CN101215553B - 一种阿魏酸酯酶的提取方法 - Google Patents
一种阿魏酸酯酶的提取方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101215553B CN101215553B CN2008100564776A CN200810056477A CN101215553B CN 101215553 B CN101215553 B CN 101215553B CN 2008100564776 A CN2008100564776 A CN 2008100564776A CN 200810056477 A CN200810056477 A CN 200810056477A CN 101215553 B CN101215553 B CN 101215553B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- 100kda
- esterase
- feruloyl esterase
- sodium phosphate
- chromatography
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Abstract
本发明涉及一种从瘤胃液或产阿魏酸酯酶菌培养液中提取阿魏酸酯酶的方法，该方法包括以下步骤：1)过滤离心；2)超滤浓缩；3)加热；4)离子交换层析；5)疏水层析；6)分子筛层析。本发明根据不同种类阿魏酸酯酶的不同理化性质，通过各种分离纯化步骤的有机结合，从成分较为复杂、阿魏酸酯酶种类较多的培养液或瘤胃液中提取各种具有阿魏酸酯酶活性的蛋白质，获得了高活性酯酶。利用本发明的方法，可提取得到多种阿魏酸酯酶，从而达到了较好的生产效果，在饲料工业中具有较高的实际应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种阿魏酸酯酶的提取方法，具体的说，是一种从瘤胃液或产阿魏酸酯酶菌培养液中提取阿魏酸酯酶的方法。
背景技术
阿魏酸酯酶(E.C.3.1.1.73，也被称为肉桂酸酯酶，肉桂酸水解酶)是水解植物细胞壁中羟基肉桂酸和糖之间酯键的一类酶，其催化的主要反应为：多糖-阿魏酸酯+H2O→阿魏酸+多糖(包括阿魏酸的一些衍生物)。
近年来，阿魏酸酯酶在饲料消化中的作用日益引起人们的关注。秸秆和饲草干物质中约30％～80％为细胞壁成分，然而，反刍动物对这些细胞壁的消化利用率不超过50％。因此，细胞壁成为反刍动物消化秸秆和饲草的瓶颈因素。阿魏酸酯酶可以打开饲料细胞壁木质素中阿魏酸、对香豆酸及二聚阿魏酸等分子与半纤维素支链形成的致密网状交联结构，从空间上增加瘤胃微生物对细胞壁中纤维素和半纤维素的有效降解，因此阿魏酸酯酶已被推测为消除细胞壁降解限制因子的关键酶之一。
人们发现不仅微生物可以向胞外分泌阿魏酸酯酶，哺乳动物和植物细胞也可产生阿魏酸酯酶。在此基础上，人们对这些酯酶的纯化和酶学特性进行了一定的研究，获得了相应的基因、蛋白质序列和三维结构。目前，对阿魏酸酯酶的纯化研究多集中于从单菌培养液中提取，分离提取处理过程与其它酶制剂相似，即通过离心除去菌体，然后对上清液进行超滤、硫酸铵沉淀及各种层析等处理，得到阿魏酸酯酶。单菌培养液中组分比较单一，阿魏酸酯酶的种类较少，提取过程较为简单。但对于成分较为复杂、阿魏酸酯酶种类较多的培养液或瘤胃液，则需要更为全面有效的分离步骤。
发明内容
本发明的目的是提供一种可从瘤胃液或阿魏酸酯酶菌培养液中分离纯化阿魏酸酯酶的方法，该方法可以全面有效地从成分较为复杂、阿魏酸酯酶种类较多的培养液或瘤胃液中分离出各种阿魏酸酯酶。
本发明通过各种分离纯化步骤地有机结合，从瘤胃液或培养液中分离阿魏酸酯酶。具体的说，瘤胃液或阿魏酸酯酶菌培养液经过滤离心、超滤浓缩、加热、离子交换层析、疏水层析及分子筛层析得到阿魏酸酯酶。
本发明所提供的方法，其具体操作步骤如下：
1)过滤离心：将新鲜的瘤胃液或培养液样品经四层医用纱布过滤，滤液经20,000×g 4℃离心30分钟，去除菌体沉淀，收集上清液备用。
2)超滤浓缩：取上清液通过超滤膜进行超滤浓缩。首先通过截留分子量为100KDa的超滤膜超滤，收集＜100KDa的部分过10KDa的超滤膜超滤，弃去＜10KDa的部分，10-100KDa和＞100KDa部分浓缩10倍，制得较高纯度的酶液，用冰块控制该酶液温度在4-10℃之间，酶回收率可高达55％。
3)加热：根据不同阿魏酸酯酶的热稳定性不同，将超滤得到分子量在10-100KDa之间的浓缩液在50-70℃加热20-40分钟，10,000×g 4℃离心10分钟，去除沉淀的变性蛋白。
4)离子交换层析：将分子量＞100KDa的浓缩液和分子量在10-100KDa之间的去除变性蛋白的浓缩液透析，浓缩，加入适量200mM磷酸钠缓冲液(pH7)和适量去离子水，混匀，用强阴离子交换层析柱Q Sepharose Fast Flow column进行分离，其上柱速度为0.5mL/min-5mL/min，优选为2mL/min。未结合的物质用50mM磷酸钠缓冲液(pH7)洗提，结合的蛋白质用梯度NaCl(0-1M)的50mM磷酸钠缓冲液(pH7)溶液洗提，收集有阿魏酸酯酶活性的部分，透析，浓缩，溶于适量1M(NH4)2SO450mM的磷酸钠缓冲液(pH7)。
