CN102770439A - 从大豆工艺流中回收鲍曼-贝克抑制剂蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明描述了纯化具有指定的总BBI蛋白浓度和其它BBI特性(包括例如胰凝乳蛋白酶抑制剂活性和内毒素含量)的BBI产品的新方法。

Description

从大豆工艺流中回收鲍曼-贝克抑制剂蛋白的方法

相关申请的交叉引用

本专利申请要求提交于2009年12月30日的美国临时申请序列61/291，312的优先权，该临时申请全文以引用方式并入本文。

发明领域

本公开提供了从大豆工艺流中回收纯化的鲍曼-贝克抑制剂(BBI)蛋白的方法。具体地讲，本公开提供的方法包括层析分离，以及任选地，分离和移除BBI产品的一种或多种分离技术，所述BBI产品具有以总BBI蛋白浓度表示的至少90重量％的纯度。

发明背景

大豆工艺流包含显著量的蛋白酶抑制剂。蛋白酶抑制剂已知至少抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶以及可能抑制调控一些关键代谢功能的多种其它关键跨膜蛋白酶。蛋白酶的局部给药对于例如特应性皮炎的病症是有用的，特应性皮炎是皮肤炎症的一种普通形式，其可以局限于少数区块或者涉及身体的大部分。蛋白酶抑制剂的褪色活性和它们防止紫外线导致的色素沉着的能力在体外和体内均已被证明(参见例如，Paine等人，J.Invest.Dermatol.，116：587-595[2001])。蛋白酶抑制剂还被报道有利于创伤愈合。例如，分泌性白细胞蛋白酶抑制剂被证明当被局部施用时逆转了组织的破坏并加速了创伤愈合过程。此外，丝氨酸蛋白酶抑制剂还能够有助于在红斑狼疮病人中降低疼痛(参见例如，美国专利6,537,968)。

天然存在的蛋白酶抑制剂可见于多种食物中，例如粮谷类(燕麦、大麦和玉米)、芽甘蓝、洋葱、甜菜根、小麦、龙爪稷和花生。所关注的一个来源是大豆。大豆中存在的蛋白酶抑制剂的平均水平，两种对于库尼兹和鲍曼-贝克最重要的蛋白酶抑制剂分别是约1.4％和0.6％。

称为鲍曼-贝克(Bowman-Birk)蛋白酶抑制剂(BBI)的蛋白酶抑制剂，是从大豆分离的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的低分子量蛋白(7-8kDa)双头抑制剂。它最早是在超过六十年前被发现的(Bowman，Proc.Soc.Exptl.Med.，1946，63，574；并随后还被Birk，Y.Biochim.Biophys.Acta，1961，54，378-381；和Birk Y.等人，BiochemicalPreparations，1968，第12卷，第25-29页表征)，并且由于发现其在多种实验体系中有效的抗癌效应，已重新吸引了科学界的兴趣。

除了抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶外，BBI还具有抑制其它蛋白酶活性的能力，例如组织蛋白酶G、弹性蛋白酶和类糜蛋白酶(Birk Y.，Int J Pept Protein Res，1985，25：113-131；Larionova等人，Biokhimiya，1993，58：1437-1444；和Ware等人，Archives of Biochemistry andBiophysics 1997，344：133-138，它们每个均以引用方式并入本文)。BBI蛋白由大约65-77个氨基酸残基和大约七个二硫键组成。BBI是蛋白，其特征在于高的半胱氨酸氨基酸浓度(～20重量％)、高的水溶性、对热变性的抗性和具有在独立的抑制位点抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的能力。

在培养物和实验动物中，粗制的或纯化的BBI阻止或减少多种类型的诱导的细胞恶性转化是普遍已知的(Kennedy，A.R，The Bowman-BirkInhibitor from soybeans as an anticarcinogenic agent，Am J of ClinicalNutr，1998：68，1406S-1412S)。也参见例如：(1)Kennedy，A.R.Chemopreventive agents：protease inhibitors.Pharmacology&Therapeutics78：167-209，1998；(2)Kennedy，A.R.Overview：Anticarcinogenic activityof protease inhibitors.In：Protease Inhibitors as Cancer ChemopreventiveAgents；(3)Troll，W.，Kennedy，A.R.(编辑)；Plenum PublishingCorporation：New York，9-64，1993；(4)Kennedy，A.R.，Szuhaj，B.F.，Newberne，P.M.，Billings，P.C.Preparation and production of a cancerchemopreventive agent，Bowman-Birk Inhibitor Concentrate.Nutr.Cancer19：281-302，1993；(5)Kennedy，A.R.Prevention ofcarcinogenesis byprotease inhibitors.Cancer Res.(suppl.).54：1999s-2005s，1994；(6)Kennedy，A.R.In vitro studies of anticarcinogenic protease inhibitors.In：Protease Inhibitors as Cancer Chemopreventive Agents；Troll，W.，Kennedy，A.R.(编辑)；Plenum Publishing Corporation：New York，65-91，1993(7)Kennedy，A.R.，The Status of Human Trials UtilizingBowman-Birk Inhibitor Concentrate from Soybeans.In：Soy in Health andDisease Prevention，Michihiro Sugano(编辑)，CRC Press LLC，BocaRaton，Florida，第12章，第207-223页，2005；(8)Kennedy，A.R.Statusof current human trials utilizing Bowman Birk Inhibitor Concentrate.Proceedings of a Symposium，“Soy&Health 2006；DieteticApplications-Dietetic Applications”，在2006年10月12日和13日举行，Dusseldorf，Germany(已接受)；(9)Bartsch和MolecularMechanisms of Cancer Induction and Chemoprevention.In：Chemoprevention of Cancer and DNA Damage by Dietary Factors，Siegfried Knasmuller，Ian Johnson，David DeMarini和Clarissa Gerhauser(编辑)，Wiley-VCH Verlag，GmbH&Co.，KGaA，Weinheim，2009。

富集了BBI的大豆提取物，通常称为鲍曼-贝克抑制剂浓缩物(BBIC)，已于1992年4月取得了美国食品与药品管理局(FDA)的研究中新药(IND)地位。BBIC已显示在某些条件下表现出针对细胞恶性转化的抑制性活性，并且其施用已显示影响多种形式的癌症。参见例如美国专利7,404,973。又如，终生以1.0％膳食BBIC维持生存的动物已显示不具有生长异常并且发现具有显著延长的寿命(Kennedy等人，NutrCancer，1993，19：281-302)。

BBIC也显示出在动物模型和人类临床试验中具有在治疗口腔癌、肌肉萎缩症和预防肌肉消耗方面的活性、抗炎性活性、辐射防护活性。(参见例如Kennedy，A.R.，Soy and Health and Disease Prevention，2005和Sweeney等人的美国专利公布US 2008/0300179A1)。在小鼠中，BBIC还已显示能够在腹膜内注射之后在肺、肾和肝脏组织中抑制蛋白分解活性(Oreffo等人，Toxicology，1991，69：165-176)。BBIC还已显示减轻了神经肌肉疾病的影响(美国专利申请公布20080300179，Morris等人，J Appl Physiol.2005年11月；99(5)：1719-27，Arbogast等人，JAppl Physiol.2007年3月；102(3)：956-64)。

上文提及的美国专利5,338,547公开了用高度活性的BBI浓缩物(BBIC)产品阻止和抑制癌生成的方法，其中生物活性的水平通过胰凝乳蛋白酶抑制剂含量测量。这些BBI浓缩物产品是由从脱脂的大豆粉或大豆粕获得的酸性大豆可溶物制得的，所述酸性大豆可溶物是用pH 4-5的含水的酸提取的，并且不溶物已通过离心从其中移除。使所述大豆可溶物经过超滤以制备粗制的BBI浓缩物，所述粗制的BBI浓缩物被稀释和喷雾干燥以制备最终的干燥的BBI浓缩物产品。在本专利中公开的优选的方法实施方案中，用丙酮处理所述粗制的BBI浓缩物以产生BBI浓缩物沉淀，所述沉淀被空气干燥、研磨、用水再浆化、过滤然后冻干或喷雾干燥，以制备最终的BBI浓缩物产品。该产品被声明是癌发生的改善的抑制剂。Kennedy还提及BBI浓缩物产品能够通过Odani等人(J.Biochem.1973，74，857)所述的方法被进一步纯化，该方法涉及将所述BBIC产品片段化为两个分离的片段，一个片段具有胰蛋白酶抑制性位点，而另一个片段具有胰凝乳蛋白酶抑制性位点。然而，具有胰凝乳蛋白酶抑制性位点的级份的抑制性活性是被严重破坏的。

BBIC也显示出在动物模型和人类临床试验中具有在治疗口腔癌、肌肉萎缩症和预防肌肉消耗方面的活性、抗炎性活性、辐射防护活性。(参见例如Kennedy，A.R.，Soy and Health and Disease Prevention，2005和Sweeney等人的美国专利公布US 2008/0300179A1)。在小鼠中，BBIC还已显示能够在腹膜内注射之后在肺、肾和肝脏组织中抑制蛋白分解活性(Oreffo等人，Toxicology，1991，69：165-176)。

鉴于BBIC产品可以提供用于阻止或减缓癌发生的潜在疗法的可能性，已尝试通过多种方法制备纯的和各种各样的BBIC制备物来作为用于各种不同癌症的潜在的治疗药物(美国专利5,217,717；Kennedy等人在美国专利5,338,547中提供了对相关文献的综述，其全文以引用方式并入本文)。同样授予Kennedy等人的美国专利4,793,996公开了用丙酮处理大豆、然后是乙醇萃取和丙酮沉淀的用于获得BBIC的方法。Kennedy等人发现通过在Perlmann等人，Methods in Enzymology，19：860-861(1970)提出的乙醇萃取步骤之前用丙酮处理大豆，所得BBIC在抑制细胞的恶性转化方面较有效。

当前在本领域使用的纯化方法有多种。一些方法使用利用固载化胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶的亲和纯化。固载化胰蛋白酶将结合BBI和库尼兹胰蛋白酶抑制剂(KTI)，因此未分离出特别纯的BBI产品。作为另外一种选择，涉及使用固载化胰凝乳蛋白酶的方法，虽然它不结合KTI，具有多个问题，例如胰凝乳蛋白酶在多个使用和清洁步骤后可能从树脂中滤掉。许多以前的BBI纯化方法使用阴离子交换层析，该技术能够引起BBI异构体的精馏，此外，用阴离子交换层析获取无KTI的BBI级份、同时不显著损失BBI的产量一直是困难的。因此，迄今使用的方法尚不能产生如本文所述的纯化BBI。

本领域已知的目前用于获得纯化的BBI蛋白的方法受困于因库尼兹胰蛋白酶抑制剂(KTI)蛋白对BBI的污染导致的低纯度水平。取决于所使用的分离方法，内毒素水平同样是问题。目前的方法使用完整大豆作为原料，其可以随后通过多种方法脱脂。与此相对，本发明的方法使用脱脂的白大豆粕作为原料。因此，现有技术尚未描述具有高纯度水平的BBI产品，并且具体地，现有技术尚未描述从大豆获得的具有高纯度水平的BBI产品。此外，这里我们指出BBI是在二十世纪四十年代由Bowman鉴定的，并且还在二十世纪六十年代由Birk表征(BowmanD.E.，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，63：547-550，1946；Birk，Y.Biochim.Biophys.Acta，1961，54，378-381；和Birk.Y.等人，BiochemicalPreparations，1968，第12卷，第25-29页)。然而，在文献中或商业上没有任何BBI产品具有如本文所述的纯度水平。

因此，需要一种可用于从大豆工艺流中回收纯化BBI蛋白、以及其它组分的方法。因此，本发明描述了分离包含高纯度BBI蛋白的BBI产品的新方法。此外，本发明的方法利用比本领域当前已知方法更少的步骤，从而减少了时间和成本需求。此外，因为大豆分离物的加工需要水，本发明的方法通过减少用于大豆分离物加工的水处理所需的水量减少了产生的污染。

发明概述

本发明描述了用于纯化具有指定的总BBI蛋白浓度和其它BBI特性(包括例如胰凝乳蛋白酶抑制剂活性和内毒素含量)的BBI产品的新方法。

在本发明的某些方面，本发明涉及纯化具有指定的总BBI蛋白浓度的BBI产品的方法，所述方法包括使包含大豆蛋白和杂质的大豆工艺流经受层析分离处理，以及任选地，附加地使所述大豆工艺流经受一种或多种分离技术处理。在特定方面，BBI产品具有至少约90重量％的总BBI蛋白浓度。

在本发明的某些其它方面，所述层析分离选自离子交换层析、吸附层析、尺寸排阻层析、反相层析和亲和层析。在特定方面，所述层析分离是离子交换层析。在其它特定方面，所述层析分离是包括离子交换柱的离子交换层析。在其它特定方面，所述离子交换柱包含阴离子交换树脂、阳离子交换树脂、或它们的组合。在其它特定方面，所述方法包括控制pH以保持其低于BBI蛋白的等电点，使得通过所述离子交换树脂保留BBI蛋白。在其它特定方面，所述方法包括控制pH以保持其高于BBI蛋白的等电点，使得通过所述离子交换树脂不保留BBI蛋白。

在本发明的某些其它方面，所述一种或多种分离技术在所述层析分离之前被执行。在本发明的某些其它方面，所述一种或多种分离技术在所述层析分离之后被执行。

在本发明的某些其它方面，所述一种或多种分离技术选自膜分离、电泳、渗析、微粒过滤、沉淀、离心、结晶、重力分离、以及它们的任何组合。在特定方面，所述一种或多种分离技术是膜分离。在其它特定方面，所述膜分离包括微量过滤膜、超滤膜、或它们的组合。

在本发明的某些其它方面，所述纯化的BBI产品包含至少一种氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、以及它们的任何组合具有至少90％的同一性。

在本发明的某些其它方面，本发明涉及纯化具有至少约90重量％的总BBI蛋白浓度的BBI产品的方法，其中所述方法包括(a)使包含大豆蛋白和杂质的大豆工艺流经受一种或多种分离技术处理；以及(b)使包含大豆蛋白和杂质的大豆工艺流经受层析分离处理，其中获得具有至少约90重量％的总BBI蛋白浓度的BBI产品。在特定方面，步骤(a)在步骤(b)之前被执行。

