CZ303199A3 - Deleční mutanty faktoru X a jejich analogy - Google Patents

Description

#&cimvSeie6ka advokát ISO do PMíit 2, Háková 2

‘ J

DELECNI MUTANTY FAKTORU X A JEJICH ANALOGY t

Oblast techniky “ ‘ " " “

Tento vynález sé týká analogů faktoru ΧΔ s jednou delecí aminokyselin Argl80 až Arg234 a s jednou modifikací v oblasti aminokyselinové sekyence mezi Glyl73 až Argl79, preparátů obsahujících analogy faktoru ΧΔ podle tohoto vynálezu nebo analogy faktoru Xa a rovněž postupu přípravy analogů faktoru ΧΔ podle tohoto vynálezu.

Dosavadní stav techniky

Po inicializaci procesu srážení krve probíhá srážecí kaskáda postupnou aktivací různých proenzymů (zymogenů), které jsou přítomny v krvi v aktivní formě serinpřoteas. K nim patří m.j. faktor XlI/XIIa, faktor ΧΪ/XIa, faktor IX/IXa, faktor X/Xa, faktor VlI/VIIa a prothrombin/throm-bín. Většina těchto enzymů je ve svém fyziologickém stavu aktivní pouze tehdy, jsou-li tyto enzymy asociovány v komplexu na membránovém povrchu. Rady těchto procesů se účastní i Ca-ionty. Srážení krve probíhá buď vnitřní dráhou, při níž jsou všechny proteinové komponenty v krvi obsaženy, nebo vnější dráhou, při níž má rozhodující úlohu tkáňový faktor. K uzavření rány nakonec dojde rozštěpením fibrinogenu na fibrin působením thrombinu.

Aktivaci prothrombinu na thrombin způsobuje prothrom-binasový komplex. Thrombin je důležitý enzym, který může působit jako prokoagulant i jako antikoagulant. Prothrombi-nasový komplex, v němž se uplatňují m.j. faktor Va (jako kofaktor) a faktor Xa (jako serinproteasa), spouští

asociaci,v která je závislá na přítomnosti Ca na povrchu *fosfolipidů. Uvádí se, že faktor Xa přitom působí jako katalytická komponenta prothrombinasového komplexu.

Faktor X (Stuart-Prowerův faktor) je koagulační glyko-protein závislý na vitaminu K, který je možno aktivovat vnitřní nebo vnější dráhou kaskády srážení krve. Primární ‘ produkt translace faktoru X (pre-pro-FX) obsahuje 488 v * aminokyselin a je syntetizován v játrech nebo lidskými i* _ jaterními buňkami nejprve jako 75 kD prekurzorový protein s jedním řetězcem. V plazmě se faktor X vyskytuje převážně ve formě molekuly se dvěma řetězci (Fair a spol., 1984,

Blood 64:194-204). V průběhu biosyntézy dojde pp odštěpení pre-sekvence působením signálpeptidasy (mezi, Ser23/Leu24) a propept i du (mezi Arg40/Ala41) u molekuly faktoru.^X s jedním řetězcem po přeměně a odstranění tripeptidu Argl80-Lysl81-Argl82 k přechodu na formu se dvěma řetězci, skládaj ící se z čca 22 kD lehkého řetězce a cca 50 kD těžkého řetězce, které jsou navzájem spojeny disulfidickým můstkem a k rozštěpení této molekuly (Obr.l). Faktor X proto cirkuluje v plazmě jako molekula se dvěma řetězci. Při procesu srážení krve se faktor X konvertuje z inaktivního zymogenu na aktivní proteasový faktor Xa působením limitované proteolysy, přičemž aktivace faktoru X na faktor Xa může probíhat v jednom ze dvou komplexů vázaných na membránu: ve vnějším komplexu faktor Vlla/tkáňový faktor nebo ve vnitřním komplexu faktor VlIIa-faktor IXa-fosfolipid-Ca, tzv. "tenasovém komplexu" (Mertens a spol., 1980, Biochem. J. 185:647-658). Proteolytické štěpení mezi aminokyselinami Arg234/IIe235 - 3 -

vede k uvolnění aktivačního peptidu o délce 52 aminokyselin z N-konce těžkého řetězce a tím ke tvorbě aktivního enzymu, faktoru Xa. Katalytické centrum faktoru Xa je umístěno v těžkém řetězci.

Aktivace prostřednictvím vnějšího komplexu faktor VIIa-TF vede ke tvorbě.faktoru Xaa (35 kD) a faktoru Xa0 (31 kD), přičemž vedle nepatrných koncentrací faktoru Vila v komplexu se vyskytuje i polypeptid 42 (kD). Při-tvorbě faktoru Xaa dochází ke štěpení u Arg234/IIe235 v těžkém řetězci, což znamená aktivaci faktoru X na faktor Xa. Výskyt faktoru Xap je zřejmě způsoben autokatalytickým štěpením u Arg469/Gly470 u C-konce těžkého řetězce faktoru Xaa a odštěpením 4,5 kD-peptidu. Faktor Xaβ vykazuje stejně jako faktor Xaa katalytickou aktivitu. Bylo však prokázáno, že štěpením faktoru Xaa na faktor Xap vzniká plasminogen-re-ceptorové vazné místo a že faktor Xap vykazuje případně i fibrinolytickou aktivitu, rešp. že se podílí na fibri-nolýze jako kofaktor. Přeměna faktoru Xaa na faktor Xap je však pomalejší než tvorba thrombinu, což zabraňuje iniciaci fibrinolysy před vytvořením krevní sraženiny (Pryzdial a spol., 1996, J.Biol.Chem. 271:16614-16620; Pryzdial a spol., 1996, J.Biol.Chem. 271:16621-16626). Při přeměně na C-konci těžkého řetězce mezi Arg469/Gly470 bez předchozí úpravy mezi Arg234/IIe235 vzniká 42 kD-polypeptid. Tento meziprodukt nevykazuje žádnou katalytickou aktivitu stejně jako fragment faktoru Xat, který vzniká proteolysou u Lys370 (Mertens a spol., 1980, J.Biol. Chem. 185:647-658Pryzdial a spol., 1996, J.Biol.Chem. 271:16614-16620).

Aktivace faktoru X vnitřní dráhou je katalyzována - 4 • ♦' • · komplexem faktor IXa-faktor Vlila. Při této aktivaci se získají stejné reakční produkty, faktor Χηβ se však získá ve vyšším množství než ostatní procesní produkty faktoru X (J es ty a spol., 1074,- -J\ Biol. Chem. 249 : 5614) .

In vitro je možno faktor X aktivovat např. působením Russelova Viper Venomu (RW) nebo působením trypsinu (Bajaj a spol., 1073, J.Biol.Chem. 248:7729-7741) nebo pomocí čištěných fyziologických aktivátorů, jako jsou komplex FVIIa/TF nebo komplex faktor IXa/faktor Vlila (Mertens a spol., 1980, J.Biol.Chem. 185:647-658).

Komerčně dostupné produkty faktoru X z plazmy obsahují většinou směs faktoru Xaa a faktoru Xap, přičemž po aktivaci faktoru X na faktor Xa vzniká především faktor Xáa, který se při autokatalytickém procesu opět štěpí'na faktor Xap.

Aby bylo možno získat jednotný produkt faktoru Xa s vyšší molekulární integritou, byla v patejxtu EP 0 651 054 navržena aktivace faktoru X působením RW po delší dobu tak, aby vzniklý konečný produkt obsahoval v podstatě pouze faktor Xaβ. Vedlejší produkty, a to např. faktor Xaa nebo proteáza byly nakonec odstraněny několikanásobnou chromato-grafií.

Byla provedena izolace a charakterizace cDNA faktoru X (Leytus a spol., 1984, Proč.Nati.Acad,.Sci., USA, 82: 3699-3702; Fung a spol., 1985, Proč.Nati.Acad,.Sci., USA, 82:3591-3595). Lidský faktor X byl exprimován in vitro v různých typech buněk, jako např. v lidských embryonálních ledvinových buňkách nebo v CHO-buňkách (Rudolph a spol., 1997, Prot.Expr.Purif.10: 373-378, Volf a spol., 1991, J.Biol.Chem. 266:13726-13730). Bylo však zjištěno, že při rekombinační expresi lidského faktoru X byla úprava na pozici Arg40/Ala41 na rozdíl od provedení in vivo neúčinná a že vznikaly různé N-koncě na lehkém řetězci faktoru X (Volf a.‘spol. , 1991," J . Biol. Chem 266:13726-13730) . Rěkombi-" novaný faktor X (rFX) byl pomocí RVV aktivován iň vitro na rfaktor Xa (rFXa) nebo byl rFXa přímo exprimován, přičemž byl aktivační peptid deletován v oblasti aminokyseliny 183 až aminokyseliny 234 a nahrazen tripeptidem, aby bylo možno provést přeměnu bezprostředně v rFXa-formě s dvojitým řetězcem. Vyčištěný rFX byl přeměněn asi ze 70 % na lehký a těžký řetězec, zatímco zbývajících 30 % tvořil rFX s jedním řetězcem se 75 kD. Přímá exprese rFXa sice vedla ke tvorbě aktivního faktoru Xa, avšak zároveň vznikaly i inak-tivní intermediáty. Volf a spol. (1991, J.Biol.Chem. 266: 13726-13730) zjistili kromě toho i sníženou aktivitu rekom-binovaného faktoru X, která byla způsobena horší aktivova- * v . telností rFX působením RVV a rovněž populací inaktivních proteinů a polypeptidů z molekul prekurzorů s jedním, řetězcem. Tito autoři zjistili zejména Vysokou nestabilitu rFXa při expresi rekombinovanými buňkami, což vysvětlují vysokou rychlostí autoproteolýzy.

Aby bylo možno sledovat funkci C-terminálních polypeptidů faktoru Xaa, zavedli Eby a spol. (1992, Blood 80 (Suppl.1):1214A) stop-kodon do sekvence faktoru X na pozici Gly430. Nezjistili však žádný rozdíl mezi rychlostí aktivace faktoru Xa (FXaa) s β-peptidem nebo delečního mutantu bez β-peptidu (FXaβ).

Faktor Xa je-důležitou součástí prothrombinasového komplexu a proto se uvádí jako primární mediátor rychlého zastavení krvácení, který by byl vhodný pro léčbu pacientů s poruchami srážení krve, jako např. při výskytu hemofilie. • · - 6 ···· ♦ ·♦·

Zejména léčba hemofiliků s deficitem faktoru VIII nebo faktoru IX , prováděná koncentráty faktorů vyrobených z plazmy by mohla být-při dlouhodobné terapii .komplikována tvorbou inhibujícich protilátek proti těmto faktorům. Proto byla pro léčbu pacientů trpících hemofilií vyvinuta řada alternativ s použitím faktorů s bypassovou aktivitou. Bylo navrženo použití koncentrátu prothrombinového komplexu, částečně aktivovaného prothrombinasového komplexu (APPC), faktoru Vila nebo FEIBA. Komerčními preparáty s faktor VIII-bypassovou aktivitou (FEIBA) jsou například FEIBA nebo Autoplex. Preparát FEIBA obsahuje přibližně stejné jednotky faktoru II, faktoru VII, faktoru IX, faktoru X a FEIBA, nepatrná množství faktoru VIII a faktoru V, a dále stopová množství aktivovaných koagulačních faktorů jako jsou thrombin a faktor Xa resp. faktor s áktivitou odpovídající faktoru X (Elsinger, 1982, Activated Prothrombin Complex Concentrates. Ed.Maruiani, Ruso, Mandelli, . str. 77-87). * Elsinger poukazuje zejména na význam aktivity FEIBA, která je podobná aktivitě faktoru Xa. Bypassová aktivita faktoru VIII byla prokázána Gilesem a spol. (1988, British J.Haema- tology 9:491-497) u kombinace čištěného faktoru Xa a fosfo-lipidů v modelu na zvířatech. V řadě aplikačních oblastí je proto velká potřeba faktoru X/Xa nebo proteinů podobných faktoru X/Xa buď samotných, nebo jako součást koagulačních komplexů pro zastavení krvácení.

Doba poločasu účinnosti (Halbwertszeit) faktoru Xa je v porovnání se zymogenem jak v prostředí in vivo, tak i in vitro silně snížena. Tak např. je možno faktor X v glycero-lu přechovávat po dobu 18 měsíců ve stabilním stavu, zatímco .- 7 faktor Xa je za stejných podmínek stálý pouze 5 měsíců (Bajaj a spol., 1973', J.Biol.Chem 248:7729-2241) resp. v glycerolu při 4 dojde po 8 měsících ke snížení aktivity o- více než 60 % (Teng a spol..., 1981, Thrombosis Res. 22:. _ 213-220). Doba poločasu účinnosti faktoru Xa v šeru je pouze 30 sekund.

Vzhledem k nestálosti faktoru Xa bylo navrženo podávání preparátů obsahujících faktor X (US 4,501,731). Při krváceních ohrožujících život, zejména u hemofiliků, je však podávání faktoru X neúčinné, poněvadž při nedostatku účinného "tenasového komplexu" při vnitřním srážení krve nedojde k dostatečné aktivaci faktoru X na faktor Xa a aktivace přes vnější dráhu probíhá často příliš pomalu, takže nelze dosáhnout rychlého působení. Kromě toho hemofilici mají dostatek faktoru X, ten však vykazuje ve srovnání s faktorem Xa tisíckrát menší prothrombinasovou akťivitn. V těchto případech je žádoucí podávat aktivovaný faktor Xa přímo, případné v kombinaci s fosfolipidy, jak uvedli Giles a spol. (1988, British.J.Haematology 9:491-497) nebo s jinými koagulačními činidly, případně s činidly s faktor VIII-bypassovou aktivitou . Při přípravě faktoru Xa z faktoru X se aktivace doposud provádí převážně nefyziologickými aktivátory živočišného původu, jako jsou RVV nebo trypsin, přičemž však musí být absolutně zajištěno, aby konečný produkt neobsahoval žádnou z těchto proteas. Jak bylo uvedeno již dříve, vzniká při aktivaci faktoru X na faktor Xa řada intermediátů, z nichž některé jsou inaktivní (Bajaj a spol., 1973, J.Biol.Chem 248:7729-2241; Mertens a spol., 1980, J.Biol.Chem. 185: 647-658). Přítomnost těchto intermediátů způsobuje snížení specifické aktivity tohoto produktu, některé intermediáty mohou dokonce na aktivní serinproteasy působit antagonisticky. Příprava jednotného čistého produktu s vysokou specifickou aktivitou proto při použití běžných metod vyžaduje'nákladné postupy aktivace a zdlouhavé.chromato-grafické čištění. * ^

Podstata vynálezu Předmětem předloženého vynálezu je proto získání takového preparátu, který by obsahoval polypeptid s aktivitou faktoru X/Xa, který by měl vysokou stabilitu, a při jehož získávání by se při aktivaci na faktor Xa nemusely používat běžné proteasy, zejména živočišného původu, jako jsou např. RVV nebo trypsin. Dalším předmětem je příprava farmaceutického preparátu s faktor VIII-bypassovou aktivitou.

Tento úkol byl podle předloženého vynálezu vyřešen tak, že byl získán analog faktoru X s delecí aminokyselin . Argl80 až Arg234 z aminokyselinové sekvence faktoru X a dále byla provedena modifikace tohoto delečního mutantu faktoru X v oblasti aminokyselinové sekvence mezi Glyl73 a Argl79. Delecí aminokyselinové sekvence Argl82 až Arg234 byl dele-tován jak tripeptid Argl80 až Argl82, tak i aktivační peptid Serl83 až Arg234 a došlo tak k přímému spojení mezi lehkým a těžkým řetězcem faktoru X a aminokyselinami Argl79 a Ile235. Takto získaná sekvence však neobsahuje žádné místo přirozeného štěpení pro proteasy. Modifikací v oblasti aminokyselinové sekvence faktoru X mezi aminokyselinami Glyl73 a Argl79 a případně Ile235 se získá deleční mutant faktoru X podle vynálezu, který obsahuje nové rozpoznávací resp. reakční místo (Prozessierungsstelle), které se dosud v této pozici na polypeptidu nevyskytovalo, pro působení proteasy, která v tomto místě polypeptid běžně neštěpí. Tato modifikace zahrnuje přitom alespoň výměnu minimálně jedné aminokyseliny mezi pozicemi Glyl73 a Argl79 a případně _IIe23í v aminokyselinové sekvenci faktoru X. Pozice jednotlivých aminokyselin je přitom vztažena na číslování podle sekvence uvedené v obr. 1, která začíná Metl a končí Lys488. U modifikovaného delečního mutantu faktoru X podle tohoto vynálezu bylo pro zjednodušení nomenklatury ponecháno číslování aminokyselin kompletní sekvence faktoru X, dále však je tento modifikovaný deleční mutant faktoru X označován jako analog faktoru ΧΔ

Tato modifikace spočívá v substituci alespoň jedné aminokyseliny nebo v jedné inzerci peptidové sekvence obsahující specifické rozpoznávací místo pro proteasy (Protea-seerkennungsstelle), resp. specifické místo štěpení. Tato modifikace v analogu faktoru ΧΔ je přitom.přednostně taková, že rozpoznávací místo pro proteasy, resp. místo štěpení představuje proteasa ze skupiny endoproteas, jako jsou kexin/Kex2, furin/PACE, PC1/PC3; PC2, PC4, PACE4, LPC/PC7 (jak uvádějí Barr a spol. 1991, Cell 66:1-3 nebo v US patentu US 5,460,950), ze skupiny serinproteas, jako jsou faktor Ha, faktor Vila, faktor IXa, faktor Xlla, faktor Xla, faktor X nebo kallikrein, nebo deriváty uvedených pro-teas.

