JP2015042688A - 血管改善剤 - Google Patents

Abstract

【課題】魚類の動脈球から抽出されるエラスチンペプチドを有効成分として含む血管改善剤を提供する。
【解決手段】血管改善剤は、魚類の動脈球より抽出されたエラスチンペプチドを有効成分として含み、１０００残基あたりのグリシン、アラニン、バリン及びプロリン含量の合計が６５０残基以上であり、アスパラギン酸及びアスパラギン含量の合計が１０〜３５残基であり、グルタミン酸及びグルタミン含量の合計が２０〜５０残基であり、リジン、ヒスチジン及びアルギニン含量の合計が２０残基〜５０残基であり、デスモシン及びイソデスモシン含量の合計が０．３残基以上であり、ヒドロキシプロリン含量が１０残基以下である。
【選択図】なし

Description

本発明は、血管改善剤に関し、より具体的には魚類の動脈球から抽出されるエラスチンペプチドを有効成分として含む血管改善剤に関する。

コラーゲンと同じく皮膚等に多く含まれている物質にエラスチンがある。エラスチンは、弾性線維の主要な構成成分で、脊椎動物の結合織に広く分布する不溶性タンパク質である。生体内では動脈壁や項靭帯、肺、皮膚等、弾力性及び伸縮性が必要とされる組織に多く分布し、弾性を与える働きをしている。血管や項靭帯におけるエラスチン含量は、全乾燥重量あたり５０％以上を占めている。また、エラスチンは、皮膚の弾性に関与する成分としてコラーゲンと共に真皮結合組織に存在しており、加齢、紫外線等による皮膚中のエラスチンの減少及び変性は、皮膚のたるみやしわの一因である。そのため、エラスチンは、化粧品や健康食品分野を中心に、現在多くの製品に使用されている。また、上述のとおりエラスチンは血管の構成成分であるため、エラスチンの変性は各種血管性疾患にも関与していると考えられることから、医薬分野での利用も検討されている。

従来、エラスチンは牛項靭帯等のほ乳類由来の弾性組織を原料としていたが、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）や、豚口蹄疫を始めとする家畜疫病の発生により、安全上の見地からほ乳類由来のエラスチンは敬遠される傾向にある。そこで、魚類等の海洋性資源由来のエラスチンが注目されるようになっている。魚類において、エラスチンは動脈球という組織に豊富に含まれている。動脈球は魚類に特有の組織であり、心臓より血管へ移る動脈幹の一種で、大動脈壁の一部が発達したものである。動脈球は、弾性線維に富み、内部は海綿状構造になっているため、心臓の収縮によって常に拡張及び収縮を繰り返している。一部地域では、この動脈球を珍味として食用に供している。

エラスチンに関しては、動物由来（ウシの項靱帯）エラスチンが血管の状態を改善したという報告（特許文献１参照）等がある。

特開２００７−０４５７２２号公報

しかしながら、動物の弾性組織由来のタンパク質を原料とすることは、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）や、豚口蹄疫を始めとする家畜疫病の発生以降、安全上の見地から敬遠される傾向にある。

本発明はかかる事情に鑑みてなされたもので、魚類の動脈球から抽出されるエラスチンペプチドを有効成分として含む血管改善剤を提供することを目的とする。

上記目的に沿う本発明は、魚類の動脈球より抽出されたエラスチンペプチドを有効成分として含むことを特徴とする血管改善剤を提供することにより上記課題を解決するものである。
なお、「エラスチンペプチド」とは、エラスチンのポリペプチド鎖を断片化させることにより得られるポリペプチド及びオリゴペプチド又はそれらの混合物を意味する。

本発明の血管改善剤において、グリシン、アラニン、バリン及びプロリン含量の合計が６５０残基／１０００残基以上であり、アスパラギン酸及びアスパラギン含量の合計が１０残基／１０００残基以上３５残基／１０００残基以下であり、グルタミン酸及びグルタミン含量の合計が２０残基／１０００残基以上５０残基／１０００残基以下であり、リジン、ヒスチジン及びアルギニン含量の合計が２０残基／１０００残基以上５０残基／１０００残基以下であり、デスモシン及びイソデスモシン含量の合計が０．３残基／１０００残基以上であり、ヒドロキシプロリン含量が１０残基／１０００残基以下であることが好ましい。

