortopédicos. Exemplos de dispositivos médicos, que podem ser úteis para a administração dos peptídeos da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, esponjas (por exemplo, esponjas de colágeno, esponjas de gelatina, ou semelhantes), gaze, sonda, stents, gaiolas (por exemplo, gaiolas intervertebrais, gaiolas de fusão ou similares), cimento ósseo, misturadores ósseos, substitutos ósseos, pinos, âncoras, botões, próteses, parafusos (por exemplo, parafusos facetados, sistemas de parafusos pediculares, parafusos para ossos ou similares), espaçadores, pregos intramedulares, hastes (por exemplo, hastes do quadril ou similares), implantes personalizados, placas (por exemplo, placas de úmero, placas de pulso, placas de rádio, placas cervicais, placas lombares ou similares) e produtos de trauma. Nestas formas de realização, os peptídeos da presente invenção podem ser incorporados nos materiais utilizados para fazer o dispositivo médico ou podem ser aplicados nos materiais utilizados para fabricar os dispositivos médicos ou no próprio dispositivo médico.
[0116] Em algumas outras formas de realização, os peptídeos da
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34/64 presente invenção podem ser administrados a um sujeito em necessidade do mesmo, utilizando um dispositivo de entrega, tal como uma partícula (por exemplo, nanopartículas ou micropartículas) ou um sistema de encapsulação (por exemplo, microcápsulas, microesferas). Em alguns casos, os peptídeos da presente invenção podem ser dispersos através dos materiais que formam os sistemas de distribuição, tais como, por exemplo, cadeias poliméricas, ou podem estar localizados em poros ou cavidades formadas no sistema de entrega. Em alguns casos, a liberação dos peptídeos de tais sistemas de liberação pode ser controlada (isto é, liberação lenta, liberação prolongada ou liberação controlada). Exemplos de partículas e partículas e sistemas de encapsulação que podem ser utilizados para administrar os peptídeos da presente invenção são bem conhecidos na técnica.
[0117] Além do(s) composto(s) ativo(s), as composições farmacêuticas podem conter outros aditivos, tais como aditivos de ajuste de pH. Em particular, agentes de ajuste de pH úteis incluem ácidos, tais como ácido clorídrico, bases ou tampões, tais como lactato de sódio, acetato de sódio, fosfato de sódio, citrato de sódio, borato de sódio ou gluconato de sódio. Além disso, as composições podem conter conservantes microbianos. Conservantes microbianos úteis incluem metilparabeno, propilparabeno e álcool benzílico. O conservante microbiano é tipicamente empregado quando a formulação é colocada em um frasco projetado para uso em multidose.
[0118] Em algumas formas de realização, a presente tecnologia fornece kits compreendendo um ou mais peptídeos como aqui definidos em conjunto com instruções para utilização do kit de acordo com as aplicações aqui definidas.
[0119] A identificação de peptídeos, compostos, composições, métodos, utilizações e kits equivalentes estão bem dentro da capacidade de um técnico no assunto e não exigiria mais do que experimentação de rotina, à luz dos ensinamentos da presente descrição. A prática da invenção será ainda mais completamente compreendida a partir dos exemplos seguintes, que são aqui apresentados apenas para ilustração e não devem ser interpretados como limitativos da invenção de qualquer forma.
Exemplos [0120] Os exemplos abaixo são dados de modo a ilustrar a prática de
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35/64 várias formas de realização da presente tecnologia. Eles não pretendem limitar ou definir todo o escopo desta tecnologia. Deve ser apreciado que a tecnologia não está limitada às formas de realização particulares descritas e ilustradas aqui, mas inclui todas as modificações e variações que caem dentro do escopo da invenção, como definido nas formas de realização anexas.
Exemplo 1: Efeito de fragmentos de EIBD1 na expressão de osteocalcina durante diferenciação de osteoblastos in vitro [0121] Os peptídeos foram fabricados de acordo com um processo padrão de fabricação em química peptídica por síntese peptídica em fase sólida (SPPS) usando a estratégia Fmoc (9-fluorenilmetiloxicarbonila) (Merrifield, R.B. Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. Chem Soc. 1963, 85, 2149-2154). A identidade dos peptídeos foi verificado por LC-MS. A pureza (pelo menos 95%) e ο conteúdo líquido de peptídeos dos peptídeos foram determinados por RP-HPLC e análise elementar, respectivamente.
[0122] Cada peptídeo foi testado em um ensaio biológico medindo a sua capacidade para estimular a diferenciação de células osteoblásticas ao longo de um intervalo de 18 a 21 dias (Tabela 8) ou um intervalo de 14 a 15 dias (Tabela 9) como avaliado pela estimulação da síntese proteica de osteocalcina. As células de osteoblastos MC-3T3 El clone 4 (CL4) foram obtidas a partir de ATCC (Manassas, VA, EUA). As células foram cultivadas em a-MEM contendo 10% de soro bovino fetal (FBS; Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EUA). Após a confluência, o meio de cultura foi mudado para meio de diferenciação (DM), que continha 10% de FBS mais 50 pg/ mL de ácido ascórbico e 4 mM de β-glicerol fosfato, com ou sem um peptídeo teste (1 pg/ mL na Tabela 8 ou 1 pmol/ L na Tabela 9). O DM fresco, com ou sem peptídeo teste, foi aplicado a cada 72 horas. As monocamadas celulares foram submetidas a lise em um tampão de ensaio de radioimunoprecipitação modificado (RIPA). A proteína celular total nos lisados foi determinada usando BCA (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EUA). As proteínas celulares são separadas em gel de SDS-PAGE e transferidas para a membrana de PVDF para análise. A detecção de osteocalcina foi realizada utilizando anticorpo anti-osteocalcina na diluição 1: 200 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa
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Cruz, CA, EUA) ou diluição 1: 3.000 (NPT Inc., Chapel Hill, Carolina do Norte, EUA) e visualizada utilizando quimioluminescência aumentada (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EUA).
[0123] Nesta série de experimentos, fragmentos de HBD1 de vários comprimentos foram testados quanto à sua potência em um bioensaio de diferenciação de osteoblastos in vitro. Os resultados apresentados nas Tabelas 8 e 9 mostram que, surpreendentemente, alguns fragmentos tão curtos quanto 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos de comprimento exibem potência neste ensaio. A deleção dos aminoácidos R, L e do primeiro K no C terminal do peptídeo, tais como: HBD1 (1-12), HBD1 (1-11), HBD1 (3-11), HBD1 (4-11) e HBD1 (4-10) resultou em peptídeos biologicamente ativos. De um modo semelhante, as deleções de K, H e H no N terminal do peptídeo, tais como: HBD1 (3-13) e HBD1 (4-13) também resultaram em alguma atividade biológica preservada. Combinando deleções tanto no N terminal como no C terminal do peptídeo, o fragmento ativo mais curto foi o HBD1 (5-10), um peptídeo com 6 aminoácidos, conforme mostrado na SEQ ID NO: 14.
Tabela 8: Capacidade dos peptídeos em estimular a diferenciação de células osteoblásticas
Fragmento Sequência Peptídica Aumento em vezes vs DM +
Controle DM 1
HBD1 (1-13) KHHLGLEEPKKLR + 3,28 + 0,72
HBD1 (2-13) HHLGLEEPKKLR + 3,45 + 0,46
HBD1 (3-13) HLGLEEPKKLR + 3,04 + 0,66
HBD1 (4-13) LGLEEPKKLR + 3,91+0,88
HBD1 (1-12) KHHLGLEEPKKL + 4,05 + 0,95
HBD1 (1-11) KHHLGLEEPKK + 3,91+0,60
HBD1 (3-10) HLGLEEPK + 4,09 + 0,87
HBD1 (3-9) HLGLEEP + 2,01+0,30
HBD1 (3-12) HLGLEEPKKL + 4,25 + 0,60
Tabela 9: Capacidade dos peptídeos em estimular a diferenciação de células
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37/64 osteoblásticas
Fragmento Sequência Peptídica IliMiilllll Aumento em vezes vs DM +
Controle DM 1
HBD1 (3-11) HLGLEEPKK + 2,51+0,42
HBD1 (4-11) LGLEEPKK + 2 93 ± 0,54
HBD1 (5-11) GLEEPKK + 2,03 + 0,68
HBD1 (4-10) LGLEEPK + 1,83 + 0,52
HBD1 (5-10) GLEEPK + 1,83 + 0,53
HBD1 (4-9) LGLEEP + 1,29 + 0,23
HBD1 (2-11) HHLGLEEPKK + 3,28 + 0,36
Exemplo 2: Efeitos de várias doses de fragmentos HBD1 sobre a expressão de osteocalcina durante a diferenciação dos osteoblastos in vitro [0124] O peptídeo HBD1 (3-11) tal como apresentado na SEQ ID NO: 10 foi fabricado de acordo com um processo de fabricação convencional em química peptídica por síntese peptídica em fase sólida (SPPS) utilizando a estratégia Fmoc (9fluorenilmetiloxicarbonila) (Merrifield, R. B. Solid phase peptide synthesis I. The synthesis of a tetrapeptide J. Am. Chem. Soc. 1963, 85, 2149-2154). A identidade do peptídeo foi verificada por LC-MS. A pureza (pelo menos 95%) e a quantidade líquida de peptídeo foram determinados por RP-HPLC e análise elementar, respectivamente.
[0125] O peptídeo foi testado a diferentes concentrações em um ensaio biológico que mede a sua capacidade para estimular a diferenciação de células de osteoblastos ao longo de um intervalo de 18 dias, tal como avaliado pela estimulação da síntese proteica de osteocalcina. As células de osteoblastos MC-3T3 El clone 4 (CL4) foram obtidas a partir de ATCC (Manassas, VA, EUA). As células foram cultivadas em a-MEM contendo 10% de soro bovino fetal (FBS; Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EUA). Após a confluência, o meio de cultura foi mudado para meio de diferenciação (DM), que continha 10% de FBS mais 50 pg/ mL de ácido ascórbico e 4 mM de β-glicerol fosfato, com ou sem uma dose ascendente do peptídeo de 0,1 pg/ mL a 4 pg/ mL. O MS fresco, com ou sem o peptídeo, foi aplicado a cada 72 horas. As
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38/64 monocamadas celulares foram submetidas a lise em um tampão de ensaio de radioimunoprecipitação modificado (RIPA). A proteína celular total nos lisados foi determinada usando BCA (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EUA). As proteínas celulares são separadas em gel de SDS-PAGE e transferidas para a membrana de PVDF para análise. A detecção de osteocalcina foi realizada utilizando anticorpo antiosteocalcina a uma diluição de 1: 200 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, EUA) e visualizada utilizando quimioluminescência melhorada (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EUA).
