CN118043123A - 改进的蛋白质吸附和过滤装置 - Google Patents
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Abstract
一种用于精制生物组合物中的蛋白质或其他生物分子的装置，如用于从奶、乳清、血浆、发酵液或类似物中分离蛋白质。
Description
技术领域
本发明涉及从组合物中分离蛋白质或其他生物分子。具体地，本发明涉及用于蛋白质或其他生物分子的集体吸附和过滤的装置。
背景技术
基于具有亚微米孔隙的超滤甚至微滤膜的过滤装置的主要缺点是很容易被可溶性和/或不溶性物质(如多酚、多糖、脂质、蛋白质聚集体和胶体纤维)结垢(fouling)。这种结垢通常是无法控制的，并导致通过过滤器的液体通量大量损失。因此，许多过滤装置都配备有产生反向冲洗的系统，从而可以从过滤器中去除结垢材料。然而，这种反向冲洗系统的效率变化很大并且取决于结垢机制的具体性质。因此，在许多情况下，执行反向冲洗可能没有显著效果，特别是在膜的亚微米孔被吸附到膜表面结构的物质结垢的情况下(相对于能够穿透孔的颗粒的物理截留和堵塞)。即使物质完全或部分溶解在通过过滤装置的液体中，也可能发生吸附结垢，并且结垢物质可能积聚为覆盖过滤膜的外表面和内表面的多层结构。对于具有亚微米孔结构的膜，这种基于吸附的结垢可能很快发展到孔被堵塞并且通过膜的液体通量下降的程度。
因此，WO2015/118223A1公开了一种用于净化含有杂质(如油或溶解的金属)的液体的装置。装置中的过滤器在专用净化循环中进行净化，该净化循环采用高功率反冲洗与过滤元件超声波处理的结合。
复杂混合物的过滤，如包含蛋白质的生物组合物的精制，是经常因过滤元件的大量结垢而导致液体通量大量损失而困扰的应用领域。因此，在该领域工作时需要一个有效的用于清洁过滤器的系统。然而，许多过滤元件不适合与高效的反冲洗清洁系统一起使用。例如，常用的超滤和微滤平板膜就是这种情况，该膜由铸造在支撑膜结构顶部的分离膜层(表层)组成。而且，在通过蛋白质组合物的集体吸附和过滤来分离蛋白质的方法中，组合物中吸附剂的浓度可能非常高。然而，这又可能导致过滤器表面被吸附剂颗粒快速堵塞，并随后导致液体通量下降，从而降低处理效率。而且，某些过滤器类型在高吸附剂浓度下运行期间非常容易发生切向流流体路径的物理堵塞。
因此，用于生物组合物集体吸附和过滤的改进的装置将是有利的，并且特别是用于从生物组合物中精制蛋白质或其他生物分子的更有效和/或可靠的装置将是有利的。
发明内容
因此，本发明的目的涉及通过使用集体吸附和切向过滤装置以及洗脱目标蛋白质或其他生物分子从生物组合物中精制蛋白质或其他生物分子。
具体地，本发明的目的是提供一种装置，该装置解决了现有技术中存在的过滤器表面结垢、切向流流体路径堵塞以及导致低处理效率的低液体通量的上述问题。
因此，本发明的第一方面涉及一种装置，其包括第一入口1和一个或多个第一流体连接件3，该第一流体连接件3将流体从第一入口1引导至切向流过滤单元5的第一端4，该切向流过滤单元5包括具有标称孔径在1至150μm范围内的过滤器6，并且其中第一流体连接件3包括用于以5-70体积％的浓度悬浮在水性液体中的蛋白质或其他生物分子的吸附材料，并且其中切向流过滤单元5的第二端7具有第二流体连接件8，该第二流体连接件8将渗余物引导回到切向流过滤单元5的第一端4；切向流过滤单元5具有第三流体连接件9，该第三流体连接件9将渗透物引导至第一出口10；并且其中该装置包括自动反向冲洗系统，该系统被配置为以每小时1-500次的频率和/或0.01至200秒之间的脉冲持续时间施加渗透物的脉冲压力增加和/或反向冲洗。生物组合物中的生物分子，例如蛋白质，可以通过例如利用本文所述装置的过程精制。
因此，本发明的第二方面涉及用于分离包含在生物组合物中的蛋白质或其他生物分子的方法，该方法包括以下步骤：
i)将包含目标蛋白质或其他生物分子的生物组合物与包含用于蛋白质或其他生物分子的吸附材料的组合物混合以获得混合物，其中目标蛋白质或其他生物分子由吸附材料承载，
ii)使用具有标称孔径在1至150μm范围内的膜的切向流过滤单元过滤混合物，以获得包含目标蛋白质或其他生物分子的第一渗余物和第一渗透物，该第一渗透物任选地收集在废物罐或渗透物收集罐中，
iii)通过将获得的第一渗余物返回到切向流过滤单元，对第一渗余物进行再循环和过滤，从而获得第二渗透物，任选地收集第二渗透物，并获得第二渗余物，其中步骤iii)中的再循环和进一步过滤进行一次或多次，
iv)将洗脱液添加至第二渗余物以从吸附材料中释放目标蛋白质或其他生物分子，
v)使用切向流过滤单元过滤第二渗余物以获得包含吸附材料的第三渗余物和包含目标蛋白质或其他生物分子的第三渗透物；
vi)收集第三渗透物作为包含蛋白质或其他生物分子的分离的产物组合物。
附图说明
图1示出了根据本发明的装置的示意图(未示出反向冲洗系统)，其包括第一入口1，该第一入口1通过第一流体连接件3与切向流过滤单元5的第一端4流体连接。从第二端7，第二流体连接件8将渗余物引导回到混合罐2，而第三流体连接件9将渗透物引导至第一出口10。
图2示出了类似于图1的，根据本发明的装置的示意图(未示出反向冲洗系统)，但是在图2中包括具有混合罐的实施方案。
图3示出了本发明中实施的切向流过滤的一般概念的示意图，其中待过滤的混合物流过切向流过滤单元5内的过滤器6，由此一部分混合物作为渗余物截留在过滤器6的渗余物侧，混合物的另一部分作为渗透物通过过滤器到达渗透物侧。当接近过滤器时，包括待过滤的初始混合物和已再循环回到切向流过滤单元的任何渗余物的循环流基本上与过滤器表面相切地移动。
图4示出了根据本发明实施方案的装置的示意图，该装置还配备有在第一流体连接件3中的蠕动泵17和由电子控制单元18控制的开-关阀19。
图5示出了根据本发明实施方案的装置的示意图，该设备另外还包括第二流体连接件8中的第一可变流量控制阀20和第三流体连接件9中的第二可变流量控制阀21。电子控制单元18可以控制两个可变流量控制阀和开-关阀19。
图6示出了根据本发明实施方案的装置的示意图，该装置特别适合于频繁地产生脉冲压力增加和/或穿过切向流过滤单元中的过滤器的反向冲洗的事件。该装置还配备有导向渗透物收集罐15的第四流体连接件11。包括离心泵16的第五流体连接件从该罐引导回到过滤器6的渗透物侧。该实施方案还包括将第三流体连接件9与混合罐2连接的第六流体连接件13，例如用于在洗涤步骤期间使用。
图7示出了当设备产生渗透物的脉冲压力增加和/或反向冲洗的频繁事件时，通过切向流过滤单元中的过滤器的渗透物通量较高。当反向冲洗系统关闭时，通量迅速下降，但当系统再次打开时，通量迅速恢复。
图8示出了在280nm处测量的渗透物光密度(OD)作为系统体积的函数(1系统体积＝21L)。图中的箭头表示蛋白质洗脱的起始点，当蛋白质从蛋白质吸附材料中释放时，观察到暂时的OD增加。约190L水用于获得包含精制蛋白质的渗透物的整个过程，并且与初始组合物相比，其OD读数降低了85％。
图9示出了在加载脱脂奶期间采集的渗透物点样品的SDS-PAGE分析。
图10示出了在用水冲洗直至添加洗脱液的点(即图8中箭头所示的点)期间采集的渗透物点样品的SDS-PAGE分析。
图11示出了在用pH 4.5的水洗脱结合蛋白质期间采集的渗透物点样品的SDS-PAGE分析。
下面将更详细地描述本发明。
具体实施方式
定义
在进一步详细讨论本发明之前，首先定义以下术语和惯例：
吸附材料
在本文中，术语“吸附材料”是指能够附着至特定化合物或化合物组(例如蛋白质或其他生物分子)的材料。吸附材料也可称为吸附剂。
吸附剂
在本文中，术语“吸附剂”是指能够与特定化合物或化合物组相互作用的材料，从而可逆地附着至材料的表面。例如，吸附剂可包含能够与特定化合物相互作用的配体，例如但不限于：离子交换配体、疏水配体、亲和吸附配体和混合模式配体。吸附剂可以是基本上不可渗透的，由此只有外表面可用于与化合物相互作用，或者它可以是多孔的的，具有足够大的孔以允许化合物扩散到吸附剂的内表面中并与内表面相互作用。
或者，吸附剂可包含固定化酶，该固定化酶通过可逆吸附、物理截留或通过共价化学键合结合至蛋白质吸附材料，并用于组合物中存在的化合物的酶促修饰，例如但不限于通过固定化蛋白酶将组合物中蛋白质的受控水解转化为肽，或修饰碳水化合物，例如多糖。
洗脱液
在本文中，术语“洗脱液”是指能够释放附着于吸附材料的化合物的液体物质或组合物。
循环流
在本文中，术语“循环流”是指在第一端进入切向流过滤单元并作为渗余物从第二端离开切向流过滤单元的组合物、混合物、液体、流体或悬浮液的部分的流，其循环回到第一端，如通过混合罐。
切向流过滤单元
在本文中，术语“切向流过滤单元”或错流过滤单元是指其中过滤器表面与待过滤的组合物的流动方向相切的过滤设备。
过滤器
在本文中，术语“过滤器”是指可用于分离组合物的组分的过滤器或膜。
通量
在本文中，术语“通量”或“通量速率”是指每小时通过一平方米过滤面积的液体体积。本领域使用的单位是LMH(即L/m2/h)。
标称孔径
在本文中，术语“标称孔径”涉及过滤器的孔径，在该孔径下，大于该孔径的的组分的最小百分比应被过滤器保留。例如，平均孔径为X的过滤器的标称孔径为60％，被认为保留了至少60％的大于X的颗粒。
渗余物
在本文中，术语“渗余物”涉及已通过过滤器的组合物。因此，渗余物是被过滤器保留的过滤组合物的一部分(即保留在过滤器的渗余物侧，见图3)。
渗透物
在本文中，术语“渗透物”涉及已通过过滤器的组合物。因此，渗透物是经过过滤器的过滤组合物的一部分(即，穿过过滤器到达过滤器的渗透物侧，见图3)。
反向冲洗在本文中，术语“反向冲洗”涉及其中逆转通过过滤器的组合物的流动的事件。
渗透物的脉冲压力增加和/或反向冲洗
在本文中，术语“渗透物的脉冲压力增加和/或反向冲洗”涉及其中渗透物侧上的压力增加的事件。例如，压力增加可以足够大，使得过滤器的渗余物侧上的压力和渗透物侧上的压力之间的差基本上为零，由此通过过滤器的组合物流动可以被逆转以产生通过过滤器的弱反向冲洗。在另一个实例中，渗透物侧的压力增加远大于渗余物侧的压力，由此施加强烈的反向冲洗。
生物组合物
在本文中，术语“生物组合物”是指从生物来源(如植物、微生物和动物)获得的复杂组合物，并且是液体、悬浮液或混合物。例如，生物组合物可以是奶、乳清、发酵液、植物提取物或血浆。
生物分子
在本文中，术语“生物分子”是指由细胞和活生物体产生的分子。
精制/
在本文中，术语“精制”是指其中将蛋白质或其他生物分子从生物组合物中浓缩、分离、清洁、纯化和/或分离的过程。
分离
在本文中，术语“分离”是指与其他事物分开的事物。更具体地，它可以是已与组合物的其他物种分开的蛋白质，从而获得包含蛋白质的新组合物。
跨膜压力(TMP)
在本文中，术语“跨膜压力”定义为：
TMP＝(进料压力+渗余物压力)/2-渗透物压力。
本发明提供了一种用于精炼生物组合物中包含的蛋白质的装置。
参考图1，本发明的第一方面涉及一种装置，其包括第一入口1和一个或多个第一流体连接件3，该第一流体连接件3将流体从该入口引导至切向流过滤单元5的第一端4，该切向流过滤单元5包括具有标称孔径在1至150μm范围内的过滤器6，并且其中切向流过滤单元5的第二端7具有第二流体连接件8，该第二流体连接件8将渗余物引导回到第一切向流过滤单元；切向流过滤单元5具有第三流体连接件9，该第三流体连接件9将渗透物引导至第一出口10；并且其中该装置包括自动反向冲洗系统，该系统被配置为以每小时1-500次的频率施加渗透物的脉冲压力增加和/或反向冲洗。
图2示出了本发明的一个实施方案，其中第一入口连接到混合罐2，并且所述混合罐2连接到第一流体连接件3。
混合罐2可以是任何合适的材料，并且流体连接件3可以包括一个或多个蠕动泵17。切向流过滤单元5可以配备有任何类型的过滤器6。引导渗透物到出口的第三流体连接件9连接至第一出口10，其引导渗透物以收集在废物罐中或渗透物收集罐中。