Tato modifikace se volí přednostně tak, aby působením jedné z těchto proteas se získal polypeptid, jehož biologická aktivita odpovídá nativnímu faktoru Xa a jehož aktivita je stejná jako aktivita faktoru Xa. Pro dosažení optimální úpravy může být v některých případech nezbytné vyměnit navíc aminokyselinu IIe235. Nl·^-terminální aminokyselina isoleucin na těžkém řetězci by měla však být pokud možno po 9···

• · ··* « ·

·· ·· • #· · • · 9 · • · · · · · aktivaci zachována, poněvadž isoleucin je zástupcem aminokyselin, které máji při tvorbě míst pro vázání substrátu (Substratbindungstasche) důležitou funkci (Vatzke a spol., ť- — . 1995·, Molecular.Basis of Thrombosis and Hemostasis, ed.

Katherine High and Harold Roberts). Analogy faktoru XA « podle tohoto vynálezu vykazují v porovnání s nativní sek vencí faktoru X určitý strukturální rozdíl zejména ve složení aminokyselin, po aktivaci však mají aktivitu srovná-telnou s aktivitou přírodního faktoru X resp. faktoru Xa.

V V tomto vynálezu jsou uvedeny příklady řady analogů faktoru ΧΔ , u nichž byla provedena delece a kromě toho modifikace mezi Glyl73 a Argl79, případně IIe235. Tyto modifikace mohou být provedeny na jednom nebo několika místech v oblasti mezi aminokyselinami Glyl73 a Argl79, případně IIe235, vztaženo na sekvenci faktoru X s číslováním Metl až Lys488 podle obr.1. Substituce aminokyselin mohou být provedeny v místě IIe235 (Rl), Argl79, Glul78 (R2),

Leul77 (R3) , Thrl76 (R4) , Glnl75 (R5) a Lysl74 '(R6) , přičemž však přednostně zůstává Argl79 nezměněn.

Analogy faktoru ΧΔ podle tohoto vynálezu obsahují přednostně sekvenci faktoru X

Glyl73-R6-R5-R4-R3-R2-Argl79-Rl, kde Rl=IIe, Val, Ala, Ser nebo Thr, R2=Glu, Thr, Pro, Gly, Lys nebo Arg; R3=Leu, Phe, Lys, Met, Gin, Ser, Val, Arg nebo Pro; R4= Thr, Asn, Asp,

Ile, Ser, Pro, Arg nebo Lys; R5= Asn, Lys, Ser, Glu, Gin,

Ala, His nebo Arg a R6= Arg, Asp, Phe, Thr, Leu nebo Ser. Výhodné formy provedení analogů faktoru X podle tohoto vynálezu jsou analogy faktoru X s modifikací a) Rl=Ile, R2=Thr, R3=Leu, R4=Asn a případně R5=Asn a/anebo - 11 ········ ·· ·· ·· » · ♦ « » · · i ·· ·· ♦· • · · · • · · · ♦ ·· ··· • · ·· *· R6=Asp a upravené (prozessiert) faktorem Vila nebo faktorem IXa; b) Rl=,Val, . R2=Thr, _,R3=Phe, ,,R4=Asp a pří padně R5=Asn a/anebo R6=Pbe a/anebo Rl=IIe nebo Val (obr.2A) a uplavené faktorem Xla; c) Rl=IIe nebo Val, R2=Phe, R3=Lys, R4=IIe a případně R5=Lys a/anebo R6=Thr (obr.2C) nebo Rl=IIe, Ř2=Thr, R3=Ser, R4=Thr a případně R5=Lys a/anebo R6=Thr (Obr.21) a upravené faktorem XIIa; d) Rl=IIe nebo Val, R2=Thr, R3=Met, R4=Ser a případně R5=Ser a/anebo R6=Leu (Obr. 2D) a upravené kallikreinem; e) Rl=IIe, R2=Gly, R3=Gln, R4=Pro a případně R5=Lys a/anebo R6=Ser (0br.2H) nebo Rl=IIe, R2=Gly, R3=Glii, R4=IIe (Obr. 2F) nebo Rl=IIe, R2=Thr, R3=Lys, R4=Met (Obr. 2E) a upravené faktorem Xa; f) Rl=IIe, R2=Lys, R3=Arg, R4=Arg a případně R5=Glu, a/anebo R6=Leu nebo Rl=IIe, R2=Thr, R3=Val, R4=Arg a případně R5=Ala a/anebo R6=Leu nebo Rl=IIe, R2=Arg, R3=Val, R4=Arg a případně R5=Gln, a/anebo R6=Leu nebo Rl=IIe, R2=Arg, R3=Arg, R4=Arg a případně R5= His a/anebo R6=Leu nebo Rl=IIe, R2=Lys, R3=Pro, R4=Arg a případně R5=Asn a/anebo R6=Leu nebo Rl=IIe, R2=Lys, R3=Arg, R4=IIe a případně R5Arg a/anebo R6=Leu nebo Rl=IIe, R2=Lys, R3=Ser a R4=Arg nebo Rl=IIe, R2=Thr, R3=Val a R4=Arg nebo Rl=IIe, R2=Lys,.R3=Leu a R4=Arg (viz obr. 2G), přičemž sekvence uvedené pod f) jsou upravovány bibázickými endoproteasami, jako jsou kexin/Kex2, furin/PACE, PC1/PC3, t £: 12 ·· »* • · · » · . · • · • · ···* *··· ·♦ ·· • · * · • 9 9 9 • · »M • · · ·· ·· ·% ·· * · · ' · • · · · ··♦ 9·· • · «· #· PC2, PC4, PACE4, LPC/PC7 nebo derivátem těchto proteas.

Možný výběr modifikací a složek zaměňujících aminoky- , «· . .. _ . seliný (Aminosáure-austauscher), ktexé vedou ke změněné, pro- teasové specifitě je uveden v obr. 2. «Ρ

Tyto modifikace mohou být prováděny například řízenou mutagenesí in vitro nebo PCR nebo jinými genově-technickými metodami podle současného stavu techniky, které jsou vhodné pro provádění specifických změn DNA-sekvence pro dosažení (9 požadované výměny aminokyselin.

Aktivace analogů faktoru ΧΔ podle tohoto vynálezu na analogy faktoru Xa se provádí podle tohoto vynálezu výhodně proteasou ze skupiny endoproteas, jako jsou kexin/Kex2, furin/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE4, LPC/PC7, ze skupiny serinproteas, jako jsou faktor ITa, faktor Vila, faktor IXa, faktor XIla, faktor Xla, faktor X nebo kallikrein, nebo deriváty těchto proteas.

Analogy faktoru ΧΔ podle tohoto vynálezu jsou poly-peptidy s jednoduchým řetězcem v enzymaticky inaktivní for- mě. Aktivní analogy faktoru ΧΔ se získají až po rozštěpení proteasou na formu se dvěma řetězci. Tato modifikace tudíž umožňuje aktivaci inaktivního polypeptidického analogu faktoru ΧΔ na aktivní formu se dvěma řetězci.

Jedním z problémů při přípravě aktivního faktoru Xa je nestabilita tohoto faktoru, poněvadž při autokatalýze vznikají kromě faktoru.Xaa a faktoru Xap i jiné neaktivní inter-mediáty.

Pro přípravu v podstatě intaktních molekul aktivního 13 t · 4 · • · • 4 • ♦ ···· ···· • · • Ψ 4 4 ·

faktoru X/Xa resp. molekul podobných aktivnímu faktoru X/Xa je proto žádoucí získávat pouze takové proteiny, které by vedly ke stabilním konečným produktům.

Je známo, že preferované místo štěpení pro "přeměnu faktoru Xaa (FXaa) na faktor Xap (FXa£) je mezi Arg469/Gly470. Jak uvádějí Eby a spol. (1992, Blood, Vol. 80, Suppl.l, 1214) byl kromě prominentního karboxytermi-nálního peptidu (aminokyselinové zbytky 476-487) faktoru X nalezen i další kratší peptid (aminokyselinové zbytky 464 až 477), který vzniká autokatalýzou z faktoru Xaa. Aby bylo možno provést požadovanou úpravu intaktního faktoru X na v podstatě aktivní faktor Xa bez vzniku inaktivních inter-mediátů při této úpravě, vykazují analogy faktoru ΧΔ podle tohoto vynálezu případné další modifikace.

Analogy faktoru ΧΔ podle tohoto vynálezu'se vyznačují tím, že vykazují ve zvláštní formě svého provedení i další modifikaci v C-koncové části aminokyselinové sekvence faktoru X

Jedna z forem provedení se vyznačuje tím, že analog faktoru ΧΔ výše popsaného druhu je intaktní β-peptid (FXA a). Analogy faktoru XA podle tohoto vynálezu mají přitom provedenou modifikaci zejména v oblasti C-koncového β-peptidického místa štěpení (Betapeptidspaltstelle), která zabraňuje, aby po aktivaci faktoru XA na analog faktoru Xa došlo k odštěpení β-peptidu z faktoru X. Tak byl získán faktor Xa, který je možno izolovat až ze 100 % ve formě intaktní molekuly faktoru Xaa.

Tuto modifikaci je možno provést mutací, delecí nebo inzercí v oblasti aminokyselinové sekvence faktoru X mezi - 14 - 14 ·· ···· ···· ··«· • · ···· ···· ···· ···♦ ·♦ ·· ·· ·· aminokyselinami v místě Arg469 a Ser476 a případně Lys370. Preferována je však taková substituce aminokyselin, která zabrání' tomu, aby při výměně aminokyselin nedošlo ke změně pros.totoyého uspořádání „ polypeptidu, což .by mohlo-dále vést - -ke změně struktury a případně i funkce a aktivity daného proteinu.

Jeden způsob provedení se vyznačuje tím, že u analogů faktoru ΧΔ podle tohoto vynálezu je provedena záměna jedné aminokyseliny na místě Arg469 a/anebo Gly470, přičemž Arg469 je přednostně zaměňován Lys, His nebo Ile a Gly470 je přednostně zaměňován Ser, Ala, Val nebo Thr.

Analogy faktoru ΧΔ podle tohoto vynálezu mohou obsahovat kromě mutace na pozici Arg469 a/anebo Gly470 další mutaci na pozici Lys370 a/anebo Lys475 a/anebo Ser476. Substitucí aminokyselin na této.(těchto) pozici(ích) se zabrání přeměně analogů faktoru Xáa na analogy' faktoru Xaβ resp. na C-koncové analogy faktoru Xa, poněvadž přirozeně se vyskytující sekvence přeměny (přeměn) je (jsou) modifikována (-y) tak, že nemůže dojít k případnému autokatalytickému odštěpení karboxyterminálního peptidu.

Jiný způsob provedení se vyznačuje tím, že je u analogů faktoru ΧΔ podle tohoto vynálezu provedena delece karboxyterminálního β-peptidu (FXA β). Takovýto analog faktoru X je možno připravit tak, že cDNA pro kódování analogu faktoru XA. se exprimuje v rekombinantním expresním systému, přičemž se klonují pouze ty sekvence, které jsou kódovány pro aminokyseliny Metl až ASrgl79/IIe235 až Arg469.

Další způsob provedení se vyznačuje tím, že analogy faktoru ΧΔ podle tohoto vynálezu obsahují translační stop-signál v C-terminální části sekvence faktoru X. Tento translační stop-signál je přitom přednostně na pozici, která následuje za C-terminální aminokyselinou vznikající při přirozeném rekačním^průběhu. Tento translační stop-signál je proto přednostně na pozici aminokyseliny 470 v sekvenci faktoru X, přičemž koncový Arg469 ve faktoru ΧΔ β zůstává zachován. Přitom kódující kodon GGC pro aminokyselinu Gly470 nahrazuje TAA, TAG nebo TGA.

Další aspekt tohoto vynálezu se týká analogů faktoru ΧΔ , které se aktivují působením příslušné proteasy in vitro na analogy faktoru Xa, t.zn. na aktivované analogy faktoru ΧΔ. V závislosti na použitém a aktivovaném analogu faktoru XA se získá analog faktoru XaA , který má na C-konci lehkého řetězce provedenou odpovídající modifikaci aminokyselin která se liší od přirozeného faktoru Xa.. Tyto modifikace jsou však podle tohoto.vynálezu voleny tak, aby neovlivňovaly biologickou aktivitu.

Jestliže takovýto analog faktoru X zahrnuje případně ještě translační stop-signál v C-koncové části β-peptidu, získají se modifikované molekuly faktoru Xaβ. Jestliže se však použije analog faktoru X, tato modifikace (tyto modifikace) β-peptidické sekvence vede (vedou) k tomu, že se β-peptid neodštěpí, takže analog faktoru Xaa s provedenou záměnou aminokyselin na C-konci molekuly zůstane zachován.

Analogy faktoru ΧΔ podle tohoto vynálezu se vyznačuj i výhradně takovými modifikacemi, které mění specificitu při aktivaci, avšak aktivitu významně neovlivňují. To znamená, že se získávají vždy biologicky i funkčně aktivní molekuly faktoru Xa resp. analogů faktoru Xa. - 16 • · · · • · · · • 9 · · • 9 · · • · · ···· 9991

Pro aktivaci in vitro je možno volit proteasu ze skupiny endoproteas, jako jsou kexin/Kex2, furin/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE4, LPC/PC7, ze skupiny serinproteas, jako~jsou faktor Ha, , faktor Vila, faktor IXa; , faktor XIIa, faktor Xla, faktor X nebo kallikrein, nebo derivát těchto proteas. V rámci tohoto vynálezu je možno použit jakoukoli proteasu s výjimkou RVV nebo trypsinu, která je vhodná pro přeměnu analogů faktoru ΧΔ na analogy faktoru Xa.

Volf a spol. (1991, J.Biol.Chem. 266:13726-137309) sice uvádějí, že endopeptidasa jako je Kex2, furin nebo PÁCE se může podílet na tvorbě delečních mutantů faktoru Xa, v žádném případě však tito autoři neuvádějí údaje o vlivu těchto proteas při přípravě faktoru X. V patentu US 5,669,950 je popsána rekombinantní příprava PÁCE a použití proteasy pro zlepšenou tvorbu proteinů závislých na vitaminu K. V řadě výčtů jiných krevních faktorů je uveden i faktor X, u tohoto údaje však chybí ověřující data. V rámci tohoto vynálezu bylo poprvé jednoznačně prokázáno, že jednou z proteas nezbytných pro proces zrání faktoru X je bibázická endoproteasa, zejména endogenně se vyskytující furin. V prostředí in vivo zajišťuje tato endoproteasa především štěpení molekuly faktoru X s jedním řetězcem na zralou formu skládající se z těžkého a lehkého řetězce. V prostředí in vitro zajišťuje tato endoproteasa kromě toho i odštěpení pro-peptidové sekvence faktoru X (příklad 2).

Podle jednoho zvláštního způsobu provedení se připraví analog faktoru X Δ , který existuje přednostně v čištěném stavu ve formě molekuly s jedním řetězcem. Analogy faktoru X Δ, které v modifikované oblasti obsahují štěpné místo pro • · ·· ·« · · · · ·* » · · « ···· · I 9 · • · ···· * · · · • · · 9 9 9·9 « 999 999 Λ η · · · · · · · J. / —' #999 ···· 99 Μ 99 ·· proteasy které se v rekombinantních buňkách nevyskytuj e, se po expresi získají ve formě molekul s jedním řetězcem. Molekuly faktoru ΧΔ s jedním řetězcem se vyznačují zejména vy-sok-ou stabilitou-a integritou molekul. Dosud nebylo možno * ižolovat inaktivní molekuly faktoru ΧΔ s jednímřetězcem v čisté formě, poněvadž v rekombinantních buňkách se ve faktoru Xa vytvářela řada dalších i inaktivních intermediátů (Volf a spol., 1991, J.Biol.Chem 266:13726-13730). Izolovaný analog faktoru ΧΔ s jedním řetězcem je možno specifickým postupem aktivovat přímo na formu analogu faktoru Xa se dvěma řetězci. Tato aktivace probíhá tak, že dojde ke styku jednořetězcové molekuly faktoru ΧΔ se štěpnou proteasou, která se nachází v aktivovaném místě analogu faktoru XA . Jestliže dojde k expresi jednoho analogu faktoru ΧΔ s jedním furinovým aktivačním místem v jedné furin-deficitní buňce, je možno izolovat analog faktoru ΧΔ v jednóřetěz-cové formě a stykem s bibázickou proteasou, jako je furin/PACE nebo Kex2, je možno tento analog převést na aktivní analog faktoru ΧΔ a se dvěma řetězci. Analogy faktoru ΧΔ s jedním reakčním místem pro jednu serinproteasu nebo kallikrein je možno izolovat i ve furin-exprimujicích buňkách ve formě jednořetězcových molekul, které je možno pomocí serinproteasy převést na aktivní analog faktoru Xa.

