CN104327175B - 一种分离抗菌肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种分离抗菌肽的方法：以家蝇蛹粗提液为原料，向家蝇蛹粗提液中加入硅藻土接枝的单宁，添加比例为，每10mL家蝇蛹粗提液中加入0.8～1.2g硅藻土接枝的单宁，充分搅拌成悬浮液，并保持1～2h，然后高速离心，取沉淀物加入体积百分含量50～80％丙酮水溶液中，在25～50℃温度下浸提1～2h，然后高速离心，取上清液，采用真空冷冻干燥法除去水分和丙酮，制得抗菌肽。本发明采用硅藻土接枝单宁共沉淀法来分离抗菌肽，抗菌肽得率在0.73～1.5％之间，硅藻土接枝单宁可以重复使用，降低了生产成本，利于工业放大，所分离抗菌肽活力高，抗菌活力可达80％以上，高达90.2％。

Description

一种分离抗菌肽的方法

(一)技术领域

本发明涉及一种分离抗菌肽的方法，具体涉及从家蝇蛹粗提液中分离出抗菌肽，属于生物化工领域。

(二)背景技术

抗菌肽是一类由生物体产生的具有抗菌活性的碱性多肽，由20～60个氨基酸残基组成。这类活性多肽多数具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌等特点，被称为“第二防御体系”。瑞典科学家G.Boman等人在研究北美天蚕的免疫机制时，发现其滞育蛹经注射阴沟通杆菌及大肠杆菌等外界刺激诱导后，其血淋巴中产生了具有抑菌活性作用的多肽物质，由此分离获得世界上第一个抗菌多肽—天蚕素(Cecropins)。此后，人们从其他昆虫以及两栖类动物、哺乳动物中也分离到结构相似的抗菌多肽，已有几十种抗菌多肽的结构被测定，对其作用机理进行了大量研究。一般认为抗菌肽作用过程如下：抗菌肽作用于细胞膜，在膜上形成跨膜的离子通道，破坏了细胞膜的完整性，引起细胞膜通透性改变，造成细胞内小分子物质泄漏，破坏了细胞正常渗透压平衡，从而杀死细胞。

抗菌肽属于生物体非专一性免疫应答的产物，能够抑杀多种细菌、真菌，能够加速免疫过程，并且对正常细胞无损伤。人们利用抗菌肽的特性，将其应用于不同领域。抗菌肽在日化用品中起到杀菌消炎作用；在植物病虫害防治方面，以其对真菌的强大杀伤作用而得以应用；利用其稳定性可以作为绿色饲料的添加剂；在医药方面，由于其抗菌活性高和不宜引起抗药性，已经成为了人们对抗病原细菌和真菌感染的药物之一；抗菌肽还在生物农药方面有所应用，成为对环境无污染的友好产品。随着人们对抗菌肽研究的深入，其应用必将愈加广泛。

专利CN201110392455.9公开了一种分离天蚕素抗菌肽的方法，将含有天蚕素抗菌肽的发酵液经微滤膜过滤，收集微滤透过物；对微滤透过物进行超滤膜过滤，收集超滤透过物；对透过物进一步纳滤膜过滤，收集纳滤截留物，即得到天蚕素抗菌肽。此发明采用膜过滤的方法实现了对抗菌肽的浓缩分离，具有能耗低，收率高的特点，但所获得纳滤截留物浓度较低，产品纯度有待进一步提高。专利CN201110345856.9公开了一种从诸葛菜中提取抗菌肽的方法，将诸葛菜研磨成浆，加入可溶蛋白提取缓冲液，处理后获得上清液，加入(NH₄)₂SO₄溶液除去杂蛋白等物质，然后采用离子交换层析、透析等操作获得抗菌肽浓缩液，之后过分子筛获得活性诸葛菜抗菌肽。此法以诸葛菜为原材料，降低了成本，利用离子交换层析、透析等操作浓缩抗菌肽，提高了提取效率，但离子交换层析在工业化生产中不宜大规模应用。专利CN200710176477.5公开了一种提取猪血抗菌肽的方法，将猪血溶于缓冲液中，利用木瓜蛋白酶进行酶解，使用氯仿和亚硫酸氢钠对酶解液脱色，获得猪血抗菌肽的粗提物。精制过程如下：将粗提物过凝胶型阳离子交换柱，对离子交换柱进行洗脱，收集洗脱液，进行真空冷冻干燥。此方法操作简单，成本较低，操作条件温和，反应条件易于控制，适于少量抗菌肽的提取，并且还需要对酶解产物进一步的确定。专利CN200810218932.8公开了家蝇蛹天然抗菌肽制品及其制备方法和应用，此专利以家蝇蛹为原材料，经过酸过夜和热处理后得到上清液；上清液经分子筛过滤和超滤处理，然后进行喷雾干燥后得到抗菌肽制品。以此发明来制备抗菌肽及其制品，具有工艺简便快速的特点，适于对于抗菌肽产品质量要求低的制品。专利CN200710200375.2公开了一种家蝇分泌型抗菌肽的分离方法及其产品和应用，将抗菌肽粗提液进行透析，透析内液经固相萃取，洗脱组分经超滤分离，活性组分用反相高效液相色谱纯化，即得家蝇分泌型抗菌肽。此发明提供了一条高效、抗菌活性稳定性较好的抗菌肽提取路线，提高了分离纯化的效率。但采用反相高效液相色谱纯化不适于工业规模化生产。

随着人们对抗菌肽需求量的不断增加，对其纯度和抗菌活性的要求也在不断提高。其来源主要有三个方面：天然提取、化学合成、基因工程。由于抗菌肽分子量小，天然抗菌肽含量较少，分离纯化困难，提取产率低，在生产实践中面临许多困难。化学合成可以避免分离纯化问题，但是化学合成成本较高。利用基因工程方法，可以降低合成抗菌肽的成本，但基因工程同样遇到一些瓶颈，例如依然存在表达产物少等问题。

为此我们提出一种分离抗菌肽的方法：单宁接枝硅藻土选择性共沉淀法。

单宁酸又名单宁、鞣质，是一类具有一定聚合度的多元酚类化合物，其传统定义指分子量500～3000。单宁在制革、医药、食品、分离纯化等方面有着广泛的应用，尤其在分离纯化方面是一个比较新的方向。本发明基于单宁—蛋白质间的结合反应是由两者间多点疏水键和氢键共同作用的结果。E.Haslam.Tannins在polyphenols and MolecularComplexation文章中指出疏水作用是单宁—蛋白质反应的驱动力，单宁的酚羟基与蛋白质的极性基(主要是肽基,此外还有胍基、羟基、羰基等)发生两点氢键结合,酚羟基作为氢键的同时，使单宁—蛋白质反应进一步加强,此后单宁以多点结合的方式在蛋白质分子间形成疏水层,使蛋白质分子聚集导致沉淀。高聚合度鞣质分子能使蛋白质变性而沉淀，低聚合度鞣酸分子与蛋白质作用较弱，不会使蛋白质沉淀。聚合度过高会使蛋白质变性，因此在利用其分离蛋白质时，需要对其酚羟基进行适当的修饰。本发明就是采用硅藻土对其活性进行修饰，硅藻土表面具有大量的羟基，可以用来接枝单宁，采用硅藻土接枝单宁来沉淀抗菌肽。单宁与蛋白质之间通过非共价键结合在一起，作用力较弱，在加入丙酮溶液后，不仅断裂了单宁与蛋白质之间的作用，还会竞争性地与单宁形成氢键，将抗菌肽解离出来。从而实现了对抗菌肽的分离。本发明利用硅藻土接枝单宁共沉淀法来分离抗菌肽，通过此方法可以获得高抗菌活力的抗菌肽，分离效率高，降低了生产成本，适合工业化放大，对蛋白质的分离具有一定的意义。