在本发明的某些其它方面，本发明涉及分离和纯化具有至少约90重量％的总BBI蛋白浓度的BBI产品的方法，其中所述方法包括(a)使包含大豆蛋白和杂质的大豆工艺流经受至少一种分离技术处理以形成第一透过物和第一保留物，所述第一透过物包含所述大豆蛋白，并且所述第一保留物包含所述杂质；(b)使所述第一透过物经受至少一种分离技术处理以形成第二透过物和第二保留物，所述第二保留物包含大部分蛋白，并且所述第二透过物包含杂质；(c)使所述第二保留物与载体流混合用于通过至少一种层析分离，以使BBI蛋白流与所述工艺流中的其它蛋白分离；(d)使所述BBI蛋白流与液体沉淀介质混合并使它们经受至少一种分离技术处理以形成沉淀的BBI蛋白级份；(e)使所述沉淀的BBI蛋白级份与液体洗涤介质混合以形成溶解的BBI蛋白级份；(f)使所述溶解的蛋白级份经受至少一种分离技术处理以形成纯化的溶解的BBI蛋白级份；以及(g)使所述纯化的溶解的BBI蛋白级份经受至少一种分离操作处理以形成所述纯化的BBI产品。

附图简述

图1A是描述用于从工艺流中回收纯化的大豆乳清蛋白的方法中的步骤0至4的流程示意图。

图1B是描述用于从工艺流中回收纯化的大豆乳清蛋白的方法中的步骤5、6、14、15、16和17的流程示意图。

图1C是描述用于从工艺流中回收纯化的大豆乳清蛋白的方法中的步骤7至13的流程示意图。

图2是描述用于从大豆乳清流中回收BBI蛋白的基于膜的方法的流程示意图。

图3描述了十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，所述十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)描述了根据本发明的BBI纯化过程中产生的多种保留物和透过物，包括所得的BBI产品。

图4示出了用于确定通过本发明的方法分离的新型BBI蛋白序列的MALDI-TOF质谱数据。

图5描述了双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE)之后的本发明的BBI蛋白。

图6描述了市售的BBI产品的2D-PAGE分析结果。

图7描述了根据Odani和Ikenaka在本领域中已知的来自大豆的BBI的初级结构。

图8描述了新型BBI蛋白亚型。

发明详述

本文所述的是从蛋白制造中生成的多种豆科和非豆科植物工艺流中回收高纯度BBI蛋白和其它产品的新方法。例如，本公开的方法包括一种或多种分离技术或方法(例如层析分离或膜分离)，选择并设计所述分离技术或方法以回收BBI蛋白或其它产品、或分离所述大豆乳清流的多种组分、或上述两者皆有。回收BBI蛋白和所述大豆乳清流的一种或多种其它组分(例如多种糖，包括低聚糖)可利用多种分离技术。所述特定的分离技术取决于拟回收的期望组分，期望该组分与所述工艺流中的其它组分分离开来。

例如，纯化的BBI级份通常通过下列步骤制备：首先移除一种或多种杂质(例如，微生物或矿物)，然后移除包括一种或多种大豆贮藏蛋白(即，大豆球蛋白和β-伴球蛋白)的附加的杂质，然后移除一种或多种大豆乳清蛋白(包括例如KTI和其它非BBI的蛋白或肽)，和/或然后从大豆乳清中移除一种或多种附加的杂质，包括糖类。通过稀释，移除使纯度降低的乳清流的其它主要组分(例如，矿物、糖类和贮藏蛋白)，同时同样地通过纯化蛋白级份改善纯度，改进了高纯度形式的BBI蛋白的回收，其中所述纯化蛋白级份通过移除作为所述蛋白的拮抗物和/或具有有害效应的组分(例如，内毒素)进行。大豆乳清的多种组分的移除通常包括在所述大豆乳清的组分的移除之前和/或过程中对所述大豆乳清的纯化。

贮藏蛋白、糖类、矿物和其它杂质的移除产生富集了所期望的BBI蛋白，并且不含可能是拮抗剂或毒素或者可能在其它方面具有有毒效应的杂质的级份。例如，大豆贮藏蛋白富集的级份通常可以与富集了一种或多种大豆乳清蛋白级份一起被回收。富集了一种或多种糖类(例如低聚糖和/或多糖)的级份也通常被制备。因此，本方法提供适合作为用于回收BBI蛋白级份，并且还提供能够被用于从含水的大豆乳清中回收其它有用产品的其它级份。例如，糖类和/或矿物从大豆乳清流中的移除产生了有用的级份，糖类能够从其中被进一步分离，从而产生附加的有用的级份：浓缩的糖和矿物级份(可以包括柠檬酸)，以及可以最低限度的处理(如果存在的话)被处置或作为工艺用水被回收的相对纯的工艺流。如此产生的工艺用水在本方法的实施中可以是尤其有用的。因此，本方法的进一步的优点可以是与常规的分离制备方法相比降低的工艺用水需求。

本公开的方法以至少两种方式提供了高于制造大豆蛋白分离物和浓缩物的常规方法的优点。如所指出的，制造大豆蛋白材料的常规方法通常处理大豆乳清流(例如含水的大豆乳清或大豆糖浆)。因此，通过本公开的方法回收的产品代表了附加的产品，和目前在与常规的大豆蛋白分离物和大豆蛋白浓缩物制造的关联中未实现的收益来源。此外，对大豆乳清流或大豆糖浆进行的用于回收可出售的产品的处理，可取地降低了与对大豆乳清流或大豆糖浆的处理或处置相关的成本。例如，如本文中其它地方所详述的，本发明的多种方法提供了相对纯的工艺流，所述工艺流可以在多种其它方法中被容易地利用或者以最低限度的处理(如果存在的话)被处置，从而降低所述方法对环境的影响。某些成本与本公开的方法相关联地存在，但所分离的附加的产品和废物处理的最小化的益处据信弥补了任何增加的成本。

A.酸可溶的蛋白

大豆蛋白分离物通常在大豆贮藏蛋白的等电点(例如，约4.5的pH)从脱脂大豆粕或大豆粉的水提物中沉淀。因此，大豆蛋白分离物一般包括在酸性液体介质中不可溶的蛋白。类似地，大豆蛋白浓缩物(第二精纯的大豆蛋白材料)的蛋白同样在酸性液体介质中是不可溶的。然而，通过本公开的方法回收的大豆乳清蛋白一般是酸可溶的，意味着它们在酸性液体介质中是可溶的。

例如，本公开提供了来源于含水大豆乳清，并且在环境条件(例如，约25℃的温度)下表现出跨越相对宽范围pH的含水(通常为酸性的)介质(例如具有约2至约10、约2至约7、或约2至约6的pH的含水介质)中的优越溶解度的大豆蛋白组合物。通常所述大豆蛋白组合物的溶解度为至少约10克每升(g/L)，更典型至少约15g/L，以及更典型至少约20g/L。应当了解，提及跨越pH范围的溶解度时(包括在所附权利要求中)是指所指定的溶解度是在落在所指定的pH范围内的任何和全部的pH值达到的。例如，提及在约2至约10的pH范围至少约10g/L的溶解度表示所指定的溶解度是在3、4、5、6等pH达到的。

通过本公开的方法回收的酸可溶的大豆蛋白代表着本领域中的显著改进。如本文所指出的，所述酸可溶的蛋白是从通常被丢弃的大豆乳清流中回收的。

B.鲍曼-贝克蛋白酶抑制剂

如本文所讨论的，大豆工艺流(其包括例如大豆乳清流和大豆糖浆流)包含显著量的鲍曼-贝克蛋白酶抑制剂(BBI)。这种蛋白酶抑制剂已知至少抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和潜在地多种其它关键蛋白酶，例如调控一系列关键代谢功能的组织蛋白酶G、弹性蛋白酶和糜酶。

根据本发明实施方案分离的BBI蛋白可以包含与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、以及它们的组合的氨基酸序列具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、或甚至100％的同一性的氨基酸序列的多肽。图4描述了通过本发明分离的新型BBI蛋白亚型的质谱数据结果。在一个实施方案中，所述BBI蛋白可包含与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、以及它们的组合的一个或多个氨基酸序列具有至少70％的同一性的氨基酸序列，更优选地可包含与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、以及它们的组合的一个或多个氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，甚至更优选地可包含与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、以及它们的组合的一个或多个氨基酸序列具有至少90％的同一性的氨基酸序列，并且最优选地可包含与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、以及它们的组合的一个或多个氨基酸序列具有至少95％的同一性的氨基酸序列。

在本实施方案的另一方面，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：1至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、或甚至100％相同。

在本实施方案的另一方面，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、或甚至100％相同。

在本实施方案的另一方面，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：3至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、或甚至100％相同。

在本实施方案的另一方面，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：4至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、或甚至100％相同。

在本实施方案的另一方面，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：5至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、或甚至100％相同。

在本实施方案的另一方面，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：6至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、或甚至100％相同。

在本发明的某些方面，两种氨基酸序列之间的序列同一性通过比较所述氨基酸序列来确定。在本发明的其它方面，序列同一性能够通过比较氨基酸序列与其保守的氨基酸取代物来确定。在本发明的其它方面，本发明的蛋白能够具有一个或多个保守取代。在本发明的其它方面，本发明的蛋白能够具有一个或多个非保守的取代。

天然存在的氨基酸包括例如丙氨酸(A)、精氨酸(R)、天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C)、谷氨酸(E)、谷氨酰胺(Q)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、赖氨酸(K)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)和缬氨酸(V)。

保守的和非保守的氨基酸取代是本领域的普通技术人员已知的，例如，酸性氨基酸对另一种酸性氨基酸的取代可以被认为是保守取代而碱性氨基酸对酸性氨基酸的取代可以被认为是非保守取代；类似地，极性氨基酸对另一种极性氨基酸的取代可以被认为是保守取代而非极性氨基酸对极性氨基酸的取代可以被认为是非保守取代。氨基酸一般被分为下列类别(这能够被用作指导，用于确定取代是保守的还是非保守的)：(1)极性的/亲水性的：N、Q、S、T、K、R、H、D、E、C和Y；(2)非极性的/疏水性的：G、A、L、V、I、P、F、W和M；(3)酸性的：D、E和C；(4)碱性的：K、R和H；(5)芳香族的：F、W、Y和H；和(6)脂族的：G、A、L、V、I和P。

在本发明的某些方面，其中一个或多个氨基酸序列与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、或SEQID NO：6不同，所述一个或多个氨基酸序列也行使BBI蛋白的功能，已知它们抑制胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶的活性。用于确定这些功能的方法描述于本文中并且是本领域的普通技术人员已知的。

在本发明的其它方面，其中的组合物包含一个或多个氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5、或SEQ ID NO：6不同，所述一个或多个氨基酸序列也行使BBI蛋白的功能，已知它们抑制胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶。用于确定这些功能的方法描述于本文中并且是本领域的普通技术人员已知的。

BBI蛋白由大约65个至77个氨基酸残基和大约七个二硫键组成。BBI蛋白的初级结构自1972年起即是已知的(Odani S.和T.Ikenaka，J.Biochem.197374：6971972)并且如图7中所示。

与其它BBI产品相比，目前据信，本公开的BBI产品的纯度代表着此前未达到的水平的纯度。BBI级份的纯度是总BBI蛋白浓度、比活性(如以胰凝乳蛋白酶抑制剂单位/克蛋白测量的)和具有BBI拮抗剂功能的组分、毒素、或在单纯的对每单位数量的BBI的功效的稀释之外还具有有毒效应的其它组分的不存在的函数。一般而言，本公开的BBI产品的总BBI蛋白浓度是至少约70重量％，或至少约80重量％。通常，本公开的BBI产品的总BBI蛋白浓度是至少约90重量％，至少约91重量％，至少约92重量％，至少约93重量％，至少约94重量％，至少约95重量％，至少约96重量％，至少约97重量％，至少约98重量％和至少约99重量％。

“纯的”单体蛋白在单向或双向SDS-PAGE凝胶上电泳之后将产生一条单独的条带，将作为单独的对称吸收峰从凝胶过滤、高效液相色谱(HPLC)或离子交换柱上洗脱，将产生单独的一组质谱、核磁共振(NMR)、或W吸收光谱信号，并且在适当的情况下将没有对酶活性的污染。由于绝对的纯度不能被确定，一个简单的纯度标准被常规地使用，即在SDS-PAGE之后不能检测到多于一个的蛋白条带。(参见Mohan，Determination of purity and yield.Methods in Molecular Biology，11，307-323(1992))。图3描述了单向凝胶电泳之后的本发明的BBI蛋白。图5描述了双向凝胶电泳(2D-PAGE)之后的本发明的BBI蛋白。如图3和5所示，本发明的BBI蛋白表现为6.5kDa和14.4kDa的分子量标准之间的单一条带并且具有不同的等电点。仅有单一条带的存在表明在所述产品中没有污染物。与此相比，图6描述了对由Sigma Aldrich，St.Louis，MO商品化销售的BBI产品(产品号T9777)的2D-PAGE分析的结果。在图6中，显著不同的是，虽然样品BBI蛋白被发现与图5中的BBI蛋白介于相同的分子量标准之间，但它们没有表现为单一条带。这表明与本发明的BBI蛋白中相比，Sigma BBI样品中存在更多的污染物，包括残余的库尼兹胰蛋白酶抑制剂蛋白以及非蛋白组分。

除BBI纯度之外，本公开的BBI产品的总蛋白含量也是有利的和/或代表了本领域的改进。本公开的产品的BBI蛋白含量可通过本领域已知的常规方法测定，包括例如描述于Ohnishi，S.T.和Barr，J.K.，Asimplified method of quantitating proteins using the biuret and phenolreagents.Anal.Biochem.，86，193(1978)中的Lowry方法。一般而言，本公开的BBI产品的总蛋白含量为至少约60重量％(基于干重)，至少约70重量％，至少约80重量％，或至少约85重量％。通常，本公开的BBI产品的总蛋白含量为至少约90重量％，至少约91重量％，至少约92重量％，至少约93重量％，至少约94重量％，至少约95重量％，至少约96重量％，至少约97重量％，至少约98重量％和至少约99重量％。

