CN104797589A

CN104797589A - 分离大豆蛋白的方法

Info

Publication number: CN104797589A
Application number: CN201380060767.7A
Authority: CN
Inventors: A·O·F·利米; M·B·汉森; M·庞托皮德安
Original assignee: Upfront Chromatography AS
Current assignee: Upfront Chromatography AS
Priority date: 2012-10-23
Filing date: 2013-10-23
Publication date: 2015-07-22
Also published as: US9765111B2; WO2014064132A1; BR112015008661A2; EP2912052A1; US20150299275A1

Abstract

本发明提供了分离大豆蛋白的方法。所述方法始于大豆蛋白的水性取物或溶液，其通过至少一个扩张床吸附(EBA)过程。所述EBA过程包括将大豆蛋白的水性提取物或溶液与至少一种吸附树脂接触，所述吸附树脂含有至少一种具有特定化学结构的配体(L1或L2)。通过洗脱将目的蛋白(例如胰蛋白酶抑制剂(TI)蛋白或β-伴大豆球蛋白)从所述吸附树脂分离。本发明还提供了可通过本发明的方法获得的多种新型蛋白质组合物。

Description

分离大豆蛋白的方法

发明领域

本发明涉及一种分离大豆蛋白的方法，以及由所述方法获得的纯化的大豆蛋白、β-伴大豆球蛋白(beta-Conglycinin)和胰蛋白酶抑制剂蛋白。

发明背景

大豆是人类和动物的一种重要的蛋白质来源，无论以其未经处理的、还是经过处理的形式。大豆提供了低成本蛋白的良好来源，并因其广泛存在、具有独特的化学组成、良好的营养价值、广泛的用途和有益健康的功效，已成为一种重要的世界商品。尽管低于约5％的大豆蛋白可用于食品，但该百分比有可能增长。近几年一家主要研究机构已经重点研究了各个贮藏蛋白(如大豆球蛋白，β-伴大豆球蛋白和胰蛋白酶抑制剂)，并将它们与工业上的重要功能特性和有益健康的功效联系起来。尽管有了这种广泛的研究，各个这些蛋白质或其富集的部分还不能以低成本广泛可用。

大豆蛋白(即从大豆获得的蛋白质)还含有抗营养因子，其阻止了食物中的营养物质的吸收。特别是在许多大豆蛋白中发现的胰蛋白酶抑制剂(TI)蛋白，其抑制胰蛋白酶(一种存在于消化系统中的水解蛋白质的丝氨酸蛋白酶)的活性。因此，尽管这些蛋白在其它应用中具有有益功能，但是如果用于食品或动物饲料成分的部分，这些蛋白质会对消化酶系统产生负面的影响，并可能导致营养不良和疾病。

因此，为了降低大豆蛋白中天然存在的胰蛋白酶抑制剂蛋白的活性已经采取了特别的努力。一般方法是简单地加热大豆蛋白，该方法变性/破坏了胰蛋白酶抑制剂蛋白。然而，这种技术也破坏或变性了大豆蛋白中的其他蛋白，从而减少了他们的蛋白功能(例如形成凝胶、结合脂肪或乳化)。含有赖氨酸的蛋白质对热尤其敏感。加热还能降低大豆蛋白的水溶性。

加热大豆蛋白以破坏胰蛋白酶抑制剂(TI)蛋白的一种替代方法是将所述胰蛋白酶抑制剂(TI)蛋白与大豆蛋白的其余部分分离。这种技术的优点是避免了热，又能够提供分离的胰蛋白酶抑制剂(TI)蛋白(其本身可成为一种有用的药用产品)。

因此研究努力集中在了大豆蛋白的纯化以分离其中含有的胰蛋白酶抑制剂(TI)蛋白。Bajpai等人(Foodchemistry，89(2005)，497-501)讨论了使用固定化金属亲和层析法结合胰蛋白酶抑制剂和大豆植物凝集素。

WO2011/082358、WO2011/082359和WO2011/082360全部涉及从大豆蛋白中分离和纯化胰蛋白酶抑制剂的的各个方面。

发明目的

尽管迄今为止取得了一定的进展，仍然需要用于从大豆蛋白水性提取物或溶液纯化和分离蛋白的替代方法。

发明概要

本发明人已发现了对大豆蛋白中各种蛋白质具有选择亲和性的某些配体。

因此，本发明的第一方面涉及分离大豆蛋白的方法，所述方法包含以下步骤：

i.提供大豆蛋白的水性提取物或大豆蛋白溶液，所述大豆蛋白提取物或溶液包含至少两种类型的大豆蛋白；

ii.使所述大豆蛋白水性提取物或溶液通过至少一个膨胀床吸附过程，其中所述膨胀床吸附过程包括使所述大豆蛋白水性提取物或溶液与至少一种吸附树脂接触，所述吸附树脂选择性地吸附至少第一类型的大豆蛋白以提供非结合蛋白组分和结合蛋白组分，所述的吸附树脂包含：

至少一种配体(L1)，所述至少一种配体(L1)包含芳族或杂芳族环系统和一个或多个酸性基团，或

至少一种配体(L2)，所述至少一种配体(L2)包含烷基胺或烷基芳基胺，其中所述的在配体(L2)中的烷基胺或烷基芳基胺部分包含被选自下列的一个或多个基团所取代的胺：

a.芳基、苄基或杂芳基；

b.具有4-16碳原子的直链、支链或环状烷基，

或它们的组合；

iii.通过洗脱非结合蛋白组分或者洗脱结合蛋白组分从所述吸附树脂分离所述第一种类型的大豆蛋白，以及

iv.从所述吸附树脂分离第二种类型的大豆蛋白以提供所述第一种类型的大豆蛋白被去除了的第二种大豆蛋白组合物。

在下面的本发明的详细描述和所附的权利要求书中给出了该方法以及所述配体L1和L2的进一步细节。

本发明还提供了由本发明方法获得的大豆蛋白组合物。此外还提供了第一种组合的大豆蛋白产品，其通过将由本发明方法获得的变性的TI蛋白与由本发明方法获得的TI蛋白被去除了的第一种大豆蛋白组合物组合而成。通过将变性的TI蛋白与TI蛋白被去除了的第二种大豆蛋白组合物组合获得的第二种组合的大豆蛋白产品。

附图说明

图1-19阐明了本发明实施例的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶。

发明的详细公开

如上所述，本发明提供了分离大豆蛋白的方法，所述方法包含以下步骤：

a.芳基、苄基或杂芳基；

b.具有4-16碳原子的直链、支链或环状烷基，

或它们的组合；

所述方法适宜按顺序进行，无插入步骤。

大豆和大豆蛋白

大豆，即黄豆(Glycine max)，是生长于世界许多地方的豆科作物。大豆作为食用油、高蛋白食物、食物成分和饲料以及多种工业产品的来源具有巨大的经济意义。

大豆蛋白是大豆中存在的蛋白质的通用术语。大豆粉含有至少50％的蛋白质，由大豆碎片磨制而成。由于其相对高的蛋白含量，许多应用中需要大豆蛋白的组合物。除了人和动物饲料，大豆蛋白具有形成凝胶、结合脂肪以及乳化的有用性质。

大豆蛋白不是均一的组分。根据由超离心分析得到的其沉淀系数，大豆蛋白传统上被分为以下四大组：2S(主要是白蛋白、酶和胰蛋白酶抑制剂)，7S(主要是β-伴大豆球蛋白)，11S(主要是大豆球蛋白)和15S(主要是大豆球蛋白的二聚体)组，分别具有大约25000、160000、350000和600000的峰值分子量。典型的商业方法通过水抽提可以产生大约22％的2S、37％的7S、31％的11S和11％的15S蛋白，但是取决于种类、农作物年份、操作和进行的热处理，所述的数量可明显不同。

为了使这些蛋白彼此分离开发了复杂的实验室方法。这些技术不能实际应用于商业规模的生产。因为步骤中的小变化会显著改变产品的最终组成，这些技术的一些也很难重现。

β-伴大豆球蛋白

近来对获得纯化的β-伴大豆球蛋白组分的兴趣不断增加，主要对其有益性质的研究，诸如降低胆固醇和预防某些类型的癌症。β-伴大豆球蛋白是分子量大约180kDa的三聚体蛋白。它由α′(～71kDa)、α(～67kDa)、和β(～50kDa)三种亚基组成。

大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白占了大豆中蛋白质的大约70％。已经推断可以通过改变这些蛋白的比例来改善在食物体系中大豆蛋白成分的功能特性。以前曾经通过提高大豆球蛋白对β-伴大豆球蛋白的比例来改善豆腐类大豆凝胶的产量和质量，并为了营养目的提高含硫氨基酸的含量。每单位蛋白中大豆球蛋白比β-伴大豆球蛋白多含3到4倍的半胱氨酸和甲硫氨酸。因此认为增加大豆球蛋白的含量并降低β-伴大豆球蛋白的含量会增强蛋白质量。

胰蛋白酶抑制剂蛋白

大豆蛋白中也含有大量的胰蛋白酶抑制剂蛋白(TI)。已知该抑制剂为丝氨酸蛋白酶抑制剂，其抑制胰蛋白酶，并且也经常抑制其它丝氨酸蛋白酶。胰蛋白酶抑制剂结合胰蛋白酶的活性位点，从而阻碍肽键的催化断裂。可以通过标准方法确定胰蛋白酶抑制剂的存在和含量，所述标准方法包括使用标记的胰蛋白酶特异性肽底物的竞争性实验，当分析的样品中存在胰蛋白酶抑制剂时，所述的肽底物会以较低的速度降解。其它比较简单的实验是基于凝胶扩散技术，其中活性胰蛋白酶分子裂解沉淀的蛋白底物，从而产生澄清的区带，其大小取决于胰蛋白酶抑制剂的存在与否。

胰蛋白酶，一种丝氨酸蛋白酶，负责断裂消化体系中的肽键(特别是在精氨酸或赖氨酸处)。但是，如果胰蛋白酶抑制剂(特别是KTI)的存在会使大部分的胰蛋白酶失活，消化的蛋白则未被降解。该胰蛋白酶抑制的影响可能包括胃部疼痛、胰腺增生(细胞增殖)和/或肥大(细胞增大)。

Kuni tz-胰蛋白酶抑制剂(KTI，也称为Kuni tz大豆胰蛋白酶抑制剂)是一类胰蛋白酶抑制剂蛋白，其成员具有大约170-200个氨基酸，分子量在20至25kDa之间，并主要作用于胰蛋白酶。Kuni tz-胰蛋白酶蛋白酶抑制剂大多为单链多肽，由4个半胱氨酸连接成两个二硫桥，每个二硫桥形成的环中存在一个反应性位点。第二类抑制剂含有60-85个氨基酸，分子量范围是6-10kDa，含有较高数目的二硫键，相对热稳定，在不同的连接位点对胰蛋白酶和靡蛋白酶都有抑制。Bowman-Birk抑制剂(BBI)是该类抑制剂的一个实例。大豆中存在的蛋白酶抑制剂的平均水平分别是大约1.4％的KTI和0.6％的BBI。值得注意的是，如此低的水平使分离临床应用的天然蛋白酶抑制剂不切实际。

因此，一方面，所述的蛋白酶抑制剂(TI)是指Kuni tz-胰蛋白酶抑制剂(KTI)或Bowman-Birk抑制剂(BBI)，优选KTI。

发明方法

本发明方法从大豆蛋白的粗水性提取物或大豆蛋白溶液开始。通常所述的大豆蛋白的水性提取物通过用水或稀酸或碱抽提大豆或大豆制品(例如，粉碎的大豆、大豆粗粉或脱脂的大豆粉)获得。提取优选在1-60℃温度下进行0.1-20小时。水可以是接近中性的pH(pH 6.5-7.5)或可以是碱性，例如pH 9.0-pH 12。在某些情况下，通过加入含水碱使提取混合物的pH在提取过程中保持恒定在优选的范围内。

在某些情况下，大豆蛋白是通过进一步加工从粗提取物获得的大豆蛋白溶液，例如沉淀、离心和过滤，所述的过滤包括膜过滤，例如超滤、纳米过滤和微滤。在优选的实施方案中，所述的大豆蛋白溶液是从通过对接近中性或碱性的大豆蛋白提取物的酸化得到的蛋白沉淀而制备的。

优选的大豆蛋白溶液是大豆奶。大豆奶可以由完整的大豆或全脂的大豆粉制备。根据水的温度，干燥的豆子在水中浸泡过夜或至少3个小时或以上。然后再水化的豆子在足够的水加入下进行湿磨，得到所需固体含量的最终产品。水与豆子的重量比例应该是大约10:1。将所得到的浆或糊煮沸，加热失活大豆胰蛋白酶抑制剂而提高其营养价值，改善其味道并消毒所述的产品。在沸点或接近沸点的温度下持续加热一段时间，15-20分钟，然后通过过滤除去未溶的残渣(大豆纤维或豆渣)。传统的中国豆奶和日本豆奶加工过程存在简单但深奥的区别：中国方法是冷却过滤后煮沸滤液(豆奶)，而日本方法是先煮沸豆浆，然后热过滤所述豆浆。后一方法导致较高的豆奶产量，但是在煮沸步骤需要使用防泡沫剂或天然除沫剂。将过滤后的豆奶煮沸避免了产生泡沫的问题。通常其颜色为不透明的、白色或米色，与牛奶的稠度接近。特别优选的是热处理前的豆奶。

其它优选的大豆蛋白溶液可通过洗涤、再溶解和/或酶处理大豆纤维(豆渣)废料获得。制备豆腐产生的废料也构成了优选的大豆蛋白溶液。

为了符合分离方法中的pH，所述大豆蛋白水性提取物或溶液可在步骤(ii)前调节pH，优选调节pH在2.0-9.0之间。调节pH可能导致在水性提取物中的蛋白沉淀，因此可以对pH调节后的大豆蛋白提取物倾析、离心或过滤，在步骤(ii)前去除不溶性物质。

大豆蛋白水性提取物或溶液至少包含两种类型的大豆蛋白—第一种类型和第二种类型。

将大豆蛋白水性提取物或溶液通过至少一个分离过程，所述的分离过程包含将所述大豆蛋白水性提取物与至少一种吸附树脂接触。

所述的吸附树脂选择性吸附至少第一种类型的大豆蛋白，并有可能吸附其它大豆蛋白质。因此获得了非结合的蛋白组分和结合的蛋白组分。

所述的分离过程是固相吸附过程：膨胀床吸附(EBA)。

膨胀床吸附(EBA)

在近年来发展的各种工业性层析分离技术中，膨胀床(EBA)已经被成功地引用到生物技术工业的某些领域。EBA是一种液化床吸附，其中保持最低水平的回混。与其它层析分离技术相比，EBA因其可以直接应用非澄清原料而具有明显的优势。

在EBA过程中，当液体流过时，吸附树脂床可以在层析柱内膨胀。床的膨胀通常在每个末端具有网状结构的柱中进行，该网状结构遮盖了柱子的横截面，或在一些其它有孔的装置中进行，其不会在流动中产生涡流。例如参见WO-A-9218237(Amersham Pharmacia Biotech AB，瑞典)。在使用搅拌的进入流的体系中可以发现相同的效果，WO-A-9200799(UpFront Chromatography A/S).

