CN102250860A - 木瓜蛋白酶分离纯化方法和其固定化方法,以及所得产品 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种木瓜蛋白酶分离纯化方法和其固定化方法，以及所得产品。该分离纯化方法包括如下步骤：(1)将含木瓜蛋白酶的原料溶解，除去不溶物，之后调节蛋白浓度为10mg/ml～20mg/ml，得初始粗酶溶液；(2)将初始粗酶溶液与聚乙二醇、无机盐和水混合、溶解，待各成分混合均匀后分相，其中，初始粗酶溶液的含量为30％～40％，聚乙二醇的含量为10％～30％，无机盐的含量为10％～25％，pH值为5.5～6.5；(3)取分相后得到的聚乙二醇相以离子交换法回收木瓜蛋白酶，即可。该固定化方法为在富集着木瓜蛋白酶的聚乙二醇相中进行木瓜蛋白酶固定化即可。该分离纯化方法生物相容性好，操作步骤简单，操作条件温和，过程易于放大，产品酶活性损失少，无有机溶剂残余，且固定化步骤大为简化。
Description
技术领域
本发明涉及一种木瓜蛋白酶分离纯化方法和其固定化方法，以及所得产品。
背景技术
木瓜蛋白酶(Papain)是一种重要的植物来源蛋白酶，应用范围非常广泛。它不仅能够催化蛋白质的水解，在特定条件下还具有酰胺酶活力、酯酶活力、转氨酶活力、转酯酶活力和海因酶活力等诸多活性。木瓜蛋白酶能水解抗体制备Fab片段，合成肽、酯氨基酸类表面活性剂、氨基酸酯等化合物，已广泛应用于食品、生物、化工、洗涤剂、医药、化妆品等领域。
木瓜蛋白酶是从木瓜中提取而得。将木瓜浆液直接或稍加精制后干燥得到的产品即木瓜蛋白酶粗品，一般含有木瓜蛋白酶(Papain，EC 3.4.22.2)、甘氨酸内肽酶(Glycyl endopeptidase，EC 3.4.22.25)、木瓜凝乳蛋白酶(Chymopapain，EC 3.4.22.6)、木瓜蛋白酶Ω(Carcain，EC 3.4.22.30)、以及其它一些还未被鉴定出来的酶类、杂质等等。随着技术的进步，市场上也出现了简单精制的喷雾干燥木瓜蛋白酶粗酶粉，这种喷雾干燥的木瓜酶粗粉在生产过程中应用了较为先进的膜过滤技术和喷雾干燥技术，以除去木瓜浆液中的不溶性杂质而制得的可以完全溶解的粗酶粉。但是，由于在粗酶中各种酶的催化性质有异，不适于在一些要求较高的精细催化反应中应用，阻碍了木瓜蛋白酶的应用拓展。例如，水解抗体IgG制备Fab片段(fragment that having the antigen binding site，抗原结合片段)就需要使用高纯度的木瓜蛋白酶，具体如现有的单克隆抗体药物阿西单抗(Reopro，抗血小板凝聚单克隆抗体)就是一个Fab片段，它正是利用木瓜蛋白酶水解人-鼠嵌合单克隆抗体7E3制备而得。
对于木瓜蛋白酶的分离提纯，由于木瓜蛋白酶与木瓜粗酶中的其他蛋白酶的理化性质十分相似，分离纯化较为困难，因而市面上销售并广泛使用的木瓜蛋白酶基本上是粗酶；而已有传统的高纯度木瓜蛋白酶，市售常见为sigma公司的二次结晶木瓜蛋白酶，纯度95％左右，其制备方法是通过多步盐析后再结晶的方法，此提纯方法步骤多，成本高，对酶活影响大，会使酶中灰分增加，并且采用结晶的方法来提高酶的纯度，不利于工业生产试验放大。因此，采用新型的简单高效的分离纯化方法制备高纯度的木瓜蛋白酶就显得尤为必要，该现状亟待解决。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服了现有技术中对于木瓜蛋白酶的分离提纯方法存在步骤多，成本高，对酶活影响大，会使酶中灰分增加，并且该方法不适于工业生产试验放大等的缺陷，提供了一种生物相容性好，操作步骤简单，操作条件温和，过程易于放大，产品酶活性损失少，无有机溶剂残余的木瓜蛋白酶分离纯化方法，以及固定化步骤大为简化的木瓜蛋白酶固定化方法和所得产品。
