JPH07265606A - アフィニテイ分離法 - Google Patents

アフィニテイ分離法

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JPH07265606A
JPH07265606A JP6320760A JP32076094A JPH07265606A JP H07265606 A JPH07265606 A JP H07265606A JP 6320760 A JP6320760 A JP 6320760A JP 32076094 A JP32076094 A JP 32076094A JP H07265606 A JPH07265606 A JP H07265606A
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JP
Japan
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fluid
affinity
particles
affinity particles
target compound
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JP6320760A
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Peter J Degen
ピーター・ジェイ・デジェン
Tony Alex
トニー・アレックス
Richard F Salinaro
リチャード・フランク・サリナーロ
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Original Assignee
Pall Corp
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 既存のアフィニテイ分離法に固有の問題点を
回避し、蛋白質等を、希釈液体供給流から単離および分
離するための有効な手段を提供する。 【構成】 （ａ） 原動手段、上流側と下流側とを有す
る濾過媒体２５、前記濾過媒体の上流側と流体連通する
導入口２１、および、濾過媒体の下流側と流体連通する
濾液導出口２３を含む動的濾過装置に、濾過媒体を通過
できる流体であり、親和性粒子に吸着できる単離さるべ
き標的化合物を含有する流体と、実質的に濾過媒体を通
過できない親和性粒子とを導入し、（ｂ） 標的化合物
を親和性粒子に吸着させるに十分な条件下で、流体が濾
過媒体を通過できないように、濾過導出口を閉鎖位置に
して、動的濾過装置の原動手段を運転し、（ｃ） 濾液
導出口を開放して、流体を濾過媒体に通すことによって
親和性粒子を流体から分離する各工程を含むアフィニテ
イ分離法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、化合物の流体からの単
離および分離に関する。本発明は、改良アフィニテイ分
離法であり、これは、特に、生物学的に活性な化合物の
単離に有効である。
【０００２】
【従来の技術】エンジニアリングにおける進歩は、従
来、伝統的な生化学プロセスを通して製造するには複雑
すぎるか、または、高価すぎる、治療学的に有効な蛋白
質を商業的に量産することを可能とした。製造は、所望
の蛋白質を生産するように設計され、制御された条件
下、バイオリアクター中で生育することのできる細胞に
よって達成される。使用される技術としては、組換えＤ
ＮＡ技術を通して変異させられた微生物体の発酵、また
は、ハイブリドーマ技術を通して変異させられた哺乳類
細胞の培養が挙げられる。細胞は、塩類、糖類、蛋白質
類、および、特定の細胞の生育を支えるのに必要とされ
る種々のファクタを含有する液体培地に懸濁される。所
望される蛋白質は、細胞によって、液体培地中に分泌さ
れるか、または、細胞本体内に保持される。
【０００３】重要なその他の蛋白質は、別の手段を使用
して、例えば、動物に所望の蛋白質を生産する能力を付
与するために、遺伝的に動物種を変異させることによっ
て製造することもできる。例えば、ある種の蛋白質は、
牛(cows)を形質転換することによって生産し、それらの
ミルクから取り出すことができる。
【０００４】これら蛋白質の不均一な混合物からの分離
または精製は、少なくとも以下の理由によりやっかいな
仕事である。所望される蛋白質が、総蛋白質の少量のパ
ーセンテージであることが多い。処理される液体培地ま
たはその他の液体が、著しい量の細胞崩壊物およびその
他の粒状夾雑物を含有する。パイロジェン、病原体、毒
物およびその他の夾雑物が高濃度で存在することもあ
り、除去する必要がある。さらには、不均一な蛋白質溶
液を変成させることなく、それから、所望の蛋白質を分
離させる必要がある。
【０００５】これらのファクタの結果、精製蛋白質を多
量に生成させるために、長々とした下流処理を用いざる
を得ない。このような下流処理は、当該蛋白質の製造に
続く多数の処理工程を含み、例えば、遠心分離、細胞破
壊(cell disruption)、機械的篩分け、マイクロ濾過、
イオン交換、クロスフロー濾過(cross-flow filtratio
n)、アフィニテイ分離(affinity separation)、滅菌、
精製および包装が挙げられる。下流処理は、バイオプロ
セスされた蛋白質の製造において、主要なコストを占め
る。かくして、処理工程の数を減らすことによって高収
率の蛋白質分離を有効に行い、かつ、工業的なスケール
で使用することのできる方法は、バイオテクノロジー
を、さらに首尾よく、商業化することであろう。
【０００６】多くの化合物が配位子と錯形成し、これら
の化合物が、アフィニテイ分離として知られる技術によ
って単離されることは公知である。一般に、Kirk-Othme
r En cyclopedia of Chemical Technology, 6, 35-54 (J
ohn Wiley & Sons: New York, 1979)の“Chromatograph
y Affinity"参照。この分離法は、３相を含む。
【０００７】（ｉ） 不均一混合物からの所望の化合
物、例えば、蛋白質が、不溶性の基質、例えば、高分子
ビーズまたはガラスビーズに結合した、化学官能価、例
えば、配位子を有する錯体を形成する吸着相、（ｉｉ）
大量の溶液が、不溶性基質に緩く結合した夾雑物とと
もに洗い流される洗浄相、および、（ｉｉｉ） 溶離液
が、所望の化合物と不溶性基質に結合した配位子との間
の錯体を破壊し、所望の化合物を放出する溶離工程。結
合した配位子を有する不溶性の基質は、親和性粒子と称
し、洗浄および再使用され、この方法は、多数回、繰り
返される。
【０００８】親和性粒子は、典型的には、質量当たりの
表面積に基づいて選択される。例えば、１０μm径の非
多孔質球形ビーズは、ビーズの表面積０．０６m2/gを与
え、径１μmの同様のビーズは、ビーズの表面積６．０m
2/gを与え、径０．１μmのビーズは、ビーズの表面積６
０m2/gを与える。より小さな親和性粒子は、明らかに、
単位重量当たりより大きな表面積を与え、より望まし
い。アフィニテイ分離において、表面積約２０m2/gより
大きな表面積を有する親和性粒子を使用することが一般
に望ましい。かくして、アフィニテイ分離法において、
非多孔質の親和性粒子を使用することが所望される場合
には、このような親和性粒子は、サブミクロン範囲の径
を有する必要がある。
【０００９】アフィニテイ分離の最も広く実施されてい
る形態は、アフィニテイクロマトグラフィである。アフ
ィニテイクロマトグラフィは、親和性粒子を密に充填し
たカラムを使用し、それを通して、標的化合物、例え
ば、蛋白質を含有する流体（例えば、液体供給流）を、
加圧下、流す。このような充填または固定床システムの
流体力学は、エルガン(Ergun)の式に従う。Chem. Eng.