第一流体连接件3和任选的混合罐2包括用于5至70体积％的浓度悬浮在含水性液体中的蛋白质或其他生物分子的吸附材料。因此，吸附材料是本发明的装置/系统的一部分。
反向冲洗系统是自动的。因此，在一个实施方案中，系统调节脉冲压力增加和/或反向冲洗的频率和功率，如本领域技术人员公知的。
图4示出了根据本发明实施方案的装置的更详细示意图，其中第一流体连接件3包括蠕动泵17和在第三流体连接件9中由电子控制单元18控制的自动开-关阀19。每当开-关阀关闭时，就可以获得过滤器的渗透物侧的脉冲压力增加。
因此，本发明的一个实施方案涉及本文所述的装置，其中自动反向冲洗系统包括：
-第三流体连接件9中的由电子控制单元18控制的开-关阀19。
根据本发明的实施方案的装置的另一示意图在图5中示出并且涉及一种装置，其中该装置在第二流体连接件8中配备有第一可变流量控制阀20，和在第三流体连接件9中配备有第二可变流量控制阀21；两个阀均由一个或多个电子控制单元18控制。可变流量控制阀可与开-关阀结合使用，以在过滤器的渗透物侧产生特别可控的脉冲压力增加，如获得渗透物的适度反向冲洗。
因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中自动反向冲洗系统包括：
-第二流体连接件8中的第一可变流量控制阀20和第三流体连接件9中的第二可变流量控制阀21，该可变流量控制阀20、21由电子控制单元18控制。
此外，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中自动反向冲洗系统包括：
-第三流体连接件9中的开-关阀19，其由电子控制单元18控制，
-第二流体连接件8中的第一可变流量控制阀20和第三流体连接件9中的第二可变流量控制阀21，该可变流量控制阀20、21由电子控制单元18控制。
图6示出了根据本发明实施方案的装置的特别详细的示意图。渗透物和/或精炼产物组合物可以从出口收集，如在渗透物收集罐中。因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中第一出口10通过第四流体连接件11连接到渗透物收集罐15。相同或另一个电子控制单元18可以控制离心泵16，其通过一个或多个第五流体连接件12连接到至少一个渗透物反冲洗端口。离心泵在启动时使渗透物流体逆转流动，以获得通过过滤器6的渗透物的特别有效的反向冲洗。因此，当离心泵16启动时，第三流体连接件9处的开-关阀19可以关闭，离心泵16输送的液体通过第五流体连接件12进入过滤器6的渗透物侧，使得压力升高。而且，可变流量控制阀可用于在造成渗透物的脉冲压力增加和/或反向冲洗的事件期间获得对过滤器的渗余物侧和渗透物侧之间的压差的更多控制。离心泵16与渗透物罐15流体连接，并且使用在反向冲洗之前已经收集的渗透物来执行反向冲洗。
该装置还可以配备监测器以监测所有流体连接中的流速、温度和压力。定位在第二流体连接件8和/或第三流体连接件9中的可变流量控制阀可结合蠕动泵17的流量调节用于调节流量，从而调节穿过切向流过滤单元5的长度和穿过过滤器6的壁(从渗余物侧到渗透物侧)的从第一端4到第二端7的背压降。
因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中自动反向冲洗系统包括：
-第四流体连接件11，其将渗透物从第一出口10引导至渗透物收集罐15，
-第五流体连接件12，其将渗透物收集罐15连接到过滤器6的渗透物侧，以及
-插入第五流体连接件12中的离心泵16，并且该离心泵也由电子控制单元18控制。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中自动反向冲洗系统包括：
-第三流体连接件9中的开关阀19，其由电子控制单元18控制，
-第二流体连接件8中的第一可变流量控制阀20和第三流体连接件9中的第二可变流量控制阀21，该可变流量控制阀20、21由电子控制单元18控制，
-第四流体连接件11，其将渗透物从第一出口10引导至渗透物收集罐15，
-第五流体连接件12，其将渗透物收集罐15连接到过滤器6的渗透物侧，以及
-插入第五流体连接件12中的离心泵16，并且该离心泵也由电子控制单元18控制。
反向冲洗系统施加渗透物的脉冲压力增加和/或反向冲洗。渗透物的增加的压力和/或反向冲洗有助于释放可能已经堆积的任何材料，如已经形成流量减少层/膜的材料或已经沉积在过滤器6中和过滤器6上的材料。材料的释放允许循环流从过滤器6中去除所述材料。材料的去除导致过滤器更清洁，渗透物的吞吐量(通量)增加。在本文中，过滤器6中和过滤器6上的材料的沉积或堆积也通过使用术语“结垢”来指代。
反向冲洗系统自动运行并且优选地由电子控制单元18控制。在一个实施方案中，电子控制单元18本身能够确定反向冲洗系统所需的运行频率，使得渗透物通过过滤器6的流速被优化以提高收集产物的速率。运行频率可能非常高，每次执行的运行持续时间很短。因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中渗透物的脉冲压力增加和/或反向冲洗具有0.05至150秒之间的脉冲持续时间。
本发明的一个实施方案涉及该装置，其中在运行期间施加反向冲洗的频率为每小时至少1次，如每小时至少2次，如每小时至少4次，如每小时至少6次，如每小时至少8次，如每小时至少10次，如每小时至少12次，如每小时至少15次，如每小时至少20次，如每小时至少30次，如每小时至少40次，如每小时至少50次，如每小时至少60次。本发明的另一个实施方案涉及本文所述的装置，其中反向冲洗的频率在每小时2-400次的范围内，如在每小时2-300次的范围内，如在每小时2-200次的范围内，如在每小时2-150次的范围内，如在每小时2-100次的范围内，如在每小时2-80次的范围内，如在每小时2-60次的范围内，如在每小时3-60次的范围内，如在每小时4-60次的范围内，如在每小时5-60次的范围内，如在每小时6-60次的范围内，如在每小时6-50次的范围内，如在每小时6-40次的范围内，如在每小时6-30次的范围内。
本发明的又一实施方案涉及如本文所述的装置，其中脉冲持续时间在0.05至150秒的范围内，如在0.1至120秒的范围内，如在0.2至100秒的范围内，如在0.3至80秒的范围内，如在0.3至60秒的范围内，如在0.4至50秒的范围内，如在0.5至40秒的范围内，如在0.5至30秒的范围内，如在0.5至25秒的范围内，如在0.5至20秒的范围内，如在0.5至15秒的范围内，如在0.5至10秒的范围内，如在0.5至8秒的范围内，如在0.5至6秒的范围内，如在0.5至5秒的范围内，如在1.0至5秒的范围内。
本发明的更具体的实施方案涉及如本文所述的装置，其中反向冲洗的频率为每小时2-60次，并且脉冲持续时间在0.5秒至30秒的范围内，如在0.5至15秒的范围内，如在0.5至8秒的范围内，如在0.5至5秒的范围内。然而，本发明的另一个具体实施方案涉及本文所述的装置，其中反向冲洗的频率为每小时6-30次，并且脉冲持续时间在0.5至30秒的范围内，如在0.5至15秒的范围内，如在0.5至8秒的范围内，如在0.5至5秒的范围内。
在装置运行期间，过滤器的渗透侧和渗余侧之间的压差(P渗透-P滞留)将为负。然而，在反向冲洗事件期间，渗透物侧的压力增加，使得压差减小至零或变为正。当压差为正时，液体可以从渗透物侧穿过过滤器并进入渗余物侧，由此释放由于结垢而产生的的过滤器上的材料。然而，当压差为零时，实际上将没有液体从渗余物侧到渗透物侧。因此，本发明的发明人惊讶地发现，即使当一些或全部反向冲洗事件以零压差执行时，反向冲洗仍可有效地清洁过滤器。这种零压力反向冲洗事件被认为是有利的，因为没有或很少有液体返回到过滤器的渗余物侧并且特别温和并且增加了过滤器的寿命和生产率。自动反向冲洗系统能够自行启动适度的渗透物的脉冲压力增加和/或反向冲洗，其结合电子测量系统确定何时启动和控制每个脉冲的功率，因此被认为特别适用于复杂生物组合物的过滤。
因此，本发明的特定实施方案涉及如本文所述的装置，其中反向冲洗事件期间的压差可被控制为零(如通过关闭开-关阀19)。本发明的另一个特定实施方案涉及如本文所述的装置，其中5-100％，如10-100％，如20-100％，如30-100％，如40-100％，如50-100％的反向冲洗事件是在零反向冲洗压差的情况下操作的。
然而，对于其他应用，人们发现施加正的反向冲洗压差以实现有吸引力的单位整体过滤通量很重要。本发明的又一特定实施方案涉及如本文所述的装置，其中在反向冲洗事件期间的压差可被控制在0.01-20巴的范围内，如0.05-10巴，如0.1-8.0巴，如0.1-6.0巴，如0.1-5.0巴，如0.1-4.0巴，如0.1-3.0巴，如0.2-3.0巴，如0.3-3.0巴，如0.4-3.0巴，如0.5-2.5巴。
泵
本发明可以提供一种对吸附材料温和的装置，由此可以逐渐地使用相同的材料并且作为装置的整体部分保留。因此，装置中的一些部件，例如任何泵，可以选择以对蛋白质吸附材料造成最小的磨损。因此，本发明的一个值得注意的实施方案涉及如本文所述的装置，其中该装置包括被包括在一个或多个第一流体连接件3和/或第二流体连接件8中的一个或多个泵，所述一个或多个泵是被配置为在使用时向吸附材料施加低剪切力。本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中所述一个或多个泵是正排量泵。本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中正排量泵是低剪切泵。此外，在这方面，泵可以是选自由叶片泵、活塞泵、螺杆泵(progressing cavity pump)、螺旋泵(screw pump)和蠕动泵组成的组的单转子低剪切泵；或者选自由包括齿轮泵、凸轮泵、周向活塞泵和螺杆泵的多转子低剪切泵组成的组。因此，本发明的实施方案涉及如本文所述的装置，其中正排量泵选自由叶片泵、活塞泵、螺杆泵、螺旋泵、齿轮泵、凸轮泵、周向活塞泵、螺旋泵和蠕动泵组成的组，优选蠕动泵。
在本发明的实施方案中，包括在一个或多个第一流体连接件3和/或第二流体连接件8中的泵是正排量泵，其在使用时向蛋白质吸附材料施加低剪切力。这被认为是本发明的重要实施方案，因为当使用时，该装置使相同的吸附材料在流体连接件(以及任选的混合罐2)和过滤器6的渗余物侧周围循环。由泵、所述流体连接件和其他部件施加的低剪切力延长了吸附材料的使用寿命。因此，根据本发明的设备的使用被认为是特别具有成本效益且环境友好的。
低剪切力应理解为相同的吸附材料在混合罐和过滤器的渗余物侧之间的流体连接件和部件中循环至少50轮，如至少500轮，如至少1000轮，如至少5000轮，如至少10000轮，和/或吸附材料的每个颗粒可吸附分子多于50次，如500次，如1000次，如5000次，如10000次而不降解，即至少90％的吸附材料从一开始就在吸附材料的尺寸范围内。
过滤器
过滤器孔径
通过应用具有增加的孔隙率的过滤器类型，允许一部分材料穿过过滤器进入渗透物，可以减少过滤器结垢的趋势。孔径的增加还可以提高通量率，从而实现更快、更具成本效益的过程。此外，本发明的发明人令人惊讶地发现，通过减少过滤器的结垢，反向冲洗系统施加合适的反向冲洗以在运行期间保持高通量的能力得到强烈增强。
因此，过滤器的标称孔径应尽可能大，但仍保留吸附材料。本发明的一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中过滤器具有大于1μm的标称孔径。本发明的一个具体实施方案涉及如本文所述的装置，其中过滤器具有在1.5至80μm范围内的标称孔径。然而，本发明的一个更具体的实施方案涉及如本文所述的装置，其中过滤器具有在1.5至80μm范围内，如2至60μm，如3至50μm，如3至30μm的标称孔径。过滤器还可以具有5至50μm、如7至40μm、优选10至30μm的标称孔径。然而，对于其中原材料含有较大不溶性颗粒的一些应用，过滤器具有大的标称孔径。因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中过滤器具有在20至300μm范围内，如30至250μm，如30至200μm，如40至200μm，如50至200μm的标称孔径。
