CN106232141A - 针对由给予类固醇诱发的生长不足的药物 - Google Patents

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Abstract

提供了由给予类固醇诱发的生长不足的减轻和/或改善剂，所述药剂是用于减轻和/或改善在生长期的期间由给予类固醇诱发的生长不足的药物，并且包含至少一种类型的利钠肽受体B(NPR‑B)激动剂作为活性组分。

Description

针对由给予类固醇诱发的生长不足的药物
技术领域
本发明涉及用于减轻和/或改善由给予类固醇诱发的生长不足的药物，所述药物包含利钠肽受体B (NPR-B)激动剂例如C-型利钠肽(CNP)或CNP衍生物作为活性成分。
背景技术
“类固醇”是包含类固醇激素或其化学合成的修饰化合物的药物的通称，和通常意指含有糖皮质激素或其化学合成的修饰化合物的药物。类固醇具有药理学作用，例如抗炎作用、免疫抑制作用、淋巴细胞毒性作用、血管收缩作用和支气管扩张作用，和已知对多种疾病具有显著作用。同时，对于类固醇疗法，已经报道出现严重副作用的风险，和典型的副作用包括由过度免疫抑制作用导致的感染性疾病的发生或恶化、库欣综合征、肾上腺皮质机能减退、糖尿病、骨质疏松症和消化性溃疡(非专利文献1、非专利文献2等)。还表明，如果患者因为恐惧出现上述由类固醇疗法导致的副作用而忽视医生的给药指示，则出现使待治疗的原发性疾病的病况恶化(反跳)和发生包括恶心、头痛、不适、血压降低等的所谓的“类固醇停药综合征”的风险(非专利文献3)。
在婴儿和幼儿中，除了上述之外，长期使用类固醇还与发生生长不足的风险有关。在婴儿或幼儿中的类固醇长期疗法导致体内过量的糖皮质激素阻碍产生和分泌生长激素和胰岛素样生长因子(IGF-1)，或导致对所述激素的敏感性退化。这导致病况，从而婴儿或幼儿的正常生长受到抑制(即“生长不足”)和可导致诊断为所谓的“侏儒症”，一种身高显著低于同龄儿童的标准生长曲线的病况(非专利文献4)。在婴儿和幼儿中需要类固醇的相对长期疗法的疾病的实例包括哮喘、特应性皮炎、系统性红斑狼疮、风湿热、青少年特发性关节炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病、重症肌无力、格-巴二氏综合征、肺含铁血黄素沉着症、婴儿IgA肾病、特发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、再生障碍性贫血、急性淋巴细胞性白血病和先天性肾上腺增生。这些疾病中至少一些是难以停止类固醇疗法的严重疾病，和如果疾病恶化则可导致死亡。因此，存在使各种副作用的出现最小化同时在获得预期效果至足够程度的范围内继续使用类固醇的需要。
尽管由给予类固醇诱发的生长不足至少部分地通过随后中止或减少给药得到恢复(非专利文献5)，但婴儿或幼儿的生长期有限，一旦在儿童达到青春期时骺生长板已闭合，则不管是否使用类固醇，不预期进一步的生长。因此，在需要继续或持续类固醇疗法和由于在其儿童期严重的致死性疾病导致不能长期中止给药或减少剂量的受试者中，不预期在其生命中足够生长，和患有侏儒症的可能性升高。
根据上文，如果存在能够在需要类固醇疗法的婴儿或幼儿中减轻和/或改善由于类固醇疗法发生的生长不足而不减轻类固醇的治疗效果和不使生长不足以外的副作用恶化的药物，或能够促进患有由类固醇疗法导致的侏儒症的婴儿或幼儿的生长并治疗侏儒症的药物，则将预期在受试者的生命中QOL改善。此外，减少生长不足的风险允许用足够量的类固醇治疗原发性疾病，和这可导致原发性疾病的结果的改善。
近来，生长激素、IGF-1等用作由某些疾病引起的侏儒症的治疗剂。这些药物非常昂贵，和面临出现各种副作用的担心(非专利文献6)。因此，对于由给予类固醇诱发的生长不足，考虑到风险和收益不建议预防性或治疗性给予这些药物。
C-型利钠肽(C-型利钠肽：后文称为CNP)是NPR-B的激动剂，其通过特异性结合利钠肽受体-B (简称为NPR-B，亦称为GC-B)表现各种生理学活性。NPR-B包括鸟苷酸环化酶和与该受体结合的CNP激活其鸟苷酸环化酶并调节胞内cGMP水平。CNP作用于软骨细胞和在骨生长中起重要作用(非专利文献7、非专利文献8等)。在肝特异性CNP转基因小鼠中或通过持续静脉内给予CNP-22至正常小鼠，促进骨伸长(非专利文献9、非专利文献10)。并且在早期基础研究中，报道了除了软骨组织以外在成骨细胞中的表达作用，和骨再吸收(非专利文献11、非专利文献12)。在CNP转基因小鼠中生长板的组织化学分析已揭示，1) 生长板通过增生软骨细胞层和扩大软骨细胞层的伸长而变厚，2) 增生软骨细胞层的胞外基质增加，和3)成熟的扩大软骨细胞的大小增加。在位于相同小鼠的生长板中的扩大软骨细胞层中，未观察到通过BrdU染色指示的软骨细胞的增殖的明显改变，因此认为CNP在生长板的不同的分化阶段促进软骨细胞的分化表型的表达，而不是促进生长板中的软骨细胞的分化或增殖(非专利文献8)。此外，显示侏儒症和骨端长骨收缩的表型的软骨发育不全模型小鼠的表型通过与软骨特异性CNP转基因小鼠杂交得到拯救(非专利文献8)。根据这一点，支持了CNP具有改善在发育或生长的过程中软骨发育不全和伴随其的各种症状的作用，和尤其预期作为由软骨发育不全代表的侏儒症的治疗药的临床应用的可能性(非专利文献13)。
迄今为止，对于由给予类固醇诱发的生长不足，CNP的有用性尚不清楚。此外，完全没有阐明类固醇如何影响CNP的产生、分泌和信号转导途径。目前可得的报告表明，当地塞米松泼尼松龙治疗性给予患有急性淋巴细胞性白血病的婴儿或幼儿(年龄2-9岁)时，NTproCNP (内源CNP的分泌标志物)的血浆浓度可以是骨毒性的生物标志物(非专利文献14)，和当地塞米松添加至培养的小鼠软骨细胞中时，软骨细胞数和GC-B受体的表达水平降低，同时CNP的表达水平增加(非专利文献15)。然而，这些报告仅表明，内源CNP或NTproCNP浓度可以是发生由类固醇疗法引起的生长不足的指标。作为可以指示生长不足的骨代谢标志物，除了上述之外，还已知多种物质，包括骨型碱性磷酸酶、骨钙蛋白、I型胶原N-前肽和I型胶原C-前肽。如对于许多分子已经证明的，与生理、病理现象有关的基因/蛋白的表达改变不必然表明该基因/蛋白的药理学作用，因此不可能根据前述报告来评价CNP或NPR-B受体激动剂作为药物对抗由给予类固醇诱发的生长不足的有用性。
引用文献列表
非专利文献
非专利文献1: Hanaoka BY等, Rev Clin Immunol. (2012), Vol. 8, No. 8, pp.695-697
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非专利文献13: Yasoda A等, Endocr J. (2010), Vol. 57, No. 8, pp. 659-666
非专利文献14: Prickett TC等, Peptides (2012), Vol. 36, No. 1, pp. 54-59
非专利文献15: Agoston H等, BMC Musculoskeletal Disorders. (2006), Vol. 7,pp. 87-93。
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供用于减轻和/或改善由给予类固醇诱发的生长不足的药物，和用于治疗由于由给予类固醇诱发的生长不足而发生的侏儒症的药物。
解决问题的方案
本发明人已经证实，通过连续或持续地皮下给予大鼠药学有效剂量的类固醇，出现生长不足，如对于人所报告的。此外，本发明人发现，由类固醇引起的生长不足可通过共-给予其中通过连续或持续皮下给予类固醇引起生长不足的大鼠CNP衍生物而得到减轻和/或改善。CNP衍生物减轻由类固醇引起的生长不足的效果明显强于给予相同量的作为目前侏儒症的治疗药的生长激素。此外证实了，对于不仅由特定类固醇而且由广泛类固醇诱发的生长不足，均可见CNP衍生物减轻和/或改善生长不足的作用。还证实了，由于给予类固醇而已经发生的生长不足得到减轻，和由生长不足引起的侏儒症可通过给予CNP衍生物治疗。本发明人根据这些发现做出勤勉努力，最终完成本发明。
本发明提供以下发明。
(1) 用于减轻和/或改善由给予类固醇诱发的生长不足的药物，所述药物包含至少一种利钠肽受体B (NPR-B)激动剂作为活性成分，其中所述药物给予生长期的个体，所述个体需要持续或连续给予类固醇。
(2) 根据(1)的药物，其中NPR-B激动剂是C-型利钠肽(CNP)、其活性片段、其突变体、其衍生物或其修饰物或者抗-NPR-B抗体。