BBI产品目前据信适合的多种应用要求相对低的内毒素含量。例如，多种治疗应用要求BBI产品满足药品等级材料适用的规章。因此，在多个优选的方面，所述BBI产品的总内毒素含量为优选不超过约5.0EU/克蛋白，不超过约4.5EU/克蛋白，不超过约4.0EU/克蛋白，不超过约3.5EU/克蛋白，不超过约3.0EU/克蛋白，不超过约2.5EU/克蛋白，不超过约2.0EU/克蛋白，不超过约1.5EU/克蛋白，不超过约1.0EU/克蛋白和不超过约0.5EU/克蛋白。例如，根据多个此类方面，通常所述BBI产品的总内毒素含量为约0.5EU/克蛋白至约5EU/克蛋白，更典型为约0.5EU/克蛋白至约2.5EU/克蛋白，以及更典型为约0.5EU/克蛋白至约1EU/克蛋白。

BBI蛋白已知既抑制胰凝乳蛋白酶又抑制胰蛋白酶，而包含蛋白的组合物的其它组分(例如KTI蛋白)已知仅抑制胰蛋白酶。因此，目前据信胰凝乳蛋白酶抑制剂活性对胰蛋白酶抑制剂活性的比率是BBI蛋白的存在的指标。一般而言，胰凝乳蛋白酶抑制剂活性对胰蛋白酶抑制剂活性的比率为至少约1∶1、至少约1∶2、至少约1∶3、至少约1∶4、至少约1∶5、至少约1∶6、至少约1∶7、至少约1∶8、至少约1∶9、或至少约1∶10。在本发明的特定方面，胰凝乳蛋白酶抑制剂活性对胰蛋白酶抑制剂活性的比率为约1∶1、约1∶1.1、约1∶1.2、约1∶1.3、约1∶1.4、约1∶1.5、约1∶1.6、约1∶1.7、约1∶1.8、或约1∶1.9。

本公开的BBI产品的胰凝乳蛋白酶抑制剂活性(表示为胰凝乳蛋白酶抑制剂单位/克蛋白，或CIU/克蛋白)可通过本领域已知的常规方法测定。一般而言，本公开的BBI产品的胰凝乳蛋白酶抑制剂活性为至少约500CIU/克蛋白，更通常为至少约1000CIU/克蛋白，更通常为至少约1200CIU/克蛋白。通常，本公开的BBI产品的胰凝乳蛋白酶抑制剂活性为至少约1600CIU/克蛋白，至少约2500CIU/克蛋白，至少约2700CIU/克蛋白，或至少约3000CIU/克蛋白。

胰凝乳蛋白酶活性如此前所述(Ware等人，1997Arch.Biochem.Biophys.第344卷，第1期，第133-138页)进行，包括下列的改变。来自牛胰腺的α-胰凝乳蛋白酶购自Sigma Chemical Co.(目录号C4129，St.Louis，MO)，其活性胰凝乳蛋白酶通过用甲基伞形基对-三甲基氨基肉桂酰氯(MUTMAC，目录号M5407，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)的活性位点滴定，基于Jameson等人(Biochem.J.1973131：107-117)所述的方法进行定量。用去离子蒸馏水(dI)H₂O将BBI样品稀释至大约1mg BBI/mL(例如，称取1mg/ml纯化的BBI，SWP为10mg/ml)。在硅化微量离心管中混合以下物质：a)BBI样品，0-5ul；b)0.1M磷酸钠和1M NaCl，pH7，5ul；和c)10ul 50uM活性胰凝乳蛋白酶(溶解在1mM HCl和2mM CaCl₂中)。混合并室温下孵育10分钟。为了检测残余的胰凝乳蛋白酶活性，用dI H₂O按1∶40稀释样品，将25ul稀释的样品转入包含895ul检测缓冲液(0.5M Tris，20mM CaCl₂，1MNaCl，pH8.0)和80ul 10mM sucAAPF-pNA(目录号S7388，Sigma chemicalCo.，St.Louis，MO)的1.5ml玻璃比色杯中，混合并立即在Ab410nm以10秒间隔开始测量1分钟。调节抑制剂溶液的浓度，使得在40-80％抑制范围内获得结果，并加以外推以确定完全抑制胰凝乳蛋白酶所需的样品量。胰凝乳蛋白酶抑制活性(CI单位/克)被定义为能够完全抑制1mg活性胰凝乳蛋白酶的样品的量，如Ware等人此前所描述的(1997Arch.Biochem.Biophys.第344卷，第1期，第133-138页)。

类似地，本公开的BBI产品的胰蛋白酶抑制剂活性(按照胰蛋白酶抑制剂单位/克蛋白，或TIU/克蛋白表示)可通过本领域已知的常规方法测定，包括例如在其中一个TIU被定义为能够抑制1mg的胰蛋白酶的底物的量，而一个胰蛋白酶单位等于在pH8.2和37℃以苯甲酰-DL-精氨酸-对-硝基苯胺(BAPA)作为底物每10分钟0.019的ΔA₄₁₀。一般而言，本公开的BBI产品的胰蛋白酶抑制剂活性为至少约400TIU/克蛋白，更通常为至少约600TIU/克蛋白，更通常为至少约800TIU/克蛋白。通常，本公开的BBI产品的胰蛋白酶抑制剂活性为至少约1000TIU/克蛋白，至少约1200TIU/克蛋白，至少约1400TIU/克蛋白，或至少约1600TIU/克蛋白。胰蛋白酶抑制剂活性优选不超过约3000TIU/克蛋白(即，理论上纯的)。

应当了解，本公开的BBI产品可表现出以上指定的特征中的一种、它们的组合、或它们的全部。例如，本公开的BBI产品可表现出所指定的BBI纯度和胰凝乳蛋白酶抑制剂活性。BBI还可表现出所指定的BBI纯度、胰蛋白酶抑制剂活性或胰凝乳蛋白酶抑制剂活性和本文所公开的序列。又如，所述BBI产品可表现出所指定的BBI蛋白浓度和总内毒素含量。在这些以及另外的方面，本公开的BBI产品可表现出所指定的总大豆蛋白浓度和胰蛋白酶抑制剂活性。BBI产品还可表现出所指定的总大豆蛋白浓度和胰凝乳蛋白酶抑制剂活性。又如，本公开的BBI产品可表现出所指定的总大豆蛋白浓度和总内毒素含量。所述BBI产品的特性的这些组合是示例性的，并且这一列举并不旨在是详尽的。也就是说，根据本公开，BBI产品可以任何上文所指定范围内的任何上文所指定的值表现出上文提及的特性的任何组合。

本公开的BBI产品可用于多种药物组合物中，所述药物组合物可以被包括在药物制剂中，所述药物制剂以选自口服、局部给药、肠胃外给药、皮下给药、肌内注射、静脉注射和腹膜内注射中的至少一种模式被施用于患者。在本发明的某些方面，给药途径包括口服或肠胃外给药。在本发明的其它方面，给药途径包括通过食物的方式口服。取决于治疗所期望的持续时间和效果，本发明的组合物可以被施用一次或多次，以及间歇地施用，例如以不同的剂量和通过不同途径的组合每天或每周一次，持续若干天、若干周、或若干月。本公开的BBI产品还可用于饮食补充制剂中。药物和饮食补充剂组合物的适当形式包括例如糖浆、粉末、霜膏、注射剂、悬浮液、乳液、片剂、胶囊、锭剂、栓剂和漱口剂。

本发明的另一方面是提供包含本文所述的BBI产品的食品。此类食品可以包括但不限于饮料、块状加工食品、或本领域的普通技术人员已知的其它消费品，使得当所述食品被食用时，本文所述的BBI产品也被食用。

在一个实施方案中，食品可以是饮料。优选的饮料包括即饮型(RTD)饮料或干混型饮料(DBB)。该饮料可以是基本上浑浊的饮料或基本上清澈的饮料。合适饮料的非限制性实例包括牛奶饮料、类牛奶饮料(例如豆奶、米奶等)、体重控制饮料、蛋白混合饮料、代餐饮料、咖啡饮料、营养饮料、能量饮料、婴儿代乳品、果汁饮料、水果饮料、果味饮料、蔬菜饮料、运动饮料等。饮料的pH可以变化，并且可以是酸性的、中性的、或碱性的。

在另一个实施方案中，食品可以是食物棒(压成块的加工食品)，如格兰诺拉棒、谷类食物棒、营养棒、或能量棒。在另一个实施方案中，食品可以是基于谷类的食品。基于谷类的食品的非限制性实例包括早餐谷类食物、意大利面食、面包、焙烤产品(即，粉饼、馅饼、卷状食品、饼干、薄脆饼干)和小吃品(例如炸土豆片、脆饼干等)。基于谷类的食品的可食用材料可来源于小麦(例如漂白面粉、全麦面粉、麦芽精、麦麸等)、玉米(例如玉米面、玉米粗粉、玉米淀粉等)、燕麦(例如膨化燕麦、燕麦片、燕麦粉等)、大米(例如膨化大米、米粉、大米淀粉)等等。在另一个实施方案中，所述食品可以是营养补充剂。营养补充剂可以是液体或固体。

除了多种药物用途之外，本公开的BBI产品还适合掺入到各种个人护理产品中。例如，本公开的BBI产品目前据信降低了皮肤的光老化(参见例如Paine C.等人，J.Invest.Dermatol.116：587-595(2001)，并因此适合掺入到化妆品和皮肤护理产品中。

本发明的BBI能够从任何来源或者允许从天然的基于植物的基质离析、分离、或纯化BBI的任何方法获得。以非限制性实例的方式，天然的基于植物的基质能够来源于豆科或非豆科的植物，包括如大豆、玉米、豌豆、卡诺拉、向日葵、高粱、稻、苋属植物、马铃薯、木薯、竹芋、美人蕉、羽扇豆、油菜、小麦、燕麦、裸麦、大麦、花生、洋刀豆、薏苡、豌豆家族豆类、巴鲁、鹊豆、矛豆荚(例如，雨豆树种子)、苜蓿、蜗牛苜蓿种子、利马豆、牛油豆、芸豆、矮菜豆、甘蔗、小米、成材木、菠菜、chapule、纤毛虫、甜点香蕉、兵豆、麸、蚕豆或胡豆、绿豆、赤豆、豇豆、麻风树、绿藻、以及它们的混合物。在本发明的特定方面，BBI是在多种工艺流中从大豆获得的。多种大豆工艺流包括，例如，含水的大豆提取物流(其是大豆流的蛋白组分在其中为可溶性形式的任何流。例如来自脱脂大豆材料)、含水的豆浆提取物流(其是大豆流的蛋白组分在其中为可溶性形式的来自全部或部分脱脂的大豆材料的任何流)、含水的大豆乳清流(其是由贮藏蛋白的沉淀或盐析得到的任何乳清流；沉淀方法能够包括高温以及化学方法)、含水的大豆糖浆流(其是通过从含水的大豆乳清流中移除水产生的任何流)、含水的大豆蛋白浓缩物大豆糖浆流(其是来自对来自大豆蛋白浓缩方法的可溶性糖的醇提取物的任何流)、含水的大豆透过流(其是由不同分子量的蛋白级份的分离得到的任何流，所述分离中较小分子量的蛋白通过膜)和含水的豆腐乳清流(其包括来源于豆腐凝结过程的任何乳清流。通过本发明的方法分离的BBI产品的量可以是低至克级(实验室规模的分离)或可以是若干公吨(工业或大规模分离)。

C.用于获得大豆乳清蛋白的方法

分离技术领域的技术人员知道，由于分离不会是100％，在每一流中能够存在残余的组分。此外，本领域的技术人员了解，分离技术能够根据起始的原材料而变化。

步骤0(参见图1A)-乳清蛋白预处理能够从包括但不限于大豆分离蛋白(ISP)糖浆、ISP乳清、大豆蛋白浓缩物(SPC)糖浆、SPC乳清、功能性大豆蛋白浓缩物(FSPC)乳清、以及它们的组合的进料流开始。能够用于乳清蛋白预处理步骤中的加工助剂包括但不限于酸、碱、氢氧化钠、氢氧化钙、盐酸、水、蒸汽、以及它们的组合。在调节pH之后，步骤0的pH能够是介于约3.0和约6.0，或介于3.5和5.5之间，或约5.3。温度能够是介于约70℃和约95℃之间，或约85℃。温度保持时间可在约0分钟至约20分钟之间变化，或约10分钟。在保留时间之后，所述流通过一个离心分离步骤(通常在间歇放电圆盘式净化离心机中)以从所述乳清流分离沉淀物。来自乳清蛋白预处理的产物包括但不限于流0a中的乳清流(预处理的大豆乳清)的水相中的可溶性组分(分子量等于或小于约50千道尔顿(kD))和流0b中的不溶性大分子量蛋白(介于约300kD和约50kD之间)，例如预处理的大豆乳清、贮藏蛋白、以及它们的组合。

步骤1(参见图1A)-微生物的降低可以所述乳清蛋白预处理步骤的产物开始，包括但不限于预处理的大豆乳清。本步骤涉及预处理的大豆乳清的微量过滤。在这一步骤中，方法的变量和供选择的替代方案包括但不限于离心、死端过滤、加热灭菌、紫外灭菌、微量过滤、错流膜过滤、以及它们的组合。错流膜过滤包括但不限于：螺旋式、板框式、中空纤维、陶瓷、动态或旋转盘、纳米纤维、以及它们的组合。步骤1的pH能够是介于约2.0和约12.0，或介于约3.5和约5.5之间，或约5.3。温度能够是介于约5℃和约90℃，或介于约25℃和75℃之间，或约50℃。来自步骤1的产物包括但不限于流1a中的贮藏蛋白、微生物、硅、以及它们的组合和流1b中的纯化的预处理的大豆乳清。

步骤2(参见图1A)-水和矿物的移除可以来自流1b或4a的纯化的预处理的大豆乳清、或来自流0b的预处理的大豆乳清开始。其包括用于水的移除和部分矿物的移除的纳米过滤步骤。在这一步骤中，方法的变量和供选择的替代方案包括但不限于错流膜过滤、反向渗透、蒸发、纳米过滤、以及它们的组合。错流膜过滤包括但不限于：螺旋式、板框式、中空纤维、陶瓷、动态或旋转盘、纳米纤维、以及它们的组合。步骤2的pH能够是介于约2.0和约12.0，或介于约3.5和约5.5之间，或约5.3。温度能够是介于约5℃和约90℃，或介于约25℃和75℃之间，或约50℃。来自这一水移除步骤的产物包括但不限于流2a中的纯化的预处理的大豆乳清和流2b中的水、一些矿物、一价阳离子、以及它们的组合。