Prog., 48 (1952)。エルガンの式は、床が流体の層流に
従う時に使用され、床を横切る圧力降下が粒子の径の二
乗に反比例することを示す。計算の際、サブミクロンの
親和性粒子を使用するシステムの圧力降下は、１００μ
mの粒子を充填したものの１０００，０００倍のオーダ
である。この効果は、従来、アフィニテイ分離におい
て、このような小さなアフィニテイ粒子の使用を妨げて
きた。したがって、典型的な床は、許容可能な圧力降下
を維持するために寸法約１００μmの親和性粒子を使用
する。
【００１０】単位重量当たり広い表面積を付与すること
に関しては、非多孔質親和性粒子に付随する問題点を克
服するための試みがなされてきた。特に、非多孔質親和
性粒子は、多孔質親和性粒子で代替されてきた。典型的
な用途において、径約１００μmの多孔質ビーズは、通
常の圧力降下条件下、ビーズ当たりの表面積範囲約４０
m2/gを付与する。
【００１１】しかし、多孔質親和性粒子の使用は、非多
孔質の親和性粒子によっては体験しなかった追加の問題
点を生ずる。その理由は、完全には理解されていない
が、恐らく、閉塞(plugging)および拡散抵抗性によるも
のであり、親和性粒子の多孔質面積のわずかに外部約５
％のみが、一般に、分離されようとする基質にアクセス
可能であることによる。これは、多孔質親和性粒子の有
効表面積が理論的に使用可能な総表面積よりもはるかに
少ない結果を生ずる。供給流の前処理が多孔質親和性粒
子の閉塞および拡散抵抗性の少なくとも一部を防止する
ものの、供給流のこのような前処理は、コスト的に高
く、時間のかかる一連の工程を含む。さらに、各追加の
処理工程は、標的化合物の損失の増加をまねき、それに
より、生産性を低下させる。
【００１２】さらに、多孔質親和性粒子の総表面積の過
半が親和性粒子の表面の内部であるので、物質移動が、
分離プロセスを有効に制御し、それにより、時間がかか
り労力を要する分離を生じさせる。さらに、親和性粒子
の孔は、望ましくない化合物および崩壊物用のトラップ
として機能し、結局、所望する化合物が夾雑されてしま
う。また、親和性粒子の孔が徐々に閉塞し、親和性粒子
の有効率が、サイクル数が増す毎に低下する。また、親
和性粒子の機械的強度は、孔の存在により低下し、これ
は、ひいては、耐摩耗性および機械的安定性の低下をま
ねき、高圧において、親和性粒子の圧潰をまねく。多孔
質親和性粒子は、また、それらが床に充填されると、膨
潤し、これは、かかる現象に対する調整を必要とする。
【００１３】親和性粒子とは独立のカラム技術について
のもう一つの考察は、高流速を達成するために、カラム
が大容量を有する必要があることである。しかし、高い
カラムは、そのカラムの下方ゾーンにおいて、それらが
親和性粒子を変形させ、処理量を低下させるような高圧
を生ずる。短くてむしろ大口径のカラムを設計すること
により、この問題点を克服することが、工業的に、試み
られてきた。しかし、この妥協案は、分岐流および閉塞
流からの出発のような流れ上の問題点により、効率が非
常に低下するので、完全に満足されるものではない。
【００１４】カラムは、また、濃度ウエーブ現象(conce
ntration wave phenomenon)を示し、吸着剤の有効使用
の低下をまねく。特に、供給物がカラムを通過するにつ
れ、親和性粒子の小さなゾーンのみが、特定の時間枠内
に使用されるに過ぎない。何故ならば、導入ゾーンは、
既に、標的化合物で飽和されているからである。これ
は、ウエーブフロント(wave front)のみが所定の時間吸
着剤と相互作用する濃度ウエーブ現象を生ずる。
【００１５】固定床に固有の欠点、および、多孔質親和
性粒子がそれに使用される時に生ずる問題点を克服する
ために、本研究者らは、移動床アフィニテイ分離システ
ムに目を向けた。
【００１６】流動床は、移動床アフィニテイシステムの
一タイプである。このような床において、供給流は、カ
ラムの底部からポンプ輸送され、親和性粒子を流体のよ
うに作用させる。その結果、流動床は、濃度ウエーブ特
性を示さない。さらに、親和性粒子は、全て、同時に、
供給流に暴露される。流動床は、親和性粒子の有効使用
および処理量の増大の結果、カラムよりも高い生産性を
提供する。さらに、これらの床は、より高レベルの粒状
崩壊物を許容可能とし、固定床システムと比較して、相
対的に有効に機能する。
【００１７】しかし、流動床に伴う欠点は、効率がこの
ようなシステムに使用することのできる親和性粒子の寸
法および密度を制限することであり、すなわち、密度を
最大にし、寸法を最適にする必要があることである。こ
れは、一般に、分離プロセスの主要部分が親和性粒子の
沈降速度によって制御されることによる。かくして、使
用される親和性粒子の密度が大きい程、親和性粒子は、
より迅速に沈降し、それにより、より迅速な流動速度の
使用が可能となる。流動速度における増大は、動力学的
速度の上限に達するまでに、処理量をより高くし、した
がって、効率を高くする。動力学的速度は、親和性粒子
の寸法を小さくすることによって、増大し、それによ
り、使用可能な総表面積を増大するものの、動力学的速
度の増大は、また、達成される流動速度を制限するマイ
ナスの効果も有し、それにより、効率を低下させる。こ
れらの競争的な考察は、親和性粒子の寸法および密度に
関して、妥協がなされることを必要とし、これらの妥協
が、このタイプのシステムをより高効率とすることを妨
げる。
【００１８】もう一つのタイプの移動床システムは、撹
拌タンクシステムと称され、また、固定床カラムに優る
著しい利点を提供する。撹拌タンクシステムにおいて、
親和性粒子は、機械的手段によって、タンク内で懸濁さ
れたままである。この混合作用は、懸濁液を均一な流体
のように挙動させ、それにより、全ての粒子を、同時
に、標的化合物に暴露する。したがって、この方法は、
ループのように設計され、生産性において、著しい増大
を有する。このようなシステムにおける親和性粒子は、
好ましくは、プロセス流体中で安定な懸濁液とするため
に十分な浮力を有する。このシステムにおける充填は少
ないので、親和性粒子の好ましい径は、典型的には、カ
ラムまたは流動床におけるよりも小さく、これは、表面
積を増大させる。撹拌タンクの主要な制限は、洗浄およ
び溶離工程に使用されるフィルターが、供給原料の粗い
性質の結果として、汚染されることである。かくして、
供給流は、典型的には、前処理され、それにより、追加
の処理工程を加算し、全体のシステムの効率を低下させ
る。
【００１９】これらの種々の従来の各アフィニテイ分離
法においては、多数の処理工程が存在する。各工程は、
８０〜９０％の効率または生成物収率を有するものの、
２〜３の工程が存在するだけで、全体のシステムの効率
および生成物収率を５０％以下に低下させてしまう。追
加工程が増す毎に、全体のシステム効率は、さらに低下
する。
【００２０】
【発明が解決しようとする課題】かくして、既存のアフ
ィニテイ分離法に固有のこれら多くの問題点を回避し、
化合物、例えば、蛋白質等を、流体、例えば、希釈液体
供給流から単離および分離するためのより有効な手段を
提供する方法に対する必要性が存在する。本発明は、こ
のような方法を提供する。本発明の方法は、流体から所
望の混合物を取り出すために、比較的短時間で実施する
ことができ、全体の効率が高く、数少ない処理工程を有
するアフィニテイ分離法を含む。さらに、本発明の方法
は、所望の化合物を含有する流体を前処理する必要な
く、システムの動力学およびフロースルー(flow-throug
h)を抑制する親和性粒子と濾過媒体との両者についての
汚染の問題点を克服する。さらに、密度および寸法の異
なる多種多様の親和性粒子は、単位重量当たり広い表面
積を有する小さな親和性粒子も含めて、本発明のアフィ
ニテイ分離法に首尾よく使用することができ、それによ
り、特定の最終用途に対してより大きな効率を達成する
ために、システムをカスタム化させることができる。本
発明のこれらおよびその他の目的ならびに利点は、さら
なる本発明の特徴とともに、本明細書に記載した本発明
の記載から明らかとなるであろう。
【００２１】
【課題を解決するための手段】本発明は、（ａ） 原動
手段、上流側と下流側とを有する濾過媒体、前記濾過媒
体の上流側と流体連通する導入口、および、前記濾過媒
体の下流側と流体連通する濾液導出口を含む動的濾過装
置に、前記濾過媒体を通過することができる流体であ
り、親和性粒子に吸着することのできる単離さるべき標
的化合物を含有する流体と、実質的に前記濾過媒体を通
過することのできない親和性粒子とを導入し、 （ｂ）
前記標的化合物を前記親和性粒子に吸着させるに十分
な条件下で、前記流体が前記濾過媒体を通過できないよ
うに、前記濾液導出口を閉鎖位置にして、前記動的濾過
装置の原動手段を運転し、 （ｃ） 前記濾液導出口を
開放して、前記流体を前記動的濾過装置の前記濾過媒体