过滤系统
本发明的一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中切向流过滤单元5是管式过滤系统或盒式过滤系统。切向流过滤单元应配备提供高渗透物通量的过滤器，如由于过滤器标称孔径在微米范围内或由于自动反向冲洗系统有效防止结垢。因此，过滤器可归类为高通量过滤器(或膜)，并安装反向冲洗系统以确保过滤器的最佳性能，从而提高系统的效率。
因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中过滤器6是高通量过滤器，当TMP为约0.1-0.9巴时，其净水(clean water)渗透物通量大于1000L/m2/h。更具体地，本申请的实施方案涉及如本文所述的装置，其中过滤器6是高通量过滤器，在约0.1-0.9巴的TMP下，其净水渗透物通量大于1000L/m2/h，如大于2000L/m2/h，如大于3000L/m2/h，如大于4000L/m2/h，如大于6000L/m2/h。这些数字以每小时通过一平方米过滤器(m2)的净水量(L)表示。本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中当TMP为0.5巴±0.1巴时，过滤器6具有大于1000L/m2/h的净水渗透物通量。本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中当TMP为0.5巴±0.1巴时，过滤器6具有大于2000L/m2/h的净水渗透物通量。此外，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中当TMP为0.5巴±0.1巴时，过滤器6具有大于3000L/m2/h的净水渗透物通量。另外，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中当TMP为0.5巴±0.1巴时，过滤器6具有大于4000L/m2/h的净水渗透通量。然而，本发明的一个重要实施方案涉及如本文所述的装置，其中当TMP为0.5巴±0.1巴时，过滤器6具有大于6000L/m2/h的净水渗透物通量。在一些实施方案中，TMP的不确定性可以小至0.05巴、0.01巴、或甚至0.001巴。
切向流过滤器可以由适合于应用于水溶液中的过滤装置的任何材料制成。因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中过滤器6由选自由多孔无机材料、多孔有机聚合物及其混合物组成的组的过滤材料制成。
根据本发明的过滤器可以通过适合于产生高通量过滤器的方法来制备，例如用于产生高孔隙率过滤器的方法。因此，本发明的一个具体实施方案涉及如本文所述的装置，其中过滤材料已被熔喷、纺丝、编织、烧结或铸造以产生过滤器6的目标孔隙率。
过滤器及过滤装置
过滤器由多孔无机材料和/或多孔有机聚合物材料制成。因此，本发明的一个具体实施方案涉及如本文所述的装置，其中过滤器6由选自由烧结金属、烧结金属粉末、烧结金属线及其层、烧结金属氧化物、烧结陶瓷、多孔玻璃、聚丙烯、聚乙烯、纤维素、醋酸纤维素、人造丝、聚砜(PSU)、聚醚砜(PES)、聚芳醚砜(PAES)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚酰胺、尼龙、聚酯、表面改性PES、表面改性PTFE及其混合物组成的组的过滤材料制成。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中过滤材料是多孔烧结不锈钢颗粒或多孔烧结不锈钢网。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中过滤器由选自由聚丙烯、聚乙烯、纤维素、醋酸纤维素、人造丝、聚砜(PSU)、聚醚砜(PES)、聚芳醚砜(PAES)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚酰胺、尼龙、聚酯、表面改性PES、表面改性PTFE及其的混合物组成的组的多孔有机聚合物材料制成。
本发明的另一个具体实施方案涉及如本文所述的装置，其中过滤器是聚丙烯过滤器。本发明的另一个具体实施方案涉及如本文所述的装置，其中过滤器是聚乙烯过滤器。本发明的又一个特定实施方案涉及如本文所述的装置，其中过滤器是聚酰胺过滤器，如尼龙过滤器。本发明的另一个特定实施方案涉及如本文所述的装置，其中过滤器是熔喷聚丙烯过滤器。
根据本发明的过滤器可以具有多种形状和形式。特别相关的是设计用于错流过滤的过滤器，其中渗余物液体以垂直于滤液/渗透物流方向的方向通过过滤表面。错流过滤装置通常也称为切向流过滤装置，与液体直接穿过过滤表面的终端过滤装置相反。错流过滤装置可以是中空纤维、管状或圆柱形的形式，并且它们可以是平板、盘或板的形式。平板错流膜可以是螺旋卷绕的，或者可以与每个膜层之间的间隔件(spacer)堆叠。错流过滤器还可被设计为通过振动、摇动、旋转或自旋的最大通量和通量稳定。在本发明的一个实施方案中，过滤单元被设计成在过滤过程的运行期间施加反向冲洗。而且，过滤器和过滤装置可以被设计用于卫生运行，使得能够在运行之前和之后有效地清洁系统。
本发明的一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中过滤器6是中空纤维过滤器、管状或圆柱形、或平板过滤器。
在涉及如本文所述的装置的本发明的一个特定实施方案中，过滤器6是中空纤维过滤器或者管状或圆柱形过滤器。本发明的另一个特定实施方案涉及如本文所述的装置，其中过滤器6是螺旋卷绕平板过滤器或堆叠平板过滤器。
由于它们在运行过程中被吸附剂堵塞的倾向令人惊奇地较低，以及它们对反冲洗和反脉冲的稳定性，特别优选过滤器是中空纤维或管状或圆柱形过滤器。
当过滤器是管状中空纤维过滤器或圆柱形中空纤维过滤器时，过滤器的内径应在2-80mm的范围内。因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中中空纤维过滤器的内径在2-80mm的范围内，如3-50mm、4-50mm，如4-40mm，如5-40mm，如5-35mm，如6-35mm，如6-30mm，如6-25mm，如6-20mm，如6-15mm，如6-12mm。然而，本发明的一个具体实施方案涉及如本文所述的装置，其中过滤器6是内径在6-12mm范围内的管状中空纤维过滤器。
本发明的另一个先进实施方案涉及如本文所述的装置，其中中空纤维过滤器是管状且盘绕外径在3-40cm范围内，如4-35cm，如5-30cm，如7-25cm，如10-20cm的盘管。
本发明的又一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中过滤器6是管状中空纤维过滤器，其内径在6-12mm范围内，并且从入口到渗余物出口的液体路径的长度在25-100cm的范围内，如在30-90cm的范围内，如在35-80cm的范围内，如在35-70cm的范围内。本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中过滤器6是管状中空纤维过滤器，其内径在3-6mm范围内，并且从入口到渗余物出口的液体路径的长度在5-30cm的范围内，例如在5-25cm的范围内，如在5-20cm的范围内。
当过滤器是螺旋卷绕平板过滤器或在平板之间具有间隔件的堆叠平板过滤器时，间隔件厚度可以在2-50mm的范围内。然而，当采用高吸附剂浓度时，间隔件厚度对于降低平板膜系统中切向流流体路径堵塞的风险至关重要。因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中平板过滤器在平板之间具有间隔件，并且间隔件的厚度为2-50mm，如3-50mm，如4-50mm，如5-50mm，如6-50mm，如7-50mm，如8-50mm，如10-50mm。
在本发明的一个特定实施方案中，过滤器是在运行期间振动或摇动的平板盒。
此外，对于一些应用，过滤器可以是深度过滤器，其中过滤器板片和中空纤维是厚的。因此，本发明的一个具体实施方案涉及如本文所述的装置，其中过滤器6是壁厚为1-50mm的深度过滤器。在本发明的一个更具体的实施方案中，过滤器6是深度过滤器，其壁厚为1-40mm，如1-30mm，如1-20mm，如1.5-20mm，如2-20mm，如3-20mm，如3-15mm，如3-10mm，如4-20mm，如5-20mm，如6-20mm，如8-20mm。
当循环流中蛋白质吸附材料的浓度高时，从切向流过滤单元的入口到渗余物出口的液体路径的长度被认为是重要的。因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中从切向流过滤单元5的第一端4到第二端7的液体路径的长度在10-150cm的范围内，如在15-120cm的范围内，如在20-110cm的范围内，如在25-100cm的范围内，如在30-90cm的范围内，如在35-80cm的范围内，如在35-70cm的范围内。
吸附材料
本发明的一个方面涉及如本文所述的装置，其中该装置包括用于蛋白质或其他生物分子的吸附材料。吸附材料优选是蛋白质吸附材料。本发明的一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中吸附材料具有的粒度分布使得90体积％的颗粒具有在10-1000μm范围内的直径。本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中吸附材料具有的粒度分布使得90体积％的颗粒具有在10-1000μm范围内的直径，如在10-700μm的范围内，如在10-500μm的范围内，如在10-400μm的范围内，如在10-300μm的范围内，如在10-250μm的范围内，这样如在10-200μm的范围内，如在10-150μm的范围内，如在10-100μm的范围内，如在10-80μm的范围内，如在10-70μm的范围内，如在10-60μm的范围内，如在10-50μm的范围内，如在10-40μm的范围内。然而，对于某些应用，采用较大颗粒尺寸的吸附材料可能是有利的。因此，本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中吸附材料具有的粒度分布使得90体积％的颗粒具有在30-1000μm的范围内的直径，如在30-700μm的范围内，如在30-500μm的范围内，如在30-400μm的范围内，如在30-300μm的范围内，如在30-250μm的范围内，如在30-200μm的范围内，如在30-150μm的范围内，如在30-100μm的范围内，如在30-90μm的范围内，如在30-70μm的范围内；然而，粒度分布也可以在40-250μm的范围内，如在50-250μm的范围内，如在50-200μm的范围内，如在50-150μm的范围内。
在本发明的又一个实施方案中，吸附材料是高度多孔的，以便允许分子迁移并结合至存在于颗粒体积内部的材料表面。因此，在本发明的一个实施方案中，吸附材料是多孔的，并且其中至少90％、如95％、如98％以及优选至少99％具有10nm的孔径下限和200nm的孔径上限。因此，10至200nm之间的孔径应理解为是指所有孔的至少90％、例如95％、例如98％以及优选至少99％具有10至200nm之间的孔径。孔具有20nm的孔径下限和150nm、优选100nm的孔径上限，更优选孔具有30nm的孔径下限和100nm、优选75nm的孔径上限。使用压汞法通过孔隙率测定法方便地测定孔径。