[0126] Neste experimento, o HBD1 (3-11) foi testado em várias doses no ensaio de diferenciação de osteoblastos. Os resultados deste experimento estão resumidos na Tabela 10 abaixo. Os resultados mostram que este peptídeo melhorou a diferenciação de osteoblastos de uma forma dependente da dose, exibindo alta potência nas doses mais elevadas testadas. Isto sugere um potencial terapêutico para HBD1 (311) em distúrbios ósseos, tanto como um peptídeo isolado, um análogo do mesmo, ou como uma sequência em um peptídeo maior, ou conjugado a uma porção química, e administrado sozinho ou em combinação com anabólicos ou agentes anti-reabsorção. Tabela 10: Capacidade de diversas doses do peptídeo HBD1 (3-11) em estimular a diferenciação de células osteoblásticas
Sequência Dose (ug/ Aumento em vezes
| Fragmento i Potência
Peptídica ml.) vs DM + SD
j Controle i DM 1
| HBD1 (3-11) _ _HLGLEEPKK_ _ 0,1 - ±0,15
§ ; 0,25 + 1,81+0,15
§ ; 0,5 + 2,5 + 0,39
§ ; 1,0 + 3,28 + 0,72
§ ; 2,0 + 3,67 + 0,83
§ ; 3,0 + 3,91+0,87
§ ; 4,0 + 4,59 + 1,19
Exemplo 3: Efeito de análogos de fragmento de HBD1 com substituições de alanina sobre a expressão de osteocalcina durante a diferenciação in vitro de osteoblastos
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39/64 [0127] Os peptídeos foram preparados de acordo com um processo de fabricação convencional em química peptídica por síntese de peptídeos em fase sólida (SPPS) utilizando a estratégia Fmoc (9-fluorenilmetiloxicarbonila) (Merrifield, R. B. Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. Chem Soc. 1963, 85, 2149-2154). A identidade dos peptídeos foi verificada por LC-MS. A pureza (pelo menos 95%) e o conteúdo líquido de peptídeos dos peptídeos foram determinados por RP-HPLC e análise elementar, respectivamente.
[0128] Cada peptídeo foi testado em um ensaio biológico que mede a sua capacidade para estimular a diferenciação de células osteoblásticas ao longo de um intervalo de 15 dias, como avaliado pela estimulação da síntese proteica de osteocalcina. As células de osteoblastos MC-3T3 El clone 4 (CL4) foram obtidas a partir de ATCC (Manassas, VA, EUA). As células foram cultivadas em a-MEM contendo 10% de soro bovino fetal (FBS; Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EUA). Após a confluência, o meio de cultura foi mudado para meio de diferenciação (DM), que continha 10% de FBS mais 50 pg/ mL de ácido ascórbico e 4 mM de βglicerol fosfato, com ou sem um peptídeo teste (1 pg/ mL). O MS fresco, com ou sem peptídeo teste, foi aplicada a cada 72 horas durante 15 dias. As monocamadas celulares foram submetidas a lise em um tampão de ensaio de radioimunoprecipitação modificado (RIPA). A proteína celular total nos lisados foi determinada usando BCA (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EUA). As proteínas celulares são separadas em gel de SDS-PAGE e transferidas para a membrana de PVDF para análise. A detecção de osteocalcina foi realizada utilizando anticorpo anti-osteocalcina a uma diluição de 1: 200 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, EUA) e visualizada utilizando quimioluminescência melhorada (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EUA).
[0129] Nestes experimentos, foi examinado o efeito da substituição de cada aminoácido do peptídeo de HBD1 (3-11) parental como estabelecido na SEQ ID NO: 10. Cada peptídeo monossubstitução com Ala foi sintetizado e testado no ensaio de diferenciação de osteoblastos in vitro. Os resultados apresentados na Tabela 11 indicam que as substituições de alanina de HBD1 (3-11) nas posições 3, 8, 9, 10 ou 11 geraram compostos com atividade biológica residual. As substituições de laninas nas posições 4,
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5, 6 ou 7 resultaram em diminuição da atividade biológica, sugerindo que as cadeias laterais de L (4) G (5), L (6) e E (7) são importantes para a atividade biológica. De um modo geral, estes dados mostram que as substituições de aminoácidos com aminoácidos naturais ou não- naturais pode ser realizada nesta peptídeo com 9 aminoácido de comprimento e podem gerar análogos com atividade biológica preservada ou aumentar. Tabela 11: Capacidade de fragmentos de HBD1 com mono-substituições de Ala para estimular a diferenciação de células osteoblásticas
SEQID liiBilllllllll Sequência Peptídica Potência Aumento em vezes vs SEQ ID NO: 10
10 HLGLEEPKK + 1
17 Um LGLEEPKK - 0,64 + 0,08
18 H A GLEEPKK - 0,41+0,05
19 HL A LEEPKK - 0,29 + 0,04
20 HLG AEEPKK - 0,38 + 0,05
21 HLGL A EPKK - 0,20 + 0,03
22 HLGLE A PKK + 1,00 + 0,10
23 HLGLEE A KK + 1,12 + 0,11
24 HLGLEEPA K + 1,25 + 0,13
25 HLGLEEPK A + 0,87 + 0,09
Exemplo 5: E FEITOS de fragmento HBD1 análogos com substituições de aminoácidos na expressão de osteocalcina durante a diferenciação in vitro de osteoblastos [0130] Os peptídeos foram preparados de acordo com um processo de fabricação convencional em química peptídica por síntese de peptídeos em fase sólida (SPPS) utilizando a estratégia Fmoc (9-fluorenilmetiloxicarbonila) (Merrifield, R. B. Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. Chem Soc. 1963, 85, 2149-2154). A identidade dos peptídeos foi verificada por LC-MS. A pureza (pelo menos 95%) e o conteúdo líquido de peptídeos dos peptídeos foram determinados por RP-HPLC e análise elementar, respectivamente.
[0131] Cada peptídeo foi testado em um ensaio biológico que mede a
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41/64 sua capacidade de estimular a diferenciação de células osteoblásticas durante um intervalo de 12 dias na Tabela 12, Tabela 15 e Tabela 16 ou um intervalo de 15 dias na Tabela 13 e Tabela 14 conforme avaliado pela estimulação de síntese de proteína osteocalcina. As células de osteoblastos MC-3T3 El clone 4 (CL4) foram obtidas a partir de ATCC (Manassas, VA, EUA). As células foram cultivadas em a-MEM contendo 10% de soro bovino fetal (FBS; Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EUA). Após a confluência, o meio de cultura foi mudado para meio de diferenciação (DM), que continha 10% de FBS mais 50 pg/ mL de ácido ascórbico e 4 mM de βglicerol fosfato, com ou sem um peptídeo teste (1 pmol/L). O MS fresco, com ou sem peptídeo teste, foi aplicado a cada 72 horas. As monocamadas celulares foram submetidas a lise em um tampão de ensaio de radioimunoprecipitação modificado (RIPA). A proteína celular total nos lisados foi determinada usando BCA (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EUA). As proteínas celulares são separadas em gel de SDS-PAGE e transferidas para a membrana de PVDF para análise. A detecção de osteocalcina foi realizada utilizando anticorpo anti-osteocalcina a uma diluição de 1: 3000 (NPT Inc., Chapel Hill, NC, EUA) e visualizada utilizando quimiluminescência melhorada (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EUA).
[0132] Nestes experimentos, o efeito das substituições de aminoácidos nas posições 8, 9, 10 e 11 do peptídeo parental HBD1 (3-11) foi examinado. Cada um dos peptídeos mono ou poli-substituídos foi sintetizado e testado no ensaio de diferenciação de osteoblastos in vitro. Os resultados apresentados nas Tabelas 12, 13 e 14 indicam que as substituições conservativas ou não conservativas produziram peptídeos com atividade biológica preservada ou melhorada quando comparadas com o peptídeo parental HBD1 (3-11).
[0133] Como um exemplo ilustrativo, E (aminoácido acídico) na posição 8 pode ser substituído por R, (aminoácido básico), F, I ou P (aminoácidos hidrofóbicos não polares), ou S (aminoácido polar, não carregado), com todos os peptídeos monosubstituídos na posição 8 sendo biologicamente ativos no ensaio de diferenciação de osteoblastos (ver Tabela 12). Resultados semelhantes foram obtidos realizando substituições de aminoácidos 9 (P), 10, (K) e 11 (K) do peptídeo parental HBD1 (3-11)
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42/64 (Tabelas 12 e 13).
[0134] Curiosamente, algumas substituições geraram peptídeos com potência aumentada quando comparados com o peptídeo parental HBD1 (3-11). Por exemplo, a substituição de K na posição 11 por I, P ou S resultou em peptídeos com 2 a 3 vezes a potência do peptídeo parental HBD1 (3-11), a substituição de K na posição 10 por Q ou Y resultou em peptídeos com 2 a 3 vezes a potência do peptídeo parental HBD1 (3-11).
[0135] Poli-substituições resultaram em peptídeos biologicamente ativos. Por exemplo, a substituição de KK nas posições 10 e 11 gerou peptídeos biologicamente ativos (Tabelas 13 e 14). Em particular, a substituição de KK nas posições 10 e 11 por FV, FQ, FN ou VM resultou em peptídeos com cerca de 3 vezes a potência do peptídeo parental HBD1 (3-11) (Tabela 14).
Tabela 12: Capacidade de fragmentos de HBD1 com substituições de aminoácidos de estimular a diferenciação de células de osteoblastos (intervalo de 12 dias)
SEQ ID Sequência Peptídica Potência Aumento em vezes vs SEQ ID NO: 10 ± SE
10 HLGLEEPKK + 1
26 HLGLERPKK + 1,11
27 HLGLEEPKK + 1,58 + 0,05
28 HLGLEIPKK + 1,42 + 0,13
29 HLGLEPPKK + 1,95 + 0,15
30 HLGLESPKK + 1,40 + 0,32
31 HLGLEERKK + 0,62
32 HLGLEEFKK + 0,58
33 HLGLEELKK + 1,66
34 HLGLEESKK + 1,06
35 HLGLEEDKK + 1,26
36 HLGLEEPFK + 1,23+0,13
37 HLGLEEPPK + 1,19 + 0,2
38 HLGLEEPSK ++ 2,01+0,14
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SEQ ID llllllfiBilllll Sequência Peptídica lliiiiiili Aumento em vezes vs SEQ ID NO: 10 ± SE
39 HLGLEEPDK + 1,31+0,08
40 HLGLEEPKF ++ 2,33 + 0,03
41 HLGLEEPKI ++ 2,60 + 0,56
42 HLGLEEPKP ++ 2,67 + 0,39
43 HLGLEEPS ++ 2,83 + 0,09
44 HLGLEEPKD ++ 2,60 + 0,18
Tabela 13: Capacidade de fragmentos de HBD1 com substituições de aminoácidos de estimular a diferenciação de células osteoblásticas (intervalo de 15 dias)
SEQ ID Sequência Peptídica Aumento em vezes vs DM + SE
Controle DM 1
10 HLGLEEPKK + 2,80 + 0,13
45 HLGLEEPIK + 2,27 + 0,05
46 HLGLEEPVK + 3,83 + 1,75
47 HLGLEEPQK + 1,69 + 0,20
48 HLGLEEPTK + 4,65 + 1,44
49 HLGLEEPEK + 1,72 + 0,37
50 HLGLEEPKH + 2,56 + 1,09
51 HLGLEEPKR + 2,45 + 0,51
52 HLGLEEPKL + 3,38 + 0,19
53 HLGLEEPKM + 4,03 + 0,25
54 HLGLEEPKW + 1,54 + 0,91
55 HLGLEEPKV + 4,05 + 0,50
56 HLGLEEPKQ + 5,16 + 0,34
57 HLGLEEPKN + 3,58 + 1,01
58 HLGLEEPKY + 3,10 + 0,08
59 HLGLEEPKT + 2,38 + 0,41
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SEQ ID llllllfiBilllll Sequência Peptídica lliiiiiili Aumento em vezes vs DM + SE
60 HLGLEEPKE + 3,04 + 0,62
61 HLGLEEPSP + 3,48 + 1,28
62 HLGLEEPSS + 3,83+0,28
Tabela 14: Capacidade de fragmentos de HBD1 com substituições de aminoácidos de estimular a diferenciação de células osteoblásticas (intervalo de 15 dias)
SEQ ID ΙΙΙΙΙΙΙΙΟΙϊΙΙΙΙΙΙΙΙΙ Sequência Peptídica II· Aumento em vezes vs DM ± S D
Controle DM 1
10 HLGLEEPKK + 2,90 + 0,86
97 HLGLEEPYK ++ 6,62 + 1,92
98 HLGLEEPQK + 4,14 + 1,15
99 HLGLEEPNK + 1,46 + 0,80
100 HLGLEEPSF ++ 6,76 + 1,32
101 HLGLEEPSV ++ 6,32 + 1,27
102 HLGLEEPLM + 4,23 + 0,93
103 HLGLEEPLY + 2,33 + 0,63
104 HLGLEEPLN - 1,07 + 0,20
105 HLGLEEPLQ - 0,64 + 0,22
106 HLGLEEPFV ++ 6,98 + 1,3
107 HLGLEEPFQ ++ 7,74 + 0,73
108 HLGLEEPFN ++ 7,14 + 2,20
109 HLGLEEPVM ++ 6,54 + 0,57
110 HLGLEEPVN + 2,49 + 0,93
111 HLGLEEPMK + 4,79 + 1,64
[0136] Nestes experimentos, o efeito de substituições de aminoácidos nas posições 3, 4, 5 e 6 do peptídeo parental HBD1 (3-11) foi também examinado. Cada um dos peptídeos substituídos foi sintetizado e testado no ensaio de diferenciação de
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45/64 osteoblastos in vitro. Os resultados apresentados na Tabela 15 indicam que as substituições conservativas ou não conservativas produziram peptídeos com atividade biológica preservada ou melhorada quando comparadas com o peptídeo parental HBD1 (3-Π).
Tabela 15: Capacidade de fragmentos de HBD1 com substituições de aminoácidos de estimular a diferenciação de células de osteoblastos (intervalo de 12 dias)
SEQ ID Sequência Peptídica Aumento em vezes vs DM + SD
Controle DM 1
10 HLGLEEPKK + 3,19 + 1,00
89 KLGLEEPKK + 3,56 + 1,91
90 HVGLEEPKK + 2,40+1,03
91 HLPLEEPKK + 3,75 + 1,60
92 HLGIEEPKK + 2,70+1,43
93 NLGLEEPKK + 3,21 + 1,56
94 HTGLEEPKK + 3,01 + 1,06
95 HLKLEEPKK + 2,65 + 0,72
96 HLGSEEPKK + 3,15 + 1,82
[0137] O efeito das substituições de aminoácidos na posição 10 de um peptídeo HBD1 (3-11) truncado, nomeadamente HBD1 (3-10), foi examinado. Os peptídeos substituídos foram sintetizados e testados no ensaio de diferenciação de osteoblastos in vitro. Os resultados apresentados na Tabela 16 indicam que a substituição conservativa na posição 10 de HBD1 (3-10) produziu peptídeos com atividade biológica aumentada quando comparada com o peptídeo HBD1 (3-11). Em particular, a substituição de K na posição 10 de HBD1 (3-10) resultou em peptídeos com cerca de 3 vezes a potência do parental HBD1 (3-11).
Tabela 16: Capacidade de fragmentos de HBD1 com substituições de aminoácidos de estimular a diferenciação de células de osteoblastos (intervalo de 12 dias)
SEQ ID Sequência Peptídica Potência Aumento em vezes vs DM + SD
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SEQ ID llllllfiBilllll Sequência Peptídica lliiiiiili Aumento em vezes vs DM ± SD
Controle DM 1
10 HLGLEEPKK + 2,90 + 0,86
112 HLGLEEPR ++ 5,84 + 1,01
113 HLGLEEPH +++ 8,90+1,31
[0138] Em conclusão, a substituição de aminoácidos nas posições 3, 4, 5,
6, 8, 9, 10 e 11 de HBD1 (3-11), bem como o truncamento do aminoácido na posição 11 e a substituição do aminoácido na posição 10 gerou peptídeos bioativos, sendo alguns deles ainda mais potentes que o próprio HBD1 (3-11). Mono-substituições no N terminal ou mono- ou poli-substituições no C terminal do peptídeo com aminoácidos naturais ou não-naturais poderíam, portanto, ser uma estratégia válida para projetar análogos potentes de HBD1 (3-11), o projeto adicional de análogos é realizada de acordo com o estado da técnica comum por cientistas técnicos no campo da química peptídica.
Exemplo 6: Efeitos de análogos de fragmentos de EIBD1 PEGuilados na expressão de osteocalcina durante diferenciação de osteoblastos in vitro [0139] As cadeias principais de peptídicos foram fabricados de acordo com um processo de fabricação convencional em química peptídica por síntese peptídica em fase sólida (SPPS) utilizando a estratégia Fmoc (9fluorenilmetiloxicarbonila) (Merrifield, R. B. Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem, Soc. 1963, 85, 2149-2154). A identidade dos peptídeos foi verificada por LC-MS. A pureza (pelo menos 95%) e o conteúdo líquido de peptídeos dos peptídeos foram determinados por RP-UPLC e análise elementar, respectivamente.
[0140] Os peptídeos foram modificados com mPEG-maleimida de 20 kDa (NOF, Japão) acoplado a um resíduo de cisteína no N ou C terminal. O peptídeo mono-PEGuilado bruto resultante foi purificado em coluna de troca catiônica. As frações contendo os peptídeos PEGuilados foram reunidas e diafiltradas (utilizando um filtro de polietersulfano (PES) com um NMWL de 5.000 Da) com cloreto de sódio a
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0,9% até a condutividade ser estável. Os peptídeos PEGuilados purificados foram analisados por MALDI-MS e RP-UPLC de modo a determinar a identidade e a pureza (pelo menos 97%) destes peptídeos modificados. A falta de peptídeos não modificados (peptídeos não PEGuilados) foi verificada por SDS-PAGE. As concentrações de peptídeo PEGuilado foram determinadas por UV.
[0141] Cada peptídeo foi testado em um ensaio biológico que mede a sua capacidade de estimular a diferenciação de células osteoblásticas ao longo de um intervalo de 18 a 21 dias, como avaliado pela estimulação da síntese proteica de osteocalcina. As células de osteoblastos MC-3T3 El clone 4 (CL4) foram obtidas a partir de ATCC (Manassas, VA, EUA). As células foram cultivadas em a-MEM contendo 10% de soro bovino fetal (FBS; Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EUA). Após a confluência, o meio de cultura foi mudado para meio de diferenciação (DM), que continha 10% de FBS mais 50 pg/ mL de ácido ascórbico e 4 mM de βglicerol fosfato, com ou sem um peptídeo teste (2 pg/ mL). O MS fresco, com ou sem peptídeo teste, foi aplicado a cada 72 horas. As monocamadas celulares foram submetidas a lise em um tampão de ensaio de radioimunoprecipitação modificado (RIPA). A proteína celular total nos lisados foi determinada usando BCA (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EUA). As proteínas celulares são separadas em gel de SDS-PAGE e transferidas para a membrana de PVDF para análise. A detecção de osteocalcina foi realizada utilizando anticorpo anti-osteocalcina a uma diluição de 1: 200 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, EUA) e visualizada utilizando quimioluminescência melhorada (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EUA).
[0142] Nestes experimentos, foi examinado o efeito da conjugação de HBD1 (3-11), HBD1 (1-13) ou HBD1 (2-11) com uma cadeia de polietileno glicol (PEG). Cada um dos peptídeos PEGuilados foi sintetizado conjugado e testado no ensaio de diferenciação de osteoblastos in vitro. Como mostrado na Tabela 17, a PEGuilação dos peptídeos (9, 10 ou 13 aminoácidos em comprimento) com um PEG20 no lado N terminal dos compostos peptídicos gerados com atividade semelhante à do peptídeo não conjugado parental de HBD1 (1-13). Curiosamente, a conjugação de PEG20 na extremidade C terminal do peptídeo HBD1 (1-13) com 13 aminoácidos ou do
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48/64 peptídeo HBD1 (2-11) com 10 aminoácidos parece aumentar a potência biológica in vitro.
Tabela 17: Capacidade de fragmentos de HBD1 PEGuilados de estimular a diferenciação de células osteoblásticas
SEQ ID ΙΙΙΙΙΙΙΙ:|·ΙΙΙΙΙΙΙΙΙ Sequência Peptídica Potência Aumento em vezes vs SEQ ID NO: 1 + SE
1 KHHLGLEEPKKLR + 1
63 PEG20-C- KHHLGLEEPKKLR + 1,4 + 0,3
64 KHHLGLEEPKKLR-O PEG20 ++ 2,2 + 0,4
65 PEG20-C-HHLGLEEPKK + 1,4 + 0,1
66 HHLGLEEPKK-C-PEG20 ++ 2,2 + 0,2
67 PEG20-C-HLGLEEPKK + 1,9 + 0,2
[0143] Em conclusão, a PEGuilação dos peptídeos da presente invenção pode ser um método de conjugação adequado para melhorar o perfil farmacocinético enquanto se preserva ou melhora a atividade biológica in vitro.
Exemplo 7: Efeitos de análogos de fragmentos de EIBD1 acilados na expressão de osteocalcina durante diferenciação de osteoblastos in vitro [0144] Os peptídeos foram preparados de acordo com um processo de fabricação convencional em química peptídica por síntese de peptídeos em fase sólida (SPPS) utilizando a estratégia Fmoc (9-fluorenilmetiloxicarbonila) (Merrifield, R. B. Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. Chem Soc. 1963, 85, 2149-2154). A identidade dos peptídeos foi verificada por LC-MS. A pureza (pelo menos 95%) e o conteúdo líquido de peptídeos dos peptídeos foram determinados por RP-UPLC e análise elementar, respectivamente.
[0145] Cada peptídeo acilado foi testado em um ensaio biológico que mede a sua capacidade de estimular a diferenciação de células de osteoblastos durante um intervalo de 18 a 21 dias, como avaliado pela estimulação da síntese proteica de osteocalcina. As células de osteoblastos MC-3T3 El clone 4 (CL4) foram obtidas a
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49/64 partir de ATCC (Manassas, VA, EUA). As células foram cultivadas em α-ΜΕΜ contendo 10% de soro bovino fetal (FBS; Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EUA). Após a confluência, o meio de cultura foi mudado para meio de diferenciação (DM), que continha 10% de FBS mais 50 pg/ mL de ácido ascórbico e 4 mM de βglicerol fosfato, com ou sem um peptídeo teste (1 pg/ L). O MS fresco, com ou sem peptídeo teste, foi aplicado a cada 72 horas. As monocamadas celulares foram submetidas a lise em um tampão de ensaio de radioimunoprecipitação modificado (RIPA). A proteína celular total nos lisados foi determinada usando BCA (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EUA). As proteínas celulares são separadas em gel de SDS-PAGE e transferidas para a membrana de PVDF para análise. A detecção de osteocalcina foi realizada utilizando anticorpo anti-osteocalcina a uma diluição de 1: 200 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, EUA) e visualizada utilizando quimioluminescência melhorada (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EUA).
[0146] Nestes experimentos, o efeito da conjugação do peptídeo HBD1 (3-11) ou do peptídeo HBD1 (2-11) com uma cadeia acila de vários comprimentos foi examinado. Cada um dos peptídeos acilados foi sintetizado e testado no ensaio de diferenciação de osteoblastos in vitro. Como mostrado na Tabela 18, a acilação dos peptídeos (9 ou 10 aminoácidos em comprimento) com 14 a 20 cadeias de carbono (C14 a C20) no lado N terminal dos compostos peptídicos gerados com atividade semelhante àquela do peptídeos parentais não acilados (HBD1 (3-11) e HBD1 (2-11)). A acilação na extremidade C terminal não pareceu alterar a atividade biológica in vitro.
Tabela 18: Capacidade de fragmentos de HBD1 Acilados de estimular a diferenciação de células osteoblásticas
SEQ ID NO: Sequência Peptídica Potência Aumento em vezes vs DM
Controle DM 1
16 HHLGLEEPKK + 3,28 + 0,36
68 C16:0-HHLGLEEPKK + 2,52 + 0,52
69 C18:0-HHLGLEEPKK + 2,48 + 0,27
70 C20:0-HHLGLEEPKK + 2,11+0,11
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SEQ ID NO: Sequência Peptídica Aumento em vezes vs DM
10 HLGLEEPKK + 2,51+0,42
71 C14:0-HLGLEEPKK + 1,98 + 0,22
72 C16:0-HLGLEEPKK + 3,21+0,49
73 C18:0-HLGLEEPKK + 2,93+0,16
74 C20:0-HLGLEEPKK + 5,05 + 0,95
75 C16:0-diácido- HLGLEEPKK + 3,39 + 0,19
76 HLGLEEPKK-C16:0 + 3,18 + 0,31
[0147] Em um experimento separado, o efeito da ciclização foi examinado no peptídeo HBD1 (3-11). O HBD1 (3-11) cíclico foi sintetizado e testado no ensaio de diferenciação de osteoblastos in vitro. A ciclização não pareceu mudar a atividade biológica in vitro.
[0148] Em conclusão, a acilação ou ciclização dos peptídeos da presente invenção pode ser um método adequado para melhorar o perfil farmacocinético enquanto se preserva a atividade biológica in vitro.
Exemplo 8: Efeitos de várias doses de análogos de fragmentos de EIBD1 na expressão de osteocalcina durante diferenciação de osteoblastos in vitro [0149] Os peptídeos foram fabricados de acordo com um processo de fabricação convencional em química de peptídeos por síntese de peptídeos em fase sólida (SPPS) utilizando a estratégia Fmoc (9-fluorenilmetiloxicarbonila) (Merrifield, R. B. Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Chem, Soc. 1963, 85, 2149-2154). A identidade dos peptídeos foi verificada por LCMS. A pureza (pelo menos 95%) e o conteúdo líquido de peptídeos dos peptídeos foram determinados por RP-HPLC e análise elementar, respectivamente.
[0150] Os peptídeos foram testados a diferentes concentrações em um ensaio biológico que mede a sua capacidade de estimular a diferenciação de células de osteoblastos ao longo de um intervalo de 18 dias, tal como avaliado pela estimulação da síntese proteica de osteocalcina. As células de osteoblastos MC-3T3 El clone 4 (CL4)
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51/64 foram obtidas a partir de ATCC (Manassas, VA, EUA). As células foram cultivadas em a-MEM contendo 10% de soro bovino fetal (FBS; Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EUA). Após a confluência, o meio de cultura foi mudado para meio de diferenciação (DM), que continha 10% de FBS mais 50 pg/ mL de ácido ascórbico e 4 mM de β-glicerol fosfato, com ou sem uma dose ascendente do peptídeo. O MS fresco, com ou sem o peptídeo, foi aplicado a cada 72 horas. As monocamadas celulares foram submetidas a lise em um tampão de ensaio de radioimunoprecipitação modificado (RIPA). A proteína celular total nos lisados foi determinada usando BCA (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EUA). As proteínas celulares são separadas em gel de SDS-PAGE e transferidas para a membrana de PVDF para análise. A detecção de osteocalcina foi realizada utilizando anticorpo anti-osteocalcina a uma diluição de 1: 200 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, EUA) e visualizada utilizando quimioluminescência melhorada (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EUA). Os resultados deste experimento estão resumidos nas Tabelas 19 e 20 abaixo.
[0151] Neste experimento, um fragmento de HBD1 (3-11) acilado, um fragmento de HBD1 (3-11) com substituições de aminoácidos no C terminal, bem como um fragmento de HBD1 (3-11) truncado com uma substituição de aminoácido no C terminal (isto é, HBD1 (3-10) com uma substituição de aminoácido no C terminal), tal como identificado nas Tabelas 19, 20 e 21, foram testados em várias doses no ensaio de diferenciação de osteoblastos. Os resultados mostram que esses peptídeos melhoraram a diferenciação de osteoblastos de maneira dose-dependente, exibindo alta potência nas doses mais altas testadas. Isto sugere um potencial terapêutico para HBD1 (3-11) acilado, para análogos C terminais de HBD1 (3-11) e para análogos C terminais de HBD1 (3-10) em distúrbios ósseos.
Tabela 19: Capacidade de várias doses de HBD1 acilado (3-1 1) de estimular a diferenciação de células osteoblásticas
| SEQ ID NO: (xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxvwwvwv Sequência Peptídica KXWVXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXVWWVWV Dose (μΜ) Aumento em vezes vs DM + SD
[ Controle 1 DM 1
| io | HLGLEEPKK 1,0 2,65 ± 0,49
1 73 | C18:0-HLGLEEPKK 1,0 3,46 ± 0,47
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] SEQ ID NO: Sequência Peptídica Dose (μΜ) sssssssssssssssssssssssssssssssssssx Aumento em vezes vs DM + SD sssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssx
173 1 2.0 4,48 + 0,07
173 1 3,0 5,66 + 0,45
Tabela 20: Capacidade de várias doses de análogos de HBD1 (3-11) de estimular a diferenciação de células osteoblásticas
| SEQ ID NO: (xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxvwwww* Sequência Peptídica Dose (μΜ) Aumento em vezes vs DM ± SD
[ Controle DM 1
| io HLGLEEPKK 0,25 1,24 + 0,11
| ίο HLGLEEPKK 0,5 2,43 + 0,49
| ίο HLGLEEPKK 1,0 3,32 + 0,55
1 108 HLGLEEPFN 0,25 3,7 + 0,47
I 108 HLGLEEPFN 0,5 4,80+1,12
1 108 HLGLEEPFN 1,0 6,20+1,64
Tabela 21: Capacidade de várias doses de um análogo de HBD1 (3-10) de estimular a
diferenciação de células osteoblásticas
SEQ ID NO: Sequência Peptídica Aumento em vezes vs DM ± SD
[ Controle 1 DM 1
| io | HLGLEEPKK 0,25 1,23+0,16
| ίο | HLGLEEPKK 0,5 2,34 + 0,45
| ίο | HLGLEEPKK 1,0 3,34 + 0,45
I 113 | HLGLEEPH 0,25 2,99 + 0,53
1 113 | HLGLEEPH 0,5 3,83 + 1,64
I 113 | HLGLEEPH 1,0 4,67 + 0,46
Exemplo 9: Estabilidade dos fragmentos de EIBD1 no plasma humano [0152] Os peptídeos HBD1 (1-13), HBD1 (3-11), HBD1 cíclico (3-11),
HBD1 (1-13) com ácido palmítico no N terminal (C16:0), HBD1 (3-11) com ácido palmítico no N terminal (C16:0)) e HBD1 (3-11) com ácido esteárico no N terminal (Cl8:0) foram fabricados de acordo com um processo de fabricação padrão em química peptídica por síntese peptídica em fase sólida (SPPS) utilizando a estratégia Fmoc (9Petição 870190075665, de 06/08/2019, pág. 323/353
53/64 fluorenilmetiloxicarbonila) (Merrifield, R. B. Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 1963, 85, 2149-2154). A identidade dos peptídeos foi verificada por LC-MS. A pureza (pelo menos 95%) e o conteúdo líquido de peptídeos dos peptídeos foram determinados por RP-HPLC e análise elementar, respectivamente.