(三)发明内容

本发明是针对现有抗菌肽分离的现状，在综合分析各种分离方法优缺点之后，提供了一种分离抗菌肽的方法：硅藻土接枝单宁共沉淀法。该方法工艺简单，成本低，所提取抗菌肽抗菌活力高。

为解决本发明技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种分离抗菌肽的方法，所述方法以家蝇蛹粗提液为原料，向家蝇蛹粗提液中加入硅藻土接枝的单宁，添加比例为，每10mL家蝇蛹粗提液中加入0.8～1.2g硅藻土接枝的单宁，充分搅拌成悬浮液，并保持1～2h，然后高速离心，取沉淀物加入体积百分含量50～80％丙酮水溶液中，在25～50℃温度下浸提1～2h，然后高速离心，取上清液，采用真空冷冻干燥法除去水分和丙酮，制得抗菌肽。

所述方法中，每10mL家蝇蛹粗提液中加入0.8～1.2g硅藻土接枝的单宁，优选每10mL家蝇蛹粗提液中加入0.8～1.0g硅藻土接枝的单宁，更优选每10mL家蝇蛹粗提液中加入0.8～0.9g硅藻土接枝的单宁，最优选每10mL家蝇蛹粗提液中加入0.9g硅藻土接枝的单宁。

所述沉淀物优选加入体积百分含量70％丙酮水溶液中。

浸提时的温度优选40℃。

所述体积百分含量50～80％丙酮水溶液的体积用量优选为家蝇蛹粗提液体积的0.5～2倍，更优选为0.8～1.2倍。

所述方法中，接枝剂为二氯二甲基硅烷，溶剂为吡啶。

所述家蝇蛹粗提液可按以下方法制得：

称取家蝇蛹，用蒸馏水清洗干净，加入pH5.8、50mmol/L磷酸盐缓冲液，匀浆处理后，高速离心，取上清液，上清液中加入(NH₄)₂SO₄，高速离心，弃沉淀，收取上清液，即为家蝇蛹粗提液；

所述家蝇蛹、磷酸盐缓冲液、(NH₄)₂SO₄的质量比为1：2～3：0.5～1，优选为1：2.2：0.65。

本发明所述硅藻土接枝的单宁按以下方法制得：二甲基二氯硅烷加入无水吡啶中，搅拌均匀配成混合液，所述二甲基二氯硅烷、无水吡啶的体积比为1：15～16，然后将过100目筛的硅藻土粉末加入上述混合液中，20～30℃下(优选30℃下)搅拌反应2～3小时，再于搅拌下缓慢加入单宁，加完后搅拌反应1～2小时，再静置0.5～1小时，离心，取沉淀洗涤、干燥，制得硅藻土接枝的单宁；

所述单宁、硅藻土粉末的质量比为1:1.5～3，优选1：2.5，所述二甲基二氯硅烷、硅藻土粉末的质量比为1:1.25～2，优选1：2。

所述硅藻土粉末的比表面积一般为30～65m²/g，优选为65m²/g；。

所述单宁的分子量优选为1500～1750。可直接从市场上购买分子量1500～1750的单宁，或者也可以自行提取制备1500～1750分子量的单宁。

本发明实施例中所用的单宁按照专利CN201110187501.1制备获得，制得的余甘子鞣质即为单宁。也可从其他原料中提取获得单宁。

所述方法中，接枝剂为二氯二甲基硅烷，溶剂为吡啶。

所述硅藻土与单宁进行接枝的反应式原理如附图1所示，硅藻土接枝的单宁与抗菌肽的吸附结合反应如附图2所示。

进一步，本发明所述分离抗菌肽的方法优选按以下步骤进行：

(1)称取家蝇蛹，用蒸馏水清洗干净，加入pH5.8、50mmol/L磷酸盐缓冲液，匀浆处理后，6000r/min离心25min，取上清液，上清液中加入(NH₄)₂SO₄，8000r/min离心20min，弃沉淀，收取上清液，即为家蝇蛹粗提液；所述家蝇蛹、磷酸盐缓冲液、(NH₄)₂SO₄的质量比为1：2.2：0.65；