本発明の血管改善剤において、前記エラスチンペプチドのうち、分子量が１０００以下のものの割合が７０％以上であることが好ましい。

本発明の血管改善剤において、血管改善剤は加速度脈波のｂ／ａ値を減少させ、かつｄ／ａ値を増大させる活性を有していてもよい。
なお、「加速度脈波」とは、指先容積脈波の二次微分波であり、血管抵抗及び血流に対する血管の反応性を反映していることから、いわゆる血管年齢の推定に用いられる。

本発明の血管改善剤において、血管改善剤は平滑筋増殖阻害活性を有していてもよい。

本発明の血管改善剤において、血管改善剤は血管内皮細胞におけるエンドセリン−１産生抑制活性を有していてもよい。

本発明の血管改善剤において、血管改善剤は血管内皮細胞における組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）産生促進活性を有していてもよい。

本発明の血管改善剤において、血管改善剤は血管内皮細胞増殖賦活活性を有していてもよい。

本発明によると、副作用、固有の臭気、安全性等に関する従来技術の課題を解決し、幅広い用途に応用が可能な、血管弾性改善作用、血管における平滑筋増殖阻害活性、エンドセリン−１産生抑制能、組織プラスミノーゲン活性化因子産生促進活性及び血管内皮細胞増殖促進活性のうち１又は複数を有する血管改善剤を提供できる。

加速度脈波の標準的な波形を示す図である。 実施例１で得られたエラスチンペプチドについての平滑筋増殖阻害活性の測定結果を示すグラフである。 実施例１で得られたエラスチンペプチドについてのエンドセリン−１産生促進活性の測定結果を示すグラフである。 実施例１で得られたエラスチンペプチドについての組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）産生促進活性の測定結果を示すグラフである。 実施例１で得られたエラスチンペプチドについての血管内皮細胞増殖促進活性の測定結果を示すグラフである。

続いて、本発明を具体化した実施の形態につき説明する。
本発明の一実施の形態に係る血管改善剤は、魚類の動脈球より抽出されたエラスチンペプチド（以下、単に「エラスチンペプチド」と略称する。）を有効成分として含んでいる。

動脈球とは、魚類に特有の器官であり、弁を介して心室と結合しており、心室から大動脈へ送り出される血液の血流調節に関与している。原料として使用される動脈球の起源に特に制限はなく、任意の魚種由来の動脈球を使用することができるが、心臓から動脈球を採取するためにある程度の大きさを有する必要がある。そのため、原料として用いる動脈球は、カツオ、マグロ、カジキ、タラ、ハマチ、ブリ、サケ、マス等の大型魚に由来するものであることが好ましく、大量かつ安定的に入手できる魚種であるカツオ、マグロ、タラ、ハマチ、サケに由来するものであることがより好ましい。

エラスチンペプチドは、例えば、以下の方法により調製される。
まず、原料として使用する動脈球から血液を除去するために流水で洗浄後、粉砕する。粉砕は、ホモジナイザー、フードカッター等の任意の公知の手段により行うことができる。次いで、粉砕した動脈球から、脂質、可溶性タンパク質、コラーゲンを除去することにより、エラスチンを主成分とする不溶性タンパク質混合物が得られるが、原料のさらなる洗浄及び以後の処理を容易にするための前処理として、アルカリ溶液を用いた浸漬処理を行うことが好ましい。

アルカリ溶液による処理条件は魚種により異なるため、事前に検討の上決定することが好ましいが、カツオ由来の動脈球を使用した場合、使用されるアルカリ溶液は、水酸化ナトリウム又は水酸化カルシウム、好ましくは水酸化ナトリウムの溶液である。アルカリ溶液の濃度は０．０１Ｎ〜０．１Ｎ、好ましくは０．０２Ｎである。浸漬温度は２０℃以下、浸漬期間は数日〜２週間、好ましくは１週間である。また、浸漬中は、アルカリ溶液を１日につき２回以上取り替えることが好ましい。浸漬後、流水洗浄により過剰のアルカリを除去後、中和処理を行う。中和には、当該技術分野において使用される任意の酸を使用することができる。