在膨胀床状态，吸附剂树脂颗粒之间的间距可以导致原料流中微粒杂质的自由通过。相反地，传统的填充床作用就像深度过滤器，其可能堵塞，引起反向压力增加，除非原料是完全澄清的。因为在EBA柱中没有明显的压力产生，所以使用没有大小限制的EBA是可能的，而流速通常与填充床的柱子相关。因此，在本发明的一个优选实施方案中，吸附过程不涉及填充床。

EBA过程的特征可能在于柱内非常有限的液体回混，与非常熟知的涡旋液化床相反。床的回混通常以轴向扩散(‘容器扩散数”)来测量，参见Levenspiel的“化学反应工程(Chemical Reaction Engineering)”，第二版，John Wiley&Sons(1972)。

以至少3cm/min，诸如至少5cm/min，例如至少8cm/min，诸如至少10cm/min，例如20cm/min的线性流速通过将大豆蛋白的水性提取物应用到吸附剂柱子上可有效地进行纯化。典型地，选择所述的流速在5-50cm/min的范围内，诸如5-15cm/min的范围，例如10-30cm/min范围，诸如25-50cm/min的范围。

大豆蛋白溶液/提取物的温度优选在1℃-90℃的范围内，诸如在5℃-18℃的范围内，诸如在7℃-15℃的范围内，诸如在19℃-80℃的范围内，诸如在19℃-70℃的范围内，诸如在25℃-65℃的范围内，诸如在45℃-60℃的范围内。

当将大豆蛋白水性提取物或溶液加到吸附柱时，可优化柱子中存在的吸附剂颗粒与原料悬液的比例以保持吸附柱的高性能，而获得高纯度的纯化的蛋白产物。在本发明的一个优选实施方案中提供了柱子中的吸附剂相对于装载到柱子上的大豆蛋白水性提取物的比例为至少1:3，诸如至少1:4，例如至少1:5，诸如至少1:6，例如至少1:8，诸如至少1:10，例如至少1:12，诸如至少1:15，例如至少1:20，诸如至少1:25，例如至少1:30，诸如至少1:30的体积/体积比。

通过洗脱非结合的蛋白组分或洗脱结合的蛋白组分将第一种类型的大豆蛋白(例如胰蛋白酶抑制剂(TI)蛋白或β-伴大豆球蛋白)从所述的吸附树脂上分离。

所述的分离方法可以多种方式作用，现将进行说明。

从所述的树脂分离第一种类型的大豆蛋白的步骤包括从所述的吸附树脂洗脱胰蛋白酶抑制剂(TI)蛋白。典型地，所述第一种类型的大豆蛋白组分作为结合蛋白组分保持吸附在树脂上，而第二种类型的大豆蛋白(非结合蛋白组分)在第一次洗脱(洗涤)步骤中被洗脱。接着通过第二次洗脱将第一种类型的大豆蛋白(结合的蛋白组分)释放。这种情况尤其适用配体L2的情形，因为TI蛋白质被配体L2特异性结合。

或者，所述的第二种类型的大豆蛋白保持吸附于树脂上，而第一种类型的大豆蛋白在第一次洗脱(洗涤)步骤中从所述的吸附树脂上洗脱。然后在一个或多个随后的洗脱步骤中，第二种类型的大豆蛋白被释放，与第一种类型的大豆蛋白根本上分离。

一方面，实际上所有的大豆蛋白，包括第一种类型的大豆蛋白，起始时都吸附于所述的吸附树脂，然后第一种类型的大豆蛋白质在第二个洗脱步骤(在第一个洗脱(洗涤)步骤去除其它非结合物质之后)中从吸附树脂上洗脱下来，然后有或没有一部分的第一种类型的大豆蛋白和剩余的第二种类型的大豆蛋白在第三或更多的随后的洗脱步骤中被洗脱下来。

为了获得纯化的第一种类型的大豆蛋白(例如胰蛋白酶抑制剂蛋白(TI))，可通过现有技术中常规描述和已知的任何方法进行洗脱。可使用溶液进行吸附蛋白产品的洗脱，所述的溶液通常选自由稀碱、稀酸、稀的缓冲液、稀盐溶液和水或他们的组合构成的组。在优选实施方案中，用稀溶液进行洗脱和/或洗涤步骤，从而使在洗脱的产品中盐和其它不需要的物质的含量降到最低。

优选地，用于第一种类型的大豆蛋白组分(例如胰蛋白酶抑制剂蛋白(TI))和/或第二种类型的大豆蛋白产品的洗脱的稀溶液含有盐、缓冲液、酸或碱，其浓度低于200mM，优选低于100mM，优选低于50mM，优选低于30mM，甚至更优选20mM。可以直接测定含有待分离的蛋白的洗脱物级份来确定盐、缓冲液、酸或碱的浓度，无需另外稀释洗脱物级份。通常，低成本和无毒的盐、缓冲液、酸和碱都适用。特别优选的盐是氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化铵。特别优选的缓冲液是柠檬酸、乳酸、乙酸、磷酸、甲酸和碳酸盐缓冲液。特别优选的酸是柠檬酸、磷酸、硫酸、乙酸、甲酸、盐酸。特别优选的碱是氢氧化钠(NaOH)、氢氧化钾(KOH)、氢氧化钙(Ca(OH)₂)、氢氧化铵(NH₄OH)。所有这些可组合来实现最佳洗脱过程。

在本发明的实施方案中可使用包含小于5％(v/v)的有机溶剂，诸如小于3％(v/v)有机溶剂，例如小于1％(v/v)的有机溶剂，诸如0％(v/v)的有机溶剂进行洗脱。

吸附树脂

在本发明的实施方案中，所述的吸附树脂包含至少一种配体(L1)。所述配体(L1)包含芳族或杂芳族环系统和一个或多个酸性基团。

优选地，包含芳族或杂芳族环系统和/或一个或多个酸性基团的配体(L1)的分子量至多2000道尔顿，诸如至多1000道尔顿，诸如至多500道尔顿。

芳环系统适当地包括苯基或萘基。

本发明实施方案中所述杂芳族部分可以选自单环杂芳基，其选自噻吩、呋喃、吡喃、吡咯、咪唑、吡唑、异噻唑、异噁唑、吡啶、吡嗪、嘧啶和哒嗪基；和双环杂芳基，其选自吲哚、嘌呤、喹啉、苯并呋喃、苯并咪唑、苯并噻唑和苯并噁唑基。

在本发明的进一步实施方案中，所述酸性基团选自羧酸基((-COOH)、磺酸基(-SO₂OH)、亚磺酸基(-S(O)OH)、次膦酸基(-PH(O)(OH))、膦酸单酯基(-P(O)(OH)(OR))和膦酸基(-P(O)(OH)₂)，优选羧酸基(-COOH)。

优选地，所述配体(L1)可衍生自选自亚甲基-苯甲酸、羟基-苯甲酸、氨基-苯甲酸、巯基-苯甲酸、巯基-烟酸、巯基-四唑乙酸的化合物，诸如2-氨基-苯甲酸、3-氨基-苯甲酸、4-氨基-苯甲酸、2-巯基-苯甲酸、3-巯基-苯甲酸、4-巯基-苯甲酸、5-巯基-1-四唑乙酸、4-氨基邻苯二甲酸和5-氨基间苯二甲酸。

适当地，在配体(L1)中，所述一种或多种芳香族或杂芳族环系统被所述的一个或多个酸性基团所取代。配体L1可包含多种酸性基团以及其他取代基，如碱性和中性的取代基。

在本发明另一个实施方案中，所述吸附树脂包含至少一种配体(L2)。配体(L2)包含烷基胺或烷基芳基胺。在配体(L2)中的烷基胺或烷基芳基胺包含被选自下列的一个或多个基团所取代的胺：

i.芳基、苄基或杂芳基；

ii.具有4-16个碳原子的可以是直链、支链或环状的烷基，例如，丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、环戊基、环己基或萘烷基；

或它们的组合。

配体(L2)可选自丁胺、己胺、辛胺二丁胺、戊胺、正戊胺、N,N-二甲基-1,3-二-氨基丙烷、1,3-二氨基丙烷、1,6-二氨基己烷、1,6-二氨基己烷、1,8-氨基辛烷、1,9-二-氨基壬烷、1,12-氨基十二烷、2-氨基苄胺、2-氨基苯并咪唑、2-氨基咪唑、2,4-二-氨基-6-羟基嘧啶、苄胺或苯二甲胺。

特别优选的配体(L2)具有至少4、诸如至少5、诸如至少6的C/N比(定义为化学分子式中每一氮原子对应的碳原子数)。

在本发明的实施方案中，配体(L1或L2)的浓度为10-990μmol/g干物重吸附树脂。

在本发明的另一实施方案中，配体(L1或L2)的浓度为1-145μmol/ml水化的沉淀吸附树脂。

在本发明的另一实施方案中，配体(L1或L2)的浓度为1-130μmol/g湿的但已被吸干水分的吸附树脂。

优选地，配体(L1和L2)的浓度为10-100μmol/g湿的但已被吸干水分的吸附树脂，如15-80μmol/g湿的但已被吸干水分的吸附树脂，如20-60μmol/g湿的但已被吸干水分的吸附树脂.

除了配体(L1或L2)，吸附树脂还包含聚合物基质(polymeric basematrix)，其构成了大部分的吸附树脂，并支撑配体(L1或L2)。

所述的聚合物基质可选自某些类型的天然或合成的有机聚合物，典型地选自i)天然和合成多糖和其他基于碳水化合物的聚合物，包括琼脂、海藻酸盐、角叉菜胶、瓜尔豆胶、阿拉伯胶、盖提胶、黄蓍胶、卡拉亚树胶、刺槐豆胶、黄原胶、琼脂糖、纤维素、果胶、粘蛋白、右旋糖酐、淀粉、肝素、壳聚糖、羟基淀粉、羟丙基淀粉、羧甲基淀粉、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素和羧甲基纤维素；ii)合成的有机聚合物和能形成聚合物的单体，包括丙烯酸类聚合物、聚酰胺、聚酰亚胺、聚酯、聚醚、聚合的乙烯基化合物、聚烯烃，及它们的取代衍生物，以及包含一种以上所述聚合物的功能性共聚物和它们的取代衍生物；以及iii)它们的混合物。优选的聚合物基质基团是多糖，如琼脂糖。

在本发明的一个实施方案中，吸附树脂是颗粒的形式。吸附树脂颗粒可至少部分渗透到待分离的蛋白质中以确保其显著的结合能力，相比之下，不可渗透的颗粒只能在其表面结合目的蛋白，导致相对较低的结合能力。吸附树脂颗粒可以是不同的结构、组成和形状的颗粒群。

所述的吸附剂可进一步是多孔纤维或多孔膜形式。

配体L1或L2可通过已知适合该目的的任何形式的共价键附着于聚合物基质上，或者通过配体与固相物质之间的直接化学反应或者通过使用已知能够连接基质和配体的合适的试剂预先活化聚合物基质或配体。

这种合适的活化试剂的例子是表氯环氧丙烷、表溴环氧丙烷、烯丙基-缩水甘油醚；双-环氧化合物诸如丁二醇二缩水甘油醚；卤素取代的脂族化合物，例如二氯丙醇、二乙烯砜；羰二咪唑；醛类诸如戊二醛；醌类；溴化氰；过碘酸盐诸如高碘酸钠；二亚胺；氯三嗪类诸如三聚氯氰；磺酰氯诸如对甲苯磺酰氯和tresyl chlorides；N-羟基丁二酰亚胺；2-氟-1-甲基吡啶甲苯-4-磺酸盐；噁唑酮；马来酰亚胺；吡啶基二硫化物；和酰肼。其中，活化试剂留下一与单键不同的间隔基团SP1，例如优选表氯环氧丙烷、表溴环氧丙烷、烯丙基-缩水甘油醚；双-环氧化合物；卤素取代的脂族化合物；乙烯砜；醛类；醌类；溴化氰；氯三嗪类；噁唑酮；马来酰亚胺；吡啶基二硫化物和酰肼。

特别令人感兴趣的活化试剂被认为是环氧化合物，如表氯环氧丙烷、烯丙基缩水甘油醚和丁二醇二缩水甘油醚。在某些情况下所述活化试剂甚至可构成将免疫球蛋白结合到聚合物基质的功能的一部分，例如在二乙烯砜用作活化试剂的情况下。在其他情况下，与基质的官能团反应过程中活化试剂从基质释放。使用羰二咪唑和亚胺时是这种情况。

上面提到的可能性与定义可选的链接多聚物基质和配体L1或L2的SP1间隔的存在相关。在本发明中，SP1间隔被认为是在基质和配体间形成连接的活化试剂的一部分。因此，SP1间隔相应于活化试剂和所涉及的偶联反应。在某些情况下，例如，当使用羰二咪唑时，活化试剂形成了活化形式的基质或配体试剂。偶联反应后，在配体和基质之间没有留下活化试剂的任何部分，因此，SP1简单地就是一单键。

在其它情况下，所述SP1间隔是影响所述结合特征的所述官能团的整体部分，即所述配体，如果所述SP1间隔包含功能活性位点或取代基例如硫醇、胺、酸性基、砜基、硝基、羟基、腈基或其它能够通过氢键、静电结合或排斥、电荷转移等相互作用的基团时，这将特别明显。

还有在其它情况下，SP1间隔可包含芳环或杂芳环，其对于所述固相基质的结合特性发挥重要的作用。这例如是如果醌或氯三嗪用作聚合物基质或配体L1或L2的活化试剂的情况。

优选地，SP1间隔是单键或衍生自活化试剂的双自由基，所述活化试剂选自：表氯环氧丙烷、烯丙基缩水甘油醚、双环氧化合物诸如丁二醇二缩水甘油醚、卤素取代的脂族化合物，诸如1,3-二氯丙烷-2-醇、醛诸如戊二醛、二乙烯砜、醌、溴化氰、氯三嗪类诸如三聚氯氰、2-氟-1-甲基吡啶甲苯-4-磺酸盐、马来酰亚胺，噁唑酮和酰肼。优选地，SP1间隔选自例如化学式为-CH₂-CH(OH)-CH₂-(衍生自表氯环氧丙烷)、-(CH₂)₃-O-CH₂-CH(OH)-CH₂-(衍生自烯丙基缩水甘油醚)或-CH₂-CH(OH)-CH₂-O-(CH₂)₄-O-CH₂-CH(OH)-CH₂-(衍生自丁二醇二缩水甘油醚)的短链脂族双自由基；或单键。

因此，所述吸附树脂颗粒可由许多化学衍生的多孔材料构成，所述材料具有必要的密度和结合能力以适用于给定的流速。

为了使所述方法获得高产量，所述吸附树脂颗粒的密度可以是至少1.3g/mL，更优选地至少1.5g/mL，还更优选地至少1.8g/mL，甚至更优选地至少2.0g/mL，更优选地至少2.3g/mL，甚至更优选地2.5g/mL，最优选地至少2.8g/mL。

在本发明的优选实施方案中，所述吸附树脂颗粒的平均颗粒大小为至多500μm，特别地至多450μm，更特别地至多400μm，甚至更特别地至多350μm，甚至更特别地至多300μm，甚至更特别地至多250μm，诸如至多200μm。

所述吸附树脂颗粒可在聚合物基质中含有一种或多种无孔核芯。聚合物基质的作用是覆盖并使多个(或单个)核芯材料在一起。吸附树脂颗粒可以是如WO 92/00799所描述的簇生物(conglomerate)类型，每个颗粒具有至少两个被多孔材料包围的无孔核芯。在簇生物类型的吸附树脂颗粒中的无孔核芯可以是多种类型和大小，例如由琼脂糖(聚合物基质)包围使其在一起的两种或多种高密度颗粒组成的核芯颗粒。

所述吸附树脂颗粒还可以是薄膜型的，每一颗粒具有单个无孔核芯，周围包围着有孔的材料，例如琼脂糖包被的高密度不锈钢珠或实心玻璃珠。

无孔核芯典型地构成至多吸附树脂颗粒总体积的50％，诸如至多40％，优选地至多30％。无孔核芯可杂乱地分布在聚合物基质内，不必位于吸附树脂颗粒的中心。

适宜的无孔核芯材料的实例是无机化合物、金属、重金属、元素非金属、金属氧化物、非金属氧化物、金属盐和金属合金等。这种核芯材料的实例是金属硅酸盐、金属硼硅酸盐；陶瓷，包括二硼化钛、碳化钛、二硼化锆、碳化锆、碳化钨、碳化硅、氮化铝、氮化硅、氮化钛、氧化钇、金属硅粉和二硅化钼；金属氧化物和硫化物，包括镁、铝、钛、钒、铬、锆、铪、锰、铁、钴、镍、铜和银的氧化物；非金属氧化物；金属盐，包括硫酸钡；金属元素，包括钨、锆、钛、铪、钒、铬、锰、铁、钴、镍、铟、铜、银、金、钯、铂、钌、锇、铑和铱，以及金属元素的合金，诸如在所述金属元素之间形成的合金，例如不锈钢；结晶的和无定形碳，包括石墨、炭黑和炭。优选的无孔核芯材料为尿素钨(tungstencarbamide)、钨、钢和钛珠，例如不锈钢珠。

蛋白质组合物及其制备

本发明提供了大豆蛋白组合物的方法和组合的大豆蛋白产品。

通过将第二种类型的大豆蛋白与吸附树脂分离来提供第一种类型的大豆蛋白被去除了的第二种大豆蛋白组合物。在本发明的情形中，所述第二种大豆蛋白是“去除了”第一种类型的大豆蛋白的，这意味着通过所述方法手段第一种大豆蛋白的量在第二种大豆蛋白中被降低。然而，在一方面，所述第一种类型的大豆蛋白可能从所述第二种大豆蛋白中被完全去除。

优选地，将所述的第一种和第二种类型的大豆蛋白分离，从而当测量分离过程前后的蛋白重量比时，所述第一种类型的大豆蛋白含有少于30％，诸如少于25％，诸如少于20％，诸如少于15％，诸如少于10％，诸如少于5％的起始量的第二种类型的蛋白质。

还优选的是，将所述的第一种和第二种类型的大豆蛋白分离，从而当测量分离过程前后的蛋白重量比时，所述第二种类型的大豆蛋白含有少于30％，诸如少于25％，诸如少于20％，诸如少于15％，诸如少于10％，诸如少于5％的起始量的第一种类型的蛋白质。

