NL9402136A

NL9402136A - Werkwijze voor affiniteitscheiding.

Info

Publication number: NL9402136A
Application number: NL9402136A
Authority: NL
Original assignee: Pall Corp
Priority date: 1993-12-23
Filing date: 1994-12-15
Publication date: 1995-07-17
Also published as: CN1107748A; SE9404250L; GB9422829D0; CA2127605A1; SE9404250D0; DE4445517A1; GB2287662B; GB2287662A; DK142194A; JPH07265606A; FR2714299B1; US5567615A; FR2714299A1

Description

Titel: Werkwijze voor affiniteitscheiding.

Technisch gebied van de uitvinding

De werkwijze heeft betrekking op de isolatie en scheiding van verbindingen uit vloeistoffen. De uitvinding is een verbeterde methode voor affiniteitscheiding, die bijzonder bruikbaar is bij isolatie van biologisch werkzame verbindingen.

Achtergrond van de uitvinding

Vooruitgang in techniek heeft de produktie mogelijk gemaakt van technische hoeveelheden therapeutisch bruikbare proteïnen , welke tot nu toe te complex of duur waren om via traditionele biochemische processen te worden geproduceerd. De produktie wordt bewerkstelligd door cellen die gemaakt zijn om een gewenst proteïne te produceren en kunnen worden gekweekt in bioreaktoren onder beheerste omstandigheden. De toegepaste technologie omvat hetzij de fermentatie van microorganismen die gewijzigd zijn via recombinant DNA technieken , hetzij het kweken van zoogdiercellen welke gewijzigd zijn door hybridoma technieken. De cellen worden gesuspendeerd in een bouillon welke de zouten, suikers, proteïnen en verschillende faktoren bevat die nodig zijn voor de ondersteuning van de groei van bepaalde cellen. Het gewenste proteine kan of worden afgescheiden door de cellen in de bouillon, of binnen het cellichaam worden gehandhaafd.

Andere van belting zijnde proteïnen kunnen worden bereid onder toepassing van alternatieve middelen zoals door genetisch wijzigen van een dierlijk species teneinde het dier te voorzien van het vermogen tot produceren van het gewenste proteine. Zo kunnen bijvoorbeeld bepaalde proteïnen worden geproduceerd door transgene koeien en uit de melk daarvan worden gewonnen.

De afscheiding of zuivering van deze proteïnen uit een heterogeen mengsel is gebleken een formidabele taakt te zijn om tenminste de volgende redenen: het gewenste proteine vertegenwoordigt vaak een kleine percentage van totaal proteine; de bouillon of andere vloeistof die moet worden bewerkt kan significante hoeveelheden celafval en andere deeltjesvormige verontreinigingen bevatten; pyrogenen, pathogenen, toxinen en andere verontreinigingen kunnen in hoge concentratie aanwezig zijn en moeten worden verwijderd; en het gewenste proteine moet uit de heterogene proteineoplossing worden afgescheiden zonder het te denatureren.

Als een resultaat van deze faktoren is uitgebreide stroomafwaartse bewerking noodzakelijkerwijze toegepast voor levering van grote hoeveelheden gezuiverd proteine. Dergelijk stroomafwaarts bewerken omvat de vele fasen van bewerking die plaats hebben na de produktie van het van belang zijnde proteine waaronder, bijvoorbeeld, centrifugeren, celscheuring, mechanisch zeven, microfiltratie, ionuitwisseling, kruisstroomfiltratie, affiniteitscheiding, sterilisatie, zuivering en verpakking. Het stroomafwaarts bewerken vertegenwoordigt een overwegende kostenpost in de produktie van bio-bewerkte proteïnen. Aldus zou een methode die efficient verschaft een hoge-opbrengst levérende proteine-afscheiding door reduceren van het aantal bewerkingstrappen, en die kan worden toegepast op industriële schaal, de succesvolle commercialisering van biotechnologie verder bevorderen.

Het is bekend dat vele verbindingen complexeren met liganden zodanig dat die verbindingen kunnen worden geïsoleerd door middel van een techniek die bekend staat als affiniteitscheiding. Zie in het algemeen " Chromatogra- phy, Affinity, " Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 6^, 35-54 ( John Wiley & Sons: New York, 1979) . Deze afscheidingswerkwijze omvat drie fasen: (i) een adsorp- tiefase, waarbij de gewenste verbinding zoals een proteïne , uit een heterogeen mengsel een complex vormt met een chemische funktionaliteit, zoals een ligand, gebonden aan een onoplosbaar substraat, zoals een polymeer of glasparel, (ii) een wasfase waarin de bulk van de oplossing wordt weggewassen tesamen met verontreinigingen die los aan het onoplosbare substraat gebonden zijn, en (iii) een elutietrap waarbij een eluens het complex tussen de gewenste verbinding en het ligand gebonden aan het onoplosbare substraat verbreekt teneinde de gewenste verbinding vrij te geven. Het onoplosbare substraat met de gebonden ligand, waarnaar wordt verwezen als de affiniteitdeeltjes, kunnen worden gewassen en opnieuw worden gebruikt, en de werkwijze kan talloze keren worden herhaald.

De affiniteitdeeltjes worden normaliter gekozen gebaseerd op oppervlakteper massa eenheid. Terwijl bijvoorbeeld niet-poreuze bolvormige parels van 100 ,um diameter 2 een oppervlakte kunnen leveren van 0,06 m /g parels, zouden vergelijkbare parels met een diameter van 1 /Urn een oppervlakte verschaffen van 6,0 m /g parels, en parels van 0,1 ,um diameter zouden een oppervlak verschaffen van 60 m2/g parels. Duidelijk is dat kleinere affiniteit deeltjes een groter oppervlak per gewichteenheid verschaffen en wenselijker zijn. Bij affiniteitscheiding is het in het algemeen gewenst affiniteitdeeltjes te gebruiken die een oppervlakte bezitten van meer dan ongeveer 20 m /g. Indien aldus men wenst niet-poreuze affiniteitdeel-tjes in een affiniteit scheidingproces te gebruiken, moeten dergelijke affiniteitdeeltjes een diameter bezitten in het sub microntrajekt.

De meest wijd verspreide gepraktiseerde vorm van affiniteitscheiding is affiniteitchromatografie. Affini-teitchromatografie maakt gebruik van een kolom van dicht-gepakte affiniteitdeeltjes door welke de vloeistof ( bijvoorbeeld vloeibare toeveorstroom) die de beoogde verbinding bevat, zoals een proteïne, onder druk wordt gedwongen. De hydrodynamica van een gepakte of gefixeerd bedsys-tem zoals dit wordt beheerst door de Ergun vergelijking. Chem. Eng. Prog., 48 (1952). De Ergun vergelijking,d ie wordt gebruikt wanneer het bed een laminaire vloeistof-stroom ervaart, toont aan dat de drukval over het bed omgekeerd evenredig is met het vierkant van de deeltjesdiameter. Bij berekening liggen de drukverliezen van systemen die submicron affiniteitdeeltjes toepassen in de orde van grootte van een miljoen maal meer dan die, gepakt met 100 ^um deeltjes. Dit effekt heeft tot nu toe de toepassing van dergelijke kleine affiniteitsdeeltjes in affini-teitscheidingen verhinderd. Dientengevolge worden in het typische bed affiniteitdeeltjes gebruikt van ongeveer 100 ^urn in grootte ter handhaving van een aanvaardbare drukval.

Er zijn pogingen ondernomen om de problemen die verbonden zijn met niet-poreuze affiniteitdeeltjes met betrekking tot verschaffing van een groot oppervlak per gewichtseenheid te overwinnen. In het bijzonder werden de niet-poreuze affiniteitdeeltjes vervangen door poreuze affiniteitdeeltjes. In typische toepassingen, verschaffen poreuze parels van ongeveer 100 ,um in diameter een opper-vlakte in het gebied van ongeveer 40 m /g per parel onder gematigde drukvalomstandigheden.

De toepassing van poreuze affiniteitdeeltjes echter creëert bijkomende problemen welke niet worden ervaren bij niet-poreuze affiniteitdeeltjes. Om redenen die niet geheel begrepen zijn maar wellicht betrekking hebben op propvorming en diffusieweerstand, is algemeen slechts het buitenste van ongeveer 5% van het poreuze gebied van de affiniteitdeeltjes toegankelijk voor het af te scheiden materiaal. Dit resulteert in het effektieve oppervlak van het poreuze affiniteitdeeltje veel minder te zijn dan de totale theoretisch beschikbare oppervlakte. Terwijl de voorbehandeling van de toevoerstroom tenminste een gedeelte van de propvorming en diffusieweerstand van de poreuze affiniteitdeeltjes kan verhinderen, omvat een dergelijke voorbehandeling van de toevoerstroom een kostbare en tijdverbruikende reeks trappen. Voorts dient elke aanvullende bewerkingstrap de verhoging van het verlies van de doelverbinding en daarbij het verlagen van de produk-tiviteit.

Omdat bovendien het overwegende gedeelte van de totale oppervlakte in de poreuze affiniteitdeeltjes zich bevindt binnen het oppervlak van de affiniteitdeeltjes, beheerst massa overdracht het scheidingsproces effektief, daarbij resulterend in tijdverbruikende en omslachtige scheidingen. Voorts kunnen de poriën van de affiniteitdeeltjes werkzaam zijn als een val voor ongewenste verbindingen en afval en kan eventueel verontreiniging van de gewenste verbinding veroorzaken. Ook wordt als de poriën in de affiniteitdeeltjes geleidelijk verstoppen, de effektivi-teit van de affiniteitdeeltjes verlaagd met elke volgende cyclus. Daarenboven wordt de mechanische sterkte van de affiniteitdeeltjes wegens de aanwezigheid van de poriën verminderd, hetgeen resulteert in geringe slijtweerstand en mechanische stabiliteit en kan daarin resulteren dat bij h oge drukken het affiniteitdeeltje in elkaar zakt.

De poreuze affiniteitdeeltjes zwellen eveneens wanneer zij in een bed worden gepakt, hetgeen de instellingen vereist die voor dit verschijnsel moeten worden gemaakt.

