CZ20004422A3 - Polypeptid lidský protein C - Google Patents

Abstract

Popisuje se izolovaný polypeptid lidského proteinu C se zkráceným těžkým řetězcem, tento izolovaný polypeptid zachovává biologickou účinnost lidského proteinu C přirozeného typu; je použitelný při léčení vaskulárních okluzivních poruch, hyperkoagulačních stavů, trombotických poruch a chorobných stavů zvyšujících pravděpodobnost vzniku trombózy

Description

Polypeptid lidského proteinu C

Oblast techniky

Tento vynález patří do oblasti humánního lékařství. Konkrétněji se tento vynález týká izolovaného polypeptidů lidského proteinu C se zkráceným těžkým řetězcem, způsobů použití tohoto polypeptidů lidského proteinu C a farmaceutických přípravků tohoto polypeptidů lidského proteinu C.

Dosavadní stav techniky

Protein C je vitamin K-dependentní serinová proteasa a je přirozeným antikoagulačním prostředkem, který hraje úlohu při regulaci cévní homeostázy inaktivací faktorů V_a a VIII_a koagulační kaskády. Lidský protein C se primárně vytváří v játrech jako jednoduchý polypeptid s počtem aminokyselin 461. Tato prekurzorová molekula se podrobuje několika posttranslačním modifikacím včetně 1) odštěpení signální sekvence 42 aminokyselin, 2) proteolytického odstranění lysinového zbytku v poloze 156 ze zymogenu o jednom řetězci a argininového zbytku v poloze 157 s vytvořením formy molekuly o dvou řetězcích (to jest lehký řetězec o 155 aminokyselinových zbytcích připojený disulfidickou vazbou k těžkému řetězci obsahujícímu serinproteasu o 262 aminokyselinových zbytcích), 3) vitamin K-dependentní karboxylace 9 zbytků kyseliny glutamové seskupených v prvních 42 aminokyselinách lehkého řetězce s obdržením 9 zbytků kyseliny gama-karboxyglutamové a 4) připojení glycidu na 4 místech (1 na lehkém řetězci a 3 na těžkém řetězci). Nakonec se cirkulující zymogen o dvou řetězcích aktivuje působením komplexu trombin/ /trombomodulin, který štěpí aktivační peptid (zbytky 158 až 169) cirkulujícího zymogenu s poskytnutím aktivovaného pro• · ** ·· ·· ·· β » · φ » φ * φ φφφφ φ φ φ • ···*·· · · • * · » > Λ «Φ *» ΦΦ ΦΦΦΦ teinu C (aPC).

Ve spojení s ostatními proteiny působí protein C snad jako nejdůležitější regulátor potlačující krevní koagulační faktory, které podporují trombózu. Enzymatický systém proteinu C tedy představuje hlavní fyziologický antikoagulační mechanismus.

Kritická úloha proteinu C při řízení hemostázy se projevuje na příkladu zvýšené rychlosti trombózy při heterozygotní deficienci, rezistenci na protein C (například následkem běžné Leidenovy mutace faktoru V) a při fatálním následku neléčené homozygotní deficience proteinu C. Humánní aktivovaný protein C, odvozený od plazmy i rekombinantní, je účinným a bezpečným antitrombotickým prostředkem, což se prokazuje na řadě zvířecích modelů žilní i tepenné trombózy. Protein C se v nedávných klinických studiích projevil jako účinný při humánních trombotických onemocněních včetně léčení nedostatečnosti proteinu C a mikrovaskulární trombózy, jako je roztroušená intravaskulární koagulace spojená se sepsí.

Naneštěstí se v průběhu aktivace proteinu C odštěpuje konec C hlavního proteinu, což vede k potenciální změně struktury proteinu, která dále může vést k méně atraktivnímu farmaceutickému přípravku.

Podstata vynálezu

Původci tohoto vynálezu zjišťují, že tato zkrácená forma aPC (aktivovaného proteinu C) je biologicky účinná. Tento vynález proto poskytuje izolovaný polypeptid aPC se zkráceným těžkým řetězcem, preferovaný způsob přípravy to-

hoto polypeptidů a jeho použití jako léčiva.

Tento vynález poskytuje izolovaný polypeptid lidského proteinu C zahrnující lehký řetězec a zkrácený těžký řetězec s podmínkou, že číslo identifikace sekvence tohoto polypeptidu je 1.

Tento vynález dále poskytuje rekombinantní molekulu DNA kódující izolovaný polypeptid lidského proteinu C s omezeným těžkým řetězcem s podmínkou, že číslo identifikace sekvence této molekuly DNA je 2.

Tento vynález dále poskytuje způsob léčení trombotického onemocnění u pacienta, který potřebuje takové léčení, zahrnující podávání tomuto pacientovi farmaceuticky účinného množství izolovaného polypeptidů lidského proteinu C s omezeným hlavním řetězcem.

Způsoby a aspekty přípravy izolovaného polypeptidů lidského proteinu C se zkráceným hlavním řetězcem jsou rovněž předmětem tohoto vynálezu.