本发明的木瓜蛋白酶分离纯化方法包括如下步骤：
(1)将含木瓜蛋白酶的原料溶解，除去不溶物，之后调节蛋白浓度为10mg/ml～20mg/ml，得初始粗酶溶液；
(2)将初始粗酶溶液与聚乙二醇、无机盐和水混合、溶解，待各成分混合均匀后分相，其中，初始粗酶溶液的含量为30％～40％，聚乙二醇的含量为10％～30％，无机盐的含量为10％～25％，pH值为5.5～6.5，百分比为各成分占初始粗酶溶液、聚乙二醇、无机盐和水总量的质量百分比；
(3)取分相后得到的聚乙二醇相以离子交换法回收富集在其中的木瓜蛋白酶，即可。
下面，进一步对本发明的木瓜蛋白酶分离纯化方法进行详细介绍：
(1)将含木瓜蛋白酶的原料溶解，除去不溶物，之后调节蛋白浓度为 10mg/ml～20mg/ml，得初始粗酶溶液。
本发明中，所述的含木瓜蛋白酶的原料可按本领域常规条件选择，可以是各种木瓜乳汁、浆液、粉、木瓜蛋白酶粗酶粉以及其它任何含木瓜蛋白酶的材料，较佳的为木瓜蛋白酶粗酶粉。目前的各种商品木瓜蛋白酶粗酶粉的木瓜蛋白酶含量约在5％～8％，均可为本发明所用。
本发明中，所述的将含木瓜蛋白酶的原料按本领域常规方法溶解可按本领域常规操作进行选择；所述的溶解的溶液较佳的为含有0.5mM～5mMEDTA且pH为5.5～6.5的10mM～50mM半胱氨酸溶液。
本发明中，所述的除去不溶物为本领域常规操作条件选择，可为板框过滤或离心，较佳的为离心，更佳的为20,000×g离心15min。
本发明中，所述的步骤(1)的温度可按本领域常规条件选择，一般4℃左右均可。
(2)将初始粗酶溶液与聚乙二醇、无机盐和水混合，溶解，待各成分混合均匀后分相，其中，初始粗酶溶液的含量为30％～40％，聚乙二醇的含量为10％～30％，无机盐的含量为10％～25％，pH值为5.5～6.5，百分比为各成分占初始粗酶溶液、聚乙二醇、无机盐和水总量的质量百分比；
本发明中，所述的聚乙二醇可按本领域常规条件选择，较佳的为聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000或聚乙二醇8000。
本发明中，所述的无机盐为本领域常规双水相分离体系使用的无机盐，可按本领域常规条件选择，较佳的为硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、磷酸钾、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、甲酸钠和酒石酸钾钠中的一种或多种。
本发明中，所述的pH值的调节可按本领域常规pH调节剂调节，如氢氧化钠或盐酸。
本发明中，所述的水可按本领域常规条件选择，一般为去离子水。
本发明中，所述的混合、溶解的温度可按本领域常规条件选择，室温20℃ 左右均可。
本发明中，所述的混合均匀可按本领域常规操作进行，较佳为振荡。
本发明中，所述的分相可按本领域常规操作进行，较佳的为静置分相或离心分相。其中，所述的离心分相的条件较佳的为10,000×g离心15min。
(3)取分相后得到的聚乙二醇相以离子交换法回收富集在其中的木瓜蛋白酶，即可。
本发明中，所述的离子交换法可按本领域常规操作选择进行，较佳的包括如下步骤：在pH为4.0～6.0的条件下，将聚乙二醇相上离子交换柱，木瓜蛋白酶吸附于离子交换介质上，之后再将木瓜蛋白酶洗脱即可。
其中，所述的聚乙二醇相上样的蛋白浓度可按本领域常规条件选择，较佳的为0.5mg/ml。其蛋白浓度可用去离子水适当调节。