アルカリ処理した原料からの脂質及びコラーゲンの除去は、例えば、蒸留水を添加し高温（例えば、９５℃）で加熱する方法により行うことができる。高温で加熱することにより、コラーゲンのらせん構造が崩壊して三量体が解離し、水溶性のトロポコラーゲン（ゼラチン）が遊離する。ろ過、遠心分離、デカンテーション等の任意の公知の方法により上清を分離除去すると、不溶性タンパク質混合物が得られる。

こうして得られた不溶性タンパク質混合物に対して、ポリペプチド鎖を断片化させ、水溶性を向上させる可溶化処理を行うことにより、エラスチンペプチドを得ることができる。この際、可溶化処理に先立ち、不溶性タンパク質混合物をさらに細片化してもよい。

可溶化処理は任意の公知の方法を用いて行うことができるが、具体例としては、タンパク分解酵素による酵素分解が挙げられる。酵素分解には、食品、医薬品及び化粧品製造に使用される任意のタンパク分解酵素を使用することができるが、力価の大きなもの、たとえばＡｌｃａｌａｓｅ２．４Ｌ ＦＧ（Ｎｏｖｏｅｎｚｙｍｅ製）、プロチンＡＣ−１０Ｆ（大和化成製）、プロテアーゼＮ「アマノ」Ｇ、ペプシン（天野エンザイム製）が好ましい。分解条件は、使用される酵素及び動脈球、所望の分子量分布等に応じて適宜決定される。酵素の添加量（酵素と基質の重量比）は、当業界でタンパク質分解に用いられる通常の量であり、たとえば１：５０００〜１：１００００である。また、これらの酵素は単独で用いることもできるが、２種類以上を組み合わせて使用することが好ましい。反応後、酵素の加熱失活により酵素分解反応を終了させる。

また、可溶化処理は、不溶性タンパク質混合物を無機酸溶液中で加熱処理する酸分解法によっても行うことができる。使用する酸の例としては任意の無機酸が挙げられるが、シュウ酸が好ましく、濃度及び加熱温度は、０．２５Ｎ、９０℃が好ましい。可溶化処理後、アルカリにより中和を行うが、このとき使用するアルカリとしては水酸化ナトリウム及び水酸化カルシウムが好ましい。特に、シュウ酸を使用した場合には、これを完全に除去するために水酸化カルシウムでの中和が必須となる。

或いは、不溶性タンパク質混合物をアルカリ性含水エタノール溶液で処理するアルカリ−エタノール法によっても可溶化処理を行うことができる。この際使用する溶液は、１Ｎ水酸化ナトリウム８０％エタノール溶液であることが好ましく、処理温度は室温であることが好ましい。

以上のようにして得られたエラスチンペプチドを溶液のまま使用する場合には、溶液を所望の用途に好適なｐＨに調整し、必要であれば脱塩を行う。脱塩は、限外ろ過法、イオン交換法等の任意の方法により行うことができる。
また、不溶物が存在する場合には、ろ過、遠心分離、デカンテーション等の任意の方法を用いて除去することができる。ろ過による除去の場合には、必要に応じて、不純物を除去するために活性炭、ベントナイト、セライト等の吸着剤やろ過助剤を添加してもよい。特に溶液のまま使用する場合には、メンブレンフィルター等による除菌ろ過を併せて行うことが好ましい。
このようにして得られるエラスチンペプチドは、そのまま溶液として用いてもよく、或いは、更に濃縮後噴霧乾燥又は凍結乾燥を行うことにより得られる粉末の形態で用いてもよい。

以上のようにして得られるエラスチンペプチドのうち、分子量が１０００以下のものが占める割合は、７０％（重量％を意味する。以下同じ。）以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上である。上記の条件を具備する血管改善剤は、それぞれ、高い活性を示すと共に、投与時の吸収特性等においても優れている。エラスチンペプチドの分子量及びその存在比（重量比）は、サイズ排除クロマトグラフィー（ゲルろ過クロマトグラフィー）法、質量分析法等の任意の公知の方法を用いて決定することができる。
エラスチンペプチドのうち、分子量１０００以下のものが占める割合が７０％を下回ると、吸収効率の低下や変異原性の発現等の問題を生じるおそれがある。