に通すことによって前記親和性粒子を前記流体から分離
する各工程を含む改良アフィニテイ分離方法を提供す
る。濾液は、それにより、実質的に、標的化合物を含ま
ないようにすることができる。標的化合物の回収が所望
され、および／または、親和性粒子が再使用される場合
には、親和性粒子は、ついで、洗浄され、標的化合物
は、親和性粒子から溶離される。
【００２２】図１は、本発明の好ましい実施態様に使用
される重要な機素の概略図である。
【００２３】図２は、本発明のアフィニテイ分離法で使
用される好ましい動的濾過装置の概略図である。
【００２４】本発明は、改良アフィニテイ分離法を提供
する。特に、動的濾過装置の使用は、驚くべきことに、
所望の（または標的）化合物を含有する流体と親和性粒
子との間で接触を有効に行うために使用することがで
き、動的濾過装置は、しかる後、それに吸着または錯化
された化合物を有する親和性粒子から流体を分離するた
めに使用することができることが見いだされた。このよ
うな方法は、小さな径と、親和性粒子の重量当たり比較
的大きな表面積とを有する親和性粒子の使用を可能とす
る。
【００２５】本発明の方法は、（ａ） 原動手段、上流
側と下流側とを有する濾過媒体、前記濾過媒体の上流側
と流体連通する導入口、および、前記濾過媒体の下流側
と流体連通する濾液導出口を含む動的濾過装置に、前記
濾過媒体を通過することができる流体であり、親和性粒
子に吸着することのできる単離さるべき標的化合物を含
有する流体と、実質的に前記濾過媒体を通過することの
できない親和性粒子とを導入し、（ｂ） 前記標的化合
物を前記親和性粒子に吸着させるに十分な条件下で、前
記流体が前記濾過媒体を通過できないように、前記濾液
導出口を閉鎖位置にして、前記動的濾過装置の原動手段
を運転し、（ｃ） 前記濾液導出口を開放して、前記流
体を前記動的濾過装置の前記濾過媒体に通すことによっ
て前記親和性粒子を前記流体から分離する、各工程を含
む改良アフィニテイ分離法である。
【００２６】流体は、それによって、実質的に標的化合
物を含まなくすることができる。標的化合物の回収が所
望され、および／または、親和性粒子が再使用される場
合には、親和性粒子は、洗浄され、標的化合物は、親和
性粒子から溶離される。
【００２７】本発明の方法は、アフィニテイ分離処理操
作を通して分離することのできる希釈溶液からの化合
物、例えば、希釈発酵溶液からの蛋白質の、優れて有効
な分離法を提供する。本発明は、公知のアフィニテイ分
離法と比較して、アフィニテイ分離を行うのに必要とさ
れる処理工程数を少なくするための手段を提供し、それ
により、分離法の全体としての収率を増大させる。実
際、本発明の方法は、親和性粒子との接触に先立って、
流体の前処理の必要性をなくすことができる。さらに、
本発明の方法は、公知のアフィニテイ分離法と比較し
て、相対的に短い時間で行うことを可能とする。さら
に、本発明の方法は、好ましくは、非多孔質の親和性粒
子を使用するので、本発明は、多孔質親和性粒子の使用
に付随する問題点、例えば、親和性粒子の汚染、圧潰の
受け易さ、膨潤およぶ有効表面積の低さを回避する。ま
た、本発明の方法は、一般に、従来のアフィニテイ分離
法に付随する分岐流(chaneling)、濃度ウエーブ現象お
よび濾過媒体の汚染等の問題を生ずることがない。
【００２８】本発明の方法は、親和性粒子と処理さるべ
き流体、すなわち、親和性粒子に吸着することのできる
単離さるべき標的化合物を含有する流体を動的濾過装置
に導入することを含む。このような動的濾過装置は、望
ましくは、原動手段、上流側と下流側とを有する濾過媒
体、濾過媒体の上流側と流体連通した導入口、および、
濾過媒体の下流側と流体連通した濾液導出口を含む。濾
過媒体は、親和性粒子が実質的に濾過媒体を通過するこ
となく、処理さるべき流体が全部または実質的に濾過媒
体を通過する孔定格を有する。
【００２９】親和性粒子および処理さるべき流体が動的
濾過装置に導入されると、この装置は、例えば、適当な
バルブ手段を使用することによって濾液導出口を閉鎖し
て、流体が濾過媒体を通過するのを防止する構成であ
る。ついで、原動手段が作動し（または、親和性粒子と
処理さるべき流体との導入中に作動し）、処理さるべき
流体中の標的化合物を親和性粒子と混合し、これらを密
接に相互作用させる。この混合処理は、十分な時間、例
えば、標的化合物の親和性粒子への吸着が、最大、また
は、平衡レベルに達するまで、継続される。標的化合物
と親和性粒子との密接、かつ、再現性のある相互作用の
結果、混合処理は、標的化合物を単離するのに使用され
る親和性粒子の量、および、標的化合物を含有する流体
と親和性ビーズとの間の相互作用の時間に関して、流体
の同一バッチを処理するのを極めて正確とする。かくし
て、本発明の方法は、迅速なサイクルプロセス、およ
び、同一の流体がルーチンベース(routine base)で処理
され続けるパーマネントな製造方法における親和性粒子
の有効、かつ、保存された使用を提供する。
【００３０】ついで、親和性粒子は、流体を濾過媒体に
通すことによって、流体から分離される。このような分
離は、好ましくは、原動手段を正常に作動しつつ、例え
ば、濾液導出口を開放することによって達成することが
できる。ついで、親和性粒子は、好ましくは、適当な溶
液、例えば、洗浄緩衝液で洗浄し、残留流体を除去す
る。
【００３１】標的化合物は、親和性粒子から化合物を溶
離することによって回収される。このような溶離は、い
ずれかの適当な技術、好ましくは、親和性粒子を適当な
容器、例えば、カラムに充填し、親和性粒子を入れた容
器を介して、溶離液を、例えば、脱着剤に通し、親和性
粒子から標的化合物を取り出すことによって行われる。
【００３２】溶離液の量を最小とし、それにより、回収
される化合物の濃度を濃くするために、親和性粒子は、
好ましくは、溶離液容器に可能な限り密に充填する。標
的化合物は、典型的には、溶離液中に、未処理の流体、
すなわち、親和性粒子に接触する前の流体中の標的化合
物の濃度の少なくとも約１０倍の濃度で存在し、好まし
くは、少なくとも約２０倍以上の濃度で存在させる。最
も望ましくは、溶離液容器を通過させる溶離液の量は、
溶離液溶液容器の自由空隙率に等しいか、または、少な
くとも自由空隙率の２〜３倍以下であり、例えば、実質
的に単分散球形の親和性粒子を密に充填したカラムの体
積の約半分である。
【００３３】処理さるべき流体中の最も大きい崩壊物の
相対的寸法、濾過媒体の孔および親和性ビーズの径は、
本発明のアフィニテイ分離法の実際の使用において、重
要である。理想的には、濾過媒体は、流体の全て（最大
の崩壊物を含む）を通過させ、他方、親和性粒子の通過
を防止するものである。したがって、濾過媒体は、好ま
しくは、処理さるべき流体中の最大の崩壊物よりも大き
い、少なくとも２個のファクタ、好ましくは、５個もし
くは１０個のファクタでの孔寸法を有し、親和性粒子
は、好ましくは、濾過媒体の孔よりも大きい、少なくと
も２個のファクタ、好ましくは、５個もしくは１０個の
ファクタである。かくして、例えば、処理さるべき流体
中の最大の崩壊物が約０．１〜約０．２μmのオーダー
である場合、濾過媒体の孔寸法は、好ましくは、約１〜
３μmのオーダーであり、親和性粒子は、好ましくは、
約１０〜２０μmのオーダーである。
【００３４】一般に、最小の許容可能な親和性粒子、例
えば、径６０μm以下の親和性粒子、特に、径２０μm以
下の親和性粒子は、好ましくは、処理される流体と相互
作用するための親和性粒子の単位重量当たりの使用可能
な表面積を増大させることによって、標的化合物の回収
を向上させるために使用される。したがって、処理さる
べき流体の前処理は、一般に、追加の処理工程を導入す
ることによって、標的化合物の回収に悪影響を与えるの
で、本発明の方法に関する限り、望ましくなく、流体に
おける最大崩壊物の寸法を小さくするための、前処理、
特に、予備濾過、および／または、均一化によって生ず
る回収損失は、親和性粒子の単位重量当たり広い表面積
を有するより小さな親和性粒子を使用するための生じた
能力によって相殺されるよりも大きい例である。
【００３５】
【実施例】本発明は、添付の図面を参照することによっ
てさらに理解が深まるであろう。
【００３６】図１は、本発明の好ましい実施態様に使用
される重要な機素を概略的に示す。本発明の方法の開始
の際、流体の残りから分離される標的化合物を含有する
処理さるべき流体は、保持タンク１に存在し、親和性粒
子は、保持タンク２に存在する。この流体および親和性
粒子は、バッファタンク３に移され、そこで、これら
は、合わされて、混合物を形成し、好ましくは、撹拌さ
れる。ついで、流体および親和性粒子は、バッファタン
ク３を通過させることなく、直接、動的濾過装置４に移
すこともできるが、混合物は、導入口５を介して、動的
濾過装置４に移される。混合物は、例えば、閉鎖位置に