Een andere overweging van kolomtechniek dat affini-teitdeeltje-onafhankelijk is, is dat voor het bereiken van grote stroomsnelheden de kolom een grote capaciteit dient te bezitten. Grote kolommen echter resulteren in dergelijke hoge drukken in de lagere zone van de kolommen dat zij de affiniteitdeeltjes vervormen en de doorzet verlagen. De industrie heeft geppgd dit probleem te overwinnen door kolommen te ontwerpen die kort zijn en tamelijk breed. Dit compromis echter is niet volledig bevredigend, aangezien rendement in hoge mate wordt verlaagd wegens stromingsproblemen zoals kanaalvorming en afwijking van propstroming.

Kolommen vertonen eveneens een concentratie golfverschijnsel dat resulteert in een gering effektief gebruik van adsorptiemiddel. Specifiek wordt, als toevoer door de kolom stroomt, slechts een kleine zone van affiniteit deeltjes benut binnen een bepaald tijdraam aangezien de toegangszone reeds verzadigd is met de doelwitverbinding. Dit resulteert in een concentratie golfverschijnsel waarbij slechts het golffront in wisselwerking treedt met het adsorptiemiddel op een bepaald moment.

Teneinde het nadeel te overwinnen dat inherent is aan gefixeerde bedden en de problemen welke rijzen wanneer poreuze affiniteitdeeltjes daarin worden toegepast, hebben onderzoekres hun aandacht gekeerd naar bewegend bed affiniteitscheiding systemen.

Een gefluidiseerd bed is een type bewegend bed affiniteitsysteem. In een dergelijk bed wordt de toeveor-stroom opgepompt van de bodem van een kolom, die oorzaak is dat de affiniteitdeeltjes werken als een vloeistof.

Als een resultaat vertonen de gefluidiseerde bedden geen concentratiegolf karakteristieken. Bovendien worden alle affiniteitdeeltjes gelijktijdig aan de toevoerstroom blootgesteld. Gefluidiseerde bedden bieden een hogere produkti-viteit dan kolommen als een resultaat van de efficiënte benutting van de affiniteitdeeltjes en verhoogde doorzet. Voorts kunnen deze bedden een hogere spiegel van deel- tjesafval aanvaarden en toch nog relatief efficient werken in vergelijking met vast-bedsystemen.

Een nadeel met gefluidiseerde bedden is echter dat rendementen zowel de afmeting als dichtheid van de affiniteitdeeltjes die in dergelijke systemen kunnen worden toegepast, beperken, dat is dat het nodig is de dichtheid te maximaliseren en afmeting te optimaliseren. Dit komt omdat, in het algemeen, een overwegend gedeelte van het afscheidingsproces wordt beheerst door de bezinkingssnel-heid van de affiniteitdeeltjes. Aldus , des te groter de dichtheid van de toegepaste affiniteitdeeltjes, des te sneller de affiniteitdeeltjes zullen bezinken, daarbij de toepassing mogelijk makend van grotere fluidisatiesnel-heden. Een verhoging in de fluidisatiesnelheid zal resulteren in een hogere doorzet en derhalve in een hoger rendement, tot de bovengrens van de kineticasnelheid bereikt is. Terwijl de kineticasnelheid kan worden verhoogd door de vermindering van de grootte van de affiniteitdeeltjes ( daarbij het totale beschikbare oppervlakte verhogend), heeft de verhoging van de kineticasnelheid ook het negatieve effekt van beperking van de fluidisatiesnelheid die kan worden bereikt onder het daarbij verlagen vanhet rendement. Deze onderling strijdende beschouwingen vereisen dat compromissen worden gemaakt met betrekking tot grootte en dichtheid van de affiniteitdeeltjes, en deze compromissen verhinderen dit type systeem van het bereiken van hogere rendementen.

Een ander type van bewegend bedsysteem, aangeduid als een geroerde tanksysteem, biedt ook significante voordelen boven vast-bedkolommen. In een geroerd -tanksysteem, worden affiniteitdeeltjes in een tank in suspensie gehouden door mechanische middelen. Deze mengwerking staat de suspensie toe zich te gedragen als een homogene vloeistof, daarbij gelijktijdig alle deeltjes blootstellend aan de doel-witverbinding. Dit proces kan derhalve vorm worden gegeven als een lus, met een significante verhoging in produktivi-teit. De affiniteitdeeltjes in een dergelijk systeem zijn bij voorkeur voldoende drijvend om een stabiele suspensie in de procesvloeistof toe te staan. Aangezien er minder pakking in dit systeem is, is de voorkeursdiameter van de affiniteitdeeltjes normaliter kleiner dan in een kolom of gefluidiseerd bed, hetgeen een vergroting in oppervlakte toestaat. Een hoofdbeperking van geroerde tanks is dat de filters toegepast voor de was- en elutiefasen vervuilen als een resultaat van de ruwe aard van het toevoer-materiaal. Aldus moet de toevoerstroom normaliter worden voorbehandeld, waardoor een aanvullende procestrap wordt toegevoegd en het totale-systeemrendement wordt verlaagd.

In elk van deze verschillende conventionele affini-teitscheidingprocessen zijn er een meervoud van bewekrings-trappen. Terwijl elke trap een rendement of produktopbrengst van 80-90% kan hebben, kan het bestaan van slechts enkele procestrappen gemakkelijk het totale systeemrendement en produktopbrengst verlagen tot 50% of minder. Met elke bewerkingstrap wordt het totale systeemrendement nog verder verlaagd.

Derhalve bestaat er de noodzaak voor een werkwijze die deze vele problemen welke inherent zijn aan de bestaande affiniteitscheidingprocessen vermijdt en een efficiënter middel verschaft voor isoleren en afscheiden van verbindingen , zoals proteïnen en dergelijke, uit een vloeistof, bijvoorbeeld een verdunde vloeibare toevoerstroom.

De uitvinding verschaft een dergelijke werkwijze. De onderhavige inventieve werkwijze omvat een affiniteitscheiding proces met minder procestrappen die kan worden uitgevoerd in een relatief korte tijdsperiode met een verhoogd totaal rendement ter verwijdering van een gewenste verbinding uit een vloeistof. Bovendien overwint de onderhavige inventieve werkwijze de problemen van vervuiling wat betreft de affiniteitscheiding als filtratiemedium die de kinetica en doorstroming van het systeem belemmert, zonder de noodzaak tot voorbehandeling van de vloeistof die de gewenste verbinding bevat. Voorts kan een grote verscheidenheid aan affiniteitsdeeltjes variërend met betrekking tot zowel dichtheid als afmeting, waaronder kleine affiniteitsdeeltjes met een groot oppervlak per gewichtseenheid, succesvol in de affiniteitscheidingmethode volgens de uitvinding kunnen worden toegepast, daarbij het systeem mogelijk makend te worden aangepast voor het bereiken van grotere rendementen voor bepaalde eindtoepassingen. Deze en andere doeleinden en voordelen van de uitvinding, evenals bijkomende inventieve aspekten, zullen uit de hierin verschafte beschrijving van de uitvinding blijken.

Korte samenvatting van de uitvinding

De uitvinding verschaft een verbeterde affiniteit scheiding methode omvattend (a) introduceren van affiniteits-deeltjes en vloeistof bevattend een te isoleren doelwitver-binding die in staat is tot adsorberen aan de affiniteit deeltjes in een dynamische-filtratieinrichting omvattend aandrijfmiddelen, een filtratiemedium met stroomopwaartse en stroomafwaartse zijden, een invoer in vloeistofcommunicatie met de stroomopwaartse zijde van het filtratiemedium en een filtraatuitvoer in vloeistofcommunicatie met de stroomafwaartse zijde van het filtratiemedium, waarin de vloeistof in staat is het filtratiemedium en te passeren en de affiniteitdeeltjes in hoofdzaak niet in staat zijn het filtratiemedium te passeren, (b) bedienen van de aandri j fmiddelen van de dynamische-filtratieinrichting met de filtraatuitvoer in gesloten positie zodanig dat de vloeistof niet het filtratiemedium kan passeren onder omstandigheden die voldoende zijn om de beoogde verbinding toe te staan te adsorberen aan de affiniteitdeeltjes, en (c) afscheiden van de affiniteitdeeltjes uit de vloeistof door openen van de filtraatuitvoer teneinde de vloeistof toe te staan het filtratiemedium van de dynamische-filtra-tieinrichting te passeren. Het filtraat kan daarbij nagenoeg vrij van de doelwitverbinding worden gemaakt. Indien de winning van de doelwitverbinding gewenst is en/of indien de affiniteitdeeltjes opnieuw moeten worden gebruikt, worden de affiniteitdeeltjes dan gewassen, en wordt de doelwitverbinding van de affiniteitdeeltjes geelueerd.

Korte beschrijving van de tekeningen

Figuur 1 is een schematische afbeelding van de significante elementen toegepast in een voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding.

Figuur 2 is een schematische afbeelding van een voorkeurverdienende dynamische-filtratieinrichting voor toepassing met de onderhavige inventieve affiniteitschei-dingmethode.

Beschrijving van de voorkeursuitvoeringsvormen

De uitvinding verschaft een verbeterde affiniteit-scheidingmethode. In het bijzonder is verrassenderwijze gevonden dat de toepassing van een dynamische-filtratie inrichting kan worden gebruikt voor efficient effektueren van contact tussen een vloeistof bevattend een gewenste ( of doelwit) verbinding en affiniteitdeeltjes en dat de dynamische-filtratieinrichting daarna kan worden gebruikt voor het scheiden van de vloeistof van de affiniteitdeeltjes die daarop de geadsorbeerde of de geocmplexeerde verbinding bezitten. Een dergelijke werkwijze maakt de toepassing mogelijk van affiniteitdeeltjes die kleine diameters en relatief grote oppervlakken per gewichtseenheid van de affiniteitdeeltjes bezitten.

De onderhavige inventieve werkwijze is een verbeterde affiniteitscheidingmethode omvattend: (a) introduceren van affiniteitdeeltjes en een vloeistofbevattend een te isoleren doelwitverbinding die in staat is tot adsorberen aan de affiniteitdeeltjes in een dynamische-filtratieinrichting omvattend aandrijfmidde-len, een filtratiemedium met stroomopwaartse en stroomafwaartse zijden, een invoer in vloeistofcommunicatie met de stroomopwaartse zijde van het filtratiemedium, en een filtraatuitvoer in vloeistofcommunicatie met de stroomafwaartse zijde vanhet filtratiemedium, waarin de vloeistof in staat is het filtratiemedium te passeren en de affini-teitdeeltjes in hoofdzaak niet in staat zijn het filtratie medium te passeren, (b) bedienen van de aandrijfmiddelen van de dynamische-filtratieinrichting met de filtraatuitvoer in gesloten positie, zodat de vloeistof het filtratiemedium niet kan passeren onder omstsndigheden die voldoende zijn om de doelwitverbinding toe te staan te adsorberen aan de affiniteitdeeltjes, en (c) scheiden van de affiniteitdeeltjes van de vloeistof door openen van de filtraatuitvoer teneinde de vloeistof toe te staan het filtratiemedium van de dynamische-filtratieinrichting te passeren.