更に、エラスチンペプチドは、加速度脈波のｂ／ａ値を減少させ、かつｄ／ａ値を増大させる活性を有している。加速度脈波とは、指先容積脈波の二次微分波であり、測定された指先容積脈波の演算処理により求めることができる。１回の心臓収縮により心臓から駆出された血流は、動脈の内圧変化及び容積変化をもたらすが、動脈の特定部位で測定される内圧と容積との関係は、心臓から当該部位に至る個々の動脈特性の影響の総和となる。したがって、指尖部で測定される容積脈波は、大動脈から末梢動脈に伝播される過程で生じる投射波と反射波の合成及び共鳴の影響を受けており、指先容積脈波の波形解析より、個人における心臓からの拍出の態様、血管性状、血管壁の状態、血液の粘性等を総合的に把握できる。

加速度脈波の標準的な波形を図１に示す。標準的な加速度脈波は、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ波と呼ばれる５つの要素波を有している。加速度脈波の波形は年齢と強い相関を示すことが確認されており、年齢の増大、すなわち動脈の老化に伴い、ｂ波は浅く（ベースラインからの変位が正方向に増大）なり、一方ｄ波は深く（ベースラインからの変位が負方向に増大）なることが知られている。したがって、動脈の老化に伴い、ｂ／ａ値は増大し、ｄ／ａ値は減少する。
エラスチンペプチドが、ｂ／ａ値を減少させ、かつｄ／ａ値を増大させる活性を有していることは、エラスチンペプチドが動脈を若い年齢の状態に改善する活性を有していることを意味する。

また、エラスチンペプチドは、平滑筋増殖阻害活性を有している。加齢によるアテローム性動脈硬化を引き起こす要因としては、血管内皮細胞から産出される血管弛緩因子の低下、収縮因子の増加に加え、血管中膜に存在する平滑筋細胞が過剰に増殖することが挙げられる。したがって、エラスチンペプチドは、平滑筋増殖によるアテローム性動脈硬化を防ぎ、動脈壁の弾性を改善できる。以上のように、エラスチンペプチドは、老化した血管を改善する効果を有する血管改善剤として用いることができる。

また、エラスチンペプチドはエンドセリン−１産生抑制活性を有している。血管の老化に伴い、血管が硬化し、あるいはアテローム性動脈硬化が進展することは周知である。これらの現象には、血管内皮細胞における一酸化窒素（ＮＯ）やプロスタサイクリンの産生能の低下等による内皮依存型血管弛緩作用の低下やアンジオテンシン、エンドセリン−１による血管収縮作用の増大が関与していると考えられる。

エンドセリン−１は、血管内皮細胞が産生する２１残基のアミノ酸からなる強力な血管収縮ペプチドであり、強力な血管収縮作用と共に持続的で強い昇圧作用も有しており、平滑筋に直接作用して血管を収縮させることがわかっている。エンドセリンの産生は血管内皮の障害によって増強され、その過剰産生は高血圧症、肺血圧症、糖尿病、動脈硬化症、腎不全、心筋梗塞、狭心症、脳血管攣縮および脳梗塞等の病因の１つであると考えられている。また、高血圧、動脈硬化症、急性腎不全に罹病した患者において、血中のエンドセリン−１量が健常者と比較して有意に高いことが報告されている（丸茂ら,医学の歩み，５１−５４，１９９２）。したがって、エンドセリン−１の産生を抑制できれば高血圧症等の疾患を治療または予防できる。

また、エラスチンペプチドは組織プラスミノーゲン活性化因子（組織プラスミノーゲンアクチベータ：ｔ−ＰＡ）産生促進活性を有している。血管の老化に伴う血管の硬化やアテローム性動脈硬化の進展には血管内皮細胞の機能低下による血液凝固亢進及び線溶系低下も関与していると考えられる。
血管内皮細胞で産生される組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）は、プラスミノーゲンを活性化しプラスミンに変換することでフィブリンを分解して血栓を溶解する。
我が国では，食生活の欧米化に伴い高齢者の脳梗塞，虚血性心臓疾患等の循環器疾患の罹患率が増加しており、その予防には線溶系を正常化させることが重要である。従って、ｔ‐ＰＡの産生を促進し、血栓の形成を予防することによって血栓による疾病を治療または予防できると考えられる。

また、エラスチンペプチドは血管内皮細胞に対する増殖促進活性を有している。血管内皮細胞は血管の内膜を構成する細胞で、血圧、血液凝固、線溶系をコントロールする生理活性物質を産生し、血管環境を維持している。しかし、加齢や酸化ストレスの蓄積によって血管内皮細胞は恒常的に障害を受けており、その機能は低下する。動脈硬化症や血栓症の進展は内皮機能の低下が要因であると考えられており、血管内皮細胞を修復し、増殖促進作用を高めることは、これらの血管系疾患の予防及び改善に重要であると考えられる。

カラムクロマトグラフィー等の公知の方法を用いてエラスチンペプチドを分画し、個々のフラクションについて各活性のアッセイを行うことにより、上述の活性を有するフラクションを単独で、或いは任意の２以上を組み合わせて用いてもよく、エラスチンペプチドの分離精製を行うことなく、混合物のまま用いてもよい。いずれの場合においても、エラスチンペプチドは、老化した血管を改善する効果を持っていてよい。

エラスチンペプチドを担体等と混合することにより、老化した血管を改善する効果を有する医薬組成物として用いることができる。医薬組成物のヒトあるいは動物に対する投与形態としては、経口、経直腸、非経口（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与など）等が挙げられ、投与量は、医薬組成物の製剤形態、投与方法、使用目的及びこれに適用される投与対象の年齢、体重、症状によって適宜設定され一義的に決定することは困難であるが、ヒトの場合、一般には製剤中に含有される有効成分の量で、好ましくは成人１日当り０．１〜２０００ｍｇ／ｋｇである。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。

経口投与製剤として調製する場合は、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、コーティング剤、液剤、懸濁剤等の形態に調製することができ、非経口投与製剤にする場合には、注射剤、点滴剤、座薬等の形態に調製することができる。製剤化には、任意の公知の方法を用いることができる。例えば、エラスチンペプチドと、製薬学的に許容し得る担体又は希釈剤、安定剤、及びその他の所望の添加剤を配合して、上記の所望の剤形とすることができる。

血管改善剤を含む食品としては、エラスチンペプチドをそのまま食品として調製したもの、他の食品に添加したもの、あるいは、カプセル、錠剤等、食品又は健康食品に通常用いられる任意の形態をとることができる。

食品中に配合して摂取あるいは投与する場合には、適宜、賦形剤、増量剤、結合剤、増粘剤、乳化剤、着色料、香料、食品添加物、調味料等と混合し、用途に応じて、粉末、顆粒、錠剤等の形に成形することができる。また、適宜、食品原料中に混合して食品を調製し、血管改善効果を有する機能性食品として製品化することによって摂取することができる。

血管改善剤を含む飼料としては、エラスチンペプチドをそのまま調製したもの、あるいは飼料に配合したもの等、様々な形態をとることができる。飼料中に混合して、家畜などの動物に投与する場合には、予め飼料の原料中に混合して、機能性を付与した飼料として調製することができる。また、飼料に添加して投与することもできる。すなわち、エラスチンペプチドを有効成分として含む血管改善剤は、ブタ、ニワトリ、ウシ、ウマ、ヒツジ等の家畜や、魚類、ペット（イヌ、ネコ、鳥類）等の飼料に添加することにより、安全で、老化した血管を改善する効果を有する機能性飼料として用いることができる。

次に、本発明の作用効果を確認するために行った実施例について説明する。

実施例１：カツオ由来エラスチンペプチド粉末の製造
新鮮なカツオより動脈球（１００ｇ）を採取し、流水洗浄後粉砕した。原料の前処理として０．０２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に冷蔵庫中で１週間浸漬した。浸漬後、流水洗浄により過剰のアルカリを除去し、排出液が中性となるまで流水洗浄した。これに３倍容の蒸留水を加え、９５℃に加熱後、上清を取り除くことにより、脂質及びコラーゲン質を除去した。残留物をフードカッターで細片化し、プロチンＡＣ−１０Ｆ（大和化成製０．５％）及びプロテアーゼＮ「アマノ」Ｇ（天野エンザイム製）０．１％を基質量の１％添加し、１０時間分解を行った。８５℃以上の温度で加熱失活を行い、ろ過及び遠心分離により残渣を分離した。その後精密ろ過によって清澄化した抽出液を噴霧乾燥し、水溶性のエラスチンペプチド粉末（８ｇ）を得た。