5)疏水层析：将离子交换层析后制得的酶液先经0.45μm滤膜过滤，取适量用强疏水性预装柱HiTrap Phenyl FF column分离，其上柱速度为0.5mL/min-4mL/min，优选为0.5mL/min。未结合的部分用含1M(NH4)2SO450mM的磷酸钠缓冲液(pH7)洗脱。结合的部分用下降的梯度(NH4)2SO4(1-0M)的50mM磷酸钠缓冲液(pH7)溶液洗脱。收集有活性的部分，透析，浓缩，溶于适量50mM的磷酸钠缓冲液(pH7)。
6)分子筛层析：将疏水层析后制得的酶液经凝胶过滤柱SephacrylS-200HR 16/60column层析，用50mM磷酸钠缓冲液(pH7)等度洗脱，速度为0.5mL/min-1mL/min，优选为0.7mL/min。收集有活性的部分，浓缩，制得高纯度的阿魏酸酯酶。
本发明所提供的方法中，加热过程是否进行，可根据样品中阿魏酸酯酶的热稳定性来决定，加热温度及时间优选为60℃、30分钟。
本发明所提供的方法中，可根据蛋白质的纯化情况，选择性地进行疏水层析或分子筛层析分离过程。
本发明所提供的方法中，离子交换层析和疏水层析的梯度洗脱过程可根据阿魏酸酯酶的出峰时间进行调整。
本发明所提供的方法，可以从成分较为复杂、阿魏酸酯酶种类较多的培养液或瘤胃液中提取各种具有阿魏酸酯酶活性的蛋白质，有利于了解复杂体系中阿魏酸酯酶的概况，获得高活性酯酶。本发明在饲料工业中具有较高的实际应用价值。
附图说明
图1为利用本发明的方法在从肉牛瘤胃液中提取阿魏酸酯酶的过程中，分子量大于100KDa的样品经过离子交换层析后的分离图谱。
图2为图1中阿魏酸酯酶II峰经透析浓缩后进行疏水层析的分离图谱。
图3为利用本发明的方法在从肉牛瘤胃液中提取阿魏酸酯酶的过程中，分子量为10-100KDa的样品经过离子交换层析后的分离图谱。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1肉牛瘤胃液的处理
于清晨牛空腹时，通过牛的瘤胃瘘管从瘤胃中抽取瘤胃液1200mL，经四层医用纱布过滤，滤液经20,000×g 4℃离心30分钟，去除菌体沉淀，收集1000mL上清液以备超滤等下道工序。
取上清液首先通过截留分子量为100KDa的超滤膜超滤，收集＜100KDa的部分过10KDa的超滤膜超滤，弃去＜10KDa的部分，10-100KDa和＞100KDa部分浓缩10倍，制得较高纯度的酶液，用冰块控制该酶液温度在5℃，酶回收率可高达55％。
然后将超滤得到的分子量在10-100KDa之间的100mL浓缩液样品在60℃加热30分钟，10,000×g 4℃离心10分钟，去除沉淀的变性蛋白。
实施例2浓缩液样品的处理
将分子量＞100KDa的浓缩液和分子量在10-100KDa之间的去除变性蛋白的浓缩液100mL透析，浓缩，加入等体积200mM磷酸钠缓冲液(pH7)和2倍体积去离子水，混匀。取0.8mL分子量＞100KDa的样品用强阴离子交换层析柱Q Sepharose Fast Flow column进行分离，速度为2mL/min，以50mM磷酸钠缓冲液(pH7)为A液，含1M NaCl的50mM磷酸钠缓冲液(pH7)为B液。未结合的物质用30mLA液洗脱，结合的蛋白质用一个五步梯度：30mL 10％B液，30mL 25％B液，30mL50％B液，30mL 75％B液，100mL B液洗提结合蛋白质，收集有阿魏酸酯酶活性的部分，透析，浓缩，溶于3mL1M(NH4)2SO450mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)。
取4mL分子量为10-100KDa的样品用强阴离子交换层析柱QSepharose Fast Flow column进行分离，速度为4mL/min，以50mM磷酸钠缓冲液(pH7)为A液，含1M NaCl的50mM磷酸钠缓冲液(pH7)为B液。未结合的物质用30mlA液洗脱，结合的蛋白质按以下程序进行洗脱：10mL 0-25％B液，30mL 25％B液，10mL 25-50％B液，30mL50％B液，100mL B液，收集有阿魏酸酯酶活性的部分，透析，浓缩，溶于2mL 1M(NH4)2SO450mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)。
将离子交换层析后制得的分子量＞100KDa的酶液先经0.45μm滤膜过滤，取2mL用疏水柱HiTrap Phenyl FF column分离，其上柱速度为0.5mL/min，洗脱速度为1mL/min，以50mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)为A液，含1M(NH4)2SO4的50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)为B液。未结合的部分用24mLB液洗脱。结合的部分用一个四步梯度：20mL50％B液，20mL 10％B液，20mL A液，20mL去离子水洗提结合蛋白质。收集有活性的部分，透析，浓缩，溶于1mL 50mM的磷酸钠(pH7.0)缓冲液。
瘤胃液中阿魏酸酯酶初步提取中的总蛋白质、总活性、比活以及纯化倍数和具体的产率见下表1
表1
| 纯化步骤 | 总蛋白质(mg) | 总活性(U) | 比活(U/g蛋白质) | 纯化倍数 | 产率(％) |
