CN112813057A - 一种木瓜酶制剂的高效制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种木瓜酶制剂的高效制备方法，其包括以下具体操作步骤：S1、木瓜酶制剂粗品的制备；S2、木瓜蛋白酶粗酶制品溶液和木瓜脂肪酶粗酶制品的制备；S3、木瓜脂肪酶制剂的制备；S4、木瓜蛋白酶的分离纯化。本发明实施例所述木瓜酶制剂的高效制备方法，其能够同时自木瓜原浆中分离纯化得到木瓜蛋白酶和木瓜脂肪酶，实现了资源的完整利用，制备步骤精简且设计合理，操作简单，制备过程中对酶的活性影响较小，制取得到的木瓜蛋白酶和木瓜脂肪酶纯度高、活性高且酶活性回收率高，且经强阳离子交换法分离后还能够对试剂进行回收，以便进行重复利用，有效降低成本，可扩大化制备，满足工业化需求。
Description
技术领域
本发明涉及生化分离技术领域，特别是涉及一种木瓜酶制剂的高效制备方法。
背景技术
木瓜乳中具有木瓜蛋白酶、木瓜肽酶B、木瓜凝乳蛋白酶A、木瓜凝乳蛋白酶B等丰富的酶类。
木瓜蛋白酶具有耐高温、稳定性好、水解能力强、对PH变化和金属离子及去垢剂不敏感等特征，能用于水解各类蛋白质，目前已广泛地应用于食品、化工、轻纺工业、医药卫生等各个领域，与此同时，对木瓜蛋白酶的各种研究也日益增多，而研究、探讨、寻求最佳提取工艺对木瓜蛋白酶的开发、制备和应用具有极其重要的意义。目前提取木瓜蛋白酶的传统方法有：超滤法、盐析法、有机溶剂法、絮凝法、亲和层析法等。
木瓜脂肪酶(Carica papaya lipase，CPL)是木瓜蛋白酶生产的副产物，CPL以固体形式存在降低了木瓜蛋白酶的纯度，但CPL在木瓜中含量丰富，番木瓜脂肪酶粗酶干重占木瓜汁质量的15％左右，且其酶活水平较高，同时具有优良的性质，如在有机溶剂中的热稳定性高，在饱和异辛院中60℃下仍具有90％的酶活，因此受到国内外学者的重视。但是现有技术中分离纯化番木瓜脂肪酶的操作较为复杂，较为常用的CPL的提取方法主要是通过缓冲液反复洗涤去除木瓜乳中的水溶性蛋白酶类，离心回收CPL，CPL的得率为木瓜乳重量的2.50％左右，脂肪酶酶活为350U/g左右。该方法虽然可以完全去除木瓜乳中的水溶性的酶类，但是需要耗费大量的水电，且处理量小，一般仅适用于实验室及样品试制，难以适应产业化制备的要求。同时，该方法将水溶性蛋白酶类有效成分作为废弃物，造成较大的资源浪费。
发明内容
基于此，本发明实施例的目的在于，提供一种木瓜酶制剂的高效制备方法，其具有操作简单、成本低且所提取的酶活性高的优点。
本发明实施例是通过以下技术方案获得上述目的的：
一种木瓜酶制剂的高效制备方法，其包括以下具体操作步骤：
S1、木瓜酶制剂粗品的制备
选取当天采集的新鲜木瓜制成木瓜浆，并在木瓜浆中加入固体亚硫酸钠，在室温下搅拌至完全溶解，调节pH至5.5-6.0，冷冻干燥后得到所述木瓜酶制剂粗品；
S2、木瓜蛋白酶粗酶制品溶液和木瓜脂肪酶粗酶制品的制备
将步骤S1制得的木瓜酶制剂粗品溶解于L-半胱氨酸溶液中，搅拌混合均匀；所得混合液离心处理后用定性分析滤纸过滤，所得滤液即为所述木瓜蛋白酶粗酶制品溶液，所得沉淀即为所述木瓜脂肪酶粗酶制品；
S3、木瓜脂肪酶制剂的制备
向步骤S2所得木瓜脂肪酶粗酶制品中加入pH＝5.5的磷酸缓冲液，搅拌均匀后离心处理，除去上清液，收集沉淀，重复上述操作若干次，所得沉淀冷冻干燥后得到的冻干粉即为所述木瓜脂肪酶制剂；
S4、木瓜蛋白酶的分离纯化