在这方面，多孔吸附材料是这样的材料，其中孔隙率(定义为直径小于150nm的所有孔的总孔体积)在0.5ml/g与1.5ml/g之间，如在0.7-1.1ml/g的范围内。对于本发明，孔隙率也是通过压汞法测定的。
为了使生物组合物的蛋白质或其他生物分子附着至吸附材料，所述材料应当具有能够与蛋白质分子或其他生物分子有效相互作用的表面特性。吸附材料的基础材料可以在形成吸附材料颗粒时具有已经存在的合适的结合位点(配体)，或者可以在初始形成之后将配体引入并共价偶联至颗粒材料。
所使用的吸附材料的类型取决于待从生物组合物中分离的蛋白质或其他生物分子的性质。吸附材料应优选附着至目标蛋白或其他生物分子以形成缀合物样结构(如通过吸附)。缀合物在循环流中携带蛋白质或其他生物分子，使得吸附材料和生物分子(例如蛋白质)的结合物多次经过过滤器的渗余物侧，每次都允许循环流中的杂质通过过滤器到渗透物侧并进入废物罐或渗透物收集罐。可以通过使用安装的洗涤系统将一种或多种洗涤液施加到循环流来进一步清洁和分离吸附材料和生物分子的缀合物。每当达到所需的浓度和纯度时，就会将洗脱液添加到循环流中，从而将目标蛋白质或其他生物分子从吸附材料中释放出来。然后，包含目标蛋白质或其他生物分子的液体组合物穿过过滤器到达渗透物侧，然后可以从出口收集或收集在渗透物收集罐中。
该装置可用于升级大范围的生物组合物和/或通常包含在其中的蛋白质的浓缩和纯化。本发明的一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中吸附材料能够吸附生物组合物的一种或多种蛋白质或其他生物分子，所述生物组合物选自由哺乳动物奶或乳清、如奶、绵羊奶、山羊奶或骆驼奶、乳清、牛血浆、猪血浆、人血浆、蛋清、蛋黄、发酵液、转基因微生物发酵液、哺乳动物细胞培养物发酵液、动物组织提取物、植物组织提取物、藻类提取物、马铃薯块茎提取物和豆类提取物组成的组。
本发明的另一个先进实施方案涉及如本文所述的装置，其中吸附材料能够吸附生物组合物的一种或多种蛋白质或其他生物分子，所述生物组合物是：
-牛奶、绵羊奶、山羊奶、或骆驼奶或乳清或其衍生物，其包含至少一种选自由乳铁蛋白、免疫球蛋白G、α-乳清蛋白和β-乳清蛋白组成的组的所述蛋白质，或
-牛、猪或人血浆或其衍生物，其包含至少一种选自由白蛋白、转铁蛋白、免疫球蛋白G、免疫球蛋白A、α-1-抗胰蛋白酶和因子VIII组成的组的所述蛋白质，或
-蛋清或蛋黄或其衍生物或其混合物，其包含至少一种选自由卵清蛋白、溶菌酶、免疫球蛋白Y、卵类粘蛋白、卵转铁蛋白和抗生物素蛋白组成的组的所述蛋白质，或
-植物组织、马铃薯或豆类提取物，其包含至少一种选自由马铃薯糖蛋白、蛋白酶抑制剂、豆球蛋白、豌豆球蛋白、肽、类黄酮、多酚、碳水化合物、多糖、维生素、植物甾醇和配糖生物碱组成的组的所述蛋白质或其他生物分子，或
-转基因微生物的发酵液或其衍生物，其包含至少一种选自由以下组成的组的所述蛋白质：奶酪凝乳酶，如牛凝乳酶、骆驼凝乳酶；酶，如淀粉酶、脂肪酶、花粉酶(pollunase)、果胶酶、木聚糖酶(xylases)、漆酶、转谷氨酰胺酶、植酸酶、蛋白酶、氧化还原酶、纤维素酶、壳多糖酶；用于食品/饲料配方中胶凝、乳化或发泡的功能性蛋白质，如二磷酸核酮糖羧化酶、马铃薯糖蛋白、豆球蛋白、豌豆球蛋白、蛋白酶抑制剂、β-乳球蛋白、α-乳清蛋白、卵清蛋白、白蛋白；具有抗菌活性的蛋白质或肽，如乳铁蛋白、转铁蛋白、卵转铁蛋白、乳过氧化物酶、溶菌酶、抗生物素蛋白、烟酸(nicin))；甜味蛋白质或肽，如奇异果甜蛋白、布拉泽因(brazzein)、仙茅甜蛋白、马槟榔甜蛋白、应乐果甜蛋白、潘塔亭(pentadin)，抗冻蛋白质，包括但不限于来自植物、鱼或其他海洋动物的抗冻蛋白质，以及此类蛋白质的任何修饰和/或工程形式。
在涉及本文所述的装置的本发明的实施方案中，吸附材料是无机吸附材料或聚合物吸附材料或其复合材料。
吸附材料可以包括本身已知适用于基于吸附的蛋白质或其他生物分子分离的任何天然或合成以及有机或无机材料作为骨架，例如，天然或合成的多糖，如琼脂和琼脂糖；纤维素、纤维素醚，如羟丙基纤维素、羧甲基纤维素；淀粉；树胶，如瓜尔胶、阿拉伯树胶、印度树胶(gum ghatti)、黄芪胶、刺槐豆胶、黄原胶；果胶；粘蛋白；葡萄聚糖；壳多糖；壳聚糖；藻朊酸盐；角叉菜胶；肝素；明胶；合成聚合物，如聚酰胺，如聚丙烯酰胺和聚甲基丙烯酰胺(polymethacrylamide)；聚酰亚胺；聚酯；聚醚；聚合乙烯基化合物，例如聚乙烯醇和聚苯乙烯；聚烯烃；无机材料，如硅质材料，如二氧化硅(silicon dioxide)，包括无定形二氧化硅(silica)和石英；二氧化硅(silicas)；金属硅酸盐、可控孔玻璃和陶瓷；金属氧化物和硫化物，或这些天然或合成和有机或无机材料的组合。
本发明的一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中吸附材料是聚合物吸附材料，其包含选自由以下组成的组的一种或多种聚合物：天然多糖、琼脂、琼脂糖、葡萄聚糖、纤维素、纤维素醚、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、淀粉、树胶、瓜尔胶、阿拉伯树胶、印度树胶、黄芪胶、刺槐豆胶、黄原胶、果胶、粘蛋白、壳多糖、壳聚糖、藻朊酸盐、角叉菜胶、肝素、明胶、合成聚合物、聚酰胺、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚酰亚胺、聚丙烯酸酯、聚合乙烯基、聚苯乙烯、聚烯烃、聚乙烯醇、聚酯、聚醚、硅质材料、二氧化硅(silicon dioxide)、无定形二氧化硅(silica)、石英、二氧化硅(silica)、金属硅酸盐、可控孔玻璃、陶瓷、金属氧化物、硫化物和其复合材料。
作为吸附材料的基质骨架的特别有趣的材料是例如琼脂或琼脂糖珠，如美国Cytiva的Sepharose和Superose珠、西班牙ABT的Agarose Beads和美国Biorad的Biogel A；葡聚糖基珠，如美国Cytiva的Sephadex；纤维素基珠和膜，如捷克共和国Perloza纤维素，复合材料珠，如美国Cytiva的Sephacryl和Superdex；合成有机聚合物珠，如美国Toso-Haas的Fractogel。
因此，本发明的一个具体实施方案涉及如本文所述的装置，其中吸附材料是聚合物吸附材料，其包含选自由天然多糖、琼脂、琼脂糖、葡萄聚糖、纤维素、合成聚合物及其复合材料组成的组的一种或多种聚合物。
本发明的一个具体实施方案涉及如本文所述的装置，其中合成聚合物选自由聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚(烯丙胺)、聚(烯丙醇)、聚(乙烯胺)、聚(乙烯醇)、及其复合材料组成的组。
通常，吸附相可以是例如不规则颗粒、纤维或球形珠的形式。固相材料还可对蛋白质和其他生物分子完全或部分可渗透或完全不可渗透。本发明的一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中蛋白质吸附材料是珠、小球、微粒、纤维或颗粒的形式。
而且，吸附材料应当优选地抗剪切力，使得吸附材料不会降解成具有允许材料通过过滤器的直径的实体。因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中吸附材料抗剪切力。此外，选择本发明的吸附材料使得该材料抗剪切力，同时还具有多孔结构。因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中吸附材料是多孔吸附材料。
吸附材料可被设计成在一系列不同的可逆吸附程序(如离子交换层析和生物特异性亲和层析，如免疫吸附和蛋白A层析，以及基团特异性亲和层析，如疏水层析、亲硫层析、混合模式层析、染料层析、凝集素层析和金属螯合层析)中执行蛋白质和其他生物分子的分离和离析。
吸附材料可通过用作吸附材料骨架的吸附材料与任何化合物反应而获得，该化合物在反应后提供具有相互作用的配体的吸附材料，该吸附材料例如可与待与生物组合物分离的目标蛋白或其他生物分子结合。
这种相互作用例如是共价连接至吸附材料或作为吸附材料的天然组成部分的带负电或带正电基团的存在。取决于介质中的pH，可以形成带负电基团的基团的实例是羧酸、磺酸和膦酸。取决于介质中的pH，可以形成带正电基团的基团的实例是伯胺、仲胺、叔胺如二乙氨乙基-基团(DEAE)和季胺如二乙基-(2-羟丙基)氨基乙基-基团(QAE)。这些带电吸附材料可广泛用于通过离子交换层析法分离和离析蛋白质和其他生物分子。
因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中吸附材料包括选自由离子交换配体、亲和吸附配体和混合模式配体组成的组的一种或多种类型的配体。更具体地，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中蛋白质吸附材料是亲和吸附材料。在这方面，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中吸附材料是选自由金属螯合物吸附材料、疏水相互作用吸附材料、亲硫相互作用吸附材料、混合模式相互作用材料、蛋白A吸附材料和固定化抗体吸附材料组成的组的亲和吸附材料。
例如，如果材料表面具有疏水基团如苯基，烃如辛基、己基或丁基，则可以实现吸附材料与待分离的蛋白质或其他生物分子之间的疏水相互作用。例如，如果活化材料表面用二乙烯基砜活化并与巯基乙醇或4-羟基-吡啶、3-羟基-吡啶、2-羟基-吡啶偶联，则可以实现亲硫相互作用。例如，如果材料表面具有不带电且疏水的基团，或者带正电或带负电的基团(取决于介质中的pH)，如苄胺；烷基胺，如己基胺和辛基胺；苯甲酸，如巯基苯甲酸和氨基苯甲酸；苯基-烷基羧酸、氨基苯基-烷基羧酸，则可以实现混合模式相互作用。
配体可以通过任何类型的结合连接至吸附材料，要么通过配体和用作吸附材料骨架的吸附材料之间的直接化学反应，要么通过用合适的试剂活化配体，使得可以连接骨架材料和配体。这种合适的活化试剂的实例是环氧氯丙烷、环氧溴丙烷、烯丙基溴、烯丙基缩水甘油醚；双环氧化物，如丁二醇二缩水甘油醚；卤素取代的脂肪族化合物如二氯丙醇、二乙烯基砜；羰基二咪唑；醛，如戊二醛；醌；溴化氰；过碘酸盐，如过碘酸钠；碳二亚胺；氯代三嗪，如三聚氯氰；磺酰氯，如甲苯磺酰氯和三氟乙磺酰氯(tresyl chlorides)；N-羟基琥珀酰亚胺；2-氟-1-甲基吡啶鎓甲苯-4-磺酸盐；恶唑酮类；马来酰亚胺；吡啶基二硫化物；和酰肼。其中，活化试剂留下不同于单键的间隔基团，例如，环氧氯丙烷、环氧溴丙烷、烯丙基缩水甘油醚；双环氧化物；卤素取代的脂肪族化合物；二乙烯基砜；醛；醌；溴化氰；氯代三嗪；恶唑酮类；马来酰亚胺；吡啶基二硫化物；和酰肼。据信特别令人感兴趣的活化试剂是环氧化合物，如环氧氯丙烷、烯丙基缩水甘油醚和丁二醇二缩水甘油醚。本发明的具体实施方案涉及如本文所述的装置，其中蛋白质吸附材料具有通过与选自由环氧氯丙烷、烯丙基缩水甘油醚、苄胺、缩水甘油基三甲基氯化铵，和丁二醇二缩水甘油醚组成的组的试剂反应获得的配体。
吸附材料上的配体浓度可能对材料的结合能力有很大影响。如果配体浓度太低，则每升吸附材料可能仅结合少量蛋白质或其他生物分子。然而，如果配体浓度太高，也可能导致蛋白质或其他生物分子或多或少不可逆结合，这将导致方法的不想要的产物损失和差的经济性能。在本发明的上下文中，结合能力定义为可结合至一升吸附材料的生物分子的量(表示为克干生物分子)，该吸附材料完全水合但通过在烧结多孔玻璃漏斗上抽吸干燥排出间隙水。在涉及如本文所述的装置的本发明的一个实施方案中，蛋白质吸附材料的结合能力在1-250g/L吸附材料范围内，如5-200g/L，如10-200g/L，如20-200g/L，如25-200g/L，如30-200g/L，和如40-200g/L。