其中，所述的离子交换介质可按本领域常规选择，较佳的为阳离子交换介质，更佳的为强阳离子交换介质，进一步更佳的为快流速SP-琼脂糖凝胶，英文名Sepharose SP Fast Flow。
其中，所述的离子交换柱的平衡缓冲液可按本领域常规条件选择，较佳的为pH值5.0的50mM NaAC缓冲液。按本领域常规一般所述的平衡缓冲液先平衡离子交换柱，之后上样，再洗脱目标样品。
其中，所述的洗脱木瓜蛋白酶时的洗脱液可按本领域常规条件选择，较佳的为pH值5.0的50mM NaAC与230mM NaCl的混合液。
本发明中，所述的洗脱得到的木瓜蛋白酶溶液一般还可按本领域常规操作，将该木瓜蛋白酶溶液透析，收集透析液并干燥即可得木瓜蛋白酶酶粉。
其中，所述的透析温度可按本领域常规，一般4℃左右均可。
其中，所述的透析使用的透析袋可按本领域常规条件选择，较佳的为截留分子量3500Da的透析袋。
其中，所述的透析操作可按本领域常规操作进行，较佳的为去离子水中透析24小时，期间换水2～3次。所述的去离子水的用量无特别限定，本领 域技术人员公知，可使用大体积水进行透析。
其中，所述的干燥可按本领域常规操作，较佳的为真空冷冻干燥。
本发明还涉及前述木瓜蛋白酶分离纯化方法获得的木瓜蛋白酶。
本发明还涉及一种木瓜蛋白酶的固定化方法包括如下步骤：在如前所述木瓜蛋白酶分离纯化方法步骤(2)分相后得到的富集木瓜蛋白酶的聚乙二醇相中进行木瓜蛋白酶固定化即可。
本发明中，所述的木瓜蛋白酶固定化的方法可按本领域常规方法选择，可为载体固定化法或交联酶聚集体制备法。其中，所述的载体固定化法一般包括吸附法、共价结合法或交联法。
本发明中，所述的木瓜蛋白酶固定化的方法为载体固定化法时，所述的木瓜蛋白酶固定化较佳的包括如下步骤：向如前所述木瓜蛋白酶分离纯化方法步骤(2)分相后得到的聚乙二醇相中加入固定化酶载体进行固定化反应，之后分离获得固定化酶即可。
其中，所述的固定化酶载体可从本领域常规固定化使用的固定化酶载体中选择，包括各种无机载体，如硅藻土；各种天然有机载体，如葡聚糖及其衍生物、纤维素及其衍生物、壳聚糖及其衍生物等；各种合成载体，如氨基载体类如ZH-HA、MANAE agarose、Sepabeads EC-EA、LH-HA、BB-A等，环氧基载体类如Eupergit C、Amberzyme、ZH-EP、LH-EP、BB-2等；各种介孔材料，如SBA15、MCM41等均可使用。所述的固定化酶载体的用量本领域常规技术人员公知，可按照具体载体的负载能力适当调整。
其中，所述的固定化反应操作条件按本领域常规操作，一般为搅拌或振荡，温度为常规室温，一般25℃左右均可。
其中，所述的分离可按本领域常规操作，较佳的为过滤，更佳的为抽滤。
本发明中获得固定化木瓜蛋白酶之后一般按本领域常规操作，用去离子水清洗，抽干，并于4℃左右保存。
本发明中，所述的木瓜蛋白酶固定化的方法为交联酶聚集体制备法时， 所述的木瓜蛋白酶固定化较佳的包括如下步骤：将如前所述木瓜蛋白酶分离纯化方法步骤(2)分相后得到的聚乙二醇相中加入有机溶剂沉淀剂，木瓜蛋白酶沉淀聚集，之后再加入交联剂溶液均匀混合，交联即可。
本发明中，所述的有机溶剂沉淀剂可按本领域常规所述选择，较佳的为丙酮、乙腈、二氧六环、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、异丁醇、叔丁醇、戊醇和己醇中的一种或多种。
本发明中，所述的有机溶剂沉淀剂的用量可按本领域常规条件选择，较佳的为有机溶剂沉淀剂与聚乙二醇相体积比为1∶1～5∶1。