実施例２：ハマチ由来エラスチンペプチド粉末の製造
原料として新鮮なハマチより採取した動脈球を用い、実施例１と同様の操作により、エラスチンペプチド粉末を得た。

実施例３：マグロ由来エラスチンペプチド粉末の製造
原料として新鮮なマグロより採取した動脈球を用い、実施例１と同様の操作により、エラスチンペプチド粉末を得た。

実施例１〜３により得られたエラスチンペプチドのアミノ酸分析結果を、下記の表１に示す。

いずれのエラスチンペプチドについても、１０００残基あたりのグリシン、アラニン、バリン及びプロリン含量の合計が６５０残基以上であり、アスパラギン酸及びアスパラギン含量の合計が１０〜３５残基であり、グルタミン酸及びグルタミン含量の合計が２０〜５０残基であり、リジン、ヒスチジン及びアルギニン含量の合計が２０残基〜５０残基であり、デスモシン及びイソデスモシン含量の合計が０．３残基以上であり、ヒドロキシプロリン含量が１０残基以下であることがわかる。

実施例１〜３により得られたエラスチンペプチドのタンパク質、脂質、水分、及び灰分分析結果を、下記の表２に示す。

実施例１〜３により得られたエラスチンペプチドの分子量測定結果（財団法人日本食品分析センター：ＴＳＫｇｅｌ Ｇ２５００ＰＷＸＬカラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーにより測定）を、下記の表３に示す。なお、表３において「％」は重量％を意味する。

いずれのエラスチンペプチドについても、分子量１０００以下のものが占める割合が７０％以上であることがわかる。

実施例４：エラスチンペプチドが加速度脈波に及ぼす影響の検討
４６名の被験者（男性３０名、平均年齢４３．８±１１．５歳、女性１６名、平均年齢４２．３±１１．８歳）に、実施例１〜３により得られたエラスチンペプチドを含有するサプリメントを投与し、投与前及び投与開始後１月毎に、加速度脈波の測定を行った。投与したサプリメント（占部大観堂製薬株式会社に調製を依頼）の配合は表４のとおりとした。サプリメントは、チャックシールアルミパウチ（乾燥剤封入、２５０ｍｇ×１５０錠入）で提供した。

エラスチンペプチド含有サプリメント２錠を、就寝前に水又はぬるま湯にて摂取させた。１日あたりのエラスチンペプチド摂取量は３６０ｍｇとした（タンパク質含量９０％と仮定）。

加速度脈波の測定は、当社診療所にて看護師指導の下、加速度脈波測定システムＡｒｔｅｔｔ（（株）ユメディカ）により行なった。被験者は５分間程度の安静の後、Ａｒｔｅｔｔセンサに人差し指もしくは中指を挿入して１８秒間の指先容積脈波、指先容積脈波の二次微分波である加速度脈波を測定した。加速度脈波を構成する要素波のうち、血管弾力性や抵抗性に関与するｂ波、ｄ波よりＷａｖｅｆｏｒｍ ｉｎｄｅｘ及び血管老化偏差値を得た。

実施例１により得られたエラスチンペプチドより調製したサプリメントを投与した各被験者（男性群及び女性群）の加速度脈波波形パラメータ及び血管老化偏差値は、下記の表５及び表６に示すとおりであった。結果は平均±標準偏差で示した。なお、「ｐ＜０．０５」及び「ｐ＜０．０１」は、それぞれ、ｔ検定における有意確率ｐ値が５％未満及び１％未満であることを表したものである。

男性群において、摂取３月目より加速度脈波（波高比ｂ／ａ、Ｗａｖｅｆｏｒｍ ｉｎｄｅｘ Ｉ）及び血管老化偏差値に有意な改善が認められた。女性群では５月目に加速度脈波（波高比ｄ／ａ）に有意な改善が認められた。
なお、実施例２及び実施例３で得られたエラスチンペプチドについても同様の結果が得られた。