Takto získaný analog faktoru Xa vykazuje díky selektivní a řízené přípravě vysokou stabilitu a strukturní integritu. Zvláště důležité je, že neobsahuje inaktivní intermediáty analogů faktoru X/Xa a produkty autoproteoly-tického odbourávání.

Analogy faktoru ΧΔ podle tohoto vynálezu je možno podle předloženého vynálezu získat jak ve formě faktoru ΧΔ a s intaktním β-peptidem, tak i ve formě analogů faktoru 18

• · ···· ····

ΧΔ s delecí tohoto β-peptidu.

Další aspekt tohoto vynálezu se týká rekombinantní DNA kódované pro analogy., faktoru, ΧΔ podle tohoto, vynálezu ....Re- . kombinantni DNA se získá po expresi v analogu faktoru ΧΔ s aminokyselinovou sekvencí odpovídající lidskému faktoru X, až na jednu delecí aminokyselin od Argl80 až Arg234 a jednu modifikaci, která umožňuje přeměnu a aktivaci na aktivní formu analogu faktoru Xa jak s intaktním, tak i s deletova-ným β-peptidem.

Další aspekt tohoto vynálezu se týká preparátu zahrnujícího čištěný analog faktoru ΧΔ s jednou delecí aminokyselin od Argl80 do Arg234 a s jednou modifikací aminokyselin v oblasti mezi Glyl73 a Ařgl79 a případně IIe235. Touto modifikací se získá nové rozpoznávací resp. štěpné místo, které se na této pozici polypeptidu v přírodě nevyskytuje, pro proteázu, která polypeptid v tomto místě běžně nepřemě-ňuje. Tento preparát může přitom být čištěný preparát obsahující jednořetězcový analog faktoru ΧΔ , přičemž poly-peptidy se získají bud’ z kultivovaného buněčného systému po izolaci ze supernatantu buněčné kultury nebo z extraktu buněčné kultury. Předčištěný rekombinovaný analog faktoru ΧΔ získaný z kultivovaného buněčného systému je možno dále čistit známými postupy odpovídajícími současnému stavu techniky. K tomu jsou vhodné zejména chromátografické metody jako je gelová filtrace, chromatografie na iontoměničích nebo afinitní chromatografie.

Podle jednoho provedení obsahuje získaný preparát analog faktoru ΧΔ podle tohoto vynálezu ve formě molekuly s jedním řetězcem v enzymaticky inaktivní formě, přičemž tento analog faktoru ΧΔ má čistotu minimálně 80 %, výhod- - 19 - ·· ., ·· ·* ·· ·· ·· • · · · · · · # · «·· • · · · t · · · · · • * · · · *·· · ··· ··· • · · · · · · ···· ···· ·· ·· ·· ·· ně minimálně 90 %, obzvláště preferována je čistota 95 % a tento vyčištěný preparát neobsahuje žádné inaktivní proteolytické. intermediáty vzniklé z analogu faktoru X/Xa.

Podle zvláštního aspektu obsahuje tento preparát jed-nořetězcový analog-faktoru ΧΔ s modifikací, která umožňuje aktivaci na analogy faktoru Xa působením proteasy ze skupiny bibázických endoproteas, jako jsou kexin/Kex2, furin/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PÁCE 4, LPC/PC7, ze skupiny serinproteas, jako jsou faktor Ha, faktor Vila, faktor IXa, faktor Xlla, faktor Xla, faktor X nebo kallikrein, nebo derivát těchto proteas. Aktivace probíhá přitom při kontaktu analogu faktoru ΧΔ s odpovídající proteasou, která štěpí modifikovanou sekvenci, přičemž se získá analog faktoru Xa. V preparátu podle tohoto vynálezu * se může analog fak- , f toru ΧΔ vyskytovat jako faktor' ΧΔ a (FXA a) s intaktním β-peptidem nebo s delecí β-peptidu jako faktor ΧΔ'β nebo s jinou C-terminální delecí.

Podle dalšího způsobu provedení obsahují preparáty analogů faktoru ΧΔ podle tohoto vynálezu přednostně jedno-řetězcové molekuly v izolované formě. Přitom se získávají na příklad rekombinantní molekuly analogů faktoru ΧΔ s jedním řetězcem s modifikací, která umožňuje provést aktivaci na analogy faktoru Xa. Tuto aktivaci analogů faktoru ΧΔ na analogy faktoru Xa je možno provést stykem analogu faktoru X s proteasou vybranou ze skupiny bibázických endoproteas, jako jsou kexin/Kex2, furin/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PÁCE 4, LPC/PC7, ze skupiny serinproteas, jako jsou faktor Ha, faktor Vila, faktor IXa, faktor Xlla, faktor Xla, faktor Xa nebo kallikrein, nebo derivát těchto proteas. Tyto proteasy mohou být přitom imobilizovány na nosiči. - 20

·· ·· • · • · · · · · . ···♦ ···· ·· ·· ·« ··

Preparáty podle tohoto vynálezu se mohou použít jako výchozí materiál pro přípravu a získávání analogů faktoru

Xa. ,Ve „velkém technologickém měřítku se přitom uvede do .....ť styku preparát obsahující ječinořetězcový analog faktoru ΧΔ s případně imobilizovanou proteasou za podmínek umožňujících optimální aktivaci analogů faktoru XA na analogy faktoru Xa, takže se získají analogy faktoru Xa. Takto získané analogy faktoru Xa je možno nakonec vyčistit pomocí všeobecně známých metod a získat tak farmaceutický preparát s definovanou aktivitou faktoru Xa.

Podle dalšího aspektu tohoto vynálezu se připraví preparát obsahující analog faktoru Xa s vysokou stabilitou a strukturální integritou, který neobsahuje inaktivní intermediáty analogů faktoru X/Xa, ani autoprotolytické produkty odbourávání a který se získá v takové formě, že umožňuje provést aktivaci na dříve popsaný analog faktoru ΧΔ a připravit tak odpovídající preparát...

Podle zvláštního provedení zahrnuje tento preparát obsahující analogy faktoru XA s jedním nebo dvěma řetězci a fyziologicky přijatelný nosič a je možno z něj případně připravit farmaceutický preparát. Tuto přípravu je možno provést běžným způsobem smísením s přídavkem pufru obsahujícího soli jako jsou NaCl, CaCl2 a aminokyseliny jako je glycin a/anebo lysin při pH v rozmezí 6 až 8, a získat tak farmaceutický preparát. Vyčištěné preparáty obsahující analog faktoru X je možno připravovat jako hotové roztoky, lyofili-záty nebo hlubokozmrazené produkty skladovatelné až do doby jejich konečného použití. Skladování těchto preparátů se přednostně provádí ve formě lyofilizátu a jejich převedení na opticky čirý roztok se provádí pomocí odpovídajícího rekonstitučního roztoku.

Preparáty podle tohoto vynálezu je možno připravit i v kapaj_né formě nebo ve formě hlubokozmrazené kapaliny.

Preparáty podle tohoto vynálezu jsou obzvláště stabil ni, to' znamená, že je možno je nechat stát v rozpuštěné formě i po delší dobu před jejich použitím. Bylo prokázáno, že u preparátů podle tohoto vynálezu nedošlo k úbytku aktivity ani po několika hodinách až dnech.

Preparáty podle tohoto vynálezu je možno získat ve vhodném zařízení, přednostně v aplikátoru s použitím proteasy vybrané ze skupiny endoproteas, jako jsou kexin/Kex2, furin/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PÁCE 4, LPC/PC7, ze skupiny serinproteas, jako jsou faktor Ha, faktor Vila, faktor IXa, faktor Xlla, faktor Xla, faktor Xa nebo kalli-krein, nebo deriváty těchto proteas. ^ 1

Preparát podle tohoto vynálezu, obsahující analog fak toru ΧΔ v kombinaci s proteasou schopnou aktivovat analog faktoru XA na analog faktoru Xa je možno připravit jako kombinovaný produkt skládající se z nádobky obsahující pro-teasu imobilizovanou na nosiči, případně ve formě miniko-lonky nebo injekční stříkačky s imobilizovanou proteasou a z nádobky obsahující farmaceutický preparát s analogem faktoru ΧΔ . Aktivace analogu faktoru ΧΔ se provede tak, že se např. roztok s analogem faktoru ΧΔ protlačí přes imobilizovanou proteasu. Roztok obsahující analog faktoru ΧΔ se přednostně po dobu skladování preparátu ukládá odděleně od zmobilizované proteasy. Preparát podle tohoto vynálezu může být uložen i ve stejné nádobce jako proteasa, ovšem je třeba, aby obě složky byly odděleny nepropustnou 22

• · ···♦ ·♦·· ♦

membránou, kterou je možno při případném použití snadno odstranit. Tyto roztoky je možno uchovávat i v oddělených ' ' nádobách a smísit je až krátce před jejich použitím.

Ve zvláštním provedení se jako proteasa používá pro\ aktivaci přírodní serinproteasa, která se podílí na přirozeném srážení krve, jako je např. faktor XIIa, který nemusí být před aplikací oddělen od aktivovaného analogu faktoru Xa a může s ním být aplikován společně.

Aktivace analogu faktoru XA na analog faktoru Xa se může provést krátce před přímým použitím, tj. krátce před podáním pacientům. Tuto aktivaci je možno provést stykem s imóbilizovanou proteasou nebo smísením roztoků, obsahujících jednak proteasu a jednak analog faktoru ΧΔ . Je proto možné obě složky uchovávat v oddělených roztocích a smísit je při průtoku vhodným zařízením,· přičemž dojde k aktivaci analogu faktoru ΧΔ na analog faktoru Xa. Pacientu je tak · podávána směs faktoru Xa a další serinproteasy, která vyvolala aktivaci. Přitom je zvláště'třeba dbát na dávkování, poněvaž nadbytečná dávka serinproteasy aktivuje i endogenní faktor X, což může způsobit zkrácení doby koagulace.

Podle výhodné formy způsobu provedení se farmaceutický preparát dodává ve vhodném zařízení, přednostně v aplikáto-ru, buď v kapalné-zmrazené formě nebo v lyofilizované formě. Jako vhodný aplikátor je možno použít dvoukomorovou injekční stříkačku, popsanou v patentech AT 366 916 nebo AT 382 783.

Podle dalšího aspektu tohoto vynálezu obsahuje preparát podle tohoto vynálezu případně jako další složku krevní faktor (Blutfaktor) ve formě zymogenu nebo aktivní serinproteasy. Jako další složky jsou přitom preferovány složky s FEIB-aktivitou. K těmto látkám patří zejména faktor II, faktor VII, faktor IX, faktor VIII, faktor V a/anebo příslušné serinproteasy. Jako další složky mohou být použity i fosfolipidy, Ca-ionty a pod. Podle-zvláštního způsobu provedení podle tohoto vynálezu obsahuje preparát pcdle tohoto vynálezu minimálně jednu další složku s FEIB-aktivitou.

Preparát podle tohoto vynálezu se může dodávat jako farmaceutický preparát s aktivitou faktoru Xa jako jednosložkový preparát nebo v kombinaci s jinými faktory jako vícesložkový preparát. Před zpracováním na farmaceutický preparát se vyčištěný protein podrobuje běžné kontrole kvality a převede se na terapeuticky použitelnou formu. Při rekombinační přípravě je nutno zejména vyčištěný preparát kontrolovat, zda neobsahuje buněčné nukleové kyseliny a nukleové kyseliny pocházející z expresního vektoru, přičemž preferovaným postupem je postup popsaný v EP 0 714 987.

Vzhledem k tomu, že každý biologický materiál může být kontaminován infekčními zárodky, je nutno pro přípravu bezpečného preparátu případně provést inaktivaci virů.

Další aspekt tohoto vynálezu se týká použití preparátu výše uvedeného druhu pro výrobu léčiva. Léčivo obsahující analog faktoru X£ a odpovídající aktivovaný analog faktoru X je vhodné zejména pro léčbu pacientů s poruchami srážení krve, jako jsou hemofilici nebo pacienti, u nichž se vyvinuly inhibující protilátky proti podávaným terapeutickým prostředkům, jako např. proti faktoru VIII nebo faktoru IX.

Další aspekt tohoto vynálezu se týká postupu přípravy 24 24 .· • · ···*····

• ' · ♦ analoga faktoru ΧΔ a preparátu obsahujícího analog faktoru ΧΔ podle tohoto vynálezu. Přitom se kódovací· sekvence pro analog faktoru ΧΔ vloží do vhodného expresního systému a příslušné buňky se transfikují rekombinantní DNA. Výhodně se používají buněčné linie, které exprimují analog faktoru XA . Tyto buňky se kultivují za optimálních podmínek pro expresi genu a analog faktoru X se izoluje buď z extraktu buněčné kultury nebo ze supernatantu buněčné kultury. Rekom-binované molekuly je možno dále čistit pomocí všech známých chromatografických postupů, jako jsou anexová, katexová, afinitní nebo imurioafinitní chromatografie nebo kombinací těchto metod.

Pro přípravu analogu faktoru Xa podle tohoto vynálezu se klonuje úplná cDNA pro kódování faktoru X v expresním vektoru. To se provádí podle všeobecně známých způsobů klonování. Nukleotidová sekvence kódující faktor X se nakonec modifikuje tak, že se kódující sekvence pro aminokyseliny Argl80 až Arg234 vyštěpí a aminokyseliny v oblasti mezi Glyl73 a Argl79, případně IIe235 se změní tak, aby se získaly molekuly faktoru X výše popsaného druhu. To se provádí známými genově-technickými metodami odpovídajícími aktuálnímu stavu techniky, jako jsou řízená mutageneze in vitro, delece sekvencí, např. restrikčním odstraňováním pomocí endonukleas, vkládáním jiných pozměněných sekvencí nebo pomocí PCR. Takto připravené mutanty faktoru XA se potom vkládají a exprimují do expresního systému vhodného pro rekombinantní expresi.

Analogy faktoru ΧΔ podle tohoto vynálezu je možno připravovat i chemickou syntézou.

Analogy faktoru XA se výhodně připravují rekombinační 25

• · • I ··· · *·

expresí. Genově-technickou přípravu je možno provádět pomocí veškerých dostupných expresních systémů, -jako jsou např. permanentní buněčné linie nebo virální expresní systémy. Permanentní buněčné linie se připraví stabilní integrací cizí DNA (Fremd-DNA) do chromozomu hostitelské buňky např. z Věro, MRC5, CHO, BHK, 293, Sk-Hepl, zejména z jaterních ' buněk a buněk ledvin, nebo pomocí episomálního vektorů odvozeného např. z viru*Papilloma. Rovněž je možno použít virální expresní systémy, jako jsou např. Vaccin.ia Virus, Baculovirus nebo retrovirální systémy. Jako buněčné linie je možno obecně použít Věro, MRC5, CHO, BHK, 293, Sk-Hepl, žlázové (Drusen-), jaterní a ledvinové buňky. Jako eukaryotické expresní systémy je možno použít i kvasinky, endogenní žlázy (např.žlázy transgenních zvířat) a jiné buněčné typy. Transgenní zvířata je možno samozřejmě použít i k expresi polypeptidu podle tohoto vynálezu nebo jeho derivátů. Pro expresi rekombinantních proteinů se osvědčily speciální buňky CHO-DHFR (Urlaub a spol., Proč.Nati.Acad. Sci., USA, 77:4216-4220, 1980).

Pro rekombinantní přípravu analogu faktoru ΧΔ podle tohóto vynálezu je možno použít i prokaryotické expresní systémy. K tomu jsou vhodné zejména systémy, které umožňují expresi v E.coli nebo B.subtilis.

Analogy faktoru ΧΔ se exprimují v odpovídajících expresních systémech řízených vhodnými promotory. Při expresi v eukaryontech jsou vhodné všechny známé promotory, jako jsou SV40-, CMV-, RSV-, HSV-, EBV-, β-aktin-, hGH nebo indukovatelné promotory jako jsou např. hsp-, nebo metallothioneinový promotor. Preferována je exprimace analogů faktoru X řízená β-aktinovým promotorem v CHO-DHFR-buňkách. ·· ·· »· ·· . ·· • · '· · • · • · • * • * *· • ♦ • · • ·,♦ ♦ ♦ • • ··· • *··· · · • · · • • • «··· ·· ·· • · ··

Podle jednoho způsobu provedení tohoto vynálezu zahrnuje postup přípravy preparátu podle tohoto vynálezu i „pá.sleduj ící kroky: příprava DNA pro kódování, analogu faktoru ΧΔ , transformace buňky s rekombinantní DNA, exprese analogu faktoru X, případně za přítomnosti proteasy, izolace analogu faktoru X a případné čištění pomocí čhromatografie.

Podle jednoho způsobu provedení tohoto vynálezu se analog faktoru Xa izoluje přímo jako molekula skládající se ze dvou řetězců. Přitom se analog faktoru ΧΔ s modifikací, která umožňuje provedení úpravy pomocí bibázické proteasy jako je furin, ' v buňce exprimuje a analog faktoru ΧΔ se převede na analog faktoru Xa se dvěma řetězci. Jako buňka se používá přednostně buňka, která exprimuje proteasu vhodnou pro provedení této přeměny, jako je bibázická proteasa jako je furin nebo jeho derivát. Pro zvýšení resp. pro zlepšení účinnosti této přeměny je případně^možno buňku modifikovat tak, aby exprimovala proteasu ve zvýšené míře. To je možno provést např. ko-expresí příslušné bibázické endoproteasy, jako je furin/PACE, Kex2 nebo odpovídajícím derivátem.

Analog faktoru ΧΔ podle tohoto vynálezu je možno rovněž exprimovat v buňce, která vykazuje normální nebo suboptimální endogenní koncentraci proteasy pro přeměnu a proto probíhá neúplná přeměna na dvouřetězcovou aktivní formu. Následující přeměna na analogy faktoru Xa probíhá, pokud se secernuje v supernatantu buněčné kultury jednoře-tězcový analog faktoru X jak bylo popsáno dříve ko-kulti-vací s buňkami exprimujícími proteasu nebo při styku s proteasou případně v imobilizovaném stavu. Buněčný su-pernatant je možno přečerpat přes nosnou matrici, na níž je navázána proteasa, přičemž se v eluátu získá dvouřetězcový analog faktoru Xa. • · · '· ♦ t * • • « ·· • ♦ ♦ · • · • · • • • · • · • · • « • ··· • <·'· · ··· ·· '· • • • ·· • ··♦· ···· ♦ · ·♦ ··

Takto získaný analog faktoru Xa je možno nakonec izolovat, vyčistit a až do příštího použití, jako bylo popsáno dříve, případně upravený na farmaceutický preparát a ve stabilizovaném stavu uskladnit. Odborník může bez problémů v závislosti na pokusném uspořádání a reakčních podmínkách provést optimalizaci reakčních podmínek pro přeměnu a aktivaci. Obzvláštní význam přitom má doba styku a rychlost průtoku reakčních složek. Hodnoty průtoku by se měly pohybovat v rozmezí 0,01 ml/min až 1 ml/min. Dalšími důležitými parametry jsou teplota, hodnota pH a eluční podmínky. Po průtoku mohou být analogy faktoru Xa případně dále čištěny selektivními chromatografickými metodami. Provedení tohoto postupu s proteasou navázanou na nosiči je výhodné proto, že uspořádání reakce s použitím nosiče, přednostně v chromatografické koloně, umožňuje provedení dalších čisticích operací. :

Podle jednoho způsobu provedení se aktivace.provádí jedním chromatografickým postupem, přičemž proteasa je imobilizována na nosiči. Čištěný analog faktoru ΧΔ s jedním řetězcem se přitom vede přes matrici, na níž je navázána proteasa a z eluátu se potom izoluje vyčištěný analog faktoru Xa.

Podle jednoho aspektu tohoto vynálezu se preparát, obsahující aktivní analog faktoru Xa, získá tak, že se analog faktoru ΧΔ připravený výšeuvedeným způsobem podrobí přeměně/aktivaci a aktivovaný polypeptid se dále zpracuje na vyčištěný preparát, případně upravený jako farmaceutický preparát.

Podle dalšího aspektu přípravy preparátu obsahujícího analog faktoru ΧΔ s jedním řetězcem se analog faktoru ΧΔ s řídící sekvencí pro bibázickou proteasu exprimuje v buňce s endoproteasovou deficiencí. Tato buňka přitom přednostně vykazuje deficiencí bibázické endoproteasy, jako je kexin, furin, PÁCE nebo jejich homology. Z jedné takové 'endoprote-asa-deficientní mutantní buňky je možno izolovat analog faktoru ΧΔ ve formě jednořetězcové molekuly. Analogy faktoru obsahující procesní místo pro serinproteasu se mohou exprimovat v jakékoli běžné buňce, i v purin-po-zitivní buňce a izolovat ve formě jednořetězcových molekul.

Takto izolovaný a případně přečištěný analog faktoru X se nakonec uvede do styku s proteasou vybranou ze skupiny endoproteas, jako jsou kexin/Kex2, furin/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE4, LPC/PC7, ze skupiny serinproteas, jaké jsou faktor Ila, faktor Vila, faktor IXa, faktor Xlla, faktor Xla, faktor X nebo kallikrein, riebo s derivátem těchto proteas za podmínek, při nichž se analog faktoru X s jedním* řetězcem rozštěpí na analog faktoru Xa a aktivuje se. Při použití analogů faktoru ΧΔ aktivovaných výše uvedeným postupem na analogy faktoru Xa se získají analogy faktoru Xa s vysokou stabilitou a strukturní integritou, které přitom neobsahují inaktivní intermediáty faktoru X/Xa. Přehled obrázků na výkresech

Obr.1: Nukleotidová a aminokyselinová sekvence faktoru X

Obr.2: Schematické znázornění analogu faktoru ΧΔ s modifikovaným štěpným místem pro proteasy (Proteasen-SchnittStelle) ♦· 44 »* 44 44 44 • 4 <9 ' · • • 4 4 4 4 4 4 ♦ • • 4 4 4 4 4 4 4 * * • · 4 444 4 444 444 ♦ • • 4 • 4 4 ♦ ··· ·· . *· 44 4-4

Obr.3: Schematické znázornění expresního vektoru phAct-rFX

Obr.4: Vesternblotting-analýza rFaktoru X exprimovanéhp v CHO-buňkách před a po amplifikaci

Obr 5: Vesternblotting-analýza rFaktoru X po in vitro-štěpení furinovými deriváty

Obr.6: Vesternblotting-analýza molekul rFaktoru X exprimovaných v buňkách obsahujících a neobsahujících furin

Obr.7: Schematické znázornění analogu rFaktoru ΧΔ s pozměněným C-koncem těžkého řetězce

Obr.8: Schematické znázornění N-konce produktu přeměny rFaktoru X z CHO-, CHO/rFurin- a z furindeficitních buněk '

Obr.9: Vesternblotting-analýza rFaktoru X RVTR/I^ exprimovaného v CHO- buňkách

Obr.10: Vesternblotting-analýza rFaktoru X RVTR/I pQ vitro-aktivaci furinovým derivátem.

Tento vynález je blíže popsán v dále uvedených příkladech a obrázcích, přičemž tento vynález se však neomezuje pouze na tyto zvláštní příklady provedení. 30 ··«· ···· Příklady provedení vynálezu Příklad 1 popisuje konstrukci a expresi rFaktoru X; příklad 2 popisuje úpravu těžkého a lehkého řetězce rFaktoru X furinem; příklad 3 popisuje postup pro získání" pro-faktoru X pomocí zmobilizované proteasy; -příklad 4 popisuje aktivitu rFaktoru X připravovaného in vitro; příklad 5 popisuje expresi rFaktoru X ve furin-deficitních buňkách; příklad 6 popisuje konstrukci a expresi analogů rFaktoru ΧΔ ; příklad 7 popisuje stanovení produktů přeměny faktoru X na N-konci; příklad 8 popisuje expresi a charakterizaci FX-analogu s místem (Stelle) Arg-Val-Thr-Arg/IIe (rFX RVTR/I^ . g popisuje in vitro-aktivaci tohoto rFX RVTR/I_proteinu pomocí derivátu rFurinu.

Expresní vektory byly připraveny běžnými způsoby klonování (Maniatis a spol.: "Molecular Cloning” - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, USA, 1983) . Příprava DNA-fragmentů pomocí polymerasové reakce (Polymerase-Ketten-Reaktion - PCR) byla provedena obecnými metodami (Clackson a spol., 1991, PCR A practical approach. ED.McPherson,Quirke, Taylor, S.187-214). Příklad 1

Exprese a převedení jednořetězcového rFX na rFX s lehkým/těžkým řetězcem a. Příprava rFX-expresního vektoru

Pro přípravu rekombinantního FX (rFX) byla izolována cDNA - 31 - ·· ·· ·· ·· • · · · · t · • · · · · , · · • · ···· · · · ·· • · ' · · ·· · · ·· ·· z FX z lidské jaterní Lambda-cDNA-banky (Leber Lambda-cDNA-Bank), jak uvedli Messier a spol. (1991, Gene 99:291-294). Z pozitivního klonu byl pomocí PCR s oligonukleotidem #2911 (5’-ATT ACT CGA GAA GCT TAC CAT GGG GCG CCC ACTG-3’)· (SEQ.ID.Nrl) jako 5’-primerem a oligonukleotidem~#2912 (5’-ATTACAATTGCTGCAGGGATCCAC- 3’) (SEQ.ID.Nr2) j ako 3-prime-rem amplifikován DNA-fragment, který obsahoval 1,467 kB FX-kódující sekvenci a dále 39 bp 3’-netranslatovanou oblast, a který byl atakován v místě štěpení Xhol na 5’konci a v místě štěpení Mfel na 3’-konci. Kromě toho byla působením primeru #2911;vložena sekvence ACC před ATG v FX, takže vznikla optimální Kozák-translačně-inicializační sekvence. Nakonec byl tento PCR-produkt klonován jako Xhol/Mfel-fragment v expresním vektoru se Sall a EcoRI. Vzniklý expresní plasmid byl označen jako phAct-rFX (Obr. 3). Expresní vektor phAct zahrnuje lidský beta-actin-pro-moter, 78bp 5’UTR a rovněž intron, násobné klonoVací·místo štěpení a SV40-polyadenylační místo. ' b. Exprese rFX v CHO-buňkách

Pro získání stabilní buněčné linie pro expresi rFX byly ko-transfekovány dhfr-deficitní CHO-buňky s expresním plasmidem phAct-rFX a selektivním markerplasmidem pSV-dhfr. Při všech dalších expresních a funkčních analýzách byly buněčné kultury s bezsérovým selektivním mediem inkubovány za přítomnosti 10 gg/ml vitaminu K po dobu 24 hodin. Exprese rFX ve vzniklých buněčných klonech byla prokazována pomocí protilátky (ELISA, Asserachrom, Boehringer Mannheim) a rekombinantní protein byl potom charakterizován pomocí SDS-PAGE (Obr. 4A a B). V počátečních klonech i v sub-klonech je rekombinantní FX-protein ve formě lehkého řetězce (LC) 22 kD a těžkého řetězce (HC) o cca 50 kD, které jsou - 32 ·· ·· ·'·' ·· ·· · - 32 ·· ·· ·'·' ·· ·· · • · ··♦ identické s plasmatickým proteinem faktoru X, jak vyplývá z Vesternbíotting-analýzy (Obr. 4A). Kromě toho z pásu proteinu při 75 kD vyplývá, že tento pás odpovídá (SC)-molekule s jedním řetězcem, jejíž přítomnost byla popsána v FX-transfekačních CHO-buňkách (Volf a spol., J ,T3iol. Chem. 266:13726-13730, 1991) a rovněž v lidské plazmě (Fair a spol., Blood 64:194-204, 1984). Pro přípravu vysoce exprimujících klonů byly počáteční klony amplifikovány se stoupajícím množstvím methotrexátu a nakonec subklonovány až do stabilizace. Expresi bylo možno zvýšit z cca 200-500 ng/10E6 buněk resp. 1 pg/ml na 78 pg/10E6 buněk resp. 120 pg/ml za 24 hodin. Vesternblotting-analýza těchto vysoce exprimovaných buněčných klonů (obr. 4B a obr. 5A, záznam 2) vykazuje obohacení jednořetězcových rFX-molekul a rovněž přítomnost dalších forem v lehkém řetězci. Vedle 22 kD-formy v lehkém řetězci, která'odpovídá formě v plazmě (úplně karboxylovaná a bez propeptidu), jsou přítomny ještě tři další varianty lehkého řetězce s 21 kD, 22,5 kD a 20kD. Heterogenita lehkého řetězce v těchto klonech může být způsobena vytvářením N-terminálních sekvencí v rekombi-nantním materiálu na neúplně odštěpený propeptid (v tomto případě: ca 50 % materiálu rFX) a rovněž nedostatečným stupněm karboxylace (Untercarboxylierung) (v tomto případě: 50 % rFX). 21 kD-protein je nedostatečně karboxylovaná forma lehkého řetězce obsahující propeptid a 20 kD-protein je nedostatečně karboxylovaná forma lehkého řetězce neobsahující propeptid, zatímco 22,5 kD-pás představuje úplně karboxylovanou LC-formu obsahující propeptid. Příklad 2 - Přeměna rFX na rFX lehký/těžký řetězec působením rFurinového derivátu.

Vzhledem k podobnosti štěpných míst mezi faktor X-propeptidem/N-koncem lehkého řetězce (RVTR A) a mezi leh-.kým/těžkým řetězcem (RRKR S) s rozpoznávací sekvencí furinu (Furin-Konsensus-Erkennungssequenz) (RXK/RR X) sě naskytla možnost pro zlepšení přeměny jak jednořetězcové, tak i pro-peptid-obsahující rFX-molekuly působením rfurinového derivátu in vitro. V literatuře byly pro oba způsoby přeměny navrženy proteasy, které však neměly k furinu žádný vztah (Rehemtulla a spol., 1992, Blood 79:2349-2355; Vallin a spol,, 1994, Thromb.Res. 1994:395-403).

Supernatanty buněčných kultur CHO-rFX a CHO-rFurin TMóxHis (přihláška vynálezu EP 0 775 750) a rovněž CHO-rFX a netransfekované CHO (jako negativní kontrola) byly smíseny v poměru 1:1a inkubovány při teplotě 37 °C. V alikvotních podílech reakční směsi byl pomocí Vesterhblotting-analýzy ·· sledován obsah přeměněného rFX před inkubací (t=0) a po různých dobách inkubace (t= 2, 4, ó.hodin) (obr. 5). Důkaz rFX v supernatantu buněčných kultur byl prováděn pomocí antihumánního FX-antiséra (obr.5A) resp. monoklonální protilátky specifické pro lehký řetězec FX (obr. 5B).

Na rozdíl od směsi CHO-rFX/CHO vykazovala směs CHO-rFX/CHO-rFurin již po dvou hodinách inkubace při teplotě 37 °C (obr. 5A, záznam 7; Obr. 5B záznam 8) téměř úplnou přeměnu. Jednořetězcový rFX je v převážné míře převeden na formu lehkého a těžkého řetzězce. V oblasti lehkého řetězce byly však ještě nalezeny přeměněné bezpropeptidové formy 22 kD (karboxylovaná forma) a 20 kD (nedostatečně karboxylovaná forma) v poměru 50 : 50. Optimalizací podmínek buněčné kultury je možno tento poměr posunout ve prospěch karboxy-lované formy. Správné odštěpování pro-sekvence mezi Arg-1 - 34 « · '*:· 4·1· · · f · · · ♦ · · · » · ι · i t » * • f · I · · · · · · ·· · · · · ··· · ··« ··· • · · · · · · ···# ·Μ· I· ·# M ·· a Ala+1 a homogenita N-konce lehkého řetězce byly stanovovány pomocí N-terminálniho vytváření sekvencí. Při srovnávacím pokusu, při němž byly smíseny CHO-rFX se supernatanty CHO „nebyla u.ni po 6-hodinové inkubaci, prokázána žádná změna rFX-pásů (obr. 5A, záznam 5; obr. 5B, záznam 6). Bylo tak prokázáno, že rFurin v supernatantu CHO-buněk je biologicky aktivní a že je možno uskutečnit jak přeměnu propeptidu, tak i těžkého/lehkého řetězce rFX. Příklad 3 Přeměna faktoru X pomocí rFurinu imobilizovaného na chelát-tentakelgelu

Pro zjištění, zda je možno substrát štěpit rFurinovým derivátem vázaným v chromatografické koloněýbylo při jednom experimentálním uspořádání zjišťováno, zda jé možno jako matrici v koloně namísto Ni -NTA-agarosy použít Fractogel EMD^-Tentakelgel (Fa.Merck). Kovové ionty jsou v tomto případě v porovnání s Ni -NTA-agarosou prostorově více vzdáleny od vlastní matrice v koloně, což by mohlo zlepšit sterickou přístupnost vázaného rFurinového derivátu. Při tomto pokusném uspořádání byl profaktor X získán pomocí rFurinového derivátu vázaného na Tentakelgel následujícím způsobem:

Do Fractogel EMD -Tentakelgelu byly podle předpisu přípravy zakotveny Ni ionty a získaný materiál byl ekvili-brován s bezsérovou buněčnou kulturou. Nakonec byl na kolonu zakotven CHO-rFurinový derivát. Promývání bylo prováděno bezsérovou buněčnou kulturou obsahující stoupající koncentraci imidazolu až na 40 mM. Nakonec byl přes tuto kolonu veden profaktor X jako bezsérový CHO-supernatant. Pomocí

Vesternblotting-analýzy se specifickým faktor X-antisérem byla po průtoku kolonou prokázána přeměna profaktoru X na faktor X se dvěma řetězci. Příklad 4

Aktivita rekombinantního faktoru X připravovaného in vitro

Rekombinantní prekurzor faktoru X byl inkubován při teplotě 4 °C s rFurinem a bez rFurinu. Po určitých intervalech byly odebírány vzorky a zmrazovány na tepotu -20 °C. Po ukončení inkubace (po 4 dnech) byla u všech vzorků sledována FX-aktivita pomocí sady FX-Coatest Kit (Fa.Chromo-genix). Přitom bylo vždy 50 μΐ supernatantu smíseno s 50 μΐ FX-deficitního lidského plazmatu a podle předpisu výrobce byl rFX přídavkem hadího jedu (RW),za přítomnosti CaCl2 převeden na rFXa; rFXá hydrolyzoval nakonec chromogenní substrát (S-2337) , přičemž došlo k uvolnění žlutého para-nitroanilinu. Množství rFXa a intenzita barvy jsou vzájemně úměrné, což umožňuje stanovit množství rFXa aktivovaťelného v rFX/ml-buněčném supernatantu pomocí kalibrační přímky interpolované podle hodnot zřeďovací řady v plazmatu. Z těchto výsledků a ze známého množství rFX-antigenu (ELISA-data) je možno vypočíst procentuální podíl rFaktoru X aktivovatelného na faktor Xa. Získané výsledky jsou uvedeny v Tabulce 1.

Aby bylo možno vyloučit nespecifickou proteolytickou aktivitu CHO- a CHO-rFurinových supernatantů, byla vyhodnocována i směs těchto obou supernatantů buněčných kultur. CHO-rFX inkubovaný s CHO-supernatanty (bez rFurinu) jako kontrolní vzorek nevykázal po 4 dnech žádnou podstatnou 36 • · • · · změnu aktivity rFXa, která v rozmezí experimentálních chyb byla cca 800 mU/ml, což odpovídalo 50 až 60 % funkčního rFX. Pro porovnání byl CHO-rFX inkubován s CHO-rFurinem, přičemž byl po dobu inkubace zjištěn konstantní nárůst rFX-aktivity z cca 60 % (čas T=0) na 86 % (Tabulka 1). Tím bylo prokázáno, že in vitro-úpravou CHO-rFX z vysoce exprimovaných klonů pomocí derivátu rFurinu se podstatně zvyšuje podíl rFX aktivovatelného na funkční rFXa.

Tabulka 1

Inkubace, dny Aktivita. mU Množství antigenu, pg/ml Funkční podíl rFX, % CH0-rFX+ 0 814 14 58 CHO 1 847 14 61 2 835 • v 14 60 3 790 : : 14 56 4 763 * 14 55 j CH0-rFX+ 0 853 14 61 CHO-rFurin 1 1018 14 73 2 1099 14 49 3 1135 14 81 4 1198 14 86 CHO + 0 CHO-rFurin Plasma FX . 585 500 mU 37 • · · ♦ · · « ··*· ···· ·· ·· t« ·· Příklad5

Exprese rekombinantního faktoru X ve furin-deficitních _ buňkách ....... ... ^ Jak bylo uvedeno v předcházejících příkladech, dochází u prekurzorového proteinu faktoru X působením furinu in vitro jak k odštěpení propeptidu, tak i ke štěpení jednodu-' chého řetězce na lehký/těžký řetězec. Z toho vyplývá, že tyto kroky mohou být s různou účinností uskutečněny i endogenně v buňkách působením všudypřítomného furinu v závislosti na množství příslušného exprimovaného rFaktoru X. Tímto postupem se dále získá směs heterogenních forem rFaktoru X.

Jednou z možností, jak získat maximálně homogenní a přitom stabilní formu molekul rFaktoru X, je zabránit štěpení rFaktoru X endogenními proteasami, zejména furinem, a tak získat funkčně inaktivní prekurzor rFaktoru X (který je možno pozdější úpravou průtokem kolonou převést na funkčně aktivní formu, pokud možno přímo před použitím). <- Tento postup je obzvláště výhodný při přípravě FX-de- lečních mutantů, které obsahují namísto původního aktivač-* ního místa místo štěpitelné furinem (Furin-Spaltstelle) . U těchto látek (konstruktů) je možno provést aktivaci těchto rekombinantních rFX-mutantů in vivo působením endogenního % furinu a sekrecí aktivovaných nestabilních rFX forem. Degradací těchto forem CHO-proteasami, např. v buněčných kul- * túrách s vysokou buněčnou lýzou při skladování supernatantu buněčné kultury nebo pomocí čisticích postupů je možno získat inaktivní produkty odbourání (Volf a spol., 1991).

*n • ·'· ·· • · • · » « · « · • · • · • * • · • · • · • 0 • · • · · • · ··· · ··· • · · • • é • . · • ·· ···· ·« • « . Tohoto cíle je možno dosáhnout např. přídavkem činidel, která snižují nebo blokují intracelulární furinovou aktivitu, do buněčné kultury.

Jinou možností je apriorní použití furin-děficitních buněk (Mohring a spol., 1983, Infect. Immun. 41:998-1009; Ohniski a spol., 1994, J. Virol. 68:4075-4079; Gordon a spol., 1995, Infect. Immun. 63:82-87). Při tomto postupu byl furin-deficitní CHO-buněčný klon FD11 (Gordon a spol., 1995, Infect. Immun. 63:82-87) ko-.transfekován s 20 pg phAct-FX a 1 μg pUCSV-neo (s obsahem neomycin-rezistetního genu v pUC vektoru za kontroly SV40-promotoru). Pro získání stabilního klonu bylo toto medium suplementováno 0,8 μg G418/ml. Při porovnání molekul rFak-toru secernovaného v bezsérovém supernatantu CHO klonů s obsahem a bez obsahu furinu bylo pomocí Vesternblotting-analýzy prokázáno, že ve furindeficitních buňkách nedocházelo k přeměně prekurzoru rFaktoru a byl přítomen pouze jednořetězcový prekurzor faktoru X (obr.6); naproti tomu se rFaktor X z "normálních" buněk při mírnější (modeste) expresi přeměňoval ještě úplně, při vyšší expresi se přes přítomnost endogenního furinu přeměňoval pouze v omezené míře. Vzhledem k velmi nízkému stupni exprese rFX u použitého buněčného klonu neni lehký řetězec rFaktoru X při Blotting-analýze vidět. Příklad 6

Příprava analogů faktoru X (podle vyjádření přihlašovatele jde v současné době o nej lepší způsob provedení podle tohoto vynálezu) - 39 - 39 ·· ·· *· *· ·· *· • · · · · · · · · ♦ · · » · · · · · · · · · • * · · · ··· · ··· ··· t · · · ♦ · t «··· ···· ·· ·· ·· ·· 6.1 Konstrukce expresních plasmidů pro přípravu FX- de1ečních mutantů

Deleční mutanty faktoru X se od "divokého typu" sekvence faktoru X liší délecí aktivačního peptidu o velikosti ca 4,5 kDa mezi aminokyselinami 180 až 234. Kromě toho je možno mutagenezí v C-koncové části lehkého řetězce a/anebo y N-koncové části těžkého řetězce vkládat různá.štěpná místa sloužící pro aktivaci takto vzniklých jednořetězcových molekul faktoru X na aktivovaný polypeptid. Expresní plasmidy pro tyto deleční mutanty faktoru X jsou vždy odvozovány od phAct-FX (popsaného v příkladu 1).

Pro zjednodušení klonování delečních mutantů faktoru X byl DNA-fragment HindlII-Nael z plasmidů phAct-FX, obsahující kódování faktoru X od pozice +1 až do +1116, vložen do HindiII/Smal-restrikčních štěpných míst plasmidů pUC19. Takto získaný plasmid byl označen jako pUC/FX. Pró deleci aktivačního peptidu a vložení nových štěpných míst; např. furinových, nebo FXIa-, FXIIa-, Fxa-, FIIa^štěpných míst byl DNA-fragment Bspl20I/BstXI FX z pUC/FX-vektoru nahrazen syntetickým oligonukleotidem. Pro vložení thrombin- nebo FXIa-štěpného místa byla přečnívající sekvence BstXI-3’ vyhlazena pomocí Mung Beánovy nukleasy, takže bylo možno provést i výměnu aminokyseliny Ile na pozici 235. Potom byly deletováné DNA-fragmenty faktoru X v plasmidů pAct-FX klonovány pomocí HindiII-Agel.

Pro přípravu Asp-Phe-Thr-Arg/Val FXIa-štěpného místa byl použit oligonukleotid sens # 0009 (5’-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG GAC TTC ACC AGG GTG-3 ’ (SÉQ. ID. Nr.3) a oligonukleotid antisens # 0010 (5’-CAC CCT GGT GAA GTC CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3’) (SEQ. ID. Nr.4) a vložen do - 40 ·· • · ··· *· ι· » ···· Bšp-místa a do BstXI-místa upraveného Mung Beánovou nuklear 'sou. Tímto způsobem byla provedena mutace aminokyselin na pozici 176 až 178 na Asp-Phe-Thr a Val (Obr. 2A).

Pro přípravu Arg/Thr FIIa-štěpného místa byl použit oligonukleotid sens # 0011 (5’-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG ACC CTG GAA CGG ACC-3’ (SEQ. ID. Nr.5) a oligonukleotid antisens # 0012 (5’-GGT CCG TTC CAG GGT CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3’) (SEQ. ID. Nr.6) a vložen do Bspl20I-místa a do BstXI-místa upraveného Mung Beánovou nukleasou. Tímto způsobem byla provedena mutace aminokyseliny Ile na pozici 235 na Thr (Obr. 2B).

Pro přípravu IIe-Lys-Pro-Arg/IIe FXIIa-štěpného místa byl použit oligonukleotid sens # 0013 (5’-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG ATC AAG CCC AGG ATC-3’ (SEQ. ID. .Nr.7) a oligonukleotid antisens # 0014 (5’-CT GGG CTT GAT CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3’) (SEQ. ID. Nr.8) a vložen do Bspl20I- a do BstXI-místa. Tímto způsobem byla provedena mutace aminoky--selin na pozici 176 až 178 na Ile-Lys-Pro (Obr. 2C).

Pro přípravu Ser-Met-Thr-Arg/IIe kallikrein-štěpného místa byl použit oligonukleotid sens # 0015 (5’-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG AGC ATG ACC AGG ATC-3’ (SEQ. ID. Nr.9) a oligonukleotid # 0016 (5’-CT GGT CAT GCT CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3’) (SEQ. ID. Nr.10) a vložen do Bsp-a BstXI-místa. Tímto způsobem byla provedena mutace aminokyselin na pozici 176 až 178 na Ser-Met-Thr (Obr. 2D).

Pro přípravu-Met-Lys-Thr-Arg/IIe FXa-štěpného místa byl použit oligonukleotid sens # 0033 (5’-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG ATG AAA ACG AGG ATC-3’ (SEQ. ID. Nr.ll) a oligonukleotid antisens # 0034 (5’-CT CGT TTT CAT CTG TTT CCC ACA - 41 ·#«« ···· «· ·· *

GGG GTA G-3’) (SEQ. ID. Nr.12) a vložen do Bspl20I- a do BstXI-místa. Tímto způsobem byla provedena mutace aminokyselin na pozici 176 až 178 z Thr-Leu-Glu na Met-Lys-Thr (Obr. 2E) _.

Pro přípravu IIe-Glu-Gly-Arg/IIe FXa-štěpného místa byl použit oligonukleotid sens # 0035 (5’-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG ATC GAG GGA AGG ATC-3’ (SEQ. ID. Nr.13) a oligonukleotid antisens # 0036 (5’-CT TCC CTC GAT CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3’) (SEQ. ID. Nr.14) a vložen do Bspl20I- a do BstXI-místa. Tímto způsobem byla provedena mutace aminokyselin na pozici 176 až 178 z Thr-Leu-Glu na Ile-Glu-Gly (Obr. 2F) .

Pro přípravu Arg-Arg-Lys-.Arg/TIe furin-štěpného místa byl použit oligonukleotid sens # 0017 (5’-GG CCC'TAC CCC TGT GGG AAA CAG AGG AGG AAG AGG ATC-3’ (SEQ. - ID. Nr.15) a oligonukleotid antisens # 0018 (5’-CT CTT CCT CCT CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3’) (SEQ. ID. Nř.16) a vložen do Bspl20I- a do BstXI-místa. Tímto způsobem byla provedena mutace aminokyselin na pozici 176 až 178 na Arg-Arg-Lys (Obr. 2G).

Pro přípravu Arg-Val-Arg-Arg/IIe furin-štěpného místa byl použit oligonukleotid sens # 0019 (5’-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG AGG GTG AGG AGG ATC-3’ (SEQ. ID. Nr.17) a oligonukleotid antisens # 0020 (5’-CT CCT CAC CCT CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3’) (SEQ. ID. Nr.18) a vložen do Bspl20I- a do BstXI-místa. Tímto způsobem byla provedena mutace aminokyselin na pozici 176 až 178 na Arg-Val-Arg (Obr. 2G).

Pro přípravu Arg-Arg-Arg-Arg/IIe furin-štěpného místa byl použit oligonukleotid sens # 0021 (5’-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG AGG AGG AGG AGG ATC-3’ (SEQ. ID. Nr.19) a oligo- 42 ·· #f »1 ·· tt ·· · · · · » · · · · ,/· · ' · ;· · ··· · · íjm;· · # » · · · · ·,·· · ··· »·· '· ··.."· 4· · ♦ ·♦· ···· ·♦ ·· ·· ·· nukleotid antisens # 0022 (5’-CT CCT CCT CCT CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3’) (SEQ. ID. Nr.20) a vložen do Bspl20I- a do BstXI-místa. Tímto způsobem byla provedena mutace aminokyselin na^pozici 176_až 178 na Arg-Arg-Arg (Obr. 2G) .

Pro přípravu Arg-Pro-Lys-Arg/Ile furin-štěpného místa byl použit oligonukleotid sens # 0023 (5’-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG AGG CCC AAG AGG ATC-3’ (SEQ. ID. Nr.21) a oligonukleotid antisens # 0024 (5’-CT CTT GGG CCT CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3’) (SEQ. ID. Nr.22) a vložen do Bspl20I- a do BstXI-místa. Tímto způsobem byla provedena mutace aminokyselin na pozici 176 až 178 na Arg-Pro-Lys (Obr. 2G).

Pro přípravu Ile-Arg-Lys-Arg/IIe furin-štěpného místa byl použit oligonukleotid sens # 0Ó25 (5’-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG ATC AGG AAG AGG ATC-3’ (SEQ: ID. Nr.23) a oligonukleotid antisens # 0026 (5’-CT CTT CCT GAT CTG TTT CCC ACA. GGG GTA G-3’) (SEQ. ID. Nr.24) a vložen do Bspl20I- a dů BstXI-místa. Tímto způsobem byla provedena mutace aminokyselin na pozici 176 až 178 na Ile-Arg-Lys (Obr. 2G).

Pro přípravu Arg-Ser-Lys-Arg /Ile furin-štěpného místa byl použit oligonukleotid sens # 0027 (5’-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG AGG AGC AAG AGG ATC-3’ (SEQ. ID. Nr.25) a oligonukleotid antisens # 0028 (5’-CT CTT GCT CCT CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3’) (SEQ. ID. Nr.26) a vložen do Bspl20I- a do BstXI-místa. Tímto způsobem byla provedena mutace aminokyselin na pozici 176 až 178 na Arg-Ser-Lys (Obr. 2G).

Pro přípravu-Arg-Val-Thr-Arg /Ile furin-štěpného místa byl použit oligonukleotid sens # 0029 (5’-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG AGG GTC ACG AGG ATC-3’ (SEQ. ID. Nr.27) a oligonukleotid antisens # 0030 (5’-CT CGT GAC CCT CTG TTT CCC ACA ·« ·? ·* ·» #♦ . ·· • · · # · · ·' '· • · • · • · · · • · % i· • · 9 ♦ ·· · · ··· • ··♦ » · · · • >.· • • 9 ·♦ • 9 GGG GTA G-3’) (SEQ. ID. Nr.28) a vložen do Bspl20I- a do BstXI-místa. Tímto způsobem byla provedena mutace aminokyselin na pozici 176 až 178 na Arg-Val-Thr (Obr. 2G).

Pro přípravu Arg-Leu-Lys-Arg/IIe furin-štěpného místa byl použit oligonukleotid sense # 0031 (5’-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG AGG CTG AAA AGG ATC-3 ’ (SEQ. ID. Nr.29) a oligonukleotid antisense # 0032 (5’-CT TTT CAG CCT CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3’) (SEQ. ID. Nr.30) a vložen do Bspl20I-a do BstXI-místa. Tímto způsobem byla provedena mutace aminokyselin na pozici 176 až 178 na Arg a Lys (Obr. 2G).

Pro přípravu Pro-Gln-Gly-Arg/IIe FXa-štěpného místa byl použit oligonukleotid sens # 0037 (5’-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG CCC CAA GGA AGG ATC-3’ (SEQ. ID. Nr.31) a oligonukleotid antisens # 0038 (5’-CT TCC TTG GGG CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3’) (SEQ. ID. Nr.32) a vložen, do Bspl20I- a do BstXI-místa. Tímto způsobem byla provedena mutace aminokyselin na pozici 176 až 178 z Thr-Leu-Glu na Pro-Gln-Gly (Obr. 2H) .

Pro přípravu Thr-Ser-Thr-Arg/IIe FXIIa-štěpného místa byl použit oligonukleotid sens # 0039 (5’-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG ACG AGC ACG AGG ATC-3’ (SEQ. ID. Nr.33) a oligonukleotid antisens # 0040 (5’-CT CGT GCT CGT CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3’) (SEQ. ID. Nr.34) a vložen do Bspl20I- a do BstXI-místa. Tímto způsobem byla provedena mutace aminokyselin na pozici 176 až 178 na Ser-Thr (Obr. 21).

Pro přípravu.Arg/IIe trypsin-štěpného místa byl použit oligonukleotid sens # 0041 (5’-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG ACC CTG GAA CGG ATC-3’ (SEQ. ID. Nr.35) a oligonukleotid antisens # 0042 (5’-CG TTC CAG GGT CTG TTT CCC ACA GGG GTA - 44 ·« ♦♦ ·· • · I* • ♦ · • · • • · 9 • ;· · ♦ • ·· 9 • · · • ♦ ··♦ · ··· ·♦ *·. · ·«·# G-3’) (SEQ. ID. Nr.36) a vložen do Bspl20I- a do BstXI-mís-ta. (Obr. 2J). Získané expresní plasmidy (viz obr.3) zahrnují lidský beta-aktinový promotor, 78 bp 5’UTR, beta-aktin-intron, modifikovanou sekvenci faktoru X a dále 39 bp 3’UTR a poly-adenylační místo SV40. · 6.2 Konstrukce expresních plasmidů pro přípravu FXp-analogů

Tyto konstrukty jsou odvozeny od konstruktů dříve uvedených analogů faktoru ΧΔ , do nichž byl vložen jeden TGA-stop-kodon na pozici 470. Přitom byly aminokyseliny od pozice 457 až ke stop-kodonu odstraněny natrávením (Verdau) působením Spěl a částečně BstEII a nahrazeny oligonukleoti-dovým párem #0003 (5’-GTC ACC GCC TTC CTC AAG TGG ATC GAC AGG TCC ATG AAA ACC AGG TGA A-3’) (SEQ.ID Nr.37) a #0004 (5 ’ - CTA GTT CAC CTG GTT TTC ATG GAC CTG TCG ATC CAC TTG AGG AAG GCG-3’) (SEQ.ID.Nr.38). Schematické znázornění tohoto konstruktu analogu faktoru ΧΔ β je uvedeno v obr.7. Pro zjednodušení vyobrazení jsou všechny konstrukty analogu faktoru ΧΔ β znázorněny jako obecný konstrukt, v němž jsou proměnlivé aminokyseliny v oblasti místa štěpení znázorněny jako stínované "X". 6.3 Konstrukce expresních plasmidů pro přípravu FXAa-analogů

Aktivací faktoru X odštěpením 4,5 kDa-aktivačního peptidu na C-konci těžkého řetězce vznikne Xact-forma faktoru. Tato forma se potom přemění působením autoproteolytické aktivity a odštěpením C-konce těžkého řetězce mezi Arg469 a Gly470 na formu FXaβ. Pro přípravu expresních plasmidů - 45 *·· · _ 9· ··. ·· ·· φφ (· ·'· · · 9» · · ·· φ 9 · ··## φ · · φ • ι· '· · · ·ΦΦ+ φ φφΦ φφφ i# · <· '··# · # 9999 ···· 99 99 ·· φφ faktoru X vedoucích k tvorbě analogů faktoru ΧΔ , které se po aktivaci vyskytují výhradně ve formě FXaa s intaktním β-peptidem, byla provedena záměna aminokyseliny Arg469 na Lys, takže nemohlo docházet k žádné přeměně na C-konci těžkého řetězce.

Proto byla DNA-sekvence faktoru X kódující C-koncovou sekvenci aminokyselin odstraněna od pozice 1363 až ke stop-signálu částečným naštěpením pomocí BstEII-Spel a nahrazena dvěma vaznými oligonukleotidovými páry. Oligonukleo-tid #0005 (5’-GTC ACC GCC TTC CTC AAG TGG ATC GAC AGG TCC ATG AAA ACC AAG GGC TTG ‘CCC AAG-3’) (SEQ.ID Nr.39) a oligonukleotid #0006 (5’-TTG GCC TTG GGC AAG CCC TTG GTT TTC ATG GAC CTG TCG ATC CAC TTG AGG AAG GCG-3’) (SEQ.ID.Nr.40) byly ligovány s oligonukleotidem #0007 (5’-GCC AAG AGC CAT GCC CCG GAG GTC ATA ACG TCC TCT CCA TTA AAG TGA GAT CCC A-3’) (SEQ.ID Nr.41) a oligonukleotidem #0008 (5’-CTA GTG GGA TCT CAC TTT ÁAT GGA GAG GAC GTT ATG ACC TCC GGG GCA TGG CTC-3’) (SEQ.ID.Nr.42). Mutace aminokyseliny Arg469 byla provedena óligonukleo-tidovým párem #0005-#0006. Schematické znázornění FXA -analogu je uvedeno v obr. 7. Příklad 7

Stanovení N-konce faktoru X a produktů jeho přeměny s rFur inem a bez rFurinu

Rekombinantní faktor X byl exprimován v CHO-buňkách s endogenním furinem, jak bylo popsáno v příkladu 1, resp. ve furin-deficitních buňkách, jak bylo popsáno v příkladu 5. Izolace rFaktoru X byla provedena jednak z a) předběžně neupravené b) inkubované 12 hodin při 37 °C a c) 12 hodin při 37 °C s CHO-rFurinem upravené buněčné kultury vysoce exprimujícího CHO-rFX-klonu a jednak z d) předběžně neupravené a e) 12 hodin při 37 °C s CHO-rFurinem upravené buněčné kultury klonu CHO-FDll-fRX. Vzniklá N-koncová aminokyselina faktoru X a produktů přeměny při reakčních podmínkách a) až e) byla stanovena Edmanovou analýzou. V obr. 8 je uvedeno schematické znázornění výsledků. rFaktor X z vysoce exprimujících CHO-buněk se vyskytuje ve formě zralého těžkého a lehkého řetězce a rovněž v jednořetězcové formě, která částečně obsahuje propeptid.

Po kultivaci této buněčné kultury po dobu 12 hodin při 37 °C (b) vznikají navíc, jak popsali již Volf a spol. (1991, J.Biol.Chem. 266:13726-13730), chybné N-koncovky lehkého řetězce rFX s třemi aminokyselinami Val38-Thr39-Arg40. Tyto kryptické konce byly nalezeny i při sekvenování rFX-mate-riálu z neupravených CH0-FD11-buněk (d). Z těchto pozorování vyplývá, že výskytu těchto chybných N-konCovek jé možno zabránit minimalizací rFX-proteolýzy působením CHO-proteas, jestliže se použijí vhodné reakční nebo buněčné podmínky, odpovídající způsoby skladování a odpovídající čisticí postupy.

Na rozdíl od čištěného materiálu z CHO-buněk (a a b) je rFX z neamplifikovaných furindeficitních buněk (d) přítomen pouze ve formě neupraveného jednořetězcového prekur-zoru. Nebyly nalezeny ani žádné N-koncové sekvence, které by odpovídaly podílu propeptidu. Tím bylo prokázáno, že úprava jednořetězcového prekurzoru rFX v lehkém/těžkém řetězci ve furin-deficitních CHO-buňkách (d) již neprobíhá, což ukazuje na hlavní roli endoproteasy furinu v tomto operačním kroku probíhajícím in vivo. Dodatečně bylo prokázáno, že přeměna rFX-molekul obsahujících propeptid probíhá i ve furin-de-

47 • · · .· * *·♦* ··*· ·· »· ···* · · · · t · I 19 I

ficitních CHO - buňkách, takže furin nemá při úpravě v podmínkách in vivo žádnou podstatnou úlohu. Po inkubaci rFX z CHO-buněk (c) a z CHO-FD11-buněk (e) za přítomnosti furinu Jbyly nplezeny lehké a těžké řetězce se správnými N-konci. Tím bylo prokázáno, že jak jednořetězcové prekurzory FX,·' tak i rFX-molekuly obsahuje! propeptid se při zpracování in vitro přeměňují na homogenní zralý faktor X. Faktor X připravovaný za přítomnosti furinu vykazoval kromě toho mimořádnou integritu struktury. Příklad 8

Exprese a charakterizace rekombinantního delečního mutantu FX s místem štěpení Arg-Val-Thr-Arg/I Ie (ΡΧΔ RVTR/I)

Expresní plasmid, kódující deleční mutanty FX's místem štěpení Arg-Val-Thr-Arg/IIe (FX£ RVTR/I) byl, jak bylo uvedeno v Příkladu 1, ko-tranfserován se selekčním markérem pSV/dhfr do dhfr-deficitních CHO-buněk. Rekombinantní protein FXA RVTR/I z permanentních CHO-klonů byl charakterizován pomocí Vesternblotting-analýzy. Jak vyplývá z obr. 9, záznam 4, vystupuje tento rekombinantní protein ve formě dvojitého pásu s cca 56 a 50 kD. V buněčných kulturách ne-transferovaných CHO-buněk nebyl žádný FX-reaktivní materiál detegován (záznam 2). Tyto výsledky vylučují, že by tyto proteinové pásy odpovídaly znečištění analyzovaného superna-tantu divokým typem FX ze zbytků hovězího séra v buněčném mediu. Je proto pravděpodobné, že dvojité pásy mohou souviset s různými posttranslačními modifikacemi, např. přítomností propeptidu nebo rozdílnou glykosylací molekuly rFXA RVTR/1. Štěpné místo Arg-Val-Thr-Arg/IIe zavedené do tohoto konstruktu je identické s propéptidovým štěpným místem divokého typu molekul FX, které bylo účinně rozpoznáno a rozštěpeno in vivo působením CHO-endoproteasy (viz příklad 7) . Vesternblotting-analýza neprokázala žádné další 35 kD-resp. 31 kD těžké FX-molekuly, které by odpovídaly aktivovaným a- a β-formám těžkých řetězců rFXA RVTR/I Tyto výsledky nasvědčují tomu, že bud’ nebylo množství endoprotea-sy pro aktivaci proteinu dostatečné a/anebo tomu, že štěpné místo Arg-Val-Thr-Arg/IIe v uvedených sekvencích není in vivo rozlišeno vůbec nebo je rozlišeno nedostatečně. rFXA RVTR/I se proto vyskytuje prakticky výhradně v jedno-řetězcové formě. Příklad 9

Aktivace rekombinantního proteinu rFXA ^VTR/I pomoc£ rekombinantních furinových derivátů in vivo Místo štěpení Arg-Val-Thr-Arg v rFX-propeptidu in vivo sice bylo prokázáno pomocí jiné proteasy než je furin, v příkladu 2 však bylo uvedeno, že tato sekvence se in vitro velmi účinně a správným způsobem štěpí rFurinovým derivátem.

Vyhodnocování aktivovatelnosti rFXA RVTR/I-proteinu působením rFurinu in vitro bylo provedeno pomocí směsných experimentů. Při nich byl k supernatantu kultury buněk CHO-FXA ^^TR/I pjg--£dán rFurinový derivát rFurin Cys-Spacer-lOxHis (viz přihláška vynálezu EP 0 775 750 A2) za přítomnosti 20 mM Hepes, pH 7,0, 150 mM NaCl, 4 mM CaCl2 a 0,1 % BSA v poměru 1:1. Při kontrolním pokusu byl supernatant CHO-rFXA^^^ smísen ve stejném poměru pouze s pufrem obsahujícím BSA. Přídavek BSA má sloužit pro stabilizaci enzymatické aktivity rFurinového derivátu a vznikajících - 49 - 49

• · · · f · · ··· ···· ·· ··" «· «· aktivovaných produktů rFXA PVTR/I průběh přeměny rFXA RYrR^ byl sledován pomocí Vesternblotting-analýzy v alikvotních podílech reakční směsi před a po inkubačni do-„bě_6.,.*.24., 48 a 72 hodin (ΐ=0, t=6, t=24, t=72). .při teplotě 37 C (obr. 10). U pokusu bez přídavku rFurinu (5br. 10B) není ve spektru pásů v průběhu inkubačni doby patrná žádná změna (záznam 4 až 9) . Vzhledem k přítomnosti BSA~ v TFéákčňí směsi jsou dobře viditelné pouze lehčí molekuly rFXA RVTR/I (50 kD), molekuly 56 kD jsou překryty pásy BSA.

Za přítomnosti rFurinového derivátu (obr. 10A) se objevil již po inkubačni době 6 hodin (záznam 5) proteinový pás odpovídající 35 kD, který odpovídá α-formě FX-těžkého řetězce (viz záznam 9). Tento protein se v průběhu inkubace akumuluje a nakonec se - jako je známo u plazmy FX - přeměňuje na proteolytickou β-formu (záznam 7 a 8). Současně s detekcí aktivovaných forem těžkého řetězce byly detégovány lehké řetězce 22 kD a 20 kD, které byly v Příkladu l.b identifikovány jako karboxylovaná LC2-forma neobsahující, propeptid (což vlastně odpovídá funkční formě) resp. jako nedostatečně karboxylovaná LC4-forma neobsahující propeptid. Přítomnost nedostatečně karboxylované LC4-formy potvrzuje, že v analyzovaných CHO-klonech jsou posttranslační mechanismy modifikace omezeny. 50 kD-pás se sice jeví jako neměnný, zatímco zdánlivě se 56 kD-forma přímo odbourává na lehké/těžké řetězce, ve skutečnosti však dochází k tomu, že 56 kD-molekula se nejprve přeměňuje na 50 kD-formu a teprve potom se štěpí na lehký a těžký řetězec. To je způsobeno přítomností propeptidu v 56 kD-molekule, který se odstraňuje za vzniku 50 kD-formy. Tím bylo prokázáno, že rFX^ *^TR/^-konstrukt je akti-vovatelný prostřednictvím zabudovaného štěpného místa - 50 • » Μ·« «···

Arg-Val-Thr-Arg/IIe působením rFurinového derivátu in vitro a.že velikost vzniklých produktů přeměny konstruktu rFXA RVTR/I odpovídá plazmovým produktům FXa. Přítomnost ΡΧΔ β, vznikajícího autoproteolytickým průběhem reakce z FXA a, ukazuje na funkcionalitu molekuly rFX£ - '

Sekvenční protokol (1) Všeobecné údaje: (i) Přihlašovatel: (A) Jméno: IMMUNOAG " (B) Ulice: Industriestrasse 67 ----„ ,--- „ (C) Místo: Vien (D) Spolková země: Rakousko (E) Země: Rakousko (F) PSČ: 1220 ‘ (A) Jméno: Friedrich Dorner (B) Ulice: Peterlinigasse 17 (C) Místo: Vien (D) Spolková země: Rakousko (E) Země: Rakousko (F) PSČ: 1238 (A) Jméno: Falkp-Guenther Falkner (B) Ulice: Mannsdorf 116 (C) Místo: Mannsdorf (D) Spolková země: Rakousko (E) Země: Rakousko (F) PSČ: 2304 (A) Jméno: Michele Himmelspach (B) Ulice: Breitstetten 19 (C) Místo: Leopoldsdorf (D) Spolková země: Rakousko (E) Země: Rakousko (F) PSČ: 2285 (A) Jméno: Michael Pfleiderer (B) Ulice: Johann Nestroygasse 12/16

(C) Místo: Gross-Enzersdorf (D) Spolková země: Rakousko (E) Země: Rakousko (F) PSČ: 2301 (A) Jméno: Uwe Schlokat (B) Ulice: Hauptstrasse.51 (C) Místo: Orth/Donau (D) Spolková země: Rakousko (E) Země: Rakousko (F) PSČ: 2304 (A) Jméno: Johann Eibl (B) Ulice: Gustav Tschermakgasse 2 (C) Místo: Vien (D) Spolková země: Rakousko (E) Země: Rakousko (F) PSČ: 1180 (ii) Název vynálezu: Deleční mutánty faktoru X a jej ich analogy (iii) Počet sekvencí: 44 (iv) Počítačem čitelné znění: (A) Nosič dat: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC compatible

(C) Pracovní systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Paten In Release #1.0, Version #1.30 (EPA) (2) Údaje k sekvenci ID NO: 1: (i) Data sekvence - 53 • · *· (A) Délka: 34 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: Sekvence ID N0:1: ATTACTCGAG AAGCTTACCA TGGGGCGCCC ACTG (2) Údaje k sekvenci ID NO: 2: (i) Data sekvence (A) Délka: 24 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO:2: ATTACAATTG CTGCAGGGAT CCAC (2) Údaje k sekvenci ID NO: 3: (i) Data sekvence (A) Délka: 38 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární

(ii) Druh molekuly: Genom-DNA 54 • · 54 • · • · (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO:3: GGCCCACCC CTGTGGGAAA CAGGACTTCA CCAGGGTG (2) Údaje k sekvenci ID NO: 4: (i) Data sekvence · (A) Délka: 34 párů basi (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární

(ii) Druh molekuly: Genom-DNA

(xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO:4: CACCCTGGTG AAGTCCTGTT TCCCACAGGG GTAG i (2) Údaje k .sekvenci ID NO: 5: (i) Data sekvence (A) Délka: 38 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární

(ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 5: GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGACCCTGG AACGGACC (2) Údaje k sekvenci ID NO: 6: (i) data sekvence (A) Délka: 34 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární

(ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence; Sekvence ID NO:6: GGTCCGTTCC AGGGTCTGTT TCCCACAGGG GTAG (2) Údaje k sekvenci ID NO: 7: (i) Data sekvence

(A) Délka: 38 párů basí J (B) Druh: nukleotid » . (C) Forma řetězce: jednotlivý .řetězec (D) Topologie: lineární

(ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO:7 GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGATCAAGC CCAGGATC (2) Údaje k sekvenci ID NO: 8: (i) Data sekvence (A) Délka: 30 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární 56 56 • ·

(ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO:8: CTGGGCTTGA TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG (2) Údaje k sekvenci ID NO: 9: (i) Dana sekvence (A) Délka: 38 párů basi (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární

(ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: Sekvence ID N0:9: GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGAGCATGA CCAGGATC (2) Údaje k sekvenci ID NO: 10: (i) Data sekvence (A) Délka: 30 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární

(ii) Druh molekuly: Genom-DNA

(xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 10: CTGGTCATGC TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG (2) Údaje k sekvenci ID NO: 11: (i) Data sekvence " * * (A) Délka: -38 párů basí •(B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární

(ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 11: GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGATGAAAA CGAGATC (2) Údaje k sekvenci ID NO: 12: (i) Data sekvence (A) Délka: 30 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární

(ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 12: CTCGTTTTCA TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG (2) Údaje k sekvenci ID NO: 13: (i) Data sekvence (A) Délka: 38 párů basí (B) Druh: nukleotid 58 • * · · · • · · · · ·· «··· ···«

(C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární

(ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 13: GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGATCGAGG GAAGGATC (2) Údaje k sekvenci ID NO: 14: (i) Data sekvence (A) Délka: 30 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární

(ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 14: CTTCCCTCGA TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG (2) Údaje k sekvenci ID NO: 15: (i) data sekvence (A) Délka: 38 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární

(ii) Druh molekuly: Genom-DNA 59 59 • · · · · » -. · · · '· • · · · «······· · · (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 15:

GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGAGGAGGA AGAGGATC (2) Údaje k sekvenci~ID NO: 16: " — (i) Data sekvence (A) Délka: 30 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární

(ii) Druh molekuly: Genom-DNA

(xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 16: CTCTTCCTCC TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG (2) Údaje k sekvenci ID NO: 17: ' ' - (i) Data sekvence (A) Délka: 38 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární

(ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 17: GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGAGGGTGA GGAGGATC (2) Údaje k sekvenci ID NO: 18: + · ·· 60 (i) Data sekvence (A) Délka: 30 párů basi (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární

_ . .( i i ) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 18: CTCCTCACCC TCTGTTTCCC AGAGGGGTAG (2) Údaje k sekvenci ID NO: 19: (i) Data sekvence (A) Délka: 38 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární

(ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 19: GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGAGGAGGA GGAGGATC (2) Údaje k sekvenci ID NO: 20: (i) Data sekvence (A) Délka: 30 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární ϊ' - 61 ·♦ ·♦ ·♦ ·· • · · · ···· * · · · « · • · * · · ··· • ’· · · · ···· ···· ·« ··

(ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 20: CTCCTCCTCC TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG (2) Údaje k sekvenci ID NO: 21: (i) Data sekvence (A) Délka: 38 párů basí (B) Druh: nNukleotid (C) Forma řetězce: jednoxlivý řetězec (D) Topologie: lineární

(ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 21: GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGAGGCCCA AGAGGATC (2) Údaje k sekvenci ID NO: 22: (i) Data sekvence (A) Délka: 30 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární

(ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 22:

CTCTTGGGCC TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG ·· ·· • · · • · · ·«· • t ·· #· - 62 ·· #· - 62 β » · « ···· ··« (2) Údaje k sekvenci ID NO: 23: (i) Data sekvence * (A) Délka: 38 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec — - —(D) Topologie: -lineární ......

(ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 23: GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGATCAGGA AGAGGATC (2) Údaje k sekvenci ID NO: 24: (i) Data sekvence (A) Délka: 30 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 24: CTCTTCCTGA TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG (2) Údaje k sekvenci ID NO: 25: (i) Data sekvence (A) Délka: 38 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární

(ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 25: .GGCCCGACCC CTGTGGGAAA CAGAGGAGCA. AGAGGATC.... (2) Údaje k sekvenci ID NO: 26: (i) Data sekvence (A) Délka: 30 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 26: CTCTTGCTCC TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG (2) Údaje k sekvenci ID NO: 27: (i) Data sekvence (A) Délka: 38 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární

(ii) Druh molekuly: Genom-DNA 64 ··· ·· (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 27: GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGAGGGTCA CGAGGATC “(2) Údaje k sekvenci ID-NO: 28:· (i) Data sekvence (A) Délka: 30 párů basi (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární

(ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 28: CTCGTGACCC TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG (2) Údaje k sekvenci ID NO: 29: (i) Data sekvence (A) Délka: 38 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární

(ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 29: GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGAGGCTGA AAAGGATC (2) Údaje k sekvenci ID NO: 30: (i) Data sekvence (A) Délka: 30 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (Ď) Topologie: lineární »(ii). Druh molekuly: Genom-DNA..... . . ... . (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 30:

CttttcaGCC TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG (2) Údaje k sekvenci ID NO: 31: (i) Data sekvence (A) Délka: 38 párů basí (B) Druh: nukleotid . . .. ' (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární

(ii) Druh molekuly: Geriom-DNA (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 31: GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGCCCCAAG GAAGGATC (2) Údaje k sekvenci ID NO: 32: (i) data sekvence (A) Délka: 30 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární - 66 ·· ·· * I « < • *· '· · • · *··« ···· ·* ·· • · · · • · « f • · ·*· ♦ · · • * · · t' ·· ·· • · · · • · · · ··· ··· • · , ·· ·«

(ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 32: CTTCCTTGGG GCTGTTTCCC ACAGGGGTAG * ' ' _ (2) Údaje k sekvenci ID NO: 33: (i) Data sekvence (A) Délka: 38 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární

(ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 33: GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGACGAGCA GGAGGATG (2) Údaje k sekvenci ID NO: 34: . (i) Data sekvence (A) Délka: 30 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární

(ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 34:

CTCGTGCTCG TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG 67 • · «

• · · • · · • ··· · • · *·# ·«

··· ··« • · · »· ·· (2) Údaje k sekvenci ID NO: 35: (i) Data sekvence (A) Délka: 38 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 35: GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGACCCTGG AACGGATC (2) Údaje k sekvenci ID NO: 36: (i) Data sekvence (A) Délka: 30 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 36: CGTTCCAGGG TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG (2) Údaje k sekvenci ID NO: 37: (i) Data sekvence (A) Délka: 49 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec - 68 ·· · · ji · ·· • · · · · · · ········ ·· · · (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 37: GTC ACCGCCT- TCCTCAAGTG GATCGACAGG TCCATGAAAA.. CCAGGTGAA (2) Údaje k sekvenci ID NO: 38: (i) Data sekvence (A) Délka: 48 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární

(ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 38: CTAGTTCACC TGGTTTTCAT GGACCTGTCG ATCCACTTGA GGAAGGCG (2) Údaje k sekvenci ID NO: 39: (i) Data sekvence (A) Délka: 57 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec

(D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: Genom-DNA

········ ·· ·· ·· ·· (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 39: «

GTCACCGCCT TCCTCAAGTG GATCGACAG TCCATGAAAA CCAAGGGCTT GCCCAAG (2) Údaje k sekvenci ID NO: 40: (i) Data sekvence (A) Délka: 57 párů basi (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární

(i i) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence;-Sekvence ID NO: 40:

, « ► TTGGCCTTGG GCAAGCCCTT GGTTTTCATG GACCTGTCGA TCCACTTGAG GAAGGCG » ' (2) Údaje k sekvenci ID NO: 41: (i) Data sekvence (A) Délka: 55 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární

(ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 41:

GCCAGAGCC ATGCCCCGGA GGTCATAACG TCCTCTCCAT TAAAGTGAGA TCCCA 70 (2) Údaje k sekvenci ID NO: 42: (i) Data sekvence (A) Délka: 54 párů basí (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec - (D) Topologie: lineární . ..... .. ._ „ ________

(ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 42: CTAGTGGGAT CTCACTTTAA TGGAGAGGAC GTTATGACCT CCGGGGCATG GCTC (2) Údaje k sekvenci ID NO: 43: (i) Data sekvence (A) Délka: 1467 párů basí (B) Druh: nukleotid , , (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární

(ii) Druh molekuly: Genom-DNA (ix) Znak:

(A) Jméno/klíč: CDS (B) Poloha: 1..1467 (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 43:

v.· _ 71 _ • • ♦ i • i ► · 4 » · ♦ · ► · · · · « • · · · ··· «·· • · ·· ··< 4 ► · ► · · ·· «· • · - ·♦ ·· ATG GGG CGC CCA CTG CAC CTC GTC CTG CTC AGT GCC TCC CTG GCT GGC 48 Met Gly Arg Pro Leu His Leu Val Leu Leu Ser Ala Ser Leu Ala Gly 1 5 10 15 CTC CTG CTG CTC GGG GAA AGT CTG TTC ATC CGC AGG GAG CAG GCC AAC ' 96 Leu Leu Leu Leu Gly Glu Ser Leu Phe Ile Arg Arg Glu Gin Ala Asn 20 25 30 AAC ATC_. CTG GCG AGG GTC ACG AGG GCC AAT TCC TTT CTT GAA GAG ATG 144 Asn Ile Leu Ala Arg Val Thr* "Arg Ala Ásn Ser' Phe ‘.Leu Glu1 Glu Met - « ' · * ' 35 40 45 ~ . - AAG AAA GGA ,CAC CTC GAA AGA GAG TGC ATG GAA GAG ACC TGC TCA TAC 192 Lys Lys Gly His Leu Glu Arg Glu Cys Met Glu ’ Glu Thr" Cys Ser Tyr ·- " ' “ 50 55 60 GAA GAG GCC CGC GAG GTC TTT GAG GAC AGC GAC AAG ACG AAT GAA TTC 240 Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asp Ser Asp Lys Thr Asn Glu Phe 65 70 75 80 TGG AAT AAA TAC AAA GAT GGC GAC CAG TGT GAG ACC AGT CCT TGC CAG 288 Trp Asn Lys Tyr Lys Asp Gly Asp Gin Cys Glu Thr Ser Pro Cys Gin 85 90 95 AAC CAG GGC AAA TGT AAA GAC GGC CTC GGG GAA TAC ACC TGC ACC TGT 336 Asn Gin Gly Lys Cys Lys Asp Gly Leu Gly Glu Tyr Thr Cys Thr Cys 100 105 110 TTA GAA GGA TTC GAA GGC AAA AAC TGT .0 · ·; GAA TTA TTC ACA CGG AAG CTC 384 Leu Glu Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys Glu Leu Phe Thr Arg Lys Leu 115 120 Ψ 12 5 * . TGC AGC CTG GAC AAC GGG GAC TGT GAC CAG TTC. TGC CAC GAG GAA CAG 432 Cys Ser Leu Asp Asn Gly Asp Cys Asp Gin Phe Cys His Glu Glu Gin 130 135 140 AAC TCT GTG GTG TGC TCC TGC GCC CGC GGG TAC ACC CTG GCT GAC AAC 480 Asn Ser Val Val Cys Ser Cys Ala Arg Gly Tyr Thr Leu Ala Asp Asn 145 150 155 160 GGC AAG GCC TGC ATT CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG ACC 528 Gly Lys Ala Cys Ile Pro Thr Gly Pro Tyr Pro Cys Gly Lys Gin Thr 165 170 175 CTG GAA CGC AGG AAG AGG TCA GTG GCC CAG GCC ACC AGC AGC AGC GGG 576 Leu Glu Arg Arg Lys Arg Ser Val Ala Gin Ala Thr Ser Ser Ser Gly 18 0 185 190 GAG GCC CCT GAC AGC ATC ACA TGG .AAG CCA TAT GAT GCA GCC GAC CTG 624 Glu Ala Pro Asp Ser Ile Thr Trp Lys Pro Tyr Asp Ala Ala Asp Leu 195 200 205· GAC CCC ACC GAG AAC CCC TTC GAC CTG CTT GAC TTC AAC CAG ACG CAG 672 Asp Pro Thr Glu Asn Pro Phe Asp Leu Leu Asp Phe Asn Gin Thr Gin 210 215 220 CCT GAG AGG GGC GAC AAC AAC CTC ACC AGG ATC GTG GGA GGC CAG GAA 720 Pro Glu Arg Gly Asp Asn Asn Leu Thr Arg Ile Val Gly Gly Gin Glu 225 230 235 240 - 72 • ft • · • t «i • · * * · « . * · ·· % · · 4 * · · · *4 *······· ·· · · TGC AAG GAC GGG GAG TGT CCC TGG CAG GCC CTG CTC ATC AAT GAG GAA 768 Cys Lys Asp Gly Glu Cys Pro Trp Gin Ala Leu Leu Ile Asn Glu Glu 245 250 255 - AAC GAG GGT TTC TGT GGT GGA ACT ATT CTG AGC GAG TTC TAC ATC CTA t 816 Asn Glu Gly Phe Cys Gly Gly Thr Ile Leu Ser Glu Phe Tyr Ile Leu 260 ...... .265 • '' , , 270 ·>, - . ., » . ACG GCA GCC CAC TGT CTC TAC CAA GCC AAG AGA TTC AAG GTG AGG GTA 864 Thr Ala Ala His Cys Leu Tyr Gin Ala Lys Arg Phe Lys Val Arg Val " * 2 75 280 ' ~ " - - • 28 S- - ~~ . -- GGG GAC CGG AAC ACG GAG CAG GAG GAG GGC GGT GAG- GCG .GTG CAC GAG '912 Gly Asp Arg Asn Thr Glu Gin Glu Glu Gly Gly Glu Ala Val His Glu 290 295 300 GTG GAG GTG GTC ATC AAG CAC AAC CGG TTC ACA AAG GAG ACC TAT GAC 960 Val Glu Val Val Ile Lys His Asn Arg Phe Thr Lys Glu Thr Tyr Asp 305 310 315 320 TTC GAC ATC GCC GTG CTC CGG CTC AAG ACC CCC ATC ACC TTC CGC ATG 1008 P.he Asp Ile Ala Val Leu Arg Leu Lys Thr Pro Ile Thr Phe Arg Met 325 330 335 AAC GTG GCG CCT GCC TGC CTC CCC GAG CGT GAC TGG GCC GAG TCC ACG 1056 Asn Val Ala Pro Ala Cys Leu Pro Glu Arg Asp Trp Ala. GlU Ser Thr 340 345 350 r- t- CTG ATG ACG CAG AAG ACG GGG ATT GTG AGC GGC TTC GGG CGC ACC CAC 1104 Leu Met Thr Gin Lys Thr Gly Ile'Val Ser Gly Phe Gly Arg Thr His 355 360 365 1 GAG AAG GGC CGG CAG TCC ACC AGG CTC AAG ATG CTG GAG GTG CCC TAC 1152 Glu Lys Gly Arg Gin Ser Thr Arg Leu Lys Met Leu Glu Val Pro Tyr 370 375 380 GTG GAC CGC AAC AGC TGC AAG CTG TCC AGC AGC TTC ATC ATC ACC CAG 1200 Val Asp Arg Asn Ser Cys Lys Leu Ser Ser Ser Phe Ile Ile Thr Gin 385 390 395 400 AAC ATG TTC TGT GCC GGC TAC GAC ACC AAG CAG GAG GAT GCC TGC CAG 1248 Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Asp Thr Lys Gin Glu Asp Ala Cys Gin 405 410 415 GGG GAC AGC GGG GGC CCG CAC GTC ACC CGC TTC AAG GAC ACC TAC TTC 1296 Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val Thr Arg Phe Lys Asp Thr Tyr Phe 420 425 430 GTG ACA GGC ATC GTC AGC TGG GGA GAG AGC TGT GCC CGT AAG GGG AAG 1344 Val Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Glu Ser Cys Ala Arg Lys Gly Lys 435 440 445 - 73 • · · · ···· TAC GGG ATC TAC ACC AAG GTC ACC GCC TTC CTC AAG TGG ATC GAC AGG 1392

Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Thr Ala Phe Leu Lys Trp Ile Asp Arg 450 455 .460 TCC ATG AAA ACC AGG GGC TTG CCC AAG GCC AAG AGC CAT GCC CCG GAG 1440

Ser Met Lys Thr Arg Gly Leu Pro Lys Ala Lys Ser His Ala Pro Glu 465 470 ...... 475. . , 480" ·- . - GTC ATA ACG TCC TCT CCA TTA AAG TGA .1467

Val Ile Thr Ser Ser Pro Leu Lys * , ___________________.„..485 - · - -----------------··------ 4 (2) Údaje k sekvenci ID NO: 44: (i) Pata sekvence (A) Délka: 489 aminokyselin (B) Druh: aminokyseliný (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: Protein (xi) Popis sekvence: Sekvence ID NO: 44

Met Gly Arg Pro Leu His Leu Val 1 5

Leu Leu Leu Leu Gly Glu Ser Leu 20 '

Asn Ile Leu Ala Arg Val Thr Arg 35 40

Lys Lys Gly His Leu Glu Arg Glu 50 55

Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu 65 70

Trp Asn Lys Tyr Lys' Asp Gly Asp 85

Leu Leu Ser Ala Ser Leu Ala Gly 10 15

Phe Ile Arg Arg Glu Gin Ala Asn 25 30

Ala Asn Ser Phe Leu Glu Glu Met 45

Cys Met Glu Glu Thr Cys Ser Tyr 60

Asp Ser Asp Lys Thr Asn Glu Phe 75 80

Gin Cys Glu Thr Ser Pro Cys Gin 90 95 i*»

% r

Asn Gin Gly Lys Cys Lys Asp Gly 100 Leu Glu Gly Phe Glu Gly Lys Asn 115 120 Cys Ser,Leu Asp Asn Gly Asp Cys 130 135 Asn Ser Val Val Cys Ser Cys Ala 145------ . - -- · - -150 Gly Lys Ala Cys Ile Pro Thr Gly 16 5 Leii Glu Arg Arg Lys Arg Ser Val 180 Glu Ala Pro Asp Ser Ile Thr Trp 195 200 Asp Pro Thr Glu Asn Pro Phe Asp 210 215 Pro Glu Arg Gly Asp Asn Asn Leu 225 230 Cys Lys Asp Gly Glu Cys Pro Trp 245 Asn Glu Gly Phe Cys Gly Gly Thr 260 Thr Ala Ala His Cys Leu Tyr Gin 275 280 Gly Asp Arg Asn Thr Glu Gin Glu 290 295 Val Glu Val Val Ile Lys His Asn 305 310 Phe Asp Ile Ala Val Leu Arg Leu 325 Asn Val Ala Pro Ala Cys Leu Pro 340 Leu Met Thr Gin Lys Thr Gly Ile 355 360 Glu Lys Gly Arg Gin Ser Thr Arg 370 375 Val Asp Arg Asn Ser Cys Lys Leu 385 - 390 Asn Met .Phě Cys Ala Gly Tyr Asp 405 - 74 • · ♦ · é · • · I I · • · · · ···«··· ·«

Leu Gly Glu Tyr Thr Cys Thr Cys 105 110' Cys Glu Leu Phe Thr Arg Lys Leu 125 Asp Gin Phe, Cys His, Glu Glu Gin 140 Arg Gly Tyr Thr Leu Ala Asp Asn 155...... - 160 Pro Tyr Pro Cys Gly Lys Gin Thr 170 175 Ala Gin Ala Thr Ser Ser Ser Gly 185 190 Lys Pro Tyr Asp Ala Ala Asp Leu 205 Leu Leu Asp Phe Asn Gin Thr Gin 220 Thr Arg. Ile Val Gly Gly Gin Glu 235 240 Gin Ala Leu Leu Ile Asn Glu Glu 250 ' · 255 Ile Leu Ser Glu Phe Tyr Ile Leu 265 270 Ala Lys Arg Phe Lys Val Arg Val 285 Glu Gly Gly Glu Ala Val His Glu 300 Arg Phe Thr Lys Glu Thr Tyr Asp 315 320 Lys Thr Pro Ile Thr Phe Arg Met 330 335 Glu Arg Asp Trp Ala Glu Ser Thr 345 350 Val Ser Gly Phe Gly Arg Thr His 365 Leu Lys Met Leu Glu Val Pro Tyr 380 Ser Ser Ser Phe Ile Ile Thr Gin 395 400 Thr Lys Gin Glu Asp Ala Cys Gin 410 415 ··

Claims (45)

1. ί. «§u©r. Mim VŠETEČm advokát 120 00 PRAHA 2, Hálkova 2 76 - t t #'· ·· • · · .· • · · ·

   • ·· • · * • · · - ♦ · ,··· Ψί/hyj-^ Patentové nároky

   r ijř

   % ze skupiny Leu, Phe, Arg nebo Pro 1. Analog faktoru ΧΔ vyznačující se t í m » že zahrnuje jednu de-ieci 'aminokyselin Argl80 až" Arg 234 v aminokyselinové sekvenci faktoru Xa a jednu modifikaci v oblasti aminokyselinové .sekvence mezi .Glyl73 .a Argl79. . , ........... .
2. 2. Analog faktoru XA podle nároku 1, vyznačující se tím, že modifikace představuje místo přeměny pro proteasu, která za přírodních podmínek sekvenci faktoru X na tomto místě neštěpí.
3. 3. Analog faktoru XA podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že tato modifikace spočívá ve výměně minimálně jedné aminokyseliny v oblasti aminokyselinové sekvence mezi Glyl73 á Argl79, vztaženo na číslování aminokyselin podle obr. i/’ i
4. 4. Analog faktoru XA podle, některého nároku 1 až 3, vyznačující se t i m , že obsahuj e sekvenci faktoru X zahrnující Glyl73-R6-R5_R4_R3_R2_Argl79/Rl(235), kde a) R1 je aminokyselina vybraná ze skupiny Val, Ser, Thr, Ile nebo Ala b) R2 je aminokyselina vybraná ze skupiny Glu, Thr, Pro, Gly, Lys nebo Arg c) R3 je aminokyselina vybraná Lys, Met, Gin, Glu, Ser yal

   77

   • ♦ «··· ····

   ···♦ «· d) R4 je aminokyselina vybraná ze skupiny Thr, Asp, Asn, Ile, Ser, Met, Pro, Arg nebo Lys e) R5 je aminokyselina vybraná ze skupiny Asn, Lys Ser, Glu, Gin, Ala, His nebo Arg a - f)- R6 je aminokyselina vybraná ze skupiny Asp, -Phe, Thr, Arg, Leu nebo Ser.
5. 5. Analog faktoru ΧΔ podle některého nároku 1 až 4, vyznačující se tím, že tato modifikace představuje místo přeměny pro proteasu vybranou ze skupiny endoproteas, jako jsou kexin/Kex2, furin/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE4, LPC/PC7, ze skupiny serinproteas, jako jsou faktor Ha, faktor Vila, faktor IXa, faktor Xlla, faktor Xla, faktor X nebo kallikrein, nebo derivát těchto proteas.
6. 6. Analog faktoru ΧΔ podle některého nároku 1 až 5, vyznačující se tím, že se vyskytuje jako jednořetězcová molekula v enzymaticky inaktivní formě.
7. 7. Analog faktoru ΧΔ podle některého nároku 1 až 6, vyznačující se tím, že tato modifikace umožňuje aktivaci inaktivního polypeptidu jednořetězcového analogu faktoru ΧΔ na dvouřetězcovou aktivní formu analogu faktoru Xa.
8. 8. Analog faktoru ΧΔ podle některého nároku 1 až 7, vyznačující se tím, že zahrnuje další modifikaci v oblasti C-koncové aminokyselinové sekvence faktoru X.
9. 9. Analog faktoru ΧΔ podle nároku 8, • I ·· ♦· ·· ·· ·· • ··· · · · ·♦ · · » * · . 7Λ - · ········# ' ^ · · * · · ··· · ··· ··· • » · · · · * ···· ···· , ·♦ ·· ·« φφ vyznačující se tím, že tato modifikace je provedena v C-koncové části β-peptidického štěpného místa.
10. 10'. Analog faktoru ΧΔ ,podle nároku 9, vyznačuj í c í š' ě" tím, žě tato modifikace představuje mutaci, deleci nebo vložení v-oblasti aminokyselinové, sekvence faktoru X^mezi pozicí aminokyseliny Arg469 a Ser476.
11. 11. Analog faktoru ΧΔ podle některého nároku 8 až 10, vyznačující se tím, že tato modifikace zabraňuje odštěpení β-peptidu.
12. 12. Analog faktoru ΧΔ podle nároku 8, vyznačující se tím, že zahrnuje deleci β-peptidu faktoru X.
13. 13. Analog faktoru ΧΔ podle nároku 12, vyznačující se tím, že zahrnuje translační stop-signál v oblasti C-kohce sekvence faktoru X.
14. 14. Analog faktoru ΧΔ podle nároku 13, vyznačující se tím, že zahrnuje translační stop-signál na pozici aminokyseliny Lys470 sekvence faktoru X.
15. 15. Analog faktoru ΧΔ podle některého z nároků 1 až 14, vyznačující se tím, že tato modifikace umožňuje v oblasti aminokyselinové sekvence mezi Glyl73 a Argl79 in vitro aktivaci inaktivního analogu faktoru X na aktivní analog faktoru ΧΔ
16. 16. Analog faktoru ΧΔ podle nároku 15, - 79 ·· ·Φ ·'· ·· ♦♦ «· ·♦·· « · t · ··«· · • · · · · · · • · *·.····« ·· • · · · · ···· ···· ·· ·· ·· vyznačuj ící se tím, že tato modifikace umožňuje aktivaci působením proteasy vybrané zé skupiny en-doproteas, jako jsou kexin/Kex2, furin/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE4, LPC/PC7, ze skupiny serinproteas, jako jsou faktor" ITa, 'faktor Vila, faktor IXa, faktor Xlla^ faktor * “ ' Xla, faktor X nebo kallikrein, nebo derivátu těchto proteas.
17. 17. Analog faktoru XA podle některého z nároků 1 až 16, vyznačující se tím, že obsahuje intaktní β-peptid a vyskytuje se jako faktor ΧΔ a.
18. 18. Analog faktoru XΔ podle některého z nároků 1 až 16, vyznačující se tím, že zahrnuje deleci β-peptidu.
19. 19. Rekombinantní DNA, kódující analog faktoru ΧΔ podle některého z nároků 1 až 18, obsažené ve vektoru pro rekombinantní expresi kódovaného proteinu.
20. 20. Transformované buňky, obsahující rekombinantní DNA podle nároku 19.
21. 21. Preparát, obsahující čištěný analog faktoru XA zahrnující jednu deleci aminokyselin Argl80 až Arg234 v oblasti aminokyselinové sekvence faktoru X a jednu modifikaci v oblasti aminokyselinové sekvence mezi Glyl73 a Argl79.
22. 22. Preparát podle nároku 21, vyznačující se tím, že obsahuje jednoře-tězcový analog faktoru ΧΔ v enzymaticky inaktivní formě o čistotě minimálně 80 %, výhodně 90 %, obzvláště výhodně 95 % a že neobsahuje žádné inaktivní proteolytické inter-mediáty analogu faktoru X/Xa. - 80 - 80 ·♦ ·· • · · · • · · · • ‘ · · · φ • · · ·♦ ·* Φ · ·· • '♦ • · » · • · 9·· • ·· *· ·« *· • · ♦ · • · ♦ «·· ····
23. 23. Preparát podle některého z nároků 21 nebo 22, vyznačující se tím, že obsahuje analog faktoru ΧΔ jako faktor ΧΔ a.
24. 24. Preparát podle některého z nároků 21 nebo 22, vyznačuj ící se t í m , že obsahuje^analog _ faktoru ΧΔ jako faktor ΧΔ β.
25. 25. Preparát podle některého z nároků 21 až 24, vyznačující se tím, že obsahuje analog faktoru ΧΔ ve formě jednořetězcové molekuly v isolované formě.
26. 26. Preparát podle některého z nároků 21 až 25, vyznačující se tím, že obsahuje analog faktoru ΧΔ s vysokou stabilitou a strukturní integritou molekuly. · · .
27. 27. Preparát podle některého z nároků 21 až 26, vyznačující se tím, že obsahuje analog faktoru ΧΔ , vykazující modifikaci umožňující in vitro aktivaci analogu faktoru ΧΔ na analog faktoru Xa.
28. 28. Preparát podle některého z nároků 21 až 27, vyznačující se tím, že je formulován jako farmaceutický preparát.
29. 29. Preparát podle nároku 28, vyznačující se tím, že je uložen ve vhodném zařízení, přednostně v aplikátoru, v kombinaci s proteasou vybranou ze skupiny endoproteas, jako jsou kexin/Kex2, furin/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE4, LPC/PC7, $ ir ·* ♦ · ·· ·· ♦ · • ♦ ♦ ♦ · · • · 9 • • · · • ♦ é ♦ • • ♦ * # • · ♦ • 9 99 * · · · *··· ·· ·· 99 fí ze skupiny serinproteas, jako jsou faktor Ha, faktor Vila, faktor IXa, faktor Xlla, faktor Xla, faktor X nebo kalli-krein, nebo derivátem těchto proteas. ť .
30. 30. "Preparát podle nároku 29, , vy značu jicí se tím, že jednotlivé složky jsou vzájemně prostorově odděleny. _
31. 31. Preparát obsahující čištěný analog faktoru Xa s vysokou stabilitou a strukturní -integritou, který neobsahuje zejména inaktivní intermediáty analogů faktoru ΧΔ /Xa a produkty autoproteolytickéhó odbourávání, a který je získatel-ný aktivací analogu faktoru ΧΔ podle některého z nároků 1 až 20.
32. 32. Preparát podle nároku 31, vyznačující se tím, že obsahuje aktivní analog faktoru Xa v izolovaném stavu ve formě dvouřetěz-cových molekul. ·
33. 33. Preparát podle některého z nároků 31 nebo 32, vyznačující se tím, že obsahuje aktivní analog faktoru Xa o čistotě minimálně 80 %, výhodně 90 %, obzvláště výhodně 95 % a že neobsahuje žádné inaktivní proteolytické intermediáty analogu faktoru X/Xa.
34. 34. Preparát podle některého z nároků 31 až 33, vyznačující se tím, že obsahuje nosič ve fyziologicky akceptovatelné formě a je v dlouhodobě pro skladování stabilní formě. s e
35. 35. Preparát podle některého z nároků 21 až 34, vyznačující se tím, že obsahuje případně • 4 t 82 ♦ · ♦· » · I « •4 I ··. 44 » 4 4 | » «4 « 44 #· t ♦ 4 4 • · 4 » 444 44« P 4444 »4·· • 4 44 (¾ jako další složku krevní faktor nebo aktivovanou formu krevního faktoru.
36. 36. Preparát podle nároku 35, v y' z'n a č u j í c í sl e tím ; že obsahuje jako další složku minimálně jednu složku s faktor VIII bypassovou aktivitou.
37. 37. Preparát podle některého z nároků 21 nebo 36, vyznačující se tím, že je formulován jako farmaceutický preparát.
38. 38. Použití preparátu podle některého z nároků 21 až 37 pro výrobu léčiva.
39. 39. Použití preparátu podle některého z nároků 21 až 37 pro výrobu léčiva pro léčbu pacientů s poruchami srážení· krve, jako jsou pacienti trpící hemofilií,. u .nichž se vyvinuly inhibiční protilátky. ' ·
40. 40. Způsob přípravy preparátu, obsahujícího čištěný re-kombinantní analog faktoru ΧΔ , vyznačující se tím, že analog faktoru ΧΔ, získaný rekombinantní přípravou, se izoluje jako jednořetěz-cová molekula a čistí se chromatografickým postupem.
41. 41. Způsob podle nároku 40, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky: - příprava nukleové kyseliny pro kódování analogu faktoru ΧΔ podle některého z nároků 1 až 18 - 83 ·· ·.· ·· • · · t · · • * · · t. · · · · • · 9 - · «» I··· ···· ♦· ·· ·· M ♦ · · · · * • · · · · · *·· · ··« »·· • · · ·· ·· 4»· - transfekace vhodné buňky - exprese analogu faktoru ΧΔ - izolace jednořetězcového analogu faktoru ΧΔ a - čištění polypeptidu.
42. 42. Způsob přípravy preparátu, obsahujícího aktivní analog faktoru Xa , vyznačuj ící se tím, že se preparát, připravený podle některého z nároků 40 nebo 41 , podrobí aktivačnímu kroku.
43. 43. Způsob podle nároku 42, vyznačující se tím, že se preparát, obsahující jednořetězcový analog faktoru ΧΔ , uvede do styku s proteasou vybranou ze skupiny endoproteas, jako jsouJ kexin/Kex2, furin/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE4, LPC/PC7,* ze skupiny serinproteas, jako jsou'faktor Ha, faktor Vila, . faktor IXa, faktor Xlla, faktor Xla, faktor X nebo kalli-krein, nebo derivátem těchto proteas, za podmínek umožňujících štěpení na dvouřetězcovou formu analogu faktoru Xa.
44. 44. Způsob podle nároku 43, vyznačující se tím, že tato proteasa je imobilizovaná. J
45. 45. Způsob podle některého z nároků 41 až 44, vyznačující se tím, že se získá vyčištěný analog faktoru Xa š vysokou stabilitou a strukturní integritou, který zejména neobsahuje inaktivní intermediáty analogu faktoru ΧΔ /Xa.