De vloeistof kan daarbij nagenoeg vrij van de doelwitverbinding worden gemaakt. Indien de winning van de doelwitverbinding gewenst is en/of indien de affiniteitdeelt jes opnieuw moeten worden gebruikt, worden dan de affiniteitdeeltjes gewassen en wordt de doelwitverbinding van de affiniteitdeeltjes geelueerd. De onderhavige inventieve methode voorziet in de exceptioneel efficiënte scheiding van een verdunde oplossing van een verbinding die in staat is te worden afgescheiden via een affiniteitschei dingprocedure, zoals een proteïne uit een verdunde fermenta-tieoplossing. De uitvinding verschaft een middel voor het verminderen van het aantal procestrappen die nodig is voor uitvoering van een affiniteitscheiding in vergelijking met bekende affiniteitscheiding methoden, daarbij de totale opbrengst van de scheidingmethode verhogend. Inderdaad kan de inventieve methode het stellen zonder noodzaak van voorbehandeling van de vloeistof voorafgaande aan contact met de affiniteitdeeltjes. Bovendien is de inventieve methode in staat in een relatief kleinere hoeveelheid tijd te worden uitgevoerd vergeleken met bekende affiniteitscheidingprocessen. Aangezien de inventieve methode bij voorkeur gebruik maakt van niet-poreuze affini-teitdeeltjes vermijdt de uitvinding verder die problemen welke samengaan met de toepassing van poreuze affiniteit-deeltjes, bijvoorbeeld vervuiling van affiniteitdeeltjes, vatbaarheid voor vergruizen, swelling en laag effektief oppervlak. Daarenboven vermijdt de onderhavige inventieve methode in het algemeen problemen van kanaalvorming, con-centratiegolfverschijnsel en vervuiling van filtratiemedium verbonden met conventionele affiniteitscheidingmethoden.

De onderhavige inventieve methode omvat introduceren van de affiniteitdeeltjes en de te behandelen vloeistof, dat is een vloeistof bevattende een doelwitverbinding die moet worden geïsoleerd die in staat is tot adsorberen aan de affiniteitdeeltjes in een dynamische-filtratiein-richting. Een dergelijke dynamishce-filtratieinrichting zal wenselijkerwijze omvatten aandrijfmiddelen, een filtratiemedium met stroomopwaartse en stroomafwaartse zijden, een invoer in vloeistofcommunicatie met de stroomopwaartse zijde van het filtratiemedium, en een filtraatuitvoer in vloeistofcommunicatie met de stroomafwaartsezijde van het filtratiemedium. Het filtratiemedium heeft een porie gradering , die de vloeistof die wordt behandeld toestaat geheel of gedeeltelijk het filtratiemedium te passeren zonder toe te staan dat de affiniteitdeeltjes in aanmerkelijke mate het filtratiemedium passeren.

Wanneer de affiniteitdeeltjes en te behandelen vloeistof in de dynamische-filtratieinrichting worden geïntroduceerd, is aan de inrichting zodanig vorm gegeven dat elke vloeistof wordt verhinderd het filtratiemedium te passeren, bijvoorbeeld door toepassing van passende kleporganen voor afsluiten van de filtraatuitvoer.

De aandrijfmiddelen worden dan ingeschakeld (of kunnen tijdens de introduktie van de andere affiniteit deeltjes en te behandelen vloeistof worden ingeschakeld, teneinde menging te veroorzaken van de doelwitverbinding in de vloeistof die wordt behandeld met de affiniteit deeltjes om de bijbehorende wisselwerking zeker te stellen. Dit mengproces wordt gedurende een voldoende tijdsperiode voortgezet, bijvoorbeeld tot de adsorptie van de doelwit verbinding op de affiniteitdeeltjes een maximum of even-wichtsniveau heeft bereikt. Als een resultaat van de samenhangende en reproduceerbare wisselwerking van de doelwit verbinding en de affiniteitdeeltjes, maakt het mengproces grote precisie mogelijk bij het werken met vergelijkbare ladingen vloeistof wat betreft de hoeveelheid affiniteit deeltjes die moet worden toegepast voor isoleren van de doelwitverbinding en de tijdsduur van wisselwerking tussen de vloeistof die de doelwitverbinding bevat en de affini -teitsparels. Aldus voorziet de uitvinding in een snelle-cyclusproces en het efficiënte en besparende gebruik van affiniteitdeeltjes in permanente fabrikageprocessen waarin vergelijkbare vloeistoffen op routinebasis worden behandeld.

De affiniteitdeeltjes worden dan uit de vloeistof afgescheiden door de vloeistof het filtratiemedium te laten passeren. Een dergelijke scheiding kan worden bewerk stelligd door bijvoorbeeld openen van de filtraatuitvoer, terwijl de aandrijfmiddelen bij voorkeur continu op normale wijze werkzaam zijn. De affiniteitdeeltjes worden dan bij voorkeur gewassen met een geshcikte oplossing, bijvoorbeeld een wasbuffer, ter verwijdering van elk restant vloeistof.

De doelwitverbinding wordt gewonnen door elueren van de verbinding van de affiniteitdeeltjes. Een dergelijke elutie kan met elke geschikte techniek worden uitgevoerd, bij voorkeur door de affiniteitdeeltjes te verpakken in een geschikte houder, bijvoorbeeld een kolom, en laten passeren van het eluens, bijvoorbeeld desorptiemiddel, door de houder over de affiniteitdeeltjes ter verwijdering van de doelwitverbinding van de affiniteitdeeltjes. Teneinde de hoeveelheid eluens te minimaliseren en daarbij de concentratie aan de gewonnen verbinding te verhogen, worden de affiniteitdeeltjes zo dicht als mogelijk is in de elutiehouder gepakt. De doelwitverbinding zal normaliter in het eluens aanwezig zijn in een concentratie die renminste ongeveer 10-voudig, bij voorkeur tenminste ongeveer 20-voudig groter is dan de concentratie van de doelwitverbinding in de onbehandelde vloeistof, dat is de vloeistof voorafgaande aan contact met de affiniteitdeel-tjes. Meest gewenst is dat de hoeveelheid eluens die door de elutiehouder wordt geleid equivalent zal zijn aan ongeveer het volume vna de vrije ruimte, of tenminste niet meer dan ongeveer dan 2 of 3 maal het volume van de vrije ruimte, van de elutiehouder, bijvoorbeeld ongeveer de helft vanhet volume van een kolom die dichtgepakt is met in hoofdzaak monodisperse bolvormige affiniteitdeeltjes.

De relatieve afmetingen van de grootste afval in de te behandelen vloeistof, poriën van het filtratiemedium en de diameter van de affiniteitsparels zijn belangrijk bij de praktische toepassing van de inventieve affiniteit scheidingmethode. Idealiter zal het filtratiemedium alle vloeistof( daaronder begrepen de grootste afval ) dit te passeren terwijl de affiniteitdeeltjes worden verhinderd dit te passeren. Het filtratiemedium zal derhalve bij voorkeur een poriegrootte bezitten die tenminste een faktor 2, en bij voorkeur een faktor 5 of 10, groter is dan het grootste afvalmateriaal in de te behandelen vloeistof, en de affiniteitdeeltjes zullen bij voorkeur tenminste een faktor 2 en bij voorkeur een faktor 5 of 10 groter zijn dan de porieafmeting van het filtratiemedium. Indien aldus het grootste afcalmateriaal in de vloeistof dat moet worden behandeld van de orde van ongeveer 0,1-0,2 ^,um is, zal de poriegrootte van het filtratiemedium bij voorkeur van de orde van grootte van 1-3 ^um zijn, terwijl de affiniteitdeeltjes bij voorkeur zullen zijn van de corde van ongeveer 10-20 ^um.

In het algemeen hebben de kleinste aanvaardbare affiniteitdeeltjes, bijvoorbeeld affiniteitdeeltjes van 60 yum diameter of minder, in het bijzonder affiniteitdeel-tjes van 20 ^um diameter of minder, worden met voorkeur toegepast ter verbetering van de winning van de doelwit verbinding door verhoging van het beschikbare oppervlak per gewichtseenheid van de affiniteitdeeltjes voor wisselwerking met de vloeistof die wordt behandeld. Dienovereen komstig, terwijl voorbehandeling van de te behandelen vloeistof in samenhang met de onderhavige inventieve methode in het algemeen genomen ongewenst is aangezien hij het winningsrendement van de doelwitverbinding nadelig beïnvloedt door introduktie van een aanvullende bewerkings-trap, kunnen er gevallen zijn waarbij het verlies aan winningsrendement die het resultaat is van voorbehandeling, in het bijzonder voorfiltreren en/of homogeniseren, ter vermindering van de afmeting van het grootste afval in de vloeistof, meer dan zal worden gecompenseerd door het verkregen vermogen kleinere affiniteitdeeltjes te gebruiken die een groter oppervlak per gewichtseenheid van de affini-teitsdeeltjes bezit.

De uitvinding kan verder worden begrepen onder verwijzing naar de begeleidende tekeningen. Figuur 1 beeldt schematisch af de significante elementen die worden gebruikt in een voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding.

Bij aanvang van de werkwijze volgens de uitvinding, bevindt de te behandelen vloeistof die de doelwitverbinding bevat die uit de overgebleven vloeistof moet worden afgescheiden , in bewaarvat 1, terwijl de affiniteitdeeltjes zich bevinden in bewaarvat 2. Zowel de vloeistof als de affiniteit deeltjes worden overgebracht naar een buffervat 3 waar zij worden gecombineerd ter vorming van een mengsel en bij voorkeur bewogen,bijvoorbeeld geroerd. Het mengsel wordt dan overgebracht naar de dynamische-filtratieinrich-ting 4 via invoer 5, hoewel de vloeistof en affiniteitdeeltjes direkt zouden kunnen worden overgebracht naar de dynamische-filtratieinrichting 4 zonder passeren van het buffervat 3. Het mengsel wordt onderworpen aan de mechanische beroering van de dynamische-filtratieinrichting 4 zonder dat de vloeistof het filtratiemedium van de dynamische-filtratieinrichting 4 passeert, door bijvoorbeeld de filtraatklep 7 die in gesloten positie is.