配置双水相体系，其中水相为质量百分浓度为12-24％的无机盐水溶液，有机相为质量百分浓度为12-24％的PEG无水乙醇溶液；向所述双水相体系中加入步骤S2所得的木瓜蛋白酶粗酶制品溶液，常温下超声震荡处理后静置分相；取分相后的PEG有机相通过强阳离子交换法得到木瓜蛋白酶的盐溶液，再经过透析法截取相对分子质量为3500的组分，得到木瓜蛋白酶水溶液，冷冻干燥后得到的冻干粉即为所述木瓜蛋白酶制剂。
本发明实施例所述木瓜酶制剂的高效制备方法，其能够同时自木瓜原浆中分离纯化得到木瓜蛋白酶和木瓜脂肪酶，实现了资源的完整利用，制备步骤精简且设计合理，操作简单，制备过程中对酶的活性影响较小，制取得到的木瓜蛋白酶和木瓜脂肪酶纯度高、活性高且酶活性回收率高，且经强阳离子交换法分离后还能够对试剂进行回收，以便进行重复利用，有效降低成本，可扩大化制备，满足工业化需求。
进一步地，步骤S1中所述固体亚硫酸钠的使用量占所述木瓜浆质量的0.1-1％。
进一步地，步骤S1中为使用2mol/L的柠檬酸调节pH。
进一步地，步骤S2中所述木瓜酶制剂粗品为在4℃下溶解于L-半胱氨酸溶液中。
进一步地，步骤S2中为使用自动搅拌器搅拌混合30-50min；所述离心处理的离心转速为8000-12000rpm，离心时间为10-20min。
进一步地，步骤S3中所述木瓜脂肪酶粗酶制品与所述磷酸缓冲液的料液比为1：5。
进一步地，步骤S3中所述木瓜脂肪酶粗酶制品与所述磷酸缓冲液混合后先在4℃下搅拌35-45min后再进行离心处理；所述离心处理的离心转速为8000-12000rpm，离心时间为10-15min。
进一步地，步骤S4中所述双水相体系与所述木瓜蛋白酶粗酶制品溶液总系统中各组分的质量百分比如下：无机盐水溶液20-35％、PEG无水乙醇溶液20-40％、木瓜蛋白酶粗酶制品溶液20-30％，余量为去离子水。
进一步地，步骤S4中所述PEG为PEG 2000、PEG 4000或PEG 6000；所述无机盐为硫酸钠、碳酸钠、磷酸钠、柠檬酸钠、硫酸铵、柠檬酸钾或磷酸二氢钠。
进一步地，步骤S4所述强阳离子交换法中所用填料为SP-琼脂糖凝胶FF，所用离子交换柱的平衡缓冲液为pH＝4.8的PBS缓冲液，所用洗脱缓冲液为pH＝4.8的PBS缓冲液和1-2mol/L的NaCl水溶液的混合。
具体实施方式
为了使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面通过本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于本发明在此描述的其他方式来实施，本领域技术人员可以在不为违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受以下公开的实施例的限制。
在本发明实施例中使用到的相关试剂如下表所示：
实施例1
本发明实施例1提供一种木瓜酶制剂的高效制备方法，其包括以下具体操作步骤：
S1、木瓜酶制剂粗品的制备
选取当天采集的新鲜木瓜制成木瓜浆，并在木瓜浆中加入固体亚硫酸钠，其使用量占木瓜浆质量的0.1％，使用自动搅拌器在室温下搅拌至完全溶解，用2mol/L的柠檬酸调节pH至5.5，所得溶液冷冻干燥后得到所述木瓜酶制剂粗品；
S2、木瓜蛋白酶粗酶制品溶液和木瓜脂肪酶粗酶制品的制备
将步骤S1制得的木瓜酶制剂粗品在4℃下溶解于L-半胱氨酸溶液中，其中每90g所述木瓜脂肪酶制品溶解于500mL的L-半胱氨酸溶液；使用自动搅拌器搅拌混合30min后对所得混合液进行离心处理，离心转速为8000rpm，离心时间20min；离心处理后用定性分析滤纸过滤，所得滤液即为所述木瓜蛋白酶粗酶制品溶液，所得沉淀即为所述木瓜脂肪酶粗酶制品；
S3、木瓜脂肪酶制剂的制备
向步骤S2所得木瓜脂肪酶粗酶制品中加入pH＝5.5的磷酸缓冲液，所述木瓜脂肪酶粗酶制品与所述磷酸缓冲液的料液比为1：5；在4℃下使用自动搅拌器搅拌35min后对所得混合液进行离心处理，离心转速为8000rpm，离心时间12min，除去上清液，收集沉淀，重复上述操作若干次，所得沉淀冷冻干燥后得到的冻干粉即为所述木瓜脂肪酶制剂；
S4、木瓜蛋白酶的分离纯化
配置双水相体系，其中水相为质量百分浓度为18％的无机盐水溶液，有机相为质量百分浓度为16％的PEG无水乙醇溶液，所述无机盐为硫酸钠，所述PEG为PEG2000；向所述双水相体系中加入步骤S2所得的木瓜蛋白酶粗酶制品溶液，总系统中各组分的质量百分比为：各组分的质量百分比如下：无机盐水溶液20％、PEG无水乙醇溶液40％、木瓜蛋白酶粗酶制品溶液30％，余量为去离子水；常温下超声震荡处理后静置分相；取分相后的PEG有机相通过强阳离子交换法得到木瓜蛋白酶的盐溶液，再经过透析法截取相对分子质量为3500的组分，得到木瓜蛋白酶水溶液，冷冻干燥后得到的冻干粉即为所述木瓜蛋白酶制剂。
其中所述强阳离子交换法中所用填料为SP-琼脂糖凝胶FF，所用离子交换柱的平衡缓冲液为pH＝4.8的PBS缓冲液，所用洗脱缓冲液为pH＝4.8的PBS缓冲液和1mol/L的NaCl水溶液按照体积比1：1混合。
实施例2
本发明实施例2提供一种木瓜酶制剂的高效制备方法，其包括以下具体操作步骤：
S1、木瓜酶制剂粗品的制备
选取当天采集的新鲜木瓜制成木瓜浆，并在木瓜浆中加入固体亚硫酸钠，其使用量占木瓜浆质量的1％，使用自动搅拌器在室温下搅拌至完全溶解，用2mol/L的柠檬酸调节pH至6.0，所得溶液冷冻干燥后得到所述木瓜酶制剂粗品；
S2、木瓜蛋白酶粗酶制品溶液和木瓜脂肪酶粗酶制品的制备
将步骤S1制得的木瓜酶制剂粗品在4℃下溶解于L-半胱氨酸溶液中，其中每90g所述木瓜脂肪酶制品溶解于500mL的L-半胱氨酸溶液；使用自动搅拌器搅拌混合50min后对所得混合液进行离心处理，离心转速为12000rpm，离心时间10min；离心处理后用定性分析滤纸过滤，所得滤液即为所述木瓜蛋白酶粗酶制品溶液，所得沉淀即为所述木瓜脂肪酶粗酶制品；
S3、木瓜脂肪酶制剂的制备
向步骤S2所得木瓜脂肪酶粗酶制品中加入pH＝5.5的磷酸缓冲液，所述木瓜脂肪酶粗酶制品与所述磷酸缓冲液的料液比为1：5；在4℃下使用自动搅拌器搅拌45min后对所得混合液进行离心处理，离心转速为12000rpm，离心时间10min，除去上清液，收集沉淀，重复上述操作若干次，所得沉淀冷冻干燥后得到的冻干粉即为所述木瓜脂肪酶制剂；
S4、木瓜蛋白酶的分离纯化
配置双水相体系，其中水相为质量百分浓度为12％的无机盐水溶液，有机相为质量百分浓度为12％的PEG无水乙醇溶液，所述无机盐为柠檬酸钠，所述PEG为PEG4000；向所述双水相体系中加入步骤S2所得的木瓜蛋白酶粗酶制品溶液，总系统中各组分的质量百分比为：各组分的质量百分比如下：无机盐水溶液35％、PEG无水乙醇溶液20％、木瓜蛋白酶粗酶制品溶液30％，余量为去离子水；常温下超声震荡处理后静置分相；取分相后的PEG有机相通过强阳离子交换法得到木瓜蛋白酶的盐溶液，再经过透析法截取相对分子质量为3500的组分，得到木瓜蛋白酶水溶液，冷冻干燥后得到的冻干粉即为所述木瓜蛋白酶制剂。
其中所述强阳离子交换法中所用填料为SP-琼脂糖凝胶FF，所用离子交换柱的平衡缓冲液为pH＝4.8的PBS缓冲液，所用洗脱缓冲液为pH＝4.8的PBS缓冲液和2mol/L的NaCl水溶液按照体积比2：1混合。
实施例3
本发明实施例3提供一种木瓜酶制剂的高效制备方法，其包括以下具体操作步骤：
S1、木瓜酶制剂粗品的制备
选取当天采集的新鲜木瓜制成木瓜浆，并在木瓜浆中加入固体亚硫酸钠，其使用量占木瓜浆质量的0.05％，使用自动搅拌器在室温下搅拌至完全溶解，用2mol/L的柠檬酸调节pH至6.0，所得溶液冷冻干燥后得到所述木瓜酶制剂粗品；
S2、木瓜蛋白酶粗酶制品溶液和木瓜脂肪酶粗酶制品的制备
将步骤S1制得的木瓜酶制剂粗品在4℃下溶解于L-半胱氨酸溶液中，其中每90g所述木瓜脂肪酶制品溶解于500mL的L-半胱氨酸溶液；使用自动搅拌器搅拌混合40min后对所得混合液进行离心处理，离心转速为10000rpm，离心时间10min；离心处理后用定性分析滤纸过滤，所得滤液即为所述木瓜蛋白酶粗酶制品溶液，所得沉淀即为所述木瓜脂肪酶粗酶制品；
S3、木瓜脂肪酶制剂的制备
向步骤S2所得木瓜脂肪酶粗酶制品中加入pH＝5.5的磷酸缓冲液，所述木瓜脂肪酶粗酶制品与所述磷酸缓冲液的料液比为1：5；在4℃下使用自动搅拌器搅拌40min后对所得混合液进行离心处理，离心转速为10000rpm，离心时间15min，除去上清液，收集沉淀，重复上述操作若干次，所得沉淀冷冻干燥后得到的冻干粉即为所述木瓜脂肪酶制剂；
S4、木瓜蛋白酶的分离纯化
配置双水相体系，其中水相为质量百分浓度为24％的无机盐水溶液，有机相为质量百分浓度为24％的PEG无水乙醇溶液，所述无机盐为磷酸二氢钠，所述PEG为PEG6000；向所述双水相体系中加入步骤S2所得的木瓜蛋白酶粗酶制品溶液，总系统中各组分的质量百分比为：各组分的质量百分比如下：无机盐水溶液35％、PEG无水乙醇溶液35％、木瓜蛋白酶粗酶制品溶液20％，余量为去离子水；常温下超声震荡处理后静置分相；取分相后的PEG有机相通过强阳离子交换法得到木瓜蛋白酶的盐溶液，再经过透析法截取相对分子质量为3500的组分，得到木瓜蛋白酶水溶液，冷冻干燥后得到的冻干粉即为所述木瓜蛋白酶制剂。
其中所述强阳离子交换法中所用填料为SP-琼脂糖凝胶FF，所用离子交换柱的平衡缓冲液为pH＝4.8的PBS缓冲液，所用洗脱缓冲液为pH＝4.8的PBS缓冲液和2mol/L的NaCl水溶液按照体积比1：1混合。
本发明实施例1-3所述木瓜酶制剂的高效制备方法，其能够同时自木瓜原浆中分离纯化得到木瓜蛋白酶和木瓜脂肪酶，实现了资源的完整利用，制备步骤精简且设计合理，操作简单，制备过程中对酶的活性影响较小，制取得到的木瓜蛋白酶和木瓜脂肪酶纯度高、活性高且酶活性回收率高，经检测所制得木瓜蛋白酶纯度高达96.3％，酶活性回收率达82.6％，木瓜脂肪酶活力340U/g，且经强阳离子交换法分离后还能够对试剂进行回收，以便进行重复利用，有效降低成本，可扩大化制备，满足工业化需求。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种木瓜酶制剂的高效制备方法，其特征在于，包括以下具体操作步骤：
S1、木瓜酶制剂粗品的制备
选取当天采集的新鲜木瓜制成木瓜浆，并在木瓜浆中加入固体亚硫酸钠，在室温下搅拌至完全溶解，调节pH至5.5-6.0，冷冻干燥后得到所述木瓜酶制剂粗品；
S2、木瓜蛋白酶粗酶制品溶液和木瓜脂肪酶粗酶制品的制备