本发明中，所述的交联剂可按本领域常规所述选择，一般为双功能试剂戊二醛或碳化二亚胺，较佳的为戊二醛。其中，当交联剂为戊二醛，一般使用为市售25％戊二醛水溶液。
本发明中，所述的交联剂的用量可按本领域常规条件选择，较佳的为交联剂最终浓度为质量百分比0.5％～1.5％。
本发明中，所述的交联的反应时间可按本领域常规条件选择，较佳的为1～10小时，更佳的为2小时。
本发明中，所述的交联的反应温度可按本领域常规条件选择，一般室温25℃左右。
本发明中，所述的均匀混合可按本领域常规操作进行，一般搅拌即可。
本发明中，所述的固定化的方法为交联法时获得固定化木瓜蛋白酶(又称交联酶聚集体)，一般可按本领域常规操作进行后处理，较佳的为将所述交联后含有固定化木瓜蛋白酶的溶液离心，取固定化木瓜蛋白酶，去离子水清洗，之后干燥即可。
其中，所述的后处理温度可按本领域常规，一般4℃左右。
其中，所述的离心可按本领域常规操作进行，较佳的为20,000×g离心15min。
其中，所述的干燥可按本领域常规，一般真空冷冻干燥即可。
本发明还涉及前述木瓜蛋白酶的固定化方法获得的固定化木瓜蛋白酶。
本发明木瓜蛋白酶分离纯化方法获得木瓜蛋白酶，以及固定化方法获得的固定化木瓜蛋白酶可按本领常规用途，用于蛋白酶、酰胺酶、酯酶、转氨酶、转酯酶及海因酶等应用。
本发明所用试剂和原料除特殊说明外均市售可得。
在符合本领域常识的基础上，本发明中上述的各技术特征的优选条件可以任意组合得到本发明较佳实例。
本发明的积极进步效果在于：
本发明的木瓜蛋白酶分离纯化方法生物相容性好，成本低，操作步骤简单，操作条件温和，萃取效率高，萃取率在90％以上，过程易于放大，产品酶活性损失少，无有机溶剂残余；制得的产品木瓜蛋白酶纯度高约至96％～100％；木瓜蛋白酶固定化方法避免了使用其它的分离纯化手段将木瓜蛋白酶从聚合物相中分离出来，可直接“原位”进行固定化，使得固定化步骤大为简化，固定化率＞90％，酶活回收率＞40％；该方法不仅制得了固定化酶，而且起到了从聚合物相中回收目的酶蛋白的作用，克服了传统上使用凝胶过滤、超滤、离子交换、反萃等方法存在操作复杂，成本较高并且难于放大等缺陷。
附图说明
图1为实施例1～4的木瓜蛋白酶分离纯化的过程中聚乙二醇相与无机盐相中木瓜蛋白酶的碱性蛋白非变性电泳图。
图2为实施例1制备的木瓜蛋白酶的冻干粉外观图。
图3为实施例7制备的壳聚糖小球固定化木瓜蛋白酶外观图。
图4为实施例10制备的固定化木瓜蛋白酶外观图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在 所述的实施例范围之中。
下述实施例中，木瓜粉和木瓜蛋白酶粗酶(广西南宁杰沃利生物制品有限公司)；木瓜蛋白酶标品为二次结晶的木瓜蛋白酶(Sigma公司产品)；木瓜乳汁(木瓜浆液)为自制，以鲜木瓜为原料榨汁即可。
木瓜蛋白酶的分离纯化
实施例1
1、在4℃下，将40g木瓜乳汁溶解于100ml 50mM半胱氨酸溶液(含有5mM EDTA，pH 6.5)中，离心(20,000×g，4℃，15min)除去不溶物，测定上清蛋白浓度(常规的考马斯亮蓝染色法测定)，用50mM半胱氨酸溶液调节上清的蛋白浓度为10mg/ml，再调节溶液的pH为6.5(用6MNaOH或HCl溶液调节)，即为初始粗酶溶液；同时，配置40％聚乙二醇2000溶液；配置40％(w/w)硫酸铵溶液，调节pH为6.5；
在20℃下，将初始粗酶溶液、聚乙二醇溶液、硫酸铵溶液和去离子水混合溶解在一起，其中初始粗酶溶液的质量百分含量为40％，聚乙二醇2000的质量百分含量为30％，硫酸铵的质量百分含量为25％、去离子水的质量百分含量为5％；将配置好的双水相体系放入20℃摇床中充分混合2h，将混合均匀溶液离心(20℃，10,000×g，15min)，以使两相(上相为聚乙二醇相，下相为无机盐相)充分分离；将聚乙二醇相吸出，即得到了富含高纯度木瓜蛋白酶的聚乙二醇溶液。