[0153] Os peptídeos foram fixados (spike) em 1 pg/ ml (coluna de peptídeo) em plasma humano pré-aquecido com FGEDTA (a 37 °C) e incubados por até 48 horas. Alíquotas de plasma foram extraídas em pontos de tempo específicos (0, 24 e 48 horas após dosagem). A extração foi realizada com acetonitrila : água (75 : 25, v/ v) para HBD1 (1-13), HBD1 (1-13) com ácido palmítico no N terminal (C16:0), HBD1 (311) com ácido palmítico no N terminal (C16:0)) e HBD1 (3-11) com ácido esteárico no N terminal (Cl8:0) ou com acetonitrila : água : ácido fórmico (75 : 25 : 0,1, v/ v/ v) para HBD1 (3-11) e HBD1 cíclico (3-11). Os peptídeos foram analisados utilizando métodos de MS/ MS de eletropulverização de íons positivos de LC (coluna de fase reversa Cl8) desenvolvidos específicos para cada peptídeo. A área do pico em cada ponto de tempo foi expressa como uma porcentagem do valor obtido para o ponto de tempo t = 0 minutos. Os resultados são fornecidos na Tabela 22.
Tabela 22: Estabilidade dos fragmentos de HBD1 no plasma humano
SEQ ID Sequência peptídica Peptídeo parental restante no plasma humano
24 horas após fixação 48 horas após fixação
1 KHHLGLEEPKKLR 29% 18%
78 C16:0- KHHLGLEEPKKLR 58% 52%
10 HLGLEEPKK 92% 87%
77 (HLGLEEPKK) Cíclico 98% 95%
72 C16:0-HLGLEEPKK 94% 87%
73 C18:0-HLGLEEPKK 89% 91%
[0154] Os dados fornecidos acima mostram que o HBD1 (1-13) foi
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54/64 marcadamente degradado no plasma humano (29% e 18% de peptídeo parental restante após 24 e 48 horas de incubação a 37 °C, respectivamente). A acilação N terminal de HBD1 (1-13) com ácido palmitico (SEQ ID NO: 78) melhorou marcadamente a estabilidade do peptídeo parental (52% versus 18% do peptídeo parental remanescente após 48 horas de incubação a 37 °C). Este resultado indica que a acilação no N terminal protege este peptídeo contra a degradação da peptidase no plasma humano. Surpreendentemente, um peptídeo mais curto de 9 aminoácidos HBD1 (3-11) foi muito estável em plasma humano com uma degradação menor detectada após 24 e 48 horas de incubação a 37 °C (92% e 87% de peptídeo parental restante, respectivamente). O HBD1 (3-11) cíclico e N terminal acilado (com ácido palmítico ou esteárico) (SEQ ID NOs: 77, 72 e 73, respectivamente) tiveram um perfil de estabilidade do plasma semelhante ao do peptídeo HBD1 (3-11) linear não conjugado correspondente.
[0155] Como anteriormente mencionado aqui, é conhecido pelos técnicos no assunto do desenvolvimento de peptídeos que a degradação de peptídeos no plasma humano é uma questão importante que limita a sua utilização como agentes terapêuticos. A degradação no plasma humano diminui acentuadamente a exposição terapêutica, portanto, a eficácia. Neste contexto, a observação inesperada que a sequência de HBD1 (3-11) com 9 aminoácidos de comprimento é estável no plasma humano e biologicamente ativa (ver os resultados do Exemplo 1) é uma melhoria relevante versus o peptídeo HBD1 (1-13) com 13 aminoácidos de comprimento anteriormente descrito.
[0156] Além disso, tanto a ciclização como a acilação do N terminal dos peptídeos com 13 e 9 aminoácidos permitiram produzir novos compostos que eram biologicamente ativos e estáveis no plasma humano.
Exemplo 10: Farmacocinética de fragmentos de FIBD1 em ratos Sprague Dawley machos após injeção intravenosa e subcutânea [0157] Os HBD1 (1-13), HBD1 (3-11), HBD1 cíclico (3-11), HBD1 (311) com ácido palmítico no N terminal (C16:0) e HBD1 (3-11) com ácido esteárico no N terminal (C18:0) foram fabricados de acordo com um processo de fabricação padrão em química peptídica por síntese de peptídeos em fase sólida (SPPS) usando a estratégia
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Fmoc (9-fluorenilmetiloxicarbonila) (Merrifield, R. B. Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide (J. Am. Chem. Soc. 1963, 85, 2149-2154). A identidade dos peptídeos foi verificada por LC-MS. A pureza (pelo menos 95%) e o conteúdo líquido de peptídeos dos peptídeos foram determinados por RP-HPLC e análise elementar, respectivamente.
[0158] Os peptídeos foram reconstituídos em solução salina (0,9% NaCl). Utilizaram-se três ratos Sprague Dawley machos por grupo. Doses intravenosas foram administradas em uma veia lateral da cauda na dose de 1 pmol líquido de peptídeo/ kg. Doses subcutâneas foram administradas no flanco direito de cada animal, também na dose de 1 pmol líquido de peptídeo/ kg. Após a dosagem, amostras de sangue completo em série (ca. 0,25 mL) foram coletadas a partir de uma veia lateral da cauda em recipientes tratados com K2EDTA. Após cada coleta de amostra de sangue, as amostras foram colocadas em um bloco de resfriamento a 4 °C. As amostras foram coletadas antes da dosagem, em seguida, aos 2, 5, 15 e 30 minutos, em seguida, em 1, 2, 4, 6 e 8 e 24 horas após a dose por injeção intravenosa e em 15 e 30 minutos depois em 1, 2, 4, 6, 8 e 24 horas após a dose por injeção subcutânea.
[0159] As amostras de sangue foram centrifugadas a 10000 x g durante 2 minutos a 4 °C e o plasma resultante foi aspirado para tubos limpos e rotulados. As amostras de plasma foram congeladas instantaneamente após a aspiração e depois armazenadas a -80 °C. Os peptídeos foram extraídos e analisados como descrito no Exemplo 9. Os limites de quantificação desses métodos foram de 0,001 nmol/ mL para HBD1 cíclico (3-11) e HBD1 (3-11) e 0,003 nmol/ mL para HBD1 (1-13). Todos os valores abaixo desses limites de quantificação foram considerados como zero.
[0160] Os animais tratados com HBD1 (1-13) e HBD1 (3-11) não mostraram exposição quantificável após a administração por qualquer via de dose, portanto não foi possível calcular os parâmetros farmacocinéticos para estes dois peptídeos. Curiosamente, como mostrado nas Figuras 1 e 2, a administração de HBD1 (3-11) cíclico resultou em níveis plasmáticos detectáveis por até 8 horas e 4 horas após a administração intravenosa e subcutânea, respectivamente, e todos os animais tratados com HBD1 (3-11) com ácido palmítico no N terminal (C16:0) e HBD1 (3-11) com
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56/64 ácido esteárico no N terminal (Cl8:0) mostraram exposição até 8 horas por qualquer das vias de dosagem. As Figuras 1 e 2 ilustram gráficos que mostram os perfis farmacocinéticos de HBD1 cíclico (3-11), HBD1 (3-11) com ácido palmítico no N terminal (C16:0) e HBD1 com ácido esteárico no N terminal (C18:0) após injeção intravenosa e subcutânea única em ratos Sprague Dawley, respectivamente. Valores individuais representam a média dos valores obtidos para três ratos diferentes. Os parâmetros farmacocinéticos para HBD1 cíclico (3-11), HBD1 (3-11) com ácido palmítico no N terminal (C16:0) e HBD1 (3-11) com ácido esteárico no N terminal (C18:0) após injeção intravenosa (iv) e subcutânea (sc) estão resumidos na Tabela 23.
Tabela 23: Parâmetros farmacocinéticos dos fragmentos de HBD1 em ratos machos
Sprague Dawley
HBD1 Cíclico (3-11) 1 jiiii· ácido palmítico no N terminal (C16:0) HBD1 (3-11) com ácido esteárico no N terminal
iv Sc iv Sc iv Sc
Cmaxínmol/ml) 5,72 1,06 7,89 0,41 10,24 0,54
Tmax (h) 0,033 0,25 0,033 1,000 0,033 4,000
AUCo t (h * nmol/ mL) 2,09 0,99 4,46 1,57 9,28 4,81
Tfiltimo (h) 8 4 8 8 8 8
F (%) 48 35 52
Túitimo corresponde ao último ponto de tempo com peptídeo detectável [0161] Os dados apresentados acima mostram que HBD1 cíclico (3-11) difundem-se rapidamente a partir do local subcutâneo de injeção, para o sangue. Curiosamente, o HBD1 (3-11) com ácido esteárico no N terminal (C18:0) apresentou melhor exposição intravenosa e subcutânea e biodisponibilidade em ratos do que o HBD1 (3-11) com ácido palmítico no N terminal (C16:0) e HBD1 cíclico (3-11) (9,28 vs 4,46 e 2,09 h * nmol/ mL para injeção iv, 4,81 vs 1,57 ou 0,99 h * nmol/ mL para injeção subcutânea e 52 vs 35 e 48%, respectivamente).
[0162] Em conclusão, estes resultados mostram que a ciclização ou
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57/64 acilação de peptídeo com 9 aminoácidos de comprimento produziram peptídeos (isto é, HBD1 (3-11) cíclico ou HBD1 (3-11) com ácido palmítico no N terminal (C16:0) e HBD1 (3-11) com ácido esteárico no N terminal (C18:0)) com propriedades farmacocinéticas melhoradas, quando comparadas com o peptídeo linear HBD1 (3-11). A ciclização ou a acilação dos peptídeos da presente invenção pode permitir melhorar o seu potencial terapêutico.
Exemplo 11: Farmacocinética de análogos de fragmentos de HBD-1 acilados em ratos Sprague Dawley machos após injeção subcutânea [0163] O HBD1 (1-13) com ácido palmítico no N terminal (C16:0), HBD1 (3-11) com ácido palmítico no N terminal (C16:0), HBD1 (3-11) com ácido mirístico no N terminal (14:0), HBD1 (3-11) com ácido esteárico no N terminal (C18:0), HBD1 (3-11) com ácido araquídico no N terminal (C20:0), HBD1 (3-11) com diácido palmítico no N terminal (C16:0-diácido), HBD1 (3-11) com ácido palmítico na posição C terminal (C16:0) foram fabricados de acordo com um processo de fabricação convencional em química peptídica por síntese peptídica em fase sólida (SPPS) utilizando a estratégia Fmoc (9-fluorenilmetiloxicarbonila) (Merrifield, R. B. Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem Soc. 1963, 85, 2149-2154). A identidade dos peptídeos foi verificada por LC-MS. A pureza (pelo menos 95%) e o conteúdo líquido de peptídeos dos peptídeos foram determinados por RP-HPLC e análise elementar, respectivamente.