Pro účely tohoto vynálezu, jak se zde popisuje spolu s nároky, odpovídají následující pojmy definicím popsaným níže.

aPC neboli aktivovaný protein C, at rekombinantní nebo odvozený od plazmy - aPC, zahrnuje a přednostně znamená lidský protein C, i když aPC může též zahrnovat jiné druhy nebo deriváty mající proteolytické, amidolytické, esterolytické a biologické (antikoagulační nebo profibrinolytické) účinky proteinu C. Příklady derivátů proteinu C se popisují v US patentu č. 5 453 373 a US patentu č. 5 516 650, jejichž • · • · · ·

- 4 • ·*··*· · * · · · •· ·· ·« ···« ·· · plné znění se zde zahrnuje formou odkazu.

APTT - aktivovaný parciální tromboplastinový čas.

hPC - zymogen lidského proteinu C.

r-hPC - rekombinantní zymogen lidského proteinu C tvořený v prokaryotických buňkách, eukaryotických buňkách nebo u transgenních živočichů.

r-aPC - rekombinantní lidský aktivovaný protein C tvořený aktivací r-hPC in vitro nebo přímou sekrecí aktivované formy proteinu C z prokaryotických buněk, eukaryotických buněk nebo transgenních živočichů (W097/20043) včetně například sekrece z lidských ledvinových buněk 293 ve formě zymogenu s následnou purifikaci a aktivací způsoby dobře známými tomu, kdo má zkušenost v oboru, jak ukazuje US patent č. 4 981 952, jehož plné znění se zde zahrnuje formou odkazu.

Zymogen - se vztahuje k vylučovaným neaktivním formám proteinu C o jednom řetězci či o dvou řetězcích.

Zkrácený těžký řetězec - se vztahuje k těžkému řetězci proteinu C, jehož 4 C-terminální aminokyseliny byly odštěpeny. Pro případ lidského aktivovaného proteinu C obsahuje zkrácený těžký řetězec zbytky 170 až 415, jak se udává v sekvenci s identifikačním číslem 1.

Lehký řetězec - se vztahuje k lehkému řetězci proteinu C. Pro případ lidského aktivovaného proteinu C obsahuje lehký řetězec aminokyselinové zbytky 1 až 155 nebo polypeptidy mající alespoň jednu aminokyselinu z konce C vypuštěnu.

• ······ · · ·· »

Trombotická porucha - porucha, která se vztahuje k vytváření či přítomnosti krevní sraženiny v cévě nebo kterou toto vytváření či přítomnost krevní sraženiny ovlivňuje. Trombotické poruchy zahrnují, avšak bez omezení na tyto případy, mrtvici, infarkt myokardu, nestabilní angínu pectoris, náhlý uzávěr po angioplastice nebo zavedení stentu a trombózu jako následek periferního vaskulárního chirurgického výkonu.

Vaskulární okluzivní poruchy a hyperkoagulační stavy: poruchy zahrnující, avšak bez omezení na tyto případy, sepsi, roztroušenou intravaskulární koagulaci, purpuru fulminans, velká poranění, velké chirurgické výkony, popáleniny, syndrom respirační tísně dospělých, transplantace, hlubokou venózní trombózu, trombocytopénii vyvolanou heparinem, srpkovitost, talasemii, virovou hemoragickou horečku, trombotickou trombocytopenní purpuru a hemolytický uremický syndrom.

Farmaceutický prostředek - prostředek či roztok, který je vhodný k podávání jako terapeutický prostředek.

Farmaceuticky účinné množství ve smyslu, ve kterém se zde používá, představuje množství sloučeniny podle tohoto vynálezu, které je schopné potlačovat trombotickou poruchu u savců. Konkrétní dávka sloučeniny podávané podle tohoto vynálezu se ovšem určí na základě konkrétních okolností týkajících se případu, včetně podávané sloučeniny, konkrétního léčeného stavu a podobných úvah.

Struktura hPC je poměrně složitá vzhledem k poč-tu post-translačních modifikací. Struktura hPC zahrnuje lehký řetězec (zbytky 1 až 155) a těžký řetězec (zbytky 158 až 419). Molekula hPC se původně exprimuje jako polypeptid o 419 aminokyselinách, avšak před sekrecí z buněk se většina proteinu převádí na heterodimerní formu odstraněním dipeptidu Lys-Arg v polohách 156 až 157.

Rekombinantní lidský protein C (r-hPC) je svou strukturou a komplexností analogický lidskému proteinu C. Během převedení r-hPC na r-aPC se trombin selektivně štěpí aktivací dodekapeptidu (zbytky 158 až 169). Avšak původci tohoto vynálezu objevili podmínky, za kterých se z konce C těžkého řetězce může též odštěpovat tetrapeptid (zbytky 416 až 419) s vytvořením des (416 až 419) aPC polypeptidů. Původci dále objevili, že tato forma aPC je biologicky účinná (viz příklad 1, tabulka 1), což vede k jejímu použití jako terapeutické látky samotné nebo v kombinaci s nativním aPC. Tento vynález tedy poskytuje izolovaný des (416 až 419) aPC, způsob preferenční přípravy des (416 až 419) aPC a jeho použití jako léčiva.