ある濾液バルブ７によって、動的濾過装置４の濾過媒体
を通過する流体なしで、動的濾過装置４の機械的撹拌に
付される。
【００３７】適当な撹拌の後または中に、混合物の幾分
かまたは全ては、バッチまたは連続（インライン）法に
おける濃縮バルブ８を介して、検知タンク９に移され、
そこで、親和性粒子と結合しないままの流体中の標的化
合物の濃度が決定される。このような検知は、所望とあ
らば、動的濾過装置４内の連続または不連続基準でも行
うことができる。さらに、同一バッチの流体が繰り返し
処理されるパーマネントな製造方法においては、本発明
の方法が、標的化合物の回収に関して、極めて不変で、
かつ、再現性があるので、適当量の流体、親和性粒子お
よび動的濾過装置内の滞留時間を決定した後に何ら検知
手段を必要としない。しかし、検知手段が使用される限
り、このような検知手段は、好ましくは、濾液バルブ
７、濃縮バルブ８および洗浄緩衝液バルブ１１の開閉を
制御し、それにより、混合物の流れ方向ならびに動的濾
過装置を使用する濾過法の開始および終了を制御する。
【００３８】別個の検知タンク９を使用し、流体中の未
結合標的化合物の濃度が予備選択されたレベルよりも高
い場合には、混合物は、バッファタンク３を介して動的
濾過装置４に移し返され、先に記載した方法に従う。こ
の処理は、流体中の未結合標的化合物の濃度が予備選択
されたレベル以下となり、それにより、十分な量の標的
化合物が親和性粒子に吸着されたことを示すまで繰り返
される。
【００３９】いずれかの手段によって、十分な量の標的
化合物が親和性粒子に吸着されたことが決定されると、
ついで、濾液バルブ７が開放され、流体は、動的濾過装
置４の濾過媒体を通り、廃棄タンク６に至り、それによ
り、動的濾過装置内に、親和性ビーズを残す。濾過バル
ブ７は、ついで、典型的には、閉鎖され、これとは別
に、特に、親和性ビーズが標的化合物で飽和されていな
い場合には、追加の流体は、親和性ビーズと接触するた
めに、動的濾過装置４内に通すことができる。このよう
な追加の流体は、連続的または半連続的に動的濾過装置
４を通過し、動的濾過装置４内の幾分かの流体は、動的
濾過装置４の濾過媒体を通過し続ける。
【００４０】動的濾過装置４への流体の添加が完了する
と、動的濾過装置４内の流体は、動的濾過装置４の濾過
媒体を通過し、洗浄緩衝液バルブ１１が開いて、洗浄緩
衝液は、洗浄緩衝液タンク１０から動的濾過装置４へと
入る。洗浄緩衝液は、適当な時間、親和性粒子と混ぜ合
わされ、ついで、濾液バルブ７が、再度、開放されて、
洗浄緩衝液を廃棄タンク６へと通過させる。典型的に
は、親和性粒子に結合された標的化合物を除いて、処理
さるべき流体が動的濾過装置４から完全に取り出される
まで、このような洗浄サイクルが数回行われる。
【００４１】ついで、親和性粒子は、濃縮バルブ８を介
して、溶離液容器１３に移される。このような移動は、
洗浄緩衝液タンク１０からの洗浄緩衝液を使用し、好ま
しくは、親和性粒子が密に充填された溶離液容器１３に
親和性粒子を輸送することによって達成される。つい
で、溶離液バルブ１４は、開放され、溶離液タンク１５
からの溶離液を溶離液容器１３に通し、親和性粒子から
標的化合物を取り除き、標的化合物を収集用の溶離液容
器１３に通す。流出液流が溶離液容器１３を出ると、そ
れは、流出液流中の標的化合物のレベルをモニターし、
標的化合物の濃度が予備選択されたレベル、例えば、約
ゼロに達した時、溶離液バルブ１４を閉鎖する流出液検
知手段１６を通過する。
【００４２】親和性粒子は、それに結合した標的化合物
をもはや有せず、ついで、再使用される。好ましくは、
続く再使用のため、親和性粒子を溶離液容器１３から保
持タンク２へと移すために、懸濁緩衝液タンク１２から
溶離液容器１３に懸濁緩衝液が導入される。
【００４３】動的濾過装置４の動作と溶離液容器１３内
の化合物の溶離とを正確に調時することによって、この
２つの装置は、同時に作動し、かくして、バッチ処理を
半連続プロセスに変換する。図１は、当然のことなが
ら、本発明の好ましい実施態様を単に概略的に示すもの
であり、実際の設備およびその配置は、本発明のその他
の実施態様に対して、著しく異なる。例えば、検知手段
９は、動的濾過装置４とは別個に位置決めされるか、ま
たは、動的濾過装置４内に位置決めされて、混合物を動
的濾過装置４内に入れたり出したりする必要性をなくす
ることができる。同様に、検知手段１６は、溶離液容器
１３とは別に、または、溶離液容器１３内に位置決めさ
れ、親和性粒子からの標的化合物の溶離は、溶離液容器
１３内またはその他のいずれか適当な装置内で行うこと
もできる。その他の変形例は、当分野の当業者には、明
らかである。同様に、通常の構成要素、例えば、パイプ
およびポンプ輸送手段の引用は、上記考察からと同様に
明らかであるので、図１から省略した。本発明のコンテ
キスト中におけるこのような構成要素の使用は、当分野
において当業者公知の範囲内である。
【００４４】親和性粒子 いずれの適当な親和性粒子も、本発明において、使用す
ることができる。親和性粒子は、基質と、その表面上
の、流体中の標的化合物と結合し、その化合物を流体の
残りから分離することが可能で、ついで、親和性粒子か
ら取り除くことのできる配位子とを含む。適当な親和性
粒子は、適当な基質および配位子も含め、当分野におい
て、周知である。多くのこのような親和性粒子は、従来
のアフィニテイ分離法のコンテキスト中で使用され、本
発明の方法において、等しくまたはより有効に使用され
る。当然のことながら、特定の流体から特定の化合物を
分離するために使用される親和性粒子は、特に、親和性
粒子の基質表面に結合した配位子で変化する。配位子の
適切な選択は、標的化合物が、選択的、かつ、可逆的に
結合し、例えば、親和性粒子と錯形成、もしくは、親和
性粒子に吸着されることを確実とする。
【００４５】親和性粒子は、すなわち、径約２，０００
オングストーム未満の孔もしくは走査電子顕微鏡による
１０，０００倍の拡大で目視できない孔を有する、好ま
しくは、平滑で、かつ、非多孔質の表面を有し、臨界湿
潤表面張力(critical wetting surface tension)少なく
とも約７２ダイン／cmを有する親水性であり、結合した
配位子を介してのみ結合が生じ、非特異敵蛋白質結合を
生成しにくい。親和性粒子は、また、好ましくは、それ
ら同士の間、特に、それに結合した配位子の量に関して
均一であり、本発明のコンテキスト中で、不変、かつ、
予測可能な親和性分離結果を生ずる。
【００４６】親和性粒子は、いずれの適当な形状であっ
てもよいが、好ましくは、実質的に球形である。さら
に、親和性粒子は、好ましくは、径において、実質的に
単分散である。同寸法の球形親和性粒子は、特に、親和
性粒子の取り扱いに関して、本発明の方法の最も有効な
操作を提供する。このような親和性粒子は、一般に、流
れの問題を生ずる恐れが最も低く、このような親和性粒
子で達成することのできるより均一で、かつ、密な充填
の結果、親和性粒子から標的化合物を取り出すために使
用される溶離液容器の寸法と溶離液の量とを最小とす
る。
【００４７】親和性粒子は、いずれの適当な寸法であっ
てもよい。親和性粒子の平均径は、典型的には、約１０
０μm未満であり、さらに通常は、約６０μm未満であ
る。親和性粒子は、好ましくは、平均径約２０μm未満
を有し、より好ましくは、約１０μm未満を有する。多
くの用途に対して、親和性粒子は、好ましくは、径約１
〜約５μmを有する。前述したように、親和性粒子は、
好ましくは、径において、実質的に単分散であり、径の
範囲は、最小の粒子の径を最大の粒子の径で割ることに
より決定して、好ましくは、約５０％以上異ならず、さ
らに好ましくは、約２５％以上異ならず、最も好ましく
は、約１０％以上異ならない。親和性粒子の径は、公知
の手段、例えば、走査電子顕微鏡写真の使用を通して、
決定することができる。
【００４８】いずれにしても、標的化合物が親和性粒子
に結合した後に、親和性粒子の通過が起こるとすれば、
このような親和性粒子は、親和性粒子の損失および標的
化合物の減少を示すので、実質的に全ての親和性粒子が
濾過媒体を通過しないことが望ましい。このような親和
性粒子の損失を避けるために、基質粒子は、好ましく
は、さらなる処理の前に、動的濾過装置において使用さ
れる濾過媒体にさらすのがよい。このようにして、濾過
媒体を通過する基質粒子は、標的化合物と結合する配位
子と結合する前に取り除かれる。全体としてのアフィニ
テイ分離法の効率は、それにより、結合した標的化合物
による親和性粒子のほぼ完全なる回収を確実とし、取り
扱いを改良するために、親和性粒子の寸法分布を狭くす
ることによって、改良される。かくして得られる親和性
粒子の寸法分布は、濾過媒体を大きな孔寸法を有するも
のに変え、基質粒子を、再度、動的濾過処理に付すこと