[0164] Os peptídeos foram reconstituídos em solução salina (0,9% NaCl). Utilizaram-se três ratos Sprague Dawley machos (aproximadamente 6 semanas de idade) por grupo. Doses subcutâneas foram administradas no flanco direito de cada animal ao nível de dose alvo de 1 pmol líquido de peptídeo/ kg. Após a dosagem, amostras de sangue completo em série (ca. 0,3 mL) foram coletadas a partir do seio retro-orbital em recipientes tratados com K2EDTA. Após cada coleta de amostra de sangue, as amostras foram colocadas em um bloco de resfriamento a 4 °C. As amostras foram coletadas antes da dosagem, depois aos 15 e 30 minutos e depois às 1, 2, 4, 6, 8 e 24 horas após a injeção subcutânea. As amostras de sangue foram centrifugadas a 3500 x rpm durante 10 minutos a 4 °C e o plasma resultante foi aspirado para tubos limpos e
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58/64 etiquetados. As amostras de plasma foram congeladas instantaneamente após a aspiração e depois armazenadas a -80 °C. Os peptídeos foram extraídos com acetonitrila : água (75 : 25, v/ v) e analisados utilizando métodos de LC-MS/ MS desenvolvidos como descrito no Exemplo 9. Os limites de detecção desses métodos são 0,003 nmol/ mL para HBD1 (1-13) com ácido palmítico no N terminal (C16:0), 0,0008 nmol/ mL para HBD1 (3-11) com ácido palmítico no N terminal (C16:0), 0,0070 nmol/ mL para HBD1 (3-11) com ácido esteárico no N terminal (C18:0) e 0,0015 nmol/ mL para HBD1 (3-11) com ácido mirístico no N terminal (C14:0), HBD1 (3-11) com ácido araquídico no N terminal (C20:0), HBD1 (3-11) com diácido palmítico no N terminal (C16:0-diácido), HBD1 (3-11) com ácido palmítico no C terminal (C16:0). Todos os valores abaixo desses limites de quantificação foram considerados como zero. Os parâmetros farmacocinéticos para cada peptídeo após injeção subcutânea estão resumidos na Tabela 24. O perfil PK de alguns desses peptídeos é mostrado na Figura 3.
[0165] Curiosamente, como mostrado na Tabela 24, a administração do peptídeo resultou em níveis plasmáticos significativos durante até 8 horas após a administração subcutânea, independentemente do peptídeo acilado testado.
Tabela 24: Parâmetros farmacocinéticos de análogos de HBD-1 acilados em ratos
Sprague Dawley machos
SEQ ID Sequência peptídica L-inax (nmol/ 1·^ IIIBIII I iiiiiijj· nmol/ mL) T último (h)
78 C16:0- KHHLGLEEPKKLR 0,01 6,00 0,01 8
71 C14:0-HLGLEEPKK 0,24 1,00 1,11 6
72 C16:0-HLGLEEPKK 0,35 1,00 1,34 8
73 C18:0-HLGLEEPKK 0,54 4,00 4,81 8
74 C20:0-HLGLEEPKK 0,25 2,00 2,58 8
75 C16:0-diácido- HLGLEEPKK 0,58 0,25 1,14 8
76 HLGLEEPKK-C16:0 0,50 0,25 1,09 8
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Túitimo corresponde ao último ponto de tempo com peptídeo detectável [0166] Os dados da Tabela 24 e Figura 3 mostram que a exposição de peptídeos mais elevada foi obtida com HBD1 (3-11) com ácido esteárico no N terminal (C18:0). O uso de cadeia acila mais longa conjugada com o peptídeo aumenta a exposição do peptídeo acilado correspondente devido provavelmente a uma mais forte interação com as proteínas do soro (por exemplo, Albumina). Mas, curiosamente, HBD1 (3-11) com ácido araquídico no N terminal (C20:0) tem uma exposição menor do que HBD1 (3-11) com ácido esteárico no N terminal (C18:0) possivelmente devido a uma menor biodisponibilidade deste peptídeo após injeção subcutânea.
[0167] Em conclusão, o HBD1 (3-11) com ácido esteárico no N terminal (Cl 8:0) é biologicamente ativo, estável no plasma humano e tem uma biodisponibilidade e exposição em rato que são melhoradas versus o peptídeo HBD1 não acilado e outros peptídeos acilados. Assim, o HBD1 (3-11) com ácido esteárico no N terminal (Cl8:0) podería ser um potencial candidato a fármaco em seres humanos como uma droga anabólica do tecido ósseo, com um regime de administração adequado, tal como por exemplo uma vez por dia com administração subcutânea.
Exemplo 12: Farmacocinética de fragmentos de HBD1 em miniporcos Gottingen após injeção intravenosa e subcutânea [0168] O HBD1 (3-11) com ácido esteárico no N terminal (C18:0) foi fabricado de acordo com um processo de fabricação convencional em química de peptídeos por síntese de peptídeos em fase sólida (SPPS) utilizando a estratégia Fmoc (9-fluorenilmetiloxicarbonila) (Merrifield, R. B. Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 1963, 85, 2149-2154). A identidade do peptídeo foi verificada por LC-MS. A pureza (pelo menos 95%) e o conteúdo líquido do peptídeo foram determinados por RP-HPLC e análise elementar, respectivamente.
[0169] O peptídeo foi reconstituído em solução salina (NaCl a 0,9%). Foram utilizados três miniporcos Gottingen (aproximadamente com 8 a 10 meses de idade) por grupo. Doses intravenosas foram administradas em uma veia da orelha na dose de 0,5 pmol líquido de peptídeo/ kg. Doses subcutâneas foram administradas no flanco direito de cada animal, também na dose de 0,5 pmol líquido de peptídeo/ kg.
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Após a dosagem, amostras de sangue completo em série (ca. 0,25 mL) foram coletadas a partir de uma veia jugular em recipientes tratados com K2EDTA. Após cada coleta de amostra de sangue, as amostras foram colocadas em um bloco de resfriamento a 4 °C. As amostras foram coletadas antes da dosagem, em seguida, aos 5 e 30 minutos, em seguida, em 1, 2, 4, 8, 25, 48, 72 e 96 horas após a dose por injeção intravenosa e em 15 e 30 minutos e então em 1, 2, 4, 8, 25, 48, 72 e 96 horas pós-dose por injeção subcutânea.
[0170] As amostras de sangue foram centrifugadas a 10000 x g durante 2 minutos a 4 °C e o plasma resultante foi aspirado para tubos limpos e rotulados. As amostras de plasma foram congeladas instantaneamente após a aspiração e depois armazenadas a -80 °C. A extração e análise de peptídeos foram realizadas como descrito no Exemplo 9. O limite de quantificação deste método é de 0,0015 nmol/ mL. Todos os valores abaixo desse limite de quantificação são considerados como zero. Os resultados são apresentados na Figura 4.
[0171] Após 0,5 pmol/ kg de administração do peptídeo aos miniporcos Gottingen, concentrações máximas (Cmax) com médias de 6,27 e 0,29 nmol/ mL, tempos pós dose para concentração máxima (Tmax) com medianas de 0,083 e 4 horas e valores de média de exposição total (AUCo-t) de 3,752 e 3,072 h * nmol/ mL foram observados após injeção intravenosa e subcutânea, respectivamente. A biodisponibilidade subcutânea média calculada em relação a iv foi de 83,1%.
[0172] Curiosamente todos miniporcos Gottingen dosados com HBD1 (3-11) com ácido esteárico no N terminal (C18:0) mostraram exposição até 25 horas após a administração subcutânea, uma exposição mais longa do que em ratos (ver o Exemplo 9). Este resultado sugere fortemente que a administração subcutânea diária de HBD1 (3-11) com ácido esteárico no N terminal (C18:0) em seres humanos deve ser suficiente para, pelo menos, uma exposição de um dia inteiro do produto.
Exemplo 13: o fragmento de EIBD1 induz a formação óssea em ratos ovariectomizados [0173] O HBD1 (3-11) com ácido esteárico no N terminal (C18:0) foi fabricado de acordo com um processo de fabricação convencional em química de peptídeos por síntese de peptídeos em fase sólida (SPPS) utilizando a estratégia Fmoc
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61/64 (9-fluorenilmetiloxicarbonila) (Merrifield, R. B. Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 1963, 85, 2149-2154). A identidade do peptídeo foi verificada por LC-MS. A pureza (pelo menos 95%) e o conteúdo líquido do peptídeo foram determinados por RP-HPLC e análise elementar, respectivamente.
[0174] Efeitos sobre o osso de três doses de HBD1 (3-11) com ácido esteárico no N terminal (Cl8:0) análogo foram testados in vivo em ratos ovariectomizados (OVX), um modelo reconhecido para a osteoporose humana, em particular a osteoporose pós-menopausa. Cada grupo incluiu dez ratos Sprague-Dawley fêmeas com quatro meses de idade no início da fase in vivo do estudo. O tratamento começou seis semanas após a cirurgia de OVX e durou seis semanas adicionais. Os grupos foram randomizados antes da cirurgia de acordo com o peso corporal e a metáfise tibial de Densidade Mineral Óssea (BMD), conforme medida por tomografia computadorizada quantitativa periférica (pQCT) do equipamento Norland Stratec XCT Research SA (Norland Stratec Medizintechnik, Birkenfeld, Alemanha).
[0175] O peptídeo foi reconstituído em solução salina (0,9% NaCl) e administrado por via subcutânea duas vezes ao dia nas doses de 0,8 mg/ kg (baixa), 1,6 mg/ kg (média) ou 3,2 mg/ kg (alta) em um volume de 1 mL/ kg O grupo controle foi administrado duas vezes ao dia com solução salina por administração subcutânea. Os ratos foram pesados uma vez por semana e o volume da solução de dosagem administrada foi ajustado em conformidade.
[0176] Foram realizadas medições de tomografia computadorizada de alta resolução (pCT) usando o scanner de alta resolução SkyScan 1072 ou 1172 (Bruker microCT, Kontich, Bélgica) ex vivo na tíbia proximal direita no final do período de tratamento para medir o volume ósseo, dimensões seccionais ósseas e microarquitetura óssea. As Figuras 5A, 5B e 5C mostram o aumento da percentagem nos grupos animais OVX HBD1 (3-11) com ácido esteárico no N terminal (C18:0) para os seguintes parâmetros selecionados: fração em volume de osso (BV/ TV; %), Número Trabecular -1 -3 (Tb.N; mm’ ) e Densidade de Conectividade (Conn.D; mm’ ).