Tento vynález též poskytuje sloučeniny DNA pro použití při získávání zkráceného těžkého řetězce proteinu C. Tyto sloučeniny DNA zahrnují kódovací sekvenci pro lehký řetězec lidského proteinu C umístěnou tak, že přiléhá těsně v sestupném směru, a v translačním čtecím rámci prepropeptidovou sekvenci proteinu C přirozeného typu. Sekvence DNA též kódují dipeptid Lys-Arg, který se zpracovává během vytváření definitivně upravené formy molekuly proteinu C, aktivační peptid a zkrácený těžký řetězec molekuly proteinu C.

Ti, kteří mají zkušenost v oboru, rozpoznají, že následkem degenerovanosti genetického kódu se může aktivovaný polypeptid proteinu C popisovaný výše kódovat různými sloučeninami DNA. US patent č. 4 775 624, jehož plné znění se zde zahrnuje formou odkazu, uveřejňuje a nárokuje sekvence DNA kódující formu molekuly lidského proteinu C přirozeného typu. Ten, kdo má zkušenost v oboru, může snadno stanovit, které změny sekvencí DNA lze použít pro vytvoření ostatních sekvencí DNA, které by mohly kódovat přesně definovaný polypeptid, jak se zde popisuje, avšak tento vynález se neomezuje na specifické sekvence DNA. Následkem toho konstrukce popsané níže pro preferovanou sloučeninu DNA, vektory a transformanty podle tohoto vynálezu jsou pouze ilustrativní a neomezují předmět tohoto vynálezu.

Sloučenina DNA podle tohoto vynálezu se může připravit mutagenezí směrovanou na místo genu lidského proteinu C. Obdrží se kultury a plasmidy se izolují konvenčními způsoby a poté se mohou přímo přenášet do eukaryotických hostitelských buněk pro tvorbu proteinu C se zkráceným těžkým řetězcem. Preferuje se přenášení plasmidů do hostitelských buněk, které exprimují bezprostřední-časný genový produkt adenoviru E1A, ve kterých BK enhancer, se kterým se lze setkat při působení GBMT transkripčních kontrolních jednotek, zvyšuje expresi nejúčinněji za přítomnosti E1A. Transkripční kontrolní jednotka GBMT se plně popisuje v US patentu č. 5 573 938 a v evropské patentové přihlášce č. 91301451.0, jejichž plné znění se zde zahrnuje formou odkazu. Ti, kteří mají zkušenost v oboru, si uvědomí, že řada hostitelských buněk exprimuje, nebo se může upravit tak, aby exprimovaly bezprostřední časný genový produkt velkého DNA viru. Nejpreferovanější buněčnou linií pro exprimování derivátu lidského proteinu C podle tohoto vynálezu je linie buněk lidské ledviny 293, která se popisuje v US patentu č. 4 992 373, jehož plné znění se zde zahrnuje formou odkazu. Po exprimování v této buněčné linii se tyto deriváty purifikují od supernatantu buněčné kultury způsobem popsaným v US patentu č. 4 981 952, • · · · • ·· · · · · · · ··

- 8 • ·«··«· · · · · · ·· · · ·· · · · · ·· · jehož plné znění se zde zahrnuje formou odkazu.

Sekvence DNA podle tohoto vynálezu lze připravovat chemicky nebo kombinací restrikčních fragmentů nebo kombinací způsobů známých v oboru. Jsou k dispozici syntetizátory DNA a lze je použít pro tvorbu sloučenin DNA podle tohoto vynálezu.

Ilustrativní vektory podle tohoto vynálezu zahrnují GMBT transkripční jednotku umístěnou tak, aby stimulovala transkripci kódovacích sekvencí pozdním promotorem adenoviru. Ti, kteří mají zkušenost v oboru, rozpoznají, že v oboru existuje značný počet eukaryotických promotorů, enhancerů a expresních vektorů a že je lze použít pro exprimování sekvencí DNA k vytváření derivátů proteinu C podle tohoto vynálezu. Ti, kteří mají zkušenost v oboru, si též uvědomí, že eukaryotický expresní vektor může fungovat bez elementu enhanceru. Klíčový aspekt tohoto vynálezu spočívá v nových sekvencích DNA a odpovídajících aPC se zkráceným těžkým řetězcem připravených z těchto sekvencí.

