JPH0239896A - 低分子ペプチド組成物及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ■　産業上の利用分野 本発明は、ジペプチドを主成分とする低分子ペプチド組
成物を酵素化学的に製造するものである。

■　従来の技術及び課題 腸管におけるタンパク質の吸収は、タンパク質が胃や陽
のベロテアーゼでオリゴペプチドにまで分解された後、
腸管上皮細胞のペプチダーゼで更に分解されて吸収され
ると考えられている。それゆえジペプチドやトリペプチ
ドの吸収はアミノ酸に比べて非常に早期に行われるとい
う報告もあり、これによればアミノ酸よりジ又はトリペ
プチドの方がより好ましいことになる。

従来、ジペプチドの製造方法は有機合成化学的な方法で
行われている。しかしながら、この方法では、コストが
高くつく上に副生物の除去が困難であり、食品としての
安全性にも問題があった。

また、各種の市販プロテアーゼ剤をタンパク質に作用さ
せても良いが、この場合酵素剤中に含まれるペプチダー
ゼによりアミノ酸化されることが多い。たとえば、アス
ベルノルス　オリゼ（ＡＳｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙ
ｚａｅ）の酵素剤もアミノ酸生成性が強く、これによる
大豆タンパク譬分解物中のアミノ酸は４０％にも及んで
いる。

本発明は、有用なジおよびトリペプチドを主体とするペ
プチド混合物及びその新製造法に関するものである。

■　課題を解決するための手段 本発明はＤＰＣＰａｓｅを有効に作用させジおよびトリ
ペプチドを大量に住辛することを目的にしている。更に
具体的にいえば、Ｄ　Ｐ　ＣＰａ５ｅ　とエンドペプチ
ダーゼおよび場合によってはプロリン特異的エンドペプ
チダーゼを共存させタンパク質を分解する点にある。ま
ずＤＰＣＰａｓｅについてのべる。

ＤＰＣＰａｓｅ　は、たとえばバチルス　ズブチリス（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）　ＨＬ　５２１
株（微下研菌寄託第１０００５号）又はバチルス　プミ
ルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｕｍｉｌｕｓ）　ＨＩ−７
２１株（微工研菌寄託第１０００６号）を通常の墳養法
により培養して生成させることができるものである。な
お、そのＤ　Ｐ　ＣＰａ５ｅの性質は次の通りである。

■）作用 本酵素をＡｌａ−６（アラニン６個よりなるペプチドを
Ａｌａ−６と略記し、同様に例えばアラニン２または３
個よりなるものをＡｈａ−２、Ａｌａ　−３のごとく略
記する。以下同じ）に作用させるとカルボキシ末端より
Ａｌａ−２づつに切断するほか、アンジオテンノンＩ　
　（Ａｓｐ　　Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ　−１１ｕ　−
［（ｉｓ　−Ｐｒｏ　−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ　−Ｌｅｕ）の
カルボキン末端からＨｉｓ　−Ｌ　ｅｕを遊離する。ま
た、ブラジキニン（ｋｒｇ−Ｐｒｏ　−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
　−Ｐｈｅ−３ｅｒＰｒｏ　−Ｐｈｅ　−Ａｒｇ）をＡ
ｒｇ　−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、　ＧｌｙＰｈｅ、　　５ｅｒ
−Ｐｒｏ、　　Ｐｈｅ−Ａｒｇに分解した。すなわち、
本酵素はタンパク質のカルボキシ末端よりアミノ酸の種
類の如何を問わずジペプチド単位でペプチドをｔｌＭす
る。しかしながら、カルボキシ末端より２番目にプロリ
ンがあった場合は切断しない。

■）至適ｐＨ及び安定ｐＨ バチルス　ズブチリスＨＬ　５２１株のものは、ｐ　Ｈ
６，０−１１，０の間で安定であり、至適ｐ　ｌ（は、
７．５である。

バチルス　プミルスＨＬ　７２１株のものは、ｐＨ５，
５−９，０の間で安定であり、至適ｐＨは７．５である
。

■）作用温度 バチルス　ズブチリスＨＬ　５２１株、バチルスプミル
スｉ（Ｌ　７２１株共に酵素の作用量ｌ！！温度は５０
℃で、ｐＨ７，０，６０分処理を条件として４５℃まで
安定であった。