将步骤S1制得的木瓜酶制剂粗品溶解于L-半胱氨酸溶液中，搅拌混合均匀，所得混合液离心处理后用定性分析滤纸过滤，所得滤液即为所述木瓜蛋白酶粗酶制品溶液，所得沉淀即为所述木瓜脂肪酶粗酶制品；
S3、木瓜脂肪酶制剂的制备
向步骤S2所得木瓜脂肪酶粗酶制品中加入pH＝5.5的磷酸缓冲液，搅拌均匀后离心处理，除去上清液，收集沉淀，重复上述操作若干次，所得沉淀冷冻干燥后得到的冻干粉即为所述木瓜脂肪酶制剂；
S4、木瓜蛋白酶的分离纯化
配置双水相体系，其中水相为质量百分浓度为12-24％的无机盐水溶液，有机相为质量百分浓度为12-24％的PEG无水乙醇溶液；向所述双水相体系中加入步骤S2所得的木瓜蛋白酶粗酶制品溶液，常温下超声震荡处理后静置分相；取分相后的PEG有机相通过强阳离子交换法得到木瓜蛋白酶的盐溶液，再经过透析法截取相对分子质量为3500的组分，得到木瓜蛋白酶水溶液，冷冻干燥后得到的冻干粉即为所述木瓜蛋白酶制剂。
2.根据权利要求1所述木瓜酶制剂的高效制备方法，其特征在于：步骤S1中所述固体亚硫酸钠的使用量占所述木瓜浆质量的0.1-1％。
3.根据权利要求1所述木瓜酶制剂的高效制备方法，其特征在于：步骤S1中为使用2mol/L的柠檬酸调节pH。
4.根据权利要求1所述木瓜酶制剂的高效制备方法，其特征在于：步骤S2中所述木瓜酶制剂粗品为在4℃下溶解于L-半胱氨酸溶液中。
5.根据权利要求1所述木瓜酶制剂的高效制备方法，其特征在于：步骤S2中为使用自动搅拌器搅拌混合30-50min；所述离心处理的离心转速为8000-12000rpm，离心时间为10-20min。
6.根据权利要求1所述木瓜酶制剂的高效制备方法，其特征在于：步骤S3中所述木瓜脂肪酶粗酶制品与所述磷酸缓冲液的料液比为1：5。
7.根据权利要求1所述木瓜酶制剂的高效制备方法，其特征在于：步骤S3中所述木瓜脂肪酶粗酶制品与所述磷酸缓冲液混合后先在4℃下搅拌35-45min后再进行离心处理；所述离心处理的离心转速为8000-12000rpm，离心时间为10-15min。
8.根据权利要求1所述木瓜酶制剂的高效制备方法，其特征在于：步骤S4中所述双水相体系与所述木瓜蛋白酶粗酶制品溶液总系统中各组分的质量百分比如下：无机盐水溶液20-35％、PEG无水乙醇溶液20-40％、木瓜蛋白酶粗酶制品溶液20-30％，余量为去离子水。
9.根据权利要求1所述木瓜酶制剂的高效制备方法，其特征在于：步骤S4中所述PEG为PEG 2000、PEG 4000或PEG 6000；所述无机盐为硫酸钠、碳酸钠、磷酸钠、柠檬酸钠、硫酸铵、柠檬酸钾或磷酸二氢钠。
10.根据权利要求1所述木瓜酶制剂的高效制备方法，其特征在于：步骤S4所述强阳离子交换法中所用填料为SP-琼脂糖凝胶FF，所用离子交换柱的平衡缓冲液为pH＝4.8的PBS缓冲液，所用洗脱缓冲液为pH＝4.8的PBS缓冲液和1-2mol/L的NaCl水溶液的混合。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| EP0065395A2 (en) * | 1981-05-13 | 1982-11-24 | BOOTS-FLINT, INC. (a Delaware corp.) | Improved chymopapain and method for its production and use |
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