(3) 根据(2)的药物，其中NPR-B激动剂是hCNP-22 (SEQ ID NO: 1)、hCNP6-22(SEQ ID NO: 1的氨基酸编号6-22)或hCNP-53 (SEQ ID NO: 2)、其突变体、其衍生物或其修饰物。
(4) 根据(2)的药物，其中NPR-B激动剂是hCNP-22或hCNP6-22的衍生物或修饰物。
(5) 根据(2)-(4)中任一项的药物，其中衍生物是选自来源于免疫球蛋白的Fc区的肽、血清白蛋白和来自生长素释放肽的C-末端的部分肽的至少一种另外的肽与hCNP-22或hCNP6-22的N末端和C末端的一端或两端融合的肽。
(6) 根据(2)-(5)中任一项的药物，其中衍生物是具有选自SEQ ID NO: 6-15的氨基酸序列的肽。
(7) 根据(6)的药物，其中衍生物是具有SEQ ID NO: 8、13或15的氨基酸序列的肽。
(8) 根据(2)-(4)中任一项的药物，其中修饰物使得PEG或相关的亲水性聚合物与hCNP-22、hCNP6-22或hCNP-53的N末端和C末端的一端或两端缀合。
(9) 根据(1)-(8)中任一项的药物，其中在类固醇疗法的开始或期间给予，以减轻和/或改善生长不足。
(10) 根据(1)-(8)中任一项的药物，其中在类固醇疗法期间或结束之后给予以治疗侏儒症，所述侏儒症由于由给予类固醇诱发的生长不足而已经发生。
发明的有益效果
本发明的NPR-B激动剂减轻和/或改善由给予类固醇诱发的生长不足，和治疗由于生长不足产生的侏儒症。此外，对于在常规类固醇疗法中因为担心发生生长不足而给予的类固醇的剂量或给予类固醇的时间不足以实现类固醇的治疗效果的婴儿或幼儿，变得可以采用足以实现治疗效果的类固醇的剂量或时间。还变得可能的是，通过组合本发明的NPR-B激动剂与类固醇疗法减轻和/或改善由给予类固醇诱发的生长不足，来改善原发性疾病的结果。
附图简述
图1是显示当皮下给予7周龄雄性Crl: CD (SD)大鼠地塞米松持续28天时体重变化的图(○△◇各自代表平均值±标准偏差，n = 4-5)。组1 (○)是正常对照组，组2 (△)是0.5mg/mL地塞米松溶液给药组，和组3 (◇)是1 mg/mL地塞米松溶液给药组。在组2和组3中，以0.25 μL/hr的速率皮下给予所述溶液持续28天。当与正常对照组(组1)存在显著差异时，显示p < 0.05的数据用“*”标记，和显示p < 0.01的数据用“**”标记。
图2是显示皮下给予7周龄雄性Crl: CD (SD)大鼠地塞米松持续28天后股骨长度分布的图(×表示个体数据，○△◇表示平均值 ± 标准偏差)。组1 (○)是正常对照组，组2 (△)是0.5 mg/mL地塞米松溶液给药组，和组3 (◇)是1 mg/mL地塞米松溶液给药组。在组2和组3中，以0.25 μL/hr的速率皮下给予所述溶液持续28天。用“*”标记的数据表示与正常对照组的显著差异(p < 0.05)。
图3是显示当以0.25 μL/hr的速率皮下给予4周龄雄性Crl: WI (Wistar)大鼠0.67 mg/mL地塞米松溶液持续28天(图下方黑色条的时期)时体重变化(图3A)、身长(图3B)和尾长度(图3C) (各数据为平均值 ± 标准偏差，n = 5)的图。在开始给药后14天时，当证实由于地塞米松导致明显生长不足时，开始与CNP衍生物(A)组合连续皮下给药，和给药持续28天(图下方灰色条的时期)。组1 (○)是正常对照组，组2 (△)是地塞米松单一给药组，组3 (▲)是地塞米松和CNP衍生物(A)组合给药组。给予地塞米松持续28天，和从开始给予地塞米松后14天以0.25 μL/hr的速率皮下给予15 mg/mL CNP衍生物(A)溶液持续28天。
图4显示当以0.25 μL/hr的速率皮下给予4周龄雄性Crl: WI (Wistar)大鼠0.67mg/mL地塞米松溶液持续28天时，和在开始给药后14天，当证实由于地塞米松导致明显生长不足时，开始与CNP衍生物(A)组合继续皮下给药，在试验结束时的股骨长度分布(×表示个体数据，◇△▲表示平均值 ± 标准偏差)。组1 (○)是正常对照组，组2 (△)是地塞米松单一给药组，组3 (▲)是地塞米松和CNP衍生物(A)组合给药组。给予地塞米松持续28天，和从开始给予地塞米松后14天以0.25 μL/hr的速率皮下给予15 mg/mL CNP衍生物(A)溶液持续28天。用“**”标记的数据表示与正常对照组(组2)的显著差异(p < 0.01)。
图5说明在试验结束时股骨骺区的生长板(甲苯胺蓝染色)的组织学图像，在所述试验中以0.25 μL/hr的速率皮下给予4周龄雄性Crl: WI (Wistar)大鼠0.67 mg/mL地塞米松溶液持续28天，和对于组3，与地塞米松溶液组合皮下给予CNP衍生物(A)一天一次重复28天，或对于组4，与地塞米松溶液组合皮下给予人型生长激素一天一次重复28天。不进行给药的正常组称为组1，地塞米松单一给药组称为组2。在组织学图像中，增生软骨层通过白色双箭头指示，扩大软骨层通过灰色双箭头指示。
具体实施方式
下文将具体描述本发明。
本发明涉及用于减轻和/或改善由给予类固醇诱发的生长不足的药物，和用于治疗由于由给予类固醇诱发的生长不足而已经发生的侏儒症的药物，所述药物含有至少一种利钠肽受体B (NPR-B)激动剂作为活性成分。
<NPR-B激动剂>
在本发明中，“利钠肽受体B激动剂”意指结合NPR-B (利钠肽受体-B，亦称为鸟苷酸环化酶B (GC-B)，有时称为“NPR-B”)并具有激活其鸟苷酸环化酶的作用(下文中，“NPR-B激动剂活性”)的物质，在本说明书中有时简称为“NPR-B激动剂”。代表性的NPR-B激动剂的实例包括例如C-型利钠肽(CNP)。本发明的NPR-B激动剂不特别受到限制，只要NPR-B激动剂是具有NPR-B激动剂活性的物质；可使用CNP和其活性片段、其突变体、其衍生物、其修饰物等。此外，本发明的激动剂包括与CNP不具有结构类似性的肽或小分子化合物，只要这样的物质具有NPR-B激动剂活性。
本发明的CNP的实例包括由22个氨基酸组成的人来源的CNP-22 (hCNP-22:GLSKGCFGLK LDRIGSMSGL GC: SEQ ID NO: 1，在猪和大鼠等哺乳动物中具有共同的氨基酸序列)、人来源的CNP-53 (hCNP-53，氨基酸序列: DLRVDTKSRA AWARLLQEHP NARKYKGANKKGLSKGCFGL KLDRIGSMSG LGC: SEQ ID NO: 2)、鸡来源的CNP-22 (GLSRSCFGVKLDRIGSMSGL GC: SEQ ID NO: 3)和蛙来源的CNP-22 (GYSRGCFGVK LDRIGAFSGL GC: SEQID NO: 4)。
认为在各种类型的CNP中，对于结合NPR-B受体和对于活性而言，在序列中包含的两个C残基之间通过二硫键形成的环结构(例如，在hCNP-22中，在SEQ ID NO: 1的6位的C和22位的C之间形成二硫键，和形成环结构)是重要的(Furuya, M等, Biochem. Biophys.Res. Commun., (1992), Vol. 183, No. 3, pp. 964-969; Silver, MA, Curr. Opin.Nephrol. Hypertens., (2006), Vol. 15, pp. 14-21;和Calderone, A., MinervaEndocrinol., (2004),Vol. 29, pp. 113-127)。根据Furuya等的报道，已报道CNP6-22(仅由环结构组成的肽(由SEQ ID NO: 1的氨基酸编号6-22组成的肽))或甚至其中ANP的环结构的N末端侧的序列和C末端侧的序列分别添加至环结构的N末端和C末端的肽，显示与hCNP-22几乎相同的NPR-B激动剂活性。该报道还表明，在hCNP-22的9位的L和10位的K具有突变的肽减弱活性，但在上述以外的位置(例如16位的S和17位的M)具有突变的肽，和其中ANP的10-12位的氨基酸序列被置换为L-K-L (其是hCNP-22的相应序列(SEQ ID NO: 1的位置9-11))的肽，显示与hCNP-22几乎相同的NPR-B激动剂活性；等等。根据这些发现，对于NPR-B激动剂活性是重要的环结构的氨基酸序列是CFGLKLDRIG–Xaa1–Xaa2–SGLGC (本文中，Xaa1表示S或A，和Xaa2表示M、F或E；SEQ ID NO: 5)，和该序列称为“环结构序列”。