步骤3(参见图1A)-矿物沉淀步骤可以来自流2a的纯化的预处理的大豆乳清或来自流0a或1b的预处理的大豆乳清开始。其包括通过pH和/或温度变化沉淀的步骤。在这一步骤中，方法的变量和供选择的替代方案包括但不限于搅拌的或再循环的反应槽。能够用于矿物沉淀步骤中的加工助剂包括但不限于酸、碱、氢氧化钠、氢氧化钙、盐酸、氯化钠、肌醇六磷酸酶、以及它们的组合。步骤3的pH能够是介于约2.0和约12.0，或介于约6.0和约9.0之间，或约8.0。温度能够是介于约5℃和约90℃，或介于约25℃和75℃之间，或约50℃。pH保持时间能够是介于约0分钟至约60分钟，或介于约5分钟和约20分钟之间变化，或约10分钟。流3的产物是纯化的预处理的大豆乳清和沉淀的矿物的悬液。

步骤4(参见图1A)-矿物移除步骤可以来自流3的纯化的预处理的大豆乳清和沉淀的矿物的悬液开始。其包括离心步骤。在这一步骤中，方法的变量和供选择的替代方案包括但不限于离心、过滤、死端过滤、错流膜过滤、以及它们的组合。错流膜过滤包括但不限于：螺旋式、板框式、中空纤维、陶瓷、动态或旋转盘、纳米纤维、以及它们的组合。来自矿物移除步骤的产物包括但不限于流4a中的去矿物化的预处理的乳清和流4b中的不溶性矿物与一些蛋白矿物复合物。

步骤5(参见图1B)-蛋白分离和浓缩步骤可以来自流4a的纯化的预处理的乳清或来自流0a、1b或2a的乳清开始。其包括超滤步骤。能够用于超滤步骤中的加工助剂包括但不限于酸、碱、氢氧化钠、氢氧化钙、盐酸、以及它们的组合。在这一步骤中，方法的变量和供选择的替代方案包括但不限于错流膜过滤、超滤、以及它们的组合。错流膜过滤包括但不限于：螺旋式、板框式、中空纤维、陶瓷、动态或旋转盘、纳米纤维、以及它们的组合。步骤5的pH能够是介于约2.0和约12.0，或介于约6.0和约9.0之间，或约8.0。温度能够是介于约5℃和约90℃，或介于约25℃和75℃之间，或约50℃。来自流5a的产物包括但不限于大豆乳清蛋白、BBI、KTI、贮藏蛋白、其它蛋白、以及它们的组合。来自流5b的产物包括但不限于钛、大豆低聚糖、矿物、以及它们的组合。

步骤6(参见图1B)-蛋白洗涤和纯化步骤可以来自流4a或5a的大豆乳清蛋白、BBI、KTI、贮藏蛋白、其它蛋白或纯化的预处理的乳清、或来自流0a、1b、或2a的乳清开始。其包括渗滤步骤。在这一步骤中，方法的变量和供选择的替代方案包括但不限于再浆化、错流膜过滤、超滤、水渗滤、缓冲液渗滤、以及它们的组合。错流膜过滤包括但不限于：螺旋式、板框式、中空纤维、陶瓷、动态或旋转盘、纳米纤维、以及它们的组合。能够用于蛋白洗涤和纯化步骤中的加工助剂包括但不限于水、流、以及它们的组合。步骤6的pH能够是介于约2.0和约12.0，或介于约6.0和约9.0之间，或约7.0。温度能够是介于约5℃和约90℃，介于约25℃和75℃之间，或约50℃。来自流6a的产物包括但不限于大豆乳清蛋白、BBI、KTI、贮藏蛋白、其它蛋白、以及它们的组合。来自流6b的产物包括但不限于钛、大豆低聚糖、水、矿物、以及它们的组合。

步骤7(参见图1C)-水移除步骤可以来自流5b和/或流6b的钛、大豆低聚糖、水、矿物、以及它们的组合开始。其包括纳米过滤步骤。在这一步骤中，方法的变量和供选择的替代方案包括但不限于反向渗透、蒸发、纳米过滤、水渗滤、缓冲液渗滤、以及它们的组合。步骤7的pH能够是介于约2.0和约12.0，或介于约6.0和约9.0之间，或约7.0。温度能够是介于约5℃和约90℃，介于约25℃和75℃之间，或约50℃。来自流7a的产物包括但不限于钛、大豆低聚糖、水、矿物、以及它们的组合。来自流7b的产物包括但不限于水、矿物、以及它们的组合。

步骤8(参见图1C)-矿物移除步骤可以来自流5b、6b、7a和/或12b的钛、大豆低聚糖、水、矿物、以及它们的组合开始。其包括电渗析膜步骤。在这一步骤中，方法的变量和供选择的替代方案包括但不限于离子交换柱、层析、以及它们的组合。能够用于这一矿物移除步骤中的加工助剂包括但不限于水、酶、以及它们的组合。酶包括但不限于蛋白酶、肌醇六磷酸酶、以及它们的组合。步骤8的pH能够是介于约2.0和约12.0，或介于约6.0和约9.0之间，或约7.0。温度能够是介于约5℃和约90℃，介于约25℃和50℃之间，或约40℃。来自流8a的产物包括但不限于去矿物化的大豆低聚糖，所述去矿物化的大豆低聚糖具有介于约10毫西门子/厘米(mS/cm)和约0.5mS/cm之间，或约2mS/cm的电导率。来自流8b的产物包括但不限于水、矿物、以及它们的组合。

步骤9(参见图1C)-颜色移除步骤可以来自流8a、5b、6b、12b和/或7a的去矿物化的大豆低聚糖开始。其利用活性炭床。在这一步骤中，方法的变量和供选择的替代方案包括但不限于离子交换。能够用于这一颜色移除步骤中的加工助剂包括但不限于活性炭、离子交换树脂、以及它们的组合。温度能够是介于约5℃和约90℃之间，或约40℃。来自流9a的产物包括但不限于颜色化合物。流9b为脱色的溶液。来自流9b的产物包括但不限于大豆低聚糖及其组合。

步骤10(参见图1C)-大豆低聚糖分级步骤可以来自流9b、5b、6b、7a和/或8a的大豆低聚糖及其组合物开始。其包括层析步骤。在这一步骤中，方法的变量和供选择的替代方案包括但不限于层析、纳米过滤、以及它们的组合。能够用于这一大豆低聚糖分级步骤中的加工助剂包括但不限于酸或碱，以如本领域的技术人员所知地基于所使用的树脂调节pH。来自流10a的产物包括但不限于大豆低聚糖。来自流10b的产物包括但不限于大豆低聚糖。

步骤11(参见图1C)-水移除步骤可以来自流9b、5b、6b、7a、8a和/或10b的大豆低聚糖开始。其包括蒸发步骤。在这一步骤中，方法的变量和供选择的替代方案包括但不限于反向渗透、蒸发、纳米过滤、以及它们的组合。能够用于这一水移除步骤中的加工助剂包括但不限于消泡剂、流、真空、以及它们的组合。温度能够是介于约5℃和约90℃之间，或约60℃。来自流11a的产物包括但不限于水。来自流11b的产物包括但不限于大豆低聚糖。

步骤12(参见图1C)-附加的从大豆低聚糖分离蛋白的步骤可以来自流7a、5b和/或6b的钛、大豆低聚糖、水、矿物、以及它们的组合开始。其包括超滤步骤。在这一步骤中，方法的变量和供选择的替代方案包括但不限于错流膜过滤、孔径介于约50kD和约1kD之间的超滤、以及它们的组合。错流膜过滤包括但不限于：螺旋式、板框式、中空纤维、陶瓷、动态或旋转盘、纳米纤维、以及它们的组合。能够用于这一从糖类分离蛋白的步骤的加工助剂包括但不限于酸、碱、蛋白酶、肌醇六磷酸酶、以及它们的组合。步骤12的pH能够是介于约2.0和约12.0之间，或约7.0。温度能够是介于约5℃和约90℃，介于约25℃和75℃之间，或约50℃。来自流12b的产物包括但不限于大豆低聚糖、水、矿物、以及它们的组合。来自流12a的产物包括但不限于肽、其它蛋白、以及它们的组合。

步骤13(参见图1C)-水移除步骤可以来自流12a的肽和其它蛋白开始。其包括蒸发步骤。在这一步骤中，方法的变量和供选择的替代方案包括但不限于反向渗透、纳米过滤、喷雾干燥、以及它们的组合。来自流13a的产物包括但不限于水。来自流13b的产物包括但不限于肽、其它蛋白、以及它们的组合。

步骤14(参见图1B)-蛋白分级步骤可通过以来自流6a和/或5a的大豆乳清蛋白、BBI、KTI、贮藏蛋白、其它蛋白、以及它们的组合开始进行。其包括超滤(具有300kD至10kD的孔径)步骤。在这一步骤中，方法的变量和供选择的替代方案包括但不限于错流膜过滤、超滤、纳米过滤、以及它们的组合。错流膜过滤包括但不限于：螺旋式、板框式、中空纤维、陶瓷、动态或旋转盘、纳米纤维、以及它们的组合。步骤14的pH能够是介于约2.0和约12.0，或介于约6.0和约9.0之间，或约7.0。温度能够是介于约5℃和约90℃，介于约25℃和75℃之间，或约50℃。来自流14a的产物包括但不限于贮藏蛋白。来自流14b的产物包括但不限于大豆乳清蛋白、BBI、KTI、其它蛋白、以及它们的组合。

步骤15(参见图1B)-水移除步骤可以来自流6a、5a和/或14b的大豆乳清蛋白、BBI、KTI和其它蛋白开始。其包括蒸发步骤。在这一步骤中，方法的变量和供选择的替代方案包括但不限于蒸发、纳米过滤、RO、以及它们的组合。来自流15a的产物包括但不限于水。流15b产物包括但不限于大豆乳清蛋白、BBI、KTI、其它蛋白、以及它们的组合。

步骤16(参见图1B)-热处理步骤和瞬间冷却步骤可以来自流6a、5a、14b和/或15b的大豆乳清蛋白、BBI、KTI和其它蛋白开始。其包括超高温步骤。在这一步骤中，方法的变量和供选择的替代方案包括但不限于加热灭菌、蒸发、以及它们的组合。能够用于这一热处理和瞬间冷却步骤中的加工助剂包括但不限于水、流、以及它们的组合。所述加热步骤的温度能够是介于约129℃和约160℃之间，或约152℃。温度保持时间能够是介于约8秒和约15秒之间，或约9秒。瞬间冷却后，温度能够是介于约50℃和约95℃之间，或约82℃。来自流16的产物包括但不限于大豆乳清蛋白。

步骤17(参见图1B)-干燥步骤可以来自流6a、5a、14b、15b和/或16的大豆乳清蛋白、BBI、KTI和其它蛋白开始。其包括干燥步骤。液体进料温度能够是介于约50℃和约95℃之间，或约82℃。入口温度能够是介于约175℃和约370℃之间，或约290℃。排气温度能够是介于约65℃和约98℃之间，或约88℃。来自流17a的产物包括但不限于水。来自流17b的产物包括但不限于大豆乳清蛋白，其包括BBI、KTI、贮藏蛋白、其它蛋白以及它们的组合。

D.含水的乳清流

含水的乳清流和糖浆流是大豆工艺流的类型，它们是从精炼完整豆类或油料种子的方法产生的。完整的豆类或油料种子可以来源于多种适合的植物。以非限制性实例的方式，适合的植物包括豆科或非豆科的植物，包括如大豆、玉米、豌豆、卡诺拉、向日葵、高粱、稻、苋属植物、马铃薯、木薯、竹芋、美人蕉、羽扇豆、油菜、小麦、燕麦、裸麦、大麦、花生、洋刀豆、薏苡、豌豆家族豆类、巴鲁、鹊豆、矛豆荚(例如，雨豆树种子)、苜蓿、蜗牛苜蓿种子、利马豆、牛油豆、芸豆、矮菜豆、甘蔗、小米、成材木、菠菜、chapule、纤毛虫、甜点香蕉、兵豆、麸、蚕豆或胡豆、绿豆、赤豆、豇豆、麻风树、绿藻、以及它们的混合物。在一个实施方案中，所述豆科植物是大豆，并且从精炼大豆的方法产生的含水的乳清流是含水的大豆乳清流。

在大豆蛋白分离物的制造中产生的含水的大豆乳清流一般是相对稀释的并且通常作为废物被丢弃。更具体地，通常所述含水的大豆乳清流具有小于约10重量％，通常小于约7.5重量％，以及更典型小于约5重量％的总固体含量。例如，在多个方面，所述含水的大豆乳清流的固体含量为约0.5重量％至约10重量％，约1重量％至约4重量％，或约1重量％至约3重量％(例如，约2重量％)。因此，在商业化的大豆蛋白分离物生产过程中，产生了必须被处理或处置的显著体积的废水。

大豆乳清流通常包含大部分起始大豆材料的初始大豆蛋白含量。如本文所用，术语“大豆蛋白”一般是指来源于大豆的任何和全部的蛋白。天然存在的大豆蛋白一般是具有被亲水外壳围绕的疏水核心的球状蛋白。大量的大豆蛋白已被鉴定，包括例如贮藏蛋白如大豆球蛋白和β-伴球蛋白。大豆蛋白同样包括蛋白酶抑制剂，如上文提及的BBI蛋白。大豆蛋白也包括血球凝集素如凝集素、脂氧合酶、β-淀粉酶和露那辛。值得注意的是，大豆植物可以被转化，以产生通常不被大豆植物表达的其它蛋白。应当了解，本文提及“大豆蛋白”时同样设想了如此产生的蛋白。

基于干重，大豆蛋白占大豆乳清流的至少约10重量％，至少约15重量％，或至少约20重量％(基于干重)。通常大豆蛋白占大豆乳清流的约10重量％至约40重量％，或约20重量％至约30重量％(基于干重)。大豆蛋白分离物通常包含大部分大豆的贮藏蛋白。然而，在分离物沉淀之后剩余的大豆乳清流同样包含一种或多种大豆贮藏蛋白。

除多种大豆蛋白之外，含水的大豆乳清流还同样包含一种或多种碳水化合物(即糖类)。一般而言，糖类占大豆乳清流的至少约25重量％，至少约35重量％，或至少约45重量％(基于干重)。通常糖类占大豆乳清流的约25重量％至约75重量％，更典型约35重量％至约65重量％，更典型约40重量％至约60重量％(基于干重)。