其中，测定上、下相体积，分取上、下相样品，测定蛋白浓度和酶活力，将样品进行碱性蛋白非变性电泳(Basic Protein Native-PAGE，可参考文献Dekeyser P.M.，De Smedt S.，Demeester J.，Lauwers A.，Journal of Chromatography B：Biomedical Sciences and Applications，1994，656(1)：203-208)和快速蛋白液相色谱(FPLC，Azarkan M.，Dibiani R.，Baulard C.，Baeyens-Volant D，International Journal of Biological Macromolecules，2006，38(3-5)：216-224)检测，经检测，聚合物相中的木瓜蛋白酶纯度(FPLC测 定)为96.1％，其分离纯化效果见图1(1a为聚合物相、1b为无机盐相)。
2、离子交换填料采用Sepharose SP Fast Flow 20ml(柱子型号：Amersham Biosciences XK 16，内径16mm)；离子交换柱平衡缓冲液为A：50mM NaACpH 5.0，洗脱缓冲液为B：50mM NaAC 230mM NaCl pH 5.0；
将上述富含高纯度木瓜蛋白酶的聚乙二醇相用水稀释蛋白浓度至0.5mg/ml，用A液平衡离子交换柱后，将稀释液通入50ml，待流穿物完全流过柱子后，用B液洗脱，收集洗脱峰，装入截留分子量为3500Da透析袋中，4℃在4L去离子水中充分透析24h，期间更换3次水，收集透析液即为高纯度木瓜蛋白酶液，进一步将透析液冻结后进行真空冷冻干燥即可得到高纯度的木瓜蛋白酶酶粉，其外观可如图2所示。
实施例2
在4℃下，将30g木瓜浆液溶解于200ml 25mM半胱氨酸溶液(含有3mM EDTA，pH 6.0)中，离心(20,000×g，4℃，15min)除去不溶物，测定上清蛋白浓度，用25mM半胱氨酸溶液调节上清的蛋白浓度为10mg/ml，再调节溶液的pH为6.0(6M NaOH或HCl溶液调节)，即为初始粗酶溶液；配置40％聚乙二醇4000溶液；同时，配置40％(w/w)硫酸钠溶液，调节pH为6.0；
在20℃下，将初始粗酶溶液、聚乙二醇溶液、硫酸钠溶液和去离子水混合溶解在一起，其中初始粗酶溶液的质量百分含量为35％，聚乙二醇4000的质量百分含量为25％，硫酸钠的质量百分含量为19％、去离子水的质量百分含量为21％；将配置好的双水相体系放入20℃摇床中充分混合2h，将混合均匀溶液离心(20℃，10,000×g，15min)，以使两相充分分离；将聚乙二醇相(上相)吸出，即得到了富含高纯度木瓜蛋白酶的聚乙二醇溶液；其中，同实施例1方法对聚合物相中的木瓜蛋白酶纯度(FPLC测定)为96.8％，其分离纯化效果见图1(2a聚合物相、2b无机盐相)。
之后，将上述富含高纯度木瓜蛋白酶的聚乙二醇相按同实施例1方法处 理即可得高纯度木瓜蛋白酶液，进一步将透析液冻结后进行真空冷冻干燥即可得到高纯度的木瓜蛋白酶酶粉。
实施例3
在4℃下，将20g木瓜粉溶解于100ml 30mM半胱氨酸溶液(含有0.5mM EDTA，pH 5.8)中，离心(20,000×g，4℃，15min)除去不溶物，测定上清蛋白浓度，用30mM半胱氨酸溶液调节上清的蛋白浓度为15mg/ml，再调节溶液的pH为5.8(6M NaOH或HCl溶液调节)，即为初始粗酶溶液；同时，配置40％聚乙二醇6000溶液；pH 5.8的40％(w/w)磷酸盐溶液，由40％(w/w)K2HPO4和40％(w/w)NaH2PO4配制而得。