によって、さらに改良することができる。この第２の通
過において、濾過媒体を通過した回収基質粒子は、さら
に狭い寸法分布（第１の濾過媒体の孔寸法による実質的
に下限および第２の濾過媒体の孔寸法による上限）を有
する。このような分粒(sizing)制御法は、好ましくは、
配位子が基質粒子に結合する前に行われるものの、当然
のことながら、その技術は、すなわち、配位子の基質粒
子への結合の後に、親和性粒子を分粒するためにも使用
することができる。
【００４９】親和性粒子は、いずれの適当な密度を有し
てもよい。親和性粒子は、好ましくは、平均密度約０．
５g/cm3〜約３．０g/cm3の範囲、さらに好ましくは、約
１g/cm3〜約２g/cm3の範囲、最も好ましくは、約１g/cm
3を有し、処理中、媒体の適当な浮力を受ける。
【００５０】基質粒子 親和性粒子を製造するためには、いずれの適当な基質を
使用してもよい。上記考察したように、親和性粒子の表
面は、好ましくは、平滑、非多孔質および親水性であ
り、化合物、特に、蛋白質の吸着を受けにくい。基質
は、均一な材料であり、好ましくは、上述の好ましい特
性を満たすか、または、一以上の材料（例えば、もうひ
とつの材料で塗装されたコア材料）を含み、その表面
が、好ましくは、上述の好ましい特性を満たす。かくし
て、例えば、基質粒子は、均一な非多孔質材料、非多孔
質の高分子材料で塗装された多孔質コア材料、または、
非多孔質の高分子材料で塗装された非多孔質コア材料を
含んでもよい。基質粒子は、例えば、均一な多孔質材
料、または、多孔質材料で塗装されたコア材料を含んで
もよいが、このような基質粒子は、本発明の方法におけ
る使用には、好ましくない。
【００５１】基質粒子は、好ましくは、ガラス、アルミ
ナ、スチール（特に、ステンレススチール）、シリカ、
ＳｉＡｌ、珪藻土、または、好ましくは、高分子材料、
例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリテトラフル
オロエチレン、セルロース、セルロースエステル類、ポ
リカーボネート、ポリスチレン、アクリロニトリル−ブ
タジエン−スチレン、ポリフェニレンオキシドポリマ
ー、ポリシロキサンおよびラテックスから製造される。
基質の暴露された表面は、適当な配位子の結合を許す必
要があり、これは、さらなる処理中、非結合とはならな
い。基質は、処理さるべき流体に暴露した時、機械的に
安定で、膨潤せず、非反応性である必要がある。基質の
その他の特性は、処理さるべき特定の流体とそれより分
離さるべき標的化合物とによって変化する。例えば、基
質は、親和性粒子が所望される程度の浮力を有するよう
に選択することができる。蛋白質のアフィニテイ分離用
の特に有効な基質としては、Quantum Chemicalより入手
されるMicrothene Seriesにおける高密度および低密度
ポリエチレン（比重：０．９２〜０．９６；表面積：＜
１m2/g；平均寸法：約２０μm，粒子の約１０％が分離
することのできる約５０μm以上である）およびDu Pont
から入手可能なPTFE-30（平均寸法：約０．１〜０．５
μm）が挙げられる。
【００５２】基質を、平滑、非多孔質、親水性とし、お
よび／または、蛋白質結合をしにくくするように、基質
は、塗装されるが、標的化合物を単離するのに使用する
ために、適当な配位子がそれに結合する限りにおいて、
いずれのポリマーも塗装材料として使用することができ
る。高分子塗料をコア材料に結合させるいずれの適当な
方法も使用することができる。かくして、例えば、モノ
マー放射線グラフト法（特に、電子ビームグラフト法）
および高分子溶液塗装法を使用すると申し分ない。
【００５３】改質セルロースおよびセルロース誘導体、
例えば、セルロースアセテートは、本発明のコンテキス
ト中で一般に極めて有効なバイオコンパチブル(biocomp
atible)なポリマーである。このような改質セルロース
誘導体としては、セルロース基質ポリマーをより一層バ
イオコンパチブルにするセルロース基質ポリマーに対す
る共有結合したペンダント(pendant)バイオコンパチブ
ル表面基によって改質されたセルロースポリマー表面が
挙げられる。当分野において、多くの適当な表面基が周
知であるものの、アルブミンが、このような修飾基(mod
ifying group)として、特に有用性を示した。表面塗装
コア材料用の適当なポリマー類としては、広範なモノマ
ー類から製造することのできるホモポリマー類およびコ
ポリマー類が挙げられる。例えば、放射線グラフト用に
特に適当なモノマー類としては、アクリルおよびメタク
リル酸類（特に、ヒドロキシアルキルアクリレート類お
よびヒドロキシアルキルメタクリレート類、例えば、ヒ
ドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシプロピルアク
リレート、および、ヒドロキシブチルメタクリレート）
ならびにアリルアルコール類が挙げられる。溶液塗装用
に特に適当なポリマー類としては、ヒドロキシ官能化ポ
リマー類、例えば、アリルアルコール類、ポリビニルア
ルコール類、ポリアクリルアミド類、ビニルグリシジル
エーテル類およびアリルグリシジルエーテル類が挙げら
れる。多くのその他のモノマー類およびポリマー類も、
当然のことながら、本発明のコンテキスト中に使用する
ための親和性粒子を製造するのに使用することができ
る。
【００５４】基質の表面は、均一または塗装されたコア
タイプの基質であってもよく、好ましくは、処理さるべ
き流体中の標的化合物に対して、好ましくは、親和性が
低いかまたはないのがよい。このような表面は、基質粒
子自体の表面よりもむしろ、基質粒子の表面上の配位子
と、可逆的に、錯形成するかまたは結合し、そこで、標
的化合物の結合が、弱すぎるかまたは強すぎると、さら
なる処理において、標的化合物は、失われるかまたは回
収できなくなる。基質表面は、また、好ましくは、処理
さるべき流体によって、例えば、親水性に、自然に湿潤
され、親和性粒子と処理さるべき流体との間で良好に接
触し、それにより、処理さるべき流体から標的化合物が
良好に回収される。さらに、基質の表面は、好ましく
は、平滑とし、標的化合物以外の物質の親和性粒子の表
面上での結合配位子に対する付着を最小とし、親和性粒
子を容易に清浄化可能とする。基質は、好ましくは、多
数回再使用することができ、化学的に安定であり、分解
またはポーズ(pose)夾雑問題を生じなくする。
【００５５】配位子 配位子は、基質粒子に結合し、続く処理中、除去される
ことがなく、選択的に、標的化合物、例えば、抗体類、
抗原類、蛋白質類、核酸類、補体成分類、ホルモン類、
ビタミン類等と選択的に結合するいずれの化学官能価で
あってもよい。配位子は、典型的には、所望の官能価を
有する特定の化合物を基質粒子と反応させることによっ
て生じずるが、基質粒子、例えば、コア材料の高分子塗
装の一体部分であってもよい。
【００５６】配位子を基質粒子に結合するための方法
は、当業者に周知である。適当な結合法としては、自然
な共有結合、末端官能基の化学的な活性化およびカップ
リング試薬の結合が挙げられる。
【００５７】ある種の配位子のポリマー支持表面への自
然な共有結合は、ポリマー支持体から伸びる化学的に反
応性の基を介して進行する。かくして、例えば、ポリマ
ー支持体から伸びる反応性基、例えば、アルデヒドおよ
びエポキシは、利用可能なヒドロキシル、アミノまたは
チオール基を含有する配位子と容易にカップリングす
る。また、例えば、ポリマー支持体上の遊離のアルデヒ
ド基は、ヒドロキシル含有化合物とのアセタール結合を
介して、および、アミノ含有化合物とのイミド結合を介
して、カップリングする。また、例えば、遊離のオキシ
ム基は、アミン、ヒドロキシルおよびチオ基を含有する
化合物と、それぞれ、アルキルアミン、エーテルおよび
チオエーテル結合を介して、カップリングする。これら
の反応についてのさらに詳細な考察は、例えば、Chen e
t al.の“Chemical Procedures forEnzyme Immobilizat
ion of Porous Cellulose Beads"、Biotechnology and
Bioengineering, XIX, 1463-1473 (1977)、および“Epo
xy Activated Sepharose,"Pharmacia Fine Chemicals(A
ffinity Chromatography)、 6B, 27-32 (1979)におい
て、見ることができる。
【００５８】末端の官能基の化学的な活性化は、ポリマ
ー表面官能基をそれらの末端成分の化学的な修飾によっ
て活性化することにより達成することができる。この方
法は、末端エポキシ官能基の過ヨウ素酸による酸化によ
って活性アルデヒド基を形成することにより例証するこ
とができる。この方法は、さらに、例えば、Svec etal.