在一些情况下，第一种和第二种类型的大豆蛋白优选地都被分离以获得上面提到的两种类型的蛋白优选的分离水平。

可以将第一种类型的大豆蛋白被去除的第二种大豆蛋白组合物变性以提供变性的第二种大豆蛋白组合物。由于在所述第一种大豆蛋白组合物中不存在诸如TI蛋白质，可以在低于变性TI蛋白质所需的温度下进行变性。因此可以获得变性过程的选择性。适当地，可以加热到50℃-100℃，诸如50℃-90℃、诸如50℃-80℃、诸如55℃-80℃、诸如60℃-80℃的温度变性所述第二种大豆蛋白组合物。可替代地—或与热处理组合—可以应用酶促蛋白水解来失活任何不需要的蛋白质，诸如脂氧合酶(lipoxygenase)、凝集素和过敏性抗原。

因此，本发明涉及通过在此描述的方法获得的第二种大豆蛋白组合物。

除了以上所述，所述分离的胰蛋白酶抑制剂(TI)蛋白本身可以是被变性的以提供变性的TI蛋白。适当地，可以通过在压力下加热到90℃-150℃的温度，诸如100℃-130℃、诸如100℃-120℃，变性所述的TI蛋白。可替代地—或与热处理组合—可以应用酶促蛋白水解来失活TI。

在另外的步骤中，可以将所述变性的TI蛋白与(i)在此获得的第二种大豆蛋白组合物和/或(ii)在此获得的变性的第二种大豆蛋白组合物组合以提供各种组合的大豆蛋白产品。

特别地，可以将所述变性的TI蛋白与在此获得的第二种大豆蛋白组合物(去除了所述第一种类型的蛋白)组合以提供第一种组合的大豆蛋白产品。

另外，在此获得的所述变性的TI蛋白可以与在此获得的所述变性的第二种大豆蛋白组合物组合以提供第二种组合的大豆蛋白产品。

此外，上述的第一种组合的大豆蛋白产品可以例如通过于50℃-100℃的温度加热来变性，以形成第三种组合的大豆蛋白产品。

因此可以通过本发明方法获得各种组合的目的大豆蛋白产品：

·通过本发明方法获得的、第一种类型的大豆蛋白去除了的第二种大豆蛋白组合物。优选地，由于第一种类型的大豆蛋白是TI蛋白，该第二种大豆蛋白组合物是去除了TI蛋白的。

·通过在此描述的方法获得的变性的第二种大豆蛋白组合物。

·通过上述方法获得的第一种组合的大豆蛋白产品。

·通过上述方法获得的第二种组合的大豆蛋白产品。

·通过变性上述第二种组合的大豆蛋白产品获得的第三种组合的大豆蛋白产品。

优选地，通过将所述的第二种组合大豆蛋白产品加热到50℃-100℃，诸如50℃-90℃，诸如50℃-80℃，诸如55℃-80℃，诸如60℃-80℃，所述的第二种组合大豆蛋白产品。可替代地—或与热处理组合—可以应用酶促蛋白水解来失活任何不需要的蛋白质，诸如脂氧合酶、凝集素和过敏性抗原。

本发明的具体实施方案

具体实施方案1.分离大豆蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：

至少一种配体(L2)，所述至少一种配体(L2)包含烷基胺或烷基芳基胺，其中在配体(L2)中的所述烷基胺或烷基芳基胺部分包含被选自下列的一个或多个基团所取代的胺：

a.芳基、苄基或杂芳基；

b.具有4-16碳原子的直链、支链或环状烷基，

或它们的组合；

具体实施方案2.根据任一前述的具体实施方案的方法，其中，当所述第一种类型的大豆蛋白从所述的吸附树脂上被洗脱，所述第二种类型的大豆蛋白保持吸附在所述树脂上。

具体实施方案3.根据任一前述的具体实施方案的方法，其中所述的第一种和第二种类型的大豆蛋白在起始时都吸附在所述的吸附树脂上，然后所述第一种类型的大豆蛋白从所述的吸附树脂洗脱。

具体实施方案4.根据具体实施方案3的方法，其中通过提高洗脱剂的pH将所述第一种类型的大豆蛋白从所述的吸附树脂洗脱。

具体实施方案5.根据任一前述的具体实施方案的方法，进一步包含将所述的第二种大豆蛋白组合物变性的步骤，以提供变性的第二种大豆蛋白组合物。

具体实施方案6.根据具体实施方案5的方法，其中通过加热到50℃-100℃的温度使所述第二种大豆蛋白组合物发生变性。

具体实施方案7.根据任一前述的具体实施方案的方法，其中所述第一种类型的蛋白是β-伴大豆球蛋白。

具体实施方案8.根据具体实施方案2的方法，其中β-伴大豆球蛋白作为非结合蛋白组分被洗脱。

具体实施方案9.根据具体实施方案2的方法，其中β-伴大豆球蛋白作为结合蛋白组分被洗脱。

具体实施方案10.根据具体实施方案1-6的任一方法，其中所述第一种类型的蛋白是胰蛋白酶抑制剂(TI)蛋白。

具体实施方案11.根据具体实施方案10的方法，其中胰蛋白酶抑制剂(TI)蛋白作为非结合蛋白组分被洗脱。

具体实施方案12.根据具体实施方案10的方法，其中胰蛋白酶抑制剂(TI)蛋白作为结合蛋白组分被洗脱。

具体实施方案13.根据任一前述具体实施方案的方法，其中所述第一种类型的蛋白包含胰蛋白酶抑制剂(TI)蛋白和β-伴大豆球蛋白。

具体实施方案14.根据具体实施方案10-13的任一方法，进一步包含使分离的胰蛋白酶抑制剂(TI)蛋白变性的步骤，以提供变性的TI蛋白，例如通过加热到50-150℃的温度，优选地75-120℃.

具体实施方案15.根据具体实施方案14的方法，进一步包含将所述变性的TI蛋白与从具体实施方案5获得的第二种大豆蛋白组合物组合的步骤，以提供第一种组合的大豆蛋白产品。

具体实施方案16.根据具体实施方案14的方法，进一步包含将所述的变性的TI蛋白和从具体实施方案5获得的变性的第二种大豆蛋白组合物组合的步骤，以提供第二种组合的大豆蛋白产品。

具体实施方案17.根据具体实施方案15的方法，其中所述第一种组合的大豆蛋白产品例如通过在50℃-100℃的温度下加热进行变性，以形成第三种大豆蛋白产品。

具体实施方案18.根据任一前述具体实施方案的方法，其中包含芳族或杂芳族环系统和/或一个或多个酸性基团的配体(L1)具有至多2000道尔顿、诸如至多1000道尔顿、诸如至多500道尔顿的分子量。

具体实施方案19.根据任一前述具体实施方案的方法，其中所述配体(L1)包含芳族环系统，优选苯基或萘基。

具体实施方案20.根据任一前述具体实施方案的方法，其中所述配体(L1)包含杂芳族环系统，其可以选自单环杂芳基(选自噻吩、呋喃、吡喃、吡咯、咪唑、吡唑、异噻唑、异噁唑、吡啶、吡嗪、嘧啶和哒嗪基)；和双环杂芳基(选自吲哚、嘌呤、喹啉、苯并呋喃、苯并咪唑、苯并噻唑和苯并噁唑基)。

具体实施方案21.根据任一前述具体实施方案的方法，其中所述配体(L1)包含酸性基团，其选自羧酸基(-COOH)、磺酸基(-SO₂OH)、亚磺酸基(-S(O)OH)、次膦酸基(-PH(O)(OH))、膦酸单酯基(-P(O)(OH)(OR))和膦酸基(-P(O)(OH)₂)，优选羧酸基(-COOH)。

具体实施方案22.根据任一前述具体实施方案的方法，其中所述配体(L1)选自亚甲基-苯甲酸、羟基-苯甲酸、氨基-苯甲酸、巯基-苯甲酸、巯基-烟酸、巯基-四唑乙酸，如2-氨基-苯甲酸、3-氨基-苯甲酸、4-氨基-苯甲酸、2-巯基-苯甲酸、3-巯基-苯甲酸、4-巯基-苯甲酸、5-巯基-1-四唑乙酸、4-氨基邻苯二甲酸和5-氨基间苯二甲酸。

具体实施方案23.根据任一前述具体实施方案的方法，其中—在所述配体(L1)中—所述的一种或多种的芳香族或杂芳族环系统被所述的一个或多个酸性基团所取代。

具体实施方案24.根据具体实施方案1-17中的任一方法，其中在配体(L2)中的所述烷基胺或烷基芳基胺包括被选自下列的一个或多个基团所取代的胺：具有4-16个碳原子的可以是直链、支链或环状的烷基，例如，丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、环戊基、环己基或萘烷基；

具体实施方案25.根据具体实施方案24的方法,其中所述配体(L2)选自丁胺、己胺、辛胺二丁胺、戊胺、正戊胺、N,N-二甲基-1,3-二-氨基丙烷、1,3-二氨基丙烷、1,6-二氨基己烷、1,6-二氨基己烷、1,8-氨基辛烷、1,9-二氨基壬烷、1,12-氨基十二烷、2-氨基苄胺、2-氨基苯并咪唑、2-氨基咪唑、2,4-二-氨基-6-羟基嘧啶或苄胺。

具体实施方案26.根据任一前述具体实施方案的方法，其中所述的吸附树脂包含聚合物基质(polymeric base matrix)，其支撑配体(L1或L2)。

具体实施方案27.根据任一前述具体实施方案的方法，其中所述的聚合物基质是天然或合成的有机聚合物，选自i)天然和合成多糖和其他基于碳水化合物的聚合物，包括琼脂、海藻酸盐、角叉菜胶、瓜尔豆胶、阿拉伯胶、胶盖提、黄蓍胶、卡拉亚树胶、刺槐豆胶、黄原胶、琼脂糖、纤维素、果胶、粘蛋白、右旋糖酐、淀粉、肝素、壳聚糖、羟基淀粉、羟丙基淀粉、羧甲基淀粉、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素和羧甲基纤维素；ii)合成的有机聚合物和能形成聚合物的单体，包括丙烯酸系聚合物、聚酰胺、聚酰亚胺、聚酯、聚醚、聚合的乙烯基化合物、聚烯烃，及它们的取代衍生物，以及包含一种以上所述聚合物的功能性共聚物和它们的取代衍生物；以及iii)它们的混合物。

具体实施方案28.根据任一上述的具体实施方案的方法，其中所述的吸附树脂是颗粒的形式。

具体实施方案29.根据任一上述的具体实施方案的方法，其中所述大豆蛋白水性提取物是通过用pH6.5-7.5的水提取大豆或大豆产品而获得。

具体实施方案30.根据任一上述的具体实施方案的方法，其中所述大豆蛋白水性提取物是通过用大约pH9.0的水提取大豆或大豆产品而获得。

具体实施方案31.根据任一上述具体实施方案的方法，其中在步骤(ii)前对所述大豆蛋白水性提取物进行pH调整，优选调整至pH2.0-9.0的范围内。

具体实施方案32.根据具体实施方案31的方法，其中所述的调整了pH的大豆蛋白提取物在步骤(ii)之前通过离心或过滤去除不溶性物质。

具体实施方案33.通过具体实施方案1的方法获得的所述第一种类型的大豆蛋白被去除了的第二种大豆蛋白组合物。

具体实施方案34.通过具体实施方案5的方法获得的变性的第二种大豆蛋白组合物。

具体实施方案35.通过具体实施方案15的方法获得的第一种组合的大豆蛋白产品。

具体实施方案36.通过具体实施方案16的方法获得的第二种组合的大豆蛋白产品。

具体实施方案37.通过具体实施方案17的方法获得的第三种组合的大豆蛋白产品。

实施例

实施例1

1A)琼脂糖珠的活化

将珠子大小为20-350μm的各种高密度琼脂糖珠(UpfrontChromatography A/S制造，具有3-8％的琼脂糖浓度，含有10％的碳化钨作为高密度滤器)样品交联，并用表氯环氧丙烷(Aldrich目录号：E105-5)进行活化。确定所得的环氧基团的浓度为20-100mmol/L珠子。

1B)偶联配体到活化的珠子

使用下面的通用方法将配体偶联到实施例1A所述的活化的珠子上。

1)在吸滤器上用200ml的去离子水洗涤50ml的环氧-活化的珠子，并排掉水分。将排掉水分的吸附剂转移到250ml的塑料瓶中。

2)将配体(2.5g)溶解或悬浮于50ml去离子水中，并用2M的NaOH将pH调节到10.5-12.5，获得完全溶解的配体溶液。

3)将所述配体溶液与排掉水分的吸附剂在旋转混合器中室温下温育18小时。

4)用5升的去离子水洗涤吸附剂。

对于在水中溶解性差的配体，将配体溶解或悬浮于50％的乙醇中，并用2M NaOH调节pH到10.5-12.5。在配体溶液与吸干的吸附剂温育后，用1升的50％的乙醇，然后用4升去离子水洗涤吸附剂。

用酸碱滴定偶联配体中特征性功能基团来确定配体的浓度。

以下的化合物通过上述的通用方法偶联到表氯环氧丙烷活化的琼脂糖珠上：

4-氨基苯甲酸、4-巯基苯甲酸、4-氨基水杨酸、丁胺、己胺、辛胺、苄胺、二氨基丙烷、1.6-二氨基己烷(4％和6％琼脂糖)、二氨基辛烷、1,9-二氨基壬烷、二-氨基十二烷、2-氨基苄胺、特戊胺、二丁胺、戊胺、N,N-二甲基-二-氨基丙烷、2-氨基苯并咪唑、2,4-二-氨基-6-羟基嘧啶、2-氨基苯并咪唑、2-氨基咪唑。

1C)偶联配体氯甲基苯甲酸到实施例1A所描述的活化的珠子上

1)用800ml去离子水在吸滤器上洗涤200ml的环氧-活化的珠子并排干水分。将排干水分的吸附剂转移到500ml的塑料烧瓶中。

2)加入224ml的去离子水。用机械混合器混合所述的溶液。

3)加入32.5％的氢氧化钠，使pH达到13.5(25ml起始)

4)加入6.7g氯甲基苯甲酸。

5)每15分钟检查pH，加入32.5％NaOH保持pH在13.5。

6)每小时加入6.7g氯甲基苯甲酸。

7)混合8小时后，用5升的去离子水洗涤吸附剂。

用酸碱滴定偶联配体中特征性功能基团来确定配体的浓度。

1D)偶联配体2-乙基氨基-乙基氯化物(DEAE)到实施例1A描述的活化的珠子上

1)用800ml去离子水在吸滤器上洗涤200ml的环氧-活化的珠子并排干水分。然后用600ml的85％的N-甲基吡咯烷酮溶液洗涤。将排干水分的吸附剂转移到1000ml的塑料烧瓶中。

2)加入200ml 85％N-甲基吡咯烷酮溶液。用机械混合器混合所述的溶液。

3)在溶液中加入12g的DEAE。

4)在溶液中加入50.8g NaOH。

5)2小时后，用5升的去离子水洗涤吸附剂。

用酸碱滴定偶联配体中特征性功能基团来确定配体的浓度。

实施例2

该实施例描述用于以下实施例的大豆提取物的制备。

将干大豆(目录号：3002，Unifood Import A/S，丹麦)磨制成大豆粉。

使用两种提取方法：

1.在接近中性pH下提取

2.在pH9.0下提取

在接近中性pH下提取

将250g大豆粉与1250ml的去离子水混合。混合悬浮液1小时，然后用100μm的尼龙滤网筛除不溶性组分。所得的提取物为pH6.3、电导率5.6mS/cm的非澄清的乳状液。

在pH9.0下提取

将250g的大豆粉与1250ml的去离子水混合。混合悬浮液1小时，在混合过程中通过加入1M NaOH持续调节pH至9.0。由此在整个提取过程中保持pH在9.0。然后用100μm的尼龙滤网筛除不溶性组分。所得的提取物为pH 9.0、电导率7.0mS/cm的非澄清的乳状液。

对于通过填充床层析进行的实验，将所述提取物在10000RPM离心，去除沉淀和不溶性物质。离心后，出现上层油相。在层析步骤前去除所述油相。

实施例3

SDS-PAGE和干物质分析过程

通过下述通用过程的SDS-PAGE凝胶电泳确定下列实施例中描述的每一种测试的吸附剂的性能。

将25μL的大豆蛋白样品(10000RPM离心去除不溶物颗粒)与25μL的tris-甘氨酸样品缓冲液(LC2676,Novex by Life Technologies,USA)混合。所得的溶液在非还原条件下水中煮沸5分钟。将20μL煮过的样品上样到预制的SDS-PAGE凝胶盒中(4-20％tris-甘氨酸梯度胶(1mm),EC6025,Novex by Life Technologies,USA)。将所述凝胶于200V、400mA电泳1小时。用考马斯亮蓝染料试剂染胶过夜(SimplyBlue^TM SafeStain,LC6060)。