■）分子量 ゲル濾過法により、バチルス　ズブチリスＨＬ５２１株
のものは、１１０．０００　　バチルスプミルスＨＬ　
７２１株のものは、１５５　０００であった。

■）活性測定方法 ］、０ｍＭヘンシイルーグリシル−アラニル−プロリン
Ｑ、　ｌ　ｍ　ｅに２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ　Ｈ７゜
０）０．０５ｍｊ！と酵素液０．０５　ｍ　ｌを加え、
４０°Ｃで１５分反応させ、生ずるアラニル−プロリン
をニンヒドリン法で定量した。

」二重反応で１分間当り１μｍＯ１のアラニルプロリン
を生成する酵素量を１単位とした。

以」二はバチルス　ズブチリス及びバチルス　プミルス
の例であるが、本願においては必ずしもこれらに限定さ
れない。たとえば、上記以外にもウサギの肺に由来する
もの、ブタの腎臓、エシェリヒア　コリ（Ｅ　５ｈｅｒ
ｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　、コリネバクテリウム　イク
イ　（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｅｑｕｉ　）
等の起源のものも本願においてやはり有効に利用できる
ものである。

次にエンドペプチダーゼであるが、このものはプロリン
特異的エンドペプチダーゼを除いて通常のエンドペプチ
ダーゼが保用される。オリゴペプチドを大量に生成し、
かつアミノ酸を余り生成しないものがよい。プロリン特
異的なエンドプロテアーゼの起源もフラボバクテリウム
　メニンゴセブチカム（Ｆ　Ｉａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ　ｍｅｎｉｎｇｏｃｅｐｔｉｃｕｍ　）のほか、たと
えば羊のｗ臓由来の如きも使用できる。

エンドペプチダーゼもＤＰＣＰａｓｅ　も共に作用温度
１作用時間、使用量（力価）　、　　ｐ　Ｈ等において
格別制御ｒＦＪはない。その作用可能範囲内においてエ
ンドペプチダーゼ、プロリン特異性エンドプロテア−ゼ
及びＤＰＣＰａｓｅの作用順序も任意であるが、−Ｃ的
にはエンドペプチダーゼ、プロリン特異的エンドペプチ
ダーゼ、ＤＰＣＰａｓｅの順に作用させるのがｆｉｌで
ある。

なお、基質であるタンパク質はその起源、品種等を問わ
ずいずれも採用される。たとえば大豆タンパク冗、小麦
タンパク質、乳タンパク質又は卵白などである。

■　作用 バチルス　ズブチリス及びバチルス　プミルスの産生ず
るＤ　Ｐ　ＣＰａ５ｅ　は本発明者によってカルボキシ
末端からアミノ酸２個単位で作用しジペプチドを生成す
ることが明らかになった。すなわち、前述の■課題を解
決するための手段の項において酵素の作用として述べた
ようにへ１ａ−６を３個のＡｌａ−２に、ブラジキニン
を３個のジペプチドと１個のトリペプチドに切断する。

しかし、アンジオテンシンＩの例にみられるようにカル
ボキシ末端より２番目にプロリンが存在すると反応は進
行しない。このことは、Ａｌａ　−Ａｌａ−Ｐｒｏ　−
Ａｌａに作用しないことからも一般的性質といえる。

この反応の阻害を克服するため本発明者は種々検討の結
果フラボバクテリウム　メニンゴセブチカムに代表され
るプロリン特異的エンドペプチダーゼを共存させまたは
予め作用させると再びＤＰＣＰａｓｅの作用が始まるこ
とを発見し７た。

上記のようにＤＰＣＰａｓｅ　とプロリン特異的エンド
ペプチダーゼを共同作用させれば理論上は蛋白質をすべ
てジペプチドに分解することができる。

しかし実際に各種のペプチドやカゼインなどの高分子タ
ンパク′ｎに作用させるとペプチドに比べ著しく作用が
劣り、場合Ｇごよってばほとんど作用しない。この原因
について種々検討を行ったところ、エンドプロテアーゼ
を作用させ、オリゴペプチド化した後、ＤＰＣＰａｓｅ
ならびにプロリン特異的エンドペプチダーゼを作用させ
ると効率よくノおよびトリペプチドが生成することが判
明した。

■　実施例 実施例１ １％ペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％食塩を含
む培地をｐ　Ｈ７，３に調整し、殺菌後バチルスズブチ
リスＨＬ　５２１株を接種し、３７℃・１６時間培養す
る。培養後、遠心分離により菌体を得、ｌ０ｍＭリン酸
緩衝液で懸濁し超音波で菌体を破砕した。さらに遠心分
離により菌体破砕物を除去した。

上澄液にはＤＰＣＰａｓｅ　Ｏ，０３Ｕ／ｍＡ’を含ん
でいた。この上１７１をＱ−セファロース、ハイ）・ロ
キノルアバタイト、’Ｔ’ＳＫ　　ｇｅｌ　　Ｇ３００
０ＳＷ　Ｘ　Ｌなどの各種クロマｉ・グラフィーにより
精製した。得られた精製酵素はゲル電気泳動によって単
一のタンパク質の挙動を示した。収率は約１％であった
。

実施例２ バチルス　プミルスＨＬ　７２１株を実施例Ｉと同組成
の培地で同一条件にて培養した。同（策の精製条件にて
同様の作用を示す酵素を得ることができた。収率は１゜
５％であっｆ、−０ 実施例３ １ｇのオボアル）゛ミンを１００ｍ／の水に７容解しバ
チルス　ズブチリスのエンドペプチダーゼ０１ｇを加え
４０℃・４時間作用させた。１００°Ｃに加熱しエンド
ペプチダーゼを失活さセた後、プロリン特異的エンドペ
プチダーゼ５Ｕを加工４０℃１６時間作用させた。１０
０℃に加熱しプロリン特異的エンドペプチダーゼを失゛
活させた後、ＤＰＣＰａｓｅＯ１５Ｕを加えさらに４０
℃で１６時間反応させた。

それぞれの段階に於ける反応物のゲル濾過法による分子
量の割合を表１に示す。

表１ 基質の分解度 以上のように分子１１０００以下の低分子量のペプチド
を主成分とする組成物を得ることができた。

■　本発明の効果 本発明に使用の酵素の特異性から、本発明の低分子組成
物は、ジペプチドを主成分とするので、経口投与した場
合、腸管において速やかに吸収されやすいものであり、
栄養的にみてすぐれたものである。

特許出願人　江崎グリコ株式会社

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）タンパク質の水溶液をエンドペプチダーゼとジペ
   プチジルカルボキシペプチダーゼ（以下、ＤＰＣＰａｓ
   ｅと略記する）とによって加水分解してなることを特徴
   とする低分子ペプチド組成物。
2. （２）タンパク質の水溶液にエンドペプチダーゼとＤＰ
   ＣＰａｓｅとを添加してこれを加水分解することを特徴
   とする低分子ペプチド組成物の製造方法。
3. （３）エンドペプチダーゼとしてプロリン特異的エンド
   ペプチダーゼを使用することを特徴とする特許請求の範
   囲の（１）又は（２）記載の低分子ペプチド組成物又は
   その製造方法。
4. （４）加水分解の条件として温度２５〜６０℃、８〜７
   ２時間とすることを特徴とする特許請求の範囲の（１）
   又は（２）記載の低分子ペプチド組成物又はその製造方
   法。
5. （５）エンドペプチダーゼとして通常のエンドペプチダ
   ーゼとプロリン特異的エンドペプチダーゼとを併用する
   ことを特徴とする特許請求の範囲の（１）又は（２）記
   載の低分子ペプチド組成物又はその製造方法。