在本发明中，具有生物学活性的肽或蛋白的“活性片段”意指由涉及肽或蛋白的生物学活性的区域构成并保留肽或蛋白所具有的生物学活性的至少一部分的活性片段。作为本发明的CNP的活性片段，可使用由SEQ ID NO: 1-4的氨基酸序列中的任一个氨基酸序列的至少一部分组成并具有NPR-B激动剂活性的肽。活性片段的实例包括由上述环结构序列组成的肽(SEQ ID NO: 5的氨基酸序列)，和具体实例包括：hCNP6-22；SEQ ID NO: 1、3或4的肽，其中氨基酸序列的1-5位的一些或全部氨基酸缺失，其中所述缺失包括包含1位的连续氨基酸；和SEQ ID NO: 2的肽，其中氨基酸序列的1-31位的一些或全部氨基酸缺失，其中所述缺失包括包含1位的连续氨基酸。然而，活性片段不限于此，和具有环结构序列和NPR-B激动剂活性的任何活性片段可用作本发明的CNP的活性片段。
作为本发明的NPR-B激动剂，可使用上述活性片段本身，此外也可使用其中一个或多个氨基酸被添加至活性片段的N末端、C末端或两端的肽(活性片段的衍生物)，只要它保留预期的激动剂活性。这样的肽的实例可包括其中来源于ANP的C末端和N末端的序列被添加至hCNP6-22的N末端、C末端或两端的肽(Furuya, M.等, Biochem. Biophys. Res.Commun., (1992), Vol. 183, No. 3, pp. 964-969)。
在本发明中，具有生物学活性的肽或蛋白的“突变体”意指其中一至数个氨基酸被置换、缺失、插入和/或添加(下文称为“置换等”)至肽或蛋白的氨基酸序列的一至数个区域并保留肽或蛋白所具有的生物学活性的至少一部分的突变体。术语“数个区域”意指通常3个区域，优选2个区域。术语“数个氨基酸”意指通常10个氨基酸，优选5个氨基酸，更优选3个氨基酸和甚至更优选2个氨基酸。在其中在多个区域中进行置换等的情况下，可仅进行置换、缺失、插入和添加的任何一种，或置换、缺失、插入和添加可以其两种或更多种的组合进行。此外，用于置换等的氨基酸可以是天然存在的氨基酸，可以是天然存在的氨基酸的修饰物例如酰化形式，或可以是人工合成的氨基酸类似物。此外，可选择其中进行置换等的任何区域，只要原始肽或蛋白的活性的一部分得到保持，然而优选的是，进行置换等的区域是原始肽或蛋白的活性区域或受体结合区以外的区域。
例如，作为CNP的突变体，可使用其中已经在任何区域进行置换等的突变体，只要NPR-B激动剂活性得到保持，然而CNP的突变体优选包括其中上述环结构序列得到保留和已经在环结构序列的区域以外的区域中进行置换等的肽。CNP的具体突变体可以是其中可在SEQ ID NO: 1-4所述的氨基酸序列的预期的一个或多个区域中进行一至数个氨基酸的置换等的突变体，只要具有NPR-B激动剂活性，然而可优选是其中在SEQ ID NO: 1-4的任一个描述的氨基酸序列中在SEQ ID NO: 5所示的氨基酸以外的氨基酸的一至数个区域中进行一至数个氨基酸的置换等的突变体，和可更优选是其中在SEQ ID NO: 1、3或4所述的氨基酸序列的1-5位的一至数个区域中进行一至数个氨基酸的置换等的突变体，或其中在SEQID NO: 2所述的氨基酸序列的1-31位的一至数个区域中进行一至数个氨基酸的置换等的突变体。
作为本发明的NPR-B激动剂，可使用上述突变体本身，此外也可使用其中一个或多个氨基酸被添加至突变体的N末端、C末端或两端的肽(突变体的衍生物)，只要预期的激动剂活性得到保持。
作为CNP的突变体的具体实例，有报道，在hCNP-22的17位和18位具有突变的肽具有与hCNP-22相同的NPR-B激动剂活性；甚至在其中所述突变体的环结构元件的N末端和C末端被来源于ANP的序列置换的突变体的衍生物中，已经表明NPR-B激动剂活性为hCNP-22的活性的大约90%；在9-11位的任一处具有突变的肽显示hCNP-22的50%或更多的NPR-B激动剂活性；在10和11位均具有突变的肽具有hCNP-22的40%或更多的NPR-B激动剂活性；等等(Furuya, M.等, Biochem. Biophys. Res. Commun., (1992), Vol. 183, No. 3, pp.964-969)。此外，在另一参考文献中，已经描述了hCNP-22的各种类型的突变体保留NPR-B激动剂活性；和进一步具有对中性内肽酶(NEP)切割的抗性，NEP是CNP的分解代谢酶(WO2009/067639公报)。
在本发明中，具有生物学活性的肽或蛋白的“衍生物”意指包含进一步加入另一种肽或蛋白的肽或蛋白的氨基酸序列和原始生物活性肽或蛋白所具有的生物学活性的至少一部分得到保留的融合肽。具有所述生物学活性(在本发明中，结合NPR-B和激活鸟苷酸环化酶的作用)的至少一部分的融合肽亦称为生物活性肽的衍生物。在本发明的衍生物中，另外的肽可在原始生物活性肽或蛋白的C末端或N末端之一上融合，或另外的肽可在原始生物活性肽或蛋白的C末端和N末端两者上融合。作为待加入的肽，肽不特别受到限制，然而不具有其自己的生物活性的肽是优选的。此外，另外的肽可直接键合，或可通过由一至数个氨基酸组成的接头序列键合。作为接头序列，各种接头序列是已知的，然而经常使用包含许多G、S等的接头序列。这样的另外的肽的实例包括免疫球蛋白(优选IgG)的Fc区、血清白蛋白和来自生长素释放肽的C末端侧的部分序列。用作本发明的NPR-B激动剂的衍生物的实例可包括CNP (优选hCNP-22或hCNP-53)的衍生物和CNP的活性片段(优选hCNP6-22)的衍生物，和优选是hCNP-22的衍生物或hCNP6-22的衍生物。
CNP的衍生物的具体实例可包括例如公开于美国专利申请US 2010-305031的公布(对应于国际公布WO2009/142C307)的各种类型的CNP衍生物(该美国专利申请的公布中的SEQ ID NO: 109、110、124-130、157和158：本说明书中的SEQ ID NO: 6-14)。其中，已报道了在其中来源于生长素释放肽的C末端侧的部分序列被添加至生物活性肽例如ANP、CNP和促胃动素的衍生物中，血液中的半寿期时间得到改进，同时原始肽的生物活性得到保留。在该报道中，在其中包含来源于生长素释放肽的C末端的Wk-Xl-Y-Zm-Wnd的肽(本文中W表示碱性氨基酸例如Lys和Arg；Y表示酸性氨基酸例如Asp和Glu；X和Z彼此相同或不同，和可以是除了酸性氨基酸和碱性氨基酸之外的任何氨基酸；k和n彼此独立，是1或2的整数；l和m彼此独立，是0、1或2的自然数；和这样的序列的实例优选包括RKESKK、RKDSKK、RKSEKK和RKSDKK)被添加至CNP的N末端或C末端的任一端或两端的各种衍生物的任一种中，NPR-B激动剂活性也得到保留，和血液半寿期得到延长。用于本发明的实施例的CNP衍生物(A) (SEQID NO: 13)和CNP衍生物(C) (SEQ ID NO: 8)的任一种是在该公布中制备的CNP衍生物的代表性实例。该公布的说明书并入本申请的说明书中。
此外，关于CNP或CNP的活性片段的衍生物，甚至在其中ANP的C末端部分被添加至hCNP-22的C末端的肽中，或在其中ANP的N末端部分和C末端部分被添加至hCNP6-22的N末端和C末端的肽中(CNP活性片段的衍生物)，与hCNP-22大约相同水平的NPR-B激动剂活性得到保留(Furuya, M.等, Biochem. Biophys. Res. Commun., (1992), Vol. 183, No. 3,pp. 964-969)。此外，在另一参考文献中，已经描述了hCNP-22和hCNP-53的各种类型的衍生物保留NPR-B激动剂活性；此外，在各种类型的衍生物中多种衍生物具有NEP降解抗性；等等(WO 2009/067639公报)。此外，对于该WO 2009/067639公报中描述的衍生物，还已报道了由氨基酸序列Pro-Gly-CNP-37(SEQ ID NO: 15)组成的衍生物(其在本说明书中被定义为CNP衍生物(B))对小鼠软骨发育不全模型的药理学作用(Florence L.,等, Am. J. Hum.Genet., (2012), Vol. 91, No. 6, pp 1108-1114: 正文文本：http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S000292971200537X: 增刊:: http://download.cell.com/AJHG/mmcs/journals/0002-9297/PIIS000292971200537X.mmc1.pdf).