Alternativně lze aktivovaný polypeptid proteinu C, který se zde popisuje, připravit reakcí aktivovaného proteinu C s trombinem pro odštěpení tetrapeptidu (zbytků 416 až 419) z konce C těžkého řetězce. Další štěpení se obdrží vystavením aPC trombinu po delší dobu, obecně 10 min až 3 až 5 h za podmínek uvažovaných v oboru. Polypeptidy aPC připravené zpracováním r-aPC trombinem nebo přímou expresí z eukaryotických buněk mají podobnou aktivitu jako aPC. Proto budou aPC se zkráceným těžkým řetězcem účinné při léčení lidských trombotických onemocnění včetně substituční léčby při léčení nedostatku proteinu C, vaskulárních okluzivních poruch a hyperkoagulačních stavů včetně sepse, disseminované • · • · * · · * » ·

- 9 intravaskulární koagulace, purpury fulminans, velkých poranění, velkých chirurgických výkonů, popálenin, syndromu respirační tísně dospělých, transplantací hluboké žilní trombózy, trombocytopénie indukované heparinem, srpkovitosti, talasemie, virové hemoragické horečky, trombocytické trombocytopenní purpury a hemolytického uremického syndromu stejně tak jako trombotických poruch a chorobných stavů zvyšujících pravděpodobnost trombózy, jako je infarkt myokardu a mrtvice, podáváním izolovaného polypeptidu lidského proteinu C se zkráceným těžkým řetězcem.

Dalším ztělesněním tohoto vynálezu je způsob léčení trombotických poruch, který zahrnuje podávání pacientovi, který tuto léčbu potřebuje, farmaceuticky účinného množství izolovaného polypeptidu lidského proteinu C se zkráceným těžkým řetězcem v kombinaci s protidestičkovým prostředkem.

Dalším ztělesněním tohoto vynálezu je způsob léčení sepse zahrnující podávání pacientovi, který tuto léčbu potřebuje, farmaceuticky účinného množství izolovaného polypeptidu lidského proteinu C se zkráceným těžkým řetězcem v kombinaci s proteinem zvyšující bakteriální permeabilitu.

Izolovaný polypeptid lidského proteinu C se zkráceným těžkým řetězcem se může formulovat podobným způsobem jako aPC s farmaceuticky přijatelným zřeďovacím prostředkem. Přednostně včetně cukru, jako je sacharosa, soli a citrátového pufru. Přednostně se deriváty aPC připravují při pH

5,5 až 6,5. Obecně budou dávky derivátů aPC, které se zde popisují, analogické dávkám nativního aPC, přednostně 0,01 mg/kg/h až 0,05 mg/kg/h.

Příklady provedení vynálezu • 9 · 9 » · · · · · ···· · · · · ··· • ······ · · · · 9

Následující způsoby přípravy a příklady slouží pouze pro ilustraci. Ten, kdo má zkušenost v oboru, si uvědomí, že existují další způsoby přípravy a aktivace rekombinantního proteinu C.

Příprava 1

Příprava lidského proteinu C

Rekombinantní lidský protein C (r-hPC) se tvoří v buňkách lidských ledvin 293 způsoby dobře známými odborníkům, jako jsou způsoby popsané v US patentu č. 4 981 952, jehož plné znění se zde zahrnuje formou odkazu. Genový kódovací lidský protein C se uveřejňuje a nárokuje v US patentu č. 4 775 624, jehož plné znění se zahrnuje zde formou odkazu. Plasmid použitý pro exprimování lidského proteinu C v buňkách 293 je plasmid pLPC, který se uveřejňuje v US patentu č. 4 992 373 a US patentu č. 5 661 002, jejichž plné znění se zde zahrnují formou odkazu. Konstrukce formou plasmidu pLPC se též popisuje v evropské patentové publikaci č.

445 939 a v publikaci Grinnell a kol., Bio/Technology, 5, 1189 až 1192 (1987), jejichž plná znění se zde rovněž zahrnují formou odkazu. Ve stručnosti se plasmid přenáší do buněk 293, potom se identifikují stabilní transformanty, s jejich následnou subkultivací a růstem v médiu bez krevního séra.

Po fermentaci se obdrží médium bez buněk mikrofiltrací.

Lidský protein C se oddělí z kapaliny kultury přizpůsobením způsobů v US patentu č. 4 981 952, jehož plné znění se zde zahrnuje formou odkazu. Čiré médium se upraví kyselinou ethylendiamintetraoctovou tak, aby její koncentrace byla mM před absorpcí na měniči aniontů (Fast-Flow Q, Pharma• · · · • ·

- 11 cia). Po promytí 4 objemy sloupce roztoku o koncentracích 20 mM Tris, 200 mM chloridu sodného, pH 7,4 a 2 objemy sloupce roztoku 20 mM Tris, 150 mM chloridu sodného, pH 7,4 se vázaný rekombinantní zymogen lidského proteinu C eluuje roztokem o koncentracích 20 mM Tris, 150 mM chloridu sodného, 10 mM chloridu vápenatého, pH 7,4. Eluovaný protein má po eluci vyšší čistotu než 95 %, jak lze posoudit na základě elektroforézy na SDS-polyakrylamidovém gelu.