Na, of zelfs gedurende geschikt beroeren, wordt een gedeelte of het gehele mengsel overgebracht via concen-traatklep 8 in een lading of continu ( in-leiding) proces naar een detectievat 9 waarin de concentratie van de doelwitverbinding in de vloeistof die ongebeonden van de affiniteitdeeltjes zijn gebleven, wordt bepaald. Een dergelijke detectie kan, indien gewenst, ook plaats hebben op continu of intermitterende basis binnen de dynamische-filtratieinrichting 4. Voorts kan er in een permanent fabrikageproces waarbij vergelijkbare vloeistofladingen herhaaldelijk worden behandeld geen noodzaak zijn voor een detectieorgaan na bepaling van een geschikte hoeveelheid vloeistof, affini-teitdeeltjes en verblijftijd in de dynamische-filtratiein-richting aangezien de onderhavige werkwijze met betrekking tot de winning van de doelwitverbinding behoorlijk consistent en reproduceerbaar is. Naar mate de detectiemiddelen worden gebruikt beheersen dergelijke detectiemiddelen echter bij voorkeur opening en sluiting van filtraatklep 7, concentraatklep 8 en wasbufferklep 11, onder het daarbij beheersen van de stroomrichting van het mengsel en de initiering en terminering van het filtratieproces onder toepassing van de dynamische-filtratieinrichting 4.

Indien een afzonderlijk detectievat 9 wordt gebruikt en de concentratie van ongebonden doelwitverbinding in de vloeistof groter is dan een voorgeselekteerd niveau, wordt het mengsel teruggebracht naar de dynamische-filtra-. tieinrichting 4 via buffervat 3 en de eerder beschreven methodologie. Deze werkwijze wordt herhaald tot de concentratie aan ongebondendoelwitverbinding in de vloeistof ligt beneden het voorgeselekteerde niveau, daarbij aangevend dat een voldoende hoeveelheid van de doelwitverbinding op de affiniteitdeeltjes geadsorbeerd is.

Wanneer , op welke wijze dan ook, bepaald is dat een voldoende hoeveelheid doelwitverbinding op de affiniteitdeeltjes geadsorbeerd is, wordt de filtraatklep 7 geopend zodat de vloeistof het filtratiemedium van de dynamische-filtratieinrichting 4 passeert in afvalvat 6 onder het daarbij achterlaten van de affiniteitparels in de dynamische-filtratieinrichting 4. De filtraatklep 7 wordt dan normaliter gesloten, hoewel, als een alterna tie, een aanvullende hoeveelheid vloeistof in dit dynamische -filtratieinrichting 4 kan worden geleid voor het in aanraking brengen met de affiniteitparels, in het bijzonder indien de affiniteitparels niet verzadigd zijn met de doelwitverbinding. Dergelijke aanvullende hoeveelheid vloeistof kan in de dynamische-filtratieinrichting 4 worden geleid op een continue of semi-continue wijze terwijl een zelere hoeveelheid van de vloeistof in de dynamische-filtratieinrichting 4 voortgaat met passeren van het filtra-tiemedium van de dynamische-filtratieinrichting 4.

Nadat de toevoeging van vloeistof in de dynamische-filtratieinrichting 4 voltooid is en de vloeistof binnen de dynamische -filtratieinrichting 4 het filtratiemedium van de dynamische-filtratieinrichting 4 heeft gepasseerd, wordt de wasbufferklep 11 geopend om wasbuffer uit wasbuffervat 10 toe te staan de dynamische-filtratieinrichting 4 binnen te komen. De wasbuffer wordt toegestaan zich te mengen met de affiniteitdeeltjes gedurende een geschikte tijdsperiode, waarna de filtraatklep 7 weer wordt geopend om de wasbuffer toe te staan het afvalvat 6 te passeren. Normaliter zullen er een aantal van dergelijke wascycli zijn om zekrer te stellen dat de vloeistof die wordt behandeld, met uitzondering van de doelwitverbinding die aan de affiniteitdeeltjes gebonden is, uit de dynamische-filtratieinrichting 4 verwijderd is.

De affiniteitdeeltjes worden dan overgebracht naar het elutie opvangvat 13 via de concentraatklep 8. Een dergelijke overdracht kan worden bewerkstelligd door toepassing van wasbuffer uit wasbuffervat 10 voor transporteren van de affiniteitdeeltjes naar elutie ontvangvat 13 waarin zij met voorkeur dicht worden gepakt. Eluens-klep 14 wordt dan geopend om eleuens toe te staan vanuit eluensvat 15 het elutieontvangvat 13 te passeren ter verwijdering van de doelwitverbinding van de affiniteitdeeltjes en leiden van de doelwitverbinding door elutieontvangvat 13 voor verzamelen. Wanneer de effluentstroom het elutie ontvangvat 13 verlaat, passeert hij bij voorkeur een eff luent detectieorgaan 16 dat de spiegel van de doelwitverbinding in de effluentstroom volgt en de eluens klep sluit wanneer de concentratie van de doelwitverbinding een vooraf bepaalde niveau bereikt, bijvoorbeeld ongeveer 0.

De affiniteitdeeltjes, die niet langer de doelwit verbinding daaraan gebonden bevatten, worden dan opnieuw gebruikt. Bij voorkeur wordt een suspensiebuffer in het elutie ontvangvat 13 geïntroduceerd vanuit een suspensie buffervat 12 teneinde de affiniteitdeeltjes over te brengen uit elutie ontvangvat 13 nabewaren van twee voor daarop volgend hergebruik.

Door nauwkeurig in tijd de bewerkingen van de dyna-mische-filtratieinrichting 4 en de elutie van verbinding in elutie ontvangvat 13 op elkaar af te stemmen, kunnen de twee inrichtingen gelijktijdig worden bedreven, aldus omzetting van ladingsgewijs werken in een semi continue werkwijze. Figuur 1 is uiteraard louter een schematische weergave van een voorkeurverdienende uitvoeringsvorm volgens de uitvinding en de aktuele inrichting en de plaatsing daarvan kunnen aanmerkelijk worden gevarieerd voor andere uitvoeringsvormen van de uitvinding. Zo kunnen bijvoorbeeld de detectieorganen 9 gescheiden van de dynamische- filtratieinrichting 4 gelocaliseerd zijn, of kunnen in de dynamische-filtratieinrichting gelocaliseerd zijn met betrekking tot het eleimineren van de noodzaak voor overbrengen van het mengsel in en uit de dynamische-filtratie inrichting 4. Analoog kan het detectieorgaan 16 apart van of in elutie ontvangvat 13 worden gelocaliseerd, en kan de elutie van de doelwitverbinding uit de affiniteit deeltjes plaats hebben in elutie ontvangvat 13 of in enig andere geschikte inrichting. Andere variaties zullen de vakman bekend zijn. Analoog zijn verwijzingen naar gebruikelijke componenten zoals leidingen en pomporganen uit figuur 1 achterwege gelaten, evenals van de bovenstaande bespreking , uit overwegingen van duidelijkheid. De toepassing van dergelijke componenten in de context van de uitvinding ligt binnen het vermogen van de deskundige.

Affiniteitdeeltjes

Elke geschikte affiniteitdeeltje kan in samenhang met de uitvinding worden gebruikt. De affiniteitdeeltjes omvatten een substraat en een ligand op het oppervlak daarvan die in staat is tot binden aan de doelwitverbinding in een vloeistof teneinde afscheiding van die verbinding uit de rest van de vloeistof mogelijk te maken en vervolgens in staat te zijn van de affiniteitdeeltjes te worden verwijderd. Geschikte affiniteitdeeltjes, waaronder geschikte substraten en liganden , zijn in de techniek bekend. Vele van dergelijke affiniteitdeeltjes worden gebruikt in de context van conventionele affiniteitscheidingmethoden en worden gelijkelijk of nuttiger gebruikt in samenhang met de onderhavige inventieve methode. Uiteraard zullen de affiniteitdeeltjes toegepast voor afscheiden van een bepaalde verbinding uit een bepaalde vloeistof variëren , in het bijzonder met betrekking tot de ligand gebonden aan het substraatoppervlak van het affiniteitdeeltje.

De juiste keuze van de ligand zal waarborgen dat de doelwitverbinding selektief en omkeerbaar bindt, bijvoorbeeld complexeerd met of adsorbeerd aan, het affiniteitdeeltje.

De affiniteitdeeltjes bezitten bij voorkeur een oppervlak dat glad is en niet-poreus ( dat wil zeggen ponen bezit van minder dan ongeveer 2000 angstrom in diameter of geen zichtbare poriën bezitten bij 10.000 X vergroting in een scanning elektron micrograaf) , die hydrofiel is ( dat is een kritische bevochtigingsoppervlakte spanning van tenminste ongeveer 72 dyne/cm bezit), en die een geringe susceptibiliteit bezit jegens niet-speci- fieke proteïne binding ( dat is dat binding slechts plaats heeft via de aangehechte liganden). De affiniteitdeeltjes zijn ook bij ovorkeur onderling homogeen, in het bijzonder wat betreft de hoeveelheid daaraan gehecht ligand, ter verschaffing van consistente en voorspelbare affiniteit-scheidingresultaten in de context van de uitvinding.

De affiniteitdeeltjes kunnen van elke geschikte vorm zijn maar zijn voorkeur nagenoeg bolvormig. Bovendien zijn de affiniteitdeeltjes bij voorkeur nagenoeg monodis-pers in diameter. Bolvormige affiniteitdeeltjes van analoge afmeting voorzien de meest efficiënte bewerking van de onderhavige inventieve methode, in het bijzonder met betrekking tot de hantering van de affiniteitdeeltjes. Dergelijke affiniteitdeeltjes zullen in het algemeen de geringste waarschijnlijkheid hebben voor creeren van stromingsproblemen en zullen minimalisering van de afmeting van het elutie ontvangvat en hoeveelheid eluens gebruikt voor verwijdering van de doelwitverbinding van de affiniteitdeeltjes mogelijk maken als een resultaat van de meer uniforme en dichte pakking die met dergelijke affiniteitdeeltjes kunnen worden bereikt.