附图1显示了pH9.0、pH6.0和pH4.5下的大豆提取物的SDS-PAGE凝胶。在凝胶上也应用了纯的大豆蛋白质样品，用以确定大豆提取物中不同的蛋白质(条带)。

用以确定蛋白质的蛋白是：

大豆胰蛋白酶抑制剂(目录号：T9003,Sigma,USA)

大豆植物凝集素(目录号：L1395,Sigma,USA)

大豆球蛋白(G3171,Sigma,USA)

大豆β-伴大豆球蛋白(C5868,Sigma,USA)

大豆脂氧合酶(L7395,Sigma,USA)

在下列实施例中，根据该显示这些具体蛋白质出现在所述凝胶上的位置的SDS-PAGE凝胶来得出结论例如大豆胰蛋白酶抑制剂、大豆植物凝集素或其它具体蛋白质是否结合/没有结合到特定的吸附剂。

对应实施例3的附图1

泳道1＝大豆提取物pH 9.0

泳道2＝大豆提取物pH 6.0

泳道3＝大豆提取物pH 4.5

泳道4＝大豆胰蛋白酶抑制剂,1mg/ml

泳道5＝大豆植物凝集素,1mg/ml

泳道6＝大豆球蛋白,1mg/ml

泳道7＝大豆β-伴大豆球蛋白,1mg/ml

泳道8＝大豆脂氧化酶,1mg/ml

干物质的测定

根据下述通用过程进行测定在选定实施例中回收到蛋白洗脱物中的不可透析的干物质的量。

将固定量的洗脱物(7.5ml)对水透析18小时以除去所述蛋白样品中的小分子，诸如盐和缓冲液物质(透析膜：Spectra/Por分子多孔膜管，截留值6-8kD,Spectrum Laboratories,USA)。透析后，将透析的蛋白溶液转移到铝箔烧杯中，在100℃干燥过夜(24小时)。干物质(蛋白质)的量计算为干燥后烧杯的重量减去烧杯的重量。定量氨基酸分析通常确定超过90％的干物质确实与蛋白质相关。

实施例4:

检测根据实施例1制备的吸附剂在pH4.5时结合大豆蛋白的能力。下列配体被检测：

4-巯基苯甲酸(偶联至4％和6％的琼脂糖珠)，氯甲基苯甲酸(偶联至6％的琼脂糖珠)和4-氨基水杨酸(偶联6％的琼脂糖珠)。

过程

将1ml的吸附剂转移并填充到小敞口塑料柱子中(Poly-Prep层析柱，目录号：731-1550Biorad，USA)形成大约20mm床高的填充床。对所有检测应用通过填充物的流速为大约0.5ml/min。填充后，用10mlpH4.5的10mM柠檬酸钠平衡吸附剂。用1M HCl将大豆提取物(根据实施例2于接近中性的pH制备的)调整pH至pH4.5，并在10000RPM离心去除沉淀和不溶物。将1.5ml的离心的提取物上样到柱子上。收集穿透物(非结合蛋白)到一个级份。然后用5ml的去离子水洗涤柱子。收集穿透物(非结合的和松散结合的蛋白质)到一5ml级份。随后使用10ml50mM的NaOH从柱上释放(洗脱)结合的蛋白。收集穿透物(洗脱的蛋白，洗脱物)到一10ml级份，通过加入1M HCl立即将洗脱物级份的pH调整为pH7.0。通过SDS-PAGE(如实施例3描述的)测定吸附剂的性能。参见附图2。箭头指示利用纯化的大豆蛋白在实施例3中鉴定的条带。

结果显示所检测的芳族酸配体基本上结合所有使用量的蛋白质，包括胰蛋白酶抑制剂和大豆植物凝集素。对于4-巯基苯甲酸配体(偶联至4％和6％的琼脂糖珠)，参见泳道2和4，其代表包含非结合蛋白的穿透物级份，其实际上没有重要的蛋白条带，而胰蛋白酶抑制剂、大豆植物凝集素和其它蛋白质被发现在洗脱物中(参见泳道3和5)。对于氯甲基苯甲酸配体(偶联至6％的琼脂糖珠)参见泳道6，其代表含有非结合蛋白的穿透物级份，其实际上没有重要的蛋白条带，而胰蛋白酶抑制剂、大豆植物凝集素和其它蛋白质被发现在洗脱物中(参见泳道6)。4-氨基水杨酸配体(偶联至6％的琼脂糖珠)参见泳道7，其代表含有非结合蛋白的穿透物级份，其实际上没有重要的蛋白条带，而胰蛋白酶抑制剂、大豆植物凝集素和其它蛋白质被发现在洗脱物中(参见泳道8)。

对应实施例4的附图2

泳道1＝pH 4.5的大豆提取物

泳道2＝源自具有配体4-巯基苯甲酸的吸附剂(4％的琼脂糖珠)的上样物的穿透物(非结合蛋白)

泳道3＝源自具有配体4-巯基苯甲酸的吸附剂(4％的琼脂糖珠)的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)

泳道4＝源自具有配体4-巯基苯甲酸的吸附剂(6％的琼脂糖珠)的上样物的穿透物(非结合蛋白)

泳道5＝源自具有配体4-巯基苯甲酸的吸附剂(6％的琼脂糖珠)的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)

泳道6＝源自具有配体4-氨基水杨酸的吸附剂(6％的琼脂糖珠)的上样物的穿透物(非结合蛋白)

泳道7＝源自具有配体4-氨基水杨酸的吸附剂(6％的琼脂糖珠)的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)

泳道8＝源自具有配体氯甲基苯甲酸的吸附剂(6％的琼脂糖珠)的上样物的穿透物(非结合蛋白)

泳道9＝源自具有配体氯甲基苯甲酸的吸附剂(6％的琼脂糖珠)的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)

实施例5:

检测根据实施例1制备的具有配体4-氨基苯甲酸的吸附剂(4％琼脂糖)(利用滴定测定配体浓度为30mmol/L吸附剂)分别在pH4.5、5.0、5.5和6.0时结合大豆蛋白的能力。

过程

柱的准备和流速如实施例4。填充后，用10ml分别为pH4.5、5.0、5.5和6.0的10mM柠檬酸钠平衡吸附剂。用1M的HCl将大豆提取物(根据实施例2于接近中性的pH制备的)pH分别调整至6.0、5.5、5.0和4.5。于10000RPM离心提取物去除不溶性和沉淀的物质。将10ml离心的提取物上样到柱子上。在pH4.5下进行的实验中，将穿透物(非结合蛋白)收集到一10ml级份，在pH5.0、5.5和6.0下进行的实验中，将穿透物收集到两个5ml级份。用5ml的去离子水洗涤吸附剂。将穿透物(非结合的和松散结合的蛋白)收集到一个5ml级份。随后用10ml的50mM NaOH从柱子上释放(洗脱)结合蛋白。将穿透物(洗脱的蛋白，洗脱物)收集到1个10ml级份，并加入1M的HCl立即将洗脱物级份的pH调节为pH 7.0。

通过SDS-PAGE测定吸附剂的性能(如实施例3所述)。参见附图3a和3b。

结果显示所检测的4-氨基苯甲酸配体在pH4.5时实际上可以结合所有使用量的蛋白质，包括胰蛋白酶抑制剂和大豆植物凝集素(参见泳道2，代表了含有非结合蛋白的穿透物级份实际上没有重要的蛋白条带)。而胰蛋白酶抑制剂、大豆植物凝集素和其它蛋白质则用50mM的NaOH溶液洗脱(参见泳道4)。

在pH5.0时，只有小部分胰蛋白酶抑制剂结合到4-氨基苯甲酸配体(参见泳道7，其代表第二穿透物级份，其中胰蛋白酶抑制剂条带的强度与泳道6中的大豆蛋白提取物相似，意味着所述蛋白质没有结合吸附剂，还参见泳道8，其代表也含有胰蛋白酶抑制剂的洗涤物)。其它大豆蛋白质结合到吸附剂并用50mM的NaOH溶液洗脱(参见泳道9，洗脱物含有少量的胰蛋白酶抑制剂，代表该蛋白质的条带很弱)。

在pH5.5时胰蛋白酶抑制剂不结合于4-氨基苯甲酸配体(参见泳道11和12，其代表了含有非结合蛋白的穿透物级份，其中胰蛋白酶抑制剂的强度与代表上样到柱子上的大豆提取物的泳道10中的相同)。其它大豆蛋白质结合到吸附剂并用50mM的NaOH溶液洗脱(参见泳道14，洗脱物不包含胰蛋白酶抑制剂)。

在pH6.0时，当将大豆提取物上样到吸附剂时，大部分使用的蛋白质回收到两穿透物级份中。4-氨基苯甲酸配体只结合小量的蛋白质，并根本没有胰蛋白酶抑制剂(参见泳道16和17，其代表含有非结合蛋白的穿透物级份，其中所有主要条带的强度与代表上样到柱子上的大豆提取物的泳道15中的几乎相同)。结合蛋白用50mM的NaOH溶液洗脱(参见泳道19，洗脱物不含有胰蛋白酶抑制剂)。

附图3a,实施例5

泳道1＝pH 4.5的大豆提取物

泳道2＝pH4.5时源自具有配体4-氨基苯甲酸的吸附剂(4％琼脂糖珠)的上样物的穿透物(非结合蛋白质)。

泳道3＝具有配体4-氨基苯甲酸的吸附剂(4％的琼脂糖珠)的洗涤物(非结合的和松散结合的蛋白质)。

泳道4＝源自具有配体4-氨基苯甲酸的吸附剂(4％的琼脂糖珠)的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)。

泳道5＝pH 5.0的大豆提取物

泳道6＝pH5.0时源自具有配体4-氨基苯甲酸的吸附剂(4％琼脂糖珠)的上样物的穿透物级份1(非结合蛋白质)。

泳道7＝pH5.0时源自具有配体4-氨基苯甲酸的吸附剂(4％琼脂糖珠)的上样物的穿透物级份2(非结合蛋白质)。

泳道8＝源自具有配体4-氨基苯甲酸的吸附剂(4％琼脂糖珠)的洗涤物(非结合的和松散结合的蛋白质)。

泳道9＝pH 5.0时源自具有配体4-氨基苯甲酸的吸附剂(4％的琼脂糖珠)的洗脱物(结合的和随后被释放的蛋白质)。

泳道10＝pH 5.5的大豆提取物

泳道11＝pH5.5时源自具有配体4-氨基苯甲酸的吸附剂(4％琼脂糖珠)的上样物的穿透物级份1(非结合蛋白质)。

泳道12＝pH5.5时源自具有配体4-氨基苯甲酸的吸附剂(4％琼脂糖珠)的上样物的穿透物级份2(非结合蛋白质)。

泳道13＝源自具有配体4-氨基苯甲酸的吸附剂(4％琼脂糖珠)的洗涤物(非结合的和松散结合的蛋白质)。

泳道14＝pH 5.5时源自具有配体4-氨基苯甲酸的吸附剂(4％琼脂糖珠)的洗脱物(结合的和随后被释放的蛋白质)。

泳道15＝pH 6.0的大豆提取物

泳道16＝pH6.0时源自具有配体4-氨基苯甲酸的吸附剂(4％琼脂糖珠)的上样物的穿透物级份1(非结合蛋白质)。

泳道17＝pH6.0时源自具有配体4-氨基苯甲酸的吸附剂(4％琼脂糖珠)的上样物的穿透物2(非结合蛋白质)。

泳道18＝源自具有配体4-氨基苯甲酸的吸附剂(4％琼脂糖珠)的洗涤物(非结合的和松散结合的蛋白质)。

泳道19＝pH 6.0时源自具有配体4-氨基苯甲酸的吸附剂(4％琼脂糖珠)的洗脱物(结合的和随后被释放的蛋白质)。

实施例6

该实施例显示如何从偶联配体4-巯基苯甲酸的吸附剂(如实施例1所描述制备的)选择性洗脱胰蛋白酶抑制剂，(通过滴定测定配体的浓度为51mmol/L吸附剂)，其中，在pH4.5时提取物中所有有效的蛋白质都被结合。在洗脱过程中，分别使用a)pH6.0的10mM的柠檬酸钠，b)pH8.0的10mM的磷酸氢二钾和c)50mM的NaOH逐步增加pH。

过程

柱的制备和流速如实施例4所述。装填之后，用10ml pH4.5的10mM柠檬酸钠平衡吸附剂。用1M的HCl将大豆提取物(根据实施例2在接近中性pH下制备的)pH调整到4.5。于10000RPM离心提取物去除不溶性和沉淀物质。将10ml的离心的提取物上样到柱子。将穿透物(非结合蛋白)收集到一10ml级份。用5ml的去离子水洗涤吸附剂。将穿透物(非结合的和松散结合的蛋白质)收集到一5ml级份。随后通过使用下列缓冲液将结合的蛋白质从柱上释放(洗脱)：

10ml pH6.0的10mM柠檬酸钠，将穿透物(洗脱的蛋白质，洗脱物)收集到一10ml级份。

10ml pH 8.0的10mM磷酸氢二钾，将穿透物(洗脱的蛋白质，洗脱物)收集到一10ml级份。

10ml 50mM NaOH，将穿透物(洗脱的蛋白质，洗脱物)收集到一10ml级份，并且加入1M HCl将洗脱物级份的pH立即调节到pH 7.0。

通过SDS-PAGE测定吸附剂的性能(如实施例3所述)。参见附图4。箭头指示用纯化的大豆蛋白在实施例3中鉴定的条带。

结果显示所述的吸附剂实质上结合了所有应用到柱子上的蛋白质(参见泳道2，其代表了含有非结合蛋白质的穿透物级份，实际上没有重要的蛋白条带)，而胰蛋白酶抑制剂被选择性(pH6.0，参见泳道3)从4-巯基苯甲酸配体洗脱下来，之后其它蛋白质(包括大豆植物凝集素)分别被pH8.0的缓冲液和50mM NaOH溶液洗脱(参见泳道4和5)。

对应实施例6的附图4

泳道1＝pH4.5时的大豆提取物

泳道2＝pH4.5时源自具有配体4-巯基苯甲酸的吸附剂的上样物的穿透物(非结合蛋白)。

泳道3＝pH6.0时源自具有配体4-巯基苯甲酸的吸附剂的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)。

泳道4＝pH8.0时源自具有配体4-巯基苯甲酸的吸附剂的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)。

泳道5＝用50mM NaOH源自具有配体4-巯基苯甲酸的吸附剂的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)。

实施例7

该实施例显示如何从偶联配体4-巯基苯甲酸的吸附剂(如实施例1所描述制备的)选择性洗脱胰蛋白酶抑制剂，(通过滴定测定配体的浓度为51mmol/L吸附剂)，其中，在pH4.5时所有有效的蛋白质都被结合。在洗脱过程中，在固定的pH值通过分别使用a)pH6.0的10mM的柠檬酸钠+50mM NaCl，b)pH6.0的10mM的柠檬酸钠、200mM NaCl和最后高pH使用c)50mM的NaOH逐步增加盐浓度。

过程

a)10ml pH6.0的10mM柠檬酸钠、50mM NaCl，将穿透物(洗脱的蛋白质，洗脱物)收集到一10ml级份。

b)10ml pH 6.0的10mM柠檬酸钠、200mM NaCl，将将穿透物(洗脱的蛋白质，洗脱物)收集到一10ml级份。

c)10ml 50mM NaOH，将穿透物(洗脱的蛋白质，洗脱物)收集到一10ml级份，并且加入1M HCl将洗脱物级份的pH立即调节到pH 7.0。

通过SDS-PAGE测定吸附剂的性能(如实施例3所述)。参见附图5。箭头指示用纯化的大豆蛋白在实施例3中鉴定的条带。

结果显示所述的吸附剂实质上结合了所有应用到柱子上的蛋白质(参见泳道2，其代表了含有非结合蛋白质的穿透物级份，实际上没有重要的蛋白条带)，而胰蛋白酶抑制剂被选择性(在pH6.0使用50mMNaCl，参见泳道3)从4-巯基苯甲酸配体上洗脱下来，大豆脂氧合酶被选择性洗脱(在pH6.0使200mM NaCl，参见泳道4)，之后其它蛋白质(包括大豆植物凝集素)被50mM NaOH洗脱下来(参见泳道5)。

泳道1＝pH4.5时的大豆提取物

泳道3＝pH6.0时使用50mM NaCl源自具有配体4-巯基苯甲酸的吸附剂的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)。