最佳配体浓度可以取决于具体应用、生物组合物中蛋白质或其他生物分子的浓度以及其他方法特定参数。在本发明的上下文中，配体浓度定义为以毫摩尔(即10-3摩尔)表示的连接到一升吸附材料的配体的量，该吸附材料完全水合但通过在烧结多孔玻璃漏斗上抽吸干燥排出间隙水。
本发明的一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中吸附材料上的配体浓度在1-3000毫摩尔/L吸附材料的范围内，如10-2500毫摩尔/L，如20-2500毫摩尔/L，如30-2500毫摩尔/L，如40-2500毫摩尔/L，如50-2500毫摩尔/L，如60-2500毫摩尔/L，如80-2500毫摩尔/L，如100-2500毫摩尔/L，如125-2500毫摩尔/L，如150-2500毫摩尔/L，如200-250毫摩尔/L。
对于某些应用，生物分子，例如蛋白质与吸附材料的结合非常牢固，因此配体浓度应在1-300毫摩尔/L范围内。因此，本发明的具体实施方案涉及如本文所述的装置，其中吸附材料上的配体浓度在1-300毫摩尔/L的范围内，如5-250毫摩尔/L，如10-225毫摩尔/L，如20-200毫摩尔/L，如30-180毫摩尔/L，如30-150毫摩尔/L，如30-120毫摩尔/L，如30-100毫摩尔/L，如30-80毫摩尔/L，如30-60毫摩尔/L。然而，特别地，蛋白质吸附材料上的配体浓度可以在如40-150毫摩尔/L、40-120毫摩尔/L、40-100毫摩尔/L、40-80毫摩尔/L的范围内。
在装置的使用过程中，吸附材料通常会暴露于大范围的pH值、刺激性化学品甚至高温。因此，重要的是吸附材料在这种条件下保持稳定，并且不会侵蚀成更小的颗粒、溶解或获得改变的和不期望的多孔结构。例如，吸附材料应当优选地抗剪切力。这种能抵抗且稳定的吸附材料可以通过通常用于稳定色谱吸附剂的方法通过吸附材料骨架的化学交联来获得。因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中吸附材料是交联的。
合适的交联剂的实例是环氧氯丙烷、硼酸、环氧溴丙烷、烯丙基溴、烯丙基缩水甘油醚；双环氧化物，如丁二醇二缩水甘油醚；卤素取代的脂肪族化合物如二氯丙醇、二乙烯基砜、二丙烯酸酯(diacrylates)、二丙烯酰胺如哌嗪二丙烯酰胺、双丙烯酰胺如N，N-亚甲基双丙烯酰胺、及其混合物和衍生物。本发明的一个具体实施方案涉及如本文所述的装置，其中吸附材料已用选自由环氧氯丙烷、丁二醇二缩水甘油醚、二丙烯酸酯、双丙烯酰胺、烯丙基溴、烯丙基缩水甘油醚、硼酸及其混合物和衍生组物成的组的试剂交联。
混合罐、过滤器单元的渗余物侧和使得吸附材料能够再循环的流体连接件构成装置的一些元件，其中在装置的使用期间吸附材料被分配。其中分配有吸附材料的流体的总体积在本文中被定义为“系统体积”。系统体积不是固定的体积，因为混合罐可能被填充到不同的程度，并且在运行过程中也可以调节体积。吸附材料将以一定浓度悬浮在流体中，浓度测量为当悬浮材料样品在3000G下离心5分钟时所达到的填充吸附材料的相对体积，以占总悬浮液样品体积的百分比表示。因此，如果从混合罐中充分混合的悬浮液中取出100ml悬浮吸附材料样品并离心，并且确定吸附材料填充床的体积为33ml，则吸附材料的浓度为33/100×100％＝33％。
系统体积中吸附材料的浓度对于由使用该装置进行的任何生物分子分离过程生产的每kg生物分子(例如蛋白质)的总耗水至关重要。每kg生产的生物分子的总耗水被定义为，在根据本发明的方法的洗涤和洗脱步骤期间，在该方法的一个循环期间，每kg洗脱的生物分子(基于干物质)添加到装置中的水性流体的体积。因此，每kg生产的生物分子的耗水将取决于系统体积中吸附材料的浓度。在低浓度下，耗水量将很高，而在吸附材料的高浓度下，每kg生产的生物分子的耗水将相对较低。
因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中吸附材料悬浮在水性液体中。本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中在第一端4进入切向流过滤单元5并作为渗余物从第二端7离开切向流过滤单元5循并环回到第一端4的循环流，包含浓度在1-70％范围内，如在3-70％的范围内、如在5-70％的范围内、如在7-65％的范围内，如在10-65％的范围内，如在15-65％的范围内，如在20-65％的范围内，如在25-65％的范围内，如在30-65％的范围内，如在35-65％的范围内，并且如在40-65％的范围内的吸附材料。
对于一些应用，在吸附循环的不同步骤期间使用不同浓度的吸附材料可能进一步有利。因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中在将生物物质加载到混合罐期间，吸附材料的浓度在1-30％的范围内，如在3-30％的范围内，如在5-30％的范围内，如在5-25％的范围内，如在7-25％的范围内，并且如在10-25％的范围内。在涉及如本文所述的装置的本发明的另一个实施方案中，在洗涤和/或洗脱期间，吸附材料的浓度在20-70％的范围内，如在25-70％的范围内，如在25-65％的范围内，如在30-65％的范围内，并且如在40-65％的范围内。
吸附材料的结合能力对于用该装置进行的任何生物分子分离过程生产的每kg生物分子的总液体消耗同样至关重要。如果结合能力低，则在根据本发明方法的洗涤和洗脱步骤期间，在该方法的一个循环期间，每kg生物分子(基于干物质计)添加到装置中的水性流体的体积将较高，并且因此，废物处理和该方法的成本可能变得过高。
因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中吸附材料对于待精制的蛋白质或其他生物分子的结合能力为至少5g/L吸附剂，如至少10g/L吸附剂，如至少15g/L，如至少20g/L，如至少25g/L，如至少30g/L，如至少35g/L，如至少40g/L吸附剂，基于干物质计。
在本发明的具体实施方案中，在添加生物组合物之前，吸附材料最初作为水中的悬浮液或其他合适的水溶液存在于第一流体连接件3和/或混合罐中。在这种情况下，然后可通过进料泵逐渐添加(进料)包含目标蛋白质或其他生物分子的生物组合物，同时混合吸附材料并通过切向流过滤单元再循环，并且以基本上等于生物组合物的进料流量的流量取出(排出)第一渗透物，。
以同样的方式，洗涤和洗脱步骤通过连续且同时的进料和排出来进行。在此过程中，吸附类似于经典的填充床过程，并且获得了大量的理论塔板(plate)，从而发生更有效的蛋白质吸附。这与其中仅发生一个平衡的经典的一步分批吸附过程形成鲜明对比。
然而，对于某些应用，一个平衡阶段可能足以满足特定目的，在这种情况下，蛋白质吸附材料和生物组合物的混合可以在一个即时混合步骤中进行，而随后的洗涤和洗脱步骤以连续且同时进料和排出的方式进行。
就每小时每升吸附剂可精制的生物分子的量而言，过滤面积/吸附剂体积影响装置的生产率。如果过滤面积/吸附剂体积的比率相对较低，则生产率会较低，而如果该比率相对较高，则生产率可能会达到最大。
因此，在涉及如本文所述的装置的本发明的一个实施方案中，过滤面积/吸附剂的体积为至少0.01m2/L，如至少0.02m2/L，如至少0.05m2/L，如至少0.08m2/L，如至少0.10m2/L，如至少0.15m2/L，如至少0.20m2/L。
然而，对于一些应用，过滤面积/吸附剂体积也可能变得太大(例如，就过滤器单元的设备和维护成本以及总系统体积而言)，因此，本发明的一个实施方案是过滤面积/吸附剂体积在0.01-0.5m2/L的范围内，如0.01-0.4m2/L，如0.01-0.3m2/L，如0.01-0.2m2/L，或如在0.02-0.4m2/L的范围内，如0.02-0.3m2/L，如0.02-0.2m2/L，或如在0.03-0.4m2/L的范围，如0.03-0.3m2/L，如0.03-0.2m2/L，或如在0.04-0.4m2/L的范围内，如0.04-0.3m2/L，如0.04-0.2m2/L，或如在0.05-0.4m2/L的范围内，如0.05-0.3m2/L，如0.05-0.2m2/L，如0.05-0.15m2/L，如0.05-0.10m2/L。
吸附剂材料的具体实施方案
本发明的一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中吸附剂材料是交联的天然多糖，其粒度分布使得90体积％的颗粒具有在10-1000μm范围内的直径；配体浓度在1-300毫摩尔/L的范围内；配体选自由离子交换配体、疏水配体、亲和吸附配体和混合模式配体组成的组；完全水合的吸附材料中天然多糖的浓度在2-20w％的范围内，基于干物质计；交联的天然多糖选自由琼脂、琼脂糖、葡萄聚糖、纤维素及其复合材料组成的组；交联用选自由环氧氯丙烷、丁二醇二缩水甘油醚、烯丙基溴和烯丙基缩水甘油醚组成的组的试剂进行；吸附材料为颗粒形式。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中吸附材料是交联的天然多糖，其粒度分布使得90体积％的颗粒具有在30-300μm范围内的直径；配体选自由离子交换配体、亲和吸附配体和混合模式配体组成的组；完全水合的吸附材料中天然多糖的浓度在3-12w％的范围内，基于干物质计；交联的天然多糖选自由琼脂、琼脂糖、纤维素及其复合材料组成的组。交联用选自由环氧氯丙烷、丁二醇二缩水甘油醚、烯丙基溴和烯丙基缩水甘油醚组成的组的试剂进行；吸附材料为颗粒形式。
本发明的又一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中吸附材料是交联的合成聚合物，其粒度分布使得90体积％的颗粒的直径在30-300μm范围内；配体选自由离子交换配体、亲和吸附配体和混合模式配体组成的组；完全水合的吸附材料中合成聚合物的浓度在4-25w％的范围内，基于干物质计；交联的合成聚合物为选自由聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚(烯丙胺)、聚(烯丙醇)、聚(乙烯胺)、聚(乙烯醇)及其复合材料组成的组的合成聚合物；交联用选自由二丙烯酸酯、双丙烯酰胺、烯丙基溴、烯丙基缩水甘油醚和硼酸及其混合物和衍生物组成的组的试剂进行；吸附材料为颗粒形式。
附件
本发明装置可构造成包括附加部件，例如：附加混合罐、入口、出口、渗透物收集罐、阀和泵等。因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中该装置包含一个或多个混合罐。然而，混合罐对于本发明的装置不是必需的，并且可以在第一流体连接件3中混合生物组合物和包含吸附材料的液体。本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中该装置包含一个或多个第一入口。本发明的又一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中该装置包含一个或多个第一出口。本发明的又一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中该装置包含一个或多个渗透物收集罐。
本发明的一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中第二流体连接件8配备有如图6示出的热交换器14。热交换器使得能够调节和控制循环流中的温度。温度的控制对于获得良好的混合物粘度和/或增加目标蛋白质或其他生物分子对吸附材料的附着可能很重要。
在本发明的一些实施方案中，例如如图6示出，第三流体连接件9由另外的阀引导，使得所有渗透物通过第六流体连接件13返回到混合罐2，由此系统体积应保持恒定。