De affiniteitdeeltjes kunnen van elke geschikte afmeting zijn. De gemiddelde diameter van de affiniteitdeeltjes zal normaliter minder zijn dan ongeveer 100 ^um, en gebruikelijker minder dan ongeveer 60 ^um. Zo zullen de affiniteitsdeeltjes bij voorkeur een gemiddelde diameter bezitten van minder dan ongeveer 20 ^um, en met meer voorkeur minder dan ongeveer 10 yiirn. Voor vele toepassingen zullen de affiniteitdeeltjes met voordeel een diameter bezitten van ongeveer 1 tot ongeveer 5 ^um. Zoals eerder is beschreven zijn de affiniteitdeeltjes bij voorkeur nagenoeg monodispers in diameter zodanig , dat het trajekt van diameters bij voorkeur niet meer verschilt dan ongeveer 50%, met meer voorkeur ongeveer 25% en met meeste voorkeur ongeveer 10%, als bepaald door delen van de diameter van het kleinste deeltje door de diameter van het grootste deeltje. De diameters van de affiniteitdeeltjes kunnen worden bepaald door bekende middelen zoals via toepassing van electron scanning micrografie.

In elk geval is het gewenst dat nagneoeg alle affi-niteitdeeltjes niet het filtratiemedium passeren, aangezien de affiniteitdeeltjes die dit doen een verlies in affini-tietdeeltjes vertegenwoordigen evenals een afname in het winningsrendement van de doelwitverbinding gegeven dat een dergelijke passage plaats heeft nadat de doelverbinding aan de affiniteitdeeltjes werd gebonden. Teneinde een dergelijk verlies in affiniteitdeeltjes te vermijden, worden de substraatdeeltjes bij voorkeur blootgesteld aan het filtratiemedium dat in de dynamische-filtratie inrichting wordt toegepast, voorafgaande aan verdere bewerking. Op deze wijze worden susbstraatdeeltjes welke het filtratiemedium zouden passeren, verwijderd voorafgaande aan d ehechting van het ligand dat de doelwitverbinding bindt. Het rendmeent van de totale affiniteitscheidingme-thode wordt daarbij verbeterd door zekerstelling van de nagenoeg absolute winning van de affiniteitdeeltjes met de gebonden doelwitverbinding en versmalling van de groot-teverdeling van de affiniteitdeeltjes voor verbeterde hantering. De grootteverdeling van de aldus verkregen affiniteitdeeltjes kan verder worden verbeterd door verandering van het filtratiemedium tot een die een grotere porieafmeting bezit en weer opnieuw blootstellen van de substraatdeeltjes aan het dynamische filtratieproces.

De gewonnen substraatdeeltjes die het filtratiemedium bij deze tweede passage passeren zal een zelfs nog nauwere grootteverdeling bezitten ( in hoofdzaak beperkt aan liet lage einde door de porieafmeting van het eerste filtratie medium en in hoofdzaak beperkt aan het boveneinde door de porieafmeting van het tweede filtratiemedium). Hoewel dergelijke methoden ter beheersing van de grootte bij voorkeur worden uitgevoerd aan de substraatdeeltjes voorafgaande aan hechting vanhet ligand daaraan, kunnen de technieken uiteraard ook worden gebruikt voor grootteregeling van de affiniteitdeeltjes ( dat is na hechting van het ligand aan de substraatdeeltjes).

De affiniteitdeeltjes kunnen elke geschikte dichtheid bezitten. De affiniteitdeeltjes bezitten met voordeel een gemiddelde dichtheid die zich uitstrekt van ongeveer o 3 0,5 g/cm tot ongeveer 3,0 g/cm , bij voorkeur ongeveer 3 3 1 g/cm tot ongeveer 2 g /cm , en met meeste voorkeur

O

ongeveer 1 g /cm , om geschikt drijvend vermogen van de media tijdens bewerking zeker te stellen.

Substraatdeeltjes

Elk geschikt su· bstraat kan worden gebruikt voor het maken van de affiniteitdeeltjes. Zoals hierbovenis besproken , is het oppervlak van de affiniteitdeeltjes bij voorkeur glad, niet-poreus en hydrofiel, en bezit een geringe susceptibiliteit voor de adsorptie van verbindingen, in het bijzonder proteïnen. Het substraat kan een homogeen materiaal zijn dat bij voorkeur aan de voren genoemde voorkeurskarakteristieken voldoet, of kan meer dan een materiaal omvatten ( bijvoorbeeld een kernmateriaal bekleed met een ander materiaal), de oppervlakte waarvan bij voorkeur aan de voren genoemde voorkeurskarakteristieken voldoet. Aldus kunnen bijvoorbeeld de substraatdeeltjes een homogeen niet-poreus materiaal omvatten, een poreus kernmateriaal bekleed met een niet-poreus polymeermateriaal, of zelfs een niet-poreus kernmateriaal bekleed met een niet-poreus polymeermateriaal. Terwijl de substraatdeeltjes bijvoorbeeld een homogeen poreus materiaal of zelfs een kernmateriaal bekleed met een poreus materiaal kunnen omvatten, hebben dergelijke substraatdeeltjes geen voorkeur voor toepassing bij de werkwijze volgens de uitvinding.

De substraatdeeltjes worden bij voorkeur bereid uit glas, aluminiumoxyde , staal ( inhet bijzonder roestvast staal), siliciumoxyde, SiAl,diatomeeënaarde, of, bij voorkeur een polymeer materiaal zoals bijvoorbeeld polystyreen, polyetheen, polytetrafluoretheen, cellulose, cellulose esters, polycarbonaat, polystyreen, acrylonitrile butadieen-styreen, polyfenyleenoxydepolymeer, polysiloxaan, en latex. Het blootgestelde oppervlak van het substraat moet binding toestaan van een geschikt ligand, dat niet wordt losgelaten tijdens verdere bewerking. Het susbstraat moet mechanisch stabiel, niet-zwellend, en niet-reaktief zijn bij blootstelling aan de te behandelen vloeistof.

Andere kenmerken van het substraat zullen variëren met de betreffende te behandelen vloeistof en de daaruit af te scheiden doelwitverbinding. Het substraat kan bijvoorbeeld zodanig worden gekozen dat de affiniteitdeeltjes een gewenste mate van drijfvermogen bezitten, bijzonder bruikbare substraten voor de affiniteitscheiding van proteïne omvatten hoge- en lage-dichtheid polyethenen in de Microthene Series , te betrekken van Quantum Chemical ( soortelijk gewicht : 0,92-0,96; oppervlakte : < 1 m /g; gemiddelde grootte: ongeveer 20 ^um, met ongeveer 10% can de deeltjes groter danongeveer 50 ^um die kunnen worden afgescheiden) en PTFE-30 te betrekken bij Dupont ( gemiddelde grootte: ongeveer 0,1 tot 0,5 ^um).

Naarmate het substraat bekleed is om het substraat glad, niet-poreus, hydrofiel en/of minder vatbaar voor proteinebinding te maken, kan elk polymeer als het bekle-dingsmateriaal worden toegepast zo lang als een geschikt ligand daaraan kan worden gehecht voor gebruik bij isoleren van de doelwitverbinding. Elke geschikte methode voor Octrooiaanvrage nr. 0 007 244 hechting van een polymere bekleding op een kernmateriaal kan worden toegepast. Aldus kunnen methoden zoals monomeer stralingsenting ( in het bijzonder electronenbundelenting) en polymere oplossingbekleding op bevredigende wijze worden gebruikt.

Gemodificeerde cellulose en cellulose derivaten , zoals cellulose acetaat, zijn biocompatibele polymeren welke in het algemeen heel nuttig zijn in de ocntext van de uitvinding. Dergelijke gemodificeerde cellulosederivaten omvatten cellulosepolymeren, oppervlakte-gemodificeerd door covalent binden van zijwaartse biocompatibele opper-vlaktegroepen aan het cellulosesubstraat polymeer onder het meer biocompatibel maken daarvan. Hoewel vele geschikte oppervlaktegroepen in de techniek bekend zijn, heeft albumi-ne getoond bijzonder nuttig te zijn als een dergelijke modificerende groep. Geschikte polymeren voor oppervlaktebe-kleding van kernmaterialen omvatten homopolymeren en copo-lymeren welke kunnen worden bereid uit een brede reeks van monomeren. Zo omvatten bijvoorbeeld monomeren die bijzonder geschikt zijn voor stralingenting acryl- en methacrylzuren ( in het bijzonder hydroxyalkylacrylaten en hydroxyalkylmethacrylaten, bijvoorbeeld hydroxyethylacry laat, hydroxypropylacrylaat, en hydroxybutylmethacrylaat) en allylalcoholen. Polymeren die bijzonder geschikt zijn voor oplossingsbekleding omvatten hydroxy funktionele polymeren zoals allylalcoholen, polyvinylalcoholen, poly acrylamiden vinylglycidylethers en allylglycidylethers.

Vele andere monomeren en polymeren kunnen uiteraard bij het maken van affiniteitdeeltjes voor toepassing in de context van de uitvinding' worden gebruikt.

Het oppervlak van het substraat, dat al dan niet een homogene, of beklede-kern-type substraat is, is bij voorkeur zodanig dat hij een geringe of geen affiniteit bezit voor de doelwitverbinding in de te behandelen vloei- stof. Een dergelijk oppervlak waarborgt dat de doelwitver-binding omkeerbaar zal complexeren of anderszins hechten aan het ligand of het oppervlak van de substraatdeeltjes liever dan het oppervlak van de substraatdeeltjes op zichzelf waarbij de doelwitverbinding te zwak of te sterk kan worden gehecht om verloren of niet-winbaar te geraken bij verdere bewerking. Het substraatopperlvak is eveneens bij voorkeur spontaan bevochtigbaar door de te behandelen vloeistof bijvoorbeeld hydrofiel, om een goed contact zeker te stellen tussen de affiniteitdeeltjes en de te behandelen vloeistof en daarbij goed winningsrendement van de doelwitverbinding uit de vloeistof die wordt behandeld. Bovendien is het oppervlak van het substraat bij voorkeur glad om hechting van materiaal anders dan de doelwitverbinding aan de aangehechte ligand op het oppervlak van de affini-teitdeeltjes te minimaliseren en te voorzien in gemakkelijk reinigen van de affiniteitdeeltjes. Het substraat is bij voorkeur in staat vele malen opnieuw te worden gebruikt en dient chemisch stabiel te zijn zodanig dat hij niet ontleedt of anderszins verontreinigingsproblemen veroorzaakt.

