JP5590704B2

JP5590704B2 - 魚類由来の水溶性エラスチンを有効成分とする血小板凝集阻害剤

Info

Publication number: JP5590704B2
Application number: JP2009252500A
Authority: JP
Inventors: 孝二岡元; 絵理白土; 操子中場
Original assignee: Kyushu Institute of Technology NUC; Hayashikane Sangyo Co Ltd
Current assignee: Kyushu Institute of Technology NUC; Hayashikane Sangyo Co Ltd
Priority date: 2009-11-03
Filing date: 2009-11-03
Publication date: 2014-09-17
Anticipated expiration: 2029-11-03
Also published as: JP2011093872A

Description

本発明は、魚類由来の水溶性エラスチンを有効成分として含む血小板凝集阻害剤に関する。

エラスチンとは、動物、特に哺乳動物の皮膚の真皮、靭帯、腱、血管壁等の結合組織の中に、コラーゲンと共に存在するタンパク質である。エラスチンは、通常、生体内においては、３次元の網目構造の不溶性のタンパク質として存在している。かかるエラスチンを、酸又はアルカリで加水分解したり、酵素で処理することによって、水溶性エラスチンが得られることは広く知られている。水溶性エラスチンは、水分を豊富に保持する能力を有することから、化粧品、特に保湿剤として利用されている他（例えば、特許文献１〜３）、皮膚に弾力を与える等の美容効果があるとして、コラーゲン等と共に健康食品としても利用されている（例えば、特許文献４〜６）。また、魚類エラスチンも健康食品や化粧品の添加剤として開発されている。

更に水溶性エラスチンは、抗血栓性という性質を有しているが、その特徴を生かして、人工血管基材の内壁面にコラーゲン層を設け、これに水溶性エラスチンを架橋剤によって架橋させること（特許文献７）や、架橋剤によって架橋させたエラスチンとコラーゲン等の生体高分子との混合物を、医療用材料として用いることも提案されている（特許文献８）。しかしながら、哺乳動物由来の水溶性エラスチンは、高濃度で用いないと血小板凝集阻害効果等の抗血栓性が発揮されにくいという問題があった。

特開昭６０−２５８１０７号公報特公平５−２０４０９号公報特開２００２−２０５９１３号公報特開平６−７０９２号公報特開２００５−１３１２３号公報特開２００５−１３１２４号公報特開平８−３３６６１号公報国際公開第２００２／９６９７８号パンフレット特開２００９−２１９４２２号公報

本発明の課題は、特定の水溶性エラスチンを利用した血小板凝集阻害剤を提供することにある。

本発明は、魚類由来の水溶性エラスチンを有効成分として含み、該水溶性エラスチンが４３，０００以上に分子量分布をもつ血小板凝集阻害剤である。

魚類由来の水溶性エラスチンは、哺乳動物由来の水溶性エラスチン及び／又はそれから得られるペプチドに比較して、より優れた血小板凝集阻害活性を有している。従って、血小板凝集阻害剤として開発されることが期待できる。

カツオ由来水溶性エラスチンとウシ由来水溶性エラスチンの血小板凝集阻害率を示す図。カツオ由来水溶性エラスチンとカツオ由来エラスチンペプチドの血小板凝集阻害率を示す図。

本発明は、魚類由来の水溶性エラスチン及び／又は魚類由来のエラスチンペプチドを有効成分として含む血小板凝集阻害剤である。本発明における魚類とは特に限定はないが、カツオ、ハマチ、サケ等の比較的中ないし大型の魚が適当である。そして、これらの魚類の動脈球由来の水溶性エラスチンあるいはそれから得られるペプチドが好ましく用いられる。また、動脈球以外のエラスチンを多く含む組織由来の水溶性エラスチンあるいはそれから得られるペプチドも用いることができる。本発明におけるペプチドとはオリゴペプチドやポリペプチドを含み、アミノ酸が２〜１００個程度ペプチド結合によって連結した化合物を意味する。

水溶性エラスチンを得る方法・手段は色々と知られている。例えば、エラスチンを魚を含む動物の生体組織から抽出する場合、通常、不要部分の除去や脱脂操作等の前処理を施した動物性生体組織が用いられる。そして、前処理された組織を、ギ酸やシュウ酸を含む所定温度の酸性液に溶解したり、或いは、酵素で処理することによって、動物性生体組織に含まれている不溶性エラスチンを断片化し、水溶性エラスチンを溶解した可溶化液が得られる。あるいは、また、水酸化ナトリウム等のアルカリで水溶性エラスチンを抽出することも知られている（例えば、特許文献９参照）。本発明においては、公知のどのような方法を用いてもかまわない。また、水溶性エラスチンをペプチド化する方法も公知の方法で行うことができ、特に制限されるものではない。