洗涤/洗脱/再生
本发明的一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中该装置包含一个或多个用于添加洗涤液的第三入口。可替代地或附加地，该装置可包括洗涤罐，用于容易添加洗涤液并用于降低污染风险。因此，本发明的实施方案涉及如本文所述的装置，其中该装置包含一个或多个洗涤罐。在这方面，该装置还可以包含用于排出洗涤液的出口。因此，本发明的实施方案涉及如本文所述的装置，其中该装置包含一个或多个第三出口以从该装置排出洗涤液。
可以通过使用为此目的而安装的系统添加洗脱液来从吸附材料洗脱目标蛋白质或其他生物分子。因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中该装置包含一个或多个用于添加洗脱液的第四入口。此外，本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中该装置包含一个或多个洗脱罐。可以安装洗脱罐用于容易添加洗脱液并用于降低污染风险。本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中该装置包含一个或多个第四出口以从该装置排出洗脱液。
本发明的装置被设计成使得吸附材料可以使用很长时间而无需更换或在外部再生系统中再生。因此，本发明的装置可以包括再生罐，用于容易添加再生液并用于降低任何污染的风险。因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中该装置包含一个或多个再生罐。在涉及如本文所述的装置的本发明的另一个实施方案中，该装置包含一个或多个用于添加再生液的第二入口。在吸附材料的再生期间或之后，可以通过使用为此目的而安装的出口来排出再生液。因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中该装置包括一个或多个第二出口以从该装置排出再生液。
应当理解，第一、第二、第三和第四入口和出口可以是相同的入口或出口。或者，第一、第二、第三或第四入口或出口中的一个或多个是单独的入口或出口。
洗涤/洗脱/再生液
洗涤液可以是不会降解或以其他方式干扰生物分子-吸附材料缀合物的任何液体。也就是说，对于大多数应用，洗涤液应是基于水的。因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中洗涤液是水或水溶液或缓冲水溶液。在这方面，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中洗涤液包含无机酸或其盐、或有机酸或其盐、或这些的混合物。本发明的一个具体实施方案涉及如本文所述的装置，其中洗涤液包含酸和/或其包含钠或钾的盐。本发明的另一个具体实施方案涉及如本文所述的装置，其中洗涤液包含选自由盐酸、磷酸、硫酸、乙酸、柠檬酸、辛酸、乳酸及其组合组成的组中的一种或多种酸或其盐。本发明的一个替代实施方案涉及如本文所述的装置，其中洗涤液包含清洁剂。然而，本发明的一个最具体实施方案涉及如本文所述的装置，其中洗涤液是食品级的。
使用哪种洗脱液取决于每种特定应用(即特定类型的待精制的目标蛋白质或其他生物分子)所用吸附材料的类型。因此，在第一实施例中，特定目标蛋白质或其他生物分子的分离涉及洗涤液和洗脱液。然而，在以另一种生物分子为目标的第二实施例中，第一实施例的洗涤液可以用作洗脱液，反之第一实施例的洗脱液可以用作洗涤液。因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中洗脱液是水或盐水溶液或缓冲水溶液。在这方面，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的装置，其中洗脱液包含无机酸或其盐，或有机酸或其盐，或这些的混合物。本发明的一个具体实施方案涉及如本文所述的装置，其中洗脱液包含酸和/或其包含钠或钾的盐。本发明的另一个具体实施方案涉及如本文所述的装置，其中洗脱液包含选自由盐酸、磷酸、硫酸、乙酸、柠檬酸、辛酸、乳酸及其组合组成的组中的一种或多种酸和/或其盐。本发明的一个替代实施方案涉及如本文所述的装置，其中洗脱液包含清洁剂。然而，本发明的一个最具体实施方案涉及如本文所述的装置，其中洗脱液是食品级的。
不限于用于吸附材料再生的任何特定液体，本发明的一个特定实施方案涉及如本文所述的装置，其中再生液体是pH值在8至14范围内，如10至14，如12至13的碱性溶液。
方法
本发明的第二方面涉及一种用于分离包含在生物组合物中的蛋白质或其他生物分子的方法，该方法包括以下步骤：
i)将包含目标蛋白质或其他生物分子的生物组合物与包含用于蛋白质或其他生物分子的吸附材料的组合物混合以获得混合物，其中目标蛋白质或其他生物分子由吸附材料承载，
ii)使用切向流过滤单元过滤混合物，切向流过滤单元具有标称孔径在1至150μm范围内的膜，以获得包含目标蛋白质或其他生物分子的第一渗余物和第一渗透物，该第一渗透物任选地收集在废物罐或渗透物收集罐中，
iii)通过将获得的第一渗余物返回到切向流过滤单元，对第一渗余物进行再循环和过滤，从而获得第二渗透物，任选地收集第二渗透物，并获得第二渗余物，其中进行一次或多次步骤iii)中的再循环和进一步过滤，
iv)将洗脱液添加至第二渗余物以从吸附材料中释放目标蛋白质或其他生物分子，
v)使用切向流过滤单元过滤第二渗余物以获得包含吸附材料的第三渗余物和包含目标蛋白质或其他生物分子的第三渗透物；
vi)收集第三渗透物作为包含蛋白质或其他生物分子的分离的产物组合物。
本发明的一个具体实施方案涉及如本文所述的方法，其中切向流过滤单元中的过滤器的渗余物侧和渗透物侧之间的压差被均衡或反转，导致获得收集的第一渗透物的脉冲压力增加和/或反向冲洗，在步骤ii)至iv)中的一个或多个的过程中，至少引入一次所述压差。
本发明的另一个具体实施方案涉及如本文所述的方法，其中第一渗透物和第二渗透物作为产物组合物收集。
本发明的一个实施方案涉及本文所述的方法，其中该方法使用本文所述的装置进行。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的方法，其中该方法包括通过添加洗涤液来洗涤第一渗余物和第二渗余物的步骤。
本发明的一个特定实施方案涉及如本文所述的方法，其中频繁事件是自动的并且由一个或多个电子控制单元控制。本发明的又一个实施方案涉及如本文所述的方法，其中脉冲压力增加和/或反向冲洗事件以每小时1-500次，如在每小时2-400次的范围内，如在每小时2-300次的范围内，如在每小时2-200次的范围内，如在每小时2-150次的范围内，如在每小时2-100次的范围内，例如在每小时2-80次的范围内，如在每小时2-60次的范围内，如在每小时3-60次的范围内，如在每小时4-60次的范围内，如例如在每小时5-60次的范围内，如在每小时6-60次的范围内，如在每小时6-50次的范围内，如在每小时6-40次的范围内，如在每小时6-30次的频率进行。另外，本发明的另一个实施方案涉及本文所述的方法，其中脉冲压力增加和/或反向冲洗的脉冲持续时间在0.01至200秒的范围内，如在0.05至150秒的范围内，如在0.1至120秒的范围内，如在0.2至100秒的范围内，如在0.3至80秒的范围内，如在0.3至60秒的范围内，如在0.4至50秒的范围内，如在0.5至40秒的范围内，如在0.5至30秒的范围内，如在0.5至25秒的范围内，如在0.5至20秒的范围内，如在0.5至15秒的范围内，如在0.5至10秒的范围内，如在0.5至8秒的范围内，如在0.5至6秒的范围内，如在0.5秒至5秒的范围内，如在1.0至5秒的范围内。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的方法，其中该方法包括通过将再生液添加到第三渗余物中来再生吸附材料的步骤。
可替代的方面
本发明的第一替代实施方案涉及一种装置，其包括通向混合罐2的第一入口1，混合罐2包含以5-70体积％的浓度悬浮在水性液体中的吸附材料，所述混合罐具有一个或多个第一流体连接件3，该第一流体连接件3连接至切向流过滤单元5的第一端4，切向流过滤单元5包括具有标称孔径在1至150μm范围内的过滤器6，并且其中切向流过滤单元5的第二端7具有第二流体连接件8，该第二流体连接件8将渗余物引导回到混合罐2；切向流过滤单元5具有第三流体连接件9，该第三流体连接件9将渗透物引导至第一出口10；并且其中该装置包含自动反向冲洗系统，该系统被配置为以每小时1-500次的频率施加渗透物的脉冲压力增加和/或反向冲洗。
本发明的第二替代实施方案涉及一种装置，其包括通向混合罐2的第一入口1，混合罐2具有一个或多个第一流体连接件3，该第一流体连接件3连接至切向流过滤单元5的第一端4，切向流过滤单元5包括具有标称孔径在1至150μm的范围内的过滤器6，并且其中切向流过滤单元5的第二端7具有第二流体连接件8，该第二流体连接件8将渗余物引导回到混合罐2；切向流过滤单元5具有第三流体连接件9，该第三流体连接件9将渗透物引导至第一出口10；并且其中该装置包含自动反向冲洗系统，该系统被配置为以每小时1-500次的频率施加渗透物的脉冲压力增加和/或反向冲洗，并且其中该自动反向冲洗系统包括：
-第三流体连接件9中的开-关阀19，其由电子控制单元18控制，
-第二流体连接件8中的第一可变流量控制阀20和第三流体连接件9中的第二可变流量控制阀21，该可变流量控制阀20、21由电子控制单元18控制。
-第四流体连接件11，其将渗透物从第一出口10引导至渗透物收集罐15，
-第五流体连接件12，其将渗透物收集罐15连接至过滤器6的渗透物侧，
-插入第五流体连接件12中的离心泵16，该离心泵也由电子控制单元18控制。
本发明的第三替代实施方案涉及一种装置，其包括通向混合罐2的第一入口1，混合罐2含有以5-70体积％的浓度悬浮在水性液体中的吸附材料，所述混合罐具有一个或多个第一流体连接件3，该第一流体连接件3连接至切向流过滤单元5的第一端4，切向流过滤单元5包括具有标称孔径在1至150μm范围内的过滤器6，并且其中切向流过滤单元5的第二端7具有第二流体连接件8，该第二流体连接件8将渗余物引导回到混合罐2；切向流过滤单元5具有第三流体连接件9，该第三流体连接件9将渗透物引导至第一出口10；并且其中一个或多个第一流体连接件3和/或第二流体连接件8包含一个或多个蠕动泵17，该蠕动泵17被配置成在使用时向蛋白质吸附材料施加低剪切力，并且其中该装置包含自动反向装置冲洗系统，该系统被配置为以每小时1-500次的频率施加渗透物的脉冲压力增加和/或反向冲洗，并且其中自动反向冲洗系统包括：
-第三流体连接件9中的开-关阀19，其由电子控制单元18控制，
-第二流体连接件8中的第一可变流量控制阀20和第三流体连接件9中的第二可变流量控制阀21，该可变流量控制阀20、21由电子控制单元18控制。
-第四流体连接件11，其将渗透物从第一出口10引导至渗透物收集罐15，
-第五流体连接件12，其将渗透物收集罐15连接至过滤器6的渗透物侧，
-插入第五流体连接件12中的离心泵16，该离心泵也由电子控制单元18控制。
本发明的第四替代实施方案涉及一种装置，其包含通向混合罐2的第一入口1，该混合罐2具有一个或多个第一流体连接件3，该第一流体连接件3连接至切向流过滤单元5的第一端4，切向流过滤单元5包括具有标称孔径在1至150μm的范围内的过滤器6，并且其中切向流过滤单元5的第二端7具有第二流体连接件8，该第二流体连接件8将渗余物引导回到混合罐2；切向流过滤单元5具有第三流体连接件9，该第三流体连接件9将渗透物引导至第一出口10；并且其中一个或多个第一流体连接件3和/或第二流体连接件8包含一个或多个蠕动泵17，该蠕动泵17被配置成在使用时向蛋白质吸附材料施加低剪切力，并且其中该装置包含自动反向装置冲洗系统，该系统被配置为以每小时1-500次的频率施加脉冲压力增加和/或反向冲洗渗透物，并且其中自动反向冲洗系统包括：