大豆乳清流的糖类一般包括一种或多种单糖和/或一种或多种低聚糖或多糖。例如，在多个方面，所述大豆乳清流包含选自葡萄糖、果糖、以及它们的组合的单糖。通常单糖占大豆乳清流的约0.5重量％至约10重量％，更典型约1重量％至约5重量％(基于干重)。还根据这些以及多个其它方面，所述大豆乳清流包含选自蔗糖、棉子糖、水苏糖、以及它们的组合的低聚糖。通常低聚糖占大豆乳清流的约30重量％至约60重量％，更典型约40重量％至约50重量％(基于干重)。

含水的大豆乳清流还通常包含包括多种组分的灰分，所述组分包括例如多种矿物、植酸、柠檬酸和维生素。通常存在于大豆乳清流中的矿物包括钠、钾、钙、磷、镁、氯、铁、锰、锌、铜、以及它们的组合。存在于大豆乳清流中的维生素包括例如硫胺素和核黄素。无论其确切的组成如何，通常灰分占大豆乳清流的约5重量％至约30重量％，更典型约10重量％至约25重量％(基于干重)。

含水的大豆乳清流还通常包含脂肪级份，一般脂肪级份占大豆乳清流的约0.1重量％至约5重量％(基于干重)。在本发明的某些方面，脂肪含量通过酸水解测量，并且占大豆乳清流的约3重量％(基于干重)。

除了上述组分之外，含水的大豆乳清流通常还包含一种或多种微生物，包括例如多种细菌、霉菌和酵母。这些组分的比例通常为约1×102至约1×10⁹菌落形成单位数(CFU)每毫升不等。如本文中其它地方所详述的，在多个方面，在蛋白回收和/或分离之前，含水的大豆乳清流被处理以移除这些组分。

如所指出的，大豆蛋白分离物的常规的生产通常包括处理大豆蛋白分离物的分离之后剩余的含水的大豆乳清流。根据本公开，一种或多种蛋白和多种其它组分(例如，糖类和矿物)的回收导致相对纯的含水的大豆乳清流。蛋白和一种或多种组分未被移除的常规的大豆乳清流一般要求在处置和/或再利用之前进行处理。根据本公开的多个方面，所述含水的乳清流可以最低限度的(如果存在的话)处理被处置或作为工艺用水被利用。例如，所述含水的乳清流可以在本公开的一个或多个过滤(例如，渗滤)操作中被使用。

除了从大豆蛋白分离物的制造中产生的含水的大豆乳清流回收BBI蛋白之外，应当了解，本文所述的方法还同样适合用于回收大豆蛋白分离物的制造中产生的大豆糖浆流的一种或多种组分，因为大豆糖浆流是附加类型的大豆工艺流。

F.BBI蛋白的回收

本文所述的方法涉及纯化的BBI蛋白的回收和分离，所述BBI蛋白存在于产生自完整的豆类或油料种子的精炼方法的含水的乳清流中。如上文所论及，所述完整的豆类或油料种子可以来源于多种适合的植物。以非限制性实例的方式，适合的植物包括豆科或非豆科的植物，包括如大豆、玉米、豌豆、卡诺拉、向日葵、高粱、稻、苋属植物、马铃薯、木薯、竹芋、美人蕉、羽扇豆、油菜、小麦、燕麦、裸麦、大麦、花生、洋刀豆、薏苡、豌豆家族豆类、巴鲁、鹊豆、矛豆荚(例如，雨豆树种子)、苜蓿、蜗牛苜蓿种子、利马豆、牛油豆、芸豆、矮菜豆、甘蔗、小米、成材木、菠菜、chapule、纤毛虫、甜点香蕉、兵豆、麸、蚕豆或胡豆、绿豆、赤豆、豇豆、麻风树、绿藻、以及它们的混合物。在一个实施方案中，所述豆科植物是大豆，并且从精炼大豆的方法产生的含水的乳清流是含水的大豆乳清流。

本公开包括多种适用于从在大豆蛋白分离物的生产中产生的含水的大豆乳清流回收BBI蛋白的方法。一般而言，本公开的方法包括一个或多个操作，所述操作被设计和配置为分离出大豆工艺流(包括例如含水的大豆乳清流)的特定组分。

一般而言，根据本公开，任何本领域中熟知的多种分离和纯化技术可以被用于移除存在于含水的大豆乳清中的多种干扰组分和从其分离纯化的BBI蛋白，所述技术包括例如膜分离技术(例如，过滤，如超滤、微量过滤、纳米过滤和/或反向渗透)、层析分离技术(例如，离子交换层析、膜层析、吸附层析、尺寸排阻层析、反相层析和亲和层析，其包括例如阴离子或阳离子交换层析、模拟移动床层析、膨胀床吸附层析、凝胶过滤、反相层析、离子交换膜层析和/或混合床离子交换层析)、电泳、渗析、微粒过滤、沉淀、离心、结晶、以及它们的组合。上述多种组分的分离的主要原理是分子大小，尽管在过滤应用中，过滤介质的渗透性能够被样品的化学、分子或静电特性影响。如本文中其它地方所详述的(例如，下文提及图2时)，本公开的方法通常利用多于一种的取决于待移除的乳清流的特定组分的分离膜。例如，所述方法的一个步骤可以利用超滤分离膜，然后的一个或多个步骤利用纳米过滤分离膜。

在多个方面，本公开提供了用于回收和分离纯化的BBI蛋白的方法，所述BBI蛋白存在于大豆蛋白分离物的生产过程中产生的含水的大豆乳清流中。应当指出的是，本发明的方法不限于大豆乳清或大豆糖浆流，并且可被用于从很多种豆科或非豆科植物工艺流回收蛋白和多种其它组分。在多个方面，包含高比例的BBI蛋白级份被从大豆乳清流回收。例如，如本文其它地方所详述的，本公开的方法提供了具有此前未达到的水平的纯度的BBI蛋白组合物。

通过本公开的方法处理的大豆乳清流一般是相对稀释的。为了有利于BBI蛋白的回收和/或分离，所述乳清流优选在所述方法的初始步骤中被浓缩。大豆乳清流的浓缩有助于从所述乳清流回收和分离BBI蛋白。例如，在本公开的一个优选的实施方案中，在回收BBI蛋白之前，通过使含水的大豆乳清或其级份与分离膜接触以形成包含含水的大豆乳清的保留物和包含水的透过物，从所述含水的大豆乳清移除了水。在本公开的其它实施方案中，水可通过本领域已知的任何方法例如通过蒸发从所述大豆乳清移除。

随着BBI蛋白的回收，本公开的方法通常将蛋白自存在于大豆乳清流中的糖类分离。任选地，本公开的方法可以被配置和控制以将大豆乳清流中的糖分离至一种或多种级份(例如，单糖富集的级份和/或低聚糖富集的级份)。这可以在多个步骤中完成以将不同的糖类从蛋白分离。因此，糖类从大豆乳清流的回收提供了进一步的产品流。如所指出的，糖类的移除通常产生糖类能够被从其分离的级份，所述分离产生浓缩的糖类级份和可以最低限度的(如果存在的话)处理被处置或作为工艺用水被回收利用的相对纯的含水级份。在处理所述保留物以移除糖类之后，所述保留物被进一步处理以移除附加的组分。

如所指出的，可通过本公开被处理的多种大豆乳清流包括一种或多种矿物(例如，磷和钙)。已经注意到，一种或多种矿物的存在可通过例如膜的污染和从所期望回收的组分(即，KTI蛋白)分离方面的困难而对下游的处理构成挑战。除了一般地回收这些所期望的组分之外，从大豆乳清移除矿物目前据信还有助于回收具有较高纯度的BBI产品。如本文中其它地方所详述的，从大豆乳清移除矿物一般可以根据本领域中已知的方法进行，所述方法包括例如沉淀和离心。由于植酸通常存在于通过本发明的方法处理的含水的大豆乳清流中，矿物如钙和镁通常以植酸钙和植酸镁的形式被回收。其它被移除的矿物还可包括例如钠、钾、锌、铁、锰和铜。

在关于不溶性固体的移除的某些方面，微粒过滤、沉淀、离心、结晶、以及它们的组合可以被使用。通过这些方法移除的不溶性固体通常大于5微米。

微量过滤是通过使用微量过滤膜将固体颗粒从流体分离的方法。适合的微量过滤膜由本领域已知的适当材料构成，所述材料包括例如聚砜、改性聚砜、陶瓷和不锈钢。微量过滤膜通常具有约0.1微米至约20微米范围的孔径。在某些方面，微量过滤膜具有约0.2微米至约2微米范围的孔径。

超滤与微量过滤类似，但在分离膜的孔径方面不同。超滤膜通常被用于从具有较低分子量的分子分离具有较高分子量的分子(包括例如蛋白。适合的超滤膜通常由本领域已知的适当材料构成，所述材料例如聚砜(PS)、聚醚砜(PES)、聚丙烯(PP)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、再生纤维素、陶瓷、不锈钢、或薄膜复合材料。超滤膜通常具有约1千道尔顿(kDa)至约300kDa或约5kDa至约50kDa的阻隔分子量。除此之外或作为另外一种选择，适合的超滤膜可具有约0.002微米至约0.5微米的孔径。

纳米过滤被用于流体移除小分子。适合的纳米过滤膜通常由本领域已知的适当材料构成(例如聚醚砜、聚砜、陶瓷和聚酯上的聚酰胺型薄膜复合材料)并且通常具有约0.1kDa至约5kDa或约1kDa至约4kDa的MWCO。除此之外或作为另外一种选择，适合的纳米过滤膜可具有约0.9纳米至约9纳米的孔径。

反向渗透(或超滤)通常被用于糖类的浓缩。适合的反向渗透膜包括本领域一般已知的那些(例如，具有小于0.5nm的孔径的膜)。

本发明的过滤步骤中利用的分离膜可以单独地或以组合方式根据本领域已知的一种或多种配置方式被布置。例如，膜可以平板的形式、或者以多层膜在其中被组合到一起(连同分离器筛网的任选的层)的盒模块的形式被配置。含水的大豆乳清通常在膜堆的一端被引入交替通道，并且流体通过膜进入一个或多个滤液或透过物通道。分离膜也可被布置在螺旋状的模块中，在其中交替的膜的层围绕着中空的中心核。含水的大豆乳清被引入所述模块的一个末端，而流体通过所述交替的膜的层流向并进入所述模块的核心。又如，分离膜可被布置在中空纤维模块中，所述模块包括一束相对窄的膜管。含水的大豆乳清被引入所述模块中，并且流体沿痛过所述模块的大豆乳清的流的横向通过膜管束。适合的膜的布置描述于例如美国专利6,946,075中，其全文以引用方式并入本文。

如本文进一步所述，本发明的过滤步骤可以采用直接(常规流)过滤或切向(错流)过滤。在直接或常规流过滤中，流体(即，含水的大豆乳清)被直接向着分离膜运送。作为另外一种选择，在切向或错流过滤中，流体(即，含水的大豆乳清)可以沿分离膜表面的切向被运送。切向或错流过滤的一个优点是，含水的大豆乳清的流切向施加在膜上的摩擦或扫刮力通常有助于维持流量。相应地，在多个方面，本公开的方法中的一个或多个步骤、以及它们的组合按照错流过滤操作。适合的错流过滤器包括本领域中一般已知的那些，包括美国专利6,946,075中描述的那些。应当了解，流体的通过可以根据常规的和/或切向的(即，交错的)流适当地进行。还应当了解，流体穿越其它膜分离单元的通过可以根据这些机制中的一种或全部两种进行，所述其它膜分离单元详述于本文中与2中描述的实施方案以及其它方面相关的其它地方。

本发明所描述的方法涉及选择适当的分离操作或操作的组合，以从大豆乳清流顺序移除多种组分和回收或分离纯化的BBI产品，所述BBI产品包含本领域此前尚未达到的水平的纯度。在本发明的某些方面，并且如本文其它地方所详述的，用于回收BBI蛋白的方法利用膜分离和层析分离(例如离子交换)操作的组合。在多个方面，单独的BBI蛋白的回收通过模拟移动床操作(本领域中经常称为“SMB”配置)进行。

如本文中其它地方所指出的，通过本公开的方法处理的含水的大豆乳清流一般是相对稀释的。在多个方面，在回收作为靶标的个别的蛋白之前，含水的大豆乳清通过例如水的移除，以至少约2(例如，约3或约6)的系数被浓缩。

与用于回收BBI蛋白的其它方法相比，至少部分地由于其处理含水的大豆乳清的多个样品的能力，使用模拟移动床回收非BBI的蛋白一般也可以提供低成本、通量和/或灵活性的优势。

已经注意到，大豆乳清流的一种或多种组分可干扰BBI蛋白的回收。例如，在大豆蛋白分离物制造过程中，硅化合物(通常为硅氧烷)经常作为消泡剂被引入，通常是以包含硅的化合物的形式，例如可从Hydrite Chemical或Emerald Performance Materials商购获得的那些。无论确切的来源如何，有机硅化合物通常以按硅含量计最高约15份每一百万份(ppm)、最高约10ppm、或最高约5ppm的浓度存在于大豆乳清流中。有机硅化合物的存在一般是不可取的，因为它可能会干扰大豆乳清流的BBI蛋白的回收。

相应地，在多个方面，在用于回收和分离BBI蛋白的操作之前，硅氧烷和/或其它有机硅化合物从大豆乳清流移除，如本文中其它地方所详述的。优选地，硅化合物被移除至使得大豆乳清包含不超过痕量级有机硅的程度，如本文中进一步所详述的。除此之外或作为另外一种选择，含水的大豆乳清可包含一种或多种微生物，所述微生物可干扰所述含水的大豆乳清的所期望的组分的回收，和/或在所述方法的最终的回收的产品中是不可取的。

为了移除这些干扰组分，可使用选择性保留硅消泡剂和/或一种或多种微生物的分离膜过滤所述大豆乳清流，以产生包含硅和/或一种或多种微生物的保留物和包含含水的大豆乳清的透过物。这一初始纯化中使用的特定膜(包括例如微量过滤)是根据待移除的组分选择的。无论所选择的膜的类型和从大豆乳清流移除的组分如何，优选所期望的BBI蛋白的至少主要部分、并且优选所期望的BBI蛋白的基本上全部存在于保留物中。进而就这一点而言，应当注意的是，提及包含含水的大豆乳清的透过物时表示用于移除一种或多种杂质的对乳清流的处理对所述大豆乳清流的其它组分具有很小的(如果存在的话)影响。