本発明の魚類由来の水溶性エラスチン及び／又はエラスチンペプチドは、後述のごとく、優れた血小板凝集阻害活性を有している。従って、本発明の魚類由来の水溶性エラスチン又はエラスチンペプチドは、それを有効成分とする血小板凝集阻害剤あるいは抗血栓剤としての医薬として利用できる。

本発明の医薬は、有効成分である水溶性エラスチン及び／又はエラスチンペプチドと、薬学上許容される添加物とを混合することにより製造できる。本発明の医薬は、経口投与または非経口投与することができる。経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤が挙げられる。非経口剤としては、注射剤や点滴剤が挙げられる。これらの製剤は、製剤分野で通常行われている手段・方法により、薬学上許容される担体を用いて製剤化することができる。

医薬としての投与量は、被投与者の年齢、体重、症状、投与時間、剤形、投与方法、薬剤の組み合わせ等に依存するが、例えば、本発明の有効成分を医薬として経口投与する場合は、成人１人当たり０．５〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重である。

以下、実施例により本発明を詳述する。

[カツオ由来水溶性エラスチンの単離・調製]
カツオ動脈球から、水溶性エラスチンを以下の手順で単離・調製した。カツオ動脈球１００ｇを０．０２Ｎ・ＮａＯＨ水溶液で洗浄した（４℃）。その後、流水洗浄により過剰のアルカリを除去し、排出液が中性となるまで流水洗浄した。これに蒸留水を添加して９５℃で加熱処理し、カツオの動脈球脱脂組織を得た。得られた組織を、１Ｍ・ＮａＣｌ水溶液による処理（４℃、２４時間）を６回繰り返し、次いで、０．０５Ｎ・ＮａＯＨ水溶液処理（５０℃、３０分）、０．０５Ｎ・ＮａＯＨ水溶液処理（５０℃、１５分）を２回、０．０１Ｎ・ＮａＯＨ水溶液処理（４℃、１５分）を３回行って、不溶性エラスチンを得た。得られた不溶性エラスチンを、０．２５Ｍのシュウ酸水溶液による抽出処理（１００℃、３０分）を４回行って、本発明のカツオ由来の水溶性エラスチン１．６４ｇを得た。

[カツオ由来エラスチンペプチドの単離・調製]
カツオ動脈球から、以下の手順でエラスチンペプチドを単離・調製した。カツオ動脈球１００ｇを０．０２Ｎ・ＮａＯＨ水溶液で洗浄した（４℃）。その後、流水洗浄により過剰のアルカリを除去し、排出液が中性となるまで流水洗浄した。これに蒸留水を添加して９５℃で加熱処理し、カツオの動脈球脱脂組織を得た。得られた組織を、０．５％のProtin AC-１０F（大和化成製）と０．１％のProtease N（天野エンザイム製）の水溶液で処理し（５０℃、１０時間）、本発明のカツオ由来のエラスチンペプチドを１０ｇ得た。

[ウシ由来水溶性エラスチンの単離・調製]
比較例として、ウシ項靭帯から、以下の手順でエラスチンペプチドを単離・調製した。ウシ項靭帯１００ｇをアセトン５００ｃｃで洗浄（４℃）し、ウシの項靭帯脱脂組織を得た。これを１Ｍ・ＮａＣｌ水溶液による処理（４℃、２４時間）を６回繰り返し、次いで、０．１Ｎ・ＮａＯＨ水溶液による抽出処理（１００℃、１５分）を６回繰返して、残渣として不溶性エラスチン２２．８ｇを得た。得られた不溶性エラスチンを、０．２５Ｍのシュウ酸水溶液による抽出処理（１００℃、１時間）を６回繰返して、可溶部としてウシ由来の水溶性エラスチン５．１３ｇを得た。

[水溶性エラスチン及びエラスチンペプチドの分子量分布]
上記で単離したカツオ由来水溶性エラスチン、エラスチンペプチド及びウシ由来水溶性エラスチンの分子量分布を、SDS-PAGE及びHPLCにより分析したところ以下のようであった。

カツオ由来水溶性エラスチンは、３，５００〜２０万超の範囲に広域に分布しているものの、４３，０００以上の範囲が主体であった。

カツオ由来エラスチンペプチドは、１０，０００以上は０％、３，０００〜１０，０００が７％、１，０００〜３，０００が１４％、５００〜１，０００が１７％、５００以下が６２％であった（ピーク面積の１００分率で計算）。

ウシ由来水溶性エラスチンは、６５，０００以上の範囲の広域に存在していた。

[水溶性エラスチン及びエラスチンペプチドのアミノ酸組成]
単離・調製したカツオ由来水溶性エラスチン、エラスチンペプチド及びウシ由来水溶性エラスチンのアミノ酸組成を調べるため、アミノ酸分析を行った。各粉末約１ｍｇを、６Ｎ・ＨＣｌの１ｍｌに溶解し、加水分解用チューブに入れ、減圧下で窒素ガス置換後チューブを封管した。その後、４８時間、１１０℃で加水分解した。加水分解サンプルについて、アミノ酸分析を行いアミノ酸組成を算出した結果を表1に示した。

表１においてアミノ酸の組成は、アミノ酸の１０００残基あたりの残基数で表している。Ide及びDesはエラスチンのみに含まれるアミノ酸で、Ideはイソデスモシンを、Desはデスモシンを表す。

[カツオ由来の水溶性エラスチン、エラスチンペプチド及びウシ由来水溶性エラスチンの血小板凝集阻害活性の測定]
（１）血小板の調整
３．１８％クエン酸緩衝液０．３ｍｌを含む採血管で採血したヒト血液３ｍｌを、遠心分離（１０００ｒｐｍ、１０分、３７℃）し、上清のplatelet-rich plasma(PRP)を回収した。沈殿物を含む血液は、再度、遠心分離（１５００ｒｐｍ、１５分、３７℃）を行い、上清のplatelet-poor
plasma(PPP)を回収した。

（２）血小板凝集阻害実験
惹起物質：０．５ｍｇ／ｍｌのコラーゲン溶液
阻害物質：カツオ由来水溶性エラスチン、カツオ由来エラスチンペプチド、
ウシ由来水溶性エラスチン
血小板凝集阻害実験はアグリゴメーター（RIKADENKI）を用いて、比濁法により血小板凝集能を測定した。PPPの透過率を１００％、PRPを０％に調整して凝集能を透過率によって測定した。光源の波長は３６０ｎｍ、スターラーの回転速度は１２００ｒｐｍとした。

先ず、血小板凝集惹起物質であるコラーゲンが、血小板凝集を示す添加量を検討した。キュベットの中にPRPを２５０μｌ入れ、１分間preincubateし、０．５ｍｇ／ｍｌのコラーゲン溶液の異なる量を加え、凝集率を測定した。(最大凝集活性を示すコラーゲン溶液量：７μｌ)

次に、血小板凝集阻害実験はセルの中にPRPを２５０μｌ入れ、1分間preincubate（１，２００ｒｐｍ、３７℃）し、阻害物質である各水溶性エラスチンを添加し、５分間preincubate（１，２００ｒｐｍ、３７℃）した後、惹起物質である０．５ｍｇ／ｍｌのコラーゲン溶液を加え、血小板凝集に対する阻害能を測定した。

様々な濃度のカツオ由来水溶性エラスチン、エラスチンペプチド、及び比較のためにウシ由来水溶性エラスチンを用い、それぞれの溶液を、PPPにより調製し、阻害実験に用いた。そして凝集率曲線を求め、その結果から阻害率を計算した。阻害率は、阻害率＝（コントロールの凝集率）−（各サンプルの凝集率）で計算した。

先ず、カツオ由来水溶性エラスチンとウシ由来水溶性エラスチンの血小板凝集阻害実験を行い、凝集率曲線を求め（図示せず）、その結果から阻害率を計算した。結果は図１に示した。なお、collagen添加５分前に、各濃度（０．１９〜５．２３ｍｇ／ｍｌ）の水溶性エラスチンを添加した。

次に、カツオ由来水溶性エラスチンとカツオ由来エラスチンペプチドの血小板凝集阻害実験を行い、凝集率曲線を求め（図示せず）、その結果から阻害率を計算した。結果は図２に示した。なお、collagen添加５分前に、各濃度（０．１９〜５．２３ｍｇ／ｍｌ）の水溶性エラスチン及びエラスチンペプチドを添加した。

（３）血小板凝集阻害活性の比較
図１から分かるように、カツオ由来水溶性エラスチンはウシ由来水溶性エラスチンよりも血小板凝集阻害活性が高く、５．２３ｍｇ／ｍｌの濃度では約３．５倍も高かった。さらに、図２から分かるように、カツオ由来エラスチンペプチドはカツオ由来水溶性エラスチンよりも血小板凝集活性が高く、５．２３ｍｇ／ｍｌの濃度では約３倍高かった。即ち、カツオ由来エラスチンペプチドはウシ由来水溶性エラスチンよりも、血小板凝集阻害活性が５．２３ｍｇ／ｍｌの濃度では約11倍高かった。

Claims

魚類由来の水溶性エラスチンを有効成分として含み、該水溶性エラスチンが４３，０００以上に分子量分布をもつ血小板凝集阻害剤。
前記水溶性エラスチンが、ギ酸若しくはシュウ酸を含む酸性液又は水酸化ナトリウムを含むアルカリ性溶液への不溶性エラスチンの溶解により得られたものであることを特徴とする請求項１記載の血小板凝集阻害剤。