-第三流体连接件9中的开-关阀19，其由电子控制单元18控制，
-第二流体连接件8中的第一可变流量控制阀20和第三流体连接件9中的第二可变流量控制阀21，该可变流量控制阀20、21由电子控制单元18控制。
-第四流体连接件11，其将渗透物从第一出口10引导至渗透物收集罐15，
-第五流体连接件12，其将渗透物收集罐15连接到过滤器6的渗透物侧，
-插入第五流体连接件12中的离心泵16，该离心泵也由电子控制单元18控制。
本发明的第五替代实施方案涉及一种装置，其包括通向混合罐2的第一入口1，混合罐2含有以5-70体积％浓度悬浮在水性液体中的吸附材料，所述混合罐2具有一个或多个第一流体连接件3，该第一流体连接件3连接至切向流过滤单元5的第一端4，切向流过滤单元5包括标称孔径在1至150μm范围内的过滤器6，并且其中切向流过滤单元5的第二端7具有第二流体连接件8，该第二流体连接件8将渗余物引导回到混合罐2；切向流过滤单元5具有第三流体连接件9，该第三流体连接件9将渗透物引导至第一出口10；并且其中该装置包括自动反向冲洗系统，该系统被配置为以每小时1-500次的频率和/或0.01至200秒之间的脉冲持续时间施加渗透物的脉冲压力增加和/或反向冲洗。
应当注意，在本发明的一个方面的上下文中描述的实施方案和特征也适用于本发明的其他方面。
本申请中引用的所有专利和非专利参考文献均通过引用整体并入本文。
现在将在以下非限制性实施例中进一步详细描述本发明。
实施例
实施例1–装置和反向冲洗的测试
图6显示了用于实施例的装置的示意图。混合罐2是具有圆锥形底部的圆柱形不锈钢罐，并且第一流体连接件3包含最大流量为75L/min的变流蠕动管泵17。切向流过滤单元5是配备有由熔喷聚丙烯制成且标称孔径为30微米的过滤管的圆柱形单元。过滤管的长度为1200mm，外径为30mm，内径为20mm。过滤管的总内表面过滤面积为0.076m2。
渗透物第三流体连接件9连接至第一出口10，该第一出口10将渗透物引导至废物罐以进行收集或通过第四流体连接件11以收集在渗透物收集罐15中。渗透物第三流体连接件9还配备有开-关阀19和电子控制单元18(反脉冲控制器)，以选定的频率切换阀位置。相同的控制器18控制离心泵16，该离心泵16通过第五流体连接件12连接到切向流过滤单元5上的渗透物反冲洗端口，该泵16在被启动时反转渗透物流体的流动以获得通过过滤管的脉冲压力增加/反向冲洗。因此，当泵16启动时，第三流体连接件9处的开-关阀19关闭，并且由离心泵16输送的液体然后通过第五流体连接件12进入过滤器单元的渗透物侧。离心泵16连接到渗透物罐15，并且对在施加脉冲压力增加/反向冲洗之前收集的渗透物进行脉冲压力增加/反向冲洗。
该装置还配备了监测器以监测所有流体连接件中的流量、温度和压力。位于第二和第三流体连接件8、9中的可变流量控制阀20、21结合可变蠕动泵17的流量调节用于调节流量，从而调节穿过切向流过滤单元5的长度和穿过过滤器壁(从渗余物侧到渗透物侧)的背压降。
渗透物出口由阀引导，使得所有渗透物通过第六流体连接件13返回到混合罐2，由此系统体积在整个测试过程中保持恒定。
为了使用水和吸附剂测试装置，混合罐填充有20L的6％琼脂糖珠(其粒度在45-165微米范围内)的水性悬浮液(Cytiva，美国)。悬浮液中交联琼脂糖珠的浓度为31％，其通过将悬浮液样品在3000G下离心5分钟来测定(即，离心后100ml样品将有31ml沉积珠)。因此，测试开始时的系统体积为20L。
测试A.有和无反向冲洗的通量率(Flux rates)
对于该测试，蠕动泵设定为20L/min的流量，其中吸附剂悬浮液通过第一流体连接件再循环以经过切向流过滤单元并通过第二流体连接件返回到混合罐。在测试开始时，渗透物第三和第五流体连接件完全关闭，使得没有渗透物能够通过过滤单元。在这些条件下，在切向流过滤单元的第一端处测量的第一流体连接件中的压力为0.1巴，并且在过滤单元的第二端处测量的第二流体连接件中的压力为0巴。过滤器渗余物侧和过滤器渗透物侧(TMP)之间的压力梯度定义如下：
TMP＝(进料压力+渗余物压力)/2-渗透物压力
通过打开第二可变流量控制阀并通过调节第二返回流体连接件上的第一可变流量控制阀施加背压，将TMP调节至设定值。对于此测试，TMP在三次单独的运行中连续设置为以下值：0.225巴、0.400巴和0.800巴。
一旦第二可变流量控制阀打开并且TMP设置为所需值，脉冲压力增加和/或反向冲洗(BP)即背压循环开始，其中开-关阀关闭并启动离心泵以反转通过第五流体连接件的渗透物流动。泵启动3秒后停泵，开-关阀再次打开。该循环每分钟重复一次，并且在每次BP后10s测量渗透物流量。系统运行11分钟后，BP循环将关闭如下所示的一段时间，同时在此期间继续间隔地进行渗透物流量测量。
·当TMP为0.225巴时，使系统在没有BP的情况下运行32min。
·当TMP为0.400巴时，使系统在没有BP的情况下运行16min。
·当TMP为0.800巴时，使系统在没有BP的情况下运行10min。
在没有BP的情况下指定的时间段后，重新启动BP循环，并在每个BP后10s再次测量渗透物流量。
通量，定义为每平方米过滤面积每小时的升渗透物，通过每次渗透物流量测量来计算。因此，对于0.076m2的膜面积，1L/min的渗透物流量，通量等于1×60×(1/0.076)＝789.5L/m2/h或789.5LMH。
图7显示，当装置在激活频繁反向冲洗事件的情况下运行时，随着TMP高达约0.4巴，通量高于3300LMH并增加，但对于所有测试的TMP，当BP循环停止时，通量会非常快地下降至约1500LMH。这种通量抑制随着时间的推移而恶化，但是一旦重新启动BP循环，通量几乎立即恢复到初始水平。
结论：反向通量系统可有效确保通过过滤器的高通量。
实施例2–制备环氧氯丙烷活化的琼脂糖珠。
将粒度在45-160微米范围内的6％琼脂糖珠(Cytiva，美国)与环氧氯丙烷如下反应：在搅拌下，在密闭反应容器中将20L珠悬浮的16L水中。悬浮液加热至40℃，然后添加2.4L环氧氯丙烷(Sigma-Aldrich，美国)和2.0L 32.5％(w/w)氢氧化钠。将悬浮液搅拌并在40℃下维持3小时，然后将其转移至nutsche过滤器并用200L水洗涤。然后将珠排出间隙水，从而可以将活化的珠作为滤饼除去。洗涤并沥干的珠具有每克沥干珠52微摩尔环氧基团的含量。
实施例3–制备连接有苄胺配体的蛋白质吸附剂。
将如实施例2中制备的20L环氧氯丙烷活化珠悬浮在16L水中并在搅拌下转移至密闭反应容器中。然后向悬浮液中加入2L苄胺(Sigma-Aldrich，美国)并用盐酸将悬浮液的pH调节至10.5。将悬浮液在环境温度搅拌24小时，然后将其转移至nutsche过滤器并依次用50L水、200L 0.05M盐酸和100L水洗涤。然后将珠排出间隙水，从而可以将苄胺偶联的珠作为滤饼除去。洗涤并沥干的珠具有每克沥干的珠42微摩尔苄胺基团的含量。
实施例4–制备磺酸离子交换吸附剂。
通过交联粒度在45-160微米范围内的6％琼脂糖珠(Cytiva，美国)制备离子交换吸附剂。将珠与环氧氯丙烷如下反应：在搅拌下，在密闭反应容器中，将20L珠悬浮在15L0.2M硫酸钠(Sigma Aldrich，美国)中。悬浮液加热至40℃，然后添加1.2L环氧氯丙烷(Sigma-Aldrich，美国)和1.5L 32.5％(w/w)氢氧化钠。将悬浮液搅拌并在40℃下维持18小时，然后将其转移至nutsche过滤器并用200L水洗涤。然后将珠排出间隙水，从而可以将活化的珠作为滤饼除去。
与磺化剂反应：然后将交联珠悬浮在20L 32.5％w/w氢氧化钠中并作为悬浮液转移回反应容器。向悬浮液中添加0.8kg十二烷基硫酸钠，然后在温和搅拌下加热至65℃。此后，在连续搅拌下以10×1kg等份加入10kg 1,4-丁烷磺内酯(Organica，德国)，间隔30分钟。调节温度保持在65-75℃的范围内。最后添加丁烷磺内酯后，使混合物再反应额外2小时。反应后，将悬浮液转移至nutsche过滤器并依次用200L水、200L 0.05M氢氧化钠和400L水洗涤。然后将珠排出间隙水，从而可以将丁烷磺内酯偶联的珠作为滤饼除去。发现经洗涤并沥干的珠具有每克沥干的珠185微摩尔可滴定磺酸基团的含量。
实施例5–制备季胺离子交换吸附剂。
通过交联粒度在45-160微米范围内的6％琼脂糖珠(Cytiva，美国)制备季胺离子交换吸附剂。珠与环氧氯丙烷如下反应：在搅拌下，将20L珠悬浮在密闭反应容器中的15L0.2M硫酸钠(Sigma Aldrich，美国)中。悬浮液加热至40℃，然后添加1.2L环氧氯丙烷(Sigma-Aldrich，美国)和1.5L 32.5％(w/w)氢氧化钠。将悬浮液搅拌并在40℃下维持18小时，然后将其转移至nutsche过滤器并用200L水洗涤。然后将珠排出间隙水，从而可以将交联的珠作为滤饼除去。
与季胺试剂反应：然后将交联珠悬浮在15L 0.6M氢氧化钠中并作为悬浮液转移回反应容器。然后向悬浮液中添加994g硫酸钠并在温和搅拌下加热至65℃。此后，在连续搅拌下以10×1kg等份加入12kg缩水甘油基三甲基氯化铵(Sigma Aldrich，美国)，间隔30分钟。调节温度保持在55-65℃的范围内。最后添加试剂后，让混合物再反应额外20小时。反应后，将悬浮液转移至nutsche过滤器并依次用200L水、200L 0.05M盐酸和200L水洗涤。然后将珠排出间隙水，从而可以将季胺偶联的珠作为滤饼除去。发现洗涤并沥干的珠具有每克沥干的珠175微摩尔季胺基团的含量。
实施例6–从脱脂牛奶中分离β-乳球蛋白。
该实施例展示了根据本发明的装置，如图6所示的装置，用于从脱脂牛奶中选择性地分离β-乳球蛋白(β-Ig)的用途。
材料和方法
吸附剂：
季胺离子交换吸附剂，如实施例5中所述。将吸附剂悬浮在水中，浓度为30％，该浓度通过在3000G下离心5分钟测定。将悬浮液填充到混合罐2中，系统体积为21L，这意味着使用的吸附剂的总体积为6.3L。
原料：
脱脂奶来自当地的一家乳制品厂。
设备设置
(编号参见图6)：
切向流单元：
切向流过滤单元5是圆柱形单元，配备有由熔喷聚丙烯制成的具有30微米标称孔径的七个过滤管。过滤管的尺寸为：外径：10mm，内径：6mm，长度：300mm。发现每个过滤管中过滤器的过滤面积为：56.5cm2，因此过滤器6的总过滤面积为395.6cm2(0.04m2)。
系统设置：
蠕动泵17设定为22L/min。整个实验期间跨膜压力(TMP)设置为0.2巴。通过调节开-关阀19和第一变流量控制阀20来调节TMP。反向冲洗设置：在吸附剂的洗涤和洗脱过程中，每24秒进行一次反向冲洗。在每次反向冲洗期间离心泵16运行1秒。反向冲洗由含有水的渗透物收集罐15供给。加载原材料期间，反向冲洗系统未运行。使用单独的蠕动泵(图6中未示出)将原料、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液分别通过第一入口1进料到混合罐2中。将泵速调节为与通过第三流体连接件9入口的渗透物流相同以保持混合罐2中的恒定体积。通过第三流体连接件9的渗透物料流被连接至单独的罐(图6中未示出)以分别收集未结合级分、洗涤级分和产物级分(洗出液)。
实施例中使用的例如用于制备缓冲液和溶液的化学品至少是试剂级的商业产品。用于进行实验的水是去离子水。
缓冲液
0.25M柠檬酸pH 4.0
48g柠檬酸，来自BDH Chemicals
添加900ml水并用1M NaOH将pH调节至4.5。然后添加水至最终体积为1.0L。
1M柠檬酸
192g柠檬酸，来自BDH Chemicals
加水至1.0L。
SDS-PAGE电泳试剂
a)LDS样品缓冲液，4X购自Abcam，英国
b)SDS运行缓冲液，20x购自Abcam，英国
c)预制16％凝胶购自Abcam，英国