本发明的CNP-22的衍生物的实例包括由其中从N末端连续的1或多个至30个或更少的氨基酸从人CNP-53的氨基酸序列(SEQ ID NO: 2)中缺失的氨基酸序列组成的肽，特别是CNP-36 (SEQ ID NO: 2的氨基酸编号18-53)。这样的衍生物优选是由其中从hCNP-53 (SEQID NO: 2)的N末端连续的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸缺失的氨基酸序列组成的肽，和更优选其中从hCNP-53的N末端的17个连续的氨基酸缺失的hCNP-36 (由SEQ ID NO: 2的氨基酸编号18-53的氨基酸序列组成的肽)。
这些各种CNP衍生物和CNP活性片段的衍生物可优选地用作本发明的NPR-B激动剂。本发明的NPR-B激动剂更优选是由其中从N末端的1或多个至30个或更少的连续氨基酸(优选25个或更少，和更优选20个或更少)从SEQ ID NO: 2中缺失的氨基酸序列组成的衍生物，或选自SEQ ID NO: 6-15的任何衍生物；和进一步优选是CNP衍生物(A) (SEQ ID NO:13)、CNP衍生物(C) (SEQ ID NO: 8)或CNP衍生物(B) (SEQ ID NO: 15)。
在本发明中，具有生物学活性的肽或蛋白的“修饰物”意指其中肽或蛋白中包含的氨基酸的一至数个区域通过化学反应用另一化学物质修饰，并且此外肽或蛋白所具有的生物学活性的至少一部分在修饰后得到保留的修饰物。作为其中进行修饰的区域，可选择任何区域，只要原始肽或蛋白的活性在修饰物中得到保留。
例如，对于其中化学物质大到一定程度(例如聚合物)的修饰，修饰优选在肽或蛋白的活性区域或受体结合位点以外的区域进行。此外，在用于防止被分解代谢酶切割的修饰的情况下，在切割位点上进行的修饰是优选的。
例如，只要具有NPR-B激动剂活性，CNP的修饰可以是其中SEQ ID NO: 1-4的任一个的氨基酸序列中预期的一个或多个区域被修饰的修饰物。然而，优选其中在SEQ ID NO:1-4的任一个的氨基酸序列中在SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列以外的氨基酸的一至数个区域被修饰的修饰物，更优选其中SEQ ID NO: 1、3或4的氨基酸序列的1-5位的一至数个区域被修饰的修饰物。此外，在赋予NEP切割抗性的修饰的情况下，已知NEP在各种类型的CNP肽中包含的环结构中在SEQ ID NO: 5的1位的C和2位的F之间的位点切割CNP，因此该区域可被修饰。
此外，上述CNP活性片段、CNP突变体和其衍生物的修饰也包括在本发明中。所述各种类型的修饰物也可用于本发明中，只要它们保留NPR-B激动剂活性。
作为化学修饰的方法，各种方法是已知的，例如：加入用于制药技术(药理学上使用)的高分子量聚合物的方法，例如聚乙二醇(PEG)和聚乙烯醇(PVA)；其中作为接头的化合物被添加至氨基(例如K残基)的侧链的方法，另一蛋白等(例如血清白蛋白)通过所述接头键合；等等是已知的。然而，所述方法不限于此，可使用各种方法。
作为CNP、其活性片段、其突变体和其衍生物的所述修饰的具体实例，举出公开于WO 2009/067639公报的那些。在该参考文献中公开了其中各种类型的水性聚合物(例如PEG)与hCNP-22和hCNP-53键合的修饰物，和其中在hCNP-22中作为NEP的切割位点的Cys6-Phe7的肽键被置换为-CH2-NH-、-C(=O)-N(R)- (其中R表示低级烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基)等的拟-肽键的多种修饰物保留NPR-B激动剂活性，且与hCNP-22相比，其中许多具有改进的血液半寿期时间。此外，关于各种生物活性肽的修饰物的制备方法，修饰物可例如参考美国专利申请US 2009-0175821等的公布而合适地制备。
对于CNP与NPR-B受体的结合，其环结构是重要的。因此，特别是在其中另外的肽或部分与其末端部分键合的衍生物或修饰物中，这样的另外的肽或部分对环结构的影响小，衍生物或修饰物可预期保留NPR-B激动剂活性至足够的程度，而不抑制与NPR-B受体的结合。这得到本文所述的许多参考文献的支持。
上述CNP或其活性片段、或其突变体、其衍生物、或其修饰物可以是从天然细胞或组织收集的那些，可以是通过使用基因工程或细胞工程技术产生的那些，可以是化学合成的那些，或可以是按上述获得的那些经酶处理或化学处理以修饰氨基酸残基或除去部分的氨基酸序列的那些。这些物质可参考本申请的说明书和引用的文献根据常规方法合适地产生。
通过本领域技术人员已知的常规方法，可容易地测量某一物质是否具有NPR-B激动剂活性。具体而言，所述方法为将物质加入强制表达NPR-B(Suga S.,等,Endocrinology, (1992), Vol. 130, No. 1, pp. 229-239)的培养的细胞，并测量培养的细胞的胞内cGMP水平。短语“部分的NPR-B激动剂活性得到保留”意指当对NPR-B激动剂物质和CNP在相同的测试中测量NPR-B激动剂活性时，NPR-B激动剂物质的cGMP增加活性峰值保留CNP的峰值的至少10%或更多，和优选保留30%或更多，更优选50%或更多，和甚至更优选70%或更多。此外，即使NPR-B激动剂物质的活性在其峰值时未显著增加，当给予活体时显示关于活性持续时间和血液半寿期时间的有利结果的物质也可用于本发明。
此外，化合物，甚至与利钠肽不具有共同结构的化合物(例如小分子化合物)，可用于本发明作为NPR-B激动剂，只要它是当加入上述测试方法时导致cGMP产生能力改进的化合物。
此外，根据本领域普通知识，使用上述方法，从通过用包含NPR-B的配体结合位点的抗原性蛋白免疫动物制备的抗-NPR-B抗体中选择具有NPR-B激动剂活性的抗体。由此制备的具有NPR-B激动剂活性的抗-NPR-B抗体也可用作本发明的NPR-B激动剂。此外，由此使用的抗体可以各种已知的形式制备，即通过免疫原性动物产生的抗体、嵌合抗体、CDR-移植抗体、人源化抗体、全人抗体等等。可使用根据上述抗体制备的抗体片段例如Fab和scFv。
本发明的NPR-B激动剂的实例优选包括CNP、具有其环结构序列的活性片段、或其中在并非环结构序列的序列中进行置换等的突变体、或其衍生物或修饰物；更优选包括hCNP-22、hCNP-53、hCNP6-22、其衍生物或其修饰物；和甚至更优选包括hCNP-53、CNP衍生物(A): CNP (1-22)生长素释放肽(12-28, E17D, SEQ ID NO: 13)、CNP衍生物(B): Pro-Gly-CNP-37 (SEQ ID NO: 15)、CNP衍生物(C): CNP (1-22)生长素释放肽(12-28, SEQ IDNO: 8)和其部分肽。
<给药受试者>
本发明的NPR-B激动剂可用作用于通过给予受试者来减轻和/或改善由给予生长期的个体类固醇诱发的生长不足的药物的活性成分，所述个体需要持续或连续给予类固醇。
在本发明中，“生长期的个体，所述个体需要持续或连续给予类固醇”意指患有通过类固醇可治愈的疾病的生长期的受试者，对其预定或正进行类固醇的给药，或类固醇的给药已经以在正常生长期间可阻抑或抑制骨伸长的剂量和/或给予时间完成。给予本发明的药物的受试者不特别受到限制，只要它是哺乳动物，和实例包括人、猴、狗、猫和马，其中优选是人。在本发明中，“生长期”意指生长板保持在使得受试者的长骨的骺线未闭合的情况下的时期，和在人的情况下，它通常为18岁或更年轻，优选15岁或更年轻，更优选12岁或更年轻。因为本发明的药物减轻和/或改善生长不足，通过将药物给予处于高的生长速度的时期的受试者，效果更可能是显著的。
在本发明中，“类固醇”是包含糖皮质激素或与其相关的化合物作为活性成分的药剂，在医学情况下其用于关于疾病的治疗目的。代表性实例包括包含泼尼松龙、倍氯米松、培他米松、氟替卡松、地塞米松、氢化可的松等作为活性成分的药剂(Payne等, PaediatrRespir Rev., (2001), Vol. 2, pp. 145-150, Pelaia G等, Life Sci., (2003), Vol.72, No. 14, pp. 1549-1561)，然而其不限于此。本发明的类固醇的制剂形式不受限制，可以是口服制剂、注射剂、外用制剂等。
在本发明中，“由给予类固醇诱发的生长不足”意指如下文描述的事件的发生和发展以及自所述发生和发展产生的表现的全部。在生长期的受试者中长期使用类固醇与发生生长不足的风险有关。在生长期的类固醇长期疗法导致体内过量的糖皮质激素阻止产生和分泌生长激素和胰岛素样生长因子(IGF-1)，或导致对所述激素的敏感性退化。这导致其中正常生长受到抑制的病况(即“生长不足”)和可导致诊断为所谓的“侏儒症”，一种身高显著低于同龄受试者的标准生长曲线的病况(Kawaguchi H等, J Bone Miner Res. (2001),Vol. 25, No. 12, pp. 2735-2743)。
生长期的受试者需要相对长期的类固醇治疗的疾病，即用本发明的药物给予的受试者所正患有的或过去所患有的疾病，其实例包括：哮喘、特应性皮炎、系统性红斑狼疮、风湿热、青少年特发性关节炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病、重症肌无力、格-巴二氏综合征、肺含铁血黄素沉着症、婴儿IgA肾病、特发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、再生障碍性贫血、急性淋巴细胞性白血病和先天性肾上腺增生。这些疾病中的至少一些为难以停止类固醇疗法的严重疾病，如果疾病变得恶化，则可导致死亡。因此，存在对使各种副作用的出现最小化，同时在获得预期效果至足够程度的范围内继续使用类固醇的需要。
在本发明中，“减轻”生长不足意指以下过程，即通过实现至少一种以下效果，因为生长不足而可发生的侏儒症不发生，或预期侏儒症的程度减轻：抑制损伤的发生，减轻或延迟损伤的进展，和减轻损伤的程度。为减轻生长不足的目的，理想的是，在临开始类固醇疗法之前或同时开始给予本发明的药物，或在类固醇疗法期间开始给予本发明的药物，和优选的是，给予持续或连续进行，直到类固醇疗法结束或其后经过一段时间后。
在本发明中，“改善”生长不足意指通过实现至少一种以下效果，使受试者的高度达到相同年龄的(个体的)标准高度范围：改进受试者的生长速度以与相同年龄的标准生长速度相当或比其更好；在生长不足的进展过程中防止侏儒症发生；恢复已发生的侏儒症；和在事件(包括损伤)结束后，以使产生的损伤病况更接近正常状态的方式恢复。为改善生长不足的目的，开始给予生长期的受试者本发明的药物，所述受试者已经历一定时期的类固醇疗法或已完成所述疗法，并显示向侏儒症的趋势或患有侏儒症。当在类固醇疗法期间进行给药时，预期发生减轻效果和改善效果两者。
本发明的药物不特别受到限制，只要其是包含本发明的NPR-B激动剂作为活性成分的药物，为减轻和/或改善由给予受试者类固醇诱发的生长不足的目的，或为治疗因生长不足而已发生的侏儒症，其经配制用于需要持续或连续给予类固醇的生长期的受试者。然而，药物的包装说明书优选包括对以下效果的描述：药物可给予正经历类固醇疗法的受试者，药物给予处于由于给予类固醇导致的发生生长不足的危险的受试者或已经发生生长不足的受试者，和为减轻和/或改善生长不足的目的或为治疗因生长不足已经发生的侏儒症而给予本发明的药物。
<药物的形式>
当在临开始受试者的类固醇疗法之前或同时开始给予药物，或在受试者的类固醇疗法期间开始给予药物，并在类固醇疗法期间持续给予药物时，本发明的药物能够减轻和/或改善由给予类固醇诱发的生长不足或治疗由于生长不足已经发生的侏儒症。在该情况下，在本发明中，短语“本发明的药物在类固醇疗法期间持续或连续给予”意指在一定时间内药物所给予的受试者接受所有活性成分(类固醇和本发明的NPR-B激动剂)至其体内。可给予在单一制剂中包含所有活性成分的制剂，或各活性成分可分开配制，和各活性成分可分开给予。当它们分开配制时，给药时间不特别受到限制，和它们可同时给予，或可在不同的时间以一定间隔或在不同的天数给予。多种活性成分或药物“组合给予”的表述也包括其中起NPR-B激动剂作用的多种活性物质各自给予的情况。当多种活性成分在不同的时间或在不同的天数给予时，给予活性成分的顺序不特别受到限制。因为不同的制剂通常根据它们各自的给药方法给予，它们可给予相同的次数或不同的次数。此外，当活性成分分开配制时，制剂各自的给药方法(给予途径)可相同，或它们可通过不同的给药方法(给予途径)给予。此外，所有活性成分同时存在于体内不是必需的，而是仅需要各活性成分在一定时间内(例如一个月，优选一个周，更优选数天，还优选一天)摄入体内，和当给予另一种活性成分时，一种活性成分可已从体内消失。
本发明的药物通过在类固醇疗法期间或结束后给药，能够治疗由于由给予类固醇诱发的生长不足而已经发生的侏儒症。关于术语“侏儒症”，通常与相同种族、相同性别和相同年龄的身高相比低于或等于标准高度减-2 SD的高度，或两年内小于或等于-1.5 SD的生长速度，被定义为侏儒症。在该情况下对生长期的受试者进行给药，只要不超过受试者年龄的标准身高+2 SD。甚至在不适合于侏儒症的定义的情况下，经历持续或连续类固醇疗法或具有所述疗法的历史的生长期的患者，与相同种族、相同性别和相同年龄的标准身高相比其明显具有低的身高，或其显示显著降低的生长速度，被怀疑患有生长不足，因此所述患者也可以是给予本发明的药物的受试者。
此外，通过上文描述的本发明的药物的作用，变得可能的是，因为给予类固醇导致的生长不足的风险降低而增加用于原发性疾病的疗法的类固醇的量和延长治疗时间，以致原发性疾病的结果可得到改善，本发明也提供具有这样的作用的药物。
用作本发明的药物的活性成分的物质可以是上述NPR-B激动剂的药学上可接受的盐。即在本发明中，上述NPR-B激动剂的无机酸或有机酸的酸加成盐也可用作活性成分，无机酸例如盐酸、硫酸或磷酸，有机酸例如甲酸、乙酸、丁酸、琥珀酸、柠檬酸等。或者，在本发明中，上述NPR-B激动剂的钠、钾、锂、钙等的金属盐或与有机碱的盐的形式也可用作活性成分。此外，本发明的药物组合物可包含根据活性成分的游离形式的物质或其药学上可接受的盐。
本发明的药物组合物包含NPR-B激动剂或其药学上可接受的盐作为活性成分，和进一步通过使用在一般配制过程中使用的载体、赋形剂、其它添加剂、稀释剂等制备。用于制剂的载体或赋形剂的实例包括例如乳糖、硬脂酸镁、淀粉、滑石粉、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、橄榄油、芝麻油、可可脂、乙二醇和通常使用的其它载体或赋形剂。
作为用于口服给予的固体组合物，使用片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂等。在所述固体组合物中，至少一种活性成分与至少一种惰性稀释剂混合，所述稀释剂例如乳糖、甘露醇、葡萄糖、羟丙基纤维素、微晶纤维素、淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、偏硅酸铝镁等。根据常规方法，所述组合物可包含除了惰性稀释剂以外的添加剂，例如润滑剂例如硬脂酸镁，崩解剂例如羟乙酸纤维素钙和增溶剂例如谷氨酸或天冬氨酸。片剂或丸剂可按需要用糖包衣料例如蔗糖、明胶或邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素或者由胃或肠溶物质制成的薄膜包衣，或可用两个或更多个层包覆。此外，还包括自可被吸收的物质例如明胶制成的胶囊。
用于口服给予的液体组合物包含药学上可接受的乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂、酏剂等，和可进一步包含通常使用的惰性稀释剂，例如纯化水、乙醇等。该组合物可包含佐剂例如惰性稀释剂以外的湿润剂和助悬剂；甜味剂；矫味剂；芳香剂；防腐剂等。
作为用于胃肠外给予的注射用制剂，在无菌和含水形式或非水形式下包括溶液剂、混悬剂和乳剂。作为含水溶液剂或混悬剂，包括例如注射溶剂和注射用盐水溶液。作为非水溶液剂和混悬剂，包括例如丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄油、醇例如乙醇、Polysorbate 80 (注册商标)等。这样的组合物可进一步包含佐剂例如防腐剂、湿润剂、乳化剂、分散剂、稳定剂(例如乳糖)和增溶剂(例如谷氨酸和天冬氨酸)。这些可以例如通过用微滤膜过滤除菌、热灭菌例如高压蒸汽灭菌或混合杀菌剂的普通灭菌方法等来灭菌。注射剂可以是溶液制剂，或可以是使用前溶解和重构的冻干制剂。作为用于冻干的赋形剂，可使用例如糖醇，例如甘露醇或葡萄糖，或糖。
本发明的药物组合物优选通过通常用于药物的给药方法给予，例如口服给药方法；或经粘膜给予、静脉内给予、肌内给予、皮下给予等的胃肠外给药方法。在其中活性成分是NPR-B激动剂抗体的情况下，本发明的药物组合物通常通过胃肠外途径，例如通过注射(皮下注射、静脉内注射、肌内注射、腹膜内注射等)、通过皮肤、通过粘膜、通过鼻、通过肺等给予，然而也可通过口服给药给予。
当活性成分是肽物质时，可作为对消化道降解较不敏感的药物制剂，例如作为其中作为活性成分的肽包封在核糖体中的微胶囊制剂通过口服给予进行给药。此外，其中活性成分通过直肠、鼻、舌下等的粘膜而非消化道吸收的给药方法也可使用。在该情况下，给予个体可以栓剂、鼻喷雾剂、吸入剂或舌下含片的形式进行。
可用作本发明的药物组合物的活性成分的物质的剂量根据原发性疾病的类型、个体(受试者)的年龄和体重、症状的程度和给药途径而改变，然而对于人而言，其为例如大约100 mg/kg或更少，优选大约50 mg/kg或更少，和更优选5 mg/kg或更少，通常作为每日剂量的上限。此外，作为每日剂量的下限，剂量为例如大约0.005 μg/kg或更多，优选0.025 μg/kg或更多，和更优选0.1 μg/kg或更多。
本发明的CNP的剂量根据受试者个体的体重、待治疗的疾病、症状等而改变，然而，在组织水平上以局部给药其大约为10-15 M至10-6 M的水平，和优选大约为10-12 M至10-8 M的水平。对于系统性给药，剂量大约为0.01 μg/人至10000 μg/人，和优选1 μg/人至5000 μg/人的水平。
本发明的药物组合物与类固醇组合使用，或给予在过去已经给予了类固醇的受试者。本发明的药物组合物可与另一种骨形成促进剂、骨再吸收抑制剂或侏儒症治疗剂组合使用。欲组合的药剂的实例包括例如，二膦酸盐制剂、骨形态发生蛋白(BMP)制剂、甲状旁腺激素(PTH)制剂、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)制剂、抗-破骨细胞分化因子(RANKL)抗体制剂、生长激素制剂和胰岛素样生长因子(IGF-1)，然而药剂不限于此。
此外，在其中本发明的治疗剂用于基因疗法的情况下，可使用这样的治疗剂，其中编码NPR-B激动剂肽的氨基酸序列的核酸在宿主细胞中起作用的启动子序列(例如巨细胞启动子(CMV启动子)等)下游插入适合于基因疗法的已知载体例如病毒载体，优选慢病毒载体或腺伴随病毒载体和更优选腺病毒载体；或化学合成的脂质体、病毒被膜或病毒被膜和合成的脂质体的复合物。作为编码CNP的基因，可使用包含编码SEQ ID NO: 1-5中任一个的氨基酸序列的核苷酸序列的基因。关于具体基因疗法的方法，可使用ExperimentalMedicine (Jikken Igaku), Vol. 12, p. 303, 1994中描述的方法、本文引用的文献中的方法等。
实施例
下文中，通过实施例的方式更详细地描述了本发明。这些实施例阐述了本发明的实施方案的实例，本发明不限于这些实施例。
本发明的实施例中使用的CNP衍生物(A) (SEQ ID NO: 13)和CNP衍生物(C) (SEQID NO: 8)按照美国专利公开号US 2010-305031中的描述制备。CNP衍生物(B) (SEQ IDNO: 15)根据WO 2009/067639公报的描述制备。
<实施例1>：准备地塞米松-诱发的生长不足模型大鼠
[方法]
在渗透泵(MINI-OSMOTIC PUMP Model 2004，可获自DURECT CORPORATION，流速：0.25μL/hr，持续28天)中装填浓度0.5 mg/mL (组2)或1 mg/mL(组3)的地塞米松(地塞米松注射剂“KS”，可获自Kyoritsuseiyaku Corporation)，将一个渗透泵植入每只7周龄雄性Crl:CD (SD)大鼠的背部皮下(5只动物/组，总共10只动物)。另外，在对照组(组1，5只动物)中，将装有盐水的一个渗透泵(与上述相同)植入每只动物的背部皮下。然后饲养动物28天，每周两次或三次地测量它们的体重。在最后一天，在异氟烷麻醉下收集血液接着立即安乐死后，取出右股骨，并测量长度。从收集的血液分离血浆，并使用胆固醇E-Test Wako (可获自Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)测定胆固醇浓度，并使用皮质酮, ELISA Kit,AssayMax (96孔) (EC3001-1，可获自ASSAYPRO LLC.)测量血浆皮质酮浓度。
[结果]
在地塞米松给药期间的大鼠体重变化显示于图1，在最后一天右股骨的长度显示于图2。通过持续皮下给予地塞米松，体重以剂量依赖性方式降低，和股骨长度以剂量依赖性方式缩短。在最后一天收集的血浆中皮质酮和胆固醇的浓度显示于表1。通过持续皮下给予地塞米松，组2和组3的皮质酮浓度显著低于组1，和组3的用于生物合成皮质酮的胆固醇的浓度显著更高。在本研究中，地塞米松的剂量为0.009-0.027 mg/kg/天(表2)，和其低于在地塞米松注射剂“KS”的包装说明书对于狗或猫记载的治疗剂量(皮下或肌内注射0.05-0.1mg地塞米松/1 kg体重，每天一次)。研究表明，地塞米松的治疗剂量诱发大鼠的生长不足。
[表1：在28天持续皮下给予地塞米松至雄性Crl: CD (SD)大鼠结束时皮质酮和胆固醇的血浆浓度]
[表1]
(平均值 ± 标准偏差，n = 4-5)
**：与组1显著差异(p < 0.01)，*：与组1显著差异(p < 0.05)，NS：与组1无显著差异(p> 0.05)
[表2：各组中地塞米松的平均剂量]
[表2]
-：仅介质
<实施例2> CNP衍生物(A)和大鼠生长不足诱发物地塞米松的组合给药研究
[方法]
在渗透泵(MINI-OSMOTIC PUMP Model 2004，可获自DURECT CORPORATION，流速：0.25μL/hr，持续28天)中装填1 mg/mL地塞米松溶液(地塞米松注射剂“KS”，可获自Kyoritsuseiyaku Corporation，组2和组3)或对照组的盐水(组1)，将一个渗透泵植入每只7周龄雄性Crlj: WI (Wistar)大鼠的背部皮下。同时，将在组3中装有20 mg/mL CNP衍生物(A)溶液或在组1和组2中装有介质1 (0.03 mol/L乙酸盐缓冲液(pH 4.0)/1%苯甲醇/10%蔗糖)的一个渗透泵(与上述相同)与含有地塞米松或盐水的泵同时植入背部皮下。然后饲养动物28天，和在最后一天测量体重、身长(鼻子前端至肛门的长度)和尾长度，和在异氟烷麻醉下从腹部主动脉收集血液后，收集右股骨和主要器官(脾、胸腺、肝、心和肺)。关于股骨，使用测径器测量骨长度和宽度，和测量器官重量。通过使用胆固醇E- Test Wako (可获自Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)和Quantikine(R) ELISA Mouse/Rat IGF-IImmunoassay (MG100，可获自R&D Systems)测量从血液制备的血浆中的胆固醇和IGF-1的浓度。