在20℃下，将初始粗酶溶液、聚乙二醇溶液、磷酸盐溶液和去离子水混合溶解在一起，其中初始粗酶溶液的质量百分含量为30％，聚乙二醇6000的质量百分含量为18％，磷酸盐的质量百分含量为10％、去离子水的质量百分含量为42％；将配置好的双水相体系放入20℃摇床中充分混合2h，将混合均匀溶液离心(20℃，10,000×g，15min)，以使两相充分分离；将聚乙二醇相(上相)吸出，即得到了富含高纯度木瓜蛋白酶的聚乙二醇溶液；其中，同实施例1方法对聚合物相中的木瓜蛋白酶纯度(FPLC测定)为98.4％，其分离纯化效果见图1(3a聚合物相、3b无机盐相)。
之后，将上述富含高纯度木瓜蛋白酶的聚乙二醇相按同实施例1方法处理即可得高纯度木瓜蛋白酶液，进一步将透析液冻结后进行真空冷冻干燥即可得到高纯度的木瓜蛋白酶酶粉。
实施例4
在4℃下，将10g木瓜蛋白酶粗酶粉溶解于100ml 10mM半胱氨酸溶液(含有0.5mM EDTA，pH 5.5)中，离心(20,000×g，4℃，15min)除去不溶物，测定上清蛋白浓度，用10mM半胱氨酸溶液调节上清的蛋白浓度为20mg/ml，再调节溶液的pH为5.5(6M NaOH或HCl溶液调节)，即为初始粗酶溶液；配置40％聚乙二醇8000溶液；同时，配置40％(w/w)酒 石酸钾钠溶液，调节pH为5.5。
在20℃下，将初始粗酶溶液、聚乙二醇溶液、酒石酸钾钠溶液和去离子水混合溶解在一起，其中初始粗酶溶液的质量百分含量为30％，聚乙二醇8000的质量百分含量为10％，酒石酸钾钠的质量百分含量为13％、去离子水的质量百分含量为47％；将配置好的双水相体系放入20℃摇床中充分混合2h，将混合均匀溶液离心(20℃，10,000×g，15min)，以使两相充分分离；将聚乙二醇相(上相)吸出，即得到了富含高纯度木瓜蛋白酶的聚乙二醇溶液；其中，同实施例1方法对聚合物相中的木瓜蛋白酶纯度(FPLC测定)为100％，其分离纯化效果见图1(4a聚合物相、4b无机盐相)。
之后，将上述富含高纯度木瓜蛋白酶的聚乙二醇相按同实施例1方法处理即可得高纯度木瓜蛋白酶液，进一步将透析液冻结后进行真空冷冻干燥即可得到高纯度的木瓜蛋白酶酶粉。
木瓜蛋白酶的原位固定化
实施例5
预准备：氨基载体的活化
称取3g ZH-HA载体(购自香港GeneRad Biotech Laboratory有限公司)加入12ml 0.1M的磷酸钾缓冲液(pH 8.0)中，在摇床上200rpm清洗15min，测定pH，维持pH在7.8-8.2之间，1h后用3#砂芯过滤抽干，将载体加入12ml 2％(w/v)的戊二醛0.02M磷酸钾缓冲液(pH 8.0)中，在25℃下200rpm活化1h，活化后的载体用去离子水充分清洗，抽干后保存于4℃(在24h内使用)。
氨基载体原位固定化木瓜蛋白酶
取0.5g活化的ZH-HA载体加入5ml酶溶液(聚乙二醇相，实施例1)中，装入25ml具塞锥形瓶。将锥形瓶放入25℃摇床200rpm固定化48h，固定化结束后通过抽滤得到固定化酶，先将固定化酶先用去离子水清洗，再用1M的NaCl溶液(用pH 7.0的0.02M磷酸钾缓冲液配置)漂洗，最终 用0.02M的磷酸钾缓冲液(pH 7.0)充分清洗，抽干后，4℃保存。该方法固定化木瓜蛋白酶，固定化率达到90.2％，酶活回收率达到52.5％。
实施例6
介孔材料原位固定化木瓜蛋白酶