Ligand

Het ligand kan elke chemische funktionaliteit zijn die kan worden gehecht aan substraatdeeltjes zonder tijdens opvolgende bewerkingen te worden verwijderd en zal selektief binden met de doelwitverbinding zoals anti-lichamen, antigenen, proteïnen, nucleinezuren, complement componenten, hormonen, vitaminen en dergelijke. Het ligand zal normaliter worden verschaft door reageren van een bepaalde verbinding die de gewenste funktionaliteit bezit met de substraatdeeltjes, maar kan ook een integraal deel van het substraatdeeltje zijn , bijvoorbeeld, van de polyme-re bekleding of een kernmateriaal.

Methoden voor hechting van het ligand aan de sub-straatdeeltjes zijn aan de vakman bekend. Geschikte hech-tingsmethoden omvatten spontane covalente hechting, chemische aktivering van terminale funktionele groepen, en hechting van koppelingsreagens.

Spontane covalente hechting van bepaalde liganden aan polymeren steunoppervlakken loopt via chemisch reaktie-ve groepen die zich uitstrekken van de polymere ondersteuning. Reaktieve groepen bijvoorbeeld zoals aldehyde en epoxy die zich uitstrekken van de polymere ondersteuning, koppelen aldus vlot liganden die beschikbare hydroxyl, amino, of thiolgroepen bevatten. Vrije aldehyde groepen op de polymere ondersteuning koppelen bijvoorbeeld ook via acetaalbindingen met hydroxyl—bevattende verbindingen en via imide bindingen met amino-bevattende verbindingen. Daarenboven koppelen bijvoorbeeld vrije oximgroepen via alkylamine, ether, en thioetherbindingen met verbindingen die respektievelijk amino, hydroxyl, en thiogroepen bevatten. Meer uitgebreide besprekingen van deze reakties kunnen bijvoorbeeld worden gevonden in Chen et al., " Chemical Procedures for Enzyme Immobilisation of Porous Cellulose Beads, " Biotechnology and Bioengineering, XIX,1463-1473, (1977), en in "Epoxy Activated Sepharose, " Pharmacia Fine Chemicals ( Affinity Chromatography), 6B, 27-32 ( 1979) .

Chemische aktivering van terminale funktionele groepen kunnen worden bewerkstelligd door aktivering van funktionele groepen aan een polymeeroppervlak door chemische modificatie aan de terminale componenten daarvan.

Deze werkwijze kan worden toegelicht door oxydatie van terminale epoxyfuncties met perjoodzuur ter vorming van aktieve aldehydegroepen. Deze werkwijze wordt verder toegelicht in bijvoorbeeld Svec et al., " Immobilisation of Amyloglucosidose on Poly

( Glycidyl Methacrylate) Co ( Ethylene Dimethacrylate )_7carrier and Its Derivates," Biotechnology and Bioengineering, XX, 1319-1328 ( 1978) .

De immobilisatie van het ligand zoals een ligand kan verlopen zoals hierboven beschreven. Condensatiereakties kunnen worden bewerkstelligd tussen vrije carboxyl en aminegroepen via carbodiimide aktivering van de carboxygroepen zoals beschreven is in bijvoorbeeld Hoffman et al., " New Approaches tot Non-Thrombogenic Materials," Coagulation-Current Research and Clinical Applications, ( Academie Press, New York 1973) . De immobilisatie van de liganden wordt gerealiseerd door carbodiimide aktivering door hetzij de polymeer, hetzij ligand carboxylgroepen en condensatie met een vrij amine ter vorming van een stabiele peptide binding. De eindorientatie is algemeen een faktor met betrekking ertoe of een amine of een carboxyl bevattend polymeer gebruikt is.

Koppeling reagens hechting kan worden gerealiseerd onder toepassing van een verscheidenheid van koppelings agentia ter vorming van covalente bruggen tussen polymeren enaliganden. Vrije hydroxyl en/of amine bevattende polymeren en liganden kunnen covalent worden gekoppeld door reagentia zoals bijvoorbeeld cyanogeen bromide, diisocyanaten, dial-dehyden, en trichloor-2-triazine. Een meer uitputtende bespreking van deze techniek kan bijvoorbeeld worden gevonden in de Chen et al. literatuurplaats , welke hierboven geciteerd is.

De voorkeurverdienende methode voor immobiliseren van een ligand op een polymeer substraat in een bepaald geval wordt in het algemeen gedicteerd door de moleculaire locaties van het reaktieve bindingsdeel van het ligand en de bepaalde funktionele groepen van het ligand en polymeer substraat die covalent kunnen worden gecombineerd.

Zo heeft bijvoorbeeld tegenwoordig voorkeur om in het geval van polymeersubstraten die terminale hydroxyfunkties bevatten te aktiveren door behandeling met een alkalische oplossing van cyanogeenbromide ( bijvoorbeeld 10-2% w/v). Normaliter wordt het reaktiemengsel bij kamertemperatuur gehandhaafd ( bijvoorbeeld 20-25°C) gedurende ongeveer 30 minuten. De pH van de oplossing wordt gehandhaafd in een gebied van ongeveer 10 tot 12 door toevoeging van alkalisch materiaal, bijvoorbeeld KOH of NaOH. Het polymeer wordt dan uitgebreid gewassen met fysiologische zoutoplossing ( 0,9 g %) en geincubeerd met oplossingen van een gezuiverd ligand, opgelost in een licht alkalische buffer oplossing, gedurende 12-16 uren bij 2-8°C. Het polymeer wordt uitgebreid gespoeld met fysiologische zoutoplossing ter verwijdering van niet-gebonden of niet-specifiek-gebonden liganden.

Analoog worden liganden bij voorkeur op glycidyl bevattende polymeren geïmmobiliseerd via ether, thioether of alkylamine bindingen. Epoxy-geaktiveerde polymeersub-straten worden gespoeld en gezwollen met waterige neutrale bufferoplossingen bij kamertemperatuur. Gezuiverde liganden , opgelost boraat carbonaat, of fosfaatbuffer oplossingen worden met glycidylpolymeersubstraat gedurende 12-20 uren bij 4-30°C geincubeerd. Overmaat en niet-spe-cifiek gebonden liganden worden verwijderd door spoelen van het polymeer met zoutoplossing, azijnzuur ( 0,2-1,0 M) , en fosfaat-gebufferd ( pH = 7,2 ±/ - 0,2= zoutoplossingen. Aktivering van amine en carboxyl bevattende polymeer matrices wordt gerealiseerd door behandeling met gezuiverde liganden opgelost in licht zure ( pH = 4,5-6,5) bufferoplossingen van een water-oplosbaar carbodiimide. De liganden zijn covalent gekoppeld aan een polymeer substraat door incubatie van het polymeersubstraat, ligand en carbodiimide reactanten gedurende 12-16 uren bij 2-8°C. De polymeer-ligand conjugaten worden afwisselend gewassen in zuur en daarna alkali besproeiingen tot de sproeioplossingen helder van ligand en carbodiimide reactanten zijn.

bij wijze van verder voorbeeld, wordt een werkwijze van binding van liganden aan het oppervlak van susbstraat deeltjes beschreven in Amerikaans octrooi 5,077,210.

Een silaan wordt aan het silaan gebonden en koppelt aan een heterobifunktionele verknoper aan een funktionele groep van het ligand, daarbij een andere funktionele groep achterlatend die vrij is te binden aan de doelwitverbin-ding zoals een proteïne. Bij voorkeur bezit het silaan een funktionele groep die reageert met de hydroxylgroep van het substraat en een thiolterminale groep die reageert met een funktionele groep van een heterobifunktioneel verknopingsmiddel dat een succinimidegroep voor daaropvolgende reaktie met een aminogroep van een doelwitverbinding, zoals een proteine, bevat.

Een werkwijze voor binding van antilichamen aan het oppervlak van substraatdeeltjes wordt beschreven door Amerikaans octrooi, 4,357,311. Deze werkwijze omvat het covalent binden van een antilichaam via trichloor-triazine ter verschaffing van de affiniteitdeeltjes. Voorts worden talrijke methoden voor immobiliseren van enzymen op het oppervlak van substraatdeeltjes geopenbaard in " Enzyme Technology" ( Noyes Data Corporation 1983) , in het bijzonder op bladzijden 38 tot 59 daarvan.

Afstandhouders kunnen eveneens worden gebruikt bij bereiding van affiniteitdeeltjes voor toepassing bij de onderhavige inventieve affiniteit scheidingmethode.

Een spacer is in het algemeen een molecuul dat tenminste twee reaktieve funktionele groepen bevat welke gelijk of verschillend kunnen zijn, gesitueerd aan tegenovergestelde einden van het molecuul en wordt gebruikt voor binden van de substraatdeeltjes en het ligand. Afstandhou-ders kunnen worden toegepast voor het vergemakkelijken van de hechting van een ligand aan substraatdeeltjes en om zeker te stellen dat het ligand voldoende weg van de substraatdeeltjes wordt gehouden om meer efficient contact te hebben met de te behandelen vloeistof en, meer in het bijzonder, de doelwitverbinding. Geschikte afstandhouders waarin de reaktieve funktionele groepen gelijk zijn omvatten bijvoorbeeld 6-diaminohexaan, divinyl sulfon, glutaraldehyde, 1,4-cyclohexaan dicarbonzuur, ethyleen diamine tetraazijnzuur, triethyleen glycol, 1,4-butaan diol diglycidyl ether, methyleen-p-fenyl-diisocyanaat en barnsteenzuur anhydride. Geschikte afstandhouders waarbij de reaktieve funktionele groepen niet dezelfde zijn omvatten bijvoorbeeld 6-aminocapronzuur, p-nitrobenzoylchloride, l,2-epoxy-3-(p-nitrofenoxy) propaan, aminopropyltriethoxy-silaan, en homocysteinethioaceton. Polypeptiden, en meer specifiek proteïnen kunnen eveneens als spacers worden gebruikt. Albumine, een proteïne met geringe affiniteit is bijvoorbeeld succesvol· toegepast als een spacer, en albumine en andere natuurlijke proteïnen dienen ook de substraatdeeltjes meer biocompatibel te maken.