実施例５：平滑筋増殖阻害活性の測定
細胞は正常ヒト大動脈血管平滑筋細胞（クラボウ）を使用し、培養培地は専用培地であるＨｕｍｅｄｉａ−ＳＧ２を使用した。

２５ｃｍ^２フラスコにてセミコンフルエントになるまで平滑筋細胞を培養し、常法にて細胞を回収した。回収した細胞は、Ｈｕｍｅｄｉａ−ＳＧ２を用いて２×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに０．１ｍｌずつ播種した。細胞播種２４時間後に培地を除去し、エラスチンペプチドを溶解した培地０．１ｍｌを添加した（最終エラスチン濃度１２５、２５０、５００、１０００、２０００μｇ／ｍＬ）。培養開始から４日後（エラスチンペプチド添加から３日後）に培養上清を除去し、ＰＢＳで細胞表面を洗浄し新たな培地を１００μｌ／ｗｅｌｌずつ添加した。さらにｃｅｌｌｃｏｕｎｔｉｎｇｋｉｔ−８（同仁化学研究所）を１０μｌ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１時間保持した。色素が発色している事を確認し、マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍを測定した。

実施例１で得られたエラスチンペプチドについて、結果を図２に示す。エラスチンペプチドを添加したもの全てに増殖抑制の傾向が見られ、１０００、２０００μｇ／ｍＬ添加した区ではコントロールに対しそれぞれ９０．２％、８２．２％の細胞増殖率（ともにｐ＜０．０１）となり、平滑筋増殖抑制効果があることが示唆された。
なお、実施例２及び実施例３で得られたエラスチンペプチドについても同様の結果が得られた。

実施例６：エンドセリン−１産生抑制活性の測定
細胞は正常ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（クラボウ）を使用し、培養培地は専用培地であるＨｕｍｅｄｉａ−ＥＧ２を使用した。
２５ｃｍ^２フラスコにて前培養した血管内皮細胞を常法にて回収した。回収した細胞を１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるよう２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅへ播種し、ほぼコンフルエントとなるまで４〜５日間培養した。培地を除去し、ＰＢＳで洗浄した後、培地０．９ｍｌとＰＢＳに溶解した実施例１で得られたエラスチンペプチド、または対照（コントロール）としてＰＢＳを０．１ｍｌ添加し、エラスチンペプチドの終濃度を０．１、０．５、１、５μｇ／ｍＬとした。エラスチンペプチド溶液は０．２２μｍのフィルターを通すことにより滅菌したものを使用した。３７℃、５％ＣＯ_２下で２４時間培養後、培養上清を回収し、サンプルとした。培養上清中のエンドセリン−1量はＥｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１（ｈｕｍａｎ）ＥＩＡ Ｋｉｔ（ａｓｓａｙ ｄｅｓｉｇｎｓ）にて定量した。

図３に示すとおり、エラスチンペプチドによって濃度依存的にエンドセリン−１産生が抑制され、その産生量は対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）におけるエンドセリン−１の産生量を１００％とすると、１μｇ／ｍＬでは８９．８％、５μｇ／ｍＬでは８８．１％（共にｐ＜０．００１）であった。これらの結果から、実施例１で得られたエラスチンペプチドにエンドセリン産生抑制活性があることが確認された。
なお、実施例２及び３で得られたエラスチンペプチドについても同様の結果が得られた。

実施例７：組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）産生抑制活性の測定
細胞は正常ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（クラボウ）を使用し、培養培地は専用培地ＨｕＭｅｄｉａ−ＥＧ２（クラボウ）を用いた。
２５ｃｍ^２フラスコにて前培養した血管内皮細胞を常法にて回収した。回収した細胞を１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるよう２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅへ播種し、ほぼコンフルエントとなるまで４〜５日間培養した。培地を除去し、ＰＢＳで２回洗浄した後、測定培地（ＲＰＭＩ１６４０（５％ＦＢＳを含む））０．９ｍｌとＰＢＳに溶解した実施例１で得られたエラスチンペプチド、または対照（コントロール）としてＰＢＳを０．１ｍｌ添加し、エラスチンペプチドの終濃度を１０、１００、１０００μｇ／ｍＬとした。エラスチンペプチド溶液は０．２２μｍのフィルターを通すことにより滅菌したものを使用した。３７℃、５％ＣＯ_２下で２４時間培養後、培養上清を回収した。回収後、４℃、２０００ｇで１０分間遠心分離し、上清をサンプルとした。培養上清中のｔ−ＰＡ量はＡｓｓａｙ Ｍａｘ Ｈｕｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅ‐Ｔｙｐｅ Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ＡＳＳＡＹＰＲＯ）にて定量した。