取0.7g SBA15(购自上海百瑞生物技术有限公司)载体加入5ml酶溶液(聚乙二醇相，实施例3)中，装入25ml具塞锥形瓶。将锥形瓶放入25℃摇床200rpm固定化48h，固定化结束后通过抽滤得到固定化酶，再将固定化酶用去离子水清洗，最终用0.02M的磷酸钾缓冲液(pH 7.0)充分清洗，抽干后，4℃保存。该方法固定化木瓜蛋白酶，固定化率达到93.4％，酶活回收率达到64.3％。
实施例7
预准备：壳聚糖小球的制备
将200ml1.5％(v/v)的乙酸溶液加热至70-80℃，称取2g壳聚糖粉末在不断搅拌下缓慢加入，直至壳聚糖完全溶解，超声除气。采用注射器配上针头(5号)，在室温下将1％(v/v)的壳聚糖溶液滴加入缓慢搅拌的1L 1MNaOH 30％(v/v)甲醇的固化溶液中。固化后，用去离子水清洗小球，直至洗液为中性。将制备的壳聚糖小球放入去离子水中，4℃保存待用。
壳聚糖小球原位固定化木瓜蛋白酶
取0.4g壳聚糖小球加入5ml酶溶液(聚乙二醇相，实施例4)中，装入25ml具塞锥形瓶，再加入戊二醛溶液(25％，w/v)使其终浓度为1％。将锥形瓶放入25℃摇床200rpm固定化48h，固定化结束后通过抽滤得到固定化酶，先将固定化酶用去离子水清洗，再用1M的NaCl溶液(用pH 7.0的0.02M磷酸钾缓冲液配置)漂洗，最终用0.02M的磷酸钾缓冲液(pH 7.0)充分清洗，抽干后，4℃保存，其产品外观可如图3所示。该方法固定化木瓜蛋白酶，固定化率达到90.4％，酶活回收率达到40.3％。
固定化木瓜蛋白酶(交联酶聚集体)制备
实施例8
向20ml聚乙二醇相(实施例3)中加入20ml丙酮，在4℃下静止沉淀15min；接着将戊二醛溶液(25％，w/v)加入悬浊液中使其终浓度为1.5％，然后在25℃下200rpm交联1h；在交联结束时，将整个悬浊液在4℃、20,000×g下离心15min，将离心下来的固定化木瓜蛋白酶用去离子水清洗3遍；最后，将固定化木瓜蛋白酶进行真空冷冻干燥以制备干粉。
实施例9
向20ml聚乙二醇相(实施例4)中加入100ml丁醇，在4℃下静止沉淀15min；接着将戊二醛溶液(25％，w/v)加入悬浊液中使其终浓度为1％，然后在25℃下200rpm交联5h；在交联结束时，将整个悬浊液在4℃、20,000×g下离心15min，将离心下来的固定化木瓜蛋白酶用去离子水清洗3遍；最后，将固定化木瓜蛋白酶进行真空冷冻干燥以制备干粉。
实施例10
向20ml聚乙二醇相(实施例2)中加入50ml乙醇，在4℃下静止沉淀15min；接着将戊二醛溶液(25％，w/v)加入悬浊液中使其终浓度为0.5％，然后在25℃下200rpm交联10h；在交联结束时，将整个悬浊液在4℃、20,000×g下离心15min，将离心下来的固定化木瓜蛋白酶用去离子水清洗3遍；最后，将固定化木瓜蛋白酶进行真空冷冻干燥以制备干粉，其外观可见如图4所示。该固定化方法固定化木瓜蛋白酶，固定化率达到99.3％，酶活回收率达到47.8％。
Claims (10)
1.一种木瓜蛋白酶分离纯化方法，其特征在于：其包括如下步骤：
(1)将含木瓜蛋白酶的原料溶解，除去不溶物，之后调节蛋白浓度为10mg/ml～20mg/ml，得初始粗酶溶液；
(2)将初始粗酶溶液与聚乙二醇、无机盐和水混合、溶解，待各成分混合均匀后分相，其中，初始粗酶溶液的含量为30％～40％，聚乙二醇的含量为10％～30％，无机盐的含量为10％～25％，pH值为5.5～6.5，百分比为各成分占初始粗酶溶液、聚乙二醇、无机盐和水总量的质量百分比；