Dynamische-filtratieinrichting

De dynamische-filtratieinrichting kan elke geschikte dynamische-filtratieinrichting zijn. Het werkingsprincipe van een dynamische-filtratieinrichting is handhaving van een filtratiemedium vrij van verstopping of vervuiling door afweren van deeltjesvormig materiaal uit het filtratiemedium en door losscheuren van de vorming van koeklagen grenzend aan het filtratiemedium. Deze resultaten worden bewerkstelligd door voldoende snel ten opzichte van het filtratiemedium bewegen van de vloeistofstroom om hoge afschuifsnelheden te produceren evenals hoge hefkrachten op de deeltjes, bijvoorbeeld door toepassing van retatie-middelen die binnen de dynamische-filtratieinrichting werken die inwerken op de te behandelen vloeistof, hoewel andere middelen zoals oscillerende en reciprocerende middelen, vergelijkbaar kunnen worden toegepast voor bereiken van het vergelijkbaar effekt. De afschuiving aan het grensvlak vloeistof-filtratiemedium in een dynamisch-filtra-tieproces is nagenoeg onafhankelijk van kruisstroom vloeistof snelheid, anders dan bij tangentiale of kruisstroom filtratietechnieken ( die lijden aan andere problemen zoals voortijdige filterverstopping wegens adsorptie van verbinding en grote en niet-uniforme drukverlagingen verbonden met grote tangentiale snelheden langs de lengte van het filter, potentieel terugstroom door het filtratie medium veroorzakend en reduceren van de filtratie ).

Dynamische filtratie biedt in de ocntext van de uitvinding een aantal uitvoeringsvoordelen. De zeer hoge afschuifsnelheden, geproduceerd in het dynamische -filtratie samenstel verschaffen een uitstekend middel voor zekerstelling dat de affiniteitdeeltjes grondig in aanraking komen met de behandelde vloeistof zodat een hoog winnings-rendement van de doelwitverbinding wordt zeker gesteld. Aangezien bovendien wwargenomen is dat verhogingen in de snelheid van de doordringingsflux in sommige systemen ongeveer lineair zijn met verhoogde afschuifsnelheid, kan het filtratiegebied nodig voor efficient verwijderen van de behandelde vloeistof van de affiniteitdeeltjes ten opzichte van andere filtratiemiddelen dramatisch kan worden gereduceerd.

Een typische dynamische-filtratieinrichting omvat een buitenste ondoordringbare behuizing en een inwendig element dat het filtratiemedium bevat en dat ten opzichte van de vloeistof beweegt. Een verscheidenheid van geschikte aandrijforganen kan worden toegepast voor uitvoering van een dergelijke relatieve beweging zoals bijvoorbeeld rotatie, oxcillatie, of reciprocerende middelen. Geschikte cylindri- sche dynamische filtratiesystemen worden geopenbaard in Amerikaanse octrooien 3,797,662, 4,066,554, 4,093,552, 4,427,552, 4,900,440, en 4,956,102. Geschikte rotatie schijf dynamische filtratiesystemen worden geopenbaard in Amerikaanse octrooien 3,997,447, 4,956,102, en 5,037, 562, evenals in Amerikaanse octrooiaanvrage serie no. 07/812,123, ingediend 24 december , 1991. andere geschikte dynamische -filtratiesystemen worden geopenbaard in Amerikaans octrooi 4,952,317. Geschikte in de handel verkrijgbare dynamische filtratiesamenstellingen omvatten ASEA Brown Bovery rotatie CROT, Nw Logic V-SEP, en de filtra-tieinrichtingen besproeken in Murkes, " Fundamentals of Crossflow Filtration, " Separation and Purification Methods , 19_ (1) , 1-29 (1990) . Andere geschikte configuraties voor de dynamische-filtratieinrichting kunnen ook in de context van de uitvinding worden toegepast. Binnen de context van de uitvinding produceert de dynamische-filtratieinrichting bij voorkeur afschuifsnelheden van tenminste ongeveer 5.000 sec en met meer voorkeur tenminste ongeveer 10.000 sec

Het filtratiemedium, toegepast in samenhang met de dynamische-filtratieinrichting, kan elk geschikt filtratiemedium zijn en zal normaliter een poreus membraan zijn, bij voorkeur een microporeus polymeer membraan. Terwijl het filtratiemedium elke geschikte poriegrootte kan bezitten, bijvoorbeeld ongeveer 20 ^um of minder, ongeveer 10 yum og minder, ongeveer 5 ^um of minder, of zelfs 1 urn of minder, zal het filtratiemedium bij voorkeur toestaan dat alle of tenminste nagenoeg alle vloeistof die wordt behandeld het filtratiemedium passeert onder tegen-houding van alle of tenminste nagenoeg alle , affiniteit deeltjes. Aldus is de poriegrootte van het filtratiemedium in hoge mate afhankelijk van de afmeting van de affiniteit deeltjes en de afmeting van de grootste afval ( dat is niet-doelwitverbinding) in de behandelde vloeistof.

figuur 2 laat een voorkeurverdienende dynamische-filtratieinrichting voor toepassing bij de onderhavige inventieve affiniteitscheidingmethode zien. De dynamische-filtratieinrichting omvat een huis 20 met een toevoer voor 21, een concentraat poort 22, en een filtraatpoort 23. Een roterend orgaan 24 is binnen het huis 20 aangebracht tesamen met een filtratiemedium 25. De toevoer voor 21 en concentraat voor 22 staan in vloeistofcommuni-catie met de stroomopwaartse zijde van het filtratiemedium 25, terwijl de filtraatpoort 23 in vloeistofcommunicatie staat met de stroomafwaartse zijde van het filtratiemedium 25. Een elutieontvangvat 26 staat in vloeistofcommunicatie met de stroomopwaartse zijde van het filtratiemedium 25 en is verbonden met het huis 20 door middel van een elutie ontvangvat invoerklep 27 die de stroom van de affiniteit deeltjes en vloeistoffen in de top van het elutie ontvangvat 26 kan beheersen. Het elutie ontvangvat 26 bezit ook een elutie ontvangvat uitvoerklep 28 bij de bodem van het elutie ontvangvat 26 die de instroom en uitstroom van vloeistoffen in het elutie ontvangvat 26 kan beheersen.

tijdens gebruik wordt een mengsel van de vloeistof die de doelwitverbinding bevat en de affiniteitdeeltjes aan het huis 20 van de dynamische-filtratieinrichting toegevoerd via toevoerpoort 21. Het rotatieorgaan 24 wordt geaktiveerd gedurende een voldoende tijdsperiode om binding van de doelwitverbinding met de affiniteitdeeltjes binnen de dynamische-filtratieinrichting te effektueren, waarbij de ocncentraatpoort 22 en filtraatpoort 23 worden gesloten zodat niets van het mengsel het filtratiemedium 25 kan passeren.

Het mengsel wordt dan door filtratiemedium 25 gefiltreerd door openen van filtraatpoort 23 om de vloeistof toe te staan te worden verwijderd uit het inwendige van de dynamische-filtratieinrichting. Wasbuffer kan in de dynamische-filtratieinrichting worden geïntroduceerd via toevoerpoort 21 ter verwijdering van niet-gebonden materiaal uit het inwendige van de dynamische-filtratieinrichting , en de wasbuffer kan vervolgens worden toegestaan de filtraatpoort 23 te passeren. Meervoudige wastrappen, indien gewenst, kunnen uiteraard op dezelfde wijze worden uitgevoerd. De affiniteitdeeltjes worden dan overgebracht naar het elutie ontvangvat 26 via elutie ontvangvat invoer-klep 27, bij voorkeur door de introductie van een kleine hoeveelheid wasbuffer in de dynamische-filtratieinrichting. Teneinde te waarborgen dat het gehele dode volume van de dynamische-filtratieinrichting efficient en volledig wordt gedraineerd in het elutie ontvangvat 26, wordt de dynamische-filtratieinrichting bij voorkeur iets verplaatst, bijvoorbeeld 5-10 0 ten opzichte van de horizontaal met het elutie ontvangvat gelocaliseerd bij het lage punt van de dynamische-filtratieinrichting.

Vervolgens wordt eluens in het elutie ontvangvat 26 geïntroduceerd via bijvoorbeeld toevoerpoort 21 en elutie ontvangvat invoerklep 27, ter verwijdering van de doelwitverbinding van de affiniteitdeeltjes, die uit het elutie ontvangvat 26 kan worden afgevoerd via elutie ontvangvat uitvoerklep 28. Nadat de doelwitverbinding van de affiniteitdeeltjes verwijderd is en gewonnen, kunnen de affiniteitdeeltjes vervolgens opnieuw worden gebruikt door bijvoorbeeld introduceren van een suspensiebuffer in het elutie ontvangvat 26 via elutie ontvangvat uitvoer klep 28 om de affiniteitdeeltjes over te brengen terug naar de dynamische-filtratieinrichting via elutie ontvangvat invoerklep 27. De suspensiebuffer kan dan desgewenst worden verwijderd via filtraatpoort 23 , en het proces herhaald met aanvullende vloeistof die de doelwitverbinding bevat.

Figuur 2 is uiteraard louter een schematische weergave van een voorkeursuitvoeringsvorm van de inrichting die bruikbaar is ter uitvoering van de onderhavige inventieve methode, en bijzondere aspekten van een aktuele inrichting voor toepassing bij de uitvinding kunnen aanmerkelijk worden gevarieerd. Zo kunnen bijvoorbeeld detectieorganen worden gelocaliseerd binnen de dynamische-filtratieinrich-ting ter bepaling van de hoeveelheid niet-gebonden doelwit verbinding. Analoog kan een detectieorgaan worden gelocaliseerd apart van of in het elutie ontvangvat ter bepaling van de hoeveelheid doelwitverbinding die van de affiniteit deeltjes geelueerd is. Andere variaties zullen de vakman duidelijk zijn. Zo zijn om vergelijkbare redenen verwijzingen naar gebruikelijke componenten zoals leidingen en pomporganen uit figuur 2 achterwege gelaten, evenals uit de bovenstaande bespreking, uit overwegingen van duidelijkheid. De toepassing van dergelijke componenten in de ocntext van de uitvinding valt binnen het vermogen van op het betreffende gebied deskundige.

Toepassingsvoorbeelden

De onderhavige werkwijze kan worden gebruikt voor het afscheiden of isoleren van iedere verbinding uit iedere vloeistof zo lang de verbinding en vloeistof geschikt zijn voor affiniteitscheiding. De onderhavige inventieve methode kan bijvoorbeeld worden gebruikt voor isoleren van proteïnen en antilichamen uit vloeistoffen zoals fer-mentatieprodukten, melk en vol bloed of serum. De onderhavige inventieve methode kan ook worden gebruikt voor isoleren van een bepaald stereoisomeer uit een racemisch mengsel.

De werkwijze volgens de uitvinding is bijzonder goed geschikt voor de isolatie of afscheiding van een proteïne uit een verdunde proteine-beladen fermentatie bouillon aangezien de werkwijze volgens de uitvinding niet nodig heeft dat de bouillon wordt voorbehandeld ter verwijdering van ongewenste verontreinigingen, bijvoorbeeld celafval, pyrogenen, pathogen , of toxinen.

Verschillende andere combinaties van liganden en doelwitverbindingen worden hieronder weergegeven:

Meer van dergelijke ligand-doelwitverbinding betrekkingen zijn de vakman bekend en kunnen in de context van de onderhavige inventieve affiniteitscheidingmethode worden toegepast.

Alle hierin geciteerde verwijzingen, waaronder publikaties, octrooien , en octrooiaanvragen, worden hierbij in hun geheel onder verwijzing daarnaar opgenomen.

Hoewel de uitvinding beschreven werd met nadruk op voorkeursuitvoeringsvormen, zal het de vakman duidelijk zijn dat variaties van de voorkeursuitvoeringsvormen kunnen worden toegepast en dat wordt bedoeld dat de uitvinding anders dan als specifiek hierin beschreven is in praktijk kan worden gebracht. Dienovereenkomstig omvat deze uitvinding alle modificaties omvat binnen de geest en het kader van de uitvinding als gedefinieerd door de volgende conclusies .

Claims

1. Werkwijze voor affiniteitscheiding omvattend: (a) introduceren van affiniteitdeeltjes en een vloeistof die een te isoleren doelwitverbinding bevat die in staat is tot adsorberen aan de affiniteitdeeltjes in een dynamische-filtratieinrichting omvattende aandrijf-middelen, een filtratiemedium met stroomopwaartse en stroom afwaartse zijden, een invoer in vloeistofcommunicatie met de stroomopwaartse zijde van het filtratiemedium en een filtraatuitvoer in vloeistofcommunicatie met de stroom afwaartse zijde van het filtratiemedium, waarbij de vloeistof in staat is het filtratiemedium te passeren en de affiniteitdeeltjes in hoofdzaak niet in staat zijn het filtratiemedium te passeren, (b) bedrijven van de aandrijfmiddelen van de dyna-mische-filtratieinrichting met de filtraatuitvoer in een gesloten positie zodat de vloeistof het filtratiemedium niet kan passeren onder omstandigheden die voldoende zijn om de doelwitverbinding toe te staan aan de affiniteit deeltjes te adsorberen, en (c) scheiden van de affiniteitdeeltjes van de vloeistof door openen van de filtraatuitvoer teneinde de vloeistof toe te staan het filtratiemedium van de dynamische- filtratieinrichting te passeren.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, welke werkwijze verder omvat (d) wassen van de affiniteitdeeltjes en (e) elueren van de doelwitverbinding van de affiniteitdeeltjes.

3. Werkwijze volgens conclusie 1, waarin de affiniteitdeeltjes niet-poreus zijn.

4. Werkwijze volgens conclusie 3, waarin de affiniteitdeeltjes nagenoeg bolvormig zijn.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, waarin de affiniteitdeeltjes nagenoeg monodispers in diameter zijn.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, waarin de affini-teitdeeltjes een diameter bezitten van tenminste tweevoudig groter dan de poriegrootte van het filtratiemedium.

7. Werkwijze volgens conclusie 6, waarin het filtratiemedium een poriegrootte bezit van tenminste twee-vou-dig groter dan de afmeting van het grootste afvalmateriaal in de vloeistof.

8. Werkwijze volgens conclusie 5, waarin de affini-teitdeeltjes een diameter bezitten van ongeveer vijf-vou-dig groter dan de porieafmeting van het filtratiemedium.

9. Werkwijze volgens conclusie 8, waarin het filtratiemedium een porieafmeting bezit van tenminste ongeveer vijf-voudig groter dan de afmeting van het grootste afvalmateriaal in de vloeistof.

10. Werkwijze volgens conclusie 1, waarin de concentratie van de doelwitverbinding in de vloeistof wordt gevolgd.

11. Werkwijze volgens conclusie 1, waarin de schei-dingstrap (c) wordt uitgevoerd wanneer de concentratie in de vloeistof aan de doelwitverbinding die niet geadsorbeerd is aan de affiniteitdeeltjes valt beneden een vooraf bepaald niveau.

12. Werkwijze volgens conlcusie 2, waarin de doel witverbinding van de affiniteitdeeltjes wordt geeelueerd door overbrengen van de affiniteitdeeltjes die de doelwit verbinding daarop geadsorbeerd bevatten uit de dynamische filtratieinrichting in een elutie ontvangvat en leiden van een eluens door het elutie ontvangvat ter verwijdering van de doelwitverbinding.

13. Werkwijze volgens conlcusie 12, waarin de doelwitverbinding in het eluens aanwezig is in een concentratie van tenminste ongeveer 10 maal groter dan de concentratie van de doelwitverbinding in de vloeistof voorafgaande aan contact met de affiniteitdeeltjes.

14. Werkwijze volgens conclusie 12, waarin de hoeveelheid eluens dat door het elutie ontvangvat wordt geleid, equivalent is aan ongeveer het volume van de vrije ruimte van het elutie ontvangvat.

15. Werkwijze volgens conclusie 12, waarin de geelu-eerde affiniteitdeeltjes dan worden overgebracht terug naar de dynamische-filtratieinrichting en de werkwijze wordt herhaald.

16. Werkwijze volgens conclusie 15, waarin het elutie ontvangvat in vloeistofcommunicatie is met de stroom-opwaartse zijde van het filtratiemedium van de dynamische-filtratieinrichting .

17. Werkwijze volgens conclusie 1, waarin de dynamische-filtratieinrichting wordt bedreven voor bereiken van een afschuifsnelheid van tenminste ongeveer 5.000 -1 sec

18. Werkwijze ovlgens conclusie 17, waarin de dynamische-filtratieinrichting wordt bedreven voor bereiken van een afschuifsnelheid van tenminste ongeveer 10.000 -1 sec

19. Werkwijze volgens conlcusie 1, waarin de doelwit-verbinding een proteïne is.

20. Werkwijze volgens conlcusie 19, waarin de vloeistof een fermentatieprodukt is.

21. Werkwijze volgens conclusie 19, waarin de vloeistof melk is.

22. Werkwijze volgens conclusie 1, waarin de doelwit-verbinding een antilichaam is.

23. Werkwijze volgens conclusie 22, waarin de vloeistof vol bloed of serum is.

24. Werkwijze volgens conclusie 1 waarin de doel-witverbinding een stereoisomeer is en de vloeistof een racemisch mengsel.

25. Werkwijze volgens conclusie 1, waarin de doel- witverbinding biologisch werkzaam is.

26. Werkwijze volgens conclusie 1, waarin de affini-tietdeeltjes een gemiddelde diameter bezitten van ongeveer 60 yUm of minder.

27. Werkwijze volgens conclusie 26, waarin de affi-niteitdeeltjes een gemiddelde diameter bezitten van ongeveer 20 ^urn of minder.

28. Werkwijze volgens conclusie 27, waarin het filtratiemedium een poriegrootte bezit van minder dan ongeveer 5 ^um.

29. Werkwijze volgens conclusie 1, waarin de affi-niteitdeeltjes een gemiddelde diameter bezitten van tenminste ongeveer 1 ^um.

30. Werkwijze volgens conclusie 29, waarin het filtratiemedium een microporeus membraan is met een porie grootte van minder dan ongeveer 1 ^um.

31. Werkwijze voor sortering op grootte van affini-teitdeeltjes omvattend: (a) introduceren van substraat deeltjes in een dynamische-filtratieinrichting omvattend aandrijfmiddelen, een filtratiemedium met stroomopwaartse en stroomafwaartse zijden, een invoer in vloeistofcommunicatie met de stroom opwaartse zijde van het filtratiemedium en filtraatuitvoer in vloeistofcommunicatie met de stroomafwaartse zijde van het filtratiemedium, (b) bedrijven van de aandrijfmiddelen van de dyna-mische-filtratieinrichting met de filtraatuitvoer in open positie zodat de substraatdeeltjes met een diameter die significant kleiner is dan de poriegrootte van het filtratiemedium , het filtratiemedium passeren, en (c) winnen van de substraatdeeltjes welke het filtratiemedium niet passeren uit de dynamische-filtratieinrich-ting.

32. Werkwijze volgens conclusie 31, waarin een ligand vervolgens wordt gehecht aan de gewonnen substraat deeltjes ter vorming van affiniteitdeeltjes.

33. Werkwijze volgens conclusie 31, waarin de werkwijze wordt herhaald met de gewonnen substraatdeeltjes onder toepassing van een filtratiemedium met een grotere poriegrootte, en de substraatdeeltjes die het filtratie medium passeren worden gewonnen.

34. Werkwijze volgens conclusie 33, waarin een ligand vervolgens wordt gehecht aan de gewonnen substraatdeelt jes ter vorming van affiniteitdeeltjes.

35. Affiniteitdeeltje omvattend een substraat en een daaraan gehecht ligand, welk substraat omvat een kernmateriaal en een niet-poreus, hydrofiel polymeerbekleding daarop.

36. Affiniteitdeeltje volgens conclusie 35, waarin de polymeerbekleding straling-geente monomeren omvat.

37. Affiniteitdeeltje volgens conclusie 36, waarin de monomeren geselekteerd zijn uit de groep bestaande uit acryl- en methacrylzuren.

38. Affiniteitdeeltje volgens conclusie 37, waarin het kernmateriaal poreus is.