[0177] As propriedades biomecânicas ósseas foram determinadas por teste de compressão usando o sistema de testes biomecânicos Instron 3343 (Instron,
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Norwood, MA, EUA). Os testes biomecânicos foram realizados ex vivo em uma vértebra lombar (teste de compressão) e no colo do fêmur (teste de flexão em cantilever) no final do período de tratamento. A Figura 6A mostra o aumento da percentagem de animais OVX no grupo tratado com dose elevada de HBD1 (3-11) com ácido esteárico no N terminal (C18:0) em ensaio de compressão no corpo vertebral lombar para os seguintes parâmetros selecionados: carga máxima (N), absorção de energia na carga máxima (mJ) e tensão na carga máxima (MPa). A Figura 6B ilustra o aumento da percentagem em animais OVX no grupo tratado com dose elevada de HBD1 (3-11) com ácido esteárico no N terminal (C18:0) em ensaio de flexão em cantilever em pescoço femoral para os seguintes parâmetros selecionados: Carga (N) e Energia (mJ) no ponto de carga máxima; Carga (N) e Energia (mJ) no ponto de quebra.
[0178] Os resultados mostram que HBD1 (3-11) com ácido esteárico no N terminal (C18:0) tem um efeito anabólico sobre o osso no rato ovariectomizado. Em particular, aumentou a percentagem de fração de volume ósseo (BV/ TV), número trabecular (Tb.N) e densidade de conectividade (Conn.D.) na metáfise tibial de um modo dependente de dose como apresentado nas Figuras 5A, 5B e 5C. Além disso, a dose de 3,2 mg/ kg de BID de HBD1 (3-11) com ácido esteárico no N terminal (C18:0) aumentou a resistência óssea, conforme indicado por melhores propriedades biomecânicas (em particular carga máxima, absorção de energia na carga máxima e tensão na carga máxima) de vertebra lombar e do colo do fêmur em particular carga no ponto de ruptura), tal como apresentado nas Figuras 6 A e 6B.
[0179] Em conclusão, o HBD1 (3-11) com ácido esteárico no N terminal (C18:0) e os peptídeos da presente invenção podem induzir a formação de osso. Isso pode implicar em um potencial terapêutico em vários distúrbios relacionados aos ossos, incluindo osteoporose, osteogênese imperfeita e outros distúrbios associados com o metabolismo ósseo comprometido.
[0180] Entende-se que os dados relatados na presente especificação são dados apenas para ilustrar a presente invenção e não podem ser considerados como constituindo uma limitação dos mesmos.
[0181] Embora a presente invenção tenha sido descrita em conexão com
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63/64 suas formas de realização específicas, deve ser entendido que é capaz de modificações adicionais e esta aplicação destina-se a cobrir quaisquer variações, usos ou adaptações da presente invenção seguindo, em geral, os princípios da presente invenção e incluindo tais afastamentos da presente invenção como sendo de acordo com a prática conhecida ou habitual na técnica a que a presente invenção se refere e como pode ser aplicada às características essenciais aqui apresentadas anteriormente, e como segue no escopo do das reivindicações em anexo.
[0182] Todos os documentos publicados mencionados no presente relatório descritivo são aqui incorporados por referência.
Bibliografia [0183] WO 2005/014635;
[0184] US Pat. No. 9,220,746;
[0185] Xi G. et al. The Heparin-Binding Domains of IGFBP-2 Mediate Its Inhibitory Effect on Preadipocyte Differentiation and Fat Development in Male Mice. Endocrinology, 154(11):4146-4157 (2013).
[0186] Poster 0268 by Xi et al. presented at the Annual Meeting of the American Society for Bone and Mineral Research (ASBMR) in Atlanta on September 16-19, 2016. A unique peptide containing the heparin binding domain of IGFBP-2 increases bone mass in ovariectomized (OVX) rats.
[0187] Wheatcroft SB, Kearney MT, Shah AM, Ezzat VA, Miell JR, Modo M, Williams SC, Cawthom WP, Medina-Gomez G, Vidal-Puig A, Sethi JK, Crossey PA. IGF-binding protein-2 protects against the development of obesity and insulin resistance. Diabetes. 2007;56(2): 285-294.
[0188] DeMambro VE, Clemmons DR, Horton LG, et al. Genderspecific changes in bone turnover and skeletal architecture in igfbp-2-null mice. Endocrinology. 2008; 149(5):2051-2061.
[0189] Hedbacker K, Birsoy K, Wysocki RW, et al. Antidiabetic effects of IGFBP2, a leptin-regulated gene. Cell Metab. 2010; 11(1): 11-22.
[0190] Xi, G. et al. (2014) IGFBP-2 directly stimulates osteoblast differentiation. J. Bone Miner. Res. 20, 2427-2438.
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64/64 [0191] Kawai M, Breggia AC, DeMambro VE, et al. The heparin binding domain of IGFBP-2 has insulin-like growth factor binding-independent biologic activity in the growing skeleton. J Biol Chem. 2011; 286(16):14670-80.

Claims (83)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. PEPTÍDEO ISOLADO, caracterizado pelo fato de que consiste em um fragmento de domínio de ligação à heparina (HBD) conforme mostrado na SEQ ID NO: 1, o referido fragmento tendo 6 a 9 aminoácidos de comprimento e compreendendo uma sequência de aminoácidos GLEEPK como apresentado na SEQ ID NO: 14 ou um análogo do mesmo.
  2. 2. PEPTÍDEO ISOLADO, caracterizado pelo fato de que consiste em um fragmento de domínio de ligação à heparina (HBD) como apresentado na SEQ ID NO: 1, o referido fragmento tendo 6 a 10 aminoácidos de comprimento e compreendendo uma sequência de aminoácidos GLEEPK como apresentado na SEQ ID NO: 14 ou um análogo do mesmo para uso na prevenção ou tratamento de um distúrbio ósseo.
  3. 3. PEPTÍDEO ISOLADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que o HBD é HBD1.
  4. 4. PEPTÍDEO ISOLADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o peptídeo isolado, é modificado.
  5. 5. PEPTÍDEO ISOLADO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a modificação é realizada in vitro.
  6. 6. PEPTÍDEO ISOLADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 5, caracterizado pelo fato de que a modificação é uma modificação pós-tradução.
  7. 7. PEPTÍDEO ISOLADO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a modificação pós-tradução é uma peguilação.
  8. 8. PEPTÍDEO ISOLADO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o peptídeo isolado, é acoplado a um ou mais grupos de peguilação (PEG).
  9. 9. PEPTÍDEO ISOLADO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o um ou mais grupos PEG estão no N terminal do peptídeo isolado.
  10. 10. PEPTÍDEO ISOLADO, de acordo com a reivindicação 8,
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    2/11 caracterizado pelo fato de que o um ou mais grupos PEG estão no C terminal do peptídeo isolado.
  11. 11. PEPTÍDEO ISOLADO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a modificação pós-tradução é acilação.
  12. 12. PEPTÍDEO ISOLADO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o peptídeo isolado é acoplado a um ou mais grupos acila.
  13. 13. PEPTÍDEO ISOLADO, de acordo com a reivindicação12, caracterizado pelo fato de que o um ou mais grupos acila estão no N terminaldo peptídeo isolado.
  14. 14. PEPTÍDEO ISOLADO, de acordo com a reivindicação12, caracterizado pelo fato de que o um ou mais grupos acila estão no C terminaldo peptídeo isolado.
  15. 15. PEPTÍDEO ISOLADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14, caracterizado pelo fato de que a acilação é uma acilação graxa.
  16. 16. PEPTÍDEO ISOLADO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a acilação graxa é feita por acoplamento de um ou mais de um ácido láurico (C12:0), ácido tridecíclico (C13:0), ácido mirístico (C14:0), ácido pentadecíclico (C15:0), ácido palmítico (C16:0), ácido margárico (C17:0), ácido esteárico (C18:0), ácido nonadecíclico (C19:0), ácido araquidínico (C20:0), ácido heneicosílico (C21:0), ácido beênico (C22:0), ácido tricosílico (C23:0) e ácido lignocérico (C24:0) para o peptídeo isolado.
  17. 17. PEPTÍDEO ISOLADO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a acilação graxa é feita acoplando um ou mais de um ácido mirístico (C14:0), ácido palmítico (C16:0) e ácido esteárico (C18:0) ao peptídeo isolado.
  18. 18. PEPTÍDEO ISOLADO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a acilação graxa é feita acoplando um ou mais ácidos graxos insaturados.
  19. 19. PEPTÍDEO ISOLADO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o um ou mais ácidos graxos insaturados é um ácido graxo
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    3/11 monoinsaturado.
  20. 20. PEPTÍDEO ISOLADO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o um ou mais ácidos graxos insaturados é um ácido graxo poliinsaturado.
  21. 21. PEPTÍDEO ISOLADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que o peptídeo isolado é cíclico.
  22. 22. PEPTÍDEO ISOLADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que o fragmento é como descrito na SEQ ID NO: 14 ou é um análogo do mesmo.
  23. 23. PEPTÍDEO ISOLADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que o fragmento é como descrito na SEQ ID NO: 10 ou é um análogo do mesmo.
  24. 24. PEPTÍDEO ISOLADO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o fragmento é como descrito na SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 9 ou é um análogo do mesmo.
  25. 25. PEPTÍDEO ISOLADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que o fragmento é como descrito na SEQ ID NO: 77 ou é um análogo do mesmo.
  26. 26. PEPTÍDEO ISOLADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de que o análogo do mesmo é um análogo conservative do mesmo.
  27. 27. PEPTÍDEO ISOLADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de que o análogo do mesmo é um análogo estrutural do mesmo.
  28. 28. PEPTÍDEO ISOLADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de que o análogo do mesmo é um análogo funcional do mesmo.
  29. 29. PEPTÍDEO ISOLADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de que o análogo do mesmo é tanto um análogo estrutural como um análogo funcional do mesmo.
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    4/11
  30. 30. PEPTÍDEO ISOLADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizado pelo fato de que o peptídeo isolado compreende um grupo de ligação.
  31. 31. PEPTÍDEO ISOLADO, caracterizado pelo fato de que consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de: SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24,
    SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO:29,
    SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO:34,
    SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO:39,
    SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO:44,
    SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO:49,
    SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO:54,
    SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO:59,
    SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO:64,
    SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO:69,
    SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO:74,
    SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO:89,
    SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO:94,
    SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO:99,
    SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113 e qualquer análogo dos mesmos.
  32. 32. PEPTÍDEO ISOLADO, caracterizado pelo fato de que consiste em uma sequência de aminoácidos como descrita na SEQ ID NO: 7 ou um análogo da mesma.
  33. 33. PEPTÍDEO ISOLADO, caracterizado pelo fato de que consiste em uma sequência de aminoácidos como descrita na SEQ ID NO: 10 ou um análogo da mesma.