d)用于蛋白质的即时15min染色考马斯蓝购自Kem-En Tec Nordic,丹麦。
试验
a)SDS-PAGE电泳：
使用SDS-PAGE凝胶电泳分析每个实施例中产生的样品，该分析显示出每个样品中的蛋白质组成。使用英国Abcam的电泳仪和预制16块凝胶进行SDS-PAGE凝胶电泳。将蛋白质样品与LDS样品缓冲液混合并在70℃下孵育10分钟。将样品施加到预制凝胶上，并允许蛋白质在SDS运行缓冲液中、在非还原运行条件下以200V、90mA运行一小时。凝胶在染色溶液中显色18小时。通过目视检查评估蛋白质条带，或通过扫描密度测定法分析蛋白质条带，以量化测试溶液中特定蛋白质的量。
b)分光光度测量渗透物样品
在洗涤和洗脱期间从渗透物料流(即，从图6上的第三流体连接件9)采集点样品。这些是在分光光度计(VWR，UV-3100PC)上在280nm处测量的。这些读数用于确定吸附剂的洗涤和洗脱效率。
程序
过滤系统按照材料和方法中所述的设置启动。当TMP调节至0.2巴时，渗透物流量为2.1L/min，同时将脱脂奶以相同的流速泵入混合罐2，保持恒定的系统体积，导致停留时间为10分钟。
在加载期间从第三流体连接件9中的渗透物料流中抽取10ml点样品。加载49L脱脂奶后，开始用水洗涤并启动反向冲洗系统。外部进料泵以3L/min的流量将水泵入混合罐2以洗掉未结合脱脂奶组分。总共110L水用于洗涤步骤。在洗涤过程期间，从第三流体连接件9中的渗透物流中抽取10ml点样品。
洗涤后，开始洗脱结合的β-Ig：首先关闭渗透物开-关阀19，并停止外部进料泵和反向冲洗系统。然后，渗余物通过切向流过滤单元5再循环，而没有任何渗透物料流。为了从吸附剂中释放结合的蛋白质，将2.3L 0.25M，pH 4.0柠檬酸钠添加到混合罐2中，以达到25mM柠檬酸钠的终浓度，并通过添加1M柠檬酸将pH调节至pH 4.5。再循环10分钟后，渗透物开-关阀19再次打开以达到0.2巴的TMP。所得渗透物流量为3.0L/min。首先，在不启动外部进料泵的情况下收集2.3L的渗透物，达到21L的系统体积。然后启动外部进料泵以3L/min的流量将水泵入混合罐2中以洗掉释放的蛋白质，并且反向冲洗系统处于活动状态。在洗脱期间，从第三流体连接件9中的渗透物料流中取出10ml点样品。总共使用80L水来洗涤/洗脱出解吸的β-乳球蛋白产物。
将所有收集的点样品加载到SDS-PAGE凝胶上。还通过分光光度法在280nm处对来自洗涤和洗脱的点样品进行分析。
结果
分光光度结果：
图8显示了点样品在280nm处获得的光密度(OD)值，作为洗涤和洗脱过程中泵入混合罐的水的系统体积的函数(即1系统体积＝21L)。
图8中的图表说明了洗涤过程中渗透物吸光度降低。用5.25系统体积的水洗涤后，渗透物中残留的量少于初始OD读数(在280nm处测量)的10％。在箭头处开始洗脱，并且OD读数由于β-乳球蛋白的释放而增加。使用3.8系统体积的水进行洗脱可将渗透物中的OD读数降低85％。因此，约190L水用于获得包含精制蛋白质的渗透物的整个过程，并且与初始组合物相比，其OD读数降低了85％。
脱脂奶加载期间的平均渗透物流量为2.1L/min，对应于3150LMH的通量，并且洗涤和洗脱期间的平均流量为3.0L/min，对应于4500LMH的通量。
SDS-PAGE结果：
β-Ig与蛋白质吸附材料的初始结合：
通过对在吸附剂载体上包含β-Ig的混合物过滤期间获得的渗透物进行SDS-PAGE分析来研究吸附剂的蛋白质结合效率和容量。SDS-PAGE结果如图9所示，每个泳道代表：
泳道1：脱脂奶
泳道2：将5L脱脂奶加载至混合罐后渗透物的点样品，
泳道3：将10L脱脂奶加载至混合罐后渗透物的点样品，
泳道4：将15L脱脂奶加载至混合罐后渗透物的点样品，
泳道5：将20L脱脂奶加载至混合罐后渗透物的点样品，
泳道6：将25L脱脂奶加载至混合罐后渗透物的点样品，
泳道7：将30L脱脂奶加载至混合罐后渗透物的点样品，
泳道8：将35L脱脂奶加载至混合罐后渗透物的点样品，
泳道9：将40L脱脂奶加载至混合罐后渗透物的点样品，
泳道10：将42L脱脂奶加载至混合罐后渗透物的点样品。
从图9所示的SDS-PAGE分析得出结论，阴离子交换吸附剂几乎结合了脱脂奶中存在的所有β-乳球蛋白。加载30L脱脂奶(泳道7-10)后，渗透物中开始出现只有极少量的β-乳球蛋白。据估计，不到所应用的β-乳球蛋白总量的5％。
洗涤与蛋白质吸附材料结合的β-Ig：
通过对洗涤期间获得的渗透物进行SDS-PAGE分析，研究了蛋白质吸附材料在洗涤液(即水)应用期间防止β-Ig洗脱的能力。这些SDS-PAGE结果如图10所示，每个泳道代表：
泳道1：用0.95系统体积洗涤后渗透物的点样品，
泳道2：用1.9系统体积洗涤后渗透物的点样品，
泳道3：用2.86系统体积洗涤后渗透物的点样品，
泳道4：用3.81系统体积洗涤后渗透物的点样品，
泳道5：用4.53系统体积洗涤后渗透物的点样品，
泳道6：用5.24系统体积洗涤后渗透物的点样品。
从图10中的SDS-PAGE分析得出的结论是，用5.24系统体积的水洗涤后，大部分非结合蛋白(其中酪蛋白占主导地位)被洗掉。
洗脱和收集包含目标蛋白质的精制渗透物：
通过对洗脱步骤中获得的渗透物进行SDS-PAGE分析，研究了通过添加柠檬酸洗脱溶液将渗余物流中的pH调节至4.5而从吸附剂材料中释放β-Ig的情况。结果如图11所示，其中每条泳道代表：
泳道1：用0.71系统体积洗脱后渗透物的点样品，
泳道2：用1.43系统体积洗脱后渗透物的点样品，
泳道3：用1.90系统体积洗脱后渗透物的点样品，
泳道4：用2.38系统体积洗脱后的渗透物的点样品，
泳道5：用2.86系统体积洗脱后渗透物的点样品，
泳道6：用3.33系统体积洗脱后渗透物的点样品，
泳道7：用3.8系统体积洗脱后渗透物的点样品。
从图11中的SDS-PAGE分析可以看出，洗脱液级分含有高度纯化的β-乳球蛋白渗透物，仅含有微量的其他蛋白质。水洗掉了洗脱的β-乳球蛋白，导致渗透物中蛋白质浓度从泳道1到泳道7降低(见图11)。
编号列表
1.第一入口。
2.混合罐。
3.第一流体连接件。
4.(切向流过滤单元的)第一端。
5.切向流过滤单元。
6.过滤器。
7.(切向流过滤单元的)第二端。
8.第二流体连接件。
9.第三流体连接件。
10.第一出口。
11.第四流体连接件。
12.第五流体连接件。
13.第六流体连接件。
14.热交换器。
15.渗透物收集罐。
16.离心泵。
17.蠕动泵。
18.电子控制单元。
19.开-关阀。
20.第一可变流量控制阀。
21.第二可变流量控制阀。
参考文献
·WO 2015/118223 A1
Claims (11)
1.一种装置，包括第一入口1和一个或多个第一流体连接件3，所述第一流体连接件3将流体从所述第一入口1引导至切向流过滤单元5的第一端4，所述切向流过滤单元5包括具有标称孔径在1至150μm范围内的过滤器6，并且其中所述第一流体连接件3包括用于以5-70体积％的浓度悬浮在水性液体中的蛋白质或其他生物分子的吸附材料，并且其中所述切向流过滤单元5的第二端7具有第二流体连接件8，所述第二流体连接件8将渗余物引导回到所述切向流过滤单元5的所述第一端；所述切向流过滤单元5具有第三流体连接件9，所述第三流体连接件9将渗透物引导至第一出口10；并且其中所述装置包括自动反向冲洗系统，所述系统被配置为以每小时1-500次的频率和/或0.01至200秒之间的脉冲持续时间施加渗透物的脉冲压力增加和/或反向冲洗。
2.根据前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述自动反向冲洗系统包括：
-所述第三流体连接件9中的开关阀19，所述开关阀19由电子控制单元18控制。
3.根据前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述自动反向冲洗系统包括：
-所述第二流体连接件8中的第一可变流量控制阀20和第三流体连接件9中的第二可变流量控制阀21，所述可变流量控制阀20、21由电子控制单元18控制。
4.根据前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述自动反向冲洗系统包括：
-第四流体连接件11，其将渗透物从第一出口10引导至渗透物收集罐15，-第五流体连接件12，其将所述渗透物收集罐15连接到过滤器6的渗透物侧，以及
-插入所述第五流体连接件12中的离心泵16，并且所述离心泵也由所述电子控制单元18控制。
5.根据前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述过滤器具有在1.5μm至80μm的范围内的标称孔径。
6.根据前述权利要求中任一项所述的装置，其中混合罐连接在在所述第一入口1和所述第一流体连接件3之间，并且其中所述混合罐包含所述吸附材料。
7.根据前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述过滤器6是高通量过滤器，当TMP为约0.1-0.9巴时，净水渗透物通量大于1000L/m2/h。
8.根据前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述吸附材料具有的粒度分布使得90体积％的颗粒具有在10-1000μm范围内的直径。
9.根据前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述吸附材料是聚合物吸附材料，所述聚合物吸附材料包含选自由以下组成的组的一种或多种聚合物：天然多糖、琼脂、琼脂糖、葡萄聚糖、纤维素、纤维素醚、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、淀粉、树胶、瓜尔胶、阿拉伯树胶、印度树胶、黄芪胶、刺槐豆胶、黄原胶、果胶、粘蛋白、壳质、壳聚糖、藻朊酸盐、角叉菜胶、肝素、明胶、合成聚合物、聚酰胺、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚酰亚胺、聚丙烯酸酯、聚合乙烯基、聚苯乙烯、聚烯烃、聚乙烯醇、聚酯、聚醚、硅质材料、二氧化硅、无定形二氧化硅、石英、二氧化硅、金属硅酸盐、可控孔玻璃、陶瓷、金属氧化物、硫化物及其复合材料。
10.一种用于分离生物组合物中包含的蛋白质或其他生物分子的方法，该方法包括以下步骤：
i)将包含目标蛋白质或其他生物分子的生物组合物与包含用于蛋白质或其他生物分子的吸附材料的组合物混合以获得混合物，其中所述目标蛋白质或其他生物分子由所述吸附材料承载，
ii)使用具有标称孔径在1至150μm范围内的膜的切向流过滤单元过滤所述混合物，以获得包含所述目标蛋白质或其他生物分子的第一渗余物和第一渗透物，所述第一渗透物任选地收集在废物罐或渗透物收集罐中，
iii)通过将获得的第一渗余物返回到所述切向流过滤单元，对所述第一渗余物进行再循环和过滤，从而获得第二渗透物，任选地收集所述第二渗透物，并获得第二渗余物，其中步骤iii)中的所述再循环和进一步过滤进行一次或多次，
iv)将洗脱液添加至所述第二渗余物以从所述吸附材料中释放所述目标蛋白质或其他生物分子，
v)使用所述切向流过滤单元过滤所述第二渗余物以获得包含所述吸附材料的第三渗余物和包含所述目标蛋白质或其他生物分子的第三渗透物；
vi)收集所述第三渗透物作为包含蛋白质或其他生物分子的分离的产物组合物。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述切向流过滤单元中的过滤器的渗余物侧和渗透物侧之间的压差被均衡或反转，从而获得所收集的第一渗透物的脉冲压力增加和/或反向冲洗，在步骤ii)至iv)中的一个或多个过程期间，至少引入一次所述压差。
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