| 粗提(20000×g离心)10-100KDa60℃加热30分钟＞100KDa | 398.5134.7531.54145.1 | 1.660.310.250.98 | 4.189.037.956.76 | 12.161.91.62 | 10018.8615.0658.99 |
Claims (8)
1.一种提取阿魏酸酯酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)过滤离心：将新鲜的瘤胃液或阿魏酸酯酶菌培养液经四层医用纱布过滤，滤液经20,000×g 4℃离心30分钟，去除菌体沉淀，收集上清液；
2)超滤浓缩：取上清液，通过截留分子量为100KDa的超滤膜超滤，收集＜100KDa的部分过10KDa的超滤膜超滤，弃去＜10KDa的部分，分别将10-100KDa和＞100KDa的部分浓缩10倍，制得较高纯度的酶液，用冰块控制该酶液温度在4-10℃之间；
3)加热：根据不同阿魏酸酯酶的热稳定性不同，将超滤得到分子量在10-100KDa之间的浓缩液在50-70℃加热20-40分钟，10,000×g 4℃离心10分钟，去除沉淀的变性蛋白；
4)离子交换层析：对分子量＞100KDa的浓缩液和分子量在10-100KDa之间的去除变性蛋白的浓缩液进行透析，浓缩，过离子交换柱，未结合的部分用50mM pH 7磷酸钠缓冲液洗提，结合的蛋白质用梯度0-1M NaCl的50mM pH 7磷酸钠缓冲液洗提，收集有阿魏酸酯酶活性的部分，透析，浓缩，溶于适量1M(NH4)2SO4的50mM pH 7磷酸钠缓冲液；
5)疏水层析：将离子交换层析后制得的酶液经疏水层析柱分离，未结合的部分用1M(NH4)2SO4的50mM pH 7磷酸钠缓冲液洗脱，结合的部分用梯度1-0M(NH4)2SO4的50mM pH 7磷酸钠缓冲液洗脱，收集有阿魏酸酯酶活性的部分，透析，浓缩，溶于适量50mM pH 7磷酸钠缓冲液；
6)分子筛层析：将疏水层析后制得的酶液经分子筛层析柱分离，用50mM pH 7磷酸钠缓冲液等度洗脱，收集有阿魏酸酯酶活性的部分，浓缩，制得高纯度的阿魏酸酯酶。
2.如权利要求1所述的提取阿魏酸酯酶的方法，其特征在于，步骤3)中所述加热的条件为在60℃下加热30分钟。
3.如权利要求2所述的提取阿魏酸酯酶的方法，其特征在于，步骤4)中所使用的离子交换层析柱为强阴离子交换层析柱QSepharose Fast Flow column，上柱速度为0.5mL/min-5mL/min。
4.如权利要求3所述的提取阿魏酸酯酶的方法，其特征在于，上柱速度为2mL/min。
5.如权利要求3所述的提取阿魏酸酯酶的方法，其特征在于，步骤5)中所使用的疏水层析柱为强疏水性预装柱HiTrap Phenyl FFcolumn，上柱速度为0.5mL/min-4mL/min。
6.如权利要求5所述的提取阿魏酸酯酶的方法，其特征在于，上柱速度为0.5mL/min。
7.如权利要求3或5所述的提取阿魏酸酯酶的方法，其特征在于，步骤6)中所使用的分子筛层析柱为凝胶过滤柱SephacrylS-200HR 16/60 column，上柱速度为0.5mL/min-1mL/min。
8.如权利要求7所述的提取阿魏酸酯酶的方法，其特征在于，上柱速度为0.7mL/min。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2008100564776A CN101215553B (zh) | 2008-01-18 | 2008-01-18 | 一种阿魏酸酯酶的提取方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2008100564776A CN101215553B (zh) | 2008-01-18 | 2008-01-18 | 一种阿魏酸酯酶的提取方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101215553A CN101215553A (zh) | 2008-07-09 |
| CN101215553B true CN101215553B (zh) | 2010-07-28 |
Family
ID=39622062
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2008100564776A Expired - Fee Related CN101215553B (zh) | 2008-01-18 | 2008-01-18 | 一种阿魏酸酯酶的提取方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101215553B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8586339B2 (en) * | 2010-03-26 | 2013-11-19 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Facilitated process for purification of proteins |