(3)取分相后得到的聚乙二醇相以离子交换法回收富集在其中的木瓜蛋白酶，即可。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的含木瓜蛋白酶的原料为木瓜蛋白酶粗酶粉；所述的溶解的溶液为含有0.5mM～5mM EDTA且pH为5.5～6.5的10mM～50mM半胱氨酸溶液；所述的除去不溶物为板框过滤或离心，较佳的为20,000×g离心15min；
和/或，步骤(2)中，所述的聚乙二醇为聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000或聚乙二醇8000；所述的无机盐为硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、磷酸钾、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、甲酸钠和酒石酸钾钠中的一种或多种；所述的混合均匀为振荡；所述的分相为静置分相或离心分相，其中，所述的离心分相的条件较佳的为10,000×g离心15min；
和/或，步骤(3)中，所述的离子交换法包括如下步骤：在pH为4.0～6.0的条件下，将聚乙二醇相上离子交换柱，木瓜蛋白酶吸附于离子交换介质上，之后再将木瓜蛋白酶洗脱即可。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的聚乙二醇相上样的蛋白浓度为0.5mg/ml；所述的离子交换介质为阳离子交换介质，较佳的为强阳离子交换介质，更佳的为快流速SP-琼脂糖凝胶；所述的离子交换柱的平衡缓冲液为pH值5.0的50mM NaAC缓冲液；所述的洗脱木瓜蛋白酶时的洗脱液为pH值5.0的50mM NaAC与230mM NaCl的混合液。
4.一种如权利要求1～3任一项所述的木瓜蛋白酶分离纯化方法获得的木瓜蛋白酶。
5.一种木瓜蛋白酶的固定化方法，其特征在于：其包括如下步骤：在如权利要求1～4任一项所述木瓜蛋白酶分离纯化方法步骤(2)分相后得到的富集木瓜蛋白酶的聚乙二醇相中进行木瓜蛋白酶固定化即可。
6.如权利要求5所述的固定化方法，其特征在于：所述的木瓜蛋白酶固定化的方法为载体固定化法时，所述的木瓜蛋白酶固定化包括如下步骤：向聚乙二醇相中加入固定化酶载体进行固定化反应，之后分离获得固定化酶即可。
7.如权利要求6所述的固定化方法，其特征在于：所述的固定化酶载体为硅藻土类无机载体、葡聚糖及其衍生物、纤维素及其衍生物、壳聚糖及其衍生物、氨基载体类合成载体、环氧基载体类合成载体和介孔材料中的一种或多种；所述的固定化反应操作条件为搅拌或振荡；所述的分离为过滤。
8.如权利要求5所述的固定化方法，其特征在于：所述的木瓜蛋白酶固定化的方法为交联酶聚集体制备法时，所述的木瓜蛋白酶固定化包括如下步骤：向聚乙二醇相中加入有机溶剂沉淀剂，木瓜蛋白酶沉淀聚集，之后再加入交联剂溶液均匀混合，交联即可。
9.如权利要求8所述的固定化方法，其特征在于：所述的有机溶剂沉淀剂为丙酮、乙腈、二氧六环、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、异丁醇、叔丁醇、戊醇和己醇中的一种或多种；所述的有机溶剂沉淀剂的用量为有机溶剂沉淀剂与聚乙二醇相体积比为1∶1～5∶1；所述的交联剂为戊二醛或碳化二亚胺；所述的交联剂的用量为交联剂最终浓度为质量百分比0.5％～1.5％；所述的交联的反应时间为1～10小时，较佳的为2小时。
10.一种如权利要求5～9任一项所述的固定化方法获得的固定化木瓜蛋白酶。
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