泳道4＝pH6.0时使用200mM NaCl源自具有配体4-巯基苯甲酸的吸附剂的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)。

实施例8

该实施例显示如何从偶联配体4-氨基苯甲酸的吸附剂(如实施例1所描述制备的)选择性洗脱胰蛋白酶抑制剂和大豆植物凝集素，(通过滴定测定配体的浓度为30mmol/L吸附剂)，其中，在pH4.5时提取物中所有有效的蛋白质都被结合。在洗脱过程中，通过使用pH不断增加的稀释缓冲液逐步增加pH。

过程

柱的制备和流速如实施例4所述。装填之后，用10ml pH4.5的10mM柠檬酸钠平衡吸附剂。用1M的HCl将大豆提取物(根据实施例2在接近中性pH下制备的)pH调整到4.5。于10000RPM离心提取物去除不溶性和沉淀物质。将10ml的离心的提取物上样到柱子。将穿透物(非结合蛋白)收集到一10ml级份。用5ml的去离子水洗涤吸附剂。将穿透物(非结合的和松散结合的蛋白质)收集到一5ml级份。

随后通过使用下列缓冲液将结合的蛋白质从柱上释放(洗脱)：

10ml pH5.75的10mM柠檬酸钠，将穿透物(洗脱的蛋白质，洗脱物)收集到一10ml级份。

10ml pH 6.0的10mM磷酸氢二钾，将穿透物(洗脱的蛋白质，洗脱物)收集到一10ml级份。

10ml pH 6.5的10mM磷酸氢二钾，将穿透物(洗脱的蛋白质，洗脱物)收集到一10ml级份。

10ml pH 7.0的10mM磷酸氢二钾，将穿透物(洗脱的蛋白质，洗脱物)收集到一10ml级份。

10ml pH 7.5的10mM磷酸氢二钾，将穿透物(洗脱的蛋白质，洗脱物)收集到一10ml级份。

通过SDS-PAGE测定吸附剂的性能(如实施例3所述)。参见附图6。箭头指示用纯化的大豆蛋白在实施例3中鉴定的条带。

结果显示所述的吸附剂实质上结合了所有应用到柱子上的蛋白质(参见泳道2，其代表了含有非结合蛋白质的穿透物级份，实际上没有重要的蛋白条带)，而胰蛋白酶抑制剂被选择性(在pH5.75，参见泳道4)从4-氨基苯甲酸配体洗脱下来。大豆植物凝集素被选择性(在pH6.5，参见泳道6)洗脱下来。大豆脂氧合酶被选择性洗脱(在pH7.0，参见泳道7)。之后其它蛋白质分别被pH 7.5、pH8.0的缓冲液和50mM NaOH溶液洗脱下来(参见泳道8、9和10)。

对应实施例8的附图6

泳道1＝pH4.5时的大豆提取物

泳道2＝pH4.5时源自具有配体4-氨基苯甲酸的吸附剂(4％的琼脂糖珠)的上样物的穿透物(非结合蛋白)。

泳道3＝具有配体4-氨基苯甲酸的吸附剂(4％的琼脂糖珠)的洗涤物(非结合的和松散结合的蛋白质)

泳道4＝pH5.75时源自具有配体4-氨基苯甲酸的吸附剂(4％的琼脂糖珠)的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)。

泳道5＝pH6.0时源自具有配体4-氨基苯甲酸的吸附剂(4％的琼脂糖珠)的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)。

泳道6＝pH6.5时源自具有配体4-氨基苯甲酸的吸附剂(4％的琼脂糖珠)的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)。

泳道7＝pH7.0时源自具有配体4-氨基苯甲酸的吸附剂(4％的琼脂糖珠)的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)。

泳道8＝pH7.5时源自具有配体4-氨基苯甲酸的吸附剂(4％的琼脂糖珠)的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)。

泳道9＝pH8.0时源自具有配体4-氨基苯甲酸的吸附剂(4％的琼脂糖珠)的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)。

泳道10＝用50mM NaOH源自具有配体4-氨基苯甲酸的吸附剂(4％的琼脂糖珠)的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)。

实施例9

该实施例显示如何从偶联配体4-氨基苯甲酸的吸附剂(如实施例1所描述制备的)选择性洗脱胰蛋白酶抑制剂，(通过滴定测定配体的浓度为30mmol/L吸附剂)，其中，在pH4.5时所有有效的蛋白质都被结合。在洗脱过程中，分别使用a)pH5.0的10mM的柠檬酸钠，b)pH5.25的10mM的柠檬酸钠，c)pH5.5的10mM的柠檬酸钠，d)pH5.75的10mM的柠檬酸钠和e)50mM的NaOH逐步增加pH。

过程

a)10ml pH5.0的10mM柠檬酸钠，将穿透物(洗脱的蛋白质，洗脱物)收集到一10ml级份。

b)10ml pH5.25的10mM柠檬酸钠，将穿透物(洗脱的蛋白质，洗脱物)收集到一10ml级份。

c)10ml pH5.5的10mM柠檬酸钠，将穿透物(洗脱的蛋白质，洗脱物)收集到一10ml级份。

d)10ml pH5.75的10mM柠檬酸钠，将穿透物(洗脱的蛋白质，洗脱物)收集到一10ml级份。

e)10ml 50mM NaOH，将穿透物(洗脱的蛋白质，洗脱物)收集到一10ml级份，并且加入1M HCl将洗脱物级份的pH立即调节到pH 7.0。

通过SDS-PAGE测定吸附剂的性能(如实施例3所述)。参见附图7。箭头指示用纯化的大豆蛋白在实施例3中鉴定的条带。

结果显示所述的吸附剂实质上结合了所有应用到柱子上的蛋白质(参见泳道2，其代表了含有非结合蛋白质的穿透物级份，实际上没有重要的蛋白条带)，而胰蛋白酶抑制剂被选择性(在pH5.0到pH5.5，参见泳道4到泳道6)从4-氨基苯甲酸配体洗脱下来，之后其它蛋白质(包括大豆植物凝集素)分别被pH5.75的缓冲液和50mM NaOH溶液洗脱下来(参见泳道7和8)。

对应实施例9的附图7

泳道1＝pH4.5时的大豆提取物

泳道4＝pH5.0时源自具有配体4-氨基苯甲酸的吸附剂(4％的琼脂糖珠)的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)。

泳道5＝pH5.25时源自具有配体4-氨基苯甲酸的吸附剂(4％的琼脂糖珠)的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)。

泳道6＝pH5.5时源自具有配体4-氨基苯甲酸的吸附剂(4％的琼脂糖珠)的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)。

泳道7＝pH5.75时源自具有配体4-氨基苯甲酸的吸附剂(4％的琼脂糖珠)的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)。

泳道8＝用50mM NaOH源自具有配体4-氨基苯甲酸的吸附剂(4％的琼脂糖珠)的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)。

实施例10

用阴离子交换剂分离大豆蛋白。检测根据实施例1D制备的偶联配体DEAE的吸附剂(通过滴定测定配体的浓度为104mmol/L吸附剂)pH6.0时结合大豆蛋白的能力。

过程

柱的制备和流速如实施例4所述。装填之后，用10ml pH6.0的0.1M柠檬酸钠、然后用10ml pH6.0的10mM柠檬酸钠平衡吸附剂。用1M的HCl将大豆提取物(根据实施例2在接近中性pH下制备的)pH调整到6.0，10000RPM离心去除沉淀和不溶性物质。将7.5ml的离心的提取物上样到柱子。将穿透物(非结合蛋白)收集到一7.5ml级份。然后用5ml的去离子水洗涤柱子。将穿透物(非结合的和松散结合的蛋白质)收集到一个级份。

随后用10ml 50mM NaOH从柱子上释放(洗脱)结合的蛋白质。将穿透物(洗脱的蛋白质，洗脱物)收集到一10ml级份，并且加入1M HCl将洗脱物级份的pH立即调节到pH 7.0。

通过SDS-PAGE测定吸附剂的性能(如实施例3所述)。参见附图8。箭头指示用纯化的大豆蛋白在实施例3中鉴定的条带。

结果显示所述阴离子交换剂具有低的结合能力；其只结合小部分的大豆蛋白，特别是没能很好结合胰蛋白酶抑制剂。泳道2代表了含有非结合蛋白质的穿透物级份，其实际上包含所有的胰蛋白酶抑制剂和所有重要的蛋白条带(包括大豆植物凝集素)。在洗脱物(参见泳道4)中的大豆蛋白包含非常小量的胰蛋白酶抑制剂和大豆植物凝集素。

对应实施例10的附图8

泳道1＝pH6.0的大豆提取物

泳道2＝pH6.0时源自具有配体DEAE的吸附剂的上样物的穿透物(非结合蛋白)。

泳道3＝具有配体DEAE的吸附剂的洗涤物(非结合的和松散结合的蛋白质)

泳道4＝源自具有配体DEAE的吸附剂的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)。

实施例11

检测根据实施例1制备的吸附剂在pH6.0时结合大豆蛋白的能力。下列配体被检测：

丁胺(偶联6％琼脂糖)，己胺(偶联6％琼脂糖)，辛胺(偶联6％琼脂糖)，苄胺(偶联4％琼脂糖)，苄胺(偶联6％琼脂糖)。

过程

柱的制备和流速如实施例4所述。装填之后，用10ml pH6.0的10mM柠檬酸钠平衡吸附剂。用1M的HCl将大豆提取物(根据实施例2在接近中性pH下制备的)pH调整到6.0，10000RPM离心去除沉淀和不溶性物质。将1.5ml的离心的提取物上样到柱子。将穿透物(非结合蛋白)收集到一1.5ml级份。然后用5ml的去离子水洗涤柱子。将穿透物(非结合的和松散结合的蛋白质)收集到一5ml级份。

通过SDS-PAGE测定吸附剂的性能(如实施例3所述)。参见附图9a和9b。箭头指示用纯化的大豆蛋白在实施例3中鉴定的条带。

结果显示所检测的烷基胺配体实际上结合所有应用量的胰蛋白酶抑制剂。大豆植物凝集素的结合非常低。只有一部分其它大豆蛋白结合到配体。

对于丁胺配体(偶联6％琼脂糖)参见泳道2，其代表了含有非结合蛋白的穿透物级份，其中包含小量的胰蛋白酶抑制剂和所有重要的蛋白条带(包括大豆植物凝集素)。胰蛋白酶抑制剂和其它蛋白质存在于洗脱物中(参见泳道3)。

对于己胺配体(偶联6％琼脂糖)，参见泳道4，其代表了包含非结合蛋白的穿透物级份，其中不含有胰蛋白酶抑制剂。存在所有重要的蛋白条带(包括大豆植物凝集素)。胰蛋白酶抑制剂和其它蛋白存在于洗脱物中(参见泳道5)。

对于辛胺配体(偶联6％琼脂糖)，参见泳道6，其代表了包含非结合蛋白的穿透物级份，其中含有非常少量的胰蛋白酶抑制剂并存在所有重要的蛋白条带(包括大豆植物凝集素)。胰蛋白酶抑制剂和其它蛋白存在于洗脱物中(参见泳道7)。

对于苄胺配体(偶联4％和6％琼脂糖)，参见泳道8和10，其代表了包含非结合蛋白的穿透物级份，其中不含有胰蛋白酶抑制剂。存在所有重要的蛋白条带(包括大豆植物凝集素)。胰蛋白酶抑制剂和其它蛋白存在于洗脱物中(参见泳道9和11)。

对应实施例11的附图9a

泳道1＝pH 6.0的大豆提取物

泳道2＝具有配体丁胺(偶联6％琼脂糖)的吸附剂的上样物的穿透物(非结合蛋白)

泳道3＝源自具有配体丁胺(偶联6％琼脂糖)的吸附剂的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)

泳道4＝具有配体己胺(偶联6％琼脂糖)的吸附剂的上样物的穿透物(非结合蛋白)

泳道5＝源自具有配体己胺(偶联6％琼脂糖)的吸附剂的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)

泳道6＝具有配体辛胺(偶联6％琼脂糖)的吸附剂的上样物的穿透物(非结合蛋白)

泳道7＝源自具有配体辛胺(偶联6％琼脂糖)的吸附剂的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)

泳道8＝具有配体苄胺(偶联4％琼脂糖)的吸附剂的上样物的穿透物(非结合蛋白)

泳道9＝源自具有配体苄胺(偶联4％琼脂糖)的吸附剂的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)

对应实施例11的附图9b

泳道10＝具有配体苄胺(偶联6％琼脂糖)的吸附剂的上样物的穿透物(非结合蛋白)

泳道11＝源自具有配体苄胺(偶联6％琼脂糖)的吸附剂的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)

泳道12＝pH 6.0的大豆提取物

实施例12

检测根据实施例1制备的吸附剂在pH6.0时结合大豆蛋白的能力。下列配体(＝L2)被检测：

二氨基丙烷、1.6-二氨基己烷(4％和6％琼脂糖)、二氨基辛烷、1,9-二氨基壬烷、二-氨基十二烷、2-氨基苄胺、特戊胺、二丁胺、戊胺、N,N-二甲基-二氨基丙烷、2-氨基苯并咪唑(4％和6％琼脂糖)、2,4-二-氨基-6-羟基嘧啶、2-氨基咪唑

过程

柱的制备和流速如实施例4所述。装填之后，用10ml pH6.0的10mM柠檬酸钠平衡吸附剂。用1M的HCl将大豆提取物(根据实施例2在接近中性pH下制备的)pH调整到6.0，10000RPM离心去除沉淀和不溶性物质。将7.5ml的离心的提取物上样到柱子。将穿透物(非结合蛋白)收集到一7.5ml级份。然后用5ml的去离子水洗涤柱子。将穿透物(非结合的和松散结合的蛋白质)收集到一5ml级份。

随后用10ml 50mM NaOH从柱子上释放(洗脱)结合的蛋白质。将穿透物(洗脱的蛋白质，洗脱物)收集到一10ml级份，并且加入1M HCl将洗脱物级份的pH立即调节到pH7.0。

通过SDS-PAGE测定吸附剂的性能(如实施例3所述)。参见附图10a、10b、10c和10d。箭头指示用纯化的大豆蛋白在实施例3中鉴定的条带。

从附图中可以看到，根据配体的结构，所检测的吸附剂将大豆蛋白分离到不同的程度。

泳道1＝pH 6.0的大豆提取物

泳道2＝源自具有配体1.6-二氨基己烷(偶联6％琼脂糖)的吸附剂的上样物的穿透物(非结合蛋白)

泳道3＝源自具有配体1.6-二氨基己烷(偶联6％琼脂糖)的吸附剂的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)

泳道4＝源自具有配体1.6-二氨基己烷(偶联4％琼脂糖)的吸附剂的上样物的穿透物(非结合蛋白)

泳道5＝源自具有配体1.6-二氨基己烷(偶联4％琼脂糖)的吸附剂的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)

泳道6＝源自具有配体二氨基丙烷(偶联4％琼脂糖)的吸附剂的上样物的穿透物(非结合蛋白)

泳道7＝源自具有配体二氨基丙烷(偶联4％琼脂糖)的吸附剂的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)

泳道8＝具有配体二氨基辛烷(偶联6％琼脂糖)的吸附剂的上样物的穿透物(非结合蛋白)

泳道9＝源自具有配体二氨基辛烷(偶联6％琼脂糖)的吸附剂的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)

对应实施例12的附图10b

泳道10＝pH 6.0的大豆提取物

泳道11＝源自具有配体N,N-二甲基-二氨基丙烷(偶联6％琼脂糖)的吸附剂的上样物的穿透物(非结合蛋白)

泳道12＝源自具有配体N,N-二甲基-二氨基丙烷(偶联6％琼脂糖)的吸附剂的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)

泳道13＝pH 6.0的大豆提取物

泳道14＝源自具有配体戊胺(偶联6％琼脂糖)的吸附剂的上样物的穿透物(非结合蛋白)

泳道15＝源自具有配体戊胺(偶联6％琼脂糖)的吸附剂的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)

泳道16＝源自具有配体1,9-二氨基壬烷(偶联6％琼脂糖)的吸附剂的上样物的穿透物(非结合蛋白)

泳道17＝源自具有配体1,9-二氨基壬烷(偶联6％琼脂糖)的吸附剂的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)

泳道18＝源自具有配体二丁胺(偶联6％琼脂糖)的吸附剂的上样物的穿透物(非结合蛋白)

泳道19＝源自具有配体二丁胺(偶联6％琼脂糖)的吸附剂的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)

附图10c

泳道20＝源自具有配体二-氨基十二烷(偶联5％琼脂糖)的吸附剂的上样物的穿透物(非结合蛋白)

泳道21＝源自具有配体二-氨基十二烷(偶联5％琼脂糖)的吸附剂的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)

泳道22＝pH 6.0的大豆提取物

泳道23＝源自具有配体2-氨基苄胺(偶联6％琼脂糖)的吸附剂的上样物的穿透物(非结合蛋白)

泳道24＝源自具有配体2-氨基苄胺(偶联6％琼脂糖)的吸附剂的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)

泳道25＝源自具有配体特戊胺(偶联6％琼脂糖)的吸附剂的上样物的穿透物(非结合蛋白)

泳道26＝源自具有配体特戊胺(偶联6％琼脂糖)的吸附剂的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)

附图10d

泳道27＝pH 6.0的大豆提取物

泳道28＝源自具有配体2-氨基苯并咪唑(偶联6％琼脂糖)的吸附剂的上样物的穿透物(非结合蛋白)

泳道29＝源自具有配体2-氨基苯并咪唑(偶联6％琼脂糖)的吸附剂的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)

泳道30＝源自具有配体2,4-二-氨基-6-羟基嘧啶(偶联6％琼脂糖)的吸附剂的上样物的穿透物(非结合蛋白)

泳道31＝源自具有配体2,4-二-氨基-6-羟基嘧啶(偶联6％琼脂糖)的吸附剂的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)

泳道32＝源自具有配体2-氨基苯并咪唑(偶联4％琼脂糖)的吸附剂的上样物的穿透物(非结合蛋白)

泳道33＝源自具有配体2-氨基苯并咪唑(偶联4％琼脂糖)的吸附剂的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)

泳道34＝源自具有配体2-氨基咪唑(偶联6％琼脂糖)的吸附剂的上样物的穿透物(非结合蛋白)

泳道35＝源自具有配体2-氨基咪唑(偶联6％琼脂糖)的吸附剂的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)

实施例13

检测根据实施例1制备的偶联配体己胺的吸附剂(通过滴定测定配体的浓度为31mmol/L吸附剂)在不同的pH值：pH9、pH8、pH7、pH6、pH5和pH4.5时结合胰蛋白酶抑制剂和其它大豆蛋白的能力。

过程

柱的制备和流速如实施例4所述。装填之后，分别用10ml pH4.5的10mM的柠檬酸钠、pH5.0的10mM的柠檬酸钠、pH6.0的10mM的柠檬酸钠、pH7.0的10mM的磷酸氢二钾、pH8.0的10mM的Tris和pH9.0的10mM的磷酸氢二钾平衡吸附剂。用1M的HCl将大豆提取物(根据实施例2在pH9下制备的)pH分别调整到9.0、8.0、7.0、6.0、5.0和4.5，10000RPM离心去除沉淀和不溶性物质。将7.5ml的离心的提取物上样到柱子。将穿透物(非结合蛋白)收集到三个2.5ml级份。然后用5ml的去离子水洗涤柱子。将穿透物(非结合的和松散结合的蛋白质)收集到一5ml级份。

通过SDS-PAGE测定吸附剂的性能(如实施例3所述)。参见附图11a-f。

结果显示在pH9.0时，只有小量的蛋白质结合到吸附剂(参见泳道7，其代表了只含有少数几个非常弱的条带的洗脱物级份。泳道1代表大豆提取物中所有蛋白的条带，泳道2-5代表在穿透物级份中的非结合蛋白条带。这些条带的强度非常类似于泳道1中的条带，这意味着所述的吸附剂没有结合这些蛋白质)。只有小部分的胰蛋白酶抑制剂被结合并释放到洗脱物中(参见泳道7)。

在pH 8.0时，大部分的胰蛋白酶抑制剂以及一部分其它大豆蛋白结合到吸附剂(参见泳道9到11，其代表含有非结合蛋白的穿透物级份基本上没有胰蛋白酶抑制剂条带，在最后的穿透物级份中开始出现弱的胰蛋白酶抑制剂条带＝泳道11)。结合到吸附剂的胰蛋白酶抑制剂和其它蛋白质被回收到洗脱物中(参见泳道14)。

在pH 7.0、pH 6.0和pH 5.0时，所有的胰蛋白酶抑制剂和一部分其它大豆蛋白质结合到吸附剂。胰蛋白酶抑制剂和其它结合的蛋白质被一起回收到洗脱物中(分别参见泳道21、泳道28和泳道35。在这三个pH值从吸附剂的上样物的穿透物级份不含有胰蛋白酶抑制剂(分别参见泳道19、泳道26和泳道33))。

在pH 4.5时，实际上只有胰蛋白酶抑制剂结合到吸附剂，一部分胰蛋白酶抑制剂没有结合(参见泳道38和39，其代表从吸附剂的上样物的最后两个穿透物级份，以及泳道41，其代表检测到洗涤物中的弱的胰蛋白酶抑制剂条带，意味着它没有结合到吸附剂)。胰蛋白酶抑制剂被回收到洗脱物中(参见泳道42，除了代表胰蛋白酶抑制剂的条带外检测到非常少数的其它条带)。

在下表中，通过扫描SDS-PAGE凝胶的光密度计算了在所检测的不同pH时在洗脱物中的胰蛋白酶抑制剂(TI)的纯度。图像处理系统用于扫描的不同泳道(Alphalmanager gel documentation system fromAlpha Innotech,(Protein Simple,USA))。

pH	洗脱物中TI纯度，％
		9	24.0
8	32.6
		7	21.9
6	26.9
		5	38.1
4.5	72.0

根据下表，使用相同的原理估计每克蛋白中胰蛋白酶抑制剂的相对含量从起始物质到总的穿透物级份(非结合蛋白组分)被减少。

pH	起始物质	总的穿透物级份。胰蛋白酶抑制剂浓度/g蛋白
			9.0	100％	30％
8.0	100％	15％
			7.0	100％	10％
6.0	100％	<2％
			5.0	100％	<2％
4.5	100％	<2％

附图11a-11f:

泳道1＝pH 9.0的大豆提取物

泳道2＝pH 9.0时源自具有配体己胺的吸附剂的上样物的穿透物级份1(非结合蛋白)

泳道3＝pH 9.0时源自具有配体己胺的吸附剂的上样物的穿透物级份2(非结合蛋白)

泳道4＝pH 9.0时源自具有配体己胺的吸附剂的上样物的穿透物级份3(非结合蛋白)

泳道5＝pH 9.0时源自具有配体己胺的吸附剂的上样物的穿透物级份1到3的集合(非结合蛋白)

泳道6＝源自具有配体己胺的吸附剂的洗涤物(非结合的和松散结合的蛋白)

泳道7＝源自具有配体己胺的吸附剂的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)(在pH9.0时进行的实验)

泳道8＝pH 8.0的大豆提取物

泳道9＝pH 8.0时源自具有配体己胺的吸附剂的上样物的穿透物级份1(非结合蛋白)

泳道10＝pH 8.0时源自具有配体己胺的吸附剂的上样物的穿透物级份2(非结合蛋白)

泳道11＝pH 8.0时源自具有配体己胺的吸附剂的上样物的穿透物级份3(非结合蛋白)

泳道12＝pH 8.0时源自具有配体己胺的吸附剂的上样物的穿透物级份1到3的集合(非结合蛋白)

泳道13＝源自具有配体己胺的吸附剂的洗涤物(非结合的和松散结合的蛋白)

泳道14＝源自具有配体己胺的吸附剂的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)(在pH8.0时进行的实验)

泳道15＝pH 7.0的大豆提取物

泳道16＝pH 7.0时源自具有配体己胺的吸附剂的上样物的穿透物级份1(非结合蛋白)

泳道17＝pH 7.0时源自具有配体己胺的吸附剂的上样物的穿透物级份2(非结合蛋白)

泳道18＝pH 7.0时源自具有配体己胺的吸附剂的上样物的穿透物级份3(非结合蛋白)

泳道19＝pH 7.0时源自具有配体己胺的吸附剂的上样物的穿透物级份1到3的集合(非结合蛋白)

泳道20＝源自具有配体己胺的吸附剂的洗涤物(非结合的和松散结合的蛋白)

泳道21＝源自具有配体己胺的吸附剂的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)(在pH7.0时进行的实验)

泳道22＝pH 6.0的大豆提取物

泳道23＝pH 6.0时源自具有配体己胺的吸附剂的上样物的穿透物级份1(非结合蛋白)

泳道24＝pH 6.0时源自具有配体己胺的吸附剂的上样物的穿透物级份2(非结合蛋白)

泳道25＝pH 6.0时源自具有配体己胺的吸附剂的上样物的穿透物级份3(非结合蛋白)

泳道26＝pH 6.0时源自具有配体己胺的吸附剂的上样物的穿透物级份1到3的集合(非结合蛋白)

泳道27＝源自具有配体己胺的吸附剂的洗涤物(非结合的和松散结合的蛋白)

泳道28＝源自具有配体己胺的吸附剂的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)(在pH6.0时进行的实验)

泳道29＝pH 5.0的大豆提取物

泳道30＝pH 5.0时源自具有配体己胺的吸附剂的上样物的穿透物级份1(非结合蛋白)

泳道31＝pH 5.0时源自具有配体己胺的吸附剂的上样物的穿透物级份2(非结合蛋白)

泳道32＝pH 5.0时源自具有配体己胺的吸附剂的上样物的穿透物级份3(非结合蛋白)

泳道33＝pH 5.0时源自具有配体己胺的吸附剂的上样物的穿透物级份1到3的集合(非结合蛋白)

泳道34＝源自具有配体己胺的吸附剂的洗涤物(非结合的和松散结合的蛋白)

泳道35＝源自具有配体己胺的吸附剂的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)(在pH5.0时进行的实验)

泳道36＝pH 4.5的大豆提取物

泳道30＝pH 4.5时源自具有配体己胺的吸附剂的上样物的穿透物级份1(非结合蛋白)

泳道37＝pH 4.5时源自具有配体己胺的吸附剂的上样物的穿透物级份2(非结合蛋白)

泳道38＝pH 4.5时源自具有配体己胺的吸附剂的上样物的穿透物级份3(非结合蛋白)

泳道39＝pH 4.5时源自具有配体己胺的吸附剂的上样物的穿透物级份1到3的集合(非结合蛋白)

泳道40＝源自具有配体己胺的吸附剂的洗涤物(非结合的和松散结合的蛋白)

泳道41＝源自具有配体己胺的吸附剂的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)(在pH4.5时进行的实验)

实施例14

检测根据实施例1制备的偶联配体苄胺的吸附剂(通过滴定测定配体的浓度为55mmol/L吸附剂)在不同的pH值：pH9、pH8、pH7、pH6、pH5和pH4.5时结合胰蛋白酶抑制剂和其它大豆蛋白的能力。

过程

柱的制备和流速如实施例4所述。装填之后，分别用10ml pH4.5的10mM的柠檬酸钠、pH5.0的10mM的柠檬酸钠、pH6.0的10mM的柠檬酸钠、pH7.0的10mM的磷酸氢二钾、pH8.0的10mM的Tris和pH9.0的10mM的磷酸氢二钾平衡吸附剂。用1M的HCl将大豆提取物(根据实施例2在pH9下制备的)pH分别调整到9.0、8.0、7.0、6.0、5.0和4.5，10000RPM离心去除沉淀和不溶性物质。将7.5ml的离心的提取物上样到柱子。将穿透物(非结合蛋白)收集到一个7.5ml级份。然后用5ml的去离子水洗涤柱子。将穿透物(非结合的和松散结合的蛋白质)收集到一个级份。

随后用10ml 50mM NaOH从柱子上释放(洗脱)结合的蛋白质。将穿透物(洗脱的蛋白质，洗脱物)收集到一个级份，并且加入1M HCl将洗脱物级份的pH立即调节到pH 7.0。

通过SDS-PAGE测定吸附剂的性能(如实施例3所述)。参见附图12。

结果显示在pH9时，只有小量的蛋白质结合到吸附剂(参见泳道3，其代表了只含有少数几个非常弱的条带的洗脱物级份。泳道1代表大豆提取物中所有蛋白的条带，泳道2代表在穿透物级份中的非结合蛋白条带。这些条带的强度非常类似于泳道1中的条带，这意味着所述的吸附剂没有结合这些蛋白质)。

在pH 8时，所有胰蛋白酶抑制剂以及一小部分其它大豆蛋白结合到吸附剂(参见泳道5，其代表含有非结合蛋白的穿透物级份基本上没有胰蛋白酶抑制剂条带，代表所有其它蛋白的条带仍然存在，并且这些条带的强度非常类似于泳道5中的条带＝大豆提取物，意味着所述的吸附剂没有结合这些蛋白)。胰蛋白酶抑制剂被回收到洗脱物中(参见泳道6)。

在pH 7时，所有的胰蛋白酶抑制剂和一部分其它大豆蛋白质结合到吸附剂。在pH7时比pH8时有更多的其它蛋白质结合到吸附剂(参见泳道8，其代表含有非结合蛋白的穿透物级份实际上没有胰蛋白酶抑制剂条带)。胰蛋白酶抑制剂和其它结合的蛋白质一起被回收到洗脱物中(参见泳道9.比较泳道6＝pH8时的洗脱物与泳道9＝pH7时的洗脱物，胰蛋白酶抑制剂条带强度相似，但是代表其它蛋白质的条带的强度在pH7时比pH8时强，这意味着更多的其它蛋白质在pH7时结合)。

在pH 6时，所有的胰蛋白酶抑制剂和一部分其它大豆蛋白质结合到吸附剂(参见泳道11，其代表含有非结合蛋白的穿透物级份实际上没有胰蛋白酶抑制剂条带)。胰蛋白酶抑制剂和其它结合的蛋白质一起被回收到洗脱物中(参见泳道12)。

在pH 5时，所有的胰蛋白酶抑制剂和一部分其它大豆蛋白质结合到吸附剂(参见泳道14，其代表含有非结合蛋白的穿透物级份实际上没有胰蛋白酶抑制剂条带)。胰蛋白酶抑制剂和其它结合的蛋白质一起被回收到洗脱物中(参见泳道15)。

在pH 4.5时，所有的胰蛋白酶抑制剂和一部分其它大豆蛋白质结合到吸附剂(参见泳道17，其代表含有非结合蛋白的穿透物级份实际上没有胰蛋白酶抑制剂条带)。胰蛋白酶抑制剂和其它结合的蛋白质一起被回收到洗脱物中(参见泳道18)。

在下表中，通过扫描SDS-PAGE凝胶的光密度计算了在所检测的不同pH时的洗脱物中胰蛋白酶抑制剂(TI)的纯度。图像处理系统用于扫描的不同泳道(Alphalmanager gel documentation system from AlphaInnotech,(Protein Simple,USA))

pH	洗脱物中TI纯度，％
		9	36.9
8	36.6
		7	36.0
6	30.9
		5	31.1
4.5	46.0

使用相同的原理估计了与起始物质相比，在pH6.0时在总的穿透物级份(非结合蛋白质)中每克总蛋白含有少于10％的的胰蛋白酶抑制剂。

对应实施例14的附图12

泳道1＝pH 9.0的大豆提取物

泳道2＝pH 9.0时源自具有配体苄胺的吸附剂的上样物的穿透物级份(非结合蛋白)

泳道3＝源自具有配体苄胺的吸附剂的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)(在pH9.0时进行的实验)

泳道4＝pH 8.0的大豆提取物

泳道5＝pH 8.0时源自具有配体苄胺的吸附剂的上样物的穿透物级份(非结合蛋白)

泳道6＝源自具有配体苄胺的吸附剂的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)(在pH8.0时进行的实验)

泳道7＝pH 7.0的大豆提取物

泳道8＝pH 7.0时源自具有配体苄胺的吸附剂的上样物的穿透物级份(非结合蛋白)

泳道9＝源自具有配体苄胺的吸附剂的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)(在pH7.0时进行的实验)

泳道10＝pH 6.0的大豆提取物

泳道11＝pH 6.0时源自具有配体苄胺的吸附剂的上样物的穿透物级份(非结合蛋白)

泳道12＝源自具有配体苄胺的吸附剂的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)(在pH12.0时进行的实验)

泳道13＝pH 5.0的大豆提取物

泳道14＝pH 5.0时源自具有配体苄胺的吸附剂的上样物的穿透物级份(非结合蛋白)

泳道15＝源自具有配体苄胺的吸附剂的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)(在pH5.0时进行的实验)

泳道16＝pH 4.5的大豆提取物

泳道17＝pH 4.5时源自具有配体苄胺的吸附剂的上样物的穿透物级份(非结合蛋白)

泳道18＝源自具有配体苄胺的吸附剂的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)(在pH4.5时进行的实验)

实施例15

根据实施例1制备的偶联配体己胺的吸附剂(通过滴定测定配体的浓度为31mmol/L吸附剂)在pH6下上样大豆蛋白，用稀碱溶液洗脱，以得到具有低离子强度的最后的蛋白溶液(洗脱物)，从而方便进一步的下游处理。因为低传导性，在所述产品干燥之前的超滤过程中不需要渗滤。

进行两次实验，其中分别用50mM的NaOH(11.5mS/cm)和10mM NaOH(2.4mS/cm)进行结合蛋白的洗脱。

过程

柱的制备和流速如实施例4所述。装填之后，用10ml pH6.0的10mM的柠檬酸钠平衡吸附剂。用1M的HCl将大豆提取物(根据实施例2在在接近中性pH下制备的)pH调整到6.0，10000RPM离心去除沉淀和不溶性物质。将7.5ml的离心的提取物上样到柱子。将穿透物(非结合蛋白)收集到一7.5ml级份。然后用5ml的去离子水洗涤柱子。将穿透物(非结合的和松散结合的蛋白质)收集到一5ml级份。

随后分别用10ml 10mM NaOH和10ml 50mM NaOH从柱子上释放(洗脱)结合的蛋白质。将穿透物(洗脱的蛋白质，洗脱物)收集到一10ml级份，并且加入1M HCl将洗脱物级份的pH立即调节到pH 7.0。根据实施例3对两次洗脱物进行干物质定量。

从10mM NaOH洗脱缓冲液得到的洗脱物的传导性是591μS/cm。干物质定量显示在洗脱物中获得44mg蛋白，相应于上样到柱子上的每ml大豆提取物为5.9mg蛋白。

从50mM NaOH洗脱缓冲液得到的洗脱物的传导性是4.95mS/cm。干物质定量显示在洗脱物中获得41mg蛋白，相应于上样到柱子上的每ml大豆提取物为5.5mg蛋白。

结果显示在偶联配体己胺的吸附剂上的结合蛋白可以被稀的氢氧化钠溶液洗脱，得到具有低离子强度的蛋白溶液(洗脱物)。由于低传导性，在产品干燥前的超滤过程中无需渗滤。

实施例16

使用根据实施例1制备的具有配体苄胺的吸附剂(通过滴定测定配体的浓度为55mmol/L吸附剂)从大豆提取物分离胰蛋白酶抑制剂。

过程

柱的制备和流速如实施例4所述。装填之后，用10ml pH6.0的10mM的柠檬酸钠平衡吸附剂。用1M的HCl将大豆提取物(根据实施例2在在接近中性pH下制备的)pH调整到6.0，10000RPM离心去除沉淀和不溶性物质。将20ml的离心的提取物上样到柱子。将穿透物(非结合蛋白)收集到一个级份。然后用5ml的去离子水洗涤柱子。将穿透物(非结合的和松散结合的蛋白质)收集到一个级份。

利用如实施例3所述的干物质定量确定结合到吸附剂上的蛋白量。干物质定量显示在洗脱物中产生60mg蛋白质，相应于每ml大豆提取物3mg蛋白质被上样到柱子上。

通过SDS-PAGE测定吸附剂的性能(如实施例3所述)。参见附图13。

结果显示大部分的胰蛋白酶抑制剂以及一小部分其它大豆蛋白结合到吸附剂(参见泳道2，其代表含有非结合蛋白的穿透物级份，胰蛋白酶抑制剂的量较低(胰蛋白酶抑制剂条带的强度较低)，代表所有其它蛋白的条带仍然存在，并且这些条带的强度非常类似于泳道1中的条带＝大豆提取物，意味着所述的吸附剂没有结合这些蛋白)。胰蛋白酶抑制剂被回收到洗脱物中(参见泳道4)。

泳道1＝pH 6.0的大豆提取物

泳道2＝pH 6.0时源自具有配体苄胺的吸附剂的上样物的穿透物级份(非结合蛋白)

泳道3＝具有配体苄胺的吸附剂的洗涤物(非结合的和松散结合的蛋白质)

泳道4＝源自具有配体苄胺的吸附剂的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)

实施例17

该实施例显示如何从偶联配体己胺的吸附剂(如实施例1所描述制备的)选择性洗脱胰蛋白酶抑制剂，(通过滴定测定配体的浓度为31mmol/L吸附剂)，其中，在pH6.0时蛋白质被结合。在洗脱过程中，通过使用pH不断增加的稀释缓冲液逐步增加pH。

过程

柱的制备和流速如实施例4所述。装填之后，用10ml pH6.0的10mM柠檬酸钠平衡吸附剂。用1M的HCl将大豆提取物(根据实施例2在接近中性pH下制备的)pH调整到6.0。于10000RPM离心提取物去除不溶性和沉淀物质。将7.5ml的离心的提取物上样到柱子。将穿透物(非结合蛋白)收集到一7.5ml级份。用5ml的去离子水洗涤吸附剂。将穿透物(非结合的和松散结合的蛋白质)收集到一5ml级份。

10ml pH5.75的10mM柠檬酸钠，将穿透物(洗脱的蛋白，洗脱物)收集到一10ml级份

10ml pH4.5的10mM柠檬酸钠，将穿透物(洗脱的蛋白，洗脱物)收集到一10ml级份

10ml pH4.0的10mM柠檬酸钠，将穿透物(洗脱的蛋白，洗脱物)收集到一10ml级份

10ml pH3.5的10mM柠檬酸钠，将穿透物(洗脱的蛋白，洗脱物)收集到一10ml级份

10ml pH3.0的10mM柠檬酸钠，将穿透物(洗脱的蛋白，洗脱物)收集到一10ml级份

10ml 50mM NaOH，将穿透物(洗脱的蛋白质，洗脱物)收集到一10ml级份，并且加入1M HCl将洗脱物级份的pH立即调节到pH7.0。

通过SDS-PAGE测定吸附剂的性能(如实施例3所述)。参见附图14。箭头指示用纯化的大豆蛋白在实施例3中鉴定的条带。

结果显示所述的吸附剂实质上结合了所有应用到柱子上的胰蛋白酶抑制剂和少部分的其它蛋白质(参见泳道2，其代表含有非结合蛋白质的穿透物级份，实际上没有胰蛋白酶抑制剂条带，代表所有其它蛋白质的条带仍然存在，并且这些条带的强度与泳道1＝大豆提取物中的条带相似，这意味着吸附剂没有结合这些蛋白质)。

胰蛋白酶抑制剂在5.75-3.5的pH范围内从己胺配体上被洗脱(参见泳道4-7)，之后大多数其它蛋白质被50mM NaOH溶液洗脱(参见泳道9)

泳道1＝pH 6.0的大豆提取物

泳道2＝pH 6.0时源自具有配体己胺的吸附剂的上样物的穿透物级份(非结合蛋白)

泳道3＝具有配体己胺的吸附剂的洗涤物(非结合的和松散结合的蛋白质)

泳道4＝pH 5.75时源自具有配体己胺的吸附剂的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)

泳道5＝pH 4.5时源自具有配体己胺的吸附剂的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)

泳道6＝pH 4.0时源自具有配体己胺的吸附剂的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)

泳道7＝pH 3.5时源自具有配体己胺的吸附剂的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)

泳道8＝pH 3.0时源自具有配体己胺的吸附剂的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)

泳道9＝用50mM NaOH源自具有配体己胺的吸附剂的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)

实施例18

该实施例显示如何从偶联配体苄胺的吸附剂(如实施例1所描述制备的)选择性洗脱胰蛋白酶抑制剂，(通过滴定测定配体的浓度为55mmol/L吸附剂)，其中，在pH6.0时蛋白质被结合。在洗脱过程中，分别使用a)pH4.5的10mM的柠檬酸钠，b)pH3.0的10mM的柠檬酸钠，c)50mM的NaOH逐步降低pH。

过程

a)10ml pH4.5的10mM柠檬酸钠，将穿透物(洗脱的蛋白质，洗脱物)收集到一10ml级份。

b)10ml pH3.0的10mM柠檬酸钠，将穿透物(洗脱的蛋白质，洗脱物)收集到一10ml级份。

c)10ml 50mM NaOH，将穿透物收集到(洗脱的蛋白质，洗脱物)收集到一10ml级份，并且加入1M HCl将洗脱物级份的pH立即调节到pH 7.0。

通过SDS-PAGE测定吸附剂的性能(如实施例3所述)。参见附图15。箭头指示用纯化的大豆蛋白在实施例3中鉴定的条带。

结果显示所述的吸附剂实质上结合了所有应用到柱子上的胰蛋白酶抑制剂和较少部分的其它蛋白质(参见泳道2，其代表了含有非结合蛋白质的穿透物级份，实际上胰蛋白酶抑制剂条带)。

胰蛋白酶抑制剂在pH3.0时从苄胺配体上洗脱(参见泳道5)。其它蛋白质分别被pH4.5的溶液和50mM NaOH溶液洗脱(参见泳道4和6)。

对应实施例18的附图Y

泳道1＝pH 6.0的大豆提取物

泳道4＝pH 4.5时源自具有配体苄胺的吸附剂的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)

泳道5＝pH 3.0时源自具有配体苄胺的吸附剂的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)

泳道6＝用50mM NaOH源自具有配体苄胺的吸附剂的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)

实施例19

该实施例显示从偶联配体4-氨基苯甲酸的吸附剂(如实施例1所描述制备的)的洗脱物中回收的大豆蛋白的量，(通过滴定测定配体的浓度为30mmol/L吸附剂)，其中，在pH4.5时的上样比分别为1:10(每升吸附剂上样10L提取物)、1:20和1:30。通过实施例3所述的干物质定量确定结合蛋白的量。

过程

柱的制备和流速如实施例4所述。装填之后，用10ml pH4.5的10mM柠檬酸钠平衡吸附剂。用1M的HCl将大豆提取物(根据实施例2在接近中性pH下制备的)pH调整到4.5。于10000RPM离心提取物去除不溶性和沉淀物质。分别将10ml、20ml和30ml的离心的提取物上样到柱子。将穿透物(非结合蛋白)收集到10ml级份。用5ml的去离子水洗涤吸附剂。将穿透物(非结合的和松散结合的蛋白质)收集到一5ml级份。

随后通过使用10ml 50mM NaOH将结合的蛋白质从柱子上释放(洗脱)。将穿透物(洗脱的蛋白质，洗脱物)收集到一10ml级份，并且加入1M HCl将洗脱物级份的pH立即调节到pH 7.0。

通过SDS-PAGE测定吸附剂的性能(如实施例3所述)。参见附图16a和16b。

下表显示了从不同上样比的柱子上洗脱的蛋白质的量(用实施例3所述的干物质定量确定)。吸附剂的结合能力计算为洗脱物中的蛋白mg除以吸附剂的体积(1ml)。产量计算为洗脱物中的蛋白mg除以提取物上样体积(分别为10、20和30ml)。

结果显示越多的大豆蛋白提取物上样到偶联配体4-氨基苯甲酸的吸附剂上，则实现越高的结合能力，意味着每个纯化循环蛋白质的高产量。

泳道1＝pH 4.5的大豆提取物

泳道2＝pH 4.5时源自具有配体4-氨基苯甲酸(4％琼脂糖珠)的吸附剂的上样物的穿透物(非结合蛋白)

泳道3＝具有配体4-氨基苯甲酸(4％琼脂糖珠)的吸附剂的洗涤物(非结合的和松散结合的蛋白质)

泳道4＝源自具有配体4-氨基苯甲酸(4％琼脂糖珠)的吸附剂的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)

泳道5＝pH 4.5的大豆提取物

泳道6＝pH 4.5时源自具有配体4-氨基苯甲酸(4％琼脂糖珠)的吸附剂的上样物的穿透物级份1(非结合蛋白)

泳道7＝pH 4.5时源自具有配体4-氨基苯甲酸(4％琼脂糖珠)的吸附剂的上样物的穿透物级份2(非结合蛋白)

泳道8＝具有配体4-氨基苯甲酸(4％琼脂糖珠)的吸附剂的洗涤物(非结合的和松散结合的蛋白质)

泳道9＝源自具有配体4-氨基苯甲酸(4％琼脂糖珠)的吸附剂的上样物的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)

泳道10＝pH 4.5时源自具有配体4-氨基苯甲酸(4％琼脂糖珠)的吸附剂的上样物的穿透物级份1(非结合蛋白)

泳道11＝pH 4.5时源自具有配体4-氨基苯甲酸(4％琼脂糖珠)的吸附剂的上样物的穿透物级份2(非结合蛋白)

泳道12＝pH 4.5时源自具有配体4-氨基苯甲酸(4％琼脂糖珠)的吸附剂的上样物的穿透物级份2(非结合蛋白)

泳道13＝具有配体4-氨基苯甲酸(4％琼脂糖珠)的吸附剂的洗涤物(非结合的和松散结合的蛋白质)

泳道14＝源自具有配体4-氨基苯甲酸(4％琼脂糖珠)的吸附剂的上样物的洗脱物(结合的并随后被释放的蛋白质)

实施例20

该实施例显示从偶联配体4-巯基苯甲酸的吸附剂(如实施例1所描述制备的)的洗脱物中回收的大豆蛋白的量，(通过滴定程度定配体的浓度为51mmol/L吸附剂)，其中，在pH4.5时的上样比为1:20(每升吸附剂上样20L提取物)。通过实施例3所述的干物质定量确定蛋白的量。

过程

柱的制备和流速如实施例4所述。装填之后，用10ml pH4.5的10mM柠檬酸钠平衡吸附剂。用1M的HCl将大豆提取物(根据实施例2在接近中性pH下制备的)pH调整到4.5。于10000RPM离心提取物去除不溶性和沉淀物质。将20ml离心的提取物上样到柱子。将穿透物(非结合蛋白)收集到一20ml级份。用5ml的去离子水洗涤吸附剂。将穿透物(非结合的和松散结合的蛋白质)收集到一5ml级份。

根据实施例3定量洗脱物中的干物质。结果显示在洗脱物中回收了57mg蛋白质，其相应于每ml大豆提取物2.85mg蛋白质。由此得出吸附剂的结合能力为每ml吸附剂57mg蛋白质。

实施例21

该实施例显示如何从偶联配体4-氨基苯甲酸的吸附剂(如实施例1所描述制备的)选择性洗脱胰蛋白酶抑制剂，(通过滴定测定配体的浓度为30mmol/L吸附剂)，其中，在pH4.5蛋白质被结合。用pH6.0的10mM柠檬酸钠选择性洗脱胰蛋白酶抑制剂，用10mM NaOH洗脱其它结合的蛋白质。

使用膨胀床吸附(EBA)层析进行该实验。

用于该实验的EBA柱：具有150cm玻璃管的直径1cm的实验室EBA柱(目录号：7010-0100+7010-1500,Upfront Chromatography A/S,Denmark)。

过程

柱装填为50cm固定床高，等于40ml吸附剂。上样提取物过程中的流速：10cm/min＝8ml/min。平衡、洗涤和洗脱过程中的流速：15cm/min＝12ml/min。装填之后，用200ml pH4.5的10mM柠檬酸钠平衡吸附剂。用1M的HCl将大豆提取物(根据实施例2在接近中性pH下制备的)pH调整到4.5。不经离心直接将提取物上样到柱子上。将600ml的提取物上样到柱子。将穿透物(非结合蛋白)收集到三个200ml级份。用230ml的去离子水洗涤吸附剂。将穿透物(非结合的和松散结合的蛋白质)收集到一260ml级份。

随后使用下列缓冲液从柱子上释放(洗脱)结合的蛋白质：

pH 6.0的10mM柠檬酸钠(缓冲液的传导性：2.32mS/cm)。将穿透物(洗脱的蛋白质，洗脱物)收集到一192ml的级份，所得到的洗脱物的传导性＝2.0mS/cm。

10mM NaOH(缓冲液的传导性：2.4mS/cm)。将穿透物(洗脱的蛋白质，洗脱物)收集到一140ml的级份，所得到的洗脱物的传导性＝1.0mS/cm。所得到的洗脱物的pH是pH7.59，因为所述蛋白是用稀氢氧化钠缓冲液释放的。

通过SDS-PAGE测定吸附剂的性能(如实施例3所述)。参见附图17。

对洗脱物1和洗脱物2进行干物质定量(如实施例3所述)。

洗脱物1中的蛋白浓度为3.2mg/ml，因此产量为每ml上样到柱子上的大豆提取物1.0mg蛋白质。

洗脱物2中的蛋白浓度为6.2mg/ml，因此产量为每ml上样到柱子上的大豆提取物1.4mg蛋白质。

因此总的吸附剂结合能力是每ml吸附剂36mg蛋白质。结果显示胰蛋白酶抑制剂被选择性源自具有配体4-氨基苯甲酸的吸附剂上洗脱(pH6.0，参见泳道7)，之后其它蛋白质被10mM NaOH溶液洗脱(参见泳道8)。

泳道1＝pH 4.5的大豆提取物

泳道2＝pH 4.5时源自具有配体4-氨基苯甲酸(4％琼脂糖珠)的吸附剂的上样物的穿透物级份1(非结合蛋白)

泳道3＝pH 4.5时源自具有配体4-氨基苯甲酸(4％琼脂糖珠)的吸附剂的上样物的穿透物级份2(非结合蛋白)

泳道4＝pH 4.5时源自具有配体4-氨基苯甲酸(4％琼脂糖珠)的吸附剂的上样物的穿透物级份3(非结合蛋白)

泳道5＝pH 4.5时源自具有配体4-氨基苯甲酸(4％琼脂糖珠)的吸附剂的上样物的穿透物级份1-3的集合(非结合蛋白)

泳道6＝具有配体4-氨基苯甲酸(4％琼脂糖珠)的吸附剂的洗涤物(非结合的和松散结合的蛋白质)

泳道7＝pH 6.0时源自具有配体4-氨基苯甲酸(4％琼脂糖珠)的吸附剂的洗脱物级份(结合的并随后被释放的蛋白质)

泳道8＝用10mM NaOH源自具有配体4-氨基苯甲酸(4％琼脂糖珠)的吸附剂的洗脱物级份(结合的并随后被释放的蛋白质)

实施例22

本实施例显示了如何从沉淀的大豆蛋白去除胰蛋白酶抑制剂。

将大豆提取物(根据实施例2在接近中性pH下制备的)10000RPM离心去除不溶性和沉淀物质。用1M的HCl将20ml离心的提取物的pH调整到4.5。于10000RPM离心提取物。收集上清。将沉淀重新溶解于20ml的pH8.0的10mM磷酸氢二钾中。重新溶解的大豆蛋白中的胰蛋白酶抑制剂在pH8.0时选择性结合于偶联配体苄胺的吸附剂(如实施例1所述制备)(通过滴定测定配体浓度为55mmol/L吸附剂)。

过程

柱的制备和流速如实施例4所述。装填之后，用10ml pH8.0的10mMTris平衡吸附剂。用1M的NaOH将重新溶解的大豆蛋白溶液的pH调整到8.0。10000RPM离心该溶液去除不溶性和沉淀物质。将14ml上样到柱子。将穿透物(非结合蛋白)收集到四个3.5ml级份。用5ml的去离子水洗涤吸附剂。将穿透物(非结合的和松散结合的蛋白质)收集到一5ml级份。

随后使用10ml 10mM NaOH将结合的蛋白质从柱子上释放(洗脱)。将穿透物(洗脱的蛋白质，洗脱物)收集到一10ml级份，并且加入1M HCl将洗脱物级份的pH立即调节到pH 7.0。

通过SDS-PAGE测定吸附剂的性能(如实施例3所述)。参见附图18。

结果显示当将pH调整到pH4.5时，大部分的大豆蛋白被沉淀(泳道1代表pH6.0时大豆提取物中的所有蛋白质条带，泳道2代表大豆蛋白在pH4.5被沉淀时的上清，因为沉淀重要的条带不再存在)。

沉淀中(来自pH4.5时的沉淀)的蛋白质可以重新溶解于pH8.0的磷酸缓冲液中。(泳道3代表重新溶解的蛋白质，其中重要的蛋白条带重新出现)。

重新溶解的蛋白组分含有胰蛋白酶抑制剂(参见泳道3)。偶联配体苄胺的吸附剂实质上选择性结合了应用到柱子上的所有胰蛋白酶抑制剂，该组分中的其它蛋白质被回收到从该吸附剂的穿透物级份中(参见泳道4至8，其代表含有非结合蛋白的穿透物级份＝在重新溶解的蛋白组分中所有主要蛋白条带，除了胰蛋白酶抑制剂基本不存在于这些组分中)。胰蛋白酶抑制剂被回收到实验的洗脱物中(参见泳道10)。

泳道1＝pH 6.0的大豆提取物

泳道2＝pH 4.5时大豆蛋白沉淀后的上清液

泳道3＝pH 8.0时重新溶解的沉淀(来自pH 4.5时大豆蛋白的沉淀)

泳道4＝pH 8.0时源自具有配体苄胺的吸附剂的上样物的穿透物级份1(非结合蛋白)

泳道5＝pH 8.0时源自具有配体苄胺的吸附剂的上样物的穿透物级份2(非结合蛋白)

泳道6＝pH 8.0时源自具有配体苄胺的吸附剂的上样物的穿透物级份3(非结合蛋白)

泳道7＝pH 8.0时源自具有配体苄胺的吸附剂的上样物的穿透物级份4(非结合蛋白)

泳道8＝pH 8.0时源自具有配体苄胺的吸附剂的上样物的穿透物级份1-4的集合(非结合蛋白)

泳道9＝具有配体苄胺的吸附剂的洗涤物(非结合的和松散结合的蛋白质)

泳道10＝源自具有配体苄胺的吸附剂的洗脱物级份(结合的并随后被释放的蛋白质)

实施例23

本实施例显示了当胰蛋白酶抑制剂存在时以及在pH4.5沉淀前去除胰蛋白酶抑制剂时如何在pH4.5沉淀大豆蛋白。在pH8.0时胰蛋白酶抑制剂选择性结合偶联配体苄胺的吸附剂(通过滴定测定配体的浓度为55mmol/L吸附剂)。

将本实验的穿透物(仍然含有小量的胰蛋白酶抑制剂)的pH调整到pH7.0，在pH7.0时所述小量遗留的胰蛋白酶抑制剂选择性结合于偶联配体苄胺的吸附剂(通过滴定测定配体的浓度为55mmol/L吸附剂)。

使用膨胀床吸附(EBA)层析进行本实验。用于实验的EBA柱：具有150cm玻璃管的直径1cm的实验室EBA柱(目录号：7010-0100+7010-1500,Upfront Chromatography A/S,Denmark)。

柱1的过程(上样pH＝8.0)

柱装填为50cm固定床高，等于40ml吸附剂。整个实验过程中的流速：10cm/min＝8ml/min。装填之后，用200ml pH8.0的10mM Tris平衡吸附剂。用1M的HCl将大豆提取物(根据实施例2在pH9.0时制备的)pH调整到8.0。不经离心直接将提取物上样到柱子上。将300ml的提取物上样到柱子。将穿透物(非结合蛋白)收集到一300ml级份。用280ml的去离子水洗涤吸附剂。将穿透物(非结合的和松散结合的蛋白质)收集到一245ml级份。

随后使用下列缓冲液从柱子上释放(洗脱)结合的蛋白质：

10mM NaOH(缓冲液的传导性：2.4mS/cm)。将穿透物(洗脱的蛋白质，洗脱物)收集到一325ml的级份，所得到的洗脱物的传导性＝606μS/cm。

柱2的过程(上样pH＝7.0)

柱装填为50cm固定床高，等于40ml吸附剂。整个实验过程中的流速：10cm/min＝8ml/min。装填之后，用200ml pH6.0的10mM柠檬酸钠平衡吸附剂。用1M的HCl将大豆提取物(＝从上述柱1的上样物的穿透物)pH调整到7.0。不经离心直接将提取物上样到柱子上。将200ml的提取物上样到柱子。将穿透物(非结合蛋白)收集到一200ml级份。用300ml的去离子水洗涤吸附剂。将穿透物(非结合的和松散结合的蛋白质)收集到一285ml级份。

随后使用下列缓冲液从柱子上释放(洗脱)结合的蛋白质：

10mM NaOH(缓冲液的传导性：2.4mS/cm)。将穿透物(洗脱的蛋白质，洗脱物)收集到一275ml的级份，所得到的洗脱物的传导性＝702μS/cm。

大豆蛋白的沉淀过程

在pH9.0(根据实施例2)制备大豆提取物，将去除了大部分的胰蛋白酶抑制剂的所述大豆提取物(pH8.0)和pH7.0时完全去除胰蛋白酶抑制剂的大豆提取物用1M盐酸调整pH至pH4.5。10000RPM离心所述的制备物去除不溶性和沉淀的物质，通过根据实施例3的SDS-PAGE检测上清。参见附图19a-c。

通过SDS-PAGE(如实施例3所述)测定在不同上样pH值时吸附剂的性能。参见附图19a-c。

对两次洗脱物进行干物质定量(如实施例3所述)。

得自柱1的洗脱物的蛋白浓度为3.08mg/ml，因此每ml上样到柱上的大豆提取物产生3.33mg蛋白质。

得自柱2的洗脱物的蛋白浓度为4mg/ml，因此每ml上样到柱上的大豆提取物产生5.5mg蛋白质。

结果显示吸附剂结合了pH8.0时应用到柱1的胰蛋白酶抑制剂的主要部分(参见泳道2，其代表含有非结合蛋白的穿透物级份中实际上没有胰蛋白酶抑制剂条带)。洗脱物中含有胰蛋白酶抑制剂和非常小部分的其它蛋白(参见泳道4)。

结果显示吸附剂结合了pH7.0时应用到柱2的胰蛋白酶抑制剂的主要部分(参见泳道6，其代表含有非结合蛋白的穿透物级份中没有胰蛋白酶抑制剂条带)。洗脱物中含有胰蛋白酶抑制剂和一部分的其它蛋白(参见泳道8)。

从SDS-PAGE可以断定如果从提取物中完全去除胰蛋白酶抑制剂，则大豆植物凝集素和大豆脂氧合酶沉淀较好(参见泳道12。代表脂氧合酶的条带不存在，意味着该蛋白被沉淀，而在泳道10和11中该条带仍然存在，其中胰蛋白酶抑制剂也存在。与泳道10和11相比，代表凝集素的条带非常弱，意味着较多的凝集素被沉淀)。

泳道1＝pH 8.0的大豆提取物

泳道2＝pH 8.0时源自具有配体苄胺的吸附剂的上样物的穿透物级份(非结合蛋白)(柱1)

泳道4＝源自具有配体苄胺的吸附剂的洗脱物级份(结合的并随后被释放的蛋白质)

泳道5＝pH 7.0时从柱1的上样物的大豆提取物穿透物级份

泳道6＝pH 7.0时源自具有配体苄胺的吸附剂的上样物的穿透物级份(非结合蛋白)(柱2)

泳道7＝具有配体苄胺的吸附剂的洗涤物(非结合的和松散结合的蛋白质)

泳道8＝源自具有配体苄胺的吸附剂的洗脱物级份(结合的并随后被释放的蛋白质)

泳道10＝来自在pH9.0制备的大豆提取物用1M盐酸调整至pH 4.5时的上清

泳道11＝来自在去除胰蛋白酶抑制剂的大豆提取物(在pH8.0时)的pH用1M盐酸调整至pH 4.5时的上清

泳道12＝来自在完全去除胰蛋白酶抑制剂的大豆提取物(在pH7.0时)的pH用1M盐酸调整至pH 4.5时的上清

实施例24

本实施例显示了如何用酶促实验确定胰蛋白酶抑制剂从大豆提取物中被去除。

在大豆提取物中加入特定量的胰蛋白酶(来自牛的胰腺，T4665,Sigma,USA)。在从pH6.0时上样到偶联配体苄胺的吸附剂上的大豆提取物的穿透物级份中也加入相同量的胰蛋白酶。该级份中含有极低量的胰蛋白酶抑制剂(胰蛋白酶抑制剂结合到苄胺配体)。胰蛋白酶/大豆提取物溶液与底物N-苯甲酰基-L-精氨酸-4-硝基苯胺盐酸化物(N-benzoyl-L-arginin-4-nitroanilid,hydrochloride)(B3279,Sigma,USA)混合。

底物的分解产物产生的黄颜色可以在410nm下被测量。测量颜色的产生随时间的变化(两分钟)，并计算ΔAbs。ΔAbs越高，则样品中胰蛋白酶活性越高。当胰蛋白酶/大豆提取物溶液中存在胰蛋白酶抑制剂并与底物混合时，那么ΔAbs低，因为胰蛋白酶抑制剂抑制了胰蛋白酶底物反应。反之亦然，如果不存在胰蛋白酶抑制剂，则ΔAbs高，因为没有什么抑制胰蛋白酶底物反应。

下述过程被使用：

底物溶液：1.5mM的N-苯甲酰基-L-精氨酸-4-硝基苯胺盐酸化物(溶于pH 8.0的0.1M tris、10mM氯化钙)。

胰蛋白酶溶液：0.3mg胰蛋白酶/ml(溶于1mM HCl)。

大豆提取物的稀释：将大豆提取物在10000RPM离心，上清稀释于1mM HCl。100μL稀释的大豆提取物与50μL胰蛋白酶溶液混合20分钟。20分钟后，加入600μL pH8.0的0.1M tris、10mM氯化钙。加入375μL底物溶液。充分混合样品，并立即用分光光度计在410nm下测量达2分钟。

下列样品被测量：

a)没有大豆提取物时的胰蛋白酶活性

b)pH 6时的大豆提取物

c)其中的胰蛋白酶抑制剂已经被偶联配体苄胺的吸附剂在pH6.0时去除的大豆提取物(用如实施例14所述的过程制备该样品)。

下表显示上述每一样品的结果(ΔAbs)。

数字表明，当未处理的大豆提取物(含胰蛋白酶抑制剂)加入到胰蛋白酶，ΔAbs降低了6倍，这意味着胰蛋白酶抑制剂抑制了胰蛋白酶与底物之间的反应(产生浅黄色)。当将胰蛋白酶与其中大部分的胰蛋白酶抑制剂已被偶联配体苄胺的吸附剂在pH6.0去除的大豆提取物混合时，则ΔAbs与不存在胰蛋白酶抑制剂时基本相同，即该吸附剂结合了大部分(>90％)的胰蛋白酶抑制剂。

Claims

1.分离大豆蛋白方法，所述方法包括以下步骤：

ii.使所述大豆蛋白的水性提取物或溶液通过至少一个膨胀床吸附过程，其中所述膨胀床吸附过程包括使所述大豆蛋白的水性提取物或溶液与至少一种吸附树脂接触，所述吸附树脂选择性地吸附至少第一类型的大豆蛋白以提供非结合蛋白组分和结合蛋白组分，所述的吸附树脂包含：

a.芳基、苄基或杂芳基；

b.具有4-16碳原子的直链、支链或环状烷基，

或它们的组合；

iv.从所述吸附树脂分离所述第二种类型的大豆蛋白以提供所述第一种类型的大豆蛋白被去除了的第二种大豆蛋白组合物。

2.根据权利要求1的方法，进一步包含将所述的第二种大豆蛋白组合物变性的步骤，以提供变性的第二种大豆蛋白组合物。

3.根据任一前述权利要求的方法，其中所述第一种类型的蛋白是β-伴大豆球蛋白。

4.根据权利要求1-3的任一方法，其中所述第一种类型的蛋白是胰蛋白酶抑制剂(TI)蛋白。

5.根据权利要求4的方法，进一步包含将分离的胰蛋白酶抑制剂(TI)蛋白变性以提供变性的TI蛋白的步骤，例如通过在50-150℃、优选在75-120℃的温度下加热。

6.根据权利要求5的方法，进一步包含将所述的变性的TI蛋白与权利要求3的方法获得的第二种大豆蛋白组合物组合的步骤，以获得第一种组合的大豆蛋白产品。

7.根据权利要求5的方法，进一步包含将所述的变性的TI蛋白质与权利要求4的方法获得的变性的第二种大豆蛋白组合物组合的步骤，以提供第二种组合的大豆蛋白产品。

8.根据权利要求6的方法，其中所述第一种组合的大豆蛋白产品被变性，例如通过在50℃-100℃的温度下加热，以形成第三种组合的大豆蛋白产品。

9.根据任一前述权利要求的方法，其中所述配体(L1)包含芳族环系统，优选苯基或萘基。

10.根据权利要求1-8中的任一方法，其中所述的配体(L2)中的烷基胺或烷基芳基胺包含被选自下列的一个或多个基团所取代的胺：具有4-16个碳原子的可以是直链、支链或环状的烷基，例如，丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、环戊基、环己基或萘烷基。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述的配体(L2)选自丁胺、己胺、辛胺二丁胺、戊胺、正戊胺、N,N-二甲基-1,3-二-氨基丙烷、1,3-二氨基丙烷、1,6-二氨基己烷、1,6-二氨基己烷、1,8-氨基辛烷、1,9-二-氨基壬烷、1,12-氨基十二烷、2-氨基苄胺、2-氨基苯并咪唑、2-氨基咪唑、2,4-二-氨基-6-羟基嘧啶或苄胺。

12.根据权利要求1的方法获得的第二种大豆蛋白组合物，其中第一种类型的大豆蛋白被去除。

13.根据权利要求2的方法获得的变性的第二种大豆蛋白组合物。

14.根据权利要求6的方法获得的第一种组合的大豆蛋白产品。

15.根据权利要求7的方法获得的第二种组合的大豆蛋白产品。

16.根据权利要求8的方法获得的第三种组合的大豆蛋白产品。