[结果]
持续皮下给予地塞米松和CNP衍生物(A) 28天后的体重、身长和尾长度显示于表3，和股骨的长度和宽度显示于表4。最后一天，组2和组3的体重显著低于组1 (p < 0.01)，和未观察到组合给予CNP衍生物(A)的效果。另一方面，身长、尾长度和股骨长度通过地塞米松治疗显著缩短(组2) (p < 0.01)，和通过组合给予CNP衍生物(A) (组3)恢复至与组1相同的水平。关于股骨宽度，尽管观察到由于给予地塞米松而缩短的趋势，但并不显著(p >0.05)，和未测定出组合使用CNP衍生物(A)的影响。最后一天的胆固醇和IGF-1浓度显示于表5。最后一天血浆中胆固醇浓度由于给予地塞米松而显著增加(组2) (p < 0.01)。由于在组3内大的数据变化，在组3和组1或2任一之间未观察到显著差异。与组1相比，在组2和3中血浆IGF-1浓度显著降低(p < 0.05)。
最后一天的主要器官的重量显示于表6。在组2和组3中给予地塞米松的脾和胸腺的重量(体重比(%))显著低于组1，和未观察到组合给予CNP衍生物(A)的影响。因此，认为地塞米松的免疫抑制作用不能通过组合给予CNP衍生物(A)而被抑制。
如上文所述，揭示了由于给予地塞米松诱发的骨伸长抑制(组2和3)通过组合给予CNP衍生物(组3)而明显得到改善。另一方面，当将地塞米松给予大鼠时，观察到症状例如体重损失、血浆胆固醇浓度增加、IGF-1浓度降低以及脾和胸腺重量降低，但未观察到组合给予CNP衍生物(A)对这些症状的影响。
[表3：28天持续皮下给予地塞米松和CNP衍生物(A)至雄性Crlj: WI (Wistar)大鼠后的体重、身长和尾长度]
[表3]
溶媒1：0.03 mol/L乙酸盐缓冲液(pH 4.0)/1%苯甲醇/10%蔗糖
**：与组1显著差异(p < 0.0１)，NS：与组1无显著差异(p > 0.05)
[表4：28天持续皮下给予地塞米松和CNP衍生物(A)至雄性Crlj: WI (Wistar)大鼠后的右股骨的长度和厚度]
[表4]
对于骺区指示宽度(最大宽度)
**：与组1显著差异(p < 0.01)，NS：与组1无显著差异(p > 0.05)
[表5：28天持续皮下给予地塞米松和CNP衍生物(A)至雄性Crlj: WI (Wistar)大鼠后的胆固醇和IGF-1的血浆浓度]
[表5]
**：与组1显著差异(p < 0.01)，*：与组1显著差异(p < 0.05)，NS：与组1无显著差异(p> 0.05)
[表6：28天持续皮下给予地塞米松和CNP衍生物(A)至雄性Crlj: WI (Wistar)大鼠后的主要器官的重量]
[表6]
**：与组1显著差异(p < 0.01)，*：与组1显著差异(p < 0.05)，NS：与组1无显著差异(p> 0.05)
<实施例3> 在地塞米松诱发的大鼠生长不足模型中人型CNP-53或各种CNP衍生物的组合给药研究
[方法]
在渗透泵(MINI-OSMOTIC PUMP Model 2004，可获自DURECT CORPORATION，流速：0.25μL/hr，持续28天)中装填0.67 mg/mL地塞米松溶液(地塞米松注射剂“KS”，可获自Kyoritsuseiyaku Corporation)，将一个渗透泵植入每只5周龄雄性Crlj: WI (Wistar)大鼠的背部皮下(5只动物/组，组2-6，总共25只动物)。同时，将在组3中装有15 mg/mL CNP衍生物(A)溶液、在组4中装有人型CNP-53、在组5中装有CNP衍生物(B)和在组6中装有CNP衍生物(C)的一个渗透泵(与上述相同)同时植入背部皮下。未给予正常对照组任何物质(组1，5只动物)。然后饲养动物28天，和测量体重、身长和尾长度的变化。在最后一天，在异氟烷麻醉下从腹部主动脉收集血液和处死动物，和从收集的血液分离血浆和使用“LabAssay (商标)胆固醇” (可获自Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)测定胆固醇浓度。在收集血液和处死动物后，取出右股骨和胸腺，和测量右股骨长度和胸腺重量。
[结果]
当与持续皮下给予地塞米松同时组合在28天持续皮下药中使用人型CNP-53、CNP衍生物(A)、(B)或(C)的任一种时，在最后一天的体重、身长、尾长度和股骨长度显示于表7。在地塞米松给药组(组2)中，大鼠体重增加和身体和尾长度伸长显著受到抑制，和在其中人型CNP-53或CNP衍生物(A)、(B)或(C)的任一种组合给予的组中(组3-组6)，与地塞米松单一给药组(组2)相比，身长和尾长度的伸长显著得到促进(p < 0.05或0.01)。股骨长度由于给予地塞米松而显著缩短，和在其中人型CNP-53或CNP衍生物(A)、(B)或(C)的任一种组合给予的组中(组3-组6)，而不是在地塞米松单一给药组(组2)中，股骨长度显示更长的趋势。另一方面，在血浆胆固醇浓度和胸腺重量方面，在地塞米松单一给药组(组2)和其中人型CNP-53或CNP衍生物(A)、(B)或(C)的任一种组合给予的组(组3-组6)之间未观察到明显不同(表8)。
[表7：28天持续皮下给予地塞米松和各种CNP衍生物至5周龄雄性Crlj: WI(Wistar)大鼠后的体重、身长、尾长度和右股骨长度]
[表7]
与组1，
##：显著差异(p < 0.01)，#：显著差异(p < 0.05)，NS：无显著差异(p > 0.05)
与组2，
**：显著差异(p < 0.01)，*：显著差异(p < 0.05)，NS：无显著差异(p > 0.05)
[表8：28天持续皮下给予地塞米松和各种CNP衍生物至5周龄雄性Crlj: WI (Wistar)大鼠后的血浆胆固醇浓度和胸腺重量]
[表8]
**：与组2显著差异(p < 0.01)，*：与组2显著差异(p < 0.05)，NS：与组2无显著差异(p> 0.05)
<实施例4> 对于地塞米松诱发的大鼠生长不足，CNP衍生物(A)的后续给药试验
[方法]
在渗透泵(MINI-OSMOTIC PUMP Model 2004，可获自DURECT CORPORATION，流速：0.25μL/hr，持续28天)中装填0.67 mg/mL地塞米松溶液(地塞米松注射剂“KS”，可获自Kyoritsuseiyaku Corporation)，将一个渗透泵植入每只4周龄雄性Crlj: WI (Wistar)大鼠的背部皮下(5只动物/组，组2和组3)，和饲养动物14天。在证实由于给予地塞米松导致显著减少(减轻体重或缩短身长或尾长度)后，将装有15 mg/mL CNP衍生物(A)溶液的渗透泵(与上述相同)另外植入仅组3动物的背部皮下，和饲养动物另外的28天。在饲喂期间，测量体重、身长和尾长度的变化，和在最后一天，在异氟烷麻醉下从腹部主动脉收集血液和处死动物，取出右股骨和测量其长度。
[结果]
在试验期间大鼠体重、身长和尾长度的变化显示于图3。在从开始给予地塞米松起14天后，与组1相比，在组2中大鼠体重增加和身体和尾长度的伸长显著受到抑制(表9)。然后仅在组3中开始给予CNP衍生物(A)，和与未给药组(组2)相比，身长和尾长度的伸长增加，和从开始给予CNP衍生物(A)起28天后，在组3中身长和尾长度比组2显著更长(p < 0.01)。此外，从开始给予CNP衍生物(A)起28天后股骨比未给药组显著更长(p < 0.01) (图4)，但未观察到通过组合给予CNP衍生物(A)导致的体重变化的显著改变。