(2)二甲基二氯硅烷加入无水吡啶中，搅拌均匀配成混合液，所述二甲基二氯硅烷、无水吡啶的体积比为1：16，然后将过100目筛的硅藻土粉末加入上述混合液中，30℃下搅拌反应2小时，再于搅拌下缓慢加入分子量1500～1750单宁，加完后搅拌反应1h，静置30min后，5000r/min离心5min，取沉淀，用蒸馏水洗涤，40℃干燥，制得硅藻土接枝的单宁；

所述单宁、硅藻土粉末的质量比为1：2.5，所述二甲基二氯硅烷、硅藻土粉末的质量比为1：2；

(3)向家蝇蛹粗提液中加入硅藻土接枝的单宁，添加比例为，每10mL家蝇蛹粗提液中加入0.9g硅藻土接枝的单宁，充分搅拌成悬浮液，并保持1h，然后5000r/min转速下离心10min，取沉淀物加入体积百分含量70％丙酮水溶液中，在40℃温度下浸提1h，然后6000r/min离心20min，取上清液，采用真空冷冻干燥法除去水分和丙酮，制得抗菌肽。

与现有技术相比，本方法基于单宁与蛋白质结合的特性，利用硅藻土接枝单宁来吸附抗菌肽，离心后共沉淀，采用丙酮溶液解离抗菌肽，离心除去硅藻土接枝单宁。最后采用真空冷冻干燥技术获得高活性的抗菌肽。其优点主要在于：

a)制备硅藻土接枝单宁所需成本低，利于工业放大。

b)所分离抗菌肽抗菌活力高。抗菌肽得率高达1.5％，抗菌活力可达80％以上，高达90.2％。

C)硅藻土接枝单宁可以重复利用，节约成本。

(四)附图说明

图1硅藻土与单宁接枝的反应原理示意图。

图2硅藻土接枝的单宁与抗菌肽的吸附结合反应示意图。

(五)具体实施方式

下面以具体实施例来对本发明方案进行进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。

本发明实施例中的家蝇蛹粗提液按以下方法制得：

称取100.0g家蝇蛹，用蒸馏水清洗干净。加入220ml pH5.850mmol/L磷酸盐缓冲液，匀浆处理后，6000r/min离心25min，取上清液，向上清液中加入65.0g(NH₄)₂SO₄，再于8000r/min离心20min。弃沉淀，收取上清液。可获得200ml上清液，即为家蝇蛹粗提液。

硅藻土接枝的单宁按以下方法制得：

量取5.0ml二甲基二氯硅烷加入到80ml无水吡啶溶液中，磁力搅拌均匀得混合液，将CD02硅藻土(购于嵊州市华力硅藻土制品有限公司)过100目标准筛后，称取10.0g比表面积为65m²/g的硅藻土，缓慢加入到上述混合液中，30℃搅拌条件下充分反应2h，然后再缓慢加入4.0g分子量为1500～1750单宁(单宁按照专利CN201110187501.1制备)。添加过程中需不停搅拌，加完后搅拌反应1h。静置30min后，5000r/min离心5min，取沉淀，用蒸馏水洗涤三次，40℃干燥，制得16.2g硅藻土接枝的单宁。

单宁的制备方法为：

余甘子干燥果实粉碎，取1kg，放入超临界萃取装置中，在温度为45℃，压力为30MPa下萃取50min，残留物加5L70％的乙醇溶液进行超声提取，超声频率为35KHz，提取2次，每次1h，过滤，合并提取液，浓缩，加入浓度为6％明胶溶液，搅拌至不再产生沉淀，离心，沉淀物用90％丙酮水溶液溶解，滤除明胶，得到初步纯化液，上1LHPD-400大孔树脂柱，吸附完成后，先用5L水洗脱，在用5L70％乙醇溶液洗脱，控制流速为4.5mL/min，收集含分子量1500～1750的余甘子鞣质的洗脱液，浓缩，冷冻干燥即得分子量为1500～1750单宁。

抗菌活力测定方法：

用0.1mol/L pH6.4的磷酸钾缓冲液从固体斜面上将金黄色葡萄球菌冲下，配成一定浓度的悬浊液(OD_570nm＝0.3～0.5)。取3ml该悬浮液置于冰浴中，再加入50μL用无菌水溶解的抗菌肽样品，混匀，测其在570nm处A₀值。然后将其移入30℃温浴中，反应30min后取出，立即置于冰浴中10min，以终止反应。测其在570nm处A值。抗菌活力按U²＝(A₀-A)/A式计算。U：活力单位。

实施例1：

向200ml家蝇蛹粗提液中加入16.0g硅藻土接枝的单宁，充分搅拌至硅藻土悬浮，保持一小时。然后5000r/min离心10min，取沉淀。用200mL50％丙酮溶液25℃浸提沉淀物1h后，6000r/min离心20min，弃沉淀。采用真空冷冻干燥法除去水分和丙酮，获得抗菌肽，称其质量并测定抗菌活力。收得抗菌肽1.01g，抗菌肽得率为1.01％(以家蝇蛹质量为标准)，抗菌活力为82.3％。

实施例2：

向200ml家蝇蛹粗提液中加入17.0g硅藻土接枝的单宁，充分搅拌至硅藻土悬浮，保持一小时。然后5000r/min离心10min，取沉淀。用200mL60％丙酮溶液30℃浸提沉淀物1h后，6000r/min离心20min，弃沉淀。采用真空冷冻干燥法除去水分和丙酮，获得抗菌肽，称其质量并测定抗菌活力。收得抗菌肽1.22g，抗菌肽得率为1.22％(以家蝇蛹质量为标准)，抗菌活力到86.0％。

实施例3：

向200ml家蝇蛹粗提液中加入18.0g硅藻土接枝的单宁，充分搅拌至硅藻土悬浮，保持一小时。5000r/min离心10min，取沉淀。用200mL70％丙酮溶液40℃浸提沉淀物1h后，6000r/min离心20min，弃沉淀。采用真空冷冻干燥法除去水分和丙酮，获得抗菌肽，称其质量并测定抗菌活力。收得抗菌肽1.5g，抗菌肽得率为1.5％(以家蝇蛹质量为标准)，抗菌活力达到90.2％。

实施例4：

向200ml家蝇蛹粗提液中加入19.0g硅藻土接枝的单宁，充分搅拌至硅藻土悬浮，保持一小时。5000r/min离心10min，取沉淀。用200mL75％丙酮溶液45℃浸提沉淀物1h后，6000r/min离心20min，弃沉淀。采用真空冷冻干燥法除去水分和丙酮，获得抗菌肽，称其质量并测定抗菌活力。收得抗菌肽0.9g，抗菌肽得率为0.9％(以家蝇蛹质量为标准)，抗菌活力为80％。

实施例5：

向200ml家蝇蛹粗提液中加入20.0g硅藻土接枝的单宁，充分搅拌至硅藻土悬浮，保持一小时。5000r/min离心10min，取沉淀。用200mL80％丙酮溶液50℃浸提沉淀物1h后，6000r/min离心20min，弃沉淀。采用真空冷冻干燥法除去水分和丙酮，获得抗菌肽，称其质量并测定抗菌活力。收得抗菌肽0.76g，抗菌肽得率达到为0.76％(以家蝇蛹质量为标准)，抗菌活力为72.6％。

Claims (9)

1.一种分离抗菌肽的方法，其特征在于所述方法为：

(1)二甲基二氯硅烷加入无水吡啶中，搅拌均匀配成混合液，所述二甲基二氯硅烷、无水吡啶的体积比为1：15～16，然后将过100目筛的硅藻土粉末加入上述混合液中，20～30℃下搅拌反应2～3小时，再于搅拌下缓慢加入单宁，加完后搅拌反应1～2小时，再静置0.5～1小时，离心，取沉淀洗涤、干燥，制得硅藻土接枝的单宁；所述单宁、硅藻土粉末的质量比为1:1.5～3，所述二甲基二氯硅烷、硅藻土粉末的质量比为1:1.25～2；

(2)以家蝇蛹粗提液为原料，向家蝇蛹粗提液中加入所述的硅藻土接枝的单宁，添加比例为，每10mL家蝇蛹粗提液中加入0.8～1.2g硅藻土接枝的单宁，充分搅拌成悬浮液，并保持1～2h，然后高速离心，取沉淀物加入体积百分含量50～80％丙酮水溶液中，在25～50℃温度下浸提1～2h，然后高速离心，取上清液，采用真空冷冻干燥法除去水分和丙酮，制得所述抗菌肽。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中，所述单宁、硅藻土粉末的质量比为1：2.5，所述二甲基二氯硅烷、硅藻土粉末的质量比为1：2。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中，所述单宁为分子量1500～1750的单宁。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中，每10mL家蝇蛹粗提液中加入0.8～1.0g硅藻土接枝的单宁。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中，每10mL家蝇蛹粗提液中加入0.9g硅藻土接枝的单宁。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中，所述沉淀物加入体积百分含量70％丙酮水溶液中进行浸提。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中，所述浸提时的温度为40℃。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中，所述家蝇蛹粗提液按以下方法制得：

称取家蝇蛹，用蒸馏水清洗干净，加入pH5.8、50mmol/L磷酸盐缓冲液，匀浆处理后，高速离心，取上清液，上清液中加入(NH₄)₂SO₄，高速离心，弃沉淀，收取上清液，即为家蝇蛹粗提液；

所述家蝇蛹、磷酸盐缓冲液、(NH₄)₂SO₄的质量比为1：2～3：0.5～1。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法按以下步骤进行：

(1)称取家蝇蛹，用蒸馏水清洗干净，加入pH5.8、50mmol/L磷酸盐缓冲液，匀浆处理后，6000r/min离心25min，取上清液，上清液中加入(NH₄)₂SO₄，8000r/min离心20min，弃沉淀，收取上清液，即为家蝇蛹粗提液；所述家蝇蛹、磷酸盐缓冲液、(NH₄)₂SO₄的质量比为1：2.2：0.65；

(2)二甲基二氯硅烷加入无水吡啶中，搅拌均匀配成混合液，所述二甲基二氯硅烷、无水吡啶的体积比为1：16，然后将过100目筛的硅藻土粉末加入上述混合液中，30℃下搅拌反应2小时，再于搅拌下缓慢加入分子量1500～1750单宁，加完后搅拌反应1h，静置30min后，5000r/min离心5min，取沉淀，用蒸馏水洗涤，40℃干燥，制得硅藻土接枝的单宁；

所述单宁、硅藻土粉末的质量比为1：2.5，所述二甲基二氯硅烷、硅藻土粉末的质量比为1：2；

(3)向家蝇蛹粗提液中加入硅藻土接枝的单宁，添加比例为，每10mL家蝇蛹粗提液中加入0.9g硅藻土接枝的单宁，充分搅拌成悬浮液，并保持1h，然后5000r/min转速下离心10min，取沉淀物加入体积百分含量70％丙酮水溶液中，在40℃温度下浸提1h，然后6000r/min离心20min，取上清液，采用真空冷冻干燥法除去水分和丙酮，制得抗菌肽。