の“Immobilization of Amyloglucosidose on Poly［(G
lycidyl methacrylate)Co(Ethylene Dimethacrylat
e）］Carrier and Its Derivatives," Biotechno logy
and Bioengineering, XX, 1319-1328 (1978)において、
例証される。配位子の固定化は、上述のようにして、進
行させることができる。縮合反応は、例えば、Hoffman
et al.の“New Approaches to Non-Thrombogenic Mater
ials,”Coa gulation-Current Research and Clinical A
pplications, (Academic Press, New York 1973）に記
載されているように、カルボキシル基のカルボジイミド
活性化を介して、遊離のカルボキシル基とアミン基との
間で達成することができる。配位子の固定化は、ポリマ
ーまたは配位子カルボキシル基によるカルボジイミド活
性化および遊離のアミンとの縮合によって行われ、安定
なペプチド結合を形成する。配位子の最終配向は、一般
に、アミンもしくはカルボキシル含有ポリマーが使用さ
れるか、否かのファクタである。
【００５９】カップリング試薬の結合は、種々のカップ
リング試薬を使用して、ポリマーと配位子との間に共有
結合を形成することによって達成することができる。遊
離のヒドロキシルおよび／またはアミン含有ポリマーお
よび配位子は、試薬、例えば、シアノーゲンブロマイ
ド、ジイソシアネート類、ジアルデヒド類およびトリク
ロロ−ｓ−トリアジンによって共有結合的にカップリン
グすることができる。この技術についてのさらに徹底し
た考察は、例えば、上記引用したChen et al.の引例に
おいて、見ることができる。
【００６０】所定の場合において、配位子をポリマー基
質に固定化する好ましい方法は、一般に、配位子の反応
性結合部位の分子位置と、配位子の特定の官能基と、共
有結合することのできるポリマー基質とによって、一般
に、支配される。例えば、末端ヒドロキシ官能基を含有
するポリマー基質の場合に、シアノーゲンブロマイドの
アルカリ性溶液（例えば、１０〜２０％w/v)で処理する
ことによって、活性化することが、現在、好ましい。典
型的には、反応混合物は、室温（例えば、２０〜２５
℃）に約３０分間維持される。溶液のｐＨは、アルカリ
性物質、例えば、ＫＯＨまたはＮａＯＨの添加により、
約１０〜１２の範囲に維持される。ついで、ポリマー
は、生理的塩水（０．９gm%)で十分に洗浄され、幾分ア
ルカリ性の緩衝溶液に溶解した精製された配位子の溶液
を用い、２〜８℃で１２〜１６時間インキュベートされ
る。ポリマーは、生理的塩水で十分に濯がれ、未結合ま
たは非特異的に結合した配位子を除去する。
【００６１】同様に、配位子は、好ましくは、エーテ
ル、チオエーテルまたはアルキルアミン結合を介して、
グリシジル含有ポリマー類に固定される。エポキシ活性
化されたポリマー基質は、濯がれ、中性の水性緩衝溶液
を用いて、室温で膨潤される。精製された配位子、溶解
されたボレート、カーボネートまたはリン酸塩緩衝溶液
は、４〜３０℃で、１２〜２０時間、グリシジルポリマ
ー基質とインキュベートされる。過剰および非特異的結
合した配位子は、ポリマーを塩水、酢酸（０．２〜１．
０モル）、リン酸塩緩衝（ｐＨ＝７．２＋／−０．２）
塩水溶液でポリマーを濯ぐことによって取り除かれる。
アミンおよびカルボキシル含有ポリマーマトリックスの
活性化は、幾分酸性（ｐＨ＝４．５〜６．５）の水溶性
カルボジイミドの緩衝溶液に溶解した精製配位子で処理
することによって行うことができる。配位子は、ポリマ
ー基質、配位子およびカルボジイミド反応体を、２〜８
℃で、１２〜１６時間、インキュベートすることによっ
て、ポリマー基質に共有結合的にカップリングされる。
ポリマー−配位子共役体は、交互に、酸、ついで、アル
カリで洗浄され、濯ぎ溶液に配位子およびカルボジイミ
ド反応体が見られなくなるまで洗浄される。
【００６２】さらなる例として、配位子を基質粒子の表
面に結合する方法は、米国特許5,077,210に記載されて
いる。シランが基質に結合され、配位子の一方の官能基
で、ヘテロ二官能性の架橋剤とカップリングされ、それ
により、標的化合物、例えば、蛋白質に自由に結合する
異なる官能基を残す。好ましくは、シランは、基質のヒ
ドロキシル基と反応する官能基、および、標的化合物、
例えば、蛋白質のアミノ基と続いて反応するためのコハ
ク酸イミド基を含有するヘテロ二官能性架橋剤の官能基
と反応するチオール末端基を有する。
【００６３】抗体を基質粒子の表面に結合させる方法
は、米国特許4,357,311に記載されている。この方法
は、トリクロロ−トリアジンを介して抗体を共有結合さ
せて、親和性粒子を生成することを含む。さらに、酵素
を基質粒子の表面に固定化するための数多くの方法は、
“Enzyme Technology"(Noyes Data Corporation 1983)
の、特に、３８〜５９頁に開示されている。
【００６４】スペーサもまた、本発明のアフィニテイ分
離法に使用するための親和性粒子を製造するのに、使用
される。スペーサは、一般に、少なくとも２つの反応性
官能基を有する分子であり、これら官能基は、同一であ
っても、異なっていてもよく、分子の対向端に位置し、
基質粒子および配位子と結合するために使用される。ス
ペーサは、配位子の基質粒子への結合を促進するために
使用され、配位子は、処理さるべき流体、さらに特に、
標的化合物とより有効に接触するために、基質粒子から
十分に離れて保持される。反応性官能基が同一である適
当なスペーサとしては、例えば、６−ジアミノヘキサ
ン、ジビニルスルホン、グルタルアルデヒド、１，４−
シクルヘキサンジカルボン酸、エチレンジアミンテトラ
酢酸、トリエチレングリコール、１，４−ブタンジオー
ルジグリシジルエーテル、メチレン−ｐ−フェニルジイ
ソシアネートおよび無水コハク酸が挙げられる。反応性
官能基が同一でない適当なスペーサとしては、例えば、
６−アミノカプロン酸、ｐ−ニトロベンゾイルクロライ
ド、１，２−エポキシー３−（−ｐ−ニトロフェノキ
シ）プロパン、アミノプロピルトリエトキシシランおよ
びホモシステインチオラクトンが挙げられる。ポリペプ
チド類、および、さらに特に、蛋白質を、スペーサとし
て、使用することもできる。アルブミン、低親和性蛋白
質は、例えば、スペーサとして、首尾よく使用すること
ができ、アルブミンおよびその他の天然蛋白質もまた、
基質粒子をよりバイオコンパチブルとする役割を果た
す。
【００６５】動的濾過装置 動的濾過装置は、いずれの適当な動的濾過装置であって
もよい。動的濾過装置の操作原理は、濾過媒体から粒状
物を除き、濾過媒体に隣接するケーク層の形成を防止す
ることによって、濾過媒体を閉塞または汚染しないで維
持することである。これらの結果は、動的濾過装置内で
作動する、処理さるべき流体に作用する回転手段を使用
し、濾過媒体に関して十分に速く流体流を移動させるこ
とによって、粒状物に高剪断速度および高揚力を生じさ
せることによって達成される。回転手段以外に、その他
の手段、例えば、振動および往復手段も、同様の効果を
達成するために、同様に、使用することができる。動的
濾過法における流体濾過媒体界面における剪断は、化合
物吸着、および、フィルターの長手方向に沿った高タン
ジェンシャル速度(high tangential velocities)にとも
ない、濾過媒体を介して逆流を生じ濾過を減速するおそ
れのある、大きくて不均一な圧力降下による初期フィル
ター閉塞のようなその他の欠点のあるタンジェンシャル
もしくはクロスフロー(crossflow)濾過技術と違って、
クロスフロー(crossflow)流体速度からほぼ独立であ
る。
【００６６】動的濾過は、本発明のコンテキスト中にお
いて、多くの性能利点を生ずる。動的濾過アセンブリに
おいて生ずる非常に速い剪断速度は、親和性粒子が処理
さるべき流体によって完全に接触され、標的化合物の高
速回収を保証する優れた手段を提供する。さらに、透過
フラックス速度(permeatate flux rate)における増大
が、幾つかのシステムにおける剪断速度の増大ととも
に、ほぼ直線的に観測されるので、親和性粒子から処理
さるべき流体を効率よく除去するために必要とされる濾
過面積は、その他の濾過手段に比べて、劇的に、減少し
うる。
【００６７】典型的な動的濾過装置は、外部不透過ハウ
ジングと、流体に関して、移動する濾過媒体を含有する
内部機素とを含む。このような相対的な移動を行うため
に、種々の適当な原動手段、例えば、回転手段、振動手
段または往復手段が使用される。適当なシリンダー状の
動的濾過システムは、米国特許3,797,662、4,066,554、
4,093,552、4,427,552、4,900,440および4,956,102に開
示されている。適当な回転デイスク動的濾過システム
は、米国特許3,997,447、4,956,102および5,037,562、
ならびに、１９９１年１２月２４日に出願された米国特
許出願セリアルNo.07/812,123に開示されている。その
他の適当な動的濾過システムは、米国特許4,952,317に
開示されている。適当な商業的に入手可能な動的濾過ア
センブリとしては、ASEA Brown Bovery rotary CROT，N
ew Logic V-SEPおよびMurkesの“Fundamentals of Cros
sflow Filtration,”Separation and Purification Met
hods,19(1), 1-29 (1990)に考察されている濾過装置が
挙げられる。動的濾過装置用のその他の適当な構成は、
また、本発明のコンテキスト中で使用することができ
る。本発明のコンテキスト中では、動的濾過装置は、好
ましくは、剪断速度少なくとも約５，０００sec-1、さ
らに好ましくは、少なくとも約１０，０００sec-1を生
ずる。
【００６８】動的濾過装置に関連して使用される濾過媒
体は、いずれの適当な濾過媒体であってもよく、典型的
には、多孔質膜であり、好ましくは、微孔質高分子膜で
ある。濾過媒体は、適当な孔定格、例えば、約２０μm
以下、約１０μm以下、約５μm以下、さらには、約１μ
m以下を有するものの、濾過媒体は、好ましくは、処理
さるべき流体の全てまたは少なくとも実質的に全てにつ
いて濾過媒体を通過させ、親和性粒子の全てまたは少な
くとも実質的に全てを保持する。かくして、濾過媒体の
孔の定格は、親和性粒子の寸法および処理さるべき流体
中の最大崩壊物（すなわち、非標的化合物）の寸法に大
きく依存する。
【００６９】図２は、本発明のアフィニテイ分離法で使
用するための好ましい動的濾過装置を概略的に示す。動
的濾過装置は、供給口２１を有するハウジング２０、濃
縮口２２、および濾液口２３を含む。回転手段２４は、
濾過媒体２５に沿って、ハウジング２０内に配置され
る。供給口２１および濃縮口２２は、濾過媒体２５の上
流側と流体連通し、濾液口２３は、濾過媒体２５の下流
側と流体連通している。流体は、濾過媒体２５を通過す
ることができ、親和性粒子は、濾過媒体２５を通過する
ことが実質的にできない。溶離液容器２６は、濾過媒体
２５の上流側で流体連通し、溶離液容器の頂部への親和
性粒子と流体との流入を制御することのできる溶離液容
器導入口バルブ２７によってハウジング２０に接続して
いる。溶離液容器２６は、また、溶離液容器２６への流
体の流入および流出を制御することのできる溶離液底部
における溶離液容器導出口バルブ２８を有する。
【００７０】使用において、標的化合物を含有する流体
と親和性流体との混合物は、供給口２１を介して、動的
濾過装置のハウジング２０に供給される。回転手段２４
は、混合物が全く濾過媒体２５を通過しないように濃縮
口２２および濾液口２３を閉鎖して、動的濾過装置内で
標的化合物と親和性粒子との結合を行うのに十分な期
間、活性化される。
【００７１】ついで、混合物は、濾液口２３を開放する
ことによって濾過媒体２５を通して濾過され、流体を動
的濾過装置内から除去する。洗浄緩衝液は、供給口２１
を介して動的濾過装置内に導入され、動的濾過装置内か
ら未結合物質を取り除き、ついで、洗浄緩衝液は、濾液
口２３を通過させられる。望ましい場合には、多数の洗
浄工程も、当然のことながら、同様に、実施することが
できる。ついで、親和性粒子は、好ましくは、動的濾過
装置に少量の洗浄緩衝液を導入することによって、溶離
液容器導入口バルブ２７を介して、溶離液容器２６に移
される。動的濾過装置の全積載体積(dead volume)が、
有効に、かつ、完全に、溶離液容器２６に排出されるた
めには、動的濾過装置は、好ましくは、動的濾過装置の
低い点に位置決めされた溶離液容器と水平から幾分、例
えば、５〜１０°変位される。
【００７２】ついで、例えば、供給口２１および溶離液
容器導入口バルブ２７を介して、溶離液容器２６に溶離
液が導入され、親和性粒子から標的化合物を取り除き、
これは、溶離液容器導出口バルブ２８を介して、溶離液
容器２６から排出される。標的化合物が親和性粒子から
取り除かれ、回収された後、親和性粒子は、ついで、例
えば、懸濁緩衝液を、溶離液容器導出口バルブ２８を介
して、溶離液容器２６に導入することによって、再使用
され、溶離液容器導入口バルブ２７を介して、親和性粒
子を再度動的濾過装置に移す。懸濁緩衝液は、ついで、
所望とあらば、濾液口２３によって取り出され、本方法
は、標的化合物を含有するさらなる流体で繰り返され
る。
【００７３】図２は、当然のことながら、本発明の方法
を実施するのに有効な装置の好ましい実施態様の単なる
概略的な例であり、本発明で使用するための実際の装置
の特別な態様は、著しく変更することができる。例え
ば、検知手段は、動的濾過装置内に位置決めされ、未結
合の標的化合物の量を決定する。同様に、検知手段は、
溶離液容器から離れてまたは溶離液容器内に位置決め
し、親和性粒子から溶離される標的化合物の量を決定す
る。その他の変形、変更は、当業者には、明らかであろ
う。同様に、通常の構成部分、例えば、パイプおよびポ
ンプ輸送手段に対する引用は、上記考察からと同様、明
らかとするために、図２から省略した。本発明のコンテ
キスト中におけるこのような構成部分の使用は、当分野
における当業者に周知である。
【００７４】使用例 本発明の方法は、化合物および流体がアフィニテイ分離
に適当である限り、いずれの化合物も流体から分離また
は単離するために使用することができる。例えば、本発
明の方法は、流体、例えば、発酵生成物、ミルク、およ
び、全血または血清から、蛋白質および抗体を単離する
ために使用することができる。本発明の方法は、また、
ラセミ混合物から特定の立体異性体を単離するためにも
使用することができる。
【００７５】望ましくない夾雑物、例えば、細胞崩壊
物、パイロジェン、病原体または毒物を取り除くため
に、液体培地が前処理されることを本発明が必要としな
いので、本発明の方法は、希釈蛋白質−ラーデン発酵(p
rotein-laden fermentation)液体培地から蛋白質を単離
または分離するために、特に適している。
【００７６】配位子および標的化合物の種々のその他の
組み合わせは、以下の表１に記載する。
【００７７】
【表１】 さらなるこのような配位子−標的化合物の関係は、当分
野の当業者には公知であり、本発明のアフィニテイ分離
法のコンテキスト中で使用することができる。
【００７８】本明細書で引用した引例は、全て、刊行物
類、特許および特許出願も含めて、参考のために、それ
らの内容全てを、本明細書で引用する。
【００７９】本発明をその好ましい実施態様について強
調して記載したが、当業者であれば、この好ましい実施
態様の変形および変更例を使用し、本明細書で特に記載
した以外にも本発明を実施することができることは、自
明であろう。したがって、本発明は、特許請求の範囲に
記載した本発明の精神および範囲内に含まれる全ての変
形および変更をも包含するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の好ましい実施態様において使用した重
要な機素の概略図である。
【図２】本発明のアフィニテイ分離法で使用するための
好ましい動的濾過装置の概略図である。
【符号の説明】
１，２ 保持タンク ３ バッファタンク ４ 動的濾過装置 ５ 導入口 ６ 廃棄タンク ７ 濾液バルブ ８ 濃縮バルブ ９ 検知タンク １０ 洗浄緩衝液タンク １１ 洗浄緩衝液バルブ １３ 溶離液容器 １４ 溶離液バルブ １５ 溶離液タンク １６ 流出液検知手段 ２０ ハウジング ２１ 供給口 ２２ 濃縮口 ２３ 濾液口 ２４ 回転手段 ２５ 濾過媒体 ２６ 溶離液容器 ２７ 溶離液導入口バルブ ２８ 溶離液導出口バルブ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 トニー・アレックス アメリカ合衆国ニュージャージー州08824, ケンドール・パーク，ヘンダーソン・ロー ド 58 (72)発明者 リチャード・フランク・サリナーロ アメリカ合衆国ニューヨーク州10706，ハ スティングズ・オン・ハドソン，バーンサ イド・ドライブ 19

Claims (37)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ａ） 原動手段、上流側と下流側とを
    有する濾過媒体、前記濾過媒体の上流側と流体連通する
    導入口、および、前記濾過媒体の下流側と流体連通する
    濾液導出口を含む動的濾過装置に、前記濾過媒体を通過
    することができる流体であり、親和性粒子に吸着するこ
    とのできる単離さるべき標的化合物を含有する流体と、
    実質的に前記濾過媒体を通過することのできない親和性
    粒子とを導入し、 （ｂ） 前記標的化合物を前記親和性粒子に吸着させる