在多个供选择的替代方面，所述乳清流中包含的细菌可在蛋白的回收之前通过加热被杀死。加热大豆乳清流以杀灭细菌的方式是不严格的，并且一般可根据本领域已知的常规方法进行。然而，加热大豆乳清流以杀灭微生物可能引入蛋白变性的风险。相应地，通过不包括对大豆乳清流的加热的方法将细菌和其它微生物从大豆乳清流移除一般是优选的。

图2描述了用于从在大豆蛋白分离物的生成中产生的大豆乳清流中回收一种或多种单独的蛋白的本公开的方法的实施方案。

如图2中所示，含水的大豆乳清1被引入包含第一过滤进料区域6的膜分离单元5中，所述第一过滤进料区域6以比分离膜7另一侧的第一透过区域8中的压力更高的压力与所述膜的一侧接触。优选地，膜分离单元5包含至少一种微量过滤膜。

跨越膜分离单元5中的分离膜7的跨膜压力一般为至少约5psi、至少约25psi、至少约50psi、至少约100psi、或至少约150psi。流体通常以至少约1升流体/小时-平方米、或约1升流体/小时-平方米至约200升流体/小时-平方米横截面膜区域(横向于流动方向)的体积流量或流量通过所述膜。流量可以被例如过滤的类型、膜的污染等影响。大豆乳清通常以约0℃至约100℃，更典型以约25℃至约60℃的温度被引入所述膜分离单元的过滤进料区域。通常，含水的大豆乳清1由于保留物的原因体积减少约5％。

流体穿越分离膜的通过导致第一保留物9和第一透过区域8中的第一透过物13。所述第一保留物9将主要包含一种或多种微生物和不溶性材料。更具体地，所述第一保留物9通常相对于所述第一透过物13富集了微生物。优选地，所述第一保留物9包含所述含水的大豆乳清的微生物含量的主要部分或全部。甚至更优选地，所述第一保留物9还包含消泡剂(例如，存在于所述含水的大豆乳清中的有机硅的硅或包含脂质的化合物)的主要部分。更具体地，基于消泡剂含量，所述第一保留物9包含至少约70重量％，更优选至少约80重量％，甚至更优选至少约90重量％的含水的大豆乳清的消泡剂含量。所述第一透过物13将主要包含所述含水的大豆乳清流的全部的多种剩余组分，例如可溶性大豆贮藏蛋白、大豆乳清蛋白、多种糖类、水、矿物、异黄酮素和维生素。

再次就图2而言，所述第一透过物13被引入包含第二过滤进料区域18的膜分离单元17中，所述第二过滤进料区域18以比第二透过区域20中的压力更高的压力与分离膜19的一侧接触。膜分离单元17优选包含至少一种超滤膜作为分离膜19。跨越膜分离单元17中的分离膜19的跨膜压力一般为至少约5psi、至少约10psi、至少约25psi、至少约50psi、至少约100psi、或至少约150psi。流体通常以至少约1升流体/小时-平方米、或约1升流体/小时-平方米至约150升流体/小时-平方米横截面膜区域(横向于流动方向)的体积流量或流量通过所述膜。大豆乳清通常以约0℃至约100℃，更典型以约25℃至约60℃的温度被引入所述膜分离单元的过滤进料区域。通常含水的大豆乳清1以至少约5、或约5至约75(例如，约25)的浓缩系数被浓缩。超滤步骤可以任选地包括渗滤。渗滤体积通常为约1份直到约10份渗滤体积每份保留物范围。

流体穿越所述分离膜的通过导致第二保留物21和第二透过物25。所述第二保留物21包含大部分所述含水的大豆乳清的蛋白含量，并因此被进一步处理以回收BBI蛋白。优选地，所述第二保留物21包含存在于被引入所述第一过滤进料区域6的含水的大豆乳清中的多种大豆乳清蛋白的至少约25重量％至至少约90重量％(例如，至少约50重量％)(基于干重)。

再次就图2而言，所述第二透过物25一般包含没有被回收至第二保留物21中的任何蛋白和所述大豆乳清流的多种其它组分(例如，多种糖类、水、矿物、维生素和异黄酮素)。尽管未图示于图2中，所述第二透过物25的组分可按照适当的分离操作被进一步处理，以分离和/或移除来自所述含水的乳清流的单独的组分。在附加的分离步骤之后，将优选地形成相对纯的水流，其在被处置或使用之前需要最低限度的处理(如果存在的话)。因此，本文所述的发明还通过例如改善环境品质而具有环境有益效果。

将所述第二保留物21与载体流23混合以形成进料24，通向包含至少一种离子交换树脂30的离子交换柱或单元29。所述载体流的确切位置不被严格要求。因此，本文所述的发明还通过例如改善环境品质而具有环境有益效果。在BBI蛋白的回收的多个方面，所述载体流包括非挥发性的缓冲液，包括如柠檬酸钠，或挥发性的缓冲液，包括如甲酸铵。例如，在多个方面，所述载体流包括在含水混合物中以约10毫摩尔每升至约30毫摩尔每升(例如，20mM)。

所述第二保留物21和/或进料流24的pH影响大豆蛋白的溶解度，而沉淀的蛋白可以导致离子交换树脂的污染。因此，可能期望将流向离子交换柱的进料的pH控制在某些范围内(例如，通过缓冲作用)。如果必要，可通过例如稀释所述第二保留物、载体流和/或通过所述保留物和载体流的混合提供的进料，将所述进料的pH维持在所述范围内。稀释剂的组成没有严格要求，通常为可由本领域的技术人员容易地选择的含水介质(例如，去离子水)。除了影响所述进料的pH外，稀释还通常降低所述进料的内在离子强度，这促进了蛋白与离子交换树脂的结合。除此之外或作为另外一种选择，所述进料的pH可通过载体流的选择来控制。

离子交换树脂被选择为适用于第二保留物21和进料24中存在的一种或多种蛋白的选择性保留和回收。在多个方面，所述离子交换树脂被选择用于BBI蛋白的选择性保留或非BBI蛋白的保留，使得BBI蛋白与非BBI蛋白分离。以下的讨论聚焦在从含水的大豆乳清(例如，第二保留物21)回收和分离BBI蛋白上。然而，应当了解，下列的流程能够容易地适应其它靶蛋白(例如KTI蛋白)的回收以及含水的之外的其它类型的输入流(例如，从喷雾干燥的复原的)。

无论离子交换单元的确切配置如何，适用于BBI蛋白的回收的离子交换树脂包括多种阳离子和阴离子交换树脂。取决于进入离子交换柱的进料，尽管阳离子交换树脂和阴离子交换树脂均适用于回收BBI蛋白，所述离子交换树脂在多个方面包括阳离子交换树脂。例如，暴露于低于其等电点(pI)的pH中的蛋白更加可能具有带正电荷的区域，并因此更加牢固地与阳离子交换树脂结合。所述进料流中的大多数蛋白具有比BBI的pI和所述进料通常的pH更高的pI。因此，这些蛋白通常更加牢固地与所述树脂结合。包含BBI蛋白级份可通过使树脂与适当的洗脱剂接触而被容易地从离子交换柱上洗脱。

作为另外一种选择，所述进料的pH可以被控制为低于BBI蛋白的pI，以通过离子交换树脂提供BBI蛋白的保留。其它蛋白(例如KTI蛋白)也与所述树脂结合。然而，所期望的级份的回收可通过使离子交换树脂与用于蛋白级份的差别洗脱的适当的洗脱剂接触进行。

适当的阳离子交换树脂包括本领域所熟知的多种树脂。在至少一个实施方案中，所述离子交换树脂包括Poros 20HS-由Applied Biosystems制造的交联的多聚(苯乙烯-二乙烯基苯)基质，其表面涂覆了用磺基丙基(例如，丙烷磺酸，-CH₂CH₂CH₂SO₃ ^-)官能化的多羟基聚合物。

已经观察到，调节保留物和/或进料的pH可以导致非BBI蛋白的沉淀。在这样的实例中，沉淀的蛋白可以在引入离子交换柱之前通过任何的膜分离技术(例如，过滤，如超滤、微量过滤、纳米过滤和/或反向渗透)、层析分离技术(例如，离子交换层析、吸附层析、尺寸排阻层析、反相层析和亲和层析，其包括例如阴离子或阳离子交换层析、模拟移动床层析、膨胀床吸附层析、凝胶过滤、反相层析、离子交换膜层析和/或混合床离子交换层析)、电泳、渗析、微粒过滤、沉淀、离心、结晶、重力分离(包括分别使用例如硫酸铵或氯化铵的盐析或盐溶)、或它们的组合从所述进料分离(未显示于图2中)。分离可以在约1至10的pH范围在约0℃至100℃的温度下进行。

再次就图2而言，在进料24通过了离子交换柱30之后，回收了洗脱的BBI蛋白流33。

如果必要的话，使离子交换树脂与适当的洗脱剂接触，以产生包含洗脱的BBI蛋白的流33和包含KTI蛋白的流37。蛋白从离子交换柱的洗脱通常通过多阶段的方法进行。根据多个方面，在第一阶段，所述柱与用于从离子交换树脂移除BBI蛋白的洗脱剂接触。适当的洗脱剂例如包括氯化钠与柠檬酸钠的混合物。例如，适当的洗脱剂能够包括使用1mM和400mM之间的溶液、氯化钠对柠檬酸钠的体积比为约15∶1至约25∶1的氯化钠和柠檬酸钠的混合物。除如此洗脱的BBI蛋白之外，取决于条件(例如，pH、离子强度等)，包含BBI蛋白的流能够通过离子交换柱(例如，流穿)。洗脱缓冲液包括例如缓冲液和适当的反离子，这能够由本领域的普通技术人员确定。在第二阶段，离子交换树脂与用于以例如包含KTI蛋白的流37的形式移除非BBI蛋白的洗脱剂接触。

在本发明的某些方面，在其中使用不保留BBI蛋白(既，流穿)的离子交换柱获得BBI蛋白，BBI蛋白具有与柱的固定相相同的电荷并因此流穿而不被保留。然而，非BBI的蛋白被所述柱保留。

再次就图2而言，包含BBI蛋白的流33与液体沉淀介质45一起被引入包含沉淀区域的分离单元41中。一般而言，所述液体沉淀介质45包含沉淀剂。通常，所述液体沉淀剂包含硫酸铵以从BBI蛋白流33沉淀BBI蛋白。在多个方面，所述液体沉淀介质以约30％至约60％(例如约40％至约50％)的浓度或其在所述液体沉淀介质中的饱和浓度包含硫酸铵。

BBI蛋白级份33与沉淀介质45在沉淀区域内的接触形成了沉淀的BBI蛋白级份49和被从分离单元41移除的上清液53。在盐或缓冲液的存在或不存在下，所述沉淀的BBI蛋白级份49与含水的洗涤介质57混合以形成溶解的BBI蛋白级份61。所述BBI蛋白级份61可以包含残余的沉淀剂(例如硫酸铵)和一种或多种其它杂质。

如图2中所示，溶解的蛋白级份61被引入渗析或渗滤单元65中以移除任何残余的沉淀剂和一种或多种杂质。所述渗析或渗滤单元的形式或配置无严格要求，并且本领域的技术人员可以容易地选择所述单元。例如，可以使用包括适当的渗析盒(例如Slide-A-Lyzer，由ThermoScientific Pierce Protein Research Products制造，具有2000道尔顿的阻隔分子量)的渗析单元或包括错流过滤膜(其可以更适合用于大规模分离)的渗滤单元。残余的沉淀剂和/或杂质的移除通过监测溶解的蛋白级份61的电导率来确定。一旦实现适当的杂质移除，即从渗析或渗滤单元65移走纯化的BBI溶解的蛋白级份73。纯化的溶解的BBI蛋白级份73可以被引入干燥单元77(例如冷冻干燥单元或喷雾干燥单元)以形成干燥的纯化的BBI蛋白产品81。任选地，对纯化的溶解的BBI蛋白级份73的处理从所述BBI蛋白级份移除了一种或多种剩余的杂质，以形成本发明的纯化的BBI蛋白产品81。例如，使用

X114进行处理以移除一种或多种内毒素。

图3示出了对如图2所示的本发明的方法过程中分离的多种保留物和透过物的SDS-PAGE纯度分析，包括最终的BBI产品。泳道1描述了分离之前的大豆乳清的组成并且显示了多重组分的存在。与此相对，泳道8描述了按照本发明的分离方法从大豆乳清分离的BBI蛋白并且几乎不含附加的组分，这意味着高水平的纯度。

图2中所描述的方法设计不限于原料或以上所示的大豆乳清组分的分离和回收的顺序，并且可被用于制备与上文所论及的那些不同的工艺流，包括例如如所附权利要求中所示的。

F.制备BBI蛋白的附加的方法

在某些实施方案中，本发明的BBI蛋白通过例如重组方法或合成产生。本发明的蛋白的重组制备使用本领域的普通技术人员已知的标准技术进行。此类方法包括例如制备一种或多种编码核酸序列，这能够通过基于聚合酶链反应(PCR)的方法用全长cDNA序列作为模板进行。在制备了所期望的核酸序列之后，该序列被插入表达载体(包括，例如，大肠杆菌(Escherichia coli)pCAL-n表达质粒)中，然后将其转入微生物；然后，使用选择标记(包括，例如，抗生素抗性选择标记或荧光选择标记)，进行对包含含有所期望序列的质粒的克隆的选择；然后大量制备包含含有所期望序列的质粒的克隆；并从所期望的克隆纯化肽(参加，例如，Gorlatov等人所述的方法，Biochemistry(2002)41，4107-4116；美国专利4,980,456)。作为另外一种选择，本发明的肽能够通过合成方法或半合成方法(例如，重组制备和合成方法的组合)制备。

合成制备能够通过例如应用根据Carpino L.A.和Han.G Y，J.(Amer.Chem.Soc.1981；37；3404-3409)的芴甲氧羰基保护基团策略或叔-丁氧羰基(t-Boc)-保护基团策略进行。肽使用多重肽合成仪合成例如通过根据Merrifield R.B.(J.Amer.Chem.Soc.1963；85，2149-2154)的固相肽合成方法。然后对粗制肽进行纯化。

用于本发明的蛋白的合成制备的示例性方法描述于下文中。100mgTentagel-S-RAM(Rapp-Polymere)以0.24mmol/g的载量被转入可商购获得的肽合成设备(PSMM(Shimadzu))中，其中肽序列根据碳二亚胺/HOBt方法被逐步构建。FMOC-氨基酸衍生物通过加入5倍克分子数相等的过量二异丙基碳二亚胺(DIC)、二异丙基乙胺(DIPEA)和羟基苯并三唑(HOBt)，然后转入反应容器，与树脂载体混合30分钟而被预激活。洗涤步骤通过例如添加DMF并彻底混合1分钟进行。裂解步骤通过例如在DMF中添加哌啶并彻底混合4分钟进行。单个反应的移除和洗涤溶液通过迫使溶液通过反应容器的底部玻璃料实现。使用了氨基酸衍生物FMOC-Ala、FMOC-Arg(Pbf)、FMOC-Asp、FMOC-Gly、FMOC-His(Trt)、FMOC-Ile、FMOC-Leu、FMOC-Lys(BOC)、FMOC-Pro、FMOC-Ser(tBu)和FMOC-Tyr(tBu)(Orpegen)。当合成完成时，干燥肽树脂。随后通过在室温用三氟乙酸/TIS/EDT/水(体积比95∶2∶2∶1)处理2小时来裂解肽酰胺。通过过滤、浓缩所述溶液和通过加入冰冷的乙醚沉淀，获得固体形式的粗产物。在0.1％TFA中以5-60％梯度乙腈在40分钟内以12ml/min的流量通过RP-HPLC纯化肽，并通过UV检测器方法在215nm评估洗脱液。通过分析型RP-HPLC和质谱测定了单种级份的纯度。

定义

为了更好的理解本发明，下文定义了几个术语。

如本文所用，术语“酸可溶的”是指物质在具有约2至约7的pH的含水介质中以10克每升(g/L)的浓度具有至少约80％的溶解度。

如本文所用，术语“大豆分离蛋白”或“分离大豆蛋白”是指按无水计具有至少约90％的大豆蛋白的蛋白含量的大豆材料。

如本文所用，术语“对象”是指需要对病理状态进行治疗的哺乳动物(优选人类)、鸟、鱼、爬行动物、两栖动物，所述病理状态包括但不限于与肌肉相关的疾病、非受控的细胞生长、自身免疫疾病和癌症。

如本文所用，术语“工艺流”是指来源于精炼完整的豆类或油料种子的方法的次级或附带的产物，包括含水的流、溶剂流、或从干燥的(例如喷雾干燥的)复原的流，其包括例如含水的大豆提取物流、含水的豆浆提取物流、含水的大豆乳清流、含水的大豆糖浆流、含水的大豆蛋白浓缩物大豆糖浆流、含水的大豆透过物流和含水的豆腐乳清流，并且附加地包括例如液体和干粉形式的大豆乳清蛋白，其能够根据本文所公开的方法被回收作为中间产物。

如本文所用，术语“其它蛋白”被定义为包括但不限于露那辛、凝集素、脱水蛋白、脂氧合酶、以及它们的组合。

如本文所用，术语“大豆乳清蛋白”或“大豆乳清”被定义为包括在大豆贮藏蛋白通常不溶解的pH可溶的蛋白，包括但不限于BBI、KTI、露那辛、脂氧合酶、脱水蛋白、凝集素、肽、以及它们的组合。大豆乳清蛋白还可以包括贮藏蛋白。

如本文所用，术语“大豆低聚糖”被定义为包括但不限于糖。糖被定义为包括但不限于蔗糖、棉子糖、水苏糖、毛蕊花糖、单糖、以及它们的组合。

当介绍本发明或其优选实施方案的要素时，冠词“一个”和“所述”旨在表示有一个或多个要素。术语“包含”、“包括”和“具有”旨在表示包容性并且表示除列出要素外还可以有其它要素。

在不脱离本发明范围的条件下，可对以上化合物、产品和方法进行各种更改，这意味着可将上文描述和下文实施例中包含的所有内容理解为例证性的而非限定性的。

实施例

实施例1：从大豆乳清蛋白中回收BBI蛋白

具有大约3.7重量％的总固体含量和22.5重量％(基于干重)的总蛋白含量的含水的大豆乳清(145l)被引入包含BTS-25或MMM 0.45微米微量过滤膜的OPTISEP 7000过滤模块中。含水的大豆乳清穿越膜的通过形成了包含含水的大豆乳清的透过物(132l，具有3.2重量％的固体含量)和包含大于99％的大豆乳清初始细菌含量和大于90％的大豆乳清硅消泡剂含量的保留物。

来自微量过滤模块的透过物(132l)被引入包含具有约100kDa的孔径的再生纤维素(RC)超滤膜的OPTISEP 7000过滤模块中。透过物穿越超滤膜的通过形成了包含糖类、矿物与维生素的第二透过物，和具有大约25.4重量％的固体含量与大约83重量％(基于干重)的总大豆蛋白含量的第二保留物(大约2l)。

第二保留物(516ml)以小批量被引入包含Poros 20HS阳离子交换树脂的离子交换柱中(68.3ml柱床体积)，所述树脂是以pH 3的20mM柠檬酸钠预平衡过的。必要时，通过用20mM pH 3柠檬酸钠进行5x稀释并添加HCl，将与离子交换树脂接触的保留物(即，引入离子交换柱的进料流)的pH维持在约4.15。

每一批保留物以大约76cm/hr的线性流量通过所述柱，产生BBI蛋白流(大约73g)。通过用20mM pH 3柠檬酸钠中的400mM氯化钠洗脱，从所述离子交换柱回收了包含BBI蛋白的第二蛋白级份(大约9g)，并且通过用20mM pH 3柠檬酸钠中的1M氯化钠洗脱，从所述离子交换柱回收了包含其它蛋白的第三蛋白级份(大约27g)。包含BBI的级份产生了令人吃惊地且出乎意料地纯的BBI组合物。预期这一级份将包含附加的蛋白(包括例如KTI和具有与BBI的pI相等或更低的pI的其它大豆乳清蛋白)。

在大约23℃的温度用(NH₄)₂SO₄经过大约30分钟将BBI蛋白流(大约6.45l)调至40％饱和度，以形成上清液和沉淀的BBI蛋白级份，通过离心将它们分离。

使沉淀的BBI蛋白级份在大约23℃的温度与45％饱和的(NH₄)₂SO₄洗涤介质接触两次，每次大约5分钟。

沉淀的BBI蛋白级份被溶解于最小体积的去离子水中，并转入Pierce 2K分子量阻隔Slide-a-lyzer渗析盒中，并用去离子水彻底地渗析。从所述渗析盒回收了BBI蛋白级份，并离心移除了少量沉淀的材料。

可溶的BBI蛋白级份被调至4℃的温度，并加入足量的10％的TritonX114溶液(温度为4℃)以得到1％的Triton X114终浓度。这个混合物在4℃温度下搅拌大约60小时。加热混合物至大约40℃30分钟，以达到Triton X114的浊点沉淀(相分离)。

离心所述混合物，并收集上层的BBI蛋白级份。在4℃的温度使富集了内毒素的下层Triton X114相与去离子水接触30分钟。加热混合物至大约40℃30分钟，以达到Triton X114的浊点沉淀(相分离)。离心所述混合物，收集上层残余的BBI蛋白级份相并与之前的BBI蛋白级份材料合并。令人吃惊地且出乎意料地，就内毒素的移除而言，TritonX114溶液表现得比其它溶液好得多。

总的BBI蛋白级份通过Pall Life Sciences 0.2微米HT Tuffryn膜Acrodisc针式过滤器进入乙醇清洗过的玻璃小瓶中。将小瓶在-80℃冷冻，并在Labconco Freezone 4.5冷冻干燥系统上冷冻干燥。

回收了大约2.9g的BBI(＞95％纯度，如通过SDS-PAGE测定的)。表1示出了在根据实施例1中所述的方法的每一纯化步骤获得的结果，最终得到了高纯度的产品。

表1

实施例2：从大豆乳清蛋白中回收BBI蛋白

具有86.2重量％(基于干重，如通过氮燃烧检测法，标准的凯氏(Kjeldahl)方法所测定的)的总蛋白含量的喷雾干燥的大豆乳清蛋白(44gm)被重悬于去离子水中至终浓度为10％(w/v)，并于室温搅拌2小时。在Beckman JA-10转子中以4000×G离心悬浮液10分钟以移除不溶物。用4倍体积的10mM，pH 3.0柠檬酸钠缓冲液稀释上清液，并用浓盐酸进一步调节至3.0的最终pH。在Jouan C60转子中以4000RPM室温离心所述调节了pH的上清液30分钟，倒出上清液并用作柱的载样。

用于柱展开的溶液如下：溶液A：去离子水；溶液B：柠檬酸钠，500mM，pH 2.1。21.6×5cm柱的SP Sepharose Fast Flow树脂(424ml)在Axichrom 50/300柱(GE Healthcare，Piscataway，NJ)中以3倍柱体积的98％溶液A、2％溶液B进行平衡。上一段中描述的最终的大豆乳清蛋白溶液(2.29升，采用改进的Lowry方法，Sigma-Aldrich Total ProteinKit，Micro-Lowry，Onishi和Barr改进，估算为14.2mg/ml蛋白)以50ml/min的流量被施加至柱上。用98％溶液A、2％溶液B(20倍柱体积)洗涤所述柱，然后以2-15％的溶液B线性梯度用5倍柱体积洗脱，然后是无梯度的15％溶液B洗脱附加的20倍柱体积。然后，以无梯度的20％溶液B进行附加的20倍柱体积的洗脱，之后是100％溶液B、5倍柱体积。

在整个柱洗脱阶段收集代表性的级份。从297ml至2120ml收集级份1(1740ml)。整个的15％无梯度洗脱步骤被收集为级份2(8500ml)。整个的20％溶液B无梯度步骤被收集为级份3(8500ml)。级份4(2120ml)包括100％溶液B洗脱液。在级份2中，根据10-20％Criterion Tris-HCl凝胶(Bio-Rad Labs，Hercules，CA)上的SDS-PAGE分析鉴定了纯化的BBI。

可溶的BBI蛋白级份被调至4℃的温度，并加入足量的10％的TritonX114溶液(温度为4℃)以得到1％的Triton X114终浓度。这个混合物在4℃温度下搅拌大约60小时。加热混合物至大约40℃30分钟，以达到Triton X114的浊点沉淀(相分离)。

离心所述混合物，并收集上层的BBI蛋白级份。在4℃的温度使富集了内毒素的下层Triton X114相与去离子水接触30分钟。加热混合物至大约40℃30分钟，以达到Triton X114的浊点沉淀(相分离)。离心所述混合物，收集上层残余的BBI蛋白级份相并与之前的BBI蛋白级份材料合并。然后，使用Virtis Freezemobile 25XL将所述材料部分地冷冻干燥，以使样品的体积减少至大约150ml。

总的BBI蛋白级份通过Pall Life Sciences 0.2微米HT Tuffryn膜Acrodisc针式过滤器进入乙醇清洗过的玻璃小瓶中。将小瓶在-80℃冷冻，并在Virtis Freezemobile 25XL冷冻干燥系统上冷冻干燥。

回收了大约3.6g的BBI(＞95％纯度，如通过SDS-PAGE测定的)。表2示出了在根据实施例2中所述的方法的每一纯化步骤获得的结果，最终得到了高纯度的产品。

表2

实施例3：BBI蛋白样品与本发明的BBI蛋白的比较

作为已知的BBI蛋白结构和本发明的BBI蛋白之间的比较，表3列出了每种之中存在的氨基酸残基的摩尔百分比(mol％)。由UC Davis的Molecular Structure Facility使用L-8800 Hitachi分析仪分析了本发明的BBI产品。该分析仪使用离子交换层析来分离氨基酸，之后是“柱后”茚三酮反应检测体系。标准的水解程序使用6N HCl在110℃进行24小时。在标准的酸水解之前，通过用过甲酸氧化测定了半胱氨酸(以及胱氨酸)和甲硫氨酸，这产生了酸稳定的形式磺基丙氨酸和甲硫氨酸砜。色氨酸使用MES水解步骤测定。

表3：存在于已知的BBI蛋白和BBI蛋白亚型(E113609-146)中 的氨基酸残基的比较。

实施例4：用于处理病理状态的BBI。

如之前所讨论的，本发明的BBI蛋白被用于治疗患者中的某些病理状态。BBI蛋白是单一的BBI蛋白或本文所述的BBI蛋白的任何混合物。本发明的BBI蛋白能够作为例如包含本发明的BBI蛋白和药用载体的组合物或者作为包含本发明的BBI蛋白的食物被施用。

已发现本发明的BBI蛋白阻止了功能性骨骼肌质量和力量在停用期间的损失。已发现本发明的BBI蛋白向饮食中的添加显著地减轻了后肢悬吊之后的骨骼肌萎缩。此外，已发现本发明的BBI蛋白的施用在mdx小鼠中导致了肌营养不良肌肉的功能性改善，因此展示了包含本发明的BBI蛋白的组合物用于治疗退行性肌肉紊乱(包括例如肌肉萎缩症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、脊髓性肌肉萎缩症和脊髓损伤)的进一步用途。

后肢悬吊实验和方法如上文所述并且是本领域的普通技术人员已知的(参见例如，Matuszczak等人，Aviat Space Environ Med 75：581-588，2004；Arbogast等人，Journal of Applied Physiology March 2007，第102卷3：956-964；美国早期公开20080300179)。神经变性的肌肉紊乱实验和方法此前已被描述，并且是本领域的普通技术人员已知的(参见例如Morris等人，J Appl Physiol.2010年11月；109(5)：1492-9；美国早期公开20080300179)。

在小鼠中，包含本发明的BBI蛋白的组合物抑制与停用相关的肌肉萎缩的进程的能力，通过对已知在肌肉去负荷(例如后肢悬吊)期间变化的多种生理学参数的测量而被证明。将在BBI治疗的(即，服用包含本发明的BBI蛋白的组合物)悬吊和未悬吊的动物中获得的结果，与用aBBI(即，服用包含经过高温高压以移除抑制性活性的本发明的BBI蛋白的组合物)或标准食物饲喂的那些进行了比较。对于每一实验，饲喂了所述三种类型的饲料之一的小鼠接受了后肢悬吊或被用作未悬吊的对照物。

在初始实验中，三月龄的小鼠被用于展示补充了BBI的食物减少与后肢悬吊相关的肌肉萎缩的量的能力。对于这一实验，悬吊了14天的小鼠被给予了补充了BBI或aBBI的食物。在悬吊之后，解剖了肌肉并测量了力量。在饲喂BBI的动物中，强直力量比在饲喂aBBI的动物中更高。以张力每克肌肉重量测量的平均特异性力量，在饲喂BBI的动物中比在饲喂aBBI的动物中更高。饲喂BBI的动物的肌肉重量比饲喂aBBI的动物的肌肉重量更高。饲喂aBBI的动物比饲喂BBI的动物萎缩百分比更高。

随着在饲喂BBI的动物中观察到了肌肉重量的提高，使用六月龄的小鼠进行了更大尺度的研究。

在这些实验中，在实验期之前和之后，测量了悬吊和未悬吊的小鼠的体重。经过14天后，每一组中未悬吊的动物表现出体重的少量增加。悬吊的饲喂BBI的和饲喂aBBI的动物经过14天的后肢悬吊之后体重降低。悬吊的饲喂对照物的动物经过14天的后肢悬吊之后体重降低。身体质量的降低此前已被许多研究报道(参见Thomason，D.B.和Booth，F.W.J Appl Physiol 1990 68：1-12中的参考文献)并且已被提出既是因为总食物摄入的减少也是因为每克食物摄入的体重增加的降低(MoreyE R.Bioscience 29：168-172，1979)。

为了确定本发明的BBI蛋白是否能够减轻停用性萎缩过程中的肌肉损失，饲喂了对照食物或补充了BBI的食物的动物被悬吊了3天、7天、或14天。已发现饮食补充BBI在每一时间点均减轻了肌肉质量的损失。在7天的后肢悬吊之后，饲喂BBI的动物的肌肉质量比饲喂aBBI的和饲喂对照物的动物更高。饲喂BBI的动物的平均比目鱼肌重量比饲喂aBBI的和饲喂对照物的动物更高。与饲喂aBBI的和饲喂对照物的动物相比，饲喂BBI的动物的萎缩百分比是有限的和降低的。饲喂对照物的未悬吊的、饲喂BBI的未悬吊的和饲喂aBBI的未悬吊的动物肌肉重量没有差异。

对全部的组而言，每块肌肉的平均纤维数量是相似的，表明后肢悬吊没有导致单根肌纤维的消失。因此，以横截面测量了单根肌纤维的纤维面积。确定纤维大小是否有任何改变的一个简单方法是，定量强力区域中的纤维数量(例如40x物镜)。提高的纤维尺寸减少了视野区域内的纤维数量(即，肌纤维越小，纤维数量越高)。采用这一方法，与饲喂aBBI的动物相比，饲喂BBI的动物在后肢研究中的平均纤维数量是更低的，这展示了在饲喂BBI的动物中萎缩的减轻。

对层粘连蛋白染色的肌肉横截面进行了分析以直接测量纤维面积。与饲喂aBBI的动物相比，在饲喂BBI的动物中平均纤维面积是提高的。

因此，本发明的BBI蛋白的施用，至少通过减缓纤维尺寸的降低从而维持肌肉的总体质量，减轻了与后肢悬吊相关的肌肉萎缩。

为了确定肌肉是否依然是功能性的，在全部的饲喂组中，对非悬吊的和悬吊的动物的比目鱼肌均进行了收缩测量。由饲喂BBI的悬吊的动物产生的总的强直力量高于类似的饲喂对照物和饲喂aBBI的动物。这一结果展示了在肌肉萎缩模型中，本发明的BBI蛋白能够维持功能性的肌肉质量和允许肌肉产生总体上更强的力量。

在小鼠中观察到的肌肉质量的变化是与BBI的摄入相关的。更具体地，以14天的实验期中消耗的食物的量对单个动物的肌肉重量进行了作图。结果指示了每天消耗的BBI食物的量与肌肉重量之间的正相关性。与aBBI摄入相比，BBI对于肌肉重量的效应作为每天的食物摄入的函数是提高的。对饲喂BBI的动物再评估至消耗了较高量的BBI的子集，在对比目鱼肌的评估中表现出肌肉萎缩的量的进一步减少。在饲喂aBBI的小鼠中的类似分析指示没有比目鱼肌的此类变化。这指示了BBI的消耗的增加降低了肌肉萎缩的程度(即，剂量反应)。这些结果指示，所消耗的食物的量，或者更具体地讲BBI的量，在与后肢悬吊相关的肌肉萎缩的量的减少中是重要的。

在附加的实验中，插入了渗透泵以将本发明的BBI蛋白或本发明的aBBI蛋白直接递送至六月龄小鼠。每一动物在背部的前方部分具有通过手术直接插入至皮肤下的包含BBI(10％w/v)或aBBI(10％w/v)的Alzet渗透泵(Alza，Palo Alto，Calif.)。所述泵经过两周的时间以例如0.5.mu.l/h的速率恒定地释放所述溶液。BBI治疗的动物的肌肉重量比aBBI治疗的动物的肌肉重量更高。肌肉质量通过BBI的维持导致了在14天的悬吊之后肌肉重量的增加。在mdx小鼠(杜氏肌营养不良症的小鼠模型)中也进行了实验。

在这些实验中，用包含本发明的BBI蛋白的组合物对雄性mdx小鼠的治疗，具体而言对其的食物补充，在四周龄时开始进行，并持续了12周。每周监测并记录动物的重量。在对照组mdx小鼠和提供了补充了1.0％BBI的食物的那些之间，没有观察到体重增加方面的差异。此外，作为进一步的对照，向野生型C57BL/6小鼠提供了补充了BBI的食物，以确定BBI是否导致正常的、非营养不良的肌肉大小或功能方面的任何变化。

mdx小鼠的隔膜在4月龄时表现出显著的纤维化，这可以使用常规的苏木精-伊红(H&E)染色观察到。使用将肌肉组织染为红色而将纤维化的和结缔组织染为深蓝色的三色方法，能够实现来自肌肉细胞的纤维化组织的更显著的区分。与对照组mdx小鼠相比，饲喂BBI被发现显著地改善了用H&E和三色法染色的mdx小鼠隔膜的外观。

此外，mdx小鼠的肌纤维从大约4周龄起开始经历明显的退化/再生循环。肌纤维的再生需要出现在再生中的纤维中央的卫星细胞的激活和融合。因此，再生中肌纤维的量度是中央核肌纤维(CNF)的存在，提高的CNF比例代表着提高的再生。对肌肉截面进行染色，层粘连蛋白显示了肌纤维的轮廓，用核染料4，6-联脒-2-苯基吲哚对核进行了染色。对每一肌肉，以占总纤维数量的比例测定了CNF的数量，对每一测量使用了总计2-4块肌肉。在BBI治疗之后，观察到了胫前肌、EDL肌肉和膈膜肌肉中CNF比例的显著降低。

埃文氏蓝色染料(Evan′s blue dye)被用于测定未治疗的和BBI治疗的mdx小时的膜完整性。在处死前二十四小时，向动物腹膜内注射了埃文氏蓝色染料。肌肉被切割、固定和在荧光显微镜下观察，以确定膜损伤的程度。在至少一只未治疗的mdx动物的四头肌肌肉中观察到了申通区域的增加。

与非营养不良的动物相比，mdx小鼠的EDL肌肉展示了质量和横截面积的增加。然而，并非所有质量的增加均与每一横截面积的力量的提高(特异性力量)相关联；相反，mdx肌肉的特异性力量可存在显著的降低。BBI治疗显著地提高了肌肉质量、绝对力量和横截面积，同时维持了特异性力量。这些结果显示通过BBI治疗获得了力量的改善。尽管特异性力量未改变，提高的肌肉质量和绝对力量向动物提供了更强的完成日常任务的能力。提高的肌肉质量并非仅仅由于体重的总体增加，因为存在肌肉重量对体重的比率的显著提高。

因此，如上述每一个实施例所展示的，在杜氏肌营养不良症的该小鼠模型的小鼠摄取了十二周的BBI之后，在骨骼肌的多种形态学和功能性测量中存在显著的改善。

相应地，本发明提供了使用包含本发明的BBI蛋白的组合物的方法。

本文还展示了，在退行性骨骼肌紊乱的小鼠模型中，服用包含本发明的BBI蛋白的组合物，由于力量的提高和肌肉质量的增加而改善了骨骼月几的功能。

此外，本发明还提供了用于减轻退行性骨骼肌疾病或紊乱的症状和/或减缓其进程的组合物和方法。如本文所展示的，在退行性骨骼肌紊乱杜氏肌营养不良症的小鼠模型中，用包含本发明的BBI蛋白的组合物进行的治疗改善了骨骼肌功能。

本领域的技术人员将容易地了解，本文所述的方法和组合物代表示例性的实施方案，并且不旨在限制本发明的范围。对本领域的技术人员而言将显而易见的是，可以对本文所公开的本公开进行不同的替换和修改，而不会背离本发明的范围和精神。

本说明书中提及的全部专利和出版物指示本公开所属的领域的那些技术人员的水平。全部专利和出版物均以引用方式并入本文，其引用程度如同每一单独的公布被特定和个别地以引用方式并入。

本文适当地例证性地描述的本公开可以在未具体公开于本文中的任何元件或限制的不存在下实施。因此例如在本文的每一实例中，术语“包含/包括”、“基本上由...组成”和“由...组成”中的任何一个可以被其它两个术语之一替代。本文所用的术语和表述被用于描述而并非进行限制，使用此类术语和表述并无意排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同形式，但公认的是在受权利要求书保护的本公开的范围内可以使用各种修改形式。因此，应当理解，虽然通过优选实施方案和任选特征对本公开进行了具体描述，但是本领域的技术人员可借助本文所公开的概念的修改形式和变型形式，并且应当理解此类修改形式和变型形式在本发明的范围内。

Claims (22)

1.纯化具有至少约90重量％的总BBI蛋白浓度的BBI产品的方法，其中所述方法包括：

(a)使包含大豆蛋白和杂质的大豆工艺流经受层析分离处理；以及

(b)任选地，使包含大豆蛋白和杂质的大豆工艺流经受一种或多种分离技术处理，

其中获得具有至少约90重量％的总BBI蛋白浓度的BBI产品。

2.权利要求1的方法，其中所述层析分离选自离子交换层析、吸附层析、尺寸排阻层析、反相层析和亲和层析。

3.权利要求2的方法，其中所述层析分离是包括离子交换柱的离子交换层析。

4.权利要求3的方法，其中所述离子交换柱包含阴离子交换树脂、阳离子交换树脂、或它们的组合。

5.权利要求3的方法，其中所述离子交换柱保留所述BBI产品。

6.权利要求3的方法，其中所述离子交换柱不保留所述BBI产品。

7.权利要求1的方法，其中所述一种或多种分离技术选自膜分离、电泳、渗析、微粒过滤、沉淀、离心、结晶、重力分离、以及它们的任何组合。

8.权利要求7的方法，其中所述一种或多种分离技术是膜分离。

9.权利要求8的方法，其中使所述大豆工艺流以至少约1升流体/小时-平方米的体积流量通过膜。

10.权利要求9的方法，其中所述体积流量是约1至约400升流体/小时-平方米。

11.权利要求8的方法，其中使所述大豆工艺流在约0℃至约100℃的温度下通过膜。

12.权利要求8的方法，其中使所述大豆工艺流在约25℃至约75℃的温度下通过膜。

13.权利要求8的方法，其中所述膜包括微量过滤膜、超滤膜、或它们的组合。

14.权利要求3的方法，其中所述方法还包括控制pH以保持其低于BBI蛋白的等电点，使得通过所述离子交换树脂保留BBI蛋白。

15.权利要求3的方法，其中所述方法还包括控制pH以保持其高于BBI蛋白的等电点，使得通过所述离子交换树脂不保留BBI蛋白。

16.权利要求1的方法，其中所述一种或多种分离技术在所述层析分离之前被执行。

17.权利要求1的方法，其中所述一种或多种分离技术在所述层析分离之后被执行。

18.权利要求1的方法，其中所述纯化的BBI产品具有至少约95重量％的总BBI蛋白浓度。

19.权利要求1的方法，其中所述纯化的BBI产品包含至少一种氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、以及它们的任何组合具有至少90％的同一性。

20.权利要求1的方法，其中所述纯化的BBI产品包含至少一种氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、以及它们的任何组合具有至少95％的同一性。

21.纯化具有至少约90重量％的总BBI蛋白浓度的BBI产品的方法，其中所述方法包括：

(a)使包含大豆蛋白和杂质的大豆工艺流经受一种或多种分离技术处理；以及

(b)使包含大豆蛋白和杂质的大豆工艺流经受层析分离处理，

其中获得具有至少约90重量％的总BBI蛋白浓度的BBI产品。

22.纯化具有至少约90重量％的总BBI蛋白浓度的BBI产品的方法，其中所述方法包括：

(a)使包含大豆蛋白和杂质的大豆工艺流经受至少一种分离技术处理以形成第一透过物和第一保留物，所述第一透过物包含所述大豆蛋白，并且所述第一保留物包含所述杂质；

(b)使所述第一透过物经受至少一种分离技术处理以形成第二透过物和第二保留物，所述第二保留物包含大部分蛋白，并且所述第二透过物包含杂质；以及

(c)使所述第二保留物与载体流混合用于通过至少一种层析分离，以使BBI蛋白流与所述工艺流中的其它蛋白分离；

(d)使所述BBI蛋白流与液体沉淀介质混合并使它们经受至少一种分离技术处理以形成沉淀的BBI蛋白级份；

(e)使所述沉淀的BBI蛋白级份与液体洗涤介质混合以形成溶解的BBI蛋白级份；

(f)使所述溶解的蛋白级份经受至少一种分离技术处理以形成纯化的溶解的BBI蛋白级份；以及

(g)使所述纯化的溶解的蛋白级份经受至少一种分离操作处理以形成所述纯化的BBI产品，

其中获得具有至少约90重量％的总BBI蛋白浓度的BBI产品。

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