Další čištění proteinu se provede úpravou koncentrace chloridu sodného na 3 M s následnou adsorpcí na hydrofobní interakční pryskyřici (Toyopearl Phenyl 650M, TosoHaas), která je v rovnováze s roztokem o koncentracích 20 mM Tris,

M chloridu sodného, 10 mM chloridu vápenatého, pH 7,4. Po promytí dvěma objemy sloupce ekvilibračního pufru bez chloridu vápenatého se rekombinantní lidský protein C eluuje 20 mM roztokem Tris, pH 7,4. Eluovaný protein se připraví pro aktivaci odstraněním zbytkového vápníku. Rekombinantní lidský protein C se ponechá projít kovovou afinitní kolonou (Chelex-100, Bio-Rad) pro odstranění vápníku a opět se naváže na měnič aniontů (Fast Flow Q, Pharmacia). Oba tyto sloupce se uspořádají sériově a ponechá se ustavit rovnováha s roztokem o koncentracích 20 mM Tris, 150 mM chloridu sodného, 5 mM kyseliny ethylendiamintetraoctové, pH 7,4. Po aplikaci proteinu se sloupec Chelex-100 promyje jedním objemem sloupce téhož pufru před odpojením ze série. Sloupec měniče aniontů se promyje třemi objemy sloupce ekvilibračního pufru před eluci proteinu roztokem o koncentracích 0,4 M chloridu sodného, 20 mM Tris-acetatu, pH 6,5. Koncentrace rekombinantního lidského proteinu C a rekombinantního aktivovaného proteinu C v roztocích se měří pomocí ultrafialového světla při 280 nm a extinkce E0,l% činí 1,81 respektive 1,85.

Příprava 2

Aktivace rekombinantního lidského proteinu C

Bovinní thrombin se naváže na aktivovanou CH-Sepharosu 4B (Pharmacia) za přítomnosti pufru HEPES o koncentraci 50 mM, pH 7,5 při teplotě 4 °C. Reakce připojení se provede na pryskyřici, kterou již byla naplněna kolona, s použitím zhruba 5000 jednotek thrombinu/ml pryskyřice. Roztok thrombinu cirkuluje kolonou zhruba po dobu 3 h před přídavkem MEA do koncentrace 0,6 ml/1 cirkulačního roztoku. Roztok obsahující MEA cirkuluje po dobu dalších 10 až 12 h pro zajištění úplného zablokování nezreagovaných aminů na pryskyřici. Po zablokování se pryskyřice s připojeným thrombinem promyje 10 objemy sloupce roztoku o koncentracích 1 M chloridu sodného, 20 mM Tris, pH 6,5 pro odstranění veškerého nespecificky vázaného proteinu a použije se v aktivačních reakcích po ekvilibraci v aktivačním pufru.

K purifikovanému rhPC se přidá kyselina ethylendiamintetraoctová do koncentrace 5 mM (pro vazbu veškerého zbývajícího vápníku ve formě chelátu) a roztok se zředí na koncentraci 2 mg/ml pufrem Tris 20 mM, pH 7,4 nebo Tris-acetat 20 mM, pH 6,5. Získaný roztok se ponechá projít thrombinovým sloupcem ekvilibrováným při teplotě 37 °C s 50 mM roztokem chloridu sodného a buď s pufrem 20 mM Tris pH

7,4 nebo 20 mM Tris-acetat pH 6,5. Průtok se upraví tak, aby umožňoval dobu kontaktu mezi rHPC a thrombinovou pryskyřicí zhruba 20 min. Eluát se sbírá a ihned se provádí zkouška jeho amidolytické aktivity. Pokud roztok nemá specifickou (amidolytickou) aktivitu srovnatelnou s určeným standardem aPC, recykluje se thrombinovou kolonou pro dokončení aktiva• · 0 0 0 • 0

- 13 ce rhPC. Poté následuje zředění roztoku 1:1 pufrem 20 mM, jak se uvádí výše, o pH buď 7,4 nebo 6,5 pro udržení aPC při nižších koncentracích do provedení dalšího kroku zpracování.

Odstranění vylouženého thrombinu z roztoku aPC se provede vazbou aPC na měnič aniontů (Fast Flow Q, Pharmacia) ekvilibrovaný v aktivačním pufru (buď 20 mM Tris, pH 7,4 nebo 20 mM Tris-acetat, pH 6,5) s 150 mM roztokem chloridu sodného. Thrombin za těchto podmínek neinteraguje s měničem aniontů, avšak prochází kolonou do aplikačního eluátu vzorku. Jakmile se aPC aplikuje na kolonu, provede se promytí 2 až 6 objemy sloupce ekvilibračního pufru o koncentraci 20 mM před eluci vázaného aPC elučním krokem s použití 0,4 M roztoku chloridu sodného buď v 5 mM Tris-acetatu, pH 6,5 nebo 20 mM Tris, pH 7,4. Vyšší objemové promývací podíly sloupce umožňují úplnější odstranění dodekapeptidu.

Antikoagulační aktivita aktivovaného proteinu C se určí měřením prodloužení srážlivosti ve zkoušce aktivovaného parciálního thromboplastinového času (APTT). Standardní křivka se získá pro zředěný pufr (1 mg/ml bovinního serumalbuminu [BSAjpro radioimunoeseje, 20 mM Tris, pH 7,4, 150 mM chlorid sodný, 0,02 % nitridu sodného) v rozmezí koncentrací proteinu C od 125 do 1000 ng/ml, zatímco vzorky se připraví při několika zředěních v tomto koncentračním rozmezí. Do každé kyvety vzorku se přidá 50 μΐ chladné koňské plazmy a 50 μΐ rekonstituovaného aktivovaného činidla pro stanovení parciálního thromboplastinového času (APTT Reagent, Sigma) a roztok se inkubuje při teplotě 37 °C po dobu 5 min. Po inkubaci se přidá do každé kyvety 50 μΐ příslušných vzorků či standardů. Místo vzorku nebo standardu se použije zřeďovací pufr pro stanovení bazální srážlivosti. Časovači zařízení fibrometru (CoA Screener Hemostasis Anály• ······ · · ·· · • · ···· ·· • · · · · · · · · · ·· ·

- 14 zer, American Labor) se spustí ihned po přídavku 50 μΐ 30 mM roztoku chloridu sodného o teplotě 37 °C ke každému vzorku či standardu. Koncentrace aktivovaného proteinu C ve vzorcích se vypočítá z rovnice lineární regrese standardní křivky. Hodnoty srážlivosti, které se zde uvádějí, jsou průměrem minima tří paralelních stanovení včetně vzorků standardní křivky.

Příklad 1

Příprava des (416 až 419) aktivovaného proteinu C

Pro přípravu des (416 až 419) aPC se jako výchozí látka, použije aPC. Použije se immobilizovaná thrombinová pryskyřice (10 mg thrombinu/ml pryskyřice CH-Sepharose 4B). N-glykosidasa F se obdrží od Boehringer Mannheim. Koňská krevní plazma je produktem Animal Technologies, lne. (Tyler, TX). Aktivovaná CH Sepharosa^R 4B se obdrží od Pharmacia Biotech. Veškeré další chemikálie jsou chemicky čisté látky podle Americké chemické společnosti, které jsou komerčně dostupné.

ml immobilizované thrombinové pryskyřice se umístí na filtr 0,2 μπι. Pryskyřice se promyje zhruba 5x20 ml pufru Tris o koncentraci 40 mM, pH 7,02. Promytá immobilizovaná thrombinová pryskyřice se přenese do polypropylenové lahvičky 50 ml, přidá se 12 ml alikvótu roztoku aPC 2,67 mg/ml (120 mg aPC ve 45 ml pufru Tris 40 mM, pH 7,02) a konečný objem suspenze se upraví zhruba na 21 ml pufrem Tris. Suspenze se inkubuje při teplotě okolí za stálého jemného třepání. Po inkubačních časech 10, 25, 50, 100, 160 a 240 min se z lahvičky odeberou alikvóty suspenze po 3 ml. Tyto alikvóty se centrifugují při frekvenci otáčení 2000 min^-1 ( ICE

- 15 • ······ · · ·· · « ·· ·· ···· ··

CRU-5000 Centrifuge) po dobu 1 min a supernatanty se přenesou do několika polypropylenových lahviček o obsahu 1,5 ml. Tyto lahvičky se ihned umístí na lázeň se suchým ledem pro zmrazení roztoku. Kontrolní vzorek se připraví ve stejném čase s použitím deaktivované pryskyřice CH-Sepharose 4B, která neobsahuje immobilizovaný thrombin.

Zkouška na obsah proteinu. Alikvóty (150 μΐ) roztoku vzorku se zředí 450 μΐ pufru Tris 40 mM, pH 7,02 nebo vodou pro použití s reakčními činidly. Kyveta pro vzorek se promyje dvakrát roztokem vzorku a měří se absorbance tohoto roztoku v ultrafialovém světle (při vlnové délce 280 nm). Jako blank se pro toto měření použije pufr Tris nebo voda pro použití s reakčními činidly.

Rozbor LC/MS pro distribuci polypeptidů proteinu. Alikvóty zhruba 600 μΐ roztoku vzorku se smísí s 240 mg močoviny, 88 μΐ 3 M pufru Tris (pH 8,0) a 15 μΐ roztoku dithiothreitolu 50 mg/ml a směs se inkubuje po dobu 30 min při teplotě 37 °C. Vzorek se alkyluje přídavkem 50 μΐ roztoku jodacetamidu 50 mg/ml a inkubací při teplotě místnosti ve tmě po dobu 30 min. Vzorky se poté odsolí na gelové filtrační koloně pro jednorázové použití, deglykosyluji

N-glykosidasou F a analyzují hmotnostní spektrometrií LC/MS.

Analýza vysokovýkonnou kapalinovou chromatografií s reverzními fázemi. Alikvóty po 300 až 400 μΐ roztátého roztoku vzorku se promísí s dostatečným objemem 0,1% roztoku kyseliny trifluoroctové s obdržením roztoku zhruba 1 mg/ml. Tento roztok se použije jako roztok vzorku o vysoké koncentraci. Roztok vzorku o nízké koncentraci se připraví smísením alikvótu 50 μΐ roztoku o vysoké koncentraci se 450 μΐ 0,1% roztoku kyseliny trifluoroctové. Alikvóty po 100 μΐ vzorků

- 16 o vysoké koncentraci a nízké koncentraci se vstřikují na systém vysokovýkonné kapalinové chromatografie.

Rozbor APTT. Vzorek se analyzuje na automatizovaném analyzátoru aktivovaného parciálního thromboplastinového času (APTT) CoaLab. Veškeré vzorky se zředí s použitím ručních pipet na konečné koncentrace mezi 410 ng a 420 ng aPC/ml. Referenční standard aPC mající přiřazenou schopnost 303 jednotek/mg se užije pro tento rozbor. Des (416 až 419) aPC připravený, jak se popisuje výše, má podobnou biologickou aktivitu jako nativní aPC při měření v rozboru APTT. Vztah mezi antikoagulační aktivitou APTT a procentem Des (416 až 419) aPC ukazuje tabulka 1. Procentický obsah Des (416 až 419) aPC může být až 68 % a přitom se stále udržuje v podstatě stejná antikoagulační aktivita jako u nativního aPC. Obecně aPC připravený způsoby, které se zde popisují, obsahuje zhruba 1 % až zhruba 25 % Des (416 až 419) aPC.

- 17 Tabulka 1

Doba inkubace (min)

Procentický podíl (%) Des (416-419) aPC Kontrola Vzorek

Aktivita APTT (j ednotek/mg)

Kontrola Vzorek

t = 0	13	-	512	-
t = 10	14	20		503
t = 25	14	26		533
t = 50	14	35		530
t = 100	14	46		521
t = 160	14	57		509
t = 240	13	68		509

Seznam sekvencí <110> Eli Lilly and Company <12O> Polypeptid proteinu C <130> zkrácený těžký řetězec proteinu C <140> X12279 <141> 1999-06-02 <160> 2 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1244 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: rekombinantní lidský protein C zkrácený na konci C <400> 1 gccaactcct tcctggagga gctccgtoac agcagcctgg agcgggagtg catagaggag 60 atctgtgact tcgaggaggc caaggaaatt ttccaaaatg tggatgacac actggccttc 120 tggtccaagc acgtcgacgg tgaccagtgc ttggtcttgc ccttggagca cccgtgcgcc 180 agcctgtgct gcgggcacgg caegtgcatc gacggcatcg gcagcttcag ctgcgactgc 240 cgcagcggct gggagggccg cttctgccag cgcgaggtga gcttcctcaa ttgctcgctg 300 gacaacggcg gctgcacgca ttactgccta gaggaggtgg gctggcggcg ctgtagctgt 360 gcgcctggct acaagctggg ggacgacctc ctgcagtgtc accccgcagt gaagttccct 420 tgtgggaggc cctggaagcg gatggagaag aagcgcagtc acctgaaacg agacacagaa 480 gaccáagaag accaagtaga tccgcggctc attgatggga agatgaccag gcggggagac 540 agcccctggc aggtggtcct gctggactca aagaagaagc tggcctgcgg ggcagtgctc 600 atccacecct cctgggtgct gacagcggcc cactgcatgg atgagtccaa gaagctcctt 660 gtcaggcttg gagagtatga cctgcggcgc tgggagaagt gggagetgga eetggacatc 720 aaggaggtct tcgtccaccc caactacagc aagagcacca ccgacaatga catcgcactg 780 ctgcaectgg cccagcccgc caccctctcg cagaccatag tgcccatctg cctcccggac 840 agcggccttg cagagcgcga gctcaatcag gccggccagg agaccctcgt gacgggctgg 900 ggctaccaca gcagccgaga gaaggaggcc aagagaaacc gcaccttcgt cctcaacttc 960 atcaagattc ccgtggtccc gcacaatgag tgcagcgagg tcatgagcaa catggtgtct 1020 gagaacatgc tgtgtgcggg catoctcggg gaccggcagg atgcctgcga gggcgacagt 1080 ggggggecca tggtcgcctc cttccacggc acctggttcc tggtgggcct ggtgagctgg 1140 ggtgagggct gtgggctcct tcacaactac ggcgtttaca ccaaagtcag ccgctacctc 1200 gactggatcc atgggcacat cagagacaag gaagcccccc agaag 1245 <210> 2 • ······ · · · · · · • · ···· ··· •· e · ·· ···· ·· lit

<211>	415
<212 >	PRT
<213 >	Umělá sekvence
<220>
<223>	Popis umělé sekvence: aminokyselinová	sekvence
	rekombinantního lidského proteinu C se	zkrácením
	konce C

<400> 2

Ala 1

Asn

Ser

Phe

Leu 5

Glu

Glu

Leu

Arg

His 10

Ser

Ser

Leu

Glu

Arg 15

Glu

Cys

Ile

Glu

Glu 20

Ile

Cys

Asp

Phe

Glu 25

Glu

Ala

Lys

Glu

Ile 30

Phe

Gin

Asn

Val

Asp 35

Asp

Thr

Leu

Ala

Phe 40

Trp

Ser

Lys

His

Val 45

Asp

Gly

Asp

Gin

Cys 50

Leu

Val

Leu

Pro

Leu 55

Glu

His

Pro

Cys

Ala 60

Ser

Leu

Cys

Cys

Gly 65

His

Gly

Thr

Cys

Ile 70

Asp

Gly

Ile

Gly

Ser 75

Phe

Ser

Cys

Asp

Cys 80

Arg

Ser

Gly

Trp

Glu 85

Gly Arg

Phe

Cys

Gin 90

Arg

Glu

Val

Ser

Phe 95

Leu

Asn

Cys

Ser

Leu 100

Asp

Asn

Gly

Gly

Cys 105

Thr

His

Tyr

Cys

Leu 110

Glu

Glu

Val

Gly

Trp 115

Arg

Arg

Cys

Ser

Cys 120

Ala

Pro

Gly

Tyr

Lys 125

Leu

Gly

Asp

Asp

Leu 130

Leu

Gin

Cys

His

Pro 135

Ala

Val

Lys

Phe

Pro 140

Cys

Gly Arg

Pro

Trp 145

Lys

Arg

Met

Glu

Lys 150

Lys

Arg

Ser

His

Leu 155

Lys

Arg

Asp

Thr

Glu 160

Asp

Gin

Glu

Asp

Gin 165

Val

Asp

Pro

Arg

Leu 170

Ile

Asp

Gly

Lys

Met 175

Thr

Arg

Arg

Gly

Asp

Ser

Pro

Trp

Gin

Val

Val

Leu

Leu

Asp

Ser

Lys

Lys

180 185 190

Lys Leu Ala Cys Gly Ala Val Leu Ile His Pro Ser Trp Val Leu Thr 195 200 205

Ala Ala His Cys Met Asp Glu Ser
210	215
Glu Tyr Asp 225	Leu Arg Arg Trp Glu 230
Lys Glu Val	Phe Val His Pro Asn 245
Asp Ile Ala	Leu Leu His Leu Ala 260
Ile Val Pro 275	Ile Cys Leu Pro Asp 280
Asn Gin Ala 290	Gly Gin Glu Thr Leu 295
Ser Arg Glu 305	Lys Glu Ala Lys Arg 310
Ile Lys Ile	Pro Val Val Pro His 325
Asn Met Val	Ser Glu Asn Met Leu 340
Gin Asp Ala 355	Cys Glu Gly Asp Ser 360
His Gly Thr 370	Trp Phe Leu Val Gly 375
Gly Leu Leu	His Asn Tyr Gly Val

385 390

Lys	Lys	Leu	Leu 220	Val	Arg	Leu	Gly
Lys	Trp	Glu 235	Leu	Asp	Leu	Asp	Ile 240
Tyr	Ser 250	Lys	Ser	Thr	Thr	Asp 255	Asn
Gin 265	Pro	Ala	Thr	Leu	Ser 270	Gin	Thr
Ser	Gly	Leu	Ala	Glu 285	Arg	Glu	Leu
Val	Thr	Gly	Trp 300	Gly	Tyr	His	Ser
Asn	Arg	Thr 315	Phe	Val	Leu	Asn	Phe 320
Asn	Glu 330	Cys	Ser	Glu	Val	Met 335	Ser
Cys 345	Ala	Gly	Ile	Leu	Gly Asp Arg 350
Gly Gly	Pro	Met	Val 365	Ala	Ser	Phe
Leu	Val	Ser	Trp 380	Gly	Glu	Gly	Cys
Tyr	Thr	Lys 395	Val	Ser	Arg	Tyr	Leu 400

Asp Trp Ile His Gly His Ile Arg Asp Lys Glu Ala Pro Gin Lys 405 410 415

Claims (8)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Izolovaný polypeptid lidského proteinu C obsahující lehký řetězec a zkrácený těžký řetězec.
2. 2. Polypeptid podle nároku 1, jehož číslo identifikace sekvence je 1.
3. 3. Rekombinantní molekula DNA kódující polypeptid lidského proteinu C podle nároku 1.
4. 4. Rekombinantní molekula DNA podle nároku 3, jejíž číslo identifikace sekvence je 2.
5. 5. Izolovaný polypeptid lidského proteinu C podle nároku 1, který je aktivovaný.
6. 6. Způsob léčení trombotických poruch, vaskulárních okluzivních poruch a hyperkoagulačních stavů u pacienta , který potřebuje tuto léčbu, vyznačující se tím, že se tomuto pacientovi podává farmaceuticky účinné množství izolovaného aktivovaného polypeptidu proteinu

   C se zkráceným těžkým řetězcem podle nároku 1.
7. 7. Vektor obsahující nukleovou kyselinu podle nároku

   2 .
8. 8. Hostitelská buňka, vyznačující se tím, že obsahuje izolovanou nukleovou kyselinu podle nároku 2.