[表9：当将CNP衍生物(A)皮下给予至其中通过持续皮下给予地塞米松诱发生长不足的雄性Crlj: WI (Wistar)大鼠持续28天时的体重、身长、尾长度和股骨长度]
[表9]
括号内：自开始给予CNP衍生物(A)至组3的增量
**：与组2显著差异(p < 0.01)，*：与组2显著差异(p < 0.05)，NS：与组2无显著差异(p> 0.05)
<实施例5> 在大鼠中各种类固醇和CNP衍生物(A)的同时组合给药试验
[方法]
将0.3 mg/mL地塞米松溶液(地塞米松注射剂“KS”，可获自KyoritsuseiyakuCorporation，用盐水稀释)、悬浮于含0.1%聚山梨醇酯的盐水中的琥珀酸泼尼松龙(可获自Wako Pure Chemical Industries, Ltd.，泼尼松龙浓度5 mg/mL)或悬浮于含0.1%聚山梨醇酯的盐水中的二丙酸培他米松(可获自Wako Pure Chemical Industries, Ltd.，培他米松浓度0.3 mg/mL)以体积1 mL/kg每日一次给予至4周龄雄性Crlj: WI (Wistar)大鼠的背部皮下(对于各组物质，10只动物)，持续28天。不给予对照组任何物质(5只动物，组1)。同时，在背部皮下以体积1 mL/kg每天一次持续28天，对于各组10只动物中的5只(组2、组4、组6)，给予介质(0.03 mol/L乙酸盐缓冲液(pH 4.0)/1%苯甲醇/10%蔗糖)和对于剩余的5只动物(组3、组5、组7)，组合给予介质和1 mg/mL CNP衍生物(A)溶液。在给药最后一天后的当天，在异氟烷麻醉下测量体重、身长和尾长度后，从腹部主动脉收集血液，和处死动物，取出右股骨和测量股骨长度。
[结果]
因为重复给予地塞米松、泼尼松龙和培他米松的任一种28天，观察到大鼠体重增加的显著抑制，和身长、尾长度和股骨长度生长的显著降低(p < 0.05或0.01)(表10)，这些类固醇被认为诱发大鼠生长不足。与重复给予这些类固醇同时进行的组合重复皮下给予剂量1mg/kg的CNP衍生物(A)，导致与未给予CNP衍生物(A)的组相比，显著延长身长、尾长度和股骨(p < 0.05或0.01)。这些揭示了CNP衍生物(A)减轻和/或改善由于给予其它类固醇例如泼尼松龙和培他米松以及地塞米松诱发的生长不足。
[表10：当将地塞米松、泼尼松龙或培他米松一天一次皮下给予至雄性Crlj: WI(Wistar)大鼠重复28天时的体重、身长、尾长度和右股骨长度]
[表10]
与组1，
##：显著差异(p < 0.01)，#：显著差异(p < 0.05)，NS：无显著差异(p > 0.05)
在组2与组3、组4与组5、组6与组7的显著差异检验中，与组2、组4或组6，
**：显著差异(p < 0.01)，*：显著差异(p < 0.05)，NS：无显著差异(p > 0.05)
<实施例6> 在CNP衍生物(A)和人生长激素之间对地塞米松诱发的大鼠生长不足的作用的比较研究
[方法]
在渗透泵(MINI-OSMOTIC PUMP Model 2004，可获自DURECT CORPORATION，流速：0.25μL/hr，持续28天)中装填0.67 mg/mL地塞米松溶液(地塞米松注射剂“KS”，可获自Kyoritsuseiyaku Corporation)，将一个渗透泵植入每只4周龄雄性Crlj: WI (Wistar)大鼠的背部皮下(5只动物/组，组2-组4，共15只动物)。以体积2 mL/kg一天一次持续28天，对于组3，给予1 mg/mL CNP衍生物(A)溶液(介质: 0.03 mol/L乙酸盐缓冲液(pH 4.0)/1%苯甲醇/10%蔗糖)，和对于组4，给予用磷酸盐缓冲液稀释的1 mg/mL人型生长激素制剂溶液(生长激素BS皮下注射剂10 mg “SANDOZ”)，分别至5只大鼠的背部皮下。不给予正常对照组任何物质(5只动物，组1)。在最后一天，在测量体重、身长和尾长度后，在异氟烷麻醉下从腹部主动脉收集血液和处死动物，取出左股骨和测量骨长度，和然后制备骺区的组织病理学样本。
[结果]
当将地塞米松和CNP衍生物(A)或人型生长激素组合给予时的体重、身长、尾长度和左股骨长度显示于表11。在地塞米松给药组(组2)中，体重增加以及身长和尾长度的伸长显著受到抑制(p < 0.01)。与仅地塞米松给药组(组2)相比，在CNP衍生物(A)的组合给药组(组3)中，身体和尾长度的伸长受损显著得到改善(p < 0.01和p < 0.05)。在人型生长激素的组合给药组(组4)中，在身长和尾长度的伸长方面与仅地塞米松给药组(组2)相比未观察到显著差异(p > 0.05)。与组1相比，在最后一天的左股骨长度由于给予地塞米松(组2)而显著缩短(p < 0.01)。与仅地塞米松给药组(组2)相比，在CNP衍生物(A)的组合给药组(组3)中在最后一天的左股骨长度显著更长(p < 0.01)。在人型生长激素的组合给药组(组4)和仅地塞米松给药组(组2)之间未观察到显著差异(p > 0.05)。左股骨的骺区的生长板软骨层显示由于仅给予地塞米松导致的缩窄趋势，和与仅给予地塞米松相比，通过组合给予CNP衍生物(A)或人型生长激素显示膨胀趋势(图5)。
[表11：28天持续皮下给予地塞米松至4周龄雄性Crlj: WI (Wistar)大鼠后的体重、身长、尾长度和右股骨长度，和组合重复皮下给予CNP衍生物(A)或人型生长激素的影响。
[表11]
1) 病例数为4，因为1个病例中在试验期间装有地塞米松的泵从皮下脱落和因此去除。
与组1：
##：显著差异(p < 0.01)，#：显著差异(p < 0.05)，NS：无显著差异(p > 0.05)
与组2：
##：显著差异(p < 0.01)，*：显著差异(p < 0.05)，NS：无显著差异(p > 0.05)。

Claims (10)

1. 用于减轻和/或改善由给予类固醇诱发的生长不足的药物，所述药物包含至少一种利钠肽受体B (NPR-B)激动剂作为活性成分，其中将所述药物给予在生长期的个体，所述个体需要连续或持续给予类固醇。
2.权利要求1的药物，其中所述NPR-B激动剂是C-型利钠肽(CNP)、其活性片段、其突变体、其衍生物或其修饰物或者抗-NPR-B抗体。
3. 权利要求1的药物，其中所述NPR-B激动剂是hCNP-22 (SEQ ID NO: 1)、hCNP6-22(SEQ ID NO: 1的氨基酸编号6-22)或hCNP-53 (SEQ ID NO: 2)、其突变体、其衍生物或其修饰物。
4.权利要求1的药物，其中所述NPR-B激动剂是hCNP-22或hCNP6-22的衍生物或修饰物。
5.权利要求2-4中任一项的药物，其中所述衍生物是其中选自来源于免疫球蛋白的Fc区的肽、血清白蛋白和来自生长素释放肽的C-末端的部分肽的至少一种另外的肽与hCNP-22或hCNP6-22的N末端和C末端的一端或两端融合的肽。
6. 权利要求2-4中任一项的药物，其中所述衍生物是具有选自SEQ ID NO: 6-15的氨基酸序列的肽。
7. 权利要求6的药物，其中所述衍生物是具有SEQ ID NO: 8、13或15的氨基酸序列的肽。
8.权利要求2-4中任一项的药物，其中所述修饰物使得PEG或相关的亲水性聚合物与hCNP-22、hCNP6-22或hCNP-53的N末端和C末端的一端或两端缀合。
9.权利要求1-8中任一项的药物，其中在类固醇疗法的开始或期间给药以减轻和/或改善生长不足。
10.权利要求1-8中任一项的药物，其中在类固醇疗法期间或结束后给药以治疗侏儒症，所述侏儒症由于由给予类固醇诱发的生长不足而已经发生。
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