図４に示すとおり、エラスチンペプチドによって濃度依存的にｔ−ＰＡ産生が促進され、その産生量は対照（コントロール）のｔ−ＰＡ量を１００％とすると、１０μｇ／ｍＬでは１０５．２％、１００μｇ／ｍＬでは１０６．２％（ｐ＜０．０５）、１０００μｇ／ｍＬでは１１３．１％（ｐ＜０．０１）であった。これらの結果から、実施例１で得られたエラスチンペプチドにｔ−ＰＡ産生促進活性があることが確認された。
なお、実施例２及び３で得られたエラスチンペプチドについても同様の結果が得られた。

実施例８：血管内皮細胞に対する増殖促進活性の測定
細胞は正常ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（クラボウ）を使用し、培養培地は専用培地であるＨｕｍｅｄｉａ−ＥＧ２を使用した。
２５ｃｍ^２フラスコにて前培養した血管内皮細胞を常法にて回収した。回収した細胞をＥＧ−２培地に懸濁し、９６ｗｅｌｌプレートに１×１０^３ｃｅｌｌｓ播種した。同時にＰＢＳに実施例１で得られたエラスチンペプチドを溶解させた被験物を培養液の１／１０量添加した。ＣＯ_２インキュベーター内で（３７℃、５％ ＣＯ_２）３日間培養後、ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。対照（コントロール）としてＰＢＳのみ添加した。コントロールの吸光度を１００とし、エラスチンペプチド添加区の相対値を求めた。

図５に示すとおり、実施例１で得られたエラスチンペプチドによって濃度依存的に血管内皮細胞増殖促進効果を示し、コントロールに対して１２．５μｇ／ｍＬ添加区では１０８％、２５μｇ／ｍＬでは１１０％、５０μｇ／ｍＬでは１１５％（ｐ＜０．０１）であった。
なお、実施例２及び３で得られたエラスチンペプチドについても同様の結果が得られた。

Claims (8)

1. 魚類の動脈球より抽出されたエラスチンペプチドを有効成分として含むことを特徴とする血管改善剤。
2. グリシン、アラニン、バリン及びプロリン含量の合計が６５０残基／１０００残基以上であり、
   アスパラギン酸及びアスパラギン含量の合計が１０残基／１０００残基以上３５残基／１０００残基以下であり、
   グルタミン酸及びグルタミン含量の合計が２０残基／１０００残基以上５０残基／１０００残基以下であり、
   リジン、ヒスチジン及びアルギニン含量の合計が２０残基／１０００残基以上５０残基／１０００残基以下であり、
   デスモシン及びイソデスモシン含量の合計が０．３残基／１０００残基以上であり、
   ヒドロキシプロリン含量が１０残基／１０００残基以下であることを特徴とする請求項１記載の血管改善剤。
3. 前記エラスチンペプチドのうち、分子量が１０００以下のものの割合が７０％以上であることを特徴とする請求項１又は２記載の血管改善剤。
4. 加速度脈波のｂ／ａ値を減少させ、かつｄ／ａ値を増大させる活性を有することを特徴とする請求項１から３のいずれか１項記載の血管改善剤。
5. 平滑筋増殖阻害活性を有することを特徴とする請求項１から４のいずれか１項記載の血管改善剤。
6. 血管内皮細胞におけるエンドセリン−１産生抑制活性を有することを特徴とする請求項１から５のいずれか１項記載の血管改善剤。
7. 血管内皮細胞における組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）産生促進活性を有することを特徴とする請求項１から６のいずれか１項記載の血管改善剤。
8. 血管内皮細胞増殖賦活活性を有することを特徴とする請求項１から７のいずれか１項記載の血管改善剤。

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