  34. 34. PEPTÍDEO ISOLADO, caracterizado pelo fato de que consiste
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    5/11 em uma sequência de aminoácidos como descrita na SEQ ID NO: 15 ou um análogo da mesma.
  35. 35. PEPTÍDEO ISOLADO, caracterizado pelo fato de que consiste em uma sequência de aminoácidos como descrita na SEQ ID NO: 73 ou um análogo da mesma.
  36. 36. PEPTÍDEO ISOLADO, caracterizado pelo fato de que consiste em uma sequência de aminoácidos como descrita na SEQ ID NO: 77 ou um análogo da mesma.
  37. 37. PEPTÍDEO ISOLADO, caracterizado pelo fato de que consiste em uma sequência de aminoácidos como descrita na SEQ ID NO: 97 ou um análogo da mesma.
  38. 38. PEPTÍDEO ISOLADO, caracterizado pelo fato de que consiste em uma sequência de aminoácidos como descrita na SEQ ID NO: 100 ou um análogo da mesma.
  39. 39. PEPTÍDEO ISOLADO, caracterizado pelo fato de que consiste em uma sequência de aminoácidos como descrita na SEQ ID NO: 101 ou um análogo da mesma.
  40. 40. PEPTÍDEO ISOLADO, caracterizado pelo fato de que consiste em uma sequência de aminoácidos tal como descrita na SEQ ID NO: 106 ou um análogo da mesma.
  41. 41. PEPTÍDEO ISOLADO, caracterizado pelo fato de que consiste em uma sequência de aminoácidos como descrita na SEQ ID NO: 107 ou um análogo da mesma.
  42. 42. PEPTÍDEO ISOLADO, caracterizado pelo fato de que consiste em uma sequência de aminoácidos como descrita na SEQ ID NO: 108 ou um análogo da mesma.
  43. 43. PEPTÍDEO ISOLADO, caracterizado pelo fato de que consiste em uma sequência de aminoácidos como descrita na SEQ ID NO: 109 ou um análogo da mesma.
  44. 44. PEPTÍDEO ISOLADO, caracterizado pelo fato de que consiste
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    6/11 em uma sequência de aminoácidos como descrita na SEQ ID NO: 112 ou um análogo da mesma.
  45. 45. PEPTÍDEO ISOLADO, caracterizado pelo fato de que consiste em uma sequência de aminoácidos como descrita na SEQ ID NO: 113 ou um análogo da mesma.
  46. 46. PEPTÍDEO ISOLADO, caracterizado pelo fato de que consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 16 ou um análogo da mesma para uso na prevenção ou tratamento de um distúrbio ósseo.
  47. 47. PEPTÍDEO ISOLADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 43, caracterizado pelo fato de que é para uso na preveção ou tratamento de um distúrbio ósseo em um sujeito em necessidade do mesmo.
  48. 48. USO DO PEPTÍDEO ISOLADO, conforme definido qualquer uma das reivindicações 1 a 43, caracterizado pelo fato de que é para a prevenção ou tratamento de um distúrbio ósseo em um sujeito em necessidade do mesmo.
  49. 49. USO DO PEPTÍDEO ISOLADO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 43, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para prevenção ou tratamento de um distúrbio ósseo em um sujeito em necessidade do mesmo.
  50. 50. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 47, caracterizado pelo fato de que o distúrbio ósseo é selecionado a partir de: osteoporose, osteopenia, osteogênese imperfeita, osteonecrose, baixa massa óssea, doença de Paget, metástase óssea, afrouxamento prostático asséptico, periodontite, doença metastática do osso, artrite reumatoide, artrite de lupus, doença periodontal, perda óssea alveolar, pósosteotomia, perda óssea idiopática na infância, curvatura da coluna vertebral, perda de altura e cirurgia protética.
  51. 51. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 47, caracterizado pelo fato de que a doença óssea é selecionada a partir de: um osso fraturado, um defeito ósseo, um transplante ósseo, um enxerto ósseo, um câncer ósseo, um substituto da articulação, uma reparação articular, uma fusão óssea, um reparo de
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    7/11 facetas, uma degeneração óssea, um implante dentário, um reparo dentário e um déficit na medula óssea.
  52. 52. USO DO PEPTÍDEO ISOLADO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 43, caracterizado pelo fato de que é para melhorar a formação óssea em um sujeito em necessidade do mesmo.
  53. 53. USO DO PEPTÍDEO ISOLADO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 43, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para melhorar a formação óssea em um sujeito em necessidade do mesmo.
  54. 54. USO DO PEPTÍDEO ISOLADO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 43, caracterizado pelo fato de que é para inibir a reabsorção óssea em um sujeito em necessidade do mesmo.
  55. 55. USO DO PEPTÍDEO ISOLADO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 43, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para inibir a reabsorção óssea em um sujeito em necessidade do mesmo.
  56. 56. USO DO PEPTÍDEO ISOLADO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 43, caracterizado pelo fato de que é para induzir a deposição óssea em um sujeito em necessidade do mesmo.
  57. 57. USO DO PEPTÍDEO ISOLADO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 43, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para induzir a deposição óssea em um sujeito em necessidade do mesmo.
  58. 58. USO DO PEPTÍDEO ISOLADO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 43, caracterizado pelo fato de que é para induzir a maturação óssea em um sujeito em necessidade do mesmo.
  59. 59. USO DO PEPTÍDEO ISOLADO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 43, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para indução da maturação óssea em um sujeito em necessidade do mesmo.
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    8/11
  60. 60. USO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 53 a 57, caracterizado pelo fato de que o sujeito tem um distúrbio ósseo em um local alvo.
  61. 61. USO, conforme definido na reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que o local alvo é um ou mais espaços intervertebrais, uma articulação facetaria, um local de uma fratura óssea, um osso da boca, um osso do queixo, um osso da maxila, um local de implante e qualquer combinação dos mesmos.
  62. 62. USO DO PEPTÍDEO ISOLADO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 43, caracterizado pelo fato de que é para estimular a osteoblastogênese em um sujeito em necessidade do mesmo.
  63. 63. MÉTODO PARA PREVENÇÃO OU TRATAMENTO DE UM DISTÚRBIO ÓSSEO em um sujeito em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que o método compreende a administração do peptídeo isolado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 43, ao sujeito em uma quantidade eficaz para prevenir ou tratar o distúrbio ósseo no sujeito.
  64. 64. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que o distúrbio ósseo é selecionado a partir de: osteoporose, osteopenia, osteogênese imperfeita, osteonecrose, baixa massa óssea, doença de Paget, metástase óssea, afrouxamento prostático asséptico, periodontite, doença metastática do osso, artrite reumatoide, artrite de lupus, doença periodontal, perda óssea alveolar, pósosteotomia, perda óssea idiopática na infância, curvatura da coluna vertebral, perda de altura e cirurgia pro té tie a.
  65. 65. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que o distúrbio ósseo é selecionado a partir de: osteopatia em doentes com acromegalia, doença óssea relacionada com fibrose cística, doença óssea adinâmica, osteodistrofia renal associada com doença renal crônica, doença óssea associada com cistinose, e doença óssea associada à hiperoxalúria.
  66. 66. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que o distúrbio ósseo é selecionado a partir de: um osso fraturado, um defeito ósseo, um transplante ósseo, um enxerto de osso, um câncer dos ossos, uma substituição da articulação, uma reparação de junta, uma fusão, uma reparação de faceta, uma
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    9/11 degeneração óssea, um implante dentário, uma reparação dentária, um défice na medula óssea e qualquer combinação dos mesmos.
  67. 67. MÉTODO PARA MELHORAR A FORMAÇÃO ÓSSEA em um sujeito em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que o método compreende administrar o peptídeo isolado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 43, ao sujeito em uma quantidade eficaz para prevenir ou melhorar a formação óssea no sujeito.
  68. 68. MÉTODO PARA INIBIR A REABSORÇÃO ÓSSEA em um sujeito em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que o método compreende administrar o peptídeo isolado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 43, ao sujeito em uma quantidade eficaz para inibir a reabsorção óssea no sujeito.
  69. 69. MÉTODO PARA INDUZIR A DEPOSIÇÃO ÓSSEA em um sujeito em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que o método compreende administrar o peptídeo isolado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 43, ao sujeito em uma quantidade eficaz para induzir deposição óssea no sujeito.
  70. 70. MÉTODO PARA INDUZIR A MATURAÇÃO ÓSSEA em um sujeito em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que o método compreende administrar o peptídeo isolado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 43, ao sujeito em uma quantidade eficaz para induzir a maturação óssea no sujeito.
  71. 71. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 61a
    70, caracterizado pelo fato de que a referida administração é administração intratecal, administração subcutânea, administração cutânea, administração oral, administração intravenosa, administração intraperitoneal, administração intramuscular, administração via um implante, administração via uma matriz, administração via um gel, ou qualquer combinação dos mesmos.
  72. 72. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 61a
    71, caracterizado pelo fato de que a quantidade eficaz é de cerca de 1 pg/ kg a cerca de 50 mg/ kg.
  73. 73. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 61a
    72, caracterizado pelo fato de que a referida administração é realizada uma, duas ou três
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    10/11 vezes por dia.
  74. 74. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 61a 73, caracterizado pelo fato de que a referida administração é continuada durante um período de pelo menos cerca de 10 semanas ou cerca de 24 semanas.
  75. 75. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 61a 73, caracterizado pelo fato de que a referida administração é continuada durante um período de pelo menos cerca de 24 semanas.
  76. 76. MÉTODO DE EXPANDIR CÉLULAS TRONCO EX VIVO, caracterizado pelo fato de que compreende o contato do peptídeo isolado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 43, com células tronco de um sujeito, em que as referidas células tronco são mantidas sob condições nas quais são reintroduzidas no sujeito.
  77. 77. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada pelo fato de que compreende o peptídeo isolado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 43, em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável.
  78. 78. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 77, caracterizada pelo fato de que o veículo farmaceuticamente aceitável é um veículo líquido.
  79. 79. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 77, caracterizada pelo fato de que o veículo farmaceuticamente aceitável é um implante biomédico.
  80. 80. USO DO PEPTÍDEO ISOLADO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 43, caracterizado pelo fato de que é para inibição da diferenciação de células adiposas no sujeito.
  81. 81. USO DO PEPTÍDEO ISOLADO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 43, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para inibição da diferenciação de células adiposas em um sujeito.
  82. 82. USO DO PEPTÍDEO ISOLADO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 43, caracterizado pelo fato de que é para modulação da massa gorda em um sujeito.
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    11/11
  83. 83. USO DO PEPTÍDEO ISOLADO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 43, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para modulação da massa gorda em um sujeito.
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