    に十分な条件下で、前記流体が前記濾過媒体を通過でき
    ないように、前記濾液導出口を閉鎖位置にして、前記動
    的濾過装置の原動手段を運転し、 （ｃ） 前記濾液導出口を開放して、前記流体を前記動
    的濾過装置の前記濾過媒体に通すことによって前記親和
    性粒子を前記流体から分離する、各工程を含むアフィニ
    テイ分離法。
  2. 【請求項２】 前記親和性粒子に吸着されていない前記
    標的化合物の前記流体の濃度が、所定のレベルに降下す
    る時、前記分離工程（ｃ）が行われる、請求項１に記載
    の方法。
  3. 【請求項３】 さらに、（ｄ） 前記親和性粒子を洗浄
    し、（ｅ） 前記標的化合物を前記親和性粒子から溶離
    することを含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記標的化合物が、それに吸着された前
    記標的化合物を有する前記親和性粒子を前記動的濾過装
    置から溶離液容器に移し、溶離液を前記溶離液容器に通
    して前記標的化合物を取り出すことによって、前記親和
    性粒子から溶離される、請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記標的化合物が、前記親和性粒子と接
    触する前に、前記流体中の前記標的化合物の濃度よりも
    少なくとも約１０倍以上の濃度で前記溶離液中に存在す
    る、請求項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記溶離液容器を通る溶離液の量が、前
    記溶離液容器の自由な空隙率にほぼ等しい、請求項４ま
    たは５に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記溶離された親和性粒子が、ついで、
    前記動的濾過装置に戻され、本方法が繰り返される、請
    求項４〜６のいずれか１項の記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記溶離液容器が、前記動的濾過装置の
    前記濾過媒体の上流側と流体連通している、請求項７に
    記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記動的濾過装置が、剪断速度少なくと
    も約５，０００秒-1を達成するように運転される、請求
    項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記動的濾過装置が、剪断速度少なく
    とも約１０，０００秒-1を達成するように運転される、
    請求項９項に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記親和性粒子が、非多孔質である、
    請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記親和性粒子が、実質的に球形であ
    る、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記親和性粒子が、径において、実質
    的に単分散である、請求項１〜１２のいずれか１項に記
    載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記親和性粒子が、前記濾過媒体の孔
    寸法よりも少なくとも約２倍大きい径を有する、請求項
    １〜１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記親和性粒子が、前記濾過媒体の孔
    寸法よりも少なくとも約５倍大きい径を有する、請求項
    １４項に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記親和性粒子が、平均径約６０μm
    以下を有する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の
    方法。
  17. 【請求項１７】 前記親和性粒子が、平均径約２０μm
    以下を有する、請求項１６に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記親和性粒子が、平均径少なくとも
    約１μmを有する、請求項１７に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記濾過媒体が、前記流体中の最大の
    崩壊物の寸法の少なくとも約２倍大きい孔寸法を有す
    る、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記濾過媒体が、前記流体中の最大の
    崩壊物の寸法の少なくとも約５倍大きい孔寸法を有す
    る、請求項１９に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 前記濾過媒体が、孔定格約５μm未満
    を有する、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方
    法。
  22. 【請求項２２】 前記濾過媒体が、孔定格約１μm未満
    を有する微孔質膜である、請求項２１に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 前記親和性粒子に吸着されない前記標
    的化合物の前記流体中の濃度が、モニターされる、請求
    項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 前記標的化合物が、生物学的に活性で
    ある、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記標的化合物が、蛋白質である、請
    求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 前記標的化合物が、抗体である、請求
    項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 前記流体が、発酵生成物である、請求
    項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 前記流体が、ミルクである、請求項１
    〜２６のいずれか１項に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 前記流体が、全血または血清である、
    請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 前記標的化合物が、立体異性体であ
    り、前記流体が、ラセミ混合物である、請求項１〜２３
    のいずれか１項に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 （ａ） 原動手段、上流側と下流側と
    を有する濾過媒体、前記濾過媒体の上流側と流体連通す
    る導入口、および、前記濾過媒体の下流側と流体連通す
    る濾液導出口を含む動的濾過装置に、基質粒子を導入
    し、 （ｂ） 前記濾液導出口を開放位置にして、前記動的濾
    過装置の前記原動手段を運転して、前記濾過媒体の孔寸
    法よりも著しく小さい径を有する前記基質粒子の全てを
    前記濾過媒体に通過させ、 （ｃ） 前記濾過媒体を通過しない前記基質粒子を前記
    動的濾過装置から回収することを含む、親和性粒子を分
    粒する方法。
  32. 【請求項３２】 前記方法が、より大きな孔定格を有す
    る濾過媒体を使用して、前記回収された基質粒子で繰り
    返され、前記濾過媒体を通過する前記基質粒子が、回収
    される、請求項３１に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 続いて、親和性粒子を形成するため
    に、配位子が、前記回収された基質粒子に結合される、
    請求項３１または３２に記載の方法。
  34. 【請求項３４】 基質と、これに結合した配位子とを含
    み、前記基質が、コア物質と、その表面の、非多孔質、
    親水性ポリマー塗膜とを含む親和性粒子。
  35. 【請求項３５】 前記ポリマー塗膜が、放射線グラフト
    されたモノマー類を含む、請求項３４に記載の親和性粒
    子。
  36. 【請求項３６】 前記モノマー類が、アクリル酸および
    メタクリル酸からなる群から選択される、請求項３５に
    記載の親和性粒子。
  37. 【請求項３７】 前記コア物質が、多孔質である、請求
    項３４〜３６のいずれか１項に記載の親和性粒子。
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