| CN102286442B (zh) * | 2011-09-02 | 2012-08-29 | 浙江大学 | 一种烟曲霉发酵生产阿魏酸酯酶的方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006026763A1 (en) * | 2004-09-01 | 2006-03-09 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Ferulate esterase producing strains and methods of using same |
-
2008
- 2008-01-18 CN CN2008100564776A patent/CN101215553B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006026763A1 (en) * | 2004-09-01 | 2006-03-09 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Ferulate esterase producing strains and methods of using same |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| E. Topakas et al..Purification and characterization of a feruloyl esterase fromFusarium oxysporum catalyzing esterification of phenolic acidsin ternary water /organic solvent mixtures.Journal of Biotechnology102.2003,10233-44. * |
| Evangelos Topakas et al..Purification and characterization of a Fusarium oxysporumferuloyl esterase (FoFAE-I) catalysing transesterification ofphenolic acid esters.Enzyme and Microbial Technology33.2003,33729-737. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101215553A (zh) | 2008-07-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102286590B (zh) | 一种海蜇降压肽的制备方法 | |
| CN101182495B (zh) | 以猪小肠为原料联产生产碱性磷酸酶和肝素钠的联产工艺 | |
| CN102775466A (zh) | 富硒酵母中含硒蛋白的制备方法 | |
| CN104069151B (zh) | 一种罗汉果甙ⅳ含量高的提取物制备方法 | |
| CN106146652A (zh) | 一种发菜中藻蓝蛋白的提取纯化方法 | |
| CN109468357A (zh) | 一种脾氨肽的制备方法 | |
| CN107722132B (zh) | 一种从海藻中联产海藻多糖和海藻蛋白的方法 | |
| CN101215553B (zh) | 一种阿魏酸酯酶的提取方法 | |
| CN102942628A (zh) | 一种从猪血中提取生物活性物质的联产方法 | |
| CN102676475A (zh) | 一种从鸡蛋蛋清中提取溶菌酶的方法 | |
| CN101845089B (zh) | 一种适合规模化生产眼镜蛇蛇毒神经毒素并降低神经毒性的方法 | |
| CN101348779B (zh) | 从猪胰脏中提取纯化弹性蛋白酶的方法 | |
| CN104774827A (zh) | 一种以鲍鱼内脏为原料制备褐藻胶裂解酶的方法 | |
| CN102775511B (zh) | 一种从辣椒渣中提取辣椒多糖的方法 | |
| CN104327175B (zh) | 一种分离抗菌肽的方法 | |
| CN100497366C (zh) | 从枣中提取环磷酸腺苷（cAMP）工艺 | |
| CN102746413B (zh) | 蜂花粉多糖酶解破壁结合热水超声浸提方法 | |
| CN108191991A (zh) | 一种杏鲍菇多糖的提纯方法 | |
| CN1250567C (zh) | 钙离子结合蛋白的提纯方法 | |
| CN101200491B (zh) | 蛹虫草子实体水溶性肽多糖的快速分离纯化方法 | |
| CN101063118B (zh) | 纯化l-门冬酰胺酶的方法 | |
| CN106146608A (zh) | 一种蜜蜂抗菌肽的提取制备方法 | |
| CN109370996A (zh) | 一种过氧化氢酶纯净化提纯方法 | |
| RU2584601C1 (ru) | Способ выделения протеолитического фермента террилитина | |
| CN114990183B (zh) | 一种基于大米蛹虫草子实体制备虫草素和降血压肽的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20100728 Termination date: 20130118 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |