JP2019187269A - エラスチン分解酵素 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)エラスチンに対して分解活性を有するポリペプチドであって、当該ポリペプチドが、下記の(1)又は(2)のアミノ酸配列を有するポリペプチド。
(1)配列番号1から選択されるアミノ酸配列と同一配列を有するポリペプチド
(2)配列番号1から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(b)本発明のポリペプチドが、ストレプトマイセス属に由来するものである、ポリペプチド、
(c)本発明のポリペプチドが、エラスチンに対して分解活性を有する酵素であって、以下の性質を有する酵素。
(1) 至適反応pH:pH7.0〜11.0
(2) 至適反応温度:50〜80℃
(3) 分子量が、約18kDa、約14kDa、又は約11kDa
培養上清を酵素液として使用することもできるが、UF濃縮、疎水クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等により処理し、精製し、酵素液を得ても良い。
(1)Streptomyces nanshensis(JCM 16226)の胞子懸濁液(107個/ml以上)白金耳を種培地(可溶性コーンスターチ30g/l、コーン・スティープ・リカー30g/l、硫酸アンモニウム1g/l 、硫酸マグネシウム0.5g/l、炭酸カルシウム3g/l、pH7.0)20mlに接種し200ml容三角フラスコで28℃、200rpmで12時間培養し、種培養終了液を得た。
(2)得られた種培養終了液1mlを主培地(可溶性コーンスターチ300g/l、コーン・スティープ・リカー150g/l 、脱脂大豆粉250g/l 、硫酸アンモニウム10g/l 、硫酸マグネシウム5g/l 、炭酸カルシウム30g/l、pH7.0)2000mlに移植し、10l容フラスコで28℃ 、200rpmで40時間培養し、主培養終了液を得た。
(3)酵素処理液をフィルタープレス濾過により、菌体等の固形分を除去し、分画分子量6000のUF膜で処理を行い、濃縮液画分を回収し、これをスプレードライ乾燥してポリペプチドを得た。
精製した酵素をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分子量を検討した。電気泳動後、クマシーブリリアントブルー染色法( シグマ社製) により染色した。結果を図1に示す。約18kDa、約14kDa、約11kDaの付近にバンドが確認された。
約18kDa、約14kDa、約11kDaのタンパク質は常法により内部アミノ酸配列、N末端アミノ酸配列を解析した結果、すべて同一のタンパク質がN末端よりプロセッシングを受けて短くなっていたタンパク質であった。さらに、本エラスターゼ遺伝子の全長を常法により決定した結果、726bpの塩基配列からなる遺伝子であった。約18kDa、約14kDa、約11kDaそれぞれのタンパク質に該当する塩基配列をpNCMO2又はpNY326(タカラバイオ株式会社製)のマルチクローニングサイトにクローニングし、Brevibacillus発現システム(タカラバイオ株式会社製)にて発現解析を行った。その結果、3種いずれのタンパク質についてもエラスチン分解活性を確認した。
筋原線維の分解性ならびにエラスチンの分解性について実施例1で調製した酵素を用いて検討を行った。エラスチン分解活性はエラスチンコンゴーレッド(ナカライテスク社製)を基質として用いて、1時間に495 nmの吸光度を1変化させる酵素活性を1Uとした。 筋原線維の分解性は、ウシ肩肉より調製した1%筋原線維溶液900μlに1U/mlに調製した酵素溶液100μlを加え、pH8.0、25℃で6時間反応させた。その結果、図2で示すように市販の中性、アルカリプロテアーゼ4種(ビオプラーゼOP、ビオプラーゼSP−20FG(以上ナガセケムテックス社製)、アルカラーゼ(ノボザイムズ社製)、プロチンSD−AY10(天野エンザイム社製))よりも筋原線維の分解性が弱いことが明らかになった。エラスチンの分解性は、0.6%ウシ靭帯由来のエラスチン900μlに2U/mlに調製した酵素溶液100μlを加え、pH8.0、25℃で8時間反応させた。その結果、図3示すように本酵素のエラスチンの分解性は市販酵素に比べ、顕著に強いことが明らかとなった。
基質特性の検討と同様に、各種温度、pH、及び温度安定性を測定した。
至適pHは、pH5.0〜7.0(リン酸緩衝液)、pH7.0〜8.5(トリス塩酸緩衝液)、pH8.5〜11.0(炭酸緩衝液)の各条件下でエラスチン分解活性を測定した。pH8.0の活性値を100%とした時の相対値で評価した結果、pH7.0から11.0までの幅広いpHで高い酵素活性を示しており、80%以上の活性が保持されていた(図4)。また、至適のpHは8.0であった。
至適温度を4℃〜80℃の各条件下でエラスチン分解活性を測定した。その結果、4℃〜80℃の幅広い温度帯で活性があり、至適の温度は70℃であった(図5)。
温度耐熱性は、30℃〜70℃の各温度で10分間処理した後の残存活性で評価した。その結果、30℃〜60℃では高い残存活性を有していた(図6)。
カツオ動脈球に含まれるエラスチンの分解活性を検討した。製造例により得られたポリペプチドと特開2005−343851に記載の方法によりエラスチンを分解しエラスチンペプチドを比較した。さらに、製造例に得られたポリペプチドについては、キハダマグロ、ビンチョウマグロの動脈球から得られたエラスチンを処理した。結果は図7示す。
Claims (3)
- エラスチンに対して分解活性を有するポリペプチドであって、当該ポリペプチドが、下記の(1)又は(2)のアミノ酸配列を有するポリペプチド。
(1)配列番号1であらわされるアミノ酸配列と同一配列を有するポリペプチド
(2)配列番号1から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド - 請求項1のポリペプチドが、ストレプトマイセス属に由来するものである、ポリペプチド。
- 請求項1又は2に記載のエラスチンに対して分解活性を有するポリペプチドであって、以下の性質を有する酵素。
(1)至適反応pH:pH7.0〜11.0
(2) 至適反応温度:50〜80℃
(3) 分子量が、約18kDa、約14kDa、又は約11kDa
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